可溶性ポリペプチドの単離方法
【課題】物物理学的特性（可溶性、高い発現及び／又は安定性）が改良されたポリペプチド、特に抗体フラグメントを同定するハイスループットスクリーニング方法を提供する。
【解決手段】任意のポリペプチド配列を発現することができるファージディスプレイライブラリを得る工程、ライブラリファージによる細菌層の感染を可能にする工程、及び細菌層上の平均よりも大きいプラークを形成するファージを同定する工程を包含する、望ましい生物物理学的特性を有するポリペプチド（単量体のヒトＶＨ及びヒトＶＬを含む）を同定する方法。前記、望ましい生物物理学的特性を有するポリペプチドの、免疫治療、又は診断用薬剤としての使用。
【解決手段】任意のポリペプチド配列を発現することができるファージディスプレイライブラリを得る工程、ライブラリファージによる細菌層の感染を可能にする工程、及び細菌層上の平均よりも大きいプラークを形成するファージを同定する工程を包含する、望ましい生物物理学的特性を有するポリペプチド（単量体のヒトＶＨ及びヒトＶＬを含む）を同定する方法。前記、望ましい生物物理学的特性を有するポリペプチドの、免疫治療、又は診断用薬剤としての使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリペプチド、特に単量体のヒト抗体フラグメントの単離、同定及び操作に関する。
【背景技術】
【０００２】
脊椎動物の抗体は通常、一対の重（Ｈ）鎖及び軽（Ｌ）鎖から構成される。組み合わされたＨ鎖及びＬ鎖の最初のドメインであるＶＨ及びＶＬは配列においてより可変的であり、抗原を認識し、抗原に結合する抗体部分である。ＶＨドメイン及びＶＬドメインは対で抗原を認識する。
【０００３】
ラクダ科（ラクダ、ヒトコブラクダ及びラマ）の免疫レパートリは、重鎖抗体と呼ばれる変わった種類の抗体を保有するという点で、特殊である(Hamers, Casterman C. et al., 1993)。これらの抗体は軽鎖を欠いており、したがってこれらの組み合わせ部位はＶＨ
Ｈと呼ばれる１個のドメインから構成される。
【０００４】
組み換え型ＶＨＨの単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）は、従来の四本鎖抗体由来の一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントに勝る幾つかの利点を提供する。ｓｄＡｂの親和性はｓｃＦｖの親和性と同程度であるが、ｓｄＡｂは、可溶性、安定性、凝集耐性、リフォールディング性、発現収率及びＤＮＡ操作の易操作性、ライブラリ構築並びに三次元構造決定といった点でｓｃＦｖより優れている。抗体を伴う適用において、上記のＶＨＨ ｓｄＡｂの特性の多くが望ましい。
【０００５】
しかし、ＶＨＨの非ヒト性質によって、免疫原性によるヒトの免疫療法におけるＶＨＨの利用が制限される。この点において、ヒトのＶＨ及びＶＬ ｓｄＡｂの免疫原性が最小であると考えられるので、免疫療法への適用に対する理想的な候補である。
【０００６】
しかし、ヒトのＶＨ及びＶＬは従来の抗体由来のＶＨ及びＶＬに共通の特徴である凝集の傾向が強い(Davies, J. et al., 1994; Tanha, J. et al., 2001; Ward, E. S. et al., 1989)。このように抗体用途に好適な単量体のヒトのＶＨ及びＶＬを得る試みが行われ
てきた。このようなＶＨ及びＶＬは、高い発現収率、高いリフォールディング性及び凝集耐性等のＶＨＨに一般的な他の有用な特性も示す。これらのＶＨ及びＶＬでライブラリ骨格として構築される合成ライブラリは、治療用の有望なタンパク質源として役立つ可能性がある。
【０００７】
ラクダ及びラマのＶＨＨからそれぞれ、ヒトのＶＨ又はＶＬに組み込まれる鍵となる可溶性残余物を伴うラクダ化(camelization)並びにラマ化(llamination)を利用して、単量
体のヒトのＶＨ及びＶＬを生成した。これらのＶＨ及びＶＬに基づき構築され、ＣＤＲランダム化により生成される合成ｓｄＡｂライブラリは、様々な抗原との結合因子を得るといった点で機能的であることが示された(Davies, J. et al., 1995; Tanha, J. et al., 2001)。
【０００８】
別の手法において、上記の技術的手段を用いることなく、完全なヒトの単量体のＶＨ及びＶＬをヒトの合成ＶＨ及びＶＬライブラリから単離した。一実験において、ヒトＶＨライブラリを鶏卵リゾチームに対してパンニングした(panned)時に単量体のヒトＶＨを発見した(Jesperps, L. et al., 2004b)。さらに最近では、可逆的非フォールディング及び親和性基準に基づく選択方法によって、合成ヒトＶＨライブラリから多くの単量体のＶＨが得られた(Jespers, L. et al., 2004a)。この知見は、適切な選択方法が望ましい生物物
理学的特性を有する珍しい単量体のヒトＶＨを効率的に捕捉する鍵となるという事実を明確に示していた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の第１の目的は、生物物理学的特性（可溶性、高い発現及び／又は安定性（熱変性後の高いリフォールディング、化学変性剤に対する高い耐性、及びプロテアーゼ、特にトリプシン等の胃腸プロテアーゼに対する高い耐性等）を含む）が改良されたポリペプチド、特に抗体フラグメントを同定するハイスループットスクリーニング方法を提供することである。
【００１０】
本発明の第２の目的は、単量体のヒトＶＨ及びヒトＶＬを同定するハイスループットスクリーニング方法を提供することである。
【００１１】
本発明の第３の目的は、単量体のヒトＶＨ及びヒトＶＬを同定、単離及び特徴付けすることである。
【００１２】
本発明の第４の目的は、抗体フラグメント、特に単量体のヒトＶＨ及びヒトＶＬの多量体を構築及び特徴付けることである。
【００１３】
本発明の第５の目的は、ポリペプチド、特に抗体フラグメント及び最も特定的には単量体のヒトＶＨ及びヒトＶＬからディスプレイライブラリを構築することである。
【００１４】
本発明の第６の目的は、ポリペプチド、特に抗体フラグメント及び最も特定的には生物物理的な特性が改良された単量体のヒトＶＨ及びヒトＶＬを生成するＤＮＡシャッフリング法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
発明の要約
ポリペプチド、好ましくは抗体フラグメント及び最も好ましくは望ましい生物物理学的特性（可溶性、安定性、高い発現性、単量体性、非凝集性、結合特異性）を有するヒトＶＨ及びヒトＶＬを単離する方法が提供される。この方法は、様々なポリペプチド配列を発現することができるファージディスプレイライブラリを得る工程、ライブラリファージによる細菌層の感染を可能にする工程、及び細菌層上の平均よりも大きいプラークを形成するファージを同定する工程を包含する。それからファージを単離し、シークエンシングか、又はそうでなければポリペプチド配列を特定するこれらの工程を用いる。
【００１６】
本発明は、上記の方法で同定されるポリペプチド、特に単量体のヒトＶＨ及びヒトＶＬも提供し、これは免疫療法に及び／又は診断用薬剤もしくは検出用薬剤として有用であり得る。単量体のヒトＶＨ及びヒトＶＬは組合せて、二量体、三量体、五量体又は他の多量体を形成してもよく、これは免疫療法に及び／又は診断用薬剤もしくは検出用薬剤として有用であり得る。
【００１７】
上記の方法によって同定されたポリペプチド（ヒトＶＨ及びヒトＶＬを含む）を、可溶性、安定性、単量体性、高発現性、結合特異性、及びヒト起源等の改良された生物物理学的特性のために選択するＤＮＡシャッフリング等の方法によって操作することができる。
【００１８】
上記の方法によって同定されたポリペプチド（ヒトＶＨ及びヒトＶＬを含む）は、さらにディスプレイライブラリを生成するのにも使用することがあり、これを同様に使用して、上記の方法によってさらにポリペプチドを単離することができる。
【００１９】
第１の態様において、本発明は、標的ポリペプチドを同定する方法であって、ａ）様々なポリペプチド配列を発現することができるファージディスプレイライブラリを得ること、ｂ）ライブラリファージによって、細菌層の感染を可能にすること、ｃ）細菌層上の平均よりも大きいプラークを形成するファージを同定することを含む、方法を提供する。
【００２０】
第２の態様において、本発明は、配列番号８〜配列番号５４から成る群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。
【００２１】
第３の態様において、本発明は、配列番号８〜配列番号２２から成る群より選択される少なくとも１個のアミノ酸配列を含むＶＨ抗体フラグメントを提供する。
【００２２】
第４の態様において、本発明は、配列番号２３〜配列番号５４から成る群より選択される少なくとも１個のアミノ酸配列を含むＶＬ抗体フラグメントを提供する。
【００２３】
第５の態様において、本発明は、望ましい生物物理学的特性を有するポリペプチドを生成する方法であって、ａ）請求項４１、４２、４４、４５、４７、４８、５９若しくは７０に記載の抗体フラグメントをコードするか、又は請求項２４、２７、３７若しくは３９に記載のポリペプチド配列をコードし、且つ第１の望ましい特性を有する少なくとも１個の第１の核酸配列を提供する工程と、ｂ）第２の望ましい特性を有する抗体フラグメントをコードする少なくとも１個の第２の核酸配列を提供する工程と、ｃ）少なくとも１個の第１の核酸配列及び少なくとも１個の第２の核酸配列をランダムなフラグメントに切断する工程と、ｄ）ランダムなフラグメントを再び集合化させる工程と、ｅ）ランダムなフラグメントを発現する工程と、ｆ）発現されたランダムなフラグメントを第１の望ましい特性及び前記第２の望ましい特性に関してスクリーニングする工程とを含む、方法を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
発明の詳細な説明
ヒト起源であり、可溶性、安定性、凝集に対する耐性、リフォールディング性、高発現性、及びＤＮＡレベルでの易操作性があり、ライブラリ構築及び三次元構造決定に理想的であるポリペプチド、特に抗体フラグメントを同定することが望ましい。このような抗体フラグメントは、多種の免疫療法への適用、並びに診断用薬剤及び検出用薬剤としても有用である。ヒトの単量体のＶＨ抗体及びＶＬ抗体は上記の特性の多くを有しているとされるので、特に興味深い。
【００２５】
上記の特性を有するポリペプチドは、様々なポリペプチド配列を発現することができるライブラリのハイスループットスクリーニングによって同定することができる。例えば、ファージディスプレイライブラリ（好ましくは、Ｍ１３又はｆｄ等の繊維状ファージ）は、ファージの影響を受けやすい細菌の領域（細菌層）をファージで感染させ、それからプラークとして知られるはっきりした無菌領域を探すことにより、どのファージが細菌を首尾よく溶解させるかを決定することによりスクリーニングすることができる。単量体のラマ化ＶＨ及びＶＬが、凝集傾向のある完全なヒトＶＨを示すファージよりも大きいプラークを細菌層上に形成する。したがって、ヒトＶＨレパートリから珍しく自然発生的な単量体のＶＨ及びＶＬを同定する手段として、プラークサイズを使用することができる。
【００２６】
本明細書中に記載の方法は、可溶性、安定性（安定性には、多くの特徴（高熱リフォールディング効率、高い融解温度、３７℃での長期（数日）のインキュベート後の機能性の維持、化学変性剤に対する耐性、プロテアーゼに対する耐性、０℃未満、４℃未満及び室温での長期の保存期間、細胞内環境における機能性の維持、並びに血流中等のヒトの体内
の機能性の維持を含むが、これらに限定されない）が含まれる）、及び様々な起源の高発現性のタンパク質を同定するのにも有用であり、これらのタンパク質としては、
１．ＶＨ、ＶＬ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ及びより詳細にはヒト抗体であるＩｇＧ等の全抗体、
２．非抗体スカフォールドの一本鎖Ｔ細胞受容体、Ｔ細胞受容体ドメイン、トランスフェリン、リポカリン、ｋｕｎｉｔｚドメイン、アンキリン反復、及び細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ−４）に基づくタンパク質変異体（ヒトのものを含む）、
３．ウイルス性及び細菌性のタンパク質ワクチン等のワクチン、
４．治療用タンパク質（例えば、インスリン、成長ホルモン、エリスロポエチン）
５．タンパク質性の診断用試薬及び生化学試薬（例えば、プロテインＡ、プロテインＧ）
が挙げられる。
【００２７】
ポリペプチドをこの方法で同定されれば、このポリペプチドを使用して、さらなるライブラリを構築することができる。例えば、ＶＨの核酸配列を選択することによって、これを行うことができる。ランダムなコドンを有するオリゴヌクレオチドを作り、ＶＨ配列に組み込む。このようにして、それぞれの特殊なオリゴヌクレオチドをＶＨ遺伝子に組み込み、修飾されたＶＨ遺伝子によってわずかに変異のある配列のライブラリが構成される。一般的に、ＶＨのＣＤＲ又はループをランダム化させるように、オリゴヌクレオチドを設計する。例えば、１個、２個又は３個全てのＶＨ ＣＤＲをランダム化させることができる。それから、使用するライブラリの種類に応じて、ＶＨライブラリを適切なベクターにクローニングさせ、核酸配列をポリペプチドとして発現させる。一般的にパンニング(panning)によって、ライブラリポリペプチドと結合する分子に関してライブラリをスクリー
ニングする。ライブラリはファージディスプレイライブラリ、又はリボソームディスプレイ及び酵母ディスプレイ等の他のディスプレイライブラリであり得る。
【００２８】
本明細書中に記載の方法で同定したポリペプチドを例えば、単量体の架橋により二量体、三量体、五量体及び他の多量体を形成し、免疫療法に使用することができる。このことにより、抗原分子におけるより良好な親和性及び幾つかの抗原におけるより緩やかな拡散速度がもたらされ得る。別の可能性のある手法は、ポリペプチドを様々な機能を有する種々の分子と結合又は融合させることである。例えば、抗体フラグメントは、特定の細胞又は分子を標的、破壊又は修飾するために、放射性核種、細胞傷害性薬剤、トキシン、ペプチド、タンパク質、酵素、リポソーム、脂質、Ｔ細胞超抗原又はウイルスと結合することができる。
【００２９】
本明細書中に記載の選択方法で同定したＶＨ又はＶＬを単離すれば、ＶＨ又はＶＬをさらに操作し、可溶性、安定性、単量体性、結合特異性、ヒト起源又は高発現性等の改良された生物物理学的特性に関して選択することができる。ＤＮＡシャッフリング又は交互伸長法等のｉｎ ｖｉｔｒｏ組み換え技法で、これを達成することができる。ＤＮＡシャッフリングは、抗体フラグメント等の第１のポリペプチド（ドナー）及び第２のポリペプチド（アクセプタ）の核酸配列をランダムなフラグメントに切断し、ＰＣＲ様反応によりランダムなフラグメントを再び集合化させることを含む。それから、再集合化されたフラグメントをスクリーニングし、所望の特性に関して選択する。
【００３０】
例えば、高い安定性のある１つ又は複数のＶＨ（ドナー）を十分な安定性を欠いている１つ又は複数のＶＨ（アクセプタ）と混合し、ＤＮＡシャッフリングにかけることができる。このことにより、ドナーＶＨから安定性残基を組み込んだアクセプタＶＨの突然変異型が発生する。本明細書に記載の方法によって、又はリボソームディスプレイ、酵母ディスプレイ、細菌細胞ディスプレイ及びファージディスプレイ等の他の発展的なタンパク質スクリーニングシステムによって、新たな安定性のある突然変異型を同定することができ
る。同様に、この技法を使用して、可溶性、単量体性、及び高発現性等の望ましい特質を形質転換することができる。
【００３１】
ドナーＶＨ及びアクセプタＶＨが望ましい特性を有する場合に、この技法を使用して両方の特性を有するＶＨを生成することができる。例えば、重要な治療用リガンド又は診断用リガンドと結合する不安定なドナーＶＨを安定性のあるアクセプタＶＨでシャッフルすることができる。新たに生成した安定性のあるＶＨもリガンドと結合する能力があることを確実にするために、スクリーニングシステムは、リガンド結合工程を伴い得る。
【００３２】
ＤＮＡシャッフリングは、ラクダ科の重鎖抗体の可変領域並びにナースシャーク及びテンジクザメの可変領域等の非ヒトＶＨ、又は治療標的と結合する非ヒトＶＬをヒト化するのにも有用であり得る。可溶性、安定性、単量体性、及び高発現性等の望ましい特性を有するヒトＶＨ及びヒトＶＬをドナーとして使用することができる。例えば、良好な安定性のある１つ又は複数のヒトＶＨ（ドナー）を１つ又は複数の治療用の非ヒトＶＨ（アクセプタ）と混合し、ＤＮＡシャッフリングにかけることができる。これにより、安定性があり、且つヒト化されたアクセプタＶＨの突然変異型が発生する。本明細書に記載の方法によって、又はリボソームディスプレイ、酵母ディスプレイ、細菌細胞ディスプレイ及びファージディスプレイ等の他の発展的なタンパク質スクリーニングシステムによって、新たに発生したヒト化され、且つ安定性がある変異型を同定することができる。さらなる実施例では、アクセプタＶＨは治療用ＶＨＨ（ラクダ科の重鎖抗体の可変ドメイン）であり得る。
【００３３】
さらに、この技法はＶＨ及びＶＬ以外のポリペプチドの望ましい特性を選択するのにも有用である。上記で示されるように、ドナーポリペプチド及びアクセプタポリペプチドは、両方ともヒトであり得るか、又はドナーがヒトであり、アセプタが非ヒトであり得る。
【００３４】
可溶性、単量体性、高発現性、又は安定性をＶＨ及びＶＬに与える可能性のある手法は、アクセプタＶＨ及びＶＬ上の相補性決定領域（ＣＤＲ）をグラフト化することによるものであり得る。ＣＤＲは、単一ドメイン抗体の可溶性及び安定性、及びそれに応じた本明細書中に記載の方法で単離したＶＨ及びＶＬ由来のＣＤＲ等のこれらの領域のグラフト化を伴うことが知られているので、可溶性及び／又は安定性をアクセプタＶＨ及びＶＬに与えることができる。
ヒトの単量体のＶＨ及びＶＬ
異なる生殖細胞及び全配列を有する幾つかの単量体のヒトＶＨが、ファージプラークサイズに基づくこの選択方法によって、ナイーブヒトＶＨファージディスプレイライブラリから同定された（図１及び配列番号８〜配列番号２２を参照のこと）。ＶＨは、３７℃でのトリプシン処理、３７℃での数週間のインキュベート、又は４℃での数ヶ月の保存後でも機能性及び単量体を維持し、熱リフォールディング効率が高く、大腸菌において良好な収率で生成され、プロテインＡ結合活性を有する。
【００３５】
さらに、幾つかの単量体のヒトＶＬが同定された（図６及び配列番号２３〜配列番号５４を参照のこと）。ＶＬも大腸菌において良好な収率で生成され、プロテインＬ結合活性を有する。
【００３６】
また、スカフォールドとして上記のＶＨを利用する合成ライブラリからのＶＨによって、このような特性が明らかになる。したがって、このようなライブラリによって、生理学的温度での良好な有効性、長い保存期間、及び費用効率が高い生産を有する治療用ＶＨ又は診断用ＶＨが得られ得る。高温リフォールディング効率の特徴によって、ＶＨ結合因子が一時的に高温に曝された後に、その活性を維持するように要求される場合に対するこれらのライブラリの生物工学的適用をさらに拡大させる。ＶＨは、その望ましい生物物理学
的特性により、体内適用に非常に適しているはずである。プロテインＡ結合特性は、診断試験におけるＶＨ精製及びＶＨ検出、免疫ブロット法及び免疫細胞化学を単純化し、ライブラリから非機能性のＶＨを取り除くことによって、ライブラリ性能を高めるために利用することができる。同様に、スカフォールドとしてＶＬを利用するライブラリによって、同様に望ましい特性を有する治療用のＶＬＳ又は診断用のＶＬＳが得られる。ＶＬがプロテインＬと結合するので、このプロテインＬ結合特性を利用することにより、ＶＬ精製及びＶＬ検出が単純化される。
【００３７】
本発明のＶＨ及びＶＬで構成されたディスプレイライブラリは、診断用薬剤及び検出用薬剤の有用な供給源でもあり得る。
【００３８】
これまでに報告された有益な生物物理学的特性を有する完全なヒトＶＨは、単一のＶ生殖細胞系配列：ＤＰ−４７に基づいていた(Jespers, L. et al., 2004b; Jespers, L. et
al., 2004a)。この研究における単量体のヒトＶＨが、ＤＰ−４７を含む６個の異なる生殖細胞系配列から起因しているという見解によって、安定性のあるＶＨは生殖細胞系遺伝子の利用に関して限定されないことが実証される。事実、本発明者らがファミリーの単量体のＶＨを単離し、本明細書で記載するものとは異なる生殖細胞系起源は、プロテインＡ結合活性のあるＶＨ３ファミリーのＶＨのサブセットに対する本発明者らの選択を制限させない可能性が非常に高い。ＶＨにおいて複数の突然変異が発生すること、及びＣＤＲ３はｓｄＡｂの生物物理学的プロファイルの形成にも関与することが知られているという事実により、本発明のＶＨの観察された生物物理学な挙動に関与するアミノ酸突然変異（第１表）を特定することは不可能である。しかし、ｓｄＡｂ安定性及び可溶性に重要であることが知られている位置（例えば、ＨＶＨＰ４２３及びＨＶＨＰ４４ＢにおけるＶ３７Ｆ）での突然変異又は同じ位置（例えば、９個のＶＨにおけるＬ５Ｖ／Ｑ及びＶ５Ｑ）で複数回起こる突然変異は、ＶＨの生物物理学的特性を決定するのに役立つ。ライブラリ構築に関して、ライブラリ安定性を危うくすることなくＣＤＲランダム化が行われるように、本発明のＶＨの単量体性は、ＣＤＲ、特にＣＤＲ３には依存しないことが望ましい。これに関して、安定性に関してＣＤＲ３への依存性が小さいので、より小さいＣＤＲ３を有するＶＨ（例えばＨＶＨＢ８２）が好ましいスカフォールドであり得る。
【００３９】
全体の配列及びＣＤＲ３の長さに関する本発明のＶＨ及びＶＬの多様性によって、より良好な性能のライブラリの構築が可能になる。合成ＶＨライブラリが単一スカフォールドで構築されている。レパートリ形成へのこのような手法は、多様なスカフォールドを利用する天然のｉｎ ｖｉｖｏでの「手法」とはかなり異なっている。本明細書中に報告されている配列に基づいて、多様な組のＶＨ及びＶＬの可用性を利用し、複数のＶＨ及びＶＬのスカフォールドに基づくライブラリを作ることができる。このようなライブラリは、ｉｎ ｖｉｖｏでのレパートリのより良好な模倣であり、したがってより最適な複雑性を有する。ｓｄＡｂにおける３個のＣＤＲの中で、ＣＤＲ３は一般的に最も有意にレパートリの多様性に寄与し、この理由から一般的にＣＤＲ３の長さを同時に変えることによって、ＶＨ及びＶＬのスカフォールドにおけるＣＤＲ３ランダム化が達成される。この有意性がライブラリの複雑性を改良するが、親スカフォールドＣＤＲ３の長さを壊すことによって、ライブラリの安定性をも危うくする可能性がある。ＣＤＲ３の長さに関して本明細書中で開示されるＶＨ及びＶＬの不均一性によって、良好な複雑性、良好な安定性及び良好な生物物理学的な特徴の両方を有するライブラリの形成を可能にする。このようなライブラリは、好ましくはサブライブラリから成り、それぞれのサブライブラリは、親ＣＤＲ３の長さを壊すことなく、単一のＶＨ、及びＶＬスカフォールド上のＣＤＲ３のランダム化（及び必要に応じてＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２のランダム化）によって作られる。
【００４０】
治療標的に特異的なＶＨＨ、ＶＨ及びＶＬをヒト化することに関して、最適なＶＨ及びＶＬフレームワークを選択するといった点でも、本発明のＶＨ及びＶＬの多用途性は有益
である。比較的容易に免疫性、非免疫性又は合成ＶＨＨライブラリから治療標的に対する親和性の高いラクダ科のＶＨＨを得て、その後ヒト化（ＣＤＲグラフト化、再サーフェイシング(resurfacing)、脱免疫化）を行い、可能性のあるＶＨＨ免疫原性を除去すること
ができる。それにより、治療用ＶＨの生成に対するヒトＶＨライブラリの手法の代替方法を提供する。後者の手法による親和性の高い治療用ＶＨの生成は、最初の合成ヒトＶＨライブラリから選択される主要な結合因子（複数可）の面倒で、且つ時間のかかるさらなるｉｎ ｖｉｔｒｏの親和性突然変異を要求することが度々あり得る。
【００４１】
比較的容易に免疫性、非免疫性又は合成ＶＨライブラリから治療標的に対する非ヒトＶＨを得て、その後ヒト化（ＣＤＲグラフト化、再サーフェイシング、脱免疫化）を行い、非ヒトＶＨ免疫原性を除去することができる。それにより、治療用ＶＨの生成に対するヒトＶＨライブラリの手法の代替方法を提供する。
【００４２】
比較的容易に免疫性、非免疫性又は合成ＶＨＨライブラリから治療標的に対する非ヒトＶＬを得て、その後ヒト化（ＣＤＲグラフト化、再サーフェイシング、脱免疫化）を行い、ＶＨＨ免疫原性を除去することができる。それにより、治療用ＶＬの生成に対するヒトＶＬライブラリの手法の代替方法を提供する。
【００４３】
改良された生物物理学的特性を有するタンパク質の選択に対する多くの発展的な手法が記載されている(Forrer, P. et al., 1999; Waldo, G. S., 2003)、(Jespers, L. et al., 2004a; Jung, S. et al., 1999; Matsuura, T. et al., 2003)。一般的に確実にライブラリ集合から不安定又は安定性の低い変異型よりも安定性のある変異型を優先的に選択するために、安定性圧力が必要とされる。例えば関連の研究で、凝集耐性のあるＶＨを選択するために、ＶＨファージディスプレイライブラリの熱処理が要求された(Jespers, L. et al., 2004a)。ファージディスプレイを含む発展的な選択の手法の例としては、従来の
ファージディスプレイ、選択的感染ファージ及びタンパク質分解の手法が挙げられる。最初の２個の手法において、安定性のあるタンパク質が不安定なものよりもそのリガンドに対してより良好な結合特性を有するという仮定に基づき、親和性の選択を使用して、ライブラリから安定性のある種を選択する。しかし、安定性選択工程がさらに包含されていても、これらの手法は主に安定性よりも親和性をより高める(Jung, S. et al., 1999)。結
合工程が要求されることによって、既知のリガンドを有するタンパク質に対するこれらの手法の適用性も制限される。第３のタンパク質分解の手法は、不安定なタンパク質がプロテアーゼに対して耐性がないのに対して、安定性のあるタンパク質は一般的に小さく、したがってプロテアーゼに対して耐性があるという事実に基づいている。ファージディスプレイフォーマットは、表示されたタンパク質のプロテアーゼ安定性が、ファージ感染性に変換されるように操作される。このように、変異型のファージディスプレイライブラリをプロテアーゼで処理する場合、安定性のあるタンパク質を表示するファージのみがこれらの感染性を維持し、その後、大腸菌宿主を感染させることにより選択することができる。この手法はリガンド結合と独立しているので、一般的に有用である。しかし、安定であり、且つ十分にフォールディングしたタンパク質であってもプロテアーゼ感受性部位（例えば、ループ及びリンカー）を有し、これによりタンパク質分解の手法における安定性のある種の選択が妨げられることもあり得る(Bai, Y. et al., 2004)。
【００４４】
これに対して、本発明の発展的な手法において、優れた生物物理学的特性を有するタンパク質は肉眼で簡単に判別される。この手法は、リガンド結合工程、タンパク質分解工程又は脱安定化工程を要求せず、したがって報告された選択的手法において直面する可能性のある複雑性が回避される。結合工程に対する要求がないことは、この手法が一般的に有用であることも意味する。オプションとして、結合工程は選択されたタンパク質が機能的であることを確実にすることが含まれてもよい。しかし、本発明の手法の（プラーク視覚化のための）プレート培養に対する依存性によって、操作することができ、小さいライブ
ラリに対する適用を制限し得るプレートの数に関して、可能性のある運搬上の制限が導入される。それにもかかわらず、ライブラリを最初に取り扱いが可能な大きさに縮小する場合、現在の手法の有用性は大きなライブラリにまで拡大することが可能である。例えば、選択システムに大きい集合の不安定な種を取り除き（例えば、プロテインＡ表面上又は疎水性相互作用カラム上のライブラリ吸収）、これにより露出した疎水性表面を有する不完全にフォールディングしたタンパク質を除去する、取り除く工程を組み込むことにより、これを行うことができる(Matsuura, T. et al., 2003)。本明細書中において、この手法
を使用して、非常に不安定なＶＨ及びＶＬのバックグラウンドにおいて良好な生物物理学的特性を有するＶＨ及びＶＬを選択した。しかし、適度に良好な安定性を有するタンパク質で集合化された突然変異型のライブラリから「最良の」種を選択することはより困難であり得る。この場合、より短期間のインキュベート時間でのプラーク形成速度に基づくか、又はプラークサイズ及び頻度基準(frequency criteria)に基づいて、主要な変異型を同定することができる。
【００４５】
本発明の選択手法は、プロテインＬ、プロテインＡ又は任意のリガンドを伴う結合工程の選択システムにおける任意選択の包含を有するｓｃＦｖ及びＦａｂ等の安定性があり、且つ十分フォールディングした抗体フラグメント、並びに安定性のある非抗体スカフォールド及びこれらの突然変異型の同定にまで拡大することができる。さらに、ファージプラークサイズとＶＨ発現収率との間に見られる相関関係は、本発明の手法を利用しなければ変異型のファージディスプレイライブラリから不完全であるか、又は不十分な発現を有するタンパク質の高発現性がある変形を得るために本発明の手法を利用することができることを意味する。ブースト化タンパク質の発現がタンパク質の生産コストを有意に埋め合わせる治療用タンパク質又は高価で不完全な発現性のタンパク質試薬の場合、この適用は特に魅力的である。
五量体の結合分析
ＶＬ及びＶＨの両方が五量体化の影響を受けやすく、五量体化を使用して、親和性の低いＶＬ又はＶＨの単量体を親和性の高いＶＬ又はＶＨの五量体に迅速に変換することができる。このような五量体は貴重な診断用薬剤及び検出用薬剤である。このような用途において、ＶＬ又はＶＨの五量体のその標的との結合は、酵素（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ又はアルカリ性のホスファターゼ）等のレポーター分子又は五量体と結合する蛍光分子で検出することができる。代替的に、五量体の結合は、レポーター分子と結合する二次分子で検出することができる。二次分子は、五量体自体又は６Ｈｉｓタグ若しくはｃ−Ｍｙｃタグ等のタグに特異的であり得る。例えば、一般的な二次分子はイムノグロブリンである。
【００４６】
プロテインＡを有するＶＨとプロテインＬを有するＶＬとの間の相互作用は、これらの標的抗原を有するＶＨとＶＬとの間の相互作用とは基本的に異なっている。ＶＨ又はＶＬの抗原結合は、抗体ドメインの結合部位を形成する３個の抗原結合ループを伴う。プロテインＡ結合活性を有するＶＨ及びプロテインＬ結合活性を有するＶＬのプロテインＡ結合は、抗体結合部位とは全体的に異なる抗体ドメイン上に結合部位及び残基を伴う。このように、プロテインＡ結合活性を有するＶＨは、同時にプロテインＡ及びその標的抗原と結合することができ、プロテインＬ結合活性を有するＶＬは、同時にプロテインＬ及びその標的抗原と結合することができる。本発明のＶＨとＶＬはそれぞれ、プロテインＡ及びプロテインＬに対する親和性を有するので、上記の検出用途及び診断用途のための二次分子として、プロテインＡ及びプロテインＬを使用することができる。ヒトＶＨ及びヒトＶＬの五量体は治療のためにも使用することができる。
五量体による病原体検出
ＶＨのプロテインＡ結合活性及びＶＬのプロテインＬ結合活性を使用して、表面上にプロテインＡ及び／又はプロテインＬを有する細菌を検出することができる。プロテインＡは、病原菌である黄色ブドウ球菌の表面上に存在する。このように、本明細書に記載のも
の等のプロテインＡ結合活性を有するＶＨを使用して、黄色ブドウ球菌を検出することができる。同様に、細胞表面上にプロテインＬを有する細菌、特にペプトストレプトコッカス属マグヌス(Peptostreptococcus magnus)等の病原菌の検出のために、プロテインＬ結
合活性を有するＶＬ単量体及びＶＬ五量体を使用することができる。
【００４７】
プロテインＬは、ヒトにおけるＰ．ｍａｇｎｕｓ(Ricci, S. et al., 2001)の発症の毒性因子に関連する。膣炎において、プロテインＬは、架橋表面結合性のＩｇＥによりその効果を発揮すると考えられる。プロテインＬ結合活性を有するＶＬ単量体及び／又はＶＬ五量体がプロテインＬのＩｇＥ架橋作用を阻害する可能性があるので、これらは治療剤として潜在性がある。
【００４８】
プロテインＡは、ヒトにおける黄色ブドウ球菌(Fournier, B. et al., 2004)の発症の
毒性因子に関連する。その毒性は、抗体と結合することを含む宿主成分と相互作用する能力に起因している。プロテインＡ結合活性を有するＶＨ単量体及び／又はＶＨ五量体が宿主成分を有するプロテインＡの相互作用を阻害する可能性があるので、これらは治療剤として潜在性がある。
【実施例】
【００４９】
単量体のヒトＶＨの同定及び配列分析
完全なヒトＶＨライブラリ及びラマ化したヒトＶＨライブラリの構築の間に、単量体のラマ化したＶＨを表示するファージが、凝集傾向のある完全なヒトＶＨを表示するファージよりも細菌層上でより大きいプラークを形成したことを確認した。このように、ヒトＶＨレパートリから珍しく自然発生的な単量体のＶＨを同定する手段として、プラークサイズを使用した（図１）。この目的で、サイズが６×１０８であるヒトＶＨを示すファージライブラリを構築し、寒天プレート上でプラークとして増殖させた。タイタープレート上で、ライブラリは本質的に、幾つかの大きいプラークが散在する小さいプラークから成る。２０個のクローンにおけるＰＣＲによって、小さいプラークがＶＨ表示ファージに対応し、一方で大きいプラークは野性型のファージ（すなわち、ＶＨ配列挿入を欠くファージ）を表すことが示された。ＶＨ表示ファージは、大きいプラーク形態では見出されなかった。このことは、ヒトのレパートリ及び大きいサイズのライブラリにおける単量体のＶＨの不足により予想外のことではなかった。単量体のＶＨの同定を容易にするために、ＶＨ３ファミリー由来のヒトＶＨのサブセットと結合するプロテインＡに対してライブラリをパンニングすることにより、ライブラリを取り扱いが可能な大きさまで縮小し、プラークサイズ形態が大きくなるのを阻害する野性型のファージを取り除くことを決めた。
【００５０】
数回のパンニングの後、ライブラリはファージを生成する大きいプラークに関して富化され、１１０個を超えるこのようなプラークのＰＣＲ及びシークエンシングにより、全てがＶＨオープンリーディングフレームを完成させたことを示した。分析のために選択された大きいプラークのサイズは図１で示す。シークエンシングによって、ＶＨ３ファミリーに属する１５個の異なるＶＨが示され、ＤＰ−３８、ＤＰ−４７、Ｖ３−４９、Ｖ３−５３、ＹＡＣ−５又は８−１Ｂの生殖細胞系Ｖセグメントを利用した（第１表、図２）。ＤＰ−３８及びＤＰ−４７の生殖細胞系配列は、これまではプロテインＡ結合に関係していた。さらに、それらのプロテインＡ結合活性と一致して、全てのＶＨは、５７位でＴｈｒ残基を有していた（図２）。最も頻繁に利用された生殖細胞系Ｖセグメントは、ＶＨの５０％を越えて発生するＤＰ−４７であったが、最も高頻度なクローン（すなわち、ＨＶＨＰ４２８、相対頻度４６％）はＶ３−４９生殖細胞系Ｖセグメントを利用した。ＤＰ−４７生殖細胞系配列を有するＨＶＨＰ４２９は相対頻度が２１％である２番目に豊富なＶＨであった（図２）。ＶＨ ＣＤＲ３の長さは、ＨＶＨＢ８２における４個のアミノ酸からＨＶＨＰ４３０における１６個のアミノ酸の範囲であり、ＨＶＨＰ４３０はＣＤＲ３において一対のＣｙｓ残基を有していた。親の生殖細胞系Ｖセグメント（残基１〜９４）及び
ＦＲ４（残基１０３〜１１３）配列に対するアミノ酸突然変異は全てのＶＨで見られ、ＨＶＨＰ４４（Ｌ５Ｖ及びＱ１０５Ｒ）及びＨＶＨＢ８２（Ｅ１Ｑ及びＬ５Ｑ）に対する２個の突然変異からＨＶＨＰ４２６に対する１６個の突然変異までの範囲であった（第１表）。突然変異はＶセグメントに集中し、１０５位及び１０８位の２個の突然変異のみが１５個のＦＲ４全てで検出された。ＨＶＨＰ４４及びＨＶＨＢ８２は、その両方がＧｌｎの代わりに１０５位で正に荷電したアミノ酸を有するという点で他のＶＨとは異なっていた（第１表、図２）。しかし、ＨＶＨＰ４４において正に荷電したアミノ酸が突然変異によって得られたが、ＨＶＨＢ８２における正に荷電したアミノ酸は生殖細胞系でコードされていた。ＨＶＨＰ４２３及びＨＶＨＰ４４Ｂを除いて、残りのＶＨは鍵となる可溶性位置で生殖細胞系残基を有していた：３７Ｖ／４４Ｇ／４５Ｌ／４７Ｗ又は３７Ｆ／４４Ｇ／４５Ｌ／４７Ｗ（ＨＶＨＰ４２８）、ＨＶＨＰ４２３及びＨＶＨＰ４４ＢはＶ３７Ｆ突然変異を有していた。ＶＨ可溶性に重要であることが示されるか、又は仮定される他の位置での突然変異には、７個のＥ６Ｑ、３個のＳ３５Ｔ／Ｈ、１個のＲ８３Ｇ及び１個のＫ８３Ｒ、１個のＡ８４Ｐ及び１個のＴ８４Ａ及び１個のＭ１０８Ｌが包含されていた。１１個のＥ１Ｑ、８個のＬ５Ｖ／Ｑ及び１個のＶ５Ｑ突然変異を包含した高頻度の突然変異も１位及び５位で観察された。
ヒトＶＨの生物物理学的特徴
ＨＶＨＰ４４Ｂ（ＨＶＨＰ４２３と本質的に同じであった）を除いて、全てのＶＨはｃ−Ｍｙｃ−Ｈｉｓ５タグとの融合における培養液量１Ｌの大腸菌株ＴＧ１で発現し、固定化金属親和性クロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）によって、ペリプラズム抽出物から均一に精製した。発現収率は、振盪フラスコ内で細菌培養液１Ｌ当たりで精製タンパク質１．８〜６２．１ｍｇの範囲であり、ＶＨのほとんどは数ｍｇの収率があった（第２表）。ＨＶＨＰ４２３及びＨＶＨＰ４３０の例において、「明らかに」同じ発現条件下での別の試験によって、６２．１及び２３．７ｍｇに対してそれぞれ、２．４及び６．４ｍｇの収率が得られた。このことは、本明細書中に記載の多くのＶＨに対して、大した努力をせずに最適な発現条件を達成でき、それにより第２表で報告された値より有意に高い発現収率がもたらされることを意味している。予想通り、全てのＶＨは表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析（ＫＤは０．２〜３μＭである）においてプロテインＡと結合していて、範囲及び規模はプロテインＡ結合活性を有するラマＶＨＨ変異型についてこれまでに報告されていた範囲及び規模に匹敵していた。ＶＨはＦａｂ基準面と結合しなかった。
【００５１】
ゲルろ過クロマトグラフィ及びＮＭＲによるオリゴマー化状態に関して、ヒトＶＨの凝集傾向を評価した（第２表）。全てのＶＨをＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ゲルろ過クロマトグラフィにかけた。ラマＶＨＨ（すなわち、Ｈ１１Ｃ７）と同様に、全てのＶＨにおいて、単量体で期待される溶離量で対称な単一のピークが与えられ、凝集体は実質的に全く存在しなかった（図３ＡのＨＶＨＰ４２８における例を参照のこと）。これに対して、一般的なヒトＶＨ（すなわち、ＢＴ３２／Ａ６）はかなりの量の凝集体を形成した。３個のＶＨに関しては、ＶＨ二量体で期待される移動度を有する微小ピークも観察された。微小ピークのＳＰＲ分析によって、二量体のＶＨと一致して、単量体ＶＨに対する値よりも有意に緩やかな解離速度値(off-rate value)が与えられた。二量体のピークは、ラマＶＨＨ（Ｈ１１Ｃ７）の場合にも観察された。高濃度のＶＨのフォールディング状態及びオリゴマー化状態をさらにＮＭＲ分析で研究した。表ＩＩに示すように、全てのＶＨタンパク質の研究によって、比較的可溶性であると考えられ、十分にフォールディングされた三次元構造が推測された。ＶＨフラグメントの一次元ＮＭＲスペクトル（図３Ｂ）によって、ＶＨドメインの構造フォールディング特徴が示された。ＨＶＨＰ４１４フラグメント及びＨＶＨＰ４１４の２個のイソ型（ｃ−Ｍｙｃ配列を有する及び有さないＶＨ１４及びＶＨ１４−ｃＭｙｃ−）に対するＰＦＧ−ＮＭＲ拡散実験の使用によっても、タンパク質の凝集状態を評価した。ＶＨ１４は、ｃ−Ｍｙｃ Ｎ１３２Ｅ突然変異を有し、且つさらにＮ末端にメチオニン残基を有するＨＶＨＰ４１４の改変バージョンである。簡単に述べると、ＰＦＧ−ＮＭＲデータ（示されず）によって、全てのタンパク質サンプルが、ＮＭＲ実験に使用
した比較的高いタンパク質濃度であっても予想される単量体の分子量を有することが示された。
【００５２】
一貫して３７℃でのトリプシンに対する耐性に関して、ＶＨの安定性をさらに研究し、その後３７℃で長期的にインキュベートを行った。トリプシンは、Ｃ末端のＡｒｇ又はＬｙｓ残基でポリペプチドのアミド骨格を切断する。ヒトＶＨにおいて９〜１３個のＡｒｇ及びＬｙｓ残基が存在する（図２）。トリプシンによる消化の影響を受けやすいＣ末端のｃ−ＭｙｃタグにおいてさらなるＬｙｓ残基も存在する。図４ａは、トリプシン消化の間のＨＶＨＰ４１４のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。１時間以内に、元のバンドは、ｃ−Ｍｙｃ−Ｈｉｓ５タグを有しないＶＨで期待される移動度があった単一の生成物に完全に変換された。トリプシンによる１時間のインキュベート後に１２個の他のＶＨにおいて、同じ結果が得られた。トリプシン処理したＶＨのランダムに選択されたサンプル（すなわち、ＨＶＨＰ４１４、ＨＶＨＰ４１９、ＨＶＨＰ４２０、ＨＶＨＰ４２３、ＨＶＨＰ４２９、ＨＶＨＰ４３０及びＨＶＨＭ８１）における質量分析によって、それぞれの場合に、消化した生成物の分子質量がＣ末端残基としてのｃ−Ｍｙｃ Ｌｙｓを有するＶＨに対応していたことが確認された。ＨＶＨＭ４１において、消化時の残りよりも有意に短いフラグメントが与えられ、この場合質量分析実験によって、ＣＤＲ３におけるＡｒｇ９９に対する切断部位がマッピングされた（データ図示せず）。
【００５３】
０．３２ｍｇ／ｍｌ（ＨＶＨＰ４２８）〜３．２ｍｇ／ｍｌ（ＨＶＨＰ４２０）の濃度に及ぶ１１個のＶＨを３７℃で１７日間インキュベートした。その後、オリゴマー化状態及びプロテインＡ結合に関して、これらの安定性を決定した。ゲルろ過クロマトグラフィによって示されるように、３７℃でのＶＨの処理は凝集体形成を全く誘導しなかった：全てのＶＨは、未処理のＶＨのものと実質的に同一であったクロマトグラムプロファイルを与え、本質的に単量体として存在していた（ＨＶＨＰ４２０についての例、図４ｃを参照のこと）。ＶＨが３７℃での処理後の自然のフォールディングを維持したことを確実するために、２個のＶＨ（すなわち、ＨＶＨＰ４１４（１．２ｍｇ／ｍｌ）及びＨＶＨＰ４２０（３．２ｍｇ／ｍｌ））をランダムに選択し、ＳＰＲによってプロテインＡと結合するこれらのＫＤを求め（ＨＶＨＰ４２０に関して示されるデータ、図４ｃの挿入図）、未処理のＶＨに対して得られたＫＤと比較した（第２表）。熱処理したＶＨに関して算出したＫＤは１．４μＭであり、ＨＶＨＰ４１４及びＨＶＨＰ４２０に関して算出したＫＤはそれぞれ１．０μＭであった。これらの値は未処理のＶＨの対応する値と本質的に同一であり（第２表）、このことはＶＨの３７℃での処理がこれらの天然フォールディング(native fold)に影響を与えなかったことを示している。ＶＨが３７℃のインキュベート期間で
余り小さくなく、且つ非天然であり、ゲルろ過実験及びＳＰＲ実験の間室温まで戻した時にこれらの天然のフォールディングを再開する可能性は、十分にフォールディングした天然のタンパク質に一般的に関連する特性であるＶＨが３７℃でトリプシンに対して耐性があった（上記を参照のこと）という事実を鑑みて疑わしい。
【００５４】
天然のＶＨ（ＫＤｎ）及び熱処理して、リフォールディングしたＶＨ（ＫＤｒｅｆ）のプロテインＡとの結合のＫＤを比較することによって、ヒトＶＨのリフォールディング効率（ＲＥ）を研究した(Tanha, J. et al., 2002)。ＶＨ分画が熱処理によって不活性化される場合、このパラメータはフォールディングした、すなわち活性のある抗体フラグメントの濃度に基づいているので、測定ＫＤは高くなる。このように、ＫＤｎとＫＤｒｅｆとの比によって、ＶＨＲＥの測定値が与えられる。図５は、幾つかの選択されたＶＨ濃度での天然状態（太線）及びリフォールディング状態（細線）における固定化されたプロテインＡとのＨＶＨＰ４２３の結合に対するセンサーグラムを比較している。示され得るように、リフォールディングしたＶＨのプロテインＡとの結合は全ての例でより小さく、これにより非フォールディングは完全に可逆ではないことが示される。１４個のＶＨそれぞれにおいて、天然状態及びリフォールディング状態におけるプロテインＡの結合を幾つかの
濃度で測定し、ＫＤ及びその後のＲＥを求めた（第２表、ＫＤｒｅｆ値は示されていない）。２個の抗イディオタイプのラマＶＨＨ（Ｈ１１Ｆ９及びＨ１１Ｂ２）のＫＤ及びＲＥも求め、これらは参照として使用された。４個のＶＨは、Ｈ１１Ｆ９及びＨ１１Ｂ２のそれぞれの、９５％及び１００％のＲＥと同程度の９２％〜９５％の範囲のＲＥであった。別の５個のＶＨは、８４％〜８８％の範囲のＲＥであり、３個は７０％を超えていた。２個のＶＨだけが有意に低いＲＥであった：ＨＶＨＰ４１３（５２％）及びＨＶＨＰ４２１（１４％）。これまでに調べられた幾つかの公開されたＶＨＨは約５０％のＲＥであった(van der Linden, R. H. et al., 1999)。
ヒトＶＨファージディスプレイライブラリ構築及びパンニング
ランダムヘキサヌクレオチドプライマー及びＦｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ（商標）キット(GE Healthcare, Baie d'Urfe, QC, Canada)を使用して、ヒト脾臓ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。鋳型としてｃＤＮＡを使用して、ＶＨフレームワーク領域１（ＦＲ１）に特異的なプライマー及びイムノグロブリンＭ特異的なプライマー(de Haard, H. J. et al., 1999)を使用した９個の別々の反応におけるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、ＣＨ配列をフランキングしたＶＨ遺伝子を増幅した。生成物をゲル精製し、２回目のＰＣＲにおける鋳型として使用することにより、クローニング目的のためにフランキングしたＡｐａｌ Ｉ及びＮｏｔ Ｉ制限部位も導入したＦＲ１特異的なプライマー及びＦＲ４特異的なプライマー(de Haard, H. J. et al., 1999)を使用して、ＶＨ遺伝子を構築した。得られたＶＨレパートリＤＮＡをｆｄ−ｔｅｔＧＩＩＩＤファージベクターにクローニングし、ＶＨファージディスプレイライブラリを構築した(Tanha, J. et al., 2001)。プロテインＡに対するパンニング(Amersham Biosciences Inc.)を記載のように行
った(Tanha, J. et al., 2001)。ＤＮＡＰＬＯＴソフトウェアバージョン２．０．１及びＶ ＢＡＳＥバージョン１．０(http://vbase.dnaplot.de/cgi-bin/vbase/vsearch.pl)を使用して、選択されたＶＨの生殖細胞系配列帰属を行った。記載のようにＨ１１ ｓｃＦｖに対してパンニングすることによって、ラマＶＨＨファージディスプレイライブラリからラマＶＨＨ Ｈ１１Ｃ７、Ｈ１１Ｆ９及びＨ１１Ｂ２を単離した(Tanha, J. et al., 2002)。
ＶＨの発現及び精製
標準的なクローニング技法により、ＶＨをｐＳＪＦ２発現ベクターにクローニングした(Sambrook, J. Fritsch E. F. and Maniatis T, 1989)。ｓｄＡｂのペリプラズム発現及
びその後の固定化金属親和性クロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）による精製を記載のように行った(Muruganandam, A. et al., 2002)。それぞれのタンパク質において算出したモル吸
収係数を使用したＡ２８０測定によって、タンパク質濃度を測定した(Pace, C. N. et al., 1995)。記載のように、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５カラム(GE Healthcare)において、精製
したＶＨのゲルろ過クロマトグラフィを行った(Deng, S. J. et al., 1995)。
結合及びリフォールディング効率の実験
ＶＨ／ＶＨＨの平衡解離定数（ＫＤ）及びリフォールディング効率（ＲＥ）は、ＢＩＡＣＯＲＥ３０００バイオセンサーシステム(Biacore Inc., Piscataway, NJ)で回収した表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）データから得られた。プロテインＡとのＶＨの結合を測定するために、プロテインＡの２０００個の共鳴単位（ＲＵ）又は基準となる抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）を研究等級のＣＭ５センサーチップ(Biacore Inc.)上で固定化した。製造業者によって提供されるアミンカップリングキットを使用して、１０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）中の２５μｇ／ｍｌ（プロテインＡ）又は５０μｇ／ｍｌ（Ｆａｂ）の濃度で固定化を行った。抗イディオタイプのラマＶＨＨのＨ１１ｓｃＦｖとの結合を測定するために、上記のように、５０μｇ／ｍｌのＨ１１ ｓｃＦｖ ４１００ＲＵ又は１０μｇ／ｍｌのＳｅ１５５−４ ＩｇＧ基準 ３０００ＲＵを固定化した。全ての例において、流量４０μｌ／分で、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ及び０．００５％のＰ２０を含む１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）中、２５℃で分析を行い、表面を洗浄緩衝液で洗浄することにより再生させた。リフォールディングタンパク質の結合活性を測定するために、１０μｇ／ｍｌの濃度、８５℃で２０分間インキュベートするこ
とによって、ＶＨ又はＶＨＨを変性させた。それから、リフォールディングするためにタンパク質サンプルを３０分間室温まで冷却し、その後室温で５分間１４０００ｒｐｍでマイクロフュージで遠心分離して、任意のタンパク質沈殿物を除去した。上清を回収し、上記のようにＳＰＲによって結合活性について分析した。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ４．１ソフトウェア(Biacore Inc.)を同時に使用して、フォールディングしたタンパク質及びリフォールディングタンパク質両方に関するデータを１：１の相互作用モデルに適合させ、その後ＫＤを求めた。ＲＥは、
【００５５】
【化１】
【００５６】
（式中、ＫＤｎは天然タンパク質のＫＤであり、ＫＤｒｅｆはリフォールディングタンパク質のＫＤである）から求めた。
トリプシン消化実験
１ｍＭのＨＣｌ中の新たに調製した０．１μｇ／μｌのシークエンシング等級のトリプシン(Hoffmann-La Roche Ltd., Mississauga, ON, Canada)３μｌを１００ｍＭのＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．８）中のＶＨ６０μｇに加えた。３７℃で１時間、全量６０μｌで消化反応を行い、０．１μｇ／μｌのトリプシン阻害剤(Sigma, Oakville, ON, Canada)５μｌを加えることにより停止させた。消化の完了後、５μｌを取り除き、ＳＤＳ
−ＰＡＧＥで分析して、ＺｉｐＴｉｐＣ４(Millipore, Nepean, ON, Canada)を使用して
残りを脱塩し、５０：５０のメタノール：水の１％酢酸で溶離して、ＭＡＬＤＩ質量分析によってＶＨの質量を求めた。
３７℃でのタンパク質安定性研究
３７℃で１７日間ＰＢＳ緩衝液において０．３２〜３．２ｍｇ／ｍｌの濃度での単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）をインキュベートした。インキュベートの後、視覚的に凝集体の形成が全く見られなくても、５分間最大速度でミクロフュージにおいてタンパク質サンプルを沈降させた。それから、サンプルをＳｕｐｅｒｄｅｘ７５サイズ排除カラム(GE Healthcare)に適用させ、プロテインＡに対するＳＰＲ分析における単量体のピークを回収し
た。プロテインＡ５００ＲＵ又は基準Ｆａｂを固定化したこと、及び５０μｇ／ｍｌの濃度で固定化を行ったことを除いて、上記のようにＳＰＲ分析を行った。
ＮＭＲ実験
ＮＭＲ分析におけるＶＨサンプルを１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ及び０．０２％のＮａＮ３（ｐＨ７．０）中に溶解した。タンパク質濃度は４０μＭ〜１．０ｍＭであった。全てのＮＭＲ実験は、Ｂｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ−８００ＮＭＲスペクトロメータ又はＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ−５００ＮＭＲスペクトロメータにおいて２９８Ｋで行った。一次元（１Ｄ）１Ｈ ＮＭＲスペクトルを１６３８４個のデータ点で記録し、スペクトル幅はそれぞれ、５００ＭＨｚで８９９２．８１Ｈｚ及び８００ＭＨｚで１７６０５．６３Ｈｚであった。２０４８×４００のデータ点の二次元１Ｈ−１Ｈ ＮＯＥＳＹスペクトルがスペクトル幅１１９９０．０４Ｈｚ及び混合時間１２０ｍｓのＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ−８００ＮＭＲスペクトロメータにおいて得られた。全てのＮＭＲ実験において、３−９−１９パルス列によって行われたＷＡＴＥＲＧＡＴＥ法(Piotto, M. et al., 1992; Sklenar, V. et al., 1993)を使用して
水抑制を達成した。ＮＭＲデータを処理し、Ｂｒｕｋｅｒ ＸＷＩＮＮＭＲソフトウェアパッケージを使用して分析した。３軸勾配がある三重共鳴プローブを備えるＢｒｕｋｅｒ
Ａｖａｎｃｅ−５００ ＮＭＲスペクトルメータで水抑制ＬＥＤ配列(Altieri, A. S. et al., 1995)によって、全てのＰＦＧ−ＮＭＲ拡散測定を行った。一次元プロトンスペ
クトルを処理し、Ｂｒｕｋｅｒ Ｘｗｉｎｎｍｒソフトウェアパッケージを使用して分析
した。全ての所与のＰＦＧ強度で均一に全てのＮＭＲシグナルが弱まった場合に、メチル及びメチレンプロトン領域（２．３ｐｐｍ〜−０．３ｐｐｍ）におけるＮＭＲスペクトルを統合することにより、ＮＭＲシグナル強度を得た。
ヒトＶＬファージディスプレイライブラリ構築及びパンニング
ヒトＶＨに関して上記のように、ｃＤＮＡをヒト脾臓ｍＲＮＡから合成した。ｃＤＮＡをＰＣＲの鋳型として使用し、６個のＶκバックプライマー、１１個のＶλバックプライマー(de Haard, H. J. et al., 1999)、４個のＶκフォワードプライマー及び２個のＶλフォワードプライマー(Sblattero, D. et al., 1998)を使用して、反応体積５０μｌでＶＬ遺伝子を増幅させた。バックプライマー及びフォワードプライマーを修飾して、その後のクローニング目的のためにそれぞれ、Ａｐａ ＬＩ制限部位及びＮｏｔ Ｉ制限部位をフランキングさせた。これらの縮重の程度に反映された比で共にフォワードプライマーがプールされた。プールされたＶλフォワードプライマー及び１１個の個々のＶλバックプライマーを使用して、１１個の別々の反応でＶλ遺伝子をＰＣＲした。同様に、プールされたＶκフォワードプライマー及び６個の個々のＶλバックプライマーを使用して、６個の別々の反応でＶλ遺伝子を増幅させた。ＰＣＲ生成物をプールし、ゲル精製して、Ａｐａ ＬＩ制限エンドヌクレアーゼ及びＮｏｔ Ｉ制限エンドヌクレアーゼで消化した。ヒトＶＨに関して上記のように、ライブラリを構築した。個々のライブラリコロニーにおいてプラークＰＣＲを行い、増幅したＶＬ遺伝子を記載のようにシークエンシングした(Tanha, J. et al., 2003)。ヒトＶＨライブラリに関して上記のように、プロテインＬ(Biolynx Inc., Brockville, ON, Canada)に対するパンニング及び選択されたＶＬの生殖細胞系の配列帰属を行った。
ＶＬの発現及び精製
「ＶＨの発現及び精製」においてＶＨに関して上記のように、ＶＬの発現、精製、濃度決定及びゲルろ過クロマトグラフィを行った。
ＶＬ及びＶＨ五量体の発現及び精製
標準的なＰＣＲにおいて特異的なプライマーを使用して、ＨＶＨＰ３２８ ＶＨ及びＨＶＬＰ３３５ ＶＬ遺伝子を増幅させた。標準的なクローニング技法を使用して、発現ベクターにおいてＶＴ１Ｂ五量体化ドメイン遺伝子と融合して、ＨＶＨＰ３２８及びＨＶＬＰ３３５遺伝子をクローニングして、ＨＶＨＰ３２８ＰＶＴ２及びＨＶＬＰ３３５ＰＴＶ２五量体を得た(Zhang, J. et al. 2004)。五量体を記載のように発現及び精製した(Zhang, J. et al., 2004)。上記のようにタンパク質濃度を決定した。
ＶＬの表面プラズモン共鳴
ＢＩＡＣＯＲＥ３０００バイオセンサーシステム(Biacore, Inc., Piscataway, NJ)を
使用したＳＰＲによって、ＶＬのプロテインＬとの相互作用に対する結合反応速度を測定した。プロテインＬ６８０ＲＵ又は基準Ｆａｂ ８７０ＲＵを研究等級のＣＭ５センサーチップ(Biacore)上で固定化させた。製造業者によって供給されたアミンカップリングキ
ットを使用して、１０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）において５０μｇ／ｍｌのタンパク質濃度で固定化を行った。５０μｌ／分又は１００μｌ／分の流量で１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ及び０．００５％のＰ２０を含む１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中、２５℃で全ての測定を行った。洗浄緩衝液で洗浄することにより表面を再生した。ＢｌＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ４．１ソフトウェア(Biacore, Inc.)を使用して
、データを評価した。
五量体ＶＬ及びＶＨの表面プラズモン共鳴
ＳＰＲによって、ＨＶＨＰ３２８ＰＶＴ２のプロテインＡとの相互作用及びＨＶＬＰ３３５ＰＴＶ２のプロテインＬとの相互作用に対する結合反応速度を決定した。５２０ＲＵのプロテインＡ又は基準Ｆａｂを上記のように固定化した。ＶＬ五量体に関して、上記のように調製した同様の表面を使用した。上記のように測定を行ったが、流量は２０μｌ／分であった。３秒間、５０ｍＭのＨＣｌで洗浄することによって、表面を再生した。単量体に関して記載のようにデータを評価した。
細胞の微小凝集
ＢＨＩプレート由来の黄色ブドウ球菌の単一コロニーを使用して、ＢＨＩ培地１５ｍＬを接種した。細菌を３７℃、２００ｒｐｍで一晩成長させた。翌朝、培養液を回転バケット、Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＴ６０００Ｂ冷凍遠心器において４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し（spun down）、上清を除去して、細胞ペレットをＰＢＳ緩衝液で再懸濁させた。
細胞を再び遠心分離し、上清を除去して、細胞ペレットを再びＰＢＳ緩衝液で再懸濁させた。細胞をＡ６００が１．０になるまで希釈し、段階希釈した細胞を３７℃のＢＨＩプレート上に広げて、一晩成長させた。翌朝、細胞力価を測定した。Ａ６００ １．０が１．５×１０９細胞／ｍｌに対応する。同一の工程を行い、成長培地が２ｘＹＴであったことを除いて、その後の微小凝集アッセイのために大腸菌株ＴＧ１細胞を調製した。生菌数は同様であった、Ａ６００ １．０＝２．１×１０９細胞／ｍｌ。
【００５７】
微小凝集アッセイを行うために、マイクロタイタープレートにおけるウェル１〜ウェル１１でＰＢＳにおいてＨＶＨＰ３２８ＰＶＴ２の２倍希釈を行った。ウェル１２（ブランク）はＰＢＳのみを含んでいた。それぞれのウェルの全量は５０μｌであった。その後、ＰＢＳ５０μｌにおける１×１０８個の黄色ブドウ球菌細胞を全てのウェルに加えて、プレートを４℃で一晩インキュベートした。結果を永続的に記録するために、翌朝にプレートの写真を撮った。五量体の対照実験のために、ＨＶＨＰ３２８ＰＶＴ２をＶＬ五量体、ＨＶＬＰ３３５ＰＴＶ２に置き換えた。細胞の対照実験において、同じ２個の組の実験を大腸菌ＴＧ１細胞で繰り返した。
単量体のヒトＶＬの同定及び配列分析
ヒトＶＨファージディスプレイライブラリから可溶性のＶＨを単離するために用いられた本質的に同じ選択方法を、可溶性で単量体のＶＬを単離するためにヒトＶＬライブラリに適用した。大きさが３×１０６であるヒトＶＬライブラリを構築した。ライブラリタイタープレートから２４個のプラークを選別し、これらのＶＬ遺伝子をＰＣＲ及びシークエンシングした。配列は、生殖細胞系起源に関して異なるが、ＶＬの７５％はＶλ起源であった（データ図示せず）。プロテインＬに対する３回のパンニングによって、大きいプラークにおける富化がもたらされた。３９個の大きいプラークをシークエンシングして、３２個の特殊な配列を同定した（図６）。ＨＶＬＰ３２５、ＨＶＬＰ３３５及びＨＶＬＰ３５１はそれぞれ、３、４及び２の頻度で起こった。λクラス（サブグループＶλ１、生殖細胞系１ｂ）であるＨＶＬＰ３８９を除いて、残りの３１個のＶＬはＶκクラスに属していた。３１個のκＶＬの中で、２４個はＶκＩＩＩサブグループに含まれ、７個はＶκ１サブグループに含まれていた。２４個のＶκＩＩＩ配列の１６個は、残りの利用されるＡ２７、Ｌ２及びＬ６生殖細胞系配列を有するＬ６生殖細胞系配列を利用する。Ｖκ１サブグループのＶＬはＯ２／Ｏ１２又はＡ３０生殖細胞系配列に由来する。顕著な突然変異は９６位で起こった。この位置での生殖細胞系アミノ酸は芳香族及び疎水性アミノ酸、κＶＬに対するＴｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ又はＩｌｅ、及びλＶＬに対するＴｙｒ、Ｖａｌ又はＡｌａである。しかし、κＶＬの選択プールにおける３１個の中の５個だけが９６位でこれらの生殖細胞系アミノ酸を有している：ＨＶＬＰ３２５、ＨＶＬＰ３４９、ＨＶＬＰ３８８、ＨＶＬＰ３１０９及びＨＶＬＰ３９３。９６位での２１個のアミノ酸を帯電させ、この中の２０個が正に帯電する：Ａｒｇ、Ｌｙｓ又はＨｉｓ。２個のアミノ酸はＰｒｏ、１個はＧｌｎ、１個はＳｅｒ、及び１個はＴｈｒである。単量体化のためにゲルろ過クロマトグラフィで分析された７個のκＶＬの中で９６位がＡｒｇ又はＬｙｓである６個が単量体であった一方で、９６位が生殖細胞系アミノ酸ＬｅｕであるＨＶＬＰ３２５が凝集体を形成した（以下を参照のこと）。同様に、λクラスであり、且つＳｅｒに対する生殖細胞系突然変異を有していたＨＶＬＰ３８９も単量体であった（以下を参照のこと）。これらのデータは単量体化等のＶＬの生物物理学的特性が改良された９６位での生殖細胞系アミノ酸からの偏差に相関がある（３２個の中の２７個）。
【００５８】
κクラスの１８個のＶＬは、λＶＬでのみ見出されるアミノ酸Ｔｈｒ、Ｖａｌ及びＬｅｕに置き換えられたこれらの最後の３残基（１０５〜１０７）を有していた。これらの置
換はκＶＬの生物物理学的特性を改良する役割を果たしている可能性があり、これにより１０５〜１０７位の元のκ残基を有する親クローンを超えた上記のＶＬの選択がもたらされる。
ヒトＶＬの特徴付け
異なるＶ生殖細胞系起源を有する選択ＶＬの中の８個は、培養液１Ｌ中の大腸菌で発現し、精製された：ＨＶＬＰ３２４、ＨＶＬＰ３２５、ＨＶＬＰ３３５、ＨＶＬＰ３４２、ＨＶＬＰ３５１、ＨＶＬＰ３６４、ＨＶＬＰ３８９及びＨＶＬＰ３１０３（第６表）。全てがＨＶＬＰ３２４に対する６．２ｍｇからＨＶＬＰ３３５及びＨＶＬＰ３６４に対する約７５ｍｇまでに及ぶ良好な収率で発現した。
【００５９】
ゲルろ過クロマトグラフィによるこれらのオリゴマー化状態に関するヒトＶＬの凝集傾向を評価した。ＶＬを０．６ｍｇ／ｍｌの濃度でＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ゲルろ過クロマトグラフィにかけた。ＨＶＬＰ３２５を除いた全てが凝集体を本質的に含んでおらず、平均見掛けの分子質量が１２．７ｋＤａ（範囲、６．２〜１９．２ｋＤａ）である対称の単一ピークを得た（図７Ａ及び第３表）。これは単量体のＶＬに関する期待分子質量（１３．４〜１３．８ｋＤａ）と一致している。単一ドメインの抗体に関する見掛けの分子質量の変動はこれまでに報告されている(Jespers, L. et al., 2004a; Stevens, F. J. et al.,
1980)。ＨＶＬＰ３２５に関して、凝集体が全タンパク質（凝集体＋単量体）の１１％を構成していた。ＨＶＬＰ３５１、ＨＶＬＰ３４２、ＨＶＬＰ３３５及びＨＶＬＰ３１０３は、これらの利用可能な最も高い濃度、すなわちそれぞれ、０．８９ｍｇ／ｍｌ、１．０ｍｇ／ｍｌ、４．９ｍｇ／ｍｌ及び５．９ｍｇ／ｍｌで試験した場合、依然として単量体であった（図７Ｂ）。
【００６０】
ＢＩＡＣＯＲＥ分析前に、ＶＬをＳｕｐｅｒｄｅｘ−７５クロマトグラフィにかけて、物質の凝集に何ら確証がなかったとしても精製した単量体のピークを回収した。ＳＰＲ分析において、全ての選択されたＶＬは、プロテインＬと結合した（図８）。ＶＬがプロテインＬに対するパンニングによって単離されたので、このことは予想外のことではなかった。全てに関して、プロテインＬとの結合のＫＤは、０．６〜３μＭであった（第３表）。ＨＶＬＰ３２４及びＨＶＬＰ３４２はＫＤがそれぞれさらに１０ｎＭ及び４０ｎＭ小さかった。ＶκＩサブグループのＶＬのプロテインＬとの低い親和性及び高い親和性の結合が、これまでに報告されている（参考文献）。ＨＶＬＰ３２４及びＨＶＬＰ３４２の両方がＶκＩサブグループに属している（第３表）。予想通りに、速度論データ及び平衡データは、実際に単量体である単量体ピークと一致していた。
五量体の結合分析
表面プラズモン共鳴によって、ＨＶＨＰ３２８ＰＶＴ２五量体のプロテインＡとの結合及びＨＶＬＰ３３５ＰＴＶ２五量体のプロテインＬとの結合を測定した（図９）。会合速度をｋｏｂｓ対濃度のプロットから独立して算出した。五量体の集合の間の多価結合における不均一性によって、１を超えた解離速度（ｋｄ）を算出することができる。したがって、１を超えた平衡解離定数（ＫＤ）を得ることができる。ＨＶＨＰ３２８ＰＴＶ２及びＨＶＬＰ３３５ＰＴＶ２はそれぞれ、２ｎＭ及び２００ｐＭの最小ＫＤを有していた（第４表）。ｋｄがより遅い場合、ＨＶＨＰ３２８ＰＴＶ２及びＨＶＬＰ３３５ＰＴＶ２はそれぞれ、９００ｐＭ及び９０ｐＭまで低いＫＤを有していた。
ＶＬ及びＶＨによる病原菌検出
ＶＨのプロテインＡ結合活性及びＶＬのプロテインＬ結合活性を使用して、これらの表面上にプロテインＡ及び／又はプロテインＬを有する細菌を検出することができる。本明細書中のＶＨ及びＶＬ等のＶＨ及びＶＬが可溶性であり、且つ単量体である（凝集傾向が失われている）場合、このことは可能である。ラクダ科の重鎖抗体又はナースシャーク及びテンジクザメのＩｇＮＡＲ等の軽鎖が欠失した抗体由来の可変ドメインは、自然発生的に可溶性且つ単量体である。このことから、プロテインＡ結合活性及びプロテインＬ結合活性を有するものを使用して、これらの表面上にプロテインＡ及び／又はプロテインＬを
有する細菌を検出することもできる。プロテインＡは、病原菌である黄色ブドウ球菌の表面上に存在する。このように、本明細書中に記載のもの等のプロテインＡ結合活性のあるＶＨを使用して、黄色ブドウ球菌を検出することができる。本発明者らは微小凝集アッセイを行い、ＨＶＨＰ３２８ＰＶＴ２ ＶＨ五量体の黄色ブドウ球菌と結合する能力を検出した。マイクロタイターウェル（ウェル１〜ウェル１１）において２倍希釈したＨＶＨＰ３２８ＰＶＴ２で一定数の細菌細胞をインキュベートした（図１０）。ウェル１２は五量体の代わりに緩衝液を含んでいた。ＶＨが細菌細胞と結合する場合、したがってその多量体の性質により、五量体は細胞を架橋し、その結果、細胞凝集をもたらすことが可能であるはずである。凝集細胞がマイクロタイターウェルにおける拡散細胞として現れる（図１０）。何の結合もなければ、凝集は起こるはずがなく、したがって凝集体は存在せず、細胞はウェルの底部に点として現れる。図１０で示されるように、細胞の凝集体が存在するので、五量体は黄色ブドウ球菌と結合する。凝集体は最大ウェル７まで観察される。ウェル７より先は、五量体の濃度が結合するには低すぎるので、凝集体は存在しない。対照のＶＬ五量体は、全く凝集を示さず、これによりＶＨ五量体の黄色ブドウ球菌に対する特異性が実証される（図１０）。予想通りＶＨ五量体が大腸菌（ＴＧ１株）又はサルモネラ細胞を凝集させないので、結合は細胞特異的でもある（データは示さず）。同様に、これらの細胞表面上にプロテインＬを有する細菌、特にペプトストレプトコッカス属マグヌス等の病原菌の検出にプロテインＬ結合活性を有するＶＬ単量体及びＶＬ五量体を使用することができる。
【００６１】
上記で記載の実施例は、本発明の実際の範囲を限定する役割を果たすものでは決してなく、むしろ例示目的のために表されていることが理解される。
参考文献リスト
【００６２】
【表１】
【００６３】
【表２】
【００６４】
【表３】
【００６５】
【表４】
【００６６】
【表５】
【００６７】
【表６】
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】選択された実施例の結果（可溶性ＶＨ（ＨＶＨＰ４２８）を示すファージと不溶性ＶＨ（ＢＴ３２／Ａ６）を示すファージとの間のプラークサイズの対比）の図的記述を示す。この写真はプラークの可視化を高めるために拡大した細菌層の寒天プレートの一部を示す。プレートは、それぞれ同じ数の２個のプラーク型を含んでいたが、この写真は基本的に大きいＨＶＨＰ４２８プラークを含んでいる。ＢＴ３２／Ａ６プラークの大多数は小さすぎて写真において鮮明ではっきりした画像を得ることができなかった。矢印で示されたプラークは、この画像で可視化させるのに十分大きかった小さい割合のＢＴ３２／Ａ６ファージを示している。アスタリスクは、ＨＶＨＰ４２８ファージの代表的なプラークサイズを示す。プラークの同一性は、ＤＮＡシークエンシングによって決定された。
【図２】プロテインＡに対する親和性及びプラークサイズに基づき選択されたヒトＶＨのアミノ酸配列。入力配列(sequence entries)の点は、ＨＶＨＰ２Ｍ１０又はＨＶＨＰ４４とアミノ酸が同一であることを示す。ダッシュ記号は配列アラインメントのために含まれている。鍵となる可溶性部分の残基及びプロテインＡ結合特性を有するＶＨ／ＶＨＨに関連する５７Ｔ残基は太字である。カバットナンバリングシステムを使用する。「頻度」の値の総計は１１４である。ＣＤＲは相補性決定領域であり、ＦＲはフレームワーク領域であり、ｇｌｎ ｓｅｑは生殖細胞系の配列である。
【図３Ａ】ヒトＶＨの凝集傾向。ゲルろ過クロマトグラムによって、この研究で単離したヒトＶＨ（ＨＶＨＰ４２８）のオリゴマー化状態をラマＶＨＨ（Ｈ１１Ｃ７）及び典型的なヒトＶＨ（ＢＴ３２／Ａ６）のものと比較する。それぞれのクロマトグラムの最後に溶離したピークは単量体のＶＨに対応する。二量体のＨ１１Ｃ７のピークは矢印によって示される。
【図３Ｂ】（ｉ）８００ＭＨｚでのＨＶＨＰ４１４、（ｉｉ）５００ＭＨｚのＨＶＨＰ４２３、及び８００ＭＨｚのＨＶＨＰ４２８の一次元の１Ｈ ＮＭＲスペクトル。左側のパネルのスペクトルは、低強度のシグナルのより良好な視覚化を可能にするように２倍に拡大されている。
【図４Ａ】３７℃でのトリプシンに対する耐性及び３７℃での長期のインキュベート後の完全性に関するヒトＶＨの安定性。２１ｋＤａのマーカーに対して未処理のＨＶＨＰ４１４ＶＨと１５、３０及び６０分でトリプシン処理したＨＶＨＰ４１４ＶＨとの移動度を比較するＳＤＳ−ＰＡＧＥ。ＨＶＨＰ４１４−ｃＭｙｃは、ｃ−Ｍｙｃを欠失したＨＶＨＰ４１４ＶＨを示す。
【図４Ｂ】３７℃でのトリプシンに対する耐性及び３７℃での長期のインキュベート後の完全性に関するヒトＶＨの安定性。未処理のＨＶＨＰ４１４ＶＨ及びトリプシン処理（６０分）ＨＶＨＰ４１４ＶＨの質量分析法によって得られた分子質量プロファイル。処理済ＶＨの質量分析プロファイルを未処理のＶＨのものの上に重ねて、より良好な視覚的比較を行う。未処理のＶＨの実験の分子質量は、１４９６７．６Ｄａであり、これは期待分子質量１４９６７．７Ｄａとほぼ同一である。トリプシン処理したＶＨで観察された分子質量（１３３６８．５Ｄａ）は、ｃ−ＭｙｃタグにおけるＫ（Ｌｙｓ）での切断によるＣ末端での１３アミノ酸の欠失を示し、期待分子質量１３３６８．０Ｄａを与える。トリプシン切断部位は、ＨＶＨＰ４１４のアミノ酸配列上の垂直な矢印によって示される。
【図４Ｃ】３７℃でのトリプシンに対する耐性及び３７℃での長期のインキュベート後の完全性に関するヒトＶＨの安定性。３７℃で処理したＨＶＨＰ４２０ＶＨのオリゴマー化状態（上方のプロファイル）と未処理のＶＨ（下方のプロファイル）のものとの比較をするゲルろ過クロマトグラム。重ねるとクロマトグラムが区別できないので、このクロマトグラムを垂直に移動させた。それぞれのクロマトグラムの主なピーク及び微小ピークは、それぞれ単量体のＶＨ及び二量体のＶＨに対応する。二量体のＶＨは、全タンパク質の３％を構成する。挿入図は、様々な濃度でのプロテインＡとの３７℃で処理したＨＶＨＰ４２０の結合に関するセンサーグラムオーバーレイを示す。温度安定性試験に使用されるＶＨは、既に４℃で数ヶ月間調製したストック由来であった。
【図５】天然ＨＶＨＰ４２３（太線）及びリフォールディングしたＨＶＨＰ４２３（細線）の７５、１００、１５０及び２００ｎＭの濃度で固定化されたプロテインＡとの結合を示すセンサーグラムオーバーレイ。ＫＤｎ及びＫＤｒｅｆがそれぞれのセンサーグラムから算出され、以下で記載のようにＲＥを求めるのに使用した。
【図６】プロテインＬに対する親和性及びプラークサイズに基づき選択されたヒトＶＬのアミノ酸配列。入力配列における点は、ＨＶＬＰ３３３とアミノ酸が同一であることを示す。ダッシュ記号は配列アラインメントのために含まれる。配列ナンバリング及びＣＤＲ指定に関するＶ ＢＡＳＥ(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/index.php？module＝pagemaster&PAGE_user_op＝view_page&PAGE_id＝7&MMN_position＝5:5)を参照されたい。Ｌ６、Ａ２７、Ｌ２、Ｌ１６、Ｏ２／Ｏ１２、Ａ３０及び１ｂは、Ｖ生殖細胞系設計である。Ｊ生殖細胞系設計は括弧内である。ＮＦは見当たらない。
【図７Ａ】ヒトＶＬドメインのサイズ排除クロマトグラム。ＶＬを０．６ｍｇ／ｍｌの濃度で添加した。「＃」及び「＊」は、それぞれ凝集体及び単量体のピークを示す。凝集体は排除体積で溶出する。
【図７Ｂ】ヒトＶＬドメインのサイズ排除クロマトグラム。ＶＬを利用可能な最も高い濃度（１．０ｍｇ／ｍｌのＨＶＬＰ３４２、５．９ｍｇ／ｍｌのＨＶＬＰ３１０３、４．９ｍｇ／ｍｌのＨＶＬＰ３３５、０．８９ｍｇ／ｍｌのＨＶＬＰ３５１）で適用した。「＃」及び「＊」は、それぞれ凝集体及び単量体のピークを示す。凝集体は排除体積で溶出する。ＨＶＬＰ３４２パネルにおける矢印で示されたピークは、前の測定からのキャリーオーバーである。
【図８】０．２、０．５、０．７５、１、２、３、５及び１０μＭ（ＨＶＬＰ３８９、ＨＶＬＰ３５１及びＨＶＬＰ３６４）；１、２、３、５、７．５及び１０ｎＭ（ＨＶＬＰ３４２）；０．２、０．５、１、２、３、５及び１０μＭ（ＨＶＬＰ３３５）；０．２、０．５、１、１．５、２及び５μＭ（ＨＶＬＰ３２５）；０．２、０．５、０．７５、１、１．５、２、３及び５μＭ（ＨＶＬＰ３１０３）；並びに１、２、３、４、５及び６ｎＭ（ＨＶＬＰ３２４）の濃度で固定化されたプロテインＬとのＶＬの結合を示すセンサーグラムオーバーレイ。プロテインＬの低親和性部位と結合するＨＶＬＰ３２４及びＨＶＬＰ３４２に関するセンサーグラムは含まれないが、算出されたＫＤは第３表に記録される。
【図９Ａ】表面プラズモン共鳴実験におけるプロテインＡとＨＶＨＰ３２８ＰＴＶ２との結合を示す図である。１、２、３、４、６、８及び１０ｎＭの濃度で固定化したプロテインＡとＨＶＨ２８ＰＴＶ２との結合を示すセンサーグラムオーバーレイ。結合データは第４表に記録される。
【図９Ｂ】表面プラズモン共鳴実験におけるプロテインＬとＨＶＬＰ３３５ＰＴＶ２との結合を示す図である。１、２、２．５、３、３．５、４及び４．５ｎＭの濃度で固定化したプロテインＬとＨＶＨ３３５ＰＴＶ２との結合を示すセンサーグラムオーバーレイ。結合データは第４表に記録される。
【図１０】黄色ブドウ球菌による微小凝集実験の結果を示す図である。五量体の濃度は、ウェル１からウェル１１まで２分の１ずつに減少し、ウェル１２は五量体がＰＢＳ緩衝液で置き換えられている。上の行のウェルはＨＶＨＰ３２８ＰＴＶ２五量体を含み、下の行はＨＶＬＰ３３５ＰＴＶ２五量体を含む。ウェル１〜６の五量体の濃度はそれぞれ、２１５、１０８、５４、２７、１３及び７μｇ／ｍｌである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリペプチド、特に単量体のヒト抗体フラグメントの単離、同定及び操作に関する。
【背景技術】
【０００２】
脊椎動物の抗体は通常、一対の重（Ｈ）鎖及び軽（Ｌ）鎖から構成される。組み合わされたＨ鎖及びＬ鎖の最初のドメインであるＶＨ及びＶＬは配列においてより可変的であり、抗原を認識し、抗原に結合する抗体部分である。ＶＨドメイン及びＶＬドメインは対で抗原を認識する。
【０００３】
ラクダ科（ラクダ、ヒトコブラクダ及びラマ）の免疫レパートリは、重鎖抗体と呼ばれる変わった種類の抗体を保有するという点で、特殊である(Hamers, Casterman C. et al., 1993)。これらの抗体は軽鎖を欠いており、したがってこれらの組み合わせ部位はＶＨ
Ｈと呼ばれる１個のドメインから構成される。
【０００４】
組み換え型ＶＨＨの単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）は、従来の四本鎖抗体由来の一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントに勝る幾つかの利点を提供する。ｓｄＡｂの親和性はｓｃＦｖの親和性と同程度であるが、ｓｄＡｂは、可溶性、安定性、凝集耐性、リフォールディング性、発現収率及びＤＮＡ操作の易操作性、ライブラリ構築並びに三次元構造決定といった点でｓｃＦｖより優れている。抗体を伴う適用において、上記のＶＨＨ ｓｄＡｂの特性の多くが望ましい。
【０００５】
しかし、ＶＨＨの非ヒト性質によって、免疫原性によるヒトの免疫療法におけるＶＨＨの利用が制限される。この点において、ヒトのＶＨ及びＶＬ ｓｄＡｂの免疫原性が最小であると考えられるので、免疫療法への適用に対する理想的な候補である。
【０００６】
しかし、ヒトのＶＨ及びＶＬは従来の抗体由来のＶＨ及びＶＬに共通の特徴である凝集の傾向が強い(Davies, J. et al., 1994; Tanha, J. et al., 2001; Ward, E. S. et al., 1989)。このように抗体用途に好適な単量体のヒトのＶＨ及びＶＬを得る試みが行われ
てきた。このようなＶＨ及びＶＬは、高い発現収率、高いリフォールディング性及び凝集耐性等のＶＨＨに一般的な他の有用な特性も示す。これらのＶＨ及びＶＬでライブラリ骨格として構築される合成ライブラリは、治療用の有望なタンパク質源として役立つ可能性がある。
【０００７】
ラクダ及びラマのＶＨＨからそれぞれ、ヒトのＶＨ又はＶＬに組み込まれる鍵となる可溶性残余物を伴うラクダ化(camelization)並びにラマ化(llamination)を利用して、単量
体のヒトのＶＨ及びＶＬを生成した。これらのＶＨ及びＶＬに基づき構築され、ＣＤＲランダム化により生成される合成ｓｄＡｂライブラリは、様々な抗原との結合因子を得るといった点で機能的であることが示された(Davies, J. et al., 1995; Tanha, J. et al., 2001)。
【０００８】
別の手法において、上記の技術的手段を用いることなく、完全なヒトの単量体のＶＨ及びＶＬをヒトの合成ＶＨ及びＶＬライブラリから単離した。一実験において、ヒトＶＨライブラリを鶏卵リゾチームに対してパンニングした(panned)時に単量体のヒトＶＨを発見した(Jesperps, L. et al., 2004b)。さらに最近では、可逆的非フォールディング及び親和性基準に基づく選択方法によって、合成ヒトＶＨライブラリから多くの単量体のＶＨが得られた(Jespers, L. et al., 2004a)。この知見は、適切な選択方法が望ましい生物物
理学的特性を有する珍しい単量体のヒトＶＨを効率的に捕捉する鍵となるという事実を明確に示していた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の第１の目的は、生物物理学的特性（可溶性、高い発現及び／又は安定性（熱変性後の高いリフォールディング、化学変性剤に対する高い耐性、及びプロテアーゼ、特にトリプシン等の胃腸プロテアーゼに対する高い耐性等）を含む）が改良されたポリペプチド、特に抗体フラグメントを同定するハイスループットスクリーニング方法を提供することである。
【００１０】
本発明の第２の目的は、単量体のヒトＶＨ及びヒトＶＬを同定するハイスループットスクリーニング方法を提供することである。
【００１１】
本発明の第３の目的は、単量体のヒトＶＨ及びヒトＶＬを同定、単離及び特徴付けすることである。
【００１２】
本発明の第４の目的は、抗体フラグメント、特に単量体のヒトＶＨ及びヒトＶＬの多量体を構築及び特徴付けることである。
【００１３】
本発明の第５の目的は、ポリペプチド、特に抗体フラグメント及び最も特定的には単量体のヒトＶＨ及びヒトＶＬからディスプレイライブラリを構築することである。
【００１４】
本発明の第６の目的は、ポリペプチド、特に抗体フラグメント及び最も特定的には生物物理的な特性が改良された単量体のヒトＶＨ及びヒトＶＬを生成するＤＮＡシャッフリング法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
発明の要約
ポリペプチド、好ましくは抗体フラグメント及び最も好ましくは望ましい生物物理学的特性（可溶性、安定性、高い発現性、単量体性、非凝集性、結合特異性）を有するヒトＶＨ及びヒトＶＬを単離する方法が提供される。この方法は、様々なポリペプチド配列を発現することができるファージディスプレイライブラリを得る工程、ライブラリファージによる細菌層の感染を可能にする工程、及び細菌層上の平均よりも大きいプラークを形成するファージを同定する工程を包含する。それからファージを単離し、シークエンシングか、又はそうでなければポリペプチド配列を特定するこれらの工程を用いる。
【００１６】
本発明は、上記の方法で同定されるポリペプチド、特に単量体のヒトＶＨ及びヒトＶＬも提供し、これは免疫療法に及び／又は診断用薬剤もしくは検出用薬剤として有用であり得る。単量体のヒトＶＨ及びヒトＶＬは組合せて、二量体、三量体、五量体又は他の多量体を形成してもよく、これは免疫療法に及び／又は診断用薬剤もしくは検出用薬剤として有用であり得る。
【００１７】
上記の方法によって同定されたポリペプチド（ヒトＶＨ及びヒトＶＬを含む）を、可溶性、安定性、単量体性、高発現性、結合特異性、及びヒト起源等の改良された生物物理学的特性のために選択するＤＮＡシャッフリング等の方法によって操作することができる。
【００１８】
上記の方法によって同定されたポリペプチド（ヒトＶＨ及びヒトＶＬを含む）は、さらにディスプレイライブラリを生成するのにも使用することがあり、これを同様に使用して、上記の方法によってさらにポリペプチドを単離することができる。
【００１９】
第１の態様において、本発明は、標的ポリペプチドを同定する方法であって、ａ）様々なポリペプチド配列を発現することができるファージディスプレイライブラリを得ること、ｂ）ライブラリファージによって、細菌層の感染を可能にすること、ｃ）細菌層上の平均よりも大きいプラークを形成するファージを同定することを含む、方法を提供する。
【００２０】
第２の態様において、本発明は、配列番号８〜配列番号５４から成る群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。
【００２１】
第３の態様において、本発明は、配列番号８〜配列番号２２から成る群より選択される少なくとも１個のアミノ酸配列を含むＶＨ抗体フラグメントを提供する。
【００２２】
第４の態様において、本発明は、配列番号２３〜配列番号５４から成る群より選択される少なくとも１個のアミノ酸配列を含むＶＬ抗体フラグメントを提供する。
【００２３】
第５の態様において、本発明は、望ましい生物物理学的特性を有するポリペプチドを生成する方法であって、ａ）請求項４１、４２、４４、４５、４７、４８、５９若しくは７０に記載の抗体フラグメントをコードするか、又は請求項２４、２７、３７若しくは３９に記載のポリペプチド配列をコードし、且つ第１の望ましい特性を有する少なくとも１個の第１の核酸配列を提供する工程と、ｂ）第２の望ましい特性を有する抗体フラグメントをコードする少なくとも１個の第２の核酸配列を提供する工程と、ｃ）少なくとも１個の第１の核酸配列及び少なくとも１個の第２の核酸配列をランダムなフラグメントに切断する工程と、ｄ）ランダムなフラグメントを再び集合化させる工程と、ｅ）ランダムなフラグメントを発現する工程と、ｆ）発現されたランダムなフラグメントを第１の望ましい特性及び前記第２の望ましい特性に関してスクリーニングする工程とを含む、方法を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
発明の詳細な説明
ヒト起源であり、可溶性、安定性、凝集に対する耐性、リフォールディング性、高発現性、及びＤＮＡレベルでの易操作性があり、ライブラリ構築及び三次元構造決定に理想的であるポリペプチド、特に抗体フラグメントを同定することが望ましい。このような抗体フラグメントは、多種の免疫療法への適用、並びに診断用薬剤及び検出用薬剤としても有用である。ヒトの単量体のＶＨ抗体及びＶＬ抗体は上記の特性の多くを有しているとされるので、特に興味深い。
【００２５】
上記の特性を有するポリペプチドは、様々なポリペプチド配列を発現することができるライブラリのハイスループットスクリーニングによって同定することができる。例えば、ファージディスプレイライブラリ（好ましくは、Ｍ１３又はｆｄ等の繊維状ファージ）は、ファージの影響を受けやすい細菌の領域（細菌層）をファージで感染させ、それからプラークとして知られるはっきりした無菌領域を探すことにより、どのファージが細菌を首尾よく溶解させるかを決定することによりスクリーニングすることができる。単量体のラマ化ＶＨ及びＶＬが、凝集傾向のある完全なヒトＶＨを示すファージよりも大きいプラークを細菌層上に形成する。したがって、ヒトＶＨレパートリから珍しく自然発生的な単量体のＶＨ及びＶＬを同定する手段として、プラークサイズを使用することができる。
【００２６】
本明細書中に記載の方法は、可溶性、安定性（安定性には、多くの特徴（高熱リフォールディング効率、高い融解温度、３７℃での長期（数日）のインキュベート後の機能性の維持、化学変性剤に対する耐性、プロテアーゼに対する耐性、０℃未満、４℃未満及び室温での長期の保存期間、細胞内環境における機能性の維持、並びに血流中等のヒトの体内
の機能性の維持を含むが、これらに限定されない）が含まれる）、及び様々な起源の高発現性のタンパク質を同定するのにも有用であり、これらのタンパク質としては、
１．ＶＨ、ＶＬ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ及びより詳細にはヒト抗体であるＩｇＧ等の全抗体、
２．非抗体スカフォールドの一本鎖Ｔ細胞受容体、Ｔ細胞受容体ドメイン、トランスフェリン、リポカリン、ｋｕｎｉｔｚドメイン、アンキリン反復、及び細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ−４）に基づくタンパク質変異体（ヒトのものを含む）、
３．ウイルス性及び細菌性のタンパク質ワクチン等のワクチン、
４．治療用タンパク質（例えば、インスリン、成長ホルモン、エリスロポエチン）
５．タンパク質性の診断用試薬及び生化学試薬（例えば、プロテインＡ、プロテインＧ）
が挙げられる。
【００２７】
ポリペプチドをこの方法で同定されれば、このポリペプチドを使用して、さらなるライブラリを構築することができる。例えば、ＶＨの核酸配列を選択することによって、これを行うことができる。ランダムなコドンを有するオリゴヌクレオチドを作り、ＶＨ配列に組み込む。このようにして、それぞれの特殊なオリゴヌクレオチドをＶＨ遺伝子に組み込み、修飾されたＶＨ遺伝子によってわずかに変異のある配列のライブラリが構成される。一般的に、ＶＨのＣＤＲ又はループをランダム化させるように、オリゴヌクレオチドを設計する。例えば、１個、２個又は３個全てのＶＨ ＣＤＲをランダム化させることができる。それから、使用するライブラリの種類に応じて、ＶＨライブラリを適切なベクターにクローニングさせ、核酸配列をポリペプチドとして発現させる。一般的にパンニング(panning)によって、ライブラリポリペプチドと結合する分子に関してライブラリをスクリー
ニングする。ライブラリはファージディスプレイライブラリ、又はリボソームディスプレイ及び酵母ディスプレイ等の他のディスプレイライブラリであり得る。
【００２８】
本明細書中に記載の方法で同定したポリペプチドを例えば、単量体の架橋により二量体、三量体、五量体及び他の多量体を形成し、免疫療法に使用することができる。このことにより、抗原分子におけるより良好な親和性及び幾つかの抗原におけるより緩やかな拡散速度がもたらされ得る。別の可能性のある手法は、ポリペプチドを様々な機能を有する種々の分子と結合又は融合させることである。例えば、抗体フラグメントは、特定の細胞又は分子を標的、破壊又は修飾するために、放射性核種、細胞傷害性薬剤、トキシン、ペプチド、タンパク質、酵素、リポソーム、脂質、Ｔ細胞超抗原又はウイルスと結合することができる。
【００２９】
本明細書中に記載の選択方法で同定したＶＨ又はＶＬを単離すれば、ＶＨ又はＶＬをさらに操作し、可溶性、安定性、単量体性、結合特異性、ヒト起源又は高発現性等の改良された生物物理学的特性に関して選択することができる。ＤＮＡシャッフリング又は交互伸長法等のｉｎ ｖｉｔｒｏ組み換え技法で、これを達成することができる。ＤＮＡシャッフリングは、抗体フラグメント等の第１のポリペプチド（ドナー）及び第２のポリペプチド（アクセプタ）の核酸配列をランダムなフラグメントに切断し、ＰＣＲ様反応によりランダムなフラグメントを再び集合化させることを含む。それから、再集合化されたフラグメントをスクリーニングし、所望の特性に関して選択する。
【００３０】
例えば、高い安定性のある１つ又は複数のＶＨ（ドナー）を十分な安定性を欠いている１つ又は複数のＶＨ（アクセプタ）と混合し、ＤＮＡシャッフリングにかけることができる。このことにより、ドナーＶＨから安定性残基を組み込んだアクセプタＶＨの突然変異型が発生する。本明細書に記載の方法によって、又はリボソームディスプレイ、酵母ディスプレイ、細菌細胞ディスプレイ及びファージディスプレイ等の他の発展的なタンパク質スクリーニングシステムによって、新たな安定性のある突然変異型を同定することができ
る。同様に、この技法を使用して、可溶性、単量体性、及び高発現性等の望ましい特質を形質転換することができる。
【００３１】
ドナーＶＨ及びアクセプタＶＨが望ましい特性を有する場合に、この技法を使用して両方の特性を有するＶＨを生成することができる。例えば、重要な治療用リガンド又は診断用リガンドと結合する不安定なドナーＶＨを安定性のあるアクセプタＶＨでシャッフルすることができる。新たに生成した安定性のあるＶＨもリガンドと結合する能力があることを確実にするために、スクリーニングシステムは、リガンド結合工程を伴い得る。
【００３２】
ＤＮＡシャッフリングは、ラクダ科の重鎖抗体の可変領域並びにナースシャーク及びテンジクザメの可変領域等の非ヒトＶＨ、又は治療標的と結合する非ヒトＶＬをヒト化するのにも有用であり得る。可溶性、安定性、単量体性、及び高発現性等の望ましい特性を有するヒトＶＨ及びヒトＶＬをドナーとして使用することができる。例えば、良好な安定性のある１つ又は複数のヒトＶＨ（ドナー）を１つ又は複数の治療用の非ヒトＶＨ（アクセプタ）と混合し、ＤＮＡシャッフリングにかけることができる。これにより、安定性があり、且つヒト化されたアクセプタＶＨの突然変異型が発生する。本明細書に記載の方法によって、又はリボソームディスプレイ、酵母ディスプレイ、細菌細胞ディスプレイ及びファージディスプレイ等の他の発展的なタンパク質スクリーニングシステムによって、新たに発生したヒト化され、且つ安定性がある変異型を同定することができる。さらなる実施例では、アクセプタＶＨは治療用ＶＨＨ（ラクダ科の重鎖抗体の可変ドメイン）であり得る。
【００３３】
さらに、この技法はＶＨ及びＶＬ以外のポリペプチドの望ましい特性を選択するのにも有用である。上記で示されるように、ドナーポリペプチド及びアクセプタポリペプチドは、両方ともヒトであり得るか、又はドナーがヒトであり、アセプタが非ヒトであり得る。
【００３４】
可溶性、単量体性、高発現性、又は安定性をＶＨ及びＶＬに与える可能性のある手法は、アクセプタＶＨ及びＶＬ上の相補性決定領域（ＣＤＲ）をグラフト化することによるものであり得る。ＣＤＲは、単一ドメイン抗体の可溶性及び安定性、及びそれに応じた本明細書中に記載の方法で単離したＶＨ及びＶＬ由来のＣＤＲ等のこれらの領域のグラフト化を伴うことが知られているので、可溶性及び／又は安定性をアクセプタＶＨ及びＶＬに与えることができる。
ヒトの単量体のＶＨ及びＶＬ
異なる生殖細胞及び全配列を有する幾つかの単量体のヒトＶＨが、ファージプラークサイズに基づくこの選択方法によって、ナイーブヒトＶＨファージディスプレイライブラリから同定された（図１及び配列番号８〜配列番号２２を参照のこと）。ＶＨは、３７℃でのトリプシン処理、３７℃での数週間のインキュベート、又は４℃での数ヶ月の保存後でも機能性及び単量体を維持し、熱リフォールディング効率が高く、大腸菌において良好な収率で生成され、プロテインＡ結合活性を有する。
【００３５】
さらに、幾つかの単量体のヒトＶＬが同定された（図６及び配列番号２３〜配列番号５４を参照のこと）。ＶＬも大腸菌において良好な収率で生成され、プロテインＬ結合活性を有する。
【００３６】
また、スカフォールドとして上記のＶＨを利用する合成ライブラリからのＶＨによって、このような特性が明らかになる。したがって、このようなライブラリによって、生理学的温度での良好な有効性、長い保存期間、及び費用効率が高い生産を有する治療用ＶＨ又は診断用ＶＨが得られ得る。高温リフォールディング効率の特徴によって、ＶＨ結合因子が一時的に高温に曝された後に、その活性を維持するように要求される場合に対するこれらのライブラリの生物工学的適用をさらに拡大させる。ＶＨは、その望ましい生物物理学
的特性により、体内適用に非常に適しているはずである。プロテインＡ結合特性は、診断試験におけるＶＨ精製及びＶＨ検出、免疫ブロット法及び免疫細胞化学を単純化し、ライブラリから非機能性のＶＨを取り除くことによって、ライブラリ性能を高めるために利用することができる。同様に、スカフォールドとしてＶＬを利用するライブラリによって、同様に望ましい特性を有する治療用のＶＬＳ又は診断用のＶＬＳが得られる。ＶＬがプロテインＬと結合するので、このプロテインＬ結合特性を利用することにより、ＶＬ精製及びＶＬ検出が単純化される。
【００３７】
本発明のＶＨ及びＶＬで構成されたディスプレイライブラリは、診断用薬剤及び検出用薬剤の有用な供給源でもあり得る。
【００３８】
これまでに報告された有益な生物物理学的特性を有する完全なヒトＶＨは、単一のＶ生殖細胞系配列：ＤＰ−４７に基づいていた(Jespers, L. et al., 2004b; Jespers, L. et
al., 2004a)。この研究における単量体のヒトＶＨが、ＤＰ−４７を含む６個の異なる生殖細胞系配列から起因しているという見解によって、安定性のあるＶＨは生殖細胞系遺伝子の利用に関して限定されないことが実証される。事実、本発明者らがファミリーの単量体のＶＨを単離し、本明細書で記載するものとは異なる生殖細胞系起源は、プロテインＡ結合活性のあるＶＨ３ファミリーのＶＨのサブセットに対する本発明者らの選択を制限させない可能性が非常に高い。ＶＨにおいて複数の突然変異が発生すること、及びＣＤＲ３はｓｄＡｂの生物物理学的プロファイルの形成にも関与することが知られているという事実により、本発明のＶＨの観察された生物物理学な挙動に関与するアミノ酸突然変異（第１表）を特定することは不可能である。しかし、ｓｄＡｂ安定性及び可溶性に重要であることが知られている位置（例えば、ＨＶＨＰ４２３及びＨＶＨＰ４４ＢにおけるＶ３７Ｆ）での突然変異又は同じ位置（例えば、９個のＶＨにおけるＬ５Ｖ／Ｑ及びＶ５Ｑ）で複数回起こる突然変異は、ＶＨの生物物理学的特性を決定するのに役立つ。ライブラリ構築に関して、ライブラリ安定性を危うくすることなくＣＤＲランダム化が行われるように、本発明のＶＨの単量体性は、ＣＤＲ、特にＣＤＲ３には依存しないことが望ましい。これに関して、安定性に関してＣＤＲ３への依存性が小さいので、より小さいＣＤＲ３を有するＶＨ（例えばＨＶＨＢ８２）が好ましいスカフォールドであり得る。
【００３９】
全体の配列及びＣＤＲ３の長さに関する本発明のＶＨ及びＶＬの多様性によって、より良好な性能のライブラリの構築が可能になる。合成ＶＨライブラリが単一スカフォールドで構築されている。レパートリ形成へのこのような手法は、多様なスカフォールドを利用する天然のｉｎ ｖｉｖｏでの「手法」とはかなり異なっている。本明細書中に報告されている配列に基づいて、多様な組のＶＨ及びＶＬの可用性を利用し、複数のＶＨ及びＶＬのスカフォールドに基づくライブラリを作ることができる。このようなライブラリは、ｉｎ ｖｉｖｏでのレパートリのより良好な模倣であり、したがってより最適な複雑性を有する。ｓｄＡｂにおける３個のＣＤＲの中で、ＣＤＲ３は一般的に最も有意にレパートリの多様性に寄与し、この理由から一般的にＣＤＲ３の長さを同時に変えることによって、ＶＨ及びＶＬのスカフォールドにおけるＣＤＲ３ランダム化が達成される。この有意性がライブラリの複雑性を改良するが、親スカフォールドＣＤＲ３の長さを壊すことによって、ライブラリの安定性をも危うくする可能性がある。ＣＤＲ３の長さに関して本明細書中で開示されるＶＨ及びＶＬの不均一性によって、良好な複雑性、良好な安定性及び良好な生物物理学的な特徴の両方を有するライブラリの形成を可能にする。このようなライブラリは、好ましくはサブライブラリから成り、それぞれのサブライブラリは、親ＣＤＲ３の長さを壊すことなく、単一のＶＨ、及びＶＬスカフォールド上のＣＤＲ３のランダム化（及び必要に応じてＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２のランダム化）によって作られる。
【００４０】
治療標的に特異的なＶＨＨ、ＶＨ及びＶＬをヒト化することに関して、最適なＶＨ及びＶＬフレームワークを選択するといった点でも、本発明のＶＨ及びＶＬの多用途性は有益
である。比較的容易に免疫性、非免疫性又は合成ＶＨＨライブラリから治療標的に対する親和性の高いラクダ科のＶＨＨを得て、その後ヒト化（ＣＤＲグラフト化、再サーフェイシング(resurfacing)、脱免疫化）を行い、可能性のあるＶＨＨ免疫原性を除去すること
ができる。それにより、治療用ＶＨの生成に対するヒトＶＨライブラリの手法の代替方法を提供する。後者の手法による親和性の高い治療用ＶＨの生成は、最初の合成ヒトＶＨライブラリから選択される主要な結合因子（複数可）の面倒で、且つ時間のかかるさらなるｉｎ ｖｉｔｒｏの親和性突然変異を要求することが度々あり得る。
【００４１】
比較的容易に免疫性、非免疫性又は合成ＶＨライブラリから治療標的に対する非ヒトＶＨを得て、その後ヒト化（ＣＤＲグラフト化、再サーフェイシング、脱免疫化）を行い、非ヒトＶＨ免疫原性を除去することができる。それにより、治療用ＶＨの生成に対するヒトＶＨライブラリの手法の代替方法を提供する。
【００４２】
比較的容易に免疫性、非免疫性又は合成ＶＨＨライブラリから治療標的に対する非ヒトＶＬを得て、その後ヒト化（ＣＤＲグラフト化、再サーフェイシング、脱免疫化）を行い、ＶＨＨ免疫原性を除去することができる。それにより、治療用ＶＬの生成に対するヒトＶＬライブラリの手法の代替方法を提供する。
【００４３】
改良された生物物理学的特性を有するタンパク質の選択に対する多くの発展的な手法が記載されている(Forrer, P. et al., 1999; Waldo, G. S., 2003)、(Jespers, L. et al., 2004a; Jung, S. et al., 1999; Matsuura, T. et al., 2003)。一般的に確実にライブラリ集合から不安定又は安定性の低い変異型よりも安定性のある変異型を優先的に選択するために、安定性圧力が必要とされる。例えば関連の研究で、凝集耐性のあるＶＨを選択するために、ＶＨファージディスプレイライブラリの熱処理が要求された(Jespers, L. et al., 2004a)。ファージディスプレイを含む発展的な選択の手法の例としては、従来の
ファージディスプレイ、選択的感染ファージ及びタンパク質分解の手法が挙げられる。最初の２個の手法において、安定性のあるタンパク質が不安定なものよりもそのリガンドに対してより良好な結合特性を有するという仮定に基づき、親和性の選択を使用して、ライブラリから安定性のある種を選択する。しかし、安定性選択工程がさらに包含されていても、これらの手法は主に安定性よりも親和性をより高める(Jung, S. et al., 1999)。結
合工程が要求されることによって、既知のリガンドを有するタンパク質に対するこれらの手法の適用性も制限される。第３のタンパク質分解の手法は、不安定なタンパク質がプロテアーゼに対して耐性がないのに対して、安定性のあるタンパク質は一般的に小さく、したがってプロテアーゼに対して耐性があるという事実に基づいている。ファージディスプレイフォーマットは、表示されたタンパク質のプロテアーゼ安定性が、ファージ感染性に変換されるように操作される。このように、変異型のファージディスプレイライブラリをプロテアーゼで処理する場合、安定性のあるタンパク質を表示するファージのみがこれらの感染性を維持し、その後、大腸菌宿主を感染させることにより選択することができる。この手法はリガンド結合と独立しているので、一般的に有用である。しかし、安定であり、且つ十分にフォールディングしたタンパク質であってもプロテアーゼ感受性部位（例えば、ループ及びリンカー）を有し、これによりタンパク質分解の手法における安定性のある種の選択が妨げられることもあり得る(Bai, Y. et al., 2004)。
【００４４】
これに対して、本発明の発展的な手法において、優れた生物物理学的特性を有するタンパク質は肉眼で簡単に判別される。この手法は、リガンド結合工程、タンパク質分解工程又は脱安定化工程を要求せず、したがって報告された選択的手法において直面する可能性のある複雑性が回避される。結合工程に対する要求がないことは、この手法が一般的に有用であることも意味する。オプションとして、結合工程は選択されたタンパク質が機能的であることを確実にすることが含まれてもよい。しかし、本発明の手法の（プラーク視覚化のための）プレート培養に対する依存性によって、操作することができ、小さいライブ
ラリに対する適用を制限し得るプレートの数に関して、可能性のある運搬上の制限が導入される。それにもかかわらず、ライブラリを最初に取り扱いが可能な大きさに縮小する場合、現在の手法の有用性は大きなライブラリにまで拡大することが可能である。例えば、選択システムに大きい集合の不安定な種を取り除き（例えば、プロテインＡ表面上又は疎水性相互作用カラム上のライブラリ吸収）、これにより露出した疎水性表面を有する不完全にフォールディングしたタンパク質を除去する、取り除く工程を組み込むことにより、これを行うことができる(Matsuura, T. et al., 2003)。本明細書中において、この手法
を使用して、非常に不安定なＶＨ及びＶＬのバックグラウンドにおいて良好な生物物理学的特性を有するＶＨ及びＶＬを選択した。しかし、適度に良好な安定性を有するタンパク質で集合化された突然変異型のライブラリから「最良の」種を選択することはより困難であり得る。この場合、より短期間のインキュベート時間でのプラーク形成速度に基づくか、又はプラークサイズ及び頻度基準(frequency criteria)に基づいて、主要な変異型を同定することができる。
【００４５】
本発明の選択手法は、プロテインＬ、プロテインＡ又は任意のリガンドを伴う結合工程の選択システムにおける任意選択の包含を有するｓｃＦｖ及びＦａｂ等の安定性があり、且つ十分フォールディングした抗体フラグメント、並びに安定性のある非抗体スカフォールド及びこれらの突然変異型の同定にまで拡大することができる。さらに、ファージプラークサイズとＶＨ発現収率との間に見られる相関関係は、本発明の手法を利用しなければ変異型のファージディスプレイライブラリから不完全であるか、又は不十分な発現を有するタンパク質の高発現性がある変形を得るために本発明の手法を利用することができることを意味する。ブースト化タンパク質の発現がタンパク質の生産コストを有意に埋め合わせる治療用タンパク質又は高価で不完全な発現性のタンパク質試薬の場合、この適用は特に魅力的である。
五量体の結合分析
ＶＬ及びＶＨの両方が五量体化の影響を受けやすく、五量体化を使用して、親和性の低いＶＬ又はＶＨの単量体を親和性の高いＶＬ又はＶＨの五量体に迅速に変換することができる。このような五量体は貴重な診断用薬剤及び検出用薬剤である。このような用途において、ＶＬ又はＶＨの五量体のその標的との結合は、酵素（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ又はアルカリ性のホスファターゼ）等のレポーター分子又は五量体と結合する蛍光分子で検出することができる。代替的に、五量体の結合は、レポーター分子と結合する二次分子で検出することができる。二次分子は、五量体自体又は６Ｈｉｓタグ若しくはｃ−Ｍｙｃタグ等のタグに特異的であり得る。例えば、一般的な二次分子はイムノグロブリンである。
【００４６】
プロテインＡを有するＶＨとプロテインＬを有するＶＬとの間の相互作用は、これらの標的抗原を有するＶＨとＶＬとの間の相互作用とは基本的に異なっている。ＶＨ又はＶＬの抗原結合は、抗体ドメインの結合部位を形成する３個の抗原結合ループを伴う。プロテインＡ結合活性を有するＶＨ及びプロテインＬ結合活性を有するＶＬのプロテインＡ結合は、抗体結合部位とは全体的に異なる抗体ドメイン上に結合部位及び残基を伴う。このように、プロテインＡ結合活性を有するＶＨは、同時にプロテインＡ及びその標的抗原と結合することができ、プロテインＬ結合活性を有するＶＬは、同時にプロテインＬ及びその標的抗原と結合することができる。本発明のＶＨとＶＬはそれぞれ、プロテインＡ及びプロテインＬに対する親和性を有するので、上記の検出用途及び診断用途のための二次分子として、プロテインＡ及びプロテインＬを使用することができる。ヒトＶＨ及びヒトＶＬの五量体は治療のためにも使用することができる。
五量体による病原体検出
ＶＨのプロテインＡ結合活性及びＶＬのプロテインＬ結合活性を使用して、表面上にプロテインＡ及び／又はプロテインＬを有する細菌を検出することができる。プロテインＡは、病原菌である黄色ブドウ球菌の表面上に存在する。このように、本明細書に記載のも
の等のプロテインＡ結合活性を有するＶＨを使用して、黄色ブドウ球菌を検出することができる。同様に、細胞表面上にプロテインＬを有する細菌、特にペプトストレプトコッカス属マグヌス(Peptostreptococcus magnus)等の病原菌の検出のために、プロテインＬ結
合活性を有するＶＬ単量体及びＶＬ五量体を使用することができる。
【００４７】
プロテインＬは、ヒトにおけるＰ．ｍａｇｎｕｓ(Ricci, S. et al., 2001)の発症の毒性因子に関連する。膣炎において、プロテインＬは、架橋表面結合性のＩｇＥによりその効果を発揮すると考えられる。プロテインＬ結合活性を有するＶＬ単量体及び／又はＶＬ五量体がプロテインＬのＩｇＥ架橋作用を阻害する可能性があるので、これらは治療剤として潜在性がある。
【００４８】
プロテインＡは、ヒトにおける黄色ブドウ球菌(Fournier, B. et al., 2004)の発症の
毒性因子に関連する。その毒性は、抗体と結合することを含む宿主成分と相互作用する能力に起因している。プロテインＡ結合活性を有するＶＨ単量体及び／又はＶＨ五量体が宿主成分を有するプロテインＡの相互作用を阻害する可能性があるので、これらは治療剤として潜在性がある。
【実施例】
【００４９】
単量体のヒトＶＨの同定及び配列分析
完全なヒトＶＨライブラリ及びラマ化したヒトＶＨライブラリの構築の間に、単量体のラマ化したＶＨを表示するファージが、凝集傾向のある完全なヒトＶＨを表示するファージよりも細菌層上でより大きいプラークを形成したことを確認した。このように、ヒトＶＨレパートリから珍しく自然発生的な単量体のＶＨを同定する手段として、プラークサイズを使用した（図１）。この目的で、サイズが６×１０８であるヒトＶＨを示すファージライブラリを構築し、寒天プレート上でプラークとして増殖させた。タイタープレート上で、ライブラリは本質的に、幾つかの大きいプラークが散在する小さいプラークから成る。２０個のクローンにおけるＰＣＲによって、小さいプラークがＶＨ表示ファージに対応し、一方で大きいプラークは野性型のファージ（すなわち、ＶＨ配列挿入を欠くファージ）を表すことが示された。ＶＨ表示ファージは、大きいプラーク形態では見出されなかった。このことは、ヒトのレパートリ及び大きいサイズのライブラリにおける単量体のＶＨの不足により予想外のことではなかった。単量体のＶＨの同定を容易にするために、ＶＨ３ファミリー由来のヒトＶＨのサブセットと結合するプロテインＡに対してライブラリをパンニングすることにより、ライブラリを取り扱いが可能な大きさまで縮小し、プラークサイズ形態が大きくなるのを阻害する野性型のファージを取り除くことを決めた。
【００５０】
数回のパンニングの後、ライブラリはファージを生成する大きいプラークに関して富化され、１１０個を超えるこのようなプラークのＰＣＲ及びシークエンシングにより、全てがＶＨオープンリーディングフレームを完成させたことを示した。分析のために選択された大きいプラークのサイズは図１で示す。シークエンシングによって、ＶＨ３ファミリーに属する１５個の異なるＶＨが示され、ＤＰ−３８、ＤＰ−４７、Ｖ３−４９、Ｖ３−５３、ＹＡＣ−５又は８−１Ｂの生殖細胞系Ｖセグメントを利用した（第１表、図２）。ＤＰ−３８及びＤＰ−４７の生殖細胞系配列は、これまではプロテインＡ結合に関係していた。さらに、それらのプロテインＡ結合活性と一致して、全てのＶＨは、５７位でＴｈｒ残基を有していた（図２）。最も頻繁に利用された生殖細胞系Ｖセグメントは、ＶＨの５０％を越えて発生するＤＰ−４７であったが、最も高頻度なクローン（すなわち、ＨＶＨＰ４２８、相対頻度４６％）はＶ３−４９生殖細胞系Ｖセグメントを利用した。ＤＰ−４７生殖細胞系配列を有するＨＶＨＰ４２９は相対頻度が２１％である２番目に豊富なＶＨであった（図２）。ＶＨ ＣＤＲ３の長さは、ＨＶＨＢ８２における４個のアミノ酸からＨＶＨＰ４３０における１６個のアミノ酸の範囲であり、ＨＶＨＰ４３０はＣＤＲ３において一対のＣｙｓ残基を有していた。親の生殖細胞系Ｖセグメント（残基１〜９４）及び
ＦＲ４（残基１０３〜１１３）配列に対するアミノ酸突然変異は全てのＶＨで見られ、ＨＶＨＰ４４（Ｌ５Ｖ及びＱ１０５Ｒ）及びＨＶＨＢ８２（Ｅ１Ｑ及びＬ５Ｑ）に対する２個の突然変異からＨＶＨＰ４２６に対する１６個の突然変異までの範囲であった（第１表）。突然変異はＶセグメントに集中し、１０５位及び１０８位の２個の突然変異のみが１５個のＦＲ４全てで検出された。ＨＶＨＰ４４及びＨＶＨＢ８２は、その両方がＧｌｎの代わりに１０５位で正に荷電したアミノ酸を有するという点で他のＶＨとは異なっていた（第１表、図２）。しかし、ＨＶＨＰ４４において正に荷電したアミノ酸が突然変異によって得られたが、ＨＶＨＢ８２における正に荷電したアミノ酸は生殖細胞系でコードされていた。ＨＶＨＰ４２３及びＨＶＨＰ４４Ｂを除いて、残りのＶＨは鍵となる可溶性位置で生殖細胞系残基を有していた：３７Ｖ／４４Ｇ／４５Ｌ／４７Ｗ又は３７Ｆ／４４Ｇ／４５Ｌ／４７Ｗ（ＨＶＨＰ４２８）、ＨＶＨＰ４２３及びＨＶＨＰ４４ＢはＶ３７Ｆ突然変異を有していた。ＶＨ可溶性に重要であることが示されるか、又は仮定される他の位置での突然変異には、７個のＥ６Ｑ、３個のＳ３５Ｔ／Ｈ、１個のＲ８３Ｇ及び１個のＫ８３Ｒ、１個のＡ８４Ｐ及び１個のＴ８４Ａ及び１個のＭ１０８Ｌが包含されていた。１１個のＥ１Ｑ、８個のＬ５Ｖ／Ｑ及び１個のＶ５Ｑ突然変異を包含した高頻度の突然変異も１位及び５位で観察された。
ヒトＶＨの生物物理学的特徴
ＨＶＨＰ４４Ｂ（ＨＶＨＰ４２３と本質的に同じであった）を除いて、全てのＶＨはｃ−Ｍｙｃ−Ｈｉｓ５タグとの融合における培養液量１Ｌの大腸菌株ＴＧ１で発現し、固定化金属親和性クロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）によって、ペリプラズム抽出物から均一に精製した。発現収率は、振盪フラスコ内で細菌培養液１Ｌ当たりで精製タンパク質１．８〜６２．１ｍｇの範囲であり、ＶＨのほとんどは数ｍｇの収率があった（第２表）。ＨＶＨＰ４２３及びＨＶＨＰ４３０の例において、「明らかに」同じ発現条件下での別の試験によって、６２．１及び２３．７ｍｇに対してそれぞれ、２．４及び６．４ｍｇの収率が得られた。このことは、本明細書中に記載の多くのＶＨに対して、大した努力をせずに最適な発現条件を達成でき、それにより第２表で報告された値より有意に高い発現収率がもたらされることを意味している。予想通り、全てのＶＨは表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析（ＫＤは０．２〜３μＭである）においてプロテインＡと結合していて、範囲及び規模はプロテインＡ結合活性を有するラマＶＨＨ変異型についてこれまでに報告されていた範囲及び規模に匹敵していた。ＶＨはＦａｂ基準面と結合しなかった。
【００５１】
ゲルろ過クロマトグラフィ及びＮＭＲによるオリゴマー化状態に関して、ヒトＶＨの凝集傾向を評価した（第２表）。全てのＶＨをＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ゲルろ過クロマトグラフィにかけた。ラマＶＨＨ（すなわち、Ｈ１１Ｃ７）と同様に、全てのＶＨにおいて、単量体で期待される溶離量で対称な単一のピークが与えられ、凝集体は実質的に全く存在しなかった（図３ＡのＨＶＨＰ４２８における例を参照のこと）。これに対して、一般的なヒトＶＨ（すなわち、ＢＴ３２／Ａ６）はかなりの量の凝集体を形成した。３個のＶＨに関しては、ＶＨ二量体で期待される移動度を有する微小ピークも観察された。微小ピークのＳＰＲ分析によって、二量体のＶＨと一致して、単量体ＶＨに対する値よりも有意に緩やかな解離速度値(off-rate value)が与えられた。二量体のピークは、ラマＶＨＨ（Ｈ１１Ｃ７）の場合にも観察された。高濃度のＶＨのフォールディング状態及びオリゴマー化状態をさらにＮＭＲ分析で研究した。表ＩＩに示すように、全てのＶＨタンパク質の研究によって、比較的可溶性であると考えられ、十分にフォールディングされた三次元構造が推測された。ＶＨフラグメントの一次元ＮＭＲスペクトル（図３Ｂ）によって、ＶＨドメインの構造フォールディング特徴が示された。ＨＶＨＰ４１４フラグメント及びＨＶＨＰ４１４の２個のイソ型（ｃ−Ｍｙｃ配列を有する及び有さないＶＨ１４及びＶＨ１４−ｃＭｙｃ−）に対するＰＦＧ−ＮＭＲ拡散実験の使用によっても、タンパク質の凝集状態を評価した。ＶＨ１４は、ｃ−Ｍｙｃ Ｎ１３２Ｅ突然変異を有し、且つさらにＮ末端にメチオニン残基を有するＨＶＨＰ４１４の改変バージョンである。簡単に述べると、ＰＦＧ−ＮＭＲデータ（示されず）によって、全てのタンパク質サンプルが、ＮＭＲ実験に使用
した比較的高いタンパク質濃度であっても予想される単量体の分子量を有することが示された。
【００５２】
一貫して３７℃でのトリプシンに対する耐性に関して、ＶＨの安定性をさらに研究し、その後３７℃で長期的にインキュベートを行った。トリプシンは、Ｃ末端のＡｒｇ又はＬｙｓ残基でポリペプチドのアミド骨格を切断する。ヒトＶＨにおいて９〜１３個のＡｒｇ及びＬｙｓ残基が存在する（図２）。トリプシンによる消化の影響を受けやすいＣ末端のｃ−ＭｙｃタグにおいてさらなるＬｙｓ残基も存在する。図４ａは、トリプシン消化の間のＨＶＨＰ４１４のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。１時間以内に、元のバンドは、ｃ−Ｍｙｃ−Ｈｉｓ５タグを有しないＶＨで期待される移動度があった単一の生成物に完全に変換された。トリプシンによる１時間のインキュベート後に１２個の他のＶＨにおいて、同じ結果が得られた。トリプシン処理したＶＨのランダムに選択されたサンプル（すなわち、ＨＶＨＰ４１４、ＨＶＨＰ４１９、ＨＶＨＰ４２０、ＨＶＨＰ４２３、ＨＶＨＰ４２９、ＨＶＨＰ４３０及びＨＶＨＭ８１）における質量分析によって、それぞれの場合に、消化した生成物の分子質量がＣ末端残基としてのｃ−Ｍｙｃ Ｌｙｓを有するＶＨに対応していたことが確認された。ＨＶＨＭ４１において、消化時の残りよりも有意に短いフラグメントが与えられ、この場合質量分析実験によって、ＣＤＲ３におけるＡｒｇ９９に対する切断部位がマッピングされた（データ図示せず）。
【００５３】
０．３２ｍｇ／ｍｌ（ＨＶＨＰ４２８）〜３．２ｍｇ／ｍｌ（ＨＶＨＰ４２０）の濃度に及ぶ１１個のＶＨを３７℃で１７日間インキュベートした。その後、オリゴマー化状態及びプロテインＡ結合に関して、これらの安定性を決定した。ゲルろ過クロマトグラフィによって示されるように、３７℃でのＶＨの処理は凝集体形成を全く誘導しなかった：全てのＶＨは、未処理のＶＨのものと実質的に同一であったクロマトグラムプロファイルを与え、本質的に単量体として存在していた（ＨＶＨＰ４２０についての例、図４ｃを参照のこと）。ＶＨが３７℃での処理後の自然のフォールディングを維持したことを確実するために、２個のＶＨ（すなわち、ＨＶＨＰ４１４（１．２ｍｇ／ｍｌ）及びＨＶＨＰ４２０（３．２ｍｇ／ｍｌ））をランダムに選択し、ＳＰＲによってプロテインＡと結合するこれらのＫＤを求め（ＨＶＨＰ４２０に関して示されるデータ、図４ｃの挿入図）、未処理のＶＨに対して得られたＫＤと比較した（第２表）。熱処理したＶＨに関して算出したＫＤは１．４μＭであり、ＨＶＨＰ４１４及びＨＶＨＰ４２０に関して算出したＫＤはそれぞれ１．０μＭであった。これらの値は未処理のＶＨの対応する値と本質的に同一であり（第２表）、このことはＶＨの３７℃での処理がこれらの天然フォールディング(native fold)に影響を与えなかったことを示している。ＶＨが３７℃のインキュベート期間で
余り小さくなく、且つ非天然であり、ゲルろ過実験及びＳＰＲ実験の間室温まで戻した時にこれらの天然のフォールディングを再開する可能性は、十分にフォールディングした天然のタンパク質に一般的に関連する特性であるＶＨが３７℃でトリプシンに対して耐性があった（上記を参照のこと）という事実を鑑みて疑わしい。
【００５４】
天然のＶＨ（ＫＤｎ）及び熱処理して、リフォールディングしたＶＨ（ＫＤｒｅｆ）のプロテインＡとの結合のＫＤを比較することによって、ヒトＶＨのリフォールディング効率（ＲＥ）を研究した(Tanha, J. et al., 2002)。ＶＨ分画が熱処理によって不活性化される場合、このパラメータはフォールディングした、すなわち活性のある抗体フラグメントの濃度に基づいているので、測定ＫＤは高くなる。このように、ＫＤｎとＫＤｒｅｆとの比によって、ＶＨＲＥの測定値が与えられる。図５は、幾つかの選択されたＶＨ濃度での天然状態（太線）及びリフォールディング状態（細線）における固定化されたプロテインＡとのＨＶＨＰ４２３の結合に対するセンサーグラムを比較している。示され得るように、リフォールディングしたＶＨのプロテインＡとの結合は全ての例でより小さく、これにより非フォールディングは完全に可逆ではないことが示される。１４個のＶＨそれぞれにおいて、天然状態及びリフォールディング状態におけるプロテインＡの結合を幾つかの
濃度で測定し、ＫＤ及びその後のＲＥを求めた（第２表、ＫＤｒｅｆ値は示されていない）。２個の抗イディオタイプのラマＶＨＨ（Ｈ１１Ｆ９及びＨ１１Ｂ２）のＫＤ及びＲＥも求め、これらは参照として使用された。４個のＶＨは、Ｈ１１Ｆ９及びＨ１１Ｂ２のそれぞれの、９５％及び１００％のＲＥと同程度の９２％〜９５％の範囲のＲＥであった。別の５個のＶＨは、８４％〜８８％の範囲のＲＥであり、３個は７０％を超えていた。２個のＶＨだけが有意に低いＲＥであった：ＨＶＨＰ４１３（５２％）及びＨＶＨＰ４２１（１４％）。これまでに調べられた幾つかの公開されたＶＨＨは約５０％のＲＥであった(van der Linden, R. H. et al., 1999)。
ヒトＶＨファージディスプレイライブラリ構築及びパンニング
ランダムヘキサヌクレオチドプライマー及びＦｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ（商標）キット(GE Healthcare, Baie d'Urfe, QC, Canada)を使用して、ヒト脾臓ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。鋳型としてｃＤＮＡを使用して、ＶＨフレームワーク領域１（ＦＲ１）に特異的なプライマー及びイムノグロブリンＭ特異的なプライマー(de Haard, H. J. et al., 1999)を使用した９個の別々の反応におけるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、ＣＨ配列をフランキングしたＶＨ遺伝子を増幅した。生成物をゲル精製し、２回目のＰＣＲにおける鋳型として使用することにより、クローニング目的のためにフランキングしたＡｐａｌ Ｉ及びＮｏｔ Ｉ制限部位も導入したＦＲ１特異的なプライマー及びＦＲ４特異的なプライマー(de Haard, H. J. et al., 1999)を使用して、ＶＨ遺伝子を構築した。得られたＶＨレパートリＤＮＡをｆｄ−ｔｅｔＧＩＩＩＤファージベクターにクローニングし、ＶＨファージディスプレイライブラリを構築した(Tanha, J. et al., 2001)。プロテインＡに対するパンニング(Amersham Biosciences Inc.)を記載のように行
った(Tanha, J. et al., 2001)。ＤＮＡＰＬＯＴソフトウェアバージョン２．０．１及びＶ ＢＡＳＥバージョン１．０(http://vbase.dnaplot.de/cgi-bin/vbase/vsearch.pl)を使用して、選択されたＶＨの生殖細胞系配列帰属を行った。記載のようにＨ１１ ｓｃＦｖに対してパンニングすることによって、ラマＶＨＨファージディスプレイライブラリからラマＶＨＨ Ｈ１１Ｃ７、Ｈ１１Ｆ９及びＨ１１Ｂ２を単離した(Tanha, J. et al., 2002)。
ＶＨの発現及び精製
標準的なクローニング技法により、ＶＨをｐＳＪＦ２発現ベクターにクローニングした(Sambrook, J. Fritsch E. F. and Maniatis T, 1989)。ｓｄＡｂのペリプラズム発現及
びその後の固定化金属親和性クロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）による精製を記載のように行った(Muruganandam, A. et al., 2002)。それぞれのタンパク質において算出したモル吸
収係数を使用したＡ２８０測定によって、タンパク質濃度を測定した(Pace, C. N. et al., 1995)。記載のように、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５カラム(GE Healthcare)において、精製
したＶＨのゲルろ過クロマトグラフィを行った(Deng, S. J. et al., 1995)。
結合及びリフォールディング効率の実験
ＶＨ／ＶＨＨの平衡解離定数（ＫＤ）及びリフォールディング効率（ＲＥ）は、ＢＩＡＣＯＲＥ３０００バイオセンサーシステム(Biacore Inc., Piscataway, NJ)で回収した表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）データから得られた。プロテインＡとのＶＨの結合を測定するために、プロテインＡの２０００個の共鳴単位（ＲＵ）又は基準となる抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）を研究等級のＣＭ５センサーチップ(Biacore Inc.)上で固定化した。製造業者によって提供されるアミンカップリングキットを使用して、１０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）中の２５μｇ／ｍｌ（プロテインＡ）又は５０μｇ／ｍｌ（Ｆａｂ）の濃度で固定化を行った。抗イディオタイプのラマＶＨＨのＨ１１ｓｃＦｖとの結合を測定するために、上記のように、５０μｇ／ｍｌのＨ１１ ｓｃＦｖ ４１００ＲＵ又は１０μｇ／ｍｌのＳｅ１５５−４ ＩｇＧ基準 ３０００ＲＵを固定化した。全ての例において、流量４０μｌ／分で、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ及び０．００５％のＰ２０を含む１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）中、２５℃で分析を行い、表面を洗浄緩衝液で洗浄することにより再生させた。リフォールディングタンパク質の結合活性を測定するために、１０μｇ／ｍｌの濃度、８５℃で２０分間インキュベートするこ
とによって、ＶＨ又はＶＨＨを変性させた。それから、リフォールディングするためにタンパク質サンプルを３０分間室温まで冷却し、その後室温で５分間１４０００ｒｐｍでマイクロフュージで遠心分離して、任意のタンパク質沈殿物を除去した。上清を回収し、上記のようにＳＰＲによって結合活性について分析した。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ４．１ソフトウェア(Biacore Inc.)を同時に使用して、フォールディングしたタンパク質及びリフォールディングタンパク質両方に関するデータを１：１の相互作用モデルに適合させ、その後ＫＤを求めた。ＲＥは、
【００５５】
【化１】
【００５６】
（式中、ＫＤｎは天然タンパク質のＫＤであり、ＫＤｒｅｆはリフォールディングタンパク質のＫＤである）から求めた。
トリプシン消化実験
１ｍＭのＨＣｌ中の新たに調製した０．１μｇ／μｌのシークエンシング等級のトリプシン(Hoffmann-La Roche Ltd., Mississauga, ON, Canada)３μｌを１００ｍＭのＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．８）中のＶＨ６０μｇに加えた。３７℃で１時間、全量６０μｌで消化反応を行い、０．１μｇ／μｌのトリプシン阻害剤(Sigma, Oakville, ON, Canada)５μｌを加えることにより停止させた。消化の完了後、５μｌを取り除き、ＳＤＳ
−ＰＡＧＥで分析して、ＺｉｐＴｉｐＣ４(Millipore, Nepean, ON, Canada)を使用して
残りを脱塩し、５０：５０のメタノール：水の１％酢酸で溶離して、ＭＡＬＤＩ質量分析によってＶＨの質量を求めた。
３７℃でのタンパク質安定性研究
３７℃で１７日間ＰＢＳ緩衝液において０．３２〜３．２ｍｇ／ｍｌの濃度での単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）をインキュベートした。インキュベートの後、視覚的に凝集体の形成が全く見られなくても、５分間最大速度でミクロフュージにおいてタンパク質サンプルを沈降させた。それから、サンプルをＳｕｐｅｒｄｅｘ７５サイズ排除カラム(GE Healthcare)に適用させ、プロテインＡに対するＳＰＲ分析における単量体のピークを回収し
た。プロテインＡ５００ＲＵ又は基準Ｆａｂを固定化したこと、及び５０μｇ／ｍｌの濃度で固定化を行ったことを除いて、上記のようにＳＰＲ分析を行った。
ＮＭＲ実験
ＮＭＲ分析におけるＶＨサンプルを１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ及び０．０２％のＮａＮ３（ｐＨ７．０）中に溶解した。タンパク質濃度は４０μＭ〜１．０ｍＭであった。全てのＮＭＲ実験は、Ｂｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ−８００ＮＭＲスペクトロメータ又はＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ−５００ＮＭＲスペクトロメータにおいて２９８Ｋで行った。一次元（１Ｄ）１Ｈ ＮＭＲスペクトルを１６３８４個のデータ点で記録し、スペクトル幅はそれぞれ、５００ＭＨｚで８９９２．８１Ｈｚ及び８００ＭＨｚで１７６０５．６３Ｈｚであった。２０４８×４００のデータ点の二次元１Ｈ−１Ｈ ＮＯＥＳＹスペクトルがスペクトル幅１１９９０．０４Ｈｚ及び混合時間１２０ｍｓのＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ−８００ＮＭＲスペクトロメータにおいて得られた。全てのＮＭＲ実験において、３−９−１９パルス列によって行われたＷＡＴＥＲＧＡＴＥ法(Piotto, M. et al., 1992; Sklenar, V. et al., 1993)を使用して
水抑制を達成した。ＮＭＲデータを処理し、Ｂｒｕｋｅｒ ＸＷＩＮＮＭＲソフトウェアパッケージを使用して分析した。３軸勾配がある三重共鳴プローブを備えるＢｒｕｋｅｒ
Ａｖａｎｃｅ−５００ ＮＭＲスペクトルメータで水抑制ＬＥＤ配列(Altieri, A. S. et al., 1995)によって、全てのＰＦＧ−ＮＭＲ拡散測定を行った。一次元プロトンスペ
クトルを処理し、Ｂｒｕｋｅｒ Ｘｗｉｎｎｍｒソフトウェアパッケージを使用して分析
した。全ての所与のＰＦＧ強度で均一に全てのＮＭＲシグナルが弱まった場合に、メチル及びメチレンプロトン領域（２．３ｐｐｍ〜−０．３ｐｐｍ）におけるＮＭＲスペクトルを統合することにより、ＮＭＲシグナル強度を得た。
ヒトＶＬファージディスプレイライブラリ構築及びパンニング
ヒトＶＨに関して上記のように、ｃＤＮＡをヒト脾臓ｍＲＮＡから合成した。ｃＤＮＡをＰＣＲの鋳型として使用し、６個のＶκバックプライマー、１１個のＶλバックプライマー(de Haard, H. J. et al., 1999)、４個のＶκフォワードプライマー及び２個のＶλフォワードプライマー(Sblattero, D. et al., 1998)を使用して、反応体積５０μｌでＶＬ遺伝子を増幅させた。バックプライマー及びフォワードプライマーを修飾して、その後のクローニング目的のためにそれぞれ、Ａｐａ ＬＩ制限部位及びＮｏｔ Ｉ制限部位をフランキングさせた。これらの縮重の程度に反映された比で共にフォワードプライマーがプールされた。プールされたＶλフォワードプライマー及び１１個の個々のＶλバックプライマーを使用して、１１個の別々の反応でＶλ遺伝子をＰＣＲした。同様に、プールされたＶκフォワードプライマー及び６個の個々のＶλバックプライマーを使用して、６個の別々の反応でＶλ遺伝子を増幅させた。ＰＣＲ生成物をプールし、ゲル精製して、Ａｐａ ＬＩ制限エンドヌクレアーゼ及びＮｏｔ Ｉ制限エンドヌクレアーゼで消化した。ヒトＶＨに関して上記のように、ライブラリを構築した。個々のライブラリコロニーにおいてプラークＰＣＲを行い、増幅したＶＬ遺伝子を記載のようにシークエンシングした(Tanha, J. et al., 2003)。ヒトＶＨライブラリに関して上記のように、プロテインＬ(Biolynx Inc., Brockville, ON, Canada)に対するパンニング及び選択されたＶＬの生殖細胞系の配列帰属を行った。
ＶＬの発現及び精製
「ＶＨの発現及び精製」においてＶＨに関して上記のように、ＶＬの発現、精製、濃度決定及びゲルろ過クロマトグラフィを行った。
ＶＬ及びＶＨ五量体の発現及び精製
標準的なＰＣＲにおいて特異的なプライマーを使用して、ＨＶＨＰ３２８ ＶＨ及びＨＶＬＰ３３５ ＶＬ遺伝子を増幅させた。標準的なクローニング技法を使用して、発現ベクターにおいてＶＴ１Ｂ五量体化ドメイン遺伝子と融合して、ＨＶＨＰ３２８及びＨＶＬＰ３３５遺伝子をクローニングして、ＨＶＨＰ３２８ＰＶＴ２及びＨＶＬＰ３３５ＰＴＶ２五量体を得た(Zhang, J. et al. 2004)。五量体を記載のように発現及び精製した(Zhang, J. et al., 2004)。上記のようにタンパク質濃度を決定した。
ＶＬの表面プラズモン共鳴
ＢＩＡＣＯＲＥ３０００バイオセンサーシステム(Biacore, Inc., Piscataway, NJ)を
使用したＳＰＲによって、ＶＬのプロテインＬとの相互作用に対する結合反応速度を測定した。プロテインＬ６８０ＲＵ又は基準Ｆａｂ ８７０ＲＵを研究等級のＣＭ５センサーチップ(Biacore)上で固定化させた。製造業者によって供給されたアミンカップリングキ
ットを使用して、１０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）において５０μｇ／ｍｌのタンパク質濃度で固定化を行った。５０μｌ／分又は１００μｌ／分の流量で１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ及び０．００５％のＰ２０を含む１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中、２５℃で全ての測定を行った。洗浄緩衝液で洗浄することにより表面を再生した。ＢｌＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ４．１ソフトウェア(Biacore, Inc.)を使用して
、データを評価した。
五量体ＶＬ及びＶＨの表面プラズモン共鳴
ＳＰＲによって、ＨＶＨＰ３２８ＰＶＴ２のプロテインＡとの相互作用及びＨＶＬＰ３３５ＰＴＶ２のプロテインＬとの相互作用に対する結合反応速度を決定した。５２０ＲＵのプロテインＡ又は基準Ｆａｂを上記のように固定化した。ＶＬ五量体に関して、上記のように調製した同様の表面を使用した。上記のように測定を行ったが、流量は２０μｌ／分であった。３秒間、５０ｍＭのＨＣｌで洗浄することによって、表面を再生した。単量体に関して記載のようにデータを評価した。
細胞の微小凝集
ＢＨＩプレート由来の黄色ブドウ球菌の単一コロニーを使用して、ＢＨＩ培地１５ｍＬを接種した。細菌を３７℃、２００ｒｐｍで一晩成長させた。翌朝、培養液を回転バケット、Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＴ６０００Ｂ冷凍遠心器において４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し（spun down）、上清を除去して、細胞ペレットをＰＢＳ緩衝液で再懸濁させた。
細胞を再び遠心分離し、上清を除去して、細胞ペレットを再びＰＢＳ緩衝液で再懸濁させた。細胞をＡ６００が１．０になるまで希釈し、段階希釈した細胞を３７℃のＢＨＩプレート上に広げて、一晩成長させた。翌朝、細胞力価を測定した。Ａ６００ １．０が１．５×１０９細胞／ｍｌに対応する。同一の工程を行い、成長培地が２ｘＹＴであったことを除いて、その後の微小凝集アッセイのために大腸菌株ＴＧ１細胞を調製した。生菌数は同様であった、Ａ６００ １．０＝２．１×１０９細胞／ｍｌ。
【００５７】
微小凝集アッセイを行うために、マイクロタイタープレートにおけるウェル１〜ウェル１１でＰＢＳにおいてＨＶＨＰ３２８ＰＶＴ２の２倍希釈を行った。ウェル１２（ブランク）はＰＢＳのみを含んでいた。それぞれのウェルの全量は５０μｌであった。その後、ＰＢＳ５０μｌにおける１×１０８個の黄色ブドウ球菌細胞を全てのウェルに加えて、プレートを４℃で一晩インキュベートした。結果を永続的に記録するために、翌朝にプレートの写真を撮った。五量体の対照実験のために、ＨＶＨＰ３２８ＰＶＴ２をＶＬ五量体、ＨＶＬＰ３３５ＰＴＶ２に置き換えた。細胞の対照実験において、同じ２個の組の実験を大腸菌ＴＧ１細胞で繰り返した。
単量体のヒトＶＬの同定及び配列分析
ヒトＶＨファージディスプレイライブラリから可溶性のＶＨを単離するために用いられた本質的に同じ選択方法を、可溶性で単量体のＶＬを単離するためにヒトＶＬライブラリに適用した。大きさが３×１０６であるヒトＶＬライブラリを構築した。ライブラリタイタープレートから２４個のプラークを選別し、これらのＶＬ遺伝子をＰＣＲ及びシークエンシングした。配列は、生殖細胞系起源に関して異なるが、ＶＬの７５％はＶλ起源であった（データ図示せず）。プロテインＬに対する３回のパンニングによって、大きいプラークにおける富化がもたらされた。３９個の大きいプラークをシークエンシングして、３２個の特殊な配列を同定した（図６）。ＨＶＬＰ３２５、ＨＶＬＰ３３５及びＨＶＬＰ３５１はそれぞれ、３、４及び２の頻度で起こった。λクラス（サブグループＶλ１、生殖細胞系１ｂ）であるＨＶＬＰ３８９を除いて、残りの３１個のＶＬはＶκクラスに属していた。３１個のκＶＬの中で、２４個はＶκＩＩＩサブグループに含まれ、７個はＶκ１サブグループに含まれていた。２４個のＶκＩＩＩ配列の１６個は、残りの利用されるＡ２７、Ｌ２及びＬ６生殖細胞系配列を有するＬ６生殖細胞系配列を利用する。Ｖκ１サブグループのＶＬはＯ２／Ｏ１２又はＡ３０生殖細胞系配列に由来する。顕著な突然変異は９６位で起こった。この位置での生殖細胞系アミノ酸は芳香族及び疎水性アミノ酸、κＶＬに対するＴｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ又はＩｌｅ、及びλＶＬに対するＴｙｒ、Ｖａｌ又はＡｌａである。しかし、κＶＬの選択プールにおける３１個の中の５個だけが９６位でこれらの生殖細胞系アミノ酸を有している：ＨＶＬＰ３２５、ＨＶＬＰ３４９、ＨＶＬＰ３８８、ＨＶＬＰ３１０９及びＨＶＬＰ３９３。９６位での２１個のアミノ酸を帯電させ、この中の２０個が正に帯電する：Ａｒｇ、Ｌｙｓ又はＨｉｓ。２個のアミノ酸はＰｒｏ、１個はＧｌｎ、１個はＳｅｒ、及び１個はＴｈｒである。単量体化のためにゲルろ過クロマトグラフィで分析された７個のκＶＬの中で９６位がＡｒｇ又はＬｙｓである６個が単量体であった一方で、９６位が生殖細胞系アミノ酸ＬｅｕであるＨＶＬＰ３２５が凝集体を形成した（以下を参照のこと）。同様に、λクラスであり、且つＳｅｒに対する生殖細胞系突然変異を有していたＨＶＬＰ３８９も単量体であった（以下を参照のこと）。これらのデータは単量体化等のＶＬの生物物理学的特性が改良された９６位での生殖細胞系アミノ酸からの偏差に相関がある（３２個の中の２７個）。
【００５８】
κクラスの１８個のＶＬは、λＶＬでのみ見出されるアミノ酸Ｔｈｒ、Ｖａｌ及びＬｅｕに置き換えられたこれらの最後の３残基（１０５〜１０７）を有していた。これらの置
換はκＶＬの生物物理学的特性を改良する役割を果たしている可能性があり、これにより１０５〜１０７位の元のκ残基を有する親クローンを超えた上記のＶＬの選択がもたらされる。
ヒトＶＬの特徴付け
異なるＶ生殖細胞系起源を有する選択ＶＬの中の８個は、培養液１Ｌ中の大腸菌で発現し、精製された：ＨＶＬＰ３２４、ＨＶＬＰ３２５、ＨＶＬＰ３３５、ＨＶＬＰ３４２、ＨＶＬＰ３５１、ＨＶＬＰ３６４、ＨＶＬＰ３８９及びＨＶＬＰ３１０３（第６表）。全てがＨＶＬＰ３２４に対する６．２ｍｇからＨＶＬＰ３３５及びＨＶＬＰ３６４に対する約７５ｍｇまでに及ぶ良好な収率で発現した。
【００５９】
ゲルろ過クロマトグラフィによるこれらのオリゴマー化状態に関するヒトＶＬの凝集傾向を評価した。ＶＬを０．６ｍｇ／ｍｌの濃度でＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ゲルろ過クロマトグラフィにかけた。ＨＶＬＰ３２５を除いた全てが凝集体を本質的に含んでおらず、平均見掛けの分子質量が１２．７ｋＤａ（範囲、６．２〜１９．２ｋＤａ）である対称の単一ピークを得た（図７Ａ及び第３表）。これは単量体のＶＬに関する期待分子質量（１３．４〜１３．８ｋＤａ）と一致している。単一ドメインの抗体に関する見掛けの分子質量の変動はこれまでに報告されている(Jespers, L. et al., 2004a; Stevens, F. J. et al.,
1980)。ＨＶＬＰ３２５に関して、凝集体が全タンパク質（凝集体＋単量体）の１１％を構成していた。ＨＶＬＰ３５１、ＨＶＬＰ３４２、ＨＶＬＰ３３５及びＨＶＬＰ３１０３は、これらの利用可能な最も高い濃度、すなわちそれぞれ、０．８９ｍｇ／ｍｌ、１．０ｍｇ／ｍｌ、４．９ｍｇ／ｍｌ及び５．９ｍｇ／ｍｌで試験した場合、依然として単量体であった（図７Ｂ）。
【００６０】
ＢＩＡＣＯＲＥ分析前に、ＶＬをＳｕｐｅｒｄｅｘ−７５クロマトグラフィにかけて、物質の凝集に何ら確証がなかったとしても精製した単量体のピークを回収した。ＳＰＲ分析において、全ての選択されたＶＬは、プロテインＬと結合した（図８）。ＶＬがプロテインＬに対するパンニングによって単離されたので、このことは予想外のことではなかった。全てに関して、プロテインＬとの結合のＫＤは、０．６〜３μＭであった（第３表）。ＨＶＬＰ３２４及びＨＶＬＰ３４２はＫＤがそれぞれさらに１０ｎＭ及び４０ｎＭ小さかった。ＶκＩサブグループのＶＬのプロテインＬとの低い親和性及び高い親和性の結合が、これまでに報告されている（参考文献）。ＨＶＬＰ３２４及びＨＶＬＰ３４２の両方がＶκＩサブグループに属している（第３表）。予想通りに、速度論データ及び平衡データは、実際に単量体である単量体ピークと一致していた。
五量体の結合分析
表面プラズモン共鳴によって、ＨＶＨＰ３２８ＰＶＴ２五量体のプロテインＡとの結合及びＨＶＬＰ３３５ＰＴＶ２五量体のプロテインＬとの結合を測定した（図９）。会合速度をｋｏｂｓ対濃度のプロットから独立して算出した。五量体の集合の間の多価結合における不均一性によって、１を超えた解離速度（ｋｄ）を算出することができる。したがって、１を超えた平衡解離定数（ＫＤ）を得ることができる。ＨＶＨＰ３２８ＰＴＶ２及びＨＶＬＰ３３５ＰＴＶ２はそれぞれ、２ｎＭ及び２００ｐＭの最小ＫＤを有していた（第４表）。ｋｄがより遅い場合、ＨＶＨＰ３２８ＰＴＶ２及びＨＶＬＰ３３５ＰＴＶ２はそれぞれ、９００ｐＭ及び９０ｐＭまで低いＫＤを有していた。
ＶＬ及びＶＨによる病原菌検出
ＶＨのプロテインＡ結合活性及びＶＬのプロテインＬ結合活性を使用して、これらの表面上にプロテインＡ及び／又はプロテインＬを有する細菌を検出することができる。本明細書中のＶＨ及びＶＬ等のＶＨ及びＶＬが可溶性であり、且つ単量体である（凝集傾向が失われている）場合、このことは可能である。ラクダ科の重鎖抗体又はナースシャーク及びテンジクザメのＩｇＮＡＲ等の軽鎖が欠失した抗体由来の可変ドメインは、自然発生的に可溶性且つ単量体である。このことから、プロテインＡ結合活性及びプロテインＬ結合活性を有するものを使用して、これらの表面上にプロテインＡ及び／又はプロテインＬを
有する細菌を検出することもできる。プロテインＡは、病原菌である黄色ブドウ球菌の表面上に存在する。このように、本明細書中に記載のもの等のプロテインＡ結合活性のあるＶＨを使用して、黄色ブドウ球菌を検出することができる。本発明者らは微小凝集アッセイを行い、ＨＶＨＰ３２８ＰＶＴ２ ＶＨ五量体の黄色ブドウ球菌と結合する能力を検出した。マイクロタイターウェル（ウェル１〜ウェル１１）において２倍希釈したＨＶＨＰ３２８ＰＶＴ２で一定数の細菌細胞をインキュベートした（図１０）。ウェル１２は五量体の代わりに緩衝液を含んでいた。ＶＨが細菌細胞と結合する場合、したがってその多量体の性質により、五量体は細胞を架橋し、その結果、細胞凝集をもたらすことが可能であるはずである。凝集細胞がマイクロタイターウェルにおける拡散細胞として現れる（図１０）。何の結合もなければ、凝集は起こるはずがなく、したがって凝集体は存在せず、細胞はウェルの底部に点として現れる。図１０で示されるように、細胞の凝集体が存在するので、五量体は黄色ブドウ球菌と結合する。凝集体は最大ウェル７まで観察される。ウェル７より先は、五量体の濃度が結合するには低すぎるので、凝集体は存在しない。対照のＶＬ五量体は、全く凝集を示さず、これによりＶＨ五量体の黄色ブドウ球菌に対する特異性が実証される（図１０）。予想通りＶＨ五量体が大腸菌（ＴＧ１株）又はサルモネラ細胞を凝集させないので、結合は細胞特異的でもある（データは示さず）。同様に、これらの細胞表面上にプロテインＬを有する細菌、特にペプトストレプトコッカス属マグヌス等の病原菌の検出にプロテインＬ結合活性を有するＶＬ単量体及びＶＬ五量体を使用することができる。
【００６１】
上記で記載の実施例は、本発明の実際の範囲を限定する役割を果たすものでは決してなく、むしろ例示目的のために表されていることが理解される。
参考文献リスト
【００６２】
【表１】
【００６３】
【表２】
【００６４】
【表３】
【００６５】
【表４】
【００６６】
【表５】
【００６７】
【表６】
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】選択された実施例の結果（可溶性ＶＨ（ＨＶＨＰ４２８）を示すファージと不溶性ＶＨ（ＢＴ３２／Ａ６）を示すファージとの間のプラークサイズの対比）の図的記述を示す。この写真はプラークの可視化を高めるために拡大した細菌層の寒天プレートの一部を示す。プレートは、それぞれ同じ数の２個のプラーク型を含んでいたが、この写真は基本的に大きいＨＶＨＰ４２８プラークを含んでいる。ＢＴ３２／Ａ６プラークの大多数は小さすぎて写真において鮮明ではっきりした画像を得ることができなかった。矢印で示されたプラークは、この画像で可視化させるのに十分大きかった小さい割合のＢＴ３２／Ａ６ファージを示している。アスタリスクは、ＨＶＨＰ４２８ファージの代表的なプラークサイズを示す。プラークの同一性は、ＤＮＡシークエンシングによって決定された。
【図２】プロテインＡに対する親和性及びプラークサイズに基づき選択されたヒトＶＨのアミノ酸配列。入力配列(sequence entries)の点は、ＨＶＨＰ２Ｍ１０又はＨＶＨＰ４４とアミノ酸が同一であることを示す。ダッシュ記号は配列アラインメントのために含まれている。鍵となる可溶性部分の残基及びプロテインＡ結合特性を有するＶＨ／ＶＨＨに関連する５７Ｔ残基は太字である。カバットナンバリングシステムを使用する。「頻度」の値の総計は１１４である。ＣＤＲは相補性決定領域であり、ＦＲはフレームワーク領域であり、ｇｌｎ ｓｅｑは生殖細胞系の配列である。
【図３Ａ】ヒトＶＨの凝集傾向。ゲルろ過クロマトグラムによって、この研究で単離したヒトＶＨ（ＨＶＨＰ４２８）のオリゴマー化状態をラマＶＨＨ（Ｈ１１Ｃ７）及び典型的なヒトＶＨ（ＢＴ３２／Ａ６）のものと比較する。それぞれのクロマトグラムの最後に溶離したピークは単量体のＶＨに対応する。二量体のＨ１１Ｃ７のピークは矢印によって示される。
【図３Ｂ】（ｉ）８００ＭＨｚでのＨＶＨＰ４１４、（ｉｉ）５００ＭＨｚのＨＶＨＰ４２３、及び８００ＭＨｚのＨＶＨＰ４２８の一次元の１Ｈ ＮＭＲスペクトル。左側のパネルのスペクトルは、低強度のシグナルのより良好な視覚化を可能にするように２倍に拡大されている。
【図４Ａ】３７℃でのトリプシンに対する耐性及び３７℃での長期のインキュベート後の完全性に関するヒトＶＨの安定性。２１ｋＤａのマーカーに対して未処理のＨＶＨＰ４１４ＶＨと１５、３０及び６０分でトリプシン処理したＨＶＨＰ４１４ＶＨとの移動度を比較するＳＤＳ−ＰＡＧＥ。ＨＶＨＰ４１４−ｃＭｙｃは、ｃ−Ｍｙｃを欠失したＨＶＨＰ４１４ＶＨを示す。
【図４Ｂ】３７℃でのトリプシンに対する耐性及び３７℃での長期のインキュベート後の完全性に関するヒトＶＨの安定性。未処理のＨＶＨＰ４１４ＶＨ及びトリプシン処理（６０分）ＨＶＨＰ４１４ＶＨの質量分析法によって得られた分子質量プロファイル。処理済ＶＨの質量分析プロファイルを未処理のＶＨのものの上に重ねて、より良好な視覚的比較を行う。未処理のＶＨの実験の分子質量は、１４９６７．６Ｄａであり、これは期待分子質量１４９６７．７Ｄａとほぼ同一である。トリプシン処理したＶＨで観察された分子質量（１３３６８．５Ｄａ）は、ｃ−ＭｙｃタグにおけるＫ（Ｌｙｓ）での切断によるＣ末端での１３アミノ酸の欠失を示し、期待分子質量１３３６８．０Ｄａを与える。トリプシン切断部位は、ＨＶＨＰ４１４のアミノ酸配列上の垂直な矢印によって示される。
【図４Ｃ】３７℃でのトリプシンに対する耐性及び３７℃での長期のインキュベート後の完全性に関するヒトＶＨの安定性。３７℃で処理したＨＶＨＰ４２０ＶＨのオリゴマー化状態（上方のプロファイル）と未処理のＶＨ（下方のプロファイル）のものとの比較をするゲルろ過クロマトグラム。重ねるとクロマトグラムが区別できないので、このクロマトグラムを垂直に移動させた。それぞれのクロマトグラムの主なピーク及び微小ピークは、それぞれ単量体のＶＨ及び二量体のＶＨに対応する。二量体のＶＨは、全タンパク質の３％を構成する。挿入図は、様々な濃度でのプロテインＡとの３７℃で処理したＨＶＨＰ４２０の結合に関するセンサーグラムオーバーレイを示す。温度安定性試験に使用されるＶＨは、既に４℃で数ヶ月間調製したストック由来であった。
【図５】天然ＨＶＨＰ４２３（太線）及びリフォールディングしたＨＶＨＰ４２３（細線）の７５、１００、１５０及び２００ｎＭの濃度で固定化されたプロテインＡとの結合を示すセンサーグラムオーバーレイ。ＫＤｎ及びＫＤｒｅｆがそれぞれのセンサーグラムから算出され、以下で記載のようにＲＥを求めるのに使用した。
【図６】プロテインＬに対する親和性及びプラークサイズに基づき選択されたヒトＶＬのアミノ酸配列。入力配列における点は、ＨＶＬＰ３３３とアミノ酸が同一であることを示す。ダッシュ記号は配列アラインメントのために含まれる。配列ナンバリング及びＣＤＲ指定に関するＶ ＢＡＳＥ(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/index.php？module＝pagemaster&PAGE_user_op＝view_page&PAGE_id＝7&MMN_position＝5:5)を参照されたい。Ｌ６、Ａ２７、Ｌ２、Ｌ１６、Ｏ２／Ｏ１２、Ａ３０及び１ｂは、Ｖ生殖細胞系設計である。Ｊ生殖細胞系設計は括弧内である。ＮＦは見当たらない。
【図７Ａ】ヒトＶＬドメインのサイズ排除クロマトグラム。ＶＬを０．６ｍｇ／ｍｌの濃度で添加した。「＃」及び「＊」は、それぞれ凝集体及び単量体のピークを示す。凝集体は排除体積で溶出する。
【図７Ｂ】ヒトＶＬドメインのサイズ排除クロマトグラム。ＶＬを利用可能な最も高い濃度（１．０ｍｇ／ｍｌのＨＶＬＰ３４２、５．９ｍｇ／ｍｌのＨＶＬＰ３１０３、４．９ｍｇ／ｍｌのＨＶＬＰ３３５、０．８９ｍｇ／ｍｌのＨＶＬＰ３５１）で適用した。「＃」及び「＊」は、それぞれ凝集体及び単量体のピークを示す。凝集体は排除体積で溶出する。ＨＶＬＰ３４２パネルにおける矢印で示されたピークは、前の測定からのキャリーオーバーである。
【図８】０．２、０．５、０．７５、１、２、３、５及び１０μＭ（ＨＶＬＰ３８９、ＨＶＬＰ３５１及びＨＶＬＰ３６４）；１、２、３、５、７．５及び１０ｎＭ（ＨＶＬＰ３４２）；０．２、０．５、１、２、３、５及び１０μＭ（ＨＶＬＰ３３５）；０．２、０．５、１、１．５、２及び５μＭ（ＨＶＬＰ３２５）；０．２、０．５、０．７５、１、１．５、２、３及び５μＭ（ＨＶＬＰ３１０３）；並びに１、２、３、４、５及び６ｎＭ（ＨＶＬＰ３２４）の濃度で固定化されたプロテインＬとのＶＬの結合を示すセンサーグラムオーバーレイ。プロテインＬの低親和性部位と結合するＨＶＬＰ３２４及びＨＶＬＰ３４２に関するセンサーグラムは含まれないが、算出されたＫＤは第３表に記録される。
【図９Ａ】表面プラズモン共鳴実験におけるプロテインＡとＨＶＨＰ３２８ＰＴＶ２との結合を示す図である。１、２、３、４、６、８及び１０ｎＭの濃度で固定化したプロテインＡとＨＶＨ２８ＰＴＶ２との結合を示すセンサーグラムオーバーレイ。結合データは第４表に記録される。
【図９Ｂ】表面プラズモン共鳴実験におけるプロテインＬとＨＶＬＰ３３５ＰＴＶ２との結合を示す図である。１、２、２．５、３、３．５、４及び４．５ｎＭの濃度で固定化したプロテインＬとＨＶＨ３３５ＰＴＶ２との結合を示すセンサーグラムオーバーレイ。結合データは第４表に記録される。
【図１０】黄色ブドウ球菌による微小凝集実験の結果を示す図である。五量体の濃度は、ウェル１からウェル１１まで２分の１ずつに減少し、ウェル１２は五量体がＰＢＳ緩衝液で置き換えられている。上の行のウェルはＨＶＨＰ３２８ＰＴＶ２五量体を含み、下の行はＨＶＬＰ３３５ＰＴＶ２五量体を含む。ウェル１〜６の五量体の濃度はそれぞれ、２１５、１０８、５４、２７、１３及び７μｇ／ｍｌである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的ポリペプチドを同定する方法であって、
（ａ）様々なポリペプチド配列を発現することができるファージディスプレイライブラリを得ること、
（ｂ）前記ライブラリファージによって、細菌層(bacterial lawn)の感染を可能にすること、
（ｃ）前記細菌層上の平均よりも大きいプラークを形成するファージを同定すること
を含む、標的ポリペプチドを同定する方法。
【請求項２】
前記標的ポリペプチドが可溶性である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的ポリペプチドが単量体である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記標的ポリペプチドが非凝集性である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記標的ポリペプチドが高発現性である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記標的ポリペプチドが安定である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ファージが繊維状ファージである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ファージがＭ１３又はｆｄである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記安定なポリペプチドが比較的高い熱リフォールディング効率を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記安定なポリペプチドが比較的高い融解温度を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記安定なポリペプチドが３７℃での長期のインキュベート後にこれらの機能性を維持する、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
前記安定なポリペプチドが化学変性剤に比較的耐性がある、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
前記安定なポリペプチドがプロテアーゼに比較的耐性がある、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
前記安定なポリペプチドが室温以上で、４℃、又は０℃未満で比較的長期の保存期間を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項１５】
前記安定性のポリペプチドが、細胞内環境において機能的である、請求項６に記載の方法。
【請求項１６】
前記安定なポリペプチドが、ヒト体内に投与される場合に機能的である、請求項６に記載の方法。
【請求項１７】
（ｄ）工程（ｃ）の前記より大きいプラークファージを単離する工程と、
（ｅ）前記より大きいプラークファージにより発現される前記ポリペプチドの配列又は他の特徴を決定する工程と
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記標的ポリペプチドが抗体又は抗体のフラグメントである、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記標的ポリペプチドがヒトＶＨ抗体フラグメント又はヒトＶＬ抗体フラグメントである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記標的ポリペプチドがワクチンである、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記標的ポリペプチドが治療用タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記標的ポリペプチドが、一本鎖Ｔ細胞受容体、Ｔ細胞受容体ドメイン、トランスフェリン、リポカリン、ｋｕｎｉｔｚドメイン、アンキリン反復、及び細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原から成る群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記標的ポリペプチドがタンパク質性の診断用試薬及び生化学試薬である、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
配列番号８〜配列番号５４から成る群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【請求項２５】
請求項２４に記載のアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【請求項２６】
請求項２４又は２５に記載のポリペプチドをコードする核酸配列。
【請求項２７】
請求項２４に記載のアミノ酸配列のＣＤＲ３部分を含むポリペプチド。
【請求項２８】
請求項２７に記載のポリペプチドをコードする核酸配列。
【請求項２９】
請求項２４に記載のアミノ酸配列のＦＲ１部分を含むポリペプチド。
【請求項３０】
請求項２９に記載のポリペプチドをコードする核酸配列。
【請求項３１】
請求項２４に記載のアミノ酸配列のＦＲ２部分を含むポリペプチド。
【請求項３２】
請求項３１に記載のポリペプチドをコードする核酸配列。
【請求項３３】
請求項２４に記載のアミノ酸配列のＦＲ３部分を含むポリペプチド。
【請求項３４】
請求項３３に記載のポリペプチドをコードする核酸配列。
【請求項３５】
請求項２４に記載のアミノ酸配列のＦＲ４部分を含むポリペプチド。
【請求項３６】
請求項３５に記載のポリペプチドをコードする核酸配列。
【請求項３７】
請求項２４に記載のアミノ酸配列のＣＤＲ２部分を含むポリペプチド。
【請求項３８】
請求項３７に記載のポリペプチドをコードする核酸配列。
【請求項３９】
請求項２４に記載のアミノ酸配列のＣＤＲ１部分を含むポリペプチド。
【請求項４０】
請求項３９に記載のポリペプチドをコードする核酸配列。
【請求項４１】
配列番号８〜配列番号２２から成る群より選択される少なくとも１個のアミノ酸配列を含むＶＨ抗体フラグメント。
【請求項４２】
配列番号２３〜配列番号５４から成る群より選択される少なくとも１個のアミノ酸配列を含むＶＬ抗体フラグメント。
【請求項４３】
請求項４１に記載のＶＨ抗体フラグメント又は請求項４２に記載のＶＬ抗体フラグメントをコードする核酸配列。
【請求項４４】
請求項４１に記載の少なくとも２個のアミノ酸配列を含むＶＨ抗体フラグメント。
【請求項４５】
請求項４２に記載の少なくとも２個のアミノ酸配列を含むＶＬ抗体フラグメント。
【請求項４６】
請求項４４に記載のＶＨ抗体フラグメント又は請求項４５に記載のＶＬ抗体フラグメントをコードする核酸配列。
【請求項４７】
請求項４１に記載の少なくとも３個のアミノ酸配列を含むＶＨ抗体フラグメント。
【請求項４８】
請求項４２に記載の少なくとも３個のアミノ酸配列を含むＶＬ抗体フラグメント。
【請求項４９】
請求項４７に記載のＶＨ抗体フラグメント又は請求項４８に記載のＶＬ抗体フラグメントをコードする核酸配列。
【請求項５０】
請求項４１、４４又は４７に記載の少なくとも２個のＶＨ抗体フラグメントを含む多量体。
【請求項５１】
請求項４２、４５又は４８に記載の少なくとも２個のＶＬ抗体フラグメントを含む多量体。
【請求項５２】
請求項４１、４４又は４７に記載の少なくとも１個のＶＨ抗体フラグメント及び請求項４２、４５又は４８に記載の少なくとも１個のＶＬ抗体フラグメントを含む多量体。
【請求項５３】
請求項４１、４４又は４７に記載の２個のＶＨ抗体フラグメントを含む二量体。
【請求項５４】
請求項４２、４５又は４８に記載の２個のＶＬ抗体フラグメントを含む二量体。
【請求項５５】
請求項４１、４４又は４７に記載の３個のＶＨ抗体フラグメントを含む三量体。
【請求項５６】
請求項４２、４５又は４８に記載の３個のＶＬ抗体フラグメントを含む三量体。
【請求項５７】
請求項４１、４４又は４７に記載の５個のＶＨ抗体フラグメントを含む五量体。
【請求項５８】
請求項４２、４５又は４８に記載の５個のＶＬ抗体フラグメントを含む五量体。
【請求項５９】
請求項１に記載の方法で同定されるＶＨ抗体フラグメント。
【請求項６０】
ヒト起源のものである、請求項５９に記載のＶＨ抗体フラグメント。
【請求項６１】
第１表に示される対応する親の生殖細胞系(germline)配列由来のアミノ酸配列を有する、請求項５９に記載のＶＨ抗体フラグメント。
【請求項６２】
ＶＨ３ファミリーに属する、請求項５９に記載のＶＨ抗体フラグメント。
【請求項６３】
ＤＰ４７、Ｖ３−４９、ＤＰ−３８、Ｖ３−５３、ＹＡＣ−５及び８−１Ｂから成る群より選択されるＶ生殖細胞系に属する、請求項５９に記載のＶＨ抗体フラグメント。
【請求項６４】
ＪＨ４ｂ、ＪＨ６ｃ、ＪＨ３ｂ、ＪＨ４、ＪＨ３ａ及びＪＨ１から成る群より選択されるＪ生殖細胞系に属する、請求項５９に記載のＶＨ抗体フラグメント。
【請求項６５】
そのアミノ酸配列の３７位にバリン以外の残基を有する、請求項５９に記載のＶＨ抗体フラグメント。
【請求項６６】
そのアミノ酸配列の３７位にフェニルアラニン残基を有する、請求項６３に記載のＶＨ抗体フラグメント。
【請求項６７】
そのアミノ酸配列の３７位にチロシン残基を有する、請求項６３に記載のＶＨ抗体フラグメント。
【請求項６８】
そのアミノ酸配列の１、５、６、３５、８３、８４、８４ａ及び１０８位から成る群より選択される位置で突然変異を有する、請求項５９に記載のＶＨ抗体フラグメント。
【請求項６９】
プロテインＡと結合する、請求項５９に記載のＶＨ抗体フラグメント。
【請求項７０】
請求項１に記載の方法で同定されるＶＬ抗体フラグメント。
【請求項７１】
ヒト起源のものである、請求項７０に記載のＶＬ抗体フラグメント。
【請求項７２】
Ｖκ１、Ｖκ３又はＶλ１のサブグループに属する、請求項７０に記載のＶＬ抗体フラグメント。
【請求項７３】
κクラスに属する、請求項７０に記載のＶＬ抗体フラグメント。
【請求項７４】
Ｌ６、Ａ２７、Ｌ２、Ｌ１６、Ｏ２／Ｏ１２、Ａ３０及び１ｂから成る群より選択されるＶ生殖細胞系に属する、請求項７０に記載のＶＬ抗体フラグメント。
【請求項７５】
Ｊκ１、Ｊκ４、Ｊκ２及びＪλ３ｂから成る群より選択されるＪ生殖細胞系に属する、請求項７０に記載のＶＬ抗体フラグメント。
【請求項７６】
そのアミノ酸配列の９６位にアルギニン、プロリン、リシン、スレオニン、ロイシン、セリン、チロシン、グルタミン酸、グルタミン又はヒスチジン残基を有する、請求項７０に記載のＶＬ抗体フラグメント。
【請求項７７】
そのアミノ酸配列の９６位に荷電アミノ酸残基を有する、請求項７０に記載のＶＬ抗体フラグメント。
【請求項７８】
プロテインＬと結合する、請求項７０に記載のＶＬ抗体フラグメント。
【請求項７９】
そのアミノ酸配列の１０５、１０６及び１０７位にスレオニン、バリン又はロイシンの
アミノ酸残基を有する、請求項７０に記載のＶＬ抗体フラグメント。
【請求項８０】
請求項１に記載の方法で同定されるポリペプチド配列。
【請求項８１】
請求項８０に記載のポリペプチド配列をコードする核酸配列。
【請求項８２】
請求項８０に記載のポリペプチド配列を使用して構築されるディスプレイライブラリ。
【請求項８３】
請求項２４、５９又は７０に記載のポリペプチド配列を使用して構築されるディスプレイライブラリ。
【請求項８４】
請求項４１、４２、４４、４５、４７又は４８に記載のＶＨ抗体フラグメント又はＶＬ抗体フラグメントを使用して構築されるディスプレイライブラリ。
【請求項８５】
請求項２７、３７又は３９に記載のポリペプチド配列を使用して構築されるディスプレイライブラリ。
【請求項８６】
請求項２４、５９又は７０に記載のポリペプチドのループ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１、Ｈ２又はＨ３）領域を使用して構築されるディスプレイライブラリ。
【請求項８７】
ファージディスプレイライブラリである、請求項８２〜８６のいずれか一項に記載のディスプレイライブラリ。
【請求項８８】
リボソームディスプレイ、ＡＲＭリボソームディスプレイ、酵母ディスプレイ、細菌細胞ディスプレイ又はｉｎ ｖｉｔｒｏ区画化ライブラリである、請求項８２〜８６のいずれか一項に記載のディスプレイライブラリ。
【請求項８９】
望ましい生物物理学的特性を有するポリペプチドを調製する方法であって、
ａ）請求項４１、４２、４４、４５、４７、４８、５９若しくは７０に記載の抗体フラグメントをコードするか、又は請求項２４、２７、３７若しくは３９に記載のポリペプチド配列をコードし、且つ第１の望ましい特性を有する少なくとも１個の第１の核酸配列を提供する工程と、
ｂ）第２の望ましい特性を有する抗体フラグメントをコードする少なくとも１個の第２の核酸配列を提供する工程と、
ｃ）前記少なくとも１個の第１の核酸配列及び前記少なくとも１個の第２の核酸配列をランダムなフラグメントに切断する工程と、
ｄ）前記ランダムなフラグメントを再び集合化させる工程と、
ｅ）前記ランダムなフラグメントを発現する工程と、
ｆ）前記発現されたランダムなフラグメントを前記第１の望ましい特性及び前記第２の望ましい特性に関してスクリーニングする工程と
を含む、方法。
【請求項９０】
前記第１の望ましい特性が、可溶性、安定性、単量体性(monomericity)、高発現性、ヒト起源及び結合特異性から成る群より選択される、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記第２の望ましい特性が、可溶性、安定性、単量体性、高発現性、ヒト起源及び結合特異性から成る群より選択される、請求項８９に記載の方法。
【請求項９２】
前記少なくとも１個の第２の抗体フラグメントが非ヒト起源のものである、請求項８９に記載の方法。
【請求項９３】
前記少なくとも１個の第２の抗体フラグメントがヒト起源のものである、請求項８９に記載の方法。
【請求項９４】
前記少なくとも１個の第２の抗体フラグメントがヒトＶＨ又はヒトＶＬである、請求項８９に記載の方法。
【請求項９５】
前記再び集合化されたランダムなフラグメントのスクリーニングが、リボソームディスプレイ、酵母ディスプレイ、ファージディスプレイ、細菌細胞ディスプレイ、ＡＲＭリボソームディスプレイ又はｉｎ ｖｉｔｒｏ区画化によって達成される、請求項８９に記載の方法。
【請求項９６】
請求項５９又は７０に記載の抗体フラグメント及び薬学的に好適な薬剤を含む薬学的組成物。
【請求項９７】
請求項２４又は８０に記載のポリペプチド配列及び薬学的に好適な薬剤を含む薬学的組成物。
【請求項９８】
請求項２６又は８１に記載の核酸配列を含む組換えベクター。
【請求項９９】
請求項９８に記載の組み換えベクターで形質転換される宿主細胞。
【請求項１】
標的ポリペプチドを同定する方法であって、
（ａ）様々なポリペプチド配列を発現することができるファージディスプレイライブラリを得ること、
（ｂ）前記ライブラリファージによって、細菌層(bacterial lawn)の感染を可能にすること、
（ｃ）前記細菌層上の平均よりも大きいプラークを形成するファージを同定すること
を含む、標的ポリペプチドを同定する方法。
【請求項２】
前記標的ポリペプチドが可溶性である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的ポリペプチドが単量体である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記標的ポリペプチドが非凝集性である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記標的ポリペプチドが高発現性である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記標的ポリペプチドが安定である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ファージが繊維状ファージである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ファージがＭ１３又はｆｄである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記安定なポリペプチドが比較的高い熱リフォールディング効率を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記安定なポリペプチドが比較的高い融解温度を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記安定なポリペプチドが３７℃での長期のインキュベート後にこれらの機能性を維持する、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
前記安定なポリペプチドが化学変性剤に比較的耐性がある、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
前記安定なポリペプチドがプロテアーゼに比較的耐性がある、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
前記安定なポリペプチドが室温以上で、４℃、又は０℃未満で比較的長期の保存期間を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項１５】
前記安定性のポリペプチドが、細胞内環境において機能的である、請求項６に記載の方法。
【請求項１６】
前記安定なポリペプチドが、ヒト体内に投与される場合に機能的である、請求項６に記載の方法。
【請求項１７】
（ｄ）工程（ｃ）の前記より大きいプラークファージを単離する工程と、
（ｅ）前記より大きいプラークファージにより発現される前記ポリペプチドの配列又は他の特徴を決定する工程と
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記標的ポリペプチドが抗体又は抗体のフラグメントである、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記標的ポリペプチドがヒトＶＨ抗体フラグメント又はヒトＶＬ抗体フラグメントである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記標的ポリペプチドがワクチンである、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記標的ポリペプチドが治療用タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記標的ポリペプチドが、一本鎖Ｔ細胞受容体、Ｔ細胞受容体ドメイン、トランスフェリン、リポカリン、ｋｕｎｉｔｚドメイン、アンキリン反復、及び細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原から成る群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記標的ポリペプチドがタンパク質性の診断用試薬及び生化学試薬である、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
配列番号８〜配列番号５４から成る群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【請求項２５】
請求項２４に記載のアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【請求項２６】
請求項２４又は２５に記載のポリペプチドをコードする核酸配列。
【請求項２７】
請求項２４に記載のアミノ酸配列のＣＤＲ３部分を含むポリペプチド。
【請求項２８】
請求項２７に記載のポリペプチドをコードする核酸配列。
【請求項２９】
請求項２４に記載のアミノ酸配列のＦＲ１部分を含むポリペプチド。
【請求項３０】
請求項２９に記載のポリペプチドをコードする核酸配列。
【請求項３１】
請求項２４に記載のアミノ酸配列のＦＲ２部分を含むポリペプチド。
【請求項３２】
請求項３１に記載のポリペプチドをコードする核酸配列。
【請求項３３】
請求項２４に記載のアミノ酸配列のＦＲ３部分を含むポリペプチド。
【請求項３４】
請求項３３に記載のポリペプチドをコードする核酸配列。
【請求項３５】
請求項２４に記載のアミノ酸配列のＦＲ４部分を含むポリペプチド。
【請求項３６】
請求項３５に記載のポリペプチドをコードする核酸配列。
【請求項３７】
請求項２４に記載のアミノ酸配列のＣＤＲ２部分を含むポリペプチド。
【請求項３８】
請求項３７に記載のポリペプチドをコードする核酸配列。
【請求項３９】
請求項２４に記載のアミノ酸配列のＣＤＲ１部分を含むポリペプチド。
【請求項４０】
請求項３９に記載のポリペプチドをコードする核酸配列。
【請求項４１】
配列番号８〜配列番号２２から成る群より選択される少なくとも１個のアミノ酸配列を含むＶＨ抗体フラグメント。
【請求項４２】
配列番号２３〜配列番号５４から成る群より選択される少なくとも１個のアミノ酸配列を含むＶＬ抗体フラグメント。
【請求項４３】
請求項４１に記載のＶＨ抗体フラグメント又は請求項４２に記載のＶＬ抗体フラグメントをコードする核酸配列。
【請求項４４】
請求項４１に記載の少なくとも２個のアミノ酸配列を含むＶＨ抗体フラグメント。
【請求項４５】
請求項４２に記載の少なくとも２個のアミノ酸配列を含むＶＬ抗体フラグメント。
【請求項４６】
請求項４４に記載のＶＨ抗体フラグメント又は請求項４５に記載のＶＬ抗体フラグメントをコードする核酸配列。
【請求項４７】
請求項４１に記載の少なくとも３個のアミノ酸配列を含むＶＨ抗体フラグメント。
【請求項４８】
請求項４２に記載の少なくとも３個のアミノ酸配列を含むＶＬ抗体フラグメント。
【請求項４９】
請求項４７に記載のＶＨ抗体フラグメント又は請求項４８に記載のＶＬ抗体フラグメントをコードする核酸配列。
【請求項５０】
請求項４１、４４又は４７に記載の少なくとも２個のＶＨ抗体フラグメントを含む多量体。
【請求項５１】
請求項４２、４５又は４８に記載の少なくとも２個のＶＬ抗体フラグメントを含む多量体。
【請求項５２】
請求項４１、４４又は４７に記載の少なくとも１個のＶＨ抗体フラグメント及び請求項４２、４５又は４８に記載の少なくとも１個のＶＬ抗体フラグメントを含む多量体。
【請求項５３】
請求項４１、４４又は４７に記載の２個のＶＨ抗体フラグメントを含む二量体。
【請求項５４】
請求項４２、４５又は４８に記載の２個のＶＬ抗体フラグメントを含む二量体。
【請求項５５】
請求項４１、４４又は４７に記載の３個のＶＨ抗体フラグメントを含む三量体。
【請求項５６】
請求項４２、４５又は４８に記載の３個のＶＬ抗体フラグメントを含む三量体。
【請求項５７】
請求項４１、４４又は４７に記載の５個のＶＨ抗体フラグメントを含む五量体。
【請求項５８】
請求項４２、４５又は４８に記載の５個のＶＬ抗体フラグメントを含む五量体。
【請求項５９】
請求項１に記載の方法で同定されるＶＨ抗体フラグメント。
【請求項６０】
ヒト起源のものである、請求項５９に記載のＶＨ抗体フラグメント。
【請求項６１】
第１表に示される対応する親の生殖細胞系(germline)配列由来のアミノ酸配列を有する、請求項５９に記載のＶＨ抗体フラグメント。
【請求項６２】
ＶＨ３ファミリーに属する、請求項５９に記載のＶＨ抗体フラグメント。
【請求項６３】
ＤＰ４７、Ｖ３−４９、ＤＰ−３８、Ｖ３−５３、ＹＡＣ−５及び８−１Ｂから成る群より選択されるＶ生殖細胞系に属する、請求項５９に記載のＶＨ抗体フラグメント。
【請求項６４】
ＪＨ４ｂ、ＪＨ６ｃ、ＪＨ３ｂ、ＪＨ４、ＪＨ３ａ及びＪＨ１から成る群より選択されるＪ生殖細胞系に属する、請求項５９に記載のＶＨ抗体フラグメント。
【請求項６５】
そのアミノ酸配列の３７位にバリン以外の残基を有する、請求項５９に記載のＶＨ抗体フラグメント。
【請求項６６】
そのアミノ酸配列の３７位にフェニルアラニン残基を有する、請求項６３に記載のＶＨ抗体フラグメント。
【請求項６７】
そのアミノ酸配列の３７位にチロシン残基を有する、請求項６３に記載のＶＨ抗体フラグメント。
【請求項６８】
そのアミノ酸配列の１、５、６、３５、８３、８４、８４ａ及び１０８位から成る群より選択される位置で突然変異を有する、請求項５９に記載のＶＨ抗体フラグメント。
【請求項６９】
プロテインＡと結合する、請求項５９に記載のＶＨ抗体フラグメント。
【請求項７０】
請求項１に記載の方法で同定されるＶＬ抗体フラグメント。
【請求項７１】
ヒト起源のものである、請求項７０に記載のＶＬ抗体フラグメント。
【請求項７２】
Ｖκ１、Ｖκ３又はＶλ１のサブグループに属する、請求項７０に記載のＶＬ抗体フラグメント。
【請求項７３】
κクラスに属する、請求項７０に記載のＶＬ抗体フラグメント。
【請求項７４】
Ｌ６、Ａ２７、Ｌ２、Ｌ１６、Ｏ２／Ｏ１２、Ａ３０及び１ｂから成る群より選択されるＶ生殖細胞系に属する、請求項７０に記載のＶＬ抗体フラグメント。
【請求項７５】
Ｊκ１、Ｊκ４、Ｊκ２及びＪλ３ｂから成る群より選択されるＪ生殖細胞系に属する、請求項７０に記載のＶＬ抗体フラグメント。
【請求項７６】
そのアミノ酸配列の９６位にアルギニン、プロリン、リシン、スレオニン、ロイシン、セリン、チロシン、グルタミン酸、グルタミン又はヒスチジン残基を有する、請求項７０に記載のＶＬ抗体フラグメント。
【請求項７７】
そのアミノ酸配列の９６位に荷電アミノ酸残基を有する、請求項７０に記載のＶＬ抗体フラグメント。
【請求項７８】
プロテインＬと結合する、請求項７０に記載のＶＬ抗体フラグメント。
【請求項７９】
そのアミノ酸配列の１０５、１０６及び１０７位にスレオニン、バリン又はロイシンの
アミノ酸残基を有する、請求項７０に記載のＶＬ抗体フラグメント。
【請求項８０】
請求項１に記載の方法で同定されるポリペプチド配列。
【請求項８１】
請求項８０に記載のポリペプチド配列をコードする核酸配列。
【請求項８２】
請求項８０に記載のポリペプチド配列を使用して構築されるディスプレイライブラリ。
【請求項８３】
請求項２４、５９又は７０に記載のポリペプチド配列を使用して構築されるディスプレイライブラリ。
【請求項８４】
請求項４１、４２、４４、４５、４７又は４８に記載のＶＨ抗体フラグメント又はＶＬ抗体フラグメントを使用して構築されるディスプレイライブラリ。
【請求項８５】
請求項２７、３７又は３９に記載のポリペプチド配列を使用して構築されるディスプレイライブラリ。
【請求項８６】
請求項２４、５９又は７０に記載のポリペプチドのループ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１、Ｈ２又はＨ３）領域を使用して構築されるディスプレイライブラリ。
【請求項８７】
ファージディスプレイライブラリである、請求項８２〜８６のいずれか一項に記載のディスプレイライブラリ。
【請求項８８】
リボソームディスプレイ、ＡＲＭリボソームディスプレイ、酵母ディスプレイ、細菌細胞ディスプレイ又はｉｎ ｖｉｔｒｏ区画化ライブラリである、請求項８２〜８６のいずれか一項に記載のディスプレイライブラリ。
【請求項８９】
望ましい生物物理学的特性を有するポリペプチドを調製する方法であって、
ａ）請求項４１、４２、４４、４５、４７、４８、５９若しくは７０に記載の抗体フラグメントをコードするか、又は請求項２４、２７、３７若しくは３９に記載のポリペプチド配列をコードし、且つ第１の望ましい特性を有する少なくとも１個の第１の核酸配列を提供する工程と、
ｂ）第２の望ましい特性を有する抗体フラグメントをコードする少なくとも１個の第２の核酸配列を提供する工程と、
ｃ）前記少なくとも１個の第１の核酸配列及び前記少なくとも１個の第２の核酸配列をランダムなフラグメントに切断する工程と、
ｄ）前記ランダムなフラグメントを再び集合化させる工程と、
ｅ）前記ランダムなフラグメントを発現する工程と、
ｆ）前記発現されたランダムなフラグメントを前記第１の望ましい特性及び前記第２の望ましい特性に関してスクリーニングする工程と
を含む、方法。
【請求項９０】
前記第１の望ましい特性が、可溶性、安定性、単量体性(monomericity)、高発現性、ヒト起源及び結合特異性から成る群より選択される、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記第２の望ましい特性が、可溶性、安定性、単量体性、高発現性、ヒト起源及び結合特異性から成る群より選択される、請求項８９に記載の方法。
【請求項９２】
前記少なくとも１個の第２の抗体フラグメントが非ヒト起源のものである、請求項８９に記載の方法。
【請求項９３】
前記少なくとも１個の第２の抗体フラグメントがヒト起源のものである、請求項８９に記載の方法。
【請求項９４】
前記少なくとも１個の第２の抗体フラグメントがヒトＶＨ又はヒトＶＬである、請求項８９に記載の方法。
【請求項９５】
前記再び集合化されたランダムなフラグメントのスクリーニングが、リボソームディスプレイ、酵母ディスプレイ、ファージディスプレイ、細菌細胞ディスプレイ、ＡＲＭリボソームディスプレイ又はｉｎ ｖｉｔｒｏ区画化によって達成される、請求項８９に記載の方法。
【請求項９６】
請求項５９又は７０に記載の抗体フラグメント及び薬学的に好適な薬剤を含む薬学的組成物。
【請求項９７】
請求項２４又は８０に記載のポリペプチド配列及び薬学的に好適な薬剤を含む薬学的組成物。
【請求項９８】
請求項２６又は８１に記載の核酸配列を含む組換えベクター。
【請求項９９】
請求項９８に記載の組み換えベクターで形質転換される宿主細胞。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０】
【公開番号】特開２０１２−７０７４８（Ｐ２０１２−７０７４８Ａ）
【公開日】平成２４年４月１２日（２０１２．４．１２）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１１−２５４９８８（Ｐ２０１１−２５４９８８）
【出願日】平成２３年１１月２２日（２０１１．１１．２２）
【分割の表示】特願２００８−５０２２０７（Ｐ２００８−５０２２０７）の分割
【原出願日】平成１８年３月２４日（２００６．３．２４）
【出願人】（５０６１７５７９２）ナショナル リサーチ カウンシル オブ カナダ (9)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年４月１２日（２０１２．４．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２５４９８８（Ｐ２０１１−２５４９８８）
【出願日】平成２３年１１月２２日（２０１１．１１．２２）
【分割の表示】特願２００８−５０２２０７（Ｐ２００８−５０２２０７）の分割
【原出願日】平成１８年３月２４日（２００６．３．２４）
【出願人】（５０６１７５７９２）ナショナル リサーチ カウンシル オブ カナダ (9)
【Ｆターム（参考）】
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