反応性代謝物を同定するためのトラッピング化合物および方法
式（Ｉ）の化合物は、反応性代謝物を同定するのに有用である。
［式中、ＸはＣＨ２であり、かつ、ｐ、ｑおよびｒはそれぞれ独立して０または１であるが、但し、ｐが０であり、ｑが０であり、かつ、ｒが１である化合物は除外されるものとする］
［式中、ＸはＣＨ２であり、かつ、ｐ、ｑおよびｒはそれぞれ独立して０または１であるが、但し、ｐが０であり、ｑが０であり、かつ、ｒが１である化合物は除外されるものとする］
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、反応性代謝物を検出するための非同位体トラッピング化合物および方法、ならびに、薬物候補を同定する方法、に向けられたものである。より詳細には、この、反応性代謝物を検出するための非同位体トラッピング化合物および方法を利用して、「ソフト」な反応性代謝物および「ハード」な反応性代謝物、ならびに、さらには、アシルグルクロニド、を検出することができる。
【背景技術】
【０００２】
患者の罹患率および死亡率の問題において、化合物の特定の毒性は、臨床開発においても上市後においても、依然として、安全性に対する深刻な懸念事項のままである。これらの特定の薬物有害事象は制限的使用につながり得り、また、市場からの撤退にさえつながり得り、このことは、結果的に、製薬会社に、より大きな負担をもたらす。有名な例として、トログリタゾンは、その上市後すぐに、予期せぬ毒性のために撤退した。
【０００３】
特定の薬物有害事象は、通常、個々の感受性の度合いが高い場合に現れる、まれなケースである。さらに、これらの反応は、一般に、用量非依存的に起こる。現在、ヒトにおいて専ら起こるような反応を評価するのに使用可能な動物モデルは存在しない。したがって、これらの特定の薬物毒性は、前臨床試験において正確に評価することができず、また、臨床試験において認識できない場合が多い。
【０００４】
現時点では、これらの特定の有害薬物反応のメカニズムはよく分かっていない。化学的に反応性の高い代謝物が特定の毒性に関係しているということを示唆する証拠が、特に肝毒性について、数多くある。特定の毒性に関連する数多くの化合物は、主にシトクロムＰ４５０酵素（ＣＹＰ）によって、同様に、例えばペルオキシダーゼ、シクロオキシゲナーゼおよびミエロペルオキシダーゼなどの他の酸化酵素によって仲介される種々の代謝経路を介して、または、ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）によって仲介される別の代謝経路を介して、反応性代謝物を生じる。これは、こうした毒性に関連する数多くの化合物が、まず、代謝活性化を受け、その結果、細胞タンパク質に共有結合する有毒性の反応性代謝物を生じる、と仮定したものである。これらの共有結合修飾されたタンパク質は、しばしば、抗原性であり、それ故に、免疫応答を刺激し、その結果、特定の薬物反応をもたらす。別の仮説では、反応性代謝物による細胞タンパク質の共有結合修飾がシグナル伝達カスケードと細胞の必須の機能とをブロックし、それにより、臨床上観察される致命的な結果が引き起こされる、と言われている。したがって、反応性代謝物を同定するための方法が深刻に必要とされている。
【０００５】
酸化酵素により生じる化学的な化合物の反応性代謝物は、化学的な性質に基づく、「ソフト」な反応性代謝物および「ハード」な反応性代謝物という、２つのカテゴリーに特徴付けることができる。「ソフト」な反応性代謝物には、キノン、キノンイミン、イミノキノンメチド、エポキシド、アレーンオキシドおよびニトレニウムイオンを含み、かつ、例えばシステイン中のスルフヒドリル基などの「ソフト」な求核基と容易に反応する、求電子性代謝物の大多数が含まれる。一方、「ハード」な反応性代謝物は、最も一般的にはアルデヒドと考えられているが、これらは、例えばリシン、アルギニンといったアミン、および、核酸などの、「ハード」な求核基と優先的に反応する。それらの不安定性ゆえに、反応性代謝物の直接の検出および特徴付けは、非常に困難であることが立証されている。一般的に利用されているアプローチの１つは、これらの反応性代謝物を捕捉分子でトラップすることであり、これにより、その後の例えばタンデム質量分析などの公知の検出方法による特徴付けが可能な、安定した付加物が形成される。
【０００６】
ＵＧＴにより生じる、反応性代謝物の別のカテゴリーは、アシルグルクロニドである。アシルグルクロニドは、本質的に反応性の化学種であり、分子内転位およびアノマー化、次いで、タンパク質との反応を経て、共有結合付加物を生じる。現在、ニュートラルロスタンデム質量分析を用いた、トラッピング剤を使用したアシルグルクロニドの検出システムに関する報告は存在しない。
【０００７】
最近、Huebertらは、ＷＯ２００８／０４２６３４Ａ２の中で、安定同位体標識トラッピング化合物と質量分析とを用いる、反応性代謝物を検出するための方法を開示した。しかしながら、Huebertらは、単に、「安定同位体標識化合物」を用いる方法を開示しただけであり、例示した一実施形態のような、いかなる「非同位体標識化合物」も示さなかった。また、Huebertらにより開示された方法は、「ソフト」な反応性代謝物および「ハード」な反応性代謝物を検出することができるのみであり、例示したもののような、いかなる「アシルグルクロニド」も検出することはできない。
【０００８】
他方で、本発明は、式（Ｉ）の非同位体化合物により、一度の実験での、「ソフト」な反応性代謝物および「ハード」な反応性代謝物、ならびに、さらにはアシルグルクロニドの検出のための新規の方法を与えることができるという特定の特徴を指し示している。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、（「ソフト」な反応性代謝物および「ハード」な反応性代謝物ならびにアシルグルクロニドを含む）反応性代謝物を同定するための非同位体トラッピング化合物、すなわち、式（Ｉ）の化合物：
【化１】
に向けられたものである。
【００１０】
本発明は、さらに、試験化合物の反応性代謝物を検出するための方法であって、
（ａ）試験化合物を、上記式（Ｉ）の化合物および薬物代謝酵素とともにインキュベートし、１種類以上の付加物を含む生成物混合物を得ること；ならびに
（ｂ）工程（ａ）の付加物を検出すること、
を含む方法に向けられたものである。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】ＥＣＯを用いて分析した場合の、ジクロフェナクについての、全イオンクロマトグラム（ＴＩＣ；上段）、ならびに、１２９Ｄａ（中段）および１４７Ｄａ（下段）のニュートラルロススキャニングのＴＩＣを説明するものである。
【図１Ｂ】ＥＣＯを用いて分析した場合の、ジクロフェナク由来の付加物Ｉのフルスキャンスペクトル（上段）およびプロダクトイオンスペクトル（下段）を説明するものである。
【図１Ｃ】ＥＣＯを用いて分析した場合の、ジクロフェナク由来の付加物ＩＩのフルスキャンスペクトル（上段）およびプロダクトイオンスペクトル（下段）を説明するものである。
【図２Ａ】ＥＣＯを用いて分析した場合の、クロザピンについての、ＴＩＣ（上段）、ならびに、１２９Ｄａ（中段）および１４７Ｄａ（下段）のニュートラルロススキャニングのＴＩＣを説明するものである。
【図２Ｂ】ＥＣＯを用いて分析した場合の、クロザピン由来の付加物Ｉのフルスキャンスペクトル（上段）およびプロダクトイオンスペクトル（下段）を説明するものである。
【図３Ａ】ＥＣＯを用いて分析した場合の、２−［２−チエニル］−フランについての、ＴＩＣ（上段）、ならびに、１２９Ｄａ（中段）および１４７Ｄａ（下段）のニュートラルロススキャニングのＴＩＣを説明するものである。
【図３Ｂ】ＥＣＯを用いて分析した場合の、２−［２−チエニル］−フラン由来の付加物Ｉのフルスキャンスペクトル（上段）およびプロダクトイオンスペクトル（下段）を説明するものである。
【図３Ｃ】ＥＣＯを用いて分析した場合の、２−［２−チエニル］−フラン由来の付加物ＩＩのフルスキャンスペクトル（上段）およびプロダクトイオンスペクトル（下段）を説明するものである。
【図３Ｄ】ＥＣＯを用いて分析した場合の、２−［２−チエニル］−フラン由来の付加物ＩＩＩのフルスキャンスペクトル（上段）およびプロダクトイオンスペクトル（下段）を説明するものである。
【図４Ａ】ＥＣＯを用いて分析した場合の、ジクロフェナクアシルグルクロニドについての、ＴＩＣ（上段）、ならびに、１２９Ｄａ（中段）および１４７Ｄａ（下段）のニュートラルロススキャニングのＴＩＣを説明するものである。
【図４Ｂ】ＥＣＯを用いて分析した場合の、ジクロフェナクアシルグルクロニド由来の付加物Ｉのフルスキャンスペクトル（上段）およびプロダクトイオンスペクトル（下段）を説明するものである。
【図５Ａ】ＥＣＨＫを用いて分析した場合の、ジクロフェナクについての、ＴＩＣ（上段）、および、１２９ＤａのニュートラルロススキャニングのＴＩＣ（下段）を説明するものである。
【図５Ｂ】ＥＣＨＫを用いて分析した場合の、ジクロフェナク由来の付加物Ｉのフルスキャンスペクトル（上段）およびプロダクトイオンスペクトル（下段）を説明するものである。
【図５Ｃ】ＥＣＨＫを用いて分析した場合の、ジクロフェナク由来の付加物ＩＩのフルスキャンスペクトル（上段）およびプロダクトイオンスペクトル（下段）を説明するものである。
【図６Ａ】ＥＣＨＫを用いて分析した場合の、クロザピンについての、ＴＩＣ（上段）、および、１２９ＤａのニュートラルロススキャニングのＴＩＣ（下段）を説明するものである。
【図６Ｂ】ＥＣＨＫを用いて分析した場合の、クロザピン由来の付加物Ｉのフルスキャンスペクトル（上段）およびプロダクトイオンスペクトル（下段）を説明するものである。
【図７Ａ】ＥＣＨＫを用いて分析した場合の、２−［２−チエニル］−フランについての、ＴＩＣ（上段）、および、１２９ＤａのニュートラルロススキャニングのＴＩＣ（下段）を説明するものである。
【図７Ｂ】ＥＣＨＫを用いて分析した場合の、２−［２−チエニル］−フラン由来の付加物Ｉのフルスキャンスペクトル（上段）およびプロダクトイオンスペクトル（下段）を説明するものである。
【図７Ｃ】ＥＣＨＫを用いて分析した場合の、２−［２−チエニル］−フラン由来の付加物ＩＩのフルスキャンスペクトル（上段）およびプロダクトイオンスペクトル（下段）を説明するものである。
【図７Ｄ】ＥＣＨＫを用いて分析した場合の、２−［２−チエニル］−フラン由来の付加物ＩＩＩのフルスキャンスペクトル（上段）およびプロダクトイオンスペクトル（下段）を説明するものである。
【図８Ａ】ＥＣＨＫを用いて分析した場合の、ジクロフェナクアシルグルクロニドについての、ＴＩＣ（上段）、および、１２９ＤａのニュートラルロススキャニングのＴＩＣ（下段）を説明するものである。
【図８Ｂ】ＥＣＨＫを用いて分析した場合の、ジクロフェナクアシルグルクロニド由来の付加物Ｉのフルスキャンスペクトル（上段）およびプロダクトイオンスペクトル（下段）を説明するものである。
【図９Ａ】ＥＨＣＫを用いて分析した場合の、ジクロフェナクについての、ＴＩＣ（上段）、および、１２９ＤａのニュートラルロススキャニングのＴＩＣ（下段）を説明するものである。
【図９Ｂ】ＥＨＣＫを用いて分析した場合の、ジクロフェナク由来の付加物Ｉのフルスキャンスペクトル（上段）およびプロダクトイオンスペクトル（下段）を説明するものである。
【図９Ｃ】ＥＨＣＫを用いて分析した場合の、ジクロフェナク由来の付加物ＩＩのフルスキャンスペクトル（上段）およびプロダクトイオンスペクトル（下段）を説明するものである。
【図１０Ａ】ＥＨＣＫを用いて分析した場合の、クロザピンについての、ＴＩＣ（上段）、および、１２９ＤａのニュートラルロススキャニングのＴＩＣ（下段）を説明するものである。
【図１０Ｂ】ＥＨＣＫを用いて分析した場合の、クロザピン由来の付加物Ｉのフルスキャンスペクトル（上段）およびプロダクトイオンスペクトル（下段）を説明するものである。
【図１１Ａ】ＥＨＣＫを用いて分析した場合の、２−［２−チエニル］−フランについての、ＴＩＣ（上段）、および、１２９ＤａのニュートラルロススキャニングのＴＩＣ（下段）を説明するものである。
【図１１Ｂ】ＥＨＣＫを用いて分析した場合の、２−［２−チエニル］−フラン由来の付加物Ｉのフルスキャンスペクトル（上段）およびプロダクトイオンスペクトル（下段）を説明するものである。
【図１１Ｃ】ＥＨＣＫを用いて分析した場合の、２−［２−チエニル］−フラン由来の付加物ＩＩのフルスキャンスペクトル（上段）およびプロダクトイオンスペクトル（下段）を説明するものである。
【図１１Ｄ】ＥＨＣＫを用いて分析した場合の、２−［２−チエニル］−フラン由来の付加物ＩＩＩのフルスキャンスペクトル（上段）およびプロダクトイオンスペクトル（下段）を説明するものである。
【図１２Ａ】ＥＨＣＫを用いて分析した場合の、ジクロフェナクアシルグルクロニドについての、ＴＩＣ（上段）、および、１２９ＤａのニュートラルロススキャニングのＴＩＣ（下段）を説明するものである。
【図１２Ｂ】ＥＨＣＫを用いて分析した場合の、ジクロフェナクアシルグルクロニド由来の付加物Ｉのフルスキャンスペクトル（上段）およびプロダクトイオンスペクトル（下段）を説明するものである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、反応性代謝物に結合する能力を有する非同位体トラッピング化合物、すなわち、式（Ｉ）の化合物：
【化２】
に向けられたものであり、式中、
ＸはＣＨ２であり、かつ、
ｐ、ｑおよびｒはそれぞれ独立して０または１であるが、
但し、ｐが０であり、ｑが０であり、かつ、ｒが１である化合物は除外されるものとする。
【００１３】
式（Ｉ）の化合物はトリペプチド誘導体である。式（Ｉ）の化合物は、固相ペプチド合成により、保護アミノ酸（グルタミン酸、システイン／ホモシステイン、および、リシン／ホモリシン／オルニチン／β−リシン）から調製することができる。
【００１４】
式（Ｉ）の化合物は、好ましくは、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）の化合物：
【化３】
【化４】
【化５】
である。
【００１５】
式（ＩＩ）の化合物は、ＥＣＯと略記されるγ−グルタミルシステイニルオルニチンであり、式（ＩＩＩ）の化合物は、ＥＣＨＫと略記されるγ−グルタミルシステイニルホモリシンであり、また、式（ＩＶ）の化合物は、ＥＨＣＫと略記されるγ−グルタミルホモシステイニルリシンである。
【００１６】
式（Ｉ）〜（ＩＶ）の化合物は３つのキラル炭素を有しており、種々の立体異性体が存在する。式（Ｉ）〜（ＩＶ）の化合物はいずれの立体異性体であってもよく、またはその混合物であってもよい。好ましくは、式（Ｉ）〜（ＩＶ）の化合物は、ある特定の立体異性体のみを実質的に含む。より好ましくは、式（Ｉ）〜（ＩＶ）の化合物を構成するアミノ酸は、すべてＬ型であるか、または、すべてＤ型である。
【００１７】
式（Ｉ）の化合物は２つの「トラッピングゾーン」を有し、これらは、それぞれ、「ハード」な反応性代謝物と「ソフト」な反応性代謝物とをトラップする。より詳細には、式（Ｉ）の化合物上のスルフヒドリル（−ＳＨ）基は、いわゆる「ソフト」な反応性代謝物と反応して、それらをトラップし、一方、式（Ｉ）の化合物上の−（Ｘ）ｒ−ＣＨ２−ＮＨ２基は、いわゆる「ハード」な反応性代謝物と反応して、それらをトラップする。よって、式（Ｉ）の化合物は、「ハード」な反応性代謝物と「ソフト」な反応性代謝物の両方を同時にトラップする能力を有する。
【化６】
【００１８】
特に断りのない限り、本明細書で用いられている「反応性代謝物」という語には、「ソフト」な反応性代謝物および「ハード」な反応性代謝物ならびにアシルグルクロニドが含まれるものとする。
【００１９】
特に断りのない限り、本明細書で用いられている「ソフトな代謝物」という語は、例えばシステイン中のスルフヒドリル基および式（Ｉ）の化合物上の−ＳＨ基などの、「ソフト」な求核基と容易に反応する少なくとも１つの置換基を含む任意の求電子性代謝物を意味するものとする。そのような置換基の適切な例としては、キノン、キノンイミン、イミノキノンメチド、エポキシド、アレーンオキシド、および、ニトレニウムイオンなどが挙げられるが、これに限定されない。
【００２０】
特に断りのない限り、本明細書で用いられている「ハードな代謝物」という語は、例えばリシン、アルギニンといったアミン、または、式（Ｉ）の化合物の−（Ｘ）ｒ−ＣＨ２−ＮＨ２基などの、「ハード」な求核基と容易に反応する少なくとも１つの置換基を含む任意の求電子性代謝物を意味するものとする。そのような置換基の適切な例としては、アルデヒドなどが挙げられるが、これに限定されない。
【００２１】
特に断りのない限り、本明細書で用いられている「アシルグルクロニド」という語は、例えばシステイン中のスルフヒドリル基、式（Ｉ）の化合物の−ＳＨ基、リシン、アルギニンといったアミン、または式（Ｉ）の化合物の−（Ｘ）ｒ−ＣＨ２−ＮＨ２基などの、求核基と反応する任意の反応性代謝物を意味するものとする。そのような置換基の適切な例としては、１−Ｏ−β−アシルグルクロニドなどが挙げられるが、これに限定されない。
【００２２】
反応性代謝物は、試験化合物に付随する数多くの有害事象、特に、深刻なおよび／または有毒性の有害事象、に関係していることから、試験化合物によって生じるすべての反応性代謝物を検出できることは非常に望ましいことである。試験化合物が反応性代謝物を生じるかどうかを、その試験化合物の、ヒトへの投与前に判定することは、さらに、非常に望ましい。
【００２３】
当業者は、すべての試験化合物が反応性代謝物を生じるとは限らないということ、そして、さらには、すべての試験化合物が「ソフト」な反応性代謝物および「ハード」な反応性代謝物ならびにアシルグルクロニドを生じるとは限らないということを理解するであろう。反応性代謝物を生じない試験化合物もあるであろうし、「ハード」な反応性代謝物のみを生じる試験化合物もあるであろうし、「ソフト」な反応性代謝物のみを生じる試験化合物もあるであろうし、アシルグルクロニドのみを生じる試験化合物もあるであろうし、また、「ソフト」な反応性代謝物および「ハード」な反応性代謝物ならびにアシルグルクロニドを生じる試験化合物もあるであろう。よって、本発明のトラッピング化合物および方法は、試験化合物によって生じるあらゆるタイプの反応性代謝物を検出する。
【００２４】
当業者は、本発明の方法は、反応性代謝物を同定することに向けられたものであると同時に、試験化合物が反応性代謝物を生じるかどうかを判定するプロセスをも包含している、ということをさらに理解するであろう。一実施形態においては、本発明は、有望な薬物候補（例えば、反応性代謝物を生じない試験化合物）を同定するための方法に向けられたものである。よって、本発明の方法には、（本明細書において、より詳細に記載されているような）インキュベーションにより、反応性代謝物、ひいては付加物がもたらされることがなく、かつ、１２９Ｄａまたは１４７Ｄａのニュートラルロススキャニングの全イオンスペクトルがピークを示さず、それにより、当該試験化合物が、検出可能ないかなる反応性代謝物も生じないということが指し示される、というプロセスが含まれる。
【００２５】
「ソフト」な代謝物に対しては、グルタチオンは、「ソフト」な反応性代謝物を検出するためにミクロソームインキュベーションにおいて使用される最も一般的なトラッピング剤である。しかしながら、「ハード」な反応性代謝物およびアシルグルクロニドに対しては、グルタチオンは、そのトラッピング効率ゆえに、適切なトラッピング剤ではない。むしろ、「ハード」な反応性代謝物を検出するためには、代わりとなるトラッピング剤、例えばセミカルバジド、メトキシルアミンおよびα−アセチルリシンなど、が使用される。他方で、アシルグルクロニドを検出するためには、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）が有用である。上記の理由から、これらは、「ハード」な反応性代謝物および「ソフト」な反応性代謝物ならびにアシルグルクロニドの検出のために、異なるトラッピング剤を用いた３つの別々の実験を必要とする。この状況であっても、本発明は、式（Ｉ）の非同位体標識化合物により、一度の実験での、「ソフト」な反応性代謝物および「ハード」な反応性代謝物、ならびに、さらにはアシルグルクロニドの検出のための新規の方法を与えることができるという特定の特徴を指し示している。
【００２６】
特に断りのない限り、本明細書で用いられている「薬物代謝酵素」は、試験化合物を代謝することのできる、ヒトまたは動物組織由来の、好ましくはヒト、ラット、マウス、ハムスター、イヌ、サルまたはウサギ組織由来の、より好ましくはヒト、ラット、マウス、ハムスター、イヌ、サルまたはウサギの肝組織由来の、任意の酵素またはその混合物を意味するものとする。（例えば、Drug Metabolizing Enzymes, Edited by JaeS. Lee, R. Scott Obach and Michael B. Fisher, Marcel Dekker, lnc. (2003)を参照のこと。）適切な例としては、肝ミクロソーム、シトクロムＰ４５０酵素、または、シトクロムＰ４５０酵素の種々のアイソフォームの混合物、ペルオキシダーゼ、シクロオキシゲナーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）等が挙げられるが、これに限定されない。好ましくは、薬物代謝酵素はヒト肝ミクロソームであり、より好ましくは、シトクロムＰ４５０酵素、組換え酵素およびＵＧＴである。当業者は、試験化合物を、ＵＧＴおよびシトクロムＰ４５０酵素またはシトクロムＰ４５０酵素の種々のアイソフォームの混合物とともにインキュベートする場合には、このＵＧＴおよびシトクロムＰ４５０酵素またはシトクロムＰ４５０の種々のアイソフォームの混合物は、ウリジン二リン酸グルクロン酸（ＵＤＰＧＡ）およびＮＡＤＰＨ補因子またはＮＡＤＰＨ再生系と組み合わせてインキュベートされる、ということを理解するであろう。
【００２７】
特に断りのない限り、本明細書で用いられている「試験化合物」という語は、反応性代謝物（単数または複数）の形成について試験される任意の化学物質を意味するものとする。好ましくは、試験化合物は、薬学的な作用物質またはその塩、エステルもしくはプロドラッグである。
【００２８】
特に断りのない限り、本明細書で用いられている「薬物候補」という語は、反応性代謝物（単数または複数）を生じない任意の化学物質または試験化合物を意味するものとする。好ましくは、薬物候補は、薬学的な作用物質またはその塩、エステルもしくはプロドラッグである。
【００２９】
別途指示がない限り、本明細書で用いられている「付加物」という語は、反応性代謝物の、式（Ｉ）の化合物との、任意の共有結合複合体を意味するものとする。
【００３０】
本明細書、特にスキームおよび実施例、において用いられている略語は、以下の通りである：
ＡＰＣＩ−ＭＳ／ＭＳ＝大気圧化学イオン化タンデム質量分析
ＣＹＰ＝シトクロムＰ４５０酵素
ＵＧＴ＝ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ
Ｄａ＝ダルトン
ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ＝エレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析
ＨＰＬＣ＝高速液体クロマトグラフィー
ＭＳ＝質量分析
ＮＡＤＰＨ＝β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）
ＳＰＥ＝固相抽出
ＵＤＰＧＡ＝ウリジン二リン酸グルクロン酸
【００３１】
本発明の一実施形態では、当該薬物代謝酵素は、ヒト肝ミクロソーム、シトクロムＰ４５０酵素、ペルオキシダーゼ、シクロオキシゲナーゼ、ミエロペルオキシダーゼおよびＵＧＴからなる群より選択される。好ましくは、当該薬物代謝酵素はシトクロムＰ４５０酵素およびＵＧＴである。
【００３２】
一実施形態では、薬物代謝酵素、例えばＳ９、組換え酵素またはミクロソーム酵素など、を含有する細胞の任意の分画とともに試験化合物をインキュベートすることにより形成された反応性代謝物を検出するのに、本発明を適用する。一実施形態では、試験化合物が、ヒト対象内で（すなわち、この試験化合物のヒトへの投与後に）反応性代謝物を形成するかどうかを予測するのに本発明の方法を適用する。
【００３３】
当業者は、「Ｓ９」という略語が、Ｓ９画分（ポストミトコンドリア上清画分）を指し、これはミクロソームとサイトゾルとの混合物である、とのことを理解するであろう。したがって、これは、Ｐ４５０酵素、フラビンモノオキシゲナーゼ、カルボキシルエステラーゼ、エポキシドヒドロラーゼ、ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼ、メチルトランスフェラーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼおよび他の薬物代謝酵素などの、種々の第Ｉ相および第ＩＩ相酵素を含有する。
【００３４】
１種類以上のインキュベーション生成物（非反応性代謝物、反応性代謝物と式（Ｉ）の化合物との間で形成された付加物）を含有する生成物混合物は、好ましくは、公知の方法に従って、例えば遠心分離、ＳＰＥ、蒸発または液−液抽出によって、精製し、濃縮して、生成物濃縮物を得る。次いで、この生成物濃縮物を、質量分析における使用に適した（すなわち、質量分析計への注入に適した）溶媒、例えば水中５％アセトニトリルおよび水中５％メタノールなど、に溶解させる。
【００３５】
好ましくは、この生成物混合物は、公知の方法に従って、例えば液体クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、キャピラリー電気泳動、または他の分離技術によって、個々の付加物成分に分離する。次いで、ニュートラルロス質量スペクトルを、各付加物または付加物成分について測定する。ニュートラルロス質量スペクトルは、公知の方法に従って、任意のイオン化源を用いて、例えばＡＰＣＩ−ＭＳ／ＭＳおよびＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳなどによって、好ましくはＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳによって、測定してもよい。あるいは、分離および質量スペクトル測定は、例えばＬＣ／ＭＳなどのループシステムを用いて、１ステップで完了させてもよい。
【００３６】
本発明の方法は、試験化合物が、一度の実験で、「ハード」な反応性代謝物および／もしくは「ソフト」な反応性代謝物ならびに／またはアシルグルクロニドを生じるかどうかを判定することが意図されたものである。当業者は、本発明の方法により「ハード」な反応性代謝物および「ソフト」な反応性代謝物の両方ならびにアシルグルクロニドが同時に検出されることとなるが、ある特定の試験化合物から、「ハード」な反応性代謝物、「ソフト」な反応性代謝物またはアシルグルクロニドのいずれかが形成されない場合には、この方法は、いずれかのタイプの反応性代謝物が形成されるかを検出するために行われることとなる、ということを理解するであろう。加えて、反応性代謝物が形成されない場合には、この方法により、１２９Ｄａおよび１４７Ｄａのニュートラルロススキャニングの全イオンスペクトルにピークがないことを示す質量スペクトルが作成され、それにより、その試験化合物が薬物候補として同定されることとなる。
【００３７】
本発明は、さらに、薬物候補（すなわち、いかなる反応性代謝物も生じない試験化合物）を同定するための方法であって、
（ａ）試験化合物を、式（Ｉ）の非同位体標識化合物と薬物代謝酵素とを含む混合物とともにインキュベートして、生成物混合物を得ること；
（ｂ）工程（ａ）において生じた生成物混合物のニュートラルロス質量スペクトルを測定すること；および
（ｃ）ニュートラルロス質量スペクトルにおいてピークがないことを検出すること、
を含む方法に向けられたものである。
【００３８】
以下の実施例は、本発明の理解を助けるために記載したものであり、添付の特許請求の範囲において記載されている本発明をなんらかの形で限定するようには意図されておらず、また、そのように解釈されるべきではない。
【実施例】
【００３９】
実施例１：「ソフト」な反応性代謝物および「ハード」な反応性代謝物をトラップするための標準的な手順
【００４０】
Ａ．インキュベーション＆化合物トラッピング：
【００４１】
ここで記載するすべてのミクロソームインキュベーションは、３７℃にて、ウォーターバス中またはヒートブロック上で行った。試験化合物を、０．１ｍＭのＥＤＴＡを含む１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中のヒト肝ミクロソーム製剤（シトクロムＰ４５０酵素製剤）および式（Ｉ）の化合物と混合した。得られた混合物を、３７℃で５分間、予め温めておいた。次いで、この反応混合物に、補因子−ＮＡＤＰＨを（反応を開始させるために）添加して、最終体積を５００μｌにした。
【００４２】
得られた反応混合物は、５０μＭの試験化合物、２ｍｇ／ｍｌのミクロソームタンパク質、１ｍＭの式（Ｉ）の化合物の混合物および３ｍＭのＮＡＤＰＨを含有していた。
【００４３】
１５または６０分のインキュベーション後、１０００μｌの５０％メタノール／５０％アセトニトリルの添加により反応を終結させた。得られた混合物を、１０，０００ｇで１０分間、４℃にて遠心して沈殿タンパク質をペレットにし、上清を乾燥させた。得られた残渣を、５０％メタノールで可溶化した。
【００４４】
Ｂ．質量分析：
【００４５】
ＭＳ分析は、ＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＦＴＭＳ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、ブレーメン、ドイツ）で行った。ＥＳＩイオン源は陽イオンモードで動作させた。全溶出液を、この質量分析計中へ、＋５ｋＶで噴霧し、この溶媒液滴の脱溶媒和を、３５０℃の加熱したキャピラリー温度によってさらに支援した。ニュートラルロススキャニングモードで収集される質量スペクトルは、ｍ／ｚ ２００〜１１００の範囲にわたり、分解能３００００でスキャンすることによって得た。
【００４６】
Ｃ．ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析：
【００４７】
反応性代謝物の完全プロファイリングのために、試料を、まず、オートサンプラーを備えたＰｒｏｍｉｎｅｎｃｅ ＬＣシステム（島津製作所、京都、日本）を用いてクロマトグラフ分離に供し、溶出液を、ニュートラルロススキャニングモードで動作させたＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＦＴＭＳに導入した。クロマトグラフ分離には、Ｌ−カラムＯＤＳ（オクタデシルシリル−シリカゲル；２．１×１５０ｍｍ、化学物質評価研究機構、東京、日本）を用いた。このクロマトグラフシステムでは、溶媒Ａ（５ｍＭの酢酸アンモニウム）と溶媒Ｂ（５ｍＭの酢酸アンモニウムを含む９５％アセトニトリル）との勾配として送達される二成分溶媒系が用いられた。初期勾配条件は９５％Ａ：５％Ｂを４分間であり、その後は、次の１３分にわたって１００％Ｂまでの流速０．２５ｍＬ／分での直線勾配であった。当該溶媒組成は、その後、初期条件での再平衡化の前に、１００％Ｂで８分間保持した。精製した試料の２０μｌずつに対してＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を行った。データ取得は、Ｘｃａｌｉｂｅｒ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０ソフトウェア（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、ブレーメン、ドイツ）を用いて行った。
【００４８】
実施例２〜４：ソフトな反応性代謝物および／またはハードな反応性代謝物の検出
【００４９】
上記実施例１に記載されている手順に従って、本発明の方法とＥＣＯとを適用することにより、１２９Ｄａまたは１４７Ｄａのニュートラルロススキャニングを用いて、「ソフト」な反応性代謝物および／または「ハード」な反応性代謝物を生じることが知られている試験化合物の反応性代謝物を検出した。
【００５０】
実施例２：ＥＣＯによって分析したジクロフェナク
【００５１】
「ソフト」な反応性代謝物を検出するべく、本方法およびＥＣＯの有用性を評価するための試験化合物として、ジクロフェナクを選択した。
【００５２】
図１Ａは、当該反応混合物について得た、全イオンクロマトグラム（ＴＩＣ）、ならびに、１２９Ｄａおよび１４７ＤａのニュートラルロススキャニングのＴＩＣを示している。１４７ＤａのニュートラルロススキャニングのＴＩＣにおいて、保持時間１０．２分にて検出された最も強いピークは、ｍ／ｚ ６４０および６７４にてプロトン化イオンを示す、ジクロフェナクの反応性代謝物の、ＥＣＯとの２種類の付加物を含むものであった。この２種類の付加物のフルスキャンスペクトルおよびプロダクトイオンスペクトルを、それぞれ、図１Ｂおよび１Ｃに示した。
【００５３】
本方法において検出された、ジクロフェナクの反応性代謝物の、ＥＣＯとの２種類の付加物の形成は、下記のスキームＥ１で概説する通りである。
【化７】
【００５４】
実施例３：ＥＣＯによって分析したクロザピン
【００５５】
「ソフト」な反応性代謝物を検出するべく、本方法およびＥＣＯの有用性を評価するための試験化合物として、クロザピンを選択した。
【００５６】
図２Ａは、当該反応混合物について得た、ＴＩＣ、ならびに、１２９Ｄａおよび１４７ＤａのニュートラルロススキャニングのＴＩＣを示している。１４７ＤａのニュートラルロススキャニングのＴＩＣにおいて、保持時間１０．３分にて検出された最も強いピークは、ｍ／ｚ ６８９にてプロトン化イオンを示す、１種類の付加物を含むものであった。この付加物のフルスキャンスペクトルおよびプロダクトイオンスペクトルを、図２Ｂに示した。
【００５７】
本方法において検出された、クロザピンの反応性代謝物の、ＥＣＯとの付加物の形成は、下記のスキームＥ２で概説する通りである。
【化８】
【００５８】
実施例４：ＥＣＯによって分析した２−［２−チエニル］−フラン
【００５９】
「ソフト」な反応性代謝物と「ハード」な反応性代謝物の両方を検出するべく、本方法およびＥＣＯの有用性を評価するための試験化合物として、２−［２−チエニル］−フランを選択した。
【００６０】
図３Ａは、当該反応混合物について得た、ＴＩＣ、ならびに、１２９Ｄａおよび１４７ＤａのニュートラルロススキャニングのＴＩＣを示している。３つの強いピークが、１２９ＤａのニュートラルロススキャニングのＴＩＣにおいて、保持時間１０．２分、１０．７分および１１．０分にて検出された。１０．２分における第一成分は、図３Ｂに示すように、フルスキャンスペクトルにおいて、ｍ／ｚ ５１３にてプロトン化イオンを示し、また、ｍ／ｚ ３８４にてプロダクトイオンを示したが、これは、プロダクトイオンスペクトルにおいてピログルタミン酸部分の喪失を指し示すものであった。１０．７分における第二成分は、図３Ｃに示すように、フルスキャンスペクトルにおいて、ｍ／ｚ ４８１にてプロトン化イオンを示し、また、ｍ／ｚ ３５２にてプロダクトイオンを示したが、これは、プロダクトイオンスペクトルにおいてピログルタミン酸部分の喪失を指し示すものであった。１１．０分における第三成分は、図３Ｄに示すように、フルスキャンスペクトルにおいて、ｍ／ｚ ４９５にてプロトン化イオンを示し、また、ｍ／ｚ ３６６にてプロダクトイオンを示したが、これは、プロダクトイオンスペクトルにおいてピログルタミン酸部分の喪失を指し示すものであった。
【００６１】
本方法において検出された、２−［２−チエニル］−フランの反応性代謝物の、ＥＣＯとの３種類の付加物の形成は、下記のスキームＥ３で概説する通りである。
【化９】
【００６２】
実施例５：アシルグルクロニドをトラップするための標準的な手順
【００６３】
Ａ．インキュベーション＆化合物トラッピング：
【００６４】
ここで記載するすべてのインキュベーションは、３７℃にて、ウォーターバス中またはヒートブロック上で行った。ジクロフェナクアシルグルクロニドを、０．１ｍＭのＥＤＴＡを含む１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中に添加した。得られた混合物を、３７℃で５分間、予め温めておいた。次いで、この反応混合物に、式（Ｉ）の化合物を（反応を開始させるために）添加して、最終体積を５００μｌにした。
【００６５】
得られた反応混合物は、１００μＭのジクロフェナクアシルグルクロニド、１ｍＭの式（Ｉ）の化合物の混合物を含有していた。
【００６６】
６０分のインキュベーション後、氷上に置くことによりインキュベーションを停止させ、試料の２０μｌずつをＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析に適用した。
【００６７】
Ｂ．質量分析：
【００６８】
ＭＳ分析は、ＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＦＴＭＳ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、ブレーメン、ドイツ）で行った。ＥＳＩイオン源は陽イオンモードで動作させた。全溶出液を、この質量分析計中へ、＋５ｋＶで噴霧し、この溶媒液滴の脱溶媒和を、３５０℃の加熱したキャピラリー温度によってさらに支援した。ニュートラルロススキャニングモードで収集される質量スペクトルは、ｍ／ｚ ２００〜１１００の範囲にわたり、分解能３００００でスキャンすることによって得た。
【００６９】
Ｃ．ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析：
【００７０】
反応性代謝物の完全プロファイリングのために、試料を、まず、オートサンプラーを備えたＰｒｏｍｉｎｅｎｃｅ ＬＣシステム（島津製作所、京都、日本）を用いてクロマトグラフ分離に供し、溶出液を、ニュートラルロススキャニングモードで動作させたＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＦＴＭＳに導入した。クロマトグラフ分離には、Ｌ−カラムＯＤＳ（２．１×１５０ｍｍ、化学物質評価研究機構、東京、日本）を用いた。このクロマトグラフシステムでは、溶媒Ａ（５ｍＭの酢酸アンモニウム）と溶媒Ｂ（５ｍＭの酢酸アンモニウムを含む９５％アセトニトリル）との勾配として送達される二成分溶媒系が用いられた。初期勾配条件は９５％Ａ：５％Ｂを４分間であり、その後は、次の１３分にわたって１００％Ｂまでの直線勾配であった。当該溶媒組成は、その後、初期条件での再平衡化の前に、１００％Ｂで８分間保持した。精製した試料の２０μｌずつに対してＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を行った。データ取得は、Ｘｃａｌｉｂｅｒ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０ソフトウェア（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、ブレーメン、ドイツ）を用いて行った。
【００７１】
実施例６：ＥＣＯによって分析したジクロフェナクアシルグルクロニド
【００７２】
ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼによって生じた反応性代謝物を検出するべく、本方法およびＥＣＯの有用性を評価するための試験化合物として、ジクロフェナクアシルグルクロニドを選択した。
【００７３】
図４Ａは、当該反応混合物について得た、ＴＩＣ、ならびに、１２９Ｄａおよび１４７ＤａのニュートラルロススキャニングのＴＩＣを示している。共通の強いピークが、１２９Ｄａおよび１４７ＤａのニュートラルロススキャニングのＴＩＣにおいて、保持時間１２．１分にて検出された。このピークは、図４Ｂに示すように、フルスキャンスペクトルにおいて、ｍ／ｚ ６４２にてプロトン化イオンを示し、また、ｍ／ｚ ４９５にてプロダクトイオンを示すが、これは、プロダクトイオンスペクトルにおいてピログルタミン酸部分の喪失を指し示すものであった。
【００７４】
本方法において検出された、ジクロフェナクアシルグルクロニドのＥＣＯとの付加物の形成は、下記のスキームＥ４で概説する通りである。
【化１０】
【００７５】
実施例７〜９：ソフトな反応性代謝物および／またはハードな反応性代謝物の検出
【００７６】
上記実施例１に記載されている手順に従って、本発明の方法とＥＣＨＫとを適用することにより、１２９Ｄａのニュートラルロススキャニングを用いて、「ソフト」な反応性代謝物および／または「ハード」な反応性代謝物を生じることが知られている試験化合物の反応性代謝物を検出した。
実施例７：ＥＣＨＫによって分析したジクロフェナク
【００７７】
「ソフト」な反応性代謝物を検出するべく、本方法およびＥＣＨＫの有用性を評価するための試験化合物として、ジクロフェナクを選択した。
【００７８】
図５Ａは、当該反応混合物について得た、ＴＩＣおよび１２９ＤａのニュートラルロススキャニングのＴＩＣを示している。１２９ＤａのニュートラルロススキャニングのＴＩＣにおいて、保持時間１０．７分にて検出された最も強いピークは、ｍ／ｚ ６６８および７０２にてプロトン化イオンを示す、ジクロフェナクの反応性代謝物の、ＥＣＨＫとの２種類の付加物を含むものであった。この２種類の付加物のフルスキャンスペクトルおよびプロダクトイオンスペクトルを、それぞれ、図５Ｂおよび５Ｃに示した。
【００７９】
本方法において検出された、ジクロフェナクの反応性代謝物の、ＥＣＨＫとの２種類の付加物の形成は、下記のスキームＥ５で概説する通りである。
【化１１】
【００８０】
実施例８：ＥＣＨＫによって分析したクロザピン
【００８１】
「ソフト」な反応性代謝物を検出するべく、本方法およびＥＣＨＫの有用性を評価するための試験化合物として、クロザピンを選択した。
【００８２】
図６Ａは、当該反応混合物について得た、ＴＩＣおよび１２９ＤａのニュートラルロススキャニングのＴＩＣを示している。１２９ＤａのニュートラルロススキャニングのＴＩＣにおいて、保持時間１１．１分にて検出された最も強いピークは、ｍ／ｚ ７１７にてプロトン化イオンを示す、１種類の付加物を含むものであった。この付加物のフルスキャンスペクトルおよびプロダクトイオンスペクトルを、図６Ｂに示した。
【００８３】
本方法において検出された、クロザピンの反応性代謝物の、ＥＣＨＫとの付加物の形成は、下記のスキームＥ６で概説する通りである。
【化１２】
【００８４】
実施例９：ＥＣＨＫによって分析した２−［２−チエニル］−フラン
【００８５】
「ソフト」な反応性代謝物と「ハード」な反応性代謝物の両方を検出するべく、本方法およびＥＣＨＫの有用性を評価するための試験化合物として、２−［２−チエニル］−フランを選択した。
【００８６】
図７Ａは、当該反応混合物について得た、ＴＩＣおよび１２９ＤａのニュートラルロススキャニングのＴＩＣを示している。２つの強いピークが、１２９ＤａのニュートラルロススキャニングのＴＩＣにおいて、保持時間１０．６分および１１．９分にて検出された。１０．６分における第一成分は、図７Ｂに示すように、フルスキャンスペクトルにおいて、ｍ／ｚ ５４１にてプロトン化イオンを示し、また、ｍ／ｚ ４１２にてプロダクトイオンを示したが、これは、プロダクトイオンスペクトルにおいてピログルタミン酸部分の喪失を指し示すものであった。１１．９分における第二成分は、２−［２−チエニル］−フランの反応性代謝物の、ＥＣＨＫとの２種類の付加物を含むものであり、そして、図７Ｃおよび７Ｄに示すように、フルスキャンスペクトルにおいて、ｍ／ｚ ５０９および５２３にてプロトン化イオンを示し、また、ｍ／ｚ ３８０および３９４にてプロダクトイオンを示したが、これは、プロダクトイオンスペクトルにおいてピログルタミン酸部分の喪失を指し示すものであった。
【００８７】
本方法において検出された、２−［２−チエニル］−フランの反応性代謝物の、ＥＣＨＫとの３種類の付加物の形成は、下記のスキームＥ７で概説する通りである。
【化１３】
【００８８】
実施例１０：ＥＣＨＫによって分析したジクロフェナクアシルグルクロニド
【００８９】
実施例５に記載されている手順に従って、本発明の方法とＥＣＨＫとを適用することにより、ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼによって生じた反応性代謝物を検出した。
【００９０】
ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼによって生じた反応性代謝物を検出するべく、本方法およびＥＣＨＫの有用性を評価するための試験化合物として、ジクロフェナクアシルグルクロニドを選択した。
【００９１】
図８Ａは、当該反応混合物について得た、ＴＩＣおよび１２９ＤａのニュートラルロススキャニングのＴＩＣを示している。１つの強いピークが、１２９ＤａのニュートラルロススキャニングのＴＩＣにおいて、保持時間１２．５分にて検出された。このピークは、図８Ｂに示すように、フルスキャンスペクトルにおいて、ｍ／ｚ ６７０にてプロトン化イオンを示し、また、ｍ／ｚ ５４１にてプロダクトイオンを示したが、これは、プロダクトイオンスペクトルにおいてピログルタミン酸部分の喪失を指し示すものであった。
【００９２】
本方法において検出された、ジクロフェナクアシルグルクロニドのＥＣＨＫとの付加物の形成は、下記のスキームＥ８で概説する通りである。
【化１４】
【００９３】
実施例１１〜１３：ソフトな反応性代謝物および／またはハードな反応性代謝物の検出
【００９４】
上記実施例１に記載されている手順に従って、本発明の方法とＥＨＣＫとを適用することにより、１２９Ｄａのニュートラルロススキャニングを用いて、「ソフト」な反応性代謝物および／または「ハード」な反応性代謝物を生じることが知られている試験化合物の反応性代謝物を検出した。
【００９５】
実施例１１：ＥＨＣＫによって分析したジクロフェナク
【００９６】
「ソフト」な反応性代謝物を検出するべく、本方法およびＥＨＣＫの有用性を評価するための試験化合物として、ジクロフェナクを選択した。
【００９７】
図９Ａは、当該反応混合物について得た、ＴＩＣおよび１２９ＤａのニュートラルロススキャニングのＴＩＣを示している。２つの強いピークが、１２９ＤａのニュートラルロススキャニングのＴＩＣにおいて、保持時間１０．５分および１０．８分にて検出された。１０．５分および１０．８分におけるこの２種類の成分は、ｍ／ｚ ６６８および７０２にてプロトン化イオンを示した。この２種類の付加物のフルスキャンスペクトルおよびプロダクトイオンスペクトルを、それぞれ、図９Ｂおよび９Ｃに示した。
【００９８】
本方法において検出された、ジクロフェナクの反応性代謝物の、ＥＣＨＫとの２種類の付加物の形成は、下記のスキームＥ９で概説する通りである。
【化１５】
【００９９】
実施例１２：ＥＨＣＫによって分析したクロザピン
【０１００】
「ソフト」な反応性代謝物を検出するべく、本方法およびＥＨＣＫの有用性を評価するための試験化合物として、クロザピンを選択した。
【０１０１】
図１０Ａは、当該反応混合物について得た、ＴＩＣおよび１２９ＤａのニュートラルロススキャニングのＴＩＣを示している。１２９ＤａのニュートラルロススキャニングのＴＩＣにおいて、保持時間１１．２分にて検出された最も強いピークは、ｍ／ｚ ７１７にてプロトン化イオンを示す、１種類の付加物を含むものであった。この付加物のフルスキャンスペクトルおよびプロダクトイオンスペクトルを、図１０Ｂに示した。
【０１０２】
本方法において検出された、クロザピンの反応性代謝物の、ＥＨＣＫとの付加物の形成は、下記のスキームＥ１０で概説する通りである。
【化１６】
【０１０３】
実施例１３：ＥＨＣＫによって分析した２−［２−チエニル］−フラン
【０１０４】
「ソフト」な反応性代謝物と「ハード」な反応性代謝物の両方を検出するべく、本方法およびＥＨＣＫの有用性を評価するための試験化合物として、２−［２−チエニル］−フランを選択した。
【０１０５】
図１１Ａは、当該反応混合物について得た、ＴＩＣおよび１２９ＤａのニュートラルロススキャニングのＴＩＣを示している。１２９ＤａのニュートラルロススキャニングのＴＩＣにおいて、保持時間１２．０分にて検出されたピークは、ｍ／ｚ ５０９、５４１および５２３にてプロトン化イオンを示す、２−［２−チエニル］−フランの反応性代謝物の、ＥＨＣＫとの３種類の付加物を含むものであった。この３種類の付加物のフルスキャンスペクトルおよびプロダクトイオンスペクトルを、それぞれ、図１１Ｂ、１１Ｃおよび１１Ｄに示した。
【０１０６】
本方法において検出された、２−［２−チエニル］−フランの反応性代謝物の、ＥＨＣＫとの３種類の付加物の形成は、下記のスキームＥ１１で概説する通りである。
【化１７】
【０１０７】
実施例１４：ＥＨＣＫによって分析したジクロフェナクアシルグルクロニド
【０１０８】
実施例５に記載されている手順に従って、本発明の方法とＥＨＣＫとを適用することにより、ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼによって生じた反応性代謝物を検出した。
【０１０９】
ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼによって生じた反応性代謝物を検出するべく、本方法およびＥＨＣＫの有用性を評価するための試験化合物として、ジクロフェナクアシルグルクロニドを選択した。
【０１１０】
図１２Ａは、当該反応混合物について得た、ＴＩＣおよび１２９ＤａのニュートラルロススキャニングのＴＩＣを示している。１つの強いピークが、１２９ＤａのニュートラルロススキャニングのＴＩＣにおいて、保持時間１２．８分にて検出された。このピークは、図１２Ｂに示すように、フルスキャンスペクトルにおいて、ｍ／ｚ ６７０にてプロトン化イオンを示し、また、ｍ／ｚ ５４１にてプロダクトイオンを示したが、これは、プロダクトイオンスペクトルにおいてピログルタミン酸部分の喪失を指し示すものであった。
【０１１１】
本方法において検出された、ジクロフェナクアシルグルクロニドのＥＨＣＫとの付加物の形成は、下記のスキームＥ１２で概説する通りである。
【化１８】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、反応性代謝物を検出するための非同位体トラッピング化合物および方法、ならびに、薬物候補を同定する方法、に向けられたものである。より詳細には、この、反応性代謝物を検出するための非同位体トラッピング化合物および方法を利用して、「ソフト」な反応性代謝物および「ハード」な反応性代謝物、ならびに、さらには、アシルグルクロニド、を検出することができる。
【背景技術】
【０００２】
患者の罹患率および死亡率の問題において、化合物の特定の毒性は、臨床開発においても上市後においても、依然として、安全性に対する深刻な懸念事項のままである。これらの特定の薬物有害事象は制限的使用につながり得り、また、市場からの撤退にさえつながり得り、このことは、結果的に、製薬会社に、より大きな負担をもたらす。有名な例として、トログリタゾンは、その上市後すぐに、予期せぬ毒性のために撤退した。
【０００３】
特定の薬物有害事象は、通常、個々の感受性の度合いが高い場合に現れる、まれなケースである。さらに、これらの反応は、一般に、用量非依存的に起こる。現在、ヒトにおいて専ら起こるような反応を評価するのに使用可能な動物モデルは存在しない。したがって、これらの特定の薬物毒性は、前臨床試験において正確に評価することができず、また、臨床試験において認識できない場合が多い。
【０００４】
現時点では、これらの特定の有害薬物反応のメカニズムはよく分かっていない。化学的に反応性の高い代謝物が特定の毒性に関係しているということを示唆する証拠が、特に肝毒性について、数多くある。特定の毒性に関連する数多くの化合物は、主にシトクロムＰ４５０酵素（ＣＹＰ）によって、同様に、例えばペルオキシダーゼ、シクロオキシゲナーゼおよびミエロペルオキシダーゼなどの他の酸化酵素によって仲介される種々の代謝経路を介して、または、ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）によって仲介される別の代謝経路を介して、反応性代謝物を生じる。これは、こうした毒性に関連する数多くの化合物が、まず、代謝活性化を受け、その結果、細胞タンパク質に共有結合する有毒性の反応性代謝物を生じる、と仮定したものである。これらの共有結合修飾されたタンパク質は、しばしば、抗原性であり、それ故に、免疫応答を刺激し、その結果、特定の薬物反応をもたらす。別の仮説では、反応性代謝物による細胞タンパク質の共有結合修飾がシグナル伝達カスケードと細胞の必須の機能とをブロックし、それにより、臨床上観察される致命的な結果が引き起こされる、と言われている。したがって、反応性代謝物を同定するための方法が深刻に必要とされている。
【０００５】
酸化酵素により生じる化学的な化合物の反応性代謝物は、化学的な性質に基づく、「ソフト」な反応性代謝物および「ハード」な反応性代謝物という、２つのカテゴリーに特徴付けることができる。「ソフト」な反応性代謝物には、キノン、キノンイミン、イミノキノンメチド、エポキシド、アレーンオキシドおよびニトレニウムイオンを含み、かつ、例えばシステイン中のスルフヒドリル基などの「ソフト」な求核基と容易に反応する、求電子性代謝物の大多数が含まれる。一方、「ハード」な反応性代謝物は、最も一般的にはアルデヒドと考えられているが、これらは、例えばリシン、アルギニンといったアミン、および、核酸などの、「ハード」な求核基と優先的に反応する。それらの不安定性ゆえに、反応性代謝物の直接の検出および特徴付けは、非常に困難であることが立証されている。一般的に利用されているアプローチの１つは、これらの反応性代謝物を捕捉分子でトラップすることであり、これにより、その後の例えばタンデム質量分析などの公知の検出方法による特徴付けが可能な、安定した付加物が形成される。
【０００６】
ＵＧＴにより生じる、反応性代謝物の別のカテゴリーは、アシルグルクロニドである。アシルグルクロニドは、本質的に反応性の化学種であり、分子内転位およびアノマー化、次いで、タンパク質との反応を経て、共有結合付加物を生じる。現在、ニュートラルロスタンデム質量分析を用いた、トラッピング剤を使用したアシルグルクロニドの検出システムに関する報告は存在しない。
【０００７】
最近、Huebertらは、ＷＯ２００８／０４２６３４Ａ２の中で、安定同位体標識トラッピング化合物と質量分析とを用いる、反応性代謝物を検出するための方法を開示した。しかしながら、Huebertらは、単に、「安定同位体標識化合物」を用いる方法を開示しただけであり、例示した一実施形態のような、いかなる「非同位体標識化合物」も示さなかった。また、Huebertらにより開示された方法は、「ソフト」な反応性代謝物および「ハード」な反応性代謝物を検出することができるのみであり、例示したもののような、いかなる「アシルグルクロニド」も検出することはできない。
【０００８】
他方で、本発明は、式（Ｉ）の非同位体化合物により、一度の実験での、「ソフト」な反応性代謝物および「ハード」な反応性代謝物、ならびに、さらにはアシルグルクロニドの検出のための新規の方法を与えることができるという特定の特徴を指し示している。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、（「ソフト」な反応性代謝物および「ハード」な反応性代謝物ならびにアシルグルクロニドを含む）反応性代謝物を同定するための非同位体トラッピング化合物、すなわち、式（Ｉ）の化合物：
【化１】
に向けられたものである。
【００１０】
本発明は、さらに、試験化合物の反応性代謝物を検出するための方法であって、
（ａ）試験化合物を、上記式（Ｉ）の化合物および薬物代謝酵素とともにインキュベートし、１種類以上の付加物を含む生成物混合物を得ること；ならびに
（ｂ）工程（ａ）の付加物を検出すること、
を含む方法に向けられたものである。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】ＥＣＯを用いて分析した場合の、ジクロフェナクについての、全イオンクロマトグラム（ＴＩＣ；上段）、ならびに、１２９Ｄａ（中段）および１４７Ｄａ（下段）のニュートラルロススキャニングのＴＩＣを説明するものである。
【図１Ｂ】ＥＣＯを用いて分析した場合の、ジクロフェナク由来の付加物Ｉのフルスキャンスペクトル（上段）およびプロダクトイオンスペクトル（下段）を説明するものである。
【図１Ｃ】ＥＣＯを用いて分析した場合の、ジクロフェナク由来の付加物ＩＩのフルスキャンスペクトル（上段）およびプロダクトイオンスペクトル（下段）を説明するものである。
【図２Ａ】ＥＣＯを用いて分析した場合の、クロザピンについての、ＴＩＣ（上段）、ならびに、１２９Ｄａ（中段）および１４７Ｄａ（下段）のニュートラルロススキャニングのＴＩＣを説明するものである。
【図２Ｂ】ＥＣＯを用いて分析した場合の、クロザピン由来の付加物Ｉのフルスキャンスペクトル（上段）およびプロダクトイオンスペクトル（下段）を説明するものである。
【図３Ａ】ＥＣＯを用いて分析した場合の、２−［２−チエニル］−フランについての、ＴＩＣ（上段）、ならびに、１２９Ｄａ（中段）および１４７Ｄａ（下段）のニュートラルロススキャニングのＴＩＣを説明するものである。
【図３Ｂ】ＥＣＯを用いて分析した場合の、２−［２−チエニル］−フラン由来の付加物Ｉのフルスキャンスペクトル（上段）およびプロダクトイオンスペクトル（下段）を説明するものである。
【図３Ｃ】ＥＣＯを用いて分析した場合の、２−［２−チエニル］−フラン由来の付加物ＩＩのフルスキャンスペクトル（上段）およびプロダクトイオンスペクトル（下段）を説明するものである。
【図３Ｄ】ＥＣＯを用いて分析した場合の、２−［２−チエニル］−フラン由来の付加物ＩＩＩのフルスキャンスペクトル（上段）およびプロダクトイオンスペクトル（下段）を説明するものである。
【図４Ａ】ＥＣＯを用いて分析した場合の、ジクロフェナクアシルグルクロニドについての、ＴＩＣ（上段）、ならびに、１２９Ｄａ（中段）および１４７Ｄａ（下段）のニュートラルロススキャニングのＴＩＣを説明するものである。
【図４Ｂ】ＥＣＯを用いて分析した場合の、ジクロフェナクアシルグルクロニド由来の付加物Ｉのフルスキャンスペクトル（上段）およびプロダクトイオンスペクトル（下段）を説明するものである。
【図５Ａ】ＥＣＨＫを用いて分析した場合の、ジクロフェナクについての、ＴＩＣ（上段）、および、１２９ＤａのニュートラルロススキャニングのＴＩＣ（下段）を説明するものである。
【図５Ｂ】ＥＣＨＫを用いて分析した場合の、ジクロフェナク由来の付加物Ｉのフルスキャンスペクトル（上段）およびプロダクトイオンスペクトル（下段）を説明するものである。
【図５Ｃ】ＥＣＨＫを用いて分析した場合の、ジクロフェナク由来の付加物ＩＩのフルスキャンスペクトル（上段）およびプロダクトイオンスペクトル（下段）を説明するものである。
【図６Ａ】ＥＣＨＫを用いて分析した場合の、クロザピンについての、ＴＩＣ（上段）、および、１２９ＤａのニュートラルロススキャニングのＴＩＣ（下段）を説明するものである。
【図６Ｂ】ＥＣＨＫを用いて分析した場合の、クロザピン由来の付加物Ｉのフルスキャンスペクトル（上段）およびプロダクトイオンスペクトル（下段）を説明するものである。
【図７Ａ】ＥＣＨＫを用いて分析した場合の、２−［２−チエニル］−フランについての、ＴＩＣ（上段）、および、１２９ＤａのニュートラルロススキャニングのＴＩＣ（下段）を説明するものである。
【図７Ｂ】ＥＣＨＫを用いて分析した場合の、２−［２−チエニル］−フラン由来の付加物Ｉのフルスキャンスペクトル（上段）およびプロダクトイオンスペクトル（下段）を説明するものである。
【図７Ｃ】ＥＣＨＫを用いて分析した場合の、２−［２−チエニル］−フラン由来の付加物ＩＩのフルスキャンスペクトル（上段）およびプロダクトイオンスペクトル（下段）を説明するものである。
【図７Ｄ】ＥＣＨＫを用いて分析した場合の、２−［２−チエニル］−フラン由来の付加物ＩＩＩのフルスキャンスペクトル（上段）およびプロダクトイオンスペクトル（下段）を説明するものである。
【図８Ａ】ＥＣＨＫを用いて分析した場合の、ジクロフェナクアシルグルクロニドについての、ＴＩＣ（上段）、および、１２９ＤａのニュートラルロススキャニングのＴＩＣ（下段）を説明するものである。
【図８Ｂ】ＥＣＨＫを用いて分析した場合の、ジクロフェナクアシルグルクロニド由来の付加物Ｉのフルスキャンスペクトル（上段）およびプロダクトイオンスペクトル（下段）を説明するものである。
【図９Ａ】ＥＨＣＫを用いて分析した場合の、ジクロフェナクについての、ＴＩＣ（上段）、および、１２９ＤａのニュートラルロススキャニングのＴＩＣ（下段）を説明するものである。
【図９Ｂ】ＥＨＣＫを用いて分析した場合の、ジクロフェナク由来の付加物Ｉのフルスキャンスペクトル（上段）およびプロダクトイオンスペクトル（下段）を説明するものである。
【図９Ｃ】ＥＨＣＫを用いて分析した場合の、ジクロフェナク由来の付加物ＩＩのフルスキャンスペクトル（上段）およびプロダクトイオンスペクトル（下段）を説明するものである。
【図１０Ａ】ＥＨＣＫを用いて分析した場合の、クロザピンについての、ＴＩＣ（上段）、および、１２９ＤａのニュートラルロススキャニングのＴＩＣ（下段）を説明するものである。
【図１０Ｂ】ＥＨＣＫを用いて分析した場合の、クロザピン由来の付加物Ｉのフルスキャンスペクトル（上段）およびプロダクトイオンスペクトル（下段）を説明するものである。
【図１１Ａ】ＥＨＣＫを用いて分析した場合の、２−［２−チエニル］−フランについての、ＴＩＣ（上段）、および、１２９ＤａのニュートラルロススキャニングのＴＩＣ（下段）を説明するものである。
【図１１Ｂ】ＥＨＣＫを用いて分析した場合の、２−［２−チエニル］−フラン由来の付加物Ｉのフルスキャンスペクトル（上段）およびプロダクトイオンスペクトル（下段）を説明するものである。
【図１１Ｃ】ＥＨＣＫを用いて分析した場合の、２−［２−チエニル］−フラン由来の付加物ＩＩのフルスキャンスペクトル（上段）およびプロダクトイオンスペクトル（下段）を説明するものである。
【図１１Ｄ】ＥＨＣＫを用いて分析した場合の、２−［２−チエニル］−フラン由来の付加物ＩＩＩのフルスキャンスペクトル（上段）およびプロダクトイオンスペクトル（下段）を説明するものである。
【図１２Ａ】ＥＨＣＫを用いて分析した場合の、ジクロフェナクアシルグルクロニドについての、ＴＩＣ（上段）、および、１２９ＤａのニュートラルロススキャニングのＴＩＣ（下段）を説明するものである。
【図１２Ｂ】ＥＨＣＫを用いて分析した場合の、ジクロフェナクアシルグルクロニド由来の付加物Ｉのフルスキャンスペクトル（上段）およびプロダクトイオンスペクトル（下段）を説明するものである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、反応性代謝物に結合する能力を有する非同位体トラッピング化合物、すなわち、式（Ｉ）の化合物：
【化２】
に向けられたものであり、式中、
ＸはＣＨ２であり、かつ、
ｐ、ｑおよびｒはそれぞれ独立して０または１であるが、
但し、ｐが０であり、ｑが０であり、かつ、ｒが１である化合物は除外されるものとする。
【００１３】
式（Ｉ）の化合物はトリペプチド誘導体である。式（Ｉ）の化合物は、固相ペプチド合成により、保護アミノ酸（グルタミン酸、システイン／ホモシステイン、および、リシン／ホモリシン／オルニチン／β−リシン）から調製することができる。
【００１４】
式（Ｉ）の化合物は、好ましくは、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）の化合物：
【化３】
【化４】
【化５】
である。
【００１５】
式（ＩＩ）の化合物は、ＥＣＯと略記されるγ−グルタミルシステイニルオルニチンであり、式（ＩＩＩ）の化合物は、ＥＣＨＫと略記されるγ−グルタミルシステイニルホモリシンであり、また、式（ＩＶ）の化合物は、ＥＨＣＫと略記されるγ−グルタミルホモシステイニルリシンである。
【００１６】
式（Ｉ）〜（ＩＶ）の化合物は３つのキラル炭素を有しており、種々の立体異性体が存在する。式（Ｉ）〜（ＩＶ）の化合物はいずれの立体異性体であってもよく、またはその混合物であってもよい。好ましくは、式（Ｉ）〜（ＩＶ）の化合物は、ある特定の立体異性体のみを実質的に含む。より好ましくは、式（Ｉ）〜（ＩＶ）の化合物を構成するアミノ酸は、すべてＬ型であるか、または、すべてＤ型である。
【００１７】
式（Ｉ）の化合物は２つの「トラッピングゾーン」を有し、これらは、それぞれ、「ハード」な反応性代謝物と「ソフト」な反応性代謝物とをトラップする。より詳細には、式（Ｉ）の化合物上のスルフヒドリル（−ＳＨ）基は、いわゆる「ソフト」な反応性代謝物と反応して、それらをトラップし、一方、式（Ｉ）の化合物上の−（Ｘ）ｒ−ＣＨ２−ＮＨ２基は、いわゆる「ハード」な反応性代謝物と反応して、それらをトラップする。よって、式（Ｉ）の化合物は、「ハード」な反応性代謝物と「ソフト」な反応性代謝物の両方を同時にトラップする能力を有する。
【化６】
【００１８】
特に断りのない限り、本明細書で用いられている「反応性代謝物」という語には、「ソフト」な反応性代謝物および「ハード」な反応性代謝物ならびにアシルグルクロニドが含まれるものとする。
【００１９】
特に断りのない限り、本明細書で用いられている「ソフトな代謝物」という語は、例えばシステイン中のスルフヒドリル基および式（Ｉ）の化合物上の−ＳＨ基などの、「ソフト」な求核基と容易に反応する少なくとも１つの置換基を含む任意の求電子性代謝物を意味するものとする。そのような置換基の適切な例としては、キノン、キノンイミン、イミノキノンメチド、エポキシド、アレーンオキシド、および、ニトレニウムイオンなどが挙げられるが、これに限定されない。
【００２０】
特に断りのない限り、本明細書で用いられている「ハードな代謝物」という語は、例えばリシン、アルギニンといったアミン、または、式（Ｉ）の化合物の−（Ｘ）ｒ−ＣＨ２−ＮＨ２基などの、「ハード」な求核基と容易に反応する少なくとも１つの置換基を含む任意の求電子性代謝物を意味するものとする。そのような置換基の適切な例としては、アルデヒドなどが挙げられるが、これに限定されない。
【００２１】
特に断りのない限り、本明細書で用いられている「アシルグルクロニド」という語は、例えばシステイン中のスルフヒドリル基、式（Ｉ）の化合物の−ＳＨ基、リシン、アルギニンといったアミン、または式（Ｉ）の化合物の−（Ｘ）ｒ−ＣＨ２−ＮＨ２基などの、求核基と反応する任意の反応性代謝物を意味するものとする。そのような置換基の適切な例としては、１−Ｏ−β−アシルグルクロニドなどが挙げられるが、これに限定されない。
【００２２】
反応性代謝物は、試験化合物に付随する数多くの有害事象、特に、深刻なおよび／または有毒性の有害事象、に関係していることから、試験化合物によって生じるすべての反応性代謝物を検出できることは非常に望ましいことである。試験化合物が反応性代謝物を生じるかどうかを、その試験化合物の、ヒトへの投与前に判定することは、さらに、非常に望ましい。
【００２３】
当業者は、すべての試験化合物が反応性代謝物を生じるとは限らないということ、そして、さらには、すべての試験化合物が「ソフト」な反応性代謝物および「ハード」な反応性代謝物ならびにアシルグルクロニドを生じるとは限らないということを理解するであろう。反応性代謝物を生じない試験化合物もあるであろうし、「ハード」な反応性代謝物のみを生じる試験化合物もあるであろうし、「ソフト」な反応性代謝物のみを生じる試験化合物もあるであろうし、アシルグルクロニドのみを生じる試験化合物もあるであろうし、また、「ソフト」な反応性代謝物および「ハード」な反応性代謝物ならびにアシルグルクロニドを生じる試験化合物もあるであろう。よって、本発明のトラッピング化合物および方法は、試験化合物によって生じるあらゆるタイプの反応性代謝物を検出する。
【００２４】
当業者は、本発明の方法は、反応性代謝物を同定することに向けられたものであると同時に、試験化合物が反応性代謝物を生じるかどうかを判定するプロセスをも包含している、ということをさらに理解するであろう。一実施形態においては、本発明は、有望な薬物候補（例えば、反応性代謝物を生じない試験化合物）を同定するための方法に向けられたものである。よって、本発明の方法には、（本明細書において、より詳細に記載されているような）インキュベーションにより、反応性代謝物、ひいては付加物がもたらされることがなく、かつ、１２９Ｄａまたは１４７Ｄａのニュートラルロススキャニングの全イオンスペクトルがピークを示さず、それにより、当該試験化合物が、検出可能ないかなる反応性代謝物も生じないということが指し示される、というプロセスが含まれる。
【００２５】
「ソフト」な代謝物に対しては、グルタチオンは、「ソフト」な反応性代謝物を検出するためにミクロソームインキュベーションにおいて使用される最も一般的なトラッピング剤である。しかしながら、「ハード」な反応性代謝物およびアシルグルクロニドに対しては、グルタチオンは、そのトラッピング効率ゆえに、適切なトラッピング剤ではない。むしろ、「ハード」な反応性代謝物を検出するためには、代わりとなるトラッピング剤、例えばセミカルバジド、メトキシルアミンおよびα−アセチルリシンなど、が使用される。他方で、アシルグルクロニドを検出するためには、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）が有用である。上記の理由から、これらは、「ハード」な反応性代謝物および「ソフト」な反応性代謝物ならびにアシルグルクロニドの検出のために、異なるトラッピング剤を用いた３つの別々の実験を必要とする。この状況であっても、本発明は、式（Ｉ）の非同位体標識化合物により、一度の実験での、「ソフト」な反応性代謝物および「ハード」な反応性代謝物、ならびに、さらにはアシルグルクロニドの検出のための新規の方法を与えることができるという特定の特徴を指し示している。
【００２６】
特に断りのない限り、本明細書で用いられている「薬物代謝酵素」は、試験化合物を代謝することのできる、ヒトまたは動物組織由来の、好ましくはヒト、ラット、マウス、ハムスター、イヌ、サルまたはウサギ組織由来の、より好ましくはヒト、ラット、マウス、ハムスター、イヌ、サルまたはウサギの肝組織由来の、任意の酵素またはその混合物を意味するものとする。（例えば、Drug Metabolizing Enzymes, Edited by JaeS. Lee, R. Scott Obach and Michael B. Fisher, Marcel Dekker, lnc. (2003)を参照のこと。）適切な例としては、肝ミクロソーム、シトクロムＰ４５０酵素、または、シトクロムＰ４５０酵素の種々のアイソフォームの混合物、ペルオキシダーゼ、シクロオキシゲナーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）等が挙げられるが、これに限定されない。好ましくは、薬物代謝酵素はヒト肝ミクロソームであり、より好ましくは、シトクロムＰ４５０酵素、組換え酵素およびＵＧＴである。当業者は、試験化合物を、ＵＧＴおよびシトクロムＰ４５０酵素またはシトクロムＰ４５０酵素の種々のアイソフォームの混合物とともにインキュベートする場合には、このＵＧＴおよびシトクロムＰ４５０酵素またはシトクロムＰ４５０の種々のアイソフォームの混合物は、ウリジン二リン酸グルクロン酸（ＵＤＰＧＡ）およびＮＡＤＰＨ補因子またはＮＡＤＰＨ再生系と組み合わせてインキュベートされる、ということを理解するであろう。
【００２７】
特に断りのない限り、本明細書で用いられている「試験化合物」という語は、反応性代謝物（単数または複数）の形成について試験される任意の化学物質を意味するものとする。好ましくは、試験化合物は、薬学的な作用物質またはその塩、エステルもしくはプロドラッグである。
【００２８】
特に断りのない限り、本明細書で用いられている「薬物候補」という語は、反応性代謝物（単数または複数）を生じない任意の化学物質または試験化合物を意味するものとする。好ましくは、薬物候補は、薬学的な作用物質またはその塩、エステルもしくはプロドラッグである。
【００２９】
別途指示がない限り、本明細書で用いられている「付加物」という語は、反応性代謝物の、式（Ｉ）の化合物との、任意の共有結合複合体を意味するものとする。
【００３０】
本明細書、特にスキームおよび実施例、において用いられている略語は、以下の通りである：
ＡＰＣＩ−ＭＳ／ＭＳ＝大気圧化学イオン化タンデム質量分析
ＣＹＰ＝シトクロムＰ４５０酵素
ＵＧＴ＝ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ
Ｄａ＝ダルトン
ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ＝エレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析
ＨＰＬＣ＝高速液体クロマトグラフィー
ＭＳ＝質量分析
ＮＡＤＰＨ＝β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）
ＳＰＥ＝固相抽出
ＵＤＰＧＡ＝ウリジン二リン酸グルクロン酸
【００３１】
本発明の一実施形態では、当該薬物代謝酵素は、ヒト肝ミクロソーム、シトクロムＰ４５０酵素、ペルオキシダーゼ、シクロオキシゲナーゼ、ミエロペルオキシダーゼおよびＵＧＴからなる群より選択される。好ましくは、当該薬物代謝酵素はシトクロムＰ４５０酵素およびＵＧＴである。
【００３２】
一実施形態では、薬物代謝酵素、例えばＳ９、組換え酵素またはミクロソーム酵素など、を含有する細胞の任意の分画とともに試験化合物をインキュベートすることにより形成された反応性代謝物を検出するのに、本発明を適用する。一実施形態では、試験化合物が、ヒト対象内で（すなわち、この試験化合物のヒトへの投与後に）反応性代謝物を形成するかどうかを予測するのに本発明の方法を適用する。
【００３３】
当業者は、「Ｓ９」という略語が、Ｓ９画分（ポストミトコンドリア上清画分）を指し、これはミクロソームとサイトゾルとの混合物である、とのことを理解するであろう。したがって、これは、Ｐ４５０酵素、フラビンモノオキシゲナーゼ、カルボキシルエステラーゼ、エポキシドヒドロラーゼ、ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼ、メチルトランスフェラーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼおよび他の薬物代謝酵素などの、種々の第Ｉ相および第ＩＩ相酵素を含有する。
【００３４】
１種類以上のインキュベーション生成物（非反応性代謝物、反応性代謝物と式（Ｉ）の化合物との間で形成された付加物）を含有する生成物混合物は、好ましくは、公知の方法に従って、例えば遠心分離、ＳＰＥ、蒸発または液−液抽出によって、精製し、濃縮して、生成物濃縮物を得る。次いで、この生成物濃縮物を、質量分析における使用に適した（すなわち、質量分析計への注入に適した）溶媒、例えば水中５％アセトニトリルおよび水中５％メタノールなど、に溶解させる。
【００３５】
好ましくは、この生成物混合物は、公知の方法に従って、例えば液体クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、キャピラリー電気泳動、または他の分離技術によって、個々の付加物成分に分離する。次いで、ニュートラルロス質量スペクトルを、各付加物または付加物成分について測定する。ニュートラルロス質量スペクトルは、公知の方法に従って、任意のイオン化源を用いて、例えばＡＰＣＩ−ＭＳ／ＭＳおよびＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳなどによって、好ましくはＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳによって、測定してもよい。あるいは、分離および質量スペクトル測定は、例えばＬＣ／ＭＳなどのループシステムを用いて、１ステップで完了させてもよい。
【００３６】
本発明の方法は、試験化合物が、一度の実験で、「ハード」な反応性代謝物および／もしくは「ソフト」な反応性代謝物ならびに／またはアシルグルクロニドを生じるかどうかを判定することが意図されたものである。当業者は、本発明の方法により「ハード」な反応性代謝物および「ソフト」な反応性代謝物の両方ならびにアシルグルクロニドが同時に検出されることとなるが、ある特定の試験化合物から、「ハード」な反応性代謝物、「ソフト」な反応性代謝物またはアシルグルクロニドのいずれかが形成されない場合には、この方法は、いずれかのタイプの反応性代謝物が形成されるかを検出するために行われることとなる、ということを理解するであろう。加えて、反応性代謝物が形成されない場合には、この方法により、１２９Ｄａおよび１４７Ｄａのニュートラルロススキャニングの全イオンスペクトルにピークがないことを示す質量スペクトルが作成され、それにより、その試験化合物が薬物候補として同定されることとなる。
【００３７】
本発明は、さらに、薬物候補（すなわち、いかなる反応性代謝物も生じない試験化合物）を同定するための方法であって、
（ａ）試験化合物を、式（Ｉ）の非同位体標識化合物と薬物代謝酵素とを含む混合物とともにインキュベートして、生成物混合物を得ること；
（ｂ）工程（ａ）において生じた生成物混合物のニュートラルロス質量スペクトルを測定すること；および
（ｃ）ニュートラルロス質量スペクトルにおいてピークがないことを検出すること、
を含む方法に向けられたものである。
【００３８】
以下の実施例は、本発明の理解を助けるために記載したものであり、添付の特許請求の範囲において記載されている本発明をなんらかの形で限定するようには意図されておらず、また、そのように解釈されるべきではない。
【実施例】
【００３９】
実施例１：「ソフト」な反応性代謝物および「ハード」な反応性代謝物をトラップするための標準的な手順
【００４０】
Ａ．インキュベーション＆化合物トラッピング：
【００４１】
ここで記載するすべてのミクロソームインキュベーションは、３７℃にて、ウォーターバス中またはヒートブロック上で行った。試験化合物を、０．１ｍＭのＥＤＴＡを含む１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中のヒト肝ミクロソーム製剤（シトクロムＰ４５０酵素製剤）および式（Ｉ）の化合物と混合した。得られた混合物を、３７℃で５分間、予め温めておいた。次いで、この反応混合物に、補因子−ＮＡＤＰＨを（反応を開始させるために）添加して、最終体積を５００μｌにした。
【００４２】
得られた反応混合物は、５０μＭの試験化合物、２ｍｇ／ｍｌのミクロソームタンパク質、１ｍＭの式（Ｉ）の化合物の混合物および３ｍＭのＮＡＤＰＨを含有していた。
【００４３】
１５または６０分のインキュベーション後、１０００μｌの５０％メタノール／５０％アセトニトリルの添加により反応を終結させた。得られた混合物を、１０，０００ｇで１０分間、４℃にて遠心して沈殿タンパク質をペレットにし、上清を乾燥させた。得られた残渣を、５０％メタノールで可溶化した。
【００４４】
Ｂ．質量分析：
【００４５】
ＭＳ分析は、ＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＦＴＭＳ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、ブレーメン、ドイツ）で行った。ＥＳＩイオン源は陽イオンモードで動作させた。全溶出液を、この質量分析計中へ、＋５ｋＶで噴霧し、この溶媒液滴の脱溶媒和を、３５０℃の加熱したキャピラリー温度によってさらに支援した。ニュートラルロススキャニングモードで収集される質量スペクトルは、ｍ／ｚ ２００〜１１００の範囲にわたり、分解能３００００でスキャンすることによって得た。
【００４６】
Ｃ．ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析：
【００４７】
反応性代謝物の完全プロファイリングのために、試料を、まず、オートサンプラーを備えたＰｒｏｍｉｎｅｎｃｅ ＬＣシステム（島津製作所、京都、日本）を用いてクロマトグラフ分離に供し、溶出液を、ニュートラルロススキャニングモードで動作させたＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＦＴＭＳに導入した。クロマトグラフ分離には、Ｌ−カラムＯＤＳ（オクタデシルシリル−シリカゲル；２．１×１５０ｍｍ、化学物質評価研究機構、東京、日本）を用いた。このクロマトグラフシステムでは、溶媒Ａ（５ｍＭの酢酸アンモニウム）と溶媒Ｂ（５ｍＭの酢酸アンモニウムを含む９５％アセトニトリル）との勾配として送達される二成分溶媒系が用いられた。初期勾配条件は９５％Ａ：５％Ｂを４分間であり、その後は、次の１３分にわたって１００％Ｂまでの流速０．２５ｍＬ／分での直線勾配であった。当該溶媒組成は、その後、初期条件での再平衡化の前に、１００％Ｂで８分間保持した。精製した試料の２０μｌずつに対してＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を行った。データ取得は、Ｘｃａｌｉｂｅｒ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０ソフトウェア（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、ブレーメン、ドイツ）を用いて行った。
【００４８】
実施例２〜４：ソフトな反応性代謝物および／またはハードな反応性代謝物の検出
【００４９】
上記実施例１に記載されている手順に従って、本発明の方法とＥＣＯとを適用することにより、１２９Ｄａまたは１４７Ｄａのニュートラルロススキャニングを用いて、「ソフト」な反応性代謝物および／または「ハード」な反応性代謝物を生じることが知られている試験化合物の反応性代謝物を検出した。
【００５０】
実施例２：ＥＣＯによって分析したジクロフェナク
【００５１】
「ソフト」な反応性代謝物を検出するべく、本方法およびＥＣＯの有用性を評価するための試験化合物として、ジクロフェナクを選択した。
【００５２】
図１Ａは、当該反応混合物について得た、全イオンクロマトグラム（ＴＩＣ）、ならびに、１２９Ｄａおよび１４７ＤａのニュートラルロススキャニングのＴＩＣを示している。１４７ＤａのニュートラルロススキャニングのＴＩＣにおいて、保持時間１０．２分にて検出された最も強いピークは、ｍ／ｚ ６４０および６７４にてプロトン化イオンを示す、ジクロフェナクの反応性代謝物の、ＥＣＯとの２種類の付加物を含むものであった。この２種類の付加物のフルスキャンスペクトルおよびプロダクトイオンスペクトルを、それぞれ、図１Ｂおよび１Ｃに示した。
【００５３】
本方法において検出された、ジクロフェナクの反応性代謝物の、ＥＣＯとの２種類の付加物の形成は、下記のスキームＥ１で概説する通りである。
【化７】
【００５４】
実施例３：ＥＣＯによって分析したクロザピン
【００５５】
「ソフト」な反応性代謝物を検出するべく、本方法およびＥＣＯの有用性を評価するための試験化合物として、クロザピンを選択した。
【００５６】
図２Ａは、当該反応混合物について得た、ＴＩＣ、ならびに、１２９Ｄａおよび１４７ＤａのニュートラルロススキャニングのＴＩＣを示している。１４７ＤａのニュートラルロススキャニングのＴＩＣにおいて、保持時間１０．３分にて検出された最も強いピークは、ｍ／ｚ ６８９にてプロトン化イオンを示す、１種類の付加物を含むものであった。この付加物のフルスキャンスペクトルおよびプロダクトイオンスペクトルを、図２Ｂに示した。
【００５７】
本方法において検出された、クロザピンの反応性代謝物の、ＥＣＯとの付加物の形成は、下記のスキームＥ２で概説する通りである。
【化８】
【００５８】
実施例４：ＥＣＯによって分析した２−［２−チエニル］−フラン
【００５９】
「ソフト」な反応性代謝物と「ハード」な反応性代謝物の両方を検出するべく、本方法およびＥＣＯの有用性を評価するための試験化合物として、２−［２−チエニル］−フランを選択した。
【００６０】
図３Ａは、当該反応混合物について得た、ＴＩＣ、ならびに、１２９Ｄａおよび１４７ＤａのニュートラルロススキャニングのＴＩＣを示している。３つの強いピークが、１２９ＤａのニュートラルロススキャニングのＴＩＣにおいて、保持時間１０．２分、１０．７分および１１．０分にて検出された。１０．２分における第一成分は、図３Ｂに示すように、フルスキャンスペクトルにおいて、ｍ／ｚ ５１３にてプロトン化イオンを示し、また、ｍ／ｚ ３８４にてプロダクトイオンを示したが、これは、プロダクトイオンスペクトルにおいてピログルタミン酸部分の喪失を指し示すものであった。１０．７分における第二成分は、図３Ｃに示すように、フルスキャンスペクトルにおいて、ｍ／ｚ ４８１にてプロトン化イオンを示し、また、ｍ／ｚ ３５２にてプロダクトイオンを示したが、これは、プロダクトイオンスペクトルにおいてピログルタミン酸部分の喪失を指し示すものであった。１１．０分における第三成分は、図３Ｄに示すように、フルスキャンスペクトルにおいて、ｍ／ｚ ４９５にてプロトン化イオンを示し、また、ｍ／ｚ ３６６にてプロダクトイオンを示したが、これは、プロダクトイオンスペクトルにおいてピログルタミン酸部分の喪失を指し示すものであった。
【００６１】
本方法において検出された、２−［２−チエニル］−フランの反応性代謝物の、ＥＣＯとの３種類の付加物の形成は、下記のスキームＥ３で概説する通りである。
【化９】
【００６２】
実施例５：アシルグルクロニドをトラップするための標準的な手順
【００６３】
Ａ．インキュベーション＆化合物トラッピング：
【００６４】
ここで記載するすべてのインキュベーションは、３７℃にて、ウォーターバス中またはヒートブロック上で行った。ジクロフェナクアシルグルクロニドを、０．１ｍＭのＥＤＴＡを含む１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中に添加した。得られた混合物を、３７℃で５分間、予め温めておいた。次いで、この反応混合物に、式（Ｉ）の化合物を（反応を開始させるために）添加して、最終体積を５００μｌにした。
【００６５】
得られた反応混合物は、１００μＭのジクロフェナクアシルグルクロニド、１ｍＭの式（Ｉ）の化合物の混合物を含有していた。
【００６６】
６０分のインキュベーション後、氷上に置くことによりインキュベーションを停止させ、試料の２０μｌずつをＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析に適用した。
【００６７】
Ｂ．質量分析：
【００６８】
ＭＳ分析は、ＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＦＴＭＳ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、ブレーメン、ドイツ）で行った。ＥＳＩイオン源は陽イオンモードで動作させた。全溶出液を、この質量分析計中へ、＋５ｋＶで噴霧し、この溶媒液滴の脱溶媒和を、３５０℃の加熱したキャピラリー温度によってさらに支援した。ニュートラルロススキャニングモードで収集される質量スペクトルは、ｍ／ｚ ２００〜１１００の範囲にわたり、分解能３００００でスキャンすることによって得た。
【００６９】
Ｃ．ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析：
【００７０】
反応性代謝物の完全プロファイリングのために、試料を、まず、オートサンプラーを備えたＰｒｏｍｉｎｅｎｃｅ ＬＣシステム（島津製作所、京都、日本）を用いてクロマトグラフ分離に供し、溶出液を、ニュートラルロススキャニングモードで動作させたＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＦＴＭＳに導入した。クロマトグラフ分離には、Ｌ−カラムＯＤＳ（２．１×１５０ｍｍ、化学物質評価研究機構、東京、日本）を用いた。このクロマトグラフシステムでは、溶媒Ａ（５ｍＭの酢酸アンモニウム）と溶媒Ｂ（５ｍＭの酢酸アンモニウムを含む９５％アセトニトリル）との勾配として送達される二成分溶媒系が用いられた。初期勾配条件は９５％Ａ：５％Ｂを４分間であり、その後は、次の１３分にわたって１００％Ｂまでの直線勾配であった。当該溶媒組成は、その後、初期条件での再平衡化の前に、１００％Ｂで８分間保持した。精製した試料の２０μｌずつに対してＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を行った。データ取得は、Ｘｃａｌｉｂｅｒ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０ソフトウェア（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、ブレーメン、ドイツ）を用いて行った。
【００７１】
実施例６：ＥＣＯによって分析したジクロフェナクアシルグルクロニド
【００７２】
ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼによって生じた反応性代謝物を検出するべく、本方法およびＥＣＯの有用性を評価するための試験化合物として、ジクロフェナクアシルグルクロニドを選択した。
【００７３】
図４Ａは、当該反応混合物について得た、ＴＩＣ、ならびに、１２９Ｄａおよび１４７ＤａのニュートラルロススキャニングのＴＩＣを示している。共通の強いピークが、１２９Ｄａおよび１４７ＤａのニュートラルロススキャニングのＴＩＣにおいて、保持時間１２．１分にて検出された。このピークは、図４Ｂに示すように、フルスキャンスペクトルにおいて、ｍ／ｚ ６４２にてプロトン化イオンを示し、また、ｍ／ｚ ４９５にてプロダクトイオンを示すが、これは、プロダクトイオンスペクトルにおいてピログルタミン酸部分の喪失を指し示すものであった。
【００７４】
本方法において検出された、ジクロフェナクアシルグルクロニドのＥＣＯとの付加物の形成は、下記のスキームＥ４で概説する通りである。
【化１０】
【００７５】
実施例７〜９：ソフトな反応性代謝物および／またはハードな反応性代謝物の検出
【００７６】
上記実施例１に記載されている手順に従って、本発明の方法とＥＣＨＫとを適用することにより、１２９Ｄａのニュートラルロススキャニングを用いて、「ソフト」な反応性代謝物および／または「ハード」な反応性代謝物を生じることが知られている試験化合物の反応性代謝物を検出した。
実施例７：ＥＣＨＫによって分析したジクロフェナク
【００７７】
「ソフト」な反応性代謝物を検出するべく、本方法およびＥＣＨＫの有用性を評価するための試験化合物として、ジクロフェナクを選択した。
【００７８】
図５Ａは、当該反応混合物について得た、ＴＩＣおよび１２９ＤａのニュートラルロススキャニングのＴＩＣを示している。１２９ＤａのニュートラルロススキャニングのＴＩＣにおいて、保持時間１０．７分にて検出された最も強いピークは、ｍ／ｚ ６６８および７０２にてプロトン化イオンを示す、ジクロフェナクの反応性代謝物の、ＥＣＨＫとの２種類の付加物を含むものであった。この２種類の付加物のフルスキャンスペクトルおよびプロダクトイオンスペクトルを、それぞれ、図５Ｂおよび５Ｃに示した。
【００７９】
本方法において検出された、ジクロフェナクの反応性代謝物の、ＥＣＨＫとの２種類の付加物の形成は、下記のスキームＥ５で概説する通りである。
【化１１】
【００８０】
実施例８：ＥＣＨＫによって分析したクロザピン
【００８１】
「ソフト」な反応性代謝物を検出するべく、本方法およびＥＣＨＫの有用性を評価するための試験化合物として、クロザピンを選択した。
【００８２】
図６Ａは、当該反応混合物について得た、ＴＩＣおよび１２９ＤａのニュートラルロススキャニングのＴＩＣを示している。１２９ＤａのニュートラルロススキャニングのＴＩＣにおいて、保持時間１１．１分にて検出された最も強いピークは、ｍ／ｚ ７１７にてプロトン化イオンを示す、１種類の付加物を含むものであった。この付加物のフルスキャンスペクトルおよびプロダクトイオンスペクトルを、図６Ｂに示した。
【００８３】
本方法において検出された、クロザピンの反応性代謝物の、ＥＣＨＫとの付加物の形成は、下記のスキームＥ６で概説する通りである。
【化１２】
【００８４】
実施例９：ＥＣＨＫによって分析した２−［２−チエニル］−フラン
【００８５】
「ソフト」な反応性代謝物と「ハード」な反応性代謝物の両方を検出するべく、本方法およびＥＣＨＫの有用性を評価するための試験化合物として、２−［２−チエニル］−フランを選択した。
【００８６】
図７Ａは、当該反応混合物について得た、ＴＩＣおよび１２９ＤａのニュートラルロススキャニングのＴＩＣを示している。２つの強いピークが、１２９ＤａのニュートラルロススキャニングのＴＩＣにおいて、保持時間１０．６分および１１．９分にて検出された。１０．６分における第一成分は、図７Ｂに示すように、フルスキャンスペクトルにおいて、ｍ／ｚ ５４１にてプロトン化イオンを示し、また、ｍ／ｚ ４１２にてプロダクトイオンを示したが、これは、プロダクトイオンスペクトルにおいてピログルタミン酸部分の喪失を指し示すものであった。１１．９分における第二成分は、２−［２−チエニル］−フランの反応性代謝物の、ＥＣＨＫとの２種類の付加物を含むものであり、そして、図７Ｃおよび７Ｄに示すように、フルスキャンスペクトルにおいて、ｍ／ｚ ５０９および５２３にてプロトン化イオンを示し、また、ｍ／ｚ ３８０および３９４にてプロダクトイオンを示したが、これは、プロダクトイオンスペクトルにおいてピログルタミン酸部分の喪失を指し示すものであった。
【００８７】
本方法において検出された、２−［２−チエニル］−フランの反応性代謝物の、ＥＣＨＫとの３種類の付加物の形成は、下記のスキームＥ７で概説する通りである。
【化１３】
【００８８】
実施例１０：ＥＣＨＫによって分析したジクロフェナクアシルグルクロニド
【００８９】
実施例５に記載されている手順に従って、本発明の方法とＥＣＨＫとを適用することにより、ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼによって生じた反応性代謝物を検出した。
【００９０】
ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼによって生じた反応性代謝物を検出するべく、本方法およびＥＣＨＫの有用性を評価するための試験化合物として、ジクロフェナクアシルグルクロニドを選択した。
【００９１】
図８Ａは、当該反応混合物について得た、ＴＩＣおよび１２９ＤａのニュートラルロススキャニングのＴＩＣを示している。１つの強いピークが、１２９ＤａのニュートラルロススキャニングのＴＩＣにおいて、保持時間１２．５分にて検出された。このピークは、図８Ｂに示すように、フルスキャンスペクトルにおいて、ｍ／ｚ ６７０にてプロトン化イオンを示し、また、ｍ／ｚ ５４１にてプロダクトイオンを示したが、これは、プロダクトイオンスペクトルにおいてピログルタミン酸部分の喪失を指し示すものであった。
【００９２】
本方法において検出された、ジクロフェナクアシルグルクロニドのＥＣＨＫとの付加物の形成は、下記のスキームＥ８で概説する通りである。
【化１４】
【００９３】
実施例１１〜１３：ソフトな反応性代謝物および／またはハードな反応性代謝物の検出
【００９４】
上記実施例１に記載されている手順に従って、本発明の方法とＥＨＣＫとを適用することにより、１２９Ｄａのニュートラルロススキャニングを用いて、「ソフト」な反応性代謝物および／または「ハード」な反応性代謝物を生じることが知られている試験化合物の反応性代謝物を検出した。
【００９５】
実施例１１：ＥＨＣＫによって分析したジクロフェナク
【００９６】
「ソフト」な反応性代謝物を検出するべく、本方法およびＥＨＣＫの有用性を評価するための試験化合物として、ジクロフェナクを選択した。
【００９７】
図９Ａは、当該反応混合物について得た、ＴＩＣおよび１２９ＤａのニュートラルロススキャニングのＴＩＣを示している。２つの強いピークが、１２９ＤａのニュートラルロススキャニングのＴＩＣにおいて、保持時間１０．５分および１０．８分にて検出された。１０．５分および１０．８分におけるこの２種類の成分は、ｍ／ｚ ６６８および７０２にてプロトン化イオンを示した。この２種類の付加物のフルスキャンスペクトルおよびプロダクトイオンスペクトルを、それぞれ、図９Ｂおよび９Ｃに示した。
【００９８】
本方法において検出された、ジクロフェナクの反応性代謝物の、ＥＣＨＫとの２種類の付加物の形成は、下記のスキームＥ９で概説する通りである。
【化１５】
【００９９】
実施例１２：ＥＨＣＫによって分析したクロザピン
【０１００】
「ソフト」な反応性代謝物を検出するべく、本方法およびＥＨＣＫの有用性を評価するための試験化合物として、クロザピンを選択した。
【０１０１】
図１０Ａは、当該反応混合物について得た、ＴＩＣおよび１２９ＤａのニュートラルロススキャニングのＴＩＣを示している。１２９ＤａのニュートラルロススキャニングのＴＩＣにおいて、保持時間１１．２分にて検出された最も強いピークは、ｍ／ｚ ７１７にてプロトン化イオンを示す、１種類の付加物を含むものであった。この付加物のフルスキャンスペクトルおよびプロダクトイオンスペクトルを、図１０Ｂに示した。
【０１０２】
本方法において検出された、クロザピンの反応性代謝物の、ＥＨＣＫとの付加物の形成は、下記のスキームＥ１０で概説する通りである。
【化１６】
【０１０３】
実施例１３：ＥＨＣＫによって分析した２−［２−チエニル］−フラン
【０１０４】
「ソフト」な反応性代謝物と「ハード」な反応性代謝物の両方を検出するべく、本方法およびＥＨＣＫの有用性を評価するための試験化合物として、２−［２−チエニル］−フランを選択した。
【０１０５】
図１１Ａは、当該反応混合物について得た、ＴＩＣおよび１２９ＤａのニュートラルロススキャニングのＴＩＣを示している。１２９ＤａのニュートラルロススキャニングのＴＩＣにおいて、保持時間１２．０分にて検出されたピークは、ｍ／ｚ ５０９、５４１および５２３にてプロトン化イオンを示す、２−［２−チエニル］−フランの反応性代謝物の、ＥＨＣＫとの３種類の付加物を含むものであった。この３種類の付加物のフルスキャンスペクトルおよびプロダクトイオンスペクトルを、それぞれ、図１１Ｂ、１１Ｃおよび１１Ｄに示した。
【０１０６】
本方法において検出された、２−［２−チエニル］−フランの反応性代謝物の、ＥＨＣＫとの３種類の付加物の形成は、下記のスキームＥ１１で概説する通りである。
【化１７】
【０１０７】
実施例１４：ＥＨＣＫによって分析したジクロフェナクアシルグルクロニド
【０１０８】
実施例５に記載されている手順に従って、本発明の方法とＥＨＣＫとを適用することにより、ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼによって生じた反応性代謝物を検出した。
【０１０９】
ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼによって生じた反応性代謝物を検出するべく、本方法およびＥＨＣＫの有用性を評価するための試験化合物として、ジクロフェナクアシルグルクロニドを選択した。
【０１１０】
図１２Ａは、当該反応混合物について得た、ＴＩＣおよび１２９ＤａのニュートラルロススキャニングのＴＩＣを示している。１つの強いピークが、１２９ＤａのニュートラルロススキャニングのＴＩＣにおいて、保持時間１２．８分にて検出された。このピークは、図１２Ｂに示すように、フルスキャンスペクトルにおいて、ｍ／ｚ ６７０にてプロトン化イオンを示し、また、ｍ／ｚ ５４１にてプロダクトイオンを示したが、これは、プロダクトイオンスペクトルにおいてピログルタミン酸部分の喪失を指し示すものであった。
【０１１１】
本方法において検出された、ジクロフェナクアシルグルクロニドのＥＨＣＫとの付加物の形成は、下記のスキームＥ１２で概説する通りである。
【化１８】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）の化合物：
【化１】
［式中、
ＸはＣＨ２であり、かつ
ｐ、ｑおよびｒはそれぞれ独立して０または１であるが、
但し、ｐが０であり、ｑが０であり、かつ、ｒが１である化合物は除外されるものとする］。
【請求項２】
式（ＩＩ）の化合物：
【化２】
である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
式（ＩＩＩ）の化合物：
【化３】
である、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
式（ＩＶ）の化合物：
【化４】
である、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
試験化合物の反応性代謝物を検出するための方法であって、
（ａ）試験化合物を、式（Ｉ）の化合物：
【化５】
［式中、
ＸはＣＨ２であり、かつ
ｐ、ｑおよびｒはそれぞれ独立して０または１であるが、
但し、ｐが０であり、ｑが０であり、かつ、ｒが１である化合物は除外されるものとする］、
および薬物代謝酵素とともにインキュベートし、１種類以上の付加物を含む生成物混合物を得ること；ならびに
（ｂ）工程（ａ）の付加物を検出すること、
を含む方法。
【請求項６】
式（Ｉ）の化合物が、式（ＩＩ）の化合物：
【化６】
、式（ＩＩＩ）の化合物：
【化７】
または、式（ＩＶ）の化合物：
【化８】
である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記薬物代謝酵素が、ヒト、ラット、マウス、ハムスター、イヌ、サルまたはウサギ肝ミクロソームである、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
前記薬物代謝酵素が、ＮＡＤＰＨ補因子と組み合わせたシトクロムＰ４５０酵素、または、ＮＡＤＰＨ再生系と組み合わせたシトクロムＰ４５０酵素である、請求項５または６に記載の方法。
【請求項９】
前記薬物代謝酵素が、ウリジン二リン酸グルクロン酸（ＵＤＰＧＡ）補因子と組み合わせたＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼである、請求項５または６に記載の方法。
【請求項１０】
前記付加物が、ニュートラルロス質量スペクトルにおいて検出される、請求項５〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ニュートラルロス質量スペクトルが、ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳまたはＬＳ／ＭＳを用いて測定される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１】
式（Ｉ）の化合物：
【化１】
［式中、
ＸはＣＨ２であり、かつ
ｐ、ｑおよびｒはそれぞれ独立して０または１であるが、
但し、ｐが０であり、ｑが０であり、かつ、ｒが１である化合物は除外されるものとする］。
【請求項２】
式（ＩＩ）の化合物：
【化２】
である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
式（ＩＩＩ）の化合物：
【化３】
である、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
式（ＩＶ）の化合物：
【化４】
である、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
試験化合物の反応性代謝物を検出するための方法であって、
（ａ）試験化合物を、式（Ｉ）の化合物：
【化５】
［式中、
ＸはＣＨ２であり、かつ
ｐ、ｑおよびｒはそれぞれ独立して０または１であるが、
但し、ｐが０であり、ｑが０であり、かつ、ｒが１である化合物は除外されるものとする］、
および薬物代謝酵素とともにインキュベートし、１種類以上の付加物を含む生成物混合物を得ること；ならびに
（ｂ）工程（ａ）の付加物を検出すること、
を含む方法。
【請求項６】
式（Ｉ）の化合物が、式（ＩＩ）の化合物：
【化６】
、式（ＩＩＩ）の化合物：
【化７】
または、式（ＩＶ）の化合物：
【化８】
である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記薬物代謝酵素が、ヒト、ラット、マウス、ハムスター、イヌ、サルまたはウサギ肝ミクロソームである、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
前記薬物代謝酵素が、ＮＡＤＰＨ補因子と組み合わせたシトクロムＰ４５０酵素、または、ＮＡＤＰＨ再生系と組み合わせたシトクロムＰ４５０酵素である、請求項５または６に記載の方法。
【請求項９】
前記薬物代謝酵素が、ウリジン二リン酸グルクロン酸（ＵＤＰＧＡ）補因子と組み合わせたＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼである、請求項５または６に記載の方法。
【請求項１０】
前記付加物が、ニュートラルロス質量スペクトルにおいて検出される、請求項５〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ニュートラルロス質量スペクトルが、ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳまたはＬＳ／ＭＳを用いて測定される、請求項１０に記載の方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１１Ｄ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１１Ｄ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【公表番号】特表２０１２−５２４７０９（Ｐ２０１２−５２４７０９Ａ）
【公表日】平成２４年１０月１８日（２０１２．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４０２５１（Ｐ２０１１−５４０２５１）
【出願日】平成２２年４月１６日（２０１０．４．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２０１０／０５７１９２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１２３０８５
【国際公開日】平成２２年１０月２８日（２０１０．１０．２８）
【出願人】（５０６１３７１４７）エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 (215)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１０月１８日（２０１２．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年４月１６日（２０１０．４．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２０１０／０５７１９２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１２３０８５
【国際公開日】平成２２年１０月２８日（２０１０．１０．２８）
【出願人】（５０６１３７１４７）エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 (215)
【Ｆターム（参考）】
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