卵胆礬を含む癌予防及び治療用組成物
本発明は、卵胆礬を含む癌予防及び治療用組成物、より詳細には、胆礬を卵白に混合して製造される毒性が除去された卵胆礬を単独で含んだり、竹塩との混合物として含む癌予防治療用組成物、及びその製造方法に関するもので、本発明の卵胆礬を含む組成物は、抗癌活性に優れているので、癌の予防及び治療用薬学製剤または健康機能食品の製造に有用に用いることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、卵胆礬を含む癌予防及び治療用組成物に関するもので、より詳細には、胆礬を卵白に混合して製造される毒性が除去された卵胆礬を単独で、または竹塩との混合物として含む癌予防治療用組成物、及びその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
癌とは、主に統制されない細胞の増殖から始まり、周囲の正常組織または器管に浸潤してこれらを破壊し、新しい成長場所を作ることができ、個体の生命を奪うことのできる疾患群を総称する。過去の約１０年間癌を克服するために、細胞周期や細胞死滅の調節と、発癌遺伝子や癌抑制遺伝子を含む新しい標的の模索において著しい発展を遂げてきたにもかかわらず、癌の発生率は文明の発達とともに増加している。
【０００３】
現在、癌患者のための治療法は、外科的手術、放射線治療、約４０種類の強い細胞毒性を示す抗癌物質投与による化学療法に依存しているが、これら治療法も、ほとんどが早期癌患者や特定癌のみに限定されており、癌による死亡は継続的に増加している。
【０００４】
また、抗癌剤のほとんどが強い毒性を示す化学的製剤であるので、毒性の少ない抗癌剤、特に天産物由来の抗癌剤が持続的に開発されている。
【０００５】
胆礬は、硫酸銅からなる硫酸塩鉱物の一種であって、主成分としてＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏを含有しているが、天然鉱物であるため、その他に微量の天然ミネラルが混合されている青色の結晶である。胆礬は、三斜晶系に属し、ガラス光沢があり、半透明な青色を帯びており、吐剤、殺虫剤、顔料、媒染剤及び電解液などに使用されるものと知られている。胆礬は、鉱物性生薬であるため毒性の憂いがあり、実際に薬用に用いるには限界があった。そのため、胆礬の抗癌剤への用途については全く知られていない。
【０００６】
竹塩は、仁山金一勳（１９０９〜１９９２）先生の発明品であって、竹と塩を合成してなるもので、これは、新しい細胞を生成させる作用をする竹と、殺菌及び腐敗を防止する塩とを炉で高熱で複数回繰り返して処理することによって、これらが持つ毒素を除去し、薬効を最大限に増進させた秘薬として知られている。
【０００７】
竹塩は、人体の根源である胃腸を丈夫にし、炎症疾患の原因を治療する薬理作用があるだけでなく、血をきれいにする清血作用をし、体内に積もった老廃物除去及び解毒作用をするようになり、酸性体質を弱アルカリ性体質に変える効能を有する。また、竹塩は、一般の塩に比べて抗炎症作用及び細菌に対する殺菌力が３〜４倍以上強く、殺菌作用を通して人体内で解熱作用をするものと知られている。
【０００８】
本発明者は、胆礬の毒性を卵白で中和させた卵胆礬が癌細胞のアポトーシスを誘導し、癌細胞の増殖を抑制することによって、天然抗癌剤として用いる可能性があることを確認し、卵胆礬を単独または竹塩との混合物として含む組成物が抗癌剤として広範囲に利用できることを確認した結果、本発明を完成するに至った。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】仁山金一勳「宇宙と神薬（１９８０年）」
【非特許文献２】仁山金一勳「神薬（１９８６年）」
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、卵胆礬を有効成分として含む癌予防及び治療用組成物を提供することにある。
【００１１】
本発明の更に他の目的は、卵胆礬を有効成分として含む癌予防及び改善用健康機能食品を提供することにある。
【００１２】
本発明の更に他の目的は、（ａ）天然鉱物性生薬である胆礬を全量が灰色または褐色に変わるまで加熱して脱水させる段階；（ｂ）脱水された胆礬を冷やした後、粉末化する段階；及び（ｃ）前記段階（ｂ）の胆礬粉末を卵白に混合する段階を含む、卵胆礬の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
一つの様態として、本発明は、卵胆礬を有効成分として含む癌予防及び治療用組成物に関するものである。
【００１４】
本発明において、「卵胆礬」は、卵の卵白と胆礬が混合されたものを意味し、胆礬（ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏを主成分とする天然鉱物）を焼いて脱水・粉末化した後、卵の卵白を混合して反応させることによって製造することが好ましい。このように製造された卵胆礬は、胆礬特有の毒性が卵白によって中和され、毒性が減少及び除去され、薬性は増強される。
【００１５】
また、本発明の前記組成物は、竹塩をさらに含むことができる。
【００１６】
本発明に用いられる竹塩は、市販のものを使用したり、直接製造することができる。このとき、竹塩は、竹塩発明家である仁山金一勳先生の冊子「宇宙と神薬（１９８０年）」と「神薬（１９８６年）」に記載された製造法の通りに、西海岸の天日塩を王竹の竹筒に入れ、黄土で入口を封じた後、鉄釜にきちんと積み上げ、松の薪の火にくべて焼き、このように王竹の竹筒を焼いて残った塩の柱を粉に粉砕する。その後、これを再び新しい王竹の竹筒に入れ、黄土で入口を封じた後、鉄釜で松の薪を用いて８回焼き上げた後、最後の９回目ではまつやにを添加し、火力を高めながら塩を溶かし落とした仁山先生の正統９回溶融竹塩製造法に充実した竹塩を使用することが好ましいが、これに制限されることはない。
【００１７】
本発明の組成物に含まれる卵胆礬及び竹塩は、粉末状であることが好ましい。また、本発明の組成物が卵胆礬及び竹塩を全て含む場合、粉末状の卵胆礬及び竹塩は、１：９９〜９９：１重量比の多様な比率で混合して含むことができ、好ましくは１：５〜１：５０の重量比で含み、最も好ましくは１：５、１：１０、１：１５、１：２５及び１：３０の重量比で含む。
【００１８】
前記組成物が経口用製剤として用いられる場合、竹塩粉末が卵胆礬粉末と同一であるか、それより高い含量で含まれることが好ましく、幼いか、体力が弱いか、老衰・病弱なときは竹塩の比率を高め、体力が比較的良好なときは卵胆礬の比率を漸次高めてもよく、卵胆礬と竹塩の比率が約１：１０及び１：５になったときにも服用が可能である。
【００１９】
また、前記組成物を体に塗ったり、洗浄またはスプレーする用途の塗布用製剤として用いたり、かん腸用に用いる場合は、卵胆礬の比率が高くても構わなく、卵胆礬の単独使用も可能である。
【００２０】
本発明の卵胆礬を含む組成物は、カスパーゼ３（ｃａｓｐａｓｅ３）の活性増進を通した癌抑制能を有する。
【００２１】
本発明の具体的な実施例において、卵胆礬をＨｅｐＧ２（肝癌細胞）、ＳＷ４８０（大膓癌細胞）、ＭＣＦ−７（乳房癌細胞）及びＮＣＩ−Ｈ４６０（肺癌細胞）に処理した場合、濃度依存的に癌細胞の増殖が抑制されることを確認した。また、肝癌細胞及び肺癌細胞に卵胆礬を処理した場合、アポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ、細胞死滅）が誘導され、核分節と染色質凝縮が生じることを確認した。また、本発明の卵胆礬組成物が持つ癌細胞増殖抑制能をタンパク質水準で観察した結果、カスパーゼ３タンパク質を活性化させることによって、細胞死滅を誘導し、癌細胞の増殖を抑制することを確認した。
【００２２】
本発明の卵胆礬組成物は、癌の予防及び治療用途に用いることができる。本発明において、「予防」とは、組成物の投与によって疾患の形成を抑制したり、発病を遅延させる全ての行為を意味し、「治療」とは、組成物の投与によって前記疾患の症状が好転したり、有利に変更される全ての行為を意味する。
【００２３】
前記本発明の組成物は、ほとんどの癌に適用可能であり、例えば、肝癌、乳房癌、肺癌、大膓癌、胃癌、膵膓癌、子宮癌、前立腺癌、骨癌、神経膠腫及び白血病などに適用可能であり、このうち肝癌、大膓癌、乳房癌及び肺癌に適用されることが好ましいが、これに制限されることはない。
【００２４】
本発明の卵胆礬を有効成分として含む組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含み、薬学的組成物として用いることができ、担体と共に製剤化することができる。また、本発明の前記組成物は、単一剤として使用したり、薬効を増強できる他の有効成分と共に複合剤として使用することができる。
【００２５】
本発明の用語である「薬学的に許容可能な担体」とは、生物体を刺激せず、投与化合物の生物学的活性及び特性を阻害しない担体または希釈剤をいう。液状溶液に製剤化される組成物において許容される薬剤学的担体としては、生体に適切なものとして、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール及びこれら成分のうち１成分以上を混合して使用することができ、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、静菌剤などの他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑剤をさらに添加し、水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。
【００２６】
本発明の前記組成物は、これを有効成分として含むいかなる剤形にも適用可能であり、経口用または非経口用剤形に製造することができる。本発明の薬学的剤形は、口腔、直腸、鼻腔、局所、皮下、膣または非経口（筋肉内、皮下及び静脈内を含む。）投与に適した形態、または吸入や注入による投与に適した形態を含む。
【００２７】
本発明の組成物を含む経口投与用剤形としては、例えば、錠剤、トローチ剤、水溶性または油性懸濁液、調剤粉末または顆粒、エマルジョン、ハードまたはソフトカプセル、シロップまたはエリキシル剤に製剤化することができる。錠剤及びカプセルなどの剤形に製剤化するために、ラクトース、サッカロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アミロペクチン、セルロースまたはゼラチンなどの結合剤、リン酸二カルシウムなどの賦形剤、トウモロコシ澱粉またはサツマイモ澱粉などの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、フマル酸ステアリルナトリウムまたはポリエチレングリコールワックスなどの潤滑油を含むことができ、カプセル剤形の場合、前記言及した物質の他にも脂肪油などの液体担体をさらに含有することができる。
【００２８】
本発明の組成物を含む非経口投与用剤形は、皮下注射、静脈注射または筋肉内注射などの注射用形態、坐剤注入方式または呼吸器を通して吸入可能にするエアロゾル剤などのスプレー用に製剤化することができる。注射用剤形に製剤化するためには、本発明の組成物を安定剤または緩衝剤と共に水で混合して溶液または懸濁液に製造し、これをアンプルまたはバイアルの単位投与用に製剤化することができる。坐剤として注入するためには、ココアバターまたは他のグリセリドなどの通常の坐薬ベースを含む坐薬またはかん腸剤などの直腸投与用組成物に製剤化することができる。エアロゾル剤などのスプレー用に剤形化する場合、水が分散された濃縮物または湿潤粉末が分散されるように、推進剤などを添加剤と共に配合することができる。
【００２９】
更に他の様態として、本発明は、前記卵胆礬組成物を用いて癌を予防及び治療する方法に関するものである。
【００３０】
本発明において、前記疾患の治療は、卵胆礬を含む薬学的組成物を投与する段階を含むことができる。本発明の用語である「投与」は、何らかの適切な方法で患者に本発明の薬学的組成物を導入することを意味する。
【００３１】
本発明の組成物は、目的組織に到逹できる一つの経口または非経口の多様な経路を通して投与することができ、具体的には、口腔、直腸、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、経皮、鼻腔内、吸入、眼球内または皮内経路を通して通常の方式で投与することができるが、このうち、経口投与または経皮塗布によって投与することが好ましい。
【００３２】
本発明の治療方法は、本発明の組成物を薬学的有効量で投与することを含む。適切な総１日投与量は、正しい医学的判断範囲内で処置医によって決定可能であることは当業者にとって自明である。特定患者に対する具体的な治療的有効量は、達成しようとする反応の種類と程度、場合によって他の製剤が使用されるか否か、具体的組成物、患者の年齢、体重、一般の健康状態、性別及び食餌、投与時間、投与経路及び組成物の分泌率、治療期間、具体的組成物と共にまたは同時に使用される薬物を含めた多様な因子と医薬分野でよく知られた類似因子に従って異なるように適用することが好ましい。したがって、本発明の目的に符合した薬学的組成物の１日有効投与量は、上述した事項を考慮して決定することが好ましく、最も好ましくは、卵胆礬粉末の重量を基準にして服用時に約０．１ｇ〜３０ｇであって、かん腸や皮膚などへの外用剤としての使用量には制限がない。
【００３３】
また、本発明の治療方法は、癌が発生可能な任意の動物に適用可能であり、動物は、人間及び霊長類のみならず、牛、豚、羊、馬、犬及び猫などの家畜を含む。
【００３４】
特に、本発明の組成物を経口投与する方法としては、水や、生姜及び甘草を混合して煎じた水で飲み込む方法、楡根皮水などで飲み込む方法、唾で飲み込む方法が可能である。また、摂取方法は、そのまま食べる方法の他に、カプセルに入れて前記多様な方法で服用する方法もあるが、カプセルを唾で飲み込む方法は、水や飲料水で飲み込む方法よりも効果的であり、食物や飲料水に少量だけ混合して食べることもできる。例えば、お粥や焼いたニンニクなどに前記混合物を添加して食べる方法もあり、竹塩醤油に卵胆礬粉末を混合して服用する方法もある。
【００３５】
本発明の具体的実施例において、本発明の卵胆礬を竹塩と共に癌患者に服用させ、抗癌効果を観察した結果、大膓癌、肺癌、骨癌、子宮頚部異型細胞症、甲状腺癌などに治療効能があることを確認した。
【００３６】
更に他の様態として、本発明は、卵胆礬を有効成分として含む癌予防及び改善用健康機能食品に関するものである。
【００３７】
本発明の前記健康機能食品は、卵胆礬と共に竹塩をさらに含んで提供することができる。
【００３８】
本発明の組成物は、食品学的に許容可能な食品添加剤をさらに含んで製剤化することができ、癌予防及び治療用健康機能食品に用いることができる。本発明の健康機能食品は、錠剤、カプセル剤、丸剤、液剤などの形態を含む。
【００３９】
本発明の組成物を添加できる食品としては、例えば、各種食品類、飲料水、ガム、お茶、ビタミン複合剤、健康機能性食品類などがある。
【００４０】
本発明で定義される「健康機能食品」は、人体に有用な機能性を有する原料や成分を使用して製造及び加工した食品を意味し、「機能性」とは、人体の構造及び機能に対して栄養素を調節したり、生理学的作用などのような保健用途に有用な効果を得る目的で摂取することを意味する。
【００４１】
本発明の組成物は、癌を予防または改善するための目的で食品または飲み物に添加できるが、このとき、前記組成物は、食品または飲料水中に、全体の食品重量の０．０１〜１０重量％で添加することができ、例えば、健康飲料組成物は、全ての組成物１００を基準にして０．０１〜５ｇ、好ましくは、０．５〜１ｇの比率で添加することができる。
【００４２】
更に他の様態として、本発明は、（ａ）天然鉱物性生薬である胆礬を全量が灰色または褐色に変わるまで加熱して脱水させる段階；（ｂ）脱水された胆礬を冷やした後、粉末化する段階；及び（ｃ）前記段階（ｂ）の胆礬粉末を卵白に混合する段階を含む、卵胆礬の製造方法に関するものである。
【００４３】
以下、本発明の卵胆礬の製造方法を段階別に説明する。
【００４４】
段階（ａ）は、胆礬（ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏを含む天然鉱物）を加熱して脱水させる段階である。胆礬を加熱する方法としては、当業界で公知となった通常の加熱方法を用いることができ、好ましくは、釜に入れ、ガスの火、薪の火または炭火で焼く方法で加熱することができる。加熱時には３〜５時間の間隔で色が変わることを観察しながら上下に混合し、熱を均一に加えるとよい。加熱時間は１回の使用量によって調整可能であるが、約１０〜２４時間加熱することが適切であって、胆礬の全量の色が灰色または褐色に変わり、脱水塩状態になるまで加熱することが好ましい。
【００４５】
段階（ｂ）は、段階（ａ）で加熱して脱水された胆礬を冷やした後、粉末化する段階である。加熱して脱水された胆礬は、熱が完全に抜け出るまで冷やさなければならなく、このとき、胆礬の水分含量は約０％〜５％であることが好ましい。脱水された胆礬を完全に冷やした後、これをきれいに粉砕して粉末化し、粉末化した胆礬は、湿気が吸収されないようにビニール袋や密閉容器に入れて乾燥した場所に保管することが好ましい。
【００４６】
段階（ｃ）は、前記段階（ｂ）の胆礬粉末を卵白に混合し、胆礬と卵白を反応させることによって胆礬の毒性を減少及び除去し、薬性は増強させる段階である。
【００４７】
卵は、卵黄と卵白に分離して卵白のみを用い、地元産のものを使用することが好ましく、より好ましくは烏骨鶏卵を使用する。前記段階（ｂ）で準備された脱水状態の胆礬粉末に卵白を混合するが、このとき、胆礬粉末６００ｇ当たり卵７〜２０個の卵白（１４０〜４００ｇ）を混合することが好ましく、より好ましくは３００ｇを混合する。混合時には状態を観察しながら卵白の量を調節し、木べらのように反応性がほとんどない道具を用いて混ぜるとよい。また、化学反応が生じない容器、例えば、土器、陶磁器、麦飯石容器を使用して混合することが好ましい。混合過程で反応熱による高い熱が発生するので、注意を要する。
【００４８】
また、混合時に卵白の量が過度に少ないと、脱水された胆礬粉末の毒性を充分に中和させることが難しく、その一方、卵白の量が過度に多いと、混合時に反応熱が微弱になるか、発生しなくなり、十分な混合効果を得ることが難しいので、卵白の量を注意して調節しなければならない。前記の混合物を充分に混合させた後、反応時に生じた反応熱が完全に消えるまで熱を冷やすことが好ましい。
【００４９】
また、本発明の前記卵胆礬の製造方法は、段階（ｃ）以後に、（ｄ）前記段階（ｃ）の混合物を冷やした後、粉末化する段階をさらに含むことができる。
【００５０】
段階（ｄ）は、段階（ｃ）の混合物を、熱が完全に抜け出るまで冷やした後、混合物状態の卵胆礬を細かく粉砕して粉末化する段階である。卵胆礬を粉末化することによって、薬学的または食品学的製剤に効率的に用いることができ、卵胆礬の反応性面積が増大し、疾病治療的活性を極大化できるようになる。
【００５１】
このような製造方法を通して製造される卵胆礬は、胆礬の持つ毒性が除去され、薬性は増強され、癌を予防または治療するための薬学的または食品学的組成物として利用できるようになる。
【発明の効果】
【００５２】
本発明の卵胆礬を含む組成物は、胆礬の毒性が除去され、薬物学的活性が最大化された状態で製造され、優れた抗癌活性を示すので、癌の予防及び治療用組成物に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】微生物復帰突然変異試験のための実験過程を概略的に示した図である。
【図２】焼いた胆礬（ＩＳ３）、卵胆礬（ＩＳ４）及び生胆礬（ＩＳ５）をＨｅｐＧ２（肝癌細胞）、ＮＣＩ−Ｈ４６０（肺癌細胞）、ＳＷ４８０（大膓癌細胞）及びＭＣＦ−７（乳房癌細胞）の４つの癌細胞に処理した後、各細胞に対してＭＴＴアッセイ（ａｓｓａｙ）を施行した結果を示す図である。
【図３】焼いた胆礬（ＩＳ３）、卵胆礬（ＩＳ４）及び生胆礬（ＩＳ５）をＨｅｐＧ２（肝癌細胞）、ＮＣＩ−Ｈ４６０（肺癌細胞）、ＳＷ４８０（大膓癌細胞）及びＭＣＦ−７（乳房癌細胞）の４つの癌細胞に処理した後、各細胞に対してＭＴＴアッセイ（ａｓｓａｙ）を施行した結果を示す図である。
【図４】焼いた胆礬（ＩＳ３）、卵胆礬（ＩＳ４）及び生胆礬（ＩＳ５）をＨｅｐＧ２（肝癌細胞）、ＮＣＩ−Ｈ４６０（肺癌細胞）、ＳＷ４８０（大膓癌細胞）及びＭＣＦ−７（乳房癌細胞）の４つの癌細胞に処理した後、各細胞に対してＭＴＴアッセイ（ａｓｓａｙ）を施行した結果を示す図である。
【図５】焼いた胆礬（ＩＳ３）、卵胆礬（ＩＳ４）及び生胆礬（ＩＳ５）をＨｅｐＧ２（肝癌細胞）、ＮＣＩ−Ｈ４６０（肺癌細胞）、ＳＷ４８０（大膓癌細胞）及びＭＣＦ−７（乳房癌細胞）の４つの癌細胞に処理した後、各細胞に対してＭＴＴアッセイ（ａｓｓａｙ）を施行した結果を示す図である。
【図６】ＩＳ３及びＩＳ４をそれぞれ５０μｇ／ｍｌの濃度でＮＣＩ−Ｈ４６０及びＨｅｐＧ２細胞に処理した後、これら細胞をＤＡＰＩ染色した結果を示し、矢印表示は、アポトーシス核（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｎｕｃｌｅｉ）を示す図である。
【図７】ＩＳ３及びＩＳ４をそれぞれ５０μｇ／ｍｌの濃度でＮＣＩ−Ｈ４６０及びＨｅｐＧ２細胞に処理した後、これら細胞をＤＡＰＩ染色した結果を示し、矢印表示は、アポトーシス核（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｎｕｃｌｅｉ）を示す図である。
【図８】卵胆礬（ＩＳ４）を多様な濃度でＮＣＩ−Ｈ４６０細胞に処理した後、これら細胞のタンパク質発現水準を観察するために、ウェスタンブロットを行った結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明する。ただし、下記の実施例は、本発明を例示するものに過ぎなく、本発明の内容が下記の実施例に限定されるのではない。
【００５５】
（実施例１．試験物質（生胆礬、焼いた胆礬及び卵胆礬）製造）
生胆礬を火に焼いて脱水させた胆礬（焼いた胆礬）と卵胆礬を製造し、実験には生胆礬、焼いた胆礬及び卵胆礬を用いた。
【００５６】
まず、焼いた胆礬は、生胆礬を加熱・脱水させて製造し、生胆礬に２４時間熱を加えると、生胆礬が脱水されながら灰色または褐色の光に変わるが、このような脱水塩状態の胆礬を焼いた胆礬と言う。焼いた胆礬が完全に冷えた後、細かく粉砕して粉末化して用意する。
【００５７】
卵胆礬は、焼いた胆礬粉末に卵白を混合して反応させることによって製造するが、焼いた胆礬粉末パウダー６００ｇに地元産の卵１３個の卵白のみを分離して卵白３００ｇと混合し、焼いた胆礬が卵白中の水分と反応して高熱（反応熱）が発生し、緑色に変わりながらパウダーがもつれるようになるが、このような状態を卵胆礬と言う。
【００５８】
このように製造された焼いた胆礬（ＩＳ３）、卵胆礬（ＩＳ４）及び生胆礬（ＩＳ５）をそれぞれの試験物質として使用するために、天秤にそれぞれ１００ｍｇを計り、Ｄ．Ｄ．Ｗに総量を１ｍｌにして溶かす。試験物質が全て溶けた後、６００ｒｐｍで遠心分離し、上澄液を０.８μｍのシリンジフィルタ（ｓｙｒｉｎｇｅ ｆｉｌｔｅｒ）でフィルタリングした（表１）。
【００５９】
【表１】
【００６０】
（実施例２．遺伝毒性検査のための微生物復帰突然変異試験）
【００６１】
焼いた胆礬及び卵胆礬の遺伝毒性程度を調査するために、細胞突然変異原を判別できる微生物復帰突然変異試験を行った。
【００６２】
実験原理は、ヒスチジン要求性菌株として、ヒスチジンがないと生育できない性質を用いたもので、突然変異実験で突然変異原によって生じる元の菌株特性であるヒスチジン利用回復を調査する実験で、無処理群（陰性対照群）に比べて２倍以上の菌数を示したり、試験物質の濃度依存的に菌数が増加する場合に陽性と判定し、突然変異原として確定されるようになる。
【００６３】
微生物復帰突然変異試験を行うために、まず、前培養法として試験標準菌株であるサルモネラ・チフィリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｉｍｕｒｉｕｍ）ＴＡ９８、ＴＡ１００、ＴＡ１５３５、ＴＡ１５３７を対象として実験した。まず、耐性実験を行った後、胆礬に耐性を示す各菌株のうち２個の菌株であるサルモネラ・チフィリウムＴＡ１００、ＴＡ１０２を選択して実験菌株として使用した。サルモネラ・チフィリウムＴＡ１００は、遺伝子のうちグアニン（ｇｕａｎｉｎｅ）とサイトシン（ｃｙｔｏｃｉｎｅ）の復帰に対する試験菌株であって、サルモネラ・チフィリウムＴＡ１０２は、アデニン（ａｄｅｎｉｎｅ）とチミン（Ｔｈｙｍｉｎｅ）の復帰に対する試験菌株である。
【００６４】
細胞に対する抗菌実験で、卵胆礬を５０００μｇ／プレート、焼いた胆礬を２５００μｇ／プレートを使用したとき、菌株に対する生育抑制が表れた。したがって、菌の抑制がない濃度である下記の濃度で遺伝毒性（復帰突然変異）試験を行った（図１）。
【００６５】
処理群としては、卵胆礬の場合、最大濃度を２５００μｇ／プレートにし、１２５０、６２５、３１３、１５６及び７８μｇ／プレートの濃度で使用した。また、焼いた胆礬の場合、最大濃度を１２５０μｇ／プレートにし、６２５，３１３，１５６及び７８μｇ／プレートの濃度で使用した。
【００６６】
陽性対照群としては、アジ化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ａｚｉｄｅ）１μｇ／プレート（サルモネラ・チフィリウムＴＡ１００処理用）及びマイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）Ｃ−１μｇ／プレート（サルモネラ・チフィリウムＴＡ１０２処理用）を使用し、陰性対照群としては蒸留水を使用した。
【００６７】
それぞれの試験物質、陽性対照群化合物、蒸留水をプレートに処理した後、復帰突然変異された菌株の数を測定した。その結果は、次に示す通りである（表２〜表５）。
【００６８】
【表２】
【００６９】
【表３】
【００７０】
【表４】
【００７１】
【表５】
【００７２】
サルモネラ・チフィリウムＴＡ１００の場合、微生物生育抑制を誘発しない最大濃度で卵胆礬及び焼いた胆礬処理群の菌数が陽性対照群に比べて著しく小さく、陰性対照群と比べたときも類似する水準に表れた。また、濃度依存的にコロニー数が増加しなかった。そのため、卵胆礬及び焼いた胆礬は復帰突然変異原でないと判定した。
【００７３】
サルモネラ・チフィリウムＴＡ１０２の場合も、微生物生育抑制を誘発しない最大濃度で、卵胆礬及び焼いた胆礬処理群ではコロニーがほとんど生成されなく、これは、陽性対照群に比べて著しく小さい数であり、陰性対照群と比べたときも類似する水準であった。また、濃度依存的にコロニー数が増加しなかった。そのため、卵胆礬及び焼いた胆礬は復帰突然変異原でないと判定した。
【００７４】
（実施例３．癌細胞培養）
ＮＣＩ−Ｈ４６０（肺癌細胞）は、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌ−グルタミン含有）に１０％のＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び１００Ｕ／ｍｌのストレプトマイシンを入れ、５％のＣＯ２培養器で細胞培養を施行した。
【００７５】
ＳＷ４８０（大膓癌細胞）及びＭＣＦ−７（乳房癌細胞）細胞は、ＮＣＩ−Ｈ４６０（肺癌細胞）と同一の条件で細胞培養を施行した。ＨｅｐＧ２（肝癌細胞）は、ＤＭＥＭ培地（Ｌ−グルタミン含有）に１０％のＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び１００Ｕ／ｍｌのストレプトマイシンを入れ、５％のＣＯ２培養器で細胞培養を施行した。
【００７６】
ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＭＣＦ−７、ＳＷ４８０、ＨｅｐＧ２細胞は、韓国細胞株銀行から分譲を受けて使用した。
【００７７】
（実施例４．ＭＴＴ評価法を通した細胞生存率測定）
焼いた胆礬（ＩＳ３）、卵胆礬（ＩＳ４）及び生胆礬（ＩＳ５）が癌細胞の増殖に及ぼす影響を調査するために、これら物質を多様な濃度で癌細胞に処理し、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）評価法を通した細胞生存率を測定することによって、癌細胞増殖の抑制可否を評価した。
【００７８】
ＨｅｐＧ２（肝癌細胞）、ＳＷ４８０（大膓癌細胞）、ＭＣＦ−７（乳房癌細胞）及びＮＣＩ―Ｈ４６０（肺癌細胞）の４つの癌細胞に対してＭＴＴアッサイを施行した。まず、それぞれの細胞を９６ウェルプレートに１×１０５セル／ｍｌの濃度で１００μｌずつ接種し、３７°Ｃ、５％のＣＯ２培養器で２４時間培養した。その後、各ウェル当たりの試験物質（ＩＳ３、ＩＳ４、ＩＳ５）をそれぞれ１００μｌずつ濃度別に（０、３．１２５、６．２５、１２．５、２５、５０μｇ／ｍｌ）２４時間処理した。
【００７９】
ＭＴＴ（ｔｈｉａｚｏｌｙｌ ｂｌｕｅ、ＳＩＧＭＡ Ｃｏ．）を２ｍｇ／ｍｌの濃度で準備して１５μｌずつ添加し、３時間〜４時間反応させた。各ウェル当たり試験物質１１５μｌを除去し、紫色の物質３０μｌのみを残した後、ＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）を１５０μｌ添加し、マイクロプレート・ミキサー上で１０分間よく混合して沈殿物を溶解させた後、マイクロプレート・リーダで５４０ｎｍの吸光度でＯＤ（ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ）値を測定した。全ての実験結果は、細胞を培養しないウェルで測定された吸光度に対して補正した値を算出した。
【００８０】
全ての試料で濃度が増加するとともに増殖抑制効果が表れたが、そのうちＩＳ４（卵胆礬）を処理したとき、癌細胞の増殖を最も効果的に抑制することに表れた（図２、図３、図４及び図５）。
【００８１】
（実施例５．ＤＡＰＩ染色を通した細胞のアポトーシス確認）
焼いた胆礬（ＩＳ３）、卵胆礬（ＩＳ４）及び生胆礬（ＩＳ５）が癌細胞（ＮＣＩ−Ｈ４６０及びＨｅｐＧ２）のアポトーシスを生じさせることによって細胞増殖を抑制するか否かを観察するために、癌細胞に各試料を処理した後、ＤＡＰＩ染色をし、蛍光顕微鏡で細胞形態を観察した。具体的な実験過程は、次に示す通りである。
【００８２】
８ウェルチャンバースライドに１×１０５セル／ｍｌの細胞をそれぞれ４００μｌずつ入れて２４時間培養した後、試料（５０μｇ／ｍｌの濃度）を処理し、２４時間反応させた後、反応終了後に培地を捨て、７５ｍＭのＫＣｌを約５００μｌ入れて５分間反応した。これは、細胞を膨らませて核の観察を容易にするためである。その次に、酢酸とメタノールを１：３で混ぜてコールドアイス状態にした後、これを約５００μｌ入れて５分間反応させ、細胞を固定した。これを２回繰り返して施行した。固定が終了すると、空気中で完全に乾かした後、ＤＡＰＩ染色溶液を約１００μｌ落として１０分間染色した後、ＰＢＳで洗浄した。グリセロールでカバーガラスを覆い、蛍光顕微鏡で（×１００または×２００）観察した。３００個の細胞を数え、このうち核の断片化と染色質の凝縮を示す細胞をアポトーシスの形態的判定基準にしたがって判読して観察した。
【００８３】
アポトーシスは、予定細胞死滅（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ）であって、細胞の萎縮、染色質の凝縮、ＤＮＡ分節、ミトコンドリアの機能障害、カスパーゼ・プロテアーゼ活性化などの特徴を伴うものと報告されたことがある。ＤＡＰＩは、青色の蛍光染料であって、ＤＮＡのＡＴクラスターがあるマイナー・グルーブに結合し、蛍光が増加する物質であるが、このような特性により、分節・凝縮されたアポトーシス小体を顕微鏡を通して簡単に確認し、ＤＮＡ断片化程度を肉眼で観察することができる。
【００８４】
５０μｇ／ｍｌの濃度でＩＳ３及びＩＳ４をそれぞれ処理したＨ４６０、ＨｅｐＧ２細胞にＤＡＰＩ染色を実施したが、対照群（胆礬試料を処理しない）と対比したとき、全ての核の分節と染色質の凝縮を観察することができた。特に、ＩＳ４（卵胆礬）グループでは、多くのアポトーシス小体を観察することができた（図６及び図７）。
【００８５】
（実施例６．ウェスタンブロットを通したアポトーシス関連タンパク質発現確認）
卵胆礬が癌細胞に及ぼす影響をタンパク質水準で観察するために、アポトーシス関連タンパク質であるカスパーゼ３、Ｂａｘ及びＢｃｌ−２タンパク質発現調節程度を確認した。
【００８６】
ｂａｘは、サイトゾルからミトコンドリアに移動しながらミトコンドリアからシトクロムＣの分泌を促進し、結局、細胞死滅を誘導する機能を有する一方、ｂｃｌ−２は、細胞外や細胞内の状況の伝達を受ける重要な信号伝達体系として作用し、ミトコンドリアへのｂａｘの移動を抑制することによって細胞死滅を抑制させる作用をするものと知られている（Ｎｏｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．，２０００）。
【００８７】
カスパーゼ−３は、細胞死滅に最も直接的に関連したカスパーゼであって、細胞死滅の初期段階に作用し、３５ｋＤａ酵素前駆体（ｐｒｏｅｎｚｙｍｅ）の分離によって誘導された１７及び１９ｋＤａ異種二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）が活性化された形態で（Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ−Ａｌｎｅｍｒｉ ｅｔ ａｌ．，１９９４）カスパーゼ―８とカスパーゼ−９の初期信号を増幅させる。
【００８８】
細胞死滅は、外因的及び内因的経路に分けられ、二つの場合、いずれもカスパーゼ−３の活性化を通して細胞死滅を誘発するようになる。カスパーゼ−３が活性化された形態で観察されるためには、不活性形態である３５ｋＤａのプロカスパーゼ−３の相対的な発現が減少したり、それらの活性型である１７ｋＤａと１９ｋＤａ分子量のタンパク質が検出されなければならない（Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ａｈｎ ｅｔ ａｌ．，２００４）。
【００８９】
卵胆礬（ＩＳ４）が、アポトーシスを誘発するものと知られたいくつかのタンパク質（カスパーゼ３、Ｂａｘ及びＢｃｌ−２タンパク質）の発現を調節するかどうかを観察するために、ウェスタンブロットを行った。これを通して、卵胆礬が細胞内でどの経路を通してアポトーシスを誘発させるかを確認した。具体的な実験過程は、次に示す通りである。
【００９０】
ＮＣＩ−Ｈ４６０（肺癌細胞）にＩＳ４を０、２５、５０及び１００μｇ／ｍｌの濃度でそれぞれ処理した後、３７°Ｃで２４時間培養した。その後、スクレーパで細胞を集め、集めた細胞を、盛り込まれていた培地と共に１０００ｒｐｍで遠心分離して上層液を捨てた後、２ｍのコールドＰＢＳで２回洗浄した。これに５０ｍＭのトリスｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％のアジ化ナトリウム、０．２％のＳＤＳ、ＰＭＳＦ（Ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ）１００μｇ／ｍｌ、アプロチニン５０μｌ／ｍｌ、Ｉｇａｐｅｌ６３０（またはＮＰ−４０）１％、ＮａＦ１００ｍＭ、デオキシコール酸ナトリウム０．５％、ＥＤＴＡ（Ｅｔｈｙｌｎｅｄｉａｍｉｎｅｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ−−Ｓｉｇｍａ Ｅ−４８８４）０．５ｍＭ、ＥＧＴＡ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ−ｂｉｓ（β−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌｅｔｈｅｒ）Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−四酢酸−−ｓｉｇｍａ Ｅ−４３７８）０．１ｍＭで組成されたライシスバッファ（Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ）を５０〜１００μｌを加えてよく混合した（ｖｏｒｔｅｘ）後、４°Ｃで２時間溶解した。反応の終了後、試料を１.５ｍｌのチューブに入れて３０秒間ボルテックスし、４°Ｃで２３，０００ｇで１時間遠心分離し、遠心分離した上澄液のみを得る。最終抽出物のタンパク質量は、バイオラッド・プロテイン・アッサイ・キット（Ｂｉｏ−ｒａｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ）を使用して測定する。定量になったタンパク質にライシスバッファと５Ｘサンプルバッファを混ぜてタンパク質の量を同一にした後、１００°Ｃのヒートブロックで５分間沸騰した後、しばらくの間遠心分離して試料を集める。分離ゲル（Ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ ｇｅｌ）（１２．５％）と濃縮ゲル（Ｓｔａｃｋｉｎｇ ｇｅｌ）（５％）を作った後、電気泳動をしてトランスファーした。トランスファーが終了したゲルは、染色液（ｓｔａｉｎｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｓｏｌｎ．）溶液に１０分浸漬してから脱染色溶液に移し、残ったタンパク質を確認した。また、トランスファーされたメンブレンは、ＴＢＳ―Ｔ溶液で洗浄した後、少しだけ水分を除去し、ＴＢＳ−Ｔ溶液で希釈した約５％のスキムミルク（ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ）で約２時間ブロッキングした後、ＴＢＳ―Ｔ溶液で複数回洗浄する。１次抗体（Ｂａｘ、Ｂｃｌ−２、Ｃｌｅａｖｅｄ ｃａｓｐａｓｅ−３；ｃｅｌｌｓｉｇｎａｌｉｎｇ）及び２次抗体（Ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ）と反応させ、ＥＣＬ溶液に約１分間反応させた後、フィルムをカセットに載せて撮影した後、現像して観察した。
【００９１】
Ｈ４６０細胞にＩＳ４を処理した結果、Ｃｌｅａｖｅｄ ｃａｓｐａｓｅ−３の発現は、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌで増加する傾向を示したが、１００μｇ／ｍｌでは少し減少する傾向を示した。これは、過度に高い濃度の試料が処理され、毒性を示したものと考えられる。ＩＳ４を処理した群でｂｃｌ−２の発現が少し増加し、ｂａｘの発現は減少した（図８）。
【００９２】
これを通して、本発明の組成物の主な有効成分である卵胆礬は、癌細胞でカスパーゼ３タンパク質を活性化させることによってアポトーシスを誘導することを確認することができ、ｂａｘ／ｂｃｌ−２経路でない他の経路を通してカスパーゼ３タンパク質を活性化させてアポトーシスを誘発することが分かった。
【００９３】
（実施例７．抗癌効果確認）
ヒト由来肺癌細胞であるＮＣＩ−Ｈ４６０をヌードマウスの前肢に皮下移植し、一定の大きさまで固形癌を形成した後、Ｉｎ ｖｉｖｏ試験で人体由来肺癌細胞株に対する細胞殺害能力が最も良く表れた卵緑礬（ＩＳ４）を４週間経口投与し、卵緑礬の抗癌効果に対する研究を行った。すなわち、抗癌効果検索は、一週間に２回デジタルキャリパーを使用して固形癌の大きさを測定し、体重と共に経時的な変化を確認し、最終測定日には固形癌の成長抑制率を計算して比較した。試験終了日には、摘出した固形癌の重さと体積測定器（ｐｌｅｔｈｙｓｍｏｍｅｔｅｒ）を用いて固形癌の実体積を測定し、試験期間中に日々の症状観察を通して固形癌の中心怪死が表れる個体と、それぞれの固形癌大きさの測定結果で固形癌の体積が１５００ｍｍ３以上になる個体とを確認し、これら二つの条件のうち一つの条件に該当する個体を死亡個体と見なし、各群ごとに平均生存日を求め、試験終了後、陽性対照群に対比して生存増加率（％）を計算した。試験終了後、剖検時には肉眼的に内部臓器の異常有無を確認した後、採血を実施して血中ＡＬＰ、ＣＲＥ、ＢＵＮ、ＴＧ、ＡＬＴ、ＡＳＴ、Ｃａレベル、ＧＬＵ、総コレステロールを分析し、臓器（心臓、脾臓、睾丸）を摘出し、臓器の重さを測定した。
【００９４】
（＜７−１＞材料及び方法）
１．移植癌細胞準備
移植するヒト肺癌（Ｈｕｍａｎ ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）（ＮＣＩ−Ｈ４６０）セルは、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１０％のヒーティングされたウシ胎仔血清（ｆｅｔａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ）が入っているＲＰＭＩ―１６４０（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を２６０ｍｌのティッシュフラスコ（ｔｉｓｓｕｅ ｆｌａｓｋｓ）に盛り込み、９５％のＣＯ２、３７°Ｃのインキューベータ（ＭＣＯ−２０ＡＩＣ、Ｓａｎｙｏ）で培養した。セルが癒着されると、ＨＢＳＳ（Ｈａｎｋｓ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）で２回洗浄し、０．２％のＨＢＳＳ内のトリプシンで洗浄して使用した。
【００９５】
２．検疫及び順化
実験動物の入手時、全ての動物の一般健康状態に対する獣医学的検疫を実施した。試験を実施するのに相応しくかつ健康な動物を選抜し、環境に適応させるために１週間の順化期間を経た。
【００９６】
３．群分離
順化期間を経た後、健康な継代群の皮下に腫瘍塊を移植し、培養した腫瘍塊を摘出し、表面に分布した血管と脂肪層を除去した後、新鮮な腫瘍組織のみを選別して無処置動物の皮下に移植した。移植後、個別腫瘍の体積が１００ｍｍ３に達すると、体重と腫瘍大きさを測定し、無作為法で群分離した。
【００９７】
４.個体識別
飼育箱には、試験類型、試験番号、試験物質、群番号、個体番号、性別、投与量、実験期間及び試験責任者を記載した個体識別カードを付着した。個体識別は、テールマーキング（ｔａｉｌ ｍａｒｋｉｎｇ）法を使用して行った。処理群及び投与用量を下記の表６に示した。
【００９８】
【表６】
【００９９】
５．投与方法
試験物質を生理食塩水に溶かし、ゾンデ（ｚｏｎｄｅ）を使用して４週間１日１回強制に経口投与した。
【０１００】
６．評価方法
１）体重測定
試験期間中の体重変化を観察するために、試験開始後、７日ごとに体重を測定した。
【０１０１】
２）腫瘍含有モデル製作
１×１０７セル／ヌードマウス／１００μｌを注入して腫瘍株を獲得した後、継代群に継代した。３回にわたった反復継代で元の固形癌の性質を回復した腫瘍塊を得た後、この腫瘍塊を５匹の継代群に移植した。
【０１０２】
腫瘍の中心怪死（ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｃｒｏｓｉｓ）が生じる前に十分な血液供給で急速に育つ段階の腫瘍を含有した動物を犠牲させ、主に急速な分裂が起きる外郭部位を一定の大きさ（３×３×３ｍｍ）に切って腫瘍切片を作った。套管針の端に腫瘍片を載せ、動物の左側後肢の前側方を約４ｍｍ切除し、ここを通して準備した套管針を挿入し、左側前肢の後方の体幹側面部に端が達するようにした。套管針を軽くかつ迅速に３６０度回転させながら抜き、腫瘍片を目標位置に位置させ、切除部位は消毒した。肌の上を触って腫瘍片の位置を確認し、１週間に２回以上成長を観察した。移植後、体積が１００ｍｍ３に達したものに群分離した後、試験物質を投与した。
【０１０３】
３）抗癌試験（平均腫瘍容積、ｍｅａｎ ｔｕｍｏｒ ｖｏｌｕｍｅ）
１週間に２回ずつキャリパー（ｃａｌｉｐｅｒｓ）で腫瘍の長・短軸を測定し、体重を測定した。最初に薬物を投与してから２８日が経過すると、実験を終了し、実験資料を整理して試験物質による固形癌抑制効果を判定した。経時的な固形癌の体積及び抑制率の計算は、下記の公式を用いて換算した。
【０１０４】
Ｖ（ｍｅａｎ ｔｕｍｏｒ ｖｏｌｕｍｅ）＝（Ａ×Ｂ２）／２（Ａ＝長軸長さ、Ｂ＝短縮長さ）
【０１０５】
ＩＲ（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒａｔｅ）＝［ＣＶ−ＴＶ／ＴＶ］×１００
（ＣＶ＝対照群の腫瘍容積、ＴＶ＝処置群の腫瘍容積）
【０１０６】
４）平均生存時間と寿命のパーセント増加（％ＩＬＳ）
試験期間中に各試験群の日々の症状観察を通して固形癌の中心怪死が表れる個体と固形癌大きさの測定日の結果から、固形癌の体積が１５００ｍｍ３以上になる個体を確認し、二つの条件のうち一つに該当する個体を死亡個体と見なし、生存増加率を下記の公式のように計算した。
【０１０７】
％ＩＬＳ＝［（Ｔ−Ｃ）／Ｃ］×１００、
（ここで、ＣとＴは、対照群と処置群のマウスの平均生存日）
【０１０８】
７．血中脂質値検査と一般血液検査
剖検時に腹帯動脈を通して採血して血清を獲得し、血液生化学自動分析機（ＨＩＴＡＣＨＩ、Ｔｏｋｙｏ、ＪＡＰＡＮ）を用いてＡＬＰ（ａｌａｎｉｎｅ ｐｈｏｐｓｐｈａｔａｓｅ）、ＣＲＥ（ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ）、Ｃａ、ＧＬＵ（ｇｌｕｃｏｓｅ）、ＡＬＴ（ａｌａｎｉｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ＡＳＴ．ＵＮを分析した。
【０１０９】
８．病理組織学的検査
試験終了時、放血致死させた後、肝、腎臓、脾臓を摘出して重量を測定し、肉眼的な所見を観察した。組織を１０％の中性ホルマリン液に固定した後、パラフィン包埋過程を経て４μｍ厚さの組織切片を製作した後、ヘマトキシリン＆エオシンで染色し、光学顕微鏡で観察した。
【０１１０】
９．統計学的分析
各実験結果に対して分散の同質性を比較するためのリーベン検定（Ｌｅｖｅｎｅ′ｓ ｔｅｓｔ）を実施し、分散が同質性を有する場合、ＡＮＯＶＡ（ｏｎｅ−ｗａｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖａｒｉａｎｃｅ）を実施し、有意性が観察されると、対照群との有意差がある試験群を調査するためにＤｕｎｎｅｔｔ′ｓ ｔ−ｔｅｓｔを実施した（ｐ＜０．０５またはｐ＜０．０１）。
【０１１１】
（＜７−２＞結果及び考察）
１．体重変化
本実験期間中における体重の変化と飼料及び飲水摂取量の変化において、ＮＣＩ−Ｈ４６０セル単独群よりはＩＳ４の投与群で投与初期体重と飼料の摂取量が減少したが、１週後からは正常に回復した（図９、図１０、図１１）。試験期間中に群間の留意すべき事項は表れなかった。
【０１１２】
２．腫瘍（固形癌）の体積変化
試験期間中の固形癌の体積を一週間に２回キャリパーを使用して測定した結果を見ると、ＮＣＩ−Ｈ４６０セル単独群よりは、ＩＳ４ ４５、９０ｍｇ／ｋｇ投与群で腫瘍容積が濃度依存的に抑制された（図１２）。各群の経時的変化を見ると、ＩＳ４投与後、約１２日後からＮＣＩ−Ｈ４６０腫瘍成長を抑制し、１５日後からはＮＣＩ−Ｈ４６０セル単独群に比べて固形癌成長抑制の傾向を示した。固形癌抑制傾向を数値的に見ると、試験後半日である２２日で、ＮＣＩ−Ｈ４６０セル単独群２８０６．４７ｍｍ３に比べてＩＳ ４ ４５ｍｇ／ｋｇ群は２２２１.７４ｍｍ３、ＩＳ４ ４５ ９０ｍｇ／ｋｇ群は１５１７.０７ｍｍ３に表れた。
【０１１３】
３．腫瘍（固形癌）体積抑制率測定
前記の測定した固形癌の体積を、ＮＣＩ−Ｈ４６０セル単独群の固形癌体積の１００％を基準にした成長抑制率分析結果で見ると、試験物質投与群で８日後から２５日まで用量依存的な抑制傾向が表れた。（ＩＳ４ ４５ｍｇ／ｋｇ Ｉ．Ｒ ８２.４７％＜ＩＳ４ ９０ｍｇ／ｋｇ Ｉ．Ｒ ５９.９９％ ａt ２２ｄａｙ）ＩＳ４ ９０ｍｇ／ｋｇ投与群では、投与２２日後に固形癌成長抑制率が減少したことに表れた（表７）。
【０１１４】
【表７】
【０１１５】
４.腫瘍（固形癌）の重さ及び体積測定
【０１１６】
試験終了日に摘出した固形癌の重さ及び体積変動記録（ｐｌｅｔｈｙｓｍｏｍｅｔｅｒ）による体積測定結果を見ると、陽性対照群であるＮＣＩ−Ｈ４６０セル単独の固形癌の重さ及び体積２．５２±０．７５ｇと４．６７±１．１８ｃｍ３に比べて、ＩＳ４ ４５ｍｇ／ｋｇ群では２．２４±０．７８ｇ、４．０３±１．２８ｃｍ３に減少し、ＩＳ４ ９０ｍｇ／ｋｇ群では２．１７±０．６０ｇ、３．７９±０．８５ｃｍ３に有意性のある減少（ｐ＜０．０５）を示した（表８）。
【０１１７】
【表８】
【０１１８】
５．平均生存時間及び生存率増加量測定
試験期間中に各試験群の日々の症状観察を通して固形癌の中心怪死が表れる個体と、固形大きさ測定日の結果で固形癌の体積が１５００ｍｍ３以上になる個体とを確認し、二つの条件に該当する個体を死亡個体と見なして得た結果で平均生存時間を計算してみると、陽性対照群であるＮＣＩ−Ｈ４６０セル単独群では１８．２９±３．５９日で、ＩＳ４ ４５ｍｇ／ｋｇ投与群では２０．７１±２．６１日として生存率が１０．６８％増加した。また、ＩＳ４ ９０ｍｇ／ｋｇ投与群では２２．３３±２．４４日として生存率が２２．０８％増加した（表９、図１３）。
【０１１９】
【表９】
【０１２０】
６．組織病理学的観察（光学顕微鏡）及び臓器重さ測定
剖検時における臓器重さ変化確認でＩＳ４投与群（４５ｍｇ／ｋｇ）間の相対重量がＮＣＩ−Ｈ４６０セル単独群に比べて有意性のある減少（ｐ＜０．０１）を示したことを除いては、他の臓器重さで留意すべき変化は表れなかった。詳細な結果を見ると、剖検時における肝の臓器重さは、ＮＣＩ−Ｈ４６０セル単独群の１．７６±０．０７ｇに比べて、ＩＳ４４５ｍｇ／ｋｇ群では１．５４±０．０７ｇとして有意性のある減少（ｐ＜０．０１）を示した。しかし、ＩＳ４ ９０ｍｇ／ｋｇ群では１．６９±０．１０ｇに減少する傾向があるが、有意性は表れなかった（表１０）。組織病理学的にも、群間の留意すべき所見は表れなかった（図１４）。
【０１２１】
【表１０】
【０１２２】
７．血液生化学的分析
剖検時における血液生化学分析結果を見ると、血中ＡＬＰ、ＣＡ、ＣＲＥ、ＡＬＴ、ＡＳＴ数値では試験物質投与による留意すべき差は表れなかった（表１１）。
【０１２３】
一方、血中ＵＮ数値で、全ての試験物質投与群で有意性のある減少結果が表れた（ＩＳ４ ４５ｍｇ／ｋｇ、ＩＳ４ ９０ｍｇ／ｋｇ、ｐ＜０．０１）。また、ＩＳ４ ４５ｍｇ／ｋｇ群のＰＨＯＳ数値は、７．７９±０.８２mg／dlとしてＮＣＩ−Ｈ４６０セル単独群の９．２７±０．９９ｍｇ／ｄｌに比べて有意性のある減少を示した。（ＩＳ４ ４５ｍｇ／ｋｇ群、ｐ＜０．０５）
【０１２４】
【表１１】
【０１２５】
（実施例８．治療事例）
卵胆礬粉末と竹塩粉末を１：２０の重量比で混合して卵胆礬竹塩を製造した後、カプセルに卵胆礬竹塩の混合粉末を０．５ｇずつ入れて患者に提供し、１個ずつ唾で飲み込んだり、食水で飲み込む方法で一日１０個〜２０個ずつ服用するようにした（日々の投与量は、成人を基準にして総量５ｇ〜１０ｇ、または体重１０ｋｇ当たりカプセル１〜３個）。患者は、前記投与量を１〜２時間の間隔で２〜１０回に分けて服用し、場合によって、卵胆礬竹塩の他に通常の気力補強のための湯薬及び舎利醤油を共に服用した。
【０１２６】
（＜８−１＞事例１．子宮頚部異型細胞症治療）
名前：コ・＊＊、年齢：３５歳、性別：女、子宮頚部異型細胞症、結核薬を２年間服用し、Ｂ型肝炎保菌状態で３ヶ月間湯薬、卵胆礬竹塩及び舎利醤油を服用し、卵胆礬竹塩水を子宮に注入する治療を施行した。検査の結果、細胞がほぼ正常になっており、核のみが未だに少しだけ大きくなっている状態との診断を受けた後、服用中断による再発、再治療（湯薬と卵胆礬竹塩服用及び卵胆礬竹塩注入）後、１ヶ月ぶりに正常に完治した。
【０１２７】
（＜８−２＞事例２．大膓癌、肺癌、骨癌治療）
名前：ゾン・＊＊、年齢：５７歳、性別：男、大膓癌、肺癌、骨癌（頚椎癌）状態で、大膓癌、肺癌転移手術（当時、排尿問題で検査したとき、膀胱には異常がなかったが、神経を押すため膀胱の一部を少しだけ切除）後、脊椎に再発し、転移、頚椎癌、９回の脊椎癌細胞増殖によって脊椎が破壊され、肋骨神経を押すため痛みが激しい。抗癌治療を６回再び受けたが、結果は少しもよくならず、癌細胞がそのままの状態で治療可能性がなく、鎮痛剤で一日一日堪えながら抗癌さえも受けられない状況で、５ヶ月間湯薬、卵胆礬竹塩及び舎利醤油を服用した。その後、病院で検査した結果、完治という判定を受けた。
【０１２８】
（＜８−３＞事例３．甲状腺癌治療）
名前：キム・＊＊、年齢：４６歳、性別：男、１２年前に急性肝炎で治療を受けた病歴があり、現在肝に石灰化現象があるが、甲状腺癌診断を受けた後、病院での抗癌治療なしに、湯薬、卵胆礬竹塩及び舎利醤油を服用した。服用してから一ヶ月ぶりにＣＴ撮影をした結果、５．１ｍｍであった癌細胞が４．６ｍｍに減少した。服用してから６ヶ月後に完治した。
（産業上の利用可能性）
【０１２９】
本発明に係る卵胆礬を有効成分として含む組成物は、胆礬の毒性が除去され、薬物学的活性が最大化された状態で製造され、抗癌活性に優れているので、癌の予防及び治療用薬学製剤または健康機能食品製造に有用に用いることができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、卵胆礬を含む癌予防及び治療用組成物に関するもので、より詳細には、胆礬を卵白に混合して製造される毒性が除去された卵胆礬を単独で、または竹塩との混合物として含む癌予防治療用組成物、及びその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
癌とは、主に統制されない細胞の増殖から始まり、周囲の正常組織または器管に浸潤してこれらを破壊し、新しい成長場所を作ることができ、個体の生命を奪うことのできる疾患群を総称する。過去の約１０年間癌を克服するために、細胞周期や細胞死滅の調節と、発癌遺伝子や癌抑制遺伝子を含む新しい標的の模索において著しい発展を遂げてきたにもかかわらず、癌の発生率は文明の発達とともに増加している。
【０００３】
現在、癌患者のための治療法は、外科的手術、放射線治療、約４０種類の強い細胞毒性を示す抗癌物質投与による化学療法に依存しているが、これら治療法も、ほとんどが早期癌患者や特定癌のみに限定されており、癌による死亡は継続的に増加している。
【０００４】
また、抗癌剤のほとんどが強い毒性を示す化学的製剤であるので、毒性の少ない抗癌剤、特に天産物由来の抗癌剤が持続的に開発されている。
【０００５】
胆礬は、硫酸銅からなる硫酸塩鉱物の一種であって、主成分としてＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏを含有しているが、天然鉱物であるため、その他に微量の天然ミネラルが混合されている青色の結晶である。胆礬は、三斜晶系に属し、ガラス光沢があり、半透明な青色を帯びており、吐剤、殺虫剤、顔料、媒染剤及び電解液などに使用されるものと知られている。胆礬は、鉱物性生薬であるため毒性の憂いがあり、実際に薬用に用いるには限界があった。そのため、胆礬の抗癌剤への用途については全く知られていない。
【０００６】
竹塩は、仁山金一勳（１９０９〜１９９２）先生の発明品であって、竹と塩を合成してなるもので、これは、新しい細胞を生成させる作用をする竹と、殺菌及び腐敗を防止する塩とを炉で高熱で複数回繰り返して処理することによって、これらが持つ毒素を除去し、薬効を最大限に増進させた秘薬として知られている。
【０００７】
竹塩は、人体の根源である胃腸を丈夫にし、炎症疾患の原因を治療する薬理作用があるだけでなく、血をきれいにする清血作用をし、体内に積もった老廃物除去及び解毒作用をするようになり、酸性体質を弱アルカリ性体質に変える効能を有する。また、竹塩は、一般の塩に比べて抗炎症作用及び細菌に対する殺菌力が３〜４倍以上強く、殺菌作用を通して人体内で解熱作用をするものと知られている。
【０００８】
本発明者は、胆礬の毒性を卵白で中和させた卵胆礬が癌細胞のアポトーシスを誘導し、癌細胞の増殖を抑制することによって、天然抗癌剤として用いる可能性があることを確認し、卵胆礬を単独または竹塩との混合物として含む組成物が抗癌剤として広範囲に利用できることを確認した結果、本発明を完成するに至った。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】仁山金一勳「宇宙と神薬（１９８０年）」
【非特許文献２】仁山金一勳「神薬（１９８６年）」
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、卵胆礬を有効成分として含む癌予防及び治療用組成物を提供することにある。
【００１１】
本発明の更に他の目的は、卵胆礬を有効成分として含む癌予防及び改善用健康機能食品を提供することにある。
【００１２】
本発明の更に他の目的は、（ａ）天然鉱物性生薬である胆礬を全量が灰色または褐色に変わるまで加熱して脱水させる段階；（ｂ）脱水された胆礬を冷やした後、粉末化する段階；及び（ｃ）前記段階（ｂ）の胆礬粉末を卵白に混合する段階を含む、卵胆礬の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
一つの様態として、本発明は、卵胆礬を有効成分として含む癌予防及び治療用組成物に関するものである。
【００１４】
本発明において、「卵胆礬」は、卵の卵白と胆礬が混合されたものを意味し、胆礬（ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏを主成分とする天然鉱物）を焼いて脱水・粉末化した後、卵の卵白を混合して反応させることによって製造することが好ましい。このように製造された卵胆礬は、胆礬特有の毒性が卵白によって中和され、毒性が減少及び除去され、薬性は増強される。
【００１５】
また、本発明の前記組成物は、竹塩をさらに含むことができる。
【００１６】
本発明に用いられる竹塩は、市販のものを使用したり、直接製造することができる。このとき、竹塩は、竹塩発明家である仁山金一勳先生の冊子「宇宙と神薬（１９８０年）」と「神薬（１９８６年）」に記載された製造法の通りに、西海岸の天日塩を王竹の竹筒に入れ、黄土で入口を封じた後、鉄釜にきちんと積み上げ、松の薪の火にくべて焼き、このように王竹の竹筒を焼いて残った塩の柱を粉に粉砕する。その後、これを再び新しい王竹の竹筒に入れ、黄土で入口を封じた後、鉄釜で松の薪を用いて８回焼き上げた後、最後の９回目ではまつやにを添加し、火力を高めながら塩を溶かし落とした仁山先生の正統９回溶融竹塩製造法に充実した竹塩を使用することが好ましいが、これに制限されることはない。
【００１７】
本発明の組成物に含まれる卵胆礬及び竹塩は、粉末状であることが好ましい。また、本発明の組成物が卵胆礬及び竹塩を全て含む場合、粉末状の卵胆礬及び竹塩は、１：９９〜９９：１重量比の多様な比率で混合して含むことができ、好ましくは１：５〜１：５０の重量比で含み、最も好ましくは１：５、１：１０、１：１５、１：２５及び１：３０の重量比で含む。
【００１８】
前記組成物が経口用製剤として用いられる場合、竹塩粉末が卵胆礬粉末と同一であるか、それより高い含量で含まれることが好ましく、幼いか、体力が弱いか、老衰・病弱なときは竹塩の比率を高め、体力が比較的良好なときは卵胆礬の比率を漸次高めてもよく、卵胆礬と竹塩の比率が約１：１０及び１：５になったときにも服用が可能である。
【００１９】
また、前記組成物を体に塗ったり、洗浄またはスプレーする用途の塗布用製剤として用いたり、かん腸用に用いる場合は、卵胆礬の比率が高くても構わなく、卵胆礬の単独使用も可能である。
【００２０】
本発明の卵胆礬を含む組成物は、カスパーゼ３（ｃａｓｐａｓｅ３）の活性増進を通した癌抑制能を有する。
【００２１】
本発明の具体的な実施例において、卵胆礬をＨｅｐＧ２（肝癌細胞）、ＳＷ４８０（大膓癌細胞）、ＭＣＦ−７（乳房癌細胞）及びＮＣＩ−Ｈ４６０（肺癌細胞）に処理した場合、濃度依存的に癌細胞の増殖が抑制されることを確認した。また、肝癌細胞及び肺癌細胞に卵胆礬を処理した場合、アポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ、細胞死滅）が誘導され、核分節と染色質凝縮が生じることを確認した。また、本発明の卵胆礬組成物が持つ癌細胞増殖抑制能をタンパク質水準で観察した結果、カスパーゼ３タンパク質を活性化させることによって、細胞死滅を誘導し、癌細胞の増殖を抑制することを確認した。
【００２２】
本発明の卵胆礬組成物は、癌の予防及び治療用途に用いることができる。本発明において、「予防」とは、組成物の投与によって疾患の形成を抑制したり、発病を遅延させる全ての行為を意味し、「治療」とは、組成物の投与によって前記疾患の症状が好転したり、有利に変更される全ての行為を意味する。
【００２３】
前記本発明の組成物は、ほとんどの癌に適用可能であり、例えば、肝癌、乳房癌、肺癌、大膓癌、胃癌、膵膓癌、子宮癌、前立腺癌、骨癌、神経膠腫及び白血病などに適用可能であり、このうち肝癌、大膓癌、乳房癌及び肺癌に適用されることが好ましいが、これに制限されることはない。
【００２４】
本発明の卵胆礬を有効成分として含む組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含み、薬学的組成物として用いることができ、担体と共に製剤化することができる。また、本発明の前記組成物は、単一剤として使用したり、薬効を増強できる他の有効成分と共に複合剤として使用することができる。
【００２５】
本発明の用語である「薬学的に許容可能な担体」とは、生物体を刺激せず、投与化合物の生物学的活性及び特性を阻害しない担体または希釈剤をいう。液状溶液に製剤化される組成物において許容される薬剤学的担体としては、生体に適切なものとして、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール及びこれら成分のうち１成分以上を混合して使用することができ、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、静菌剤などの他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑剤をさらに添加し、水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。
【００２６】
本発明の前記組成物は、これを有効成分として含むいかなる剤形にも適用可能であり、経口用または非経口用剤形に製造することができる。本発明の薬学的剤形は、口腔、直腸、鼻腔、局所、皮下、膣または非経口（筋肉内、皮下及び静脈内を含む。）投与に適した形態、または吸入や注入による投与に適した形態を含む。
【００２７】
本発明の組成物を含む経口投与用剤形としては、例えば、錠剤、トローチ剤、水溶性または油性懸濁液、調剤粉末または顆粒、エマルジョン、ハードまたはソフトカプセル、シロップまたはエリキシル剤に製剤化することができる。錠剤及びカプセルなどの剤形に製剤化するために、ラクトース、サッカロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アミロペクチン、セルロースまたはゼラチンなどの結合剤、リン酸二カルシウムなどの賦形剤、トウモロコシ澱粉またはサツマイモ澱粉などの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、フマル酸ステアリルナトリウムまたはポリエチレングリコールワックスなどの潤滑油を含むことができ、カプセル剤形の場合、前記言及した物質の他にも脂肪油などの液体担体をさらに含有することができる。
【００２８】
本発明の組成物を含む非経口投与用剤形は、皮下注射、静脈注射または筋肉内注射などの注射用形態、坐剤注入方式または呼吸器を通して吸入可能にするエアロゾル剤などのスプレー用に製剤化することができる。注射用剤形に製剤化するためには、本発明の組成物を安定剤または緩衝剤と共に水で混合して溶液または懸濁液に製造し、これをアンプルまたはバイアルの単位投与用に製剤化することができる。坐剤として注入するためには、ココアバターまたは他のグリセリドなどの通常の坐薬ベースを含む坐薬またはかん腸剤などの直腸投与用組成物に製剤化することができる。エアロゾル剤などのスプレー用に剤形化する場合、水が分散された濃縮物または湿潤粉末が分散されるように、推進剤などを添加剤と共に配合することができる。
【００２９】
更に他の様態として、本発明は、前記卵胆礬組成物を用いて癌を予防及び治療する方法に関するものである。
【００３０】
本発明において、前記疾患の治療は、卵胆礬を含む薬学的組成物を投与する段階を含むことができる。本発明の用語である「投与」は、何らかの適切な方法で患者に本発明の薬学的組成物を導入することを意味する。
【００３１】
本発明の組成物は、目的組織に到逹できる一つの経口または非経口の多様な経路を通して投与することができ、具体的には、口腔、直腸、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、経皮、鼻腔内、吸入、眼球内または皮内経路を通して通常の方式で投与することができるが、このうち、経口投与または経皮塗布によって投与することが好ましい。
【００３２】
本発明の治療方法は、本発明の組成物を薬学的有効量で投与することを含む。適切な総１日投与量は、正しい医学的判断範囲内で処置医によって決定可能であることは当業者にとって自明である。特定患者に対する具体的な治療的有効量は、達成しようとする反応の種類と程度、場合によって他の製剤が使用されるか否か、具体的組成物、患者の年齢、体重、一般の健康状態、性別及び食餌、投与時間、投与経路及び組成物の分泌率、治療期間、具体的組成物と共にまたは同時に使用される薬物を含めた多様な因子と医薬分野でよく知られた類似因子に従って異なるように適用することが好ましい。したがって、本発明の目的に符合した薬学的組成物の１日有効投与量は、上述した事項を考慮して決定することが好ましく、最も好ましくは、卵胆礬粉末の重量を基準にして服用時に約０．１ｇ〜３０ｇであって、かん腸や皮膚などへの外用剤としての使用量には制限がない。
【００３３】
また、本発明の治療方法は、癌が発生可能な任意の動物に適用可能であり、動物は、人間及び霊長類のみならず、牛、豚、羊、馬、犬及び猫などの家畜を含む。
【００３４】
特に、本発明の組成物を経口投与する方法としては、水や、生姜及び甘草を混合して煎じた水で飲み込む方法、楡根皮水などで飲み込む方法、唾で飲み込む方法が可能である。また、摂取方法は、そのまま食べる方法の他に、カプセルに入れて前記多様な方法で服用する方法もあるが、カプセルを唾で飲み込む方法は、水や飲料水で飲み込む方法よりも効果的であり、食物や飲料水に少量だけ混合して食べることもできる。例えば、お粥や焼いたニンニクなどに前記混合物を添加して食べる方法もあり、竹塩醤油に卵胆礬粉末を混合して服用する方法もある。
【００３５】
本発明の具体的実施例において、本発明の卵胆礬を竹塩と共に癌患者に服用させ、抗癌効果を観察した結果、大膓癌、肺癌、骨癌、子宮頚部異型細胞症、甲状腺癌などに治療効能があることを確認した。
【００３６】
更に他の様態として、本発明は、卵胆礬を有効成分として含む癌予防及び改善用健康機能食品に関するものである。
【００３７】
本発明の前記健康機能食品は、卵胆礬と共に竹塩をさらに含んで提供することができる。
【００３８】
本発明の組成物は、食品学的に許容可能な食品添加剤をさらに含んで製剤化することができ、癌予防及び治療用健康機能食品に用いることができる。本発明の健康機能食品は、錠剤、カプセル剤、丸剤、液剤などの形態を含む。
【００３９】
本発明の組成物を添加できる食品としては、例えば、各種食品類、飲料水、ガム、お茶、ビタミン複合剤、健康機能性食品類などがある。
【００４０】
本発明で定義される「健康機能食品」は、人体に有用な機能性を有する原料や成分を使用して製造及び加工した食品を意味し、「機能性」とは、人体の構造及び機能に対して栄養素を調節したり、生理学的作用などのような保健用途に有用な効果を得る目的で摂取することを意味する。
【００４１】
本発明の組成物は、癌を予防または改善するための目的で食品または飲み物に添加できるが、このとき、前記組成物は、食品または飲料水中に、全体の食品重量の０．０１〜１０重量％で添加することができ、例えば、健康飲料組成物は、全ての組成物１００を基準にして０．０１〜５ｇ、好ましくは、０．５〜１ｇの比率で添加することができる。
【００４２】
更に他の様態として、本発明は、（ａ）天然鉱物性生薬である胆礬を全量が灰色または褐色に変わるまで加熱して脱水させる段階；（ｂ）脱水された胆礬を冷やした後、粉末化する段階；及び（ｃ）前記段階（ｂ）の胆礬粉末を卵白に混合する段階を含む、卵胆礬の製造方法に関するものである。
【００４３】
以下、本発明の卵胆礬の製造方法を段階別に説明する。
【００４４】
段階（ａ）は、胆礬（ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏを含む天然鉱物）を加熱して脱水させる段階である。胆礬を加熱する方法としては、当業界で公知となった通常の加熱方法を用いることができ、好ましくは、釜に入れ、ガスの火、薪の火または炭火で焼く方法で加熱することができる。加熱時には３〜５時間の間隔で色が変わることを観察しながら上下に混合し、熱を均一に加えるとよい。加熱時間は１回の使用量によって調整可能であるが、約１０〜２４時間加熱することが適切であって、胆礬の全量の色が灰色または褐色に変わり、脱水塩状態になるまで加熱することが好ましい。
【００４５】
段階（ｂ）は、段階（ａ）で加熱して脱水された胆礬を冷やした後、粉末化する段階である。加熱して脱水された胆礬は、熱が完全に抜け出るまで冷やさなければならなく、このとき、胆礬の水分含量は約０％〜５％であることが好ましい。脱水された胆礬を完全に冷やした後、これをきれいに粉砕して粉末化し、粉末化した胆礬は、湿気が吸収されないようにビニール袋や密閉容器に入れて乾燥した場所に保管することが好ましい。
【００４６】
段階（ｃ）は、前記段階（ｂ）の胆礬粉末を卵白に混合し、胆礬と卵白を反応させることによって胆礬の毒性を減少及び除去し、薬性は増強させる段階である。
【００４７】
卵は、卵黄と卵白に分離して卵白のみを用い、地元産のものを使用することが好ましく、より好ましくは烏骨鶏卵を使用する。前記段階（ｂ）で準備された脱水状態の胆礬粉末に卵白を混合するが、このとき、胆礬粉末６００ｇ当たり卵７〜２０個の卵白（１４０〜４００ｇ）を混合することが好ましく、より好ましくは３００ｇを混合する。混合時には状態を観察しながら卵白の量を調節し、木べらのように反応性がほとんどない道具を用いて混ぜるとよい。また、化学反応が生じない容器、例えば、土器、陶磁器、麦飯石容器を使用して混合することが好ましい。混合過程で反応熱による高い熱が発生するので、注意を要する。
【００４８】
また、混合時に卵白の量が過度に少ないと、脱水された胆礬粉末の毒性を充分に中和させることが難しく、その一方、卵白の量が過度に多いと、混合時に反応熱が微弱になるか、発生しなくなり、十分な混合効果を得ることが難しいので、卵白の量を注意して調節しなければならない。前記の混合物を充分に混合させた後、反応時に生じた反応熱が完全に消えるまで熱を冷やすことが好ましい。
【００４９】
また、本発明の前記卵胆礬の製造方法は、段階（ｃ）以後に、（ｄ）前記段階（ｃ）の混合物を冷やした後、粉末化する段階をさらに含むことができる。
【００５０】
段階（ｄ）は、段階（ｃ）の混合物を、熱が完全に抜け出るまで冷やした後、混合物状態の卵胆礬を細かく粉砕して粉末化する段階である。卵胆礬を粉末化することによって、薬学的または食品学的製剤に効率的に用いることができ、卵胆礬の反応性面積が増大し、疾病治療的活性を極大化できるようになる。
【００５１】
このような製造方法を通して製造される卵胆礬は、胆礬の持つ毒性が除去され、薬性は増強され、癌を予防または治療するための薬学的または食品学的組成物として利用できるようになる。
【発明の効果】
【００５２】
本発明の卵胆礬を含む組成物は、胆礬の毒性が除去され、薬物学的活性が最大化された状態で製造され、優れた抗癌活性を示すので、癌の予防及び治療用組成物に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】微生物復帰突然変異試験のための実験過程を概略的に示した図である。
【図２】焼いた胆礬（ＩＳ３）、卵胆礬（ＩＳ４）及び生胆礬（ＩＳ５）をＨｅｐＧ２（肝癌細胞）、ＮＣＩ−Ｈ４６０（肺癌細胞）、ＳＷ４８０（大膓癌細胞）及びＭＣＦ−７（乳房癌細胞）の４つの癌細胞に処理した後、各細胞に対してＭＴＴアッセイ（ａｓｓａｙ）を施行した結果を示す図である。
【図３】焼いた胆礬（ＩＳ３）、卵胆礬（ＩＳ４）及び生胆礬（ＩＳ５）をＨｅｐＧ２（肝癌細胞）、ＮＣＩ−Ｈ４６０（肺癌細胞）、ＳＷ４８０（大膓癌細胞）及びＭＣＦ−７（乳房癌細胞）の４つの癌細胞に処理した後、各細胞に対してＭＴＴアッセイ（ａｓｓａｙ）を施行した結果を示す図である。
【図４】焼いた胆礬（ＩＳ３）、卵胆礬（ＩＳ４）及び生胆礬（ＩＳ５）をＨｅｐＧ２（肝癌細胞）、ＮＣＩ−Ｈ４６０（肺癌細胞）、ＳＷ４８０（大膓癌細胞）及びＭＣＦ−７（乳房癌細胞）の４つの癌細胞に処理した後、各細胞に対してＭＴＴアッセイ（ａｓｓａｙ）を施行した結果を示す図である。
【図５】焼いた胆礬（ＩＳ３）、卵胆礬（ＩＳ４）及び生胆礬（ＩＳ５）をＨｅｐＧ２（肝癌細胞）、ＮＣＩ−Ｈ４６０（肺癌細胞）、ＳＷ４８０（大膓癌細胞）及びＭＣＦ−７（乳房癌細胞）の４つの癌細胞に処理した後、各細胞に対してＭＴＴアッセイ（ａｓｓａｙ）を施行した結果を示す図である。
【図６】ＩＳ３及びＩＳ４をそれぞれ５０μｇ／ｍｌの濃度でＮＣＩ−Ｈ４６０及びＨｅｐＧ２細胞に処理した後、これら細胞をＤＡＰＩ染色した結果を示し、矢印表示は、アポトーシス核（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｎｕｃｌｅｉ）を示す図である。
【図７】ＩＳ３及びＩＳ４をそれぞれ５０μｇ／ｍｌの濃度でＮＣＩ−Ｈ４６０及びＨｅｐＧ２細胞に処理した後、これら細胞をＤＡＰＩ染色した結果を示し、矢印表示は、アポトーシス核（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｎｕｃｌｅｉ）を示す図である。
【図８】卵胆礬（ＩＳ４）を多様な濃度でＮＣＩ−Ｈ４６０細胞に処理した後、これら細胞のタンパク質発現水準を観察するために、ウェスタンブロットを行った結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明する。ただし、下記の実施例は、本発明を例示するものに過ぎなく、本発明の内容が下記の実施例に限定されるのではない。
【００５５】
（実施例１．試験物質（生胆礬、焼いた胆礬及び卵胆礬）製造）
生胆礬を火に焼いて脱水させた胆礬（焼いた胆礬）と卵胆礬を製造し、実験には生胆礬、焼いた胆礬及び卵胆礬を用いた。
【００５６】
まず、焼いた胆礬は、生胆礬を加熱・脱水させて製造し、生胆礬に２４時間熱を加えると、生胆礬が脱水されながら灰色または褐色の光に変わるが、このような脱水塩状態の胆礬を焼いた胆礬と言う。焼いた胆礬が完全に冷えた後、細かく粉砕して粉末化して用意する。
【００５７】
卵胆礬は、焼いた胆礬粉末に卵白を混合して反応させることによって製造するが、焼いた胆礬粉末パウダー６００ｇに地元産の卵１３個の卵白のみを分離して卵白３００ｇと混合し、焼いた胆礬が卵白中の水分と反応して高熱（反応熱）が発生し、緑色に変わりながらパウダーがもつれるようになるが、このような状態を卵胆礬と言う。
【００５８】
このように製造された焼いた胆礬（ＩＳ３）、卵胆礬（ＩＳ４）及び生胆礬（ＩＳ５）をそれぞれの試験物質として使用するために、天秤にそれぞれ１００ｍｇを計り、Ｄ．Ｄ．Ｗに総量を１ｍｌにして溶かす。試験物質が全て溶けた後、６００ｒｐｍで遠心分離し、上澄液を０.８μｍのシリンジフィルタ（ｓｙｒｉｎｇｅ ｆｉｌｔｅｒ）でフィルタリングした（表１）。
【００５９】
【表１】
【００６０】
（実施例２．遺伝毒性検査のための微生物復帰突然変異試験）
【００６１】
焼いた胆礬及び卵胆礬の遺伝毒性程度を調査するために、細胞突然変異原を判別できる微生物復帰突然変異試験を行った。
【００６２】
実験原理は、ヒスチジン要求性菌株として、ヒスチジンがないと生育できない性質を用いたもので、突然変異実験で突然変異原によって生じる元の菌株特性であるヒスチジン利用回復を調査する実験で、無処理群（陰性対照群）に比べて２倍以上の菌数を示したり、試験物質の濃度依存的に菌数が増加する場合に陽性と判定し、突然変異原として確定されるようになる。
【００６３】
微生物復帰突然変異試験を行うために、まず、前培養法として試験標準菌株であるサルモネラ・チフィリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｉｍｕｒｉｕｍ）ＴＡ９８、ＴＡ１００、ＴＡ１５３５、ＴＡ１５３７を対象として実験した。まず、耐性実験を行った後、胆礬に耐性を示す各菌株のうち２個の菌株であるサルモネラ・チフィリウムＴＡ１００、ＴＡ１０２を選択して実験菌株として使用した。サルモネラ・チフィリウムＴＡ１００は、遺伝子のうちグアニン（ｇｕａｎｉｎｅ）とサイトシン（ｃｙｔｏｃｉｎｅ）の復帰に対する試験菌株であって、サルモネラ・チフィリウムＴＡ１０２は、アデニン（ａｄｅｎｉｎｅ）とチミン（Ｔｈｙｍｉｎｅ）の復帰に対する試験菌株である。
【００６４】
細胞に対する抗菌実験で、卵胆礬を５０００μｇ／プレート、焼いた胆礬を２５００μｇ／プレートを使用したとき、菌株に対する生育抑制が表れた。したがって、菌の抑制がない濃度である下記の濃度で遺伝毒性（復帰突然変異）試験を行った（図１）。
【００６５】
処理群としては、卵胆礬の場合、最大濃度を２５００μｇ／プレートにし、１２５０、６２５、３１３、１５６及び７８μｇ／プレートの濃度で使用した。また、焼いた胆礬の場合、最大濃度を１２５０μｇ／プレートにし、６２５，３１３，１５６及び７８μｇ／プレートの濃度で使用した。
【００６６】
陽性対照群としては、アジ化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ａｚｉｄｅ）１μｇ／プレート（サルモネラ・チフィリウムＴＡ１００処理用）及びマイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）Ｃ−１μｇ／プレート（サルモネラ・チフィリウムＴＡ１０２処理用）を使用し、陰性対照群としては蒸留水を使用した。
【００６７】
それぞれの試験物質、陽性対照群化合物、蒸留水をプレートに処理した後、復帰突然変異された菌株の数を測定した。その結果は、次に示す通りである（表２〜表５）。
【００６８】
【表２】
【００６９】
【表３】
【００７０】
【表４】
【００７１】
【表５】
【００７２】
サルモネラ・チフィリウムＴＡ１００の場合、微生物生育抑制を誘発しない最大濃度で卵胆礬及び焼いた胆礬処理群の菌数が陽性対照群に比べて著しく小さく、陰性対照群と比べたときも類似する水準に表れた。また、濃度依存的にコロニー数が増加しなかった。そのため、卵胆礬及び焼いた胆礬は復帰突然変異原でないと判定した。
【００７３】
サルモネラ・チフィリウムＴＡ１０２の場合も、微生物生育抑制を誘発しない最大濃度で、卵胆礬及び焼いた胆礬処理群ではコロニーがほとんど生成されなく、これは、陽性対照群に比べて著しく小さい数であり、陰性対照群と比べたときも類似する水準であった。また、濃度依存的にコロニー数が増加しなかった。そのため、卵胆礬及び焼いた胆礬は復帰突然変異原でないと判定した。
【００７４】
（実施例３．癌細胞培養）
ＮＣＩ−Ｈ４６０（肺癌細胞）は、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌ−グルタミン含有）に１０％のＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び１００Ｕ／ｍｌのストレプトマイシンを入れ、５％のＣＯ２培養器で細胞培養を施行した。
【００７５】
ＳＷ４８０（大膓癌細胞）及びＭＣＦ−７（乳房癌細胞）細胞は、ＮＣＩ−Ｈ４６０（肺癌細胞）と同一の条件で細胞培養を施行した。ＨｅｐＧ２（肝癌細胞）は、ＤＭＥＭ培地（Ｌ−グルタミン含有）に１０％のＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び１００Ｕ／ｍｌのストレプトマイシンを入れ、５％のＣＯ２培養器で細胞培養を施行した。
【００７６】
ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＭＣＦ−７、ＳＷ４８０、ＨｅｐＧ２細胞は、韓国細胞株銀行から分譲を受けて使用した。
【００７７】
（実施例４．ＭＴＴ評価法を通した細胞生存率測定）
焼いた胆礬（ＩＳ３）、卵胆礬（ＩＳ４）及び生胆礬（ＩＳ５）が癌細胞の増殖に及ぼす影響を調査するために、これら物質を多様な濃度で癌細胞に処理し、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）評価法を通した細胞生存率を測定することによって、癌細胞増殖の抑制可否を評価した。
【００７８】
ＨｅｐＧ２（肝癌細胞）、ＳＷ４８０（大膓癌細胞）、ＭＣＦ−７（乳房癌細胞）及びＮＣＩ―Ｈ４６０（肺癌細胞）の４つの癌細胞に対してＭＴＴアッサイを施行した。まず、それぞれの細胞を９６ウェルプレートに１×１０５セル／ｍｌの濃度で１００μｌずつ接種し、３７°Ｃ、５％のＣＯ２培養器で２４時間培養した。その後、各ウェル当たりの試験物質（ＩＳ３、ＩＳ４、ＩＳ５）をそれぞれ１００μｌずつ濃度別に（０、３．１２５、６．２５、１２．５、２５、５０μｇ／ｍｌ）２４時間処理した。
【００７９】
ＭＴＴ（ｔｈｉａｚｏｌｙｌ ｂｌｕｅ、ＳＩＧＭＡ Ｃｏ．）を２ｍｇ／ｍｌの濃度で準備して１５μｌずつ添加し、３時間〜４時間反応させた。各ウェル当たり試験物質１１５μｌを除去し、紫色の物質３０μｌのみを残した後、ＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）を１５０μｌ添加し、マイクロプレート・ミキサー上で１０分間よく混合して沈殿物を溶解させた後、マイクロプレート・リーダで５４０ｎｍの吸光度でＯＤ（ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ）値を測定した。全ての実験結果は、細胞を培養しないウェルで測定された吸光度に対して補正した値を算出した。
【００８０】
全ての試料で濃度が増加するとともに増殖抑制効果が表れたが、そのうちＩＳ４（卵胆礬）を処理したとき、癌細胞の増殖を最も効果的に抑制することに表れた（図２、図３、図４及び図５）。
【００８１】
（実施例５．ＤＡＰＩ染色を通した細胞のアポトーシス確認）
焼いた胆礬（ＩＳ３）、卵胆礬（ＩＳ４）及び生胆礬（ＩＳ５）が癌細胞（ＮＣＩ−Ｈ４６０及びＨｅｐＧ２）のアポトーシスを生じさせることによって細胞増殖を抑制するか否かを観察するために、癌細胞に各試料を処理した後、ＤＡＰＩ染色をし、蛍光顕微鏡で細胞形態を観察した。具体的な実験過程は、次に示す通りである。
【００８２】
８ウェルチャンバースライドに１×１０５セル／ｍｌの細胞をそれぞれ４００μｌずつ入れて２４時間培養した後、試料（５０μｇ／ｍｌの濃度）を処理し、２４時間反応させた後、反応終了後に培地を捨て、７５ｍＭのＫＣｌを約５００μｌ入れて５分間反応した。これは、細胞を膨らませて核の観察を容易にするためである。その次に、酢酸とメタノールを１：３で混ぜてコールドアイス状態にした後、これを約５００μｌ入れて５分間反応させ、細胞を固定した。これを２回繰り返して施行した。固定が終了すると、空気中で完全に乾かした後、ＤＡＰＩ染色溶液を約１００μｌ落として１０分間染色した後、ＰＢＳで洗浄した。グリセロールでカバーガラスを覆い、蛍光顕微鏡で（×１００または×２００）観察した。３００個の細胞を数え、このうち核の断片化と染色質の凝縮を示す細胞をアポトーシスの形態的判定基準にしたがって判読して観察した。
【００８３】
アポトーシスは、予定細胞死滅（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ）であって、細胞の萎縮、染色質の凝縮、ＤＮＡ分節、ミトコンドリアの機能障害、カスパーゼ・プロテアーゼ活性化などの特徴を伴うものと報告されたことがある。ＤＡＰＩは、青色の蛍光染料であって、ＤＮＡのＡＴクラスターがあるマイナー・グルーブに結合し、蛍光が増加する物質であるが、このような特性により、分節・凝縮されたアポトーシス小体を顕微鏡を通して簡単に確認し、ＤＮＡ断片化程度を肉眼で観察することができる。
【００８４】
５０μｇ／ｍｌの濃度でＩＳ３及びＩＳ４をそれぞれ処理したＨ４６０、ＨｅｐＧ２細胞にＤＡＰＩ染色を実施したが、対照群（胆礬試料を処理しない）と対比したとき、全ての核の分節と染色質の凝縮を観察することができた。特に、ＩＳ４（卵胆礬）グループでは、多くのアポトーシス小体を観察することができた（図６及び図７）。
【００８５】
（実施例６．ウェスタンブロットを通したアポトーシス関連タンパク質発現確認）
卵胆礬が癌細胞に及ぼす影響をタンパク質水準で観察するために、アポトーシス関連タンパク質であるカスパーゼ３、Ｂａｘ及びＢｃｌ−２タンパク質発現調節程度を確認した。
【００８６】
ｂａｘは、サイトゾルからミトコンドリアに移動しながらミトコンドリアからシトクロムＣの分泌を促進し、結局、細胞死滅を誘導する機能を有する一方、ｂｃｌ−２は、細胞外や細胞内の状況の伝達を受ける重要な信号伝達体系として作用し、ミトコンドリアへのｂａｘの移動を抑制することによって細胞死滅を抑制させる作用をするものと知られている（Ｎｏｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．，２０００）。
【００８７】
カスパーゼ−３は、細胞死滅に最も直接的に関連したカスパーゼであって、細胞死滅の初期段階に作用し、３５ｋＤａ酵素前駆体（ｐｒｏｅｎｚｙｍｅ）の分離によって誘導された１７及び１９ｋＤａ異種二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）が活性化された形態で（Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ−Ａｌｎｅｍｒｉ ｅｔ ａｌ．，１９９４）カスパーゼ―８とカスパーゼ−９の初期信号を増幅させる。
【００８８】
細胞死滅は、外因的及び内因的経路に分けられ、二つの場合、いずれもカスパーゼ−３の活性化を通して細胞死滅を誘発するようになる。カスパーゼ−３が活性化された形態で観察されるためには、不活性形態である３５ｋＤａのプロカスパーゼ−３の相対的な発現が減少したり、それらの活性型である１７ｋＤａと１９ｋＤａ分子量のタンパク質が検出されなければならない（Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ａｈｎ ｅｔ ａｌ．，２００４）。
【００８９】
卵胆礬（ＩＳ４）が、アポトーシスを誘発するものと知られたいくつかのタンパク質（カスパーゼ３、Ｂａｘ及びＢｃｌ−２タンパク質）の発現を調節するかどうかを観察するために、ウェスタンブロットを行った。これを通して、卵胆礬が細胞内でどの経路を通してアポトーシスを誘発させるかを確認した。具体的な実験過程は、次に示す通りである。
【００９０】
ＮＣＩ−Ｈ４６０（肺癌細胞）にＩＳ４を０、２５、５０及び１００μｇ／ｍｌの濃度でそれぞれ処理した後、３７°Ｃで２４時間培養した。その後、スクレーパで細胞を集め、集めた細胞を、盛り込まれていた培地と共に１０００ｒｐｍで遠心分離して上層液を捨てた後、２ｍのコールドＰＢＳで２回洗浄した。これに５０ｍＭのトリスｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％のアジ化ナトリウム、０．２％のＳＤＳ、ＰＭＳＦ（Ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ）１００μｇ／ｍｌ、アプロチニン５０μｌ／ｍｌ、Ｉｇａｐｅｌ６３０（またはＮＰ−４０）１％、ＮａＦ１００ｍＭ、デオキシコール酸ナトリウム０．５％、ＥＤＴＡ（Ｅｔｈｙｌｎｅｄｉａｍｉｎｅｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ−−Ｓｉｇｍａ Ｅ−４８８４）０．５ｍＭ、ＥＧＴＡ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ−ｂｉｓ（β−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌｅｔｈｅｒ）Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−四酢酸−−ｓｉｇｍａ Ｅ−４３７８）０．１ｍＭで組成されたライシスバッファ（Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ）を５０〜１００μｌを加えてよく混合した（ｖｏｒｔｅｘ）後、４°Ｃで２時間溶解した。反応の終了後、試料を１.５ｍｌのチューブに入れて３０秒間ボルテックスし、４°Ｃで２３，０００ｇで１時間遠心分離し、遠心分離した上澄液のみを得る。最終抽出物のタンパク質量は、バイオラッド・プロテイン・アッサイ・キット（Ｂｉｏ−ｒａｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ）を使用して測定する。定量になったタンパク質にライシスバッファと５Ｘサンプルバッファを混ぜてタンパク質の量を同一にした後、１００°Ｃのヒートブロックで５分間沸騰した後、しばらくの間遠心分離して試料を集める。分離ゲル（Ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ ｇｅｌ）（１２．５％）と濃縮ゲル（Ｓｔａｃｋｉｎｇ ｇｅｌ）（５％）を作った後、電気泳動をしてトランスファーした。トランスファーが終了したゲルは、染色液（ｓｔａｉｎｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｓｏｌｎ．）溶液に１０分浸漬してから脱染色溶液に移し、残ったタンパク質を確認した。また、トランスファーされたメンブレンは、ＴＢＳ―Ｔ溶液で洗浄した後、少しだけ水分を除去し、ＴＢＳ−Ｔ溶液で希釈した約５％のスキムミルク（ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ）で約２時間ブロッキングした後、ＴＢＳ―Ｔ溶液で複数回洗浄する。１次抗体（Ｂａｘ、Ｂｃｌ−２、Ｃｌｅａｖｅｄ ｃａｓｐａｓｅ−３；ｃｅｌｌｓｉｇｎａｌｉｎｇ）及び２次抗体（Ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ）と反応させ、ＥＣＬ溶液に約１分間反応させた後、フィルムをカセットに載せて撮影した後、現像して観察した。
【００９１】
Ｈ４６０細胞にＩＳ４を処理した結果、Ｃｌｅａｖｅｄ ｃａｓｐａｓｅ−３の発現は、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌで増加する傾向を示したが、１００μｇ／ｍｌでは少し減少する傾向を示した。これは、過度に高い濃度の試料が処理され、毒性を示したものと考えられる。ＩＳ４を処理した群でｂｃｌ−２の発現が少し増加し、ｂａｘの発現は減少した（図８）。
【００９２】
これを通して、本発明の組成物の主な有効成分である卵胆礬は、癌細胞でカスパーゼ３タンパク質を活性化させることによってアポトーシスを誘導することを確認することができ、ｂａｘ／ｂｃｌ−２経路でない他の経路を通してカスパーゼ３タンパク質を活性化させてアポトーシスを誘発することが分かった。
【００９３】
（実施例７．抗癌効果確認）
ヒト由来肺癌細胞であるＮＣＩ−Ｈ４６０をヌードマウスの前肢に皮下移植し、一定の大きさまで固形癌を形成した後、Ｉｎ ｖｉｖｏ試験で人体由来肺癌細胞株に対する細胞殺害能力が最も良く表れた卵緑礬（ＩＳ４）を４週間経口投与し、卵緑礬の抗癌効果に対する研究を行った。すなわち、抗癌効果検索は、一週間に２回デジタルキャリパーを使用して固形癌の大きさを測定し、体重と共に経時的な変化を確認し、最終測定日には固形癌の成長抑制率を計算して比較した。試験終了日には、摘出した固形癌の重さと体積測定器（ｐｌｅｔｈｙｓｍｏｍｅｔｅｒ）を用いて固形癌の実体積を測定し、試験期間中に日々の症状観察を通して固形癌の中心怪死が表れる個体と、それぞれの固形癌大きさの測定結果で固形癌の体積が１５００ｍｍ３以上になる個体とを確認し、これら二つの条件のうち一つの条件に該当する個体を死亡個体と見なし、各群ごとに平均生存日を求め、試験終了後、陽性対照群に対比して生存増加率（％）を計算した。試験終了後、剖検時には肉眼的に内部臓器の異常有無を確認した後、採血を実施して血中ＡＬＰ、ＣＲＥ、ＢＵＮ、ＴＧ、ＡＬＴ、ＡＳＴ、Ｃａレベル、ＧＬＵ、総コレステロールを分析し、臓器（心臓、脾臓、睾丸）を摘出し、臓器の重さを測定した。
【００９４】
（＜７−１＞材料及び方法）
１．移植癌細胞準備
移植するヒト肺癌（Ｈｕｍａｎ ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）（ＮＣＩ−Ｈ４６０）セルは、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１０％のヒーティングされたウシ胎仔血清（ｆｅｔａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ）が入っているＲＰＭＩ―１６４０（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を２６０ｍｌのティッシュフラスコ（ｔｉｓｓｕｅ ｆｌａｓｋｓ）に盛り込み、９５％のＣＯ２、３７°Ｃのインキューベータ（ＭＣＯ−２０ＡＩＣ、Ｓａｎｙｏ）で培養した。セルが癒着されると、ＨＢＳＳ（Ｈａｎｋｓ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）で２回洗浄し、０．２％のＨＢＳＳ内のトリプシンで洗浄して使用した。
【００９５】
２．検疫及び順化
実験動物の入手時、全ての動物の一般健康状態に対する獣医学的検疫を実施した。試験を実施するのに相応しくかつ健康な動物を選抜し、環境に適応させるために１週間の順化期間を経た。
【００９６】
３．群分離
順化期間を経た後、健康な継代群の皮下に腫瘍塊を移植し、培養した腫瘍塊を摘出し、表面に分布した血管と脂肪層を除去した後、新鮮な腫瘍組織のみを選別して無処置動物の皮下に移植した。移植後、個別腫瘍の体積が１００ｍｍ３に達すると、体重と腫瘍大きさを測定し、無作為法で群分離した。
【００９７】
４.個体識別
飼育箱には、試験類型、試験番号、試験物質、群番号、個体番号、性別、投与量、実験期間及び試験責任者を記載した個体識別カードを付着した。個体識別は、テールマーキング（ｔａｉｌ ｍａｒｋｉｎｇ）法を使用して行った。処理群及び投与用量を下記の表６に示した。
【００９８】
【表６】
【００９９】
５．投与方法
試験物質を生理食塩水に溶かし、ゾンデ（ｚｏｎｄｅ）を使用して４週間１日１回強制に経口投与した。
【０１００】
６．評価方法
１）体重測定
試験期間中の体重変化を観察するために、試験開始後、７日ごとに体重を測定した。
【０１０１】
２）腫瘍含有モデル製作
１×１０７セル／ヌードマウス／１００μｌを注入して腫瘍株を獲得した後、継代群に継代した。３回にわたった反復継代で元の固形癌の性質を回復した腫瘍塊を得た後、この腫瘍塊を５匹の継代群に移植した。
【０１０２】
腫瘍の中心怪死（ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｃｒｏｓｉｓ）が生じる前に十分な血液供給で急速に育つ段階の腫瘍を含有した動物を犠牲させ、主に急速な分裂が起きる外郭部位を一定の大きさ（３×３×３ｍｍ）に切って腫瘍切片を作った。套管針の端に腫瘍片を載せ、動物の左側後肢の前側方を約４ｍｍ切除し、ここを通して準備した套管針を挿入し、左側前肢の後方の体幹側面部に端が達するようにした。套管針を軽くかつ迅速に３６０度回転させながら抜き、腫瘍片を目標位置に位置させ、切除部位は消毒した。肌の上を触って腫瘍片の位置を確認し、１週間に２回以上成長を観察した。移植後、体積が１００ｍｍ３に達したものに群分離した後、試験物質を投与した。
【０１０３】
３）抗癌試験（平均腫瘍容積、ｍｅａｎ ｔｕｍｏｒ ｖｏｌｕｍｅ）
１週間に２回ずつキャリパー（ｃａｌｉｐｅｒｓ）で腫瘍の長・短軸を測定し、体重を測定した。最初に薬物を投与してから２８日が経過すると、実験を終了し、実験資料を整理して試験物質による固形癌抑制効果を判定した。経時的な固形癌の体積及び抑制率の計算は、下記の公式を用いて換算した。
【０１０４】
Ｖ（ｍｅａｎ ｔｕｍｏｒ ｖｏｌｕｍｅ）＝（Ａ×Ｂ２）／２（Ａ＝長軸長さ、Ｂ＝短縮長さ）
【０１０５】
ＩＲ（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒａｔｅ）＝［ＣＶ−ＴＶ／ＴＶ］×１００
（ＣＶ＝対照群の腫瘍容積、ＴＶ＝処置群の腫瘍容積）
【０１０６】
４）平均生存時間と寿命のパーセント増加（％ＩＬＳ）
試験期間中に各試験群の日々の症状観察を通して固形癌の中心怪死が表れる個体と固形癌大きさの測定日の結果から、固形癌の体積が１５００ｍｍ３以上になる個体を確認し、二つの条件のうち一つに該当する個体を死亡個体と見なし、生存増加率を下記の公式のように計算した。
【０１０７】
％ＩＬＳ＝［（Ｔ−Ｃ）／Ｃ］×１００、
（ここで、ＣとＴは、対照群と処置群のマウスの平均生存日）
【０１０８】
７．血中脂質値検査と一般血液検査
剖検時に腹帯動脈を通して採血して血清を獲得し、血液生化学自動分析機（ＨＩＴＡＣＨＩ、Ｔｏｋｙｏ、ＪＡＰＡＮ）を用いてＡＬＰ（ａｌａｎｉｎｅ ｐｈｏｐｓｐｈａｔａｓｅ）、ＣＲＥ（ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ）、Ｃａ、ＧＬＵ（ｇｌｕｃｏｓｅ）、ＡＬＴ（ａｌａｎｉｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ＡＳＴ．ＵＮを分析した。
【０１０９】
８．病理組織学的検査
試験終了時、放血致死させた後、肝、腎臓、脾臓を摘出して重量を測定し、肉眼的な所見を観察した。組織を１０％の中性ホルマリン液に固定した後、パラフィン包埋過程を経て４μｍ厚さの組織切片を製作した後、ヘマトキシリン＆エオシンで染色し、光学顕微鏡で観察した。
【０１１０】
９．統計学的分析
各実験結果に対して分散の同質性を比較するためのリーベン検定（Ｌｅｖｅｎｅ′ｓ ｔｅｓｔ）を実施し、分散が同質性を有する場合、ＡＮＯＶＡ（ｏｎｅ−ｗａｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖａｒｉａｎｃｅ）を実施し、有意性が観察されると、対照群との有意差がある試験群を調査するためにＤｕｎｎｅｔｔ′ｓ ｔ−ｔｅｓｔを実施した（ｐ＜０．０５またはｐ＜０．０１）。
【０１１１】
（＜７−２＞結果及び考察）
１．体重変化
本実験期間中における体重の変化と飼料及び飲水摂取量の変化において、ＮＣＩ−Ｈ４６０セル単独群よりはＩＳ４の投与群で投与初期体重と飼料の摂取量が減少したが、１週後からは正常に回復した（図９、図１０、図１１）。試験期間中に群間の留意すべき事項は表れなかった。
【０１１２】
２．腫瘍（固形癌）の体積変化
試験期間中の固形癌の体積を一週間に２回キャリパーを使用して測定した結果を見ると、ＮＣＩ−Ｈ４６０セル単独群よりは、ＩＳ４ ４５、９０ｍｇ／ｋｇ投与群で腫瘍容積が濃度依存的に抑制された（図１２）。各群の経時的変化を見ると、ＩＳ４投与後、約１２日後からＮＣＩ−Ｈ４６０腫瘍成長を抑制し、１５日後からはＮＣＩ−Ｈ４６０セル単独群に比べて固形癌成長抑制の傾向を示した。固形癌抑制傾向を数値的に見ると、試験後半日である２２日で、ＮＣＩ−Ｈ４６０セル単独群２８０６．４７ｍｍ３に比べてＩＳ ４ ４５ｍｇ／ｋｇ群は２２２１.７４ｍｍ３、ＩＳ４ ４５ ９０ｍｇ／ｋｇ群は１５１７.０７ｍｍ３に表れた。
【０１１３】
３．腫瘍（固形癌）体積抑制率測定
前記の測定した固形癌の体積を、ＮＣＩ−Ｈ４６０セル単独群の固形癌体積の１００％を基準にした成長抑制率分析結果で見ると、試験物質投与群で８日後から２５日まで用量依存的な抑制傾向が表れた。（ＩＳ４ ４５ｍｇ／ｋｇ Ｉ．Ｒ ８２.４７％＜ＩＳ４ ９０ｍｇ／ｋｇ Ｉ．Ｒ ５９.９９％ ａt ２２ｄａｙ）ＩＳ４ ９０ｍｇ／ｋｇ投与群では、投与２２日後に固形癌成長抑制率が減少したことに表れた（表７）。
【０１１４】
【表７】
【０１１５】
４.腫瘍（固形癌）の重さ及び体積測定
【０１１６】
試験終了日に摘出した固形癌の重さ及び体積変動記録（ｐｌｅｔｈｙｓｍｏｍｅｔｅｒ）による体積測定結果を見ると、陽性対照群であるＮＣＩ−Ｈ４６０セル単独の固形癌の重さ及び体積２．５２±０．７５ｇと４．６７±１．１８ｃｍ３に比べて、ＩＳ４ ４５ｍｇ／ｋｇ群では２．２４±０．７８ｇ、４．０３±１．２８ｃｍ３に減少し、ＩＳ４ ９０ｍｇ／ｋｇ群では２．１７±０．６０ｇ、３．７９±０．８５ｃｍ３に有意性のある減少（ｐ＜０．０５）を示した（表８）。
【０１１７】
【表８】
【０１１８】
５．平均生存時間及び生存率増加量測定
試験期間中に各試験群の日々の症状観察を通して固形癌の中心怪死が表れる個体と、固形大きさ測定日の結果で固形癌の体積が１５００ｍｍ３以上になる個体とを確認し、二つの条件に該当する個体を死亡個体と見なして得た結果で平均生存時間を計算してみると、陽性対照群であるＮＣＩ−Ｈ４６０セル単独群では１８．２９±３．５９日で、ＩＳ４ ４５ｍｇ／ｋｇ投与群では２０．７１±２．６１日として生存率が１０．６８％増加した。また、ＩＳ４ ９０ｍｇ／ｋｇ投与群では２２．３３±２．４４日として生存率が２２．０８％増加した（表９、図１３）。
【０１１９】
【表９】
【０１２０】
６．組織病理学的観察（光学顕微鏡）及び臓器重さ測定
剖検時における臓器重さ変化確認でＩＳ４投与群（４５ｍｇ／ｋｇ）間の相対重量がＮＣＩ−Ｈ４６０セル単独群に比べて有意性のある減少（ｐ＜０．０１）を示したことを除いては、他の臓器重さで留意すべき変化は表れなかった。詳細な結果を見ると、剖検時における肝の臓器重さは、ＮＣＩ−Ｈ４６０セル単独群の１．７６±０．０７ｇに比べて、ＩＳ４４５ｍｇ／ｋｇ群では１．５４±０．０７ｇとして有意性のある減少（ｐ＜０．０１）を示した。しかし、ＩＳ４ ９０ｍｇ／ｋｇ群では１．６９±０．１０ｇに減少する傾向があるが、有意性は表れなかった（表１０）。組織病理学的にも、群間の留意すべき所見は表れなかった（図１４）。
【０１２１】
【表１０】
【０１２２】
７．血液生化学的分析
剖検時における血液生化学分析結果を見ると、血中ＡＬＰ、ＣＡ、ＣＲＥ、ＡＬＴ、ＡＳＴ数値では試験物質投与による留意すべき差は表れなかった（表１１）。
【０１２３】
一方、血中ＵＮ数値で、全ての試験物質投与群で有意性のある減少結果が表れた（ＩＳ４ ４５ｍｇ／ｋｇ、ＩＳ４ ９０ｍｇ／ｋｇ、ｐ＜０．０１）。また、ＩＳ４ ４５ｍｇ／ｋｇ群のＰＨＯＳ数値は、７．７９±０.８２mg／dlとしてＮＣＩ−Ｈ４６０セル単独群の９．２７±０．９９ｍｇ／ｄｌに比べて有意性のある減少を示した。（ＩＳ４ ４５ｍｇ／ｋｇ群、ｐ＜０．０５）
【０１２４】
【表１１】
【０１２５】
（実施例８．治療事例）
卵胆礬粉末と竹塩粉末を１：２０の重量比で混合して卵胆礬竹塩を製造した後、カプセルに卵胆礬竹塩の混合粉末を０．５ｇずつ入れて患者に提供し、１個ずつ唾で飲み込んだり、食水で飲み込む方法で一日１０個〜２０個ずつ服用するようにした（日々の投与量は、成人を基準にして総量５ｇ〜１０ｇ、または体重１０ｋｇ当たりカプセル１〜３個）。患者は、前記投与量を１〜２時間の間隔で２〜１０回に分けて服用し、場合によって、卵胆礬竹塩の他に通常の気力補強のための湯薬及び舎利醤油を共に服用した。
【０１２６】
（＜８−１＞事例１．子宮頚部異型細胞症治療）
名前：コ・＊＊、年齢：３５歳、性別：女、子宮頚部異型細胞症、結核薬を２年間服用し、Ｂ型肝炎保菌状態で３ヶ月間湯薬、卵胆礬竹塩及び舎利醤油を服用し、卵胆礬竹塩水を子宮に注入する治療を施行した。検査の結果、細胞がほぼ正常になっており、核のみが未だに少しだけ大きくなっている状態との診断を受けた後、服用中断による再発、再治療（湯薬と卵胆礬竹塩服用及び卵胆礬竹塩注入）後、１ヶ月ぶりに正常に完治した。
【０１２７】
（＜８−２＞事例２．大膓癌、肺癌、骨癌治療）
名前：ゾン・＊＊、年齢：５７歳、性別：男、大膓癌、肺癌、骨癌（頚椎癌）状態で、大膓癌、肺癌転移手術（当時、排尿問題で検査したとき、膀胱には異常がなかったが、神経を押すため膀胱の一部を少しだけ切除）後、脊椎に再発し、転移、頚椎癌、９回の脊椎癌細胞増殖によって脊椎が破壊され、肋骨神経を押すため痛みが激しい。抗癌治療を６回再び受けたが、結果は少しもよくならず、癌細胞がそのままの状態で治療可能性がなく、鎮痛剤で一日一日堪えながら抗癌さえも受けられない状況で、５ヶ月間湯薬、卵胆礬竹塩及び舎利醤油を服用した。その後、病院で検査した結果、完治という判定を受けた。
【０１２８】
（＜８−３＞事例３．甲状腺癌治療）
名前：キム・＊＊、年齢：４６歳、性別：男、１２年前に急性肝炎で治療を受けた病歴があり、現在肝に石灰化現象があるが、甲状腺癌診断を受けた後、病院での抗癌治療なしに、湯薬、卵胆礬竹塩及び舎利醤油を服用した。服用してから一ヶ月ぶりにＣＴ撮影をした結果、５．１ｍｍであった癌細胞が４．６ｍｍに減少した。服用してから６ヶ月後に完治した。
（産業上の利用可能性）
【０１２９】
本発明に係る卵胆礬を有効成分として含む組成物は、胆礬の毒性が除去され、薬物学的活性が最大化された状態で製造され、抗癌活性に優れているので、癌の予防及び治療用薬学製剤または健康機能食品製造に有用に用いることができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
卵胆礬を有効成分として含む癌予防及び治療用組成物。
【請求項２】
竹塩をさらに含む、請求項１に記載の癌予防及び治療用組成物。
【請求項３】
前記卵胆礬及び竹塩は粉末状である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物は、卵胆礬及び竹塩を１：５〜１：５０の重量比で含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記卵胆礬は、胆礬を加熱、脱水及び粉末化した後、卵白を混合して製造される、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
薬学的に許容可能な担体をさらに含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項７】
前記癌は、肝癌、乳房癌、肺癌、大膓癌、胃癌、膵膓癌、子宮癌、前立腺癌、骨癌、神経膠腫及び白血病で構成された群から選択される、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物は、カスパーゼ３の活性増進を通した癌抑制能を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
卵胆礬を有効成分として含む癌予防及び改善用健康機能食品。
【請求項１０】
竹塩をさらに含む、請求項９に記載の癌予防及び改善用健康機能食品。
【請求項１１】
（ａ）天然鉱物性生薬である胆礬を全量が灰色または褐色に変わるまで加熱・脱水させる段階；
（ｂ）脱水された胆礬を冷やした後、粉末化する段階；及び
（ｃ）前記段階（ｂ）の胆礬粉末を卵白に混合する段階を含む、卵胆礬の製造方法。
【請求項１２】
前記段階（ｃ）以後に、（ｄ）前記段階（ｃ）の混合物を冷やした後、粉末化する段階をさらに含む、請求項１１に記載の卵胆礬の製造方法。
【請求項１３】
前記段階（ｃ）は、胆礬粉末６００ｇ当たり卵７〜２０個の卵白（１４０〜４００ｇ）を混合する、請求項１１に記載の卵胆礬の製造方法。
【請求項１４】
請求項１の卵胆礬組成物を用いて癌を予防及び治療する方法。
【請求項１】
卵胆礬を有効成分として含む癌予防及び治療用組成物。
【請求項２】
竹塩をさらに含む、請求項１に記載の癌予防及び治療用組成物。
【請求項３】
前記卵胆礬及び竹塩は粉末状である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物は、卵胆礬及び竹塩を１：５〜１：５０の重量比で含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記卵胆礬は、胆礬を加熱、脱水及び粉末化した後、卵白を混合して製造される、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
薬学的に許容可能な担体をさらに含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項７】
前記癌は、肝癌、乳房癌、肺癌、大膓癌、胃癌、膵膓癌、子宮癌、前立腺癌、骨癌、神経膠腫及び白血病で構成された群から選択される、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物は、カスパーゼ３の活性増進を通した癌抑制能を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
卵胆礬を有効成分として含む癌予防及び改善用健康機能食品。
【請求項１０】
竹塩をさらに含む、請求項９に記載の癌予防及び改善用健康機能食品。
【請求項１１】
（ａ）天然鉱物性生薬である胆礬を全量が灰色または褐色に変わるまで加熱・脱水させる段階；
（ｂ）脱水された胆礬を冷やした後、粉末化する段階；及び
（ｃ）前記段階（ｂ）の胆礬粉末を卵白に混合する段階を含む、卵胆礬の製造方法。
【請求項１２】
前記段階（ｃ）以後に、（ｄ）前記段階（ｃ）の混合物を冷やした後、粉末化する段階をさらに含む、請求項１１に記載の卵胆礬の製造方法。
【請求項１３】
前記段階（ｃ）は、胆礬粉末６００ｇ当たり卵７〜２０個の卵白（１４０〜４００ｇ）を混合する、請求項１１に記載の卵胆礬の製造方法。
【請求項１４】
請求項１の卵胆礬組成物を用いて癌を予防及び治療する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公表番号】特表２０１２−５１４０３１（Ｐ２０１２−５１４０３１Ａ）
【公表日】平成２４年６月２１日（２０１２．６．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４４３５１（Ｐ２０１１−５４４３５１）
【出願日】平成２１年８月１２日（２００９．８．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００９／００４５０８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０７６９３７
【国際公開日】平成２２年７月８日（２０１０．７．８）
【出願人】（５１１１５８６７２）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年６月２１日（２０１２．６．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月１２日（２００９．８．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００９／００４５０８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０７６９３７
【国際公開日】平成２２年７月８日（２０１０．７．８）
【出願人】（５１１１５８６７２）
【Ｆターム（参考）】
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