説明

口腔衛生組成物

本発明は、口腔衛生用途に使用するためのアルケミラ・ウルガリス、アルケミラ・ウルガリスを含む経口組成物、および、好ましくは、動物の口腔における、歯垢の低減または抑制、および/または歯垢の細菌量の変更を通じた、動物の口腔衛生の改善または維持における、アルケミラ・ウルガリスまたは前記組成物の使用に関する。本発明はまた、動物の歯肉炎の予防または治療に使用するためのアルケミラ・ウルガリスを含む。本発明は、動物の口腔衛生を改善または維持する方法についても提供する。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、口腔衛生用途に使用するためのアルケミラ・ウルガリス(Alchemilla vulgaris)、アルケミラ・ウルガリスを含む経口組成物、および、好ましくは、動物の口腔における、歯垢の低減または調節、および/または歯垢の細菌量の変更を通じた、動物の口腔衛生の改善または維持における、アルケミラ・ウルガリスまたは前記組成物の使用に関する。本発明はまた、動物の歯肉炎の予防または治療用途のアルケミラ・ウルガリスを含む。本発明は、動物の口腔衛生を改善または維持する方法についても提供する。
【背景技術】
【0002】
動物における口腔衛生の維持または改善の必要性は、非常に重大である。口腔衛生の不良は、歯周疾患(歯肉炎)、および最終的には、動物の健康にとって深刻な影響を有しうる、歯の喪失につながる可能性がある。
【0003】
口腔衛生の不良は、多くの疾患および病状によって起因しうる。ネコおよびイヌに最もよく見られる疾患の1つは、歯周疾患である。歯周疾患は、すべてのネコおよびイヌの一生のある時期において、影響を及ぼす。歯周疾患のすべての事例における病原体は、歯垢である。
【0004】
愛玩動物における歯垢の形成(および歯肉炎などの関連する症状)を低減または調節するための現在の食餌方法は、通常、動物が咀嚼または摂食する際に、歯から歯垢をこすり落とす作用をする、硬い噛み物(chews)またはトリーツ(treats)などの機械的手段である。機械的手段は、その効果をテクスチャに依存しており、その手段が破損に耐え、したがって咀嚼の際の歯磨き時間を増加させるためには、もろいよりは噛み応えのあるテクスチャが好ましい。ネコは、長時間咀嚼することへの熱中度がイヌよりも低い。したがって、種々の動物用の製品は、これらのさまざまな選好を考慮して、テクスチャが異なっている。
【0005】
テクスチャ加工された玩具を用いて、テクスチャ加工された表面を提供する任意の製品を動物が摂取することなく、歯の表面から機械的に歯垢を除去してもよい。
【0006】
しかしながら、テクスチャ加工された食材または玩具などの機械的手段による歯垢の除去は、歯の表面から歯垢をこすり落とすために、動物がその機械的手段の咀嚼に十分な時間をかけることに依存している。その所要時間を見積もり、監視することは難しい。加えて、口腔内のすべての歯の表面の歯垢の調節は、機械摩耗だけでは達成することが困難であり、特定の歯は、他の歯よりも効率よく歯垢の除去を受けることとなる。
【0007】
歯垢は、ブラッシングによる歯磨きによっても除去または低減されうる。しかしながら、飼い主による歯磨きの順守は低く、その結果、毎日、歯磨きによる口腔ケアを受けているイヌおよびネコはほとんどいない。
【0008】
歯垢の除去のための機械的手段の代替として、クロルヘキシジンおよびトリクロサンなどの特定の合成化合物を抗菌剤として使用して、歯垢を低減させることができる。しかしながら、これらの化合物は、広範囲に及ぶ抗菌剤であり、したがって、定期的に摂取すると、健全な腸内細菌叢群のバランスを崩す可能性がある。さらには、特定の歯垢細菌は歯周の健康と関係しており、幅広い抗菌効果を伴う処理は、これらの個体群を破壊し、実質的に、健全な口腔の細菌叢を低減させる結果となり、口腔衛生の低下につながるであろう。
【0009】
歯の表面の細菌性バイオフィルムの蓄積は、十分に対処しない場合には、歯肉炎の原因となりうる。歯肉炎は、歯肉線上に蓄積した歯垢によって生じる歯肉の炎症である。それは、歯肉の痛み、発赤、および出血を生じさせうる。
【0010】
口腔衛生の不良のさらなる有力な要因は、歯石である。歯石は、正常の場合、歯磨きによっては除去することができず、歯の表面に蓄積し、歯肉組織を刺激し、歯肉炎を生じさせる。これは、口腔衛生が不良である、または低下していることのさらなる徴候である。
【0011】
トリポリリン酸ナトリウムなどの歯石形成抑制剤をペットの食材および人間の口腔衛生製品に加えることは、歯石の蓄積予防の助けとなる。しかしながら、これは、動物の口腔衛生上、歯周疾患の有害な影響の一因となっている歯垢内の細菌群組成に対処するものではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0012】
したがって、動物における歯垢の影響を、特に、自然な方法で、単に機械的手段、あるいは合成化学物質または化合物に頼らずに、動物にストレスを与えることなく、低減させることが必要とされている。さらには、動物における歯肉炎の予防および治療も依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【0013】
したがって、本発明は、動物における口腔衛生の改善または維持に使用するアルケミラ・ウルガリスを提供する。本発明を、以下の非限定的な例および図に関連して、説明する。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】未処理対照の割合で表示した、処置された単一種のバイオフィルムから培養したPeptostreptococcus stomatisコロニーにおけるアルケミラ・ウルガリスの効果。未処理CFU(コロニー形成単位)(100%)=1.34×10
【発明を実施するための形態】
【0015】
アルケミラ・ウルガリス(マータス・コミュニス(Myrtus communis))は、南欧および北アフリカ原産のフトモモ科(Myrtaceae)の顕花植物である。
【0016】
本発明者らは、アルケミラ・ウルガリスが、動物の口腔衛生を改善および/または維持可能であることを、偶然にも見出した。
【0017】
アルケミラ・ウルガリスは、好ましくは、動物の歯垢を調節または低下させることによって、動物の口腔衛生を改善または維持し、それによって、歯垢および/またはプラークによって生じる疾患を引き起こす因子が、動物の口腔において低減されることを意味する。
【0018】
歯垢は、好気性および嫌気性の細菌からなる、混合細菌群である。歯垢は個体間で変化しうるが、その形成過程は、(i)第1のコロニー形成(付着)、(ii)第2のコロニー形成(共凝集)、および(iii)成熟(病原性)の3つの重要事象に分けることができる。
【0019】
歯垢の発達は、歯の表面が、歯の唾液ペリクルといわれる、タンパク質および糖タンパク質のフィルムで覆われることから始まる。細菌の先駆種が唾液ペリクル内の分子に付着し、最初に単層を、次いで歯の表面に垂直に細菌の垣を形成する(pallisades)。
【0020】
細菌は、弱い引力によって短時間保持され、その間に、多くの特異的付着メカニズムが、かなりの時間、表面の近くに細胞を保持する。これらの特異的相互作用は、場合によっては細胞表面から突き出る微細線維または線毛と呼ばれる繊細な構造を含みうる、レクチン様の、静電気的および疎水的相互作用の組合せでありうる。その後、初期の付着は細胞外ポリマーの産生によって、実質上不可逆になる。
【0021】
ヒトでは、連鎖球菌は、唾液ペリクルに付着するすべての細菌の47〜52%を構成する、最も一般的な主要な定着菌群である。
【0022】
この初期段階の間およびその後、種々の細菌による第2のコロニー形成が生じ、細菌多様性の大幅な増加に至る。第2のコロニー形成の事象の中で最も重要なのは、共凝集の過程であり、それによって主要な定着菌群がコロニー形成の基質として作用する。
【0023】
共凝集は、「混合性の細胞凝集が形成されるような、2種類の異なる細菌性細胞型の表面分子間の認識」であるとされている。共凝集はまた、「懸濁液におけるパートナー細胞間の付着」ともいわれている。
【0024】
共凝集は、特定の細菌「パートナー」間に生じる、きわめて特異的な過程である。各株は、独自のパートナー、および、細胞−細胞間の認識メカニズムを有している。他のいくつかの株と共凝集することのできる株群も存在する。人体研究に基づいて、これらのその後に定着菌群の中心となる、このような生命体の1つは、成熟した歯垢における主要な生命体である、フソバクテリウム・ヌクレアタムである。
【0025】
共凝集は、人の歯垢形成において重要な役割を果たすことが知られている。イヌの口腔細菌の異なる株間の共凝集は、他の動物における歯垢の形成および発達におけるこの作用と同様の役割を示すことが、インビトロで測定されている。
【0026】
歯垢のバイオフィルムの発達の間のある時点において、すべての組成における変化率が遅くなる。バイオフィルムがこの段階に達するには数日かかると考えられているが、それが起こる時点については現在のところ判明していない。
【0027】
ヒトの歯垢では、一連の細菌種は、グラム陽性の球菌および桿菌として生じ、次第に、グラム陰性の、フィラメント状および鞭毛を有する生命体に置き換わる。成熟したバイオフィルムもまた、深さが増加するにつれて、次第に嫌気性になる傾向にある。
【0028】
この時点では、バイオフィルムは極相群落に達しているといわれ、そこでは、多くの細菌はその生存をバイオフィルム内の他の細菌に依存している。この段階では、歯周疾患に関連する多くの生命体が存在する。これらの細菌は、プロテアーゼおよび溶血素など、歯周疾患の病原因子である、多くの化合物を産生する。プロテアーゼ、特にトリプシンは、免疫グロブリンを分解し、サイトカインおよびそれらの受容体を不活性化し、宿主組織を分解し、口腔内の出血を促進する能力を含む、多くの能力を有することが報告されている。歯垢の細菌は、歯垢のバイオマスとして知られている。
【0029】
ポルフィロモナス属、バクテロイデス属、およびプレボテラ属などの黒色色素産生性嫌気性菌に加えて、ペプトストレプトコッカスなどの病原菌も、しばしば歯垢中に存在し、そのすべてが病状の一因となると考えられている。
【0030】
本発明のアルケミラ・ウルガリスは、これらのバイオフィルムの形成の抑制、および/またはバイオフィルムの有害な活性の抑制に有用であり、したがって、動物における歯垢の調節または低減による口腔衛生の改善または維持に役立つ。本発明のアルケミラ・ウルガリスは、動物における歯肉炎の予防または治療も提供する。
【0031】
バイオフィルムにおける病原菌のレベルの低下によって、歯垢の衛生が改善される。したがって、本発明のアルケミラ・ウルガリスは、歯垢の細菌量を変化させるのに有用であり、動物の口腔における歯垢の病原菌量を低減させることが好ましい。アルケミラ・ウルガリスはまた、歯垢の健全な細菌の増殖を促進しうる。本発明のアルケミラ・ウルガリスは、動物の口腔に存在する歯垢の衛生の改善に有用である。
【0032】
本発明のアルケミラ・ウルガリスは、動物の歯垢における炎症性プロテアーゼおよび/または黒色色素産生性嫌気性菌のレベルを低減することが好ましい。これらは、歯垢に認められる重要な疾患を引き起こす因子である。
【0033】
アルケミラ・ウルガリスは、ペプトストレプトコッカス種を含むであろう、歯垢中の病原菌を抑制または低減させることが最も好ましい。
【0034】
本発明のアルケミラ・ウルガリスは、ヒトを含む任意の動物に適している。しかしながら、好ましい実施の形態では、動物は愛玩動物またはヒトである。愛玩動物については、ペットとして飼育されている任意の動物を意味し、ネコ、イヌ、ウマ、ウサギ、またはモルモットが挙げられる。組成物は、ネコ、またはイヌ、もしくはヒト用であることが好ましい。
【0035】
当業者には、アルケミラ・ウルガリスを称するのに他の名称が用いられることが理解されよう。
【0036】
本発明のアルケミラ・ウルガリスは、植物全体またはその一部でありうる。それは、根、樹皮、茎、葉またはそれらの任意の組合せであって構わない。アルケミラ・ウルガリスは、乾燥、粉砕、粉末化、または細断されてもよい。アルケミラ・ウルガリスは、アルケミラ・ウルガリスの樹皮であることが好ましい。
【0037】
追加で、または代替として、アルケミラ・ウルガリス抽出物を使用してもよい。適切な抽出物として、メタノール抽出物、エタノール抽出物、クロロフォルム抽出物または水抽出物が挙げられる。
【0038】
本発明の第2の態様は、アルケミラ・ウルガリスを含む経口組成物を提供する。
【0039】
アルケミラ・ウルガリスは、組成物の0.1〜20重量%の量で含まれて差し支えなく、1〜15重量%がさらに好ましく、3〜10重量%がさらになお好ましく、あるいは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10重量%の量で含まれうる。アルケミラ・ウルガリスは、組成物の約3重量%の量で含まれることが最も好ましい。
【0040】
組成物には、アルケミラ・ウルガリスが、口腔衛生の改善または維持に関する唯一の活性成分として含まれうる。あるいは、組成物には、1種類以上のさらに口腔衛生を改善または維持する、または歯垢を低減または調節する成分を含む、混合物の一部として、アルケミラ・ウルガリスが含まれうる。
【0041】
本明細書では以後、「経口組成物」という用語は、食材、食餌およびサプリメントを含む、動物の口腔、好ましくは動物の歯の表面と接触した状態になるすべての組成物に及ぶ。任意のこれらの形態は、固体、半固体、または液体でありうる。組成物は、ペーストまたはゲルであってもよい。
【0042】
組成物は、歯垢における疾患を引き起こす因子および/またはバイオマスの低減または抑制によって、動物における歯肉炎の予防または治療を含む口腔衛生の改善または維持、もしくは、動物における歯垢を調節または低減させることを目的として、アルケミラ・ウルガリスを十分な量で含まない任意の食材に加えるべきサプリメントの形態であって差し支えない。
【0043】
サプリメント中のアルケミラ・ウルガリスの濃度は、動物の主要な食餌または食材に加えて使用して差し支えない。これは、動物の食餌に多少のサプリメントを含めることによって、または動物に多少のサプリメントを追加的に与えることによって行ってよい。サプリメントは、動物に与える前に希釈を要する、本発明のアルケミラ・ウルガリス組成物を極めて高濃度で含む食材として形成されうる。サプリメントは、固体(例えば、粉末)、半固体(例えば、食品に似た硬さ/ゲル)、液体、ペーストを含む任意の形態であって差し支えなく、あるいは、錠剤またはカプセルの形態であってもよい。液体は、便利には、食品に混練することができ、あるいは、例えばスプーンまたはピペットのような器具で、動物に直接与えてもよい。サプリメントは、本発明の1種類以上の成分の割合が高くて差し支えなく、あるいは、各部分が1種類以上の成分を所要の濃度で含む、少なくとも2つの部分を合わせたパックの形態であってもよい。
【0044】
アルケミラ・ウルガリスまたはアルケミラ・ウルガリスを含む組成物は、市販用ペットフード製品組成物、あるいは、市販用の栄養補助食品組成物中に取り込まれることが好ましい。ペットフード製品は、乾燥、半乾燥、湿り気のある、または液体(飲料)製品であって差し支えない。湿り気のある製品として、スズまたはホイル容器中の固体であって、70〜90%の水分含量を有する食品が挙げられる。乾燥製品には、同様の組成を有するが、5〜15%の水分含量を有し、ビスケット様のキブル(kibbles)として存在する食品が挙げられる。組成物が、食餌、食材、またはサプリメントを含む場合には、パッケージ化されることが好ましい。このようにすると、消費者はパッケージから、食品中の成分を認識し、対象とする動物に適していることを認識することができる。パッケージは、金属(通常、スズまたはフレキシホイル(flexifoil)の形態である)、プラスチック、紙、またはカードであって差し支えない。製品中の水分量は、使用可能な、または所望されるパッケージの種類に影響を及ぼしうる。
【0045】
本発明に従った組成物は、動物が、その食餌で消費しうる任意の製品を含む。したがって、本発明は、ペットフードスナック(例えば、スナックバー、ビスケット、および甘味製品)のみならず、人または他の動物用の基本的食品にも及ぶ。組成物は加熱調理製品でもよい。それに、肉または動物由来の材料(ウシ、鶏、七面鳥、子羊、血漿、髄骨など、またはそれらの2つ以上の組合せ)を取り込んでもよい。あるいは、組成物は、タンパク質源を提供するために肉を含まなくてもよい(大豆、トウモロコシグルテン、または大豆製品などの肉代替物を含むことが好ましい)。組成物は、大豆タンパク質濃縮物、ミルクタンパク質、グルテンなどの追加のタンパク質源を含みうる。組成物は、1種類以上の穀物(例えば、小麦、トウモロコシ、米、カラスムギ、オオムギ)などのデンプン源を含んでもよく、あるいは、デンプンを含まなくてもよい。典型的な乾燥した市販のイヌおよびネコ用の食品は、約30%の粗タンパク質、約10〜20%の脂肪を含み、残りは食物繊維およびアッシュを含む炭水化物である。典型的なウェット、または湿り気のある製品は、(乾燥重量当たり)約40%の脂肪、50%のタンパク質を含み、残りは繊維およびアッシュである。本発明の組成物は、ネコ、イヌまたは任意の他の愛玩動物、もしくはヒト用の食餌、食材またはサプリメントとしての販売される、本明細書に記載するような食材に特に好適である。
【0046】
本明細書では、「飼い」イヌおよび「飼い」ネコという用語は、イヌおよびネコ、特に、フェリス・ドメスティクス(Felis domesticus)およびカニス・ドメスティクス(Canis domesticus)を意味する。
【0047】
組成物は、主要な食事の食材に加えて動物に消費させうる、噛み物(チュー)またはトリーツに施用、または取り込んで差し支えない。組成物は、主要な食事の食材にコーティングとして、または取り込んで提供されてもよい。
【0048】
あるいは、組成物は、動物用玩具などの非摂食性の製品にコーティングとして施用されうる、液体、ゲル、ペーストなどであってもよい。組成物は、製品内に取り込まれてもよい。動物が玩具を咀嚼する際に、組成物が動物の口腔の一部またはすべてと接触した状態になり、動物の口腔衛生を改善または維持する。
【0049】
組成物が噛み応えのある、または硬い製品内に取り込まれるか、または表面にコーティングされる場合、組成物中のアルケミラ・ウルガリスの作用はもちろんのこと、動物の歯に対する製品の機械的作用を通じて歯垢を除去することによって動物の口腔衛生が改善または維持されるという追加的利益が達成される。
【0050】
アルケミラ・ウルガリスによる、ある歯垢バイオフィルム形成細菌の抑制は、歯垢の細菌量の低下による動物の歯垢の調節または低減につながる。
【0051】
動物の口腔衛生を改善または維持するために、組成物を任意のレベルの口腔衛生を有する動物に使用して差し支えない。
【0052】
口腔衛生を維持するために、組成物を、良好な、または許容できる口腔衛生を有する動物に使用してもよい。この場合における組成物は、歯垢形成を調節し、動物の歯周の健康における、ある歯垢細菌の破壊的影響を最小限に抑えうる。
【0053】
あるいは、動物の口腔衛生を改善するため、組成物を口腔衛生の不良な動物に使用してもよい。口腔衛生の改善は、さらなる歯垢の蓄積を調節することによってなされ、最も重症度の高い段階への疾患の進行を遅らせうる。それは、動物の歯の表面にすでに存在する歯垢をも低減させうる。中等症から重症の歯周疾患の事例では、動物は、口腔衛生の利益を達成し、将来の獣医および/または歯科治療の頻度を低減させるために、組成物の使用前に、獣医または歯科治療を必要とする場合がある。
【0054】
組成物は、経口組成物である。経口組成物については、使用の間に、動物の口腔が組成物に晒されることを意味し、組成物が動物の歯の表面と直接接触することが好ましい。歯の表面が組成物のアルケミラ・ウルガリスと直接接触することが最も好ましい。
【0055】
これらの経口組成物としては、練り歯磨き、うがい薬、または任意の他のゲル、液体またはペーストなどが挙げられる。経口組成物は、先に定義されたような食材であってもよい。
【0056】
本発明の第3の態様は、動物の口腔衛生を改善または維持するための組成物の製造におけるアルケミラ・ウルガリスの使用を提供する。口腔衛生は、疾患を引き起こす因子、バイオマス、または病原菌の低減および/または抑制を含む、動物における歯垢を調節または低減させることにより、改善または維持されることが好ましい。本発明の組成物の製造および歯肉炎の治療におけるアルケミラ・ウルガリスの使用についても提供する。
【0057】
本発明は、第4の態様として、動物にアルケミラ・ウルガリスまたは第2の態様の組成物を投与する工程を含む、動物の口腔衛生を改善または維持する方法も提供する。本方法は、先に定義したように、動物における歯垢を低減または調節することによって動物の口腔衛生を改善または維持することが好ましい。
【0058】
第4の態様の方法では、食材に含めることを通じた組成物の消費によって、または、動物が咀嚼する玩具上の組成物を含むコーティングによって、動物の口腔が組成物に晒される。
【0059】
本方法は、不良な口腔衛生、または歯垢、歯肉炎、または歯周疾患の影響を受けやすい動物に使用されることが好ましい。
【0060】
組成物を、不良な口腔衛生を有する動物に投与して、そこに含まれる歯垢または因子の量を低減させ、次いで、摂食の継続により、さらなる歯垢の形成、あるいは、そこに含まれる1つ以上の因子を、調節、低減または抑制してもよい。動物は、アルケミラ・ウルガリスまたは組成物の有益な効果が見られるように、組成物の使用前または使用の間に、歯石の沈着を除去するため、獣医および/または歯の治療を必要とする場合がある。
【0061】
口腔衛生の不良については、当業者に認識されるように、歯石および歯垢の蓄積、歯肉炎、口臭、歯肉退縮の存在、および/または歯周ポケットを含む、この状態の多くの徴候の存在を意味している。
【0062】
本発明の各態様のすべての特性は、当業者に認識されるように、必要な変更を加えた、すべての他の態様に関係している。
【実施例】
【0063】
アルケミラ・ウルガリスを、次のインビトロ実験によって、動物における歯垢を調節または低減させる能力について試験した。歯肉縁上の歯垢をネコから採取し、下記のようなさまざまなアッセイを行い、アルケミラ・ウルガリスが動物の口腔衛生を改善または維持する能力を有するか否かについて判断した。
【0064】
実施例1
最初のアッセイは、アルケミラ・ウルガリスが、口腔衛生を改善または維持するため、動物における使用に適しているか否かの判断を補助するために、設定された。
【0065】
これらのアッセイには、歯垢形成細菌株の付着を抑制する能力、および、これらの細菌株におけるプロテアーゼの産生を抑制する能力が含まれていた。
【0066】
アルケミラ・ウルガリスは、バイオフィルム形成細菌株の付着を最大で100%抑制し、プロテアーゼの産生を最大で66%抑制した。アルケミラ・ウルガリスはまた、試験した8種の細菌株のうちの2種において、溶血の抑制を示した。
【0067】
これらの結果は、アルケミラ・ウルガリスが、望ましくない口腔細菌を抑制可能であることを示唆しており、したがって、口腔衛生を改善または維持する能力について、さらなるアッセイを行った。
【0068】
実施例2
アッセイ接種材料:ネコからの歯垢および唾液の摂取
アッセイには、接種用に、ネコの新鮮な歯肉縁上の歯垢および唾液が必要とされる。接種材料は、さまざまな年齢、品種、および口腔衛生状態にある、18匹のネコの群からサンプリングした、プールされた歯垢およびフィルタ処理されていない唾液からなる。
【0069】
歯垢および唾液を人工唾液に再懸濁して約10%の歯垢および30%の唾液の接種材料を形成した。
【0070】
アッセイの設定
プレートバイオフィルムアッセイ(PBA)は、24ウェルプレートフォーマットを使用し、代表的なネコの歯垢であるバイオフィルムをヒドロキシアパタイト(HA)ディスク上で増殖させる。24ウェルアッセイプレートに取り込ませる前に、各HAディスクを、2時間、ネコの人工唾液中50%のフィルタ殺菌したネコの唾液の溶液で前処理する。前処理工程は、HAディスク表面の唾液ペリクルの形成に刺激を与える。前処理の後、各HAディスクをそれぞれ、24ウェルプレート上のウェルに置く。接種材料を2等分し、その一方に好適な濃度で活性を加える。他方は対照(非活性)を意味する。1mlの接種材料を各ウェルに加え、アッセイプレートを38℃で48時間、好気的に振とう培養する。24時間および30時間後、ディスクを、上述と同様に、活性を好適な濃度で含む、新鮮な人工唾液中に移動させる。48時間後、アッセイのため、バイオフィルムで覆われたHAディスクをアッセイプレートから取り出す。各HAディスクを、バイオマスの定量化に使用されるものを除いて、500μlのPBSに入れ、ボルテックスで30秒間混合し、ディスクから増殖したバイオフィルムを溶液中に移す。次に、バイオフィルム懸濁液を分析に使用する。バイオマスの定量化に用いられている、バイオフィルムで覆われたHAディスクを24ウェルアッセイプレートから取り出し、直接、クリスタル・バイオレットアッセイに使用する。
【0071】
実施例3
PBAにおいて試験されたアルケミラ・ウルガリス抽出物
ネコのPBAにおける試験に用いられたアルケミラ・ウルガリスの抽出物は、初期のスクリーニング回で良好な活性を示したことから、メタノール抽出物(M)であった。抽出は前述の通りに行なった。
【0072】
加えて、クロルヘキシジン(Lloyds Pharmacy社製)を、標準的判断基準(gold standard reference)、または陽性対照として含めた。しかしながら、クロルヘキシンは、合成化学物質であり、純粋な形態で使用される化学物質である場合には潜在的な毒性効果を有しうることから、動物用組成物の用途には望ましくない。
【0073】
実施例4
バイオフィルムの測定
ネコのPBAで産生されたバイオフィルム、ならびに、バイオフィルムの発達におけるアルケミラ・ウルガリスおよび非植物性化合物の効果を評価するため、以下の分析が用いられた:
バイオマスの定量化(クリスタル・バイオレットアッセイ)
プロテアーゼ活性
細菌の生菌数
各アッセイの簡単な説明を以下に示す。
【0074】
バイオマス
HAディスク上で増殖させたバイオフィルムの総量を、クリスタル・バイオレット染色法を用いて定量化した。バイオマスは、対照と比較したサンプルの595nmにおけるOD測定値(OD595)に直接比例することが示された。結果は、ディスク上で増殖させたバイオフィルムの量における活性処理の効果を反映して、非活性対照と比較して、活性処理されたサンプルでは、OD595における低下が見られることを示した。
【0075】
アルケミラ・ウルガリスはバイオマスを最大85.6%低減させた。
【0076】
プロテアーゼ活性
トリプシン様プロテアーゼ活性を、液体BAPNAアッセイ、すなわち、サンプル中に存在するトリプシンの量が発色強度に直接的に比例する、比色分析を用いて測定した。サンプルをトリプシン標準曲線に対して定量化し、結果を、対照と比較した活性処理サンプル中のプロテアーゼ活性の抑制の%割合として表した。
【0077】
アルケミラ・ウルガリスは、プロテアーゼの産生を100%削減させた。
【0078】
細菌数
細菌の生菌数を、ヘミンおよびメナジオンを補充したコロンビア血液寒天プレートを用いて定量化した。好気性菌は2日間培養後にカウントし、黒色色素産生性細菌コロニー(BPC)を含む嫌気性菌に関しては、適切な条件で9日間培養後にカウントした。プレートカウント数をコロニー形成単位(cfu)/mlとして表し、対照と活性プレートの差分を対数で表示した。
【0079】
アルケミラ・ウルガリスは、対照と比較して、黒色色素産生性細菌コロニーのプレートカウント数を、対数で5.9低減させた。
【0080】
実施例5
データの統計分析
各サンプルをアッセイ内で5回繰り返した。別記されない限り、すべての抽出物は、アッセイにおいて、500μg/mlの濃度で試験された。各サンプルについて、得られたすべての値を対数化し、対数値から平均値を算出した。
【0081】
次に、不等分散を伴う両側t−検定(2-tailed t-test)を行った。不等分散分析は、個々の分析が独立しているものとして選択されており、言い換えれば、その測定値は、互いに比較することができない。各データセットについてp値を取得し、これらにデータの再現性の指示を与えた。
【0082】
結果
試験において、アルケミラ・ウルガリスがどのように機能したかをまとめた表を以下に示す。好気性菌、嫌気性菌、および黒色色素産生性細菌コロニー(BPC)を対数減少値として表示し、プロテアーゼおよびバイオマスについては%減少値として表示した。
【表1】

【0083】
アルケミラ・ウルガリスは、黒色色素産生性細菌コロニーのカウント数、プロテアーゼ産生およびバイオマスにおいて顕著な抑制効果を有していた。
【0084】
カメリア・シネンシスが、ヒトの歯垢細菌に強力な作用を有することは、当技術分野においてよく知られている。上記結果から、アルケミラ・ウルガリスが、カメリア・シネンシスよりもネコの歯垢における歯垢細菌の抑制に有効であり、したがって、動物における口腔衛生の維持または改善に使用する、驚くべき、新規な植物成分を提供することが分かる。
【0085】
実施例6
原料の試験
アルケミラ・ウルガリスの生の植物材料についても、上述の抽出物と同様にプレートバイオフィルムアッセイで試験した。250μmの細孔サイズの篩を通して生の植物材料を調製し、アッセイにおいて5000μg/mlで試験した。生の材料は、バイオフィルムの抑制にも有効であり、バイオマスを最大83.8%低減し、プロテアーゼを最大82.4%低減した。
【0086】
実施例7
ヒトの歯垢分離株(plaque isolates)の抑制
アルケミラ・ウルガリスの粉末についても、ヒトの歯垢に通常見られる有機体であるPeptostreptococcus stomatisを用いた、ヒト用のプレートバイオフィルムアッセイにおける、バイオフィルムの形成の抑制について、試験した。各試験薬の最終的な濃度は250μl/mlであった。試験は、アッセイごとに5回繰り返した。
【0087】
ヒドロキシアパタイトディスクを、人工唾液(Prattenら、1998年)中でPeptostreptococcus stomatisと共に培養する前に、室温で2時間、20%の殺菌し、プールされたヒト唾液中で培養した。歯周炎の開始および進行の間の歯肉縁下の窪みに見られる条件を模倣して、バイオフィルムを、37℃で24時間、嫌気性条件(10%H2、10%CO2、80%N2)で培養した。
【0088】
バイオフィルムを分散させ、逐次希釈した後、嫌気性条件下でインキュベートする前に、ヘミンおよびメナジオン(5mg/ml)を含むコロンビア血液寒天上に固定した。37℃で24時間増殖させた後、コロニー数をカウントした。
【0089】
図1に示すように、アルケミラ・ウルガリスを用いたバイオフィルムの処理は、未処理対照および口腔衛生用途において通常用いられる天然植物であるユーカリの葉の粉末て処理したものと比較して、ペプトストレプトコッカス(Peptostreptococcus)のバイオフィルムにおける細菌数を低減させた。
【0090】
実施例8
さまざまな製品用途では、最高120℃までの温度に曝露された後にも、原料の活性が残存することが必要とされるであろう。これを試験するため、アルケミラ・ウルガリスを120℃で10分間加熱し、その活性を、非加熱処理対照と比較する、プレートバイオフィルムアッセイで試験した。
【0091】
上述のように、アルケミラ・ウルガリスの加熱処理は、その能力に影響を与えない。加熱処理されたアルケミラ・ウルガリスは、非加熱対照の45.2%と比べて、バイオマスを66.2%低減させる。プロテアーゼ産生は、加熱処理した材料および非加熱処理材料の両方によって100%抑制される。

【特許請求の範囲】
【請求項1】
動物の口腔衛生の維持または改善用のアルケミラ・ウルガリス。
【請求項2】
動物の歯肉炎の予防および治療用であることを特徴とする請求項1記載のアルケミラ・ウルガリス。
【請求項3】
前記アルケミラ・ウルガリスが、前記動物の口腔の歯垢および/またはプラークによって産生される疾患を引き起こす因子を低減、抑制または調節することを特徴とする請求項1または2記載のアルケミラ・ウルガリス。
【請求項4】
前記アルケミラ・ウルガリスが、前記動物の口腔内の歯垢の細菌量を変化させることを特徴とする請求項1〜3いずれか1項記載のアルケミラ・ウルガリス。
【請求項5】
前記アルケミラ・ウルガリスが、前記細菌量を低減させることによって前記細菌量を変化させることを特徴とする請求項4記載のアルケミラ・ウルガリス。
【請求項6】
前記アルケミラ・ウルガリスが、前記動物の口腔に存在する歯垢の衛生を改善することを特徴とする請求項1〜5いずれか1項記載のアルケミラ・ウルガリス。
【請求項7】
前記アルケミラ・ウルガリスが、歯垢における炎症性プロテアーゼおよび/または病原菌を低減または抑制することを特徴とする請求項1〜4いずれか1項記載のアルケミラ・ウルガリス。
【請求項8】
前記病原菌が黒色色素産生性嫌気性菌を含むことを特徴とする請求項7項記載のアルケミラ・ウルガリス。
【請求項9】
前記病原菌がペプトストレプトコッカス(Peptostreptococcus)を含むことを特徴とする請求項7項記載のアルケミラ・ウルガリス。
【請求項10】
前記動物がネコ、イヌ、またはヒトであることを特徴とする請求項1〜9いずれか1項記載のアルケミラ・ウルガリス。
【請求項11】
アルケミラ・ウルガリスを含む経口組成物。
【請求項12】
請求項1〜10いずれか1項に記載された用途のための請求項11記載の組成物。
【請求項13】
前記アルケミラ・ウルガリスが、前記組成物中に0.1〜20重量%の濃度で存在することを特徴とする請求項11または12記載の組成物。
【請求項14】
前記組成物が食材であることを特徴とする請求項11〜13いずれか1項記載の組成物。
【請求項15】
動物の口腔衛生の改善または維持のための組成物の製造におけるアルケミラ・ウルガリスの使用方法。
【請求項16】
動物の歯肉炎の予防または治療のための組成物の製造におけるアルケミラ・ウルガリスの使用方法。
【請求項17】
前記組成物が、前記動物の歯垢を低減または調節することを特徴とする請求項15または16記載の使用方法。
【請求項18】
アルケミラ・ウルガリスまたは請求項11〜14いずれか1項記載の組成物を有効量で動物に投与する工程を含む、動物の口腔衛生を維持または改善する方法。
【請求項19】
実質的に実施例に記載されている用途のアルケミラ・ウルガリス。
【請求項20】
実質的に実施例に記載されている、経口組成物。
【請求項21】
実質的に実施例に記載されている、動物の口腔衛生を維持または改善する方法。

【図1】
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【公表番号】特表2010−513431(P2010−513431A)
【公表日】平成22年4月30日(2010.4.30)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2009−542181(P2009−542181)
【出願日】平成19年11月27日(2007.11.27)
【国際出願番号】PCT/GB2007/004522
【国際公開番号】WO2008/074978
【国際公開日】平成20年6月26日(2008.6.26)
【出願人】(390037914)マース インコーポレーテッド (80)
【氏名又は名称原語表記】MARS INCORPORATED
【Fターム(参考)】