卵巣癌査定のための尿のメソセリン／巨核球可能化因子関連ペプチド（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ／ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒｆａｍｉｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）の検出
本発明は、メソセリン(mesothelin)、巨核球可能因子(megakaryocyte potentiating factor)と関連するアミノ酸配列(amino acid sequences)を有するペプチド（peptides）と卵巣癌患者の血清中の発生に関係する他のペプチドの女性の尿中の発生を査定するための方法とキットに関するものである。その方法とキットは、女性の卵巣癌を診断し、その他の点では、無症候の女性の卵巣癌の展開を予測し、卵巣癌治療法の効果を査定するために使用することができるものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
卵巣癌査定のための尿のメソセリン／巨核球可能化因子関連ペプチド(mesothelin/megakaryocyte potentiating factor family peptide)の検出。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、一般的に女性の卵巣癌の診断に関するものである。
【０００３】
卵巣癌は米国における女性の癌死亡の主要な原因のひとつである。卵巣癌患者の間で死亡率が比較的高い理由のひとつは、この疾病が進行した状態になるまでしばしばそうと診断されないことにある。
【０００４】
卵巣腫瘍は腫瘍が発生した細胞のタイプ、腫瘍細胞の形態学、および腫瘍の進行段階によって分類できる。
【０００５】
卵巣腫瘍は次の３つの卵巣細胞のタイプのいずれからでも−上皮細胞、生殖細胞、間質細胞のいずれからでも起こりうる。上皮卵巣腫瘍（ＥＯＴｓ）は全卵巣腫瘍の８５％以上を占める卵巣腫瘍の最も一般的なタイプである。ＥＯＴｓは卵巣の外側表面を覆う上皮細胞から発生する。ある種のＥＯＴｓは良性で医学的損傷は比較的に殆どない。併し悪性のＥＯＴｓは無制御に成長し近くの細胞を侵し又は離れた身体部分に転移する。生殖細胞卵巣腫瘍は卵子生産細胞から発生し、やはり良性のものと悪性のものとがある。間質卵巣腫瘍は卵巣結合組織細胞から発生するが比較的まれである。
【０００６】
ＥＯＴｓは上皮卵巣腫瘍を構成する細胞の種類によってさらに特徴づけられている。確認されている細胞の種類としては血清、粘液嚢胞、子宮内膜、および明細胞がある。ある種のＥＯＴｓはこれらの細胞種のなかで明確に区別できないものがあり、これらの区別できないＥＯＴｓが明確に区別できるＥＯＴｓの種類よりもより早く成長し蔓延する傾向がある。
【０００７】
ＥＯＴｓはまた等級と段階によっても分類される。腫瘍の等級はその肉眼で見える外観を著すものである。等級１腫瘍は、通常の卵巣組織に近似する傾向を有し、比較的良好な予後診断がなされる傾向を有している。等級３腫瘍は異常な外観を有する傾向があり、普通、悪い予後診断がなされる。等級２の腫瘍は等級１と等級３の中間である。腫瘍の段階とは腫瘍がその元の状態から広がった度合い又は範囲を示すものである。段階１の卵巣腫瘍は１つ又は両方の卵巣に限られる。段階１の中での等級づけとしては、１つの卵巣内部に限られる腫瘍（段階１Ａ）,両卵巣内部にかぎられる腫瘍（段階１Ｂ）,１つ又は両卵巣の表面に現れ、破裂したカプセルを有する１つまたはそれ以上の卵巣の状態で、或いは腹水に存在する腫瘍細胞又は腹膜洗浄で検出された腫瘍細胞と関連する腫瘍（段階１Ｃ）であらわされる。段階２卵巣腫瘍は卵巣をこえて骨盤内に広がったものである。段階２内の等級づけとしては、子宮や卵管の１つ又は両方に広がった腫瘍を段階２Ａとあらわし、他の骨盤臓器に広がるか、腹水に存在するか腹膜洗浄で検出された腫瘍細胞と関連した腫瘍を段階２Ｂとしてあらわす。段階３卵巣腫瘍は骨盤をこえてリンパ節にひろがるか骨盤、リンパ節両方にひろがったものである。段階４卵巣腫瘍は腹膜腔をこえた臓器に広がったものである。
【０００８】
卵巣腫瘍の早期診断は腫瘍の効果的治療のためにも患者の生存を伸ばすためにも重要である。卵巣癌の早期診断はこの疾病が進んだ状況に進行するまで目に見える兆候が殆どないという事実から判りにくいものである。卵巣腫瘍のための現存する診断テストには、効果的治療を与えるのに十分なほど早期な段階の卵巣癌を検出するのにあまねく成功しているといえるものはない。現存するテストが十分早期の卵巣癌を検出しない理由は完全には判っていない。例えば、いくつかのテストは腫瘍細胞から放出されるマーカーに依存しているが、その放出レベルは腫瘍の大きさが比較的大きく成長するまでは検出したと信頼できるにはあまりにも低いレベルなのである。
【０００９】
人々によって卵巣癌診断に用いられたマーカーにはＣＡ１２５（ハリラほか、１９８７、Br. J. キャンサー、５６（２）：１５３−１５６（Halila et al., Br. J. Cancer 56(2):153-156)）、癌性胎児抗原 (carcinoembryonic antigen)（ＣＥＡ；ジュエイほか、１９９７、ジネコルオンコル６７（３）：２５９−２７１（CEA; Juweid et al., 1997 Gynecol. Oncol 67(3):259-271））、血管内皮成長因子（vascular endothelial growth factor）（ＶＥＧＦ；キャンディド ドス レイスほか、２００２、ジネコルオブステットインベスト５４（３）：１３２−１３６（VEGF; Candido Dos Reis et al., Gynecol. Obstet. Invest. 54(3)132-136)、尿ゴナドトロピンペプチド（urinary gonadotropin)（ＵＧＰ；シュッターほか、アンチキャンサー レス１９（６C）：５５５１−５５５７（UGP;Schutter et al., 1999, Anticancer Res. 19(6C):5551-5557）、ネオプテリン(neopterin),ザルカほか、１９８８、アクタチアヒュング２９（４）：３５９−３６４(Szarka et al., 1988, Acta Chir. Hung. 29(4):359-364))、ＣＤ４４ スプライスヴァリアント（splice variants) (ウールスタイドほか、１９９５、オンコロジィ５２（５）：４００−４０６（Uhl-Steidl et al., 1995, Oncology 52(5):400-406)),尿システインプロテナーゼ(urinary cysteine proteinase)（ＵＣＰ；ガオほか、１９９６、ヒュアキイイケダクェクェバオ２７（３）：２９１−２９４(UCP; Gao et al., 1996, Hua Xi Yi Ke Da Xue Xue Bao 27(3):291-294)), 抗マリグニン抗体(anti-malignin antibody)（ボゴッホほか１９９１、ランセット３３７：９２７）（Bogoch et al., Lancet 337:927)), 腫瘍関連トリプシン抑制剤(tumor-associated trypsin inhibitor)（ＴＡＴＩ；メドルほか、１９９５、Br. J. キャンサー、７１（５）：１０５１−１０５４(TATI; Medl et al., 1995, Br. J. Cancer 71(5):1051-1054)); ハリラほか、１９８８、Br. J. キャンサー、５７（３）：３０４−３０７（Halia et al., 1988, Br. J. Cancer 57(3)304-307)). クドーほか（１９９９、ジネコルオブステットインベスト４７（１）：５２−５７（Kudoh et al., Gynecol. Obstet. Invest 47(1);52-57)）は、乳酸脱水素酵素(lactate dehydrogenase)（ＬＤＨ）、アルファーヒドロキシ酪酸脱水素酵素（alpha-hydroxybutyrate dehydrogenase) (ａＨＢＤＨ）、ＣＡ１９−９，組織ポリペプチド抗原(tissue polypeptide antigen)（ＴＰＡ），シアリルＴＮ（ＳＴＮ）を含むいくつかの他のＥＯＴs用血清マーカーの有用性を比較した。この段落にあげられたマーカーはどれも卵巣癌患者それぞれに異常量で存在しているわけではない。
【００１０】
メソセリンは少なくとも中皮細胞、中皮腫、いくつかの扁平上皮癌、及び卵巣癌の表面に発現されたタンパク質である（チャングほか、１９９６、プロック．ナショナル．アカデミ．サイエンス．ＵＳＡ９３：１３６−１４０（Chang et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci USA 93:136-140))。メソセリンは文献に記載されている(例えば、米国特許第６，０８３，５０２号）。メソセリンと結合する抗体についても記載されている。例えば、Ｋ１と称される単クローン性の抗体が米国特許第５，３２０，９５６に記載されており、受入番号ＨＢ１０５７０としてアメリカ基準培養物収集展示場（American Type Culture Collection)（ＡＴＣＣ；１０８０１大学通り；マナサス、バージニア２０１１０−２２０９；ＵＳＡ）に他の人によって預託されたハイブリドーマによって分泌される。抗体Ｋ１は卵巣癌や他の細胞の表面に見出される約４０キロダルトンのタンパク質と結合することが判明されている（チャングほか、１９９６、プロック．ナショナル．アカデミ．サイエンス．ＵＳＡ９３：１３６−１４０（Chung et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(1):136-140))。メソセリンと呼ばれるそのタンパク質はより大きな(約６９キロダルトン)前駆タンパク質から得られ、その配列は図１に示されている。ショラーら（１９９９、プロック．ナショナル．アカデミ．サイエンス．ＵＳＡ９６（２０）：１１５３１−１１５３６（Scholler et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(20):11531-11536))は、メソセリン(methothelin)や巨核球可能化因子(megakaryocyte potentiating factor)（ＭＰＦ）のアミノ端末配列に高度に類似するアミノ酸配列を有する抗原が卵巣癌にかかった多くの患者の血清中に発生することを確認した。ショラーは、この抗原が卵巣癌の診断のための有用な血清マーカーたりうると提案している。
【００１１】
有用な診断テストというものは患者のなかの卵巣癌の発生を検出できることだけであってはならず、それがまた安価、非侵襲性で使いやすいものであることが望ましい。テスト用担体として血液や血清を用いる診断テストは審査される患者から血液を抜き取らねばならず、時として抜き取った血液サンプルは更に分離、精製、または他の処理を必要とする。血液の抜き取りは訓練されたヘルスケア従事者によってなされねばならず、患者にとっては苦痛の多い侵襲的なもので、血液サンプルの貯蔵と輸送のための専門設備と試薬が必要で血液からの病原体の伝染の危険を有している。それに較べ、尿サンプルは殆ど又は全く専門的な設備を要さずに収集でき、ヘルスケア従事者によるしっかりした監視を必要とせず、患者の通常の生理上のプロセスの一部としてつくることができ、一般に伝染病の重要な原因とはならない。これらの理由から、テスト用担体として尿サンプルを用いた診断テストは血液サンプルで行われる同等のテストより好ましい。
【００１２】
本発明は、尿サンプルを使って実行でき、疾病進行の早期段階での卵巣癌検出に用い得る卵巣癌診断テストを提供する。
【発明の開示】
【００１３】
本発明は女性における卵巣癌（即ち、上皮、間質、生殖細胞卵巣癌の１つ又はそれ以上）の診断方法に関する。その方法は女性から採取した尿素中のメソセリン及び／又は巨核球可能化因子族（ＭＭＰＦＦ）ペプチド(mesothelin/megakaryocyte potentiating factor family peptide)の発生を査定することを含んで構成されていることを特徴とする。尿中のＭＭＰＦＦペプチドの発生はその女性が卵巣癌にかかっていることを示している。
【００１４】
１つの実施形態においては特にＭＭＰＦＦペプチドと結合する第１抗体と尿 (又は遠心分離した尿）を接触させることによって女性の尿のなかのＭＭＰＦＦペプチドを査定する。ＭＭＰＦＦペプチドがこの第１抗体と結合したかを査定することによって女性の尿のなかのＭＭＰＦＦペプチドの発生を査定することが出来る。例えば、第１抗体がロボット装置で自動分析するのに適合するように作製されたプラスチックのマルチウエルプレートのような基板に結び付けることが出来る。ＭＭＰＦＦペプチドと第１抗体の結合は、例えば第１抗体と特にＭＭＰＦＦペプチドと結合する第２抗体を接触させ第１と第２の抗体が一緒に局在しているかを査定することによって評価できる。第２抗体は酵素、放射性核種、発蛍光団、及び発色団を構成する群から選定された化合物で検出可能にラベル付けすることが出来る。
【００１５】
例として、この方法は結合している抗ＭＭＰＦＦペプチド捕獲抗体を有するプレートと女性から採取した尿とを接触させることから構成されている。尿は１０分又は１時間のような任意の時間プレートで熟成することが出来る。そのプレートは次いで、捕獲抗体が結合するよりも強くＭＭＰＦＦペプチドのエピトープと結合するビオチン化した第２抗体と接触することができる。ストレプタビディン(streptavidin)結合酵素はビオチン化した抗体と結合して発色性担体（例えば西洋わさびペルオキシダーゼ(horseradish peroxidase)の発色性担体である３、３'、５、５’−テトラメチルベンジジン）の存在のもとに検出を可能にする。勿論、第２抗体はそれに代えて蛍光体でのラベル付け、放射能でのラベル付け、または他の方法で検出できるようにラベル付けすることが出来る。
【００１６】
卵巣癌を診断するための方法についての他の実施形態において、第１の抗体が、第１の抗体と尿が接触しているラベル付けしたその担体と接触される。尿と接触した第１抗体と結合するラベルをつけた配位子の量と、尿と接触しなかった第１抗体の相当量と結合するラベルをつけた配位子の量を比較することによって尿からどのくらいの量のＭＭＰＦＦが第１抗体と結合したかを査定することができる。
【００１７】
ここに記載されるキットと方法が自然に発生するＭＭＰＦＦペプチド（即ちメソセリンと卵巣癌患者の体から自然に造りだされるようなタンパク質の部分のような両全長タンパク質）と合成的に造られたＭＭＰＦＦペプチドを含む種々のＭＭＰＦＦペプチドを検出するのに用いることができる。ＭＭＰＦＦペプチドのアミノ酸配列は、配列ＩＤ番号１から５よりなる群から選択された１つの配列の少なくとも１０(２０、５０、又は２００）の連続する残基から構成されていることを特徴としている。その代わり、ＭＭＰＦＦペプチドは少なくとも２０の連続アミノ酸残基の部分から構成され、その部分のアミノ酸配列は、配列ＩＤ番号１から５よりなる群から選択された１つの配列の２０の連続する残基と少なくとも９０％（又は９５％）同じであることを特徴としている。
【００１８】
ここに開示されたキットと方法は、他の卵巣癌マーカーの発生（尿または血清中での）の査定のための既知またはこれから開発されるキットや方法とともに用いることが出来る。例をあげれば、尿に発生することが知られている卵巣癌のマーカーは尿ゴナドトロピンペプチド（urinary gonadotropin peptide)、システインプロテイナーゼ(cysteine proteinase)、ネオプテリン(neopterin)、腫瘍関連トリプシン抑制剤(tumor-associated trypsin inhibitor)である。既知の血清卵巣癌マーカーにはＣＡ１２５、癌性胎児抗原、血管内皮成長因子（vascular endothelial growth factor）、腫瘍関連トリプシン抑制剤(tumor-associated trypsin inhibitor)、ＣＤ４４スプライス変形体（splice variants)、抗マリグニン抗体(anti-malignin antibody)、乳酸脱水素酵素（lactate dehydrogenase)、アルファーヒドロキシ酪酸脱水素酵素(alpha-hydroxybutyrate dehydrogenase)、ＣＡ１９−９、組織ポリペプチド抗原(tissue polypeptide antigen)、及びシアリルＴＮがあげられる。ＣＡ１２５は卵巣癌の発生、進行のための代理マーカーとして知られている。女性の尿中のＭＭＰＦＦペプチドの発生の査定は女性の血清中のＭＭＰＦＦペプチドの査定と関連して同様に行うことが出来る。
【００１９】
殆ど同じキットと方法が女性の卵巣癌にかかっている可能性を査定するのに用いられる。即ち、採取された尿の中にＭＭＰＦＦペプチドが発生している女性は、他の点では同じで且つ尿の中にＭＭＰＦＦがない女性よりも卵巣癌にかかっている可能性が高いということを示すものである。
【００２０】
殆ど同じキットや方法が女性の卵巣癌の治療の効能を査定するのに用いられる。治療後の女性から採取した尿中のＭＭＰＦＦペプチドの量は治療前のその女性のＭＭＰＦＦの量と比較される。治療後の尿中のＭＭＰＦＦペプチドの量が少ないことはその治療の効果があったことを示している。同様に、治療後の尿中のＭＭＰＦＦペプチドの量が多いことはその治療の効き目がなかったことを示している。そのようなキットや方法は種々の治療薬や養生法の効能の比較に用いることが出来る。
【００２１】
別の観点において、本発明は女性から採取した尿中のＭＭＰＦＦペプチドの発生を査定するキットに関するものである。そのキットはＭＭＰＦＦペプチドと結合するための第１薬剤（例えば抗体）と、尿と第１薬剤との接触を記述する使用説明書とから構成されている。キットの構成は決定的なものではなくＥＬＩＳＡ、ラテックスビーズ凝集体、表面プラズモン共鳴形式のような多くの標準形式を使うことが出来る。そのキットには積極的なコントロールとして用いるためのＭＭＰＦＦペプチドを含めることが出来る。勿論、そのキットに卵巣癌の他の既知のマーカーを評価するための試薬を含めることが出来る。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
アミノ酸配列を含んでいるすべての図において、標準単一文字アミノ酸コードはアミノ酸残基を代表するのに用いられる。
【００２３】
図１はメソセリン前駆タンパク質のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：１）である。この配列はゲンバンク（登録商標）（GENBANK（登録商標）)受入番号２２０７３８６Ａにリストされているものと同じで、チャングほか、１９９６、プロック．ナショナル．アカデミ．サイエンス．ＵＳＡ９３（１）：１３６−１４０（Chung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(1):136-140）に報告されている.
【００２４】
図２は巨核球可能化因子(megakaryocyte potentiating factor)（ＭＰＦ）前駆タンパク質のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：２）である。この配列はゲンバンク（登録商標）（GENBANK（登録商標））受入番号ＮＰ００５８１４と同じで、ヤマグチほか、１９９４、Ｊ．ビオル．ケミ．２６９（２）：８０５−８０８（Yamaguchi et al, 1994, J. Biol. Chem.269(2):805-808）に報告されている。
【００２５】
図３はＭＰＦ前駆タンパク質の可溶性変形型で部分アミノ酸配列（配列ＩＤ番号：３）でゲンバンク（登録商標）（GENBANK（登録商標）)受入番号ＡＦ１８０９５１にリストされショラーら１９９９、プロック．ナショナル．アカデミ．サイエンス．ＵＳＡ９６（２０）：１１５３１−１１５３６（Scholler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(20):11531-11536)に報告されている。
【００２６】
図４Ａおよび４Ｂからなる図４は配列ＩＤ番号１の残基２９４−６２８と配列ＩＤ番号２のほぼ同じ部分との比較である。残基の数が右の余白に表記されている。「ＭＳＴ」はメソセリンを意味する。「ＭＰＦ」は巨核球可能化因子(megakaryocyte potentiating factor)を意味する。この配列において、同じアミノ酸残基は垂直線で示され、同類アミノ酸置換はクロス（＋）で示され、ダッシュ（−）は配列を合せるために配列ＩＤ番号２に挿入した隙間を意味している。
【００２７】
図５Ａおよび５Ｂからなる図５は配列ＩＤ番号１から３の同じ部分の比較である。残基の数は右の余白にあげられている。「ＭＳＴ」はメソセリンを意味する。「ＭＰＦ」は巨核球可能化因子(megakaryocyte potentiating factor)を意味する。「ＳＭＲ」はＭＰＦの可溶性変形型でその配列は図３にあげられている。この配列で、３つの配列で同じになっている残基は大文字の単一文字コードによって示され、３つの配列すべてにおいて同一でない残基は小文字の単一文字コードによって示され、配列を合せるために挿入した隙間はダッシュ（−）で表されている。
【００２８】
図６は、図６Ａおよび６Ｂからなる。図６Ａは、アミノ酸配列（配列ＩＤ番号４）でここに記載される抗体の発生に好ましいエピトープを含んでいる。図６Ｂは、アミノ酸配列（配列ＩＤ番号５）でここに記載される抗体の発生に好ましいエピトープを含んでいる。配列ＩＤ番号４及び５のそれぞれにおいて、下線を引いた太字のＸは何らかのアミノ酸残基を示し、アスパラギン酸塩またはアスパラギンのいずれかであることが好ましい。図６Ａにおいてその他の下線を引いた太字の残基は図６Ｂに示される配列には存在しない残基を示している。
【００２９】
図７は、ＣＡ１２５ＩＩ抗体の血清レベル（左から右に斜め下に伸びる線条のある棒）とＭＭＰＦＦペプチドの尿レベル（左から右に斜め上に伸びる線条のある棒）を示す棒グラフで、ここに開示されたように査定されたものである。査定は１から４として示されている４人の患者について卵巣癌診断時（ａ）と手術着手から約１ヵ月後（ｂ）の両方で行われた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本発明はメソセリン(mesothelin)、巨核球可能化因子(megakaryocyte potentiating factor)（ＭＰＦ）、及びＭＰＦの可溶性変形物を含むタンパク質族と類似な重要なアミノ酸配列を有する１つ又はそれ以上のポリペプチドが卵巣癌にかかっている女性の尿の中に発生しているという発見に関係してる。これらの尿ポリペプチドはその族のタンパク質に対抗する抗体と特に結合する。患者の尿中にこれらのポリペプチドが発生しているということはその患者が卵巣癌にかかっているという診断である。ポリペプチドの量は卵巣癌の効果的な治療によって減少する。このように、尿ポリペプチドは抗卵巣癌治療の効果を査定するのにも用いられる。
【００３１】
定義
【００３２】
ここに用いられるように、次の用語の各々はこの章内でそれと関連する意味を有している。
【００３３】
メソセリン／巨核球可能化因子族ペプチド(mesothelin/megakaryocyte potentiating factor family peptide)（ＭＭＰＦＦペプチド）は（i）配列ＩＤ番号１から５よりなる群から選択された１つの配列の少なくとも１０の連続的な残基からなるか、(ii）少なくとも２０の連続アミノ酸残基の一部からなり、その部分のアミノ酸配列は配列ＩＤ番号１から５よりなる群から選択された１つの配列の２０の連続残基と少なくとも９０％（好ましくは少なくとも９５％又は１００％）同一であるかのいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【００３４】
「抗体」というのは集合的にまた個別に免疫性グロブリン分子、免疫性グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、即ち特にＭＭＰＦＦペプチドと結合する抗原の結合サイトを含む分子に対して集合的及び個別に当てはまるものである。特にＭＭＰＦＦペプチドと結合する分子はそのペプチドと結合するが当然ポリペプチドを含んでいる試料（例えば尿サンプル）のなかの他の分子とは殆ど結合しない分子である。免疫性グロブリン分子の免疫学的活性部分の例には、抗体がそれぞれパパイン又はペプシンのような酵素と処理されることによって発生できるＦ(ab）とＦ(ab')２フラグメントが含まれている。多クーロン性と単クーロン性の一方又は両方の抗体がここに記載される方法とキットに用いられる。
【００３５】
「単クーロン抗体」という語は特定のエピトープと免疫学的に反応することのできる抗原結合サイトの一種のみを含む抗体分子の集団をいう。
【００３６】
「ラベル付けした」という語は抗体またはペプチドに関するもので、検出可能物質をペプチド又は抗体にカップリング（即ち物理的に結合する）することによって直接ペプチド又は抗体にラベルを付けることと、それを直接ラベル付けされる他の試薬とカップリングすることによってペプチド又は抗体を間接的にラベル付けすることを含んでいる。間接ラベル付けの例には蛍光ラベル付けした第２抗体を用い蛍光ラベル付けしたストレプタビディン(streptavidin)で検出できるようペプチドをビオチンで末端ラベル付けすることで基本の３抗体を検出することを含んでいる。
【００３７】
「使用説明書」というのは刊行物、記録、図表、又はここに記載されているキットをどのように使うかを伝達するのに用いることが出来るその他の表現媒体と、卵巣癌に関係するものとして尿中のＭＭＰＦＦの発生を解釈するための情報、またはその両者である。本発明のキットについての使用説明書は例えば本発明のキットを含む容器に添付されるか、キットをいれた容器と一緒に出荷することができる。代わりに、使用説明書は容器と別に出荷することが出来るが意図としては使用説明書とキットを受取人が一緒に使うようにということである。
【００３８】
詳細な記載
【００３９】
タンパク質族とかなりのアミノ酸配列類似性を有する１つまたはそれ以上のポリペプチド（メソセリン／巨核球可能化因子族(mesothelin/megakaryocyte potentiating factor family peptide)；ＭＭＰＦＦ）が卵巣癌にかかった女性の尿に発生する。これらの尿ペプチドは、例えばＭＭＰＦＦのタンパク質に対抗する抗体で検出される。患者の尿にこのようなペプチドが発生することは、患者が卵巣癌にかかっていることを示すものである。卵巣癌の多様性、個々のなかでの遺伝子的多様性や他の要因により、ＭＭＰＦＦペプチドは卵巣癌にかかった全患者の尿中には現れにくく、殆ど同じ型の卵巣癌にかかった個々に対して異なった量で現れやすいのである。これらの変化を考慮にいれても、女性の尿中のＭＭＰＦＦペプチドの１つ又はそれ以上の発生があれば、その女性は卵巣癌にかかっていることを示している。
【００４０】
都合のよいことには、卵巣癌にかかった女性の尿にＭＭＰＦＦペプチドが発生することは卵巣癌だと判る段階に依存しないようである。そのため、ＭＭＰＦＦペプチドの尿での発生は早期段階での卵巣癌の診断に用いることが出来て、治療が無駄となるか、無駄に近い病状段階に達する前に癌の効果的な治療が可能となるのである。
【００４１】
ここに開示されたキットと方法の他の利点は卵巣癌患者の尿中のＭＭＰＦＦペプチドの量と濃度が腫瘍の状態を示すものであることである。そのため、尿ＭＭＰＦＦペプチド発生の査定は卵巣癌の治療のための養生法の効果を査定するのに用いることが出来る。養生で腫瘍の収縮、後退がおこる分だけＭＭＰＦＦペプチドの尿中濃度が減少することが期待される。同様に、卵巣癌治療の間に尿中のＭＭＰＦＦペプチドが徐々にスムースに増加していることは、治療のための養生が腫瘍の成長を抑制していないことを示している。
【００４２】
ここに記載されているキットや方法は種々の卵巣癌型の発生、進行を査定するのに用いることが出来る。ひとつの重要な実施形態では、キットと方法が最も普通の卵巣癌のなかの上皮卵巣癌の発生または進行を査定するのに用いられる。その他の実施形態では、このキットや方法は間質卵巣腫瘍や生殖細胞卵巣腫瘍の発生や進行を査定するのに用いられる。
【００４３】
診断方法
【００４４】
本発明は女性の卵巣癌の診断方法を含むものである。その方法は女性から採取した尿のなかのメソセリン／巨核球可能化因子族(mesothelin/megakaryocyte potentiating factor family peptide)（ＭＭＰＦＦ）ペプチドの発生を査定することを含んで構成されることを特徴としている。尿中のＭＭＰＦＦペプチドの発生は女性が卵巣癌にかかったことを示唆するものである。種々の型の卵巣癌（例えば上皮卵巣癌）、程度、段階がこの方法を用いて診断される。この方法はまた種々の細胞の型（例えば血清細胞、粘液細胞、子宮細胞、明細胞、及び区別できない卵巣腫瘍）によって特徴づけられる卵巣癌の診断に用いることが出来る。
【００４５】
女性の尿中のＭＭＰＦＦペプチドの発生を査定するのに用いられるこの方法は決定的なものではない。どんな方法でもペプチドの有無を査定するのに用いられればその方法でよいのである。尿中のＭＭＰＦＦペプチドの量（例えば濃度）を査定できる方法がいくつかの実施形態では好ましく、特に、比較のために時間の経過とともになされる査定の場合に好ましい（例えば、抗癌治療の養生効果の査定の場合）。
【００４６】
ひとつの実施形態において、患者の尿中でのＭＭＰＦＦペプチドの発生が、特にＭＭＰＦＦペプチドと結合する抗体と尿の接触により、そしてＭＭＰＦＦペプチドが第１抗体と結合したかを査定することによって査定される。
【００４７】
この分野では多くのＭＭＰＦＦ結合抗体が知られている。例えば米国特許第５，３２０，９５６に記載され、受入番号ＨＢ１０５７０としてＡＴＣＣに預託されたハイブリドーマによって分泌される抗体を使うことが出来る。その抗体はチャングほか（１９９６、プロック．ナショナル．アカデミ．サイエンス．ＵＳＡ９３：１３６−１４０（Chung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(1):136-140）に記載のように、特にメソセリンタンパク質の約４０キロダルトン部と結合する。他の好適な抗体についてはショラーほか（１９９９、プロック．ナショナル．アカデミ．サイエンス．ＵＳＡ９６（２０）：１１５３１−１１５３６（Scholler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(20):11531-11536）及びＰＣＴ公報ＷＯ００／５０９００に記載され、そのような抗体はＯＶ５６９，４Ｈ３，３Ｇ３，及び１Ａ６と呼ばれている。
【００４８】
２つの抗ＭＭＰＦＦペプチド抗体を用いる診断用キットと方法において、２つの抗体は同じエピトープとの結合を競わせないことが好ましい。例を挙げれば、ショラーほかによってＯＶ５６９と呼ばれる抗体は４Ｈ３，３Ｇ３，及び１Ａ６と呼ばれる抗体に結合されたエピトープと異なるエピトープの所で結合する。このように、例えばＯＶ５６９は適当な抗体結合条件のもとにある担体と結合し患者の尿中に存在するＭＭＰＦＦペプチドと結合する捕獲抗体として用いることが出来、抗体４Ｈ３，３Ｇ３，及び１Ａ６のひとつが検出可能にラベル付けされ、捕獲抗体と患者の尿の接触後、捕獲抗体と接触することができる。検出可能にラベル付けした抗体と捕獲抗体との結合はＭＭＰＦＦペプチドが患者の尿に存在していたことを示している。捕獲抗体と一緒に局在している検出可能なラベルの量の分析から存在していたペプチドの量を示すことが出来る。
【００４９】
ここに記載されているように、ＭＭＰＦＦペプチドの幾つかの部分は重要なアミノ酸配列相同を共有している。図１から３は少なくとも３つのＭＭＰＦＦタンパク質のアミノ酸配列の少なくともある部分を示している。図４と５はこれらの配列の直線性を示し、これらのタンパク質のなかの最大配列相同の領域を示している。これらの図から、図６Ａおよび６Ｂ（それぞれ配列ＩＤ番号４と５）に示される配列がＭＭＰＦＦペプチドの有用な部分をあらわしている。これらの配列のいずれかの全部分又は一部分（例えば、１０、２０、５０、又は２００の連続残基）に対抗する抗体は特に卵巣癌患者の尿中に発生するものを含むのＭＭＰＦＦペプチドの広い範囲と結合することが期待される。
【００５０】
ＭＭＰＦＦ（例えばここに記載されたもの又は従来技術の中に記載されているもの）又はその一部が多クーロン及び単クーロン抗体作製のための標準技術を用いて抗体を発生させるための免疫抗原として用いることが出来る。全長ＭＭＰＦＦの断片は免疫抗原として用いられる場合には配列ＩＤ番号１から５までのいずれかのアミノ酸配列か他のＭＭＰＦＦメンバーのアミノ酸配列の少なくとも１０のアミノ酸残基（好ましくは１２、１５、２０、５０、１００か２００またはそれ以上）からなることが望ましい。
【００５１】
ここに記載されたキットと方法に有用な抗体の発生に適切なＭＭＰＦＦペプチドは、配列ＩＤ番号１から５よりなる群から選択された１つの配列の２０の連続する残基と少なくとも９０％（好ましくは少なくとも９５％或いは１００％）は同一である少なくとも２０の連続したアミノ酸残基の部分から構成されているものである。
【００５２】
抗体発生方法は既知でありここに簡単に要約のみを記載する。一般に免疫抗原はウサギ、ヤギ、ねずみ、その他の哺乳動物又は脊髄動物のような適当な対象（即ち免疫担当）を免疫化することによって抗体を作製するのに用いられる。好適な免疫抗原作製には例えば遺伝子組み換えと表現された、又は化学的に合成されたポリペプチドを含めることが出来る。その作製は更にフロインドの完全又は不完全補助薬又は同じ免疫活性化試薬のような補助薬を含めることが出来る。
【００５３】
多クーロン抗体は免疫抗原として本発明のポリペプチドを用いて適当な対象を免疫化することによって上述のように作製することが出来る。免疫化した対象中の抗体タイターは固定したポリペプチドを用いた酵素結合免疫吸着剤査定法（ＥＬＩＳＡ）のような標準技法によって時間の経過とともに監視することが出来る。望むなら、抗体分子はその対象から収穫され又は分離され（例えば、対象の血液、血清から）、タンパク質Ａクロマトグラフィーのような既知の技法によって精製されＩｇＧ留分を得ることができる。
【００５４】
免疫化後適切なときに、例えば、特定の抗体タイターが最高のとき、抗体生産細胞を対象から収穫し、元来はコーラーとミルスタイン（１９７５）ネイチャー２５６：４９５−４９７（Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495-497）に記載されたハイブリドーマ技法、人のＢ細胞ハイブリドーマ技法（コツボーほか（１９８３）イムノル．トゥデイ４：７２（Kozbor et al., (1983) Immunol. Today 4:72）、ＥＢＶハイブリドーマ技法（コールほか（１９８５）モノクロナル アンチボディ アンド キャンサーテラピー、アランＲ．リス,インクｐｐ７７−９６（Cole et al., 81985） Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96）又はトリオーマ技法のような標準技法によって単クーロン抗体を作製するのに用いることが出来る。ハイブリドーマを生産する技術はよく知られている（カレント プロトコル イン イムノロジー（１９９４）コリガンほか（Eds.）ジョン ウイリー＆サン、インク．、ニューヨーク、ＮＹ(Current Protocols in Immunology (1994) Coligan et al., (Eds.) John Wiley & Sons, Inc., New York, NY). 本発明の単クーロン抗体を生産するハイブリドーマ細胞は、問題のポリペプチドと結合する抗体用ハイブリドーマ培養菌の上澄みを、例えば標準ＥＬＩＳＡ査定を用いて、スクリーニングすることによって検出される。
【００５５】
単クーロン抗体分泌ハイブリドーマの作製の代わりに、本発明のポリペプチドに対抗する単クーロン抗体は組み換え組み合わせ免疫性グロブリンライブラリー（例えば抗体ファージ展示ライブラリ）を問題のポリペプチドでスクリーニングすることで同定され分離される。ファージ展示ライブラリを発生させスクリーニングするためのキットは市販で入手可能である。（例えば、ファーマシア リコンビナント ファージ アンチボディ システムのカタログ番号２７−９４００−０１（Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Catalog No. 27-9400-01)；とストラータジーンＳＵＲＦＺＡＰＴＭファージディスプレイキット カタログ番号２４０６１２(Stratagene SURFZAPTM Phage Display Kit, Catalog No. 240612）。また、特に、抗体展示ライブラリを発生、スクリーニングする用途に適用できる方法や試薬の例は、例えば、米国特許番号５，２２３，４０９、ＰＣＴ公報番号ＷＯ９２／１８６１９，ＰＣＴ公報番号ＷＯ９１／１７２７１，ＰＣＴ公報番号ＷＯ９２／２０７９１，ＰＣＴ公報番号ＷＯ９２／１５６７９，ＰＣＴ公報番号ＷＯ９３／０１２８８，ＰＣＴ公報番号ＷＯ９２／０１０４７，ＰＣＴ公報番号ＷＯ９２／０９６９０，ＰＣＴ公報番号ＷＯ９０／０２８０９，フックスほか、（１９９１）バイオ／テクノロジー９：１３７０−１３７２（Fucks et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372;ヘイほかフム．アンチボド．ハイブリドマス３：８１−８５(Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85); フュースほか（１９８９）サイエンス２４６：１２７５−１２８１(Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281);グリフィスほか（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ．１２：７２５−７３４(Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12:725-734).
【００５６】
人間的な部分と非人間的な部分の両方からなる標準的な組み換えＤＮＡ技法を用いた空想的且つ人間的単クーロン抗体組み換え抗体は本発明の範囲内にあるものである。そのような空想的且つ人間的単クーロン抗体はこの分野で既知の組み換えＤＮＡ技法によって造られるが、ＰＣＴ公報番号ＷＯ８７／０２６７１；ヨーロッパ特許番号１８４，１８７；ヨーロッパ特許番号１７１，４９６；ヨーロッパ特許番号１７３，４９４；ＰＣＴ公報番号ＷＯ８６／０１５３３；米国特許番号４，８１６，５６７；ヨーロッパ特許番号１２５，０２３；ベターほか．（１９８８）サイエンス２４０；１０４１−１０４３（Better et al. (1988) Science 240:1041-1043;リューほか．（１９８７）プロック．ナット．アカド。サイエンス．ＵＳＡ８４：３４３９−３４４３(Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443); リューほか．（１９８７）Ｊ．イムノル．３９：３５２１−３５２６（Liu et al. (1987) J.Immunol. 139:3521-3526);サンほか．（１９８７）プロック．ナット．アカド。サイエンス．ＵＳＡ８４：２１４−２１８(Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218);ニシムラほか．（１９８７）キャンサーレス．４７：９９９−１００５(Nishimura et al. (1987) Cancer Res. 47:999-1005);ウッドほか．（１９８５）ネイチャー３１４：４４６−４４９（Wood etal. (1985) Nature 314:446-449); ショウほか．（１９８８）J.ナット．キャンサーインスト．８０：１５５３−１５５９（Shaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559);モリソン（１９８５）サイエンス２２９：１２０２−１２０７（Morrison (1985) Science 229:1202-1207);オーイほか．（１９８６）バイオ／テクニーク４：２１４(Oi et al. (1986) Bio/Techniques 4:214); 米国特許番号５，２２５，５３９；ジョンほか．（１９８６）ネイチャー３２１：５５２−５２５（Jones et al. (1986) Nature 321: 552-525);バーホーヤン（１９８８）サイエンス２３９：１５３４(Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534); バイドラほか．（１９８８）Ｊ．イムノル．１４１：４０５３−４０６０（Beidler et al. (1988) J.Immunol. 141:4053-4060）。
【００５７】
抗ＭＭＰＦＦペプチド抗体を患者から採取した尿と接触させる実施形態において、尿はその自然に分泌された状態で用いられるか使用前に部分的に精製するか浄化して使うことが出来る。例えば、尿は標準の方法である遠心分離によってその尿を抗体と接触させる前に沈殿物をほとんど除いてもよい。代わりに、尿はその量を減らすか大きな汚染物を除くために濾過または限外濾過してもよい。何故なら、尿中に発生するＭＭＰＦＦペプチドは１０，０００から１００，０００ダルトンの範囲の分子量をもつポリペプチドであると思われ、ＭＭＰＦＦペプチドが検出前に除かれてしまうのを防ぐために適切な濾過又は限外濾過の選定が必要である。例をあげれば、比較的大きな孔のフィルター（例えば、２５０，０００から百万ダルトンの分子量を有する球状粒子の通過を許す様なもの）が尿から粒状物質を除くのに用いることが出来て、約５０００ダルトン以上の分子量をもつタンパク質の通過を除外するような膜を装備した限外濾過装置が炉液を濃縮するのに用いることが出来る。この実施例では、限外濾過装置のなかの残留物のなかのＭＭＰＦＦの発生を査定できる。
【００５８】
ＭＭＰＦＦペプチドは卵巣癌患者の尿中に比較的多量に存在することが多く、ここに記載された多くの方法（例えば免疫学的方法）は比較的感度がよいので、通常卵巣癌患者の尿中のＭＭＰＦＦペプチドの発生を検出するのに尿の濃縮は必要としない。尿の浄化が必要とされる場合、遠心分離が好ましい。何故なら、限外濾過を使えば尿中に存在するＭＭＰＦＦペプチドが濾過媒体と結合したり絡まったりする可能性がないからである。
【００５９】
女性の尿中のＭＭＰＦＦペプチドの発生を査定する好ましい方法は通常［サンドイッチＥＬＩＳＡ］査定法として知られる処理法である（ＥＬＩＳＡは酵素で連接した免疫性吸着剤査定法の略称である）。この方法では、抗体はガラスビーズやプラスチックのマルチウエルプレートの底面のような担体に結合される。この抗体は「捕獲」抗体と呼ばれる。女性からのそのままの、或いは浄化したり精製した尿が種々の条件のもと（例えば、塩、活性剤の濃度が低くタンパク質変性でない条件）に担体と接触され、尿中にＭＭＰＦＦペプチドがあれば特に捕獲抗体と結合する。担体は任意にはＭＭＰＦＦペプチドを含まない液体で洗浄して残りの尿及び結合していないＭＭＰＦＦを除く。次いで担体は捕獲抗体が結合しているエピトープの所と異なるエピトープの所でＭＭＰＦＦと結合する第２抗体と接触させる。第２抗体は配位子又は配位子の受容体のいずれかと検出可能にラベル付けされるか結合する。どちらにせよ、担体を第２抗体を含まない液体で洗浄した後に第２抗体の結合が検出される。第２抗体の検出はＭＭＰＦＦペプチドの尿中での存在を示している。第２抗体の量が定量されれば、次いで尿中のＭＭＰＦＦペプチドの量が定量できる。例えば、既知量のＭＭＰＦＦを含む対照試料を用いて行った測定で検出した第２抗体の量を比較することによって定量できる。
【００６０】
抗体検出は抗体を検出可能物質とカップリングすることによって可能になる。検出可能な物質の例には種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、及び放射性物質がある。好適な酵素の例には西洋わさびペルオキシダーゼ（horseradish peroxidase)、アルカリホスフォターゼ(alkaline phoaphatase)、ベータガラクトシダーゼ(beta-galactosidase)、アセチルコリンエステラーゼ(acetylcholinesterase)を含み、好適な補欠分子族複合体はストレプタヴィディン／バイオチン(streptavidin/biotin)とアビジン／バイオチン(avidin/biotin)である。好適な蛍光物質の例はウンベリフェロン(umbelliferone)、フルオレセイン(fluorescein)、フルオレセインイソチオシアネート(fluorescein isothiocyanate)、ローダミン(rhodamine)、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセン(dichlorotriazinylamine fluorescein)、塩化ダンシル(dansyl chloride)又はフィコエリトリン(phycoerythrin)である。発光物質の例はルミノール(luminol)で、生体発光性物質の例はルシフェラーゼ(luciferase)、ルシフェリン(luciferin)、及びエクオリン(aequorin)で、好適な放射性物質の例は１２５I、１３１I、３５S、又は３Ｈである。
【００６１】
標準化した査定装置を使用することでここに記載された方法の自動化ができるようになる。例えば、２４、４８、９６、３８４のウエルのあるプラスチックプレートのような多くの異なった標準化した査定用容器が知られている。これらの容器がロボット装置にはめ込まれるようにした所では試料の自動分析が達成され比較的短い時間で多くの試料を高処理量でスクリーニングできている。コンピュータ制御査定に使用するように作製された自動査定装置と容器はこの分野で既知でありここに記載されたキットや方法に容易に適合されている。
【００６２】
女性から採取された尿中のＭＭＰＦＦペプチドの発生を査定するのに用いることの出来る免疫学的査定についての他のタイプは普通「競合」査定と呼ばれる。この査定では、特にＭＭＰＦＦペプチドと結合する抗体が担体に固定される。そのままの尿、浄化又は精製された尿がその担体に接触され（好ましくは数分又は数時間の間）尿中にＭＭＰＦＦペプチドが存在すれば、それが抗体と結合する。特に抗体と結合するラベル付け配位子（例えば、同じＭＭＰＦＦペプチド又は別のＭＭＰＦＦペプチドのラベル付きのもの）が次いで担体と接触される（好ましくは数分又は数時間の間）。ラベルまたはラベル付き配位子を含まない液体で担体を洗浄した後、担体と結合したラベル付き配位子の量が査定される。担体と結合したラベルの量が患者の尿とは接触していないが他の点では同様に処理された単体に結合したラベルの量と比較される。結合したラベルのこの２つの量の差が担体に結合したＭＭＰＦＦペプチドの量を示すものであり、担体に適用された尿サンプル中に存在したＭＭＰＦＦペプチドの量を示唆するものである。
【００６３】
免疫学的競合査定が用いられると、担体と結合した抗体のラベル付き配位子は患者の尿中に存在していると判っているか又は存在していると思われるＭＭＰＦＦペプチドと出来るだけ同じでなければならない。例えば、その配位子とそのＭＭＰＦＦペプチドは同じアミノ酸配列を有するか含んでいなければならない。同様に患者の尿中に発生するＭＭＰＦＦペプチドがグリコシル化されたものと思われる場合、配位子も同様に同じ位置で同じ程度にグリコシル化されていなければならない。このように、配位子に対する抗体とＭＭＰＦＦペプチドに対する抗体の類似性の差は最小にする事が出来て競合査定の精度を改善することが出来る。
【００６４】
ここに記載されるキットや方法は人間の患者の尿のなかにあるＭＭＰＦＦペプチドの発生の査定のみに用いることが出来るもので、そのような発生が女性が卵巣癌にかかっていることを示すものである。併し、もし卵巣癌の１つ以上のマーカーの発生が女性のなかで査定されれば、多くの卵巣癌が検出できて卵巣癌の診断における大きな確信が得られるのである。その他の卵巣癌マーカーも普通尿のなかで発見されるマーカーでありうるし、通常血液のなかで発見されるマーカーでありうるし、又は尿及び血液の両方で発見されるマーカーでありうる。例をあげれば、ＭＭＰＦＦペプチドは卵巣癌にかかった患者の血清のなかに見つかる（ショラーほか、１９９９、プロック．ナショナル．アカデミ．サイエンス．ＵＳＡ９６（２０）：１１５３１−１１５３６（Scholler et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(20):11531-11536))。このように、尿中のＭＭＰＦＦペプチドの発生の査定用にここに記載されたキットや方法は、血清中の同じ又は別のＭＭＰＦＦペプチドの検出のためのキットや方法と関連付けて用いることが出来る。
【００６５】
尿中に発生することが知られている他の卵巣癌マーカーには尿グナドトロピンペプチド（urinary gonadotropin peptide(ＵＧＰ；シュッターほか、１９９９、アンチキャンサー レス１９（６C）：５５５１−５５５７（UGP;Schutter et al., 1999, Anticancer Res. 19(6C):5551-5557)), システインプロテイナーゼ(cysteine proteinase)(ＵＣＰ；ガオほか、１９９６、ヒュアキイイケダクェクェバオ２７（３）：２９１−２９４(UCP; Gao et al., 1996, Hua Xi Yi Ke Da Xue Xue Bao 27(3):291-294), ネオプテリン(neopterin)(ザルカほか、１９９８、アクタチアヒュング２９（４）：３５９−３６４（Szarka et al., 1988, Acta Chir. Hung. 29(4):359-364)) 及び腫瘍関連トリプシン抑制剤(tumor-associated trypsin inhibitor)(ＴＡＴＩ；メドルほか、１９９５、Br. J. キャンサー、７１（５）：１０５１−１０５４（TATI; Medl et al., 1995, Br. J. Cancer 71(5):1051-1054; ハリラほか、１９８８、Br. J. キャンサー、５７（３）：３０４−３０７(Halia et al., 1988, Br. J. Cancer 57(3)304-307))がある。
【００６６】
血清中に発生することが知られている他の卵巣癌マーカーにはＣＡ１２５（ハリラほか、１９８７、Br. J. キャンサー、５６（２）：１５３−１５６（Halila et al., Br. J. Cancer 56(2):153-156)）, 癌性胎児抗原 (carcinoembryonic antigen）（ＣＥＡ；ジュエイほか、１９９７、ジネコルオンコル６７（３）：２５９−２７１（CEA; Juweid et al., 1997 Gynecol. Oncol 67(3):259-271））、血管内皮成長因子（vascular endothelial growth）（ＶＥＧＦ；キャンディド ドス レイスほか、２００２、ジネコルオブステットインベスト５４（３）：１３２−１３６（VEGF; Candido Dos Reis et al., Gynecol. Obstet. Invest. 54(3)132-136)、腫瘍関連トリプシン抑制剤(tumor-associated trypsin inhibitor) (ＴＡＴＩ；メドルほか、１９９５、Br. J. キャンサー、７１（５）：１０５１−１０５４（TATI; Medl et al., 1995, Br. J. Cancer 71(5):1051-1054; ハリラほか、１９８８、Br. J. キャンサー、５７（３）：３０４−３０７(Halia et al., 1988, Br. J. Cancer 57(3)304-307)), ＣＤ４４ スプライス変形体（CD44 splice variants) (ウールスタイドほか、１９９５、オンコロジィ５２（５）：４００−４０６（Uhl-Steidl et al., 1995, Oncology 52(5):400-406)), 抗マリグニン抗体(anti-malignin antibody)（ボゴッホほか１９９１、ランセット３３７：９２７）（Bogoch et al., Lancet 337:927)), 乳酸脱水素酵素（lactate dehydrogenase)（ＬＤＨ）、アルファーヒドロキシ酪酸脱水素酵素(alpha-hydroxybutyrate dehydrogenase) (ａＨＢＤＨ）、ＣＡ１９−９，組織ポリペプチド抗原(tissue polypeptide antigen)（ＴＰＡ），シアリルＴＮ（ＳＴＮ; クドーほか（１９９９、ジネコルオブステットインベスト４７（１）；５２−５７（Kudoh et al., 1999, Gynecol. Obstet. Invest 47(1);52-57)）がある。血液及び又は尿中のこれら既知のマーカーの組み合わせのいずれかを査定するためのキットや方法は、それが少なくとも尿中のＭＭＰＦＦペプチドの発生を査定するキットや方法であるかぎり本発明に含むものである。
【００６７】
女性から採取した尿中のＭＭＰＦＦペプチドの発生を査定するためのここに記載したキットや方法は、女性が卵巣癌にかかる可能性を査定するのに使うことが出来る。女性の尿中のＭＭＰＦＦペプチドの発生の検出は他の点では同じであるがその尿のなかにＭＭＰＦＦが発生していない女性にくらべて一層卵巣癌にかかっているらしいことを示している。卵巣腫瘍、腫瘍成長の早期段階、腫瘍形成の初期、及び卵巣腫瘍形成の可能性の増大、との間の差が殆ど区別できないということは認められていることである。それでもなお、これらの進行各々の結果は女性の健康が傷ついてしまう卵巣腫瘍の展開発展なのである。この理由から、ここに開示されているキットや方法を用いたこれらの段階のいずれかを査定することが有用なのである。
【００６８】
抗ＭＭＰＦＦペプチド抗体は臨床テストの手順の一部として、例えば、行った卵巣癌治療の養生の効果を測定するために尿中のＭＭＰＦＦのレベルを診断的に又は予後診断的に監視するのに用いることが出来る。
【００６９】
ここに記載されたキットや方法はひとつの薬剤（例えばアゴニスト、アンタゴニスト、ペプチドミメティック、タンパク質、ペプチド、核酸、小さい分子、または他の薬物候補品）は卵巣癌を緩和、抑制、後退、又は予防するために患者に与えることが出来るかどうかを決定するために用いることが出来る。例えば、そのような方法は、卵巣癌患者が特定の薬剤、または特定の種類の薬剤を用いれば効果的に治療されるかどうかを決定するのに用いられる。
【００７０】
尿ＭＭＰＦＦペプチド発生の査定のためのキット
【００７１】
本発明は哺乳類（例えば女性）から採取された尿サンプル中のＭＭＰＦＦの発生を検出するためのキットも含んでいる。そのキットはＭＭＰＦＦペプチドと結合する第１の薬剤、そのＭＭＰＦＦペプチドとその薬剤との結合を査定するための第２の薬剤、尿と第１の薬剤を接触させることを記載した使用説明書から構成されている。これらのキットは患者が卵巣癌に苦しんでいるか癌進行の危険が高まっているかを決定するために用いることが出来る。例えば、キットは尿サンプル中のＭＭＰＦＦペプチドを検出可能なラベル付き化合物又は薬剤から構成することが出来る。そのキットは又、或いはその代わりに、サンプル中のＭＭＰＦＦペプチドの量を決定する手段を含むことができる。キットはＭＭＰＦＦペプチドの量が通常のレベル（例えば、実施例１の方法を用いて４５０ナノメータでの吸光度測定値が少なくとも０．２）の上か下であるとき検査した患者が卵巣癌にかかっているか進行のリスクを負っているかを査定するための説明書を含むものである。
【００７２】
抗体をベースにしたキットに関し、そのキットは、例えば、（１）特にＭＭＰＦＦペプチドと結合する第１抗体（例えば、固形支持体に付けられた）とオプションとして、（２）特にＭＭＰＦＦペプチド（例えば、第１抗体が結合しているところのエピトープと別のエピトープのところ）か第１抗体のどちらかと結合し検出可能な薬剤と結合している第２の別の抗体から構成することができる。代わりに、そのキットは第１抗体とその第１抗体のラベル付き配位子から構成することが出来る。その第１抗体と女性の尿サンプルを接触させた後、ラベル付き配位子と第１抗体の結合がここで記載されたような競合型査定で査定することができる。
【００７３】
そのキットは更に試薬、及び又は、女性の尿又は血清中に女性の卵巣癌の発生を示唆する他のマーカーの発生を査定するための指導書を含んで構成できる。
【００７４】
実施例
【００７５】
本発明は次の実施例をもとにここに記載される。これらの実施例は説明の目的のためにのみ提供するものであって、本発明はこれらの実施例に限定されるものではなく、ここに提供された教示の結果として明らかなすべての変形を含むものである。
【００７６】
実施例１
【００７７】
試料中のＭＭＰＦＦを査定するためのサンドウィッチＥＬＩＳＡ査定
【００７８】
尿中のＭＭＰＦＦを検出するために用いられる代表的査定についてここに記載する。査定は、予め単クーロン抗体４Ｈ３（ショラーら１９９９、プロック．ナショナル．アカデミ．サイエンス．ＵＳＡ９６（２０）：１１５３１−１１５３６（Scholler et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(20):11531-11536）とＰＣＴ公報ＷＯ００／５０９００に記載されたような)が塗布してある、９６のウエルのある、すっきりしたミクロ滴低定プレートのなかで行われる。ウエルの底には、炭酸塩−重炭酸塩バファー（ｐＨ９．６）１ミリリッター当たり３マイクログラムの抗体からなる懸濁液５０マイクロリッターが個々のウエルに加えられることによって、抗体が塗られる。そのプレートがまわされて、ウエルの底面が塗布され次いで４℃で一夜乾燥される。個々のウエルをウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の３％（ｗ／ｖ)懸濁液で満たし、２時間室温に保ち、その後ＢＳＡ懸濁液をその個々のウエルから取り除く。
【００７９】
人間のＩｇ配列をエンコードしたベクトルを用いてイムノグロブリン（Ｉｇ）定常領域に溶融したＭＰＦアミノ酸配列（即ち、４４ｋＤａメンブラン結合領域）の部分からなる溶融タンパク質（ショラーら１９９９、プロック．ナショナル．アカデミ．サイエンス．ＵＳＡ９６（２０）：１１５３１−１１５３６（Scholler et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(20):11531-11536）に記載されたように）を用いて標準カーブがつくられる（ＰＣＴ公報番号ＷＯ００／５０９００及びホーレンバウほか、１９９５、J.イムノル．メス．１８８：１−７（Hollenbaugh et al., 1995, J. Immunol. Meth. 188:1-7に記載のように）。この溶融たんぱく質はｈＩｇＧと呼ばれる。標準カーブについて、溶融タンパク質がミリリッター当たり１．０マイクログラム、ミリリッター当たり０．１マイクログラム、及びその４連続５倍希釈液（即ち、１：５、１：２５、１:１２５、１：６２５）の濃度で査定される。用いられた希釈剤はＢＳＡの７％（ｗ／ｖ）懸濁液であった。
【００８０】
査定を行うために、ｈＩｇＧ溶融タンパク質希釈液、比較例、又は尿サンプル、又は希釈尿サンプルの５０マイクロリッターが個々のウエルに加えられた。そのプレートは１時間常温で培養され、ウエルは０．０５％（ｖ／ｖ）トゥイーン（登録商標）２０界面活性剤を含むトリス緩衝したサリン（ｐH７．８から８）で洗浄した。ビオチン化単クーロン抗体ＯＶ５６９（ショラーら１９９９、プロック．ナショナル．アカデミ．サイエンス．ＵＳＡ９６（２０）：１１５３１−１１５３６（Scholler et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(20):11531-11536）及びＰＣＴ公報番号ＷＯ００／５０９００に記載）のリッター当たり２００ナノグラム懸濁液５０マイクロリッターが個々のウエルに加えられた。常温で１時間プレートを培養し、そのあと０．０５％（ｖ／ｖ）トゥイーン（登録商標）２０界面活性剤を含むトリス緩衝したサリン（ｐH７．８から８）で洗浄した後、ストレプタヴィディン−西洋わさびペルオキシダーゼ(streptavidin-horseradish peroxidase)（アラバマ州バーミンガムのサウザーンバイオテクノロジーアソシエートインクのカタログ番号７１００−０５から得た（Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, Al. catalog no. 7100-05））の１:５０００希釈液５０マイクロリッターを個々のウエルに加え、そのプレートを常温で１時間培養した。５０マイクロリッターの３、３’、５、５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ；西洋わさびペルオキシダーゼ（horseradish peroxidase）用発色体担体；メリーランド、ガイサースブルグ、キルクガード＆ペリーラボラトリー、インク（Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD）から得られる）を個々のウエルに加えて信号を発生する。そのプレートを常温で１５分培養し５０マイクロリッタのＴＭＢストップ液（０．１規定硫酸；メリーランド、ガイサースブルグ、キルクガード＆ペリーラボラトリー、インク（Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD）から得られる）を加えてペルオキシダーゼ反応を停止した。ペルオキシダーゼのＴＭＢへの反応により出来た青色をモレキュラーディバイセススペクトラマックス（登録商標）プラス３８４（Molecular Devices SpectraMax Plus 384)分光光度プレートリーダー(モデル番号０２５２３)を用いて４５０ナノメータでの吸光度を測定した。
【００８１】
実施例２
【００８２】
卵巣癌患者から得られた尿サンプル中のＭＭＰＦＦの検出
【００８３】
卵巣癌にかかった２５人の患者から尿サンプルを得た。個々の尿サンプルを１５分１３０００ｒｐｍ（約 １５，７００(ｇ）で遠心分離し沈殿を除去した。尿サンプル上澄みの各々５０マイクロリッターの部分標本を実施例１で述べた査定法を用いてテストした。
【００８４】
テストした２５サンプルのうち、２２サンプルが４５０ナノメータで０．２より大きい吸光度を示した。これらのデータは、尿中のＭＭＰＦＦ検出のための発色体サンドウィッチＥＬＩＳＡ型査定法が多くの患者の卵巣癌の発生を検出するのに信頼できる方法であることを示している。
【００８５】
実施例３
【００８６】
卵巣癌患者から得られた尿サンプル中のＭＭＰＦＦ信号の確認
【００８７】
実施例２に記載された尿サンプル中のＭＭＰＦＦ発生に相当する擬似信号を有する非特定結合を除外するために、実施例２で比較的高い吸光度値が得られた尿サンプルが選ばれた。抗体４Ｈ３が塗布されていないことを除き実施例１に記載されたものと同じ査定用プレートが調整された。個々の尿サンプルが準備され実施例２に記載したプレートに加えられた。
【００８８】
この実施例でテストされたサンプルはいずれも背景強度を超える信号は検出されなかった。
【００８９】
別の実験では、実施例２に記載された尿サンプルが実施例１で述べられたように調整されたプレートを用いてテストされた。しかしこの実験で用いられた５６９単クーロン抗体はビオチン化されていないものであった。それ以外には、査定法は実施例１に記載の通りであった。テストされたサンプルのいずれについても背景強度を超える信号はなかった。
【００９０】
他の別の実験では、ビオチン化した単クーロン抗体５６９の代わりに前述のＭＭＰＦＦと無関係のビオチン化した抗体が用いられたこと以外には実施例１に記載された方法で査定が行われた。この方法による実施例２記載の尿サンプルの査定では、この方法でテストされたときの背景を超える信号は出なかった。
【００９１】
卵巣癌の患者から得られた尿を使用した４５０ナノメータでのサンドウィッチＥＬＩＳＡ査定の吸光信号が増加していることが、これらのデータは患者の尿中のＭＭＰＦＦペプチドの存在を示唆する真の応答であることを示している。
【００９２】
実施例４
【００９３】
膀胱癌と診断された３１患者から得られた尿サンプル、良性の婦人病にかかった３人の女性からの尿サンプル、正常な健康成人から得られた２２の尿サンプルが実施例１に記載された査定法を用いてテストされた。
【００９４】
データは正常な健康な患者から得られた尿はＭＭＰＦＦペプチドが非常に低いレベルであることを示している。実施例２に記載のように、２５の卵巣癌患者のうちの２２（８８％）の尿は著しく高いＭＭＰＦＦペプチドレベルを示した。膀胱癌(即ち他の泌尿生殖系疾病)患者から得られた尿サンプルは３１サンプルのうち８サンプルにのみ高レベルのＭＭＰＦＦペプチドが示された。良性の婦人病にかかっている女性から得られた３つの尿サンプル中には高いＭＭＰＦＦペプチドレベルは検出されなかった。総合すると、５６の非卵巣癌患者のうち８の尿サンプルのみしか高いＭＭＰＦＦペプチドレベルを示さず、一方卵巣癌患者からの２５の尿サンプルのうち２２が高いＭＭＰＦＦペプチドを示した。これらのデータは卵巣癌のこの査定法は正診８６％であることを示している。
【００９５】
実施例５
【００９６】
尿ＭＭＰＦＦペプチドレベルと卵巣癌の段階との相関
【００９７】
実施例２において尿サンプルが分析された２５人の卵巣癌患者の各々について、その癌の段階についての情報が集められた。４つの段階の各々についての卵巣癌を有する患者が代表とされた。患者の癌の段階と患者の尿中に検出されたＭＭＰＦＦペプチドの量には明らかな相関はなかった。ここに記載された尿ＭＭＰＦＦペプチド査定法は早期段階卵巣癌の発生の査定に後期段階卵巣癌と同じように効果的に使用することが出来ることがこの観察から言える。
【００９８】
実施例６
【００９９】
尿ＭＭＰＦＦペプチドレベルに対する卵巣癌治療の効果
【０１００】
実施例２に記載の２５人の卵巣癌患者のうち４患者に対する卵巣癌治療のＭＭＰＦＦペプチドレベルについての効果が査定され、ＣＡ１２５と呼ばれる卵巣癌腫瘍マーカーの血清レベルと比較した。４患者のそれぞれから得られた血清サンプルにおけるＣＡ１２５が治療前、治療後でＣＡ１２５IITM（ペンシルバニア、マルヴァーン フジレバイオ ダイアグノスティックス、インク．（Fujirebio Diagnostics, Inc., Malvern, PA)査定と本質的に同じ免疫性査定法を用いて査定された。尿ＭＭＰＦＦペプチドレベルは実施例１及び２に記載の方法を用いて４患者の各々について治療前後で査定された。
【０１０１】
尿ＭＭＰＦＦペプチドレベルの治療前後での変化は図７に説明されているように４人の患者のそれぞれにおいて血清ＣＡ１２５レベルの変化にほぼ比例していた。何故ならＣＡ１２５は卵巣癌進行の代理マーカーとしてこの分野では受け入れられており、これらのデータは尿のＭＭＰＦＦペプチドレベルと疾病進行とは相関関係があることを示している。これらのデータはこのテストの臨床的価値と卵巣癌治療効果を監視する非侵襲性方法として使える可能性を立証している。
【０１０２】
実施例７
【０１０３】
ＭＭＰＦＦペプチドの尿レベルと血清レベルの間の相関
【０１０４】
実施例２で査定された尿サンプルを提供した２５人の患者の各々から血液を採取した。実施例１に記載の作業標準を用いてこれらの血液サンプルの血清ＭＭＰＦＦペプチドレベルを測定した。血清と尿サンプルは個々の患者から同じ日に集められたものである。
【０１０５】
ＭＭＰＦＦペプチドが、いくつかの例では非常に低いレベルであったとはいえ、すべての患者から尿と血清の両方のサンプルに検出されている。尿サンプルのテストに０．２吸光度単位（４５０ナノメータで）をカットオフ値として用いた場合、テストした２５サンプルのうち２２（８８％）はＭＭＰＦＦは陽のテスト結果であった。血清サンプルのテストに０．１吸光度単位（４５０ナノメータで）をカットオフ値として用いた場合、テストした２５サンプルのうち１６のみ（６４％）がＭＭＰＦＦは陽のテスト結果であった。これらのデータから、ＭＭＰＦＦペプチドレベルは卵巣癌患者の血清と尿の両方において上昇することを示している。併し、尿中のＭＭＰＦＦペプチドの検出はより感度が高いようで、それだけ大きい診断的価値を有しているといえよう。
【０１０６】
実施例８
【０１０７】
尿ＣＡ１２５レベルの査定
【０１０８】
ＣＡ１２５レベルが実施例２に記載された２５の尿サンプルの各々についてＣＡ１２５IIＴＭテストキットを用いて査定された。上記査定の背景強度を超える結果は尿サンプルからは全くでなかった。これらの結果からＣＡ１２５はこれらの患者の尿には存在していないことを示している。これらのデータは、ＣＡ１２５のような血清腫瘍マーカーは、血清の中には発生していてもその患者の尿中には必ずしも存在しないことを立証している。
【０１０９】
ここに記載された個々の特許、特許申請書、公報で開示されたものはすべて参照文献としてここに組み込まれる。
【０１１０】
本発明は特定の実施形態を参照に開示されたが本発明の他の実施形態や変形が当業者によって本発明の真の精神と範囲から逸脱することなく案出しうることは明らかである。添付の請求の範囲はそのような実施形態や相当する変形の全てを含むものである。
【図１】
【図２】
【図３】
【図７】
【技術分野】
【０００１】
卵巣癌査定のための尿のメソセリン／巨核球可能化因子関連ペプチド(mesothelin/megakaryocyte potentiating factor family peptide)の検出。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、一般的に女性の卵巣癌の診断に関するものである。
【０００３】
卵巣癌は米国における女性の癌死亡の主要な原因のひとつである。卵巣癌患者の間で死亡率が比較的高い理由のひとつは、この疾病が進行した状態になるまでしばしばそうと診断されないことにある。
【０００４】
卵巣腫瘍は腫瘍が発生した細胞のタイプ、腫瘍細胞の形態学、および腫瘍の進行段階によって分類できる。
【０００５】
卵巣腫瘍は次の３つの卵巣細胞のタイプのいずれからでも−上皮細胞、生殖細胞、間質細胞のいずれからでも起こりうる。上皮卵巣腫瘍（ＥＯＴｓ）は全卵巣腫瘍の８５％以上を占める卵巣腫瘍の最も一般的なタイプである。ＥＯＴｓは卵巣の外側表面を覆う上皮細胞から発生する。ある種のＥＯＴｓは良性で医学的損傷は比較的に殆どない。併し悪性のＥＯＴｓは無制御に成長し近くの細胞を侵し又は離れた身体部分に転移する。生殖細胞卵巣腫瘍は卵子生産細胞から発生し、やはり良性のものと悪性のものとがある。間質卵巣腫瘍は卵巣結合組織細胞から発生するが比較的まれである。
【０００６】
ＥＯＴｓは上皮卵巣腫瘍を構成する細胞の種類によってさらに特徴づけられている。確認されている細胞の種類としては血清、粘液嚢胞、子宮内膜、および明細胞がある。ある種のＥＯＴｓはこれらの細胞種のなかで明確に区別できないものがあり、これらの区別できないＥＯＴｓが明確に区別できるＥＯＴｓの種類よりもより早く成長し蔓延する傾向がある。
【０００７】
ＥＯＴｓはまた等級と段階によっても分類される。腫瘍の等級はその肉眼で見える外観を著すものである。等級１腫瘍は、通常の卵巣組織に近似する傾向を有し、比較的良好な予後診断がなされる傾向を有している。等級３腫瘍は異常な外観を有する傾向があり、普通、悪い予後診断がなされる。等級２の腫瘍は等級１と等級３の中間である。腫瘍の段階とは腫瘍がその元の状態から広がった度合い又は範囲を示すものである。段階１の卵巣腫瘍は１つ又は両方の卵巣に限られる。段階１の中での等級づけとしては、１つの卵巣内部に限られる腫瘍（段階１Ａ）,両卵巣内部にかぎられる腫瘍（段階１Ｂ）,１つ又は両卵巣の表面に現れ、破裂したカプセルを有する１つまたはそれ以上の卵巣の状態で、或いは腹水に存在する腫瘍細胞又は腹膜洗浄で検出された腫瘍細胞と関連する腫瘍（段階１Ｃ）であらわされる。段階２卵巣腫瘍は卵巣をこえて骨盤内に広がったものである。段階２内の等級づけとしては、子宮や卵管の１つ又は両方に広がった腫瘍を段階２Ａとあらわし、他の骨盤臓器に広がるか、腹水に存在するか腹膜洗浄で検出された腫瘍細胞と関連した腫瘍を段階２Ｂとしてあらわす。段階３卵巣腫瘍は骨盤をこえてリンパ節にひろがるか骨盤、リンパ節両方にひろがったものである。段階４卵巣腫瘍は腹膜腔をこえた臓器に広がったものである。
【０００８】
卵巣腫瘍の早期診断は腫瘍の効果的治療のためにも患者の生存を伸ばすためにも重要である。卵巣癌の早期診断はこの疾病が進んだ状況に進行するまで目に見える兆候が殆どないという事実から判りにくいものである。卵巣腫瘍のための現存する診断テストには、効果的治療を与えるのに十分なほど早期な段階の卵巣癌を検出するのにあまねく成功しているといえるものはない。現存するテストが十分早期の卵巣癌を検出しない理由は完全には判っていない。例えば、いくつかのテストは腫瘍細胞から放出されるマーカーに依存しているが、その放出レベルは腫瘍の大きさが比較的大きく成長するまでは検出したと信頼できるにはあまりにも低いレベルなのである。
【０００９】
人々によって卵巣癌診断に用いられたマーカーにはＣＡ１２５（ハリラほか、１９８７、Br. J. キャンサー、５６（２）：１５３−１５６（Halila et al., Br. J. Cancer 56(2):153-156)）、癌性胎児抗原 (carcinoembryonic antigen)（ＣＥＡ；ジュエイほか、１９９７、ジネコルオンコル６７（３）：２５９−２７１（CEA; Juweid et al., 1997 Gynecol. Oncol 67(3):259-271））、血管内皮成長因子（vascular endothelial growth factor）（ＶＥＧＦ；キャンディド ドス レイスほか、２００２、ジネコルオブステットインベスト５４（３）：１３２−１３６（VEGF; Candido Dos Reis et al., Gynecol. Obstet. Invest. 54(3)132-136)、尿ゴナドトロピンペプチド（urinary gonadotropin)（ＵＧＰ；シュッターほか、アンチキャンサー レス１９（６C）：５５５１−５５５７（UGP;Schutter et al., 1999, Anticancer Res. 19(6C):5551-5557）、ネオプテリン(neopterin),ザルカほか、１９８８、アクタチアヒュング２９（４）：３５９−３６４(Szarka et al., 1988, Acta Chir. Hung. 29(4):359-364))、ＣＤ４４ スプライスヴァリアント（splice variants) (ウールスタイドほか、１９９５、オンコロジィ５２（５）：４００−４０６（Uhl-Steidl et al., 1995, Oncology 52(5):400-406)),尿システインプロテナーゼ(urinary cysteine proteinase)（ＵＣＰ；ガオほか、１９９６、ヒュアキイイケダクェクェバオ２７（３）：２９１−２９４(UCP; Gao et al., 1996, Hua Xi Yi Ke Da Xue Xue Bao 27(3):291-294)), 抗マリグニン抗体(anti-malignin antibody)（ボゴッホほか１９９１、ランセット３３７：９２７）（Bogoch et al., Lancet 337:927)), 腫瘍関連トリプシン抑制剤(tumor-associated trypsin inhibitor)（ＴＡＴＩ；メドルほか、１９９５、Br. J. キャンサー、７１（５）：１０５１−１０５４(TATI; Medl et al., 1995, Br. J. Cancer 71(5):1051-1054)); ハリラほか、１９８８、Br. J. キャンサー、５７（３）：３０４−３０７（Halia et al., 1988, Br. J. Cancer 57(3)304-307)). クドーほか（１９９９、ジネコルオブステットインベスト４７（１）：５２−５７（Kudoh et al., Gynecol. Obstet. Invest 47(1);52-57)）は、乳酸脱水素酵素(lactate dehydrogenase)（ＬＤＨ）、アルファーヒドロキシ酪酸脱水素酵素（alpha-hydroxybutyrate dehydrogenase) (ａＨＢＤＨ）、ＣＡ１９−９，組織ポリペプチド抗原(tissue polypeptide antigen)（ＴＰＡ），シアリルＴＮ（ＳＴＮ）を含むいくつかの他のＥＯＴs用血清マーカーの有用性を比較した。この段落にあげられたマーカーはどれも卵巣癌患者それぞれに異常量で存在しているわけではない。
【００１０】
メソセリンは少なくとも中皮細胞、中皮腫、いくつかの扁平上皮癌、及び卵巣癌の表面に発現されたタンパク質である（チャングほか、１９９６、プロック．ナショナル．アカデミ．サイエンス．ＵＳＡ９３：１３６−１４０（Chang et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci USA 93:136-140))。メソセリンは文献に記載されている(例えば、米国特許第６，０８３，５０２号）。メソセリンと結合する抗体についても記載されている。例えば、Ｋ１と称される単クローン性の抗体が米国特許第５，３２０，９５６に記載されており、受入番号ＨＢ１０５７０としてアメリカ基準培養物収集展示場（American Type Culture Collection)（ＡＴＣＣ；１０８０１大学通り；マナサス、バージニア２０１１０−２２０９；ＵＳＡ）に他の人によって預託されたハイブリドーマによって分泌される。抗体Ｋ１は卵巣癌や他の細胞の表面に見出される約４０キロダルトンのタンパク質と結合することが判明されている（チャングほか、１９９６、プロック．ナショナル．アカデミ．サイエンス．ＵＳＡ９３：１３６−１４０（Chung et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(1):136-140))。メソセリンと呼ばれるそのタンパク質はより大きな(約６９キロダルトン)前駆タンパク質から得られ、その配列は図１に示されている。ショラーら（１９９９、プロック．ナショナル．アカデミ．サイエンス．ＵＳＡ９６（２０）：１１５３１−１１５３６（Scholler et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(20):11531-11536))は、メソセリン(methothelin)や巨核球可能化因子(megakaryocyte potentiating factor)（ＭＰＦ）のアミノ端末配列に高度に類似するアミノ酸配列を有する抗原が卵巣癌にかかった多くの患者の血清中に発生することを確認した。ショラーは、この抗原が卵巣癌の診断のための有用な血清マーカーたりうると提案している。
【００１１】
有用な診断テストというものは患者のなかの卵巣癌の発生を検出できることだけであってはならず、それがまた安価、非侵襲性で使いやすいものであることが望ましい。テスト用担体として血液や血清を用いる診断テストは審査される患者から血液を抜き取らねばならず、時として抜き取った血液サンプルは更に分離、精製、または他の処理を必要とする。血液の抜き取りは訓練されたヘルスケア従事者によってなされねばならず、患者にとっては苦痛の多い侵襲的なもので、血液サンプルの貯蔵と輸送のための専門設備と試薬が必要で血液からの病原体の伝染の危険を有している。それに較べ、尿サンプルは殆ど又は全く専門的な設備を要さずに収集でき、ヘルスケア従事者によるしっかりした監視を必要とせず、患者の通常の生理上のプロセスの一部としてつくることができ、一般に伝染病の重要な原因とはならない。これらの理由から、テスト用担体として尿サンプルを用いた診断テストは血液サンプルで行われる同等のテストより好ましい。
【００１２】
本発明は、尿サンプルを使って実行でき、疾病進行の早期段階での卵巣癌検出に用い得る卵巣癌診断テストを提供する。
【発明の開示】
【００１３】
本発明は女性における卵巣癌（即ち、上皮、間質、生殖細胞卵巣癌の１つ又はそれ以上）の診断方法に関する。その方法は女性から採取した尿素中のメソセリン及び／又は巨核球可能化因子族（ＭＭＰＦＦ）ペプチド(mesothelin/megakaryocyte potentiating factor family peptide)の発生を査定することを含んで構成されていることを特徴とする。尿中のＭＭＰＦＦペプチドの発生はその女性が卵巣癌にかかっていることを示している。
【００１４】
１つの実施形態においては特にＭＭＰＦＦペプチドと結合する第１抗体と尿 (又は遠心分離した尿）を接触させることによって女性の尿のなかのＭＭＰＦＦペプチドを査定する。ＭＭＰＦＦペプチドがこの第１抗体と結合したかを査定することによって女性の尿のなかのＭＭＰＦＦペプチドの発生を査定することが出来る。例えば、第１抗体がロボット装置で自動分析するのに適合するように作製されたプラスチックのマルチウエルプレートのような基板に結び付けることが出来る。ＭＭＰＦＦペプチドと第１抗体の結合は、例えば第１抗体と特にＭＭＰＦＦペプチドと結合する第２抗体を接触させ第１と第２の抗体が一緒に局在しているかを査定することによって評価できる。第２抗体は酵素、放射性核種、発蛍光団、及び発色団を構成する群から選定された化合物で検出可能にラベル付けすることが出来る。
【００１５】
例として、この方法は結合している抗ＭＭＰＦＦペプチド捕獲抗体を有するプレートと女性から採取した尿とを接触させることから構成されている。尿は１０分又は１時間のような任意の時間プレートで熟成することが出来る。そのプレートは次いで、捕獲抗体が結合するよりも強くＭＭＰＦＦペプチドのエピトープと結合するビオチン化した第２抗体と接触することができる。ストレプタビディン(streptavidin)結合酵素はビオチン化した抗体と結合して発色性担体（例えば西洋わさびペルオキシダーゼ(horseradish peroxidase)の発色性担体である３、３'、５、５’−テトラメチルベンジジン）の存在のもとに検出を可能にする。勿論、第２抗体はそれに代えて蛍光体でのラベル付け、放射能でのラベル付け、または他の方法で検出できるようにラベル付けすることが出来る。
【００１６】
卵巣癌を診断するための方法についての他の実施形態において、第１の抗体が、第１の抗体と尿が接触しているラベル付けしたその担体と接触される。尿と接触した第１抗体と結合するラベルをつけた配位子の量と、尿と接触しなかった第１抗体の相当量と結合するラベルをつけた配位子の量を比較することによって尿からどのくらいの量のＭＭＰＦＦが第１抗体と結合したかを査定することができる。
【００１７】
ここに記載されるキットと方法が自然に発生するＭＭＰＦＦペプチド（即ちメソセリンと卵巣癌患者の体から自然に造りだされるようなタンパク質の部分のような両全長タンパク質）と合成的に造られたＭＭＰＦＦペプチドを含む種々のＭＭＰＦＦペプチドを検出するのに用いることができる。ＭＭＰＦＦペプチドのアミノ酸配列は、配列ＩＤ番号１から５よりなる群から選択された１つの配列の少なくとも１０(２０、５０、又は２００）の連続する残基から構成されていることを特徴としている。その代わり、ＭＭＰＦＦペプチドは少なくとも２０の連続アミノ酸残基の部分から構成され、その部分のアミノ酸配列は、配列ＩＤ番号１から５よりなる群から選択された１つの配列の２０の連続する残基と少なくとも９０％（又は９５％）同じであることを特徴としている。
【００１８】
ここに開示されたキットと方法は、他の卵巣癌マーカーの発生（尿または血清中での）の査定のための既知またはこれから開発されるキットや方法とともに用いることが出来る。例をあげれば、尿に発生することが知られている卵巣癌のマーカーは尿ゴナドトロピンペプチド（urinary gonadotropin peptide)、システインプロテイナーゼ(cysteine proteinase)、ネオプテリン(neopterin)、腫瘍関連トリプシン抑制剤(tumor-associated trypsin inhibitor)である。既知の血清卵巣癌マーカーにはＣＡ１２５、癌性胎児抗原、血管内皮成長因子（vascular endothelial growth factor）、腫瘍関連トリプシン抑制剤(tumor-associated trypsin inhibitor)、ＣＤ４４スプライス変形体（splice variants)、抗マリグニン抗体(anti-malignin antibody)、乳酸脱水素酵素（lactate dehydrogenase)、アルファーヒドロキシ酪酸脱水素酵素(alpha-hydroxybutyrate dehydrogenase)、ＣＡ１９−９、組織ポリペプチド抗原(tissue polypeptide antigen)、及びシアリルＴＮがあげられる。ＣＡ１２５は卵巣癌の発生、進行のための代理マーカーとして知られている。女性の尿中のＭＭＰＦＦペプチドの発生の査定は女性の血清中のＭＭＰＦＦペプチドの査定と関連して同様に行うことが出来る。
【００１９】
殆ど同じキットと方法が女性の卵巣癌にかかっている可能性を査定するのに用いられる。即ち、採取された尿の中にＭＭＰＦＦペプチドが発生している女性は、他の点では同じで且つ尿の中にＭＭＰＦＦがない女性よりも卵巣癌にかかっている可能性が高いということを示すものである。
【００２０】
殆ど同じキットや方法が女性の卵巣癌の治療の効能を査定するのに用いられる。治療後の女性から採取した尿中のＭＭＰＦＦペプチドの量は治療前のその女性のＭＭＰＦＦの量と比較される。治療後の尿中のＭＭＰＦＦペプチドの量が少ないことはその治療の効果があったことを示している。同様に、治療後の尿中のＭＭＰＦＦペプチドの量が多いことはその治療の効き目がなかったことを示している。そのようなキットや方法は種々の治療薬や養生法の効能の比較に用いることが出来る。
【００２１】
別の観点において、本発明は女性から採取した尿中のＭＭＰＦＦペプチドの発生を査定するキットに関するものである。そのキットはＭＭＰＦＦペプチドと結合するための第１薬剤（例えば抗体）と、尿と第１薬剤との接触を記述する使用説明書とから構成されている。キットの構成は決定的なものではなくＥＬＩＳＡ、ラテックスビーズ凝集体、表面プラズモン共鳴形式のような多くの標準形式を使うことが出来る。そのキットには積極的なコントロールとして用いるためのＭＭＰＦＦペプチドを含めることが出来る。勿論、そのキットに卵巣癌の他の既知のマーカーを評価するための試薬を含めることが出来る。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
アミノ酸配列を含んでいるすべての図において、標準単一文字アミノ酸コードはアミノ酸残基を代表するのに用いられる。
【００２３】
図１はメソセリン前駆タンパク質のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：１）である。この配列はゲンバンク（登録商標）（GENBANK（登録商標）)受入番号２２０７３８６Ａにリストされているものと同じで、チャングほか、１９９６、プロック．ナショナル．アカデミ．サイエンス．ＵＳＡ９３（１）：１３６−１４０（Chung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(1):136-140）に報告されている.
【００２４】
図２は巨核球可能化因子(megakaryocyte potentiating factor)（ＭＰＦ）前駆タンパク質のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：２）である。この配列はゲンバンク（登録商標）（GENBANK（登録商標））受入番号ＮＰ００５８１４と同じで、ヤマグチほか、１９９４、Ｊ．ビオル．ケミ．２６９（２）：８０５−８０８（Yamaguchi et al, 1994, J. Biol. Chem.269(2):805-808）に報告されている。
【００２５】
図３はＭＰＦ前駆タンパク質の可溶性変形型で部分アミノ酸配列（配列ＩＤ番号：３）でゲンバンク（登録商標）（GENBANK（登録商標）)受入番号ＡＦ１８０９５１にリストされショラーら１９９９、プロック．ナショナル．アカデミ．サイエンス．ＵＳＡ９６（２０）：１１５３１−１１５３６（Scholler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(20):11531-11536)に報告されている。
【００２６】
図４Ａおよび４Ｂからなる図４は配列ＩＤ番号１の残基２９４−６２８と配列ＩＤ番号２のほぼ同じ部分との比較である。残基の数が右の余白に表記されている。「ＭＳＴ」はメソセリンを意味する。「ＭＰＦ」は巨核球可能化因子(megakaryocyte potentiating factor)を意味する。この配列において、同じアミノ酸残基は垂直線で示され、同類アミノ酸置換はクロス（＋）で示され、ダッシュ（−）は配列を合せるために配列ＩＤ番号２に挿入した隙間を意味している。
【００２７】
図５Ａおよび５Ｂからなる図５は配列ＩＤ番号１から３の同じ部分の比較である。残基の数は右の余白にあげられている。「ＭＳＴ」はメソセリンを意味する。「ＭＰＦ」は巨核球可能化因子(megakaryocyte potentiating factor)を意味する。「ＳＭＲ」はＭＰＦの可溶性変形型でその配列は図３にあげられている。この配列で、３つの配列で同じになっている残基は大文字の単一文字コードによって示され、３つの配列すべてにおいて同一でない残基は小文字の単一文字コードによって示され、配列を合せるために挿入した隙間はダッシュ（−）で表されている。
【００２８】
図６は、図６Ａおよび６Ｂからなる。図６Ａは、アミノ酸配列（配列ＩＤ番号４）でここに記載される抗体の発生に好ましいエピトープを含んでいる。図６Ｂは、アミノ酸配列（配列ＩＤ番号５）でここに記載される抗体の発生に好ましいエピトープを含んでいる。配列ＩＤ番号４及び５のそれぞれにおいて、下線を引いた太字のＸは何らかのアミノ酸残基を示し、アスパラギン酸塩またはアスパラギンのいずれかであることが好ましい。図６Ａにおいてその他の下線を引いた太字の残基は図６Ｂに示される配列には存在しない残基を示している。
【００２９】
図７は、ＣＡ１２５ＩＩ抗体の血清レベル（左から右に斜め下に伸びる線条のある棒）とＭＭＰＦＦペプチドの尿レベル（左から右に斜め上に伸びる線条のある棒）を示す棒グラフで、ここに開示されたように査定されたものである。査定は１から４として示されている４人の患者について卵巣癌診断時（ａ）と手術着手から約１ヵ月後（ｂ）の両方で行われた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本発明はメソセリン(mesothelin)、巨核球可能化因子(megakaryocyte potentiating factor)（ＭＰＦ）、及びＭＰＦの可溶性変形物を含むタンパク質族と類似な重要なアミノ酸配列を有する１つ又はそれ以上のポリペプチドが卵巣癌にかかっている女性の尿の中に発生しているという発見に関係してる。これらの尿ポリペプチドはその族のタンパク質に対抗する抗体と特に結合する。患者の尿中にこれらのポリペプチドが発生しているということはその患者が卵巣癌にかかっているという診断である。ポリペプチドの量は卵巣癌の効果的な治療によって減少する。このように、尿ポリペプチドは抗卵巣癌治療の効果を査定するのにも用いられる。
【００３１】
定義
【００３２】
ここに用いられるように、次の用語の各々はこの章内でそれと関連する意味を有している。
【００３３】
メソセリン／巨核球可能化因子族ペプチド(mesothelin/megakaryocyte potentiating factor family peptide)（ＭＭＰＦＦペプチド）は（i）配列ＩＤ番号１から５よりなる群から選択された１つの配列の少なくとも１０の連続的な残基からなるか、(ii）少なくとも２０の連続アミノ酸残基の一部からなり、その部分のアミノ酸配列は配列ＩＤ番号１から５よりなる群から選択された１つの配列の２０の連続残基と少なくとも９０％（好ましくは少なくとも９５％又は１００％）同一であるかのいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【００３４】
「抗体」というのは集合的にまた個別に免疫性グロブリン分子、免疫性グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、即ち特にＭＭＰＦＦペプチドと結合する抗原の結合サイトを含む分子に対して集合的及び個別に当てはまるものである。特にＭＭＰＦＦペプチドと結合する分子はそのペプチドと結合するが当然ポリペプチドを含んでいる試料（例えば尿サンプル）のなかの他の分子とは殆ど結合しない分子である。免疫性グロブリン分子の免疫学的活性部分の例には、抗体がそれぞれパパイン又はペプシンのような酵素と処理されることによって発生できるＦ(ab）とＦ(ab')２フラグメントが含まれている。多クーロン性と単クーロン性の一方又は両方の抗体がここに記載される方法とキットに用いられる。
【００３５】
「単クーロン抗体」という語は特定のエピトープと免疫学的に反応することのできる抗原結合サイトの一種のみを含む抗体分子の集団をいう。
【００３６】
「ラベル付けした」という語は抗体またはペプチドに関するもので、検出可能物質をペプチド又は抗体にカップリング（即ち物理的に結合する）することによって直接ペプチド又は抗体にラベルを付けることと、それを直接ラベル付けされる他の試薬とカップリングすることによってペプチド又は抗体を間接的にラベル付けすることを含んでいる。間接ラベル付けの例には蛍光ラベル付けした第２抗体を用い蛍光ラベル付けしたストレプタビディン(streptavidin)で検出できるようペプチドをビオチンで末端ラベル付けすることで基本の３抗体を検出することを含んでいる。
【００３７】
「使用説明書」というのは刊行物、記録、図表、又はここに記載されているキットをどのように使うかを伝達するのに用いることが出来るその他の表現媒体と、卵巣癌に関係するものとして尿中のＭＭＰＦＦの発生を解釈するための情報、またはその両者である。本発明のキットについての使用説明書は例えば本発明のキットを含む容器に添付されるか、キットをいれた容器と一緒に出荷することができる。代わりに、使用説明書は容器と別に出荷することが出来るが意図としては使用説明書とキットを受取人が一緒に使うようにということである。
【００３８】
詳細な記載
【００３９】
タンパク質族とかなりのアミノ酸配列類似性を有する１つまたはそれ以上のポリペプチド（メソセリン／巨核球可能化因子族(mesothelin/megakaryocyte potentiating factor family peptide)；ＭＭＰＦＦ）が卵巣癌にかかった女性の尿に発生する。これらの尿ペプチドは、例えばＭＭＰＦＦのタンパク質に対抗する抗体で検出される。患者の尿にこのようなペプチドが発生することは、患者が卵巣癌にかかっていることを示すものである。卵巣癌の多様性、個々のなかでの遺伝子的多様性や他の要因により、ＭＭＰＦＦペプチドは卵巣癌にかかった全患者の尿中には現れにくく、殆ど同じ型の卵巣癌にかかった個々に対して異なった量で現れやすいのである。これらの変化を考慮にいれても、女性の尿中のＭＭＰＦＦペプチドの１つ又はそれ以上の発生があれば、その女性は卵巣癌にかかっていることを示している。
【００４０】
都合のよいことには、卵巣癌にかかった女性の尿にＭＭＰＦＦペプチドが発生することは卵巣癌だと判る段階に依存しないようである。そのため、ＭＭＰＦＦペプチドの尿での発生は早期段階での卵巣癌の診断に用いることが出来て、治療が無駄となるか、無駄に近い病状段階に達する前に癌の効果的な治療が可能となるのである。
【００４１】
ここに開示されたキットと方法の他の利点は卵巣癌患者の尿中のＭＭＰＦＦペプチドの量と濃度が腫瘍の状態を示すものであることである。そのため、尿ＭＭＰＦＦペプチド発生の査定は卵巣癌の治療のための養生法の効果を査定するのに用いることが出来る。養生で腫瘍の収縮、後退がおこる分だけＭＭＰＦＦペプチドの尿中濃度が減少することが期待される。同様に、卵巣癌治療の間に尿中のＭＭＰＦＦペプチドが徐々にスムースに増加していることは、治療のための養生が腫瘍の成長を抑制していないことを示している。
【００４２】
ここに記載されているキットや方法は種々の卵巣癌型の発生、進行を査定するのに用いることが出来る。ひとつの重要な実施形態では、キットと方法が最も普通の卵巣癌のなかの上皮卵巣癌の発生または進行を査定するのに用いられる。その他の実施形態では、このキットや方法は間質卵巣腫瘍や生殖細胞卵巣腫瘍の発生や進行を査定するのに用いられる。
【００４３】
診断方法
【００４４】
本発明は女性の卵巣癌の診断方法を含むものである。その方法は女性から採取した尿のなかのメソセリン／巨核球可能化因子族(mesothelin/megakaryocyte potentiating factor family peptide)（ＭＭＰＦＦ）ペプチドの発生を査定することを含んで構成されることを特徴としている。尿中のＭＭＰＦＦペプチドの発生は女性が卵巣癌にかかったことを示唆するものである。種々の型の卵巣癌（例えば上皮卵巣癌）、程度、段階がこの方法を用いて診断される。この方法はまた種々の細胞の型（例えば血清細胞、粘液細胞、子宮細胞、明細胞、及び区別できない卵巣腫瘍）によって特徴づけられる卵巣癌の診断に用いることが出来る。
【００４５】
女性の尿中のＭＭＰＦＦペプチドの発生を査定するのに用いられるこの方法は決定的なものではない。どんな方法でもペプチドの有無を査定するのに用いられればその方法でよいのである。尿中のＭＭＰＦＦペプチドの量（例えば濃度）を査定できる方法がいくつかの実施形態では好ましく、特に、比較のために時間の経過とともになされる査定の場合に好ましい（例えば、抗癌治療の養生効果の査定の場合）。
【００４６】
ひとつの実施形態において、患者の尿中でのＭＭＰＦＦペプチドの発生が、特にＭＭＰＦＦペプチドと結合する抗体と尿の接触により、そしてＭＭＰＦＦペプチドが第１抗体と結合したかを査定することによって査定される。
【００４７】
この分野では多くのＭＭＰＦＦ結合抗体が知られている。例えば米国特許第５，３２０，９５６に記載され、受入番号ＨＢ１０５７０としてＡＴＣＣに預託されたハイブリドーマによって分泌される抗体を使うことが出来る。その抗体はチャングほか（１９９６、プロック．ナショナル．アカデミ．サイエンス．ＵＳＡ９３：１３６−１４０（Chung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(1):136-140）に記載のように、特にメソセリンタンパク質の約４０キロダルトン部と結合する。他の好適な抗体についてはショラーほか（１９９９、プロック．ナショナル．アカデミ．サイエンス．ＵＳＡ９６（２０）：１１５３１−１１５３６（Scholler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(20):11531-11536）及びＰＣＴ公報ＷＯ００／５０９００に記載され、そのような抗体はＯＶ５６９，４Ｈ３，３Ｇ３，及び１Ａ６と呼ばれている。
【００４８】
２つの抗ＭＭＰＦＦペプチド抗体を用いる診断用キットと方法において、２つの抗体は同じエピトープとの結合を競わせないことが好ましい。例を挙げれば、ショラーほかによってＯＶ５６９と呼ばれる抗体は４Ｈ３，３Ｇ３，及び１Ａ６と呼ばれる抗体に結合されたエピトープと異なるエピトープの所で結合する。このように、例えばＯＶ５６９は適当な抗体結合条件のもとにある担体と結合し患者の尿中に存在するＭＭＰＦＦペプチドと結合する捕獲抗体として用いることが出来、抗体４Ｈ３，３Ｇ３，及び１Ａ６のひとつが検出可能にラベル付けされ、捕獲抗体と患者の尿の接触後、捕獲抗体と接触することができる。検出可能にラベル付けした抗体と捕獲抗体との結合はＭＭＰＦＦペプチドが患者の尿に存在していたことを示している。捕獲抗体と一緒に局在している検出可能なラベルの量の分析から存在していたペプチドの量を示すことが出来る。
【００４９】
ここに記載されているように、ＭＭＰＦＦペプチドの幾つかの部分は重要なアミノ酸配列相同を共有している。図１から３は少なくとも３つのＭＭＰＦＦタンパク質のアミノ酸配列の少なくともある部分を示している。図４と５はこれらの配列の直線性を示し、これらのタンパク質のなかの最大配列相同の領域を示している。これらの図から、図６Ａおよび６Ｂ（それぞれ配列ＩＤ番号４と５）に示される配列がＭＭＰＦＦペプチドの有用な部分をあらわしている。これらの配列のいずれかの全部分又は一部分（例えば、１０、２０、５０、又は２００の連続残基）に対抗する抗体は特に卵巣癌患者の尿中に発生するものを含むのＭＭＰＦＦペプチドの広い範囲と結合することが期待される。
【００５０】
ＭＭＰＦＦ（例えばここに記載されたもの又は従来技術の中に記載されているもの）又はその一部が多クーロン及び単クーロン抗体作製のための標準技術を用いて抗体を発生させるための免疫抗原として用いることが出来る。全長ＭＭＰＦＦの断片は免疫抗原として用いられる場合には配列ＩＤ番号１から５までのいずれかのアミノ酸配列か他のＭＭＰＦＦメンバーのアミノ酸配列の少なくとも１０のアミノ酸残基（好ましくは１２、１５、２０、５０、１００か２００またはそれ以上）からなることが望ましい。
【００５１】
ここに記載されたキットと方法に有用な抗体の発生に適切なＭＭＰＦＦペプチドは、配列ＩＤ番号１から５よりなる群から選択された１つの配列の２０の連続する残基と少なくとも９０％（好ましくは少なくとも９５％或いは１００％）は同一である少なくとも２０の連続したアミノ酸残基の部分から構成されているものである。
【００５２】
抗体発生方法は既知でありここに簡単に要約のみを記載する。一般に免疫抗原はウサギ、ヤギ、ねずみ、その他の哺乳動物又は脊髄動物のような適当な対象（即ち免疫担当）を免疫化することによって抗体を作製するのに用いられる。好適な免疫抗原作製には例えば遺伝子組み換えと表現された、又は化学的に合成されたポリペプチドを含めることが出来る。その作製は更にフロインドの完全又は不完全補助薬又は同じ免疫活性化試薬のような補助薬を含めることが出来る。
【００５３】
多クーロン抗体は免疫抗原として本発明のポリペプチドを用いて適当な対象を免疫化することによって上述のように作製することが出来る。免疫化した対象中の抗体タイターは固定したポリペプチドを用いた酵素結合免疫吸着剤査定法（ＥＬＩＳＡ）のような標準技法によって時間の経過とともに監視することが出来る。望むなら、抗体分子はその対象から収穫され又は分離され（例えば、対象の血液、血清から）、タンパク質Ａクロマトグラフィーのような既知の技法によって精製されＩｇＧ留分を得ることができる。
【００５４】
免疫化後適切なときに、例えば、特定の抗体タイターが最高のとき、抗体生産細胞を対象から収穫し、元来はコーラーとミルスタイン（１９７５）ネイチャー２５６：４９５−４９７（Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495-497）に記載されたハイブリドーマ技法、人のＢ細胞ハイブリドーマ技法（コツボーほか（１９８３）イムノル．トゥデイ４：７２（Kozbor et al., (1983) Immunol. Today 4:72）、ＥＢＶハイブリドーマ技法（コールほか（１９８５）モノクロナル アンチボディ アンド キャンサーテラピー、アランＲ．リス,インクｐｐ７７−９６（Cole et al., 81985） Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96）又はトリオーマ技法のような標準技法によって単クーロン抗体を作製するのに用いることが出来る。ハイブリドーマを生産する技術はよく知られている（カレント プロトコル イン イムノロジー（１９９４）コリガンほか（Eds.）ジョン ウイリー＆サン、インク．、ニューヨーク、ＮＹ(Current Protocols in Immunology (1994) Coligan et al., (Eds.) John Wiley & Sons, Inc., New York, NY). 本発明の単クーロン抗体を生産するハイブリドーマ細胞は、問題のポリペプチドと結合する抗体用ハイブリドーマ培養菌の上澄みを、例えば標準ＥＬＩＳＡ査定を用いて、スクリーニングすることによって検出される。
【００５５】
単クーロン抗体分泌ハイブリドーマの作製の代わりに、本発明のポリペプチドに対抗する単クーロン抗体は組み換え組み合わせ免疫性グロブリンライブラリー（例えば抗体ファージ展示ライブラリ）を問題のポリペプチドでスクリーニングすることで同定され分離される。ファージ展示ライブラリを発生させスクリーニングするためのキットは市販で入手可能である。（例えば、ファーマシア リコンビナント ファージ アンチボディ システムのカタログ番号２７−９４００−０１（Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Catalog No. 27-9400-01)；とストラータジーンＳＵＲＦＺＡＰＴＭファージディスプレイキット カタログ番号２４０６１２(Stratagene SURFZAPTM Phage Display Kit, Catalog No. 240612）。また、特に、抗体展示ライブラリを発生、スクリーニングする用途に適用できる方法や試薬の例は、例えば、米国特許番号５，２２３，４０９、ＰＣＴ公報番号ＷＯ９２／１８６１９，ＰＣＴ公報番号ＷＯ９１／１７２７１，ＰＣＴ公報番号ＷＯ９２／２０７９１，ＰＣＴ公報番号ＷＯ９２／１５６７９，ＰＣＴ公報番号ＷＯ９３／０１２８８，ＰＣＴ公報番号ＷＯ９２／０１０４７，ＰＣＴ公報番号ＷＯ９２／０９６９０，ＰＣＴ公報番号ＷＯ９０／０２８０９，フックスほか、（１９９１）バイオ／テクノロジー９：１３７０−１３７２（Fucks et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372;ヘイほかフム．アンチボド．ハイブリドマス３：８１−８５(Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85); フュースほか（１９８９）サイエンス２４６：１２７５−１２８１(Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281);グリフィスほか（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ．１２：７２５−７３４(Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12:725-734).
【００５６】
人間的な部分と非人間的な部分の両方からなる標準的な組み換えＤＮＡ技法を用いた空想的且つ人間的単クーロン抗体組み換え抗体は本発明の範囲内にあるものである。そのような空想的且つ人間的単クーロン抗体はこの分野で既知の組み換えＤＮＡ技法によって造られるが、ＰＣＴ公報番号ＷＯ８７／０２６７１；ヨーロッパ特許番号１８４，１８７；ヨーロッパ特許番号１７１，４９６；ヨーロッパ特許番号１７３，４９４；ＰＣＴ公報番号ＷＯ８６／０１５３３；米国特許番号４，８１６，５６７；ヨーロッパ特許番号１２５，０２３；ベターほか．（１９８８）サイエンス２４０；１０４１−１０４３（Better et al. (1988) Science 240:1041-1043;リューほか．（１９８７）プロック．ナット．アカド。サイエンス．ＵＳＡ８４：３４３９−３４４３(Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443); リューほか．（１９８７）Ｊ．イムノル．３９：３５２１−３５２６（Liu et al. (1987) J.Immunol. 139:3521-3526);サンほか．（１９８７）プロック．ナット．アカド。サイエンス．ＵＳＡ８４：２１４−２１８(Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218);ニシムラほか．（１９８７）キャンサーレス．４７：９９９−１００５(Nishimura et al. (1987) Cancer Res. 47:999-1005);ウッドほか．（１９８５）ネイチャー３１４：４４６−４４９（Wood etal. (1985) Nature 314:446-449); ショウほか．（１９８８）J.ナット．キャンサーインスト．８０：１５５３−１５５９（Shaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559);モリソン（１９８５）サイエンス２２９：１２０２−１２０７（Morrison (1985) Science 229:1202-1207);オーイほか．（１９８６）バイオ／テクニーク４：２１４(Oi et al. (1986) Bio/Techniques 4:214); 米国特許番号５，２２５，５３９；ジョンほか．（１９８６）ネイチャー３２１：５５２−５２５（Jones et al. (1986) Nature 321: 552-525);バーホーヤン（１９８８）サイエンス２３９：１５３４(Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534); バイドラほか．（１９８８）Ｊ．イムノル．１４１：４０５３−４０６０（Beidler et al. (1988) J.Immunol. 141:4053-4060）。
【００５７】
抗ＭＭＰＦＦペプチド抗体を患者から採取した尿と接触させる実施形態において、尿はその自然に分泌された状態で用いられるか使用前に部分的に精製するか浄化して使うことが出来る。例えば、尿は標準の方法である遠心分離によってその尿を抗体と接触させる前に沈殿物をほとんど除いてもよい。代わりに、尿はその量を減らすか大きな汚染物を除くために濾過または限外濾過してもよい。何故なら、尿中に発生するＭＭＰＦＦペプチドは１０，０００から１００，０００ダルトンの範囲の分子量をもつポリペプチドであると思われ、ＭＭＰＦＦペプチドが検出前に除かれてしまうのを防ぐために適切な濾過又は限外濾過の選定が必要である。例をあげれば、比較的大きな孔のフィルター（例えば、２５０，０００から百万ダルトンの分子量を有する球状粒子の通過を許す様なもの）が尿から粒状物質を除くのに用いることが出来て、約５０００ダルトン以上の分子量をもつタンパク質の通過を除外するような膜を装備した限外濾過装置が炉液を濃縮するのに用いることが出来る。この実施例では、限外濾過装置のなかの残留物のなかのＭＭＰＦＦの発生を査定できる。
【００５８】
ＭＭＰＦＦペプチドは卵巣癌患者の尿中に比較的多量に存在することが多く、ここに記載された多くの方法（例えば免疫学的方法）は比較的感度がよいので、通常卵巣癌患者の尿中のＭＭＰＦＦペプチドの発生を検出するのに尿の濃縮は必要としない。尿の浄化が必要とされる場合、遠心分離が好ましい。何故なら、限外濾過を使えば尿中に存在するＭＭＰＦＦペプチドが濾過媒体と結合したり絡まったりする可能性がないからである。
【００５９】
女性の尿中のＭＭＰＦＦペプチドの発生を査定する好ましい方法は通常［サンドイッチＥＬＩＳＡ］査定法として知られる処理法である（ＥＬＩＳＡは酵素で連接した免疫性吸着剤査定法の略称である）。この方法では、抗体はガラスビーズやプラスチックのマルチウエルプレートの底面のような担体に結合される。この抗体は「捕獲」抗体と呼ばれる。女性からのそのままの、或いは浄化したり精製した尿が種々の条件のもと（例えば、塩、活性剤の濃度が低くタンパク質変性でない条件）に担体と接触され、尿中にＭＭＰＦＦペプチドがあれば特に捕獲抗体と結合する。担体は任意にはＭＭＰＦＦペプチドを含まない液体で洗浄して残りの尿及び結合していないＭＭＰＦＦを除く。次いで担体は捕獲抗体が結合しているエピトープの所と異なるエピトープの所でＭＭＰＦＦと結合する第２抗体と接触させる。第２抗体は配位子又は配位子の受容体のいずれかと検出可能にラベル付けされるか結合する。どちらにせよ、担体を第２抗体を含まない液体で洗浄した後に第２抗体の結合が検出される。第２抗体の検出はＭＭＰＦＦペプチドの尿中での存在を示している。第２抗体の量が定量されれば、次いで尿中のＭＭＰＦＦペプチドの量が定量できる。例えば、既知量のＭＭＰＦＦを含む対照試料を用いて行った測定で検出した第２抗体の量を比較することによって定量できる。
【００６０】
抗体検出は抗体を検出可能物質とカップリングすることによって可能になる。検出可能な物質の例には種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、及び放射性物質がある。好適な酵素の例には西洋わさびペルオキシダーゼ（horseradish peroxidase)、アルカリホスフォターゼ(alkaline phoaphatase)、ベータガラクトシダーゼ(beta-galactosidase)、アセチルコリンエステラーゼ(acetylcholinesterase)を含み、好適な補欠分子族複合体はストレプタヴィディン／バイオチン(streptavidin/biotin)とアビジン／バイオチン(avidin/biotin)である。好適な蛍光物質の例はウンベリフェロン(umbelliferone)、フルオレセイン(fluorescein)、フルオレセインイソチオシアネート(fluorescein isothiocyanate)、ローダミン(rhodamine)、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセン(dichlorotriazinylamine fluorescein)、塩化ダンシル(dansyl chloride)又はフィコエリトリン(phycoerythrin)である。発光物質の例はルミノール(luminol)で、生体発光性物質の例はルシフェラーゼ(luciferase)、ルシフェリン(luciferin)、及びエクオリン(aequorin)で、好適な放射性物質の例は１２５I、１３１I、３５S、又は３Ｈである。
【００６１】
標準化した査定装置を使用することでここに記載された方法の自動化ができるようになる。例えば、２４、４８、９６、３８４のウエルのあるプラスチックプレートのような多くの異なった標準化した査定用容器が知られている。これらの容器がロボット装置にはめ込まれるようにした所では試料の自動分析が達成され比較的短い時間で多くの試料を高処理量でスクリーニングできている。コンピュータ制御査定に使用するように作製された自動査定装置と容器はこの分野で既知でありここに記載されたキットや方法に容易に適合されている。
【００６２】
女性から採取された尿中のＭＭＰＦＦペプチドの発生を査定するのに用いることの出来る免疫学的査定についての他のタイプは普通「競合」査定と呼ばれる。この査定では、特にＭＭＰＦＦペプチドと結合する抗体が担体に固定される。そのままの尿、浄化又は精製された尿がその担体に接触され（好ましくは数分又は数時間の間）尿中にＭＭＰＦＦペプチドが存在すれば、それが抗体と結合する。特に抗体と結合するラベル付け配位子（例えば、同じＭＭＰＦＦペプチド又は別のＭＭＰＦＦペプチドのラベル付きのもの）が次いで担体と接触される（好ましくは数分又は数時間の間）。ラベルまたはラベル付き配位子を含まない液体で担体を洗浄した後、担体と結合したラベル付き配位子の量が査定される。担体と結合したラベルの量が患者の尿とは接触していないが他の点では同様に処理された単体に結合したラベルの量と比較される。結合したラベルのこの２つの量の差が担体に結合したＭＭＰＦＦペプチドの量を示すものであり、担体に適用された尿サンプル中に存在したＭＭＰＦＦペプチドの量を示唆するものである。
【００６３】
免疫学的競合査定が用いられると、担体と結合した抗体のラベル付き配位子は患者の尿中に存在していると判っているか又は存在していると思われるＭＭＰＦＦペプチドと出来るだけ同じでなければならない。例えば、その配位子とそのＭＭＰＦＦペプチドは同じアミノ酸配列を有するか含んでいなければならない。同様に患者の尿中に発生するＭＭＰＦＦペプチドがグリコシル化されたものと思われる場合、配位子も同様に同じ位置で同じ程度にグリコシル化されていなければならない。このように、配位子に対する抗体とＭＭＰＦＦペプチドに対する抗体の類似性の差は最小にする事が出来て競合査定の精度を改善することが出来る。
【００６４】
ここに記載されるキットや方法は人間の患者の尿のなかにあるＭＭＰＦＦペプチドの発生の査定のみに用いることが出来るもので、そのような発生が女性が卵巣癌にかかっていることを示すものである。併し、もし卵巣癌の１つ以上のマーカーの発生が女性のなかで査定されれば、多くの卵巣癌が検出できて卵巣癌の診断における大きな確信が得られるのである。その他の卵巣癌マーカーも普通尿のなかで発見されるマーカーでありうるし、通常血液のなかで発見されるマーカーでありうるし、又は尿及び血液の両方で発見されるマーカーでありうる。例をあげれば、ＭＭＰＦＦペプチドは卵巣癌にかかった患者の血清のなかに見つかる（ショラーほか、１９９９、プロック．ナショナル．アカデミ．サイエンス．ＵＳＡ９６（２０）：１１５３１−１１５３６（Scholler et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(20):11531-11536))。このように、尿中のＭＭＰＦＦペプチドの発生の査定用にここに記載されたキットや方法は、血清中の同じ又は別のＭＭＰＦＦペプチドの検出のためのキットや方法と関連付けて用いることが出来る。
【００６５】
尿中に発生することが知られている他の卵巣癌マーカーには尿グナドトロピンペプチド（urinary gonadotropin peptide(ＵＧＰ；シュッターほか、１９９９、アンチキャンサー レス１９（６C）：５５５１−５５５７（UGP;Schutter et al., 1999, Anticancer Res. 19(6C):5551-5557)), システインプロテイナーゼ(cysteine proteinase)(ＵＣＰ；ガオほか、１９９６、ヒュアキイイケダクェクェバオ２７（３）：２９１−２９４(UCP; Gao et al., 1996, Hua Xi Yi Ke Da Xue Xue Bao 27(3):291-294), ネオプテリン(neopterin)(ザルカほか、１９９８、アクタチアヒュング２９（４）：３５９−３６４（Szarka et al., 1988, Acta Chir. Hung. 29(4):359-364)) 及び腫瘍関連トリプシン抑制剤(tumor-associated trypsin inhibitor)(ＴＡＴＩ；メドルほか、１９９５、Br. J. キャンサー、７１（５）：１０５１−１０５４（TATI; Medl et al., 1995, Br. J. Cancer 71(5):1051-1054; ハリラほか、１９８８、Br. J. キャンサー、５７（３）：３０４−３０７(Halia et al., 1988, Br. J. Cancer 57(3)304-307))がある。
【００６６】
血清中に発生することが知られている他の卵巣癌マーカーにはＣＡ１２５（ハリラほか、１９８７、Br. J. キャンサー、５６（２）：１５３−１５６（Halila et al., Br. J. Cancer 56(2):153-156)）, 癌性胎児抗原 (carcinoembryonic antigen）（ＣＥＡ；ジュエイほか、１９９７、ジネコルオンコル６７（３）：２５９−２７１（CEA; Juweid et al., 1997 Gynecol. Oncol 67(3):259-271））、血管内皮成長因子（vascular endothelial growth）（ＶＥＧＦ；キャンディド ドス レイスほか、２００２、ジネコルオブステットインベスト５４（３）：１３２−１３６（VEGF; Candido Dos Reis et al., Gynecol. Obstet. Invest. 54(3)132-136)、腫瘍関連トリプシン抑制剤(tumor-associated trypsin inhibitor) (ＴＡＴＩ；メドルほか、１９９５、Br. J. キャンサー、７１（５）：１０５１−１０５４（TATI; Medl et al., 1995, Br. J. Cancer 71(5):1051-1054; ハリラほか、１９８８、Br. J. キャンサー、５７（３）：３０４−３０７(Halia et al., 1988, Br. J. Cancer 57(3)304-307)), ＣＤ４４ スプライス変形体（CD44 splice variants) (ウールスタイドほか、１９９５、オンコロジィ５２（５）：４００−４０６（Uhl-Steidl et al., 1995, Oncology 52(5):400-406)), 抗マリグニン抗体(anti-malignin antibody)（ボゴッホほか１９９１、ランセット３３７：９２７）（Bogoch et al., Lancet 337:927)), 乳酸脱水素酵素（lactate dehydrogenase)（ＬＤＨ）、アルファーヒドロキシ酪酸脱水素酵素(alpha-hydroxybutyrate dehydrogenase) (ａＨＢＤＨ）、ＣＡ１９−９，組織ポリペプチド抗原(tissue polypeptide antigen)（ＴＰＡ），シアリルＴＮ（ＳＴＮ; クドーほか（１９９９、ジネコルオブステットインベスト４７（１）；５２−５７（Kudoh et al., 1999, Gynecol. Obstet. Invest 47(1);52-57)）がある。血液及び又は尿中のこれら既知のマーカーの組み合わせのいずれかを査定するためのキットや方法は、それが少なくとも尿中のＭＭＰＦＦペプチドの発生を査定するキットや方法であるかぎり本発明に含むものである。
【００６７】
女性から採取した尿中のＭＭＰＦＦペプチドの発生を査定するためのここに記載したキットや方法は、女性が卵巣癌にかかる可能性を査定するのに使うことが出来る。女性の尿中のＭＭＰＦＦペプチドの発生の検出は他の点では同じであるがその尿のなかにＭＭＰＦＦが発生していない女性にくらべて一層卵巣癌にかかっているらしいことを示している。卵巣腫瘍、腫瘍成長の早期段階、腫瘍形成の初期、及び卵巣腫瘍形成の可能性の増大、との間の差が殆ど区別できないということは認められていることである。それでもなお、これらの進行各々の結果は女性の健康が傷ついてしまう卵巣腫瘍の展開発展なのである。この理由から、ここに開示されているキットや方法を用いたこれらの段階のいずれかを査定することが有用なのである。
【００６８】
抗ＭＭＰＦＦペプチド抗体は臨床テストの手順の一部として、例えば、行った卵巣癌治療の養生の効果を測定するために尿中のＭＭＰＦＦのレベルを診断的に又は予後診断的に監視するのに用いることが出来る。
【００６９】
ここに記載されたキットや方法はひとつの薬剤（例えばアゴニスト、アンタゴニスト、ペプチドミメティック、タンパク質、ペプチド、核酸、小さい分子、または他の薬物候補品）は卵巣癌を緩和、抑制、後退、又は予防するために患者に与えることが出来るかどうかを決定するために用いることが出来る。例えば、そのような方法は、卵巣癌患者が特定の薬剤、または特定の種類の薬剤を用いれば効果的に治療されるかどうかを決定するのに用いられる。
【００７０】
尿ＭＭＰＦＦペプチド発生の査定のためのキット
【００７１】
本発明は哺乳類（例えば女性）から採取された尿サンプル中のＭＭＰＦＦの発生を検出するためのキットも含んでいる。そのキットはＭＭＰＦＦペプチドと結合する第１の薬剤、そのＭＭＰＦＦペプチドとその薬剤との結合を査定するための第２の薬剤、尿と第１の薬剤を接触させることを記載した使用説明書から構成されている。これらのキットは患者が卵巣癌に苦しんでいるか癌進行の危険が高まっているかを決定するために用いることが出来る。例えば、キットは尿サンプル中のＭＭＰＦＦペプチドを検出可能なラベル付き化合物又は薬剤から構成することが出来る。そのキットは又、或いはその代わりに、サンプル中のＭＭＰＦＦペプチドの量を決定する手段を含むことができる。キットはＭＭＰＦＦペプチドの量が通常のレベル（例えば、実施例１の方法を用いて４５０ナノメータでの吸光度測定値が少なくとも０．２）の上か下であるとき検査した患者が卵巣癌にかかっているか進行のリスクを負っているかを査定するための説明書を含むものである。
【００７２】
抗体をベースにしたキットに関し、そのキットは、例えば、（１）特にＭＭＰＦＦペプチドと結合する第１抗体（例えば、固形支持体に付けられた）とオプションとして、（２）特にＭＭＰＦＦペプチド（例えば、第１抗体が結合しているところのエピトープと別のエピトープのところ）か第１抗体のどちらかと結合し検出可能な薬剤と結合している第２の別の抗体から構成することができる。代わりに、そのキットは第１抗体とその第１抗体のラベル付き配位子から構成することが出来る。その第１抗体と女性の尿サンプルを接触させた後、ラベル付き配位子と第１抗体の結合がここで記載されたような競合型査定で査定することができる。
【００７３】
そのキットは更に試薬、及び又は、女性の尿又は血清中に女性の卵巣癌の発生を示唆する他のマーカーの発生を査定するための指導書を含んで構成できる。
【００７４】
実施例
【００７５】
本発明は次の実施例をもとにここに記載される。これらの実施例は説明の目的のためにのみ提供するものであって、本発明はこれらの実施例に限定されるものではなく、ここに提供された教示の結果として明らかなすべての変形を含むものである。
【００７６】
実施例１
【００７７】
試料中のＭＭＰＦＦを査定するためのサンドウィッチＥＬＩＳＡ査定
【００７８】
尿中のＭＭＰＦＦを検出するために用いられる代表的査定についてここに記載する。査定は、予め単クーロン抗体４Ｈ３（ショラーら１９９９、プロック．ナショナル．アカデミ．サイエンス．ＵＳＡ９６（２０）：１１５３１−１１５３６（Scholler et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(20):11531-11536）とＰＣＴ公報ＷＯ００／５０９００に記載されたような)が塗布してある、９６のウエルのある、すっきりしたミクロ滴低定プレートのなかで行われる。ウエルの底には、炭酸塩−重炭酸塩バファー（ｐＨ９．６）１ミリリッター当たり３マイクログラムの抗体からなる懸濁液５０マイクロリッターが個々のウエルに加えられることによって、抗体が塗られる。そのプレートがまわされて、ウエルの底面が塗布され次いで４℃で一夜乾燥される。個々のウエルをウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の３％（ｗ／ｖ)懸濁液で満たし、２時間室温に保ち、その後ＢＳＡ懸濁液をその個々のウエルから取り除く。
【００７９】
人間のＩｇ配列をエンコードしたベクトルを用いてイムノグロブリン（Ｉｇ）定常領域に溶融したＭＰＦアミノ酸配列（即ち、４４ｋＤａメンブラン結合領域）の部分からなる溶融タンパク質（ショラーら１９９９、プロック．ナショナル．アカデミ．サイエンス．ＵＳＡ９６（２０）：１１５３１−１１５３６（Scholler et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(20):11531-11536）に記載されたように）を用いて標準カーブがつくられる（ＰＣＴ公報番号ＷＯ００／５０９００及びホーレンバウほか、１９９５、J.イムノル．メス．１８８：１−７（Hollenbaugh et al., 1995, J. Immunol. Meth. 188:1-7に記載のように）。この溶融たんぱく質はｈＩｇＧと呼ばれる。標準カーブについて、溶融タンパク質がミリリッター当たり１．０マイクログラム、ミリリッター当たり０．１マイクログラム、及びその４連続５倍希釈液（即ち、１：５、１：２５、１:１２５、１：６２５）の濃度で査定される。用いられた希釈剤はＢＳＡの７％（ｗ／ｖ）懸濁液であった。
【００８０】
査定を行うために、ｈＩｇＧ溶融タンパク質希釈液、比較例、又は尿サンプル、又は希釈尿サンプルの５０マイクロリッターが個々のウエルに加えられた。そのプレートは１時間常温で培養され、ウエルは０．０５％（ｖ／ｖ）トゥイーン（登録商標）２０界面活性剤を含むトリス緩衝したサリン（ｐH７．８から８）で洗浄した。ビオチン化単クーロン抗体ＯＶ５６９（ショラーら１９９９、プロック．ナショナル．アカデミ．サイエンス．ＵＳＡ９６（２０）：１１５３１−１１５３６（Scholler et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(20):11531-11536）及びＰＣＴ公報番号ＷＯ００／５０９００に記載）のリッター当たり２００ナノグラム懸濁液５０マイクロリッターが個々のウエルに加えられた。常温で１時間プレートを培養し、そのあと０．０５％（ｖ／ｖ）トゥイーン（登録商標）２０界面活性剤を含むトリス緩衝したサリン（ｐH７．８から８）で洗浄した後、ストレプタヴィディン−西洋わさびペルオキシダーゼ(streptavidin-horseradish peroxidase)（アラバマ州バーミンガムのサウザーンバイオテクノロジーアソシエートインクのカタログ番号７１００−０５から得た（Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, Al. catalog no. 7100-05））の１:５０００希釈液５０マイクロリッターを個々のウエルに加え、そのプレートを常温で１時間培養した。５０マイクロリッターの３、３’、５、５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ；西洋わさびペルオキシダーゼ（horseradish peroxidase）用発色体担体；メリーランド、ガイサースブルグ、キルクガード＆ペリーラボラトリー、インク（Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD）から得られる）を個々のウエルに加えて信号を発生する。そのプレートを常温で１５分培養し５０マイクロリッタのＴＭＢストップ液（０．１規定硫酸；メリーランド、ガイサースブルグ、キルクガード＆ペリーラボラトリー、インク（Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD）から得られる）を加えてペルオキシダーゼ反応を停止した。ペルオキシダーゼのＴＭＢへの反応により出来た青色をモレキュラーディバイセススペクトラマックス（登録商標）プラス３８４（Molecular Devices SpectraMax Plus 384)分光光度プレートリーダー(モデル番号０２５２３)を用いて４５０ナノメータでの吸光度を測定した。
【００８１】
実施例２
【００８２】
卵巣癌患者から得られた尿サンプル中のＭＭＰＦＦの検出
【００８３】
卵巣癌にかかった２５人の患者から尿サンプルを得た。個々の尿サンプルを１５分１３０００ｒｐｍ（約 １５，７００(ｇ）で遠心分離し沈殿を除去した。尿サンプル上澄みの各々５０マイクロリッターの部分標本を実施例１で述べた査定法を用いてテストした。
【００８４】
テストした２５サンプルのうち、２２サンプルが４５０ナノメータで０．２より大きい吸光度を示した。これらのデータは、尿中のＭＭＰＦＦ検出のための発色体サンドウィッチＥＬＩＳＡ型査定法が多くの患者の卵巣癌の発生を検出するのに信頼できる方法であることを示している。
【００８５】
実施例３
【００８６】
卵巣癌患者から得られた尿サンプル中のＭＭＰＦＦ信号の確認
【００８７】
実施例２に記載された尿サンプル中のＭＭＰＦＦ発生に相当する擬似信号を有する非特定結合を除外するために、実施例２で比較的高い吸光度値が得られた尿サンプルが選ばれた。抗体４Ｈ３が塗布されていないことを除き実施例１に記載されたものと同じ査定用プレートが調整された。個々の尿サンプルが準備され実施例２に記載したプレートに加えられた。
【００８８】
この実施例でテストされたサンプルはいずれも背景強度を超える信号は検出されなかった。
【００８９】
別の実験では、実施例２に記載された尿サンプルが実施例１で述べられたように調整されたプレートを用いてテストされた。しかしこの実験で用いられた５６９単クーロン抗体はビオチン化されていないものであった。それ以外には、査定法は実施例１に記載の通りであった。テストされたサンプルのいずれについても背景強度を超える信号はなかった。
【００９０】
他の別の実験では、ビオチン化した単クーロン抗体５６９の代わりに前述のＭＭＰＦＦと無関係のビオチン化した抗体が用いられたこと以外には実施例１に記載された方法で査定が行われた。この方法による実施例２記載の尿サンプルの査定では、この方法でテストされたときの背景を超える信号は出なかった。
【００９１】
卵巣癌の患者から得られた尿を使用した４５０ナノメータでのサンドウィッチＥＬＩＳＡ査定の吸光信号が増加していることが、これらのデータは患者の尿中のＭＭＰＦＦペプチドの存在を示唆する真の応答であることを示している。
【００９２】
実施例４
【００９３】
膀胱癌と診断された３１患者から得られた尿サンプル、良性の婦人病にかかった３人の女性からの尿サンプル、正常な健康成人から得られた２２の尿サンプルが実施例１に記載された査定法を用いてテストされた。
【００９４】
データは正常な健康な患者から得られた尿はＭＭＰＦＦペプチドが非常に低いレベルであることを示している。実施例２に記載のように、２５の卵巣癌患者のうちの２２（８８％）の尿は著しく高いＭＭＰＦＦペプチドレベルを示した。膀胱癌(即ち他の泌尿生殖系疾病)患者から得られた尿サンプルは３１サンプルのうち８サンプルにのみ高レベルのＭＭＰＦＦペプチドが示された。良性の婦人病にかかっている女性から得られた３つの尿サンプル中には高いＭＭＰＦＦペプチドレベルは検出されなかった。総合すると、５６の非卵巣癌患者のうち８の尿サンプルのみしか高いＭＭＰＦＦペプチドレベルを示さず、一方卵巣癌患者からの２５の尿サンプルのうち２２が高いＭＭＰＦＦペプチドを示した。これらのデータは卵巣癌のこの査定法は正診８６％であることを示している。
【００９５】
実施例５
【００９６】
尿ＭＭＰＦＦペプチドレベルと卵巣癌の段階との相関
【００９７】
実施例２において尿サンプルが分析された２５人の卵巣癌患者の各々について、その癌の段階についての情報が集められた。４つの段階の各々についての卵巣癌を有する患者が代表とされた。患者の癌の段階と患者の尿中に検出されたＭＭＰＦＦペプチドの量には明らかな相関はなかった。ここに記載された尿ＭＭＰＦＦペプチド査定法は早期段階卵巣癌の発生の査定に後期段階卵巣癌と同じように効果的に使用することが出来ることがこの観察から言える。
【００９８】
実施例６
【００９９】
尿ＭＭＰＦＦペプチドレベルに対する卵巣癌治療の効果
【０１００】
実施例２に記載の２５人の卵巣癌患者のうち４患者に対する卵巣癌治療のＭＭＰＦＦペプチドレベルについての効果が査定され、ＣＡ１２５と呼ばれる卵巣癌腫瘍マーカーの血清レベルと比較した。４患者のそれぞれから得られた血清サンプルにおけるＣＡ１２５が治療前、治療後でＣＡ１２５IITM（ペンシルバニア、マルヴァーン フジレバイオ ダイアグノスティックス、インク．（Fujirebio Diagnostics, Inc., Malvern, PA)査定と本質的に同じ免疫性査定法を用いて査定された。尿ＭＭＰＦＦペプチドレベルは実施例１及び２に記載の方法を用いて４患者の各々について治療前後で査定された。
【０１０１】
尿ＭＭＰＦＦペプチドレベルの治療前後での変化は図７に説明されているように４人の患者のそれぞれにおいて血清ＣＡ１２５レベルの変化にほぼ比例していた。何故ならＣＡ１２５は卵巣癌進行の代理マーカーとしてこの分野では受け入れられており、これらのデータは尿のＭＭＰＦＦペプチドレベルと疾病進行とは相関関係があることを示している。これらのデータはこのテストの臨床的価値と卵巣癌治療効果を監視する非侵襲性方法として使える可能性を立証している。
【０１０２】
実施例７
【０１０３】
ＭＭＰＦＦペプチドの尿レベルと血清レベルの間の相関
【０１０４】
実施例２で査定された尿サンプルを提供した２５人の患者の各々から血液を採取した。実施例１に記載の作業標準を用いてこれらの血液サンプルの血清ＭＭＰＦＦペプチドレベルを測定した。血清と尿サンプルは個々の患者から同じ日に集められたものである。
【０１０５】
ＭＭＰＦＦペプチドが、いくつかの例では非常に低いレベルであったとはいえ、すべての患者から尿と血清の両方のサンプルに検出されている。尿サンプルのテストに０．２吸光度単位（４５０ナノメータで）をカットオフ値として用いた場合、テストした２５サンプルのうち２２（８８％）はＭＭＰＦＦは陽のテスト結果であった。血清サンプルのテストに０．１吸光度単位（４５０ナノメータで）をカットオフ値として用いた場合、テストした２５サンプルのうち１６のみ（６４％）がＭＭＰＦＦは陽のテスト結果であった。これらのデータから、ＭＭＰＦＦペプチドレベルは卵巣癌患者の血清と尿の両方において上昇することを示している。併し、尿中のＭＭＰＦＦペプチドの検出はより感度が高いようで、それだけ大きい診断的価値を有しているといえよう。
【０１０６】
実施例８
【０１０７】
尿ＣＡ１２５レベルの査定
【０１０８】
ＣＡ１２５レベルが実施例２に記載された２５の尿サンプルの各々についてＣＡ１２５IIＴＭテストキットを用いて査定された。上記査定の背景強度を超える結果は尿サンプルからは全くでなかった。これらの結果からＣＡ１２５はこれらの患者の尿には存在していないことを示している。これらのデータは、ＣＡ１２５のような血清腫瘍マーカーは、血清の中には発生していてもその患者の尿中には必ずしも存在しないことを立証している。
【０１０９】
ここに記載された個々の特許、特許申請書、公報で開示されたものはすべて参照文献としてここに組み込まれる。
【０１１０】
本発明は特定の実施形態を参照に開示されたが本発明の他の実施形態や変形が当業者によって本発明の真の精神と範囲から逸脱することなく案出しうることは明らかである。添付の請求の範囲はそのような実施形態や相当する変形の全てを含むものである。
【図１】
【図２】
【図３】
【図７】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
女性の卵巣癌の診断方法であって、女性から採取した尿中のメソセリン／巨核球可能化因子族（ＭＭＰＦＦ）ペプチド(mesothelin/megakaryocyte potentiating factor family peptide)の発生を査定することを含んで構成され、それにより尿中のＭＭＰＦＦペプチドの発生が女性の卵巣癌にかかっていることの示唆とすることを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記卵巣癌は上皮卵巣癌であることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、前記卵巣癌は間質卵巣癌であることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、前記卵巣癌は幹細胞卵巣癌であることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、尿中におけるＭＭＰＦＦペプチドの発生は特にＭＭＰＦＦペプチドと結合する第１抗体と尿を接触させ、ＭＭＰＦＦペプチドが前記第１抗体と結合したかどうかを査定することによって査定することを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、尿を第１抗体と接触させる前に尿を遠心分離機にかけて沈殿物があればそれをそこから殆ど取り除くことを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項５に記載の方法であって、第１抗体は担体と結合していることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって、前記担体はプラスチック容器であることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、前記容器はマルチウエルプレートであることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、前記プレートはロボット装置による自動分析に適合するようになっているものであることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項５に記載の方法であって、ＭＭＰＦＦペプチドと第１抗体との結合は、尿と前記第１抗体の接触の後、特にＭＭＰＦＦペプチドと結合する第２抗体と第１抗体を接触させ、第１と第２の抗体が一緒に局在しているかを査定することによって査定することを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、前記尿は、第１抗体と第２抗体の接触前少なくとも１０分間第１抗体と接触していることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載の方法であって、前記尿は、第１抗体と第２抗体の接触前少なくとも６０分間第１抗体と接触していることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１１に記載の方法であって、第２抗体は検出可能にラベル付けしてあることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、前記第２抗体は酵素、放射性核種、発蛍光団、及び発色団を構成する群から選択された化合物と連接していることを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１１に記載の方法であって、第２抗体は配位子に連接しており、第１及び第２抗体の局在が、第２抗体と(i) 配位子と結合する受容体と（ii）検出可能ラベル、から構成される化合物との接触によって査定されることを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、前記ラベルは酵素、放射性核種、発蛍光団、及び発色団を構成する群から選択されていることを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１６に記載の方法であって、前記配位子はビオチンであり前記受容体はアビジンであることを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法であって、前記アビジンはストレプタビジン(streptavidin)であることを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、前記ラベルは酵素であることを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法であって、前記酵素は西洋わさびペルオキシダーゼ(horseradish peroxidase)であることを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法であって、第１及び第２抗体の局在は３、３’、５、５’−テトラメチルベンジジンであることを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項５に記載の方法であって、第１抗体と尿を接触させた後に、第１抗体と第１抗体をラベル付けした担体とを接触させ、尿と接触させた第１抗体と結合するラベル付けした配位子の量と、尿と接触させなかった等量の第１抗体と結合するラベル付けした配位子の量を比較することを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法であって、ラベル付けした配位子はＭＭＰＦＦペプチドと同じアミノ酸配列を有していることを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法であって、ラベル付けした配位子のグリコシル化状態はＭＭＰＦＦペプチドのグリコシル化状態と同じであることを特徴とする方法。
【請求項２６】
請求項１に記載の方法であって、ＭＭＰＦＦペプチドはグリコシル化されていることを特徴とする方法。
【請求項２７】
請求項１に記載の方法であって、ＭＭＰＦＦペプチドのアミノ酸配列は、配列ＩＤ番号１から５よりなる群から選択された１つの配列の少なくとも１０の連続する残基から構成されていることを特徴とする方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法であって、ＭＭＰＦＦペプチドのアミノ酸配列は、配列ＩＤ番号１から５よりなる群から選択された１つの配列の少なくとも２０の連続する残基から構成されていることを特徴とする方法。
【請求項２９】
請求項２７に記載の方法であって、ＭＭＰＦＦペプチドのアミノ酸配列は、配列ＩＤ番号１から５よりなる群から選択された１つの配列の少なくとも５０の連続する残基から構成されていることを特徴とする方法。
【請求項３０】
請求項２７に記載の方法であって、ＭＭＰＦＦペプチドのアミノ酸配列は、配列ＩＤ番号１から５よりなる群から選択された１つの配列の少なくとも２００の連続する残基から構成されていることを特徴とする方法。
【請求項３１】
請求項２７に記載の方法であって、ＭＭＰＦＦペプチドのアミノ酸配列は、配列ＩＤ番号１から５よりなる群から選択された１つの配列から構成されていることを特徴とする方法。
【請求項３２】
請求項２７に記載の方法であって、ＭＭＰＦＦペプチドのアミノ酸配列は、配列ＩＤ番号４の少なくとも１０の連続的残基から構成されていることを特徴とする方法。
【請求項３３】
請求項２７に記載の方法であって、ＭＭＰＦＦペプチドのアミノ酸配列は、配列ＩＤ番号５の少なくとも１０の連続的残基から構成されていることを特徴とする方法。
【請求項３４】
請求項１に記載の方法であって、ＭＭＰＦＦペプチドは、少なくとも２０の連続アミノ酸残基の部分からなり、その部分のアミノ酸配列は配列ＩＤ番号１から５よりなる群から選択された１つの配列の２０の連続残基に対し少なくとも９０％同じであることを特徴とする方法。
【請求項３５】
請求項３４に記載の方法であって、ＭＭＰＦＦペプチドは、少なくとも２０の連続アミノ酸残基の部分からなり、その部分のアミノ酸配列は配列ＩＤ番号４と５よりなる群から選択された１つの配列の２０の連続残基に対し少なくとも９０％同じであることを特徴とする方法。
【請求項３６】
請求項１に記載の方法であって、更に、女性の尿中の第２卵巣癌マーカーの発生の査定を含んで構成され、尿中の前記第２マーカーの発生もまた女性が卵巣癌にかかっていることの示唆であることを特徴とする方法。
【請求項３７】
請求項３６に記載の方法であって、前記第２の卵巣癌マーカーは尿ゴナドトロピンペプチド（urinary gonadotropin peptide)、システインプロテイナーゼ(cysteine proteinase)、ネオプテリン(neopterin)、及び腫瘍関連トリプシン抑制剤(tumor-associated trypsin inhibitor)よりなる群から選択されたものであることを特徴とする方法。
【請求項３８】
請求項１に記載の方法であって、更に、女性の血清中の第２卵巣癌マーカーの発生の査定を含んで構成され、血清中の前記第２マーカーの発生もまた女性が卵巣癌にかかっていることの示唆であることを特徴とする方法。
【請求項３９】
請求項３８に記載の方法であって、前記第２卵巣癌マーカーはＣＡ１２５、癌性胎児抗原(carcinoembryonic antigen）、血管内皮成長因子（vascular endothelial growth factor）、腫瘍関連トリプシン抑制剤(tumor-associated trypsin inhibitor)、ＣＤ４４スプライス変形体（splice variants)、抗マリグニン抗体(anti-malignin antibody)、乳酸脱水素酵素（lactate dehydrogenase)、アルファーヒドロキシ酪酸脱水素酵素 (alpha-hydroxybutyrate dehydrogenase)、ＣＡ１９−９、組織ポリペプチド抗原(tissue polypeptide antigen)、及びシアリルＴＮよりなる群から選択されたものであることを特徴とする方法。
【請求項４０】
請求項３８に記載の方法であって、前記第２の卵巣癌マーカーはＣＡ１２５であることを特徴とする方法。
【請求項４１】
請求項１に記載の方法はさらに女性の血清中のＭＭＰＦＦペプチドの発生の査定を含んで構成され、血清中の前記ＭＭＰＦＦペプチドの発生もまた女性が卵巣癌にかかっていることの示唆であることを特徴とする方法。
【請求項４２】
女性が卵巣癌になった可能性を査定する方法であって、その方法は女性から採取した尿中のメソセリン／巨核球可能化因子族（ＭＭＰＦＦ）ペプチド(mesothelin/megakaryocyte potentiating factor family peptide)の発生を査定することを含んで構成され、尿中にＭＭＰＦＦペプチドが発生するということは、その女性が、尿中にＭＭＰＦＦの発生がなくその他では同じ女性に較べてより卵巣癌になりやすいことを示唆するものであることを特徴とする方法。
【請求項４３】
女性の卵巣癌の治療の効果を査定する方法であって、治療後の女性から採取した尿中のメソセリン／巨核球可能化因子族（ＭＭＰＦＦ）ペプチド(mesothelin/megakaryocyte potentiating factor family peptide)の量を査定し、その量と手術前その女性から採取した尿中のＭＭＰＦＦペプチドの量を比較することから構成され、手術後の尿中のＭＭＰＦＦペプチドの量がより少なくなっていれば手術が効果的であったことを示していることを特徴とする方法。
【請求項４４】
女性から採取した尿中のメソセリン／巨核球可能化因子族（ＭＭＰＦＦ）ペプチド(mesothelin/megakaryocyte potentiating factor family peptide)の発生を査定するキットであって、そのキットはＭＭＰＦＦペプチドと結合するための第１薬剤と、尿と前記第１薬剤を接触することを記述する使用説明書から構成されていることを特徴とするキット。
【請求項４５】
請求項４４に記載のキットであって、前記第１薬剤は抗体であることを特徴とするキット。
【請求項４６】
請求項４５に記載のキットであって、前記抗体は薄い金属フィルムに結合されていることを特徴とするキット。
【請求項４７】
請求項４６に記載のキットであって、前記フィルムは表面プラズモン共鳴装置内の分析に用いられることを特徴とするキット。
【請求項４８】
請求項４４に記載のキットであって、更に、ＭＭＰＦＦペプチドが前記第１薬剤との結合を査定するための第２薬剤を含んで構成されていることを特徴とするキット。
【請求項４９】
請求項４８に記載のキットであって、前記第２薬剤は前記第１薬剤の検出可能にラベルをつけた配位子であることを特徴とするキット。
【請求項５０】
請求項４９に記載のキットであって、前記第１薬剤は抗体で前記配位子はＭＭＰＦＦペプチドであることを特徴とするキット。
【請求項５１】
請求項４９に記載のキットであって、前記配位子は酵素、放射性核種、発蛍光団、及び発色団よりなる群から選択された化合物でラベル付けされていることを特徴とするキット。
【請求項５２】
請求項４８に記載のキットであって、前記第２薬剤は検出可能にラベル付けした抗体であることを特徴とするキット。
【請求項５３】
請求項５２に記載のキットであって、前記抗体はビオチン化した抗体であることを特徴とするキット。
【請求項５４】
請求項５２に記載のキットであって、前記抗体は酵素、放射性核種、発蛍光団、及び発色団よりなる群から選択された化合物でラベル付けされていることを特徴とするキット。
【請求項５５】
請求項４８に記載のキットであって、前記第１薬剤は検出可能にラベル付けされている抗体と結合するエピトープとは異なるＭＭＰＦＦのエピトープと結合する抗体であることを特徴とするキット。
【請求項５６】
請求項４４に記載のキットであって、更に、女性から採取した尿サンプルを遠心分離する装置を含んで構成されていることを特徴とするキット。
【請求項５７】
請求項４４に記載のキットであって、前記第１薬剤は担体に結合されていることを特徴とするキット。
【請求項５８】
請求項５７に記載のキットであって、前記担体はプラスチックの容器であることを特徴とするキット。
【請求項５９】
請求項５８に記載のキットであって、前記容器はマルチウエルプレートであることを特徴とするキット。
【請求項６０】
請求項５９に記載のキットであって、前記プレートはロボット装置による自動分析に適合するように作製されたものであることを特徴とするキット。
【請求項６１】
請求項５８に記載のキットであって、前記第１薬剤は抗体であることを特徴とするキット。
【請求項６２】
請求項６１に記載のキットであって、前記第２薬剤は第２抗体であることを特徴とするキット。
【請求項６３】
請求項６２に記載のキットであって、前記第２抗体は配位子に連接されていることを特徴とするキット。
【請求項６４】
請求項６３に記載のキットであって、更に、（i）前記配位子と結合する受容体と（ii）検出可能なラベルを含んで構成されていることを特徴とするキット。
【請求項６５】
請求項６４に記載のキットであって、ラベルは酵素、放射性核種、発蛍光団、及び発色団よりなる群から選択された化合物でラベル付けされていることを特徴とするキット。
【請求項６６】
請求項６５に記載のキットであって、前記配位子はビオチンであり、前記受容体はアビジンであることを特徴とするキット。
【請求項６７】
請求項６６に記載のキットであって、前記アビジンはストレプタビジン(streptavidin)であることを特徴とするキット。
【請求項６８】
請求項６７に記載のキットであって、前記ラベルは酵素であることを特徴とするキット。
【請求項６９】
請求項６８に記載のキットであって、前記酵素は西洋わさびペルオキシダーゼ(horseradish peroxidase)であることを特徴とするキット。
【請求項７０】
請求項６９に記載のキットであって、更に、３、３’、５、５’−テトラメチルベンジジンを含んで構成されていることを特徴とするキット。
【請求項７１】
請求項４４に記載のキットであって、更に、対照例としてのＭＭＰＦＦペプチドを含んで構成され、対照例ペプチドのアミノ酸配列は配列ＩＤ番号１から５よりなる群から選ばれたひとつの配列の少なくとも１０の連続する残基を含んで構成されていることを特徴とするキット。
【請求項７２】
請求項７１に記載のキットであって、対照例ペプチドのアミノ酸配列は配列ＩＤ番号１から５よりなる群から選ばれたひとつの配列の少なくとも２０の連続する残基を含んで構成されていることを特徴とするキット。
【請求項７３】
請求項７１に記載のキットであって、対照例ペプチドのアミノ酸配列は配列ＩＤ番号１から５よりなる群から選ばれたひとつの配列の少なくとも５０の連続する残基を含んで構成されていることを特徴とするキット。
【請求項７４】
請求項７１に記載のキットであって、対照例ペプチドのアミノ酸配列は配列ＩＤ番号１から５よりなる群から選ばれたひとつの配列の少なくとも２００の連続する残基を含んで構成されていることを特徴とするキット。
【請求項７５】
請求項７１に記載のキットであって、対照例ペプチドのアミノ酸配列は配列ＩＤ番号１から５よりなる群から選ばれたひとつの配列を含んで構成されていることを特徴とするキット。
【請求項７６】
請求項７１に記載のキットであって、対照例ペプチドのアミノ酸配列は配列ＩＤ番号４の少なくとも１０の連続する残基を含んで構成されていることを特徴とするキット。
【請求項７７】
請求項７１に記載のキットであって、対照例ペプチドのアミノ酸配列は配列ＩＤ番号５の少なくとも１０の連続する残基を含んで構成されていることを特徴とするキット。
【請求項７８】
請求項４４に記載のキットであって、更に、少なくとも２０の連続するアミノ酸残基の部分を含んで構成される対照例ペプチドを含み、その部分のアミノ酸配列は配列ＩＤ番号１から５よりなる群から選択された配列の２０の連続する残基と少なくとも９０％同一であることを特徴とするキット。
【請求項７９】
請求項７８に記載のキットであって、前記対照例ペプチドは少なくとも２０の連続するアミノ酸残基の部分を含んで構成され、その部分のアミノ酸配列は配列ＩＤ番号４と５よりなる群から選択された配列の２０の連続する残基と少なくとも９０％同一であることを特徴とするキット。
【請求項８０】
請求項４４に記載のキットであって、更に、女性の尿中の第２卵巣癌マーカーの発生を査定する試薬を含んで構成されることを特徴とするキット。
【請求項８１】
請求項８０に記載のキットであって、前記第２の卵巣癌マーカーは尿ゴナドトロピンペプチド（urinary gonadotropin peptide)、システインプロテイナーゼ(cysteine proteinase)、ネオプテリン(neopterin)、腫瘍関連トリプシン抑制剤(tumor-associated trypsin inhibitor)よりなる群から選択されたものであることを特徴とするキット。
【請求項８２】
請求項４４に記載のキットであって、更に、女性の血清中の第２卵巣癌マーカーの発生を査定する試薬を含んで構成されることを特徴とするキット。
【請求項８３】
請求項８２に記載のキットであって、前記第２卵巣癌マーカーはＣＡ１２５、癌性胎児抗原(carcinoembryonic antigen）、血管内皮成長因子（vascular endothelial growth factor）、腫瘍関連トリプシン抑制剤(tumor-associated trypsin inhibitor)、ＣＤ４４スプライス変形体（splice variants)、抗マリグニン抗体(anti-malignin antibody)、乳酸脱水素酵素（lactate dehydrogenase)、アルファーヒドロキシ酪酸脱水素酵素(alpha-hydroxybutyrate dehydrogenase)、ＣＡ１９−９、組織ポリペプチド抗原(tissue polypeptide antigen)、及びシアリルＴＮよりなる群から選択されたものであることを特徴とするキット。
【請求項８４】
請求項８３に記載のキットであって、前記第２の卵巣癌マーカーはＣＡ１２５であることを特徴とするキット。
【請求項１】
女性の卵巣癌の診断方法であって、女性から採取した尿中のメソセリン／巨核球可能化因子族（ＭＭＰＦＦ）ペプチド(mesothelin/megakaryocyte potentiating factor family peptide)の発生を査定することを含んで構成され、それにより尿中のＭＭＰＦＦペプチドの発生が女性の卵巣癌にかかっていることの示唆とすることを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記卵巣癌は上皮卵巣癌であることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、前記卵巣癌は間質卵巣癌であることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、前記卵巣癌は幹細胞卵巣癌であることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、尿中におけるＭＭＰＦＦペプチドの発生は特にＭＭＰＦＦペプチドと結合する第１抗体と尿を接触させ、ＭＭＰＦＦペプチドが前記第１抗体と結合したかどうかを査定することによって査定することを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、尿を第１抗体と接触させる前に尿を遠心分離機にかけて沈殿物があればそれをそこから殆ど取り除くことを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項５に記載の方法であって、第１抗体は担体と結合していることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって、前記担体はプラスチック容器であることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、前記容器はマルチウエルプレートであることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、前記プレートはロボット装置による自動分析に適合するようになっているものであることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項５に記載の方法であって、ＭＭＰＦＦペプチドと第１抗体との結合は、尿と前記第１抗体の接触の後、特にＭＭＰＦＦペプチドと結合する第２抗体と第１抗体を接触させ、第１と第２の抗体が一緒に局在しているかを査定することによって査定することを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、前記尿は、第１抗体と第２抗体の接触前少なくとも１０分間第１抗体と接触していることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載の方法であって、前記尿は、第１抗体と第２抗体の接触前少なくとも６０分間第１抗体と接触していることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１１に記載の方法であって、第２抗体は検出可能にラベル付けしてあることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、前記第２抗体は酵素、放射性核種、発蛍光団、及び発色団を構成する群から選択された化合物と連接していることを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１１に記載の方法であって、第２抗体は配位子に連接しており、第１及び第２抗体の局在が、第２抗体と(i) 配位子と結合する受容体と（ii）検出可能ラベル、から構成される化合物との接触によって査定されることを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、前記ラベルは酵素、放射性核種、発蛍光団、及び発色団を構成する群から選択されていることを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１６に記載の方法であって、前記配位子はビオチンであり前記受容体はアビジンであることを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法であって、前記アビジンはストレプタビジン(streptavidin)であることを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、前記ラベルは酵素であることを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法であって、前記酵素は西洋わさびペルオキシダーゼ(horseradish peroxidase)であることを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法であって、第１及び第２抗体の局在は３、３’、５、５’−テトラメチルベンジジンであることを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項５に記載の方法であって、第１抗体と尿を接触させた後に、第１抗体と第１抗体をラベル付けした担体とを接触させ、尿と接触させた第１抗体と結合するラベル付けした配位子の量と、尿と接触させなかった等量の第１抗体と結合するラベル付けした配位子の量を比較することを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法であって、ラベル付けした配位子はＭＭＰＦＦペプチドと同じアミノ酸配列を有していることを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法であって、ラベル付けした配位子のグリコシル化状態はＭＭＰＦＦペプチドのグリコシル化状態と同じであることを特徴とする方法。
【請求項２６】
請求項１に記載の方法であって、ＭＭＰＦＦペプチドはグリコシル化されていることを特徴とする方法。
【請求項２７】
請求項１に記載の方法であって、ＭＭＰＦＦペプチドのアミノ酸配列は、配列ＩＤ番号１から５よりなる群から選択された１つの配列の少なくとも１０の連続する残基から構成されていることを特徴とする方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法であって、ＭＭＰＦＦペプチドのアミノ酸配列は、配列ＩＤ番号１から５よりなる群から選択された１つの配列の少なくとも２０の連続する残基から構成されていることを特徴とする方法。
【請求項２９】
請求項２７に記載の方法であって、ＭＭＰＦＦペプチドのアミノ酸配列は、配列ＩＤ番号１から５よりなる群から選択された１つの配列の少なくとも５０の連続する残基から構成されていることを特徴とする方法。
【請求項３０】
請求項２７に記載の方法であって、ＭＭＰＦＦペプチドのアミノ酸配列は、配列ＩＤ番号１から５よりなる群から選択された１つの配列の少なくとも２００の連続する残基から構成されていることを特徴とする方法。
【請求項３１】
請求項２７に記載の方法であって、ＭＭＰＦＦペプチドのアミノ酸配列は、配列ＩＤ番号１から５よりなる群から選択された１つの配列から構成されていることを特徴とする方法。
【請求項３２】
請求項２７に記載の方法であって、ＭＭＰＦＦペプチドのアミノ酸配列は、配列ＩＤ番号４の少なくとも１０の連続的残基から構成されていることを特徴とする方法。
【請求項３３】
請求項２７に記載の方法であって、ＭＭＰＦＦペプチドのアミノ酸配列は、配列ＩＤ番号５の少なくとも１０の連続的残基から構成されていることを特徴とする方法。
【請求項３４】
請求項１に記載の方法であって、ＭＭＰＦＦペプチドは、少なくとも２０の連続アミノ酸残基の部分からなり、その部分のアミノ酸配列は配列ＩＤ番号１から５よりなる群から選択された１つの配列の２０の連続残基に対し少なくとも９０％同じであることを特徴とする方法。
【請求項３５】
請求項３４に記載の方法であって、ＭＭＰＦＦペプチドは、少なくとも２０の連続アミノ酸残基の部分からなり、その部分のアミノ酸配列は配列ＩＤ番号４と５よりなる群から選択された１つの配列の２０の連続残基に対し少なくとも９０％同じであることを特徴とする方法。
【請求項３６】
請求項１に記載の方法であって、更に、女性の尿中の第２卵巣癌マーカーの発生の査定を含んで構成され、尿中の前記第２マーカーの発生もまた女性が卵巣癌にかかっていることの示唆であることを特徴とする方法。
【請求項３７】
請求項３６に記載の方法であって、前記第２の卵巣癌マーカーは尿ゴナドトロピンペプチド（urinary gonadotropin peptide)、システインプロテイナーゼ(cysteine proteinase)、ネオプテリン(neopterin)、及び腫瘍関連トリプシン抑制剤(tumor-associated trypsin inhibitor)よりなる群から選択されたものであることを特徴とする方法。
【請求項３８】
請求項１に記載の方法であって、更に、女性の血清中の第２卵巣癌マーカーの発生の査定を含んで構成され、血清中の前記第２マーカーの発生もまた女性が卵巣癌にかかっていることの示唆であることを特徴とする方法。
【請求項３９】
請求項３８に記載の方法であって、前記第２卵巣癌マーカーはＣＡ１２５、癌性胎児抗原(carcinoembryonic antigen）、血管内皮成長因子（vascular endothelial growth factor）、腫瘍関連トリプシン抑制剤(tumor-associated trypsin inhibitor)、ＣＤ４４スプライス変形体（splice variants)、抗マリグニン抗体(anti-malignin antibody)、乳酸脱水素酵素（lactate dehydrogenase)、アルファーヒドロキシ酪酸脱水素酵素 (alpha-hydroxybutyrate dehydrogenase)、ＣＡ１９−９、組織ポリペプチド抗原(tissue polypeptide antigen)、及びシアリルＴＮよりなる群から選択されたものであることを特徴とする方法。
【請求項４０】
請求項３８に記載の方法であって、前記第２の卵巣癌マーカーはＣＡ１２５であることを特徴とする方法。
【請求項４１】
請求項１に記載の方法はさらに女性の血清中のＭＭＰＦＦペプチドの発生の査定を含んで構成され、血清中の前記ＭＭＰＦＦペプチドの発生もまた女性が卵巣癌にかかっていることの示唆であることを特徴とする方法。
【請求項４２】
女性が卵巣癌になった可能性を査定する方法であって、その方法は女性から採取した尿中のメソセリン／巨核球可能化因子族（ＭＭＰＦＦ）ペプチド(mesothelin/megakaryocyte potentiating factor family peptide)の発生を査定することを含んで構成され、尿中にＭＭＰＦＦペプチドが発生するということは、その女性が、尿中にＭＭＰＦＦの発生がなくその他では同じ女性に較べてより卵巣癌になりやすいことを示唆するものであることを特徴とする方法。
【請求項４３】
女性の卵巣癌の治療の効果を査定する方法であって、治療後の女性から採取した尿中のメソセリン／巨核球可能化因子族（ＭＭＰＦＦ）ペプチド(mesothelin/megakaryocyte potentiating factor family peptide)の量を査定し、その量と手術前その女性から採取した尿中のＭＭＰＦＦペプチドの量を比較することから構成され、手術後の尿中のＭＭＰＦＦペプチドの量がより少なくなっていれば手術が効果的であったことを示していることを特徴とする方法。
【請求項４４】
女性から採取した尿中のメソセリン／巨核球可能化因子族（ＭＭＰＦＦ）ペプチド(mesothelin/megakaryocyte potentiating factor family peptide)の発生を査定するキットであって、そのキットはＭＭＰＦＦペプチドと結合するための第１薬剤と、尿と前記第１薬剤を接触することを記述する使用説明書から構成されていることを特徴とするキット。
【請求項４５】
請求項４４に記載のキットであって、前記第１薬剤は抗体であることを特徴とするキット。
【請求項４６】
請求項４５に記載のキットであって、前記抗体は薄い金属フィルムに結合されていることを特徴とするキット。
【請求項４７】
請求項４６に記載のキットであって、前記フィルムは表面プラズモン共鳴装置内の分析に用いられることを特徴とするキット。
【請求項４８】
請求項４４に記載のキットであって、更に、ＭＭＰＦＦペプチドが前記第１薬剤との結合を査定するための第２薬剤を含んで構成されていることを特徴とするキット。
【請求項４９】
請求項４８に記載のキットであって、前記第２薬剤は前記第１薬剤の検出可能にラベルをつけた配位子であることを特徴とするキット。
【請求項５０】
請求項４９に記載のキットであって、前記第１薬剤は抗体で前記配位子はＭＭＰＦＦペプチドであることを特徴とするキット。
【請求項５１】
請求項４９に記載のキットであって、前記配位子は酵素、放射性核種、発蛍光団、及び発色団よりなる群から選択された化合物でラベル付けされていることを特徴とするキット。
【請求項５２】
請求項４８に記載のキットであって、前記第２薬剤は検出可能にラベル付けした抗体であることを特徴とするキット。
【請求項５３】
請求項５２に記載のキットであって、前記抗体はビオチン化した抗体であることを特徴とするキット。
【請求項５４】
請求項５２に記載のキットであって、前記抗体は酵素、放射性核種、発蛍光団、及び発色団よりなる群から選択された化合物でラベル付けされていることを特徴とするキット。
【請求項５５】
請求項４８に記載のキットであって、前記第１薬剤は検出可能にラベル付けされている抗体と結合するエピトープとは異なるＭＭＰＦＦのエピトープと結合する抗体であることを特徴とするキット。
【請求項５６】
請求項４４に記載のキットであって、更に、女性から採取した尿サンプルを遠心分離する装置を含んで構成されていることを特徴とするキット。
【請求項５７】
請求項４４に記載のキットであって、前記第１薬剤は担体に結合されていることを特徴とするキット。
【請求項５８】
請求項５７に記載のキットであって、前記担体はプラスチックの容器であることを特徴とするキット。
【請求項５９】
請求項５８に記載のキットであって、前記容器はマルチウエルプレートであることを特徴とするキット。
【請求項６０】
請求項５９に記載のキットであって、前記プレートはロボット装置による自動分析に適合するように作製されたものであることを特徴とするキット。
【請求項６１】
請求項５８に記載のキットであって、前記第１薬剤は抗体であることを特徴とするキット。
【請求項６２】
請求項６１に記載のキットであって、前記第２薬剤は第２抗体であることを特徴とするキット。
【請求項６３】
請求項６２に記載のキットであって、前記第２抗体は配位子に連接されていることを特徴とするキット。
【請求項６４】
請求項６３に記載のキットであって、更に、（i）前記配位子と結合する受容体と（ii）検出可能なラベルを含んで構成されていることを特徴とするキット。
【請求項６５】
請求項６４に記載のキットであって、ラベルは酵素、放射性核種、発蛍光団、及び発色団よりなる群から選択された化合物でラベル付けされていることを特徴とするキット。
【請求項６６】
請求項６５に記載のキットであって、前記配位子はビオチンであり、前記受容体はアビジンであることを特徴とするキット。
【請求項６７】
請求項６６に記載のキットであって、前記アビジンはストレプタビジン(streptavidin)であることを特徴とするキット。
【請求項６８】
請求項６７に記載のキットであって、前記ラベルは酵素であることを特徴とするキット。
【請求項６９】
請求項６８に記載のキットであって、前記酵素は西洋わさびペルオキシダーゼ(horseradish peroxidase)であることを特徴とするキット。
【請求項７０】
請求項６９に記載のキットであって、更に、３、３’、５、５’−テトラメチルベンジジンを含んで構成されていることを特徴とするキット。
【請求項７１】
請求項４４に記載のキットであって、更に、対照例としてのＭＭＰＦＦペプチドを含んで構成され、対照例ペプチドのアミノ酸配列は配列ＩＤ番号１から５よりなる群から選ばれたひとつの配列の少なくとも１０の連続する残基を含んで構成されていることを特徴とするキット。
【請求項７２】
請求項７１に記載のキットであって、対照例ペプチドのアミノ酸配列は配列ＩＤ番号１から５よりなる群から選ばれたひとつの配列の少なくとも２０の連続する残基を含んで構成されていることを特徴とするキット。
【請求項７３】
請求項７１に記載のキットであって、対照例ペプチドのアミノ酸配列は配列ＩＤ番号１から５よりなる群から選ばれたひとつの配列の少なくとも５０の連続する残基を含んで構成されていることを特徴とするキット。
【請求項７４】
請求項７１に記載のキットであって、対照例ペプチドのアミノ酸配列は配列ＩＤ番号１から５よりなる群から選ばれたひとつの配列の少なくとも２００の連続する残基を含んで構成されていることを特徴とするキット。
【請求項７５】
請求項７１に記載のキットであって、対照例ペプチドのアミノ酸配列は配列ＩＤ番号１から５よりなる群から選ばれたひとつの配列を含んで構成されていることを特徴とするキット。
【請求項７６】
請求項７１に記載のキットであって、対照例ペプチドのアミノ酸配列は配列ＩＤ番号４の少なくとも１０の連続する残基を含んで構成されていることを特徴とするキット。
【請求項７７】
請求項７１に記載のキットであって、対照例ペプチドのアミノ酸配列は配列ＩＤ番号５の少なくとも１０の連続する残基を含んで構成されていることを特徴とするキット。
【請求項７８】
請求項４４に記載のキットであって、更に、少なくとも２０の連続するアミノ酸残基の部分を含んで構成される対照例ペプチドを含み、その部分のアミノ酸配列は配列ＩＤ番号１から５よりなる群から選択された配列の２０の連続する残基と少なくとも９０％同一であることを特徴とするキット。
【請求項７９】
請求項７８に記載のキットであって、前記対照例ペプチドは少なくとも２０の連続するアミノ酸残基の部分を含んで構成され、その部分のアミノ酸配列は配列ＩＤ番号４と５よりなる群から選択された配列の２０の連続する残基と少なくとも９０％同一であることを特徴とするキット。
【請求項８０】
請求項４４に記載のキットであって、更に、女性の尿中の第２卵巣癌マーカーの発生を査定する試薬を含んで構成されることを特徴とするキット。
【請求項８１】
請求項８０に記載のキットであって、前記第２の卵巣癌マーカーは尿ゴナドトロピンペプチド（urinary gonadotropin peptide)、システインプロテイナーゼ(cysteine proteinase)、ネオプテリン(neopterin)、腫瘍関連トリプシン抑制剤(tumor-associated trypsin inhibitor)よりなる群から選択されたものであることを特徴とするキット。
【請求項８２】
請求項４４に記載のキットであって、更に、女性の血清中の第２卵巣癌マーカーの発生を査定する試薬を含んで構成されることを特徴とするキット。
【請求項８３】
請求項８２に記載のキットであって、前記第２卵巣癌マーカーはＣＡ１２５、癌性胎児抗原(carcinoembryonic antigen）、血管内皮成長因子（vascular endothelial growth factor）、腫瘍関連トリプシン抑制剤(tumor-associated trypsin inhibitor)、ＣＤ４４スプライス変形体（splice variants)、抗マリグニン抗体(anti-malignin antibody)、乳酸脱水素酵素（lactate dehydrogenase)、アルファーヒドロキシ酪酸脱水素酵素(alpha-hydroxybutyrate dehydrogenase)、ＣＡ１９−９、組織ポリペプチド抗原(tissue polypeptide antigen)、及びシアリルＴＮよりなる群から選択されたものであることを特徴とするキット。
【請求項８４】
請求項８３に記載のキットであって、前記第２の卵巣癌マーカーはＣＡ１２５であることを特徴とするキット。
【公表番号】特表２００７−５２５６４３（Ｐ２００７−５２５６４３Ａ）
【公表日】平成１９年９月６日（２００７．９．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０７１６４（Ｐ２００６−５０７１６４）
【出願日】平成１６年３月１５日（２００４．３．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００７７６５
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８３４４９
【国際公開日】平成１６年９月３０日（２００４．９．３０）
【出願人】（５０５３４５０３７）フジレビオ アメリカ インク (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年９月６日（２００７．９．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年３月１５日（２００４．３．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００７７６５
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８３４４９
【国際公開日】平成１６年９月３０日（２００４．９．３０）
【出願人】（５０５３４５０３７）フジレビオ アメリカ インク (2)
【Ｆターム（参考）】
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