口腔ケア法及びシステム
本発明は、口のバイオフローラを評価する、および評価に従って塩基性アミノ酸を利用する適切な処置を提供する方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001] この出願は２００８年２月９日に出願された米国特許出願Ｎｏ．６１／０２７，４３７の利益を主張し、２００８年２月９日に出願された米国特許出願Ｎｏ．６１／０２７，４４２、ならびに全て２００８年２月８日に出願された米国特許出願Ｎｏ．６１／０２７，４３２；６１／０２７，４３１；６１／０２７，４２０；および６１／０２７，４３５の利益も主張し、その出願の内容を全て本明細書に援用する。
【０００２】
[0002] 技術分野
[0003] この発明は、口の中の齲食原性細菌およびアルギニン分解（ａｒｇｉｎｏｌｙｔｉｃ）細菌の相対的なレベルを、例えば、塩基性アミノ酸を遊離または塩の型で含む組成物を用いる歯科ケア計画の一部として測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
[0004] アルギニンおよび他の塩基性アミノ酸は口腔ケアにおける使用に関して提案されており、虫歯の形成および歯の過敏との戦いにおいて重要な利益を有すると考えられている。商業的に入手できるアルギニンに基づく練り歯磨きは、アルギニンおよび炭酸水素カルシウムを含むＣａｖｉＳｔａｔ（登録商標）を含むＤｅｎＣｌｕｄｅ（登録商標）およびＰｒｏＣｌｕｄｅ（登録商標）である。
【０００４】
[0005] 口の中のバイオフローラのタイプは、虫歯の発達において、および口の健康において一般に重要な役割を果たす。例えば、アルギニンの有益な作用における重要な因子は、アルギニンおよび他の塩基性アミノ酸が、齲食原性ではなく歯の上の、および口腔中での位置に関してＳ．ミュータンス（Ｓ． ｍｕｔａｎｓ）のような齲食原性細菌と競合する特定のタイプの細菌、例えばＳ．サングイス（Ｓ． ｓａｎｇｕｉｓ）により代謝され得ることであると仮定されてきた。アルギニン分解細菌はアルギニンおよび他の塩基性アミノ酸を用いてアンモニアを生成することができ、それによりそれらの環境のｐＨを上昇させ、一方齲食原性細菌は糖を代謝して乳酸を生成し、それはプラークのｐＨを低下させ歯を脱灰させる傾向があり、最終的には虫歯につながる。
【０００５】
[0006] 口の中のバイオフローラのタイプを監視する効率的な手段があれば、例えば最適な処置を決定するのに、および患者の処置の有効性を監視するのに有用であろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
[0007] 本発明は、口の中のバイオフローラを評価するための迅速かつ単純な方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
[0008] 第１態様において、本発明はプラークのアンモニア生成レベルを測定してアルギニン分解細菌の相対的な個体数を決定する。
[0009] 別の態様において、本発明はプラークの乳酸レベルを測定して齲食原性細菌の相対的な個体数を決定する。
【０００８】
[0010] 別の態様において、本発明はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、例えば定量的リアルタイムＰＣＲを用いて口の中の、例えばプラークまたは唾液中のバイオフローラを特性づける。
【０００９】
[0011] 別の例において、本発明は逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて口の中の、例えばプラークまたは唾液中のバイオフローラを特性づける。
[0012] 別の態様において、抗体プローブ、例えば蛍光抗体プローブを用いて口の中の、例えばプラークまたは唾液中のバイオフローラを特性づける。
【００１０】
[0013] 例えば、本発明は少なくとも１種類の齲食原性細菌、例えばＳ．ミュータンスおよび少なくとも１種類のアルギニン分解細菌、例えばＳ．サングイスのレベルを定量する。
【００１１】
[0014] 別の態様において、患者は前記の方法の１種類およびそれに従って定められた処置を用いて評価される。
[0015] 本発明の方法は、プラークの生態（ｅｃｏｌｏｇｙ）における損傷を与える可能性のある変化を検出するために、および歯に対する検出可能なまたは重要な脱灰または損傷が存在する前の矯正的な処置を可能にするために特に有用である。
【００１２】
[0016] 従って、本発明は口の健康を増進するための、例えば次のことのための方法を提供し：
ａ．齲食の形成を低減または抑制する、
ｂ．歯の脱灰を低減または抑制し、再石灰化を促進する、
ｃ．早期のエナメル質の病変の形成を処置、低減または抑制する、
ｄ．歯の過敏性を低減する、
ｅ．歯肉炎を低減または抑制する、
ｆ．口の中の潰瘍または切り傷の治癒を促進する、
ｇ．酸を産生する細菌のレベルを低減する、
ｈ．アルギニン分解細菌の相対的なレベルを増大させる、
ｉ．口腔中での微生物のバイオフィルムの形成を抑制する、
ｊ．糖負荷の後のプラークのｐＨを少なくともｐＨ５．５のレベルに上げる、および／または維持する、
ｋ．プラークの蓄積を低減する、
ｌ．口内乾燥を処置、緩和または低減する
ｍ．歯を白くする、
ｎ．例えば口の組織を経る全身感染の可能性を低減することにより、心血管の健康を含む全身の健康を増進する、
ｏ．歯を齲食原性細菌およびそれらの作用に対して免疫化する、
ｐ．歯および口腔を清潔にする、および／または
ｑ．歯の酸食を低減する、
それは例えば前記の方法のいずれかを用いる、口腔のバイオフローラを測定すること、および必要であれば、有効量の塩基性アミノ酸、例えばアルギニンまたはその塩を含む口腔ケア製品を投与することを含む。
【００１３】
[0017] 本発明はさらに、口腔のバイオフローラが、本発明に従う方法により測定される、高いレベルの齲食原性細菌および／または高いラクテートレベル、および／または低いレベルのアルギニン分解細菌および／または低いレベルのプラークのアンモニア生成を含む対象において口の健康を増進するための医薬の製造のための、遊離または塩の型の塩基性アミノ酸の使用を提供する。
【００１４】
[0018] 本発明はさらに、口腔を美容的に増進するための方法を提供し（ここでその美容的な増進は、例えば歯をより白くすることおよび／または口臭を低減することを含んでいてよい）、その方法は、本発明に従う方法を用いて口腔のバイオフローラを測定すること、およびもし必要であれば、高いレベルの齲食原性細菌および／または高いラクテートレベルの存在、および／または低いレベルのアルギニン分解細菌および／または低いレベルのプラークのアンモニア生成の存在により、遊離または塩の型の塩基性アミノ酸を含む口腔ケア製品を投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、純粋培養物および混合集団からのＡ．アクチノミセテムコミタンスの増幅を示す。
【図２】図２は、生きた、および死んだＡ．アクチノミセテムコミタンスの混合物からのＲＮＡの増幅を示す。
【図３】図３は、Ａ．アクチノミセテムコミタンスの純粋および混合培養物から増幅された生成物の融解ピーク分析を示す。
【図４】図４は、標準曲線ならびに既知の濃度の生存している、および死んだＡ．アクチノミセテムコミタンスの増幅から生成された標準曲線の線形回帰を図説する。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
プラークの代謝−アンモニアの生成
[0019] 歯のプラークの、アルギニンをアンモニアに変換する能力は、アルギニン分解活性のマーカーである。特定の細菌が糖類を酸に変換できるのとちょうど同じように、特定の細菌はアルギニンをアンモニアに変換する能力を有している。アルギニン分解性の種の相対濃度を増大させることは、これらの細菌は酸性条件を好み齲食の危険性を増大させる齲食原性細菌の増殖にとって好ましくない条件を作り出すため、有益である。アルギニンの毎日の使用は、糖の頻繁な消費が酸を酸性する細菌に有利である条件を作り出すのと類似した方式で、アルギニン分解細菌に有利であるプラーク生態における変化を作り出すことが期待される。アンモニアは酸を中和することができる塩基であり、中性のプラークｐＨを維持するのを助ける。中性のｐＨ条件は、非病原性細菌にとってより有利である。アンモニア生成の測定は、アルギニンをアンモニアに変換することができる全ての細菌からの寄与を測定する。これは、選ばれたアルギニン分解細菌の濃度を測定し代謝的に活性な（生きた）および不活性な（死んだ）細菌を識別しないリアルタイムＰＣＲ法（下記でさらに記述する）と対照的である。
【００１７】
[0020] アンモニア検出キットは、アンモニアの生成を測定するために、例えばＤｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ （Ｏｘｆｏｒｄ， ＣＴ）から商業的に入手することができる。定量および決定の原理は、アンモニアがアルファ−ケトグルタル酸および還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）と反応してＬ−グルタミンおよびＮＡＤＰを形成することが知られていることである。その反応は、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＬＤＨ）により触媒される。ＮＡＤＰＨの酸化による３４０ｎｍの吸光度の減少は、アンモニア濃度に比例する。プラーク試料は、予め定められた処理プロトコルの後に集められる。一部の適用において、プラークは歯の固定装置（ｒｅｔａｉｎｅｒ）に取り付けられたエナメル質またはＨＡＰ標本から集められる。別の適用において、プラークは直接歯から集められる。
【００１８】
乳酸レベルによるプラークの生態学（ｅｃｏｌｏｇｙ）
[0021] ちょうどアンモニアレベルの測定がアルギニン分解細菌のレベルを測定するための代用品として役立つように、乳酸は齲食原性細菌のレベルを測定するための代用品として役立つ。対象は、朝の口腔清掃をせずに、および前の晩から節食または飲むことをせずに得られたプラークを有する。彼らは１０％スクロース溶液で２分間ゆすぐ。８分後、歯の表面（複数）をひっかいてプラークを集める。プラーク試料を氷上で、予め重さを測定したチューブの中に集め、プラークの重量を決定する。分析には、氷で冷やした水を既知の量のプラーク試料に添加し、次いで試料を８０度Ｃに５分間加熱して細菌を殺し、全ての酸を放出させた後、試料を氷水中でさらに５分間冷却することが含まれる。次いで試料を遠心分離し、上清を濾過する。ラクテート濃度を、キャピラリー電気泳動を用いて測定する。
【００１９】
定量的リアルタイムＰＣＲによるプラークの生態学
[0022] 定量的リアルタイムＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）は、ＤＮＡを定量する非常に感度の高い手段である。ＤＮＡの量は存在する細菌の量に直接関係があるため、歯のプラークから単離した細菌のＤＮＡを細菌の総レベルを定量するのに用いる。リアルタイムＰＣＲは、政府組織、例えば疾病予防管理センター（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ）およびＦＤＡに、非常に強力で高感度の技法として認められている。多くの口腔細菌の既知のゲノム配列を利用して、プローブを、口腔細菌または特定の細菌、例えばＳ．ミュータンスもしくはＳ．サングイスの総レベルを検出するように設計する。プラークまたは唾液の試料から単離したＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応により増幅する。ＤＮＡの量は、ＰＣＲ反応のそれぞれのサイクルと共に指数関数的に増大する。蛍光性の報告分子（ｒｅｐｏｒｔ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）の使用により反応がリアルタイムで見守られるため、その技法は”リアルタイム”と呼ばれる。本発明の１態様において、報告分子としてＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎを用いる。この分子は、二本鎖ＤＮＡと連携すると強く蛍光を発する。定量は、蛍光の閾値を設定し、様々な濃度でのＤＮＡ標準を用いて、閾値に達するまでに必要なサイクル数を決定することにより達成される。より多くのＤＮＡが存在すれば、閾値に達するまでにより少ないＤＮＡサイクル数が必要である。市販のリアルタイムＰＣＲ器械は、多くの製造業者、例えばＲｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓから入手することができる。
【００２０】
[0023] プラークの試料を、既知の、および一定の表面積のエナメル質またはヒドロキシアパタイトの標本から集める。存在するＤＮＡの量はどれだけ多くプラークを集めるかに直接関係するため、プラークの採集の標準化は決定的に重要である。その２種類の量は有意に相関があるため、プラークの質量をリアルタイムＰＣＲにより測定する総細菌を標準化する手段として用いるのは不適切である。結果はｍｌあたりのμｇＤＮＡとして報告される。ＤＮＡ濃度またはＬｎ（ＤＮＡ濃度）について統計学を実施することができる。総細菌に関して、対象および処理を要因として用いて、２要因ＡＮＯＶＡを実施する。もし違いが９５％信頼度で検出されるなら、違いは有意であると考えられる。特定の細菌、例えばＳ．ミュータンスまたはＳ．サングイスに関して、総細菌を共変動として用いて２要因ＡＮＣＯＶＡを行う。総細菌個体数と関係がある特定の細菌の総量は、プラーク生態の健康状態のより適切なマーカーである。
【００２１】
[0024] 本発明の特定の態様において、Ｓ．ミュータンスを齲食原性に関するマーカーとして測定する。Ｓ．ミュータンスを選ぶのは、それが齲食の開始において関係している、十分に受け入れられている危険因子であるからである。他の酸を産生する細菌が齲食の過程に関わっている一方で、Ｓ．ミュータンスは齲食原性プロセスの開始および早いステージで特に重要な役割を果たしていることが知られている。本発明の１態様において、Ｓ．サングイスは高いレベルのアルギニン分解活性（アルギニンをアンモニアに変換する能力）を示すことが知られている細菌であるため、Ｓ．サングイスをより健康なプラーク生態への変化に関するマーカーとして選ぶ。
【００２２】
ＲＴ−ＰＣＲによるプラークの生態学
[0025] 逆転写ＰＣＲは、試料中のＲＮＡ転写産物を測定する。ＲＮＡを単離し、逆転写酵素を用いて転写産物をｃＤＮＡに変換し、ＰＣＲを用いてｃＤＮＡを増幅する。ＲＴ−ＰＣＲの利点は、口腔細菌の検出のためのＤＮＡに基づいた方法はそれらの種の生存度を決定できないことである。口腔細菌はバイオフィルム共同体（ｂｉｏｆｉｌｍ ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ）において最も頻繁に見つけられるため、殺した後長い期間の間、死んだ細菌のＤＮＡはバイオフィルムの構造の内部に保持され得る。他の方法、例えば蛍光に基づいた生存度アッセイ（Ｌｉｖｅ Ｄｅａｄ ｋｉｔ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）は、生物が傷ついた膜を有しているか否かを検出することができるが、特定の種を直接検出することはない。
【００２３】
[0026] 従って、逆転写リアルタイムＰＣＲは、複合的な共同体の内部に存在する口腔細菌の特定の種の生菌を定量するための方法である。ｍＲＮＡは比較的短い半減期を有しており、従って、最近活動している細菌を示す。我々は、伸長因子ｔｕｆに対する種特異的なプライマーを開発した。この遺伝子は増殖期、培地または環境条件により有意に制御されず、それにより検出される細菌の数へのスプリアス効果（ｓｐｕｒｉｏｕｓ ｅｆｆｅｃｔｓ）を最小限にする。アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス（Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）を我々の試験生物として用いることで、わずか２０％の存在する生物が生存可能であれば、生きた、およびＥｔＯＨで殺した細菌の混合された集団における生存度の差を検出することができる。加えて、その方法は、６種類までの異なる種の細菌を含む混合された種の集団中のＡ．アクチノミセテムコミタンスの存在の信頼できる同定を可能にする。計算された細菌の濃度は、同じ培養物に関するＯＤ６１０に基づいて見積もられた値に密接に相関する（ｒ＝０．９６、１％未満の差）。このアッセイは、口腔の複合的な環境の内部の特定の生物の生態を研究する手段である。さらなる遺伝子配列データが利用できるようになるにつれ、多種多様な口腔細菌に対してプライマーを開発することができる。
【００２４】
蛍光抗体プローブによる細菌のレベル
[0027] 齲食診断キットを用いて、齲食原性タイプの細菌、例えばＳ．ミュータンスの、および／または非齲食原性タイプ、例えばＳ．サングイスに関する唾液中におけるレベルを、モノクローナル抗体の使用により検出する。用いる個別の抗体は細菌の種に特異的であり、抗体に結合した蛍光染料を有する。細菌のレベルは、放射された蛍光の量を測定することにより検出することができる。
【実施例】
【００２５】
実施例１
総プラーク細菌レベルを測定するためのリアルタイムＰＣＲ
[0028] 対象における総プラーク細菌のレベル（マイクログラム細菌ＤＮＡ／ｍｌ）を、異なる練り歯磨き配合物を用いて、上記の手順を用いて測定する：
【００２６】
【表１】
【００２７】
[0029] アルギニン−フッ化物配合物は、総細菌のプラーク重み（ｌｏａｄｓ）、およびＳ．ミュータンスのプラーク重みを減少させ、一方でＳ．サングイス（アルギニン分解）の重みを増すのに有効である。
【００２８】
実施例２−アンモニアの生成
[0030] アンモニアの生成を、異なる練り歯磨き配合物を用いる対象において、上記の方法を用いて測定する：
【００２９】
【表２】
【００３０】
[0031] アンモニアの生成は、アルギニンを含む配合物を用いる対象のプラークにおいて有意により高い。
実施例３−乳酸レベル
[0032] プラークの乳酸レベルを、対象において、上記のキャピラリー電気泳動を用いて測定し、スクロースの存在下でラクテートが有意に増加していることを示す。
【００３１】
【表３】
【００３２】
実施例４−リアルタイムＰＣＲ／ＲＴ−ＰＣＲ
[0033] この発明は、細菌種のリアルタイムＰＣＲでの検出の原理を、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の細胞内の生物学的活性の指標としての使用と組み合わせる。細菌試料からのｍＲＮＡの精製の後、逆転写リアルタイムＰＣＲを用いて単純な、または複合的な環境内の特定の細菌を検出および定量する。本発明は、そのプライマーの配列およびｍＲＮＡ同定法およびその適用を含む。
【００３３】
[0034] 生存細胞内のＤＮＡの１つの機能は、タンパク質の合成のために遺伝暗号を指定することである。ＤＮＡはその対応するｍＲＮＡ鎖の遺伝暗号を指定し、次いでそれが完成したタンパク質を組み立てるための指示として用いられる。ＤＮＡとは異なり、ｍＲＮＡは非常に短い半減期（秒〜分）を有しており、生存しているか、または非常に最近殺されたかのいずれかである細胞にのみ存在する。ＤＮＡは細胞中に固定されたコピー数で存在する一方、ｍＲＮＡレベルは細胞が存在する条件に応答して頻繁に変化する。様々なタンパク質の発現は、温度変化、成長培地、増殖期および他の環境条件に応答して上方または下方制御される可能性がある。従って、もし標的遺伝子を注意深く選ばないと、環境条件における変動が集団の生存度における変動であると誤って読み取られる可能性がある。この効果を避けるため、本発明は伸長因子ｔｕ、遺伝子ｔｕｆを標的配列として用いる。異なる実験条件下においてｔｕｆの発現に変化がほとんどまたは全く観察されなかったため、この配列は以前にマーカーとして用いられてきた。
【００３４】
[0035] リアルタイムＰＣＲは、遺伝物質のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅の裏の基礎的な化学を用い、それをそれぞれの増幅サイクルの後に存在する所与の遺伝子配列のコピー数を定量する機構としての蛍光標識のリアルタイム検出と結びつける。これらの方法のうちで最も単純なものは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の中に特異的にインターカレートする蛍光プローブであるＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉを用いる。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎの蛍光の増大するレベルは、従って、ｄｓＤＮＡのより大きな濃度に相関する。この色素を、特定の遺伝子配列をプライマーとして用いる（ｐｒｉｍｅｄ ｕｓｉｎｇ）ＰＣＲ反応に含めると、蛍光の増加は標的遺伝子のコピー数の増加に一致する。その後、シグナルが予め決められた強度の閾値と交差するサイクル数は、出発物質中の遺伝子配列の濃度に相関し得る。
【００３５】
[0036] リアルタイムＰＣＲの技術の発達は、特定の生物学的種を速やかに、かつ高い程度の正確さで検出および定量することを可能にした。細菌種の定量のための、一般に用いられる方法は、１６ｓリボソームサブユニットをコードするＤＮＡの可変領域に対するプライマーの開発に頼っている。このサブユニットは細菌の複製にとって決定的に重要であり、従ってその配列は容易には変異しない。特定の種に特異的な１６ｓ ｒＤＮＡ配列の検出は、複合的な環境内の単一の細菌種の検出および計数を容易にすることができる。
【００３６】
[0037] プライマーは、公に利用できるデータベース（国立生物工学情報センターおよびロスアラモス口腔病原体データベース）からのｔｕｆ遺伝子の配列に基づいて設計する。ＤＮＡ Ｓｔａｒ ＬａｓｅｒｇｅｎｅプログラムのＭｅｇＡｌｉｇｎモジュールを用いて配列をアラインメントする。このアラインメントを用いて、種の特異性の見込みを最大にするために、相違がより大きい領域を選択する。プライマーの配列は、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ Ｐｒｏｂｅ Ｄｅｓｉｇｎソフトウェアから入手できる分析情報に基づいて選択する。この発明に含まれるプライマーには、既に設計し試験したプライマーだけでなく、口腔病原体におけるこの遺伝子領域に対する全てのプライマーが含まれる。
【００３７】
[0038] 適切なＲＮＡ単離キットまたは他のＲＮＡ単離法を用いて、試料から総ＲＮＡを単離する。ＲＮＡ単離のためのあらゆる好ましい方法を用いることができる。精製したＲＮＡを、適切なＤＮａｓｅ処理試薬で２回処理する。この工程は、ＲＮＡ試料内のあらゆる混入しているＤＮＡを分解し、偽陽性の獲得を防ぐ。単離したＲＮＡを次いで逆転写して相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）分子を生成する。得られたｃＤＮＡを増幅し、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎを用いて検出する。完全なＤＮＡの除去に関する質の管理として、逆転写の工程無しでリアルタイムＰＣＲ反応を行うことができる。逆転写反応無しで得られたＰＣＲ産物は、混入したＤＮＡの結果であるに違いない。
【００３８】
[0039] 既知の量の生菌を含む培養物から単離したＲＮＡ試料に対してリアルタイム逆転写ＰＣＲ反応を実施することにより、標準曲線を生成する。それぞれの既知の試料に関する二次微分最大値をその細菌細胞の既知の濃度に対してプロットする。次いで未知の細菌試料から単離されたＲＮＡの増幅曲線の二次微分最大値を標準曲線と比較して、試料集団内の生菌の濃度を決定することができる。このデータは、口腔環境の生態に対する抗菌物質および有効分子の作用の防止において、貴重な情報であろう。
【００３９】
[0040] 次のプライマーペアは、アグリゲイティバクター（アクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ））・アクチノミセテムコミタンスからのｔｕｆ遺伝子の２２８塩基対の領域を増幅するために設計されている：
【００４０】
【表４】
【００４１】
表１．Ａ．アクチノミセテムコミタンスのｔｕｆのｍＲＮＡ発現の定量のために設計されたプライマーの特性。
[0041] これらのプライマーは、Ａ．アクチノミセテムコミタンスの純粋培養物ならびに、Ａ．アクチノミセテムコミタンスを含む、および含まない混合集団両方、の両方から単離されたＲＮＡを増幅するのに用いられる。結果、特に蛍光（Ｆ１）およびサイクル数の間の関係を、図１のグラフに示す。図１において、”水”は陰性対照を表し、”Ａａ”
は純粋なＡ．アクチノミセテムコミタンスの培養物の陽性対照である。”混合物１”は、プレボテラ・インターメディア（Ｐｒｅｖｏｌｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、ストレプトコッカス・ソブリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ）、ストレプトコッカス・オラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｏｒａｌｉｓ）、およびアクチノミセス・ビスコーサス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓ）を含む集団から精製したものであり、従って、これらのプライマーを用いる増幅に関して陰性であるはずである。”混合物３”は、Ａ．アクチノミセテムコミタンス、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ゴルドニ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）、およびストレプトコッカス・サンギニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｎｑｕｉｎｉｓ）を含む集団からのものであり、Ａ．アクチノミセテムコミタンスの増幅に関して陽性であるはずである。
【００４２】
[0042] このグラフは、Ａ．アクチノミセテムコミタンスを含む混合物が陽性対照と類似の曲線で増幅される一方で、それを欠く混合物は水の対照と同じ増幅曲線に従うことを示し、これはこれらのプライマーがＲＮＡ種の混合物の内部からＡ．アクチノミセテムコミタンスを正確に検出することができることを示している。
【００４３】
[0043] これらのプライマーの、Ａ．アクチノミセテムコミタンスの生菌のみを正確に検出および定量する能力を、下記のようにして決定する。既知の濃度のＡ．アクチノミセテムコミタンス細胞を、８０％エタノール中で１５分間懸濁することにより殺す。次いで細菌を遠心分離によりペレットにし、新鮮なブレインハートインフュージョンブロス増殖培地中で再懸濁する。エタノールで殺した細菌を３７℃で一夜培養し、増殖に関して試験し、生菌が残っていないことを確かめる。次いでエタノールで殺した細菌を生菌と定義された比率で混合し、逆転写、続いてリアルタイムＰＣＲを実施する。これらの試料の増幅を図２に示し、それは生きた、および死んだＡ．アクチノミセテムコミタンスの混合物からのＲＮＡの増幅を示す。
【００４４】
[0044] この反応のための鋳型として用いられる集団の全てが同じ総数の生物を含んでいたという事実にも関わらず、より多くの生菌を含む試料においてより早い増幅が観察され、これはこのアッセイが生きた、および死んだ細菌両方の混合物内の生菌を検出することができることを示している。加えて、図３に示したこれらの試料の融解曲線は、全ての試料において単一の同じ生成物が増幅されていることを示し、それはアッセイの高い特異性を証明する。図３は、Ａ．アクチノミセテムコミタンスの純粋および混合培養物から増幅された生成物の融解ピーク分析を示す。これらの曲線の重複は、全ての試料から単一の生成物が増幅されていることを示す。表２は、選択された標準曲線の試料中の生物の予想されたおよび計算された数の比較を示す。
【００４５】
【表５】
【００４６】
表２．選択された標準曲線の試料中の生物の予想されたおよび計算された数の比較。
[0045] 既知の濃度の、生存している、および殺した出発培養物に基づき、それぞれの集団中の生菌のおおよその数を計算し、それぞれの増幅曲線の二次微分最大値と共に用いて標準曲線を生成する。結果を図４に示し、それは標準曲線ならびに既知の濃度の生存している、および死んだＡ．アクチノミセテムコミタンスの増幅から生成された標準曲線の線形回帰を図説する。回帰直線のｒ２値は０．９６である。
【００４７】
[0046] 線形回帰直線のｒ２値は、回帰式の観察された値への適合の近さを示す。１．００により近いｒ２は、観察された値が回帰直線に密接に合うことを示す。上記の実施例に関して、標準曲線のｒ２値は０．９６であり、これは、直線において観察される全ての変動の約９６％は試料における実際の測定された変動によるものであり、この標準曲線は未知の集団中の生菌の濃度を計算するのに用いることができることを示す。
【００４８】
[0047] 実際、１回の実験において、この標準曲線に基づいて計算した生菌の濃度は、ＲＮＡの単離の前に添加した実際の濃度と有意に異なっておらず、差は２０％未満であった。これらのデータは、このアッセイが生物の複合的な集団内の特定の種の生菌を検出および定量する迅速、正確な手段であることを示している。これは、口腔の微生物の生態に対する処置の作用を分析するための強力な道具である可能性がある。
【技術分野】
【０００１】
[0001] この出願は２００８年２月９日に出願された米国特許出願Ｎｏ．６１／０２７，４３７の利益を主張し、２００８年２月９日に出願された米国特許出願Ｎｏ．６１／０２７，４４２、ならびに全て２００８年２月８日に出願された米国特許出願Ｎｏ．６１／０２７，４３２；６１／０２７，４３１；６１／０２７，４２０；および６１／０２７，４３５の利益も主張し、その出願の内容を全て本明細書に援用する。
【０００２】
[0002] 技術分野
[0003] この発明は、口の中の齲食原性細菌およびアルギニン分解（ａｒｇｉｎｏｌｙｔｉｃ）細菌の相対的なレベルを、例えば、塩基性アミノ酸を遊離または塩の型で含む組成物を用いる歯科ケア計画の一部として測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
[0004] アルギニンおよび他の塩基性アミノ酸は口腔ケアにおける使用に関して提案されており、虫歯の形成および歯の過敏との戦いにおいて重要な利益を有すると考えられている。商業的に入手できるアルギニンに基づく練り歯磨きは、アルギニンおよび炭酸水素カルシウムを含むＣａｖｉＳｔａｔ（登録商標）を含むＤｅｎＣｌｕｄｅ（登録商標）およびＰｒｏＣｌｕｄｅ（登録商標）である。
【０００４】
[0005] 口の中のバイオフローラのタイプは、虫歯の発達において、および口の健康において一般に重要な役割を果たす。例えば、アルギニンの有益な作用における重要な因子は、アルギニンおよび他の塩基性アミノ酸が、齲食原性ではなく歯の上の、および口腔中での位置に関してＳ．ミュータンス（Ｓ． ｍｕｔａｎｓ）のような齲食原性細菌と競合する特定のタイプの細菌、例えばＳ．サングイス（Ｓ． ｓａｎｇｕｉｓ）により代謝され得ることであると仮定されてきた。アルギニン分解細菌はアルギニンおよび他の塩基性アミノ酸を用いてアンモニアを生成することができ、それによりそれらの環境のｐＨを上昇させ、一方齲食原性細菌は糖を代謝して乳酸を生成し、それはプラークのｐＨを低下させ歯を脱灰させる傾向があり、最終的には虫歯につながる。
【０００５】
[0006] 口の中のバイオフローラのタイプを監視する効率的な手段があれば、例えば最適な処置を決定するのに、および患者の処置の有効性を監視するのに有用であろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
[0007] 本発明は、口の中のバイオフローラを評価するための迅速かつ単純な方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
[0008] 第１態様において、本発明はプラークのアンモニア生成レベルを測定してアルギニン分解細菌の相対的な個体数を決定する。
[0009] 別の態様において、本発明はプラークの乳酸レベルを測定して齲食原性細菌の相対的な個体数を決定する。
【０００８】
[0010] 別の態様において、本発明はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、例えば定量的リアルタイムＰＣＲを用いて口の中の、例えばプラークまたは唾液中のバイオフローラを特性づける。
【０００９】
[0011] 別の例において、本発明は逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて口の中の、例えばプラークまたは唾液中のバイオフローラを特性づける。
[0012] 別の態様において、抗体プローブ、例えば蛍光抗体プローブを用いて口の中の、例えばプラークまたは唾液中のバイオフローラを特性づける。
【００１０】
[0013] 例えば、本発明は少なくとも１種類の齲食原性細菌、例えばＳ．ミュータンスおよび少なくとも１種類のアルギニン分解細菌、例えばＳ．サングイスのレベルを定量する。
【００１１】
[0014] 別の態様において、患者は前記の方法の１種類およびそれに従って定められた処置を用いて評価される。
[0015] 本発明の方法は、プラークの生態（ｅｃｏｌｏｇｙ）における損傷を与える可能性のある変化を検出するために、および歯に対する検出可能なまたは重要な脱灰または損傷が存在する前の矯正的な処置を可能にするために特に有用である。
【００１２】
[0016] 従って、本発明は口の健康を増進するための、例えば次のことのための方法を提供し：
ａ．齲食の形成を低減または抑制する、
ｂ．歯の脱灰を低減または抑制し、再石灰化を促進する、
ｃ．早期のエナメル質の病変の形成を処置、低減または抑制する、
ｄ．歯の過敏性を低減する、
ｅ．歯肉炎を低減または抑制する、
ｆ．口の中の潰瘍または切り傷の治癒を促進する、
ｇ．酸を産生する細菌のレベルを低減する、
ｈ．アルギニン分解細菌の相対的なレベルを増大させる、
ｉ．口腔中での微生物のバイオフィルムの形成を抑制する、
ｊ．糖負荷の後のプラークのｐＨを少なくともｐＨ５．５のレベルに上げる、および／または維持する、
ｋ．プラークの蓄積を低減する、
ｌ．口内乾燥を処置、緩和または低減する
ｍ．歯を白くする、
ｎ．例えば口の組織を経る全身感染の可能性を低減することにより、心血管の健康を含む全身の健康を増進する、
ｏ．歯を齲食原性細菌およびそれらの作用に対して免疫化する、
ｐ．歯および口腔を清潔にする、および／または
ｑ．歯の酸食を低減する、
それは例えば前記の方法のいずれかを用いる、口腔のバイオフローラを測定すること、および必要であれば、有効量の塩基性アミノ酸、例えばアルギニンまたはその塩を含む口腔ケア製品を投与することを含む。
【００１３】
[0017] 本発明はさらに、口腔のバイオフローラが、本発明に従う方法により測定される、高いレベルの齲食原性細菌および／または高いラクテートレベル、および／または低いレベルのアルギニン分解細菌および／または低いレベルのプラークのアンモニア生成を含む対象において口の健康を増進するための医薬の製造のための、遊離または塩の型の塩基性アミノ酸の使用を提供する。
【００１４】
[0018] 本発明はさらに、口腔を美容的に増進するための方法を提供し（ここでその美容的な増進は、例えば歯をより白くすることおよび／または口臭を低減することを含んでいてよい）、その方法は、本発明に従う方法を用いて口腔のバイオフローラを測定すること、およびもし必要であれば、高いレベルの齲食原性細菌および／または高いラクテートレベルの存在、および／または低いレベルのアルギニン分解細菌および／または低いレベルのプラークのアンモニア生成の存在により、遊離または塩の型の塩基性アミノ酸を含む口腔ケア製品を投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、純粋培養物および混合集団からのＡ．アクチノミセテムコミタンスの増幅を示す。
【図２】図２は、生きた、および死んだＡ．アクチノミセテムコミタンスの混合物からのＲＮＡの増幅を示す。
【図３】図３は、Ａ．アクチノミセテムコミタンスの純粋および混合培養物から増幅された生成物の融解ピーク分析を示す。
【図４】図４は、標準曲線ならびに既知の濃度の生存している、および死んだＡ．アクチノミセテムコミタンスの増幅から生成された標準曲線の線形回帰を図説する。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
プラークの代謝−アンモニアの生成
[0019] 歯のプラークの、アルギニンをアンモニアに変換する能力は、アルギニン分解活性のマーカーである。特定の細菌が糖類を酸に変換できるのとちょうど同じように、特定の細菌はアルギニンをアンモニアに変換する能力を有している。アルギニン分解性の種の相対濃度を増大させることは、これらの細菌は酸性条件を好み齲食の危険性を増大させる齲食原性細菌の増殖にとって好ましくない条件を作り出すため、有益である。アルギニンの毎日の使用は、糖の頻繁な消費が酸を酸性する細菌に有利である条件を作り出すのと類似した方式で、アルギニン分解細菌に有利であるプラーク生態における変化を作り出すことが期待される。アンモニアは酸を中和することができる塩基であり、中性のプラークｐＨを維持するのを助ける。中性のｐＨ条件は、非病原性細菌にとってより有利である。アンモニア生成の測定は、アルギニンをアンモニアに変換することができる全ての細菌からの寄与を測定する。これは、選ばれたアルギニン分解細菌の濃度を測定し代謝的に活性な（生きた）および不活性な（死んだ）細菌を識別しないリアルタイムＰＣＲ法（下記でさらに記述する）と対照的である。
【００１７】
[0020] アンモニア検出キットは、アンモニアの生成を測定するために、例えばＤｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ （Ｏｘｆｏｒｄ， ＣＴ）から商業的に入手することができる。定量および決定の原理は、アンモニアがアルファ−ケトグルタル酸および還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）と反応してＬ−グルタミンおよびＮＡＤＰを形成することが知られていることである。その反応は、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＬＤＨ）により触媒される。ＮＡＤＰＨの酸化による３４０ｎｍの吸光度の減少は、アンモニア濃度に比例する。プラーク試料は、予め定められた処理プロトコルの後に集められる。一部の適用において、プラークは歯の固定装置（ｒｅｔａｉｎｅｒ）に取り付けられたエナメル質またはＨＡＰ標本から集められる。別の適用において、プラークは直接歯から集められる。
【００１８】
乳酸レベルによるプラークの生態学（ｅｃｏｌｏｇｙ）
[0021] ちょうどアンモニアレベルの測定がアルギニン分解細菌のレベルを測定するための代用品として役立つように、乳酸は齲食原性細菌のレベルを測定するための代用品として役立つ。対象は、朝の口腔清掃をせずに、および前の晩から節食または飲むことをせずに得られたプラークを有する。彼らは１０％スクロース溶液で２分間ゆすぐ。８分後、歯の表面（複数）をひっかいてプラークを集める。プラーク試料を氷上で、予め重さを測定したチューブの中に集め、プラークの重量を決定する。分析には、氷で冷やした水を既知の量のプラーク試料に添加し、次いで試料を８０度Ｃに５分間加熱して細菌を殺し、全ての酸を放出させた後、試料を氷水中でさらに５分間冷却することが含まれる。次いで試料を遠心分離し、上清を濾過する。ラクテート濃度を、キャピラリー電気泳動を用いて測定する。
【００１９】
定量的リアルタイムＰＣＲによるプラークの生態学
[0022] 定量的リアルタイムＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）は、ＤＮＡを定量する非常に感度の高い手段である。ＤＮＡの量は存在する細菌の量に直接関係があるため、歯のプラークから単離した細菌のＤＮＡを細菌の総レベルを定量するのに用いる。リアルタイムＰＣＲは、政府組織、例えば疾病予防管理センター（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ）およびＦＤＡに、非常に強力で高感度の技法として認められている。多くの口腔細菌の既知のゲノム配列を利用して、プローブを、口腔細菌または特定の細菌、例えばＳ．ミュータンスもしくはＳ．サングイスの総レベルを検出するように設計する。プラークまたは唾液の試料から単離したＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応により増幅する。ＤＮＡの量は、ＰＣＲ反応のそれぞれのサイクルと共に指数関数的に増大する。蛍光性の報告分子（ｒｅｐｏｒｔ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）の使用により反応がリアルタイムで見守られるため、その技法は”リアルタイム”と呼ばれる。本発明の１態様において、報告分子としてＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎを用いる。この分子は、二本鎖ＤＮＡと連携すると強く蛍光を発する。定量は、蛍光の閾値を設定し、様々な濃度でのＤＮＡ標準を用いて、閾値に達するまでに必要なサイクル数を決定することにより達成される。より多くのＤＮＡが存在すれば、閾値に達するまでにより少ないＤＮＡサイクル数が必要である。市販のリアルタイムＰＣＲ器械は、多くの製造業者、例えばＲｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓから入手することができる。
【００２０】
[0023] プラークの試料を、既知の、および一定の表面積のエナメル質またはヒドロキシアパタイトの標本から集める。存在するＤＮＡの量はどれだけ多くプラークを集めるかに直接関係するため、プラークの採集の標準化は決定的に重要である。その２種類の量は有意に相関があるため、プラークの質量をリアルタイムＰＣＲにより測定する総細菌を標準化する手段として用いるのは不適切である。結果はｍｌあたりのμｇＤＮＡとして報告される。ＤＮＡ濃度またはＬｎ（ＤＮＡ濃度）について統計学を実施することができる。総細菌に関して、対象および処理を要因として用いて、２要因ＡＮＯＶＡを実施する。もし違いが９５％信頼度で検出されるなら、違いは有意であると考えられる。特定の細菌、例えばＳ．ミュータンスまたはＳ．サングイスに関して、総細菌を共変動として用いて２要因ＡＮＣＯＶＡを行う。総細菌個体数と関係がある特定の細菌の総量は、プラーク生態の健康状態のより適切なマーカーである。
【００２１】
[0024] 本発明の特定の態様において、Ｓ．ミュータンスを齲食原性に関するマーカーとして測定する。Ｓ．ミュータンスを選ぶのは、それが齲食の開始において関係している、十分に受け入れられている危険因子であるからである。他の酸を産生する細菌が齲食の過程に関わっている一方で、Ｓ．ミュータンスは齲食原性プロセスの開始および早いステージで特に重要な役割を果たしていることが知られている。本発明の１態様において、Ｓ．サングイスは高いレベルのアルギニン分解活性（アルギニンをアンモニアに変換する能力）を示すことが知られている細菌であるため、Ｓ．サングイスをより健康なプラーク生態への変化に関するマーカーとして選ぶ。
【００２２】
ＲＴ−ＰＣＲによるプラークの生態学
[0025] 逆転写ＰＣＲは、試料中のＲＮＡ転写産物を測定する。ＲＮＡを単離し、逆転写酵素を用いて転写産物をｃＤＮＡに変換し、ＰＣＲを用いてｃＤＮＡを増幅する。ＲＴ−ＰＣＲの利点は、口腔細菌の検出のためのＤＮＡに基づいた方法はそれらの種の生存度を決定できないことである。口腔細菌はバイオフィルム共同体（ｂｉｏｆｉｌｍ ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ）において最も頻繁に見つけられるため、殺した後長い期間の間、死んだ細菌のＤＮＡはバイオフィルムの構造の内部に保持され得る。他の方法、例えば蛍光に基づいた生存度アッセイ（Ｌｉｖｅ Ｄｅａｄ ｋｉｔ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）は、生物が傷ついた膜を有しているか否かを検出することができるが、特定の種を直接検出することはない。
【００２３】
[0026] 従って、逆転写リアルタイムＰＣＲは、複合的な共同体の内部に存在する口腔細菌の特定の種の生菌を定量するための方法である。ｍＲＮＡは比較的短い半減期を有しており、従って、最近活動している細菌を示す。我々は、伸長因子ｔｕｆに対する種特異的なプライマーを開発した。この遺伝子は増殖期、培地または環境条件により有意に制御されず、それにより検出される細菌の数へのスプリアス効果（ｓｐｕｒｉｏｕｓ ｅｆｆｅｃｔｓ）を最小限にする。アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス（Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）を我々の試験生物として用いることで、わずか２０％の存在する生物が生存可能であれば、生きた、およびＥｔＯＨで殺した細菌の混合された集団における生存度の差を検出することができる。加えて、その方法は、６種類までの異なる種の細菌を含む混合された種の集団中のＡ．アクチノミセテムコミタンスの存在の信頼できる同定を可能にする。計算された細菌の濃度は、同じ培養物に関するＯＤ６１０に基づいて見積もられた値に密接に相関する（ｒ＝０．９６、１％未満の差）。このアッセイは、口腔の複合的な環境の内部の特定の生物の生態を研究する手段である。さらなる遺伝子配列データが利用できるようになるにつれ、多種多様な口腔細菌に対してプライマーを開発することができる。
【００２４】
蛍光抗体プローブによる細菌のレベル
[0027] 齲食診断キットを用いて、齲食原性タイプの細菌、例えばＳ．ミュータンスの、および／または非齲食原性タイプ、例えばＳ．サングイスに関する唾液中におけるレベルを、モノクローナル抗体の使用により検出する。用いる個別の抗体は細菌の種に特異的であり、抗体に結合した蛍光染料を有する。細菌のレベルは、放射された蛍光の量を測定することにより検出することができる。
【実施例】
【００２５】
実施例１
総プラーク細菌レベルを測定するためのリアルタイムＰＣＲ
[0028] 対象における総プラーク細菌のレベル（マイクログラム細菌ＤＮＡ／ｍｌ）を、異なる練り歯磨き配合物を用いて、上記の手順を用いて測定する：
【００２６】
【表１】
【００２７】
[0029] アルギニン−フッ化物配合物は、総細菌のプラーク重み（ｌｏａｄｓ）、およびＳ．ミュータンスのプラーク重みを減少させ、一方でＳ．サングイス（アルギニン分解）の重みを増すのに有効である。
【００２８】
実施例２−アンモニアの生成
[0030] アンモニアの生成を、異なる練り歯磨き配合物を用いる対象において、上記の方法を用いて測定する：
【００２９】
【表２】
【００３０】
[0031] アンモニアの生成は、アルギニンを含む配合物を用いる対象のプラークにおいて有意により高い。
実施例３−乳酸レベル
[0032] プラークの乳酸レベルを、対象において、上記のキャピラリー電気泳動を用いて測定し、スクロースの存在下でラクテートが有意に増加していることを示す。
【００３１】
【表３】
【００３２】
実施例４−リアルタイムＰＣＲ／ＲＴ−ＰＣＲ
[0033] この発明は、細菌種のリアルタイムＰＣＲでの検出の原理を、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の細胞内の生物学的活性の指標としての使用と組み合わせる。細菌試料からのｍＲＮＡの精製の後、逆転写リアルタイムＰＣＲを用いて単純な、または複合的な環境内の特定の細菌を検出および定量する。本発明は、そのプライマーの配列およびｍＲＮＡ同定法およびその適用を含む。
【００３３】
[0034] 生存細胞内のＤＮＡの１つの機能は、タンパク質の合成のために遺伝暗号を指定することである。ＤＮＡはその対応するｍＲＮＡ鎖の遺伝暗号を指定し、次いでそれが完成したタンパク質を組み立てるための指示として用いられる。ＤＮＡとは異なり、ｍＲＮＡは非常に短い半減期（秒〜分）を有しており、生存しているか、または非常に最近殺されたかのいずれかである細胞にのみ存在する。ＤＮＡは細胞中に固定されたコピー数で存在する一方、ｍＲＮＡレベルは細胞が存在する条件に応答して頻繁に変化する。様々なタンパク質の発現は、温度変化、成長培地、増殖期および他の環境条件に応答して上方または下方制御される可能性がある。従って、もし標的遺伝子を注意深く選ばないと、環境条件における変動が集団の生存度における変動であると誤って読み取られる可能性がある。この効果を避けるため、本発明は伸長因子ｔｕ、遺伝子ｔｕｆを標的配列として用いる。異なる実験条件下においてｔｕｆの発現に変化がほとんどまたは全く観察されなかったため、この配列は以前にマーカーとして用いられてきた。
【００３４】
[0035] リアルタイムＰＣＲは、遺伝物質のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅の裏の基礎的な化学を用い、それをそれぞれの増幅サイクルの後に存在する所与の遺伝子配列のコピー数を定量する機構としての蛍光標識のリアルタイム検出と結びつける。これらの方法のうちで最も単純なものは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の中に特異的にインターカレートする蛍光プローブであるＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉを用いる。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎの蛍光の増大するレベルは、従って、ｄｓＤＮＡのより大きな濃度に相関する。この色素を、特定の遺伝子配列をプライマーとして用いる（ｐｒｉｍｅｄ ｕｓｉｎｇ）ＰＣＲ反応に含めると、蛍光の増加は標的遺伝子のコピー数の増加に一致する。その後、シグナルが予め決められた強度の閾値と交差するサイクル数は、出発物質中の遺伝子配列の濃度に相関し得る。
【００３５】
[0036] リアルタイムＰＣＲの技術の発達は、特定の生物学的種を速やかに、かつ高い程度の正確さで検出および定量することを可能にした。細菌種の定量のための、一般に用いられる方法は、１６ｓリボソームサブユニットをコードするＤＮＡの可変領域に対するプライマーの開発に頼っている。このサブユニットは細菌の複製にとって決定的に重要であり、従ってその配列は容易には変異しない。特定の種に特異的な１６ｓ ｒＤＮＡ配列の検出は、複合的な環境内の単一の細菌種の検出および計数を容易にすることができる。
【００３６】
[0037] プライマーは、公に利用できるデータベース（国立生物工学情報センターおよびロスアラモス口腔病原体データベース）からのｔｕｆ遺伝子の配列に基づいて設計する。ＤＮＡ Ｓｔａｒ ＬａｓｅｒｇｅｎｅプログラムのＭｅｇＡｌｉｇｎモジュールを用いて配列をアラインメントする。このアラインメントを用いて、種の特異性の見込みを最大にするために、相違がより大きい領域を選択する。プライマーの配列は、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ Ｐｒｏｂｅ Ｄｅｓｉｇｎソフトウェアから入手できる分析情報に基づいて選択する。この発明に含まれるプライマーには、既に設計し試験したプライマーだけでなく、口腔病原体におけるこの遺伝子領域に対する全てのプライマーが含まれる。
【００３７】
[0038] 適切なＲＮＡ単離キットまたは他のＲＮＡ単離法を用いて、試料から総ＲＮＡを単離する。ＲＮＡ単離のためのあらゆる好ましい方法を用いることができる。精製したＲＮＡを、適切なＤＮａｓｅ処理試薬で２回処理する。この工程は、ＲＮＡ試料内のあらゆる混入しているＤＮＡを分解し、偽陽性の獲得を防ぐ。単離したＲＮＡを次いで逆転写して相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）分子を生成する。得られたｃＤＮＡを増幅し、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎを用いて検出する。完全なＤＮＡの除去に関する質の管理として、逆転写の工程無しでリアルタイムＰＣＲ反応を行うことができる。逆転写反応無しで得られたＰＣＲ産物は、混入したＤＮＡの結果であるに違いない。
【００３８】
[0039] 既知の量の生菌を含む培養物から単離したＲＮＡ試料に対してリアルタイム逆転写ＰＣＲ反応を実施することにより、標準曲線を生成する。それぞれの既知の試料に関する二次微分最大値をその細菌細胞の既知の濃度に対してプロットする。次いで未知の細菌試料から単離されたＲＮＡの増幅曲線の二次微分最大値を標準曲線と比較して、試料集団内の生菌の濃度を決定することができる。このデータは、口腔環境の生態に対する抗菌物質および有効分子の作用の防止において、貴重な情報であろう。
【００３９】
[0040] 次のプライマーペアは、アグリゲイティバクター（アクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ））・アクチノミセテムコミタンスからのｔｕｆ遺伝子の２２８塩基対の領域を増幅するために設計されている：
【００４０】
【表４】
【００４１】
表１．Ａ．アクチノミセテムコミタンスのｔｕｆのｍＲＮＡ発現の定量のために設計されたプライマーの特性。
[0041] これらのプライマーは、Ａ．アクチノミセテムコミタンスの純粋培養物ならびに、Ａ．アクチノミセテムコミタンスを含む、および含まない混合集団両方、の両方から単離されたＲＮＡを増幅するのに用いられる。結果、特に蛍光（Ｆ１）およびサイクル数の間の関係を、図１のグラフに示す。図１において、”水”は陰性対照を表し、”Ａａ”
は純粋なＡ．アクチノミセテムコミタンスの培養物の陽性対照である。”混合物１”は、プレボテラ・インターメディア（Ｐｒｅｖｏｌｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、ストレプトコッカス・ソブリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ）、ストレプトコッカス・オラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｏｒａｌｉｓ）、およびアクチノミセス・ビスコーサス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓ）を含む集団から精製したものであり、従って、これらのプライマーを用いる増幅に関して陰性であるはずである。”混合物３”は、Ａ．アクチノミセテムコミタンス、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ゴルドニ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）、およびストレプトコッカス・サンギニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｎｑｕｉｎｉｓ）を含む集団からのものであり、Ａ．アクチノミセテムコミタンスの増幅に関して陽性であるはずである。
【００４２】
[0042] このグラフは、Ａ．アクチノミセテムコミタンスを含む混合物が陽性対照と類似の曲線で増幅される一方で、それを欠く混合物は水の対照と同じ増幅曲線に従うことを示し、これはこれらのプライマーがＲＮＡ種の混合物の内部からＡ．アクチノミセテムコミタンスを正確に検出することができることを示している。
【００４３】
[0043] これらのプライマーの、Ａ．アクチノミセテムコミタンスの生菌のみを正確に検出および定量する能力を、下記のようにして決定する。既知の濃度のＡ．アクチノミセテムコミタンス細胞を、８０％エタノール中で１５分間懸濁することにより殺す。次いで細菌を遠心分離によりペレットにし、新鮮なブレインハートインフュージョンブロス増殖培地中で再懸濁する。エタノールで殺した細菌を３７℃で一夜培養し、増殖に関して試験し、生菌が残っていないことを確かめる。次いでエタノールで殺した細菌を生菌と定義された比率で混合し、逆転写、続いてリアルタイムＰＣＲを実施する。これらの試料の増幅を図２に示し、それは生きた、および死んだＡ．アクチノミセテムコミタンスの混合物からのＲＮＡの増幅を示す。
【００４４】
[0044] この反応のための鋳型として用いられる集団の全てが同じ総数の生物を含んでいたという事実にも関わらず、より多くの生菌を含む試料においてより早い増幅が観察され、これはこのアッセイが生きた、および死んだ細菌両方の混合物内の生菌を検出することができることを示している。加えて、図３に示したこれらの試料の融解曲線は、全ての試料において単一の同じ生成物が増幅されていることを示し、それはアッセイの高い特異性を証明する。図３は、Ａ．アクチノミセテムコミタンスの純粋および混合培養物から増幅された生成物の融解ピーク分析を示す。これらの曲線の重複は、全ての試料から単一の生成物が増幅されていることを示す。表２は、選択された標準曲線の試料中の生物の予想されたおよび計算された数の比較を示す。
【００４５】
【表５】
【００４６】
表２．選択された標準曲線の試料中の生物の予想されたおよび計算された数の比較。
[0045] 既知の濃度の、生存している、および殺した出発培養物に基づき、それぞれの集団中の生菌のおおよその数を計算し、それぞれの増幅曲線の二次微分最大値と共に用いて標準曲線を生成する。結果を図４に示し、それは標準曲線ならびに既知の濃度の生存している、および死んだＡ．アクチノミセテムコミタンスの増幅から生成された標準曲線の線形回帰を図説する。回帰直線のｒ２値は０．９６である。
【００４７】
[0046] 線形回帰直線のｒ２値は、回帰式の観察された値への適合の近さを示す。１．００により近いｒ２は、観察された値が回帰直線に密接に合うことを示す。上記の実施例に関して、標準曲線のｒ２値は０．９６であり、これは、直線において観察される全ての変動の約９６％は試料における実際の測定された変動によるものであり、この標準曲線は未知の集団中の生菌の濃度を計算するのに用いることができることを示す。
【００４８】
[0047] 実際、１回の実験において、この標準曲線に基づいて計算した生菌の濃度は、ＲＮＡの単離の前に添加した実際の濃度と有意に異なっておらず、差は２０％未満であった。これらのデータは、このアッセイが生物の複合的な集団内の特定の種の生菌を検出および定量する迅速、正確な手段であることを示している。これは、口腔の微生物の生態に対する処置の作用を分析するための強力な道具である可能性がある。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルギニン分解細菌のレベルを測定することを含む、口腔のバイオフローラを評価するための方法。
【請求項２】
齲食原性細菌の活性も測定する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アルギニン分解細菌の活性を、プラークのアンモニアの生成レベルを測定することにより評価する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
齲食原性細菌の活性を、ラクテートの生成レベルを測定することにより評価する、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも１種類の齲食原性細菌および／または少なくとも１種類のアルギニン分解細菌のレベルを定量するために、定量的リアルタイムＰＣＲ、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、および／または蛍光抗体プローブを用いることを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
アルギニン分解細菌がＳ．サングイスを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
齲食原性細菌の活性も測定し、齲食原性細菌がＳ．ミュータンスを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
歯に対する検出可能なまたは重要な脱灰または損傷が存在する前にプラークの生態における損傷を与える可能性のある変化を検出する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
口の健康を増進するための、例えば次のことのための方法であって：
ａ．齲食の形成を低減または抑制する、
ｂ．歯の脱灰を低減または抑制し、再石灰化を促進する、
ｃ．早期のエナメル質の病変の形成を処置、低減または抑制する、
ｄ．歯の過敏性を低減する、
ｅ．歯肉炎を低減または抑制する、
ｆ．口の中の潰瘍または切り傷の治癒を促進する、
ｇ．酸を産生する細菌のレベルを低減する、
ｈ．アルギニン分解細菌の相対的なレベルを増大させる、
ｉ．口腔中での微生物のバイオフィルムの形成を抑制する、
ｊ．糖負荷の後のプラークのｐＨを少なくともｐＨ５．５のレベルに上げる、および／または維持する、
ｋ．プラークの蓄積を低減する、
ｌ．口内乾燥を処置、緩和または低減する
ｍ．歯を白くする、
ｎ．心血管の健康を含む全身の健康を増進する、
ｏ．歯を齲食原性細菌に対して免疫化または保護する
ｐ．歯および口腔を清潔にする、および／または
ｑ．歯の酸食を低減する、
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法を用いる、口腔のバイオフローラを測定すること、および必要であれば、
高いレベルの齲食原性細菌および／または高いラクテートレベルの存在、および／または
低いレベルのアルギニン分解細菌および／または低いレベルのプラークのアンモニア生成の存在、
により、有効量の塩基性アミノ酸またはその塩を含む口腔ケア製品を投与することを含む方法。
【請求項１０】
塩基性アミノ酸がアルギニンまたはその塩である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
口腔のバイオフローラが、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法により測定される、高いレベルの齲食原性細菌および／または高いラクテートレベル、および／または低いレベルのアルギニン分解細菌および／または低いレベルのプラークのアンモニア生成を含む対象において口の健康を増進するための医薬の製造のための、遊離または塩の型の塩基性アミノ酸の使用。
【請求項１２】
口腔を美容的に増進するための方法であって、その方法が、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法を用いて口腔のバイオフローラを測定すること、および必要であれば、高いレベルの齲食原性細菌および／または高いラクテートレベルの存在、および／または低いレベルのアルギニン分解細菌および／または低いレベルのプラークのアンモニア生成の存在により、遊離または塩の型の塩基性アミノ酸を含む口腔ケア製品を投与することを含む、前記方法。
【請求項１】
アルギニン分解細菌のレベルを測定することを含む、口腔のバイオフローラを評価するための方法。
【請求項２】
齲食原性細菌の活性も測定する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アルギニン分解細菌の活性を、プラークのアンモニアの生成レベルを測定することにより評価する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
齲食原性細菌の活性を、ラクテートの生成レベルを測定することにより評価する、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも１種類の齲食原性細菌および／または少なくとも１種類のアルギニン分解細菌のレベルを定量するために、定量的リアルタイムＰＣＲ、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、および／または蛍光抗体プローブを用いることを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
アルギニン分解細菌がＳ．サングイスを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
齲食原性細菌の活性も測定し、齲食原性細菌がＳ．ミュータンスを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
歯に対する検出可能なまたは重要な脱灰または損傷が存在する前にプラークの生態における損傷を与える可能性のある変化を検出する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
口の健康を増進するための、例えば次のことのための方法であって：
ａ．齲食の形成を低減または抑制する、
ｂ．歯の脱灰を低減または抑制し、再石灰化を促進する、
ｃ．早期のエナメル質の病変の形成を処置、低減または抑制する、
ｄ．歯の過敏性を低減する、
ｅ．歯肉炎を低減または抑制する、
ｆ．口の中の潰瘍または切り傷の治癒を促進する、
ｇ．酸を産生する細菌のレベルを低減する、
ｈ．アルギニン分解細菌の相対的なレベルを増大させる、
ｉ．口腔中での微生物のバイオフィルムの形成を抑制する、
ｊ．糖負荷の後のプラークのｐＨを少なくともｐＨ５．５のレベルに上げる、および／または維持する、
ｋ．プラークの蓄積を低減する、
ｌ．口内乾燥を処置、緩和または低減する
ｍ．歯を白くする、
ｎ．心血管の健康を含む全身の健康を増進する、
ｏ．歯を齲食原性細菌に対して免疫化または保護する
ｐ．歯および口腔を清潔にする、および／または
ｑ．歯の酸食を低減する、
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法を用いる、口腔のバイオフローラを測定すること、および必要であれば、
高いレベルの齲食原性細菌および／または高いラクテートレベルの存在、および／または
低いレベルのアルギニン分解細菌および／または低いレベルのプラークのアンモニア生成の存在、
により、有効量の塩基性アミノ酸またはその塩を含む口腔ケア製品を投与することを含む方法。
【請求項１０】
塩基性アミノ酸がアルギニンまたはその塩である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
口腔のバイオフローラが、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法により測定される、高いレベルの齲食原性細菌および／または高いラクテートレベル、および／または低いレベルのアルギニン分解細菌および／または低いレベルのプラークのアンモニア生成を含む対象において口の健康を増進するための医薬の製造のための、遊離または塩の型の塩基性アミノ酸の使用。
【請求項１２】
口腔を美容的に増進するための方法であって、その方法が、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法を用いて口腔のバイオフローラを測定すること、および必要であれば、高いレベルの齲食原性細菌および／または高いラクテートレベルの存在、および／または低いレベルのアルギニン分解細菌および／または低いレベルのプラークのアンモニア生成の存在により、遊離または塩の型の塩基性アミノ酸を含む口腔ケア製品を投与することを含む、前記方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２０１１−５１０６８３（Ｐ２０１１−５１０６８３Ａ）
【公表日】平成２３年４月７日（２０１１．４．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５４６０１３（Ｐ２０１０−５４６０１３）
【出願日】平成２１年２月６日（２００９．２．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０３３２８７
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１００２６２
【国際公開日】平成２１年８月１３日（２００９．８．１３）
【出願人】（５９０００２６１１）コルゲート・パーモリブ・カンパニー (147)
【氏名又は名称原語表記】ＣＯＬＧＡＴＥ−ＰＡＬＭＯＬＩＶＥ ＣＯＭＰＡＮＹ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年４月７日（２０１１．４．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年２月６日（２００９．２．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０３３２８７
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１００２６２
【国際公開日】平成２１年８月１３日（２００９．８．１３）
【出願人】（５９０００２６１１）コルゲート・パーモリブ・カンパニー (147)
【氏名又は名称原語表記】ＣＯＬＧＡＴＥ−ＰＡＬＭＯＬＩＶＥ ＣＯＭＰＡＮＹ
【Ｆターム（参考）】
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