受精卵観察の画像処理方法、画像処理プログラム及び画像処理装置、並びに受精卵の製造方法
【課題】低倍観察において受精卵を高速且つ頑健に認識する手段を提供する。
【解決手段】受精卵観察の画像処理プログラムＧＰは、観察視野内に位置する受精卵を含む複数の物体と当該複数の物体の像を結像する観察光学系との光学的距離を変化させながら撮像装置により複数の物体を撮影した複数の観察画像を取得するステップＳ３と、観察画像に写し込まれた複数の物体を抽出するステップＳ４と、観察画像に含まれる物体ごとに、受精卵の属性に応じた画像の特徴量を算出するステップＳ５と、複数の観察画像間における同一物体の画像の特徴量の変化に基づいて受精卵を認識するステップＳ６，Ｓ７と、物体に対する認識結果を外部に出力するステップＳ８とをコンピュータに実現させる。
【解決手段】受精卵観察の画像処理プログラムＧＰは、観察視野内に位置する受精卵を含む複数の物体と当該複数の物体の像を結像する観察光学系との光学的距離を変化させながら撮像装置により複数の物体を撮影した複数の観察画像を取得するステップＳ３と、観察画像に写し込まれた複数の物体を抽出するステップＳ４と、観察画像に含まれる物体ごとに、受精卵の属性に応じた画像の特徴量を算出するステップＳ５と、複数の観察画像間における同一物体の画像の特徴量の変化に基づいて受精卵を認識するステップＳ６，Ｓ７と、物体に対する認識結果を外部に出力するステップＳ８とをコンピュータに実現させる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、受精卵観察において取得された観察画像から受精卵と異物とを自動判別する画像処理手段、及びこれを利用した受精卵の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生殖補助医療技術（ＡＲＴ）の発展に伴い、体外受精による受精卵を培養しながらその生育状態を観察することが行われている。受精卵などの培養物の状況を観察する装置の例として、培養顕微鏡が挙げられる（例えば、特許文献１を参照）。培養顕微鏡は、受精卵の培養に好適な環境を形成する培養装置（インベキュータ）と、培養装置に収容された培養容器内の受精卵の状態を顕微観察する顕微観察系とを備え、予め設定された一定時間ごとに受精卵の観察画像を取得し、ユーザが受精卵を目視により認識した上で、受精卵の生育状態の観察、記録、管理等を自動で行うことができるように構成される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００４−２２９６１９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
このような装置において、培養容器中の受精卵の生育状態を顕微観察する場合、培地の中から観察対象である受精卵を検出しなければならないが、培地には受精卵の他にもゴミやオイル粒等の異物が混入しているため、受精卵とそれ以外の異物とを判別して受精卵を認識するには、できる限り高倍率での顕微観察が必要になる。しかしながら、高倍観察になるほど解像度の高い画像を取得することができるものの、高倍観察になるにつれて観察視野（観察範囲）が狭くなり視野内に受精卵の像が写し込まれる確率が低くなるため、受精卵を検出するのに広視野領域において多数の高倍画像の撮影が必要になるとともに、その多数の画像の中から受精卵を識別する複雑な処理が必要となり、受精卵の検出に長時間を要するという問題があった。そのため、できる限り広視野を確保した低解像度の画像であっても受精卵を正確に認識することが可能な手段が求められている。
【０００５】
本発明は、上記のような課題に鑑みてなされたものであり、低倍観察において受精卵を高速且つ頑健に認識する手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明を例示する第１の態様に従えば、観察視野内に位置する受精卵を含む複数の物体と当該複数の物体の像を結像する観察光学系との光学的距離を変化させながら撮像装置により複数の物体を撮影した複数の観察画像を取得し、観察画像に写し込まれた複数の物体を抽出し、観察画像に含まれる物体ごとに、受精卵の属性に応じた画像の特徴量を算出し、複数の観察画像間における同一物体の画像の特徴量の変化に基づいて受精卵を認識することを特徴とする受精卵観察の画像処理方法が提供される。
【０００７】
本発明を例示する第２の態様に従えば、コンピュータにより読み取り可能であり、撮像装置により撮影されて画像を取得して画像処理する画像処理装置としてコンピュータを機能させるための画像処理プログラムであって、観察視野内に位置する受精卵を含む複数の物体と当該複数の物体の像を結像する観察光学系との光学的距離を変化させながら撮像装置により複数の物体を撮影した複数の観察画像を取得するステップと、観察画像に写し込まれた複数の物体を抽出するステップと、観察画像に含まれる物体ごとに、受精卵の属性に応じた画像の特徴量を算出するステップと、複数の観察画像間における同一物体の画像の特徴量の変化に基づいて受精卵を認識するステップと、物体に対する認識結果を外部に出力するステップとを、コンピュータに実現させることを特徴とする受精卵観察の画像処理プログラムが提供される。
【０００８】
本発明を例示する第３の態様に従えば、観察視野内に位置する受精卵を含む複数の物体と当該複数の物体の像を結像する観察光学系との光学的距離を変化させながら複数の物体を撮影する撮像装置と、光学的距離を変化させて撮像装置により撮影された複数の観察画像の各々から複数の物体を抽出し、複数の物体の中から受精卵を認識する画像解析部と、画像解析部により判断された認識結果を外部に出力する出力部とを備え、画像解析部が、観察画像に含まれる物体ごとに、受精卵の属性に応じた画像の特徴量を算出し、複数の観察画像間における同一物体の画像の特徴量の変化に基づいて受精卵を認識することを特徴とする受精卵観察の画像処理装置が提供される。
【０００９】
本発明を例示する第４の態様に従えば、所定の環境条件で受精卵を培養し、受精卵が存在する培養容器中から、上記構成の画像処理装置を用いて受精卵を識別することを特徴とする受精卵の製造方法が提供される。
【００１０】
本発明を例示する第５の態様に従えば、所定の環境条件で受精卵を培養し、受精卵が存在する培養容器中において、観察視野内に位置する受精卵を含む複数の物体と当該複数の物体の像を結像する観察光学系との光学的距離を変化させながら撮像装置により複数の物体を撮影した複数の観察画像を取得し、観察画像に写し込まれた複数の物体を抽出し、観察画像に含まれる物体ごとに、受精卵の属性に応じた画像の特徴量を算出し、複数の観察画像間における同一物体の画像の特徴量の変化に基づいて受精卵を認識することを特徴とする受精卵の製造方法が提供される。
【発明の効果】
【００１１】
このような受精卵観察の画像処理方法、画像処理プログラム及び画像処理装置、並びに受精卵の製造方法によれば、観察対象の受精卵を高速且つ頑健に認識することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】画像処理プログラムの概要を示すフローチャートである。
【図２】本発明の適用例として示す培養観察システムの概要構成図である。
【図３】上記培養観察システムのブロック図である。
【図４】（Ａ）は培養容器を示す平面図であり、（Ｂ）はディッシュを示す斜視図である。
【図５】位相差顕微鏡の概要構成図である。
【図６】受精卵とそれ以外の異物との特徴を説明するための図である。
【図７】フォーカス面を順次変更して受精卵を撮影した複数の観察画像を示す模式図である。
【図８】受精卵の輪郭部での回折現象を説明するための模式図である。
【図９】画像の特徴量算出の対象となる領域を説明するための模式図である。
【図１０】フォーカス面座標を変化させたときの面積Ｓ及び輝度総和Ｖの変化を表すグラフである。
【図１１】画像処理装置の概要構成を示すブロック図である。
【図１２】受精卵の製造方法の概要を示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を実施するための形態について、図面を参照しながら説明する。本実施形態に係る画像処理装置を適用したシステムの一例として、培養観察システムの概要構成図及びブロック図を、それぞれ図２及び図３に示す。
【００１４】
培養観察システムＢＳは、大別的には、筐体１の上部に設けられた培養室２と、複数の培養容器１０を収容保持する棚状のストッカー３と、培養容器１０内の試料を観察する観察ユニット５と、培養容器１０をストッカー３と観察ユニット５との間で搬送する搬送ユニット４と、システムの作動を統括的に制御する制御ユニット６と、画像表示装置を備えた操作盤７などから構成される。
【００１５】
培養室２は、培養環境を形成する部屋であり、環境変化やコンタミネーションを防止するためサンプル投入後は密閉状態に保持される。培養室２に付随して、培養室２内の温度を昇温・降温させる温度調整装置２１、湿度を調整する加湿器２２、ＣＯ２ガスやＮ２ガス等のガスを供給するガス供給装置２３、培養室２全体の環境を均一化させるための循環ファン２４、培養室２の温度や湿度、二酸化炭素濃度等を検出する環境センサ２５などが設けられている。各機器の作動は制御ユニット６により制御され、培養室２の温度や湿度、二酸化炭素濃度等により規定される培養環境が、操作盤７において設定された培養条件に合致した状態に維持される。
【００１６】
ストッカー３は、図２における紙面直行の前後方向、及び上下方向にそれぞれ複数に仕切られた棚状に形成されている。各棚にはそれぞれ固有の番地が設定されており、例えば前後方向をＡ〜Ｃ列、上下方向を１〜７段とした場合に、Ａ列５段の棚がＡ−５のように設定される。
【００１７】
培養容器１０は、培養物の種類や目的等に応じてフラスコやディッシュ、ウェルプレートなど適宜なものが選択され、本実施形態では、図４（Ａ）に示すように、透光性の材質で形成された直径約３５ｍｍの５つのディッシュ１１（容器１１ａ及び蓋１１ｂからなる）と、ディッシュ１１を保持するホルダ１２とを備えた構成を例示しており、図４（Ｂ）に示すように、培養物たる受精卵Ｊは、ｐＨに応じて変色するフェノールレッドなどのｐＨ指示薬が入った培地ドロップＡとともに各ディッシュ１１に注入される。ディッシュ１１の底面には、ピペット等により滴下された２０［μｌ］程度の培地ドロップＤが１〜複数個形成されており（図４（Ｂ）では３個を図示）、培地ドロップＤはディッシュ１１内において無色透明のミネラルオイルＯによって浸された状態となっている。それぞれの培地ドロップＤ内には、例えば対外受精のために同一母体から同時期に採卵された受精卵Ｊが１個（または複数個）ずつ挿入されている。また、培養容器１０にはコード番号が付与され、ストッカー３の指定番地に対応づけて収容される。
【００１８】
搬送ユニット４は、培養室２の内部に設けられて上下移動可能なＺステージ４１、前後移動可能なＹステージ４２、左右移動可能なＸステージ４３などからなり、Ｘステージ４３の先端側に培養容器１０を持ち上げ支持する支持アーム４５が設けられている。搬送ユニット４、支持アーム４５がストッカー３の全棚と観察ユニット５との間を移動可能な移動範囲を有して構成される。
【００１９】
観察ユニット５は、試料台１５の下側から試料を照明する第１照明部５１、顕微観察系の光軸に沿って試料台１５の上方から試料を照明する第２照明部５２、下方から試料を照明する第３照明部５３、試料のマクロ観察を行うマクロ観察系５４、試料のミクロ観察を行う顕微観察系５５、及び画像処理装置１００（図１１を参照）などから構成される。試料台１５は、透光性を有する材質で構成されるとともに観察領域に透明な窓部１６が設けられている。また、試料台１５は、制御ユニット６からの作動制御によりＸＹ方向（水平面内方向）およびＺ方向（上下方向）に移動可能な微細駆動ステージからなり、その上面部に載置された培養容器１０をＸＹ方向に移動させることにより、培養容器１０をマクロ観察系５４の光軸上へ挿入したり、顕微観察系５５の光軸上へ挿入したりすることが可能になっている。
【００２０】
第１照明部５１は、下部フレーム１ｂ側に設けられた面発光の光源からなり、試料台１５の下側から培養容器１０全体をバックライト照明する。第２照明部５２は、ＬＥＤ等の光源５２ａと、位相リングやコンデンサレンズ等からなる照明光学系５２ｃとを有して培養室２に設けられており、試料台１５の上方から顕微観察系５５の光軸に沿って培養容器１０中の試料を照明する。第３照明部５３は、それぞれ落射照明観察や蛍光観察に好適な波長の光を射出する複数のＬＥＤや水銀等の光源と、各光源から射出された光を顕微観察系５５の光軸に重畳させるビームスプリッタや蛍光フィルタ等からなる照明光学系とを有して、培養室２の下側に位置する下部フレーム１ｂ内に配設されており、試料台１５の下方から顕微観察系５５の光軸に沿って培養容器１０中の試料を照明する。
【００２１】
マクロ観察系５４は、観察光学系５４ａと、この観察光学系５４ａにより結像された試料の像を撮影するＣＣＤカメラ等の撮像装置５４ｃとを有し、第１照明部５１の上方に位置して培養室２内に設けられている。マクロ観察系５４は、第１照明部５１によりバックライト照明された培養容器１０の上方からの全体観察画像（マクロ画像）を撮影する。
【００２２】
顕微観察系５５は、対物レンズ８４や位相リング８２等（図５を参照）からなる観察光学系５５ａと、観察光学系５５ａにより結像された試料の像を撮影する冷却ＣＣＤ等の撮像装置５５ｃとを有し、下部フレーム１ｂの内部に配設されている。上記の第２照明部５２と顕微観察系５５とにより位相差観察用の顕微鏡８０が構成される。対物レンズ８４はレンズ駆動機構８７（図５を参照）により光軸に沿う方向（Ｚ方向）に往復移動可能に構成されており、対物レンズ８４（観察光学系５５ａ）と試料面との光軸方向の相対位置（光学的距離）を変化させることが可能になっている。レンズ駆動機構８７としては、例えばステッピングモータや、ピエゾアクチュエータ（ピエゾ素子）等が利用される。なお、本実施形態では、対物レンズ８４を光軸方向に移動させることにより試料面との相対位置を変化させているが、試料台１５を光軸方向に移動させたり、対物レンズ８４と試料台１５との両方を光軸方向に移動させてもよい。
【００２３】
また、対物レンズ８４は複数設けられるとともに、詳細図示を省略するレボルバやスライダなどの変位機構を用いて複数倍率に設定可能に構成されており、初期選択のレンズ設定に応じて、本実施形態では少なくとも低倍観察用（例えば２倍観察用）と高倍観察用（例えば１０倍観察用）との２種類の倍率の間で変倍可能なように切り換えられる。顕微観察系５５は、第２照明部５２により照明された試料の透過光による位相差画像や、第３照明部５３により照明されて試料が発する蛍光による蛍光画像など、培養容器１０内の試料を顕微鏡観察した顕微観察画像（ミクロ画像）を撮影する。なお、詳細は後述するが、本実施形態では受精卵の検出効率を向上させるために、低倍観察用の対物レンズを用いて観察することを特徴としている。
【００２４】
画像処理装置１００は、マクロ観察系５４の撮像装置５４ｃ及び顕微観察系５５の撮像装置５５ｃから入力された信号をＡ／Ｄ変換するとともに、各種の画像処理を施して全体観察画像または顕微観察画像の画像データを生成する。また、画像処理装置１００は、これらの観察画像（全体観察画像及び顕微観察画像）の画像データに対して画像解析を施し、画像中に存在するオブジェクトの抽出や、オブジェクトの画像特徴量の算出、受精卵の識別等の画像処理を行う。画像処理装置１００は、具体的には、次述する制御ユニット６のＲＯＭに記憶された画像処理プログラムが実行されることにより構築される。なお、この画像処理装置１００については、後に詳述する。
【００２５】
制御ユニット６は、処理を実行するＣＰＵ６１、培養観察システムＢＳの制御プログラムや制御データ等が設定記憶されたＲＯＭ６２、観察条件や画像データ等を一時記憶するＲＡＭ６３などを有し、培養観察システムＢＳの作動を制御する。そのため、図３に示すように、培養室２、搬送装置４、観察ユニット５、操作盤７の各構成機器が制御ユニット６に接続されている。ＲＡＭ６３には、観察プログラムに応じた培養室２の環境条件や、観察スケジュール、観察ユニット５における観察種別や観察位置、観察倍率等が設定され記憶される。また、ＲＡＭ６３には、観察ユニット５により撮影された画像データを記録する画像データ記憶領域が設けられ、培養容器１０のコード番号や撮影日時等を含むインデックス・データと画像データとが対応付けて記録される。
【００２６】
操作盤７には、キーボードやスイッチ等の入出力機器が設けられた操作パネル７１、操作画面や画像データ等を表示する表示パネル７２が設けられ、操作パネル７１において観察プログラムの設定や条件選択、動作指令等の入力が行われる。通信部６５は有線または無線の通信規格に準拠して構成されており、この通信部６５に外部接続されるコンピュータ等との間でデータの送受信が可能になっている。
【００２７】
このように概要構成される培養観察システムＢＳでは、操作盤７において設定された観察プログラムの設定条件に従い、ＣＰＵ６１がＲＯＭ６２に記憶された制御プログラムに基づいて各部の作動を制御するとともに、培養容器１０内の試料の撮影を自動的に実行する。すなわち、操作パネル７１に対するパネル操作（または通信部６５を介したリモート操作）によって観察プログラムがスタートされると、ＣＰＵ６１が、ＲＡＭ６３に記憶された環境条件の各条件値を読み込むとともに、環境センサ２５から入力される培養室２の環境状態を検出し、条件値と実測値との差異に応じて温度調整装置２１、加湿器２２、ガス供給装置２３、循環ファン２４等を作動させて、培養室２の温度や湿度、二酸化炭素濃度などの培養環境についてフィードバック制御が行われる。
【００２８】
また、ＣＰＵ６１は、ＲＡＭ６３に記憶された観察条件を読み込む、観察スケジュールに基づいて搬送ユニット４のＸ，Ｙ，Ｚステージ４１，４２，４３を作動させてストッカー３から観察対象の培養容器１０を観察ユニット５の試料台１５に搬送して、観察ユニット５による観察を開始させる。例えば、観察プログラムにおいて設定された観察がマクロ観察である場合には、搬送ユニット４によりストッカー３から搬送してきた培養容器１０をマクロ観察系５４の光軸上に位置決めして試料台１５に載置し、第１照明部５１の光源を点灯させて、バックライト照明された培養容器１０の上方から撮像装置５４ｃにより全体観察像を撮影する。撮像装置５４ｃから制御ユニット６に入力された信号は、画像処理装置１００により処理されて全体観察画像が生成され、その画像データが撮影日時等のインデックス・データなどとともにＲＡＭ６３の画像データ記憶領域に記憶される。
【００２９】
また、観察プログラムにおいて設定された観察が、培養容器１０内の特定位置の試料のミクロ観察である場合には、搬送ユニット４により搬送してきた培養容器１０内の特定位置を顕微観察系５５の光軸上に位置決めして試料台１５に載置し、第２照明部５２または第３照明部５３の光源を点灯させて、透過照明、落射照明、蛍光による顕微観察像を撮像装置５５ｃに撮影させる。撮像装置５５ｃにより撮影されて制御ユニット６に入力された信号は、画像処理装置１００により処理されて顕微観察画像（位相差画像、蛍光画像等）が生成され、その画像データが撮影日時等のインデックス・データなどとともにＲＡＭ６３の画像データ記憶領域に記憶される。
【００３０】
ＣＰＵ６１は、上記のような全体観察像の撮影や顕微観察像の撮影を、観察プログラムに設定された観察スケジュールに基づいて順次実行する。ＲＡＭ６３に記憶された画像データは、操作パネル７１から入力される画像表示指令に応じてＲＡＭ６３から読み出され、例えば指定時刻の全体観察画像や顕微観察画像、画像解析の解析結果などが表示パネル７２に表示される。
【００３１】
続いて、このように構成される培養観察システムＢＳにおいて、第２照明部５２と顕微観察系５５とにより構成される位相差顕微鏡８０について概要説明する。ここで、図５は位相差顕微鏡８０の構成を示す模式図である。位相差顕微鏡８０は、第２照明部５２において培養室２内に設けられた光源５２ａ及び照明光学系５２ｃと、顕微観察系５５において下部フレーム１ｂ内に設けられた観察光学系５５ａ及び撮像装置５５ｃとを有して構成される。
【００３２】
照明光学系５２ｃは、光源側から順に、コレクタレンズ８１、輪帯絞り８２及びコンデンサレンズ８３を備えている。観察光学系５５ａは、光源側から順に、対物レンズ８４、位相リング８５及び結像レンズ８６を備えている。
【００３３】
位相差顕微鏡８０において、光源５２ａから射出された照明光は、コレクタレンズ８１により略平行光束に変換され、輪帯形状（リング形状）のスリットが設けられた輪帯絞り８２に入射する。輪帯絞り８２のスリットを通過した光は、コンデンサレンズ８３によって集光され、試料台１５に載置された培養容器１０（ディッシュ１１）内の試料に照射される。
【００３４】
試料に照射された照明光は、試料を通過する直接光と、位相物体である試料により回折される回折光とに分かれる。この回折現象は屈折率に変化のある部位で発生するため、当該回折光は、受精卵Ｊと培地ドロップＤとの境界部分、受精卵Ｊの内部構造等、の位相物体（受精卵Ｊ）の形状情報を含んでおり、この回折により照明光に対して位相が１／４波長だけ遅れることになる。これら直接光及び回折光は対物レンズ８４により集光されて、輪帯絞り８２と光学的に共役な位置に配置された位相リング８５に入射する。
【００３５】
位相リング８５に入射する光のうち直接光は、輪帯絞り８２のスリットとほぼ同じ形状（リング状）に形成された位相板８５ａに入射して、位相板８５ａによって光の一部が吸収されて光量が弱められるとともに、位相が照明光の１／４波長だけずらされる。一方、位相リング８５に入射する光のうち回折光は、位相板８５ａ以外の部分をそのまま透過する。位相リング８５を通過した直接光及び回折光は結像レンズ８６により結像されて、撮像装置５５ｃの撮像面上で干渉する。このとき、直接光の位相は位相板８５ａによって１／４波長だけずれているため、直接光と回折光との位相差は１／２波長もしくは０になっており、その干渉によって位相の変化を光の明暗として可視化される。これにより、撮像装置５５ｃの撮像面上には明暗のコントラストがついた試料（受精卵Ｊ）の拡大像が形成され、撮像装置５５ｃにより撮影されることになる。
【００３６】
このとき、上述したように、対物レンズ８４はレンズ駆動機構８７によって光軸に沿った方向（Ｚ方向）に往復移動可能であり、試料と対物レンズ８４（観察光学系５５ａ）との相対位置（光学的距離）が変化するようになっている。これに対し、撮像装置５５ｃは試料の撮影を連続的に行うため、対物レンズ８４の移動に応じてコントラストが変化する複数の画像を所定の撮像ピッチで撮影することができる。これにより、１つの試料に対して異なるフォーカス面から取得された複数の観察画像を得ることができる。
【００３７】
ここで、撮像装置５５ｃはＣＣＤやＣＭＯＳ等の撮像素子を搭載しており、撮像素子の撮像面上に形成された試料の拡大像を撮像して得られた画像信号を画像処理装置１００へ出力する。また、画像処理装置１００には、撮像装置５５ｃからの画像信号の他に、試料台（微細駆動ステージ）１５に内蔵されたエンコーダ１５ａ（図１０を参照）及びレンズ駆動機構８７のコントローラに内蔵されたセンサー８７ａ（図１０を参照）からの位置検出信号が入力される。そのため、試料を撮像したときの試料台１５の位置（Ｘ，Ｙ方向位置）と対物レンズ８４の位置（Ｚ方向位置）とを知ることができる。
【００３８】
以上のように構成される培養観察システムＢＳにおいて、画像処理装置１００は、培養容器１０内における受精卵の生育状態等の観察を実行するため、観察画像から観察対象となる受精卵とそれ以外のゴミや気泡等の異物（非対象物）とを判別して、受精卵を認識する機能を備えている。
【００３９】
ここで、培地ドロップＤ内の混入物は、ゴミ（培地の残りかす）、オイル粒（ディッシュ１１内に充填されるミネラルオイルＯが培地に入り込んだもの）、及び気泡に大別される。ここで、図６にも示すように、受精卵、ゴミ、オイル粒、及び気泡の各々は次のような特徴を持っている。
【００４０】
（受精卵の特徴）
受精卵は、その輪郭部に膜（「透明帯」と称する）が存在する、外形が球形状を有している、輪郭内部に内部構造（卵細胞）が存在している、という特徴を持つ。
【００４１】
（ゴミの特徴）
ゴミは、その輪郭部に透明帯が存在しない、位相差画像では輪郭部にハロが現れる、輪郭内部の構造は不定である、という特徴を持つ。
【００４２】
（オイル粒、気泡の特徴）
オイル粒及び気泡は、その輪郭部に透明帯が存在しない、位相差画像では濃淡が強めにでる、外形が球形状や楕円形状である、輪郭内部の構造が少ない、という特徴を持つ。
【００４３】
このように受精卵は最外輪郭を形成する透明帯を持つという属性を有しており、対物レンズ８４を光軸方向に駆動させて、顕微観察（位相差観察）によって異なるフォーカス面の観察画像を撮影したとき、そのフォーカス面のＺ位置によっては受精卵の輪郭部で屈折率の変化がほとんど生じずに明暗のコントラストとして現れない画像、すなわち透明体（及びその輪郭部）が視認できない画像が得られる。
【００４４】
これについて、図７及び図８を追加参照して簡単に説明する。なお、図７はフォーカス面を順次変更して撮影した複数の観察画像を示す模式図であり、図８は受精卵の輪郭部での回折現象を説明するための模式図である。なお、これらの図においてはＺ軸がフォーカス面座標と一致する。位相差観察における回折現象は、前述したように屈折率変化のある部位、例えば、受精卵（位相物体）と培地ドロップＤとの境界部分や、受精卵の内部構造の部分で発生する。ここで図８に示すように、受精卵Ｊをほぼ球形として考えた場合、受精卵Ｊの輪郭部（透明帯の膜部分）において、球の中心Ｘを通る基準のフォーカス面（例えばＺ＝０）では、輪郭部が垂直方向成分となるため、屈折率変化（回折現象）がほとんどなく、明暗のコントラストが生じない。その結果、図７に示すように、透明帯（及びその輪郭部）の像が見かけ上消失することになる。一方、フォーカス面を上下（例えばＺ＝±ΔＺ）に振ると、輪郭部での屈折率変化によって回折光を生じ、透明帯（及びその輪郭部）が明暗のコントラストが付いた像として見えることになる。これに対して、ゴミやオイル粒等の異物では透明帯を持たず、輪郭部での屈折率も一様に高く安定しているため、フォーカス面のＺ位置によらず常に輪郭部が写し込まれることになる。
【００４５】
そのため、異なるフォーカス面から取得された複数の観察画像間において透明帯の像の出没を検出することで受精卵を認識することとする。ここで、観察画像において受精卵の透明帯が出現するときは、当然ながら透明帯の外側の輪郭が最外輪郭となって面積が相対的に大きくなるとともに、その最外輪郭の内側（すなわち、透明帯）の輝度が相対的に高くなる。一方、透明帯が画像から消失するときには、内部構造（図８においては卵細胞Ｃ）の輪郭が最外輪郭となって面積が相対的に小さくなるとともに、その最外輪郭の内側（卵細胞）の輝度が相対的に低くなる。そこで、最外輪郭の大きさ及びその内側の輝度を受精卵固有の特徴量として設定し、フォーカス面を振ったときの特徴量の変化に基づいて受精卵を識別する。
【００４６】
本実施形態において、画像処理装置１００による受精卵観察の画像処理方法は、異なるフォーカス面の複数の観察画像を取得し、各観察画像に写し込まれる物体（オブジェクト）に対して受精卵固有の属性に基づく画像特徴量（以下に詳述する、I．最外輪郭の大きさ、II．内輪帯の輝度総和）を算出し、観察画像に応じて画像特徴量が変化（すなわち透明帯の像が出没）する物体を受精卵であると認識するように構成される。それでは、以下にこの画像処理方法について基本的な概念から説明する、なお、以降の説明では、第２照明部５２及び顕微観察系５５等によって構成される位相差顕微鏡８０によって撮影される位相差画像(顕微観察画像)に基づいて受精卵の観察を行う場合を例示する。
【００４７】
（オブジェクトの抽出）
まず、撮像装置５５ｃにより撮影された異なるフォーカス面となる複数の観察画像（位相差画像）に対して、例えば分散フィルタまたはSnakesやLevel Set法などといった動的輪郭抽出手法を適用して、観察画像内に含まれる物体（受精卵及び異物の領域）の最外輪郭を抽出し、その輪郭に囲まれた閉じた領域をオブジェクトとして抽出してセグメンテーションを行う。こうしてセグメント化された各オブジェクトに対して、個々のオブジェクトを区別可能なように固有の標識としてラベルを割り当てる。なお、フォーカス面を振った複数の観察画像においては、同一のオブジェクトが相互に写し込まれているため、観察画像間で同一性のあるオブジェクトについては同一のラベルを付与する対応付けがなされる。
【００４８】
（特徴量算出）
ラベリング処理を施した各オブジェクトに対し、受精卵の属性に基づく画像の特徴量として、I．最外輪郭の大きさ、II．内輪帯部分の輝度総和、を計算する。なお、各オブジェクトの特徴量は観察画像単位で計算され、同一のオブジェクトであっても１つの観察画像に対して各特徴量が１つずつ計算される。なお、図９に上記の特徴量算出の対象となる部分を説明するための模式図を示す。
【００４９】
I．最外輪郭の大きさ
オブジェクトの最外輪郭の大きさとして、オブジェクト領域の面積、すなわち最外輪郭内部の面積Ｓを算出する（図９（Ａ）に斜線で示す部分の面積）。
【００５０】
II．内輪帯の輝度総和
観察画像（元画像）において、オブジェクトの最外輪郭内側に輪帯部分（「内輪帯」と称する）の領域（図９（Ｂ）に斜線で示す領域）を設定し、この内輪帯の輝度値（例えば、8ビット階調の場合に0〜255）の総和である輝度総和Ｖを算出する。例えば、オブジェクトが受精卵である場合には、内輪帯の部分が透明帯にほぼ一致し、透明帯の輝度値の総和を算出することになる。内輪帯の幅としては、過去のサンプリングデータ等から既知である受精卵の透明帯の幅に相当する大きさを、観察倍率等の画像取得条件に応じて設定する（例えば、数ピクセル分の幅）。なお、各オブジェクトの画像に対して収縮処理を施したマスク画像を生成し、原画像とマスク画像との差分画像の部分を内輪帯部分として特定してもよい。
【００５１】
以上の２つの特徴量は、ラベリングされたオブジェクトごとに求められ、これを基に複数のオブジェクトの中から受精卵を決定する。
【００５２】
（受精卵の識別）
受精卵候補となる各オブジェクトについて、複数の観察画像に対する特徴量の変化を計算する。各オブジェクトはフォーカス位置の異なる複数の観察画像の各々に写り込んでいるため、各オブジェクトに対して画像の特徴量となる面積Ｓ及び輝度総和Ｖは観察画像の枚数に対応する個数だけ取得されており、これに基づいて複数の観察画像間の同一オブジェクトについての特徴量変化を計算する。
【００５３】
ここで、受精卵の画像の特徴量変化の一例として、前述の図７の状態においてフォーカス面のＺ位置を変化させたときの面積Ｓ及び輝度総和Ｖの変化を表すグラフを図１０に示している。前述したように、フォーカス面のＺ位置を変化させて受精卵の観察画像を複数取得した場合、受精卵の持つ透明帯の像が（見た目上）一時的に消失する画像が得られることを考えると、透明帯が写し込まれていない画像に基づいて受精卵の画像の特徴量を算出すると、この特徴量である面積Ｓ及び輝度総和Ｖの値は相対的に小さな値となる。つまり、透明帯（及びその輪郭）が消失することで、画像に写る最外輪郭が内部構造（卵細胞Ｃ）の輪郭になるため、面積Ｓが減少するとともに、卵細胞Ｃが持つ構造により輝度総和Ｖも低下することになる。一方、ゴミ、オイル粒、気泡などの異物については透明帯を持たず、輪郭部での屈折率も一様に高く安定しているため、フォーカス面のＺ位置によらず常に一定の最外輪郭を写し込めるため、画像の特徴量はほとんど変化することがない。そのため、図１０（Ａ），（Ｂ）に示すように、複数の観察画像間において面積Ｓ及び輝度総和Ｓが変化するオブジェクト、より詳細には、面積Ｓ及び輝度総和Ｖが一度小さくなってから再び大きくなるように（極小点を持つように）変化するオブジェクトを受精卵であると認識する。
【００５４】
このような受精卵の判別手法（画像処理方法）では、解像度の高い高倍画像から画像特徴量を細かく数値化してこの特徴量そのものを比較するのではなく、異なるフォーカス面から取得した複数の観察画像間における画像特徴量の変化に基づいて受精卵を判別する構成であり、解像度の低い低倍画像からでも画像特徴量の顕著な変化は捉えることが可能であるため、受精卵の検出を広範囲な観察視野において高速に行うことができる。
【００５５】
なお、ゴミ等の異物の像であってもフォーカス面によっては画像の特徴量が多少変化する場合（例えば、異物が楕円球状の外形を持つ場合の面積Ｓ）も考えられるため、特徴量の変化量に対して予め所定の閾値を設定しておき、この閾値未満のオブジェクトをリジェクトするようにしてもよい。また、図７等では、基準フォーカス面（Ｚ＝０）に対して撮像ピッチ（サンプリング間隔）としてフォーカス方向にΔＺだけ上下に振って観察画像を取得した場合を例示しているが、更に複数の観察画像を連続的に取得するものであってもよい。
【００５６】
さらに、ここで用いられる対物レンズ８４の条件としては、一般的な動物由来の受精卵の大きさ（例えば、人間の受精卵の場合には直径で約１００[μｍ]程度）を考慮すると、焦点深度の浅い（ＮＡ＝０．２以上）光学レンズを適用させて、受精卵の透明帯を見た目上消失させる現象を起きやすくさせることが好ましい。
【００５７】
次に、培養観察システムＢＳの画像処理装置１００において実行される画像解析の具体的なアプリケーションについて図１及び図１１を併せて参照しながら説明する。ここで、図１は受精卵観察の画像処理プログラムＧＰにおける処理の概要を示すフローチャート、図１１は受精卵観察の画像処理を実行する画像処理装置１００の概要構成を示すブロック図である。
【００５８】
画像処理装置１００は、試料台１５及びレンズ駆動機構８７等の作動を制御する駆動制御部１１０と、撮像装置５５ｃにより撮影された観察画像を取得して記憶する画像記憶部１２０と、観察画像に写し込まれたオブジェクトごとに算出される画像の特徴量を記憶する特徴量記憶部１３０と、観察画像を解析して観察画像に写し込まれた複数のオブジェクトの中から受精卵を認識する画像解析部１４０と、画像解析部１４０により解析された判断結果を外部に出力する出力部１５０とを備え、画像解析部１４０により判断された受精卵であるか否かの判断結果を、例えば表示パネル７２に出力して表示させるように構成される。画像処理装置１００は、ＲＯＭ６２に予め設定記憶された画像処理プログラムＧＰがＣＰＵ６１に読み込まれ、ＣＰＵ６１によって画像処理プログラムＧＰに基づく処理が順次実行されるように構成される。
【００５９】
記述したように、培養観察システムＢＳでは、観察プログラムにおいて設定された観察条件に従って、所定時間ごとに指定された培養容器１０内の受精卵観察が行われる。具体的に、ＣＰＵ６１は、搬送ユニット４の各ステージ４１，４２，４３を作動させてストッカー３から観察対象の培養容器１０を観察ユニット５に搬送（本実施形態では、顕微観察系５５の光軸上に配置）する。
【００６０】
画像処理装置１００は、先ず始めにステップＳ１として、顕微観察系５５の撮像装置５５ｃによりディッシュ１１内の所望の培地ドロップＤの観察領域を撮像するために、駆動制御部１１０によって、試料台１５を面内方向（Ｘ，Ｙ方向）に駆動させる。ここで、低倍観察用（２倍観察用）の対物レンズによる視野サイズは培地ドロップ１個分のサイズよりも小さく、培地ドロップＤ１個分の視野をカバーするための必要な撮像枚数としては、例えば２×２〜３×３程度であるため、試料台１５をＸ，Ｙ方向に所定の移動ピッチでステップ状に駆動させて、試料（培地ドロップＤ）と対物レンズ８４との位置決めを行う。
【００６１】
ステップＳ２では、駆動制御部１１０によって、レンズ駆動機構８７を駆動させて対物レンズ８４を光軸方向に沿って移動させながら、撮像装置５５ｃに所定の撮像ピッチで位相差画像（観察画像）を撮影させる。なお、対物レンズ８４を往復移動させて撮像装置５５ｃにより多数の観察画像を取得したり、連続的に撮影して動画として取得するものでもよいが、一般的な受精卵の大きさから撮像位置を予め設定しておき、受精卵を識別するために必要な枚数（本実施形態では３枚）だけを取得するものでもよい。例えば、受精卵が自重でディッシュ１１の底面まで沈んでいるときには、ディッシュ１１の底面から既知の受精卵の大きさの半分（受精卵を球と仮定したときの半径値に相当する）だけ上方の位置に基準フォーカス面（Ｚ＝０）を設定し、この基準フォーカス面と、そこから撮像ピッチとして受精卵の大きさの１／４（受精卵の大きさ等によって任意に設定可）だけ上下に振った位置（すなわち、Ｚ＝±ΔＺの位置）との３か所でのみ撮影を行うものでもよい。
【００６２】
ステップＳ３では、撮像装置５５ｃから取得した複数の観察画像が、試料台１５のリニアエンコーダ１５ａやレンズ駆動機構８７のセンサー８７ａから出力される当該撮像が行われたときの位置情報とともに、培養容器１０のコード番号や観察位置、観察時刻などのインデックス・データと対応付けられて画像記憶部１２０に保存される。
【００６３】
ステップＳ４では、画像解析部１４０によって、画像記憶部１２０に記憶された各観察画像に対し、例えば、分散フィルタを施したのち二値化する手法や、動的輪郭抽出手法（SnakesやLevel Set法）などの最外輪郭抽出処理が実行され、各観察画像内に含まれるオブジェクトの最も外側の輪郭が抽出される。また、このように最外輪郭が抽出された各オブジェクトに対してラベリングが施され、複数の観察画像間で同一性があると判断されたオブジェクトに対しては同一のラベルを付与することによって対応付けがなされる。
【００６４】
ステップＳ５では、画像解析部１４０によって、各オブジェクトに対して観察画像ごとに、最外輪郭の大きさ（面積Ｓ）、及び内輪帯の輝度総和Ｖがそれぞれ算出される。特徴量記憶部１２０には、オブジェクトごとに割り当てたラベルと、画像解析部１４０により算出された画像の特徴量（面積Ｓ及び輝度総和Ｖ）とが対応付けられた状態で記憶される。
【００６５】
ステップＳ６では、画像解析部１４０によって、各オブジェクトに対して複数の観察画像間における最外輪郭の大きさＳ及び内輪帯部分の輝度総和Ｖの変化量が計算される。
【００６６】
ステップＳ７では、画像解析部１４０によって、各オブジェクトの特徴量の変化量に基づいて受精卵であるか否かが判定され、特徴量に顕著な変化があったラベルのオブジェクトが受精卵であると認識される。例えば、フォーカス面座標（Ｚ）に対する面積Ｓ及び輝度総和Ｖの変化に極小点が存在する場合、変化量が所定の閾値を超えた場合などに、その特徴量を持つオブジェクトを受精卵であると認識する。
【００６７】
ステップＳ８では、出力部１５０によって、画像解析部１４０において判断された受精卵の識別結果が出力される。出力部１５０から出力された判断結果は、操作盤７の表示パネル７２に表示され、画像解析部１４０によって受精卵であると判断されたオブジェクトに受精卵を示す識別表示がされる。
【００６８】
具体的な表示方法として、例えば、受精卵であることを示す記号を付加して表示したり、受精卵とそれ以外の異物とを異なる色相や輝度で表示したり、異物のみを塗りつぶして表示したり、異物の写り込みを除去した画像を表示する等により、受精卵とそれ以外の異物とを明瞭に判別して表示する、などのインターフェースが例示される。なお、出力部１５０から出力される上記のような判別データを、通信部６５を介して外部接続されるコンピュータ等に送信して、同様の画像を表示させたり、受精卵の生育状態を観察するための基礎データとして用いたりするように構成することができる。
【００６９】
これにより、観察者は、表示パネル７２に表示された画像や外部接続されたコンピュータ等のモニタに表示された画像を参照することにより、観察中の（または既に観察画像の取得を終了した）各画像に含まれるオブジェクトが受精卵であるか否かを直ちに判断することができる。また、このようにして受精卵とそれ以外の異物とが判別されたデータを用いることにより、受精卵の生育状態を効率的に観察することが可能になる。
【００７０】
次に、受精卵の製造方法について図１２を追加参照して概要説明する。まず、ステップＳ１１０において、受精卵を培地ドロップＤと共に培養容器１０（ディッシュ１１）内に注入し、この培養容器１０を受精卵の培養に適した環境条件に維持された培養室２内に収納して、当該環境条件の下で受精卵を培養する。なお、この環境条件は、制御ユニット６において培養室２内の温度や湿度、二酸化炭素濃度等が受精卵の培養環境に合わせて調節される。
【００７１】
ステップＳ１２０では、培養容器１０内の受精卵の観察として、前述した画像処理のステップＳ１〜Ｓ８（図１を参照）を実行して、培地ドロップＤごとに観察画像に写し込まれる複数のオブジェクトの中から受精卵を識別する。このとき培養容器１０（ディッシュ１１）内において、１個の培地ドロップＤに対して受精卵が各１個（又は複数個）ずつ識別される。
【００７２】
続いて、ステップＳ１３０では、培地ドロップＤごとに識別された複数の受精卵を所定の選別基準に基づいて選別する。受精卵の選別基準としては、卵割のタイミングや卵割球の形態等に基づいて受精卵のグレードが判定されて、この選別基準を満足する良好なものが選別される。例えば、良好な生育状態を経たものとして、卵内全ての卵細胞において卵割の起きたタイミングが同時期であるか否かに基づいて行われる。すなわち、正常な受精卵の卵割については、同じ世代の各細胞はほぼ同時期のタイミングで分裂し、胚内には同じ世代の細胞のみが存在する。一方、異常な受精卵の卵割については、同じ世代の細胞であっても分裂するタイミングがずれて、胚内には異なる世代の細胞が混在してしまう。
【００７３】
ステップＳ１４０では、上記選別した受精卵（胚盤胞と称される状態にまで成長した良好な受精卵）を採取して、例えばマイナス１９６℃の液体窒素の中で凍結保存する。そして、この受精卵（胚盤胞）は所定の周期のときに母体へ戻される（胚移植される）。なお、培養される受精卵は、ヒト、ウシ、ウマ、ブタ、マウス等の受精卵であってもよい。また、受精卵の保存は胚盤胞の状態で保存してもよいし、分割期（４細胞期胚、８細胞期胚）の状態で保存してもよい。
【００７４】
以上説明したように、本実施形態に係る画像処理プログラムＧＰ、この画像処理プログラムＧＰが実行されることにより構成される画像処理方法及び画像処理装置１００、並びに受精卵の製造方法によれば、受精卵の画像特徴量そのものを比較するのではなく、異なるフォーカス面から取得された複数の観察画像間における画像特徴量の変化に基づいて受精卵を判別するため、解像度の低い低倍画像からでも受精卵を正確に検出することができる。従って、広視野の観察範囲を利用して観察対象である受精卵を高速かつ頑健に認識することが可能になる。また、低倍観察によって観察範囲が広くなることで試料台を駆動する回数が減少するため、培養容器に無用な振動等を与えることもなく、受精卵に与えるダメージを最小限に抑えることができる。
【００７５】
なお、上述の実施形態では、最外輪郭の大きさＳ及び内輪帯の輝度総和Ｖ、の２つの画像特徴量に基づいて受精卵を認識する処理方法を例示したが、本発明はこの実施形態に限定されるものではなく、上記特徴量のうちのいずれか１つの特徴量に基づいて認識する方法や、他の特徴量（内部テクスチャの特徴量など）に基づいて認識する方法、更に他の特徴量を付加して３つ以上の複数の特徴量に基づいて認識する方法に適用しても、同様の効果を得ることができる。他の特徴量としては、受精卵には内部構造（卵細胞）が必ず存在するという属性を利用して、例えば内部構造のテクスチャ特徴量を用いてもよい。ここで、テクスチャ特徴量としては、すでに公知の種々の指標を用いることができ、その一例としては、(1)輝度値の分散、(2)微分の総和、(3)上下、左右、回転対称性（相関値）、(4)方向成分（ガボールフィルタなど）、(5)テクスチャ解析などである。
【００７６】
また、上述の実施形態において、低倍画像として観察倍率２倍程度の画像を例示しているが、本発明はこの実施形態に限定されるものではなく、例えば、観察対象の受精卵（透明帯、卵細胞、胚など）の大きさに応じて適宜な倍率を用いることができ、具体的な観察倍率の数値としては観察対象物などとの関係で適宜変更される。
【００７７】
また、上述の実施形態では、１個の培地ドロップＤに対して受精卵が１個注入され、培地ドロップＤの中から１個の受精卵を検出する構成を例示したが、本発明はこの実施形態に限定されるものではなく、培地ドロップＤに注入される複数の受精卵を全て検出するように構成してもよい。
【符号の説明】
【００７８】
ＢＳ 培養観察システム ＧＰ 画像処理プログラム
ａ 受精卵 ５ 観察ユニット
６ 制御ユニット ７ 操作盤
１０ 培養容器 １１ ディッシュ
５５ 顕微観察系 ５５ｃ 撮像装置
６１ ＣＰＵ ６２ ＲＯＭ
６３ ＲＡＭ ８０ 位相差顕微鏡
８４ 対物レンズ １００ 画像処理装置
１４０ 画像解析部 １５０ 出力部
【技術分野】
【０００１】
本発明は、受精卵観察において取得された観察画像から受精卵と異物とを自動判別する画像処理手段、及びこれを利用した受精卵の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生殖補助医療技術（ＡＲＴ）の発展に伴い、体外受精による受精卵を培養しながらその生育状態を観察することが行われている。受精卵などの培養物の状況を観察する装置の例として、培養顕微鏡が挙げられる（例えば、特許文献１を参照）。培養顕微鏡は、受精卵の培養に好適な環境を形成する培養装置（インベキュータ）と、培養装置に収容された培養容器内の受精卵の状態を顕微観察する顕微観察系とを備え、予め設定された一定時間ごとに受精卵の観察画像を取得し、ユーザが受精卵を目視により認識した上で、受精卵の生育状態の観察、記録、管理等を自動で行うことができるように構成される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００４−２２９６１９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
このような装置において、培養容器中の受精卵の生育状態を顕微観察する場合、培地の中から観察対象である受精卵を検出しなければならないが、培地には受精卵の他にもゴミやオイル粒等の異物が混入しているため、受精卵とそれ以外の異物とを判別して受精卵を認識するには、できる限り高倍率での顕微観察が必要になる。しかしながら、高倍観察になるほど解像度の高い画像を取得することができるものの、高倍観察になるにつれて観察視野（観察範囲）が狭くなり視野内に受精卵の像が写し込まれる確率が低くなるため、受精卵を検出するのに広視野領域において多数の高倍画像の撮影が必要になるとともに、その多数の画像の中から受精卵を識別する複雑な処理が必要となり、受精卵の検出に長時間を要するという問題があった。そのため、できる限り広視野を確保した低解像度の画像であっても受精卵を正確に認識することが可能な手段が求められている。
【０００５】
本発明は、上記のような課題に鑑みてなされたものであり、低倍観察において受精卵を高速且つ頑健に認識する手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明を例示する第１の態様に従えば、観察視野内に位置する受精卵を含む複数の物体と当該複数の物体の像を結像する観察光学系との光学的距離を変化させながら撮像装置により複数の物体を撮影した複数の観察画像を取得し、観察画像に写し込まれた複数の物体を抽出し、観察画像に含まれる物体ごとに、受精卵の属性に応じた画像の特徴量を算出し、複数の観察画像間における同一物体の画像の特徴量の変化に基づいて受精卵を認識することを特徴とする受精卵観察の画像処理方法が提供される。
【０００７】
本発明を例示する第２の態様に従えば、コンピュータにより読み取り可能であり、撮像装置により撮影されて画像を取得して画像処理する画像処理装置としてコンピュータを機能させるための画像処理プログラムであって、観察視野内に位置する受精卵を含む複数の物体と当該複数の物体の像を結像する観察光学系との光学的距離を変化させながら撮像装置により複数の物体を撮影した複数の観察画像を取得するステップと、観察画像に写し込まれた複数の物体を抽出するステップと、観察画像に含まれる物体ごとに、受精卵の属性に応じた画像の特徴量を算出するステップと、複数の観察画像間における同一物体の画像の特徴量の変化に基づいて受精卵を認識するステップと、物体に対する認識結果を外部に出力するステップとを、コンピュータに実現させることを特徴とする受精卵観察の画像処理プログラムが提供される。
【０００８】
本発明を例示する第３の態様に従えば、観察視野内に位置する受精卵を含む複数の物体と当該複数の物体の像を結像する観察光学系との光学的距離を変化させながら複数の物体を撮影する撮像装置と、光学的距離を変化させて撮像装置により撮影された複数の観察画像の各々から複数の物体を抽出し、複数の物体の中から受精卵を認識する画像解析部と、画像解析部により判断された認識結果を外部に出力する出力部とを備え、画像解析部が、観察画像に含まれる物体ごとに、受精卵の属性に応じた画像の特徴量を算出し、複数の観察画像間における同一物体の画像の特徴量の変化に基づいて受精卵を認識することを特徴とする受精卵観察の画像処理装置が提供される。
【０００９】
本発明を例示する第４の態様に従えば、所定の環境条件で受精卵を培養し、受精卵が存在する培養容器中から、上記構成の画像処理装置を用いて受精卵を識別することを特徴とする受精卵の製造方法が提供される。
【００１０】
本発明を例示する第５の態様に従えば、所定の環境条件で受精卵を培養し、受精卵が存在する培養容器中において、観察視野内に位置する受精卵を含む複数の物体と当該複数の物体の像を結像する観察光学系との光学的距離を変化させながら撮像装置により複数の物体を撮影した複数の観察画像を取得し、観察画像に写し込まれた複数の物体を抽出し、観察画像に含まれる物体ごとに、受精卵の属性に応じた画像の特徴量を算出し、複数の観察画像間における同一物体の画像の特徴量の変化に基づいて受精卵を認識することを特徴とする受精卵の製造方法が提供される。
【発明の効果】
【００１１】
このような受精卵観察の画像処理方法、画像処理プログラム及び画像処理装置、並びに受精卵の製造方法によれば、観察対象の受精卵を高速且つ頑健に認識することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】画像処理プログラムの概要を示すフローチャートである。
【図２】本発明の適用例として示す培養観察システムの概要構成図である。
【図３】上記培養観察システムのブロック図である。
【図４】（Ａ）は培養容器を示す平面図であり、（Ｂ）はディッシュを示す斜視図である。
【図５】位相差顕微鏡の概要構成図である。
【図６】受精卵とそれ以外の異物との特徴を説明するための図である。
【図７】フォーカス面を順次変更して受精卵を撮影した複数の観察画像を示す模式図である。
【図８】受精卵の輪郭部での回折現象を説明するための模式図である。
【図９】画像の特徴量算出の対象となる領域を説明するための模式図である。
【図１０】フォーカス面座標を変化させたときの面積Ｓ及び輝度総和Ｖの変化を表すグラフである。
【図１１】画像処理装置の概要構成を示すブロック図である。
【図１２】受精卵の製造方法の概要を示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を実施するための形態について、図面を参照しながら説明する。本実施形態に係る画像処理装置を適用したシステムの一例として、培養観察システムの概要構成図及びブロック図を、それぞれ図２及び図３に示す。
【００１４】
培養観察システムＢＳは、大別的には、筐体１の上部に設けられた培養室２と、複数の培養容器１０を収容保持する棚状のストッカー３と、培養容器１０内の試料を観察する観察ユニット５と、培養容器１０をストッカー３と観察ユニット５との間で搬送する搬送ユニット４と、システムの作動を統括的に制御する制御ユニット６と、画像表示装置を備えた操作盤７などから構成される。
【００１５】
培養室２は、培養環境を形成する部屋であり、環境変化やコンタミネーションを防止するためサンプル投入後は密閉状態に保持される。培養室２に付随して、培養室２内の温度を昇温・降温させる温度調整装置２１、湿度を調整する加湿器２２、ＣＯ２ガスやＮ２ガス等のガスを供給するガス供給装置２３、培養室２全体の環境を均一化させるための循環ファン２４、培養室２の温度や湿度、二酸化炭素濃度等を検出する環境センサ２５などが設けられている。各機器の作動は制御ユニット６により制御され、培養室２の温度や湿度、二酸化炭素濃度等により規定される培養環境が、操作盤７において設定された培養条件に合致した状態に維持される。
【００１６】
ストッカー３は、図２における紙面直行の前後方向、及び上下方向にそれぞれ複数に仕切られた棚状に形成されている。各棚にはそれぞれ固有の番地が設定されており、例えば前後方向をＡ〜Ｃ列、上下方向を１〜７段とした場合に、Ａ列５段の棚がＡ−５のように設定される。
【００１７】
培養容器１０は、培養物の種類や目的等に応じてフラスコやディッシュ、ウェルプレートなど適宜なものが選択され、本実施形態では、図４（Ａ）に示すように、透光性の材質で形成された直径約３５ｍｍの５つのディッシュ１１（容器１１ａ及び蓋１１ｂからなる）と、ディッシュ１１を保持するホルダ１２とを備えた構成を例示しており、図４（Ｂ）に示すように、培養物たる受精卵Ｊは、ｐＨに応じて変色するフェノールレッドなどのｐＨ指示薬が入った培地ドロップＡとともに各ディッシュ１１に注入される。ディッシュ１１の底面には、ピペット等により滴下された２０［μｌ］程度の培地ドロップＤが１〜複数個形成されており（図４（Ｂ）では３個を図示）、培地ドロップＤはディッシュ１１内において無色透明のミネラルオイルＯによって浸された状態となっている。それぞれの培地ドロップＤ内には、例えば対外受精のために同一母体から同時期に採卵された受精卵Ｊが１個（または複数個）ずつ挿入されている。また、培養容器１０にはコード番号が付与され、ストッカー３の指定番地に対応づけて収容される。
【００１８】
搬送ユニット４は、培養室２の内部に設けられて上下移動可能なＺステージ４１、前後移動可能なＹステージ４２、左右移動可能なＸステージ４３などからなり、Ｘステージ４３の先端側に培養容器１０を持ち上げ支持する支持アーム４５が設けられている。搬送ユニット４、支持アーム４５がストッカー３の全棚と観察ユニット５との間を移動可能な移動範囲を有して構成される。
【００１９】
観察ユニット５は、試料台１５の下側から試料を照明する第１照明部５１、顕微観察系の光軸に沿って試料台１５の上方から試料を照明する第２照明部５２、下方から試料を照明する第３照明部５３、試料のマクロ観察を行うマクロ観察系５４、試料のミクロ観察を行う顕微観察系５５、及び画像処理装置１００（図１１を参照）などから構成される。試料台１５は、透光性を有する材質で構成されるとともに観察領域に透明な窓部１６が設けられている。また、試料台１５は、制御ユニット６からの作動制御によりＸＹ方向（水平面内方向）およびＺ方向（上下方向）に移動可能な微細駆動ステージからなり、その上面部に載置された培養容器１０をＸＹ方向に移動させることにより、培養容器１０をマクロ観察系５４の光軸上へ挿入したり、顕微観察系５５の光軸上へ挿入したりすることが可能になっている。
【００２０】
第１照明部５１は、下部フレーム１ｂ側に設けられた面発光の光源からなり、試料台１５の下側から培養容器１０全体をバックライト照明する。第２照明部５２は、ＬＥＤ等の光源５２ａと、位相リングやコンデンサレンズ等からなる照明光学系５２ｃとを有して培養室２に設けられており、試料台１５の上方から顕微観察系５５の光軸に沿って培養容器１０中の試料を照明する。第３照明部５３は、それぞれ落射照明観察や蛍光観察に好適な波長の光を射出する複数のＬＥＤや水銀等の光源と、各光源から射出された光を顕微観察系５５の光軸に重畳させるビームスプリッタや蛍光フィルタ等からなる照明光学系とを有して、培養室２の下側に位置する下部フレーム１ｂ内に配設されており、試料台１５の下方から顕微観察系５５の光軸に沿って培養容器１０中の試料を照明する。
【００２１】
マクロ観察系５４は、観察光学系５４ａと、この観察光学系５４ａにより結像された試料の像を撮影するＣＣＤカメラ等の撮像装置５４ｃとを有し、第１照明部５１の上方に位置して培養室２内に設けられている。マクロ観察系５４は、第１照明部５１によりバックライト照明された培養容器１０の上方からの全体観察画像（マクロ画像）を撮影する。
【００２２】
顕微観察系５５は、対物レンズ８４や位相リング８２等（図５を参照）からなる観察光学系５５ａと、観察光学系５５ａにより結像された試料の像を撮影する冷却ＣＣＤ等の撮像装置５５ｃとを有し、下部フレーム１ｂの内部に配設されている。上記の第２照明部５２と顕微観察系５５とにより位相差観察用の顕微鏡８０が構成される。対物レンズ８４はレンズ駆動機構８７（図５を参照）により光軸に沿う方向（Ｚ方向）に往復移動可能に構成されており、対物レンズ８４（観察光学系５５ａ）と試料面との光軸方向の相対位置（光学的距離）を変化させることが可能になっている。レンズ駆動機構８７としては、例えばステッピングモータや、ピエゾアクチュエータ（ピエゾ素子）等が利用される。なお、本実施形態では、対物レンズ８４を光軸方向に移動させることにより試料面との相対位置を変化させているが、試料台１５を光軸方向に移動させたり、対物レンズ８４と試料台１５との両方を光軸方向に移動させてもよい。
【００２３】
また、対物レンズ８４は複数設けられるとともに、詳細図示を省略するレボルバやスライダなどの変位機構を用いて複数倍率に設定可能に構成されており、初期選択のレンズ設定に応じて、本実施形態では少なくとも低倍観察用（例えば２倍観察用）と高倍観察用（例えば１０倍観察用）との２種類の倍率の間で変倍可能なように切り換えられる。顕微観察系５５は、第２照明部５２により照明された試料の透過光による位相差画像や、第３照明部５３により照明されて試料が発する蛍光による蛍光画像など、培養容器１０内の試料を顕微鏡観察した顕微観察画像（ミクロ画像）を撮影する。なお、詳細は後述するが、本実施形態では受精卵の検出効率を向上させるために、低倍観察用の対物レンズを用いて観察することを特徴としている。
【００２４】
画像処理装置１００は、マクロ観察系５４の撮像装置５４ｃ及び顕微観察系５５の撮像装置５５ｃから入力された信号をＡ／Ｄ変換するとともに、各種の画像処理を施して全体観察画像または顕微観察画像の画像データを生成する。また、画像処理装置１００は、これらの観察画像（全体観察画像及び顕微観察画像）の画像データに対して画像解析を施し、画像中に存在するオブジェクトの抽出や、オブジェクトの画像特徴量の算出、受精卵の識別等の画像処理を行う。画像処理装置１００は、具体的には、次述する制御ユニット６のＲＯＭに記憶された画像処理プログラムが実行されることにより構築される。なお、この画像処理装置１００については、後に詳述する。
【００２５】
制御ユニット６は、処理を実行するＣＰＵ６１、培養観察システムＢＳの制御プログラムや制御データ等が設定記憶されたＲＯＭ６２、観察条件や画像データ等を一時記憶するＲＡＭ６３などを有し、培養観察システムＢＳの作動を制御する。そのため、図３に示すように、培養室２、搬送装置４、観察ユニット５、操作盤７の各構成機器が制御ユニット６に接続されている。ＲＡＭ６３には、観察プログラムに応じた培養室２の環境条件や、観察スケジュール、観察ユニット５における観察種別や観察位置、観察倍率等が設定され記憶される。また、ＲＡＭ６３には、観察ユニット５により撮影された画像データを記録する画像データ記憶領域が設けられ、培養容器１０のコード番号や撮影日時等を含むインデックス・データと画像データとが対応付けて記録される。
【００２６】
操作盤７には、キーボードやスイッチ等の入出力機器が設けられた操作パネル７１、操作画面や画像データ等を表示する表示パネル７２が設けられ、操作パネル７１において観察プログラムの設定や条件選択、動作指令等の入力が行われる。通信部６５は有線または無線の通信規格に準拠して構成されており、この通信部６５に外部接続されるコンピュータ等との間でデータの送受信が可能になっている。
【００２７】
このように概要構成される培養観察システムＢＳでは、操作盤７において設定された観察プログラムの設定条件に従い、ＣＰＵ６１がＲＯＭ６２に記憶された制御プログラムに基づいて各部の作動を制御するとともに、培養容器１０内の試料の撮影を自動的に実行する。すなわち、操作パネル７１に対するパネル操作（または通信部６５を介したリモート操作）によって観察プログラムがスタートされると、ＣＰＵ６１が、ＲＡＭ６３に記憶された環境条件の各条件値を読み込むとともに、環境センサ２５から入力される培養室２の環境状態を検出し、条件値と実測値との差異に応じて温度調整装置２１、加湿器２２、ガス供給装置２３、循環ファン２４等を作動させて、培養室２の温度や湿度、二酸化炭素濃度などの培養環境についてフィードバック制御が行われる。
【００２８】
また、ＣＰＵ６１は、ＲＡＭ６３に記憶された観察条件を読み込む、観察スケジュールに基づいて搬送ユニット４のＸ，Ｙ，Ｚステージ４１，４２，４３を作動させてストッカー３から観察対象の培養容器１０を観察ユニット５の試料台１５に搬送して、観察ユニット５による観察を開始させる。例えば、観察プログラムにおいて設定された観察がマクロ観察である場合には、搬送ユニット４によりストッカー３から搬送してきた培養容器１０をマクロ観察系５４の光軸上に位置決めして試料台１５に載置し、第１照明部５１の光源を点灯させて、バックライト照明された培養容器１０の上方から撮像装置５４ｃにより全体観察像を撮影する。撮像装置５４ｃから制御ユニット６に入力された信号は、画像処理装置１００により処理されて全体観察画像が生成され、その画像データが撮影日時等のインデックス・データなどとともにＲＡＭ６３の画像データ記憶領域に記憶される。
【００２９】
また、観察プログラムにおいて設定された観察が、培養容器１０内の特定位置の試料のミクロ観察である場合には、搬送ユニット４により搬送してきた培養容器１０内の特定位置を顕微観察系５５の光軸上に位置決めして試料台１５に載置し、第２照明部５２または第３照明部５３の光源を点灯させて、透過照明、落射照明、蛍光による顕微観察像を撮像装置５５ｃに撮影させる。撮像装置５５ｃにより撮影されて制御ユニット６に入力された信号は、画像処理装置１００により処理されて顕微観察画像（位相差画像、蛍光画像等）が生成され、その画像データが撮影日時等のインデックス・データなどとともにＲＡＭ６３の画像データ記憶領域に記憶される。
【００３０】
ＣＰＵ６１は、上記のような全体観察像の撮影や顕微観察像の撮影を、観察プログラムに設定された観察スケジュールに基づいて順次実行する。ＲＡＭ６３に記憶された画像データは、操作パネル７１から入力される画像表示指令に応じてＲＡＭ６３から読み出され、例えば指定時刻の全体観察画像や顕微観察画像、画像解析の解析結果などが表示パネル７２に表示される。
【００３１】
続いて、このように構成される培養観察システムＢＳにおいて、第２照明部５２と顕微観察系５５とにより構成される位相差顕微鏡８０について概要説明する。ここで、図５は位相差顕微鏡８０の構成を示す模式図である。位相差顕微鏡８０は、第２照明部５２において培養室２内に設けられた光源５２ａ及び照明光学系５２ｃと、顕微観察系５５において下部フレーム１ｂ内に設けられた観察光学系５５ａ及び撮像装置５５ｃとを有して構成される。
【００３２】
照明光学系５２ｃは、光源側から順に、コレクタレンズ８１、輪帯絞り８２及びコンデンサレンズ８３を備えている。観察光学系５５ａは、光源側から順に、対物レンズ８４、位相リング８５及び結像レンズ８６を備えている。
【００３３】
位相差顕微鏡８０において、光源５２ａから射出された照明光は、コレクタレンズ８１により略平行光束に変換され、輪帯形状（リング形状）のスリットが設けられた輪帯絞り８２に入射する。輪帯絞り８２のスリットを通過した光は、コンデンサレンズ８３によって集光され、試料台１５に載置された培養容器１０（ディッシュ１１）内の試料に照射される。
【００３４】
試料に照射された照明光は、試料を通過する直接光と、位相物体である試料により回折される回折光とに分かれる。この回折現象は屈折率に変化のある部位で発生するため、当該回折光は、受精卵Ｊと培地ドロップＤとの境界部分、受精卵Ｊの内部構造等、の位相物体（受精卵Ｊ）の形状情報を含んでおり、この回折により照明光に対して位相が１／４波長だけ遅れることになる。これら直接光及び回折光は対物レンズ８４により集光されて、輪帯絞り８２と光学的に共役な位置に配置された位相リング８５に入射する。
【００３５】
位相リング８５に入射する光のうち直接光は、輪帯絞り８２のスリットとほぼ同じ形状（リング状）に形成された位相板８５ａに入射して、位相板８５ａによって光の一部が吸収されて光量が弱められるとともに、位相が照明光の１／４波長だけずらされる。一方、位相リング８５に入射する光のうち回折光は、位相板８５ａ以外の部分をそのまま透過する。位相リング８５を通過した直接光及び回折光は結像レンズ８６により結像されて、撮像装置５５ｃの撮像面上で干渉する。このとき、直接光の位相は位相板８５ａによって１／４波長だけずれているため、直接光と回折光との位相差は１／２波長もしくは０になっており、その干渉によって位相の変化を光の明暗として可視化される。これにより、撮像装置５５ｃの撮像面上には明暗のコントラストがついた試料（受精卵Ｊ）の拡大像が形成され、撮像装置５５ｃにより撮影されることになる。
【００３６】
このとき、上述したように、対物レンズ８４はレンズ駆動機構８７によって光軸に沿った方向（Ｚ方向）に往復移動可能であり、試料と対物レンズ８４（観察光学系５５ａ）との相対位置（光学的距離）が変化するようになっている。これに対し、撮像装置５５ｃは試料の撮影を連続的に行うため、対物レンズ８４の移動に応じてコントラストが変化する複数の画像を所定の撮像ピッチで撮影することができる。これにより、１つの試料に対して異なるフォーカス面から取得された複数の観察画像を得ることができる。
【００３７】
ここで、撮像装置５５ｃはＣＣＤやＣＭＯＳ等の撮像素子を搭載しており、撮像素子の撮像面上に形成された試料の拡大像を撮像して得られた画像信号を画像処理装置１００へ出力する。また、画像処理装置１００には、撮像装置５５ｃからの画像信号の他に、試料台（微細駆動ステージ）１５に内蔵されたエンコーダ１５ａ（図１０を参照）及びレンズ駆動機構８７のコントローラに内蔵されたセンサー８７ａ（図１０を参照）からの位置検出信号が入力される。そのため、試料を撮像したときの試料台１５の位置（Ｘ，Ｙ方向位置）と対物レンズ８４の位置（Ｚ方向位置）とを知ることができる。
【００３８】
以上のように構成される培養観察システムＢＳにおいて、画像処理装置１００は、培養容器１０内における受精卵の生育状態等の観察を実行するため、観察画像から観察対象となる受精卵とそれ以外のゴミや気泡等の異物（非対象物）とを判別して、受精卵を認識する機能を備えている。
【００３９】
ここで、培地ドロップＤ内の混入物は、ゴミ（培地の残りかす）、オイル粒（ディッシュ１１内に充填されるミネラルオイルＯが培地に入り込んだもの）、及び気泡に大別される。ここで、図６にも示すように、受精卵、ゴミ、オイル粒、及び気泡の各々は次のような特徴を持っている。
【００４０】
（受精卵の特徴）
受精卵は、その輪郭部に膜（「透明帯」と称する）が存在する、外形が球形状を有している、輪郭内部に内部構造（卵細胞）が存在している、という特徴を持つ。
【００４１】
（ゴミの特徴）
ゴミは、その輪郭部に透明帯が存在しない、位相差画像では輪郭部にハロが現れる、輪郭内部の構造は不定である、という特徴を持つ。
【００４２】
（オイル粒、気泡の特徴）
オイル粒及び気泡は、その輪郭部に透明帯が存在しない、位相差画像では濃淡が強めにでる、外形が球形状や楕円形状である、輪郭内部の構造が少ない、という特徴を持つ。
【００４３】
このように受精卵は最外輪郭を形成する透明帯を持つという属性を有しており、対物レンズ８４を光軸方向に駆動させて、顕微観察（位相差観察）によって異なるフォーカス面の観察画像を撮影したとき、そのフォーカス面のＺ位置によっては受精卵の輪郭部で屈折率の変化がほとんど生じずに明暗のコントラストとして現れない画像、すなわち透明体（及びその輪郭部）が視認できない画像が得られる。
【００４４】
これについて、図７及び図８を追加参照して簡単に説明する。なお、図７はフォーカス面を順次変更して撮影した複数の観察画像を示す模式図であり、図８は受精卵の輪郭部での回折現象を説明するための模式図である。なお、これらの図においてはＺ軸がフォーカス面座標と一致する。位相差観察における回折現象は、前述したように屈折率変化のある部位、例えば、受精卵（位相物体）と培地ドロップＤとの境界部分や、受精卵の内部構造の部分で発生する。ここで図８に示すように、受精卵Ｊをほぼ球形として考えた場合、受精卵Ｊの輪郭部（透明帯の膜部分）において、球の中心Ｘを通る基準のフォーカス面（例えばＺ＝０）では、輪郭部が垂直方向成分となるため、屈折率変化（回折現象）がほとんどなく、明暗のコントラストが生じない。その結果、図７に示すように、透明帯（及びその輪郭部）の像が見かけ上消失することになる。一方、フォーカス面を上下（例えばＺ＝±ΔＺ）に振ると、輪郭部での屈折率変化によって回折光を生じ、透明帯（及びその輪郭部）が明暗のコントラストが付いた像として見えることになる。これに対して、ゴミやオイル粒等の異物では透明帯を持たず、輪郭部での屈折率も一様に高く安定しているため、フォーカス面のＺ位置によらず常に輪郭部が写し込まれることになる。
【００４５】
そのため、異なるフォーカス面から取得された複数の観察画像間において透明帯の像の出没を検出することで受精卵を認識することとする。ここで、観察画像において受精卵の透明帯が出現するときは、当然ながら透明帯の外側の輪郭が最外輪郭となって面積が相対的に大きくなるとともに、その最外輪郭の内側（すなわち、透明帯）の輝度が相対的に高くなる。一方、透明帯が画像から消失するときには、内部構造（図８においては卵細胞Ｃ）の輪郭が最外輪郭となって面積が相対的に小さくなるとともに、その最外輪郭の内側（卵細胞）の輝度が相対的に低くなる。そこで、最外輪郭の大きさ及びその内側の輝度を受精卵固有の特徴量として設定し、フォーカス面を振ったときの特徴量の変化に基づいて受精卵を識別する。
【００４６】
本実施形態において、画像処理装置１００による受精卵観察の画像処理方法は、異なるフォーカス面の複数の観察画像を取得し、各観察画像に写し込まれる物体（オブジェクト）に対して受精卵固有の属性に基づく画像特徴量（以下に詳述する、I．最外輪郭の大きさ、II．内輪帯の輝度総和）を算出し、観察画像に応じて画像特徴量が変化（すなわち透明帯の像が出没）する物体を受精卵であると認識するように構成される。それでは、以下にこの画像処理方法について基本的な概念から説明する、なお、以降の説明では、第２照明部５２及び顕微観察系５５等によって構成される位相差顕微鏡８０によって撮影される位相差画像(顕微観察画像)に基づいて受精卵の観察を行う場合を例示する。
【００４７】
（オブジェクトの抽出）
まず、撮像装置５５ｃにより撮影された異なるフォーカス面となる複数の観察画像（位相差画像）に対して、例えば分散フィルタまたはSnakesやLevel Set法などといった動的輪郭抽出手法を適用して、観察画像内に含まれる物体（受精卵及び異物の領域）の最外輪郭を抽出し、その輪郭に囲まれた閉じた領域をオブジェクトとして抽出してセグメンテーションを行う。こうしてセグメント化された各オブジェクトに対して、個々のオブジェクトを区別可能なように固有の標識としてラベルを割り当てる。なお、フォーカス面を振った複数の観察画像においては、同一のオブジェクトが相互に写し込まれているため、観察画像間で同一性のあるオブジェクトについては同一のラベルを付与する対応付けがなされる。
【００４８】
（特徴量算出）
ラベリング処理を施した各オブジェクトに対し、受精卵の属性に基づく画像の特徴量として、I．最外輪郭の大きさ、II．内輪帯部分の輝度総和、を計算する。なお、各オブジェクトの特徴量は観察画像単位で計算され、同一のオブジェクトであっても１つの観察画像に対して各特徴量が１つずつ計算される。なお、図９に上記の特徴量算出の対象となる部分を説明するための模式図を示す。
【００４９】
I．最外輪郭の大きさ
オブジェクトの最外輪郭の大きさとして、オブジェクト領域の面積、すなわち最外輪郭内部の面積Ｓを算出する（図９（Ａ）に斜線で示す部分の面積）。
【００５０】
II．内輪帯の輝度総和
観察画像（元画像）において、オブジェクトの最外輪郭内側に輪帯部分（「内輪帯」と称する）の領域（図９（Ｂ）に斜線で示す領域）を設定し、この内輪帯の輝度値（例えば、8ビット階調の場合に0〜255）の総和である輝度総和Ｖを算出する。例えば、オブジェクトが受精卵である場合には、内輪帯の部分が透明帯にほぼ一致し、透明帯の輝度値の総和を算出することになる。内輪帯の幅としては、過去のサンプリングデータ等から既知である受精卵の透明帯の幅に相当する大きさを、観察倍率等の画像取得条件に応じて設定する（例えば、数ピクセル分の幅）。なお、各オブジェクトの画像に対して収縮処理を施したマスク画像を生成し、原画像とマスク画像との差分画像の部分を内輪帯部分として特定してもよい。
【００５１】
以上の２つの特徴量は、ラベリングされたオブジェクトごとに求められ、これを基に複数のオブジェクトの中から受精卵を決定する。
【００５２】
（受精卵の識別）
受精卵候補となる各オブジェクトについて、複数の観察画像に対する特徴量の変化を計算する。各オブジェクトはフォーカス位置の異なる複数の観察画像の各々に写り込んでいるため、各オブジェクトに対して画像の特徴量となる面積Ｓ及び輝度総和Ｖは観察画像の枚数に対応する個数だけ取得されており、これに基づいて複数の観察画像間の同一オブジェクトについての特徴量変化を計算する。
【００５３】
ここで、受精卵の画像の特徴量変化の一例として、前述の図７の状態においてフォーカス面のＺ位置を変化させたときの面積Ｓ及び輝度総和Ｖの変化を表すグラフを図１０に示している。前述したように、フォーカス面のＺ位置を変化させて受精卵の観察画像を複数取得した場合、受精卵の持つ透明帯の像が（見た目上）一時的に消失する画像が得られることを考えると、透明帯が写し込まれていない画像に基づいて受精卵の画像の特徴量を算出すると、この特徴量である面積Ｓ及び輝度総和Ｖの値は相対的に小さな値となる。つまり、透明帯（及びその輪郭）が消失することで、画像に写る最外輪郭が内部構造（卵細胞Ｃ）の輪郭になるため、面積Ｓが減少するとともに、卵細胞Ｃが持つ構造により輝度総和Ｖも低下することになる。一方、ゴミ、オイル粒、気泡などの異物については透明帯を持たず、輪郭部での屈折率も一様に高く安定しているため、フォーカス面のＺ位置によらず常に一定の最外輪郭を写し込めるため、画像の特徴量はほとんど変化することがない。そのため、図１０（Ａ），（Ｂ）に示すように、複数の観察画像間において面積Ｓ及び輝度総和Ｓが変化するオブジェクト、より詳細には、面積Ｓ及び輝度総和Ｖが一度小さくなってから再び大きくなるように（極小点を持つように）変化するオブジェクトを受精卵であると認識する。
【００５４】
このような受精卵の判別手法（画像処理方法）では、解像度の高い高倍画像から画像特徴量を細かく数値化してこの特徴量そのものを比較するのではなく、異なるフォーカス面から取得した複数の観察画像間における画像特徴量の変化に基づいて受精卵を判別する構成であり、解像度の低い低倍画像からでも画像特徴量の顕著な変化は捉えることが可能であるため、受精卵の検出を広範囲な観察視野において高速に行うことができる。
【００５５】
なお、ゴミ等の異物の像であってもフォーカス面によっては画像の特徴量が多少変化する場合（例えば、異物が楕円球状の外形を持つ場合の面積Ｓ）も考えられるため、特徴量の変化量に対して予め所定の閾値を設定しておき、この閾値未満のオブジェクトをリジェクトするようにしてもよい。また、図７等では、基準フォーカス面（Ｚ＝０）に対して撮像ピッチ（サンプリング間隔）としてフォーカス方向にΔＺだけ上下に振って観察画像を取得した場合を例示しているが、更に複数の観察画像を連続的に取得するものであってもよい。
【００５６】
さらに、ここで用いられる対物レンズ８４の条件としては、一般的な動物由来の受精卵の大きさ（例えば、人間の受精卵の場合には直径で約１００[μｍ]程度）を考慮すると、焦点深度の浅い（ＮＡ＝０．２以上）光学レンズを適用させて、受精卵の透明帯を見た目上消失させる現象を起きやすくさせることが好ましい。
【００５７】
次に、培養観察システムＢＳの画像処理装置１００において実行される画像解析の具体的なアプリケーションについて図１及び図１１を併せて参照しながら説明する。ここで、図１は受精卵観察の画像処理プログラムＧＰにおける処理の概要を示すフローチャート、図１１は受精卵観察の画像処理を実行する画像処理装置１００の概要構成を示すブロック図である。
【００５８】
画像処理装置１００は、試料台１５及びレンズ駆動機構８７等の作動を制御する駆動制御部１１０と、撮像装置５５ｃにより撮影された観察画像を取得して記憶する画像記憶部１２０と、観察画像に写し込まれたオブジェクトごとに算出される画像の特徴量を記憶する特徴量記憶部１３０と、観察画像を解析して観察画像に写し込まれた複数のオブジェクトの中から受精卵を認識する画像解析部１４０と、画像解析部１４０により解析された判断結果を外部に出力する出力部１５０とを備え、画像解析部１４０により判断された受精卵であるか否かの判断結果を、例えば表示パネル７２に出力して表示させるように構成される。画像処理装置１００は、ＲＯＭ６２に予め設定記憶された画像処理プログラムＧＰがＣＰＵ６１に読み込まれ、ＣＰＵ６１によって画像処理プログラムＧＰに基づく処理が順次実行されるように構成される。
【００５９】
記述したように、培養観察システムＢＳでは、観察プログラムにおいて設定された観察条件に従って、所定時間ごとに指定された培養容器１０内の受精卵観察が行われる。具体的に、ＣＰＵ６１は、搬送ユニット４の各ステージ４１，４２，４３を作動させてストッカー３から観察対象の培養容器１０を観察ユニット５に搬送（本実施形態では、顕微観察系５５の光軸上に配置）する。
【００６０】
画像処理装置１００は、先ず始めにステップＳ１として、顕微観察系５５の撮像装置５５ｃによりディッシュ１１内の所望の培地ドロップＤの観察領域を撮像するために、駆動制御部１１０によって、試料台１５を面内方向（Ｘ，Ｙ方向）に駆動させる。ここで、低倍観察用（２倍観察用）の対物レンズによる視野サイズは培地ドロップ１個分のサイズよりも小さく、培地ドロップＤ１個分の視野をカバーするための必要な撮像枚数としては、例えば２×２〜３×３程度であるため、試料台１５をＸ，Ｙ方向に所定の移動ピッチでステップ状に駆動させて、試料（培地ドロップＤ）と対物レンズ８４との位置決めを行う。
【００６１】
ステップＳ２では、駆動制御部１１０によって、レンズ駆動機構８７を駆動させて対物レンズ８４を光軸方向に沿って移動させながら、撮像装置５５ｃに所定の撮像ピッチで位相差画像（観察画像）を撮影させる。なお、対物レンズ８４を往復移動させて撮像装置５５ｃにより多数の観察画像を取得したり、連続的に撮影して動画として取得するものでもよいが、一般的な受精卵の大きさから撮像位置を予め設定しておき、受精卵を識別するために必要な枚数（本実施形態では３枚）だけを取得するものでもよい。例えば、受精卵が自重でディッシュ１１の底面まで沈んでいるときには、ディッシュ１１の底面から既知の受精卵の大きさの半分（受精卵を球と仮定したときの半径値に相当する）だけ上方の位置に基準フォーカス面（Ｚ＝０）を設定し、この基準フォーカス面と、そこから撮像ピッチとして受精卵の大きさの１／４（受精卵の大きさ等によって任意に設定可）だけ上下に振った位置（すなわち、Ｚ＝±ΔＺの位置）との３か所でのみ撮影を行うものでもよい。
【００６２】
ステップＳ３では、撮像装置５５ｃから取得した複数の観察画像が、試料台１５のリニアエンコーダ１５ａやレンズ駆動機構８７のセンサー８７ａから出力される当該撮像が行われたときの位置情報とともに、培養容器１０のコード番号や観察位置、観察時刻などのインデックス・データと対応付けられて画像記憶部１２０に保存される。
【００６３】
ステップＳ４では、画像解析部１４０によって、画像記憶部１２０に記憶された各観察画像に対し、例えば、分散フィルタを施したのち二値化する手法や、動的輪郭抽出手法（SnakesやLevel Set法）などの最外輪郭抽出処理が実行され、各観察画像内に含まれるオブジェクトの最も外側の輪郭が抽出される。また、このように最外輪郭が抽出された各オブジェクトに対してラベリングが施され、複数の観察画像間で同一性があると判断されたオブジェクトに対しては同一のラベルを付与することによって対応付けがなされる。
【００６４】
ステップＳ５では、画像解析部１４０によって、各オブジェクトに対して観察画像ごとに、最外輪郭の大きさ（面積Ｓ）、及び内輪帯の輝度総和Ｖがそれぞれ算出される。特徴量記憶部１２０には、オブジェクトごとに割り当てたラベルと、画像解析部１４０により算出された画像の特徴量（面積Ｓ及び輝度総和Ｖ）とが対応付けられた状態で記憶される。
【００６５】
ステップＳ６では、画像解析部１４０によって、各オブジェクトに対して複数の観察画像間における最外輪郭の大きさＳ及び内輪帯部分の輝度総和Ｖの変化量が計算される。
【００６６】
ステップＳ７では、画像解析部１４０によって、各オブジェクトの特徴量の変化量に基づいて受精卵であるか否かが判定され、特徴量に顕著な変化があったラベルのオブジェクトが受精卵であると認識される。例えば、フォーカス面座標（Ｚ）に対する面積Ｓ及び輝度総和Ｖの変化に極小点が存在する場合、変化量が所定の閾値を超えた場合などに、その特徴量を持つオブジェクトを受精卵であると認識する。
【００６７】
ステップＳ８では、出力部１５０によって、画像解析部１４０において判断された受精卵の識別結果が出力される。出力部１５０から出力された判断結果は、操作盤７の表示パネル７２に表示され、画像解析部１４０によって受精卵であると判断されたオブジェクトに受精卵を示す識別表示がされる。
【００６８】
具体的な表示方法として、例えば、受精卵であることを示す記号を付加して表示したり、受精卵とそれ以外の異物とを異なる色相や輝度で表示したり、異物のみを塗りつぶして表示したり、異物の写り込みを除去した画像を表示する等により、受精卵とそれ以外の異物とを明瞭に判別して表示する、などのインターフェースが例示される。なお、出力部１５０から出力される上記のような判別データを、通信部６５を介して外部接続されるコンピュータ等に送信して、同様の画像を表示させたり、受精卵の生育状態を観察するための基礎データとして用いたりするように構成することができる。
【００６９】
これにより、観察者は、表示パネル７２に表示された画像や外部接続されたコンピュータ等のモニタに表示された画像を参照することにより、観察中の（または既に観察画像の取得を終了した）各画像に含まれるオブジェクトが受精卵であるか否かを直ちに判断することができる。また、このようにして受精卵とそれ以外の異物とが判別されたデータを用いることにより、受精卵の生育状態を効率的に観察することが可能になる。
【００７０】
次に、受精卵の製造方法について図１２を追加参照して概要説明する。まず、ステップＳ１１０において、受精卵を培地ドロップＤと共に培養容器１０（ディッシュ１１）内に注入し、この培養容器１０を受精卵の培養に適した環境条件に維持された培養室２内に収納して、当該環境条件の下で受精卵を培養する。なお、この環境条件は、制御ユニット６において培養室２内の温度や湿度、二酸化炭素濃度等が受精卵の培養環境に合わせて調節される。
【００７１】
ステップＳ１２０では、培養容器１０内の受精卵の観察として、前述した画像処理のステップＳ１〜Ｓ８（図１を参照）を実行して、培地ドロップＤごとに観察画像に写し込まれる複数のオブジェクトの中から受精卵を識別する。このとき培養容器１０（ディッシュ１１）内において、１個の培地ドロップＤに対して受精卵が各１個（又は複数個）ずつ識別される。
【００７２】
続いて、ステップＳ１３０では、培地ドロップＤごとに識別された複数の受精卵を所定の選別基準に基づいて選別する。受精卵の選別基準としては、卵割のタイミングや卵割球の形態等に基づいて受精卵のグレードが判定されて、この選別基準を満足する良好なものが選別される。例えば、良好な生育状態を経たものとして、卵内全ての卵細胞において卵割の起きたタイミングが同時期であるか否かに基づいて行われる。すなわち、正常な受精卵の卵割については、同じ世代の各細胞はほぼ同時期のタイミングで分裂し、胚内には同じ世代の細胞のみが存在する。一方、異常な受精卵の卵割については、同じ世代の細胞であっても分裂するタイミングがずれて、胚内には異なる世代の細胞が混在してしまう。
【００７３】
ステップＳ１４０では、上記選別した受精卵（胚盤胞と称される状態にまで成長した良好な受精卵）を採取して、例えばマイナス１９６℃の液体窒素の中で凍結保存する。そして、この受精卵（胚盤胞）は所定の周期のときに母体へ戻される（胚移植される）。なお、培養される受精卵は、ヒト、ウシ、ウマ、ブタ、マウス等の受精卵であってもよい。また、受精卵の保存は胚盤胞の状態で保存してもよいし、分割期（４細胞期胚、８細胞期胚）の状態で保存してもよい。
【００７４】
以上説明したように、本実施形態に係る画像処理プログラムＧＰ、この画像処理プログラムＧＰが実行されることにより構成される画像処理方法及び画像処理装置１００、並びに受精卵の製造方法によれば、受精卵の画像特徴量そのものを比較するのではなく、異なるフォーカス面から取得された複数の観察画像間における画像特徴量の変化に基づいて受精卵を判別するため、解像度の低い低倍画像からでも受精卵を正確に検出することができる。従って、広視野の観察範囲を利用して観察対象である受精卵を高速かつ頑健に認識することが可能になる。また、低倍観察によって観察範囲が広くなることで試料台を駆動する回数が減少するため、培養容器に無用な振動等を与えることもなく、受精卵に与えるダメージを最小限に抑えることができる。
【００７５】
なお、上述の実施形態では、最外輪郭の大きさＳ及び内輪帯の輝度総和Ｖ、の２つの画像特徴量に基づいて受精卵を認識する処理方法を例示したが、本発明はこの実施形態に限定されるものではなく、上記特徴量のうちのいずれか１つの特徴量に基づいて認識する方法や、他の特徴量（内部テクスチャの特徴量など）に基づいて認識する方法、更に他の特徴量を付加して３つ以上の複数の特徴量に基づいて認識する方法に適用しても、同様の効果を得ることができる。他の特徴量としては、受精卵には内部構造（卵細胞）が必ず存在するという属性を利用して、例えば内部構造のテクスチャ特徴量を用いてもよい。ここで、テクスチャ特徴量としては、すでに公知の種々の指標を用いることができ、その一例としては、(1)輝度値の分散、(2)微分の総和、(3)上下、左右、回転対称性（相関値）、(4)方向成分（ガボールフィルタなど）、(5)テクスチャ解析などである。
【００７６】
また、上述の実施形態において、低倍画像として観察倍率２倍程度の画像を例示しているが、本発明はこの実施形態に限定されるものではなく、例えば、観察対象の受精卵（透明帯、卵細胞、胚など）の大きさに応じて適宜な倍率を用いることができ、具体的な観察倍率の数値としては観察対象物などとの関係で適宜変更される。
【００７７】
また、上述の実施形態では、１個の培地ドロップＤに対して受精卵が１個注入され、培地ドロップＤの中から１個の受精卵を検出する構成を例示したが、本発明はこの実施形態に限定されるものではなく、培地ドロップＤに注入される複数の受精卵を全て検出するように構成してもよい。
【符号の説明】
【００７８】
ＢＳ 培養観察システム ＧＰ 画像処理プログラム
ａ 受精卵 ５ 観察ユニット
６ 制御ユニット ７ 操作盤
１０ 培養容器 １１ ディッシュ
５５ 顕微観察系 ５５ｃ 撮像装置
６１ ＣＰＵ ６２ ＲＯＭ
６３ ＲＡＭ ８０ 位相差顕微鏡
８４ 対物レンズ １００ 画像処理装置
１４０ 画像解析部 １５０ 出力部
【特許請求の範囲】
【請求項１】
観察視野内に位置する受精卵を含む複数の物体と前記複数の物体の像を結像する観察光学系との光学的距離を変化させながら撮像装置により前記複数の物体を撮影した複数の観察画像を取得し、
前記観察画像に写し込まれた前記複数の物体を抽出し、
前記観察画像に含まれる前記物体ごとに、受精卵の属性に応じた画像の特徴量を算出し、
前記複数の観察画像間における同一物体の画像の特徴量の変化に基づいて受精卵を認識することを特徴とする受精卵観察の画像処理方法。
【請求項２】
前記受精卵の属性が、受精卵の最外輪郭を形成する膜状の透明帯に関するものであって、
前記撮像装置が位相差観察によって得られる位相差画像を撮影するものであり、
光学的距離を変化させて前記撮像装置により撮影した前記複数の観察画像の中に、フォーカス面を前記受精卵の略中心に位置させた前記透明帯の写り込みのない観察画像を取得することにより、受精卵の画像の特徴量に変化を与えて、当該変化を持つ前記物体を受精卵であると認識することを特徴とする請求項１に記載の受精卵観察の画像処理方法。
【請求項３】
コンピュータにより読み取り可能であり、撮像装置により撮影されて画像を取得して画像処理する画像処理装置として前記コンピュータを機能させるための画像処理プログラムであって、
観察視野内に位置する受精卵を含む複数の物体と前記複数の物体の像を結像する観察光学系との光学的距離を変化させながら撮像装置により前記複数の物体を撮影した複数の観察画像を取得するステップと、
前記観察画像に写し込まれた前記複数の物体を抽出するステップと、
前記観察画像に含まれる前記物体ごとに、受精卵の属性に応じた画像の特徴量を算出するステップと、
前記複数の観察画像間における同一物体の画像の特徴量の変化に基づいて受精卵を認識するステップと、
前記物体に対する認識結果を外部に出力するステップとを、
前記コンピュータに実現させることを特徴とする受精卵観察の画像処理プログラム。
【請求項４】
前記受精卵の属性が、受精卵の最外輪郭を形成する膜状の透明帯に関するものであって、
前記撮像装置が位相差観察によって得られる位相差画像を撮影するものであり、
光学的距離を変化させて前記撮像装置により撮影した前記複数の観察画像の中に、フォーカス面を前記受精卵の略中心に位置させた前記透明帯の写り込みのない観察画像を取得することにより、受精卵の画像の特徴量に変化を与えて、当該変化を持つ前記物体を受精卵であると認識することを特徴とする請求項３に記載の受精卵観察の画像処理プログラム。
【請求項５】
観察視野内に位置する受精卵を含む複数の物体と前記複数の物体の像を結像する観察光学系との光学的距離を変化させながら前記複数の物体を撮影する撮像装置と、
光学的距離を変化させて前記撮像装置により撮影された複数の観察画像の各々から前記複数の物体を抽出し、前記複数の物体の中から受精卵を認識する画像解析部と、
前記画像解析部により判断された認識結果を外部に出力する出力部とを備え、
前記画像解析部が、前記観察画像に含まれる前記物体ごとに、受精卵の属性に応じた画像の特徴量を算出し、前記複数の観察画像間における同一物体の画像の特徴量の変化に基づいて受精卵を認識することを特徴とする受精卵観察の画像処理装置。
【請求項６】
前記受精卵の属性が、受精卵の最外輪郭を形成する膜状の透明帯に関するものであって、
前記撮像装置が位相差観察によって得られる位相差画像を撮影するものであり、
光学的距離を変化させて前記撮像装置により撮影した前記複数の観察画像の中に、フォーカス面を前記受精卵の略中心に位置させた前記透明帯の写り込みのない観察画像を取得することにより、受精卵の画像の特徴量に変化を与えて、当該変化を持つ前記物体を受精卵であると認識することを特徴とする請求項５に記載の受精卵観察の画像処理装置。
【請求項７】
所定の環境条件で受精卵を培養し、
受精卵が存在する培養容器中から、請求項５又は６に記載の画像処理装置を用いて受精卵を識別することを特徴とする受精卵の製造方法。
【請求項８】
所定の環境条件で受精卵を培養し、
受精卵が存在する培養容器中において、観察視野内に位置する受精卵を含む複数の物体と前記複数の物体の像を結像する観察光学系との光学的距離を変化させながら撮像装置により前記複数の物体を撮影した複数の観察画像を取得し、
前記観察画像に写し込まれた前記複数の物体を抽出し、
前記観察画像に含まれる前記物体ごとに、受精卵の属性に応じた画像の特徴量を算出し、
前記複数の観察画像間における同一物体の画像の特徴量の変化に基づいて受精卵を認識することを特徴とする受精卵の製造方法。
【請求項９】
認識された受精卵を所定の選別基準に基づいて選別し、
選別された受精卵を前記培養容器中から採取して保存することを特徴とする請求項７又は８に記載の受精卵の製造方法。
【請求項１】
観察視野内に位置する受精卵を含む複数の物体と前記複数の物体の像を結像する観察光学系との光学的距離を変化させながら撮像装置により前記複数の物体を撮影した複数の観察画像を取得し、
前記観察画像に写し込まれた前記複数の物体を抽出し、
前記観察画像に含まれる前記物体ごとに、受精卵の属性に応じた画像の特徴量を算出し、
前記複数の観察画像間における同一物体の画像の特徴量の変化に基づいて受精卵を認識することを特徴とする受精卵観察の画像処理方法。
【請求項２】
前記受精卵の属性が、受精卵の最外輪郭を形成する膜状の透明帯に関するものであって、
前記撮像装置が位相差観察によって得られる位相差画像を撮影するものであり、
光学的距離を変化させて前記撮像装置により撮影した前記複数の観察画像の中に、フォーカス面を前記受精卵の略中心に位置させた前記透明帯の写り込みのない観察画像を取得することにより、受精卵の画像の特徴量に変化を与えて、当該変化を持つ前記物体を受精卵であると認識することを特徴とする請求項１に記載の受精卵観察の画像処理方法。
【請求項３】
コンピュータにより読み取り可能であり、撮像装置により撮影されて画像を取得して画像処理する画像処理装置として前記コンピュータを機能させるための画像処理プログラムであって、
観察視野内に位置する受精卵を含む複数の物体と前記複数の物体の像を結像する観察光学系との光学的距離を変化させながら撮像装置により前記複数の物体を撮影した複数の観察画像を取得するステップと、
前記観察画像に写し込まれた前記複数の物体を抽出するステップと、
前記観察画像に含まれる前記物体ごとに、受精卵の属性に応じた画像の特徴量を算出するステップと、
前記複数の観察画像間における同一物体の画像の特徴量の変化に基づいて受精卵を認識するステップと、
前記物体に対する認識結果を外部に出力するステップとを、
前記コンピュータに実現させることを特徴とする受精卵観察の画像処理プログラム。
【請求項４】
前記受精卵の属性が、受精卵の最外輪郭を形成する膜状の透明帯に関するものであって、
前記撮像装置が位相差観察によって得られる位相差画像を撮影するものであり、
光学的距離を変化させて前記撮像装置により撮影した前記複数の観察画像の中に、フォーカス面を前記受精卵の略中心に位置させた前記透明帯の写り込みのない観察画像を取得することにより、受精卵の画像の特徴量に変化を与えて、当該変化を持つ前記物体を受精卵であると認識することを特徴とする請求項３に記載の受精卵観察の画像処理プログラム。
【請求項５】
観察視野内に位置する受精卵を含む複数の物体と前記複数の物体の像を結像する観察光学系との光学的距離を変化させながら前記複数の物体を撮影する撮像装置と、
光学的距離を変化させて前記撮像装置により撮影された複数の観察画像の各々から前記複数の物体を抽出し、前記複数の物体の中から受精卵を認識する画像解析部と、
前記画像解析部により判断された認識結果を外部に出力する出力部とを備え、
前記画像解析部が、前記観察画像に含まれる前記物体ごとに、受精卵の属性に応じた画像の特徴量を算出し、前記複数の観察画像間における同一物体の画像の特徴量の変化に基づいて受精卵を認識することを特徴とする受精卵観察の画像処理装置。
【請求項６】
前記受精卵の属性が、受精卵の最外輪郭を形成する膜状の透明帯に関するものであって、
前記撮像装置が位相差観察によって得られる位相差画像を撮影するものであり、
光学的距離を変化させて前記撮像装置により撮影した前記複数の観察画像の中に、フォーカス面を前記受精卵の略中心に位置させた前記透明帯の写り込みのない観察画像を取得することにより、受精卵の画像の特徴量に変化を与えて、当該変化を持つ前記物体を受精卵であると認識することを特徴とする請求項５に記載の受精卵観察の画像処理装置。
【請求項７】
所定の環境条件で受精卵を培養し、
受精卵が存在する培養容器中から、請求項５又は６に記載の画像処理装置を用いて受精卵を識別することを特徴とする受精卵の製造方法。
【請求項８】
所定の環境条件で受精卵を培養し、
受精卵が存在する培養容器中において、観察視野内に位置する受精卵を含む複数の物体と前記複数の物体の像を結像する観察光学系との光学的距離を変化させながら撮像装置により前記複数の物体を撮影した複数の観察画像を取得し、
前記観察画像に写し込まれた前記複数の物体を抽出し、
前記観察画像に含まれる前記物体ごとに、受精卵の属性に応じた画像の特徴量を算出し、
前記複数の観察画像間における同一物体の画像の特徴量の変化に基づいて受精卵を認識することを特徴とする受精卵の製造方法。
【請求項９】
認識された受精卵を所定の選別基準に基づいて選別し、
選別された受精卵を前記培養容器中から採取して保存することを特徴とする請求項７又は８に記載の受精卵の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１２−３９９２９（Ｐ２０１２−３９９２９Ａ）
【公開日】平成２４年３月１日（２０１２．３．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１８３６０５（Ｐ２０１０−１８３６０５）
【出願日】平成２２年８月１９日（２０１０．８．１９）
【出願人】（０００００４１１２）株式会社ニコン (12,601)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年３月１日（２０１２．３．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月１９日（２０１０．８．１９）
【出願人】（０００００４１１２）株式会社ニコン (12,601)
【Ｆターム（参考）】
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