卵巣癌の検出方法、及び抑制方法
【課題】卵巣癌におけるゲノム構造の変化を指標として、卵巣癌の悪性度を含めて検出する手段を提供すること。
【解決手段】卵巣癌におけるゲノム構造の変化を指標として卵巣癌の悪性度を含めた検出を可能にすることを見出した。また、本発明は、卵巣癌において、遺伝子の不活性化を回復することにより、卵巣癌の増殖を抑制することも見出した。
【解決手段】卵巣癌におけるゲノム構造の変化を指標として卵巣癌の悪性度を含めた検出を可能にすることを見出した。また、本発明は、卵巣癌において、遺伝子の不活性化を回復することにより、卵巣癌の増殖を抑制することも見出した。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、卵巣癌をその遺伝子型を観察することで初期に診断することを目的として、特定の染色体領域に存在する遺伝子の変化を検出することによって癌を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
卵巣癌［ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ（ＯＣ）］は、５０〜７０歳の女性に最も多く発生し、婦人科癌の中では２番目に多い癌であり、死亡数は他の婦人科癌よりも多いことが知られている。卵巣癌には様々な種類があり、それぞれ卵巣中の異なる種類の細胞から発生するが、卵巣癌の約８０％以上は卵巣表面に発生する上皮癌である。
【０００３】
近年、卵巣癌のための診断と治療の手順は進歩しているにも関わらず、いまだ、早期診断は困難なままとなっている。このため、卵巣癌における原因遺伝子を見つけ出し、その機能を解明することは、効果的な治療、診断マーカーの探索、化学的予防のための新しい戦略の知見を築くためにも強く望まれている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
卵巣由来、主に卵巣上皮由来細胞の癌化についての遺伝子レベルでのメカニズムが解明されれば、遺伝子レベルにおける卵巣由来細胞の癌化の発見や、卵巣癌の悪性度の診断、進行の抑制をおこなうことが可能となり、さらに、メカニズムに基づく薬剤の選別、開発や治療法の確立が可能となるはずである。具体的には、卵巣癌に特徴的な挙動を示す遺伝子を同定して、遺伝子を中心とした技術的検討をおこなうことにより、この課題を解決することができると考えられる。即ち、本発明は、卵巣癌などの癌に特徴的な挙動を示す遺伝子を同定して癌の検出方法及び細胞増殖抑制剤を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ （ＣＧＨ）はゲノム上で多数の遺伝子増幅並びに欠失、あるいは遺伝子の不活性化に伴う遺伝子異常を解析するためには、簡便で迅速であり、最良の方法である。そして、癌化並びに癌の悪性化などに関与するゲノム上の遺伝子異常を解析するためにＣＧＨアレイに搭載する８００種類のＢＡＣ/ＰＡＣ ＤＮＡを選別する（ＭＣＧ ＣａｎｃｅｒＡｒｒａｙ-８００；Ｔａｋａｄａ Ｈ．， ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ．９６，１００−１０５，２００５）ことにより、卵巣由来の細胞の癌化を促進する癌関連遺伝子、すなわち、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＣＴＧＦ）遺伝子の同定に成功した。そして、ＣＴＧＦ遺伝子の欠失、または不活性化、すなわち、ＣＴＧＦ蛋白質の減少が卵巣癌の増殖を顕著に促進すること、また、ＣＴＧＦ遺伝子の転写産物または蛋白質を増加させると卵巣癌の増殖が著しく低下することを見出すことに成功し、本発明を完成した。
【０００６】
即ち、本発明によれば、検体において、２ｑ１４．２、３ｐ２４．１、３ｑ２６．２、３ｑ２９、４ｑ３４．２、６ｑ２３、９ｐ２１．３、１１ｑ１３．３、１３ｑ２２．１、１３ｑ３３．１、１３ｑ３３．３、１５ｑ１２、１５ｑ１５．１、１７ｐ１２、１７ｐ１３．１、１７ｐ１３．３、１８ｑ２１．１、１８ｑ２１．２、１８ｑ２１．３１、１８ｑ２１．３２、１８ｑ２１．３３、１８ｑ２３、２０ｑ１３．１３、２０ｑ１３．２、２０ｑ１３．３１、２０ｑ１３．３３、Ｘｐ１１．２３、Ｘｐ１３．１、Ｘｐ１３．３、Ｘｐ２６．２、Ｘｐ２６．３、Ｘｑ２８の染色体領域に存在する遺伝子の変化を少なくとも１つ以上を検出することにより、検体の悪性度を含めた癌化を検出する、癌の検出方法が提供される。
【０００７】
好ましくは、遺伝子はＧＬＩ２、ＣＣＮＤ１、ＦＧＦ３、ＴＧＦＢＲ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＴＡＰ、ＳＭＡＤ４、ＥＶＩ１、ＭＵＣ４、ＰＴＰＮ１、ＺＮＦ２１７、ＢＣＡＳ１、ＴＦＡＰ２Ｃ、ＢＩＲＣ７、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ、ＶＥＧＦＣ、ＫＬＦ１２、ＦＧＦ１４、ＥＦＮＢ２、ＧＡＢＲＢ３、ＲＡＤ５１、ＲＨ６８６２１、ＰＭＰ２２、ＲＣＶ１、ＨＳＸＩＡＰＡＦ１、ＡＢＲ、ＨＩＣ１、ＭＡＤＨ４（ＳＭＡＤ４）、ＤＣＣ、ＭＡＬＴ１、ＧＲＰ、ＳＥＲＰＩＮＢ５、ＦＶＴ１、ＢＣＬ２、ＳＥＲＰＩＮＢ３、ＢＣＬ２、ＣＴＤＰ１、ＳＨＧＣ−１４５８２０、ＳＳＸ１、ＡＲ、ＭＬＬＴ７、ＡＢＣＢ７、ＧＰＣ３、ＦＧＦ１３、ＭＡＧＥＡ２、ＫＩＡＡ１９１３、ＥＰＢ４２Ｌ２、ＡＫＡＰ７、ＣＲＳＰ３、ＡＲＧ１、ＥＮＰＰ３、ＥＮＰＰ１、ＣＴＧＦの少なくとも１つ以上である。
【０００８】
好ましくは、遺伝子の変化は、増幅、欠失、不活性化の少なくとも１つ以上である。
好ましくは、遺伝子の変化は、ＣｐＧアイランドのメチル化による不活性化である。
好ましくは、検体において、請求項２に記載の遺伝子から翻訳される蛋白質の量を検出することにより、検体の悪性度を含めた癌化を検出する。
好ましくは、蛋白質の量を免疫組織化学的法により検出する。
好ましくは、ＣＴＧＦ遺伝子の欠失又は不活性化を検出することにより、検体の悪性度を含めた癌化を検出する。
【０００９】
好ましくは、検体は、卵巣由来の組織である。
好ましくは、癌は、卵巣癌である。
好ましくは、遺伝子の変化を、ＤＮＡチップ法、サザンブロット法、ノーザンブロット法、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法、ＦＩＳＨ法、ＣＧＨ法、または、アレイＣＧＨ法、Ｂｓｕｌｆｉｔｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ法、ＣＯＢＲＡ法を用いて検出する。
【００１０】
さらに本発明によれば、ＫＩＡＡ１９１３、ＥＰＢ４２Ｌ２、ＡＫＡＰ７、ＣＲＳＰ３、ＡＲＧ１、ＥＮＰＰ３、ＥＮＰＰ１、ＣＴＧＦ遺伝子、または、該遺伝子の発現産物である蛋白質をインビトロで細胞に導入することを含む、細胞の増殖を抑制する方法が提供される。
さらに本発明によれば、ＫＩＡＡ１９１３、ＥＰＢ４２Ｌ２、ＡＫＡＰ７、ＣＲＳＰ３、ＡＲＧ１、ＥＮＰＰ３、ＥＮＰＰ１、ＣＴＧＦ遺伝子、または、該遺伝子の発現産物である蛋白質を含む、細胞増殖抑制剤が提供される。
さらに本発明によれば、ＫＩＡＡ１９１３、ＥＰＢ４２Ｌ２、ＡＫＡＰ７、ＣＲＳＰ３、ＡＲＧ１、ＥＮＰＰ３、ＥＮＰＰ１、ＣＴＧＦ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは機能欠失型遺伝子を、インビトロで腫瘍細胞に導入することを含む、細胞の増殖を活性化する方法が提供される。
さらに本発明によれば、ＫＩＡＡ１９１３、ＥＰＢ４２Ｌ２、ＡＫＡＰ７、ＣＲＳＰ３、ＡＲＧ１、ＥＮＰＰ３、ＥＮＰＰ１、ＣＴＧＦ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは機能欠失型遺伝子を含む、細胞増殖活性化剤が提供される。
【００１１】
さらに本発明によれば、ＫＩＡＡ１９１３、ＥＰＢ４２Ｌ２、ＡＫＡＰ７、ＣＲＳＰ３、ＡＲＧ１、ＥＮＰＰ３、ＥＮＰＰ１、ＣＴＧＦ遺伝子のＣｐＧアイランドのメチル化に起因して遺伝子の発現が抑制されている卵巣癌に対して、被験物質を接触させて、遺伝子の発現を検出し、遺伝子発現が被験物質を接触させない系よりも増加していた場合に、被験物質を、遺伝子のＣｐＧアイランドの脱メチル化により遺伝子を活性化させることができる抗腫瘍物質として選別する、物質のスクリーニング法が提供される。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、卵巣由来の細胞検体における癌化、悪性度を的確に把握することが可能となった。また、卵巣癌において、遺伝子発現を不活性化するＣＴＧＦ遺伝子の転写産物を導入することにより、卵巣癌の増殖を抑制することができる。また、ＣＴＧＦ遺伝子の発現が不活性化することにより発生する卵巣癌の治療剤のスクリーニングをおこなうことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
（１）癌の検出方法
本発明による癌の検出方法は、検体において、２ｑ１４．２、３ｐ２４．１、３ｑ２６．２、３ｑ２９、４ｑ３４．２、６ｑ２３、９ｐ２１．３、１１ｑ１３．３、１３ｑ２２．１、１３ｑ３３．１、１３ｑ３３．３、１５ｑ１２、１５ｑ１５．１、１７ｐ１２、１７ｐ１３．１、１７ｐ１３．３、１８ｑ２１．１、１８ｑ２１．２、１８ｑ２１．３１、１８ｑ２１．３２、１８ｑ２１．３３、１８ｑ２３、２０ｑ１３．１３、２０ｑ１３．２、２０ｑ１３．３１、２０ｑ１３．３３、Ｘｐ１１．２３、Ｘｐ１３．１、Ｘｐ１３．３、Ｘｐ２６．２、Ｘｐ２６．３、Ｘｑ２８の染色体領域に存在する遺伝子の変化を少なくとも１つ以上を検出することにより、検体の悪性度を含めた癌化を検出することを特徴とする。より具体的には、上記の遺伝子としては、ＧＬＩ２、ＣＣＮＤ１、ＦＧＦ３、ＴＧＦＢＲ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＴＡＰ、ＳＭＡＤ４、ＥＶＩ１、ＭＵＣ４、ＰＴＰＮ１、ＺＮＦ２１７、ＢＣＡＳ１、ＴＦＡＰ２Ｃ、ＢＩＲＣ７、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ、ＶＥＧＦＣ、ＫＬＦ１２、ＦＧＦ１４、ＥＦＮＢ２、ＧＡＢＲＢ３、ＲＡＤ５１、ＲＨ６８６２１、ＰＭＰ２２、ＲＣＶ１、ＨＳＸＩＡＰＡＦ１、ＡＢＲ、ＨＩＣ１、ＭＡＤＨ４（ＳＭＡＤ４）、ＤＣＣ、ＭＡＬＴ１、ＧＲＰ、ＳＥＲＰＩＮＢ５、ＦＶＴ１、ＢＣＬ２、ＳＥＲＰＩＮＢ３、ＢＣＬ２、ＣＴＤＰ１、ＳＨＧＣ−１４５８２０、ＳＳＸ１、ＡＲ、ＭＬＬＴ７、ＡＢＣＢ７、ＧＰＣ３、ＦＧＦ１３、ＭＡＧＥＡ２、ＫＩＡＡ１９１３、ＥＰＢ４２Ｌ２、ＡＫＡＰ７、ＣＲＳＰ３、ＡＲＧ１、ＥＮＰＰ３、ＥＮＰＰ１、ＣＴＧＦの少なくとも１つ以上を選択することができる。特に好ましくは、卵巣由来の細胞におけるＣＴＧＦ遺伝子の欠失又は不活性化を検出することにより、検体の悪性度を含めた癌化を検出することができる。
【００１４】
ヒトゲノムプロジェクトの成果により、ＣＴＧＦ遺伝子の転写産物は既に知られており、６ｑ２３染色体領域に存在する遺伝子である。ＣＴＧＦ遺伝子がコードする蛋白質は、ＣＣＮ（ＣＴＧＦ、ＣＹＲ６１、ＮＯＶ）ファミリーに属し、血管形成、骨形成、腎臓疾患、皮膚疾患などの生化学的や病理学的なプロセスに広く関与することが知られている。しかし、詳細な機能は不明であり、このＣＴＧＦ遺伝子が、卵巣癌の発症、または悪性度に関わる重要な癌関連遺伝子であることは知られていない。
【００１５】
上述したように、本検出方法は、卵巣由来の細胞や卵巣癌におけるＣＴＧＦ遺伝子の欠失や不活性化を検出することを特徴とする方法である。
ＣＴＧＦ遺伝子の欠失や不活性化を検出する対象となる卵巣由来の細胞や卵巣癌は、検体提供者の生検組織細胞が好適である。
この検体組織細胞は、健常人の卵巣に由来する細胞か、卵巣癌患者の癌組織であるかを問わないが、現実的には、検査等の結果、卵巣に癌化が疑われる病変部が認められた場合の病変組織、または卵巣癌であることが確定しているが、その悪性度や進行度を判定する必要がある卵巣癌の組織、等が主な対象となり得る。
【００１６】
本検出方法により、「検査等の結果、卵巣に由来する組織や細胞に癌化が疑われる病変部が認められた場合の病変組織」におけるＣＴＧＦ遺伝子の欠失や不活性化が認められた場合には、病変組織は癌化に向かって進行しているか、あるいは既に癌化の状態であり、かつ、悪性度が高くなりつつあることが判明し、早急な本格的治療（手術等による病変部の除去、本格的な化学療法等）をおこなう必要性が示される。また、「卵巣癌であることが確定しているが、その悪性度や進行度を判定する必要がある卵巣癌の組織」におけるＣＴＧＦ遺伝子の欠失や不活性化が認められた場合にも、癌組織の悪性度が高くなりつつあることが判明し、早急な本格的治療手術等による病変部の除去、本格的な化学療法等）をおこなう必要性が示される。検体として採取された卵巣癌組織は、必要な処理、例えば、採取された組織からのＤＮＡ或るいはＲＮＡの調製をおこない、本検出方法をおこなう対象とすることができる。
【００１７】
（２）ＣＴＧＦ遺伝子の欠失の検出
ＣＴＧＦ遺伝子の欠失の検出を直接的におこなうことができる代表的な方法として、ＣＧＨ（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法とＦＩＳＨ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法を挙げることができる。この態様の本検出方法は、ＣＴＧＦ遺伝子を有するＢＡＣ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ＤＮＡ、ＹＡＣ（Ｙｅａｓｔ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ＤＮＡ、ＰＡＣ（Ｐ１−ｄｒｉｖｅｄ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ＤＮＡ（以下、ＢＡＣ ＤＮＡ等ともいう）を標識し、ＦＩＳＨをおこなうと、ＣＴＧＦ遺伝子の有無、すなわち欠失を検出することができる。具体的には、ＣＴＧＦ遺伝子を有するＢＡＣ ＤＮＡとしては、ＲＰ１１−６９I8等を上げることができる。
【００１８】
上記の態様の方法は、ゲノムＤＮＡ定着基盤を用いておこなうことが、好適であり、かつ、現実的である。
【００１９】
通常に得られるＢＡＣ ＤＮＡ等は、ゲノムＤＮＡ定着基盤を多数製造して実用化するには少量であるので、当該ＤＮＡを遺伝子増幅産物として得る必要がある（この遺伝子増幅行程を「無尽蔵化」ともいう）。無尽蔵化においては、まずＢＡＣ ＤＮＡ等を、４塩基認識酵素、例えば、ＲｓａＩ、ＤｐｎＩ、ＨａｅＩＩＩ等で消化した後、アダプターを加えてライゲーションをおこなう。アダプターは１０〜３０塩基、好適には１５〜２５塩基からなるオリゴヌクレオチドで、２本鎖は相補的配列を有し、アニーリング後、平滑末端を形成する側の３‘-末端のオリゴヌクレオチドをリン酸化する必要がある。次に、アダプターの一方のオリゴヌクレオチドと同一配列を有するプライマーを用いて、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法により増幅し、無尽蔵化することができる。一方、各ＢＡＣ ＤＮＡ等に特徴的な５０〜７０塩基のアミノ化オリゴヌクレオチドを検出用プローブとして用いることもできる。
【００２０】
このようにして無尽蔵化したＢＡＣ ＤＮＡ等を基盤上、好適には固体基盤上に定着させることにより、所望するＤＮＡ定着基盤を製造することができる。固体基盤としては、ガラス板が好ましい。ガラス等の固体基盤は、ポリ−Ｌ−リジン、アミノシラン、金・アルミニウム等の凝着により基盤をコートすることがより好ましい。
【００２１】
上記の無尽蔵化したＤＮＡを基盤上にスポットする濃度は、好ましくは１０ｐｇ/μｌ〜５μｇ/μｌ、より好ましくは１ｎｇ/μｌ〜２００ｎｇ/μｌである。スポットする量は好ましくは１ｎｌ〜１μｌ、より好ましくは１０ｎｌ〜１００ｎｌである。また、基盤に定着させる個々のスポットの大きさ及び形状は、特に限定されないが、例えば、大きさは直径０．０１〜１ｍｍであり得、上面から見た形状は円形〜楕円形であり得る。乾燥スポットの厚みは、特に制限はないが、１〜１００μｍである。さらに、スポットの個数は、特に制限はないが、使用する基盤あたり１０〜５０，０００個、より好ましくは１００〜５，０００個である。それぞれのＤＮＡはＳｉｎｇｕｌａｒからＱｕａｄｒｕｐｌｉｃａｔｅの範囲でスポットするが、Ｄｕｐｌｉｃａｔｅ或るいはＴｒｉｐｌｉｃａｔｅにスポットすることが好ましい。
【００２２】
乾燥スポットの調整は、例えば、スポッターを用いて無尽蔵化したＢＡＣ ＤＮＡ等を基盤上にたらして、複数のスポットを形成した後、スポットを乾燥することにより製造することができる。スポッターとしてインクジェット式プリンター、ピンアレイ式プリンター、バブルジェット（登録商標）式プリンターが使用できるが、インクジェット式プリンターを使用することが望ましい。例えば、ＧＥＮＥＳＨＯＴ（日本ガイシ株式会社、名古屋）等を使用できる。
このようにして無尽蔵化したＢＡＣ ＤＮＡ等を基盤上、好適には固体基盤上に定着させることにより、所望するＤＮＡ定着基盤を製造することができる。
【００２３】
また、このＣＴＧＦ遺伝子の欠失を直接的に検出する手段の一つとしてサザンブロット法を挙げることができる。サザンブロット法は、検体から得られるゲノムＤＮＡを分離して固定し、これと、ＣＴＧＦ遺伝子とのハイブリダイズを検出することにより、検体中の当該遺伝子の存在を検出する方法である。
【００２４】
また、ノーザンブロット法、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法によりＣＴＧＦ遺伝子の欠失を検出してもよい。ノーザンブロット法は、検体から得られるｍＲＮＡを分離して固定し、これとＣＴＧＦとのハイブリダイゼーションを検出することにより、検体中の当該遺伝子のｍＲＮＡの存在を検出する方法である。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法は、逆転写反応とポリメラーゼ連鎖反応による目的遺伝子の増幅を経時的（リアルタイム）に測定する方法であり、増幅率に基づいて鋳型となるｍＲＮＡの定量を行なうことができる。この定量は蛍光色素を用いて行われ、二種類の方法がある。即ち、二重鎖DNAに特異的に挿入（インターカレート）して蛍光を発する色素 (例えば、SYBR green) を用いる方法と、増幅するDNA配列に特異的なオリゴヌクレオチドに蛍光色素を結合させたプローブを用いる方法が知られている。
【００２５】
（３）ＣＴＧＦ遺伝子の不活性化の検出
ＣｐＧリッチプロモーター並びにエキソン領域を密にメチル化すると転写不活性化が起こることが報告されている（Ｂｉｒｄ ＡＰ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ，９９，４５１−４５４，１９９９）．癌細胞では、ＣｐＧアイランドはそれ以外の領域と比較すると高い頻度で密にメチル化されており、プロモーター領域のＨｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎは、癌での癌抑制遺伝子の不活性化に深く関与している（Ｅｈｒｌｉｃｈ Ｍ．， ｅｔ ａｌ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２１，６６９４−６７０２，２００２）。
【００２６】
後述するように、実際、ＣＴＧＦ遺伝子のエキソンに存在するＣｐＧアイランドはプロモーター活性を有している。また、このＣｐＧアイランドのメチル化の度合いは、一部の卵巣癌でのＣＴＧＦ遺伝子発現の抑制と強く相関していた。
【００２７】
そして、卵巣癌を、脱メチル化試薬である５−アザデオキシシチジン（５−ａｚａ−ｄＣｙｄ）存在下で培養することにより、ＣｐＧアイランドを脱メチル化することができ、その結果、ＣＴＧＦ遺伝子発現を回復させることができた。これらの結果により、ＣｐＧアイランドの高頻度メチル化（Ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）が卵巣癌における癌抑制遺伝子の発現抑制を高頻度で起こす原因の一つであることが判明した。
【００２８】
上述した検出手段により、ＣＴＧＦ遺伝子の発現量が減少していることが判明した検体細胞（癌組織に由来するプライマリー癌細胞）に対して、脱メチル化剤（５−アザデオキシシチジンなど）を作用させて、遺伝子発現量の回復を検討することができる。すなわち、検体細胞に脱メチル化剤を作用させて、ＣＴＧＦ遺伝子の発現量が回復する場合には、検体細胞における遺伝子の抑制要因は、ＣｐＧアイランドのメチル化であり、検体提供者に、脱メチル化作用を有する薬剤を投与することにより、相応の抗腫瘍効果が期待される。
【００２９】
（４）細胞増殖の抑制方法、及び細胞増殖抑制剤
本発明によればさらに、ＫＩＡＡ１９１３、ＥＰＢ４２Ｌ２、ＡＫＡＰ７、ＣＲＳＰ３、ＡＲＧ１、ＥＮＰＰ３、ＥＮＰＰ１、ＣＴＧＦ遺伝子、または、該遺伝子の発現産物である蛋白質をインビトロで細胞に導入することを含む、細胞の増殖を抑制する方法、並びに上記遺伝子又は蛋白質を含む細胞増殖抑制剤が提供される。
【００３０】
ＫＩＡＡ１９１３、ＥＰＢ４２Ｌ２、ＡＫＡＰ７、ＣＲＳＰ３、ＡＲＧ１、ＥＮＰＰ３、ＥＮＰＰ１、ＣＴＧＦ遺伝子を取り扱う場合、当業者に公知の技術を用いて培養細胞などから取得したｃＤＮＡであってもよいし、ＰＣＲ法などにより酵素学的に合成したものでもよい。ＰＣＲ法によりＤＮＡを取得する場合、ヒトの染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、目的とする塩基配列を増幅できるように設計したプライマーを使用してＰＣＲを行う。ＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片は大腸菌などの宿主で増幅可能な適切なベクター中にクローニングすることができる。
【００３１】
ＫＩＡＡ１９１３、ＥＰＢ４２Ｌ２、ＡＫＡＰ７、ＣＲＳＰ３、ＡＲＧ１、ＥＮＰＰ３、ＥＮＰＰ１、ＣＴＧＦ遺伝子の検出ブローブ又はプライマーの調製、並びに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ、２nd Ｅｄ．、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ．、１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １〜３８、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）などに記載された方法に準じて行うことができる。
【００３２】
ＫＩＡＡ１９１３、ＥＰＢ４２Ｌ２、ＡＫＡＰ７、ＣＲＳＰ３、ＡＲＧ１、ＥＮＰＰ３、ＥＮＰＰ１、ＣＴＧＦ遺伝子は、ベクターに組み込んだ組換えベクターの形態で用いることができる。ベクターとしてはウイルスベクター又は動物細胞発現用ベクター、好ましくはウイルスベクターが用いられる。ウイルスベクターとしてはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられる。中でも、レトロウイルスベクターは、細胞に感染後、ウイルスゲノムが宿主染色体に組み込まれ、ベクターに組み込んだ外来遺伝子を安定にかつ長期的に発現させる可能であるからレトロウイルスベクターを使用することが特に望ましい。
【００３３】
動物細胞発現用ベクターとしては例えばｐＣＸＮ２（Ｇｅｎｅ，１０８，１９３−２００，１９９１）、ＰＡＧＥ２０７（特開平６−４６８４１号公報）又はその改変体などを用いることができる。
【００３４】
上記組換えベクターは適当な宿主に導入して形質転換し、得られた形質転換体を培養することによって生産することができる。組換えベクターがウイルスベクターの場合、これを導入する宿主としてはウイルス生産能を有する動物細胞が用いられ、例えば、ＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞などが挙げられる。レトロウイルスベクターの宿主としては、ΨＣＲＥ、ΨＣＲＩＰ、ＭＬＶなどが、アデノウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクターの宿主としては、ヒト胎児腎臓由来の２９３細胞などが用いられる。ウイルスベクターの動物細胞への導入はリン酸カルシウム法などで行うことができる。また、組換えベクターが動物細胞発現用ベクターの場合、これを導入する宿主としては大腸菌Ｋ１２株、ＨＢ１０１株、ＤＨ５α株などを使用でき、大腸菌の形質転換は当業者に公知である。
【００３５】
得られた形質転換体はそれぞれに適した培地、培養条件により培養する。例えば、大腸菌の形質転換体の培養は、生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他を含有するｐＨ５〜８程度の液体培地を用いて行うことができる。培養は通常１５〜４３℃で約８〜２４時間程度行う。この場合、目的とする組み換えベクターは、培養終了後、通常のＤＮＡ単離精製法により得ることができる。
【００３６】
また、動物細胞の形質転換体の培養は、例えば約５〜２０％のウシ胎児血清を含む１９９培地、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地などの培地を用いて行うことができる。培地のｐＨは約６〜８が好ましい。培養は通常約３０〜４０℃で約１８〜６０時間行う。この場合、目的とする組み換えベクターは、それを含有するウイルス粒子が培養上清中に放出されるので、ウイルス粒子の濃縮、精製を塩化セシウム遠心法、ポリエチレングリコール沈澱法、フィルター濃縮法などにより得ることができる。
【００３７】
本発明の細胞増殖抑制剤は、有効成分である上記遺伝子を遺伝子治療剤に通常用いる基剤と共に配合することにより製造することができる。また、上記遺伝子をウイルスベクターに組み込んだ場合は、組換えベクターを含有するウイルス粒子を調製し、これを遺伝子治療剤に通常用いる基剤と共に配合する。
【００３８】
有効成分である上記遺伝子又は蛋白質を配合するために使用する基剤としては、通常注射剤に用いる基剤を使用することができ、例えば、蒸留水、塩化ナトリウム又は塩化ナトリウムと無機塩との混合物などの塩溶液、マンニトール、ラクトース、デキストラン、グルコースなどの溶液、グリシン、アルギニンなどのアミノ酸溶液、有機酸溶液又は塩溶液とグルコース溶液との混合溶液などが挙げられる。あるいはまた、当業者に既知の常法に従って、これらの基剤に浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、植物油、界面活性剤などの助剤を用いて、溶液、懸濁液、分散液として注射剤を調製することもできる。これらの注射剤は、粉末化、凍結乾燥などの操作により用時溶解用製剤として調製することもできる。
【００３９】
本発明の細胞増殖抑制剤の投与形態としては、通常の静脈内、動脈内などの全身投与でもよいし、局所注射又は経口投与などの局所投与を行ってもよい。さらに、細胞増殖抑制剤の投与にあたっては、カテーテル技術、遺伝子導入技術、又は外科的手術などと組み合わせた投与形態をとることもできる。
【００４０】
本発明の細胞増殖抑制剤の投与量は、患者の年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、一般に、成人では一日当たり組み換え遺伝子の重量として１μｇ／ｋｇ体重から１０００ｍｇ／ｋｇ体重程度の範囲であり、好ましくは１０μｇ／ｋｇ体重から１００ｍｇ／ｋｇ体重程度の範囲である。投与回数は特に限定されない。
【００４１】
（５）細胞増殖の活性化方法、及び細胞増殖活性化剤
本発明によれば、ＫＩＡＡ１９１３、ＥＰＢ４２Ｌ２、ＡＫＡＰ７、ＣＲＳＰ３、ＡＲＧ１、ＥＮＰＰ３、ＥＮＰＰ１、ＣＴＧＦ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは機能欠失型遺伝子を、インビトロで腫瘍細胞に導入することを含む細胞の増殖を活性化する方法、並びに上記のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは機能欠失型遺伝子を含む細胞増殖活性化剤が提供される。
【００４２】
ｓｉＲＮＡは、約２０塩基（例えば、約２１〜２３塩基）またはそれ未満の長さの二本鎖ＲＮＡであり、このようなｓｉＲＮＡ は、細胞に発現させることにより、そのｓｉＲＮＡ の標的となる遺伝子（本発明においては、ＫＩＡＡ１９１３、ＥＰＢ４２Ｌ２、ＡＫＡＰ７、ＣＲＳＰ３、ＡＲＧ１、ＥＮＰＰ３、ＥＮＰＰ１、ＣＴＧＦ遺伝子）の発現を抑制することができる。
【００４３】
本発明において用いられるｓｉＲＮＡ は、ＲＮＡｉを引き起こすことができる限り、どのような形態のものでもよい。ここで、「ｓｉＲＮＡ 」とは、ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡの略称であり、人工的に化学合成されるかまたは生化学的に合成されたものか、あるいは生物体内で合成されたものか、あるいは約４０塩基以上の二本鎖ＲＮＡが体内で分解されてできた１０塩基対以上の短鎖二本鎖ＲＮＡをいい、通常、５'−リン酸、３'−ＯＨの構造を有しており、３'末端は約２塩基突出している。このｓｉＲＮＡ に特異的なタンパク質が結合して、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ−ｃｏｍｐｌｅｘ）が形成される。この複合体は、ｓｉＲＮＡ と同じ配列を有するｍＲＮＡを認識して結合し、ＲＮａｓｅＩＩＩ様の酵素活性によってｓｉＲＮＡ の中央部でｍＲＮＡを切断する。
【００４４】
ｓｉＲＮＡ の配列と、標的として切断するｍＲＮＡの配列とは１００％一致することが好ましい。しかし、ｓｉＲＮＡ の中央から外れた位置の塩基が一致していない場合については、ＲＮＡｉによる切断活性は部分的には残存することが多いので、必ずしも１００％一致していなくてもよい。
【００４５】
ｓｉＲＮＡの塩基配列と、発現を抑制すべきＫＩＡＡ１９１３、ＥＰＢ４２Ｌ２、ＡＫＡＰ７、ＣＲＳＰ３、ＡＲＧ１、ＥＮＰＰ３、ＥＮＰＰ１、ＣＴＧＦ遺伝子の塩基配列との間で相同性のある領域は、当該遺伝子の翻訳開始領域を含まないことが好ましい。翻訳開始領域には種々の転写因子や翻訳因子が結合することが予想されるため、ｓｉＲＮＡ が効果的にｍＲＮＡに結合することができず、効果が低減することが予測されるからである。従って、相同性を有する配列は、当該遺伝子の翻訳開始領域から２０塩基離れていることが好ましく、より好ましくは当該遺伝子の翻訳開始領域から７０塩基離れている。相同性を有する配列としては、例えば、当該遺伝子の３'末端付近の配列でもよい。
【００４６】
本発明の別の態様によれば、ＲＮＡｉにより標的遺伝子の発現を抑制することができる因子として、３'末端に突出部を有する短いヘアピン構造から成るｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）を使用することができる。ｓｈＲＮＡとは、一本鎖ＲＮＡで部分的に回文状の塩基配列を含むことにより、分子内で二本鎖構造をとり、ヘアピンのような構造となる約２０塩基対以上の分子のことを言う。そのようなｓｈＲＮＡは、細胞内に導入された後、細胞内で約２０塩基（代表的には例えば、２１塩基、２２塩基、２３塩基）の長さに分解され、ｓｉＲＮＡ と同様にＲＮＡｉを引き起こすことができる。上記の通りｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ と同様にＲＮＡｉを引き起こすことから、本発明において有効に用いることができる。
【００４７】
ｓｈＲＮＡは好ましくは、３'突出末端を有している。二本鎖部分の長さは特に限定されないが、好ましくは約１０ヌクレオチド以上であり、より好ましくは約２０ヌクレオチド以上である。ここで、３'突出末端は、好ましくはＤＮＡであり、より好ましくは少なくとも２ヌクレオチド以上のＤＮＡであり、さらに好ましくは２〜４ヌクレオチドのＤＮＡである。
【００４８】
上記の通り、本発明では、ＲＮＡｉによりＫＩＡＡ１９１３、ＥＰＢ４２Ｌ２、ＡＫＡＰ７、ＣＲＳＰ３、ＡＲＧ１、ＥＮＰＰ３、ＥＮＰＰ１、ＣＴＧＦ遺伝子の発現を抑制することができる因子として、ｓｉＲＮＡ またはｓｈＲＮＡを使用することができる。ｓｉＲＮＡの長所としては、（１）細胞内に導入してもＲＮＡ自体は正常細胞の染色体内に組み込まれないので、子孫に伝わる変異を起こすような治療ではなく、安全性が高いこと、及び（２）短鎖二本鎖ＲＮＡは化学合成が比較的容易であり二本鎖にするとより安定であること、などが挙げられる。また、ｓｈＲＮＡの長所としては、遺伝子発現を長期間抑制することによって治療を行う場合、細胞内でｓｈＲＮＡを転写するようなベクターを作製して細胞内に導入することができることなどが挙げられる。
【００４９】
本発明で用いるＲＮＡｉによりＫＩＡＡ１９１３、ＥＰＢ４２Ｌ２、ＡＫＡＰ７、ＣＲＳＰ３、ＡＲＧ１、ＥＮＰＰ３、ＥＮＰＰ１、ＣＴＧＦ遺伝子の発現を抑制することができるｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡは、人工的に化学合成してもよいし、センス鎖およびアンチセンス鎖のＤＮＡ配列を逆向きに連結したヘアピン構造のＤＮＡをＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによってインビトロでＲＮＡを合成することによって作製することもできる。インビトロで合成する場合は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼおよびＴ７プロモーターを用いて、鋳型ＤＮＡからアンチセンスおよびセンスのＲＮＡを合成することができる。これらをインビトロでアニーリングした後、細胞に導入すると、ＲＮＡｉが引き起こされ、標的遺伝子の発現が抑制される。ここでは、例えば、リン酸カルシウム法、又は各種のトランスフェクション試薬（例えば、oligofectamine、Lipofectamineおよびlipofectionなど）を用いてそのようなＲＮＡを細胞内に導入することができる。
【００５０】
上記したｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡは、細胞増殖活性化剤として有用である。本発明の細胞増殖活性化剤の投与方法は、経口投与、非経口投与（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、患部への局所投与、皮膚投与など）、患部への直接投与などが挙げられる。本発明の薬剤は、医薬組成物として使用する場合、必要に応じて薬学的に許容可能な添加剤を配合することができる。 薬学的に許容可能な添加剤の具体例としては、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、キャリア、賦形剤および／または薬学的アジュバントなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５１】
本発明の薬剤の製剤形態は特に限定されないが、例えば、液剤、注射剤、徐放剤などが挙げられる。本発明の薬剤を上記製剤として処方するために使用される溶媒としては、水性または非水性のいずれでもよい。
【００５２】
さらに、本発明の細胞増殖活性化剤の有効成分であるｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡは、非ウイルスベクターまたはウイルスベクターの形態で投与することができる。非ウイルスベクター形態の場合、リポソームを用いて核酸分子を導入する方法（リポソーム法、ＨＶＪ−リポソーム法、カチオニックリポソーム法、リポフェクション法、リポフェクトアミン法など）、マイクロインジェクション法、遺伝子銃（Ｇｅｎｅ Ｇｕｎ）でキャリア（金属粒子）とともに核酸分子を細胞に移入する方法などを利用することができる。ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡをウイルスベクターを用いて生体に投与する場合は、組換えアデノウイルス、レトロウイルスなどのウイルスベクターを利用することができる。無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス、ＳＶ４０などのＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスに、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを発現するＤＮＡを導入し、細胞または組織にこの組換えウイルスを感染させることにより、細胞または組織内に遺伝子を導入することができる。
【００５３】
本発明の細胞増殖活性化剤の投与量は、使用目的、疾患の重篤度、患者の年齢、体重、性別、既往歴、又は有効成分であるｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの種類などを考慮して、当業者が決定することができる。ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの投与量は特に限定されないが、例えば、約０．１ｎｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは約１ｎｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ／日である。ＲＮＡｉは、一般に投与後１〜３日間効果が見られる。したがって、毎日〜３日に１回の頻度で投与することが好ましい。発現ベクターを用いる場合、１週間に１回程度投与することも可能である。
【００５４】
本発明では、アンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞増殖活性化剤として使用することもできる。本発明で用いるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＫＩＡＡ１９１３、ＥＰＢ４２Ｌ２、ＡＫＡＰ７、ＣＲＳＰ３、ＡＲＧ１、ＥＮＰＰ３、ＥＮＰＰ１、ＣＴＧＦ遺伝子のＤＮＡ配列中の連続する５から１００の塩基配列に対して相補的な、またはハイブリダイズするヌクレオチドであって、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれであっても良く、また機能に支障がない限りにおいて修飾されたものであってもよい。本明細書で言う「アンチセンスオリゴヌクレオチド」とは、ＤＮＡ又はｍＲＮＡの所定の領域を構成するヌクレオチドに対応するヌクレオチドがすべて相補的であるもののみならず、ＤＮＡ又はｍＲＮＡとオリゴヌクレオチドとが安定にハイブリダイズできる限り、多少のミスマッチが存在してもよい。
【００５５】
なお、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、修飾されていてもよい。適当な修飾を施すことにより、当該アンチセンスオリゴヌクレオチドは生体内で分解されにくくなり、より安定してITIIαを阻害できるようになる。このような修飾されたオリゴヌクレオチドとしては、Ｓ−オリゴ型（ホスフォロチオエート型）、Ｃ−５チアゾール型、Ｄ−オリゴ型（フォスフォジエステル型）、Ｍ−オリゴ型（メチルフォスフォネイト型）、ペプチド核酸型、リン酸ジエステル結合型、Ｃ−５プロピニルピリミジン型、２−Ｏ−プロピルリボース、２'−メトキシエトキシリボース型等の修飾型のアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、リン酸基を構成する酸素原子の少なくとも一部がイオウ原子に置換、修飾されているものでもよい。このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ耐性、水溶性、ＲＮＡへの親和性に特に優れている。リン酸基を構成する酸素原子の少なくとも一部がイオウ原子に置換、修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、例えば、Ｓ−オリゴ型等のオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００５６】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基数は、５０以下であることが好ましく、２５以下であることがより好ましい。塩基数があまりに多くなると、オリゴヌクレオチドの合成の手間とコストが増大し、また、収率も低下する。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基数は５以上であり、９以上であることが好ましい。塩基数が４以下の場合には、標的遺伝子に対する特異性が低下して好ましくないためである。
【００５７】
アンチセンスオリゴヌクレオチド（又はその誘導体）は常法によって合成することができ、例えば、市販のＤＮＡ合成装置（例えばＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製など）によって容易に合成することができる。合成法はホスホロアミダイトを用いた固相合成法、ハイドロジェンホスホネートを用いた固相合成法などで得ることができる。
【００５８】
本発明においてアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞増殖活性化剤として使用する場合には、一般的には、アンチセンスオリゴヌクレオチドと製剤用添加物（担体、賦形剤など）とを含む医薬組成物の形態で提供される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトを含む哺乳動物に医薬として投与することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与経路は特に限定されず、経口投与または非経口投与（例えば、筋肉内投与、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、鼻腔などへの粘膜投与、または吸入投与など）の何れでもよい。
【００５９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの製剤形態は特に限定されず、経口投与のための製剤としては例えば、錠剤、カプセル剤、細粒剤、粉末剤、顆粒剤、液剤、シロップ剤などが挙げられ、非経口投与のための製剤としては例えば、注射剤、点滴剤、座剤、吸入剤、経粘膜吸収剤、経皮吸収剤、点鼻剤、点耳剤などが挙げられる。アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む薬剤の形態、使用すべき製剤用添加物、製剤の製造方法などは、いずれも当業者が適宜選択可能である。
【００６０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与量は、患者の性別、年齢または体重、症状の重症度、予防または治療といった投与目的、あるいは他の合併症状の有無などを総合的に考慮して適宜選択することができる。投与量は、一般的には、０．１μｇ／ｋｇ体重／日〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、好ましくは０．１μｇ／ｋｇ体重／日〜１０ｍｇ／ｋｇ体重／日である。
【００６１】
さらに本発明では、ＫＩＡＡ１９１３、ＥＰＢ４２Ｌ２、ＡＫＡＰ７、ＣＲＳＰ３、ＡＲＧ１、ＥＮＰＰ３、ＥＮＰＰ１、ＣＴＧＦ遺伝子の機能欠失型遺伝子を細胞増殖活性化剤として使用することもできる。機能欠失型遺伝子とは、該当する遺伝子においてその機能を欠失するように変異が導入されている遺伝子のことを言う。具体的には当該遺伝子から作製されるアミノ酸配列の少なくとも１個の構成アミノ酸を欠くもの、少なくとも１個の構成アミノ酸が別のアミノ酸で置換されているもの、少なくとも１個のアミノ酸が付加されたもの等の本来の機能を欠失した一般にムテインと呼ばれるタンパク質を翻訳する当該遺伝子がこれに相当する。
【００６２】
機能欠失型遺伝子を細胞増殖活性化剤として使用する場合は、有効成分である上記遺伝子を遺伝子治療剤に通常用いる基剤と共に配合することにより製造することができる。また、上記遺伝子をウイルスベクターに組み込んだ場合は、組換えベクターを含有するウイルス粒子を調製し、これを遺伝子治療剤に通常用いる基剤と共に配合する。
【００６３】
上記基剤としては、通常注射剤に用いる基剤を使用することができ、例えば、蒸留水、塩化ナトリウム又は塩化ナトリウムと無機塩との混合物などの塩溶液、マンニトール、ラクトース、デキストラン、グルコースなどの溶液、グリシン、アルギニンなどのアミノ酸溶液、有機酸溶液又は塩溶液とグルコース溶液との混合溶液などが挙げられる。あるいはまた、当業者に既知の常法に従って、これらの基剤に浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、植物油、界面活性剤などの助剤を用いて、溶液、懸濁液、分散液として注射剤を調製することもできる。これらの注射剤は、粉末化、凍結乾燥などの操作により用時溶解用製剤として調製することもできる。
【００６４】
機能欠失型遺伝子の投与形態としては、通常の静脈内、動脈内などの全身投与でもよいし、局所注射又は経口投与などの局所投与を行ってもよい。さらに、投与にあたっては、カテーテル技術、遺伝子導入技術、又は外科的手術などと組み合わせた投与形態をとることもできる。
【００６５】
機能欠失型遺伝子の投与量は、患者の年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、一般に、成人では一日当たり組み換え遺伝子の重量として１μｇ／ｋｇ体重から１０００ｍｇ／ｋｇ体重程度の範囲であり、好ましくは１０μｇ／ｋｇ体重から１００ｍｇ／ｋｇ体重程度の範囲である。投与回数は特に限定されない。
【００６６】
また、上記した本発明の各種の遺伝子治療剤は、常法により調製されたリポソームの懸濁液に遺伝子を添加し凍結した後融解することにより製造することもできる。リポソームを調製する方法は、薄膜振とう法、超音波法、逆相蒸発法、界面活性剤除去法などがある。リポソームの懸濁液は超音波処理した後、遺伝子を添加するのが遺伝子の封入効率を向上させる上で好ましい。遺伝子を封入したリポソームはそのまま、又は水、生理食塩水などに懸濁して静脈投与することができる。
【００６７】
（６）抗腫瘍物質のスクリーニング方法
上述したように、卵巣癌に関しては、ＫＩＡＡ１９１３、ＥＰＢ４２Ｌ２、ＡＫＡＰ７、ＣＲＳＰ３、ＡＲＧ１、ＥＮＰＰ３、ＥＮＰＰ１、ＣＴＧＦ遺伝子の不活性化が大きな要因となっており、遺伝子の働きを正常化する薬剤は、卵巣癌に対する抗腫瘍剤として用いることが可能であると考えられる。特に、この不活性化の要因が、ＣＴＧＦ遺伝子のＣｐＧアイランドによるメチル化である場合には、これらの要因を解消・緩和することができる薬剤は、抗腫瘍剤として有用である。
【００６８】
これらの本スクリーニング方法をおこなう前提として、検体細胞においてＣＴＧＦ遺伝子の発現量が抑制されている卵巣癌を確保する必要がある。すなわち、本スクリーニング方法においては、「ＣＴＧＦ遺伝子のＣｐＧアイランドのメチル化に起因してＣＴＧＦ遺伝子の発現が抑制されている卵巣癌」が必要となる。これらの細胞株の確立法は、上述した知見に基づいた上で、常法に従いおこなうことができる。例えば、少なくとも、ＣＴＧＦ遺伝子の不活性化が確認された細胞の中から、既存の脱メチル化試薬（例えば５−アザデオキシシチジン）を作用させることにより、ＣＴＧＦ遺伝子のレベルが回復する細胞を選択して、これを継代して、所望する「ＣＴＧＦ遺伝子のＣｐＧアイランドのメチル化に起因してＣＴＧＦ遺伝子の発現が抑制されている卵巣癌」（以下、メチル化癌細胞株ともいう）として確立することができる。
【００６９】
本スクリーニング方法においては、上記のメチル化癌細胞株に対して被験物質を接触させることが必要である。この接触の態様は、特に限定されないが、メチル化細胞株の培養物に対して、被験物質を好適には適切な希釈倍率で希釈して添加して、引き続き培養をおこなうことによりおこなわれる。そして、被験物質を添加する前のメチル化癌細胞株におけるＣＴＧＦ遺伝子の発現量と、添加後の遺伝子の発現量を、好適には経時的に定量し、定量前後の遺伝子の発現量の差を、被験物質を添加せずに同条件で培養された対照培養物と比較して、対照培養物よりも、被験物質を添加した培養物における遺伝子の発現量が増加している場合には、被験物質はメチル化癌細胞株を用いた試薬においては「ＣＴＧＦ遺伝子のＣｐＧアイランドの脱メチル化によりＣＴＧＦ遺伝子を活性化させることができる抗腫瘍物質」として選別される。
【００７０】
さらに、本スクリーニング方法をおこなって、所望の卵巣癌に対する抗腫瘍成分としてスクリーニングされた物質を、さらに、ｉｎ ｖｉｖｏのスクリーニング、例えば、上記のメチル化癌細胞株を植えつけたヌードマウスでの卵巣癌の増殖抑制効果とヌードマウスの生存率の向上を指標とするスクリーニング方法にかけて、最終的な絞込みをおこなうことが好適である。
【００７１】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により特に限定されるものではない。
【実施例】
【００７２】
実施例１：卵巣癌における遺伝子の変化
卵巣癌での新規な遺伝子変化を検出するために、２４種類の卵巣癌細胞株（ＨＴ、ＨＴＯＡ、ＨＵＯＡ、ＫＦ２８、ＭＨ、ＯＶＴＯＫＯ、ＯＶＳＡＨＯ、ＫＦｒ１３、ＨＭＫＯＡ、ＭＣＡＳ、ＲＭＵＧ−Ｌ、ＲＭＵＧ−Ｓ、ＫＫ、ＯＶＩＳＥ、ＯＶＭＡＮＡ、ＯＶＴＯＫＯ、ＲＭＧ−Ｉ、ＲＭＧ−ＩＩ、ＥＳ−２、Ｗ３ＵＦ、ＨＩＯＡｎｕ、ＨＭＯＡ、ＨＮＯＡ、ＨＴＢＯＡ）から調製したゲノムＤＮＡを用いてＭＧＣ Ｃａｎｃｅｒ Ａｒｒａｙ−８００を使用したＣＧＨアレイ解析をおこなった（図１Ａ）。なお、対象として正常な卵巣上皮由来の細胞株（ＯＳＥ−２ａ）から抽出したゲノムを使用しＣｙ５で標識した。被検ＤＮＡとして卵巣癌細胞株から調整したゲノムＤＮＡを使用しＣｙ３で標識した。具体的には、ＤｐｎＩＩ消化したゲノムＤＮＡ（０．５μｇ）を、各々０．６ｍＭ ｄＡＴＰ、０．６ｍＭ ｄＴＴＰ、０．６ｍＭ ｄＧＴＰ、０．３ｍＭ ｄＣＴＰ及び０．３ｍＭＣｙ３−ｄＣＴＰ（卵巣癌細胞）或るいは０．３ｍＭＣｙ５−ｄＣＴＰ（正常細胞）存在下で、ＢｉｏＰｒｉｍｅ Ａｒｒａｙ ＣＧＨ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）により標識した。Ｃｙ３及びＣｙ５標識ｄＣＴＰはＧＥ ヘルスケア社より入手した。両標識ゲノムＤＮＡをＣｏｔ−１ ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）存在下でエタノールを加えて沈殿させ、１２０μｌのハイブリダイゼーション混合液（５０％ホルムアミド、１０％Ｄｅｘｔｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ、２ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣ：１５０ｍＭ ＮａＣｌ/１５ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ）、４％ ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ、ｐＨ７．０）に溶解した。３７℃で３０分間インキュベーション後、ハイブリダイゼーションマシーン（ＧｅｎｅＴＡＣ；ハーバードバイオサイエンス社）にＣＧＨアレイをセットし、４８−７２時間イハイブリダイゼーションをおこなった。その後、ＣＧＨアレイを５０％ホルムアミド/２ｘＳＳＣ（ｐＨ７．０）溶液中で５０℃にて１５分間洗浄し、次に２ｘＳＳＣ/０．１％ＳＤＳ中で５０℃にて１５分間洗浄した。風乾した後、ＣＧＨアレイをＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂスキャナー（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてＣｙ３及びＣｙ５に由来する蛍光をモニタリングした。得られた結果をＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏ６．０イメージングソフトウエア（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて解析した。Ｃｙ３に由来する蛍光強度の平均とＣｙ５に由来する蛍光強度の平均を同じ値に調整し、Ｃｙ３/Ｃｙ５のＲａｔｉｏを求めた。ゲノムに異常がない場合にはＲａｔｉｏ値は１（ｌｏｇ２Ｒａｔｉｏ＝０）である。Ｒａｔｉｏ値が１．３２以上（ｌｏｇ２Ｒａｔｉｏで０．４以上）の時にゲノムの増幅があり、４以上（ｌｏｇ２Ｒａｔｉｏで２以上）の時に顕著な増幅が認められると判定した。Ｒａｔｉｏ値が０．７５以下（ｌｏｇ２Ｒａｔｉｏで−０．４以下）の時にゲノムのヘテロ接合体欠失の可能性、０．２５以下（ｌｏｇ２Ｒａｔｉｏで−２以下）の時にホモ接合体欠失の可能性が極めて大きいと判定した。その結果を表１、及び表２に示す。
【００７３】
高レベルの遺伝子増幅は、２４種類の卵巣癌中２種類、２遺伝子座を確認することができた。また、遺伝子欠失は、２４種類の卵巣癌中３種類、４遺伝子座を確認することができた（表１）。
【００７４】
【表１】
【００７５】
【表２】
【００７６】
実施例２：卵巣癌における６ｑ２３（６ｑ２３．１−２３．２）染色体欠失領域に含まれる遺伝子の単離
卵巣癌細胞株（ＲＭＵＧ−Ｓ）において、新規に検出した６ｑ２３（６ｑ２３．１−２３．２）のホモ欠失領域に含まれる遺伝子を詳細に決定するため、まず、ＲＭＵＧ−Ｓ細胞から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としたゲノミックＰＣＲでホモ欠失領域の範囲を決定することにした。ゲノミックＰＣＲに用いたプライマー配列は、表３に示す。
【００７７】
【表３】
【００７８】
欠失領域に存在する遺伝子は、ＣＧＨアレイの結果とヒトゲノムデータベース（ｈｔｔｐ://ｇｅｎｏｍｅ.ｕｃｓｃ.ｅｄｕ/）から確認することができた（図１Ｂ、図１Ｃ）。その結果、この欠失領域には１０種の遺伝子の存在が確認できた（図１Ｂ）。そのうち、ＣＴＧＦ遺伝子、ＥＮＰＰ１遺伝子、ＥＮＰＰ３遺伝子、ＣＲＳＰ３遺伝子、ＡＲＧ遺伝子、ＡＫＡＰ７遺伝子、ＥＰＢ４１Ｌ２遺伝子、ＫＩＡＡ１９１３遺伝子のホモ欠失が、ＲＭＵＧ−Ｓ細胞（１／２４、４．２％；図１Ｃ）においてで確認することができた。
【００７９】
実施例３：卵巣癌細胞株におけるＣＴＧＦ遺伝子発現の消失とＤＮＡ脱メチル化後の回復について
上記７つの遺伝子（ＣＴＧＦ遺伝子、ＥＮＰＰ１遺伝子、ＥＮＰＰ３遺伝子、ＣＲＳＰ３遺伝子、ＡＫＡＰ７遺伝子、ＥＰＢ４１Ｌ２遺伝子、ＫＩＡＡ１９１３遺伝子）の発現レベルを調べるため、２４種類の卵巣癌細胞株、正常卵巣、正常卵巣上皮細胞由来不死化細胞株（ＯＳＥ−２ａ）についてＲｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＲＴ）−ＰＣＲをおこなった。具体的には、培養した細胞株から抽出したＲＮＡから、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、一本鎖ｃＤＮＡを合成し、表３に示すプライマー配列を用いて、ＰＣＲをおこなった。また、コントロールとして、Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子を用いた。その結果、ＣＴＧＦ遺伝子、ＥＮＰＰ１遺伝子、ＫＩＡＡ１９１３遺伝子は、６ｑ２３．１−２３．２染色体領域がホモ欠失でないにも関わらず、正常卵巣、ＯＳＥ−２ａ細胞と比較して発現の減少を示した（図１Ｄ）。これは、卵巣癌細胞株におけるエピジェネテック現象のような、ゲノム欠失以外のメカニズムによる結果と考えられる。また上記実験において、ＡＲＧ１遺伝子は、遺伝子発現データベース（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ ａｎｄ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｓｂｍ．ｏｒｇ／ｄａｔａｂａｓｅ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）の結果から、卵巣では発現されていないので検討から除外することにした。
【００８０】
ＣＴＧＦ遺伝子の発現の抑制が、ＤＮＡのメチル化による原因かどうかを調べるため、ＣＴＧＦ遺伝子が発現していない卵巣癌細胞株（ＨＮＯＡ、ＲＭＧ−ＩＩ）を用い、脱メチル化試薬５‐ａｚａ‐ｄＣｙｄを５μＭで５日間、または、脱アセチル化阻害剤ＴＳＡを１００ｎｇ／ｍｌで１２時間処理をおこなった。それらの細胞からＲＮＡを抽出し、ＣＴＧＦ遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲで調べた（図１Ｄ）。その結果、ＣＴＧＦ遺伝子は、５‐ａｚａ‐ｄＣｙｄの処理により、遺伝子発現を回復することがわかった。この結果は、明らかに、ＣＴＧＦ遺伝子の発現抑制には、ＤＮＡのメチル化が関与していることが推定される。また、ＴＳＡ処理では、ＣＴＧＦ遺伝子の発現に差が見られないことから、ＣＴＧＦ遺伝子の発現調節にヒストンの脱アセチル化の要因は少ないことが明らかとなった。
【００８１】
実施例４：卵巣癌細胞株におけるＣＴＧＦ遺伝子 ＣｐＧアイランドのメチル化
ＣｐＧアイランドのメチル化は遺伝子発現を抑制するメカニズムの１つである。ＣＴＧＦ遺伝子のＣｐＧアイランドをＣｐＧＰＬＯＴプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｍｂｏｓｓ／ｃｐｇｐｌｏｔ／）を用いて解析した結果、ＣＴＧＦ遺伝子のエキソン１、２周辺にＣｐＧアイランドが存在することを確認した（図２Ａ）。卵巣癌細胞株でのＣＴＧＦ遺伝子発現の有無によるＣＴＧＦ遺伝子のＣｐＧアイランドのメチル化状態を確認するため、３つの領域（Ｒｅｇｉｏｎ １、Ｒｅｇｉｏｎ ２、Ｒｅｇｉｏｎ ３）についてｂｉｓｕｌｆｉｔｅシーケンス解析をおこなった。
【００８２】
具体的には、ＥＺ ＤＮＡメチレーションキット（Ｚｙｍｏ ＲＥＳＥＡＲＣＨ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用し、卵巣癌細胞株に由来するゲノムＤＮＡ（２μｇ）をＳｏｄｉｕｍ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ中５０℃で１晩処理をおこない、目的とする領域を増幅するようにデザインしたプライマー（表３）を用いてＰＣＲをおこなった。これらの配列をＴＯＰＯ ＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にサブクローニングし、塩基配列を決定した。その結果、ＣＴＧＦ遺伝子の発現が減少している細胞株（ＨＴＯＡ、ＨＵＯＡ、ＲＭＵＧ−Ｌ、ＲＭＧ−Ｉ、ＨＮＯＡ、ＫＦ２８）において、Ｒｅｇｉｏｎ ２と３が極度にメチル化されていることが確認できた（図２Ａ）。また、Ｒｅｇｉｏｎ ２の３'部分、Ｒｅｇｉｏｎ ２ＢとＲｅｇｉｏｎ３はＣＴＧＦ遺伝子が発現している細胞株（ＫＫ、ＯＶＩＳＥ）でもメチル化を確認することができた。
【００８３】
卵巣癌細胞株でのＣＴＧＦ遺伝子の発現状態とメチル化状態の関連性をさらに調べるため、ＣＯＢＲＡ法を用いて解析をおこなった。具体的には、上記方法で得られたＰＣＲ産物をＢｓｔＵＩ制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）で消化し電気泳動することで検出した。ＢｓｔＵＩはメチル化されないＳｏｄｉｕｍ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅで修飾された配列は消化しないが、メチル化されたＳｏｄｉｕｍ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅで修飾されない配列を消化する性質を利用して、メチル化の度合いをモニタリングした。ＰＣＲ断片を電気泳動後、メチル化された断片のバンドとメチル化されない断片のバンドの濃度比をＭｕｌｔｉＧａｕｇｅ２．０（富士フイルム株式会社）を用いたデンシトメトリーにより測定し、メチル化された領域のメチル化度を％で表示した（図２Ａ、Ｂ）。その結果、ＣＴＧＦ遺伝子の発現状態に関わらず卵巣癌細胞株のほとんどで、メチル化したアレルはＲｅｇｉｏｎ １において確認できなかった（図２Ｂ）。一方、ＣＴＧＦ遺伝子の発現を欠いた卵巣癌細胞では、ＯＶＭＡＮＡ細胞、ＯＶＴＯＫＯ細胞を除いてＲｅｇｉｏｎ ２のメチル化アレルを確認することができた（図２Ｂ）。
【００８４】
実施例５：ＣＴＧＦ遺伝子のＣｐＧアイランド周辺配列のプロモーター活性
ＣｐＧアイランドのプロモーター活性を調べるために、このＣｐＧアイランドの周辺を含めて３つの断片（Ｆｒａｇｍｅｎｔ １、Ｆｒａｇｍｅｎｔ ２、Ｆｒａｇｍｅｎｔ ３）に分割し、それらの断片をルシフェラーゼレポータープラスミド（ｐＧＬ３‐Ｂａｓｉｃ ｖｅｃｔｏｒ：Ｐｒｏｍｅｇａ社）に挿入し、卵巣癌細胞株（ＲＭＵＧ−Ｓ、ＫＫ、ＫＦ２８）へトランスフェクションした（図２Ｃ）。Ｄｕａｌ-Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅレポーターアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて、マニュアルに従ってルシフェラーゼ活性を測定し、各Ｆｒａｇｍｅｎｔを有するｐＧＬ３ベクターに由来するルシフェラーゼ活性を測定した（図２Ｃ）。その結果、Ｒｅｇｉｏｎ ２Ａの領域を含むＦｒａｇｍｅｎｔ１と３のルシフェラーゼ活性が高いことがわかった（図３ｂ）。上記のプロモーターアッセイの結果から、Ｒｅｇｉｏｎ ２Ａのメチル化はＣＴＧＦ遺伝子発現の抑制に重要な役割をしていると考えられる。
【００８５】
実施例６：卵巣癌臨床検体におけるＣＴＧＦプロモーター領域のメチル化
卵巣癌臨床検体でのＣＴＧＦ遺伝子のメチル化を明らかにするため、６６種類の卵巣癌臨床検体で、Ｒｅｇｉｏｎ ２Ａ周辺のメチル化部位を標的としたプライマーセットを用いて、Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ（ＭＳＰ）をおこなった。その結果を図２Ｄに示す。
【００８６】
ｂｉｓｕｌｆｉｔｅシーケンスとＣＯＢＲＡの結果と一致して、ＣＴＧＦの発現が欠失している細胞株（ＲＭＵＧ−Ｌ）はメチル化され、ＣＴＧＦが発現している細胞株（ＯＳＥ−２ａ）ではメチル化されていないことを確認した（図２Ｄ）。結果として、６６種の卵巣癌臨床検体のうち３９種でＣＴＧＦの高頻度メチル化を確認することができた（５９％、図２Ｄ）。また、ＭＳＰ解析でメチル化されていない腫瘍は、ｂｉｓｕｌｆｉｔｅシーケンスにより、低頻度メチル化のパターンを示し、ＭＳＰ解析でメチル化が確認された腫瘍は、高頻度メチル化のパターンを示した（図２Ｄ）。ＣＴＧＦのメチル化と卵巣癌臨床検体における遺伝子サイレンシングの関連性を調べるため、４３症例の卵巣癌臨床検体から調製したｃＤＮＡを用い、ＣＴＧＦ ｍＲＮＡの発現状態をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲで確認することにした。その結果、ＭＳＰによりＣＴＧＦ Ｒｅｇｉｏｎ ２Ａのメチル化を示す場合では、メチル化を示さない場合よりも、遺伝子の発現が充分低いレベル（Ｐ＝０．０４１、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ ｔｅｓｔ、図２Ｄ）であり、この結果から、ＣＴＧＦ Ｒｅｇｉｏｎ ２Ａのメチル化は遺伝子サイレンシングに関連していることが考えられる。また、卵巣癌６６症例についての、ＣＴＧＦ ＣｐＧアイランドのメチル化と臨床病理診断との関連性を調べた結果を表４に示す。
【００８７】
【表４】
【００８８】
実施例７：卵巣癌臨床検体におけるＣＴＧＦの発現レベルと臨床病理学的特性間の関連性
卵巣癌におけるＣＴＧＦ遺伝子の臨床的意義を明らかにするため、ＣＴＧＦ特異的抗体を用いて卵巣癌臨床検体におけるＣＴＧＦ蛋白質の発現レベルを免疫組織化学染色により評価することにした。具体的な方法としては、パラフィン包埋した組織切片をホルマリン固定することでおこなった。シランコートされたガラススライド上の切片は、脱パラフィン化とエタノールによる段階的な脱水をおこなった。抗原は、９５℃で１０分間ｈｉｇｈ ｐＨ ｂｕｆｆｅｒ（Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ社 Ｔａｒｇｅｔ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ ｐＨ）中でオートクレーブ前処理により取り出した。内因性ペルオキシダーゼは５％過酸化水素を用いて阻害した。非特異的染色は２％標準ブタ血清で阻害した。そのスライドは抗ヒトＣＴＧＦヤギポリクローナル抗体（Ｌ−２０、１：１００希釈；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用いて４℃で一晩インキュベートした。スライドはＨｉｓｔｏｆｉｎｅ シンプルステインＭＡＸ ＰＯ（Ｇ）（Ｎｉｃｈｒｅｉ社）を用いて室温で２時間反応させた。抗原―抗体反応は０．２％ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリドと過酸化水素により可視化した。そのスライドはＭａｙｅｒ'ｓ ヘマトキシリンを用いて対比染色した。
【００８９】
免疫組織染色の結果は、レベル０（ネガティブ染色）、レベル１（腫瘍細胞の１−１０％が染色）、レベル２（腫瘍細胞の１０−５０％が染色）、レベル３（腫瘍細胞の５０％以上が染色）に分類した。ＣＴＧＦの高レベルな免疫反応は、正常卵巣上皮において確認することができた（図３Ａ左）。ＣＴＧＦ蛋白質は、正常または腫瘍上皮細胞の細胞膜または細胞質に優位に局在していることが明らかになった。
【００９０】
いくつかの卵巣癌サンプルではＣＴＧＦの高い発現を検出したが（図３Ａ中央）、ＣＴＧＦの発現が弱い（レベル１）、または無い（レベル０）卵巣癌サンプルも高頻度に確認することができた（図３Ａ右）。卵巣癌サンプルにおいて、ＣＴＧＦの低い発現レベル（レベル０と１）は８１％（５７症例中４６症例）、高い発現レベル（レベル２と３）は１９％（５７症例中１１症例）であった。ＣＴＧＦ蛋白質発現のレベルと臨床病理学的特性との関連性を表５にまとめて示す。この結果から、ＣＴＧＦ蛋白質の発現は、腫瘍のステージと関連性があることがわかる。ＣＴＧＦの発現が欠失している腫瘍は低いステージ（Ｓｔａｇｅ ＩとＩＩ）である傾向が高く、ＣＴＧＦの発現を提示している腫瘍は高いステージ（Ｓｔａｇｅ ＩＩＩとＩＶ）の傾向が高い。
【００９１】
【表５】
【００９２】
総体的な生存率としては、ＣＴＧＦ蛋白質の発現が低い卵巣癌患者は、ＣＴＧＦ蛋白質の発現が高い患者と比較してより高い生存率を示す（Ｐ＝０．１２８、Ｌｏｇ−ｒａｎｋ ｔｅｓｔ；図３Ｂ左）。Ｓｔａｇｅ ＩとＩＩの症例では、ＣＴＧＦ蛋白質の発現が低いと生存率が低くなる（図３Ｂ中央）。また、Ｓｔａｇｅ ＩＩＩとＩＶの症例では、ＣＴＧＦ蛋白質の発現が高いと生存率が低くなる（Ｐ＝０．１８９、Ｌｏｇ−ｒａｎｋ ｔｅｓｔ；図３Ｂ右）。
この傾向は、６０歳以下で転移性表現型と関連のあるＳｔａｇｅ ＩＩＩｃとＩＶの症例に限定するとより明らかである（Ｐ＝０．０３３、Ｌｏｇ−ｒａｎｋ ｔｅｓｔ；図３Ｃ）。このことから、腫瘍形成においてＣＴＧＦの不活性化の役割は、卵巣癌のステージ間で異なることが考えられる。
【００９３】
実施例８：ＣＴＧＦ遺伝子の活性化による卵巣癌の増殖抑制
これまでの結果をふまえ、ＣＴＧＦ遺伝子発現を活性化することで、卵巣癌の増殖の抑制が可能かどうかを検討した。まず、ＣＴＧＦ遺伝子のＭｙｃタグを発現するプラスミド（ｐＣＭＶ−３Ｔａｇ４−ＣＴＧＦ）を構築した。これは全長を有するＣＴＧＦ遺伝子の役割をモニタリングするために使用できる。本プラスミドは、ＲＴ−ＰＣＲにより増幅したＣＴＧＦ ｃＤＮＡをｐＣＭＶ−３Ｔａｇ４ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）にＭｙｃタグと翻訳フレームがあうように挿入して作製した。対照として、ＣＴＧＦ遺伝子を挿入しない空ベクター（ｐＣＭＶ−３Ｔａｇ４−ｍｏｃｋ）を使用した。これらの発現プラスミドを、トランスフェクション試薬であるＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）と混合し、ＨＮＯＡ細胞またはＨＭＯＡ細胞へトランスフェクションした。４８時間後細胞を回収し、抗Ｍｙｃ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用いたウエスタンブロットによりCTGF蛋白質の発現を確認した（図４Ａ）。
【００９４】
また、トランスフェクションの２週間後に、ネオマイシン系薬剤であるＧ４１８存在下で増殖した細胞を７０％エタノールで固定し、クリスタルバイオレッドで染色することによりカウントした。その結果、空ベクターでトランスフェクションした細胞と比べて、ｐＣＭＶ−３Ｔａｇ４−ＣＴＧＦでトランスフェクションした細胞は顕著にコロニー数が減少した（図４Ｂ）。この結果は明らかにＣＴＧＦ遺伝子の発現を活性化することで、卵巣癌の増殖を抑制でき癌抑制剤として機能することを示している。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】Ａ：２４種の卵巣癌細胞株におけるコピー数の増幅と欠失のゲノム全体の頻度。クローンは、ＵＣＳＣマッピング位置（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／［ｖｅｒｓｉｏｎ Ｍａｙ，２００４］に基づいて１−２２、Ｘ、Ｙ染色体の順番で整列した。アスタリスクは、高レベルの増幅（ｌｏｇ２ｒａｔｉｏ＞ ０．４）、またはホモ欠失（ｌｏｇ２ｒａｔｉｏ＜ −０．４）の認められた領域を示す（表１）。Ｂ：卵巣癌細胞株での６ｑ２３．２染色体領域の増幅の確認。上部；ＲＭＵＧ−Ｓ細胞株の代表的な増幅のアレイＣＧＨイメージ。６ｑ２３．２染色体領域のＢＡＣクローンのホモ欠失は明らかなシグナルで確認できる（矢印）。下部；ＲＭＵＧ−Ｓ細胞株での６ｑ２３．１−２３．２のホモ欠失領域をカバーするマップ。水平線で示したＢＡＣ（ＲＰ１１−６９Ｉ８）はアレイＣＧＨ解析においてホモ欠失である。ＲＭＵＧ−Ｓ細胞株におけるホモ欠失の領域は、ゲノミックＰＣＲにより決定し、白い両端矢印で示す。ＲＭＵＧ−Ｓ細胞株でゲノミックＰＣＲにより決定したホモ欠失領域周辺に位置する１０遺伝子、ホモ欠失（８遺伝子）または残っている遺伝子（２遺伝子）を矢印で示す。Ｃ：卵巣癌細胞株での６ｑ２３ホモ欠失領域周辺に位置する遺伝子のゲノミックＰＣＲとＲＴ−ＰＣＲ解析上部；ゲノミックＰＣＲによりＣＴＧＦ、ＥＮＰＰ１、ＥＮＰＰ３、ＣＲＳＰ３、ＡＲＧ１、ＡＫＡＰ７、ＥＰＢ４１Ｌ２、ＫＩＡＡ１９１３のホモ欠失は１つの卵巣癌細胞株において確認された。１：ＨＴ、２：ＨＴＯＡ、３：ＨＵＯＡ、４：ＫＦ２８、５：ＭＨ、６：ＯＶＫＡＴＥ、７：ＯＶＳＡＨＯ、８：ＫＦｒ１３、９：ＨＭＫＯＡ、１０：ＭＣＡＳ、１１：ＲＭＵＧ−Ｌ、１２：ＲＭＵＧ−Ｓ、１３：ＫＫ、１４：ＯＶＩＳＥ、１５：ＯＶＭＡＮＡ、１６：ＯＶＴＯＫＯ、１７：ＲＭＧ−Ｉ、１８：ＲＭＧ−ＩＩ、１９：ＥＳ−２、２０：Ｗ３ＵＦ、２１：ＨＩＯＡｎｕ、２２：ＨＭＯＡ、２３：ＨＮＯＡ、２４：ＨＴＢＯＡ。下部；卵巣癌細胞株と正常卵巣と正常卵巣上皮細胞由来細胞株（ＯＳＥ−２ａ）におけるＣＴＧＦ、ＥＮＰＰ１、ＥＮＰＰ３、ＣＲＳＰ３、ＡＫＡＰ７、ＥＰＢ４１Ｌ２、ＫＩＡＡ１９１３のｍＲＮＡの発現はＲＴ−ＰＣＲにより確認した。アローヘッドはゲノミックＰＣＲ解析によりホモ欠失を示した細胞株を示す。ＣＲＳＰ３、ＡＫＡＰ７、ＥＰＢ４１Ｌ２ ｍＲＮＡの発現は多くの卵巣癌細胞株で多少の減少を示した。そして、ＥＮＰＰ１、ＥＮＰＰ３、ＣＴＧＦのｍＲＮＡの発現は高頻度に消失した。ホモ欠失以外のＣＴＧＦ遺伝子発現の減少は２３細胞株中１２種（５０％）であった。Ｄ：５−ａｚａ−ｄＣｙｄ（５μＭ）５日間と／またはＴＳＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）１２時間の処理あり（＋）なし（−）をおこなった卵巣癌細胞株（ＨＮＯＡとＲＭＧ−Ｉ）におけるＣＴＧＦ遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ解析の結果を示す。
【図２】卵巣癌細胞株と卵巣癌臨床検体におけるＣＴＧＦ ＣｐＧリッチ領域のメチル化状態Ａ：ＣＴＧＦ遺伝子のエキソン1周辺のＣｐＧアイランド（白い矢印）を含むＣｐＧリッチ領域の概略図とｂｉｓｕｌｆｉｔｅシーケンスの代表的な結果。ＣｐＧ部位は垂直線で示す。エキソン１はオープンボックスで示し、転写開始点は＋１で記す。プロモーターアッセイに用いた断片は、太い黒線で示す。ＣＯＢＲＡ法とｂｉｓｕｌｆｉｔｅシーケンスで確認した領域は灰色線で示す。ＣＯＢＲＡ法のための制限酵素部位ＢｓｔＵＩは黒のアローヘッドで表す。 ＣＴＧＦを発現している卵巣癌細胞株（＋）とＣＴＧＦを発現していない卵巣癌細胞株（−）において調べたＣｐＧリッチ領域のｂｉｓｕｌｆｉｔｅシーケンスの代表的な結果。各白と黒の四角は非メチル化とメチル化ＣｐＧ部位を示し、各列は１種類のクローン由来である。ＭＳＰのためのＰＣＲプライマーは矢印で示す。Ｂ：ＢｓｔＵＩ消化後の卵巣癌細胞株におけるＣＴＧＦ ＣｐＧアイランドのＣＯＢＲＡ法の代表的な結果。矢印はメチル化ＣｐＧ部位特異的に消化された断片を示す。アローヘッドは消化されない断片で非メチル化ＣｐＧであることを示す。Ｃ：ＣＴＧＦ ＣｐＧリッチ領域のプロモーター活性。ｐＧＬ３空ベクター（ｍｏｃｋ）とＣｐＧアイランドＦｒａｇｍｅｎｔ １−３の異なった配列を含むレポーターを構築した。それらを内部コントロールベクター（ｐＲＬ−ｈＴＫ）と共にＲＭＵＧ−Ｓ細胞、ＫＫ細胞、ＫＦ２８細胞へトランスフェクションした。ルシフェラーゼ活性はコントロールに対してノーマライズした。データは３つの独立した実験の平均±ＳＤを示す。Ｄ：上部左；卵巣癌臨床検体におけるＣＴＧＦプロモーター領域のＭＳＰ解析の代表的な結果。並列に非メチル化（Ｕ）またはメチル化（Ｍ）ＤＮＡに特異的なプライマー用いて検討した。下部；ＣＴＧＦプロモーター領域のメチル化状態は腫瘍サンプルによりｂｉｓｕｌｆｉｔｅシーケンスにより決定した。上部右；粘液型腫瘍を除いた４３種の卵巣癌臨床検体について、ＭＳＰにより決定したＣＴＧＦのメチル化状態とＲＴ−ＰＣＲにより決定したｍＲＮＡ発現状態の相関関係。
【図３】卵巣癌臨床検体におけるＣＴＧＦ発現の免疫組織化学解析。Ａ：正常ヒト卵巣上皮細胞と卵巣癌臨床検体における代表的なＣＴＧＦ免疫化学染色。左；ＣＴＧＦの高い発現は正常卵巣上皮細胞で見られる。中央と右；ＣＴＧＦの発現が高い（中央）またはほとんどない（右）結果は、卵巣癌臨床検体における癌細胞で見られる。正常上皮細胞と卵巣癌細胞において、ＣＴＧＦは細胞質の頂点にはっきりと局在している。倍率ｘ２００。Ｂ：卵巣癌患者の全体の生存率に対するカプラン・マイヤーカーブ。左；全てのステージの腫瘍において、免疫組織化学法により確認したＣＴＧＦの発現が低い患者は、ＣＴＧＦの発現が高い患者よりも生存率が良いことを示す（Ｐ＝０．１２８、Ｌｏｇ−ｒａｎｋ ｔｅｓｔ）。中央；ステージＩ、ＩＩの腫瘍において、ＣＴＧＦの発現が高い患者グループで死亡が認められなかったため統計解析をおこなうことはできないが、ＣＴＧＦの発現が低い患者は、ＣＴＧＦの発現が高い患者よりも生存率が短い傾向があることを示す。右；ステージＩＩＩ、ＩＶの腫瘍において、ＣＴＧＦの発現が高い患者は、ＣＴＧＦの発現が低い患者よりも生存率が短いことを示す（Ｐ＝０．１８９、Ｌｏｇ−ｒａｎｋ ｔｅｓｔ）。Ｃ：６０歳以下でステージＩＩＩｃとＩＶの卵巣癌患者の全体的な生存率に対するカプラン・マイヤーカーブ。６０歳以下で転移表現型に関連したステージＩＩＩｃとＩＶの卵巣癌患者に制限した場合、解析に含まれるのは少数の症例であるにも関わらず、ＣＴＧＦの発現が高い患者は、ＣＴＧＦの発現が低い患者よりも明らかに生存率が短いことを示す（Ｐ＝０．０３３、Ｌｏｇ−ｒａｎｋ ｔｅｓｔ）。
【図４】卵巣癌の増殖におけるＣＴＧＦの発現の効果（Ａ、Ｂ）。ｐＣＭＶ−３Ｔａｇ４−ＣＴＧＦまたはｐＣＭＶ−３Ｔａｇ４−ｍｏｃｋをＣＴＧＦ遺伝子が欠失している細胞株（ＨＮＯＡ、ＨＭＯＡ）にトランスフェクションした。Ａ：トランスフェクション後４８時間の細胞から抽出した蛋白質１０μｇを用いて抗Ｍｙｃ抗体でウエスタンブロット解析をおこなった。Ｂ：ＣＴＧＦ遺伝子が発現していない細胞株（ＨＮＯＡ、ＨＭＯＡ）を用いたコロニーフォーメーションアッセイ。これらの細胞へＣＴＧＦを含むＭｙｃタグベクター（ｐＣＭＶ−３Ｔａｇ４−ＣＴＧＦ）または、空ベクター（ｐＣＭＶ−３Ｔａｇ４−ｍｏｃｋ）を一過性でトランスフェクションし、Ｇ４１８存在下で２週間薬剤選択をおこなった。上部；トランスフェクション後２週間で薬剤耐性コロニーを形成した結果、ＣＴＧＦ遺伝子をトランスフェクションした細胞のコロニー形成は、空ベクターをトランスフェクションした細胞よりも少ないことがわかった。下部；コロニー形成の定量解析。＞２ｍｍコロニーをカウントした、そしてその結果は３回の別々の実験の平均値±ＳＤとして表した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、卵巣癌をその遺伝子型を観察することで初期に診断することを目的として、特定の染色体領域に存在する遺伝子の変化を検出することによって癌を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
卵巣癌［ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ（ＯＣ）］は、５０〜７０歳の女性に最も多く発生し、婦人科癌の中では２番目に多い癌であり、死亡数は他の婦人科癌よりも多いことが知られている。卵巣癌には様々な種類があり、それぞれ卵巣中の異なる種類の細胞から発生するが、卵巣癌の約８０％以上は卵巣表面に発生する上皮癌である。
【０００３】
近年、卵巣癌のための診断と治療の手順は進歩しているにも関わらず、いまだ、早期診断は困難なままとなっている。このため、卵巣癌における原因遺伝子を見つけ出し、その機能を解明することは、効果的な治療、診断マーカーの探索、化学的予防のための新しい戦略の知見を築くためにも強く望まれている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
卵巣由来、主に卵巣上皮由来細胞の癌化についての遺伝子レベルでのメカニズムが解明されれば、遺伝子レベルにおける卵巣由来細胞の癌化の発見や、卵巣癌の悪性度の診断、進行の抑制をおこなうことが可能となり、さらに、メカニズムに基づく薬剤の選別、開発や治療法の確立が可能となるはずである。具体的には、卵巣癌に特徴的な挙動を示す遺伝子を同定して、遺伝子を中心とした技術的検討をおこなうことにより、この課題を解決することができると考えられる。即ち、本発明は、卵巣癌などの癌に特徴的な挙動を示す遺伝子を同定して癌の検出方法及び細胞増殖抑制剤を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ （ＣＧＨ）はゲノム上で多数の遺伝子増幅並びに欠失、あるいは遺伝子の不活性化に伴う遺伝子異常を解析するためには、簡便で迅速であり、最良の方法である。そして、癌化並びに癌の悪性化などに関与するゲノム上の遺伝子異常を解析するためにＣＧＨアレイに搭載する８００種類のＢＡＣ/ＰＡＣ ＤＮＡを選別する（ＭＣＧ ＣａｎｃｅｒＡｒｒａｙ-８００；Ｔａｋａｄａ Ｈ．， ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ．９６，１００−１０５，２００５）ことにより、卵巣由来の細胞の癌化を促進する癌関連遺伝子、すなわち、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＣＴＧＦ）遺伝子の同定に成功した。そして、ＣＴＧＦ遺伝子の欠失、または不活性化、すなわち、ＣＴＧＦ蛋白質の減少が卵巣癌の増殖を顕著に促進すること、また、ＣＴＧＦ遺伝子の転写産物または蛋白質を増加させると卵巣癌の増殖が著しく低下することを見出すことに成功し、本発明を完成した。
【０００６】
即ち、本発明によれば、検体において、２ｑ１４．２、３ｐ２４．１、３ｑ２６．２、３ｑ２９、４ｑ３４．２、６ｑ２３、９ｐ２１．３、１１ｑ１３．３、１３ｑ２２．１、１３ｑ３３．１、１３ｑ３３．３、１５ｑ１２、１５ｑ１５．１、１７ｐ１２、１７ｐ１３．１、１７ｐ１３．３、１８ｑ２１．１、１８ｑ２１．２、１８ｑ２１．３１、１８ｑ２１．３２、１８ｑ２１．３３、１８ｑ２３、２０ｑ１３．１３、２０ｑ１３．２、２０ｑ１３．３１、２０ｑ１３．３３、Ｘｐ１１．２３、Ｘｐ１３．１、Ｘｐ１３．３、Ｘｐ２６．２、Ｘｐ２６．３、Ｘｑ２８の染色体領域に存在する遺伝子の変化を少なくとも１つ以上を検出することにより、検体の悪性度を含めた癌化を検出する、癌の検出方法が提供される。
【０００７】
好ましくは、遺伝子はＧＬＩ２、ＣＣＮＤ１、ＦＧＦ３、ＴＧＦＢＲ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＴＡＰ、ＳＭＡＤ４、ＥＶＩ１、ＭＵＣ４、ＰＴＰＮ１、ＺＮＦ２１７、ＢＣＡＳ１、ＴＦＡＰ２Ｃ、ＢＩＲＣ７、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ、ＶＥＧＦＣ、ＫＬＦ１２、ＦＧＦ１４、ＥＦＮＢ２、ＧＡＢＲＢ３、ＲＡＤ５１、ＲＨ６８６２１、ＰＭＰ２２、ＲＣＶ１、ＨＳＸＩＡＰＡＦ１、ＡＢＲ、ＨＩＣ１、ＭＡＤＨ４（ＳＭＡＤ４）、ＤＣＣ、ＭＡＬＴ１、ＧＲＰ、ＳＥＲＰＩＮＢ５、ＦＶＴ１、ＢＣＬ２、ＳＥＲＰＩＮＢ３、ＢＣＬ２、ＣＴＤＰ１、ＳＨＧＣ−１４５８２０、ＳＳＸ１、ＡＲ、ＭＬＬＴ７、ＡＢＣＢ７、ＧＰＣ３、ＦＧＦ１３、ＭＡＧＥＡ２、ＫＩＡＡ１９１３、ＥＰＢ４２Ｌ２、ＡＫＡＰ７、ＣＲＳＰ３、ＡＲＧ１、ＥＮＰＰ３、ＥＮＰＰ１、ＣＴＧＦの少なくとも１つ以上である。
【０００８】
好ましくは、遺伝子の変化は、増幅、欠失、不活性化の少なくとも１つ以上である。
好ましくは、遺伝子の変化は、ＣｐＧアイランドのメチル化による不活性化である。
好ましくは、検体において、請求項２に記載の遺伝子から翻訳される蛋白質の量を検出することにより、検体の悪性度を含めた癌化を検出する。
好ましくは、蛋白質の量を免疫組織化学的法により検出する。
好ましくは、ＣＴＧＦ遺伝子の欠失又は不活性化を検出することにより、検体の悪性度を含めた癌化を検出する。
【０００９】
好ましくは、検体は、卵巣由来の組織である。
好ましくは、癌は、卵巣癌である。
好ましくは、遺伝子の変化を、ＤＮＡチップ法、サザンブロット法、ノーザンブロット法、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法、ＦＩＳＨ法、ＣＧＨ法、または、アレイＣＧＨ法、Ｂｓｕｌｆｉｔｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ法、ＣＯＢＲＡ法を用いて検出する。
【００１０】
さらに本発明によれば、ＫＩＡＡ１９１３、ＥＰＢ４２Ｌ２、ＡＫＡＰ７、ＣＲＳＰ３、ＡＲＧ１、ＥＮＰＰ３、ＥＮＰＰ１、ＣＴＧＦ遺伝子、または、該遺伝子の発現産物である蛋白質をインビトロで細胞に導入することを含む、細胞の増殖を抑制する方法が提供される。
さらに本発明によれば、ＫＩＡＡ１９１３、ＥＰＢ４２Ｌ２、ＡＫＡＰ７、ＣＲＳＰ３、ＡＲＧ１、ＥＮＰＰ３、ＥＮＰＰ１、ＣＴＧＦ遺伝子、または、該遺伝子の発現産物である蛋白質を含む、細胞増殖抑制剤が提供される。
さらに本発明によれば、ＫＩＡＡ１９１３、ＥＰＢ４２Ｌ２、ＡＫＡＰ７、ＣＲＳＰ３、ＡＲＧ１、ＥＮＰＰ３、ＥＮＰＰ１、ＣＴＧＦ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは機能欠失型遺伝子を、インビトロで腫瘍細胞に導入することを含む、細胞の増殖を活性化する方法が提供される。
さらに本発明によれば、ＫＩＡＡ１９１３、ＥＰＢ４２Ｌ２、ＡＫＡＰ７、ＣＲＳＰ３、ＡＲＧ１、ＥＮＰＰ３、ＥＮＰＰ１、ＣＴＧＦ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは機能欠失型遺伝子を含む、細胞増殖活性化剤が提供される。
【００１１】
さらに本発明によれば、ＫＩＡＡ１９１３、ＥＰＢ４２Ｌ２、ＡＫＡＰ７、ＣＲＳＰ３、ＡＲＧ１、ＥＮＰＰ３、ＥＮＰＰ１、ＣＴＧＦ遺伝子のＣｐＧアイランドのメチル化に起因して遺伝子の発現が抑制されている卵巣癌に対して、被験物質を接触させて、遺伝子の発現を検出し、遺伝子発現が被験物質を接触させない系よりも増加していた場合に、被験物質を、遺伝子のＣｐＧアイランドの脱メチル化により遺伝子を活性化させることができる抗腫瘍物質として選別する、物質のスクリーニング法が提供される。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、卵巣由来の細胞検体における癌化、悪性度を的確に把握することが可能となった。また、卵巣癌において、遺伝子発現を不活性化するＣＴＧＦ遺伝子の転写産物を導入することにより、卵巣癌の増殖を抑制することができる。また、ＣＴＧＦ遺伝子の発現が不活性化することにより発生する卵巣癌の治療剤のスクリーニングをおこなうことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
（１）癌の検出方法
本発明による癌の検出方法は、検体において、２ｑ１４．２、３ｐ２４．１、３ｑ２６．２、３ｑ２９、４ｑ３４．２、６ｑ２３、９ｐ２１．３、１１ｑ１３．３、１３ｑ２２．１、１３ｑ３３．１、１３ｑ３３．３、１５ｑ１２、１５ｑ１５．１、１７ｐ１２、１７ｐ１３．１、１７ｐ１３．３、１８ｑ２１．１、１８ｑ２１．２、１８ｑ２１．３１、１８ｑ２１．３２、１８ｑ２１．３３、１８ｑ２３、２０ｑ１３．１３、２０ｑ１３．２、２０ｑ１３．３１、２０ｑ１３．３３、Ｘｐ１１．２３、Ｘｐ１３．１、Ｘｐ１３．３、Ｘｐ２６．２、Ｘｐ２６．３、Ｘｑ２８の染色体領域に存在する遺伝子の変化を少なくとも１つ以上を検出することにより、検体の悪性度を含めた癌化を検出することを特徴とする。より具体的には、上記の遺伝子としては、ＧＬＩ２、ＣＣＮＤ１、ＦＧＦ３、ＴＧＦＢＲ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＴＡＰ、ＳＭＡＤ４、ＥＶＩ１、ＭＵＣ４、ＰＴＰＮ１、ＺＮＦ２１７、ＢＣＡＳ１、ＴＦＡＰ２Ｃ、ＢＩＲＣ７、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ、ＶＥＧＦＣ、ＫＬＦ１２、ＦＧＦ１４、ＥＦＮＢ２、ＧＡＢＲＢ３、ＲＡＤ５１、ＲＨ６８６２１、ＰＭＰ２２、ＲＣＶ１、ＨＳＸＩＡＰＡＦ１、ＡＢＲ、ＨＩＣ１、ＭＡＤＨ４（ＳＭＡＤ４）、ＤＣＣ、ＭＡＬＴ１、ＧＲＰ、ＳＥＲＰＩＮＢ５、ＦＶＴ１、ＢＣＬ２、ＳＥＲＰＩＮＢ３、ＢＣＬ２、ＣＴＤＰ１、ＳＨＧＣ−１４５８２０、ＳＳＸ１、ＡＲ、ＭＬＬＴ７、ＡＢＣＢ７、ＧＰＣ３、ＦＧＦ１３、ＭＡＧＥＡ２、ＫＩＡＡ１９１３、ＥＰＢ４２Ｌ２、ＡＫＡＰ７、ＣＲＳＰ３、ＡＲＧ１、ＥＮＰＰ３、ＥＮＰＰ１、ＣＴＧＦの少なくとも１つ以上を選択することができる。特に好ましくは、卵巣由来の細胞におけるＣＴＧＦ遺伝子の欠失又は不活性化を検出することにより、検体の悪性度を含めた癌化を検出することができる。
【００１４】
ヒトゲノムプロジェクトの成果により、ＣＴＧＦ遺伝子の転写産物は既に知られており、６ｑ２３染色体領域に存在する遺伝子である。ＣＴＧＦ遺伝子がコードする蛋白質は、ＣＣＮ（ＣＴＧＦ、ＣＹＲ６１、ＮＯＶ）ファミリーに属し、血管形成、骨形成、腎臓疾患、皮膚疾患などの生化学的や病理学的なプロセスに広く関与することが知られている。しかし、詳細な機能は不明であり、このＣＴＧＦ遺伝子が、卵巣癌の発症、または悪性度に関わる重要な癌関連遺伝子であることは知られていない。
【００１５】
上述したように、本検出方法は、卵巣由来の細胞や卵巣癌におけるＣＴＧＦ遺伝子の欠失や不活性化を検出することを特徴とする方法である。
ＣＴＧＦ遺伝子の欠失や不活性化を検出する対象となる卵巣由来の細胞や卵巣癌は、検体提供者の生検組織細胞が好適である。
この検体組織細胞は、健常人の卵巣に由来する細胞か、卵巣癌患者の癌組織であるかを問わないが、現実的には、検査等の結果、卵巣に癌化が疑われる病変部が認められた場合の病変組織、または卵巣癌であることが確定しているが、その悪性度や進行度を判定する必要がある卵巣癌の組織、等が主な対象となり得る。
【００１６】
本検出方法により、「検査等の結果、卵巣に由来する組織や細胞に癌化が疑われる病変部が認められた場合の病変組織」におけるＣＴＧＦ遺伝子の欠失や不活性化が認められた場合には、病変組織は癌化に向かって進行しているか、あるいは既に癌化の状態であり、かつ、悪性度が高くなりつつあることが判明し、早急な本格的治療（手術等による病変部の除去、本格的な化学療法等）をおこなう必要性が示される。また、「卵巣癌であることが確定しているが、その悪性度や進行度を判定する必要がある卵巣癌の組織」におけるＣＴＧＦ遺伝子の欠失や不活性化が認められた場合にも、癌組織の悪性度が高くなりつつあることが判明し、早急な本格的治療手術等による病変部の除去、本格的な化学療法等）をおこなう必要性が示される。検体として採取された卵巣癌組織は、必要な処理、例えば、採取された組織からのＤＮＡ或るいはＲＮＡの調製をおこない、本検出方法をおこなう対象とすることができる。
【００１７】
（２）ＣＴＧＦ遺伝子の欠失の検出
ＣＴＧＦ遺伝子の欠失の検出を直接的におこなうことができる代表的な方法として、ＣＧＨ（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法とＦＩＳＨ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法を挙げることができる。この態様の本検出方法は、ＣＴＧＦ遺伝子を有するＢＡＣ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ＤＮＡ、ＹＡＣ（Ｙｅａｓｔ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ＤＮＡ、ＰＡＣ（Ｐ１−ｄｒｉｖｅｄ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ＤＮＡ（以下、ＢＡＣ ＤＮＡ等ともいう）を標識し、ＦＩＳＨをおこなうと、ＣＴＧＦ遺伝子の有無、すなわち欠失を検出することができる。具体的には、ＣＴＧＦ遺伝子を有するＢＡＣ ＤＮＡとしては、ＲＰ１１−６９I8等を上げることができる。
【００１８】
上記の態様の方法は、ゲノムＤＮＡ定着基盤を用いておこなうことが、好適であり、かつ、現実的である。
【００１９】
通常に得られるＢＡＣ ＤＮＡ等は、ゲノムＤＮＡ定着基盤を多数製造して実用化するには少量であるので、当該ＤＮＡを遺伝子増幅産物として得る必要がある（この遺伝子増幅行程を「無尽蔵化」ともいう）。無尽蔵化においては、まずＢＡＣ ＤＮＡ等を、４塩基認識酵素、例えば、ＲｓａＩ、ＤｐｎＩ、ＨａｅＩＩＩ等で消化した後、アダプターを加えてライゲーションをおこなう。アダプターは１０〜３０塩基、好適には１５〜２５塩基からなるオリゴヌクレオチドで、２本鎖は相補的配列を有し、アニーリング後、平滑末端を形成する側の３‘-末端のオリゴヌクレオチドをリン酸化する必要がある。次に、アダプターの一方のオリゴヌクレオチドと同一配列を有するプライマーを用いて、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法により増幅し、無尽蔵化することができる。一方、各ＢＡＣ ＤＮＡ等に特徴的な５０〜７０塩基のアミノ化オリゴヌクレオチドを検出用プローブとして用いることもできる。
【００２０】
このようにして無尽蔵化したＢＡＣ ＤＮＡ等を基盤上、好適には固体基盤上に定着させることにより、所望するＤＮＡ定着基盤を製造することができる。固体基盤としては、ガラス板が好ましい。ガラス等の固体基盤は、ポリ−Ｌ−リジン、アミノシラン、金・アルミニウム等の凝着により基盤をコートすることがより好ましい。
【００２１】
上記の無尽蔵化したＤＮＡを基盤上にスポットする濃度は、好ましくは１０ｐｇ/μｌ〜５μｇ/μｌ、より好ましくは１ｎｇ/μｌ〜２００ｎｇ/μｌである。スポットする量は好ましくは１ｎｌ〜１μｌ、より好ましくは１０ｎｌ〜１００ｎｌである。また、基盤に定着させる個々のスポットの大きさ及び形状は、特に限定されないが、例えば、大きさは直径０．０１〜１ｍｍであり得、上面から見た形状は円形〜楕円形であり得る。乾燥スポットの厚みは、特に制限はないが、１〜１００μｍである。さらに、スポットの個数は、特に制限はないが、使用する基盤あたり１０〜５０，０００個、より好ましくは１００〜５，０００個である。それぞれのＤＮＡはＳｉｎｇｕｌａｒからＱｕａｄｒｕｐｌｉｃａｔｅの範囲でスポットするが、Ｄｕｐｌｉｃａｔｅ或るいはＴｒｉｐｌｉｃａｔｅにスポットすることが好ましい。
【００２２】
乾燥スポットの調整は、例えば、スポッターを用いて無尽蔵化したＢＡＣ ＤＮＡ等を基盤上にたらして、複数のスポットを形成した後、スポットを乾燥することにより製造することができる。スポッターとしてインクジェット式プリンター、ピンアレイ式プリンター、バブルジェット（登録商標）式プリンターが使用できるが、インクジェット式プリンターを使用することが望ましい。例えば、ＧＥＮＥＳＨＯＴ（日本ガイシ株式会社、名古屋）等を使用できる。
このようにして無尽蔵化したＢＡＣ ＤＮＡ等を基盤上、好適には固体基盤上に定着させることにより、所望するＤＮＡ定着基盤を製造することができる。
【００２３】
また、このＣＴＧＦ遺伝子の欠失を直接的に検出する手段の一つとしてサザンブロット法を挙げることができる。サザンブロット法は、検体から得られるゲノムＤＮＡを分離して固定し、これと、ＣＴＧＦ遺伝子とのハイブリダイズを検出することにより、検体中の当該遺伝子の存在を検出する方法である。
【００２４】
また、ノーザンブロット法、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法によりＣＴＧＦ遺伝子の欠失を検出してもよい。ノーザンブロット法は、検体から得られるｍＲＮＡを分離して固定し、これとＣＴＧＦとのハイブリダイゼーションを検出することにより、検体中の当該遺伝子のｍＲＮＡの存在を検出する方法である。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法は、逆転写反応とポリメラーゼ連鎖反応による目的遺伝子の増幅を経時的（リアルタイム）に測定する方法であり、増幅率に基づいて鋳型となるｍＲＮＡの定量を行なうことができる。この定量は蛍光色素を用いて行われ、二種類の方法がある。即ち、二重鎖DNAに特異的に挿入（インターカレート）して蛍光を発する色素 (例えば、SYBR green) を用いる方法と、増幅するDNA配列に特異的なオリゴヌクレオチドに蛍光色素を結合させたプローブを用いる方法が知られている。
【００２５】
（３）ＣＴＧＦ遺伝子の不活性化の検出
ＣｐＧリッチプロモーター並びにエキソン領域を密にメチル化すると転写不活性化が起こることが報告されている（Ｂｉｒｄ ＡＰ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ，９９，４５１−４５４，１９９９）．癌細胞では、ＣｐＧアイランドはそれ以外の領域と比較すると高い頻度で密にメチル化されており、プロモーター領域のＨｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎは、癌での癌抑制遺伝子の不活性化に深く関与している（Ｅｈｒｌｉｃｈ Ｍ．， ｅｔ ａｌ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２１，６６９４−６７０２，２００２）。
【００２６】
後述するように、実際、ＣＴＧＦ遺伝子のエキソンに存在するＣｐＧアイランドはプロモーター活性を有している。また、このＣｐＧアイランドのメチル化の度合いは、一部の卵巣癌でのＣＴＧＦ遺伝子発現の抑制と強く相関していた。
【００２７】
そして、卵巣癌を、脱メチル化試薬である５−アザデオキシシチジン（５−ａｚａ−ｄＣｙｄ）存在下で培養することにより、ＣｐＧアイランドを脱メチル化することができ、その結果、ＣＴＧＦ遺伝子発現を回復させることができた。これらの結果により、ＣｐＧアイランドの高頻度メチル化（Ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）が卵巣癌における癌抑制遺伝子の発現抑制を高頻度で起こす原因の一つであることが判明した。
【００２８】
上述した検出手段により、ＣＴＧＦ遺伝子の発現量が減少していることが判明した検体細胞（癌組織に由来するプライマリー癌細胞）に対して、脱メチル化剤（５−アザデオキシシチジンなど）を作用させて、遺伝子発現量の回復を検討することができる。すなわち、検体細胞に脱メチル化剤を作用させて、ＣＴＧＦ遺伝子の発現量が回復する場合には、検体細胞における遺伝子の抑制要因は、ＣｐＧアイランドのメチル化であり、検体提供者に、脱メチル化作用を有する薬剤を投与することにより、相応の抗腫瘍効果が期待される。
【００２９】
（４）細胞増殖の抑制方法、及び細胞増殖抑制剤
本発明によればさらに、ＫＩＡＡ１９１３、ＥＰＢ４２Ｌ２、ＡＫＡＰ７、ＣＲＳＰ３、ＡＲＧ１、ＥＮＰＰ３、ＥＮＰＰ１、ＣＴＧＦ遺伝子、または、該遺伝子の発現産物である蛋白質をインビトロで細胞に導入することを含む、細胞の増殖を抑制する方法、並びに上記遺伝子又は蛋白質を含む細胞増殖抑制剤が提供される。
【００３０】
ＫＩＡＡ１９１３、ＥＰＢ４２Ｌ２、ＡＫＡＰ７、ＣＲＳＰ３、ＡＲＧ１、ＥＮＰＰ３、ＥＮＰＰ１、ＣＴＧＦ遺伝子を取り扱う場合、当業者に公知の技術を用いて培養細胞などから取得したｃＤＮＡであってもよいし、ＰＣＲ法などにより酵素学的に合成したものでもよい。ＰＣＲ法によりＤＮＡを取得する場合、ヒトの染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、目的とする塩基配列を増幅できるように設計したプライマーを使用してＰＣＲを行う。ＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片は大腸菌などの宿主で増幅可能な適切なベクター中にクローニングすることができる。
【００３１】
ＫＩＡＡ１９１３、ＥＰＢ４２Ｌ２、ＡＫＡＰ７、ＣＲＳＰ３、ＡＲＧ１、ＥＮＰＰ３、ＥＮＰＰ１、ＣＴＧＦ遺伝子の検出ブローブ又はプライマーの調製、並びに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ、２nd Ｅｄ．、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ．、１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １〜３８、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）などに記載された方法に準じて行うことができる。
【００３２】
ＫＩＡＡ１９１３、ＥＰＢ４２Ｌ２、ＡＫＡＰ７、ＣＲＳＰ３、ＡＲＧ１、ＥＮＰＰ３、ＥＮＰＰ１、ＣＴＧＦ遺伝子は、ベクターに組み込んだ組換えベクターの形態で用いることができる。ベクターとしてはウイルスベクター又は動物細胞発現用ベクター、好ましくはウイルスベクターが用いられる。ウイルスベクターとしてはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられる。中でも、レトロウイルスベクターは、細胞に感染後、ウイルスゲノムが宿主染色体に組み込まれ、ベクターに組み込んだ外来遺伝子を安定にかつ長期的に発現させる可能であるからレトロウイルスベクターを使用することが特に望ましい。
【００３３】
動物細胞発現用ベクターとしては例えばｐＣＸＮ２（Ｇｅｎｅ，１０８，１９３−２００，１９９１）、ＰＡＧＥ２０７（特開平６−４６８４１号公報）又はその改変体などを用いることができる。
【００３４】
上記組換えベクターは適当な宿主に導入して形質転換し、得られた形質転換体を培養することによって生産することができる。組換えベクターがウイルスベクターの場合、これを導入する宿主としてはウイルス生産能を有する動物細胞が用いられ、例えば、ＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞などが挙げられる。レトロウイルスベクターの宿主としては、ΨＣＲＥ、ΨＣＲＩＰ、ＭＬＶなどが、アデノウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクターの宿主としては、ヒト胎児腎臓由来の２９３細胞などが用いられる。ウイルスベクターの動物細胞への導入はリン酸カルシウム法などで行うことができる。また、組換えベクターが動物細胞発現用ベクターの場合、これを導入する宿主としては大腸菌Ｋ１２株、ＨＢ１０１株、ＤＨ５α株などを使用でき、大腸菌の形質転換は当業者に公知である。
【００３５】
得られた形質転換体はそれぞれに適した培地、培養条件により培養する。例えば、大腸菌の形質転換体の培養は、生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他を含有するｐＨ５〜８程度の液体培地を用いて行うことができる。培養は通常１５〜４３℃で約８〜２４時間程度行う。この場合、目的とする組み換えベクターは、培養終了後、通常のＤＮＡ単離精製法により得ることができる。
【００３６】
また、動物細胞の形質転換体の培養は、例えば約５〜２０％のウシ胎児血清を含む１９９培地、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地などの培地を用いて行うことができる。培地のｐＨは約６〜８が好ましい。培養は通常約３０〜４０℃で約１８〜６０時間行う。この場合、目的とする組み換えベクターは、それを含有するウイルス粒子が培養上清中に放出されるので、ウイルス粒子の濃縮、精製を塩化セシウム遠心法、ポリエチレングリコール沈澱法、フィルター濃縮法などにより得ることができる。
【００３７】
本発明の細胞増殖抑制剤は、有効成分である上記遺伝子を遺伝子治療剤に通常用いる基剤と共に配合することにより製造することができる。また、上記遺伝子をウイルスベクターに組み込んだ場合は、組換えベクターを含有するウイルス粒子を調製し、これを遺伝子治療剤に通常用いる基剤と共に配合する。
【００３８】
有効成分である上記遺伝子又は蛋白質を配合するために使用する基剤としては、通常注射剤に用いる基剤を使用することができ、例えば、蒸留水、塩化ナトリウム又は塩化ナトリウムと無機塩との混合物などの塩溶液、マンニトール、ラクトース、デキストラン、グルコースなどの溶液、グリシン、アルギニンなどのアミノ酸溶液、有機酸溶液又は塩溶液とグルコース溶液との混合溶液などが挙げられる。あるいはまた、当業者に既知の常法に従って、これらの基剤に浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、植物油、界面活性剤などの助剤を用いて、溶液、懸濁液、分散液として注射剤を調製することもできる。これらの注射剤は、粉末化、凍結乾燥などの操作により用時溶解用製剤として調製することもできる。
【００３９】
本発明の細胞増殖抑制剤の投与形態としては、通常の静脈内、動脈内などの全身投与でもよいし、局所注射又は経口投与などの局所投与を行ってもよい。さらに、細胞増殖抑制剤の投与にあたっては、カテーテル技術、遺伝子導入技術、又は外科的手術などと組み合わせた投与形態をとることもできる。
【００４０】
本発明の細胞増殖抑制剤の投与量は、患者の年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、一般に、成人では一日当たり組み換え遺伝子の重量として１μｇ／ｋｇ体重から１０００ｍｇ／ｋｇ体重程度の範囲であり、好ましくは１０μｇ／ｋｇ体重から１００ｍｇ／ｋｇ体重程度の範囲である。投与回数は特に限定されない。
【００４１】
（５）細胞増殖の活性化方法、及び細胞増殖活性化剤
本発明によれば、ＫＩＡＡ１９１３、ＥＰＢ４２Ｌ２、ＡＫＡＰ７、ＣＲＳＰ３、ＡＲＧ１、ＥＮＰＰ３、ＥＮＰＰ１、ＣＴＧＦ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは機能欠失型遺伝子を、インビトロで腫瘍細胞に導入することを含む細胞の増殖を活性化する方法、並びに上記のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは機能欠失型遺伝子を含む細胞増殖活性化剤が提供される。
【００４２】
ｓｉＲＮＡは、約２０塩基（例えば、約２１〜２３塩基）またはそれ未満の長さの二本鎖ＲＮＡであり、このようなｓｉＲＮＡ は、細胞に発現させることにより、そのｓｉＲＮＡ の標的となる遺伝子（本発明においては、ＫＩＡＡ１９１３、ＥＰＢ４２Ｌ２、ＡＫＡＰ７、ＣＲＳＰ３、ＡＲＧ１、ＥＮＰＰ３、ＥＮＰＰ１、ＣＴＧＦ遺伝子）の発現を抑制することができる。
【００４３】
本発明において用いられるｓｉＲＮＡ は、ＲＮＡｉを引き起こすことができる限り、どのような形態のものでもよい。ここで、「ｓｉＲＮＡ 」とは、ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡの略称であり、人工的に化学合成されるかまたは生化学的に合成されたものか、あるいは生物体内で合成されたものか、あるいは約４０塩基以上の二本鎖ＲＮＡが体内で分解されてできた１０塩基対以上の短鎖二本鎖ＲＮＡをいい、通常、５'−リン酸、３'−ＯＨの構造を有しており、３'末端は約２塩基突出している。このｓｉＲＮＡ に特異的なタンパク質が結合して、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ−ｃｏｍｐｌｅｘ）が形成される。この複合体は、ｓｉＲＮＡ と同じ配列を有するｍＲＮＡを認識して結合し、ＲＮａｓｅＩＩＩ様の酵素活性によってｓｉＲＮＡ の中央部でｍＲＮＡを切断する。
【００４４】
ｓｉＲＮＡ の配列と、標的として切断するｍＲＮＡの配列とは１００％一致することが好ましい。しかし、ｓｉＲＮＡ の中央から外れた位置の塩基が一致していない場合については、ＲＮＡｉによる切断活性は部分的には残存することが多いので、必ずしも１００％一致していなくてもよい。
【００４５】
ｓｉＲＮＡの塩基配列と、発現を抑制すべきＫＩＡＡ１９１３、ＥＰＢ４２Ｌ２、ＡＫＡＰ７、ＣＲＳＰ３、ＡＲＧ１、ＥＮＰＰ３、ＥＮＰＰ１、ＣＴＧＦ遺伝子の塩基配列との間で相同性のある領域は、当該遺伝子の翻訳開始領域を含まないことが好ましい。翻訳開始領域には種々の転写因子や翻訳因子が結合することが予想されるため、ｓｉＲＮＡ が効果的にｍＲＮＡに結合することができず、効果が低減することが予測されるからである。従って、相同性を有する配列は、当該遺伝子の翻訳開始領域から２０塩基離れていることが好ましく、より好ましくは当該遺伝子の翻訳開始領域から７０塩基離れている。相同性を有する配列としては、例えば、当該遺伝子の３'末端付近の配列でもよい。
【００４６】
本発明の別の態様によれば、ＲＮＡｉにより標的遺伝子の発現を抑制することができる因子として、３'末端に突出部を有する短いヘアピン構造から成るｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）を使用することができる。ｓｈＲＮＡとは、一本鎖ＲＮＡで部分的に回文状の塩基配列を含むことにより、分子内で二本鎖構造をとり、ヘアピンのような構造となる約２０塩基対以上の分子のことを言う。そのようなｓｈＲＮＡは、細胞内に導入された後、細胞内で約２０塩基（代表的には例えば、２１塩基、２２塩基、２３塩基）の長さに分解され、ｓｉＲＮＡ と同様にＲＮＡｉを引き起こすことができる。上記の通りｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ と同様にＲＮＡｉを引き起こすことから、本発明において有効に用いることができる。
【００４７】
ｓｈＲＮＡは好ましくは、３'突出末端を有している。二本鎖部分の長さは特に限定されないが、好ましくは約１０ヌクレオチド以上であり、より好ましくは約２０ヌクレオチド以上である。ここで、３'突出末端は、好ましくはＤＮＡであり、より好ましくは少なくとも２ヌクレオチド以上のＤＮＡであり、さらに好ましくは２〜４ヌクレオチドのＤＮＡである。
【００４８】
上記の通り、本発明では、ＲＮＡｉによりＫＩＡＡ１９１３、ＥＰＢ４２Ｌ２、ＡＫＡＰ７、ＣＲＳＰ３、ＡＲＧ１、ＥＮＰＰ３、ＥＮＰＰ１、ＣＴＧＦ遺伝子の発現を抑制することができる因子として、ｓｉＲＮＡ またはｓｈＲＮＡを使用することができる。ｓｉＲＮＡの長所としては、（１）細胞内に導入してもＲＮＡ自体は正常細胞の染色体内に組み込まれないので、子孫に伝わる変異を起こすような治療ではなく、安全性が高いこと、及び（２）短鎖二本鎖ＲＮＡは化学合成が比較的容易であり二本鎖にするとより安定であること、などが挙げられる。また、ｓｈＲＮＡの長所としては、遺伝子発現を長期間抑制することによって治療を行う場合、細胞内でｓｈＲＮＡを転写するようなベクターを作製して細胞内に導入することができることなどが挙げられる。
【００４９】
本発明で用いるＲＮＡｉによりＫＩＡＡ１９１３、ＥＰＢ４２Ｌ２、ＡＫＡＰ７、ＣＲＳＰ３、ＡＲＧ１、ＥＮＰＰ３、ＥＮＰＰ１、ＣＴＧＦ遺伝子の発現を抑制することができるｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡは、人工的に化学合成してもよいし、センス鎖およびアンチセンス鎖のＤＮＡ配列を逆向きに連結したヘアピン構造のＤＮＡをＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによってインビトロでＲＮＡを合成することによって作製することもできる。インビトロで合成する場合は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼおよびＴ７プロモーターを用いて、鋳型ＤＮＡからアンチセンスおよびセンスのＲＮＡを合成することができる。これらをインビトロでアニーリングした後、細胞に導入すると、ＲＮＡｉが引き起こされ、標的遺伝子の発現が抑制される。ここでは、例えば、リン酸カルシウム法、又は各種のトランスフェクション試薬（例えば、oligofectamine、Lipofectamineおよびlipofectionなど）を用いてそのようなＲＮＡを細胞内に導入することができる。
【００５０】
上記したｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡは、細胞増殖活性化剤として有用である。本発明の細胞増殖活性化剤の投与方法は、経口投与、非経口投与（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、患部への局所投与、皮膚投与など）、患部への直接投与などが挙げられる。本発明の薬剤は、医薬組成物として使用する場合、必要に応じて薬学的に許容可能な添加剤を配合することができる。 薬学的に許容可能な添加剤の具体例としては、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、キャリア、賦形剤および／または薬学的アジュバントなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５１】
本発明の薬剤の製剤形態は特に限定されないが、例えば、液剤、注射剤、徐放剤などが挙げられる。本発明の薬剤を上記製剤として処方するために使用される溶媒としては、水性または非水性のいずれでもよい。
【００５２】
さらに、本発明の細胞増殖活性化剤の有効成分であるｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡは、非ウイルスベクターまたはウイルスベクターの形態で投与することができる。非ウイルスベクター形態の場合、リポソームを用いて核酸分子を導入する方法（リポソーム法、ＨＶＪ−リポソーム法、カチオニックリポソーム法、リポフェクション法、リポフェクトアミン法など）、マイクロインジェクション法、遺伝子銃（Ｇｅｎｅ Ｇｕｎ）でキャリア（金属粒子）とともに核酸分子を細胞に移入する方法などを利用することができる。ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡをウイルスベクターを用いて生体に投与する場合は、組換えアデノウイルス、レトロウイルスなどのウイルスベクターを利用することができる。無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス、ＳＶ４０などのＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスに、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを発現するＤＮＡを導入し、細胞または組織にこの組換えウイルスを感染させることにより、細胞または組織内に遺伝子を導入することができる。
【００５３】
本発明の細胞増殖活性化剤の投与量は、使用目的、疾患の重篤度、患者の年齢、体重、性別、既往歴、又は有効成分であるｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの種類などを考慮して、当業者が決定することができる。ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの投与量は特に限定されないが、例えば、約０．１ｎｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは約１ｎｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ／日である。ＲＮＡｉは、一般に投与後１〜３日間効果が見られる。したがって、毎日〜３日に１回の頻度で投与することが好ましい。発現ベクターを用いる場合、１週間に１回程度投与することも可能である。
【００５４】
本発明では、アンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞増殖活性化剤として使用することもできる。本発明で用いるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＫＩＡＡ１９１３、ＥＰＢ４２Ｌ２、ＡＫＡＰ７、ＣＲＳＰ３、ＡＲＧ１、ＥＮＰＰ３、ＥＮＰＰ１、ＣＴＧＦ遺伝子のＤＮＡ配列中の連続する５から１００の塩基配列に対して相補的な、またはハイブリダイズするヌクレオチドであって、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれであっても良く、また機能に支障がない限りにおいて修飾されたものであってもよい。本明細書で言う「アンチセンスオリゴヌクレオチド」とは、ＤＮＡ又はｍＲＮＡの所定の領域を構成するヌクレオチドに対応するヌクレオチドがすべて相補的であるもののみならず、ＤＮＡ又はｍＲＮＡとオリゴヌクレオチドとが安定にハイブリダイズできる限り、多少のミスマッチが存在してもよい。
【００５５】
なお、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、修飾されていてもよい。適当な修飾を施すことにより、当該アンチセンスオリゴヌクレオチドは生体内で分解されにくくなり、より安定してITIIαを阻害できるようになる。このような修飾されたオリゴヌクレオチドとしては、Ｓ−オリゴ型（ホスフォロチオエート型）、Ｃ−５チアゾール型、Ｄ−オリゴ型（フォスフォジエステル型）、Ｍ−オリゴ型（メチルフォスフォネイト型）、ペプチド核酸型、リン酸ジエステル結合型、Ｃ−５プロピニルピリミジン型、２−Ｏ−プロピルリボース、２'−メトキシエトキシリボース型等の修飾型のアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、リン酸基を構成する酸素原子の少なくとも一部がイオウ原子に置換、修飾されているものでもよい。このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ耐性、水溶性、ＲＮＡへの親和性に特に優れている。リン酸基を構成する酸素原子の少なくとも一部がイオウ原子に置換、修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、例えば、Ｓ−オリゴ型等のオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００５６】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基数は、５０以下であることが好ましく、２５以下であることがより好ましい。塩基数があまりに多くなると、オリゴヌクレオチドの合成の手間とコストが増大し、また、収率も低下する。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基数は５以上であり、９以上であることが好ましい。塩基数が４以下の場合には、標的遺伝子に対する特異性が低下して好ましくないためである。
【００５７】
アンチセンスオリゴヌクレオチド（又はその誘導体）は常法によって合成することができ、例えば、市販のＤＮＡ合成装置（例えばＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製など）によって容易に合成することができる。合成法はホスホロアミダイトを用いた固相合成法、ハイドロジェンホスホネートを用いた固相合成法などで得ることができる。
【００５８】
本発明においてアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞増殖活性化剤として使用する場合には、一般的には、アンチセンスオリゴヌクレオチドと製剤用添加物（担体、賦形剤など）とを含む医薬組成物の形態で提供される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトを含む哺乳動物に医薬として投与することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与経路は特に限定されず、経口投与または非経口投与（例えば、筋肉内投与、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、鼻腔などへの粘膜投与、または吸入投与など）の何れでもよい。
【００５９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの製剤形態は特に限定されず、経口投与のための製剤としては例えば、錠剤、カプセル剤、細粒剤、粉末剤、顆粒剤、液剤、シロップ剤などが挙げられ、非経口投与のための製剤としては例えば、注射剤、点滴剤、座剤、吸入剤、経粘膜吸収剤、経皮吸収剤、点鼻剤、点耳剤などが挙げられる。アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む薬剤の形態、使用すべき製剤用添加物、製剤の製造方法などは、いずれも当業者が適宜選択可能である。
【００６０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与量は、患者の性別、年齢または体重、症状の重症度、予防または治療といった投与目的、あるいは他の合併症状の有無などを総合的に考慮して適宜選択することができる。投与量は、一般的には、０．１μｇ／ｋｇ体重／日〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、好ましくは０．１μｇ／ｋｇ体重／日〜１０ｍｇ／ｋｇ体重／日である。
【００６１】
さらに本発明では、ＫＩＡＡ１９１３、ＥＰＢ４２Ｌ２、ＡＫＡＰ７、ＣＲＳＰ３、ＡＲＧ１、ＥＮＰＰ３、ＥＮＰＰ１、ＣＴＧＦ遺伝子の機能欠失型遺伝子を細胞増殖活性化剤として使用することもできる。機能欠失型遺伝子とは、該当する遺伝子においてその機能を欠失するように変異が導入されている遺伝子のことを言う。具体的には当該遺伝子から作製されるアミノ酸配列の少なくとも１個の構成アミノ酸を欠くもの、少なくとも１個の構成アミノ酸が別のアミノ酸で置換されているもの、少なくとも１個のアミノ酸が付加されたもの等の本来の機能を欠失した一般にムテインと呼ばれるタンパク質を翻訳する当該遺伝子がこれに相当する。
【００６２】
機能欠失型遺伝子を細胞増殖活性化剤として使用する場合は、有効成分である上記遺伝子を遺伝子治療剤に通常用いる基剤と共に配合することにより製造することができる。また、上記遺伝子をウイルスベクターに組み込んだ場合は、組換えベクターを含有するウイルス粒子を調製し、これを遺伝子治療剤に通常用いる基剤と共に配合する。
【００６３】
上記基剤としては、通常注射剤に用いる基剤を使用することができ、例えば、蒸留水、塩化ナトリウム又は塩化ナトリウムと無機塩との混合物などの塩溶液、マンニトール、ラクトース、デキストラン、グルコースなどの溶液、グリシン、アルギニンなどのアミノ酸溶液、有機酸溶液又は塩溶液とグルコース溶液との混合溶液などが挙げられる。あるいはまた、当業者に既知の常法に従って、これらの基剤に浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、植物油、界面活性剤などの助剤を用いて、溶液、懸濁液、分散液として注射剤を調製することもできる。これらの注射剤は、粉末化、凍結乾燥などの操作により用時溶解用製剤として調製することもできる。
【００６４】
機能欠失型遺伝子の投与形態としては、通常の静脈内、動脈内などの全身投与でもよいし、局所注射又は経口投与などの局所投与を行ってもよい。さらに、投与にあたっては、カテーテル技術、遺伝子導入技術、又は外科的手術などと組み合わせた投与形態をとることもできる。
【００６５】
機能欠失型遺伝子の投与量は、患者の年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、一般に、成人では一日当たり組み換え遺伝子の重量として１μｇ／ｋｇ体重から１０００ｍｇ／ｋｇ体重程度の範囲であり、好ましくは１０μｇ／ｋｇ体重から１００ｍｇ／ｋｇ体重程度の範囲である。投与回数は特に限定されない。
【００６６】
また、上記した本発明の各種の遺伝子治療剤は、常法により調製されたリポソームの懸濁液に遺伝子を添加し凍結した後融解することにより製造することもできる。リポソームを調製する方法は、薄膜振とう法、超音波法、逆相蒸発法、界面活性剤除去法などがある。リポソームの懸濁液は超音波処理した後、遺伝子を添加するのが遺伝子の封入効率を向上させる上で好ましい。遺伝子を封入したリポソームはそのまま、又は水、生理食塩水などに懸濁して静脈投与することができる。
【００６７】
（６）抗腫瘍物質のスクリーニング方法
上述したように、卵巣癌に関しては、ＫＩＡＡ１９１３、ＥＰＢ４２Ｌ２、ＡＫＡＰ７、ＣＲＳＰ３、ＡＲＧ１、ＥＮＰＰ３、ＥＮＰＰ１、ＣＴＧＦ遺伝子の不活性化が大きな要因となっており、遺伝子の働きを正常化する薬剤は、卵巣癌に対する抗腫瘍剤として用いることが可能であると考えられる。特に、この不活性化の要因が、ＣＴＧＦ遺伝子のＣｐＧアイランドによるメチル化である場合には、これらの要因を解消・緩和することができる薬剤は、抗腫瘍剤として有用である。
【００６８】
これらの本スクリーニング方法をおこなう前提として、検体細胞においてＣＴＧＦ遺伝子の発現量が抑制されている卵巣癌を確保する必要がある。すなわち、本スクリーニング方法においては、「ＣＴＧＦ遺伝子のＣｐＧアイランドのメチル化に起因してＣＴＧＦ遺伝子の発現が抑制されている卵巣癌」が必要となる。これらの細胞株の確立法は、上述した知見に基づいた上で、常法に従いおこなうことができる。例えば、少なくとも、ＣＴＧＦ遺伝子の不活性化が確認された細胞の中から、既存の脱メチル化試薬（例えば５−アザデオキシシチジン）を作用させることにより、ＣＴＧＦ遺伝子のレベルが回復する細胞を選択して、これを継代して、所望する「ＣＴＧＦ遺伝子のＣｐＧアイランドのメチル化に起因してＣＴＧＦ遺伝子の発現が抑制されている卵巣癌」（以下、メチル化癌細胞株ともいう）として確立することができる。
【００６９】
本スクリーニング方法においては、上記のメチル化癌細胞株に対して被験物質を接触させることが必要である。この接触の態様は、特に限定されないが、メチル化細胞株の培養物に対して、被験物質を好適には適切な希釈倍率で希釈して添加して、引き続き培養をおこなうことによりおこなわれる。そして、被験物質を添加する前のメチル化癌細胞株におけるＣＴＧＦ遺伝子の発現量と、添加後の遺伝子の発現量を、好適には経時的に定量し、定量前後の遺伝子の発現量の差を、被験物質を添加せずに同条件で培養された対照培養物と比較して、対照培養物よりも、被験物質を添加した培養物における遺伝子の発現量が増加している場合には、被験物質はメチル化癌細胞株を用いた試薬においては「ＣＴＧＦ遺伝子のＣｐＧアイランドの脱メチル化によりＣＴＧＦ遺伝子を活性化させることができる抗腫瘍物質」として選別される。
【００７０】
さらに、本スクリーニング方法をおこなって、所望の卵巣癌に対する抗腫瘍成分としてスクリーニングされた物質を、さらに、ｉｎ ｖｉｖｏのスクリーニング、例えば、上記のメチル化癌細胞株を植えつけたヌードマウスでの卵巣癌の増殖抑制効果とヌードマウスの生存率の向上を指標とするスクリーニング方法にかけて、最終的な絞込みをおこなうことが好適である。
【００７１】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により特に限定されるものではない。
【実施例】
【００７２】
実施例１：卵巣癌における遺伝子の変化
卵巣癌での新規な遺伝子変化を検出するために、２４種類の卵巣癌細胞株（ＨＴ、ＨＴＯＡ、ＨＵＯＡ、ＫＦ２８、ＭＨ、ＯＶＴＯＫＯ、ＯＶＳＡＨＯ、ＫＦｒ１３、ＨＭＫＯＡ、ＭＣＡＳ、ＲＭＵＧ−Ｌ、ＲＭＵＧ−Ｓ、ＫＫ、ＯＶＩＳＥ、ＯＶＭＡＮＡ、ＯＶＴＯＫＯ、ＲＭＧ−Ｉ、ＲＭＧ−ＩＩ、ＥＳ−２、Ｗ３ＵＦ、ＨＩＯＡｎｕ、ＨＭＯＡ、ＨＮＯＡ、ＨＴＢＯＡ）から調製したゲノムＤＮＡを用いてＭＧＣ Ｃａｎｃｅｒ Ａｒｒａｙ−８００を使用したＣＧＨアレイ解析をおこなった（図１Ａ）。なお、対象として正常な卵巣上皮由来の細胞株（ＯＳＥ−２ａ）から抽出したゲノムを使用しＣｙ５で標識した。被検ＤＮＡとして卵巣癌細胞株から調整したゲノムＤＮＡを使用しＣｙ３で標識した。具体的には、ＤｐｎＩＩ消化したゲノムＤＮＡ（０．５μｇ）を、各々０．６ｍＭ ｄＡＴＰ、０．６ｍＭ ｄＴＴＰ、０．６ｍＭ ｄＧＴＰ、０．３ｍＭ ｄＣＴＰ及び０．３ｍＭＣｙ３−ｄＣＴＰ（卵巣癌細胞）或るいは０．３ｍＭＣｙ５−ｄＣＴＰ（正常細胞）存在下で、ＢｉｏＰｒｉｍｅ Ａｒｒａｙ ＣＧＨ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）により標識した。Ｃｙ３及びＣｙ５標識ｄＣＴＰはＧＥ ヘルスケア社より入手した。両標識ゲノムＤＮＡをＣｏｔ−１ ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）存在下でエタノールを加えて沈殿させ、１２０μｌのハイブリダイゼーション混合液（５０％ホルムアミド、１０％Ｄｅｘｔｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ、２ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣ：１５０ｍＭ ＮａＣｌ/１５ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ）、４％ ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ、ｐＨ７．０）に溶解した。３７℃で３０分間インキュベーション後、ハイブリダイゼーションマシーン（ＧｅｎｅＴＡＣ；ハーバードバイオサイエンス社）にＣＧＨアレイをセットし、４８−７２時間イハイブリダイゼーションをおこなった。その後、ＣＧＨアレイを５０％ホルムアミド/２ｘＳＳＣ（ｐＨ７．０）溶液中で５０℃にて１５分間洗浄し、次に２ｘＳＳＣ/０．１％ＳＤＳ中で５０℃にて１５分間洗浄した。風乾した後、ＣＧＨアレイをＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂスキャナー（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてＣｙ３及びＣｙ５に由来する蛍光をモニタリングした。得られた結果をＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏ６．０イメージングソフトウエア（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて解析した。Ｃｙ３に由来する蛍光強度の平均とＣｙ５に由来する蛍光強度の平均を同じ値に調整し、Ｃｙ３/Ｃｙ５のＲａｔｉｏを求めた。ゲノムに異常がない場合にはＲａｔｉｏ値は１（ｌｏｇ２Ｒａｔｉｏ＝０）である。Ｒａｔｉｏ値が１．３２以上（ｌｏｇ２Ｒａｔｉｏで０．４以上）の時にゲノムの増幅があり、４以上（ｌｏｇ２Ｒａｔｉｏで２以上）の時に顕著な増幅が認められると判定した。Ｒａｔｉｏ値が０．７５以下（ｌｏｇ２Ｒａｔｉｏで−０．４以下）の時にゲノムのヘテロ接合体欠失の可能性、０．２５以下（ｌｏｇ２Ｒａｔｉｏで−２以下）の時にホモ接合体欠失の可能性が極めて大きいと判定した。その結果を表１、及び表２に示す。
【００７３】
高レベルの遺伝子増幅は、２４種類の卵巣癌中２種類、２遺伝子座を確認することができた。また、遺伝子欠失は、２４種類の卵巣癌中３種類、４遺伝子座を確認することができた（表１）。
【００７４】
【表１】
【００７５】
【表２】
【００７６】
実施例２：卵巣癌における６ｑ２３（６ｑ２３．１−２３．２）染色体欠失領域に含まれる遺伝子の単離
卵巣癌細胞株（ＲＭＵＧ−Ｓ）において、新規に検出した６ｑ２３（６ｑ２３．１−２３．２）のホモ欠失領域に含まれる遺伝子を詳細に決定するため、まず、ＲＭＵＧ−Ｓ細胞から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としたゲノミックＰＣＲでホモ欠失領域の範囲を決定することにした。ゲノミックＰＣＲに用いたプライマー配列は、表３に示す。
【００７７】
【表３】
【００７８】
欠失領域に存在する遺伝子は、ＣＧＨアレイの結果とヒトゲノムデータベース（ｈｔｔｐ://ｇｅｎｏｍｅ.ｕｃｓｃ.ｅｄｕ/）から確認することができた（図１Ｂ、図１Ｃ）。その結果、この欠失領域には１０種の遺伝子の存在が確認できた（図１Ｂ）。そのうち、ＣＴＧＦ遺伝子、ＥＮＰＰ１遺伝子、ＥＮＰＰ３遺伝子、ＣＲＳＰ３遺伝子、ＡＲＧ遺伝子、ＡＫＡＰ７遺伝子、ＥＰＢ４１Ｌ２遺伝子、ＫＩＡＡ１９１３遺伝子のホモ欠失が、ＲＭＵＧ−Ｓ細胞（１／２４、４．２％；図１Ｃ）においてで確認することができた。
【００７９】
実施例３：卵巣癌細胞株におけるＣＴＧＦ遺伝子発現の消失とＤＮＡ脱メチル化後の回復について
上記７つの遺伝子（ＣＴＧＦ遺伝子、ＥＮＰＰ１遺伝子、ＥＮＰＰ３遺伝子、ＣＲＳＰ３遺伝子、ＡＫＡＰ７遺伝子、ＥＰＢ４１Ｌ２遺伝子、ＫＩＡＡ１９１３遺伝子）の発現レベルを調べるため、２４種類の卵巣癌細胞株、正常卵巣、正常卵巣上皮細胞由来不死化細胞株（ＯＳＥ−２ａ）についてＲｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＲＴ）−ＰＣＲをおこなった。具体的には、培養した細胞株から抽出したＲＮＡから、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、一本鎖ｃＤＮＡを合成し、表３に示すプライマー配列を用いて、ＰＣＲをおこなった。また、コントロールとして、Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子を用いた。その結果、ＣＴＧＦ遺伝子、ＥＮＰＰ１遺伝子、ＫＩＡＡ１９１３遺伝子は、６ｑ２３．１−２３．２染色体領域がホモ欠失でないにも関わらず、正常卵巣、ＯＳＥ−２ａ細胞と比較して発現の減少を示した（図１Ｄ）。これは、卵巣癌細胞株におけるエピジェネテック現象のような、ゲノム欠失以外のメカニズムによる結果と考えられる。また上記実験において、ＡＲＧ１遺伝子は、遺伝子発現データベース（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ ａｎｄ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｓｂｍ．ｏｒｇ／ｄａｔａｂａｓｅ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）の結果から、卵巣では発現されていないので検討から除外することにした。
【００８０】
ＣＴＧＦ遺伝子の発現の抑制が、ＤＮＡのメチル化による原因かどうかを調べるため、ＣＴＧＦ遺伝子が発現していない卵巣癌細胞株（ＨＮＯＡ、ＲＭＧ−ＩＩ）を用い、脱メチル化試薬５‐ａｚａ‐ｄＣｙｄを５μＭで５日間、または、脱アセチル化阻害剤ＴＳＡを１００ｎｇ／ｍｌで１２時間処理をおこなった。それらの細胞からＲＮＡを抽出し、ＣＴＧＦ遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲで調べた（図１Ｄ）。その結果、ＣＴＧＦ遺伝子は、５‐ａｚａ‐ｄＣｙｄの処理により、遺伝子発現を回復することがわかった。この結果は、明らかに、ＣＴＧＦ遺伝子の発現抑制には、ＤＮＡのメチル化が関与していることが推定される。また、ＴＳＡ処理では、ＣＴＧＦ遺伝子の発現に差が見られないことから、ＣＴＧＦ遺伝子の発現調節にヒストンの脱アセチル化の要因は少ないことが明らかとなった。
【００８１】
実施例４：卵巣癌細胞株におけるＣＴＧＦ遺伝子 ＣｐＧアイランドのメチル化
ＣｐＧアイランドのメチル化は遺伝子発現を抑制するメカニズムの１つである。ＣＴＧＦ遺伝子のＣｐＧアイランドをＣｐＧＰＬＯＴプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｍｂｏｓｓ／ｃｐｇｐｌｏｔ／）を用いて解析した結果、ＣＴＧＦ遺伝子のエキソン１、２周辺にＣｐＧアイランドが存在することを確認した（図２Ａ）。卵巣癌細胞株でのＣＴＧＦ遺伝子発現の有無によるＣＴＧＦ遺伝子のＣｐＧアイランドのメチル化状態を確認するため、３つの領域（Ｒｅｇｉｏｎ １、Ｒｅｇｉｏｎ ２、Ｒｅｇｉｏｎ ３）についてｂｉｓｕｌｆｉｔｅシーケンス解析をおこなった。
【００８２】
具体的には、ＥＺ ＤＮＡメチレーションキット（Ｚｙｍｏ ＲＥＳＥＡＲＣＨ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用し、卵巣癌細胞株に由来するゲノムＤＮＡ（２μｇ）をＳｏｄｉｕｍ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ中５０℃で１晩処理をおこない、目的とする領域を増幅するようにデザインしたプライマー（表３）を用いてＰＣＲをおこなった。これらの配列をＴＯＰＯ ＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にサブクローニングし、塩基配列を決定した。その結果、ＣＴＧＦ遺伝子の発現が減少している細胞株（ＨＴＯＡ、ＨＵＯＡ、ＲＭＵＧ−Ｌ、ＲＭＧ−Ｉ、ＨＮＯＡ、ＫＦ２８）において、Ｒｅｇｉｏｎ ２と３が極度にメチル化されていることが確認できた（図２Ａ）。また、Ｒｅｇｉｏｎ ２の３'部分、Ｒｅｇｉｏｎ ２ＢとＲｅｇｉｏｎ３はＣＴＧＦ遺伝子が発現している細胞株（ＫＫ、ＯＶＩＳＥ）でもメチル化を確認することができた。
【００８３】
卵巣癌細胞株でのＣＴＧＦ遺伝子の発現状態とメチル化状態の関連性をさらに調べるため、ＣＯＢＲＡ法を用いて解析をおこなった。具体的には、上記方法で得られたＰＣＲ産物をＢｓｔＵＩ制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）で消化し電気泳動することで検出した。ＢｓｔＵＩはメチル化されないＳｏｄｉｕｍ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅで修飾された配列は消化しないが、メチル化されたＳｏｄｉｕｍ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅで修飾されない配列を消化する性質を利用して、メチル化の度合いをモニタリングした。ＰＣＲ断片を電気泳動後、メチル化された断片のバンドとメチル化されない断片のバンドの濃度比をＭｕｌｔｉＧａｕｇｅ２．０（富士フイルム株式会社）を用いたデンシトメトリーにより測定し、メチル化された領域のメチル化度を％で表示した（図２Ａ、Ｂ）。その結果、ＣＴＧＦ遺伝子の発現状態に関わらず卵巣癌細胞株のほとんどで、メチル化したアレルはＲｅｇｉｏｎ １において確認できなかった（図２Ｂ）。一方、ＣＴＧＦ遺伝子の発現を欠いた卵巣癌細胞では、ＯＶＭＡＮＡ細胞、ＯＶＴＯＫＯ細胞を除いてＲｅｇｉｏｎ ２のメチル化アレルを確認することができた（図２Ｂ）。
【００８４】
実施例５：ＣＴＧＦ遺伝子のＣｐＧアイランド周辺配列のプロモーター活性
ＣｐＧアイランドのプロモーター活性を調べるために、このＣｐＧアイランドの周辺を含めて３つの断片（Ｆｒａｇｍｅｎｔ １、Ｆｒａｇｍｅｎｔ ２、Ｆｒａｇｍｅｎｔ ３）に分割し、それらの断片をルシフェラーゼレポータープラスミド（ｐＧＬ３‐Ｂａｓｉｃ ｖｅｃｔｏｒ：Ｐｒｏｍｅｇａ社）に挿入し、卵巣癌細胞株（ＲＭＵＧ−Ｓ、ＫＫ、ＫＦ２８）へトランスフェクションした（図２Ｃ）。Ｄｕａｌ-Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅレポーターアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて、マニュアルに従ってルシフェラーゼ活性を測定し、各Ｆｒａｇｍｅｎｔを有するｐＧＬ３ベクターに由来するルシフェラーゼ活性を測定した（図２Ｃ）。その結果、Ｒｅｇｉｏｎ ２Ａの領域を含むＦｒａｇｍｅｎｔ１と３のルシフェラーゼ活性が高いことがわかった（図３ｂ）。上記のプロモーターアッセイの結果から、Ｒｅｇｉｏｎ ２Ａのメチル化はＣＴＧＦ遺伝子発現の抑制に重要な役割をしていると考えられる。
【００８５】
実施例６：卵巣癌臨床検体におけるＣＴＧＦプロモーター領域のメチル化
卵巣癌臨床検体でのＣＴＧＦ遺伝子のメチル化を明らかにするため、６６種類の卵巣癌臨床検体で、Ｒｅｇｉｏｎ ２Ａ周辺のメチル化部位を標的としたプライマーセットを用いて、Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ（ＭＳＰ）をおこなった。その結果を図２Ｄに示す。
【００８６】
ｂｉｓｕｌｆｉｔｅシーケンスとＣＯＢＲＡの結果と一致して、ＣＴＧＦの発現が欠失している細胞株（ＲＭＵＧ−Ｌ）はメチル化され、ＣＴＧＦが発現している細胞株（ＯＳＥ−２ａ）ではメチル化されていないことを確認した（図２Ｄ）。結果として、６６種の卵巣癌臨床検体のうち３９種でＣＴＧＦの高頻度メチル化を確認することができた（５９％、図２Ｄ）。また、ＭＳＰ解析でメチル化されていない腫瘍は、ｂｉｓｕｌｆｉｔｅシーケンスにより、低頻度メチル化のパターンを示し、ＭＳＰ解析でメチル化が確認された腫瘍は、高頻度メチル化のパターンを示した（図２Ｄ）。ＣＴＧＦのメチル化と卵巣癌臨床検体における遺伝子サイレンシングの関連性を調べるため、４３症例の卵巣癌臨床検体から調製したｃＤＮＡを用い、ＣＴＧＦ ｍＲＮＡの発現状態をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲで確認することにした。その結果、ＭＳＰによりＣＴＧＦ Ｒｅｇｉｏｎ ２Ａのメチル化を示す場合では、メチル化を示さない場合よりも、遺伝子の発現が充分低いレベル（Ｐ＝０．０４１、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ ｔｅｓｔ、図２Ｄ）であり、この結果から、ＣＴＧＦ Ｒｅｇｉｏｎ ２Ａのメチル化は遺伝子サイレンシングに関連していることが考えられる。また、卵巣癌６６症例についての、ＣＴＧＦ ＣｐＧアイランドのメチル化と臨床病理診断との関連性を調べた結果を表４に示す。
【００８７】
【表４】
【００８８】
実施例７：卵巣癌臨床検体におけるＣＴＧＦの発現レベルと臨床病理学的特性間の関連性
卵巣癌におけるＣＴＧＦ遺伝子の臨床的意義を明らかにするため、ＣＴＧＦ特異的抗体を用いて卵巣癌臨床検体におけるＣＴＧＦ蛋白質の発現レベルを免疫組織化学染色により評価することにした。具体的な方法としては、パラフィン包埋した組織切片をホルマリン固定することでおこなった。シランコートされたガラススライド上の切片は、脱パラフィン化とエタノールによる段階的な脱水をおこなった。抗原は、９５℃で１０分間ｈｉｇｈ ｐＨ ｂｕｆｆｅｒ（Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ社 Ｔａｒｇｅｔ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ ｐＨ）中でオートクレーブ前処理により取り出した。内因性ペルオキシダーゼは５％過酸化水素を用いて阻害した。非特異的染色は２％標準ブタ血清で阻害した。そのスライドは抗ヒトＣＴＧＦヤギポリクローナル抗体（Ｌ−２０、１：１００希釈；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用いて４℃で一晩インキュベートした。スライドはＨｉｓｔｏｆｉｎｅ シンプルステインＭＡＸ ＰＯ（Ｇ）（Ｎｉｃｈｒｅｉ社）を用いて室温で２時間反応させた。抗原―抗体反応は０．２％ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリドと過酸化水素により可視化した。そのスライドはＭａｙｅｒ'ｓ ヘマトキシリンを用いて対比染色した。
【００８９】
免疫組織染色の結果は、レベル０（ネガティブ染色）、レベル１（腫瘍細胞の１−１０％が染色）、レベル２（腫瘍細胞の１０−５０％が染色）、レベル３（腫瘍細胞の５０％以上が染色）に分類した。ＣＴＧＦの高レベルな免疫反応は、正常卵巣上皮において確認することができた（図３Ａ左）。ＣＴＧＦ蛋白質は、正常または腫瘍上皮細胞の細胞膜または細胞質に優位に局在していることが明らかになった。
【００９０】
いくつかの卵巣癌サンプルではＣＴＧＦの高い発現を検出したが（図３Ａ中央）、ＣＴＧＦの発現が弱い（レベル１）、または無い（レベル０）卵巣癌サンプルも高頻度に確認することができた（図３Ａ右）。卵巣癌サンプルにおいて、ＣＴＧＦの低い発現レベル（レベル０と１）は８１％（５７症例中４６症例）、高い発現レベル（レベル２と３）は１９％（５７症例中１１症例）であった。ＣＴＧＦ蛋白質発現のレベルと臨床病理学的特性との関連性を表５にまとめて示す。この結果から、ＣＴＧＦ蛋白質の発現は、腫瘍のステージと関連性があることがわかる。ＣＴＧＦの発現が欠失している腫瘍は低いステージ（Ｓｔａｇｅ ＩとＩＩ）である傾向が高く、ＣＴＧＦの発現を提示している腫瘍は高いステージ（Ｓｔａｇｅ ＩＩＩとＩＶ）の傾向が高い。
【００９１】
【表５】
【００９２】
総体的な生存率としては、ＣＴＧＦ蛋白質の発現が低い卵巣癌患者は、ＣＴＧＦ蛋白質の発現が高い患者と比較してより高い生存率を示す（Ｐ＝０．１２８、Ｌｏｇ−ｒａｎｋ ｔｅｓｔ；図３Ｂ左）。Ｓｔａｇｅ ＩとＩＩの症例では、ＣＴＧＦ蛋白質の発現が低いと生存率が低くなる（図３Ｂ中央）。また、Ｓｔａｇｅ ＩＩＩとＩＶの症例では、ＣＴＧＦ蛋白質の発現が高いと生存率が低くなる（Ｐ＝０．１８９、Ｌｏｇ−ｒａｎｋ ｔｅｓｔ；図３Ｂ右）。
この傾向は、６０歳以下で転移性表現型と関連のあるＳｔａｇｅ ＩＩＩｃとＩＶの症例に限定するとより明らかである（Ｐ＝０．０３３、Ｌｏｇ−ｒａｎｋ ｔｅｓｔ；図３Ｃ）。このことから、腫瘍形成においてＣＴＧＦの不活性化の役割は、卵巣癌のステージ間で異なることが考えられる。
【００９３】
実施例８：ＣＴＧＦ遺伝子の活性化による卵巣癌の増殖抑制
これまでの結果をふまえ、ＣＴＧＦ遺伝子発現を活性化することで、卵巣癌の増殖の抑制が可能かどうかを検討した。まず、ＣＴＧＦ遺伝子のＭｙｃタグを発現するプラスミド（ｐＣＭＶ−３Ｔａｇ４−ＣＴＧＦ）を構築した。これは全長を有するＣＴＧＦ遺伝子の役割をモニタリングするために使用できる。本プラスミドは、ＲＴ−ＰＣＲにより増幅したＣＴＧＦ ｃＤＮＡをｐＣＭＶ−３Ｔａｇ４ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）にＭｙｃタグと翻訳フレームがあうように挿入して作製した。対照として、ＣＴＧＦ遺伝子を挿入しない空ベクター（ｐＣＭＶ−３Ｔａｇ４−ｍｏｃｋ）を使用した。これらの発現プラスミドを、トランスフェクション試薬であるＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）と混合し、ＨＮＯＡ細胞またはＨＭＯＡ細胞へトランスフェクションした。４８時間後細胞を回収し、抗Ｍｙｃ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用いたウエスタンブロットによりCTGF蛋白質の発現を確認した（図４Ａ）。
【００９４】
また、トランスフェクションの２週間後に、ネオマイシン系薬剤であるＧ４１８存在下で増殖した細胞を７０％エタノールで固定し、クリスタルバイオレッドで染色することによりカウントした。その結果、空ベクターでトランスフェクションした細胞と比べて、ｐＣＭＶ−３Ｔａｇ４−ＣＴＧＦでトランスフェクションした細胞は顕著にコロニー数が減少した（図４Ｂ）。この結果は明らかにＣＴＧＦ遺伝子の発現を活性化することで、卵巣癌の増殖を抑制でき癌抑制剤として機能することを示している。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】Ａ：２４種の卵巣癌細胞株におけるコピー数の増幅と欠失のゲノム全体の頻度。クローンは、ＵＣＳＣマッピング位置（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／［ｖｅｒｓｉｏｎ Ｍａｙ，２００４］に基づいて１−２２、Ｘ、Ｙ染色体の順番で整列した。アスタリスクは、高レベルの増幅（ｌｏｇ２ｒａｔｉｏ＞ ０．４）、またはホモ欠失（ｌｏｇ２ｒａｔｉｏ＜ −０．４）の認められた領域を示す（表１）。Ｂ：卵巣癌細胞株での６ｑ２３．２染色体領域の増幅の確認。上部；ＲＭＵＧ−Ｓ細胞株の代表的な増幅のアレイＣＧＨイメージ。６ｑ２３．２染色体領域のＢＡＣクローンのホモ欠失は明らかなシグナルで確認できる（矢印）。下部；ＲＭＵＧ−Ｓ細胞株での６ｑ２３．１−２３．２のホモ欠失領域をカバーするマップ。水平線で示したＢＡＣ（ＲＰ１１−６９Ｉ８）はアレイＣＧＨ解析においてホモ欠失である。ＲＭＵＧ−Ｓ細胞株におけるホモ欠失の領域は、ゲノミックＰＣＲにより決定し、白い両端矢印で示す。ＲＭＵＧ−Ｓ細胞株でゲノミックＰＣＲにより決定したホモ欠失領域周辺に位置する１０遺伝子、ホモ欠失（８遺伝子）または残っている遺伝子（２遺伝子）を矢印で示す。Ｃ：卵巣癌細胞株での６ｑ２３ホモ欠失領域周辺に位置する遺伝子のゲノミックＰＣＲとＲＴ−ＰＣＲ解析上部；ゲノミックＰＣＲによりＣＴＧＦ、ＥＮＰＰ１、ＥＮＰＰ３、ＣＲＳＰ３、ＡＲＧ１、ＡＫＡＰ７、ＥＰＢ４１Ｌ２、ＫＩＡＡ１９１３のホモ欠失は１つの卵巣癌細胞株において確認された。１：ＨＴ、２：ＨＴＯＡ、３：ＨＵＯＡ、４：ＫＦ２８、５：ＭＨ、６：ＯＶＫＡＴＥ、７：ＯＶＳＡＨＯ、８：ＫＦｒ１３、９：ＨＭＫＯＡ、１０：ＭＣＡＳ、１１：ＲＭＵＧ−Ｌ、１２：ＲＭＵＧ−Ｓ、１３：ＫＫ、１４：ＯＶＩＳＥ、１５：ＯＶＭＡＮＡ、１６：ＯＶＴＯＫＯ、１７：ＲＭＧ−Ｉ、１８：ＲＭＧ−ＩＩ、１９：ＥＳ−２、２０：Ｗ３ＵＦ、２１：ＨＩＯＡｎｕ、２２：ＨＭＯＡ、２３：ＨＮＯＡ、２４：ＨＴＢＯＡ。下部；卵巣癌細胞株と正常卵巣と正常卵巣上皮細胞由来細胞株（ＯＳＥ−２ａ）におけるＣＴＧＦ、ＥＮＰＰ１、ＥＮＰＰ３、ＣＲＳＰ３、ＡＫＡＰ７、ＥＰＢ４１Ｌ２、ＫＩＡＡ１９１３のｍＲＮＡの発現はＲＴ−ＰＣＲにより確認した。アローヘッドはゲノミックＰＣＲ解析によりホモ欠失を示した細胞株を示す。ＣＲＳＰ３、ＡＫＡＰ７、ＥＰＢ４１Ｌ２ ｍＲＮＡの発現は多くの卵巣癌細胞株で多少の減少を示した。そして、ＥＮＰＰ１、ＥＮＰＰ３、ＣＴＧＦのｍＲＮＡの発現は高頻度に消失した。ホモ欠失以外のＣＴＧＦ遺伝子発現の減少は２３細胞株中１２種（５０％）であった。Ｄ：５−ａｚａ−ｄＣｙｄ（５μＭ）５日間と／またはＴＳＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）１２時間の処理あり（＋）なし（−）をおこなった卵巣癌細胞株（ＨＮＯＡとＲＭＧ−Ｉ）におけるＣＴＧＦ遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ解析の結果を示す。
【図２】卵巣癌細胞株と卵巣癌臨床検体におけるＣＴＧＦ ＣｐＧリッチ領域のメチル化状態Ａ：ＣＴＧＦ遺伝子のエキソン1周辺のＣｐＧアイランド（白い矢印）を含むＣｐＧリッチ領域の概略図とｂｉｓｕｌｆｉｔｅシーケンスの代表的な結果。ＣｐＧ部位は垂直線で示す。エキソン１はオープンボックスで示し、転写開始点は＋１で記す。プロモーターアッセイに用いた断片は、太い黒線で示す。ＣＯＢＲＡ法とｂｉｓｕｌｆｉｔｅシーケンスで確認した領域は灰色線で示す。ＣＯＢＲＡ法のための制限酵素部位ＢｓｔＵＩは黒のアローヘッドで表す。 ＣＴＧＦを発現している卵巣癌細胞株（＋）とＣＴＧＦを発現していない卵巣癌細胞株（−）において調べたＣｐＧリッチ領域のｂｉｓｕｌｆｉｔｅシーケンスの代表的な結果。各白と黒の四角は非メチル化とメチル化ＣｐＧ部位を示し、各列は１種類のクローン由来である。ＭＳＰのためのＰＣＲプライマーは矢印で示す。Ｂ：ＢｓｔＵＩ消化後の卵巣癌細胞株におけるＣＴＧＦ ＣｐＧアイランドのＣＯＢＲＡ法の代表的な結果。矢印はメチル化ＣｐＧ部位特異的に消化された断片を示す。アローヘッドは消化されない断片で非メチル化ＣｐＧであることを示す。Ｃ：ＣＴＧＦ ＣｐＧリッチ領域のプロモーター活性。ｐＧＬ３空ベクター（ｍｏｃｋ）とＣｐＧアイランドＦｒａｇｍｅｎｔ １−３の異なった配列を含むレポーターを構築した。それらを内部コントロールベクター（ｐＲＬ−ｈＴＫ）と共にＲＭＵＧ−Ｓ細胞、ＫＫ細胞、ＫＦ２８細胞へトランスフェクションした。ルシフェラーゼ活性はコントロールに対してノーマライズした。データは３つの独立した実験の平均±ＳＤを示す。Ｄ：上部左；卵巣癌臨床検体におけるＣＴＧＦプロモーター領域のＭＳＰ解析の代表的な結果。並列に非メチル化（Ｕ）またはメチル化（Ｍ）ＤＮＡに特異的なプライマー用いて検討した。下部；ＣＴＧＦプロモーター領域のメチル化状態は腫瘍サンプルによりｂｉｓｕｌｆｉｔｅシーケンスにより決定した。上部右；粘液型腫瘍を除いた４３種の卵巣癌臨床検体について、ＭＳＰにより決定したＣＴＧＦのメチル化状態とＲＴ−ＰＣＲにより決定したｍＲＮＡ発現状態の相関関係。
【図３】卵巣癌臨床検体におけるＣＴＧＦ発現の免疫組織化学解析。Ａ：正常ヒト卵巣上皮細胞と卵巣癌臨床検体における代表的なＣＴＧＦ免疫化学染色。左；ＣＴＧＦの高い発現は正常卵巣上皮細胞で見られる。中央と右；ＣＴＧＦの発現が高い（中央）またはほとんどない（右）結果は、卵巣癌臨床検体における癌細胞で見られる。正常上皮細胞と卵巣癌細胞において、ＣＴＧＦは細胞質の頂点にはっきりと局在している。倍率ｘ２００。Ｂ：卵巣癌患者の全体の生存率に対するカプラン・マイヤーカーブ。左；全てのステージの腫瘍において、免疫組織化学法により確認したＣＴＧＦの発現が低い患者は、ＣＴＧＦの発現が高い患者よりも生存率が良いことを示す（Ｐ＝０．１２８、Ｌｏｇ−ｒａｎｋ ｔｅｓｔ）。中央；ステージＩ、ＩＩの腫瘍において、ＣＴＧＦの発現が高い患者グループで死亡が認められなかったため統計解析をおこなうことはできないが、ＣＴＧＦの発現が低い患者は、ＣＴＧＦの発現が高い患者よりも生存率が短い傾向があることを示す。右；ステージＩＩＩ、ＩＶの腫瘍において、ＣＴＧＦの発現が高い患者は、ＣＴＧＦの発現が低い患者よりも生存率が短いことを示す（Ｐ＝０．１８９、Ｌｏｇ−ｒａｎｋ ｔｅｓｔ）。Ｃ：６０歳以下でステージＩＩＩｃとＩＶの卵巣癌患者の全体的な生存率に対するカプラン・マイヤーカーブ。６０歳以下で転移表現型に関連したステージＩＩＩｃとＩＶの卵巣癌患者に制限した場合、解析に含まれるのは少数の症例であるにも関わらず、ＣＴＧＦの発現が高い患者は、ＣＴＧＦの発現が低い患者よりも明らかに生存率が短いことを示す（Ｐ＝０．０３３、Ｌｏｇ−ｒａｎｋ ｔｅｓｔ）。
【図４】卵巣癌の増殖におけるＣＴＧＦの発現の効果（Ａ、Ｂ）。ｐＣＭＶ−３Ｔａｇ４−ＣＴＧＦまたはｐＣＭＶ−３Ｔａｇ４−ｍｏｃｋをＣＴＧＦ遺伝子が欠失している細胞株（ＨＮＯＡ、ＨＭＯＡ）にトランスフェクションした。Ａ：トランスフェクション後４８時間の細胞から抽出した蛋白質１０μｇを用いて抗Ｍｙｃ抗体でウエスタンブロット解析をおこなった。Ｂ：ＣＴＧＦ遺伝子が発現していない細胞株（ＨＮＯＡ、ＨＭＯＡ）を用いたコロニーフォーメーションアッセイ。これらの細胞へＣＴＧＦを含むＭｙｃタグベクター（ｐＣＭＶ−３Ｔａｇ４−ＣＴＧＦ）または、空ベクター（ｐＣＭＶ−３Ｔａｇ４−ｍｏｃｋ）を一過性でトランスフェクションし、Ｇ４１８存在下で２週間薬剤選択をおこなった。上部；トランスフェクション後２週間で薬剤耐性コロニーを形成した結果、ＣＴＧＦ遺伝子をトランスフェクションした細胞のコロニー形成は、空ベクターをトランスフェクションした細胞よりも少ないことがわかった。下部；コロニー形成の定量解析。＞２ｍｍコロニーをカウントした、そしてその結果は３回の別々の実験の平均値±ＳＤとして表した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体において、２ｑ１４．２、３ｐ２４．１、３ｑ２６．２、３ｑ２９、４ｑ３４．２、６ｑ２３、９ｐ２１．３、１１ｑ１３．３、１３ｑ２２．１、１３ｑ３３．１、１３ｑ３３．３、１５ｑ１２、１５ｑ１５．１、１７ｐ１２、１７ｐ１３．１、１７ｐ１３．３、１８ｑ２１．１、１８ｑ２１．２、１８ｑ２１．３１、１８ｑ２１．３２、１８ｑ２１．３３、１８ｑ２３、２０ｑ１３．１３、２０ｑ１３．２、２０ｑ１３．３１、２０ｑ１３．３３、Ｘｐ１１．２３、Ｘｐ１３．１、Ｘｐ１３．３、Ｘｐ２６．２、Ｘｐ２６．３、Ｘｑ２８の染色体領域に存在する遺伝子の変化を少なくとも１つ以上を検出することにより、検体の悪性度を含めた癌化を検出する、癌の検出方法。
【請求項２】
遺伝子がＧＬＩ２、ＣＣＮＤ１、ＦＧＦ３、ＴＧＦＢＲ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＴＡＰ、ＳＭＡＤ４、ＥＶＩ１、ＭＵＣ４、ＰＴＰＮ１、ＺＮＦ２１７、ＢＣＡＳ１、ＴＦＡＰ２Ｃ、ＢＩＲＣ７、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ、ＶＥＧＦＣ、ＫＬＦ１２、ＦＧＦ１４、ＥＦＮＢ２、ＧＡＢＲＢ３、ＲＡＤ５１、ＲＨ６８６２１、ＰＭＰ２２、ＲＣＶ１、ＨＳＸＩＡＰＡＦ１、ＡＢＲ、ＨＩＣ１、ＭＡＤＨ４（ＳＭＡＤ４）、ＤＣＣ、ＭＡＬＴ１、ＧＲＰ、ＳＥＲＰＩＮＢ５、ＦＶＴ１、ＢＣＬ２、ＳＥＲＰＩＮＢ３、ＢＣＬ２、ＣＴＤＰ１、ＳＨＧＣ−１４５８２０、ＳＳＸ１、ＡＲ、ＭＬＬＴ７、ＡＢＣＢ７、ＧＰＣ３、ＦＧＦ１３、ＭＡＧＥＡ２、ＫＩＡＡ１９１３、ＥＰＢ４２Ｌ２、ＡＫＡＰ７、ＣＲＳＰ３、ＡＲＧ１、ＥＮＰＰ３、ＥＮＰＰ１、ＣＴＧＦの少なくとも１つ以上である、請求項１に記載の癌の検出方法。
【請求項３】
遺伝子の変化が、増幅、欠失、不活性化の少なくとも１つ以上である、請求項１又は２に記載の癌の検出方法。
【請求項４】
遺伝子の変化が、ＣｐＧアイランドのメチル化による不活性化である、請求項１から３の何れかに記載の癌の検出方法。
【請求項５】
検体において、請求項２に記載の遺伝子から翻訳される蛋白質の量を検出することにより、検体の悪性度を含めた癌化を検出する、請求項２に記載の癌の検出方法。
【請求項６】
蛋白質の量を免疫組織化学的法により検出する、請求項５に記載の癌の検出方法。
【請求項７】
ＣＴＧＦ遺伝子の欠失又は不活性化を検出することにより、検体の悪性度を含めた癌化を検出する、癌の検出方法。
【請求項８】
検体が、卵巣由来の組織である、請求項１から７の何れかに記載の癌の検出方法。
【請求項９】
癌が、卵巣癌である、請求項１から８の何れかに記載の癌の検出方法。
【請求項１０】
遺伝子の変化を、ＤＮＡチップ法、サザンブロット法、ノーザンブロット法、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法、ＦＩＳＨ法、ＣＧＨ法、または、アレイＣＧＨ法、Ｂｓｕｌｆｉｔｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ法、ＣＯＢＲＡ法を用いて検出する、請求項１から９の何れかに記載の癌の検出方法。
【請求項１１】
ＫＩＡＡ１９１３、ＥＰＢ４２Ｌ２、ＡＫＡＰ７、ＣＲＳＰ３、ＡＲＧ１、ＥＮＰＰ３、ＥＮＰＰ１、ＣＴＧＦ遺伝子、または、該遺伝子の発現産物である蛋白質をインビトロで細胞に導入することを含む、細胞の増殖を抑制する方法。
【請求項１２】
ＫＩＡＡ１９１３、ＥＰＢ４２Ｌ２、ＡＫＡＰ７、ＣＲＳＰ３、ＡＲＧ１、ＥＮＰＰ３、ＥＮＰＰ１、ＣＴＧＦ遺伝子、または、該遺伝子の発現産物である蛋白質を含む、細胞増殖抑制剤。
【請求項１３】
ＫＩＡＡ１９１３、ＥＰＢ４２Ｌ２、ＡＫＡＰ７、ＣＲＳＰ３、ＡＲＧ１、ＥＮＰＰ３、ＥＮＰＰ１、ＣＴＧＦ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは機能欠失型遺伝子を、インビトロで腫瘍細胞に導入することを含む、細胞の増殖を活性化する方法。
【請求項１４】
ＫＩＡＡ１９１３、ＥＰＢ４２Ｌ２、ＡＫＡＰ７、ＣＲＳＰ３、ＡＲＧ１、ＥＮＰＰ３、ＥＮＰＰ１、ＣＴＧＦ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは機能欠失型遺伝子を含む、細胞増殖活性化剤。
【請求項１５】
ＫＩＡＡ１９１３、ＥＰＢ４２Ｌ２、ＡＫＡＰ７、ＣＲＳＰ３、ＡＲＧ１、ＥＮＰＰ３、ＥＮＰＰ１、ＣＴＧＦ遺伝子のＣｐＧアイランドのメチル化に起因して遺伝子の発現が抑制されている卵巣癌に対して、被験物質を接触させて、遺伝子の発現を検出し、遺伝子発現が被験物質を接触させない系よりも増加していた場合に、被験物質を、遺伝子のＣｐＧアイランドの脱メチル化により遺伝子を活性化させることができる抗腫瘍物質として選別する、物質のスクリーニング法。
【請求項１】
検体において、２ｑ１４．２、３ｐ２４．１、３ｑ２６．２、３ｑ２９、４ｑ３４．２、６ｑ２３、９ｐ２１．３、１１ｑ１３．３、１３ｑ２２．１、１３ｑ３３．１、１３ｑ３３．３、１５ｑ１２、１５ｑ１５．１、１７ｐ１２、１７ｐ１３．１、１７ｐ１３．３、１８ｑ２１．１、１８ｑ２１．２、１８ｑ２１．３１、１８ｑ２１．３２、１８ｑ２１．３３、１８ｑ２３、２０ｑ１３．１３、２０ｑ１３．２、２０ｑ１３．３１、２０ｑ１３．３３、Ｘｐ１１．２３、Ｘｐ１３．１、Ｘｐ１３．３、Ｘｐ２６．２、Ｘｐ２６．３、Ｘｑ２８の染色体領域に存在する遺伝子の変化を少なくとも１つ以上を検出することにより、検体の悪性度を含めた癌化を検出する、癌の検出方法。
【請求項２】
遺伝子がＧＬＩ２、ＣＣＮＤ１、ＦＧＦ３、ＴＧＦＢＲ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＴＡＰ、ＳＭＡＤ４、ＥＶＩ１、ＭＵＣ４、ＰＴＰＮ１、ＺＮＦ２１７、ＢＣＡＳ１、ＴＦＡＰ２Ｃ、ＢＩＲＣ７、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ、ＶＥＧＦＣ、ＫＬＦ１２、ＦＧＦ１４、ＥＦＮＢ２、ＧＡＢＲＢ３、ＲＡＤ５１、ＲＨ６８６２１、ＰＭＰ２２、ＲＣＶ１、ＨＳＸＩＡＰＡＦ１、ＡＢＲ、ＨＩＣ１、ＭＡＤＨ４（ＳＭＡＤ４）、ＤＣＣ、ＭＡＬＴ１、ＧＲＰ、ＳＥＲＰＩＮＢ５、ＦＶＴ１、ＢＣＬ２、ＳＥＲＰＩＮＢ３、ＢＣＬ２、ＣＴＤＰ１、ＳＨＧＣ−１４５８２０、ＳＳＸ１、ＡＲ、ＭＬＬＴ７、ＡＢＣＢ７、ＧＰＣ３、ＦＧＦ１３、ＭＡＧＥＡ２、ＫＩＡＡ１９１３、ＥＰＢ４２Ｌ２、ＡＫＡＰ７、ＣＲＳＰ３、ＡＲＧ１、ＥＮＰＰ３、ＥＮＰＰ１、ＣＴＧＦの少なくとも１つ以上である、請求項１に記載の癌の検出方法。
【請求項３】
遺伝子の変化が、増幅、欠失、不活性化の少なくとも１つ以上である、請求項１又は２に記載の癌の検出方法。
【請求項４】
遺伝子の変化が、ＣｐＧアイランドのメチル化による不活性化である、請求項１から３の何れかに記載の癌の検出方法。
【請求項５】
検体において、請求項２に記載の遺伝子から翻訳される蛋白質の量を検出することにより、検体の悪性度を含めた癌化を検出する、請求項２に記載の癌の検出方法。
【請求項６】
蛋白質の量を免疫組織化学的法により検出する、請求項５に記載の癌の検出方法。
【請求項７】
ＣＴＧＦ遺伝子の欠失又は不活性化を検出することにより、検体の悪性度を含めた癌化を検出する、癌の検出方法。
【請求項８】
検体が、卵巣由来の組織である、請求項１から７の何れかに記載の癌の検出方法。
【請求項９】
癌が、卵巣癌である、請求項１から８の何れかに記載の癌の検出方法。
【請求項１０】
遺伝子の変化を、ＤＮＡチップ法、サザンブロット法、ノーザンブロット法、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法、ＦＩＳＨ法、ＣＧＨ法、または、アレイＣＧＨ法、Ｂｓｕｌｆｉｔｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ法、ＣＯＢＲＡ法を用いて検出する、請求項１から９の何れかに記載の癌の検出方法。
【請求項１１】
ＫＩＡＡ１９１３、ＥＰＢ４２Ｌ２、ＡＫＡＰ７、ＣＲＳＰ３、ＡＲＧ１、ＥＮＰＰ３、ＥＮＰＰ１、ＣＴＧＦ遺伝子、または、該遺伝子の発現産物である蛋白質をインビトロで細胞に導入することを含む、細胞の増殖を抑制する方法。
【請求項１２】
ＫＩＡＡ１９１３、ＥＰＢ４２Ｌ２、ＡＫＡＰ７、ＣＲＳＰ３、ＡＲＧ１、ＥＮＰＰ３、ＥＮＰＰ１、ＣＴＧＦ遺伝子、または、該遺伝子の発現産物である蛋白質を含む、細胞増殖抑制剤。
【請求項１３】
ＫＩＡＡ１９１３、ＥＰＢ４２Ｌ２、ＡＫＡＰ７、ＣＲＳＰ３、ＡＲＧ１、ＥＮＰＰ３、ＥＮＰＰ１、ＣＴＧＦ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは機能欠失型遺伝子を、インビトロで腫瘍細胞に導入することを含む、細胞の増殖を活性化する方法。
【請求項１４】
ＫＩＡＡ１９１３、ＥＰＢ４２Ｌ２、ＡＫＡＰ７、ＣＲＳＰ３、ＡＲＧ１、ＥＮＰＰ３、ＥＮＰＰ１、ＣＴＧＦ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは機能欠失型遺伝子を含む、細胞増殖活性化剤。
【請求項１５】
ＫＩＡＡ１９１３、ＥＰＢ４２Ｌ２、ＡＫＡＰ７、ＣＲＳＰ３、ＡＲＧ１、ＥＮＰＰ３、ＥＮＰＰ１、ＣＴＧＦ遺伝子のＣｐＧアイランドのメチル化に起因して遺伝子の発現が抑制されている卵巣癌に対して、被験物質を接触させて、遺伝子の発現を検出し、遺伝子発現が被験物質を接触させない系よりも増加していた場合に、被験物質を、遺伝子のＣｐＧアイランドの脱メチル化により遺伝子を活性化させることができる抗腫瘍物質として選別する、物質のスクリーニング法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００８−２９５３２８（Ｐ２００８−２９５３２８Ａ）
【公開日】平成２０年１２月１１日（２００８．１２．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１４３１１１（Ｐ２００７−１４３１１１）
【出願日】平成１９年５月３０日（２００７．５．３０）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【出願人】（５０４１７９２５５）国立大学法人 東京医科歯科大学 (228)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１２月１１日（２００８．１２．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年５月３０日（２００７．５．３０）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【出願人】（５０４１７９２５５）国立大学法人 東京医科歯科大学 (228)
【Ｆターム（参考）】
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