単離されたルシフェラーゼおよびその使用
【課題】ルシフェラーゼまたはそれらの機能的等価物の配列、および、それらの使用方法を提供する。
【解決手段】ルシフェラーゼＬｕＡＬ、Ｌｕ１６４、Ｌｕ１６、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ５２およびＬｕ２２またはそれらの機能的等価物の配列、および、該配列がその５’側に位置する機能的プロモーターを含む、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子。そのヌクレオチド配列によってコードされるペプチド。ルシフェラーゼの、細胞系用レポータ遺伝子としての使用。
【解決手段】ルシフェラーゼＬｕＡＬ、Ｌｕ１６４、Ｌｕ１６、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ５２およびＬｕ２２またはそれらの機能的等価物の配列、および、該配列がその５’側に位置する機能的プロモーターを含む、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子。そのヌクレオチド配列によってコードされるペプチド。ルシフェラーゼの、細胞系用レポータ遺伝子としての使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、ルシフェラーゼＬｕＡＬ、Ｌｕ１６４、Ｌｕ１６、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ５２およびＬｕ２２のヌクレオチドおよびアミノ酸配列およびそれらの活性および使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
「ルシフェラーゼ」
発光（ルミネッセンス）は励起されたエミッター分子が引き起こす可視スペクトル範囲内の光子放射に与えられる用語である。蛍光とは対照的に、発光のエネルギーは短波長照射の形で外部から供給されるものではない。
【０００３】
化学発光と生物発光とは明確に区別されている。化学発光は、励起分子を与える化学反応に与えられた用語であって、その励起分子自体では、励起水準にある電子が正常エネルギー水準に戻る時に光を放射する。生物発光は、この反応が酵素で触媒される時に使用される用語である。この反応に関与する酵素は、一般にルシフェラーゼと呼ばれる。
【０００４】
発光生物の総説は、Hastings et al. 1995にも記載がある。
【発明の開示】
【０００５】
ルシフェラーゼは、ペルオキシダーゼであるか、またはモノオキシゲナーゼおよびジオキシゲナーゼである。この酵素の基質は光放出産物のための出発物質を形成し、ルシフェリンと呼ばれる。その基質は種毎に異なっている。この系の量子収率は、変換される基質分子当り、０．１フォトンと０．９フォトンとの間にある（Idelgaufts, 1993）。
【０００６】
ルシフェラーゼは、その起源またはその酵素的性質に基づいて分類できる。以下の表は、数型のルシフェラーゼについて全体像を示す。
【０００７】
表１ 細菌ルシフェラーゼ
【表１】
【０００８】
表２ セレンテラジン依存性真核生物ルシフェラーゼ
【表２】
【０００９】
表３ セレンテラジン非依存性真核生物ルシフェラーゼ
【表３】
【００１０】
ルシフェラーゼは、その基質特異性に基づいても相互に区別できる。最重要な基質には、セレンテラジン（Jones et al. 1999）およびルシフェリン、およびこれら二化合物の誘導体が含まれる。これら基質の図およびそのルシフェラーゼによる変換について以下に記載する。
【００１１】
「ルシフェラーゼ基質」
数種のルシフェラーゼ基質およびその変換については下記の実施例に記載する。本明細書に記載する基質は全て、光および二酸化炭素（CO2）の放出および酸素（O2）の消費を伴って、酵素的に変換される。補助因子またはエネルギー輸送体（たとえば、ホタル・ルシフェラーゼの場合のＡＴＰ）に対するこの反応の依存性は、酵素特異的である。
【００１２】
セレンテラジン
【化１】
エクオリンによるセレンテラジンからセレンテラミドへの変換であって、波長４７０ｎｍの光放射を伴う。
【００１３】
【化２】
ホタル・ルシフェラーゼによるルシフェリンからオキシルシフェリンへの変換であって、波長５６０ｎｍの光放射を伴う。
【００１４】
【化３】
ウミホタル・ルシフェリンからウミホタル・オキシルシフェリンへのウミホタル・ルシフェラーゼによる変換であって、波長４６０ｎｍの光放射を伴う。
【００１５】
「レポータシステム」
レポータ遺伝子または標識遺伝子は、ある遺伝子の遺伝子産物が単純な生化学的または組織化学的方法を使用すれば、容易に検出できるような遺伝子に、一般的に与えられる用語である。レポータ遺伝子には、少なくとも二つの型が認められている。
１）耐性遺伝子：耐性遺伝子は、その発現が抗生物質、その他、耐性遺伝子が存在しなければ細胞死を起こす物質の培養培地中における存在に対する耐性を細胞に与える遺伝子を示す用語である。
２）レポータ遺伝子：組換えＤＮＡ技術では、レポータ遺伝子の産物は融合標識または非融合標識として使用される。最も通常のレポータ遺伝子には、ベータガラクトシダーゼ（Alam et al. 1990）、アルカリフォスファターゼ（Yang et al. 1997；Cullen et al. 1992）、ルシフェラーゼおよびその他のフォトプロテイン（Shimomura, 1985; Philips GN, 1997; Snowdowne et al. 1984）が含まれる。
【００１６】
「Metridia longa種の分類」
節足動物門→→甲殻綱→→櫂脚類
Metridia longa 種は甲殻綱、特に櫂脚類または動物プランクトンに属する。
【００１７】
「ｃＤＮＡの単離」
Metridia longa 種の生物発光活性を研究するため、白海で標本を採集し（カルテシュ（Kartesh）生物学研究所、ロシア）、液体窒素中に保存した。Metridia longaのｃＤＮＡライブラリーを調製するため、イソチオシアネートを用いるKrieg（Krieg et al. 1996）の方法により、ＲＮＡを単離した。
【００１８】
ｃＤＮＡは、ＲＴ−ＰＣＴ法で調製した。そのために、ＲＮＡ１０μｇと逆転写酵素（Superscript Gold II）とを次の方式でインキュベーションした。
【００１９】
ＰＣＲ １． ３０秒 ９５℃
２． ６分 ６８℃
３． １０秒 ９５℃
４． ６分 ６８℃
段階３、段階４： １７サイクル
【００２０】
ポリメラーゼを不活化するため、反応産物とプロテイナーゼＫとを、３７℃で３０分間インキュベーションし、ｃＤＮＡをエタノールで沈降させた。ｃＤＮＡを水に溶解し、ＳｆｉＩとともに３７℃で１時間インキュベーションした。反応産物をゲル濾過に付して、小さな断片を分離除去した。次にこの分画したｃＤＮＡをＳｆｉＩ断片と脱リン酸化λＴｒｉｐｌＥｘ２ベクターとに結合した。λファージの発現ライブラリーを調製するために、次にin vitro パッケージングシステムにＳＭＡＲＴ・ｃＤＮＡライブラリー組立てキット（Clontech社）を用いて、クローニングしたｃＤＮＡ断片をλファージにパッケージした。
【００２１】
セレンテラジン依存性ルシフェラーゼを発現する可能性のあるｃＤＮＡ挿入体を含む組換えファージは、ライブラリースクリーニングを行うことによって確認した。
【００２２】
そのために、E. coli XL1-Blueを含む菌叢を９０mm培養皿に塗布し、３７℃で１０時間インキュベーションした。これを、培養皿当り２５００ファージに感染させ、続いてこれを８時間３７℃でインキュベーションして、プラークを形成させた。続いて培養皿を４℃に１時間放置して軟い寒天を固化させた。
【００２３】
レプリカ平板培養を行うために、ニトロセルロース膜をE. coli XL1-Blue懸濁液で飽和した後、乾燥した。乾燥した膜をファージプラークに６０秒間載せた後、新しい寒天プレート上に載せた。続いて、この寒天プレートを３７℃で２時間インキュベーションし、ＳＯＢ培地（＋１０mM−MgSO4、０．２％マルトース）を４ml添加した。この菌叢を脱着し、ＬＢ培地（＋２０mm−ＩＰＴＧ）に再懸濁し、３７℃で１時間インキュベーションした。細菌を遠心分離で収集し、超音波で破砕し、セレンテラジンを添加した後に、光度計で生物発光活性を測定した。
【００２４】
陽性の生物発光シグナルを示す培養プレートをセクターに分け、新たなレプリカ培養を行った。レプリカ培養は、個々の活性なプラークが確認されるまで続行した。陽性プラーク内にあるファージに、ｃＤＮＡ挿入物をサブクローニングするために[lacuna]、E. coli BM25.8株内のｐＴｒｉｐｌＥｘ２ベクターにＳＭＡＲＴ・ｃＤＮＡライブラリー組立てキットを製造社の指示書に従って使用してサブクローニングを行った。このｐＴｒｉｐｌＥｘ２・ｃＤＮＡをトランスフェクトしたE. coli を１００μg／ml濃度のアンピシリンを含有するＬＢ培地中、一夜３７℃でインキュベーションした。オーバーエクスプレッションを達成するために、一夜培養物をＬＢ培地で１：１５０に希釈し、３７℃で１時間インキュベーションした。次に、ＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）を最終濃度２０mMになるように加えることによって、インダクションを行った。誘導された培養物を３７℃で１時間インキュベーションし、細菌を遠心分離によって収集した。この細胞をＳＭ緩衝液０．５ml中、超音波で破砕した。セレンテラジン（１０−4M、メタノール）１０μLを添加した後に光度計で化学発光を測定した。
【００２５】
セレンテラジン依存性ルシフェラーゼ活性を示すルシフェラーゼ３種を確認した。このルシフェラーゼをそれぞれＬｕ１６４、ＬｕＡＬ、Ｌｕ２２と命名した。これらルシフェラーゼについては、以下に詳記する。
【００２６】
本発明は、このルシフェラーゼ３種の機能的等価物も包含する。機能的等価物とは、類似の基質スペクトルを持ち、分泌され、さらに少なくとも７０％の相同性があるルシフェラーゼである。８０％または９０％の相同性は、好適である。９５％の相同性は殊に好適である。
【００２７】
このルシフェラーゼは、細胞系、特に受容体、イオンチャネル、トランスポータ、転写因子または誘導系のためのレポータ遺伝子としての使用に適する。
【００２８】
このルシフェラーゼは、例えば力価測定のために、または生化学系、特にプロテイナーゼのための基質として、細菌系内で使用できる。
【００２９】
このルシフェラーゼは、たとえば、ELISA、免疫組織化学またはウェスタンブロッティングのために、抗体、その他のタンパク質に結合したレポータ酵素としても使用できる。
【００３０】
このルシフェラーゼは、BRET系（生物発光共鳴エネルギー遷移系）の中でも使用できる。
【００３１】
このルシフェラーゼは、共焦点顕微鏡術のための、またはタンパク質−タンパク質相互作用の分析のための、融合タンパク質としての使用にも適している。
【００３２】
このルシフェラーゼは、たとえばＥＬＩＳＡまたは固定などのために、ビオチン、ＮＨＳ、ＢｒＣＮまたはその他の結合メディエータと結合したレポータ酵素としても使用できる。
【００３３】
このルシフェラーゼは、さらに、たとえばノーザンおよびサザンブロッティングまたは実時間ＰＣＲなどのために、ＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドと結合したレポータ酵素としても使用できる。
【００３４】
本発明はまた、野生型としてまたはタグタンパク質としての本ルシフェラーゼの精製に関し、さらに生体内翻訳系内におけるルシフェラーゼの使用に関する。
【００３５】
ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列
ＬｕＡＬ
ルシフェラーゼＬｕＡＬは、分子量２３．７ｋＤａ、等電点８．３２を有するタンパク質である。このコード化ヌクレオチド配列は以下のとおり：
【表４】
であり、これから次表のアミノ酸配列：
【表５】
、および次表のアミノ酸組成：
【表６】
が導かれる。
【００３６】
Ｌｕ１６４
ルシフェラーゼＬｕ１６４は、分子量２３．８ｋＤａ、等電点７．８１を有するタンパク質である。このコード化ヌクレオチド配列は次のとおり：
【表７】
であり、これから次表のアミノ酸配列：
【表８】
および次表のアミノ酸組成：
【表９】
が導かれる。
【００３７】
Ｌｕ２２
ルシフェラーゼＬｕ２２は、分子量２０．２ｋＤａ、等電点７．８９を有するタンパク質である。このコード化ヌクレオチド配列は次のとおり：
【表１０】
であり、これから次表のアミノ酸配列：
【表１１】
、および次表のアミノ酸組成：
【表１２】
が導かれる。
【００３８】
これらの配列は配列表にも記載する。
【００３９】
ルシフェラーゼの酵素活性および生化学的特性
タンパク質ＬｕＡＬ、Ｌｕ１６４およびＬｕ２２は酵素であって、セレンテラジンを変換する時に光を放射する。それ故、いずれもルシフェラーゼ群に属する。ルシフェラーゼは、細菌および真核生物細胞の双方において有効に発現させることができる。真核生物細胞にて発現させるルシフェラーゼＬｕＡＬ、Ｌｕ１６４およびＬｕ２２は分泌される。細菌で発現すると、分泌は起きない。
【００４０】
ルシフェラーゼの活性は、温度依存的である。ルシフェラーゼＬｕＡＬおよびＬｕ１６４の至適温度は、各々２２℃ （ＬｕＡＬ）、２７℃（Ｌｕ１６４）と測定されている。ルシフェラーゼＬｕ２２活性の至適温度は、４℃またはそれ以下である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
実施例
プラスミド／組立て物
以下に記載する組立て物を製造するために使用するベクターは、Clontech社のベクターpcDNA3.1（+）とpTriplEx2、およびベクター pASMplr（cAMP感受性プロモータエレメント：creを有する当社内組立て物）であった。このベクターの誘導体は、pcDNA3−x、pTriplEx2−x およびpASM−xと命名した。
【００４２】
ＬｕAL
図１は、ベクターｐＴｒｉｐｌＥｘ２−ＬｕＡＬ、ｐｃＤＮＡ３−ＬｕＡＬ、およびｐＡＳＭ−ＬｕＡＬのプラスミド地図を示す。
【００４３】
図２は、ベクターｐＴｒｉｐｌＥｘ２−Ｌｕ１６４、ｐｃＤＮＡ３−Ｌｕ１６４、およびｐＡＳＭ−Ｌｕ１６４のプラスミド地図を示す。
【００４４】
図３は、ベクターｐＴｒｉｐｌＥｘ２−Ｌｕ２２、ｐｃＤＮＡ３−Ｌｕ２２、およびｐＡＳＭ−Ｌｕ２２のプラスミド地図を示す。
【００４５】
Ｌｕ１６４の基質としてのセレンテラジン誘導体
Ｌｕ１６４の基質を確認するために、各種セレンテラジン誘導体の１０μL溶液（10−4M）を、各々ＣＨＯ−ｐｃＤＮＡ３−Ｌｕ１６４細胞系列からの上清液１０μLとともに、インキュベーションし、発光を測定した。各セレンテラジンは、Molecular Probes社（米国）から購入した。
【００４６】
ルシフェラーゼＬｕＡＬおよびＬｕ２２の場合には、ルシフェラーゼＬｕ１６４と比較して相違点が見当らなかった。未修飾セレンテラジン (図Ｂ、セレンテラジンａ) が、Ｌｕ１６４、ＬｕＡＬおよびＬｕ２２のための至適基質であることが確認された。
【００４７】
図４は、Ｌｕ１６４の基質になる可能性があるセレンテラジン誘導体を示し、ここに、８．７ｋＶ、３０秒間光度計で測定した発光のグラフ（ＲＬＵ＝相対光度単位：relative light unit）とセレンテラジン誘導体の分子構造とを示す。
【００４８】
セレンテラジンに依存するルシフェラーゼＬｕ１６４、ＬｕＡＬ、およびＬｕ２２の酵素活性
細菌での発現
細菌発現は、この細菌を発現プラスミドｐＴｒｉｐｌＥｘ２−Ｌｕ１６４、 ｐＴｒｉｐｌＥｘ２−ＬｕＡＬ、およびｐＴｒｉｐｌＥｘ２−Ｌｕ２２で形質転換した結果として、E. coli のBL21 (DE3) 株内で行った。形質転換した細菌をＬＢ培地中、３７℃で３時間インキュベーションし、１ｍＭ最終濃度になるようにＩＰＴＧを加えて４時間、発現を誘導した。誘導された細菌を、遠心分離で収集し、ＰＢＳに再懸濁し、超音波で破砕した。セレンテラジン（１０−４Ｍ、メタノール）、またはルシフェリン（ホタル・ルシフェリン）を溶解液５μＬ（５ｍｇ／ｍＬ）に加え、化学発光を測定した。
【００４９】
測定は、ＲＬＵ（相対光度単位）によって９．５ｋＶ、３０秒間行った。Ｌｕ１６４、ＬｕＡＬ、Ｌｕ２２の各々の場合に、ＲＬＵの測定値２３００００、３２００００および２６００００が得られた。これら酵素を、各ベクターｐＴｒｉｐｌＥｘ２−Ｌｕ１６４、ｐＴｒｉｐｌＥｘ２−ＬｕＡＬおよびｐＴｒｉｐｌＥｘ２−Ｌｕ２２を用いて、E. coli のBL21（DE3）株内で発現した。
【００５０】
真核生物での発現
構成的真核生物発現は、一過性の実験で発現プラスミドpcDNA３−Ｌｕ１６４、pcDNA３−ＬｕＡＬおよびpcDNA３−Ｌｕ２２で細胞を形質転換することによってＣＨＯ細胞内で行った。そのために、９６穴マイクロタイタープレートの各ウェルに、ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地中の細胞１００００個を塗布し、３７℃で一夜インキュベーションした。このトランスフェクションは、製造社の指示書に従い、Fugene６キット（Roche社）を使用して行った。遺伝子移入を受けた細胞をDMEM−F１２培地中、３７℃で一夜インキュベーションした。セレンテラジン（10−4M、メタノール）添加後、培地（５μL）と細胞溶解液（５μL）の化学発光を室温、９．５ｋＶ、３０秒間光度計で測定した。
【００５１】
Ｌｕ１６４、ＬｕＡＬおよびＬｕ２２の場合に、各々測定値６８００００、６７００００及び５１００００RLU(相対光度単位)の値が得られた。発現は、ベクターｐｃＤＮＡ３−Ｌｕ１６４、ｐｃＤＮＡ３−ＬｕＡＬおよびｐｃＤＮＡ３−Ｌｕ２２を使用してCHO細胞内で行った。
【００５２】
ルシフェラーゼＬｕ１６４、 ＬｕＡＬおよびＬｕ２２の放射スペクトル
放射スペクトルを測定するために、E. coli のBL21（DE3）株細胞をプラスミドｐＴｒｉｐｌＥｘ２−Ｌｕ１６４、ｐＴｒｉｐｌＥｘ２−ＬｕＡＬおよび ｐＴｒｉｐｌＥｘ２−Ｌｕ２２で形質転換し、前記３．１に記載のようにしてオーバーエクスプレッションした。細菌溶解液１００μL容にセレンテラジン（10−4M；５０μL）を添加し、放射スペクトルを測定した。各ルシフェラーゼが発する放射スペクトルのグラフを以下に記載する。
【００５３】
ルシフェラーゼＬｕ１６４、ＬｕＡＬおよびＬｕ２２の場合には、基質の形質転換に起因する最大放射は、波長約４９０ｎｍに起きた。
【００５４】
図５は、細菌発現後に観察されるルシフェラーゼＬｕ１６４（Ａ）、ＬｕＡＬ（Ｂ）、およびＬｕ２２（Ｃ）の放射スペクトル（ＲＬＵ＝相対光度単位）を示す。
【００５５】
Ｌｕ１６４およびＬｕＡＬを例としての、ＣＨＯ細胞からのルシフェラーゼＬｕ１６４、ＬｕＡＬおよびＬｕ２２の分泌
真核生物細胞内でのルシフェラーゼＬｕ１６４、ＬｕＡＬおよびＬｕ２２の発現を特徴付けるために、ＣＨＯ細胞にプラスミドｐｃＤＮＡ３−ＬｕＡＬ、ｐｃＤＮＡ３−Ｌｕ１６４およびｐｃＤＮＡ３−Fireluc、およびｐｃＤＮＡ３．１（＋）を安定的に遺伝子移入した。得られたクローンは、ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地中で培養した。ホタル・ルシフェラーゼは、非分泌性ルシフェラーゼの陽性対照として使用した。プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）は、ＣＨＯ親細胞の内因性活性があれば検出するための対照プラスミドとして使用した。
【００５６】
ルシフェラーゼの分泌を検出するために、３８４穴マイクロタイタープレートに細胞２０００個を塗布した。２４時間後、培地を去り、細胞をTyrode溶液で洗浄し、新鮮培地３０μLを加えた。ホタル・ルシフェラーゼの場合には、セレンテラジン (１０−4M)またはルシフェリンの５μLを加えた後、最初の測定（０時間）は、光度計で９．５ｋＶ、３０秒間行った。それから１時間から５時間後に１時間から５時間の測定を行った。
【００５７】
図６は、培地中におけるルシフェラーゼ活性の時間依存的増加を示す。ホタル・ルシフェラーゼは分泌されなかった。各ルシフェラーゼＬｕＡＬ、Ｌｕ１６４およびＬｕ２２は分泌性のルシフェラーゼである。
【００５８】
図６は、ｐｃＤＮＡ３−ＬｕＡＬ、ｐｃＤＮＡ３−Firefly、ｐｃＤＮＡ３−Ｌｕ１６４またはｐｃＤＮＡ３（ｃＤＮＡ挿入のない対照ベクター）をＣＨＯ細胞に遺伝子移入した後のＣＨＯ細胞培地（５μＬ）内ルシフェラーゼ活性を示す。（RLU＝相対光度単位；ｈ＝時間；Firefly＝ホタル・ルシフェラーゼ）
【００５９】
ルシフェラーゼ活性の温度依存性
ルシフェラーゼＬｕ２２、Ｌｕ１６４およびＬｕＡＬの温度依存性を測定するために、ＣＨＯ細胞にベクターｐｃＤＮＡ３−Ｌｕ２２、ｐｃＤＮＡ３−Ｌｕ１６４、ｐｃＤＮＡ３−ＬｕＡＬを一過性に遺伝子移入し、上清液のルシフェラーゼ活性を０℃と４７℃との間の温度で測定した。この測定のために、細胞上清液とセレンテラジン溶液とを５分間測定温度に順応させた。測定は光度計で９．５ ｋＶ、３０秒間行った。
【００６０】
図７は、ルシフェラーゼＬｕＡＬ、Ｌｕ１６４およびＬｕ２２の場合に、温度に依存して発光が測定されることを示している。ルシフェラーゼ活性についての至適温度は、ＬｕＡＬでは２７℃である。Ｌｕ１６４およびＬｕ２２の場合は、至適温度はそれぞれ２２℃ および４℃またはそれ以下であることが観測された。
【００６１】
図７は、ｐｃＤＮＡ３−ＬｕＡＬ、ｐｃＤＮＡ３−FireflyおよびｐｃＤＮＡ３−Ｌｕ１６４を遺伝子移入した後のＣＨＯ細胞培地（５μL）内温度依存性ルシフェラーゼ活性を示す。（ＲＬＵ＝相対光度単位；培地＝ＤＭＥＭ−Ｆ１２＋１０％ＦＣＳ）
【００６２】
ルシフェラーゼＬｕ１６４、ＬｕＡＬおよびＬｕ２２のＣＨＯ細胞内誘導的発現；ＬｕＡＬを例として
この実験では、ＣＨＯ細胞に、発現プラスミドｐＡＳＭ−ＬｕＡＬを一過性に遺伝子移入して真核生物での発現を誘導した。そのために、９６穴マイクロタイタープレートにウェル当りＤＭＥＭ−Ｆ１２培地中の細胞１００００個を塗布し、一夜３７℃でインキュベーションした。遺伝子移入は、製造社の指示書に従ってFugene ６キット（Ｒｏｃｈｅ社）を使用して行った。遺伝子移入した細胞は、ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地中、３７℃で一夜インキュベーションした。次に細胞をフォルスコリン（Forkolin；１０−５M）で５時間誘導した。次に、セレンテラジン（１０−4M、メタノール）を添加後、培地内および細胞溶解物内の化学発光を、９．５ｋＶ、３０秒間、光度計で測定した。
【００６３】
図８は、ＣＨＯ細胞内におけるＬｕＡＬの誘導性発現を示す。この発現は３７℃で５時間フォルスコリン（10−５M ）を用いて誘導した。この活性は、細胞上清液１０μL中で測定した（ＲＬＵ＝相対光度単位；誘導係数＝誘導ＲＬＵ対非誘導ＲＬＵの比率）。
【００６４】
受容体ＮＰＹ２および受容体Ａ２Ａおよびレポータ遺伝子にＬｕＡＬを使用するものを例としての、ルシフェラーゼＬｕ１６４、ＬｕＡＬおよびＬｕ２２の細胞系内レポータ遺伝子としての使用
細胞に基づく系でＧプロテイン共役受容体の活性化の受容体特異的リガンドによる分析を可能にするために、ルシフェラーゼＬｕＡＬのｃＤＮＡ配列を、発現ベクターｐＡＳＭｐｌｒにクローニングした。この発現ベクター、ｐＡＳＭｐｌｒは、camp−感受性のプロモータエレメント（CRE）を含み、campの細胞内濃度を間接的に測定することを可能にする。この系では、ルシフェラーゼがレポータ遺伝子として役立っている。
【００６５】
細胞系において、ルシフェラーゼＬｕ２２、Ｌｕ１６４、およびＬｕ２２をレポータ遺伝子として用いることが、Ｇプロテイン共役受容体ＮＰＹ２ (神経ペプチド受容体２) およびＡ２Ａ（アデノシン受容体２a）を例として、証明された。そのために、安定なクローンＣＨＯ−ｐＡＳＭ−ＬｕＡＬに、ベクターｐｃＤＮＡ３−ＮＰＹ２またはベクターｐｃＤＮＡ３−Ａ２Ａを一過性に遺伝子移入した。受容体ＮＰＹ２はGi−共役受容体である一方で、Ａ２Ａ受容体はＧｓ−共役受容体である。
【００６６】
Ａ２Ａ受容体は、１μＭ−ＮＥＣＡを添加して４時間活性化した。ＮＰＹ２受容体は、１０−５Mフォルスコリンの存在下に１０μM−ＮＰＹ２ペプチドを加えることによって活性化した。ルシフェラーゼ活性は、セレンテラジン（１０−４Ｍ）添加後、前記培地（３０μＬ）中、光度計で９．５ｋＶ、３０秒間測定した。
【００６７】
図９は、細胞系のためのレポータ遺伝子としてのルシフェラーゼの使用を、Gプロテイン共役受容体であるＡ２ＡおよびＮＰＹ２を一例として示すものである。（ＲＬＵ＝相対光度単位）
【００６８】
【表１３】
【００６９】
【表１４】
【００７０】
【表１５】
【００７１】
【表１６】
【００７２】
【表１７】
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】ベクターｐＴｒｉｐｌＥｘ２−ＬｕＡＬ、ｐｃＤＮＡ３−ＬｕＡＬ、およびｐＡＳＭ−ＬｕＡＬのプラスミド地図を示す。
【図２】ベクターｐＴｒｉｐｌＥｘ２−Ｌｕ１６４、ｐｃＤＮＡ３−Ｌｕ１６４、およびｐＡＳＭ−Ｌｕ１６４のプラスミド地図を示す。
【図３】ベクターｐＴｒｉｐｌＥｘ２−Ｌｕ２２、ｐｃＤＮＡ３−Ｌｕ２２、およびｐＡＳＭ−Ｌｕ２２のプラスミド地図を示す。
【図４】８．７ｋＶ、３０秒間光度計で測定した発光のグラフ（ＲＬＵ＝相対光度単位：relative light unit）とＬｕ１６４の基質になる可能性があるセレンテラジン誘導体の分子構造とを示す。
【図５】細菌発現後に観察されるルシフェラーゼＬｕ１６４（Ａ）、ＬｕＡＬ（Ｂ）、およびＬｕ２２（Ｃ）の放射スペクトル（ＲＬＵ＝相対光度単位）を示す。
【図６】ｐｃＤＮＡ３−ＬｕＡＬ、ｐｃＤＮＡ３−Firefly、ｐｃＤＮＡ３−Ｌｕ１６４またはｐｃＤＮＡ３（ｃＤＮＡ挿入のない対照ベクター）をＣＨＯ細胞に遺伝子移入した後のＣＨＯ細胞培地（５μＬ）内ルシフェラーゼ活性を示す。
【図７】ｐｃＤＮＡ３−ＬｕＡＬ、ｐｃＤＮＡ３−FireflyおよびｐｃＤＮＡ３−Ｌｕ１６４を遺伝子移入した後のＣＨＯ細胞培地（５μL）内温度依存性ルシフェラーゼ活性を示す。
【図８】ＣＨＯ細胞内におけるＬｕＡＬの誘導性発現を示す。３７℃にて５時間フォルスコリン（10−５M ）で細胞を誘導した。この活性は細胞上清液１０μL中で測定した（ＲＬＵ＝相対光度単位；誘導係数＝誘導ＲＬＵ対非誘導ＲＬＵの比率）。
【図９】Gプロテイン共役受容体であるＡ２ＡおよびＮＰＹ２を一例としての、細胞系のためのレポータ遺伝子としてのルシフェラーゼの使用を示す。
【技術分野】
【０００１】
この発明は、ルシフェラーゼＬｕＡＬ、Ｌｕ１６４、Ｌｕ１６、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ５２およびＬｕ２２のヌクレオチドおよびアミノ酸配列およびそれらの活性および使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
「ルシフェラーゼ」
発光（ルミネッセンス）は励起されたエミッター分子が引き起こす可視スペクトル範囲内の光子放射に与えられる用語である。蛍光とは対照的に、発光のエネルギーは短波長照射の形で外部から供給されるものではない。
【０００３】
化学発光と生物発光とは明確に区別されている。化学発光は、励起分子を与える化学反応に与えられた用語であって、その励起分子自体では、励起水準にある電子が正常エネルギー水準に戻る時に光を放射する。生物発光は、この反応が酵素で触媒される時に使用される用語である。この反応に関与する酵素は、一般にルシフェラーゼと呼ばれる。
【０００４】
発光生物の総説は、Hastings et al. 1995にも記載がある。
【発明の開示】
【０００５】
ルシフェラーゼは、ペルオキシダーゼであるか、またはモノオキシゲナーゼおよびジオキシゲナーゼである。この酵素の基質は光放出産物のための出発物質を形成し、ルシフェリンと呼ばれる。その基質は種毎に異なっている。この系の量子収率は、変換される基質分子当り、０．１フォトンと０．９フォトンとの間にある（Idelgaufts, 1993）。
【０００６】
ルシフェラーゼは、その起源またはその酵素的性質に基づいて分類できる。以下の表は、数型のルシフェラーゼについて全体像を示す。
【０００７】
表１ 細菌ルシフェラーゼ
【表１】
【０００８】
表２ セレンテラジン依存性真核生物ルシフェラーゼ
【表２】
【０００９】
表３ セレンテラジン非依存性真核生物ルシフェラーゼ
【表３】
【００１０】
ルシフェラーゼは、その基質特異性に基づいても相互に区別できる。最重要な基質には、セレンテラジン（Jones et al. 1999）およびルシフェリン、およびこれら二化合物の誘導体が含まれる。これら基質の図およびそのルシフェラーゼによる変換について以下に記載する。
【００１１】
「ルシフェラーゼ基質」
数種のルシフェラーゼ基質およびその変換については下記の実施例に記載する。本明細書に記載する基質は全て、光および二酸化炭素（CO2）の放出および酸素（O2）の消費を伴って、酵素的に変換される。補助因子またはエネルギー輸送体（たとえば、ホタル・ルシフェラーゼの場合のＡＴＰ）に対するこの反応の依存性は、酵素特異的である。
【００１２】
セレンテラジン
【化１】
エクオリンによるセレンテラジンからセレンテラミドへの変換であって、波長４７０ｎｍの光放射を伴う。
【００１３】
【化２】
ホタル・ルシフェラーゼによるルシフェリンからオキシルシフェリンへの変換であって、波長５６０ｎｍの光放射を伴う。
【００１４】
【化３】
ウミホタル・ルシフェリンからウミホタル・オキシルシフェリンへのウミホタル・ルシフェラーゼによる変換であって、波長４６０ｎｍの光放射を伴う。
【００１５】
「レポータシステム」
レポータ遺伝子または標識遺伝子は、ある遺伝子の遺伝子産物が単純な生化学的または組織化学的方法を使用すれば、容易に検出できるような遺伝子に、一般的に与えられる用語である。レポータ遺伝子には、少なくとも二つの型が認められている。
１）耐性遺伝子：耐性遺伝子は、その発現が抗生物質、その他、耐性遺伝子が存在しなければ細胞死を起こす物質の培養培地中における存在に対する耐性を細胞に与える遺伝子を示す用語である。
２）レポータ遺伝子：組換えＤＮＡ技術では、レポータ遺伝子の産物は融合標識または非融合標識として使用される。最も通常のレポータ遺伝子には、ベータガラクトシダーゼ（Alam et al. 1990）、アルカリフォスファターゼ（Yang et al. 1997；Cullen et al. 1992）、ルシフェラーゼおよびその他のフォトプロテイン（Shimomura, 1985; Philips GN, 1997; Snowdowne et al. 1984）が含まれる。
【００１６】
「Metridia longa種の分類」
節足動物門→→甲殻綱→→櫂脚類
Metridia longa 種は甲殻綱、特に櫂脚類または動物プランクトンに属する。
【００１７】
「ｃＤＮＡの単離」
Metridia longa 種の生物発光活性を研究するため、白海で標本を採集し（カルテシュ（Kartesh）生物学研究所、ロシア）、液体窒素中に保存した。Metridia longaのｃＤＮＡライブラリーを調製するため、イソチオシアネートを用いるKrieg（Krieg et al. 1996）の方法により、ＲＮＡを単離した。
【００１８】
ｃＤＮＡは、ＲＴ−ＰＣＴ法で調製した。そのために、ＲＮＡ１０μｇと逆転写酵素（Superscript Gold II）とを次の方式でインキュベーションした。
【００１９】
ＰＣＲ １． ３０秒 ９５℃
２． ６分 ６８℃
３． １０秒 ９５℃
４． ６分 ６８℃
段階３、段階４： １７サイクル
【００２０】
ポリメラーゼを不活化するため、反応産物とプロテイナーゼＫとを、３７℃で３０分間インキュベーションし、ｃＤＮＡをエタノールで沈降させた。ｃＤＮＡを水に溶解し、ＳｆｉＩとともに３７℃で１時間インキュベーションした。反応産物をゲル濾過に付して、小さな断片を分離除去した。次にこの分画したｃＤＮＡをＳｆｉＩ断片と脱リン酸化λＴｒｉｐｌＥｘ２ベクターとに結合した。λファージの発現ライブラリーを調製するために、次にin vitro パッケージングシステムにＳＭＡＲＴ・ｃＤＮＡライブラリー組立てキット（Clontech社）を用いて、クローニングしたｃＤＮＡ断片をλファージにパッケージした。
【００２１】
セレンテラジン依存性ルシフェラーゼを発現する可能性のあるｃＤＮＡ挿入体を含む組換えファージは、ライブラリースクリーニングを行うことによって確認した。
【００２２】
そのために、E. coli XL1-Blueを含む菌叢を９０mm培養皿に塗布し、３７℃で１０時間インキュベーションした。これを、培養皿当り２５００ファージに感染させ、続いてこれを８時間３７℃でインキュベーションして、プラークを形成させた。続いて培養皿を４℃に１時間放置して軟い寒天を固化させた。
【００２３】
レプリカ平板培養を行うために、ニトロセルロース膜をE. coli XL1-Blue懸濁液で飽和した後、乾燥した。乾燥した膜をファージプラークに６０秒間載せた後、新しい寒天プレート上に載せた。続いて、この寒天プレートを３７℃で２時間インキュベーションし、ＳＯＢ培地（＋１０mM−MgSO4、０．２％マルトース）を４ml添加した。この菌叢を脱着し、ＬＢ培地（＋２０mm−ＩＰＴＧ）に再懸濁し、３７℃で１時間インキュベーションした。細菌を遠心分離で収集し、超音波で破砕し、セレンテラジンを添加した後に、光度計で生物発光活性を測定した。
【００２４】
陽性の生物発光シグナルを示す培養プレートをセクターに分け、新たなレプリカ培養を行った。レプリカ培養は、個々の活性なプラークが確認されるまで続行した。陽性プラーク内にあるファージに、ｃＤＮＡ挿入物をサブクローニングするために[lacuna]、E. coli BM25.8株内のｐＴｒｉｐｌＥｘ２ベクターにＳＭＡＲＴ・ｃＤＮＡライブラリー組立てキットを製造社の指示書に従って使用してサブクローニングを行った。このｐＴｒｉｐｌＥｘ２・ｃＤＮＡをトランスフェクトしたE. coli を１００μg／ml濃度のアンピシリンを含有するＬＢ培地中、一夜３７℃でインキュベーションした。オーバーエクスプレッションを達成するために、一夜培養物をＬＢ培地で１：１５０に希釈し、３７℃で１時間インキュベーションした。次に、ＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）を最終濃度２０mMになるように加えることによって、インダクションを行った。誘導された培養物を３７℃で１時間インキュベーションし、細菌を遠心分離によって収集した。この細胞をＳＭ緩衝液０．５ml中、超音波で破砕した。セレンテラジン（１０−4M、メタノール）１０μLを添加した後に光度計で化学発光を測定した。
【００２５】
セレンテラジン依存性ルシフェラーゼ活性を示すルシフェラーゼ３種を確認した。このルシフェラーゼをそれぞれＬｕ１６４、ＬｕＡＬ、Ｌｕ２２と命名した。これらルシフェラーゼについては、以下に詳記する。
【００２６】
本発明は、このルシフェラーゼ３種の機能的等価物も包含する。機能的等価物とは、類似の基質スペクトルを持ち、分泌され、さらに少なくとも７０％の相同性があるルシフェラーゼである。８０％または９０％の相同性は、好適である。９５％の相同性は殊に好適である。
【００２７】
このルシフェラーゼは、細胞系、特に受容体、イオンチャネル、トランスポータ、転写因子または誘導系のためのレポータ遺伝子としての使用に適する。
【００２８】
このルシフェラーゼは、例えば力価測定のために、または生化学系、特にプロテイナーゼのための基質として、細菌系内で使用できる。
【００２９】
このルシフェラーゼは、たとえば、ELISA、免疫組織化学またはウェスタンブロッティングのために、抗体、その他のタンパク質に結合したレポータ酵素としても使用できる。
【００３０】
このルシフェラーゼは、BRET系（生物発光共鳴エネルギー遷移系）の中でも使用できる。
【００３１】
このルシフェラーゼは、共焦点顕微鏡術のための、またはタンパク質−タンパク質相互作用の分析のための、融合タンパク質としての使用にも適している。
【００３２】
このルシフェラーゼは、たとえばＥＬＩＳＡまたは固定などのために、ビオチン、ＮＨＳ、ＢｒＣＮまたはその他の結合メディエータと結合したレポータ酵素としても使用できる。
【００３３】
このルシフェラーゼは、さらに、たとえばノーザンおよびサザンブロッティングまたは実時間ＰＣＲなどのために、ＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドと結合したレポータ酵素としても使用できる。
【００３４】
本発明はまた、野生型としてまたはタグタンパク質としての本ルシフェラーゼの精製に関し、さらに生体内翻訳系内におけるルシフェラーゼの使用に関する。
【００３５】
ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列
ＬｕＡＬ
ルシフェラーゼＬｕＡＬは、分子量２３．７ｋＤａ、等電点８．３２を有するタンパク質である。このコード化ヌクレオチド配列は以下のとおり：
【表４】
であり、これから次表のアミノ酸配列：
【表５】
、および次表のアミノ酸組成：
【表６】
が導かれる。
【００３６】
Ｌｕ１６４
ルシフェラーゼＬｕ１６４は、分子量２３．８ｋＤａ、等電点７．８１を有するタンパク質である。このコード化ヌクレオチド配列は次のとおり：
【表７】
であり、これから次表のアミノ酸配列：
【表８】
および次表のアミノ酸組成：
【表９】
が導かれる。
【００３７】
Ｌｕ２２
ルシフェラーゼＬｕ２２は、分子量２０．２ｋＤａ、等電点７．８９を有するタンパク質である。このコード化ヌクレオチド配列は次のとおり：
【表１０】
であり、これから次表のアミノ酸配列：
【表１１】
、および次表のアミノ酸組成：
【表１２】
が導かれる。
【００３８】
これらの配列は配列表にも記載する。
【００３９】
ルシフェラーゼの酵素活性および生化学的特性
タンパク質ＬｕＡＬ、Ｌｕ１６４およびＬｕ２２は酵素であって、セレンテラジンを変換する時に光を放射する。それ故、いずれもルシフェラーゼ群に属する。ルシフェラーゼは、細菌および真核生物細胞の双方において有効に発現させることができる。真核生物細胞にて発現させるルシフェラーゼＬｕＡＬ、Ｌｕ１６４およびＬｕ２２は分泌される。細菌で発現すると、分泌は起きない。
【００４０】
ルシフェラーゼの活性は、温度依存的である。ルシフェラーゼＬｕＡＬおよびＬｕ１６４の至適温度は、各々２２℃ （ＬｕＡＬ）、２７℃（Ｌｕ１６４）と測定されている。ルシフェラーゼＬｕ２２活性の至適温度は、４℃またはそれ以下である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
実施例
プラスミド／組立て物
以下に記載する組立て物を製造するために使用するベクターは、Clontech社のベクターpcDNA3.1（+）とpTriplEx2、およびベクター pASMplr（cAMP感受性プロモータエレメント：creを有する当社内組立て物）であった。このベクターの誘導体は、pcDNA3−x、pTriplEx2−x およびpASM−xと命名した。
【００４２】
ＬｕAL
図１は、ベクターｐＴｒｉｐｌＥｘ２−ＬｕＡＬ、ｐｃＤＮＡ３−ＬｕＡＬ、およびｐＡＳＭ−ＬｕＡＬのプラスミド地図を示す。
【００４３】
図２は、ベクターｐＴｒｉｐｌＥｘ２−Ｌｕ１６４、ｐｃＤＮＡ３−Ｌｕ１６４、およびｐＡＳＭ−Ｌｕ１６４のプラスミド地図を示す。
【００４４】
図３は、ベクターｐＴｒｉｐｌＥｘ２−Ｌｕ２２、ｐｃＤＮＡ３−Ｌｕ２２、およびｐＡＳＭ−Ｌｕ２２のプラスミド地図を示す。
【００４５】
Ｌｕ１６４の基質としてのセレンテラジン誘導体
Ｌｕ１６４の基質を確認するために、各種セレンテラジン誘導体の１０μL溶液（10−4M）を、各々ＣＨＯ−ｐｃＤＮＡ３−Ｌｕ１６４細胞系列からの上清液１０μLとともに、インキュベーションし、発光を測定した。各セレンテラジンは、Molecular Probes社（米国）から購入した。
【００４６】
ルシフェラーゼＬｕＡＬおよびＬｕ２２の場合には、ルシフェラーゼＬｕ１６４と比較して相違点が見当らなかった。未修飾セレンテラジン (図Ｂ、セレンテラジンａ) が、Ｌｕ１６４、ＬｕＡＬおよびＬｕ２２のための至適基質であることが確認された。
【００４７】
図４は、Ｌｕ１６４の基質になる可能性があるセレンテラジン誘導体を示し、ここに、８．７ｋＶ、３０秒間光度計で測定した発光のグラフ（ＲＬＵ＝相対光度単位：relative light unit）とセレンテラジン誘導体の分子構造とを示す。
【００４８】
セレンテラジンに依存するルシフェラーゼＬｕ１６４、ＬｕＡＬ、およびＬｕ２２の酵素活性
細菌での発現
細菌発現は、この細菌を発現プラスミドｐＴｒｉｐｌＥｘ２−Ｌｕ１６４、 ｐＴｒｉｐｌＥｘ２−ＬｕＡＬ、およびｐＴｒｉｐｌＥｘ２−Ｌｕ２２で形質転換した結果として、E. coli のBL21 (DE3) 株内で行った。形質転換した細菌をＬＢ培地中、３７℃で３時間インキュベーションし、１ｍＭ最終濃度になるようにＩＰＴＧを加えて４時間、発現を誘導した。誘導された細菌を、遠心分離で収集し、ＰＢＳに再懸濁し、超音波で破砕した。セレンテラジン（１０−４Ｍ、メタノール）、またはルシフェリン（ホタル・ルシフェリン）を溶解液５μＬ（５ｍｇ／ｍＬ）に加え、化学発光を測定した。
【００４９】
測定は、ＲＬＵ（相対光度単位）によって９．５ｋＶ、３０秒間行った。Ｌｕ１６４、ＬｕＡＬ、Ｌｕ２２の各々の場合に、ＲＬＵの測定値２３００００、３２００００および２６００００が得られた。これら酵素を、各ベクターｐＴｒｉｐｌＥｘ２−Ｌｕ１６４、ｐＴｒｉｐｌＥｘ２−ＬｕＡＬおよびｐＴｒｉｐｌＥｘ２−Ｌｕ２２を用いて、E. coli のBL21（DE3）株内で発現した。
【００５０】
真核生物での発現
構成的真核生物発現は、一過性の実験で発現プラスミドpcDNA３−Ｌｕ１６４、pcDNA３−ＬｕＡＬおよびpcDNA３−Ｌｕ２２で細胞を形質転換することによってＣＨＯ細胞内で行った。そのために、９６穴マイクロタイタープレートの各ウェルに、ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地中の細胞１００００個を塗布し、３７℃で一夜インキュベーションした。このトランスフェクションは、製造社の指示書に従い、Fugene６キット（Roche社）を使用して行った。遺伝子移入を受けた細胞をDMEM−F１２培地中、３７℃で一夜インキュベーションした。セレンテラジン（10−4M、メタノール）添加後、培地（５μL）と細胞溶解液（５μL）の化学発光を室温、９．５ｋＶ、３０秒間光度計で測定した。
【００５１】
Ｌｕ１６４、ＬｕＡＬおよびＬｕ２２の場合に、各々測定値６８００００、６７００００及び５１００００RLU(相対光度単位)の値が得られた。発現は、ベクターｐｃＤＮＡ３−Ｌｕ１６４、ｐｃＤＮＡ３−ＬｕＡＬおよびｐｃＤＮＡ３−Ｌｕ２２を使用してCHO細胞内で行った。
【００５２】
ルシフェラーゼＬｕ１６４、 ＬｕＡＬおよびＬｕ２２の放射スペクトル
放射スペクトルを測定するために、E. coli のBL21（DE3）株細胞をプラスミドｐＴｒｉｐｌＥｘ２−Ｌｕ１６４、ｐＴｒｉｐｌＥｘ２−ＬｕＡＬおよび ｐＴｒｉｐｌＥｘ２−Ｌｕ２２で形質転換し、前記３．１に記載のようにしてオーバーエクスプレッションした。細菌溶解液１００μL容にセレンテラジン（10−4M；５０μL）を添加し、放射スペクトルを測定した。各ルシフェラーゼが発する放射スペクトルのグラフを以下に記載する。
【００５３】
ルシフェラーゼＬｕ１６４、ＬｕＡＬおよびＬｕ２２の場合には、基質の形質転換に起因する最大放射は、波長約４９０ｎｍに起きた。
【００５４】
図５は、細菌発現後に観察されるルシフェラーゼＬｕ１６４（Ａ）、ＬｕＡＬ（Ｂ）、およびＬｕ２２（Ｃ）の放射スペクトル（ＲＬＵ＝相対光度単位）を示す。
【００５５】
Ｌｕ１６４およびＬｕＡＬを例としての、ＣＨＯ細胞からのルシフェラーゼＬｕ１６４、ＬｕＡＬおよびＬｕ２２の分泌
真核生物細胞内でのルシフェラーゼＬｕ１６４、ＬｕＡＬおよびＬｕ２２の発現を特徴付けるために、ＣＨＯ細胞にプラスミドｐｃＤＮＡ３−ＬｕＡＬ、ｐｃＤＮＡ３−Ｌｕ１６４およびｐｃＤＮＡ３−Fireluc、およびｐｃＤＮＡ３．１（＋）を安定的に遺伝子移入した。得られたクローンは、ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地中で培養した。ホタル・ルシフェラーゼは、非分泌性ルシフェラーゼの陽性対照として使用した。プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）は、ＣＨＯ親細胞の内因性活性があれば検出するための対照プラスミドとして使用した。
【００５６】
ルシフェラーゼの分泌を検出するために、３８４穴マイクロタイタープレートに細胞２０００個を塗布した。２４時間後、培地を去り、細胞をTyrode溶液で洗浄し、新鮮培地３０μLを加えた。ホタル・ルシフェラーゼの場合には、セレンテラジン (１０−4M)またはルシフェリンの５μLを加えた後、最初の測定（０時間）は、光度計で９．５ｋＶ、３０秒間行った。それから１時間から５時間後に１時間から５時間の測定を行った。
【００５７】
図６は、培地中におけるルシフェラーゼ活性の時間依存的増加を示す。ホタル・ルシフェラーゼは分泌されなかった。各ルシフェラーゼＬｕＡＬ、Ｌｕ１６４およびＬｕ２２は分泌性のルシフェラーゼである。
【００５８】
図６は、ｐｃＤＮＡ３−ＬｕＡＬ、ｐｃＤＮＡ３−Firefly、ｐｃＤＮＡ３−Ｌｕ１６４またはｐｃＤＮＡ３（ｃＤＮＡ挿入のない対照ベクター）をＣＨＯ細胞に遺伝子移入した後のＣＨＯ細胞培地（５μＬ）内ルシフェラーゼ活性を示す。（RLU＝相対光度単位；ｈ＝時間；Firefly＝ホタル・ルシフェラーゼ）
【００５９】
ルシフェラーゼ活性の温度依存性
ルシフェラーゼＬｕ２２、Ｌｕ１６４およびＬｕＡＬの温度依存性を測定するために、ＣＨＯ細胞にベクターｐｃＤＮＡ３−Ｌｕ２２、ｐｃＤＮＡ３−Ｌｕ１６４、ｐｃＤＮＡ３−ＬｕＡＬを一過性に遺伝子移入し、上清液のルシフェラーゼ活性を０℃と４７℃との間の温度で測定した。この測定のために、細胞上清液とセレンテラジン溶液とを５分間測定温度に順応させた。測定は光度計で９．５ ｋＶ、３０秒間行った。
【００６０】
図７は、ルシフェラーゼＬｕＡＬ、Ｌｕ１６４およびＬｕ２２の場合に、温度に依存して発光が測定されることを示している。ルシフェラーゼ活性についての至適温度は、ＬｕＡＬでは２７℃である。Ｌｕ１６４およびＬｕ２２の場合は、至適温度はそれぞれ２２℃ および４℃またはそれ以下であることが観測された。
【００６１】
図７は、ｐｃＤＮＡ３−ＬｕＡＬ、ｐｃＤＮＡ３−FireflyおよびｐｃＤＮＡ３−Ｌｕ１６４を遺伝子移入した後のＣＨＯ細胞培地（５μL）内温度依存性ルシフェラーゼ活性を示す。（ＲＬＵ＝相対光度単位；培地＝ＤＭＥＭ−Ｆ１２＋１０％ＦＣＳ）
【００６２】
ルシフェラーゼＬｕ１６４、ＬｕＡＬおよびＬｕ２２のＣＨＯ細胞内誘導的発現；ＬｕＡＬを例として
この実験では、ＣＨＯ細胞に、発現プラスミドｐＡＳＭ−ＬｕＡＬを一過性に遺伝子移入して真核生物での発現を誘導した。そのために、９６穴マイクロタイタープレートにウェル当りＤＭＥＭ−Ｆ１２培地中の細胞１００００個を塗布し、一夜３７℃でインキュベーションした。遺伝子移入は、製造社の指示書に従ってFugene ６キット（Ｒｏｃｈｅ社）を使用して行った。遺伝子移入した細胞は、ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地中、３７℃で一夜インキュベーションした。次に細胞をフォルスコリン（Forkolin；１０−５M）で５時間誘導した。次に、セレンテラジン（１０−4M、メタノール）を添加後、培地内および細胞溶解物内の化学発光を、９．５ｋＶ、３０秒間、光度計で測定した。
【００６３】
図８は、ＣＨＯ細胞内におけるＬｕＡＬの誘導性発現を示す。この発現は３７℃で５時間フォルスコリン（10−５M ）を用いて誘導した。この活性は、細胞上清液１０μL中で測定した（ＲＬＵ＝相対光度単位；誘導係数＝誘導ＲＬＵ対非誘導ＲＬＵの比率）。
【００６４】
受容体ＮＰＹ２および受容体Ａ２Ａおよびレポータ遺伝子にＬｕＡＬを使用するものを例としての、ルシフェラーゼＬｕ１６４、ＬｕＡＬおよびＬｕ２２の細胞系内レポータ遺伝子としての使用
細胞に基づく系でＧプロテイン共役受容体の活性化の受容体特異的リガンドによる分析を可能にするために、ルシフェラーゼＬｕＡＬのｃＤＮＡ配列を、発現ベクターｐＡＳＭｐｌｒにクローニングした。この発現ベクター、ｐＡＳＭｐｌｒは、camp−感受性のプロモータエレメント（CRE）を含み、campの細胞内濃度を間接的に測定することを可能にする。この系では、ルシフェラーゼがレポータ遺伝子として役立っている。
【００６５】
細胞系において、ルシフェラーゼＬｕ２２、Ｌｕ１６４、およびＬｕ２２をレポータ遺伝子として用いることが、Ｇプロテイン共役受容体ＮＰＹ２ (神経ペプチド受容体２) およびＡ２Ａ（アデノシン受容体２a）を例として、証明された。そのために、安定なクローンＣＨＯ−ｐＡＳＭ−ＬｕＡＬに、ベクターｐｃＤＮＡ３−ＮＰＹ２またはベクターｐｃＤＮＡ３−Ａ２Ａを一過性に遺伝子移入した。受容体ＮＰＹ２はGi−共役受容体である一方で、Ａ２Ａ受容体はＧｓ−共役受容体である。
【００６６】
Ａ２Ａ受容体は、１μＭ−ＮＥＣＡを添加して４時間活性化した。ＮＰＹ２受容体は、１０−５Mフォルスコリンの存在下に１０μM−ＮＰＹ２ペプチドを加えることによって活性化した。ルシフェラーゼ活性は、セレンテラジン（１０−４Ｍ）添加後、前記培地（３０μＬ）中、光度計で９．５ｋＶ、３０秒間測定した。
【００６７】
図９は、細胞系のためのレポータ遺伝子としてのルシフェラーゼの使用を、Gプロテイン共役受容体であるＡ２ＡおよびＮＰＹ２を一例として示すものである。（ＲＬＵ＝相対光度単位）
【００６８】
【表１３】
【００６９】
【表１４】
【００７０】
【表１５】
【００７１】
【表１６】
【００７２】
【表１７】
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】ベクターｐＴｒｉｐｌＥｘ２−ＬｕＡＬ、ｐｃＤＮＡ３−ＬｕＡＬ、およびｐＡＳＭ−ＬｕＡＬのプラスミド地図を示す。
【図２】ベクターｐＴｒｉｐｌＥｘ２−Ｌｕ１６４、ｐｃＤＮＡ３−Ｌｕ１６４、およびｐＡＳＭ−Ｌｕ１６４のプラスミド地図を示す。
【図３】ベクターｐＴｒｉｐｌＥｘ２−Ｌｕ２２、ｐｃＤＮＡ３−Ｌｕ２２、およびｐＡＳＭ−Ｌｕ２２のプラスミド地図を示す。
【図４】８．７ｋＶ、３０秒間光度計で測定した発光のグラフ（ＲＬＵ＝相対光度単位：relative light unit）とＬｕ１６４の基質になる可能性があるセレンテラジン誘導体の分子構造とを示す。
【図５】細菌発現後に観察されるルシフェラーゼＬｕ１６４（Ａ）、ＬｕＡＬ（Ｂ）、およびＬｕ２２（Ｃ）の放射スペクトル（ＲＬＵ＝相対光度単位）を示す。
【図６】ｐｃＤＮＡ３−ＬｕＡＬ、ｐｃＤＮＡ３−Firefly、ｐｃＤＮＡ３−Ｌｕ１６４またはｐｃＤＮＡ３（ｃＤＮＡ挿入のない対照ベクター）をＣＨＯ細胞に遺伝子移入した後のＣＨＯ細胞培地（５μＬ）内ルシフェラーゼ活性を示す。
【図７】ｐｃＤＮＡ３−ＬｕＡＬ、ｐｃＤＮＡ３−FireflyおよびｐｃＤＮＡ３−Ｌｕ１６４を遺伝子移入した後のＣＨＯ細胞培地（５μL）内温度依存性ルシフェラーゼ活性を示す。
【図８】ＣＨＯ細胞内におけるＬｕＡＬの誘導性発現を示す。３７℃にて５時間フォルスコリン（10−５M ）で細胞を誘導した。この活性は細胞上清液１０μL中で測定した（ＲＬＵ＝相対光度単位；誘導係数＝誘導ＲＬＵ対非誘導ＲＬＵの比率）。
【図９】Gプロテイン共役受容体であるＡ２ＡおよびＮＰＹ２を一例としての、細胞系のためのレポータ遺伝子としてのルシフェラーゼの使用を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ルシフェラーゼＬｕＡＬ、Ｌｕ１６４、Ｌｕ１６、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ５２またはＬｕ２２またはそれらの機能的等価物の配列を有する、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子。
【請求項２】
該配列がその５’側に位置する機能的プロモーターを含む、請求項１に記載の分子。
【請求項３】
組換えＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターの一成分である、請求項２に記載の分子。
【請求項４】
請求項３に記載のベクターを有する生物。
【請求項５】
該ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列と同一または相補的な、１０個以上の連続したヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１に記載のヌクレオチド配列によってコードされるペプチド。
【請求項７】
Ｌｕ１６４、ＬｕＡＬまたはＬｕ２２に対する抗体によって免疫学的に認識される、５個以上の連続したアミノ酸を含む、ペプチド。
【請求項８】
請求項１から６までに記載したルシフェラーゼの、細胞系用レポータ遺伝子としての、使用。
【請求項１】
ルシフェラーゼＬｕＡＬ、Ｌｕ１６４、Ｌｕ１６、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ５２またはＬｕ２２またはそれらの機能的等価物の配列を有する、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子。
【請求項２】
該配列がその５’側に位置する機能的プロモーターを含む、請求項１に記載の分子。
【請求項３】
組換えＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターの一成分である、請求項２に記載の分子。
【請求項４】
請求項３に記載のベクターを有する生物。
【請求項５】
該ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列と同一または相補的な、１０個以上の連続したヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１に記載のヌクレオチド配列によってコードされるペプチド。
【請求項７】
Ｌｕ１６４、ＬｕＡＬまたはＬｕ２２に対する抗体によって免疫学的に認識される、５個以上の連続したアミノ酸を含む、ペプチド。
【請求項８】
請求項１から６までに記載したルシフェラーゼの、細胞系用レポータ遺伝子としての、使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２００８−５４６８９（Ｐ２００８−５４６８９Ａ）
【公開日】平成２０年３月１３日（２００８．３．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２６４４９２（Ｐ２００７−２６４４９２）
【出願日】平成１９年１０月１０日（２００７．１０．１０）
【分割の表示】特願２００２−５４５１７５（Ｐ２００２−５４５１７５）の分割
【原出願日】平成１３年１１月２２日（２００１．１１．２２）
【出願人】（５０３４１２１４８）バイエル・ヘルスケア・アクチェンゲゼルシャフト (206)
【氏名又は名称原語表記】Ｂａｙｅｒ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ ＡＧ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年３月１３日（２００８．３．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１０月１０日（２００７．１０．１０）
【分割の表示】特願２００２−５４５１７５（Ｐ２００２−５４５１７５）の分割
【原出願日】平成１３年１１月２２日（２００１．１１．２２）
【出願人】（５０３４１２１４８）バイエル・ヘルスケア・アクチェンゲゼルシャフト (206)
【氏名又は名称原語表記】Ｂａｙｅｒ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ ＡＧ
【Ｆターム（参考）】
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