収率及び免疫原性を高めた組換えタンパク質発現系
宿主細胞における対象の組換えタンパク質の発現系であって、本質的に配列番号１のタンパク質形質導入ドメインをコードする核酸配列と、Ｈｓｐ４０Ｊドメインをコードする核酸配列と、対象のタンパク質をコードする核酸配列とから成る核酸断片を含む、発現系が提供される。核酸断片は、宿主細胞における対象の組換えタンパク質の発現に有用な宿主特異的な転写制御要素と翻訳制御要素とに操作可能に連結することができる。宿主細胞において収率を高めて対象の組換えタンパク質を製造する方法も提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、収率及び免疫原性を高めた組換えタンパク質の発現系に関する。
【背景技術】
【０００２】
より多くの製品（例えば組換えタンパク質）のヒトでの使用が認可されているか、又は認可されようとしているために、治療上使用される生物製剤の効率的な製造に対する要求が着実に増している。昔から、そして今現在でも、細菌発酵プロセスがこれらの種類の分子を製造する主なツールである。プロセス最適化の主な目的は、出来る限り最も低いコストで要求される品質の製品を高収率で得ることであるが、これは多くの場合、特定の発現構築物又は発現系の特性に左右される。
【０００３】
Ｊドメインの構造的特徴によって、Ｈｓｐ４０タンパク質と、それらのパートナーＨｓｐ７０との間の相互作用の特異性が決定されることが報告されている（Hennessy et al., Protein Science （2005）, 14:1697-1709；非特許文献１）。Ｊドメインは、主要な結合部位であり、またＨｓｐ４０及びＨｓｐ４０様タンパク質と、それらのパートナーＨｓｐ７０との間の相互作用に必要な最小領域であると考えられている（Walsh et al., EMBO report （2004）, 6:567-571；非特許文献２）。ＤＮＡワクチン系によるＳＶ４０ラージＴ抗原のＪドメインと融合したペプチドによって、そのペプチドの抗原性を高めることができることが報告されている（Reimann and Schirmbeck, Immuno Rev. （2004）, 199:54-67；非特許文献３）。Ｊドメインが、ＤｎａＫとＤｎａＪ結合基質とを繋留し、それからＤｎａＫがそのＣ末端ペプチド結合ドメインと結合することも知られている（Tilstra et al., Biochemical Society Transactions. （2007）, 35:811-815；非特許文献４）。
【０００４】
他方で、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）は、従来のエンドサイトーシスと独立してはるかに大きい分子を細胞に運ぶことができる小ペプチドである。この特性によって、ＰＴＤは、研究目的でタンパク質及び他の分子を生細胞に運ぶのに理想的なツールとなる（Beerens et al, Current Gene Therapy （2003）, 3（5）:486-494；非特許文献５）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Hennessy et al., Protein Science （2005）, 14:1697-1709
【非特許文献２】Walsh et al., EMBO report （2004）, 6:567-571
【非特許文献３】Reimann and Schirmbeck, Immuno Rev. （2004）, 199:54-67
【非特許文献４】Tilstra et al., Biochemical Society Transactions. （2007）, 35:811-815
【非特許文献５】Beerens et al, Current Gene Therapy （2003）, 3（5）:486-494
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、組換えタンパク質の収率及び免疫原性を改善する発現系の開発において、ＰＴＤもＨｓｐ４０Ｊドメインも示唆されていない。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明によれば、宿主細胞における組換え標的タンパク質の発現系であって、本質的に配列番号１のタンパク質形質導入ドメインをコードするヌクレオチド配列と、Ｈｓｐ４０−Ｊドメインをコードするヌクレオチド配列と、標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列とから成る核酸セグメントを含み、核酸セグメントが宿主細胞において、組換え標的タンパク質を発現するために、宿主特異的な転写調節要素と翻訳調節要素とに操作可能に連結する、発現系が提供される。
【０００８】
さらに本発明によれば、上記の発現系を用いて、組換え標的タンパク質を発現する方法が提供される。本発明の方法は、
本質的に配列番号１のタンパク質形質導入ドメインをコードするヌクレオチド配列と、Ｈｓｐ４０−Ｊドメインをコードするヌクレオチド配列と、標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列とから成る核酸セグメントを含む発現ベクターを構築すること（前記核酸セグメントが宿主細胞特異的な転写調節要素と翻訳調節要素とに操作可能に連結されている）、
前記発現ベクターで前記宿主細胞を形質転換すること、並びに
組換え標的タンパク質を宿主細胞から回収及び単離することを含む。
【０００９】
したがって、本発明はまた、上述の発現系を用いることによって製造される組換えタンパク質を提供する。それによって、結果として、組換えタンパク質の免疫原性が高まる。
【００１０】
本発明はまた、上記の組換えタンパク質を含むワクチンを提供し得る。
【００１１】
本発明はまた、キメラタンパク質であって、
ａ．キメラタンパク質のＮ末端に、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）又はＨＩＶ Ｔａｔ ＰＴＤ活性を有するその断片を含有する第１のポリペプチジル断片と、
ｂ．第１のポリペプチジル断片のＣ末端に、Ｊドメイン又は熱ショックタンパク質７０（Ｈｓｐ７０）非相互作用活性を有するその断片を含有する第２のポリペプチジル断片と、
ｃ．第２のポリペプチジル断片のＣ末端に、標的タンパク質又はポリペプチドを含有する第３のポリペプチジル断片とを含む、キメラタンパク質を提供する。
【００１２】
本発明はまた、キメラ遺伝子であって、
ａ．タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）又はＨＩＶ Ｔａｔ ＰＴＤ活性を有するその断片をコードする第１のＤＮＡ配列と、
ｂ．Ｊドメイン又は熱ショックタンパク質７０（Ｈｓｐ７０）非相互作用活性を有するその断片をコードする、第１のＤＮＡ配列と翻訳フレームで連結した第２のＤＮＡ配列と、
ｃ．標的タンパク質又はポリペプチドをコードする、第２のＤＮＡ配列と翻訳フレームで連結した第３のＤＮＡ配列とを含む、キメラ遺伝子を提供する。
【００１３】
本発明は、さらに別のキメラ遺伝子であって、
ａ．タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）又はＨＩＶ Ｔａｔ ＰＴＤ活性を有するその断片をコードする第１のＤＮＡ配列と、
ｂ．Ｊドメイン又は熱ショックタンパク質７０（Ｈｓｐ７０）非相互作用活性を有するその断片をコードする、第１のＤＮＡ配列と翻訳フレームで連結した第２のＤＮＡ配列とを含む、さらに別のキメラ遺伝子を提供する。
【００１４】
本発明のさらなる目的及び利点は一部、続く記載で示され、その記載から一部明らかになるか、又は本発明の実施によって理解され得る。本発明の目的及び利点は、添付の特許請求の範囲で特に指摘した要素及び組合せによって実現及び達成される。
【００１５】
上述の概要と以下の詳細な説明との両方は例示的で且つ説明のためのものであるにすぎず、本発明を特許請求されるように制限するものではないことが理解される。
【００１６】
本発明を説明する目的で、図面において本発明の好ましい実施形態を示す。しかしながら、本発明は、図示される実施形態に限定されないことを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＩＰＴＧの存在下で増殖させた、ｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩ構築物を含有する大腸菌ロゼッタ株（Rosetta）の全細胞溶解物のクマシー（登録商標）ブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。第１のレーン、標準分子量マーカー（分子量１５ｋＤａ及び２０ｋＤａに対応するバンドが示される）。第２のレーン（０）、誘導されていないｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩ、第３のレーン（１）、１時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩ、第４のレーン（２）、２時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩ、第５のレーン（３）、３時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩ、第６のレーン（４）、４時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩ、第７のレーン（５）、５時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩ、第８のレーン（６）、６時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩ、及び第９のレーン（１６）、１６時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩ。
【図２】ＩＰＴＧの存在下で増殖させた、ｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩ構築物を含有する大腸菌ロゼッタ株の全細胞溶解物のクマシー（登録商標）ブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。第１のレーン、標準分子量マーカー（分子量１５ｋＤａ及び２０ｋＤａに対応するバンドが示される）。第２のレーン（０）、誘導されていないｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩ、第３のレーン（１）、１時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩ、第４のレーン（２）、２時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩ、第５のレーン（３）、３時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩ、第６のレーン（４）、４時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩ、第７のレーン（５）、５時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩ、第８のレーン（６）、６時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩ、及び第９のレーン（１６）、１６時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩ。
【図３】ＩＰＴＧの存在下で増殖させた、ｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩＩ構築物を含有する大腸菌ロゼッタ株の全細胞溶解物のクマシー（登録商標）ブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。第１のレーン、標準分子量マーカー（分子量１５ｋＤａ及び２０ｋＤａに対応するバンドが示される）。第２のレーン（０）、誘導されていないｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩＩ、第３のレーン（１）、１時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩＩ、第４のレーン（２）、２時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩＩ、第５のレーン（３）、３時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩＩ、第６のレーン（４）、４時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩＩ、第７のレーン（５）、５時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩＩ、第８のレーン（６）、６時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩＩ、及び第９のレーン（１６）、１６時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩＩ。
【図４】ＩＰＴＧの存在下で増殖させた、ｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ニワトリＩＧＦ−Ｉ構築物を含有する大腸菌ロゼッタ株の全細胞溶解物のクマシー（登録商標）ブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。第１のレーン、標準分子量マーカー（分子量１５ｋＤａ及び２０ｋＤａに対応するバンドが示される）。第２のレーン（０）、誘導されていないｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ニワトリＩＧＦ−Ｉ、第３のレーン（１）、１時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ニワトリＩＧＦ−Ｉ、第４のレーン（２）、２時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ニワトリＩＧＦ−Ｉ、第５のレーン（３）、３時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ニワトリＩＧＦ−Ｉ、第６のレーン（４）、４時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ニワトリＩＧＦ−Ｉ、第７のレーン（５）、５時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ニワトリＩＧＦ−Ｉ、及び第８のレーン（６）、６時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ニワトリＩＧＦ−Ｉ。
【図５】ＩＰＴＧの存在下で増殖させた、ｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＡ ＲＢＤ構築物を含有する大腸菌ロゼッタ株の全細胞溶解物のクマシー（登録商標）ブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。第１のレーン、標準分子量マーカー（分子量２５ｋＤａ及び３７ｋＤａに対応するバンドが示される）。第２のレーン（０）、誘導されていないｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＡ ＲＢＤ、第３のレーン（１）、１時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＡ ＲＢＤ、第４のレーン（２）、２時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩＩ、第５のレーン（３）、３時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＡ ＲＢＤ、第６のレーン（４）、４時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＡ ＲＢＤ、第７のレーン（５）、５時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＡ ＲＢＤ、第８のレーン（６）、６時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＡ ＲＢＤ、第９のレーン（７）、７時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＡ ＲＢＤ、及び第１０のレーン（Ｏ／Ｎ）、１６時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＡ ＲＢＤ。
【図６】ＩＰＴＧの存在下で増殖させた、ｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＣＶコア構築物を含有する大腸菌ロゼッタ株の全細胞溶解物のクマシー（登録商標）ブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。第１のレーン、標準分子量マーカー（分子量２５ｋＤａ及び３７ｋＤａに対応するバンドが示される）。第２のレーン（０）、誘導されていないｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＣＶコア、第３のレーン（１）、１時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＣＶコア、第４のレーン（２）、２時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＣＶコア、第５のレーン（３）、３時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＣＶコア、第６のレーン（５）、５時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＣＶコア、第７のレーン（６）、６時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＣＶコア、及び第８のレーン（１６）、１６時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＣＶコア。
【図７】ＩＰＴＧの存在下で増殖させた、ｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨｐＮＣ構築物を含有する大腸菌ロゼッタ株の全細胞溶解物のクマシー（登録商標）ブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。第１のレーン、標準分子量マーカー（分子量１５ｋＤａ及び２０ｋＤａに対応するバンドが示される）。第２のレーン（０）、誘導されていないｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨｐＮＣ、第３のレーン（１）、１時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨｐＮＣ、第４のレーン（２）、２時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨｐＮＣ、第５のレーン（３）、３時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨｐＮＣ、第６のレーン（４）、４時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨｐＮＣ、第７のレーン（５）、５時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨｐＮＣ、及び第８のレーン（６）、６時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨｐＮＣ。
【図８】血清中、異なる濃度の組換えタンパク質、ＰＴＤ−Ｊ１−好中球ペプチド−１（ＮＰ−１）、ＰＴＤ−Ｊ１−コア及びＰＴＤ−Ｊ１を検出するためのドットブロット図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
概して本発明は、収率及び免疫原性を高めた、宿主細胞に導入して、組換え標的タンパク質を安定して且つ効率的に製造する発現系に関する。
【００１９】
本明細書中で使用する場合、「組換えタンパク質」という用語は、組換え分子、及び通常組換え方法、化学的方法又は他の好適な方法によって、タンパク質形質導入ドメイン及びＪドメインと共有結合（即ち融合）したタンパク質又はペプチド配列を意味する。必要に応じて、組換え分子は、ペプチドリンカー配列を介して１つ又は幾つかの部位で融合することができる。このペプチド配列は、宿主細胞誘発プロテアーゼによる切断のための部位を１つ又は複数含み得る。
【００２０】
「ポリペプチド」は、好ましくはその大きさにかかわらず、本質的に２０個の天然アミノ酸のいずれかから成る任意のポリマーを指す。「タンパク質」という用語は、比較的大きいタンパク質に対して用いられることが多いが、「ペプチド」は小ポリペプチドに対して用いられることが多く、この分野ではこれらの用語は重複して用いられることが多い。特に言及されない限り、「ポリペプチド」という用語は一般的にタンパク質、ポリペプチド及びペプチドを指す。
【００２１】
本発明によれば、「免疫原性」という用語は、組換えタンパク質、例えば組換え抗原性タンパク質が免疫反応を引き起こす能力を指す。
【００２２】
本発明によれば、宿主細胞における組換え標的タンパク質の発現系であって、本質的に配列番号１のタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）をコードするヌクレオチド配列と、Ｈｓｐ４０−Ｊドメインをコードするヌクレオチド配列と、標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列とから成る核酸セグメントを含み、核酸セグメントが宿主細胞において、異種タンパク質を発現するために、宿主特異的な転写調節要素と翻訳調節要素とに操作可能に連結する、発現系が提供される。例として、ＰＴＤをコードするヌクレオチド配列は、配列番号２のヌクレオチド配列を含む。また、配列番号２のヌクレオチド配列は、配列番号５及び配列番号６のオリゴヌクレオチドを使用することによって合成され得る。配列番号５及び配列番号６のオリゴヌクレオチドは、その５’末端でリン酸化し得る。それからまた、オリゴヌクレオチドは、ベクターに挿入されると、ホスファターゼによって脱リン酸化され得る。別の例によれば、ＨＳＰ４０Ｊドメインは、亜型Ａ、亜型Ｂ及び亜型ＣのＨＳＰ４０Ｊドメインから成る群から選択され得る。例えば、亜型Ａ、亜型Ｂ及び亜型ＣのＨＳＰ４０Ｊドメインは、ヒトゲノムにおける４１個のＤｎａＪ／ＨＳＰ４０タンパク質中に含有されるＪドメイン又はＪ様ドメインであり得る（Qiu et al., Cell. Mol. Life Sci. 63: 2560-2570 （2006））。本発明の一具体例によれば、ＨＳＰ４０Ｊドメインは、配列番号４のヌクレオチド配列によってコードされた配列番号３のペプチドを含む。また、配列番号４のヌクレオチド配列は、配列番号７〜配列番号１６のオリゴヌクレオチドを使用することによって合成され得る。また、標的タンパク質は、ＨＳＰペプチド、成長因子、ウイルス受容体結合ドメイン、及びウイルスコアタンパク質を含み得るが、これらに限定されない。本発明の一例において、組換えタンパク質は、免疫付与された宿主において免疫原性を示す抗原性ポリペプチドである。別の例では、本発明は上記の発現系によって製造される組換えタンパク質を含むワクチンも提供する。
【００２３】
本発明は、核酸配列、特に本発明の組換えタンパク質をコードするＤＮＡ配列を提供し得る。別の例では、ＤＮＡ配列は、ファージ、ウイルス、プラスミド、ファージミド、コスミド、ＹＡＣ又はエピソームのような染色体外の複製に適したベクターによって運ばれ得る。特に、所望の組換えタンパク質をコードするＤＮＡベクターを使用して、本明細書中に記載の調製方法を容易にすると共に、有意量の組換えタンパク質を得ることができる。ＤＮＡ配列は、適切なベクター、即ち挿入されるタンパク質コード配列の転写及び翻訳に必要な要素を含有するベクターに挿入することができる。タンパク質コード配列を発現するのに、種々の宿主ベクター系を利用してもよい。これらとしては、ウイルスを感染させた哺乳動物細胞系、ウイルスを感染させた昆虫細胞系、酵母ベクターを含有する酵母、又はバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ若しくはコスミドＤＮＡで形質転換した細菌等の微生物が挙げられる。利用される宿主ベクター系に応じて、多くの好適な転写要素及び翻訳要素の１つが使用され得る。例えばベクターは、細菌Ｔ７プロモータ等のプロモータと、転写を調節する、ｌａｃオペレータ等の誘導性オペレータとを含有し得る。
【００２４】
他のベクター及び構築物としては、染色体ＤＮＡ配列、非染色体ＤＮＡ配列及び合成ＤＮＡ配列、例えばＳＶ４０の誘導体、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、プラスミドとファージＤＮＡとの組合せに由来するベクター、プラスミドとウイルスＤＮＡとの組合せに由来するシャトルベクター、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス及び仮性狂犬病ウイルス等のウイルスＤＮＡが挙げられる。しかしながら、任意の他のベクターは、対象の宿主細胞で複製可能で且つ生存可能であれば、核酸発現構築物の調製に使用してもよい。核酸配列は、単離及び任意の所望のベクターへのクローニングのために、多くの制限エンドヌクレアーゼ部位の横に位置し得る。組換えタンパク質のその後の精製を容易にするのに添加される、ＥＥ、６ＸＨｉｓ、ＨＡ又はＭＹＣ等のタンパク質同定タグ又は精製タグも存在する。さらに、核酸発現構築物は、転写ターミネータも含有し得る。例えば、ベクターは、核酸配列の転写を終わらせるＴ７ターミネータを含有し得る。
【００２５】
本発明の一具体例によれば、組換えタンパク質は、配列番号２のヌクレオチド配列と、Ｈｓｐ４０−Ｊドメインをコードするヌクレオチド配列と、標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む発現ベクターを使用することによって製造され得る。別の例では、発現ベクターは、配列番号２のヌクレオチド配列と、配列番号４のヌクレオチド配列と、標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、発現ベクターにおいてヌクレオチド配列と操作可能に連結する、宿主特異的な転写調節要素及び翻訳調節要素とを含み得る。
【００２６】
本発明の組換え分子を運ぶベクターは、標的細胞又はかかる細胞群に効果的に形質導入され得る。必要に応じて、様々な戦略の１つ又は組合せによって、形質導入の効率をモニタリング及び定量化してもよい。
【００２７】
例えば、１つのアプローチは、細胞による組換えタンパク質の取り込みを測定するｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを伴う。アッセイには、例えば、放射性原子、蛍光タグ、リン光タグ又は発光タグ（例えばフルオレセイン、ローダミン、Ｃｙ３）による組換えタンパク質の検出可能な標識化と、その後の標識組換えタンパク質の取り込みの測定とが含まれる。代替的に、組換えタンパク質は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ又はルシフェラーゼのような、検出可能なラベルを形成可能な酵素によって標識することができる。蛍光顕微鏡検査法又はオートラジオグラフィによる標準的な細胞分別器（例えばＦＡＣＳ）での標識細胞の定量化のような幾つかの従来方法によって、取り込みを測定することができる。
【００２８】
概して上記で言及したように、宿主細胞は、所望の組換えタンパク質をコードする核酸を増殖するために調製目的で使用してもよい。このため、宿主細胞は、哺乳動物細胞のようなより高等な真核細胞であっても、若しくは酵母細胞のようなより低級の（lower）真核細胞であってもよく、又は宿主細胞は、細菌細胞のような原核細胞であってもよい。本発明による適切な宿主細胞の代表例としては、大腸菌、ストレプトミセス（Streptomyces）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）のような細菌細胞；酵母のような真菌細胞；ショウジョウバエＳ２及びスポドプテラ（Spodoptera）Ｓｆ９のような昆虫細胞；ＭＤＣＫ、Ｈｅｐ−２、ＣＨＯ又はＣＯＳのような動物細胞；ジャーカット細胞又は２９３細胞のようなヒト細胞；アデノウイルス；植物細胞、又は既にｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖に適応した、若しくはこのようにして新たに樹立した任意の他の細胞が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。適切な宿主細胞の選択は、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると見なされる。
【００２９】
さらに、所望の組換えタンパク質をコードする核酸は、細胞をトランスフェクトするのに標準的な技法によって、宿主細胞に導入することができる。「トランスフェクト（transfecting）」又は「トランスフェクション（transfection）」は、核酸を宿主細胞に導入するための全ての従来技法を包含するように意図され、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、電気穿孔（electroporation）、顕微注入（microinjection）、ウイルス形質導入及び／又は融合（integration）が挙げられる。
【００３０】
本発明は、対象の組換えタンパク質を単離する製造プロセスをさらに提供し得る。このプロセスでは、宿主細胞（例えば、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、細菌細胞又は動物細胞）（これに、調節配列と操作可能に連結した（liked）、対象のタンパク質をコードする核酸が導入されている）は、対象の組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列の転写を刺激するために、組換えタンパク質の存在下の培養培地中において生産規模で増殖し得る。その後、対象の組換えタンパク質は、採取された宿主細胞又は培養培地から単離され得る。培地又は採取された細胞から対象のタンパク質を単離するのに、標準的なタンパク質精製技法を使用してもよい。特に、精製技法を用いて、ローラーボトル、スピナーフラスコ、組織培養プレート、バイオリアクタ又は発酵槽を含む種々の装置（implementations）から大規模で（即ち少なくともミリグラム量で）所望の融合タンパク質を発現及び精製することができる。
【００３１】
本発明の組換えタンパク質は、適切な組合せの既知の技法によって分離及び精製し得る。例えばこれらの方法としては、塩析及び溶媒析出のような溶解度を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過、及びＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動のような分子量の違いを利用する方法、イオン交換カラムクロマトグラフィのような電荷の違いを利用する方法、親和性クロマトグラフィのような特異親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィのような疎水性の違いを利用する方法、並びに等電点電気泳動のような等電点の違いを利用する方法、Ｎｉ−ＮＴＡのような金属親和性カラムが挙げられる。
【００３２】
したがって、別の例によれば、本発明は、宿主細胞において収率及び免疫原性を高めて組換え標的タンパク質を製造する方法を提供し得る。本方法は、
本質的に配列番号１のタンパク質形質導入ドメインをコードするヌクレオチド配列と、Ｈｓｐ４０−Ｊドメインをコードするヌクレオチド配列と、標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列とから成る核酸セグメントを含む発現ベクターを構築すること（核酸セグメントが宿主細胞特異的な転写調節要素と翻訳調節要素とに操作可能に連結される）、
前記発現ベクターで前記宿主細胞を形質転換すること、並びに
組換え標的タンパク質を宿主細胞から回収及び単離することを含む。
【００３３】
別の一例によれば、本方法は、生物を組換えタンパク質により免疫付与する工程をさらに含む。組換えタンパク質の抗原性は、試験膜上でブロットした組換えタンパク質のエピトープ（単数又は複数）と結合する標識抗体を使用して求められ得る。また、組換えタンパク質の免疫原性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで抗原提示アッセイにおいて、並びにｉｎ ｖｉｖｏで抗体応答及び抗原性ポリペプチドによる皮下攻撃（challenge）に対する防御の誘導において他のポリペプチドと比較することができる。
【００３４】
また本発明は、
ａ．キメラタンパク質のＮ末端に、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）又はＨＩＶ Ｔａｔ ＰＴＤ活性を有するその断片を含有する第１のポリペプチジル断片と、
ｂ．第１のポリペプチジル断片のＣ末端に、Ｊドメイン又は熱ショックタンパク質７０（Ｈｓｐ７０）非相互作用活性を有するその断片を含有する第２のポリペプチジル断片と、
ｃ．第２のポリペプチジル断片のＣ末端に、標的タンパク質又はポリペプチドを含有する第３のポリペプチジル断片とを含む、キメラタンパク質を提供する。
【００３５】
また本発明は、
ａ．タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）又はＨＩＶ Ｔａｔ ＰＴＤ活性を有するその断片をコードする第１のＤＮＡ配列と、
ｂ．Ｊドメイン又は熱ショックタンパク質７０（Ｈｓｐ７０）非相互作用活性を有するその断片をコードする、第１のＤＮＡ配列と翻訳フレームで連結した第２のＤＮＡ配列と、
ｃ．標的タンパク質又はポリペプチドをコードする、第２のＤＮＡ配列と翻訳フレームで連結した第３のＤＮＡ配列とを含む、キメラ遺伝子を提供する。
【００３６】
本発明は、
ａ．タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）又はＨＩＶ Ｔａｔ ＰＴＤ活性を有するその断片をコードする第１のＤＮＡ配列と、
ｂ．Ｊドメイン又は熱ショックタンパク質７０（Ｈｓｐ７０）非相互作用活性を有するその断片をコードする、第１のＤＮＡ配列と翻訳フレームで連結した第２のＤＮＡ配列とを含む、さらに別のキメラ遺伝子を提供する。
【００３７】
本発明によれば、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）をコードする第１のＤＮＡ配列は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、Ｊドメインをコードする第２のＤＮＡ配列は、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む。好ましくは、Ｊドメインはヒト熱ショックタンパク質４０由来である。
【００３８】
抗原性ポリペプチドは、ＨＳＰペプチド、成長因子、ウイルス受容体結合ドメイン、ウイルスコアタンパク質又はそれらの組合せを含み得るが、必ずしもこれらに限定されない。例えば、宿主に対して免疫反応を誘起可能な他のタンパク質又はポリペプチドも、本発明に包含され得る。
【００３９】
これより、本発明は、以下の具体的であるが、非限定的な実施例を参照してさらに詳細に説明される。
【実施例】
【００４０】
実施例１：ｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ１−Ｊ１−Ａｇ発現ベクターの構築
ｐＥＴ２２ｂプラスミド（Novagen, Madison, Wis.）を用いて、配列番号１のタンパク質形質導入ドメインをコードするヌクレオチド配列と、配列番号３のＨｓｐ４０−Ｊドメインをコードするヌクレオチド配列と、標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含むｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ１ベクターを作製した。ここで、核酸セグメントは、宿主細胞において組換え標的タンパク質を発現するために、宿主特異的な転写調節要素と翻訳調節要素とに操作可能に連結している。大腸菌に対するＰＴＤの最適化コドンをコードするオリゴヌクレオチドは、以下の表Ｉに列挙される配列番号５及び配列番号６のプライマーを使用して化学合成した。ＮｄｅＩとＢａｍＨＩとで同時に消化したｐＥＴ２２ｂプラスミドに挿入するために、二本鎖形態にアニーリングする前、これらの２つのオリゴヌクレオチドの５’末端をポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ）で脱リン酸化して、ｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ１を作製した。
【００４１】
【表１】
【００４２】
ＨＳＰ４０遺伝子のＪドメインは、表ＩＩに示される配列番号７〜配列番号１６のオリゴヌクレオチドを使用したアセンブリＰＣＲによって合成した。これらのオリゴヌクレオチドを、大腸菌に対する最適化コドンを増幅するために設計した。単一コロニーの選択及びＤＮＡシークエンシングのために、ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクター（Promega）にクローン化した。正確なＪドメインコードＤＮＡ配列を有するプラスミドをＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩとで同時に消化し、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクターから０．２ｋｂの挿入ＤＮＡ断片を取り除いた。それから、このＤＮＡ断片を、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩとＣＩＡＰとで処理したｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ１ベクターに挿入し、ｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ１−Ｊ１発現ベクターを作製した。
【００４３】
【表２】
【００４４】
ｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ１−Ｊ１ベクターによって発現される、１つ又は複数の組換えポリペプチド又は抗原性（Ａｇ）ポリペプチドは通常、大腸菌の最適化コドンを有するＤＮＡに形質転換した。１つ又は複数の組換えポリペプチドコード領域もＰＣＲで増幅した。以下の実施例におけるこれらのポリペプチドコードＤＮＡは、都合よくｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ１−Ｊ１ベクターに挿入されるように、ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ部位の横に位置していた。結果として、ｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ１−Ｊ１−Ａｇ発現ベクターが構築された。
【００４５】
アセンブリＰＣＲ
オリゴヌクレオチドセットを用いて、コドンが最適化されたｃＤＮＡを合成した。０．５μＭのＦ１及びＲ１と、０．０５μＭのＦ２、Ｆ３、Ｒ３、Ｒ２等を、ＰＣＲ反応混合液中で調整した。反応条件は、９４℃で２分、その後９４℃で２０秒／４０℃で４０秒／７２℃で２０秒を２０サイクル、及び７２℃で５分の伸長であった。プラスミドＤＮＡ単離及びＤＮＡシークエンシングのために、ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙにクローン化した。
【００４６】
実施例２：ＰＴＤ−Ｊ−Ａｇ組換えタンパク質の発現
ｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−Ａｇベクターを大腸菌ロゼッタ株（Novagen）のコンピテントセルに形質転換した。１ｍＭのＩＰＴＧを導入する前にＯＤ６００＝０．３になるまで、アンピシリンとクロラムフェニコールとに耐性がある大腸菌コロニーをＴＹＤ培地（１Ｌ当たり１０ｇ トリプトン／２０ｇ 酵母エキス／５ｇ ＮａＣｌ／２ｇ デキストロース、ｐＨ７．２）中で、培養及び増幅させた。細胞試料を列挙する時間割で回収した。
【００４７】
０．３ＯＤ６００単位での大腸菌の総タンパク試料を、３０μＬの２×ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファー中に溶解した。５分間、水浴を沸騰させることによって処理した後、これらのタンパク質試料を、１２．５％又は１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でクマシーブリリアントブルーＲ２５０染色を実施することによって、タンパク質のバンドを可視化した。
【００４８】
実施例３：免疫付与
マウスを、ＴｉｔｅｒＭＡＸ Ｇｏｌｄアジュバントで乳化したポリペプチド５０μｇにより皮下で免疫付与した。２週間ごとに追加免疫（Boosts）を実施した。マウスの血清を回収し、ポリペプチドに対する抗体を産生させた。
【００４９】
ドットブロット法
段階希釈した組換えタンパク質又は合成ポリペプチドをＰＶＤＦ膜上にスポットした（spotted）。５％脱脂乳のＴＢＳＮ（２５ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．４／１５０ｍＭのＮａＣｌ／０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０）で１時間、膜をブロッキングした。ＴＢＳＮで４回洗浄した後、一晩インキュベートするために１０００倍に希釈したマウス抗血清中に膜を浸した。ＴＢＳＮで４回洗浄することによって、結合されていない一次抗体（Ａｂ）を取り除いた後、ＨＲＰ結合ヤギ抗マウス二次Ａｂ（２０００倍希釈）を４時間適用した。製造業者の取扱説明書に記載されるように、化学発光キット（Pierce）によって、洗浄膜上でタンパク質の標識を実施した。
【００５０】
実施例４：ヒトＨＳＰＡ１ＡペプチドＩの発現
アセンブリＰＣＲで使用するオリゴヌクレオチドを表ＩＩＩに列挙した。これらのオリゴヌクレオチドを用いて、配列番号１８（ＳＳＳＴＱＡＳＬＥＩ ＤＳＬＦＥＧＩＤＦＹ ＴＳＩＴＲＡＲＦＥＥ ＬＣＳＤＬＦＲＳＴＬ ＥＰＶＥＫＡＬＲＤＡ ＫＬＤＫＡＱＩ）のＨＡＰＡ１ＡペプチドＩをコードする配列番号１７のコドンが最適化されたｃＤＮＡを合成した。コドンが最適化されたｃＤＮＡ配列を、実施例１に従って構築した発現ベクターｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊに挿入した。
【００５１】
【表３】
【００５２】
実施例２に記載のように、組換えＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩをコードした核酸セグメントを有する発現ベクターを大腸菌に導入した。また、組換えＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩ発現を定量化し、総タンパク質に対する組換えＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩの重量パーセントで表した。図１を参照すると、組換えＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩの重量パーセントは、最初の６時間で６５％〜９２％の範囲である。また、１６時間後の組換えＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩの重量パーセントは７７％であった。
【００５３】
実施例５：ヒトＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩの発現
アセンブリＰＣＲで使用するオリゴヌクレオチドを表ＩＶに列挙した。これらのオリゴヌクレオチドを用いて、配列番号２６（ＮＶＴＡＴＤＫＳＴＧ ＫＡＮＫＩＴＩＴＮＤ ＫＧＲＬＳＫＥＥＩＥ ＲＭＶＱＥＡＥＫＹＫ ＡＥＤＥＶＱＲＥＲＶ ＳＡＫＮＡＬＥＳＹＡ Ｆ）のＨＡＰＡ１ＡペプチドＩＩをコードする配列番号２５のコドンが最適化されたｃＤＮＡを合成した。コドンが最適化されたｃＤＮＡ配列を、実施例１に従って構築した発現ベクターに挿入した。
【００５４】
【表４】
【００５５】
実施例２に記載のように、組換えＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩをコードした核酸セグメントを有する発現ベクターを大腸菌に導入した。また、組換えＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩ発現を定量化し、総タンパク質に対する組換えＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩの重量パーセントで表した。図２を参照すると、組換えＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩの重量パーセントは、最初の６時間で２７％〜５４％の範囲である。また、１６時間後の組換えＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩの重量パーセントは１０％であった。
【００５６】
実施例６：ヒトＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩＩの発現
アセンブリＰＣＲで使用するオリゴヌクレオチドを表Ｖに列挙した。これらのオリゴヌクレオチドを用いて、配列番号３５（ＥＤＥＧＬＫＧＫＩＳ ＥＡＤＫＫＫＶＬＤＫ ＣＱＥＶＩＳＷＬＤＡ ＮＴＬＡＥＫＤＥＦＥ ＨＫＲＫＥＬＥＱＶＣ ＮＰＩＩＳＧＬＹＱＧ Ａ）のＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩＩをコードする配列番号３４のコドンが最適化されたｃＤＮＡを合成した。コドンが最適化されたｃＤＮＡ配列を、実施例１に従って構築した発現ベクターに挿入した。
【００５７】
【表５】
【００５８】
実施例２に記載のように、組換えＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩＩをコードした核酸セグメントを有する発現ベクターを大腸菌に導入した。また、組換えＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩＩ発現を定量化し、総タンパク質に対する組換えＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩＩの重量パーセントで表した。図３を参照すると、組換えＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩＩの重量パーセントは、最初の５時間で１０％〜３３％の範囲である。
【００５９】
実施例７：ニワトリＩＧＦ−Ｉの発現
アセンブリＰＣＲで使用するオリゴヌクレオチドを表ＶＩに列挙した。これらのオリゴヌクレオチドを用いて、配列番号４４（ＧＰＥＴＬＣＧＡＥＬ ＶＤＡＬＱＦＶＣＧＤ ＲＧＦＹＦＳＫＰＴＧ ＹＧＳＳＳＡＡＬＨＨ ＫＧＩＶＤＥＣＣＦＱ ＳＣＤＬＲＲＬＥＭＹ ＣＡＰＩＫＰＰＫＳＡ）のニワトリＩＧＦ−Ｉをコードする配列番号４３のコドンが最適化されたｃＤＮＡを合成した。コドンが最適化されたｃＤＮＡ配列を、実施例１に従って構築した発現ベクターに挿入した。
【００６０】
【表６】
【００６１】
実施例２に記載のように、組換えＰＴＤ−Ｊ−ニワトリＩＧＦ−Ｉをコードした核酸セグメントを有する発現ベクターを大腸菌に導入した。また、組換えＰＴＤ−Ｊ−ニワトリＩＧＦ−Ｉ発現を定量化し、総タンパク質に対する組換えＰＴＤ−Ｊ−ニワトリＩＧＦ−Ｉの重量パーセントで表した。図４を参照すると、組換えＰＴＤ−Ｊ−ニワトリＩＧＦ−Ｉの重量パーセントは、最初の６時間で７４％〜９０％の範囲である。
【００６２】
実施例８：トリインフルエンザウイルスＨＡ（Ｈ５）受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）の発現
ＰＣＲに使用するプライマー対を表ＶＩＩに列挙した。これらのプライマーを用いて、配列番号５３のＨＡ−ＲＢＤをコードする配列番号５２の天然ウイルスｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡ配列を、実施例１に従って構築した発現ベクターに挿入した。
【００６３】
【表７】
【００６４】
実施例２に記載のように、組換えＰＴＤ−Ｊ−ＨＡ ＲＢＤをコードした核酸セグメントを有する発現ベクターを大腸菌に導入した。また、組換えＰＴＤ−Ｊ−ＨＡ ＲＢＤ発現を定量化し、総タンパク質に対する組換えＰＴＤ−Ｊ−ＨＡ ＲＢＤの重量パーセントで表した。図５を参照すると、組換えＰＴＤ−Ｊ−ＨＡ ＲＢＤの重量パーセントは、最初の７時間で１２％〜３８％の範囲である。また、１６時間後の組換えＰＴＤ−Ｊ−ＨＡ ＲＢＤの重量パーセントは３２％であった。
【００６５】
実施例９：Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）コアタンパク質の発現
ＰＣＲに使用するプライマー対を表ＶＩＩＩに列挙した。これらのプライマーを用いて、配列番号５７のＨＣＶコアタンパク質をコードする配列番号５６の天然ウイルスｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡ配列を、実施例１に従って構築した発現ベクターに挿入した。
【００６６】
【表８】
【００６７】
実施例２に記載のように、組換えＰＴＤ−Ｊ−ＨＣＶコアタンパク質をコードした核酸セグメントを有する発現ベクターを大腸菌に導入した。また、組換えＰＴＤ−Ｊ−ＨＣＶコアタンパク質発現を定量化し、総タンパク質に対する組換えＰＴＤ−Ｊ−ＨＣＶコアタンパク質の重量パーセントで表した。図５を参照すると、組換えＰＴＤ−Ｊ−ＨＣＶコアタンパク質の重量パーセントは、最初の６時間で１１％〜３９％の範囲である。
【００６８】
実施例１０：ＨｐＮＣ免疫原性の増大
ＰＣＲに使用するプライマー組を表ＩＸに列挙した。これらのプライマーを用いて、配列番号６１のＨｐＮＣタンパク質をコードする配列番号６０のヒトハプトグロビン融合ペプチドＨｐＮＣをコードするコドンが最適化されたｃＤＮＡ配列を合成した。ヒトハプトグロビンα鎖の融合ペプチドＨｐＮＣは、ハプトグロビンの成熟分泌されたα１及びα２ペプチドに存在するＮ末端のＤＳＧＮＤＶＴＤＩＡＤＤＧペプチドと、リンカーＧＳＧＧのテトラペプチドと、未熟ハプトグロビンα鎖にしか存在しないＣ末端のＲＨＹＥＧＳＴＶＰＥＫＫＴＰＫＳペプチドとから成っていた。コドンが最適化されたｃＤＮＡ配列を、実施例１に従って構築した発現ベクターｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊに挿入した。
【００６９】
【表９】
【００７０】
実施例２に記載のように、組換えｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨｐＮＣをコードした核酸セグメントを有する発現ベクターを大腸菌に導入した。また、組換えＰＴＤ−Ｊ−ＨｐＮＣタンパク質発現を定量化し、総タンパク質に対する組換えＰＴＤ−Ｊ−ＨｐＮＣタンパク質の重量パーセントで表した。図７を参照すると、組換えＰＴＤ−Ｊ−ＨｐＮＣタンパク質の重量パーセントは、最初の６時間で２６％〜３３％の範囲である。
【００７１】
上記の実施例の結果から、最適化コドンを有するｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ発現ベクターを使用することによって製造された組換えタンパク質の重量パーセントは、総タンパク質に対しておよそ９０％であることが明らかになった。他方で、天然ｃＤＮＡを使用した場合、総タンパク質中の組換えタンパク質の重量パーセントはおよそ４０％になり得る。したがって、本発明の発現ベクターによって、収率が高まり、組換えタンパク質が製造される。
【００７２】
実施例１１：ウサギ好中球ペプチド−１（ＮＰ−１）の免疫原性の増大
ＮＰ−１（配列番号６７）をコードするコドンが最適化されたｃＤＮＡ配列を合成し、実施例１に記載の方法に従って構築した発現ベクターｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊに挿入した。実施例２に記載のように、組換えｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＮＰ−１をコードした核酸セグメントを有する発現ベクターを大腸菌に導入した。また、組換えＮＰ−１（配列番号６８）を大腸菌から回収及び単離した。
【００７３】
実施例３に従って、組換えＮＰ−１を皮下注射することによって、マウスを免疫付与し、組換えＮＰ−１に対する抗体を産生させた。それから、マウスから血清を回収した。実施例３に記載のドットブロットアッセイを用いて、ＮＰ−１の抗原性を求めた。
【００７４】
組換えＮＰ−１を抗原に用いると、力価が高い血清が産生された。血清は、３２０ｐｇの抗原を検出することができるが、ＰＴＤ１−Ｊ１−コア組換えタンパク質と交差反応せず、このことは図８に示すように、血清が厳密にＮＰ−１領域に強く且つ特異的に対応していたことを示している。
【００７５】
当業者は、広範な本発明の概念を逸脱しなければ、上記の実施形態を変更することができることが認められる。したがって、本発明は、開示された特定の実施形態に限定されず、添付の特許請求の範囲によって規定されるような本発明の精神及び範囲内の変更形態を含むように意図されることが理解される。
【配列表フリーテキスト】
【００７６】
配列番号１：ヒト免疫不全ウイルスＴａｔ ＰＴＤ１
配列番号２：ヒト免疫不全ウイルスＴａｔ ＰＴＤ１
配列番号３：ＨＳＰ４０Ｊドメイン（Ｊ１）
配列番号４：ＨＳＰ４０Ｊドメイン（Ｊ１）−コード配列
配列番号５：ＰＴＤ１の合成の為のフォワードプライマーＰＴＤ１ ｆ
配列番号６：ＰＴＤ１の合成の為のフォワードプライマーＰＴＤ１ ｒ
配列番号７：ＨＳＰ４０Ｊドメインの合成の為のフォワードプライマーＪ１ ｎＢＦ１
配列番号８：ＨＳＰ４０Ｊドメインの合成の為のフォワードプライマーｎＦ２
配列番号９：ＨＳＰ４０Ｊドメインの合成の為のフォワードプライマーＦ３
配列番号１０：ＨＳＰ４０Ｊドメインの合成の為のフォワードプライマーＦ４
配列番号１１：ＨＳＰ４０Ｊドメインの合成の為のフォワードプライマーＦ５
配列番号１２：ＨＳＰ４０Ｊドメインの合成の為のフォワードプライマーＦ６
配列番号１３：ＨＳＰ４０Ｊドメインの合成の為のリバースプライマーＥｃｏＲ１ Ｒ１
配列番号１４：ＨＳＰ４０Ｊドメインの合成の為のリバースプライマーＲ２
配列番号１５：ＨＳＰ４０Ｊドメインの合成の為のリバースプライマーＲ３
配列番号１６：ＨＳＰ４０Ｊドメインの合成の為のリバースプライマーＲ４
配列番号１７：ヒトＨＳＰＡ１Ａペプチド Ｉ−コード配列
配列番号１８：ヒトＨＳＰＡ１Ａペプチド
配列番号１９：ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩの合成の為のフォワードプライマーＲＩ−Ｉ−ｆ１
配列番号２０：ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩの合成の為のフォワードプライマーＩ−ｆ２
配列番号２１：ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩの合成の為のフォワードプライマーＩ−ｆ３
配列番号２２：ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩの合成の為のリバースプライマーＩ−ｒ３
配列番号２３：ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩの合成の為のリバースプライマーＩ−ｒ２
配列番号２４：ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩの合成の為のリバースプライマーＸｈｏ−Ｉ−ｒ１
配列番号２５：ヒトＨＳＰＡ１Ａペプチド ＩＩ−コード配列
配列番号２６：ヒトＨＳＰＡ１Ａペプチド ＩＩ
配列番号２７：ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩの合成の為のフォワードプライマーＲＩ−ＩＩ−ｆ１
配列番号２８：ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩの合成の為のフォワードプライマーＩＩ−ｆ２
配列番号２９：ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩの合成の為のフォワードプライマーＩＩ−ｆ３
配列番号３０：ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩの合成の為のフォワードプライマーＩＩ−ｆ４
配列番号３１：ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩの合成の為のリバースプライマーＩＩ−ｒ３
配列番号３２：ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩの合成の為のリバースプライマーＩＩ−ｒ２
配列番号３３：ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩの合成の為のリバースプライマーＸｈｏ−ＩＩ−ｒ１
配列番号３４：ヒトＨＳＰＡ１Ａペプチド ＩＩＩ−コード配列
配列番号３５：ヒトＨＳＰＡ１Ａペプチド ＩＩＩ
配列番号３６：ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩＩの合成の為のフォワードプライマーＲＩ−ＩＩＩ−ｆ１
配列番号３７：ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩＩの合成の為のフォワードプライマーＩＩＩ−ｆ２
配列番号３８：ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩＩの合成の為のフォワードプライマーＩＩＩ−ｆ３
配列番号３９：ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩＩの合成の為のフォワードプライマーＩＩＩ−ｆ４
配列番号４０：ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩＩの合成の為のリバースプライマーＩＩＩ−ｒ３
配列番号４１：ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩＩの合成の為のリバースプライマーＩＩＩ−ｒ２
配列番号４２：ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩＩの合成の為のリバースプライマーＩＩＩ−ｒ１
配列番号４３：ニワトリＩＧＦ−１ コード配列
配列番号４４：ニワトリＩＧＦ−１
配列番号４５：ｃＩＧＦ−Ｉの合成の為のフォワードプライマーＲＩ−Ｆ１
配列番号４６：ｃＩＧＦ−Ｉの合成の為のフォワードプライマーＦ２
配列番号４７：ｃＩＧＦ−Ｉの合成の為のフォワードプライマーＦ３
配列番号４８：ｃＩＧＦ−Ｉの合成の為のフォワードプライマーＦ４
配列番号４９：ｃＩＧＦ−Ｉの合成の為のフォワードプライマーＦ５
配列番号５０：ｃＩＧＦ−Ｉの合成の為のリバースプライマーＲ２
配列番号５１：ｃＩＧＦ−Ｉの合成の為のリバースプライマーＸｈｏ−Ｒ１
配列番号５２：トリインフルエンザＨＡ（Ｈ５）ＲＢＤ−コード配列
配列番号５３：トリインフルエンザＨＡ（Ｈ５）ＲＢＤ
配列番号５４：トリインフルエンザＨＡ ＲＢＤの合成の為のフォワードプライマーＲＩ ＨＡ−ＲＢＤ ｆ
配列番号５５：トリインフルエンザＨＡ ＲＢＤの合成の為のリバースプライマーＸｈｏ ＨＡ−ＲＢＤ ｒ
配列番号５６：Ｃ型肝炎ウイルスコアタンパク質−コード配列
配列番号５７：Ｃ型肝炎ウイルスコアタンパク質
配列番号５８：ＨＣＶ−コアタンパク質の為のフォワードプライマーＲＩ−コアｆ
配列番号５９：ＨＣＶ−コアタンパク質の為のリバースプライマーＸｈｏ−コアｒ
配列番号６０：ヒトハプトグロビン融合ポリペプチドＨｐＮＣをコードする融合遺伝子
配列番号６１：ヒトハプトグロビン融合ポリペプチドＨｐＮＣ
配列番号６２：ヒトハプトグロビン融合ポリペプチドＨｐＮＣの為のフォワードプライマーＲＩ−Ｆ１
配列番号６３：ヒトハプトグロビン融合ポリペプチドＨｐＮＣの為のフォワードプライマーＦ２
配列番号６４：ヒトハプトグロビン融合ポリペプチドＨｐＮＣの為のフォワードプライマーＦ３
配列番号６５：ヒトハプトグロビン融合ポリペプチドＨｐＮＣの為のリバースプライマーＲ２
配列番号６６：ヒトハプトグロビン融合ポリペプチドＨｐＮＣの為のリバースプライマーＸｈｏ−Ｒ１
配列番号６７：ウサギ好中球ペプチド−１（ＮＰ−１）をコードするｃＤＮＡ
配列番号６８：ウサギ好中球ペプチド−１（ＮＰ−１）
【技術分野】
【０００１】
本発明は、収率及び免疫原性を高めた組換えタンパク質の発現系に関する。
【背景技術】
【０００２】
より多くの製品（例えば組換えタンパク質）のヒトでの使用が認可されているか、又は認可されようとしているために、治療上使用される生物製剤の効率的な製造に対する要求が着実に増している。昔から、そして今現在でも、細菌発酵プロセスがこれらの種類の分子を製造する主なツールである。プロセス最適化の主な目的は、出来る限り最も低いコストで要求される品質の製品を高収率で得ることであるが、これは多くの場合、特定の発現構築物又は発現系の特性に左右される。
【０００３】
Ｊドメインの構造的特徴によって、Ｈｓｐ４０タンパク質と、それらのパートナーＨｓｐ７０との間の相互作用の特異性が決定されることが報告されている（Hennessy et al., Protein Science （2005）, 14:1697-1709；非特許文献１）。Ｊドメインは、主要な結合部位であり、またＨｓｐ４０及びＨｓｐ４０様タンパク質と、それらのパートナーＨｓｐ７０との間の相互作用に必要な最小領域であると考えられている（Walsh et al., EMBO report （2004）, 6:567-571；非特許文献２）。ＤＮＡワクチン系によるＳＶ４０ラージＴ抗原のＪドメインと融合したペプチドによって、そのペプチドの抗原性を高めることができることが報告されている（Reimann and Schirmbeck, Immuno Rev. （2004）, 199:54-67；非特許文献３）。Ｊドメインが、ＤｎａＫとＤｎａＪ結合基質とを繋留し、それからＤｎａＫがそのＣ末端ペプチド結合ドメインと結合することも知られている（Tilstra et al., Biochemical Society Transactions. （2007）, 35:811-815；非特許文献４）。
【０００４】
他方で、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）は、従来のエンドサイトーシスと独立してはるかに大きい分子を細胞に運ぶことができる小ペプチドである。この特性によって、ＰＴＤは、研究目的でタンパク質及び他の分子を生細胞に運ぶのに理想的なツールとなる（Beerens et al, Current Gene Therapy （2003）, 3（5）:486-494；非特許文献５）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Hennessy et al., Protein Science （2005）, 14:1697-1709
【非特許文献２】Walsh et al., EMBO report （2004）, 6:567-571
【非特許文献３】Reimann and Schirmbeck, Immuno Rev. （2004）, 199:54-67
【非特許文献４】Tilstra et al., Biochemical Society Transactions. （2007）, 35:811-815
【非特許文献５】Beerens et al, Current Gene Therapy （2003）, 3（5）:486-494
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、組換えタンパク質の収率及び免疫原性を改善する発現系の開発において、ＰＴＤもＨｓｐ４０Ｊドメインも示唆されていない。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明によれば、宿主細胞における組換え標的タンパク質の発現系であって、本質的に配列番号１のタンパク質形質導入ドメインをコードするヌクレオチド配列と、Ｈｓｐ４０−Ｊドメインをコードするヌクレオチド配列と、標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列とから成る核酸セグメントを含み、核酸セグメントが宿主細胞において、組換え標的タンパク質を発現するために、宿主特異的な転写調節要素と翻訳調節要素とに操作可能に連結する、発現系が提供される。
【０００８】
さらに本発明によれば、上記の発現系を用いて、組換え標的タンパク質を発現する方法が提供される。本発明の方法は、
本質的に配列番号１のタンパク質形質導入ドメインをコードするヌクレオチド配列と、Ｈｓｐ４０−Ｊドメインをコードするヌクレオチド配列と、標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列とから成る核酸セグメントを含む発現ベクターを構築すること（前記核酸セグメントが宿主細胞特異的な転写調節要素と翻訳調節要素とに操作可能に連結されている）、
前記発現ベクターで前記宿主細胞を形質転換すること、並びに
組換え標的タンパク質を宿主細胞から回収及び単離することを含む。
【０００９】
したがって、本発明はまた、上述の発現系を用いることによって製造される組換えタンパク質を提供する。それによって、結果として、組換えタンパク質の免疫原性が高まる。
【００１０】
本発明はまた、上記の組換えタンパク質を含むワクチンを提供し得る。
【００１１】
本発明はまた、キメラタンパク質であって、
ａ．キメラタンパク質のＮ末端に、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）又はＨＩＶ Ｔａｔ ＰＴＤ活性を有するその断片を含有する第１のポリペプチジル断片と、
ｂ．第１のポリペプチジル断片のＣ末端に、Ｊドメイン又は熱ショックタンパク質７０（Ｈｓｐ７０）非相互作用活性を有するその断片を含有する第２のポリペプチジル断片と、
ｃ．第２のポリペプチジル断片のＣ末端に、標的タンパク質又はポリペプチドを含有する第３のポリペプチジル断片とを含む、キメラタンパク質を提供する。
【００１２】
本発明はまた、キメラ遺伝子であって、
ａ．タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）又はＨＩＶ Ｔａｔ ＰＴＤ活性を有するその断片をコードする第１のＤＮＡ配列と、
ｂ．Ｊドメイン又は熱ショックタンパク質７０（Ｈｓｐ７０）非相互作用活性を有するその断片をコードする、第１のＤＮＡ配列と翻訳フレームで連結した第２のＤＮＡ配列と、
ｃ．標的タンパク質又はポリペプチドをコードする、第２のＤＮＡ配列と翻訳フレームで連結した第３のＤＮＡ配列とを含む、キメラ遺伝子を提供する。
【００１３】
本発明は、さらに別のキメラ遺伝子であって、
ａ．タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）又はＨＩＶ Ｔａｔ ＰＴＤ活性を有するその断片をコードする第１のＤＮＡ配列と、
ｂ．Ｊドメイン又は熱ショックタンパク質７０（Ｈｓｐ７０）非相互作用活性を有するその断片をコードする、第１のＤＮＡ配列と翻訳フレームで連結した第２のＤＮＡ配列とを含む、さらに別のキメラ遺伝子を提供する。
【００１４】
本発明のさらなる目的及び利点は一部、続く記載で示され、その記載から一部明らかになるか、又は本発明の実施によって理解され得る。本発明の目的及び利点は、添付の特許請求の範囲で特に指摘した要素及び組合せによって実現及び達成される。
【００１５】
上述の概要と以下の詳細な説明との両方は例示的で且つ説明のためのものであるにすぎず、本発明を特許請求されるように制限するものではないことが理解される。
【００１６】
本発明を説明する目的で、図面において本発明の好ましい実施形態を示す。しかしながら、本発明は、図示される実施形態に限定されないことを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＩＰＴＧの存在下で増殖させた、ｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩ構築物を含有する大腸菌ロゼッタ株（Rosetta）の全細胞溶解物のクマシー（登録商標）ブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。第１のレーン、標準分子量マーカー（分子量１５ｋＤａ及び２０ｋＤａに対応するバンドが示される）。第２のレーン（０）、誘導されていないｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩ、第３のレーン（１）、１時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩ、第４のレーン（２）、２時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩ、第５のレーン（３）、３時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩ、第６のレーン（４）、４時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩ、第７のレーン（５）、５時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩ、第８のレーン（６）、６時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩ、及び第９のレーン（１６）、１６時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩ。
【図２】ＩＰＴＧの存在下で増殖させた、ｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩ構築物を含有する大腸菌ロゼッタ株の全細胞溶解物のクマシー（登録商標）ブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。第１のレーン、標準分子量マーカー（分子量１５ｋＤａ及び２０ｋＤａに対応するバンドが示される）。第２のレーン（０）、誘導されていないｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩ、第３のレーン（１）、１時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩ、第４のレーン（２）、２時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩ、第５のレーン（３）、３時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩ、第６のレーン（４）、４時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩ、第７のレーン（５）、５時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩ、第８のレーン（６）、６時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩ、及び第９のレーン（１６）、１６時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩ。
【図３】ＩＰＴＧの存在下で増殖させた、ｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩＩ構築物を含有する大腸菌ロゼッタ株の全細胞溶解物のクマシー（登録商標）ブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。第１のレーン、標準分子量マーカー（分子量１５ｋＤａ及び２０ｋＤａに対応するバンドが示される）。第２のレーン（０）、誘導されていないｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩＩ、第３のレーン（１）、１時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩＩ、第４のレーン（２）、２時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩＩ、第５のレーン（３）、３時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩＩ、第６のレーン（４）、４時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩＩ、第７のレーン（５）、５時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩＩ、第８のレーン（６）、６時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩＩ、及び第９のレーン（１６）、１６時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩＩ。
【図４】ＩＰＴＧの存在下で増殖させた、ｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ニワトリＩＧＦ−Ｉ構築物を含有する大腸菌ロゼッタ株の全細胞溶解物のクマシー（登録商標）ブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。第１のレーン、標準分子量マーカー（分子量１５ｋＤａ及び２０ｋＤａに対応するバンドが示される）。第２のレーン（０）、誘導されていないｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ニワトリＩＧＦ−Ｉ、第３のレーン（１）、１時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ニワトリＩＧＦ−Ｉ、第４のレーン（２）、２時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ニワトリＩＧＦ−Ｉ、第５のレーン（３）、３時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ニワトリＩＧＦ−Ｉ、第６のレーン（４）、４時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ニワトリＩＧＦ−Ｉ、第７のレーン（５）、５時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ニワトリＩＧＦ−Ｉ、及び第８のレーン（６）、６時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ニワトリＩＧＦ−Ｉ。
【図５】ＩＰＴＧの存在下で増殖させた、ｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＡ ＲＢＤ構築物を含有する大腸菌ロゼッタ株の全細胞溶解物のクマシー（登録商標）ブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。第１のレーン、標準分子量マーカー（分子量２５ｋＤａ及び３７ｋＤａに対応するバンドが示される）。第２のレーン（０）、誘導されていないｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＡ ＲＢＤ、第３のレーン（１）、１時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＡ ＲＢＤ、第４のレーン（２）、２時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩＩ、第５のレーン（３）、３時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＡ ＲＢＤ、第６のレーン（４）、４時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＡ ＲＢＤ、第７のレーン（５）、５時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＡ ＲＢＤ、第８のレーン（６）、６時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＡ ＲＢＤ、第９のレーン（７）、７時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＡ ＲＢＤ、及び第１０のレーン（Ｏ／Ｎ）、１６時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＡ ＲＢＤ。
【図６】ＩＰＴＧの存在下で増殖させた、ｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＣＶコア構築物を含有する大腸菌ロゼッタ株の全細胞溶解物のクマシー（登録商標）ブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。第１のレーン、標準分子量マーカー（分子量２５ｋＤａ及び３７ｋＤａに対応するバンドが示される）。第２のレーン（０）、誘導されていないｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＣＶコア、第３のレーン（１）、１時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＣＶコア、第４のレーン（２）、２時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＣＶコア、第５のレーン（３）、３時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＣＶコア、第６のレーン（５）、５時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＣＶコア、第７のレーン（６）、６時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＣＶコア、及び第８のレーン（１６）、１６時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨＣＶコア。
【図７】ＩＰＴＧの存在下で増殖させた、ｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨｐＮＣ構築物を含有する大腸菌ロゼッタ株の全細胞溶解物のクマシー（登録商標）ブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。第１のレーン、標準分子量マーカー（分子量１５ｋＤａ及び２０ｋＤａに対応するバンドが示される）。第２のレーン（０）、誘導されていないｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨｐＮＣ、第３のレーン（１）、１時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨｐＮＣ、第４のレーン（２）、２時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨｐＮＣ、第５のレーン（３）、３時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨｐＮＣ、第６のレーン（４）、４時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨｐＮＣ、第７のレーン（５）、５時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨｐＮＣ、及び第８のレーン（６）、６時間後の誘導されたｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨｐＮＣ。
【図８】血清中、異なる濃度の組換えタンパク質、ＰＴＤ−Ｊ１−好中球ペプチド−１（ＮＰ−１）、ＰＴＤ−Ｊ１−コア及びＰＴＤ−Ｊ１を検出するためのドットブロット図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
概して本発明は、収率及び免疫原性を高めた、宿主細胞に導入して、組換え標的タンパク質を安定して且つ効率的に製造する発現系に関する。
【００１９】
本明細書中で使用する場合、「組換えタンパク質」という用語は、組換え分子、及び通常組換え方法、化学的方法又は他の好適な方法によって、タンパク質形質導入ドメイン及びＪドメインと共有結合（即ち融合）したタンパク質又はペプチド配列を意味する。必要に応じて、組換え分子は、ペプチドリンカー配列を介して１つ又は幾つかの部位で融合することができる。このペプチド配列は、宿主細胞誘発プロテアーゼによる切断のための部位を１つ又は複数含み得る。
【００２０】
「ポリペプチド」は、好ましくはその大きさにかかわらず、本質的に２０個の天然アミノ酸のいずれかから成る任意のポリマーを指す。「タンパク質」という用語は、比較的大きいタンパク質に対して用いられることが多いが、「ペプチド」は小ポリペプチドに対して用いられることが多く、この分野ではこれらの用語は重複して用いられることが多い。特に言及されない限り、「ポリペプチド」という用語は一般的にタンパク質、ポリペプチド及びペプチドを指す。
【００２１】
本発明によれば、「免疫原性」という用語は、組換えタンパク質、例えば組換え抗原性タンパク質が免疫反応を引き起こす能力を指す。
【００２２】
本発明によれば、宿主細胞における組換え標的タンパク質の発現系であって、本質的に配列番号１のタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）をコードするヌクレオチド配列と、Ｈｓｐ４０−Ｊドメインをコードするヌクレオチド配列と、標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列とから成る核酸セグメントを含み、核酸セグメントが宿主細胞において、異種タンパク質を発現するために、宿主特異的な転写調節要素と翻訳調節要素とに操作可能に連結する、発現系が提供される。例として、ＰＴＤをコードするヌクレオチド配列は、配列番号２のヌクレオチド配列を含む。また、配列番号２のヌクレオチド配列は、配列番号５及び配列番号６のオリゴヌクレオチドを使用することによって合成され得る。配列番号５及び配列番号６のオリゴヌクレオチドは、その５’末端でリン酸化し得る。それからまた、オリゴヌクレオチドは、ベクターに挿入されると、ホスファターゼによって脱リン酸化され得る。別の例によれば、ＨＳＰ４０Ｊドメインは、亜型Ａ、亜型Ｂ及び亜型ＣのＨＳＰ４０Ｊドメインから成る群から選択され得る。例えば、亜型Ａ、亜型Ｂ及び亜型ＣのＨＳＰ４０Ｊドメインは、ヒトゲノムにおける４１個のＤｎａＪ／ＨＳＰ４０タンパク質中に含有されるＪドメイン又はＪ様ドメインであり得る（Qiu et al., Cell. Mol. Life Sci. 63: 2560-2570 （2006））。本発明の一具体例によれば、ＨＳＰ４０Ｊドメインは、配列番号４のヌクレオチド配列によってコードされた配列番号３のペプチドを含む。また、配列番号４のヌクレオチド配列は、配列番号７〜配列番号１６のオリゴヌクレオチドを使用することによって合成され得る。また、標的タンパク質は、ＨＳＰペプチド、成長因子、ウイルス受容体結合ドメイン、及びウイルスコアタンパク質を含み得るが、これらに限定されない。本発明の一例において、組換えタンパク質は、免疫付与された宿主において免疫原性を示す抗原性ポリペプチドである。別の例では、本発明は上記の発現系によって製造される組換えタンパク質を含むワクチンも提供する。
【００２３】
本発明は、核酸配列、特に本発明の組換えタンパク質をコードするＤＮＡ配列を提供し得る。別の例では、ＤＮＡ配列は、ファージ、ウイルス、プラスミド、ファージミド、コスミド、ＹＡＣ又はエピソームのような染色体外の複製に適したベクターによって運ばれ得る。特に、所望の組換えタンパク質をコードするＤＮＡベクターを使用して、本明細書中に記載の調製方法を容易にすると共に、有意量の組換えタンパク質を得ることができる。ＤＮＡ配列は、適切なベクター、即ち挿入されるタンパク質コード配列の転写及び翻訳に必要な要素を含有するベクターに挿入することができる。タンパク質コード配列を発現するのに、種々の宿主ベクター系を利用してもよい。これらとしては、ウイルスを感染させた哺乳動物細胞系、ウイルスを感染させた昆虫細胞系、酵母ベクターを含有する酵母、又はバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ若しくはコスミドＤＮＡで形質転換した細菌等の微生物が挙げられる。利用される宿主ベクター系に応じて、多くの好適な転写要素及び翻訳要素の１つが使用され得る。例えばベクターは、細菌Ｔ７プロモータ等のプロモータと、転写を調節する、ｌａｃオペレータ等の誘導性オペレータとを含有し得る。
【００２４】
他のベクター及び構築物としては、染色体ＤＮＡ配列、非染色体ＤＮＡ配列及び合成ＤＮＡ配列、例えばＳＶ４０の誘導体、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、プラスミドとファージＤＮＡとの組合せに由来するベクター、プラスミドとウイルスＤＮＡとの組合せに由来するシャトルベクター、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス及び仮性狂犬病ウイルス等のウイルスＤＮＡが挙げられる。しかしながら、任意の他のベクターは、対象の宿主細胞で複製可能で且つ生存可能であれば、核酸発現構築物の調製に使用してもよい。核酸配列は、単離及び任意の所望のベクターへのクローニングのために、多くの制限エンドヌクレアーゼ部位の横に位置し得る。組換えタンパク質のその後の精製を容易にするのに添加される、ＥＥ、６ＸＨｉｓ、ＨＡ又はＭＹＣ等のタンパク質同定タグ又は精製タグも存在する。さらに、核酸発現構築物は、転写ターミネータも含有し得る。例えば、ベクターは、核酸配列の転写を終わらせるＴ７ターミネータを含有し得る。
【００２５】
本発明の一具体例によれば、組換えタンパク質は、配列番号２のヌクレオチド配列と、Ｈｓｐ４０−Ｊドメインをコードするヌクレオチド配列と、標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む発現ベクターを使用することによって製造され得る。別の例では、発現ベクターは、配列番号２のヌクレオチド配列と、配列番号４のヌクレオチド配列と、標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、発現ベクターにおいてヌクレオチド配列と操作可能に連結する、宿主特異的な転写調節要素及び翻訳調節要素とを含み得る。
【００２６】
本発明の組換え分子を運ぶベクターは、標的細胞又はかかる細胞群に効果的に形質導入され得る。必要に応じて、様々な戦略の１つ又は組合せによって、形質導入の効率をモニタリング及び定量化してもよい。
【００２７】
例えば、１つのアプローチは、細胞による組換えタンパク質の取り込みを測定するｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを伴う。アッセイには、例えば、放射性原子、蛍光タグ、リン光タグ又は発光タグ（例えばフルオレセイン、ローダミン、Ｃｙ３）による組換えタンパク質の検出可能な標識化と、その後の標識組換えタンパク質の取り込みの測定とが含まれる。代替的に、組換えタンパク質は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ又はルシフェラーゼのような、検出可能なラベルを形成可能な酵素によって標識することができる。蛍光顕微鏡検査法又はオートラジオグラフィによる標準的な細胞分別器（例えばＦＡＣＳ）での標識細胞の定量化のような幾つかの従来方法によって、取り込みを測定することができる。
【００２８】
概して上記で言及したように、宿主細胞は、所望の組換えタンパク質をコードする核酸を増殖するために調製目的で使用してもよい。このため、宿主細胞は、哺乳動物細胞のようなより高等な真核細胞であっても、若しくは酵母細胞のようなより低級の（lower）真核細胞であってもよく、又は宿主細胞は、細菌細胞のような原核細胞であってもよい。本発明による適切な宿主細胞の代表例としては、大腸菌、ストレプトミセス（Streptomyces）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）のような細菌細胞；酵母のような真菌細胞；ショウジョウバエＳ２及びスポドプテラ（Spodoptera）Ｓｆ９のような昆虫細胞；ＭＤＣＫ、Ｈｅｐ−２、ＣＨＯ又はＣＯＳのような動物細胞；ジャーカット細胞又は２９３細胞のようなヒト細胞；アデノウイルス；植物細胞、又は既にｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖に適応した、若しくはこのようにして新たに樹立した任意の他の細胞が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。適切な宿主細胞の選択は、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると見なされる。
【００２９】
さらに、所望の組換えタンパク質をコードする核酸は、細胞をトランスフェクトするのに標準的な技法によって、宿主細胞に導入することができる。「トランスフェクト（transfecting）」又は「トランスフェクション（transfection）」は、核酸を宿主細胞に導入するための全ての従来技法を包含するように意図され、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、電気穿孔（electroporation）、顕微注入（microinjection）、ウイルス形質導入及び／又は融合（integration）が挙げられる。
【００３０】
本発明は、対象の組換えタンパク質を単離する製造プロセスをさらに提供し得る。このプロセスでは、宿主細胞（例えば、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、細菌細胞又は動物細胞）（これに、調節配列と操作可能に連結した（liked）、対象のタンパク質をコードする核酸が導入されている）は、対象の組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列の転写を刺激するために、組換えタンパク質の存在下の培養培地中において生産規模で増殖し得る。その後、対象の組換えタンパク質は、採取された宿主細胞又は培養培地から単離され得る。培地又は採取された細胞から対象のタンパク質を単離するのに、標準的なタンパク質精製技法を使用してもよい。特に、精製技法を用いて、ローラーボトル、スピナーフラスコ、組織培養プレート、バイオリアクタ又は発酵槽を含む種々の装置（implementations）から大規模で（即ち少なくともミリグラム量で）所望の融合タンパク質を発現及び精製することができる。
【００３１】
本発明の組換えタンパク質は、適切な組合せの既知の技法によって分離及び精製し得る。例えばこれらの方法としては、塩析及び溶媒析出のような溶解度を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過、及びＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動のような分子量の違いを利用する方法、イオン交換カラムクロマトグラフィのような電荷の違いを利用する方法、親和性クロマトグラフィのような特異親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィのような疎水性の違いを利用する方法、並びに等電点電気泳動のような等電点の違いを利用する方法、Ｎｉ−ＮＴＡのような金属親和性カラムが挙げられる。
【００３２】
したがって、別の例によれば、本発明は、宿主細胞において収率及び免疫原性を高めて組換え標的タンパク質を製造する方法を提供し得る。本方法は、
本質的に配列番号１のタンパク質形質導入ドメインをコードするヌクレオチド配列と、Ｈｓｐ４０−Ｊドメインをコードするヌクレオチド配列と、標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列とから成る核酸セグメントを含む発現ベクターを構築すること（核酸セグメントが宿主細胞特異的な転写調節要素と翻訳調節要素とに操作可能に連結される）、
前記発現ベクターで前記宿主細胞を形質転換すること、並びに
組換え標的タンパク質を宿主細胞から回収及び単離することを含む。
【００３３】
別の一例によれば、本方法は、生物を組換えタンパク質により免疫付与する工程をさらに含む。組換えタンパク質の抗原性は、試験膜上でブロットした組換えタンパク質のエピトープ（単数又は複数）と結合する標識抗体を使用して求められ得る。また、組換えタンパク質の免疫原性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで抗原提示アッセイにおいて、並びにｉｎ ｖｉｖｏで抗体応答及び抗原性ポリペプチドによる皮下攻撃（challenge）に対する防御の誘導において他のポリペプチドと比較することができる。
【００３４】
また本発明は、
ａ．キメラタンパク質のＮ末端に、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）又はＨＩＶ Ｔａｔ ＰＴＤ活性を有するその断片を含有する第１のポリペプチジル断片と、
ｂ．第１のポリペプチジル断片のＣ末端に、Ｊドメイン又は熱ショックタンパク質７０（Ｈｓｐ７０）非相互作用活性を有するその断片を含有する第２のポリペプチジル断片と、
ｃ．第２のポリペプチジル断片のＣ末端に、標的タンパク質又はポリペプチドを含有する第３のポリペプチジル断片とを含む、キメラタンパク質を提供する。
【００３５】
また本発明は、
ａ．タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）又はＨＩＶ Ｔａｔ ＰＴＤ活性を有するその断片をコードする第１のＤＮＡ配列と、
ｂ．Ｊドメイン又は熱ショックタンパク質７０（Ｈｓｐ７０）非相互作用活性を有するその断片をコードする、第１のＤＮＡ配列と翻訳フレームで連結した第２のＤＮＡ配列と、
ｃ．標的タンパク質又はポリペプチドをコードする、第２のＤＮＡ配列と翻訳フレームで連結した第３のＤＮＡ配列とを含む、キメラ遺伝子を提供する。
【００３６】
本発明は、
ａ．タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）又はＨＩＶ Ｔａｔ ＰＴＤ活性を有するその断片をコードする第１のＤＮＡ配列と、
ｂ．Ｊドメイン又は熱ショックタンパク質７０（Ｈｓｐ７０）非相互作用活性を有するその断片をコードする、第１のＤＮＡ配列と翻訳フレームで連結した第２のＤＮＡ配列とを含む、さらに別のキメラ遺伝子を提供する。
【００３７】
本発明によれば、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）をコードする第１のＤＮＡ配列は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、Ｊドメインをコードする第２のＤＮＡ配列は、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む。好ましくは、Ｊドメインはヒト熱ショックタンパク質４０由来である。
【００３８】
抗原性ポリペプチドは、ＨＳＰペプチド、成長因子、ウイルス受容体結合ドメイン、ウイルスコアタンパク質又はそれらの組合せを含み得るが、必ずしもこれらに限定されない。例えば、宿主に対して免疫反応を誘起可能な他のタンパク質又はポリペプチドも、本発明に包含され得る。
【００３９】
これより、本発明は、以下の具体的であるが、非限定的な実施例を参照してさらに詳細に説明される。
【実施例】
【００４０】
実施例１：ｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ１−Ｊ１−Ａｇ発現ベクターの構築
ｐＥＴ２２ｂプラスミド（Novagen, Madison, Wis.）を用いて、配列番号１のタンパク質形質導入ドメインをコードするヌクレオチド配列と、配列番号３のＨｓｐ４０−Ｊドメインをコードするヌクレオチド配列と、標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含むｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ１ベクターを作製した。ここで、核酸セグメントは、宿主細胞において組換え標的タンパク質を発現するために、宿主特異的な転写調節要素と翻訳調節要素とに操作可能に連結している。大腸菌に対するＰＴＤの最適化コドンをコードするオリゴヌクレオチドは、以下の表Ｉに列挙される配列番号５及び配列番号６のプライマーを使用して化学合成した。ＮｄｅＩとＢａｍＨＩとで同時に消化したｐＥＴ２２ｂプラスミドに挿入するために、二本鎖形態にアニーリングする前、これらの２つのオリゴヌクレオチドの５’末端をポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ）で脱リン酸化して、ｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ１を作製した。
【００４１】
【表１】
【００４２】
ＨＳＰ４０遺伝子のＪドメインは、表ＩＩに示される配列番号７〜配列番号１６のオリゴヌクレオチドを使用したアセンブリＰＣＲによって合成した。これらのオリゴヌクレオチドを、大腸菌に対する最適化コドンを増幅するために設計した。単一コロニーの選択及びＤＮＡシークエンシングのために、ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクター（Promega）にクローン化した。正確なＪドメインコードＤＮＡ配列を有するプラスミドをＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩとで同時に消化し、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクターから０．２ｋｂの挿入ＤＮＡ断片を取り除いた。それから、このＤＮＡ断片を、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩとＣＩＡＰとで処理したｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ１ベクターに挿入し、ｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ１−Ｊ１発現ベクターを作製した。
【００４３】
【表２】
【００４４】
ｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ１−Ｊ１ベクターによって発現される、１つ又は複数の組換えポリペプチド又は抗原性（Ａｇ）ポリペプチドは通常、大腸菌の最適化コドンを有するＤＮＡに形質転換した。１つ又は複数の組換えポリペプチドコード領域もＰＣＲで増幅した。以下の実施例におけるこれらのポリペプチドコードＤＮＡは、都合よくｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ１−Ｊ１ベクターに挿入されるように、ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ部位の横に位置していた。結果として、ｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ１−Ｊ１−Ａｇ発現ベクターが構築された。
【００４５】
アセンブリＰＣＲ
オリゴヌクレオチドセットを用いて、コドンが最適化されたｃＤＮＡを合成した。０．５μＭのＦ１及びＲ１と、０．０５μＭのＦ２、Ｆ３、Ｒ３、Ｒ２等を、ＰＣＲ反応混合液中で調整した。反応条件は、９４℃で２分、その後９４℃で２０秒／４０℃で４０秒／７２℃で２０秒を２０サイクル、及び７２℃で５分の伸長であった。プラスミドＤＮＡ単離及びＤＮＡシークエンシングのために、ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙにクローン化した。
【００４６】
実施例２：ＰＴＤ−Ｊ−Ａｇ組換えタンパク質の発現
ｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−Ａｇベクターを大腸菌ロゼッタ株（Novagen）のコンピテントセルに形質転換した。１ｍＭのＩＰＴＧを導入する前にＯＤ６００＝０．３になるまで、アンピシリンとクロラムフェニコールとに耐性がある大腸菌コロニーをＴＹＤ培地（１Ｌ当たり１０ｇ トリプトン／２０ｇ 酵母エキス／５ｇ ＮａＣｌ／２ｇ デキストロース、ｐＨ７．２）中で、培養及び増幅させた。細胞試料を列挙する時間割で回収した。
【００４７】
０．３ＯＤ６００単位での大腸菌の総タンパク試料を、３０μＬの２×ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファー中に溶解した。５分間、水浴を沸騰させることによって処理した後、これらのタンパク質試料を、１２．５％又は１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でクマシーブリリアントブルーＲ２５０染色を実施することによって、タンパク質のバンドを可視化した。
【００４８】
実施例３：免疫付与
マウスを、ＴｉｔｅｒＭＡＸ Ｇｏｌｄアジュバントで乳化したポリペプチド５０μｇにより皮下で免疫付与した。２週間ごとに追加免疫（Boosts）を実施した。マウスの血清を回収し、ポリペプチドに対する抗体を産生させた。
【００４９】
ドットブロット法
段階希釈した組換えタンパク質又は合成ポリペプチドをＰＶＤＦ膜上にスポットした（spotted）。５％脱脂乳のＴＢＳＮ（２５ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．４／１５０ｍＭのＮａＣｌ／０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０）で１時間、膜をブロッキングした。ＴＢＳＮで４回洗浄した後、一晩インキュベートするために１０００倍に希釈したマウス抗血清中に膜を浸した。ＴＢＳＮで４回洗浄することによって、結合されていない一次抗体（Ａｂ）を取り除いた後、ＨＲＰ結合ヤギ抗マウス二次Ａｂ（２０００倍希釈）を４時間適用した。製造業者の取扱説明書に記載されるように、化学発光キット（Pierce）によって、洗浄膜上でタンパク質の標識を実施した。
【００５０】
実施例４：ヒトＨＳＰＡ１ＡペプチドＩの発現
アセンブリＰＣＲで使用するオリゴヌクレオチドを表ＩＩＩに列挙した。これらのオリゴヌクレオチドを用いて、配列番号１８（ＳＳＳＴＱＡＳＬＥＩ ＤＳＬＦＥＧＩＤＦＹ ＴＳＩＴＲＡＲＦＥＥ ＬＣＳＤＬＦＲＳＴＬ ＥＰＶＥＫＡＬＲＤＡ ＫＬＤＫＡＱＩ）のＨＡＰＡ１ＡペプチドＩをコードする配列番号１７のコドンが最適化されたｃＤＮＡを合成した。コドンが最適化されたｃＤＮＡ配列を、実施例１に従って構築した発現ベクターｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊに挿入した。
【００５１】
【表３】
【００５２】
実施例２に記載のように、組換えＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩをコードした核酸セグメントを有する発現ベクターを大腸菌に導入した。また、組換えＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩ発現を定量化し、総タンパク質に対する組換えＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩの重量パーセントで表した。図１を参照すると、組換えＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩの重量パーセントは、最初の６時間で６５％〜９２％の範囲である。また、１６時間後の組換えＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩの重量パーセントは７７％であった。
【００５３】
実施例５：ヒトＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩの発現
アセンブリＰＣＲで使用するオリゴヌクレオチドを表ＩＶに列挙した。これらのオリゴヌクレオチドを用いて、配列番号２６（ＮＶＴＡＴＤＫＳＴＧ ＫＡＮＫＩＴＩＴＮＤ ＫＧＲＬＳＫＥＥＩＥ ＲＭＶＱＥＡＥＫＹＫ ＡＥＤＥＶＱＲＥＲＶ ＳＡＫＮＡＬＥＳＹＡ Ｆ）のＨＡＰＡ１ＡペプチドＩＩをコードする配列番号２５のコドンが最適化されたｃＤＮＡを合成した。コドンが最適化されたｃＤＮＡ配列を、実施例１に従って構築した発現ベクターに挿入した。
【００５４】
【表４】
【００５５】
実施例２に記載のように、組換えＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩをコードした核酸セグメントを有する発現ベクターを大腸菌に導入した。また、組換えＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩ発現を定量化し、総タンパク質に対する組換えＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩの重量パーセントで表した。図２を参照すると、組換えＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩの重量パーセントは、最初の６時間で２７％〜５４％の範囲である。また、１６時間後の組換えＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩの重量パーセントは１０％であった。
【００５６】
実施例６：ヒトＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩＩの発現
アセンブリＰＣＲで使用するオリゴヌクレオチドを表Ｖに列挙した。これらのオリゴヌクレオチドを用いて、配列番号３５（ＥＤＥＧＬＫＧＫＩＳ ＥＡＤＫＫＫＶＬＤＫ ＣＱＥＶＩＳＷＬＤＡ ＮＴＬＡＥＫＤＥＦＥ ＨＫＲＫＥＬＥＱＶＣ ＮＰＩＩＳＧＬＹＱＧ Ａ）のＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩＩをコードする配列番号３４のコドンが最適化されたｃＤＮＡを合成した。コドンが最適化されたｃＤＮＡ配列を、実施例１に従って構築した発現ベクターに挿入した。
【００５７】
【表５】
【００５８】
実施例２に記載のように、組換えＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩＩをコードした核酸セグメントを有する発現ベクターを大腸菌に導入した。また、組換えＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩＩ発現を定量化し、総タンパク質に対する組換えＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩＩの重量パーセントで表した。図３を参照すると、組換えＰＴＤ−Ｊ−ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩＩの重量パーセントは、最初の５時間で１０％〜３３％の範囲である。
【００５９】
実施例７：ニワトリＩＧＦ−Ｉの発現
アセンブリＰＣＲで使用するオリゴヌクレオチドを表ＶＩに列挙した。これらのオリゴヌクレオチドを用いて、配列番号４４（ＧＰＥＴＬＣＧＡＥＬ ＶＤＡＬＱＦＶＣＧＤ ＲＧＦＹＦＳＫＰＴＧ ＹＧＳＳＳＡＡＬＨＨ ＫＧＩＶＤＥＣＣＦＱ ＳＣＤＬＲＲＬＥＭＹ ＣＡＰＩＫＰＰＫＳＡ）のニワトリＩＧＦ−Ｉをコードする配列番号４３のコドンが最適化されたｃＤＮＡを合成した。コドンが最適化されたｃＤＮＡ配列を、実施例１に従って構築した発現ベクターに挿入した。
【００６０】
【表６】
【００６１】
実施例２に記載のように、組換えＰＴＤ−Ｊ−ニワトリＩＧＦ−Ｉをコードした核酸セグメントを有する発現ベクターを大腸菌に導入した。また、組換えＰＴＤ−Ｊ−ニワトリＩＧＦ−Ｉ発現を定量化し、総タンパク質に対する組換えＰＴＤ−Ｊ−ニワトリＩＧＦ−Ｉの重量パーセントで表した。図４を参照すると、組換えＰＴＤ−Ｊ−ニワトリＩＧＦ−Ｉの重量パーセントは、最初の６時間で７４％〜９０％の範囲である。
【００６２】
実施例８：トリインフルエンザウイルスＨＡ（Ｈ５）受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）の発現
ＰＣＲに使用するプライマー対を表ＶＩＩに列挙した。これらのプライマーを用いて、配列番号５３のＨＡ−ＲＢＤをコードする配列番号５２の天然ウイルスｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡ配列を、実施例１に従って構築した発現ベクターに挿入した。
【００６３】
【表７】
【００６４】
実施例２に記載のように、組換えＰＴＤ−Ｊ−ＨＡ ＲＢＤをコードした核酸セグメントを有する発現ベクターを大腸菌に導入した。また、組換えＰＴＤ−Ｊ−ＨＡ ＲＢＤ発現を定量化し、総タンパク質に対する組換えＰＴＤ−Ｊ−ＨＡ ＲＢＤの重量パーセントで表した。図５を参照すると、組換えＰＴＤ−Ｊ−ＨＡ ＲＢＤの重量パーセントは、最初の７時間で１２％〜３８％の範囲である。また、１６時間後の組換えＰＴＤ−Ｊ−ＨＡ ＲＢＤの重量パーセントは３２％であった。
【００６５】
実施例９：Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）コアタンパク質の発現
ＰＣＲに使用するプライマー対を表ＶＩＩＩに列挙した。これらのプライマーを用いて、配列番号５７のＨＣＶコアタンパク質をコードする配列番号５６の天然ウイルスｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡ配列を、実施例１に従って構築した発現ベクターに挿入した。
【００６６】
【表８】
【００６７】
実施例２に記載のように、組換えＰＴＤ−Ｊ−ＨＣＶコアタンパク質をコードした核酸セグメントを有する発現ベクターを大腸菌に導入した。また、組換えＰＴＤ−Ｊ−ＨＣＶコアタンパク質発現を定量化し、総タンパク質に対する組換えＰＴＤ−Ｊ−ＨＣＶコアタンパク質の重量パーセントで表した。図５を参照すると、組換えＰＴＤ−Ｊ−ＨＣＶコアタンパク質の重量パーセントは、最初の６時間で１１％〜３９％の範囲である。
【００６８】
実施例１０：ＨｐＮＣ免疫原性の増大
ＰＣＲに使用するプライマー組を表ＩＸに列挙した。これらのプライマーを用いて、配列番号６１のＨｐＮＣタンパク質をコードする配列番号６０のヒトハプトグロビン融合ペプチドＨｐＮＣをコードするコドンが最適化されたｃＤＮＡ配列を合成した。ヒトハプトグロビンα鎖の融合ペプチドＨｐＮＣは、ハプトグロビンの成熟分泌されたα１及びα２ペプチドに存在するＮ末端のＤＳＧＮＤＶＴＤＩＡＤＤＧペプチドと、リンカーＧＳＧＧのテトラペプチドと、未熟ハプトグロビンα鎖にしか存在しないＣ末端のＲＨＹＥＧＳＴＶＰＥＫＫＴＰＫＳペプチドとから成っていた。コドンが最適化されたｃＤＮＡ配列を、実施例１に従って構築した発現ベクターｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊに挿入した。
【００６９】
【表９】
【００７０】
実施例２に記載のように、組換えｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＨｐＮＣをコードした核酸セグメントを有する発現ベクターを大腸菌に導入した。また、組換えＰＴＤ−Ｊ−ＨｐＮＣタンパク質発現を定量化し、総タンパク質に対する組換えＰＴＤ−Ｊ−ＨｐＮＣタンパク質の重量パーセントで表した。図７を参照すると、組換えＰＴＤ−Ｊ−ＨｐＮＣタンパク質の重量パーセントは、最初の６時間で２６％〜３３％の範囲である。
【００７１】
上記の実施例の結果から、最適化コドンを有するｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ発現ベクターを使用することによって製造された組換えタンパク質の重量パーセントは、総タンパク質に対しておよそ９０％であることが明らかになった。他方で、天然ｃＤＮＡを使用した場合、総タンパク質中の組換えタンパク質の重量パーセントはおよそ４０％になり得る。したがって、本発明の発現ベクターによって、収率が高まり、組換えタンパク質が製造される。
【００７２】
実施例１１：ウサギ好中球ペプチド−１（ＮＰ−１）の免疫原性の増大
ＮＰ−１（配列番号６７）をコードするコドンが最適化されたｃＤＮＡ配列を合成し、実施例１に記載の方法に従って構築した発現ベクターｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊに挿入した。実施例２に記載のように、組換えｐＥＴ２２ｂ−ＰＴＤ−Ｊ−ＮＰ−１をコードした核酸セグメントを有する発現ベクターを大腸菌に導入した。また、組換えＮＰ−１（配列番号６８）を大腸菌から回収及び単離した。
【００７３】
実施例３に従って、組換えＮＰ−１を皮下注射することによって、マウスを免疫付与し、組換えＮＰ−１に対する抗体を産生させた。それから、マウスから血清を回収した。実施例３に記載のドットブロットアッセイを用いて、ＮＰ−１の抗原性を求めた。
【００７４】
組換えＮＰ−１を抗原に用いると、力価が高い血清が産生された。血清は、３２０ｐｇの抗原を検出することができるが、ＰＴＤ１−Ｊ１−コア組換えタンパク質と交差反応せず、このことは図８に示すように、血清が厳密にＮＰ−１領域に強く且つ特異的に対応していたことを示している。
【００７５】
当業者は、広範な本発明の概念を逸脱しなければ、上記の実施形態を変更することができることが認められる。したがって、本発明は、開示された特定の実施形態に限定されず、添付の特許請求の範囲によって規定されるような本発明の精神及び範囲内の変更形態を含むように意図されることが理解される。
【配列表フリーテキスト】
【００７６】
配列番号１：ヒト免疫不全ウイルスＴａｔ ＰＴＤ１
配列番号２：ヒト免疫不全ウイルスＴａｔ ＰＴＤ１
配列番号３：ＨＳＰ４０Ｊドメイン（Ｊ１）
配列番号４：ＨＳＰ４０Ｊドメイン（Ｊ１）−コード配列
配列番号５：ＰＴＤ１の合成の為のフォワードプライマーＰＴＤ１ ｆ
配列番号６：ＰＴＤ１の合成の為のフォワードプライマーＰＴＤ１ ｒ
配列番号７：ＨＳＰ４０Ｊドメインの合成の為のフォワードプライマーＪ１ ｎＢＦ１
配列番号８：ＨＳＰ４０Ｊドメインの合成の為のフォワードプライマーｎＦ２
配列番号９：ＨＳＰ４０Ｊドメインの合成の為のフォワードプライマーＦ３
配列番号１０：ＨＳＰ４０Ｊドメインの合成の為のフォワードプライマーＦ４
配列番号１１：ＨＳＰ４０Ｊドメインの合成の為のフォワードプライマーＦ５
配列番号１２：ＨＳＰ４０Ｊドメインの合成の為のフォワードプライマーＦ６
配列番号１３：ＨＳＰ４０Ｊドメインの合成の為のリバースプライマーＥｃｏＲ１ Ｒ１
配列番号１４：ＨＳＰ４０Ｊドメインの合成の為のリバースプライマーＲ２
配列番号１５：ＨＳＰ４０Ｊドメインの合成の為のリバースプライマーＲ３
配列番号１６：ＨＳＰ４０Ｊドメインの合成の為のリバースプライマーＲ４
配列番号１７：ヒトＨＳＰＡ１Ａペプチド Ｉ−コード配列
配列番号１８：ヒトＨＳＰＡ１Ａペプチド
配列番号１９：ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩの合成の為のフォワードプライマーＲＩ−Ｉ−ｆ１
配列番号２０：ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩの合成の為のフォワードプライマーＩ−ｆ２
配列番号２１：ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩの合成の為のフォワードプライマーＩ−ｆ３
配列番号２２：ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩの合成の為のリバースプライマーＩ−ｒ３
配列番号２３：ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩの合成の為のリバースプライマーＩ−ｒ２
配列番号２４：ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩの合成の為のリバースプライマーＸｈｏ−Ｉ−ｒ１
配列番号２５：ヒトＨＳＰＡ１Ａペプチド ＩＩ−コード配列
配列番号２６：ヒトＨＳＰＡ１Ａペプチド ＩＩ
配列番号２７：ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩの合成の為のフォワードプライマーＲＩ−ＩＩ−ｆ１
配列番号２８：ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩの合成の為のフォワードプライマーＩＩ−ｆ２
配列番号２９：ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩの合成の為のフォワードプライマーＩＩ−ｆ３
配列番号３０：ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩの合成の為のフォワードプライマーＩＩ−ｆ４
配列番号３１：ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩの合成の為のリバースプライマーＩＩ−ｒ３
配列番号３２：ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩの合成の為のリバースプライマーＩＩ−ｒ２
配列番号３３：ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩの合成の為のリバースプライマーＸｈｏ−ＩＩ−ｒ１
配列番号３４：ヒトＨＳＰＡ１Ａペプチド ＩＩＩ−コード配列
配列番号３５：ヒトＨＳＰＡ１Ａペプチド ＩＩＩ
配列番号３６：ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩＩの合成の為のフォワードプライマーＲＩ−ＩＩＩ−ｆ１
配列番号３７：ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩＩの合成の為のフォワードプライマーＩＩＩ−ｆ２
配列番号３８：ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩＩの合成の為のフォワードプライマーＩＩＩ−ｆ３
配列番号３９：ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩＩの合成の為のフォワードプライマーＩＩＩ−ｆ４
配列番号４０：ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩＩの合成の為のリバースプライマーＩＩＩ−ｒ３
配列番号４１：ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩＩの合成の為のリバースプライマーＩＩＩ−ｒ２
配列番号４２：ＨＳＰＡ１ＡペプチドＩＩＩの合成の為のリバースプライマーＩＩＩ−ｒ１
配列番号４３：ニワトリＩＧＦ−１ コード配列
配列番号４４：ニワトリＩＧＦ−１
配列番号４５：ｃＩＧＦ−Ｉの合成の為のフォワードプライマーＲＩ−Ｆ１
配列番号４６：ｃＩＧＦ−Ｉの合成の為のフォワードプライマーＦ２
配列番号４７：ｃＩＧＦ−Ｉの合成の為のフォワードプライマーＦ３
配列番号４８：ｃＩＧＦ−Ｉの合成の為のフォワードプライマーＦ４
配列番号４９：ｃＩＧＦ−Ｉの合成の為のフォワードプライマーＦ５
配列番号５０：ｃＩＧＦ−Ｉの合成の為のリバースプライマーＲ２
配列番号５１：ｃＩＧＦ−Ｉの合成の為のリバースプライマーＸｈｏ−Ｒ１
配列番号５２：トリインフルエンザＨＡ（Ｈ５）ＲＢＤ−コード配列
配列番号５３：トリインフルエンザＨＡ（Ｈ５）ＲＢＤ
配列番号５４：トリインフルエンザＨＡ ＲＢＤの合成の為のフォワードプライマーＲＩ ＨＡ−ＲＢＤ ｆ
配列番号５５：トリインフルエンザＨＡ ＲＢＤの合成の為のリバースプライマーＸｈｏ ＨＡ−ＲＢＤ ｒ
配列番号５６：Ｃ型肝炎ウイルスコアタンパク質−コード配列
配列番号５７：Ｃ型肝炎ウイルスコアタンパク質
配列番号５８：ＨＣＶ−コアタンパク質の為のフォワードプライマーＲＩ−コアｆ
配列番号５９：ＨＣＶ−コアタンパク質の為のリバースプライマーＸｈｏ−コアｒ
配列番号６０：ヒトハプトグロビン融合ポリペプチドＨｐＮＣをコードする融合遺伝子
配列番号６１：ヒトハプトグロビン融合ポリペプチドＨｐＮＣ
配列番号６２：ヒトハプトグロビン融合ポリペプチドＨｐＮＣの為のフォワードプライマーＲＩ−Ｆ１
配列番号６３：ヒトハプトグロビン融合ポリペプチドＨｐＮＣの為のフォワードプライマーＦ２
配列番号６４：ヒトハプトグロビン融合ポリペプチドＨｐＮＣの為のフォワードプライマーＦ３
配列番号６５：ヒトハプトグロビン融合ポリペプチドＨｐＮＣの為のリバースプライマーＲ２
配列番号６６：ヒトハプトグロビン融合ポリペプチドＨｐＮＣの為のリバースプライマーＸｈｏ−Ｒ１
配列番号６７：ウサギ好中球ペプチド−１（ＮＰ−１）をコードするｃＤＮＡ
配列番号６８：ウサギ好中球ペプチド−１（ＮＰ−１）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞における組換え標的タンパク質の発現系であって、本質的に配列番号１のタンパク質形質導入ドメインをコードするヌクレオチド配列と、Ｈｓｐ４０−Ｊドメインをコードするヌクレオチド配列と、標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列とから成る核酸セグメントを含み、該核酸セグメントが前記宿主細胞において、前記組換え標的タンパク質を発現するために、宿主特異的な転写調節要素と翻訳調節要素とに操作可能に連結されている、発現系。
【請求項２】
前記タンパク質形質導入ドメインをコードする前記ヌクレオチド配列が配列番号２のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の発現系。
【請求項３】
前記配列番号２のヌクレオチド配列を、配列番号５及び配列番号６のオリゴヌクレオチドを使用することによって合成する、請求項２に記載の発現系。
【請求項４】
前記ＨＳＰ４０Ｊドメインが、亜型Ａ、亜型Ｂ及び亜型ＣのＨＳＰ４０Ｊドメインから成る群から選択される、請求項１に記載の発現系。
【請求項５】
前記ＨＳＰ４０Ｊドメインが配列番号３のペプチドを含む、請求項４に記載の発現系。
【請求項６】
前記ＨＳＰ４０Ｊドメインをコードする前記ヌクレオチド配列が配列番号４のヌクレオチド配列を含む、請求項５に記載の発現系。
【請求項７】
前記配列番号４のヌクレオチド配列を、配列番号７〜配列番号１６のオリゴヌクレオチドを使用することによって合成する、請求項６に記載の発現系。
【請求項８】
前記宿主細胞が大腸菌を含む、請求項１に記載の発現系。
【請求項９】
前記標的タンパク質が、ＨＳＰペプチド、成長因子、ウイルス受容体結合ドメイン、及びウイルスコアタンパク質の少なくとも１つを含む、請求項１に記載の発現系。
【請求項１０】
請求項１に記載の発現系を用いて製造される組換えタンパク質。
【請求項１１】
請求項１０に記載の組換えタンパク質を含むワクチン。
【請求項１２】
宿主細胞において収率を高めて組換え標的タンパク質を製造する方法であって、
本質的に配列番号１のタンパク質形質導入ドメインをコードするヌクレオチド配列と、Ｈｓｐ４０−Ｊドメインをコードするヌクレオチド配列と、標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列とから成る核酸セグメントを含む発現ベクターを構築すること（該核酸セグメントが宿主細胞特異的な転写調節要素と翻訳調節要素とに操作可能に連結される）、
前記発現ベクターで前記宿主細胞を形質転換すること、並びに
前記組換え標的タンパク質を前記宿主細胞から回収及び単離することを含む、方法。
【請求項１３】
前記タンパク質形質導入ドメインをコードする前記ヌクレオチド配列が配列番号２のヌクレオチド配列を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記配列番号２のヌクレオチド配列を、配列番号５及び配列番号６のオリゴヌクレオチドを使用することによって合成する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＨＳＰ４０Ｊドメインが、亜型Ａ、亜型Ｂ及び亜型ＣのＨＳＰ４０Ｊドメインから成る群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＨＳＰ４０Ｊドメインが配列番号３のペプチドを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＨＳＰ４０Ｊドメインをコードする前記ヌクレオチド配列が配列番号４のヌクレオチド配列を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記配列番号４のヌクレオチド配列を、配列番号７〜配列番号１６のオリゴヌクレオチドを使用することによって合成する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記宿主細胞が大腸菌を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
前記標的タンパク質が、ＨＳＰペプチド、成長因子、ウイルス受容体結合ドメイン、及びウイルスコアタンパク質の少なくとも１つを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
免疫原性を高めた組換え標的タンパク質を製造する方法であって、
本質的に配列番号１のタンパク質形質導入ドメインをコードするヌクレオチド配列と、Ｈｓｐ４０−Ｊドメインをコードするヌクレオチド配列と、標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列とから成る核酸セグメントを含む発現ベクターを構築すること（該核酸セグメントが宿主特異的な転写調節要素と翻訳調節要素とに操作可能に連結される）、
前記発現ベクターで前記宿主細胞を形質転換すること、並びに
前記組換え標的タンパク質を前記宿主細胞から回収及び単離することを含む、方法。
【請求項２２】
生物を前記組換えタンパク質により免疫付与することをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記タンパク質形質導入ドメインをコードする前記ヌクレオチド配列が配列番号２のヌクレオチド配列を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記配列番号２のヌクレオチド配列を、配列番号５及び配列番号６のオリゴヌクレオチドを使用することによって合成する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＨＳＰ４０Ｊドメインが、亜型Ａ、亜型Ｂ及び亜型ＣのＨＳＰ４０Ｊドメインから成る群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＨＳＰ４０Ｊドメインが配列番号３のペプチドを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＨＳＰ４０Ｊドメインをコードする前記ヌクレオチド配列が配列番号４のヌクレオチド配列を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記配列番号４のヌクレオチド配列を、配列番号７〜配列番号１６のオリゴヌクレオチドを使用することによって合成する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記宿主細胞が大腸菌を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
前記標的タンパク質が、ＨＳＰペプチド、成長因子、ウイルス受容体結合ドメイン、及びウイルスコアタンパク質の少なくとも１つを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
キメラタンパク質であって、
ａ．前記キメラタンパク質のＮ末端に、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）又はＨＩＶ Ｔａｔ ＰＴＤ活性を有するその断片を含有する第１のポリペプチジル断片と、
ｂ．前記第１のポリペプチジル断片のＣ末端に、Ｊドメイン又は熱ショックタンパク質７０（Ｈｓｐ７０）非相互作用活性を有するその断片を含有する第２のポリペプチジル断片と、
ｃ．前記第２のポリペプチジル断片のＣ末端に、標的タンパク質又はポリペプチドを含有する第３のポリペプチジル断片とを含む、キメラタンパク質。
【請求項３２】
前記第１のポリペプチジル断片が配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む、請求項３１に記載のキメラタンパク質。
【請求項３３】
前記第２のポリペプチジル断片が配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む、請求項３１に記載のキメラタンパク質。
【請求項３４】
前記Ｊドメインがヒト熱ショックタンパク質４０由来である、請求項３１に記載のキメラタンパク質。
【請求項３５】
キメラ遺伝子であって、
ａ．タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）又はＨＩＶ Ｔａｔ ＰＴＤ活性を有するその断片をコードする第１のＤＮＡ配列と、
ｂ．Ｊドメイン又は熱ショックタンパク質７０（Ｈｓｐ７０）非相互作用活性を有するその断片をコードする、前記第１のＤＮＡ配列と翻訳フレームで連結した第２のＤＮＡ配列と、
ｃ．標的タンパク質又はポリペプチドをコードする、前記第２のＤＮＡ配列と翻訳フレームで連結した第３のＤＮＡ配列とを含む、キメラ遺伝子。
【請求項３６】
タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）をコードする前記第１のＤＮＡ配列が配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む、請求項３５に記載のキメラ遺伝子。
【請求項３７】
Ｊドメインをコードする前記第２のＤＮＡ配列が配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む、請求項３５に記載のキメラ遺伝子。
【請求項３８】
タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）をコードする前記第１のＤＮＡ配列が配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むと共に、Ｊドメインをコードする前記第２のＤＮＡ配列が配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む、請求項３５に記載のキメラ遺伝子。
【請求項３９】
前記Ｊドメインがヒト熱ショックタンパク質４０由来である、請求項３５に記載のキメラ遺伝子。
【請求項４０】
キメラ遺伝子であって、
ａ．タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）又はＨＩＶ Ｔａｔ ＰＴＤ活性を有するその断片をコードする第１のＤＮＡ配列と、
ｂ．Ｊドメイン又は熱ショックタンパク質７０（Ｈｓｐ７０）非相互作用活性を有するその断片をコードする、前記第１のＤＮＡ配列と翻訳フレームで連結した第２のＤＮＡ配列とを含む、キメラ遺伝子。
【請求項４１】
タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）をコードする前記第１のＤＮＡ配列が配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む、請求項４０に記載のキメラ遺伝子。
【請求項４２】
Ｊドメインをコードする前記第２のＤＮＡ配列が配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む、請求項４０に記載のキメラ遺伝子。
【請求項４３】
タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）をコードする前記第１のＤＮＡ配列が配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むと共に、Ｊドメインをコードする前記第２のＤＮＡ配列が配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む、請求項４０に記載のキメラ遺伝子。
【請求項４４】
前記Ｊドメインがヒト熱ショックタンパク質４０由来である、請求項４０に記載のキメラ遺伝子。
【請求項１】
宿主細胞における組換え標的タンパク質の発現系であって、本質的に配列番号１のタンパク質形質導入ドメインをコードするヌクレオチド配列と、Ｈｓｐ４０−Ｊドメインをコードするヌクレオチド配列と、標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列とから成る核酸セグメントを含み、該核酸セグメントが前記宿主細胞において、前記組換え標的タンパク質を発現するために、宿主特異的な転写調節要素と翻訳調節要素とに操作可能に連結されている、発現系。
【請求項２】
前記タンパク質形質導入ドメインをコードする前記ヌクレオチド配列が配列番号２のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の発現系。
【請求項３】
前記配列番号２のヌクレオチド配列を、配列番号５及び配列番号６のオリゴヌクレオチドを使用することによって合成する、請求項２に記載の発現系。
【請求項４】
前記ＨＳＰ４０Ｊドメインが、亜型Ａ、亜型Ｂ及び亜型ＣのＨＳＰ４０Ｊドメインから成る群から選択される、請求項１に記載の発現系。
【請求項５】
前記ＨＳＰ４０Ｊドメインが配列番号３のペプチドを含む、請求項４に記載の発現系。
【請求項６】
前記ＨＳＰ４０Ｊドメインをコードする前記ヌクレオチド配列が配列番号４のヌクレオチド配列を含む、請求項５に記載の発現系。
【請求項７】
前記配列番号４のヌクレオチド配列を、配列番号７〜配列番号１６のオリゴヌクレオチドを使用することによって合成する、請求項６に記載の発現系。
【請求項８】
前記宿主細胞が大腸菌を含む、請求項１に記載の発現系。
【請求項９】
前記標的タンパク質が、ＨＳＰペプチド、成長因子、ウイルス受容体結合ドメイン、及びウイルスコアタンパク質の少なくとも１つを含む、請求項１に記載の発現系。
【請求項１０】
請求項１に記載の発現系を用いて製造される組換えタンパク質。
【請求項１１】
請求項１０に記載の組換えタンパク質を含むワクチン。
【請求項１２】
宿主細胞において収率を高めて組換え標的タンパク質を製造する方法であって、
本質的に配列番号１のタンパク質形質導入ドメインをコードするヌクレオチド配列と、Ｈｓｐ４０−Ｊドメインをコードするヌクレオチド配列と、標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列とから成る核酸セグメントを含む発現ベクターを構築すること（該核酸セグメントが宿主細胞特異的な転写調節要素と翻訳調節要素とに操作可能に連結される）、
前記発現ベクターで前記宿主細胞を形質転換すること、並びに
前記組換え標的タンパク質を前記宿主細胞から回収及び単離することを含む、方法。
【請求項１３】
前記タンパク質形質導入ドメインをコードする前記ヌクレオチド配列が配列番号２のヌクレオチド配列を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記配列番号２のヌクレオチド配列を、配列番号５及び配列番号６のオリゴヌクレオチドを使用することによって合成する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＨＳＰ４０Ｊドメインが、亜型Ａ、亜型Ｂ及び亜型ＣのＨＳＰ４０Ｊドメインから成る群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＨＳＰ４０Ｊドメインが配列番号３のペプチドを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＨＳＰ４０Ｊドメインをコードする前記ヌクレオチド配列が配列番号４のヌクレオチド配列を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記配列番号４のヌクレオチド配列を、配列番号７〜配列番号１６のオリゴヌクレオチドを使用することによって合成する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記宿主細胞が大腸菌を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
前記標的タンパク質が、ＨＳＰペプチド、成長因子、ウイルス受容体結合ドメイン、及びウイルスコアタンパク質の少なくとも１つを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
免疫原性を高めた組換え標的タンパク質を製造する方法であって、
本質的に配列番号１のタンパク質形質導入ドメインをコードするヌクレオチド配列と、Ｈｓｐ４０−Ｊドメインをコードするヌクレオチド配列と、標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列とから成る核酸セグメントを含む発現ベクターを構築すること（該核酸セグメントが宿主特異的な転写調節要素と翻訳調節要素とに操作可能に連結される）、
前記発現ベクターで前記宿主細胞を形質転換すること、並びに
前記組換え標的タンパク質を前記宿主細胞から回収及び単離することを含む、方法。
【請求項２２】
生物を前記組換えタンパク質により免疫付与することをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記タンパク質形質導入ドメインをコードする前記ヌクレオチド配列が配列番号２のヌクレオチド配列を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記配列番号２のヌクレオチド配列を、配列番号５及び配列番号６のオリゴヌクレオチドを使用することによって合成する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＨＳＰ４０Ｊドメインが、亜型Ａ、亜型Ｂ及び亜型ＣのＨＳＰ４０Ｊドメインから成る群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＨＳＰ４０Ｊドメインが配列番号３のペプチドを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＨＳＰ４０Ｊドメインをコードする前記ヌクレオチド配列が配列番号４のヌクレオチド配列を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記配列番号４のヌクレオチド配列を、配列番号７〜配列番号１６のオリゴヌクレオチドを使用することによって合成する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記宿主細胞が大腸菌を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
前記標的タンパク質が、ＨＳＰペプチド、成長因子、ウイルス受容体結合ドメイン、及びウイルスコアタンパク質の少なくとも１つを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
キメラタンパク質であって、
ａ．前記キメラタンパク質のＮ末端に、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）又はＨＩＶ Ｔａｔ ＰＴＤ活性を有するその断片を含有する第１のポリペプチジル断片と、
ｂ．前記第１のポリペプチジル断片のＣ末端に、Ｊドメイン又は熱ショックタンパク質７０（Ｈｓｐ７０）非相互作用活性を有するその断片を含有する第２のポリペプチジル断片と、
ｃ．前記第２のポリペプチジル断片のＣ末端に、標的タンパク質又はポリペプチドを含有する第３のポリペプチジル断片とを含む、キメラタンパク質。
【請求項３２】
前記第１のポリペプチジル断片が配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む、請求項３１に記載のキメラタンパク質。
【請求項３３】
前記第２のポリペプチジル断片が配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む、請求項３１に記載のキメラタンパク質。
【請求項３４】
前記Ｊドメインがヒト熱ショックタンパク質４０由来である、請求項３１に記載のキメラタンパク質。
【請求項３５】
キメラ遺伝子であって、
ａ．タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）又はＨＩＶ Ｔａｔ ＰＴＤ活性を有するその断片をコードする第１のＤＮＡ配列と、
ｂ．Ｊドメイン又は熱ショックタンパク質７０（Ｈｓｐ７０）非相互作用活性を有するその断片をコードする、前記第１のＤＮＡ配列と翻訳フレームで連結した第２のＤＮＡ配列と、
ｃ．標的タンパク質又はポリペプチドをコードする、前記第２のＤＮＡ配列と翻訳フレームで連結した第３のＤＮＡ配列とを含む、キメラ遺伝子。
【請求項３６】
タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）をコードする前記第１のＤＮＡ配列が配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む、請求項３５に記載のキメラ遺伝子。
【請求項３７】
Ｊドメインをコードする前記第２のＤＮＡ配列が配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む、請求項３５に記載のキメラ遺伝子。
【請求項３８】
タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）をコードする前記第１のＤＮＡ配列が配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むと共に、Ｊドメインをコードする前記第２のＤＮＡ配列が配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む、請求項３５に記載のキメラ遺伝子。
【請求項３９】
前記Ｊドメインがヒト熱ショックタンパク質４０由来である、請求項３５に記載のキメラ遺伝子。
【請求項４０】
キメラ遺伝子であって、
ａ．タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）又はＨＩＶ Ｔａｔ ＰＴＤ活性を有するその断片をコードする第１のＤＮＡ配列と、
ｂ．Ｊドメイン又は熱ショックタンパク質７０（Ｈｓｐ７０）非相互作用活性を有するその断片をコードする、前記第１のＤＮＡ配列と翻訳フレームで連結した第２のＤＮＡ配列とを含む、キメラ遺伝子。
【請求項４１】
タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）をコードする前記第１のＤＮＡ配列が配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む、請求項４０に記載のキメラ遺伝子。
【請求項４２】
Ｊドメインをコードする前記第２のＤＮＡ配列が配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む、請求項４０に記載のキメラ遺伝子。
【請求項４３】
タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）をコードする前記第１のＤＮＡ配列が配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むと共に、Ｊドメインをコードする前記第２のＤＮＡ配列が配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む、請求項４０に記載のキメラ遺伝子。
【請求項４４】
前記Ｊドメインがヒト熱ショックタンパク質４０由来である、請求項４０に記載のキメラ遺伝子。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２０１０−５２６５４４（Ｐ２０１０−５２６５４４Ａ）
【公表日】平成２２年８月５日（２０１０．８．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５０７７８０（Ｐ２０１０−５０７７８０）
【出願日】平成２０年５月１５日（２００８．５．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００８／０００９４８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１３８２２９
【国際公開日】平成２０年１１月２０日（２００８．１１．２０）
【出願人】（５０９３１６７４１）康泰生医科技股▲分▼有限公司 (1)
【出願人】（５１００４６５７２）瑞林生物科技股▲分▼有限公司 (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年８月５日（２０１０．８．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年５月１５日（２００８．５．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００８／０００９４８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１３８２２９
【国際公開日】平成２０年１１月２０日（２００８．１１．２０）
【出願人】（５０９３１６７４１）康泰生医科技股▲分▼有限公司 (1)
【出願人】（５１００４６５７２）瑞林生物科技股▲分▼有限公司 (1)
【Ｆターム（参考）】
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