可溶性内皮細胞プロテインＣ／活性化プロテインＣレセプターを使用する診断アッセイ
【課題】本発明の目的は、天然に存在する可溶性ＥＰＣＲについて治療的および診断的使用を同定することである。本発明のさらなる目的は、天然に存在する可溶性ＥＰＣＲを特徴づけることである。
【解決手段】カルボキシル末端システイン残基が、別のアミノ酸と置換されているか、またはパルミトイル化されていない、改変された内皮プロテインＣレセプター。グリコシル化されていない、改変された内皮プロテインＣレセプター。単離された、選択的にスプライスされた内皮プロテインＣレセプター。膜貫通ドメインの前の天然に存在するタンパク質分解性切断部位で切断された、単離された可溶性内皮プロテインＣレセプター。
【解決手段】カルボキシル末端システイン残基が、別のアミノ酸と置換されているか、またはパルミトイル化されていない、改変された内皮プロテインＣレセプター。グリコシル化されていない、改変された内皮プロテインＣレセプター。単離された、選択的にスプライスされた内皮プロテインＣレセプター。膜貫通ドメインの前の天然に存在するタンパク質分解性切断部位で切断された、単離された可溶性内皮プロテインＣレセプター。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（発明の背景）
本発明は、一般に、内皮細胞プロテインＣ/活性化プロテインＣレセプターまたはタン
パク質分解もしくは選択的スプライシングのいずれかによって誘導されるその可溶性形態の検出および/または測定を含むアッセイの領域にある。
【０００２】
合衆国政府は、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｔ．Ｅｓｍｏｎに対する国立衛生研究所助成金ＰＯ１ＨＬ ５４８０４により、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
プロテインＣのその活性セリンプロテアーゼに対する活性化、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）は、血液凝固の調節に重要な役割を果たす一連の事象を開始する。プロテインＣ経路の臨床的重要性は、血栓症を生じる、この経路における多くの機能不全によって示される（非特許文献１；非特許文献２）。プロテインＣが欠損した患者は、通常、幼児期に生命を危うくする血栓症合併症を示す（非特許文献３；非特許文献４）。これは、プロテインＣ投与によって補正される（非特許文献５）。
【０００４】
プロテインＣおよびＡＰＣはまた、炎症に対する宿主応答の調節に関連している。活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）は、グラム陰性敗血症のヒヒモデルにおいてＥ．ｃｏｌｉの致死的効果を予防し得（非特許文献６；ＴａｙｌｏｒおよびＥｓｍｏｎに対する特許文献１）、そして予備的な臨床結果は、プロテインＣが、ヒト敗血症ショックのある形態を処置することに効果的であることを示唆する（非特許文献７）。プロテインＣ経路の重要な成分であるプロテインＳの阻害は、Ｅ．ｃｏｌｉの致死量未満のレベルに対する霊長類の応答を悪化させ、そして循環中へのＴＮＦの出現を増大する（非特許文献８）。これらの結果は、プロテインＣが、凝固の制御および炎症への影響の両方をなし得ることを示唆する。
【０００５】
プロテインＣは、凝固系の最終酵素であるトロンビンが、内皮細胞表面タンパク質であるトロンボモジュリンに結合する場合に、活性化される（非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１）。細胞培養において、トロンボモジュリン転写は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）への内皮細胞の曝露によってブロックされ（非特許文献１２そしてトロンボモジュリン活性および抗原は、その後インターナライズされそして分解される（非特許文献１３、非特許文献１４）。補体系の調節タンパク質であるＣ４ｂＢＰは、プロテインＳと結合して、インビトロ（非特許文献１５）およびインビボ（非特許文献８）でＡＰＣ抗凝固活性を支持することにおいて機能的に不活性である複合体を形成する。Ｃ４ｂＢＰは、急性期反応物質として行動する（非特許文献１６）。したがって、この経路のタンパク質は、炎症を調節するようにみえるだけでなく、これらは炎症を調節する成分と相互作用し、そしてこれら自体は、炎症メディエータによってダウンレギュレーションを受ける。
【０００６】
内皮細胞は、効率的なプロテインＣ活性化を担う公知の２つのレセプター、トロンボモジュリンおよび内皮プロテインＣ/ＡＰＣレセプター（ＥＰＣＲ）を発現する点で、プロ
テインＣ経路において重要な役割を果たす（非特許文献１７；非特許文献１８）。トロンボモジュリン（ＣＤ１４１）は、高親和性を有する循環トロンビンと結合する膜貫通補因子であり、そして得られる酵素−補因子複合体は、生理学的に関連するプロテインＣ活性化速度に必要とされる（非特許文献１９；非特許文献２０）。
【０００７】
ＥＰＣＲは、ＣＤ１/ＭＨＣクラス１ファミリーとの著しい相同性を有する最近同定さ
れたレセプターである（非特許文献１７；非特許文献２１；非特許文献２２）。プロテインＣに対する内皮細胞レセプターのクローニングおよび生物学的役割は、Ｏｋｌａｈｏｍａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎによって「Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ/Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ」と
題するＰＣＴ/ＵＳ９５/０９６３６に記載された。このタンパク質は、２３８アミノ酸からなると予測され、このアミノ酸は、Ｎ末端に１５アミノ酸のシグナル配列、およびタイプ１膜貫通タンパク質としてこのレセプターを特徴づける２３アミノ酸の膜貫通領域を含む。
【０００８】
ＥＰＣＲは、カルシウムの存在下で類似の親和性（Ｋｄapp約３０ｎＭ）でプロテイン
ＣおよびＡＰＣの両方と結合し（非特許文献２１）、そして細胞表面上で、トロンビン−トロンボモジュリン活性化複合体に対してプロテインＣ基質を提示することにより、プロテインＣ活性化を容易にする（非特許文献１８）。内皮細胞レセプターは両方とも、タイプ１膜貫通タンパク質であり、ここでリガンドは、細胞外ドメインに結合し、そして両方とも、短い細胞内細胞質テイルを有する（非特許文献２１；非特許文献２３；非特許文献２４；非特許文献２５）。さらに、それらのインビトロ細胞表面発現は、腫瘍壊死因子−αによって同様にダウンレギュレートされる（非特許文献１７）。しかし、トロンボモジュリンおよびＥＰＣＲの可溶性形態の特徴は、いくつかの点で異なる。組換え可溶性トロンボモジュリンは、膜形態に対して減少した補因子活性を有する（非特許文献２６；非特許文献２７）。精製した成分および細胞の両方で、トロンボモジュリンによって特異的に誘導されるトロンビンの基質の変化は、トロンビンにおける共有される結合ドメインについての競合、ならびに活性部位ポケットにおけるコンホメーション変化から生じる（非特許文献２８；非特許文献２９；非特許文献３０；非特許文献３１；非特許文献３２；非特許文献３３；非特許文献３４）。可溶性トロンボモジュリンもまた、種々のインヒビターによるトロンビンの不活化を加速する（非特許文献３５；非特許文献３６）。血漿および尿の両方が、検出可能なトロンボモジュリンを含み（非特許文献３７；非特許文献３８）、そしてトロンボモジュリン遺伝子がイントロンを含まないので（非特許文献２３）、これらの可溶性形態は、細胞表面での細胞外ドメインのタンパク質分解による。
【０００９】
血漿中のトロンボモジュリンの可溶性分解産物は、種々の疾患状態での内皮細胞損傷の公知のマーカーであり（非特許文献３７；非特許文献３９；非特許文献４０；非特許文献４１；非特許文献４２；非特許文献４３；非特許文献４４）、そして種々の減少した親和性を有するトロンビン結合フラグメント、ならびに非結合フラグメントの混合物から構成される（非特許文献３７）。
【００１０】
対照的に、膜貫通ドメインの直前で短縮された組換え可溶性ＥＰＣＲ（ｒｓＥＰＣＲ）は、インタクトな細胞表面発現ＥＰＣＲについて観察される親和性と同様な親和性でプロテインＣおよびＡＰＣの両方と結合する（非特許文献２１）。おそらくｒｓＥＰＣＲおよび第Ｖａ因子の両方が、トロンボモジュリンによって占有されるトロンビン中のアニオン結合外部位（ｅｘｏｓｉｔｅ）を暗示する溝に結合決定基を共有するので（非特許文献４５）、ＡＰＣ抗凝固活性は、ｒｓＥＰＣＲと結合した場合、効果的に阻害される（非特許文献２２）。しかし、ｒｓＥＰＣＲは、ＡＰＣによる小さい合成基質のタンパク質分解にも、α１−アンチトリプシンまたはプロテインＣインヒビターによるＡＰＣの不活化にも影響を及ぼさないようである（非特許文献２２）。プロテインＣ活性化を増強する膜結合ＥＰＣＲ（非特許文献１８）とは異なり、ｒｓＥＰＣＲは、可溶性トロンビン−トロンボモジュリン複合体によるプロテインＣ活性化に対してほとんど効果を有さない（非特許文献２２）。このことは、ＥＰＣＲの任意の可溶性形態が、プロテインＣについて膜結合ＥＰＣＲと競合することによってプロテインＣ活性化を阻害し得ることを示唆する。
【００１１】
免疫組織化学は、ＥＰＣＲが、主として大きな血管に由来する内皮細胞の表面上に存在し、そしてほとんどの毛細血管内皮細胞上にはないか、または低レベルでしか存在しないことを示す。
【特許文献１】米国特許第５,００９,８８９号明細書
【非特許文献１】ＥｓｍｏｎおよびＳｃｈｗａｒｚ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｍｅｄ．，１９９５，５，ｐ．１４１−１４８
【非特許文献２】Ｒｅｉｔｓｍａら，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，１９９５，７３，ｐ．８７６−８７９
【非特許文献３】Ｓｅｌｉｇｓｏｈｎら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，１９８４，３１０，ｐ．５５９−５６２
【非特許文献４】Ｅｓｍｏｎ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｍｅｄ．，１９９２，２，ｐ．２１４−２２０
【非特許文献５】Ｄｒｅｙｆｕｓら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，１９９１，３２５，ｐ．１５６５−１５６８
【非特許文献６】Ｔａｙｌｏｒら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１９８７，ｐ．７９
【非特許文献７】Ｇｅｒｓｏｎら，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ ９１，１９９３，ｐ．４１８−４２２
【非特許文献８】Ｔａｙｌｏｒら，Ｂｌｏｏｄ，１９９１，７８，ｐ．３５７−３６３
【非特許文献９】Ｅｓｍｏｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８９，２６４，ｐ．４７４３−４７４６
【非特許文献１０】ＤｉｔｔｍａｎおよびＭａｊｅｒｕｓ，Ｂｌｏｏｄ，１９９０，７５，ｐ．３２９−３３６
【非特許文献１１】Ｄｉｔｔｍａｎ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｍｅｄ．，１９９１，１，ｐ．３３１−３３６
【非特許文献１２】ＣｏｎｗａｙおよびＲｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９８８，８，ｐ．５５８８−５５９２
【非特許文献１３】Ｌｅｎｔｚら，Ｂｌｏｏｄ，１９９１，７７，ｐ．５４３−５５０
【非特許文献１４】Ｍｏｏｒｅら，Ｂｌｏｏｄ，１９８９，７３，ｐ．１５９−１６５
【非特許文献１５】Ｄａｈｌｂａｃｋ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８６，２６１，ｐ．１２０２２−１２０２７
【非特許文献１６】Ｄａｈｌｂａｃｋ，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔａｓ．，１９９１，６６，ｐ．４９−６１
【非特許文献１７】ＦｕｋｕｄｏｍｅおよびＥｓｍｏｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９４，２６９，ｐ．２６４８６−２６４９１
【非特許文献１８】Ｓｔｅａｒｎｓ−Ｋｕｒｏｓａｗａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），１９９６，９３，ｐ．１０２１２−１０２１６
【非特許文献１９】ＥｓｍｏｎおよびＯｗｅｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），１９８１，７８，ｐ．２２４９−２２５２
【非特許文献２０】Ｄｉｔｔｍａｎ，Ｗ．Ａ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｍｅｄ．，１９９１，１，ｐ．３３１−３３６
【非特許文献２１】Ｆｕｋｕｄｏｍｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９６，２７１，ｐ．１７４９１−１７４９８
【非特許文献２２】Ｒｅｇａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９６，２７１，ｐ．１７４９９−１７５０３
【非特許文献２３】Ｊａｃｋｍａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），１９８７，８４，ｐ．６４２５−６４２９
【非特許文献２４】Ｗｅｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｏｒｙ，１９８７，２６，ｐ．４３５０−４３５７
【非特許文献２５】Ｓｕｚｕｋｉら，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９８７，６，ｐ．１８９１−１８９７
【非特許文献２６】Ｇａｌｖｉｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８７，２６２，ｐ．２１９９−２２０５
【非特許文献２７】Ｐａｒｋｉｎｓｏｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９０，２６５，ｐ．１２６０２−１２６１０
【非特許文献２８】Ｙｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９１，２６６，ｐ．２３０１６−２３０２１
【非特許文献２９】Ｌｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８９，２６４，ｐ．１２９５６−１２９６２
【非特許文献３０】Ｙｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９２，２６７，ｐ．１１０２３−１１０２８
【非特許文献３１】Ｈｏｆｓｔｅｅｎｇｅら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１９８６，２３７，ｐ．２４３−２５１
【非特許文献３２】Ｍａｔｈｅｗｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９４，３３，ｐ．１３５４７−１３５５２
【非特許文献３３】Ｅｓｍｏｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８２，２５７，ｐ．７９４４−７９４７
【非特許文献３４】Ｓａｄｌｅｒら，Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ，１９９３，２３，ｐ．１８３−１９３
【非特許文献３５】ＢｏｕｒｉｎおよびＬｉｎｄａｈｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１９９３，２８９，ｐ．３１３−３３０
【非特許文献３６】Ｒｅｚａｉｅ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９５，２７０，ｐ．２５３３６−２５３３９
【非特許文献３７】Ｔａｋａｎｏら，Ｂｌｏｏｄ，１９９０，７６，ｐ．２０２４−２０２９
【非特許文献３８】ＩｓｈｉｉおよびＭａｊｅｒｕｓ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１９８５，７６，ｐ．２１７８−２１８１
【非特許文献３９】Ｔａｎａｋａら，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，１９９１，３７，ｐ．２６９−２７２
【非特許文献４０】Ｔａｋａｈａｓｈｉら，Ａｍ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，１９９１，３８，ｐ．１７４−１７７
【非特許文献４１】Ａｓａｋｕｒａら，Ａｍ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，１９９１，３８，ｐ．２８１−２８７
【非特許文献４２】Ｗａｄａら，Ａｍ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，１９９２，３９，ｐ．２０−２４
【非特許文献４３】Ｔａｋａｈａｓｈｉら，Ａｍ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，１９９２，４１：３２−３９
【非特許文献４４】Ｏｈｄａｍａら，Ｃｈｅｓｔ，１９９４，１０６，ｐ．６６６−６７１
【非特許文献４５】Ｍａｔｈｅｒら，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９６，１５，ｐ．６８２２−６８３１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、本発明の目的は、天然に存在する可溶性ＥＰＣＲについて治療的および診断的使用を同定することである。
【００１３】
本発明のさらなる目的は、天然に存在する可溶性ＥＰＣＲを特徴づけることである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（発明の要旨）
血漿ＥＰＣＲは、単離され、特徴づけられ、そして細胞性プロテインＣ活性化およびＡＰＣ抗凝固活性をブロックすることが示されている。血漿ＥＰＣＲは、約４３,０００ダ
ルトンであるようであり、そして約１００ｎｇ/ｍｌで循環する（９８.４±２７.８ｎｇ/ｍｌ、ｎ＝２２）。血漿ＥＰＣＲを、イオン交換、イムノアフィニティー、およびプロテインＣアフィニティークロマトグラフィーを使用して、ヒトのクエン酸処理血漿から精製した。フローサイトメトリー実験は、血漿ＥＰＣＲが、膜貫通および細胞質ドメインを含まないＥＰＣＲとして定義される組換え短縮型ＥＰＣＲから予め決定された親和性（Ｋｄapp約３０ｎＭ）と同様の親和性で、活性化プロテインＣと結合することを示した。さら
に、血漿ＥＰＣＲは、内皮細胞株におけるプロテインＣ活性化および１段階第Ｘａ因子凝血アッセイにおけるＡＰＣ抗凝固活性の両方を阻害した。可溶性ＥＰＣＲはまた、ヒト尿において検出されている。ＥＰＣＲをコードする遺伝子のクローニングは、少なくともヒトＥＰＣＲが選択的にスプライスされ得、選択的にスプライスされた形態（ｓＥＰＣＲ）に特有のインサートを含む短縮型可溶性ＥＰＣＲを生じることを示す。これらの結果は、血漿ＥＰＣＲが、細胞表面でのタンパク質分解または選択的スプライシングのいずれかによって誘導され得ることを示す。
【００１５】
血漿ＥＰＣＲの局所濃度が、特に疾患状態において、十分に高い場合、そのデータは、短縮型可溶性血漿ＥＰＣＲが、プロテインＣ活性化の膜結合ＥＰＣＲ増大および活性化プロテインＣの抗凝固機能を減弱させ得ることを示す。自己免疫疾患（全身性エリテマトーデス、ＳＬＥ）および敗血症（炎症および凝固異常の両方を含む障害）の患者からのＥＰＣＲのレベルと正常ＥＰＣＲを比較する実施例によって示されるように、可溶性ＥＰＣＲのレベルは、炎症および異常凝固に関連する疾患状態と相関するようである。凝固、炎症、および大血管疾患を含む疾患状態を示す、可溶性ＥＰＣＲの測定に基づくアッセイが記載される。単離精製された可溶性ＥＰＣＲ、組換え短縮型可溶性ＥＰＣＲ、および可溶性ＥＰＣＲに対する抗体を含む、アッセイ試薬が記載される。
【００１６】
本発明はさらに、以下を提供する。
（１）可溶性内皮プロテインＣレセプターについてのアッセイであって、
テストされる患者からサンプルを得る工程、および
可溶性内皮プロテインＣレセプターの量を測定する工程、
を包含する、アッセイ。
（２）上記サンプルが、尿、血漿、血清、組織サンプル、および間質液からなる群より選択される、項目１に記載のアッセイ。
（３）可溶性内皮プロテインＣレセプターの量を較正標準と相関させる工程をさらに包含する、項目１に記載のアッセイ。
（４）上記患者が、凝固および炎症状態および障害、内皮に対する損傷に関連する障害または疾患、ならびに大血管疾患からなる群より選択される障害または疾患を有する、項目１に記載のアッセイ。
（５）上記障害または疾患が、自己免疫疾患、移植、敗血症、ショック、子癇前症、糖尿病、血管疾患、腎臓疾患、および肝臓疾患からなる群より選択される、項目４に記載のアッセイ。
（６）上記血管疾患が、心肺バイパス、不安定性アンギナ、再狭窄、および血管形成からなる群より選択される、項目５に記載のアッセイ。
（７）大血管に対する損傷を検出するための、項目１に記載のアッセイ。
（８）内皮プロテインＣレセプターの検出および測定のためのキットであって、
内皮プロテインＣレセプターと免疫反応性である抗体、
患者からのサンプル中で上記抗体と内皮プロテインＣレセプターとの間の反応を検出するための試薬、および
上記反応量を、内皮プロテインＣレセプターの正常および異常レベルと相関させるための標準
を含む、キット。
（９）上記抗体が、膜貫通ドメインを含まない内皮プロテインＣレセプターについてより、膜貫通ドメインを含む内皮プロテインＣレセプターについて、より高い親和性を有する、項目８に記載のキット。
（１０）上記抗体が、選択的にスプライスされた内皮プロテインＣレセプターにおけるインサートと免疫反応性である、項目８に記載のキット。
（１１）上記抗体が、内皮プロテインＣレセプターと、活性化プロテインＣまたはプロテインＣとの結合をブロックする、項目８に記載のキット。
（１２）カルボキシル末端システイン残基が、別のアミノ酸と置換されているか、またはパルミトイル化されていない、改変された内皮プロテインＣレセプター。
（１３）グリコシル化されていない、改変された内皮プロテインＣレセプター。
（１４）単離された、選択的にスプライスされた内皮プロテインＣレセプター。
（１５）膜貫通ドメインの前の天然に存在するタンパク質分解性切断部位で切断された、単離された可溶性内皮プロテインＣレセプター。
【発明の効果】
【００１７】
自己免疫疾患（全身性エリテマトーデス、ＳＬＥ）および敗血症（炎症および凝固異常の両方を含む障害）の患者からのＥＰＣＲのレベルと正常ＥＰＣＲを比較する実施例によって示されるように、可溶性ＥＰＣＲのレベルは、炎症および異常凝固に関連する疾患状態と相関するようである。凝固、炎症、および大血管疾患を含む疾患状態を示す、可溶性ＥＰＣＲの測定に基づくアッセイが提供される。単離精製された可溶性ＥＰＣＲ、組換え短縮型可溶性ＥＰＣＲ、および可溶性ＥＰＣＲに対する抗体を含む、アッセイ試薬が提供される。これらは従来技術からは予測不可能であった格別の効果である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
（発明の詳細な説明）
（定義）
内皮プロテインＣレセプター、ＥＰＣＲ。
【００１９】
可溶性、溶液中にあり、そして細胞表面に結合していない。
【００２０】
短縮型、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含まない；タンパク質分解または選択的スプライシングのいずれかの結果であり得る。
【００２１】
（可溶性ＥＰＣＲの検出および特徴付け；生理学的役割およびマーカーとしての有用性）
ＥＰＣＲの機能のこれまでの研究は、膜形態のＥＰＣＲに結合するプロテインＣが、細胞表面上のトロンビン−トロンボモジュリン複合体によりプロテインＣ活性化の促進を生じる（Ｓｔｅａｒｎｓ−Ｋｕｒｏｓａｗａら，１９９６）が、可溶性組換えＥＰＣＲはＡＰＣ抗凝固活性を阻害する（Ｒｅｇａｎら，１９９６）ことを見出した。これらの観察は、血漿中の可溶性トロンボモジュリン分解産物が、種々の疾患状態における内皮損傷のマーカーであるという知識と共に、可溶性循環形態のＥＰＣＲが存在するかどうか、そして存在するのであれば、プロテインＣ経路においてどういう役割を有するかという疑問に至った。
【００２２】
実施例は、可溶性形態のＥＰＣＲが血漿中で循環し、そして尿中に存在することを示す
。健常ドナー集団において、血漿ＥＰＣＲレベルは、約１００ｎｇ/ｍｌであり、そして
約４３,０００ダルトンの単一抗原種であるようであった。血漿からの可溶性ＥＰＣＲの
その後の精製および機能的研究は、血漿ＥＰＣＲが、インタクトな膜結合ＥＰＣＲと同様な親和性で、プロテインＣおよびＡＰＣの両方と結合し得ることを決定した。内皮細胞株を使用するインビトロ研究は、血漿ＥＰＣＲが、生理学的濃度に近い濃度のプロテインＣおよびトロンビンで、プロテインＣを阻害することを示した。さらに、血漿への精製血漿ＥＰＣＲの直接添加は、ｒｓＥＰＣＲに対するモノクローナル抗体で逆転されるＡＰＣ抗凝固活性の阻害を生じた。
【００２３】
この精製血漿タンパク質のＥＰＣＲとの同定は、ｒｓＥＰＣＲの特性との比較に基づいた。これらのタンパク質は両方とも、同じ群のモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体と反応し、同じアミノ末端配列を有し、Ｃａ2+依存的様式で固定されたプロテインＣに結合し、そして類似の用量応答曲線でプロテインＣ活性化およびＡＰＣ抗凝固活性をブロックした。さらに、ｒｓＥＰＣＲおよび血漿ＥＰＣＲに対するプロテインＣおよびＡＰＣの親和性は共に、インタクトな膜結合ＥＰＣＲの親和性に類似する。これらの特性は、ＥＰＣＲに特有であるようである。
【００２４】
これまでの研究は、内皮細胞で発現した膜結合ＥＰＣＲが、３〜５倍の間のファクターでプロテインＣ活性化を増大することを示したが、実施例は、血漿から精製された可溶性形態のＥＰＣＲが、内皮細胞でのプロテインＣ活性化およびＡＰＣ抗凝固活性を阻害することを示す。これは、ＥＰＣＲが、いくつかの方法で、プロテインＣ経路を調節し得ることを予測する。第１に、より大きな血管（ここでは、トロンボモジュリン濃度が微小循環に対して低い）において、ＥＰＣＲ発現は、対応して増加する（Ｌａｓｚｉｋら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １９９７）。免疫組織化学は、ほとんどの器官において、ＥＰＣＲ発現は、大血管で最も高密度であり、そして血管サイズが減少するにつれて次第に減少し、最も豊富な内皮細胞タイプである毛細管内皮ではほとんどまたは全く発現しない。ＥＰＣＲ発現は、循環からプロテインＣ基質を捕獲し、そして活性化のためにトロンビン−トロンボモジュリン複合体に提示することにおいて、重要な役割を果たし得る。このことは、ＥＡ.ｈｙ９２６内皮細胞株およびヒト臍静脈内皮細胞の両方ともが、トロンボモジュリ
ンより、少なくとも６倍多い表面発現ＥＰＣＲ抗原を有するというインビトロ観察によって支持される。トロンボモジュリン濃度が高くそしてＥＰＣＲが低い微小循環では、プロテインＣ活性化にほとんど影響がないと予測される。最後に、循環可溶性ＥＰＣＲは、ＡＰＣの生成およびＡＰＣが第Ｖａ因子を不活化する能力を減少させ得る。
【００２５】
健常個体において、可溶性ＥＰＣＲレベルは、約２.５ｎＭであり、この濃度は、Ｋｄapp（約３０ｎＭ）および循環にける８０ｎＭのプロテインＣ濃度の両方よりも十分に低い。可溶性血漿ＥＰＣＲの効果（ＡＰＣ抗凝固活性およびプロテインＣ活性化の阻害）の両方ともが、正常血漿に存在する濃度よりかなり高い濃度を必要とする。このことが、血漿ＥＰＣＲの生理学的役割の疑問を、不確定のままにしている。４０ｎＭを越える可溶性ＥＰＣＲレベルを有する患者が、実施例３（狼瘡）に記載のように同定された。したがって、内皮細胞表面に近い局所濃度が、全身濃度を超えるならば、可溶性ＥＰＣＲ濃度は、ＡＰＣの生成および活性の両方を減弱するレベルに達し、血栓症の危険性に寄与する。
【００２６】
可溶性形態のレセプターは、膜結合レセプターのタンパク質分解的切断、または選択的スプライシングメカニズムによって産生され得る。膜表面でのタンパク質分解は、可溶性トロンボモジュリン、ならびにＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、Ｍ−ＣＳＦ、ＰＤＧＦ、およびＮＧＦのレセプターを遊離する（Ｈｅａｎｅｙら，１９９６，Ｂｌｏｏｄ ８７：８４７−８５７）。可溶性レセプターは、膜レセプターのアンタゴニストとして作用すること、リガンドを安定化すること、リガンド媒介されたシグナリングを開始すること、膜形態のダウンモジュレーション、およびレセプターインヒビターへ結合してレセプター−リ
ガンド活性を間接的に容易にすることを含む、多くの可能性のある機能を有する。後者のメカニズムは、両方のＩＬ−１レセプターの可溶性イソ形態が、タンパク質分解的切断によって生成され、そしてＩＬ−１αおよびＩＬ−１βへの応答性を厳格に調節する、ＩＬ−１レセプター系によって使用される（Ａｒｅｎｄら，１９９４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
１５３：４７６６−４７７４）。以下に議論するように、膜貫通ドメインの直前で短縮された可溶性タンパク質をコードするＥＰＣＲゲノム構造は、選択的スプライシング部位を含む（ＦｕｋｕｄｏｍｅおよびＥｓｍｏｎ，１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７０：５５７１−５５７７）。可溶性ＩＬ−６レセプターは、タンパク質分解メカニズムおよび選択的スプライシングメカニズムの両方によって生成されるようである（Ｍｕｌｌｂｅｒｇら，１９９４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５２：４９５８−４９６８；Ｌｕｓｔら，１９９２，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ４：９６−１００；Ｈｏｒｉｕｃｈｉら，１９９４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２４：１９４５−１９４８）。この切断部位はまた、ＭｏｒｒｉｓｓｅｙおよびＥｓｍｏｎへの米国特許第５,２９８,５９９号（その教示は本明細書に援用される）に記載のように、短縮型ＥＰＣＲ、続いて直ぐペプチド配列（抗体はこの配列に対して特異的に指向する）をコードする発現ベクターを構築することによって、大量の可溶性ＥＰＣＲを回収することにおいて有用であり得る。次いで、エピトープは、患者への投与の前または後に、タンパク質分解によって切断される。Ｈｏｐｐらへの米国特許第４,７８２,１３７号もまた参照。
【００２７】
免疫組織化学研究は、ＥＰＣＲが、主として大血管の内皮に位置し、そして毛細血管ではかろうじて検出可能であることを示した。したがって、膜結合ＥＰＣＲに由来する血漿ＥＰＣＲは、大血管疾患プロセスのマーカーとして用い得る。血漿ＥＰＣＲは、血漿トロンボモジュリンレベルとの有用な比較として用い得る。血漿トロンボモジュリンレベルは、種々の疾患状態において調整されることが示されているが、大血管および小血管の両方の疾患プロセスを反映し、ほとんどの内皮が微小血管性であるのでおそらく小血管の寄与に支配される。
【００２８】
（ＥＰＣＲのヌクレオチドおよび予測タンパク質構造分析）
ＥＰＣＲのｃＤＮＡは、２３８アミノ酸（配列番号２）のタンパク質をコードすると予測され、これは、Ｎ末端に１５アミノ酸のシグナル配列を含む（ｖｏｎＨｅｉｊｎｅ，（１９８６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４，４６８３−４６９０）。したがって、成熟タンパク質は、２２３アミノ酸を含むと予測される。組換えタンパク質の直接配列決定は、成熟タンパク質がＳｅｒ１８で始まることを示した。配列番号２は、ＥＰＣＲの予測アミノ酸配列である。配列番号２のアミノ酸１〜１５（ＭＬＴＴＬＬＰＩＬＬＬＳＧＷＡ）は、ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ（ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ，１９８６）の方法によって決定される推定シグナル配列である。配列番号２のアミノ酸２１１〜２３６（ＬＶＬＧＶＬＶＧＧＦＩＩＡＧＶＡＶＧＩＦＬＣＴＧＧＲ）は、推定膜貫通ドメインである。可能性のあるＮ−グリコシル化部位は、配列番号２のアミノ酸４７〜４９、６４〜６６、１３６〜１３８、および１７２〜１７４に存在する。細胞外システイン残基は、配列番号２のアミノ酸１７（血漿ＥＰＣＲでは除去されている）、１１４、１１８、および１８６に存在する。２３アミノ酸からなる可能性のある膜貫通領域（Ｅｎｇｅｌｍａｎら，（１９８６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ． １５，３２１−５３）を、Ｃ末端で同定した（配列番号２のアミノ酸２１１で始まる）。
【００２９】
このタンパク質はタイプ１膜貫通タンパク質である。細胞外ドメインは、４つの可能性のあるＮ−グリコシル化部位および３つのＣｙｓ残基を含む。グリコシル化は、Ｎ−グリカナーゼ消化によって示されるように、活性に必須ではない。細胞質領域は、３アミノ酸のみを含み、そしてＣｙｓで終結し、パルミトイル化されている。末端システインが適切にパルミトイル化されてない場合、タンパク質は分泌され得る。ＥＰＣＲの配列を変化させて、このシステインを別のアミノ酸と置換することにより、膜結合する代わりに分泌さ
れる、本質的に完全長のＥＰＣＲを作成する手段が提供される。
【００３０】
本明細書で使用される場合、レセプターをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１に示される配列、およびストリンジェントな条件下で配列番号１にハイブリダイズする、その保存的置換、付加、または欠失を有する配列を含む。本明細書で使用される場合、レセプターを構成するアミノ酸配列は、配列番号２に示される配列、および機能的に等価な生物学的活性を有するレセプターを形成する、その保存的置換、付加、または欠失を有する配列を含む。何が、保存的置換、付加、または欠失を構成し、そしてどれが、本明細書に記載の機能的アッセイを使用して機能的に等価なレセプター分子をコードまたは形成すると容易に確認され得るかは、当業者に周知である。これは、さらに、図３を参照することによって例示され、以下に議論される。
【００３１】
（選択的スプライシング）
レセプターは、特異的リガンドに結合して生理学的応答を生じることを担う細胞の、外部に曝された部分を有する、細胞膜に繋がれたタンパク質として最も頻繁に思い描かれる。多くの場合、もはや細胞に制限されないという事実にもかかわらず、頻繁にそのリガンドを確かに結合し得る、可溶性形態のレセプターが存在する。可溶性レセプターイソ形態へのリガンド結合はまた、多くの形態をとる応答を生じ得、これには、膜結合レセプター相互作用のアップモジュレーションまたはダウンモジュレーション、あるいは正常には応答性ではない細胞へリガンドを輸送することによって応答を伝達させることを含む（Ｈｅａｎｅｙ，ＭＬおよびＤＷ Ｇｏｌｄｅ． Ｓｏｌｕｂｌｅ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ． Ｂｌｏｏｄ ８７：８４７−８５７， １９９６）。
【００３２】
可溶性レセプターを産生するための２つの公知のメカニズムが存在する：膜結合レセプターをタンパク質分解して、細胞外ドメインを遊離し、そして膜アンカーを残すことによるもの、およびｍＲＮＡの選択的スプライシングによるもの（図１）。後者のメカニズムは多くの形態を取り得るが、リーディングフレームがエキソン−イントロン境界により連続し、そして膜貫通アンカーをコードする配列に達する前に停止コドンで終結する場合、最も単純である。これは、膜形態に類似するが、重要な差異を有するタンパク質を生成する。これは、可溶性タンパク質として、作製され、そして分泌され、そして特有のカルボキシル末端テイルを有する。このテイルを、膜結合レセプターの形成において無視されるイントロンｍＲＮＡ配列の一部を読むことによって形成した。選択的スプライシングによる可溶性レセプターの生成はまた、共に同じｍＲＮＡテンプレートを起源にするという事実にもかかわらず、膜結合レセプターとは独立して調整され得る（Ｈｅａｎｅｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ９２：２３６５−２３６９，１９９５）。
【００３３】
可溶性レセプターが選択的スプライシングメカニズムによって生成されることを証明するためには、ゲノム配列および関連領域のイントロン−エキソン境界を知らなければならない。生理学的応答と可溶性レセプターを関連付けて、プロテインＣ遺伝子およびプロテインＳ遺伝子の発現の間にかなり頻繁に含まれることが見られる異常なｍＲＮＡスプライシングと区別することもまた役立つ（Ｂｅｒｇら，Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇ Ｆｉｂｒｉｎｏｌ． ７：６２５−６３１，１９９６）。
【００３４】
以下の研究および結果の詳細は、実施例に記載される。ヒト血漿は、約１００ｎｇ/ｍ
ｌの可溶性ＥＰＣＲを含む（表１）。これを、２つのモノクローナル抗体（１４９４ｍＡｂおよび１４９５ｍＡｂ）および標準的技法を使用する酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。著しく上昇した可溶性ＥＰＣＲレベルを、全身性エリテマトーデスおよび敗血症の患者で見いだした。これらのレベルは、ほとんど例外なく、大血管の表面上のみに存在する膜結合レセプターについてかなり高いようであった。これを真相正
しく認識するために、トロンボモジュリン（ＴＭ）は、すべての内皮、ならびにいくつかの非血管細胞上で発現されるが、正常可溶性ＴＭレベルは、わずかに約１０〜４０ｎｇ/
ｍｌである（Ｔａｋａｎｏら，Ｂｌｏｏｄ ７６：２０２４−２０２９，１９９０）。可溶性ＴＭレベルは、狼瘡の患者で上昇していたが、敗血症では上昇していなかった。重要なことには、これらの患者群において、血漿ＥＰＣＲとＴＭレベルとの間に相関がなかったことである（それぞれ、ｒ2＝０.０２８および０.０３４）。
【００３５】
【表１】
【００３６】
ＴＭゲノム構造は、イントロンを含まず（Ｊａｃｋｍａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８４：６４２５−６４２９，１９８７）、そのため可溶性ＴＭイソ形態を生成するための唯一の方法は、膜結合レセプターのタンパク質分解による。好中球エラスターゼおよびカテプシンＧによる内皮ＴＭのタンパク質分解は、インビトロで示されており、これは、種々の疾患状態で見出される上昇した可溶性ＴＭレベルが、内皮表面で、活性化された炎症性細胞の産物によって媒介されるタンパク質分解から生じることを示唆する（Ｂｏｅｈｍｅら，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８７：１３４−１４０，１９９６、およびＡｂｅら，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ． １２３：８７４−８８１，１９９４）。
【００３７】
血漿ＥＰＣＲおよびＴＭレベルと高い血漿ＥＰＣＲ濃度との間の相関の欠如は、血漿ＥＰＣＲがタンパク質分解および選択的スプライシングの両方のメカニズムを起源にするという概念に一致する。ヒトＥＰＣＲのゲノム構造は、イントロンによって分離される、４つのエキソンを含む。この配列を概観することにより、７５２７位にＴＡＡ停止コドンを含むエキソンＩＩＩ−イントロンＩＩＩ境界（５'ＧＴで）の後のインフレームリーディ
ング配列が明らかになる。この停止コドンは、膜貫通ドメインをコードするエキソンＩＶの上流にあるので、予測されるタンパク質は、特有な４８残基のカルボキシル末端テイル（イントロン配列によってコードされる）を含み、そして膜貫通アンカーを含まない。
【００３８】
図１は、短縮型ＥＰＣＲが誘導され得る２つの可能性のある方法の図である：膜貫通ドメインの直前でのタンパク質分解によるか、または選択的スプライシングによる。図２に示されるように、選択的スプライシングは、選択的にスプライスされた短縮型ＥＰＣＲ中にあるペプチド配列が含まれることを生じる。図３に示されるように、この配列は、種間で高度に保存されるが、わずかな差が存在し、ヒトおよびウシのＥＰＣＲについては４８残基、マウスＥＰＣＲについては５１残基、そしてヒヒＥＰＣＲについては２２残基の新しいカルボキシル末端テイルを生じる。
【００３９】
（レセプタータンパク質の発現についての患者サンプルのスクリーニング）
患者サンプルは、ＥＰＣＲ、ＥＰＣＲ中の選択的にスプライスされたインサートに存在する特有のインサートのいずれかに対する抗体、またはコンホメーションの差に起因してＥＰＣＲまたはｓＥＰＣＲのいずれかに対してより大きな親和性で結合する抗体を使用して、ｓＥＰＣＲまたはＥＰＣＲの存在および量について、スクリーニングされ得る。サンプルはまた、存在するタンパク質を特異的に定量するための他の標準的技法を使用して、スクリーニングされ得る。
【００４０】
（診断的または治療的使用のための抗体の生成）
ＥＰＣＲ、および特に、可溶性ＥＰＣＲ（「ｓＥＰＣＲ」）、および組換え可溶性ＥＰＣＲ（「ｒｓＥＰＣＲ」）に対する抗体が生成され得、これらは、レセプタータンパク質の検出、特徴付け、または単離に有用であり、そしてほとんどの場合、リガンド結合の阻害によって、レセプタータンパク質活性を調節するために有用である。抗体は、免疫原として、ヒトまたは動物の精製または組換えレセプタータンパク質もしくはそのフラグメントを使用して、標準的技法によって生成される。
【００４１】
ＥＰＣＲに対するモノクローナル抗体を、Ｅｓｍｏｎら，１９９３，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２２２：３５９−３８５によって他のタンパク質について記載されたように得た。１４９４、１４９５、および１４９６ｍＡｂと呼ばれる抗体は、組換え可溶性ＥＰＣＲおよび細胞表面発現ＥＰＣＲに結合するＩｇＧ１κ抗体である。１４９４および１４９６ｍＡｂは、ＥＰＣＲへのプロテインＣおよびＡＰＣの結合をブロックし、そして細胞性ＥＰＣＲがトロンビン−トロンボモジュリン複合体によるプロテインＣ活性化を容易にする能力を阻害する。１４９５ｍＡｂは、ＥＰＣＲへのリガンド結合をブロックせず、細胞表面プロテインＣを変化させず、そして１４９４または１４８６ｍＡｂのエピトープとは異なる結合エピトープを有する。抗体は、標準的技法、例えば、放射標識、酵素標識、フルオレセインのような蛍光標識、金粒子、染料、および抗体の検出のための他の手段を使用して標識され得る。例えば、抗体は、標準的な手順を使用して、ビオチンアミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルでビオチン化され得る。抗体は、イムノアッセイにおける使用のための固体支持体、例えば、ＡｆｆｉＧｅｌ−１０TM、ニトロセルロース、またはマイクロタイターウェル、あるいは溶液相イムノアッセイにおける使用のための固体支持体に固定され得る。
【００４２】
好ましい実施態様では、ＥＰＣＲは、５０マイクロリットルの、１５ｍＭ Ｎａ2ＣＯ3、３５ｍＭ ＮａＨＣＯ3（ｐＨ９.６）中４マイクログラム/ｍｌの１４９５ｍＡｂで４
℃にて一晩コーティングしたマイクロタイタープレート（ＭａｘｉｓｏｒｐTM，ＮＵＮＣ
ＮＳ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して測定される。室温で、次いでプレートを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０.１Ｍ ＮａＣｌ、０.０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０（ｐＨ７.５）（アッセイ緩衝液）で３回洗浄し、そして０.１％（ｗｔ/ｖｏｌ）ゼラ
チンを含むアッセイ緩衝液で少なくとも１時間ブロックする。次いで、ウェルを洗浄し、５０マイクロリットルサンプルを３連のウェルに添加し、そしてプレートを１時間インキュベートする。ウェルを吸引し、アッセイ緩衝液で３回洗浄し、そして５０マイクロリットル、２マイクログラム/ｍｌのビオチン−１４９４ｍＡｂを添加する。プレートを１時
間インキュベートし、３回洗浄し、そして５０マイクロリットルの、０.２５マイクログ
ラム/ｍｌのストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ結合体（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ
）を添加し、そしてさらに１時間インキュベートする。ウェルを５回洗浄し、そしてＥＬＩＳＡ増幅キット（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）の基質および増幅試薬を、製造業者の指示に従って１５分間隔で連続して添加する。発色を０.３Ｍ Ｈ2ＳＯ4で停止し、そして終点吸
光度を、Ｖmaxマイクロプレートリーダーにて４９０ｍｍで読み取る。３連のウェルでの
標準は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０.１Ｍ ＮａＣｌ、および１ｍＭ ＥＤＴＡ、
０.１％ゼラチン（ｐＨ７．５）中の１.５〜１００ｎｇ ｒｓＥＰＣＲ/ｍｌである。標
準曲線は、１.５〜１２.５ｎｇ/ｍｌで直線であり、そしてサンプルを、直線範囲に入る
ように同じ緩衝液で希釈する。研究は、１〜２パーセントの間で、血漿が、アッセイの直線性にも標準曲線の感度にも影響を及ぼさないことを示す。健常ボランティアからの血漿サンプルを、１ｍＭ ＥＤＴＡを含むアッセイ緩衝液で最終的に２％血漿まで希釈した。そしてＥＰＣＲ抗原レベルを、同じプレート上で決定された標準曲線を参照して、３連ウェルの平均から算出する。
【００４３】
（障害）
可溶性ＥＰＣＲについてのアッセイは、本明細書で議論されるような凝固および炎症状態および障害、例えば、狼瘡のような自己免疫疾患、移植モニタリング、敗血症、ショック、子癇前症、糖尿病、心肺バイパス、不安定性アンギナ、再狭窄、血管形成（すなわち、血管疾患）、腎臓または肝臓疾患の検出および分析に有用である。例えば、ＥＰＣＲは、大血管についてのマーカー、したがって大血管に対する損傷についてのマーカーである。可溶性ＥＰＣＲの量の増加は、大血管傷害を示し、ＥＰＣＲのタンパク質分解またはｓＥＰＣＲ合成の刺激のいずれかを生じる。ＥＰＣＲ対トロンボモジュリンの比はまた、血液または尿のいずれかのサンプルに基づいて決定され得、これは微小血管対大血管の相対的な程度を示す。サイトカイン、白血球活性化マーカー、および補体因子または活性化マーカーに対するＥＰＣＲの相対量もまた、疾患状態を示すために使用され得る。
【００４４】
ＥＰＣＲは内皮細胞上に存在するので、内皮細胞損傷のマーカーとして有用である。これは、薬物の効果（毒性および効力の両方）の指標として使用され得る。例えば、狼瘡患者では、炎症性/凝固媒介性大血管傷害を効果的に最小にする薬物は、ＥＰＣＲレベルの
減少を生じる。
【００４５】
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照することによってさらに理解される。
【実施例】
【００４６】
（実施例１：ヒト血漿における機能的内皮プロテインＣレセプターの同定）
以下の略号を使用する：ｒｓＥＰＣＲ、膜貫通ドメインおよびサイトゾルテイルの代わりに挿入されたＨＰＣ４エピトープを有する組換え可溶性ＥＰＣＲ；ｍＡｂ、モノクローナル抗体；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動。
【００４７】
（方法）
材料。以下の試薬を示された供給業者から購入した：
ブタ腸粘膜ヘパリン、ジイソプロピルフルオロリン酸、ビオチンアミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ウシ血清アルブミン、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｉｓ，ＭＯ）；Ｓｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ ＰＣａ、Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ（Ｇｒｅｅｎｗｉｃｈ，ＣＴ）；ＥＬＩＳＡ増幅キット、ＧｉｂｃｏＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）；ＡｆｆｉＧｅｌ−１０、ＢｉｏＲａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）；ハンクス平衡化塩溶液、３−（Ｎ−モルホリン）プロパン硫酸（ＭＯＰＳ）、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｆａｉｒ Ｌａｗｎ，ＮＪ）。すべての他の試薬は、市販の最高品質なものであった。
【００４８】
タンパク質。ヒトプロテインＣ（Ｅｓｍｏｎら，１９９３，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２２２：３５９−３８５）、ウシトロンビン（Ｏｗｅｎら，１９７４，Ｊ．ＢＩｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２４９：５９４−６０５）、およびウシアンチトロンビン（Ｅｓｍｏｎ １９７７「Ｆａｃｔｏｒｓ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｒｏｍｂｉｎ ｂｙ ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ ＩＩＩ． Ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｔｈｒｏｍｂｉｎ」Ｒ．Ｌ．Ｌｕｎｄ
ｂｌａｄ，Ｊ．Ｗ．Ｆｅｎｔｏｎ，ＩＩ，およびＫ．Ｇ．Ｍａｎｎ編 Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ．４０３−４１１）を、記載のように精製した。組換え可溶性ＥＰＣＲ、ｒｓＥＰＣＲは、膜貫通ドメインの直前の残基２１０で短縮されたＥＰＣＲの細胞外ドメイン、続くＨＰＣ４モノクローナル抗体におけるカルシウム依存的イムノアフィニティー精製を可能にする１２残基配列からなる（Ｔａｋａｈａｓｈｉら，１９９２；Ｓｔｅａｒｎｓら，１９８８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６３：８２６−８３２）。ｒｓＥＰＣＲの構築、精製、およびプロテインＣ/ＡＰＣ結合特性（Ｆｕ
ｋｕｄｏｍｅら，１９９６）。ヤギ免疫前血清およびｒｓＥＰＣＲに対するヤギポリクローナル抗血清を調製し、そしてＩｇＧを精製した（Ｆｕｋｕｄｏｍｅら，１９９６）。ヤギ抗ｒｓＥＰＣＲポリクローナル抗体を、標準的手順を使用して、ビオチンアミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルでビオチン化した。
【００４９】
モノクローナル抗体。ｒｓＥＰＣＲに対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を、他のタンパク質について記載されたように得た（Ｅｓｍｏｎら，１９９３）。１４９４、１４９５、および１４９６ｍＡｂは、ｒｓＥＰＣＲおよび細胞表面発現ＥＰＣＲに結合するＩｇＧ１κ抗体である。１４９４および１４９６ｍＡｂは、ＥＰＣＲへのプロテインＣおよびＡＰＣの結合をブロックし、そして細胞性ＥＰＣＲがトロンビン−トロンボモジュリン複合体によるプロテインＣ活性化を容易にする能力を阻害する（Ｓｔｅａｒｎｓ−Ｋｕｒｏｓａｗａら，１９９６）。１４９５ｍＡｂは、ＥＰＣＲへのリガンド結合をブロックせず、細胞表面プロテインＣ活性化を変化させず、そして１４９４または１４９６ｍＡｂのエピトープとは異なる結合エピトープを有する。１４９４および１４９５ｍＡｂを、標準的手順を使用して、ビオチンアミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルでビオチン化した。１４９４ｍＡｂを、血漿ＥＰＣＲのイムノアフィニティー精製のために、製造業者の指示に従って、ＡｆｆｉＧｅｌ−１０にカップリングした。抗ＥＰＣＲ ｍＡｂのスクリーニングを、Ｓｔｅａｒｎｓ−Ｋｕｒｏｓａｗａら（１９９６）；Ｆｕｋｕｄｏｍｅら（１９９６）に記載の方法を使用して行った。
【００５０】
凝血アッセイ。１段階第Ｘａ因子凝血アッセイにおけるＡＰＣ（２５ｎＭ）抗凝固活性に対するｒｓＥＰＣＲまたは精製血漿ＥＰＣＲの効果を、８３μｇ/ｍｌの１４９６ｍＡ
ｂ（ＡＰＣ−ＥＰＣＲ相互作用をブロックする抗体）の存在または非存在下で行った（Ｒｅｇａｎら，１９９６）。可溶性ＥＰＣＲおよび１４９６ｍＡｂを、アッセイ前１５分間プレインキュベートした。
【００５１】
細胞培養。すべてのヒト細胞株を、以前に記載されたように維持した（Ｆｕｋｕｄｏｍｅら，１９９６）。ＥＡ.ｈｙ９２６細胞（形質転換されたヒト内皮細胞株；Ｅｄｇｅｌ
ｌら，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８０：３７３４−３７３７）は、Ｃｏｒａ−Ｊｅａｎ Ｅｄｇｅｌｌ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ ａｔ Ｃｈａｐｅｌ Ｈｉｌｌ）が好意により提供した。
【００５２】
フローサイトメトリー分析。蛍光プローブとして用いるために、ＡＰＣを、記載されるように（ＦｕｋｕｄｏｍｅおよびＥｓｍｏｎ、１９９４；Ｂｏｃｋ，Ｐ．Ｅ．１９８８．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７：６６３３−６６３９）、フルオレセインで活性部位（ｆｌ−ＡＰＣ）において標識した。ＥＡ.ｈｙ９２６細胞へのＡＰＣ結合に対するｒｓＥ
ＰＣＲまたは血漿ＥＰＣＲの効果を、フローサイトメトリーによって研究した（Ｆｕｋｕｄｏｍｅら、１９９６）。手短には、収集された細胞を、漸増する濃度のいずれかの可溶性ＥＰＣＲ調製物の非存在下または存在下において、６０ｎＭのｆｌ−ＡＰＣとともに、氷上で３０分間インキュベートし、洗浄し、そして細胞に結合した蛍光を、フローサイトメトリーによって１サンプルごとに１０,０００事象を計数して測定した。全てのアッセ
イを、１％のウシ血清アルブミン、３ｍＭ ＣａＣｌ2、０.６ｍＭ ＭｇＣｌ2、および
０.０２％アジ化ナトリウムを補充したハンクス平衡化塩溶液において行った。
【００５３】
細胞表面プロテインＣ活性化。ＥＡ.ｈｙ９２６細胞を９６ウェル組織培養ディッシュ
において培養した（Ｓｔｅａｒｎｓ−Ｋｕｒｏｓａｗａら、１９９６）。コンフルエントな単層を、１％（ｗ/ｖ）のウシ血清アルブミン、３ｍＭ ＣａＣｌ2、０.６ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ2、および０.０２％アジ化ナトリウムを補充したハンクス平衡化塩溶液を用いて、３回洗浄した。全てのアッセイを、室温において、同一の緩衝液中で、６０μｌの最終容量にて行った。そして、全てのタンパク質濃度は、アッセイにおける最終濃度を示す。プロテインＣ（０.１μＭ）を、示された濃度のｒｓＥＰＣＲ、血漿ＥＰＣＲ、または１４９
４ｍＡｂの非存在下または存在下で添加し、細胞とともに１５分間プレインキュベートした。トロンビンを混合液に添加して（２ｎＭ）、活性化反応を開始した。示された時間に、５０μｌのアリコートを取り出し、そして９６ウェルマイクロタイタープレート中の１０μｌのアンチトロンビン（０.７μＭ最終）およびヘパリン（５Ｕ/ｍｌ最終）に添加した。ＡＰＣアミド分解活性をＳｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ ＰＣａ基質（０.２ｍＭ）の添加
によって測定し、４０５ｎｍでの吸光度の変化速度（ｍＯＤ/分）をＶｍａｘキネティッ
クマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）で測定した。すべてのアッセイ点は、３連ウェルにおいて行われ、そして十分に活性化されたプロテインＣ対ｍＯＤ/分の標準曲線を参照することにより決定される
場合、プロテインＣ基質の１０％未満が活性化された。
【００５４】
血漿および血清の収集。健常な成人ボランティア（女性１２人および男性１０人）から、３.８％緩衝化クエン酸溶液中かまたは抗凝固剤を含まないチューブ中に、静脈穿刺に
よって全血を収集した（Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ ｔｕｂｅ；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）。年齢、食餌、または他の変数に関するドナーのスクリーニングは試みなかった。全てのボランティアに研究についての情報を開示し、彼らから書面による同意を得た。血液を、１１６０×ｇで１０分間遠心分離した。血漿および血清を等分し、アッセイまで−８０℃で冷凍保存した。
【００５５】
血漿ＥＰＣＲの定量のためのＥＬＩＳＡ。血漿におけるＥＰＣＲ抗原の検出のための酵素結合免疫吸着アッセイを開発した。マイクロタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ；Ｎｕｎｃ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を、５０μｌの、１５ｍＭ Ｎａ2ＣＯ3、３５ｍＭ ＮａＨＣＯ3（ｐＨ９．６）中４μｇ/ｍｌの１４９５ｍＡｂを用いて、４℃にて一晩コートした。以下の工程を室温で行った。ウェルを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０.１Ｍ ＮａＣｌ、０.０５％ Ｔｗｅｅｎ２０（ｐＨ７.５）（アッセイ緩衝液）で
３回洗浄し、０.１％（ｗ/ｖ）ゼラチンを含有するアッセイ緩衝液で少なくとも１時間ブロックした。ウェルを洗浄し、５０μｌのサンプルを３連のウェルに添加し、そしてプレートを１時間インキュベートした。ウェルを吸引して、アッセイ緩衝液で３回洗浄し、５０μｌの２μｇ/ｍｌビオチン−１４９４ｍＡｂを添加した。プレートを１時間インキュ
ベートし、３回洗浄し、５０μｌの０.２５μｇ/ｍｌストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ結合体（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を添加し、さらに１時間インキュベートした。ウェルを５回洗浄し、ＥＬＩＳＡ増幅キット（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）の基質および増幅試薬を、製造業者の指示に従い、１５分の間隔で連続的に添加した。発色を０.３Ｍ Ｈ2ＳＯ4
を用いて停止し、４９０ｎｍの終点吸光度をＶｍａｘマイクロプレートリーダーで読み取った。各プレートは、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０.１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ、０.１％ゼラチン（ｐＨ７.５）中１.５〜１００ｎｇ/ｍｌのｒｓＥＰＣＲの標準を３連のウェルに含んだ。標準曲線は、１.５〜１２.５ｎｇ/ｍｌで直線であり（ｒ＝０.９９）、そして血漿サンプルを直線範囲に入るように同じ緩衝液で希釈した。予備的な実験により、再終濃度１〜２％のヒト血漿は、標準曲線の直線性にも感度にも影響しないことを実証した。健常ボランティア由来の血漿サンプルを、１ｍＭＥＤＴＡを含有するアッセイ緩衝液で、最終的に２％血漿に希釈し、そしてＥＰＣＲ抗原レベルを、同一プレート上で決定された標準曲線を参照して、３連ウェルの平均から算出した。
【００５６】
コーティング抗体と検出抗体を逆にし（１４９４ｍＡｂをコーティングに；ビオチン−１４９５ｍＡｂを検出に）、そして抗体結合を、Ｂｌｕｅ Ｐｈｏｓ基質（ＫＰＬ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）で検出する、別のアッセイを開発した。この方法を使用して、敗血症患者における血漿ＥＰＣＲをアッセイした。このアッセイは、おそらく親和性の差異のために、より高感度であったが、両アッセイとも、定性的には、同様の結果を与えた。
【００５７】
ウエスタンブロット。血漿または血清サンプルのドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を、１０％アクリルアミドゲルを、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液系（Ｎａｔｕｒｅ ２２７：６８０−６８５）と共に用いて、非還元条件下で標準的な手順を用いて行った。ゲルをポリビニリデン膜（ＰＶＤＦ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に転写し、膜をブロックし、次に免疫前ヤギＩｇＧ（５０μｇ/ｍｌ）か、またはヤギ抗ｒｓＥＰＣＲポリクローナルＩｇＧ（５０μｇ/ｍｌ）のいずれかと３０分間インキュベートした。洗浄後、膜を１：２０,０００希釈のマウス抗ヤギＩ
ｇＧ−西洋わさびペルオキシダーゼ結合体（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）と３０分間インキュベートした。膜を洗浄し、結合した抗体−酵素結合体を増強化学発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ）で製造業者の指示に従って検出した。
【００５８】
免疫吸着。健常ボランティアからの血清またはクエン酸処理血漿サンプル（４００μｌ）を、ＡｆｆｉＧｅｌ−１０に結合させた５０μｌの１４９５ｍＡｂ（５ｍｇ ＩｇＧ/
ｍｌ樹脂）とともに、混合しながら４℃にて一晩インキュベートした。サンプルを遠心分離し、上清を除去し、そして樹脂を１ｍｌの２０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０.１Ｍ ＮａＣｌ、０.０２％アジ化ナトリウム（ｐＨ７.５）で
３回洗浄した。最終２０ｍＭ ジチオスレイトールを含有するＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液を、洗浄した樹脂に添加し、サンプルを３分間沸騰し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングのために処理した。膜を４μｇ/ｍｌのビオチン化ヤギ抗
ｒｓＥＰＣＲポリクローナル抗体でプローブし、そして結合抗体をストレプトアビジン−西洋わさびペルオキシダーゼ結合体（Ｐｉｅｒｃｅ）および増強化学発光検出系で検出した。予備的実験により、室温にて１〜４時間の、１００μｌのＴｒｉｓ不活化ＡｆｆｉＧｅｌ−１０樹脂でのサンプルの事前吸着、続く１４９５ｍＡｂ−ＡｆｆｉＧｅｌ−１０での一晩の免疫吸着が、同一のウエスタンブロットの結果を与えることが決定された。
【００５９】
血漿ＥＰＣＲの精製。血漿ＥＰＣＲを、イオン交換クロマトグラフィー、抗ｒｓＥＰＣＲ ｍＡｂイムノアフィニティークロマトグラフィー、およびプロテインＣ親和性カラムでのクロマトグラフィーの組み合わせを用いて、ヒトクエン酸処理血漿（Ｏｋｌａｈｏｍａ Ｂｌｏｏｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）から精製した。わずかに異なる方法で２つの調製を行った。
【００６０】
第１の調製において、血漿（１Ｌ）を等量の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.５
）、１０ｍＭ ベンズアミド、４００単位のヘパリンナトリウムで希釈し、そして１ｇの膨潤前のＱＡＥ樹脂でバッチ吸着した。沈澱後、樹脂をプロテインＣの精製のために処理した（Ｅｓｍｏｎら、１９９３）。固体硫酸アンモニウムを上清に４℃にて４０％飽和まで添加し、遠心分離し、そしてさらなる硫酸アンモニウムをその上清に７０％飽和に達するまで添加した。遠心分離後、柔らかなペレットを透析バッグに入れ、１２Ｌの２０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０.０２％アジ化ナトリウム（ｐＨ７.４）に対し一晩透析した。透析物を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０.１Ｍ ＮａＣｌ、０.０２％アジ化ナトリウム（ｐＨ７.４）で平衡化した、１４９６ｍＡｂ−ＡｆｆｉＧｅｌ−１０イムノアフィニテ
ィーカラム（６ｍｌ樹脂；５ｍｇ ＩｇＧ/ｍｌ樹脂）にかけた。カラムを、１２ｍｌを
超える同じ緩衝液で洗浄し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.４）中の５０％（ｖ/
ｖ）エチレングリコールで溶出した（Ｊｕｎ Ｘｕ、未発表の観察）。溶出物からのピーク画分をプールし（０.３７の全ＯＤ280）、濃縮し（Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ３０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、そして緩衝液を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０.１Ｍ ＮａＣｌ、３
ｍＭ ＣａＣｌ2、０.６ｍＭＭｇＣｌ2、０.０２％アジ化ナトリウム（ｐＨ７.４）に交
換した。この物質をプロテインＣアフィニティーカラムにかけた。このカラムは、同じ緩衝液においてＨＰＣ４−ＡｆｆｉＧｅｌ−１０カラム（５ｍｇ ＩｇＧ/ｍｌ樹脂；０.９×８ｃｍ）に精製プロテインＣ（３ｍｇ）をかけることにより事前に調製した。ＨＰＣ４ｍＡｂは、カルシウム依存的様式でプロテインＣ活性化領域に結合し（Ｅｓｍｏｎら、１９９３；Ｓｔｅａｒｎｓら、１９８８）、その後のプロテインＣへのＥＰＣＲの結合を妨げない。血漿ＥＰＣＲを含有するサンプルをカラムにかけた後、カラムを約１２ｍｌの緩衝液で洗浄し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０.１Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、
１０ｍＭ ＭＯＰＳ、０.０２％アジ化ナトリウム（ｐＨ７.５）で溶出した。画分を、２８０ｎｍでの吸光度について、そして上記のＥＬＩＳＡを用いてＥＰＣＲ抗原についてモニターした。プロテインＣおよび血漿ＥＰＣＲの両方を含有する溶出物を、ＦＰＬＣ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）ＭｏｎｏＱカラムにかけ、カラムを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）中の０.１〜１Ｍ ＮａＣｌの直線勾配で展開した。約半分の血漿ＥＰＣＲは、ＭｏｎｏＱカラムに結合せず、半分は、約０.
２Ｍ ＮａＣｌに溶出し、そしてプロテインＣは、約０.５Ｍ ＮａＣｌに溶出した。血
漿ＥＰＣＲの両方のイオン種は、還元条件下または非還元条件下での銀染色、クマシーＢＢ染色、またはＰＶＤＦ膜への転写後の金染色（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびビオチン−ポリクローナル抗ｒｓＥＰＣＲ抗体プローブでのウエスタンブロットで、同一のようであった。
【００６１】
血漿ＥＰＣＲの第２の調製は、４Lの血漿を用いて開始し、機能研究に十分なタンパク
質を精製した。この場合、１４９６−ＡｆｆｉＧｅｌ−１０樹脂（２０ｍｌの５ｍｇ ＩｇＧ/ｍｌ樹脂）を、１０ｍＭベンズアミジン、１ｍＭジイソプロピルフルオロホスフェ
ートおよび０.５単位/ｍｌのヘパリンナトリウム（最終濃度）と共に、クエン酸処理血漿に、直接添加した。血漿を、穏やかに混合しながら、４℃にて一晩バッチ吸着した。樹脂の沈澱後、上清をプロテインＣ精製のために処理した（Ｅｓｍｏｎら、１９９３）。樹脂を２.５×３０ｃｍのカラムに充填し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０.１Ｍ ＮａＣｌ、０.０２％アジ化ナトリウム（ｐＨ７．４）で、十分に洗浄し、そして２０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.４）中５０％のエチレングリコールで溶出した。溶出物をプール
し、濃縮し（５.５の全ＯＤ280）、ＭｏｎｏＱカラムにかけ、２つのイオン種（素通り、および０.２Ｍ ＮａＣｌ溶出ピーク）を、１４９６−ＡｆｆｉＧｅｌ−１０樹脂（１.５×１１ｃｍ）に再びかけた。カラムを前のとおりに、５０％エチレングリコールで溶出した。溶出物（０.７１ ＯＤ）を濃縮し、緩衝液を、Ｃｅｔｒｉｐｒｅｐ３０を含む、２
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０.１ＭＮａＣｌ、３ｍＭ ＣａＣｌ2、０.６ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2、０.０２％アジ化ナトリウムに交換した。次に、この物質をアフィニティーカラムにかけた。ここで、プロテインＣ（２.９ｍｇ）を、同じ緩衝液中で、ＨＰＣ２−Ａｆｆｉ
Ｇｅｌ−１０カラム（０.６×１７ｃｍ）に最初にかけた。ＨＰＣ２ｍＡｂは、プロテイ
ンＣのセリンプロテアーゼドメインに結合し、ＥＰＣＲ結合を妨げない（Ｆｕｋｕｄｏｍｅら、１９９６）。結合したＥＰＣＲを、５ｍＭ ＥＤＴＡを含有する緩衝液で溶出した。混入している血清アミロイドＰ（プロテインＣサンプル由来）を、ＦＰＬＣ ＭｏｎｏＱカラムでのイオン交換クロマトグラフィーによって除去した。サンプルを０.２Ｍ Ｎ
ａＣｌ中でカラムにかけ、その結果、血漿ＥＰＣＲは結合せず、そして０.４〜０.５Ｍ ＮａＣｌにおいて溶出する混入物から分離された。得られる精製血漿ＥＰＣＲ（０.１９
３ ＯＤ280）は、銀染色を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびポリクローナル抗ｒｓＥＰ
ＣＲを用いるウエスタンブロットにより、均質のようであった。この物質を機能研究およびアミノ末端配列分析に使用した。
【００６２】
タンパク質配列決定。可溶性血漿ＥＰＣＲのアミノ末端配列分析を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆａｃｉｌｉｔｙ、Ｗ．Ｋ．Ｗａｒｒｅｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｏｋｌａｈｏｍａ Ｃｉｔｙ）のＫｅｎｎｅｔｈ Ｊａｃｋｓｏｎ博士の研究室において行った。アミノ酸を標準の１文字コードによって表す。
【００６３】
（結果）
第１のアプローチとして、３人の健常ボランティア由来の血漿および血清サンプルを希釈し（４％ｖ/ｖ）、非還元条件下で１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動し、そしてｒｓ
ＥＰＣＲに対して惹起したヤギポリクローナル抗体を用いるウエスタンブロットのために処理した。健常ボランティア由来の血漿および血清サンプル（４％ｖ/ｖ）を非還元条件
下の１０％ゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥのために処理し、膜に転写し、そして膜をヤギ抗ｒｓＥＰＣＲポリクローナル抗体でプローブした。結果をｒｓＥＰＣＲ（０.２ｎｇ）と比
較した。結合した抗体を、マウス抗ヤギＩｇＧおよび増強化学発光検出系で検出した。２人の健常ボランティア由来の血漿サンプルを１４９５ ＡｆｆｉＧｅｌ−１０樹脂で免疫吸着した。洗浄した樹脂を溶出させ、そして還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥのために処理した。ウエスタンブロッティングを、ビオチン−ヤギ抗ｒｓＥＰＣＲをプローブとして使用して行った。
【００６４】
血漿ＥＰＣＲの純度を、銀染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ １０％ゲル、およびビオチン−ヤギ抗ｒｓＥＰＣＲでプローブした膜のウエスタンブロットから決定した（還元および非還元）。膜をポリクローナル抗体でプローブした後、血清および血漿サンプルの両方で、約４３,０００Ｄａの単一のバンドが現れる。検出されたタンパク質のサイズは、ｒｓＥ
ＰＣＲよりわずかに大きいようである。検出された他のバンドは、免疫前ＩｇＧおよびより長い暴露時間でのプロービングより判断すると、ＩｇＧのバックグラウンド結合であった。ＡｆｆｉＧｅｌ−１０樹脂と結合した抗ＥＰＣＲ １４９５ｍＡｂと共に血漿サンプルを一晩インキュベートすること、続く洗浄および還元条件下での結合抗原の溶出は、ビオチン−ヤギ抗ｒｓＥＰＣＲポリクローナル抗体でのウエスタンブロットにより検出される単一バンドを生じた。
【００６５】
ｍＡｂ １４９５をコーティング抗体として使用するＥＬＩＳＡによる、健常ボランティア由来の血漿における可溶性ＥＰＣＲ抗原の測定は、女性（ｎ＝１２）では９１.１＋/−２４.５ｎｇ/ｍｌの抗原レベル、そして男性（ｎ＝１０）では１０７.２＋/−３０.２
ｎｇ/ｍｌの抗原レベルを見出した。ともに計算する場合、平均血漿ＥＰＣＲ抗原レベル
は、９８.４＋/−２７.８ｎｇ/ｍｌであった。男性の値は、トロンボモジュリンと同様に（Ｑｕｅｈｅｎｂｅｒｇｅｒら、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ． ７６：７９２−７３４）、女性の値よりわずかに高いようであるが、研究した集団は、統計学的分析にはあまりに限定されており、そしてこの研究は、性別、年齢、食餌または他の変数に起因する差異を評価するためには設計されていなかった。
【００６６】
血漿ＥＰＣＲは、約１００ｎｇ/ｍｌの単一種であるようであるので、血漿ＥＰＣＲは
、循環ＥＰＣＲが、プロテインＣおよびＡＰＣに結合し得るか否かを決定するために重要になった。可溶性ＥＰＣＲを、イオン交換クロマトグラフィー、硫酸アンモニウムでの沈降、および実験手順において記載されるような抗ＥＰＣＲ １４９６ｍＡｂ−ＡｆｆｉＧｅｌ−１０カラムクロマトグラフィーによる免疫吸着の組み合わせによって、ヒト血漿から精製した。
【００６７】
３ｍＭ ＣａＣｌ2、０.６ｍＭ ＭｇＣｌ2を含む緩衝液中で抗プロテインＣＨＰＣ４
ｍＡｂ−ＡｆｆｉＧｅｌ−１０カラムにプロテインＣ（３ｍｇ）を適用することによって調製したプロテインＣアフィニティーカラムに、この血漿ＥＰＣＲ（約１１０μｇ）を適
用した。カラムを洗浄し、そして血漿ＥＰＣＲを画分１９に適用した。カラムを洗浄し、そして画分３５で開始する５ｍＭ ＥＤＴＡを含む緩衝液で溶出した。それらの画分について、２８０ｎｍでの吸光度およびＥＰＣＲ抗原を決定した。ＥＰＣＲ抗原を、ＥＬＩＳＡによって決定した。
【００６８】
適用した血漿ＥＰＣＲ抗原の９８％以上が、プロテインＣアフィニティーカラムに結合した。吸光度プロフィールは、この抗体へのプロテインＣ結合のカルシウム依存性と一致して、抗体カラムからのＥＰＣＲおよびプロテインＣの同時溶出を示す（Ｓｔｅａｒｎｓら、１９８８）。
【００６９】
機能研究および構造研究のために十分なタンパク質を精製するために、類似しているがわずかに改変した手順を用いて、４Ｌの血漿からＥＰＣＲを精製した。プロテインＣ−抗体アフィニティーカラムからの溶出後、タンパク質を夾雑する残渣を、ＦＰＬＣ Ｍｏｎｏ Ｑカラムでのイオン交換クロマトグラフィーによって取り出した。得られた血漿ＥＰＣＲの調製物は、銀染色を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥ １０％ゲルで均質のようであり、そして同一の結果が、ビオチン−ヤギ抗ｒｓＥＰＣＲポリクローナル抗体でプローブしたウェスタンブロットに関して、還元条件下および非還元条件下の両方で得られた。精製されたタンパク質のアミノ末端配列分析は、唯一の配列Ｓ−Ｑ−Ｄ−Ａ−Ｓ−Ｄ（この配列は、組換え可溶性ＥＰＣＲのアミノ末端配列に同一である：配列番号２）を生じた。これは、天然の供給源からのＥＰＣＲの最初のアミノ末端配列決定である。
【００７０】
血漿ＥＰＣＲの、ＡＰＣに結合する能力を、競合研究によって評価した。この競合研究において、血漿ＥＰＣＲを、ＡＰＣについて細胞性ＥＰＣＲと競合させ、そして細胞性ＥＰＣＲに結合し得る得られた遊離のＡＰＣを、フローサイトメトリーによって評価した（図４ａ）。活性部位においてフルオレセインで標識したＡＰＣ（ｆｌ−ＡＰＣ）を、血漿ＥＰＣＲまたはｒｓＥＰＣＲのいずれかの、存在下または非存在下で、ＥＡ.ｈｙ９２６
細胞とともにインキュベートした。細胞へのＡＰＣ結合の阻害についてのＥＰＣＲ濃度依存性は、ＥＰＣＲの両方の可溶性形態について類似であった。この観察は、ＡＰＣに結合することについての血漿ＥＰＣＲの親和力が、ｒｓＥＰＣＲ−ＡＰＣ結合相互作用について以前に決定された親和力（Ｋｄapp約３０ｎＭ）に類似することを示す。
【００７１】
ｒｓＥＰＣＲは、可溶性系においてプロテインＣ活性化に対してほとんど効果を有さないが（Ｒｅｇａｎら、１９９６）、膜結合ＥＰＣＲは、細胞表面上での活性化を促進する、非常に強力な能力を有する（Ｓｔｅａｒｎｓ−Ｋｕｒｏｓａｗａら、１９９６）。プロテインＣおよびＡＰＣに結合し得るＥＰＣＲの循環形態の存在を示す最新のデータは、血漿ＥＰＣＲが、プロテインＣの細胞表面活性化を変更する能力を有することを示唆した。ＥＡ.ｈｙ９２６細胞上でのほぼ生理学的レベルのプロテインＣ（０.１μＭ）のトロンビン依存性活性化は、過剰なｒｓＥＰＣＲによって、図４ｂによって示されるように、ほぼ、ＥＰＣＲ−プロテインＣ結合相互作用をブロックする抗ｒｓＥＰＣＲ １４９４ｍＡｂを用いて観察されたプロテインＣのレベルにまで阻害された。以前の研究は、ｒｓＥＰＣＲが小さな合成基質を使用するＡＰＣアミド分解活性（ａｍｉｄｏｌｙｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙ）に対する効果を有さないことを実証した（Ｒｅｇａｎら、１９９６）。血漿ＥＰＣＲは、図４ｃに示されるように、ｒｓＥＰＣＲと比較してＥＡ.ｈｙ９２６細胞上の細
胞表面プロテインＣ活性化を阻害する能力においてわずかにより有効であった。
【００７２】
１段Ｘａ因子凝固アッセイにおいて、精製された血漿および可溶性組換えＥＰＣＲは、同様に凝固時間のＡＰＣ延長を阻害した（図４ｄ）。ｒｓＥＰＣＲによるＡＰＣ抗凝固活性の阻害が、以前に観察されている（Ｒｅｇａｎら、１９９６）。予測されるように、１４９６ｍＡｂは、ＡＰＣ−血漿ＥＰＣＲ結合相互作用をブロックすることによって、この効果を逆転した。
【００７３】
（実施例２：尿における可溶性ＥＰＣＲの検出）
可溶性ＥＰＣＲが尿中に存在するかどうかという疑問を検討するために、４つの尿サンプル（朝一番の排尿）を回収し、そしてウェスタンブロッティングおよびＥＬＩＳＡによって可溶性ＥＰＣＲの存在について分析した。
【００７４】
希釈していない小児の尿サンプルを、４％の正常な血漿および組換え可溶性ＥＰＣＲ（１ｎｇ）と比較した。サンプルを、ビオチン−ヤギ−抗ｒｓＥＰＣＲおよびストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ検出系とともにインキュベートした。
【００７５】
ウェスタンブロットは、ａ）可溶性ＥＰＣＲが尿中に存在すること、およびｂ）可溶性ＥＰＣＲ抗原が、血漿中で観察されるサイズと類似のサイズで存在することを示す。明らかな分解は観察されない。ＥＬＩＳＡによって定量される、４つのサンプル中の可溶性ＥＰＣＲの量は、４０.３、６.１、３５.６、および９０.１ｎｇ/ｍｌであった。
【００７６】
（実施例３：狼瘡患者由来の血漿ＥＰＣＲの測定）
正常なヒト血漿ＥＰＣＲ濃度は、上記のように約１００ｎｇ/ｍｌ（９８.４±２７.８
ｎｇ/ｍｌ；２.５ｎＭ）である。エリテマトーデスに罹患した患者由来のサンプルのパネル（ｎ＝５４）をアッセイし、そして可溶性ＥＰＣＲレベルが、検出不能レベルから１,
７００ｎｇ/ｍｌ以上までの範囲であることを見出した。１５人の患者は、２００ｎｇ/ｍｌ以上の可溶性ＥＰＣＲレベルを有した。
【００７７】
以前の研究は、内皮損傷に起因する、狼瘡患者における上昇した可溶性血漿ＴＭレベルを示し、そして最新の狼瘡患者サンプルを、参照として血漿ＴＭについてアッセイした。それらの可溶性ＴＭレベルが、図５によって示されるように、それらの可溶性ＥＰＣＲレベルと完全に相関を有さないことが見出された。このことは、可溶性血漿ＥＰＣＲの供給源が、単に、ランダムに損傷を受けた内皮由来ではないことを示唆する重要な観察である。ＴＭとは対照的に、ヒトおよび霊長類における膜結合ＥＰＣＲ発現は大きな脈管の内皮に主に制限され、毛細管はほとんどＥＰＣＲを発現しない。ＥＰＣＲの特有の局在化は、大きな脈管の血栓症を予防するために、局所的にプロテインＣ活性化を増大すると予測される。大きな脈管への膜結合ＥＰＣＲの主な局在化は、可溶性血漿ＥＰＣＲ濃度によって予測され得る大きな脈管における標的化された血栓症の危険を示す。
【００７８】
（実施例４：敗血症性ショック患者における血漿可溶性ＥＰＣＲ）
敗血症（ａｃｃｐ/ｓｃｃｍ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，ｃｈｅｓ
ｔ １９９２；１０１：１６４４−１６５５）は、以下の臨床的発現のうちの１つより多くを含むが、それらに限定されない、感染に対する全身性炎症応答として定義される：
１）３８℃以上または３６℃未満の体温；
２）１分あたり９０拍以上の心拍数；
３）以下によって示される頻呼吸：
ａ）１分あたり２０呼吸以上の呼吸率；
ｂ）３２ｍｍＨｇ未満のＰａＣＯ2の過度呼吸；
４）１２,０００/ｍｍ3以上もしくは４,０００/ｍｍ3未満のＷＢＣカウント、または１０％以上の未熟好中球（バンド）の存在。
【００７９】
サンプルを、器官機能不全、低灌流（ｈｙｐｏｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）、または低血圧と関連する敗血症によって規定されるような、重篤な敗血症を伴うか、または伴わない、手術後の合併症を有する患者から得た。灌流異常は、乳酸アシドーシス、尿量過少、または精神状態における急性変化を含み得る。敗血症性ショックは、十分な流体（ｆｌｕｉｄ）蘇生、および心臓性ショックの非存在にもかかわらず、２４時間以上の間、血管作用薬を
必要とする低血圧を伴う敗血症をいう。
【００８０】
本研究において含まれるすべての患者は、以下の診断基準を満たした：
ａ）呼吸の支持（２４時間以上の制御された換気）およびまたは血流力学的支持（５マイクログラム/Ｋｇ/分以上の強心薬、ドパミン、もしくはドブタミン、および/または血
管作用性アミン、エピネフリン、もしくはノルエピネフリンの要求）を必要とする、敗血症および/または手術後の合併症に起因する、集中治療室への入室；
ｂ）１８歳〜７５歳の間の年齢；
ｃ）７０％未満の抗トロンビン活性（局所にて試験される）。
患者が、多くの外傷、肝硬変、または急性肝不全、末期ガン、免疫不全、白血病、妊娠、またはヘパリン治療を有する場合、その患者を除外した。
【００８１】
患者の血液サンプルを、時間０（集中治療室ＩＣＵへの入室）の時点および抗トロンビンＩＩ（ＡＴＩＩＩ）または偽薬での処置後２日目および６日目に採取した。血漿可溶性ＥＰＣＲおよび可溶性トロンボモジュリン（ＴＭ）を、時間０のサンプルに関してのみアッセイした。
ｓＥＰＣＲ：
正常：１３３.４±５３.４ｎｇ/ｍｌ（平均±標準偏差）
敗血症：２２４.９±７４.５ｎｇ/ｍｌ
平均間の有意な差あり、Ｐ＝０.００００９
ｓＴＭ：
正常：３５.５±２０.４ｎｇ/ｍｌ（平均±標準偏差）
敗血症：３９.９±７３.１ｎｇ/ｍｌ
平均間の有意な差なし、Ｐ＝０.８１
血漿中のｓＥＰＣＲレベルとｓＴＭレベルとの相関関係なし、ｒ2＝０.３４。
【００８２】
これらの結果を、図６にグラフで示す。狼瘡患者と同様に、敗血症に罹患した患者は、可溶性ＴＭレベルと相関せず、血漿ＥＰＣＲレベルにおいて非常に顕著な上昇を示す。
【００８３】
可溶性血漿ＥＰＣＲが、プロテインＣ活性化および活性化したプロテインＣ抗凝固活性の両方を阻害するという観察によって、これらの患者における上昇した血漿ＥＰＣＲレベルが、さらなる血栓の危険性を引き起こし、そして脈管損傷/応答の証拠を表すことが示
される。これらが示す状態の例は、内皮細胞刺激、アテローム発生、白血球接着、およびプラークの破裂に関連する障害を含む。
【００８４】
（実施例５：ヒヒ組織およびヒト組織におけるＥＰＣＲの選択的スプライシング形態の同定）
可溶性ＥＰＣＲイソ型が、選択的スプライシング機構によって生成され得るか否かを決定するための最初のアプローチとして、ＲＮＡを、ヒト組織およびヒヒ組織から単離し、そして逆転写酵素−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を遺伝子特異的プライマーを用いて実施した。ヒヒＥＰＣＲゲノム配列は公知ではないが、ヒヒとヒトとは進化のスケールにおいて密接に関連しているという論理に基づいて、ヒト配列に基づくプライマーを使用した。
【００８５】
一般にＲＴ−ＰＣＲ手順において、総ＲＮＡをホモジナイズした組織から単離する。ＲＮＡを、特定のアンチセンスプライマー、ヌクレオチド、および逆転写酵素と混合する。混合において、ＲＮＡは、逆転写酵素についての鋳型として作用し、第１鎖ｃＤＮＡを作製する。次いで、この新しいｃＤＮＡ鋳型を、特定のプライマーおよびＴａｑポリメラーゼを用いて従来のＰＣＲによって増幅する。ＥＰＣＲの膜形態（４２４ｂｐ）および推定の選択的スプライシング産物（６７４ｂｐ）の両方を増幅するプライマーを選択した。ＥＰＣＲの両方の形態に対応する産物を、種々のヒヒ組織（図４）ならびにヒトの肺および
胎盤から増幅した。逆転写酵素を含まないコントロール、および組織との反応における１,８８５ｂｐのバンドの欠失によって判断されるように、ゲノムＤＮＡに関する可能性の
ある夾雑は存在しないようであった。
【００８６】
ヒヒゲノムＤＮＡ配列が、選択的スプライシングのための適切なエキソン−イントロン境界およびイントロン−インフレームリーディング配列を有することを確認するために、ヒヒ腎臓ゲノムＤＮＡ由来のイントロン配列を、従来のＰＣＲによって増幅した。ゲノム構造は種間で保持されるという前提を立て、そしてイントロンＩＩＩに隣接するプライマー（ヒト配列）を使用した。これは、選択的スプライシング配列を含むと考えられるイントロン（ヒト配列）である。ヒヒ腎臓組織をホモジナイズし、そしてＤＮＡを抽出した。ＤＮＡを、特定のプライマーと混合し、そして産物をＰＣＲによって増幅した。ＤＮＡ産物を精製し、そしてアガロースゲルで電気泳動した。
【００８７】
（手順の詳細）
Ａ．ＥＰＣＲ ＥＬＩＳＡ：被覆する抗体は、ＥＰＣＲのリガンド結合ドメインに結合する１４９４ｍＡｂである。検出する抗体は、ビオチン化１４９５ｍＡｂであり、これはプロテインＣ/ＡＰＣ結合をブロックせず、そして１４９４ｍＡｂと交差反応しない。検
出系は、ストレプトアジビン−アルカリホスファターゼおよびＢｌｕｅＰｈｏｓ基質（ＫＰＬ製）である。
【００８８】
Ｂ．組織のＲＴ−ＰＣＲ：組織（５０〜１００ｍｇ）をＴｒｉｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）中にホモジナイズした。ＲＮＡを含む上層を、クロロホルムで抽出し、イソプロパノールで沈殿させ、洗浄し、そしてＤＥＰＣ−水中に溶解した。ＲＮＡ（１〜５μｇ）を、適切な緩衝液中で、製造業者の指示書に従って、ヌクレオチド、ＣＲＥＡアンチセンスプライマー、および逆転写酵素と混合した（第１鎖ｃＤＮＡ合成のためのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔTM Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ，Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）。ｃＤＮＡ産物を、ＣＲＥＳおよびＣＲＥＡプライマーを用いて、従来のＰＣＲによって、３０サイクル増幅した。ｃＤＮＡ産物を、標準的な手順を用いて、クロロホルム抽出およびアルコール沈殿によって精製し、水中に溶解し、そして２％アガロースゲルで電気泳動した。ゲルを、Ｖｉｓｔｒａ Ｇｒｅｅｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で染色し、そしてリン光画像機（ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ）（ＳｔｏｒｍTM ｓｃａｎｎｅｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．）で画像化した。
【００８９】
Ｃ．ヒヒゲノムＤＮＡのＰＣＲ：ヒヒ腎臓ＤＮＡ（８２ｍｇ）を、Ｔｒｉｚｏｌ試薬中にホモジナイズした。ＤＮＡを含む下層を、抽出し、沈殿させ、そして滅菌水中に溶解した。ＤＮＡを、緩衝液、ヌクレオチド、ならびにＨＲＴ−１およびＨＲＴ−２プライマーとの混合液中で、従来のＰＣＲによって、３０サイクル増幅した。増幅したＤＮＡを、標準的な手順を用いて、抽出し、沈殿させ、滅菌水中に溶解し、そして２％アガロースゲルで電気泳動した。単一のバンド（４６５ｂｐ）を、エチジウムブロミドで可視化し、切り出し、そしてＰＣＲ産物を、製造業者の指示書（Ｑｉａｇｅｎ）に従ってスピンカラムで精製した。ＰＣＲ産物を、同じプライマーを用いて配列決定した。
【００９０】
（Ｄ．プライマー配列）
ＣＲＥＳ：５'−ＴＣＧＴＧＣＧＣＣＴＧＧＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＧＣ−３'
（エキソンＩＩの末端近くの５'センスプライマー）
ＣＲＥＡ：５'−ＣＧＣＣＧＴＣＣＡＣＣＴＧＴＧＣＡＣＡＧＧＡＡＧ−３'
（エキソンＩＶ内の３'アンチセンスプライマー）
ＨＲＴ−１：５'−ＡＧＣＡＧＣＴＣＡＡＴＧＣＣＴＡＣＡＡＣＣＧ−３'
（エキソンＩＩＩの末端近くの５'センスプライマー）
ＨＲＴ−２：５'−ＣＣＧＴＡＧＡＡＧＧＡＣＡＣＧＴＧＴＣＣＡＣＣＴＧＣＣＧＣ−
３'
（エキソンＩＶ内の３'アンチセンスプライマー）
（ヒヒ組織に関する結果）
ゲルから切り出され、精製され、そして配列決定された腎臓ゲノムＤＮＡから増幅された単一のバンドが存在した。その配列は、ヒト配列に対して９２％同一であり、そしてエキソン−イントロン境界は保存された。このイントロン配列における高レベルの類似性は重要である。なぜなら、イントロン配列は、代表的には種間において十分には保存されないからである。終止コドンを有するイントロン内のインフレームリーディング配列もまた存在し、このことは、ヒヒの選択的にスプライシングした可溶性タンパク質中の特有の２２残基のカルボキシル末端テイルを予測する。
【００９１】
推定の可溶性ＥＰＣＲイソ型が、特有のカルボキシル末端テイルを有するという観察は、イソ型特異的抗体を使用するイソ型間の区別のための構造的差異を提供する。実用モデルとしては、タンパク質分解された可溶性ＥＰＣＲの血漿レベルが内皮損傷を報告する一方で、選択的スプライシングを受けた可溶性ＥＰＣＲのレベルが刺激に対する内皮応答を報告するというものである。可溶性ＥＰＣＲイソ型の相対的血漿レベルが、特定の病理学における大きな脈管の内皮機能不全および損傷に関する情報を提供することが期待される。
【００９２】
（ヒト組織に関する結果）
ヒト組織（胎盤、肺、および舌）由来のＲＴ−ＰＣＲ産物を、ＥＰＣＲに特異的なＣＲＥＳ/ＣＲＥＡプライマーを用いて電気泳動した。手順は、ヒヒ組織について使用された
手順と同じであった。ＥＰＣＲの膜イソ型（ｍＥＰＣＲ）および選択的スプライシングを受けた可溶性ＥＰＣＲイソ型（ｓＥＰＣＲ）に対応する産物を観察した。産物は、ヒヒ組織を用いて観察された産物と本質的に同じようである。唯一の差異は、胎盤組織がさらなる産物を有するようであることである。
【００９３】
（配列表）
【００９４】
【表２】
【００９５】
【表３】
【００９６】
【表４】
【００９７】
【表５】
【００９８】
【表６】
【００９９】
【表７】
【０１００】
【表８】
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】図１は、膜結合レセプターをタンパク質分解して細胞外ドメインを遊離しそして膜アンカーを残すこと、およびｍＲＮＡの選択的スプライシングによって、ＥＰＣＲに適用されるような可溶性レセプターを産生するための２つの既知のメカニズムの概略図であり、膜結合ＥＰＣＲ（ｍＥＰＣＲ）およびタンパク質分解血漿ＥＰＣＲ（ｐＥＰＣＲ）に特有の配列、ならびに可溶性ＥＰＣＲ（ｓＥＰＣＲ）に特有の配列を示す。
【図２】図２は、ｍＥＰＣＲおよびｓＥＰＣＲを比較する概略図であり、ヌクレオチドインサートおよびｓＥＰＣＲに特有のコードされたアミノ酸配列を示す。
【図３】図３は、選択的スプライシングによってヒト、ウシ、マウス、およびヒヒのＥＰＣＲに挿入された配列を示す。
【図４】図４ａは、可溶性血漿ＥＰＣＲがヒトプロテインＣおよびＡＰＣに結合することを示すグラフである。ＥＡ.ｈｙ９２６細胞を、氷上で30分間０〜５００ｎＭｒｓＥＰＣＲ（黒丸）または血漿ＥＰＣＲ（白丸）の存在下で、６０ｎＭ ｆｌ−ＡＰＣと共にインキュベートした。細胞を洗浄し、そして細胞結合した蛍光を、記載のようにフローサイトメトリーによって決定した。ｆｌ−ＡＰＣを添加しない場合での固有の細胞蛍光を、矢印で示す。プロットした平均細胞蛍光（ＭＣＦ）は、２連のＭＣＦ測定の平均を表す。 図４ｂおよび４ｃは、可溶性血漿ＥＰＣＲおよびｒｓＥＰＣＲが、細胞表面上でプロテインＣ活性化を阻害することを示すグラフである。図４ｂでは、ＥＡ.ｈｙ９２６細胞単層を、０.１μＭプロテインＣ単独（白四角）、または１μＭ ｒｓＥＰＣＲ（黒丸）、または２μｇ/ｍｌ １４９４ｍＡｂ（白丸）と共に、室温にて１５分間プレインキュベートした。プロテインＣ活性化を、トロンビン（２ｎＭ最終）の添加によって開始し、そして反応を、所定の時間で停止した。活性化プロテインＣを、アミド分解アッセイで決定し、そして活性速度をｍＯＤ/分で各時点についてプロットした。トロンビンを添加しないコントロールウェルを含ませた（黒四角）。各データ点は、３連のウェル測定の平均を表す。図４ｃでは、ＥＡ.ｈｙ９２６細胞単層を、０.１μＭのプロテインＣおよび示された濃度の血漿ＥＰＣＲ（白丸）またはｒｓＥＰＣＲ（黒丸）と共に、室温にて１５分間プレインキュベートした。トロンビン（最終２ｎＭ）を添加し、そして活性化を室温にて６０分間行った。上清を、アンチトロンビンおよびヘパリンの混合物に添加し、そして活性化プロテインＣ活性（ｍＯＤ/分）を、アミド分解アッセイで決定した。各データ点は、３連のウェル測定の平均を表す。 図４ｄは、可溶性血漿ＥＰＣＲがＡＰＣ抗凝固活性を阻害することを示すグラフである。ＡＰＣ（２５ｎＭ）の抗凝固活性を、４６０ｎＭの血漿ＥＰＣＲまたはｒｓＥＰＣＲの存在下で、１段階Ｘａ凝血アッセイを用いて決定した。この効果は、いずれかの可溶性ＥＰＣＲを、ＥＰＣＲへのＡＰＣの結合をブロックする、４２μｇ/ｍｌの１４９６ｍＡｂと共に、５分間プレインキュベートした場合には逆転した。データは、４〜６測定の平均±Ｓ.Ｄ.を表す。
【図５】図５は、狼瘡患者において、可溶性血漿ＴＭのレベルを可溶性血漿ＰＣＲと比較するグラフであり、ＴＭ値とＥＰＣＲ値との間に相関はないが、狼瘡患者の大多数が、可溶性血漿ＥＰＣＲの非常に上昇したレベルを示すことを証明する。
【図６】図６は、ｓＴＭ（正常）、ｓＴＭ（敗血症）、ｓＥＰＣＲ（正常）、およびｓＥＰＣＲ（敗血症）についての可溶性レセプター濃度（ｎｇ/ｍｌ）のグラフである。ｓＴＭとｓＥＰＣＲとの間に相関はない（ｒ2＝０．０３４）。
【背景技術】
【０００１】
（発明の背景）
本発明は、一般に、内皮細胞プロテインＣ/活性化プロテインＣレセプターまたはタン
パク質分解もしくは選択的スプライシングのいずれかによって誘導されるその可溶性形態の検出および/または測定を含むアッセイの領域にある。
【０００２】
合衆国政府は、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｔ．Ｅｓｍｏｎに対する国立衛生研究所助成金ＰＯ１ＨＬ ５４８０４により、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
プロテインＣのその活性セリンプロテアーゼに対する活性化、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）は、血液凝固の調節に重要な役割を果たす一連の事象を開始する。プロテインＣ経路の臨床的重要性は、血栓症を生じる、この経路における多くの機能不全によって示される（非特許文献１；非特許文献２）。プロテインＣが欠損した患者は、通常、幼児期に生命を危うくする血栓症合併症を示す（非特許文献３；非特許文献４）。これは、プロテインＣ投与によって補正される（非特許文献５）。
【０００４】
プロテインＣおよびＡＰＣはまた、炎症に対する宿主応答の調節に関連している。活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）は、グラム陰性敗血症のヒヒモデルにおいてＥ．ｃｏｌｉの致死的効果を予防し得（非特許文献６；ＴａｙｌｏｒおよびＥｓｍｏｎに対する特許文献１）、そして予備的な臨床結果は、プロテインＣが、ヒト敗血症ショックのある形態を処置することに効果的であることを示唆する（非特許文献７）。プロテインＣ経路の重要な成分であるプロテインＳの阻害は、Ｅ．ｃｏｌｉの致死量未満のレベルに対する霊長類の応答を悪化させ、そして循環中へのＴＮＦの出現を増大する（非特許文献８）。これらの結果は、プロテインＣが、凝固の制御および炎症への影響の両方をなし得ることを示唆する。
【０００５】
プロテインＣは、凝固系の最終酵素であるトロンビンが、内皮細胞表面タンパク質であるトロンボモジュリンに結合する場合に、活性化される（非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１）。細胞培養において、トロンボモジュリン転写は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）への内皮細胞の曝露によってブロックされ（非特許文献１２そしてトロンボモジュリン活性および抗原は、その後インターナライズされそして分解される（非特許文献１３、非特許文献１４）。補体系の調節タンパク質であるＣ４ｂＢＰは、プロテインＳと結合して、インビトロ（非特許文献１５）およびインビボ（非特許文献８）でＡＰＣ抗凝固活性を支持することにおいて機能的に不活性である複合体を形成する。Ｃ４ｂＢＰは、急性期反応物質として行動する（非特許文献１６）。したがって、この経路のタンパク質は、炎症を調節するようにみえるだけでなく、これらは炎症を調節する成分と相互作用し、そしてこれら自体は、炎症メディエータによってダウンレギュレーションを受ける。
【０００６】
内皮細胞は、効率的なプロテインＣ活性化を担う公知の２つのレセプター、トロンボモジュリンおよび内皮プロテインＣ/ＡＰＣレセプター（ＥＰＣＲ）を発現する点で、プロ
テインＣ経路において重要な役割を果たす（非特許文献１７；非特許文献１８）。トロンボモジュリン（ＣＤ１４１）は、高親和性を有する循環トロンビンと結合する膜貫通補因子であり、そして得られる酵素−補因子複合体は、生理学的に関連するプロテインＣ活性化速度に必要とされる（非特許文献１９；非特許文献２０）。
【０００７】
ＥＰＣＲは、ＣＤ１/ＭＨＣクラス１ファミリーとの著しい相同性を有する最近同定さ
れたレセプターである（非特許文献１７；非特許文献２１；非特許文献２２）。プロテインＣに対する内皮細胞レセプターのクローニングおよび生物学的役割は、Ｏｋｌａｈｏｍａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎによって「Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ/Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ」と
題するＰＣＴ/ＵＳ９５/０９６３６に記載された。このタンパク質は、２３８アミノ酸からなると予測され、このアミノ酸は、Ｎ末端に１５アミノ酸のシグナル配列、およびタイプ１膜貫通タンパク質としてこのレセプターを特徴づける２３アミノ酸の膜貫通領域を含む。
【０００８】
ＥＰＣＲは、カルシウムの存在下で類似の親和性（Ｋｄapp約３０ｎＭ）でプロテイン
ＣおよびＡＰＣの両方と結合し（非特許文献２１）、そして細胞表面上で、トロンビン−トロンボモジュリン活性化複合体に対してプロテインＣ基質を提示することにより、プロテインＣ活性化を容易にする（非特許文献１８）。内皮細胞レセプターは両方とも、タイプ１膜貫通タンパク質であり、ここでリガンドは、細胞外ドメインに結合し、そして両方とも、短い細胞内細胞質テイルを有する（非特許文献２１；非特許文献２３；非特許文献２４；非特許文献２５）。さらに、それらのインビトロ細胞表面発現は、腫瘍壊死因子−αによって同様にダウンレギュレートされる（非特許文献１７）。しかし、トロンボモジュリンおよびＥＰＣＲの可溶性形態の特徴は、いくつかの点で異なる。組換え可溶性トロンボモジュリンは、膜形態に対して減少した補因子活性を有する（非特許文献２６；非特許文献２７）。精製した成分および細胞の両方で、トロンボモジュリンによって特異的に誘導されるトロンビンの基質の変化は、トロンビンにおける共有される結合ドメインについての競合、ならびに活性部位ポケットにおけるコンホメーション変化から生じる（非特許文献２８；非特許文献２９；非特許文献３０；非特許文献３１；非特許文献３２；非特許文献３３；非特許文献３４）。可溶性トロンボモジュリンもまた、種々のインヒビターによるトロンビンの不活化を加速する（非特許文献３５；非特許文献３６）。血漿および尿の両方が、検出可能なトロンボモジュリンを含み（非特許文献３７；非特許文献３８）、そしてトロンボモジュリン遺伝子がイントロンを含まないので（非特許文献２３）、これらの可溶性形態は、細胞表面での細胞外ドメインのタンパク質分解による。
【０００９】
血漿中のトロンボモジュリンの可溶性分解産物は、種々の疾患状態での内皮細胞損傷の公知のマーカーであり（非特許文献３７；非特許文献３９；非特許文献４０；非特許文献４１；非特許文献４２；非特許文献４３；非特許文献４４）、そして種々の減少した親和性を有するトロンビン結合フラグメント、ならびに非結合フラグメントの混合物から構成される（非特許文献３７）。
【００１０】
対照的に、膜貫通ドメインの直前で短縮された組換え可溶性ＥＰＣＲ（ｒｓＥＰＣＲ）は、インタクトな細胞表面発現ＥＰＣＲについて観察される親和性と同様な親和性でプロテインＣおよびＡＰＣの両方と結合する（非特許文献２１）。おそらくｒｓＥＰＣＲおよび第Ｖａ因子の両方が、トロンボモジュリンによって占有されるトロンビン中のアニオン結合外部位（ｅｘｏｓｉｔｅ）を暗示する溝に結合決定基を共有するので（非特許文献４５）、ＡＰＣ抗凝固活性は、ｒｓＥＰＣＲと結合した場合、効果的に阻害される（非特許文献２２）。しかし、ｒｓＥＰＣＲは、ＡＰＣによる小さい合成基質のタンパク質分解にも、α１−アンチトリプシンまたはプロテインＣインヒビターによるＡＰＣの不活化にも影響を及ぼさないようである（非特許文献２２）。プロテインＣ活性化を増強する膜結合ＥＰＣＲ（非特許文献１８）とは異なり、ｒｓＥＰＣＲは、可溶性トロンビン−トロンボモジュリン複合体によるプロテインＣ活性化に対してほとんど効果を有さない（非特許文献２２）。このことは、ＥＰＣＲの任意の可溶性形態が、プロテインＣについて膜結合ＥＰＣＲと競合することによってプロテインＣ活性化を阻害し得ることを示唆する。
【００１１】
免疫組織化学は、ＥＰＣＲが、主として大きな血管に由来する内皮細胞の表面上に存在し、そしてほとんどの毛細血管内皮細胞上にはないか、または低レベルでしか存在しないことを示す。
【特許文献１】米国特許第５,００９,８８９号明細書
【非特許文献１】ＥｓｍｏｎおよびＳｃｈｗａｒｚ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｍｅｄ．，１９９５，５，ｐ．１４１−１４８
【非特許文献２】Ｒｅｉｔｓｍａら，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，１９９５，７３，ｐ．８７６−８７９
【非特許文献３】Ｓｅｌｉｇｓｏｈｎら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，１９８４，３１０，ｐ．５５９−５６２
【非特許文献４】Ｅｓｍｏｎ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｍｅｄ．，１９９２，２，ｐ．２１４−２２０
【非特許文献５】Ｄｒｅｙｆｕｓら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，１９９１，３２５，ｐ．１５６５−１５６８
【非特許文献６】Ｔａｙｌｏｒら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１９８７，ｐ．７９
【非特許文献７】Ｇｅｒｓｏｎら，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ ９１，１９９３，ｐ．４１８−４２２
【非特許文献８】Ｔａｙｌｏｒら，Ｂｌｏｏｄ，１９９１，７８，ｐ．３５７−３６３
【非特許文献９】Ｅｓｍｏｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８９，２６４，ｐ．４７４３−４７４６
【非特許文献１０】ＤｉｔｔｍａｎおよびＭａｊｅｒｕｓ，Ｂｌｏｏｄ，１９９０，７５，ｐ．３２９−３３６
【非特許文献１１】Ｄｉｔｔｍａｎ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｍｅｄ．，１９９１，１，ｐ．３３１−３３６
【非特許文献１２】ＣｏｎｗａｙおよびＲｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９８８，８，ｐ．５５８８−５５９２
【非特許文献１３】Ｌｅｎｔｚら，Ｂｌｏｏｄ，１９９１，７７，ｐ．５４３−５５０
【非特許文献１４】Ｍｏｏｒｅら，Ｂｌｏｏｄ，１９８９，７３，ｐ．１５９−１６５
【非特許文献１５】Ｄａｈｌｂａｃｋ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８６，２６１，ｐ．１２０２２−１２０２７
【非特許文献１６】Ｄａｈｌｂａｃｋ，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔａｓ．，１９９１，６６，ｐ．４９−６１
【非特許文献１７】ＦｕｋｕｄｏｍｅおよびＥｓｍｏｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９４，２６９，ｐ．２６４８６−２６４９１
【非特許文献１８】Ｓｔｅａｒｎｓ−Ｋｕｒｏｓａｗａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），１９９６，９３，ｐ．１０２１２−１０２１６
【非特許文献１９】ＥｓｍｏｎおよびＯｗｅｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），１９８１，７８，ｐ．２２４９−２２５２
【非特許文献２０】Ｄｉｔｔｍａｎ，Ｗ．Ａ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｍｅｄ．，１９９１，１，ｐ．３３１−３３６
【非特許文献２１】Ｆｕｋｕｄｏｍｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９６，２７１，ｐ．１７４９１−１７４９８
【非特許文献２２】Ｒｅｇａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９６，２７１，ｐ．１７４９９−１７５０３
【非特許文献２３】Ｊａｃｋｍａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），１９８７，８４，ｐ．６４２５−６４２９
【非特許文献２４】Ｗｅｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｏｒｙ，１９８７，２６，ｐ．４３５０−４３５７
【非特許文献２５】Ｓｕｚｕｋｉら，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９８７，６，ｐ．１８９１−１８９７
【非特許文献２６】Ｇａｌｖｉｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８７，２６２，ｐ．２１９９−２２０５
【非特許文献２７】Ｐａｒｋｉｎｓｏｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９０，２６５，ｐ．１２６０２−１２６１０
【非特許文献２８】Ｙｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９１，２６６，ｐ．２３０１６−２３０２１
【非特許文献２９】Ｌｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８９，２６４，ｐ．１２９５６−１２９６２
【非特許文献３０】Ｙｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９２，２６７，ｐ．１１０２３−１１０２８
【非特許文献３１】Ｈｏｆｓｔｅｅｎｇｅら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１９８６，２３７，ｐ．２４３−２５１
【非特許文献３２】Ｍａｔｈｅｗｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９４，３３，ｐ．１３５４７−１３５５２
【非特許文献３３】Ｅｓｍｏｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８２，２５７，ｐ．７９４４−７９４７
【非特許文献３４】Ｓａｄｌｅｒら，Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ，１９９３，２３，ｐ．１８３−１９３
【非特許文献３５】ＢｏｕｒｉｎおよびＬｉｎｄａｈｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１９９３，２８９，ｐ．３１３−３３０
【非特許文献３６】Ｒｅｚａｉｅ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９５，２７０，ｐ．２５３３６−２５３３９
【非特許文献３７】Ｔａｋａｎｏら，Ｂｌｏｏｄ，１９９０，７６，ｐ．２０２４−２０２９
【非特許文献３８】ＩｓｈｉｉおよびＭａｊｅｒｕｓ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１９８５，７６，ｐ．２１７８−２１８１
【非特許文献３９】Ｔａｎａｋａら，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，１９９１，３７，ｐ．２６９−２７２
【非特許文献４０】Ｔａｋａｈａｓｈｉら，Ａｍ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，１９９１，３８，ｐ．１７４−１７７
【非特許文献４１】Ａｓａｋｕｒａら，Ａｍ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，１９９１，３８，ｐ．２８１−２８７
【非特許文献４２】Ｗａｄａら，Ａｍ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，１９９２，３９，ｐ．２０−２４
【非特許文献４３】Ｔａｋａｈａｓｈｉら，Ａｍ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，１９９２，４１：３２−３９
【非特許文献４４】Ｏｈｄａｍａら，Ｃｈｅｓｔ，１９９４，１０６，ｐ．６６６−６７１
【非特許文献４５】Ｍａｔｈｅｒら，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９６，１５，ｐ．６８２２−６８３１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、本発明の目的は、天然に存在する可溶性ＥＰＣＲについて治療的および診断的使用を同定することである。
【００１３】
本発明のさらなる目的は、天然に存在する可溶性ＥＰＣＲを特徴づけることである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（発明の要旨）
血漿ＥＰＣＲは、単離され、特徴づけられ、そして細胞性プロテインＣ活性化およびＡＰＣ抗凝固活性をブロックすることが示されている。血漿ＥＰＣＲは、約４３,０００ダ
ルトンであるようであり、そして約１００ｎｇ/ｍｌで循環する（９８.４±２７.８ｎｇ/ｍｌ、ｎ＝２２）。血漿ＥＰＣＲを、イオン交換、イムノアフィニティー、およびプロテインＣアフィニティークロマトグラフィーを使用して、ヒトのクエン酸処理血漿から精製した。フローサイトメトリー実験は、血漿ＥＰＣＲが、膜貫通および細胞質ドメインを含まないＥＰＣＲとして定義される組換え短縮型ＥＰＣＲから予め決定された親和性（Ｋｄapp約３０ｎＭ）と同様の親和性で、活性化プロテインＣと結合することを示した。さら
に、血漿ＥＰＣＲは、内皮細胞株におけるプロテインＣ活性化および１段階第Ｘａ因子凝血アッセイにおけるＡＰＣ抗凝固活性の両方を阻害した。可溶性ＥＰＣＲはまた、ヒト尿において検出されている。ＥＰＣＲをコードする遺伝子のクローニングは、少なくともヒトＥＰＣＲが選択的にスプライスされ得、選択的にスプライスされた形態（ｓＥＰＣＲ）に特有のインサートを含む短縮型可溶性ＥＰＣＲを生じることを示す。これらの結果は、血漿ＥＰＣＲが、細胞表面でのタンパク質分解または選択的スプライシングのいずれかによって誘導され得ることを示す。
【００１５】
血漿ＥＰＣＲの局所濃度が、特に疾患状態において、十分に高い場合、そのデータは、短縮型可溶性血漿ＥＰＣＲが、プロテインＣ活性化の膜結合ＥＰＣＲ増大および活性化プロテインＣの抗凝固機能を減弱させ得ることを示す。自己免疫疾患（全身性エリテマトーデス、ＳＬＥ）および敗血症（炎症および凝固異常の両方を含む障害）の患者からのＥＰＣＲのレベルと正常ＥＰＣＲを比較する実施例によって示されるように、可溶性ＥＰＣＲのレベルは、炎症および異常凝固に関連する疾患状態と相関するようである。凝固、炎症、および大血管疾患を含む疾患状態を示す、可溶性ＥＰＣＲの測定に基づくアッセイが記載される。単離精製された可溶性ＥＰＣＲ、組換え短縮型可溶性ＥＰＣＲ、および可溶性ＥＰＣＲに対する抗体を含む、アッセイ試薬が記載される。
【００１６】
本発明はさらに、以下を提供する。
（１）可溶性内皮プロテインＣレセプターについてのアッセイであって、
テストされる患者からサンプルを得る工程、および
可溶性内皮プロテインＣレセプターの量を測定する工程、
を包含する、アッセイ。
（２）上記サンプルが、尿、血漿、血清、組織サンプル、および間質液からなる群より選択される、項目１に記載のアッセイ。
（３）可溶性内皮プロテインＣレセプターの量を較正標準と相関させる工程をさらに包含する、項目１に記載のアッセイ。
（４）上記患者が、凝固および炎症状態および障害、内皮に対する損傷に関連する障害または疾患、ならびに大血管疾患からなる群より選択される障害または疾患を有する、項目１に記載のアッセイ。
（５）上記障害または疾患が、自己免疫疾患、移植、敗血症、ショック、子癇前症、糖尿病、血管疾患、腎臓疾患、および肝臓疾患からなる群より選択される、項目４に記載のアッセイ。
（６）上記血管疾患が、心肺バイパス、不安定性アンギナ、再狭窄、および血管形成からなる群より選択される、項目５に記載のアッセイ。
（７）大血管に対する損傷を検出するための、項目１に記載のアッセイ。
（８）内皮プロテインＣレセプターの検出および測定のためのキットであって、
内皮プロテインＣレセプターと免疫反応性である抗体、
患者からのサンプル中で上記抗体と内皮プロテインＣレセプターとの間の反応を検出するための試薬、および
上記反応量を、内皮プロテインＣレセプターの正常および異常レベルと相関させるための標準
を含む、キット。
（９）上記抗体が、膜貫通ドメインを含まない内皮プロテインＣレセプターについてより、膜貫通ドメインを含む内皮プロテインＣレセプターについて、より高い親和性を有する、項目８に記載のキット。
（１０）上記抗体が、選択的にスプライスされた内皮プロテインＣレセプターにおけるインサートと免疫反応性である、項目８に記載のキット。
（１１）上記抗体が、内皮プロテインＣレセプターと、活性化プロテインＣまたはプロテインＣとの結合をブロックする、項目８に記載のキット。
（１２）カルボキシル末端システイン残基が、別のアミノ酸と置換されているか、またはパルミトイル化されていない、改変された内皮プロテインＣレセプター。
（１３）グリコシル化されていない、改変された内皮プロテインＣレセプター。
（１４）単離された、選択的にスプライスされた内皮プロテインＣレセプター。
（１５）膜貫通ドメインの前の天然に存在するタンパク質分解性切断部位で切断された、単離された可溶性内皮プロテインＣレセプター。
【発明の効果】
【００１７】
自己免疫疾患（全身性エリテマトーデス、ＳＬＥ）および敗血症（炎症および凝固異常の両方を含む障害）の患者からのＥＰＣＲのレベルと正常ＥＰＣＲを比較する実施例によって示されるように、可溶性ＥＰＣＲのレベルは、炎症および異常凝固に関連する疾患状態と相関するようである。凝固、炎症、および大血管疾患を含む疾患状態を示す、可溶性ＥＰＣＲの測定に基づくアッセイが提供される。単離精製された可溶性ＥＰＣＲ、組換え短縮型可溶性ＥＰＣＲ、および可溶性ＥＰＣＲに対する抗体を含む、アッセイ試薬が提供される。これらは従来技術からは予測不可能であった格別の効果である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
（発明の詳細な説明）
（定義）
内皮プロテインＣレセプター、ＥＰＣＲ。
【００１９】
可溶性、溶液中にあり、そして細胞表面に結合していない。
【００２０】
短縮型、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含まない；タンパク質分解または選択的スプライシングのいずれかの結果であり得る。
【００２１】
（可溶性ＥＰＣＲの検出および特徴付け；生理学的役割およびマーカーとしての有用性）
ＥＰＣＲの機能のこれまでの研究は、膜形態のＥＰＣＲに結合するプロテインＣが、細胞表面上のトロンビン−トロンボモジュリン複合体によりプロテインＣ活性化の促進を生じる（Ｓｔｅａｒｎｓ−Ｋｕｒｏｓａｗａら，１９９６）が、可溶性組換えＥＰＣＲはＡＰＣ抗凝固活性を阻害する（Ｒｅｇａｎら，１９９６）ことを見出した。これらの観察は、血漿中の可溶性トロンボモジュリン分解産物が、種々の疾患状態における内皮損傷のマーカーであるという知識と共に、可溶性循環形態のＥＰＣＲが存在するかどうか、そして存在するのであれば、プロテインＣ経路においてどういう役割を有するかという疑問に至った。
【００２２】
実施例は、可溶性形態のＥＰＣＲが血漿中で循環し、そして尿中に存在することを示す
。健常ドナー集団において、血漿ＥＰＣＲレベルは、約１００ｎｇ/ｍｌであり、そして
約４３,０００ダルトンの単一抗原種であるようであった。血漿からの可溶性ＥＰＣＲの
その後の精製および機能的研究は、血漿ＥＰＣＲが、インタクトな膜結合ＥＰＣＲと同様な親和性で、プロテインＣおよびＡＰＣの両方と結合し得ることを決定した。内皮細胞株を使用するインビトロ研究は、血漿ＥＰＣＲが、生理学的濃度に近い濃度のプロテインＣおよびトロンビンで、プロテインＣを阻害することを示した。さらに、血漿への精製血漿ＥＰＣＲの直接添加は、ｒｓＥＰＣＲに対するモノクローナル抗体で逆転されるＡＰＣ抗凝固活性の阻害を生じた。
【００２３】
この精製血漿タンパク質のＥＰＣＲとの同定は、ｒｓＥＰＣＲの特性との比較に基づいた。これらのタンパク質は両方とも、同じ群のモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体と反応し、同じアミノ末端配列を有し、Ｃａ2+依存的様式で固定されたプロテインＣに結合し、そして類似の用量応答曲線でプロテインＣ活性化およびＡＰＣ抗凝固活性をブロックした。さらに、ｒｓＥＰＣＲおよび血漿ＥＰＣＲに対するプロテインＣおよびＡＰＣの親和性は共に、インタクトな膜結合ＥＰＣＲの親和性に類似する。これらの特性は、ＥＰＣＲに特有であるようである。
【００２４】
これまでの研究は、内皮細胞で発現した膜結合ＥＰＣＲが、３〜５倍の間のファクターでプロテインＣ活性化を増大することを示したが、実施例は、血漿から精製された可溶性形態のＥＰＣＲが、内皮細胞でのプロテインＣ活性化およびＡＰＣ抗凝固活性を阻害することを示す。これは、ＥＰＣＲが、いくつかの方法で、プロテインＣ経路を調節し得ることを予測する。第１に、より大きな血管（ここでは、トロンボモジュリン濃度が微小循環に対して低い）において、ＥＰＣＲ発現は、対応して増加する（Ｌａｓｚｉｋら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １９９７）。免疫組織化学は、ほとんどの器官において、ＥＰＣＲ発現は、大血管で最も高密度であり、そして血管サイズが減少するにつれて次第に減少し、最も豊富な内皮細胞タイプである毛細管内皮ではほとんどまたは全く発現しない。ＥＰＣＲ発現は、循環からプロテインＣ基質を捕獲し、そして活性化のためにトロンビン−トロンボモジュリン複合体に提示することにおいて、重要な役割を果たし得る。このことは、ＥＡ.ｈｙ９２６内皮細胞株およびヒト臍静脈内皮細胞の両方ともが、トロンボモジュリ
ンより、少なくとも６倍多い表面発現ＥＰＣＲ抗原を有するというインビトロ観察によって支持される。トロンボモジュリン濃度が高くそしてＥＰＣＲが低い微小循環では、プロテインＣ活性化にほとんど影響がないと予測される。最後に、循環可溶性ＥＰＣＲは、ＡＰＣの生成およびＡＰＣが第Ｖａ因子を不活化する能力を減少させ得る。
【００２５】
健常個体において、可溶性ＥＰＣＲレベルは、約２.５ｎＭであり、この濃度は、Ｋｄapp（約３０ｎＭ）および循環にける８０ｎＭのプロテインＣ濃度の両方よりも十分に低い。可溶性血漿ＥＰＣＲの効果（ＡＰＣ抗凝固活性およびプロテインＣ活性化の阻害）の両方ともが、正常血漿に存在する濃度よりかなり高い濃度を必要とする。このことが、血漿ＥＰＣＲの生理学的役割の疑問を、不確定のままにしている。４０ｎＭを越える可溶性ＥＰＣＲレベルを有する患者が、実施例３（狼瘡）に記載のように同定された。したがって、内皮細胞表面に近い局所濃度が、全身濃度を超えるならば、可溶性ＥＰＣＲ濃度は、ＡＰＣの生成および活性の両方を減弱するレベルに達し、血栓症の危険性に寄与する。
【００２６】
可溶性形態のレセプターは、膜結合レセプターのタンパク質分解的切断、または選択的スプライシングメカニズムによって産生され得る。膜表面でのタンパク質分解は、可溶性トロンボモジュリン、ならびにＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、Ｍ−ＣＳＦ、ＰＤＧＦ、およびＮＧＦのレセプターを遊離する（Ｈｅａｎｅｙら，１９９６，Ｂｌｏｏｄ ８７：８４７−８５７）。可溶性レセプターは、膜レセプターのアンタゴニストとして作用すること、リガンドを安定化すること、リガンド媒介されたシグナリングを開始すること、膜形態のダウンモジュレーション、およびレセプターインヒビターへ結合してレセプター−リ
ガンド活性を間接的に容易にすることを含む、多くの可能性のある機能を有する。後者のメカニズムは、両方のＩＬ−１レセプターの可溶性イソ形態が、タンパク質分解的切断によって生成され、そしてＩＬ−１αおよびＩＬ−１βへの応答性を厳格に調節する、ＩＬ−１レセプター系によって使用される（Ａｒｅｎｄら，１９９４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
１５３：４７６６−４７７４）。以下に議論するように、膜貫通ドメインの直前で短縮された可溶性タンパク質をコードするＥＰＣＲゲノム構造は、選択的スプライシング部位を含む（ＦｕｋｕｄｏｍｅおよびＥｓｍｏｎ，１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７０：５５７１−５５７７）。可溶性ＩＬ−６レセプターは、タンパク質分解メカニズムおよび選択的スプライシングメカニズムの両方によって生成されるようである（Ｍｕｌｌｂｅｒｇら，１９９４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５２：４９５８−４９６８；Ｌｕｓｔら，１９９２，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ４：９６−１００；Ｈｏｒｉｕｃｈｉら，１９９４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２４：１９４５−１９４８）。この切断部位はまた、ＭｏｒｒｉｓｓｅｙおよびＥｓｍｏｎへの米国特許第５,２９８,５９９号（その教示は本明細書に援用される）に記載のように、短縮型ＥＰＣＲ、続いて直ぐペプチド配列（抗体はこの配列に対して特異的に指向する）をコードする発現ベクターを構築することによって、大量の可溶性ＥＰＣＲを回収することにおいて有用であり得る。次いで、エピトープは、患者への投与の前または後に、タンパク質分解によって切断される。Ｈｏｐｐらへの米国特許第４,７８２,１３７号もまた参照。
【００２７】
免疫組織化学研究は、ＥＰＣＲが、主として大血管の内皮に位置し、そして毛細血管ではかろうじて検出可能であることを示した。したがって、膜結合ＥＰＣＲに由来する血漿ＥＰＣＲは、大血管疾患プロセスのマーカーとして用い得る。血漿ＥＰＣＲは、血漿トロンボモジュリンレベルとの有用な比較として用い得る。血漿トロンボモジュリンレベルは、種々の疾患状態において調整されることが示されているが、大血管および小血管の両方の疾患プロセスを反映し、ほとんどの内皮が微小血管性であるのでおそらく小血管の寄与に支配される。
【００２８】
（ＥＰＣＲのヌクレオチドおよび予測タンパク質構造分析）
ＥＰＣＲのｃＤＮＡは、２３８アミノ酸（配列番号２）のタンパク質をコードすると予測され、これは、Ｎ末端に１５アミノ酸のシグナル配列を含む（ｖｏｎＨｅｉｊｎｅ，（１９８６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４，４６８３−４６９０）。したがって、成熟タンパク質は、２２３アミノ酸を含むと予測される。組換えタンパク質の直接配列決定は、成熟タンパク質がＳｅｒ１８で始まることを示した。配列番号２は、ＥＰＣＲの予測アミノ酸配列である。配列番号２のアミノ酸１〜１５（ＭＬＴＴＬＬＰＩＬＬＬＳＧＷＡ）は、ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ（ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ，１９８６）の方法によって決定される推定シグナル配列である。配列番号２のアミノ酸２１１〜２３６（ＬＶＬＧＶＬＶＧＧＦＩＩＡＧＶＡＶＧＩＦＬＣＴＧＧＲ）は、推定膜貫通ドメインである。可能性のあるＮ−グリコシル化部位は、配列番号２のアミノ酸４７〜４９、６４〜６６、１３６〜１３８、および１７２〜１７４に存在する。細胞外システイン残基は、配列番号２のアミノ酸１７（血漿ＥＰＣＲでは除去されている）、１１４、１１８、および１８６に存在する。２３アミノ酸からなる可能性のある膜貫通領域（Ｅｎｇｅｌｍａｎら，（１９８６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ． １５，３２１−５３）を、Ｃ末端で同定した（配列番号２のアミノ酸２１１で始まる）。
【００２９】
このタンパク質はタイプ１膜貫通タンパク質である。細胞外ドメインは、４つの可能性のあるＮ−グリコシル化部位および３つのＣｙｓ残基を含む。グリコシル化は、Ｎ−グリカナーゼ消化によって示されるように、活性に必須ではない。細胞質領域は、３アミノ酸のみを含み、そしてＣｙｓで終結し、パルミトイル化されている。末端システインが適切にパルミトイル化されてない場合、タンパク質は分泌され得る。ＥＰＣＲの配列を変化させて、このシステインを別のアミノ酸と置換することにより、膜結合する代わりに分泌さ
れる、本質的に完全長のＥＰＣＲを作成する手段が提供される。
【００３０】
本明細書で使用される場合、レセプターをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１に示される配列、およびストリンジェントな条件下で配列番号１にハイブリダイズする、その保存的置換、付加、または欠失を有する配列を含む。本明細書で使用される場合、レセプターを構成するアミノ酸配列は、配列番号２に示される配列、および機能的に等価な生物学的活性を有するレセプターを形成する、その保存的置換、付加、または欠失を有する配列を含む。何が、保存的置換、付加、または欠失を構成し、そしてどれが、本明細書に記載の機能的アッセイを使用して機能的に等価なレセプター分子をコードまたは形成すると容易に確認され得るかは、当業者に周知である。これは、さらに、図３を参照することによって例示され、以下に議論される。
【００３１】
（選択的スプライシング）
レセプターは、特異的リガンドに結合して生理学的応答を生じることを担う細胞の、外部に曝された部分を有する、細胞膜に繋がれたタンパク質として最も頻繁に思い描かれる。多くの場合、もはや細胞に制限されないという事実にもかかわらず、頻繁にそのリガンドを確かに結合し得る、可溶性形態のレセプターが存在する。可溶性レセプターイソ形態へのリガンド結合はまた、多くの形態をとる応答を生じ得、これには、膜結合レセプター相互作用のアップモジュレーションまたはダウンモジュレーション、あるいは正常には応答性ではない細胞へリガンドを輸送することによって応答を伝達させることを含む（Ｈｅａｎｅｙ，ＭＬおよびＤＷ Ｇｏｌｄｅ． Ｓｏｌｕｂｌｅ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ． Ｂｌｏｏｄ ８７：８４７−８５７， １９９６）。
【００３２】
可溶性レセプターを産生するための２つの公知のメカニズムが存在する：膜結合レセプターをタンパク質分解して、細胞外ドメインを遊離し、そして膜アンカーを残すことによるもの、およびｍＲＮＡの選択的スプライシングによるもの（図１）。後者のメカニズムは多くの形態を取り得るが、リーディングフレームがエキソン−イントロン境界により連続し、そして膜貫通アンカーをコードする配列に達する前に停止コドンで終結する場合、最も単純である。これは、膜形態に類似するが、重要な差異を有するタンパク質を生成する。これは、可溶性タンパク質として、作製され、そして分泌され、そして特有のカルボキシル末端テイルを有する。このテイルを、膜結合レセプターの形成において無視されるイントロンｍＲＮＡ配列の一部を読むことによって形成した。選択的スプライシングによる可溶性レセプターの生成はまた、共に同じｍＲＮＡテンプレートを起源にするという事実にもかかわらず、膜結合レセプターとは独立して調整され得る（Ｈｅａｎｅｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ９２：２３６５−２３６９，１９９５）。
【００３３】
可溶性レセプターが選択的スプライシングメカニズムによって生成されることを証明するためには、ゲノム配列および関連領域のイントロン−エキソン境界を知らなければならない。生理学的応答と可溶性レセプターを関連付けて、プロテインＣ遺伝子およびプロテインＳ遺伝子の発現の間にかなり頻繁に含まれることが見られる異常なｍＲＮＡスプライシングと区別することもまた役立つ（Ｂｅｒｇら，Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇ Ｆｉｂｒｉｎｏｌ． ７：６２５−６３１，１９９６）。
【００３４】
以下の研究および結果の詳細は、実施例に記載される。ヒト血漿は、約１００ｎｇ/ｍ
ｌの可溶性ＥＰＣＲを含む（表１）。これを、２つのモノクローナル抗体（１４９４ｍＡｂおよび１４９５ｍＡｂ）および標準的技法を使用する酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。著しく上昇した可溶性ＥＰＣＲレベルを、全身性エリテマトーデスおよび敗血症の患者で見いだした。これらのレベルは、ほとんど例外なく、大血管の表面上のみに存在する膜結合レセプターについてかなり高いようであった。これを真相正
しく認識するために、トロンボモジュリン（ＴＭ）は、すべての内皮、ならびにいくつかの非血管細胞上で発現されるが、正常可溶性ＴＭレベルは、わずかに約１０〜４０ｎｇ/
ｍｌである（Ｔａｋａｎｏら，Ｂｌｏｏｄ ７６：２０２４−２０２９，１９９０）。可溶性ＴＭレベルは、狼瘡の患者で上昇していたが、敗血症では上昇していなかった。重要なことには、これらの患者群において、血漿ＥＰＣＲとＴＭレベルとの間に相関がなかったことである（それぞれ、ｒ2＝０.０２８および０.０３４）。
【００３５】
【表１】
【００３６】
ＴＭゲノム構造は、イントロンを含まず（Ｊａｃｋｍａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８４：６４２５−６４２９，１９８７）、そのため可溶性ＴＭイソ形態を生成するための唯一の方法は、膜結合レセプターのタンパク質分解による。好中球エラスターゼおよびカテプシンＧによる内皮ＴＭのタンパク質分解は、インビトロで示されており、これは、種々の疾患状態で見出される上昇した可溶性ＴＭレベルが、内皮表面で、活性化された炎症性細胞の産物によって媒介されるタンパク質分解から生じることを示唆する（Ｂｏｅｈｍｅら，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８７：１３４−１４０，１９９６、およびＡｂｅら，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ． １２３：８７４−８８１，１９９４）。
【００３７】
血漿ＥＰＣＲおよびＴＭレベルと高い血漿ＥＰＣＲ濃度との間の相関の欠如は、血漿ＥＰＣＲがタンパク質分解および選択的スプライシングの両方のメカニズムを起源にするという概念に一致する。ヒトＥＰＣＲのゲノム構造は、イントロンによって分離される、４つのエキソンを含む。この配列を概観することにより、７５２７位にＴＡＡ停止コドンを含むエキソンＩＩＩ−イントロンＩＩＩ境界（５'ＧＴで）の後のインフレームリーディ
ング配列が明らかになる。この停止コドンは、膜貫通ドメインをコードするエキソンＩＶの上流にあるので、予測されるタンパク質は、特有な４８残基のカルボキシル末端テイル（イントロン配列によってコードされる）を含み、そして膜貫通アンカーを含まない。
【００３８】
図１は、短縮型ＥＰＣＲが誘導され得る２つの可能性のある方法の図である：膜貫通ドメインの直前でのタンパク質分解によるか、または選択的スプライシングによる。図２に示されるように、選択的スプライシングは、選択的にスプライスされた短縮型ＥＰＣＲ中にあるペプチド配列が含まれることを生じる。図３に示されるように、この配列は、種間で高度に保存されるが、わずかな差が存在し、ヒトおよびウシのＥＰＣＲについては４８残基、マウスＥＰＣＲについては５１残基、そしてヒヒＥＰＣＲについては２２残基の新しいカルボキシル末端テイルを生じる。
【００３９】
（レセプタータンパク質の発現についての患者サンプルのスクリーニング）
患者サンプルは、ＥＰＣＲ、ＥＰＣＲ中の選択的にスプライスされたインサートに存在する特有のインサートのいずれかに対する抗体、またはコンホメーションの差に起因してＥＰＣＲまたはｓＥＰＣＲのいずれかに対してより大きな親和性で結合する抗体を使用して、ｓＥＰＣＲまたはＥＰＣＲの存在および量について、スクリーニングされ得る。サンプルはまた、存在するタンパク質を特異的に定量するための他の標準的技法を使用して、スクリーニングされ得る。
【００４０】
（診断的または治療的使用のための抗体の生成）
ＥＰＣＲ、および特に、可溶性ＥＰＣＲ（「ｓＥＰＣＲ」）、および組換え可溶性ＥＰＣＲ（「ｒｓＥＰＣＲ」）に対する抗体が生成され得、これらは、レセプタータンパク質の検出、特徴付け、または単離に有用であり、そしてほとんどの場合、リガンド結合の阻害によって、レセプタータンパク質活性を調節するために有用である。抗体は、免疫原として、ヒトまたは動物の精製または組換えレセプタータンパク質もしくはそのフラグメントを使用して、標準的技法によって生成される。
【００４１】
ＥＰＣＲに対するモノクローナル抗体を、Ｅｓｍｏｎら，１９９３，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２２２：３５９−３８５によって他のタンパク質について記載されたように得た。１４９４、１４９５、および１４９６ｍＡｂと呼ばれる抗体は、組換え可溶性ＥＰＣＲおよび細胞表面発現ＥＰＣＲに結合するＩｇＧ１κ抗体である。１４９４および１４９６ｍＡｂは、ＥＰＣＲへのプロテインＣおよびＡＰＣの結合をブロックし、そして細胞性ＥＰＣＲがトロンビン−トロンボモジュリン複合体によるプロテインＣ活性化を容易にする能力を阻害する。１４９５ｍＡｂは、ＥＰＣＲへのリガンド結合をブロックせず、細胞表面プロテインＣを変化させず、そして１４９４または１４８６ｍＡｂのエピトープとは異なる結合エピトープを有する。抗体は、標準的技法、例えば、放射標識、酵素標識、フルオレセインのような蛍光標識、金粒子、染料、および抗体の検出のための他の手段を使用して標識され得る。例えば、抗体は、標準的な手順を使用して、ビオチンアミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルでビオチン化され得る。抗体は、イムノアッセイにおける使用のための固体支持体、例えば、ＡｆｆｉＧｅｌ−１０TM、ニトロセルロース、またはマイクロタイターウェル、あるいは溶液相イムノアッセイにおける使用のための固体支持体に固定され得る。
【００４２】
好ましい実施態様では、ＥＰＣＲは、５０マイクロリットルの、１５ｍＭ Ｎａ2ＣＯ3、３５ｍＭ ＮａＨＣＯ3（ｐＨ９.６）中４マイクログラム/ｍｌの１４９５ｍＡｂで４
℃にて一晩コーティングしたマイクロタイタープレート（ＭａｘｉｓｏｒｐTM，ＮＵＮＣ
ＮＳ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して測定される。室温で、次いでプレートを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０.１Ｍ ＮａＣｌ、０.０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０（ｐＨ７.５）（アッセイ緩衝液）で３回洗浄し、そして０.１％（ｗｔ/ｖｏｌ）ゼラ
チンを含むアッセイ緩衝液で少なくとも１時間ブロックする。次いで、ウェルを洗浄し、５０マイクロリットルサンプルを３連のウェルに添加し、そしてプレートを１時間インキュベートする。ウェルを吸引し、アッセイ緩衝液で３回洗浄し、そして５０マイクロリットル、２マイクログラム/ｍｌのビオチン−１４９４ｍＡｂを添加する。プレートを１時
間インキュベートし、３回洗浄し、そして５０マイクロリットルの、０.２５マイクログ
ラム/ｍｌのストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ結合体（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ
）を添加し、そしてさらに１時間インキュベートする。ウェルを５回洗浄し、そしてＥＬＩＳＡ増幅キット（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）の基質および増幅試薬を、製造業者の指示に従って１５分間隔で連続して添加する。発色を０.３Ｍ Ｈ2ＳＯ4で停止し、そして終点吸
光度を、Ｖmaxマイクロプレートリーダーにて４９０ｍｍで読み取る。３連のウェルでの
標準は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０.１Ｍ ＮａＣｌ、および１ｍＭ ＥＤＴＡ、
０.１％ゼラチン（ｐＨ７．５）中の１.５〜１００ｎｇ ｒｓＥＰＣＲ/ｍｌである。標
準曲線は、１.５〜１２.５ｎｇ/ｍｌで直線であり、そしてサンプルを、直線範囲に入る
ように同じ緩衝液で希釈する。研究は、１〜２パーセントの間で、血漿が、アッセイの直線性にも標準曲線の感度にも影響を及ぼさないことを示す。健常ボランティアからの血漿サンプルを、１ｍＭ ＥＤＴＡを含むアッセイ緩衝液で最終的に２％血漿まで希釈した。そしてＥＰＣＲ抗原レベルを、同じプレート上で決定された標準曲線を参照して、３連ウェルの平均から算出する。
【００４３】
（障害）
可溶性ＥＰＣＲについてのアッセイは、本明細書で議論されるような凝固および炎症状態および障害、例えば、狼瘡のような自己免疫疾患、移植モニタリング、敗血症、ショック、子癇前症、糖尿病、心肺バイパス、不安定性アンギナ、再狭窄、血管形成（すなわち、血管疾患）、腎臓または肝臓疾患の検出および分析に有用である。例えば、ＥＰＣＲは、大血管についてのマーカー、したがって大血管に対する損傷についてのマーカーである。可溶性ＥＰＣＲの量の増加は、大血管傷害を示し、ＥＰＣＲのタンパク質分解またはｓＥＰＣＲ合成の刺激のいずれかを生じる。ＥＰＣＲ対トロンボモジュリンの比はまた、血液または尿のいずれかのサンプルに基づいて決定され得、これは微小血管対大血管の相対的な程度を示す。サイトカイン、白血球活性化マーカー、および補体因子または活性化マーカーに対するＥＰＣＲの相対量もまた、疾患状態を示すために使用され得る。
【００４４】
ＥＰＣＲは内皮細胞上に存在するので、内皮細胞損傷のマーカーとして有用である。これは、薬物の効果（毒性および効力の両方）の指標として使用され得る。例えば、狼瘡患者では、炎症性/凝固媒介性大血管傷害を効果的に最小にする薬物は、ＥＰＣＲレベルの
減少を生じる。
【００４５】
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照することによってさらに理解される。
【実施例】
【００４６】
（実施例１：ヒト血漿における機能的内皮プロテインＣレセプターの同定）
以下の略号を使用する：ｒｓＥＰＣＲ、膜貫通ドメインおよびサイトゾルテイルの代わりに挿入されたＨＰＣ４エピトープを有する組換え可溶性ＥＰＣＲ；ｍＡｂ、モノクローナル抗体；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動。
【００４７】
（方法）
材料。以下の試薬を示された供給業者から購入した：
ブタ腸粘膜ヘパリン、ジイソプロピルフルオロリン酸、ビオチンアミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ウシ血清アルブミン、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｉｓ，ＭＯ）；Ｓｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ ＰＣａ、Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ（Ｇｒｅｅｎｗｉｃｈ，ＣＴ）；ＥＬＩＳＡ増幅キット、ＧｉｂｃｏＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）；ＡｆｆｉＧｅｌ−１０、ＢｉｏＲａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）；ハンクス平衡化塩溶液、３−（Ｎ−モルホリン）プロパン硫酸（ＭＯＰＳ）、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｆａｉｒ Ｌａｗｎ，ＮＪ）。すべての他の試薬は、市販の最高品質なものであった。
【００４８】
タンパク質。ヒトプロテインＣ（Ｅｓｍｏｎら，１９９３，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２２２：３５９−３８５）、ウシトロンビン（Ｏｗｅｎら，１９７４，Ｊ．ＢＩｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２４９：５９４−６０５）、およびウシアンチトロンビン（Ｅｓｍｏｎ １９７７「Ｆａｃｔｏｒｓ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｒｏｍｂｉｎ ｂｙ ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ ＩＩＩ． Ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｔｈｒｏｍｂｉｎ」Ｒ．Ｌ．Ｌｕｎｄ
ｂｌａｄ，Ｊ．Ｗ．Ｆｅｎｔｏｎ，ＩＩ，およびＫ．Ｇ．Ｍａｎｎ編 Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ．４０３−４１１）を、記載のように精製した。組換え可溶性ＥＰＣＲ、ｒｓＥＰＣＲは、膜貫通ドメインの直前の残基２１０で短縮されたＥＰＣＲの細胞外ドメイン、続くＨＰＣ４モノクローナル抗体におけるカルシウム依存的イムノアフィニティー精製を可能にする１２残基配列からなる（Ｔａｋａｈａｓｈｉら，１９９２；Ｓｔｅａｒｎｓら，１９８８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６３：８２６−８３２）。ｒｓＥＰＣＲの構築、精製、およびプロテインＣ/ＡＰＣ結合特性（Ｆｕ
ｋｕｄｏｍｅら，１９９６）。ヤギ免疫前血清およびｒｓＥＰＣＲに対するヤギポリクローナル抗血清を調製し、そしてＩｇＧを精製した（Ｆｕｋｕｄｏｍｅら，１９９６）。ヤギ抗ｒｓＥＰＣＲポリクローナル抗体を、標準的手順を使用して、ビオチンアミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルでビオチン化した。
【００４９】
モノクローナル抗体。ｒｓＥＰＣＲに対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を、他のタンパク質について記載されたように得た（Ｅｓｍｏｎら，１９９３）。１４９４、１４９５、および１４９６ｍＡｂは、ｒｓＥＰＣＲおよび細胞表面発現ＥＰＣＲに結合するＩｇＧ１κ抗体である。１４９４および１４９６ｍＡｂは、ＥＰＣＲへのプロテインＣおよびＡＰＣの結合をブロックし、そして細胞性ＥＰＣＲがトロンビン−トロンボモジュリン複合体によるプロテインＣ活性化を容易にする能力を阻害する（Ｓｔｅａｒｎｓ−Ｋｕｒｏｓａｗａら，１９９６）。１４９５ｍＡｂは、ＥＰＣＲへのリガンド結合をブロックせず、細胞表面プロテインＣ活性化を変化させず、そして１４９４または１４９６ｍＡｂのエピトープとは異なる結合エピトープを有する。１４９４および１４９５ｍＡｂを、標準的手順を使用して、ビオチンアミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルでビオチン化した。１４９４ｍＡｂを、血漿ＥＰＣＲのイムノアフィニティー精製のために、製造業者の指示に従って、ＡｆｆｉＧｅｌ−１０にカップリングした。抗ＥＰＣＲ ｍＡｂのスクリーニングを、Ｓｔｅａｒｎｓ−Ｋｕｒｏｓａｗａら（１９９６）；Ｆｕｋｕｄｏｍｅら（１９９６）に記載の方法を使用して行った。
【００５０】
凝血アッセイ。１段階第Ｘａ因子凝血アッセイにおけるＡＰＣ（２５ｎＭ）抗凝固活性に対するｒｓＥＰＣＲまたは精製血漿ＥＰＣＲの効果を、８３μｇ/ｍｌの１４９６ｍＡ
ｂ（ＡＰＣ−ＥＰＣＲ相互作用をブロックする抗体）の存在または非存在下で行った（Ｒｅｇａｎら，１９９６）。可溶性ＥＰＣＲおよび１４９６ｍＡｂを、アッセイ前１５分間プレインキュベートした。
【００５１】
細胞培養。すべてのヒト細胞株を、以前に記載されたように維持した（Ｆｕｋｕｄｏｍｅら，１９９６）。ＥＡ.ｈｙ９２６細胞（形質転換されたヒト内皮細胞株；Ｅｄｇｅｌ
ｌら，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８０：３７３４−３７３７）は、Ｃｏｒａ−Ｊｅａｎ Ｅｄｇｅｌｌ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ ａｔ Ｃｈａｐｅｌ Ｈｉｌｌ）が好意により提供した。
【００５２】
フローサイトメトリー分析。蛍光プローブとして用いるために、ＡＰＣを、記載されるように（ＦｕｋｕｄｏｍｅおよびＥｓｍｏｎ、１９９４；Ｂｏｃｋ，Ｐ．Ｅ．１９８８．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７：６６３３−６６３９）、フルオレセインで活性部位（ｆｌ−ＡＰＣ）において標識した。ＥＡ.ｈｙ９２６細胞へのＡＰＣ結合に対するｒｓＥ
ＰＣＲまたは血漿ＥＰＣＲの効果を、フローサイトメトリーによって研究した（Ｆｕｋｕｄｏｍｅら、１９９６）。手短には、収集された細胞を、漸増する濃度のいずれかの可溶性ＥＰＣＲ調製物の非存在下または存在下において、６０ｎＭのｆｌ−ＡＰＣとともに、氷上で３０分間インキュベートし、洗浄し、そして細胞に結合した蛍光を、フローサイトメトリーによって１サンプルごとに１０,０００事象を計数して測定した。全てのアッセ
イを、１％のウシ血清アルブミン、３ｍＭ ＣａＣｌ2、０.６ｍＭ ＭｇＣｌ2、および
０.０２％アジ化ナトリウムを補充したハンクス平衡化塩溶液において行った。
【００５３】
細胞表面プロテインＣ活性化。ＥＡ.ｈｙ９２６細胞を９６ウェル組織培養ディッシュ
において培養した（Ｓｔｅａｒｎｓ−Ｋｕｒｏｓａｗａら、１９９６）。コンフルエントな単層を、１％（ｗ/ｖ）のウシ血清アルブミン、３ｍＭ ＣａＣｌ2、０.６ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ2、および０.０２％アジ化ナトリウムを補充したハンクス平衡化塩溶液を用いて、３回洗浄した。全てのアッセイを、室温において、同一の緩衝液中で、６０μｌの最終容量にて行った。そして、全てのタンパク質濃度は、アッセイにおける最終濃度を示す。プロテインＣ（０.１μＭ）を、示された濃度のｒｓＥＰＣＲ、血漿ＥＰＣＲ、または１４９
４ｍＡｂの非存在下または存在下で添加し、細胞とともに１５分間プレインキュベートした。トロンビンを混合液に添加して（２ｎＭ）、活性化反応を開始した。示された時間に、５０μｌのアリコートを取り出し、そして９６ウェルマイクロタイタープレート中の１０μｌのアンチトロンビン（０.７μＭ最終）およびヘパリン（５Ｕ/ｍｌ最終）に添加した。ＡＰＣアミド分解活性をＳｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ ＰＣａ基質（０.２ｍＭ）の添加
によって測定し、４０５ｎｍでの吸光度の変化速度（ｍＯＤ/分）をＶｍａｘキネティッ
クマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）で測定した。すべてのアッセイ点は、３連ウェルにおいて行われ、そして十分に活性化されたプロテインＣ対ｍＯＤ/分の標準曲線を参照することにより決定される
場合、プロテインＣ基質の１０％未満が活性化された。
【００５４】
血漿および血清の収集。健常な成人ボランティア（女性１２人および男性１０人）から、３.８％緩衝化クエン酸溶液中かまたは抗凝固剤を含まないチューブ中に、静脈穿刺に
よって全血を収集した（Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ ｔｕｂｅ；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）。年齢、食餌、または他の変数に関するドナーのスクリーニングは試みなかった。全てのボランティアに研究についての情報を開示し、彼らから書面による同意を得た。血液を、１１６０×ｇで１０分間遠心分離した。血漿および血清を等分し、アッセイまで−８０℃で冷凍保存した。
【００５５】
血漿ＥＰＣＲの定量のためのＥＬＩＳＡ。血漿におけるＥＰＣＲ抗原の検出のための酵素結合免疫吸着アッセイを開発した。マイクロタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ；Ｎｕｎｃ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を、５０μｌの、１５ｍＭ Ｎａ2ＣＯ3、３５ｍＭ ＮａＨＣＯ3（ｐＨ９．６）中４μｇ/ｍｌの１４９５ｍＡｂを用いて、４℃にて一晩コートした。以下の工程を室温で行った。ウェルを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０.１Ｍ ＮａＣｌ、０.０５％ Ｔｗｅｅｎ２０（ｐＨ７.５）（アッセイ緩衝液）で
３回洗浄し、０.１％（ｗ/ｖ）ゼラチンを含有するアッセイ緩衝液で少なくとも１時間ブロックした。ウェルを洗浄し、５０μｌのサンプルを３連のウェルに添加し、そしてプレートを１時間インキュベートした。ウェルを吸引して、アッセイ緩衝液で３回洗浄し、５０μｌの２μｇ/ｍｌビオチン−１４９４ｍＡｂを添加した。プレートを１時間インキュ
ベートし、３回洗浄し、５０μｌの０.２５μｇ/ｍｌストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ結合体（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を添加し、さらに１時間インキュベートした。ウェルを５回洗浄し、ＥＬＩＳＡ増幅キット（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）の基質および増幅試薬を、製造業者の指示に従い、１５分の間隔で連続的に添加した。発色を０.３Ｍ Ｈ2ＳＯ4
を用いて停止し、４９０ｎｍの終点吸光度をＶｍａｘマイクロプレートリーダーで読み取った。各プレートは、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０.１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ、０.１％ゼラチン（ｐＨ７.５）中１.５〜１００ｎｇ/ｍｌのｒｓＥＰＣＲの標準を３連のウェルに含んだ。標準曲線は、１.５〜１２.５ｎｇ/ｍｌで直線であり（ｒ＝０.９９）、そして血漿サンプルを直線範囲に入るように同じ緩衝液で希釈した。予備的な実験により、再終濃度１〜２％のヒト血漿は、標準曲線の直線性にも感度にも影響しないことを実証した。健常ボランティア由来の血漿サンプルを、１ｍＭＥＤＴＡを含有するアッセイ緩衝液で、最終的に２％血漿に希釈し、そしてＥＰＣＲ抗原レベルを、同一プレート上で決定された標準曲線を参照して、３連ウェルの平均から算出した。
【００５６】
コーティング抗体と検出抗体を逆にし（１４９４ｍＡｂをコーティングに；ビオチン−１４９５ｍＡｂを検出に）、そして抗体結合を、Ｂｌｕｅ Ｐｈｏｓ基質（ＫＰＬ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）で検出する、別のアッセイを開発した。この方法を使用して、敗血症患者における血漿ＥＰＣＲをアッセイした。このアッセイは、おそらく親和性の差異のために、より高感度であったが、両アッセイとも、定性的には、同様の結果を与えた。
【００５７】
ウエスタンブロット。血漿または血清サンプルのドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を、１０％アクリルアミドゲルを、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液系（Ｎａｔｕｒｅ ２２７：６８０−６８５）と共に用いて、非還元条件下で標準的な手順を用いて行った。ゲルをポリビニリデン膜（ＰＶＤＦ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に転写し、膜をブロックし、次に免疫前ヤギＩｇＧ（５０μｇ/ｍｌ）か、またはヤギ抗ｒｓＥＰＣＲポリクローナルＩｇＧ（５０μｇ/ｍｌ）のいずれかと３０分間インキュベートした。洗浄後、膜を１：２０,０００希釈のマウス抗ヤギＩ
ｇＧ−西洋わさびペルオキシダーゼ結合体（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）と３０分間インキュベートした。膜を洗浄し、結合した抗体−酵素結合体を増強化学発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ）で製造業者の指示に従って検出した。
【００５８】
免疫吸着。健常ボランティアからの血清またはクエン酸処理血漿サンプル（４００μｌ）を、ＡｆｆｉＧｅｌ−１０に結合させた５０μｌの１４９５ｍＡｂ（５ｍｇ ＩｇＧ/
ｍｌ樹脂）とともに、混合しながら４℃にて一晩インキュベートした。サンプルを遠心分離し、上清を除去し、そして樹脂を１ｍｌの２０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０.１Ｍ ＮａＣｌ、０.０２％アジ化ナトリウム（ｐＨ７.５）で
３回洗浄した。最終２０ｍＭ ジチオスレイトールを含有するＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液を、洗浄した樹脂に添加し、サンプルを３分間沸騰し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングのために処理した。膜を４μｇ/ｍｌのビオチン化ヤギ抗
ｒｓＥＰＣＲポリクローナル抗体でプローブし、そして結合抗体をストレプトアビジン−西洋わさびペルオキシダーゼ結合体（Ｐｉｅｒｃｅ）および増強化学発光検出系で検出した。予備的実験により、室温にて１〜４時間の、１００μｌのＴｒｉｓ不活化ＡｆｆｉＧｅｌ−１０樹脂でのサンプルの事前吸着、続く１４９５ｍＡｂ−ＡｆｆｉＧｅｌ−１０での一晩の免疫吸着が、同一のウエスタンブロットの結果を与えることが決定された。
【００５９】
血漿ＥＰＣＲの精製。血漿ＥＰＣＲを、イオン交換クロマトグラフィー、抗ｒｓＥＰＣＲ ｍＡｂイムノアフィニティークロマトグラフィー、およびプロテインＣ親和性カラムでのクロマトグラフィーの組み合わせを用いて、ヒトクエン酸処理血漿（Ｏｋｌａｈｏｍａ Ｂｌｏｏｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）から精製した。わずかに異なる方法で２つの調製を行った。
【００６０】
第１の調製において、血漿（１Ｌ）を等量の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.５
）、１０ｍＭ ベンズアミド、４００単位のヘパリンナトリウムで希釈し、そして１ｇの膨潤前のＱＡＥ樹脂でバッチ吸着した。沈澱後、樹脂をプロテインＣの精製のために処理した（Ｅｓｍｏｎら、１９９３）。固体硫酸アンモニウムを上清に４℃にて４０％飽和まで添加し、遠心分離し、そしてさらなる硫酸アンモニウムをその上清に７０％飽和に達するまで添加した。遠心分離後、柔らかなペレットを透析バッグに入れ、１２Ｌの２０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０.０２％アジ化ナトリウム（ｐＨ７.４）に対し一晩透析した。透析物を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０.１Ｍ ＮａＣｌ、０.０２％アジ化ナトリウム（ｐＨ７.４）で平衡化した、１４９６ｍＡｂ−ＡｆｆｉＧｅｌ−１０イムノアフィニテ
ィーカラム（６ｍｌ樹脂；５ｍｇ ＩｇＧ/ｍｌ樹脂）にかけた。カラムを、１２ｍｌを
超える同じ緩衝液で洗浄し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.４）中の５０％（ｖ/
ｖ）エチレングリコールで溶出した（Ｊｕｎ Ｘｕ、未発表の観察）。溶出物からのピーク画分をプールし（０.３７の全ＯＤ280）、濃縮し（Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ３０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、そして緩衝液を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０.１Ｍ ＮａＣｌ、３
ｍＭ ＣａＣｌ2、０.６ｍＭＭｇＣｌ2、０.０２％アジ化ナトリウム（ｐＨ７.４）に交
換した。この物質をプロテインＣアフィニティーカラムにかけた。このカラムは、同じ緩衝液においてＨＰＣ４−ＡｆｆｉＧｅｌ−１０カラム（５ｍｇ ＩｇＧ/ｍｌ樹脂；０.９×８ｃｍ）に精製プロテインＣ（３ｍｇ）をかけることにより事前に調製した。ＨＰＣ４ｍＡｂは、カルシウム依存的様式でプロテインＣ活性化領域に結合し（Ｅｓｍｏｎら、１９９３；Ｓｔｅａｒｎｓら、１９８８）、その後のプロテインＣへのＥＰＣＲの結合を妨げない。血漿ＥＰＣＲを含有するサンプルをカラムにかけた後、カラムを約１２ｍｌの緩衝液で洗浄し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０.１Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、
１０ｍＭ ＭＯＰＳ、０.０２％アジ化ナトリウム（ｐＨ７.５）で溶出した。画分を、２８０ｎｍでの吸光度について、そして上記のＥＬＩＳＡを用いてＥＰＣＲ抗原についてモニターした。プロテインＣおよび血漿ＥＰＣＲの両方を含有する溶出物を、ＦＰＬＣ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）ＭｏｎｏＱカラムにかけ、カラムを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）中の０.１〜１Ｍ ＮａＣｌの直線勾配で展開した。約半分の血漿ＥＰＣＲは、ＭｏｎｏＱカラムに結合せず、半分は、約０.
２Ｍ ＮａＣｌに溶出し、そしてプロテインＣは、約０.５Ｍ ＮａＣｌに溶出した。血
漿ＥＰＣＲの両方のイオン種は、還元条件下または非還元条件下での銀染色、クマシーＢＢ染色、またはＰＶＤＦ膜への転写後の金染色（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびビオチン−ポリクローナル抗ｒｓＥＰＣＲ抗体プローブでのウエスタンブロットで、同一のようであった。
【００６１】
血漿ＥＰＣＲの第２の調製は、４Lの血漿を用いて開始し、機能研究に十分なタンパク
質を精製した。この場合、１４９６−ＡｆｆｉＧｅｌ−１０樹脂（２０ｍｌの５ｍｇ ＩｇＧ/ｍｌ樹脂）を、１０ｍＭベンズアミジン、１ｍＭジイソプロピルフルオロホスフェ
ートおよび０.５単位/ｍｌのヘパリンナトリウム（最終濃度）と共に、クエン酸処理血漿に、直接添加した。血漿を、穏やかに混合しながら、４℃にて一晩バッチ吸着した。樹脂の沈澱後、上清をプロテインＣ精製のために処理した（Ｅｓｍｏｎら、１９９３）。樹脂を２.５×３０ｃｍのカラムに充填し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０.１Ｍ ＮａＣｌ、０.０２％アジ化ナトリウム（ｐＨ７．４）で、十分に洗浄し、そして２０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.４）中５０％のエチレングリコールで溶出した。溶出物をプール
し、濃縮し（５.５の全ＯＤ280）、ＭｏｎｏＱカラムにかけ、２つのイオン種（素通り、および０.２Ｍ ＮａＣｌ溶出ピーク）を、１４９６−ＡｆｆｉＧｅｌ−１０樹脂（１.５×１１ｃｍ）に再びかけた。カラムを前のとおりに、５０％エチレングリコールで溶出した。溶出物（０.７１ ＯＤ）を濃縮し、緩衝液を、Ｃｅｔｒｉｐｒｅｐ３０を含む、２
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０.１ＭＮａＣｌ、３ｍＭ ＣａＣｌ2、０.６ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2、０.０２％アジ化ナトリウムに交換した。次に、この物質をアフィニティーカラムにかけた。ここで、プロテインＣ（２.９ｍｇ）を、同じ緩衝液中で、ＨＰＣ２−Ａｆｆｉ
Ｇｅｌ−１０カラム（０.６×１７ｃｍ）に最初にかけた。ＨＰＣ２ｍＡｂは、プロテイ
ンＣのセリンプロテアーゼドメインに結合し、ＥＰＣＲ結合を妨げない（Ｆｕｋｕｄｏｍｅら、１９９６）。結合したＥＰＣＲを、５ｍＭ ＥＤＴＡを含有する緩衝液で溶出した。混入している血清アミロイドＰ（プロテインＣサンプル由来）を、ＦＰＬＣ ＭｏｎｏＱカラムでのイオン交換クロマトグラフィーによって除去した。サンプルを０.２Ｍ Ｎ
ａＣｌ中でカラムにかけ、その結果、血漿ＥＰＣＲは結合せず、そして０.４〜０.５Ｍ ＮａＣｌにおいて溶出する混入物から分離された。得られる精製血漿ＥＰＣＲ（０.１９
３ ＯＤ280）は、銀染色を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびポリクローナル抗ｒｓＥＰ
ＣＲを用いるウエスタンブロットにより、均質のようであった。この物質を機能研究およびアミノ末端配列分析に使用した。
【００６２】
タンパク質配列決定。可溶性血漿ＥＰＣＲのアミノ末端配列分析を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆａｃｉｌｉｔｙ、Ｗ．Ｋ．Ｗａｒｒｅｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｏｋｌａｈｏｍａ Ｃｉｔｙ）のＫｅｎｎｅｔｈ Ｊａｃｋｓｏｎ博士の研究室において行った。アミノ酸を標準の１文字コードによって表す。
【００６３】
（結果）
第１のアプローチとして、３人の健常ボランティア由来の血漿および血清サンプルを希釈し（４％ｖ/ｖ）、非還元条件下で１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動し、そしてｒｓ
ＥＰＣＲに対して惹起したヤギポリクローナル抗体を用いるウエスタンブロットのために処理した。健常ボランティア由来の血漿および血清サンプル（４％ｖ/ｖ）を非還元条件
下の１０％ゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥのために処理し、膜に転写し、そして膜をヤギ抗ｒｓＥＰＣＲポリクローナル抗体でプローブした。結果をｒｓＥＰＣＲ（０.２ｎｇ）と比
較した。結合した抗体を、マウス抗ヤギＩｇＧおよび増強化学発光検出系で検出した。２人の健常ボランティア由来の血漿サンプルを１４９５ ＡｆｆｉＧｅｌ−１０樹脂で免疫吸着した。洗浄した樹脂を溶出させ、そして還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥのために処理した。ウエスタンブロッティングを、ビオチン−ヤギ抗ｒｓＥＰＣＲをプローブとして使用して行った。
【００６４】
血漿ＥＰＣＲの純度を、銀染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ １０％ゲル、およびビオチン−ヤギ抗ｒｓＥＰＣＲでプローブした膜のウエスタンブロットから決定した（還元および非還元）。膜をポリクローナル抗体でプローブした後、血清および血漿サンプルの両方で、約４３,０００Ｄａの単一のバンドが現れる。検出されたタンパク質のサイズは、ｒｓＥ
ＰＣＲよりわずかに大きいようである。検出された他のバンドは、免疫前ＩｇＧおよびより長い暴露時間でのプロービングより判断すると、ＩｇＧのバックグラウンド結合であった。ＡｆｆｉＧｅｌ−１０樹脂と結合した抗ＥＰＣＲ １４９５ｍＡｂと共に血漿サンプルを一晩インキュベートすること、続く洗浄および還元条件下での結合抗原の溶出は、ビオチン−ヤギ抗ｒｓＥＰＣＲポリクローナル抗体でのウエスタンブロットにより検出される単一バンドを生じた。
【００６５】
ｍＡｂ １４９５をコーティング抗体として使用するＥＬＩＳＡによる、健常ボランティア由来の血漿における可溶性ＥＰＣＲ抗原の測定は、女性（ｎ＝１２）では９１.１＋/−２４.５ｎｇ/ｍｌの抗原レベル、そして男性（ｎ＝１０）では１０７.２＋/−３０.２
ｎｇ/ｍｌの抗原レベルを見出した。ともに計算する場合、平均血漿ＥＰＣＲ抗原レベル
は、９８.４＋/−２７.８ｎｇ/ｍｌであった。男性の値は、トロンボモジュリンと同様に（Ｑｕｅｈｅｎｂｅｒｇｅｒら、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ． ７６：７９２−７３４）、女性の値よりわずかに高いようであるが、研究した集団は、統計学的分析にはあまりに限定されており、そしてこの研究は、性別、年齢、食餌または他の変数に起因する差異を評価するためには設計されていなかった。
【００６６】
血漿ＥＰＣＲは、約１００ｎｇ/ｍｌの単一種であるようであるので、血漿ＥＰＣＲは
、循環ＥＰＣＲが、プロテインＣおよびＡＰＣに結合し得るか否かを決定するために重要になった。可溶性ＥＰＣＲを、イオン交換クロマトグラフィー、硫酸アンモニウムでの沈降、および実験手順において記載されるような抗ＥＰＣＲ １４９６ｍＡｂ−ＡｆｆｉＧｅｌ−１０カラムクロマトグラフィーによる免疫吸着の組み合わせによって、ヒト血漿から精製した。
【００６７】
３ｍＭ ＣａＣｌ2、０.６ｍＭ ＭｇＣｌ2を含む緩衝液中で抗プロテインＣＨＰＣ４
ｍＡｂ−ＡｆｆｉＧｅｌ−１０カラムにプロテインＣ（３ｍｇ）を適用することによって調製したプロテインＣアフィニティーカラムに、この血漿ＥＰＣＲ（約１１０μｇ）を適
用した。カラムを洗浄し、そして血漿ＥＰＣＲを画分１９に適用した。カラムを洗浄し、そして画分３５で開始する５ｍＭ ＥＤＴＡを含む緩衝液で溶出した。それらの画分について、２８０ｎｍでの吸光度およびＥＰＣＲ抗原を決定した。ＥＰＣＲ抗原を、ＥＬＩＳＡによって決定した。
【００６８】
適用した血漿ＥＰＣＲ抗原の９８％以上が、プロテインＣアフィニティーカラムに結合した。吸光度プロフィールは、この抗体へのプロテインＣ結合のカルシウム依存性と一致して、抗体カラムからのＥＰＣＲおよびプロテインＣの同時溶出を示す（Ｓｔｅａｒｎｓら、１９８８）。
【００６９】
機能研究および構造研究のために十分なタンパク質を精製するために、類似しているがわずかに改変した手順を用いて、４Ｌの血漿からＥＰＣＲを精製した。プロテインＣ−抗体アフィニティーカラムからの溶出後、タンパク質を夾雑する残渣を、ＦＰＬＣ Ｍｏｎｏ Ｑカラムでのイオン交換クロマトグラフィーによって取り出した。得られた血漿ＥＰＣＲの調製物は、銀染色を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥ １０％ゲルで均質のようであり、そして同一の結果が、ビオチン−ヤギ抗ｒｓＥＰＣＲポリクローナル抗体でプローブしたウェスタンブロットに関して、還元条件下および非還元条件下の両方で得られた。精製されたタンパク質のアミノ末端配列分析は、唯一の配列Ｓ−Ｑ−Ｄ−Ａ−Ｓ−Ｄ（この配列は、組換え可溶性ＥＰＣＲのアミノ末端配列に同一である：配列番号２）を生じた。これは、天然の供給源からのＥＰＣＲの最初のアミノ末端配列決定である。
【００７０】
血漿ＥＰＣＲの、ＡＰＣに結合する能力を、競合研究によって評価した。この競合研究において、血漿ＥＰＣＲを、ＡＰＣについて細胞性ＥＰＣＲと競合させ、そして細胞性ＥＰＣＲに結合し得る得られた遊離のＡＰＣを、フローサイトメトリーによって評価した（図４ａ）。活性部位においてフルオレセインで標識したＡＰＣ（ｆｌ−ＡＰＣ）を、血漿ＥＰＣＲまたはｒｓＥＰＣＲのいずれかの、存在下または非存在下で、ＥＡ.ｈｙ９２６
細胞とともにインキュベートした。細胞へのＡＰＣ結合の阻害についてのＥＰＣＲ濃度依存性は、ＥＰＣＲの両方の可溶性形態について類似であった。この観察は、ＡＰＣに結合することについての血漿ＥＰＣＲの親和力が、ｒｓＥＰＣＲ−ＡＰＣ結合相互作用について以前に決定された親和力（Ｋｄapp約３０ｎＭ）に類似することを示す。
【００７１】
ｒｓＥＰＣＲは、可溶性系においてプロテインＣ活性化に対してほとんど効果を有さないが（Ｒｅｇａｎら、１９９６）、膜結合ＥＰＣＲは、細胞表面上での活性化を促進する、非常に強力な能力を有する（Ｓｔｅａｒｎｓ−Ｋｕｒｏｓａｗａら、１９９６）。プロテインＣおよびＡＰＣに結合し得るＥＰＣＲの循環形態の存在を示す最新のデータは、血漿ＥＰＣＲが、プロテインＣの細胞表面活性化を変更する能力を有することを示唆した。ＥＡ.ｈｙ９２６細胞上でのほぼ生理学的レベルのプロテインＣ（０.１μＭ）のトロンビン依存性活性化は、過剰なｒｓＥＰＣＲによって、図４ｂによって示されるように、ほぼ、ＥＰＣＲ−プロテインＣ結合相互作用をブロックする抗ｒｓＥＰＣＲ １４９４ｍＡｂを用いて観察されたプロテインＣのレベルにまで阻害された。以前の研究は、ｒｓＥＰＣＲが小さな合成基質を使用するＡＰＣアミド分解活性（ａｍｉｄｏｌｙｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙ）に対する効果を有さないことを実証した（Ｒｅｇａｎら、１９９６）。血漿ＥＰＣＲは、図４ｃに示されるように、ｒｓＥＰＣＲと比較してＥＡ.ｈｙ９２６細胞上の細
胞表面プロテインＣ活性化を阻害する能力においてわずかにより有効であった。
【００７２】
１段Ｘａ因子凝固アッセイにおいて、精製された血漿および可溶性組換えＥＰＣＲは、同様に凝固時間のＡＰＣ延長を阻害した（図４ｄ）。ｒｓＥＰＣＲによるＡＰＣ抗凝固活性の阻害が、以前に観察されている（Ｒｅｇａｎら、１９９６）。予測されるように、１４９６ｍＡｂは、ＡＰＣ−血漿ＥＰＣＲ結合相互作用をブロックすることによって、この効果を逆転した。
【００７３】
（実施例２：尿における可溶性ＥＰＣＲの検出）
可溶性ＥＰＣＲが尿中に存在するかどうかという疑問を検討するために、４つの尿サンプル（朝一番の排尿）を回収し、そしてウェスタンブロッティングおよびＥＬＩＳＡによって可溶性ＥＰＣＲの存在について分析した。
【００７４】
希釈していない小児の尿サンプルを、４％の正常な血漿および組換え可溶性ＥＰＣＲ（１ｎｇ）と比較した。サンプルを、ビオチン−ヤギ−抗ｒｓＥＰＣＲおよびストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ検出系とともにインキュベートした。
【００７５】
ウェスタンブロットは、ａ）可溶性ＥＰＣＲが尿中に存在すること、およびｂ）可溶性ＥＰＣＲ抗原が、血漿中で観察されるサイズと類似のサイズで存在することを示す。明らかな分解は観察されない。ＥＬＩＳＡによって定量される、４つのサンプル中の可溶性ＥＰＣＲの量は、４０.３、６.１、３５.６、および９０.１ｎｇ/ｍｌであった。
【００７６】
（実施例３：狼瘡患者由来の血漿ＥＰＣＲの測定）
正常なヒト血漿ＥＰＣＲ濃度は、上記のように約１００ｎｇ/ｍｌ（９８.４±２７.８
ｎｇ/ｍｌ；２.５ｎＭ）である。エリテマトーデスに罹患した患者由来のサンプルのパネル（ｎ＝５４）をアッセイし、そして可溶性ＥＰＣＲレベルが、検出不能レベルから１,
７００ｎｇ/ｍｌ以上までの範囲であることを見出した。１５人の患者は、２００ｎｇ/ｍｌ以上の可溶性ＥＰＣＲレベルを有した。
【００７７】
以前の研究は、内皮損傷に起因する、狼瘡患者における上昇した可溶性血漿ＴＭレベルを示し、そして最新の狼瘡患者サンプルを、参照として血漿ＴＭについてアッセイした。それらの可溶性ＴＭレベルが、図５によって示されるように、それらの可溶性ＥＰＣＲレベルと完全に相関を有さないことが見出された。このことは、可溶性血漿ＥＰＣＲの供給源が、単に、ランダムに損傷を受けた内皮由来ではないことを示唆する重要な観察である。ＴＭとは対照的に、ヒトおよび霊長類における膜結合ＥＰＣＲ発現は大きな脈管の内皮に主に制限され、毛細管はほとんどＥＰＣＲを発現しない。ＥＰＣＲの特有の局在化は、大きな脈管の血栓症を予防するために、局所的にプロテインＣ活性化を増大すると予測される。大きな脈管への膜結合ＥＰＣＲの主な局在化は、可溶性血漿ＥＰＣＲ濃度によって予測され得る大きな脈管における標的化された血栓症の危険を示す。
【００７８】
（実施例４：敗血症性ショック患者における血漿可溶性ＥＰＣＲ）
敗血症（ａｃｃｐ/ｓｃｃｍ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，ｃｈｅｓ
ｔ １９９２；１０１：１６４４−１６５５）は、以下の臨床的発現のうちの１つより多くを含むが、それらに限定されない、感染に対する全身性炎症応答として定義される：
１）３８℃以上または３６℃未満の体温；
２）１分あたり９０拍以上の心拍数；
３）以下によって示される頻呼吸：
ａ）１分あたり２０呼吸以上の呼吸率；
ｂ）３２ｍｍＨｇ未満のＰａＣＯ2の過度呼吸；
４）１２,０００/ｍｍ3以上もしくは４,０００/ｍｍ3未満のＷＢＣカウント、または１０％以上の未熟好中球（バンド）の存在。
【００７９】
サンプルを、器官機能不全、低灌流（ｈｙｐｏｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）、または低血圧と関連する敗血症によって規定されるような、重篤な敗血症を伴うか、または伴わない、手術後の合併症を有する患者から得た。灌流異常は、乳酸アシドーシス、尿量過少、または精神状態における急性変化を含み得る。敗血症性ショックは、十分な流体（ｆｌｕｉｄ）蘇生、および心臓性ショックの非存在にもかかわらず、２４時間以上の間、血管作用薬を
必要とする低血圧を伴う敗血症をいう。
【００８０】
本研究において含まれるすべての患者は、以下の診断基準を満たした：
ａ）呼吸の支持（２４時間以上の制御された換気）およびまたは血流力学的支持（５マイクログラム/Ｋｇ/分以上の強心薬、ドパミン、もしくはドブタミン、および/または血
管作用性アミン、エピネフリン、もしくはノルエピネフリンの要求）を必要とする、敗血症および/または手術後の合併症に起因する、集中治療室への入室；
ｂ）１８歳〜７５歳の間の年齢；
ｃ）７０％未満の抗トロンビン活性（局所にて試験される）。
患者が、多くの外傷、肝硬変、または急性肝不全、末期ガン、免疫不全、白血病、妊娠、またはヘパリン治療を有する場合、その患者を除外した。
【００８１】
患者の血液サンプルを、時間０（集中治療室ＩＣＵへの入室）の時点および抗トロンビンＩＩ（ＡＴＩＩＩ）または偽薬での処置後２日目および６日目に採取した。血漿可溶性ＥＰＣＲおよび可溶性トロンボモジュリン（ＴＭ）を、時間０のサンプルに関してのみアッセイした。
ｓＥＰＣＲ：
正常：１３３.４±５３.４ｎｇ/ｍｌ（平均±標準偏差）
敗血症：２２４.９±７４.５ｎｇ/ｍｌ
平均間の有意な差あり、Ｐ＝０.００００９
ｓＴＭ：
正常：３５.５±２０.４ｎｇ/ｍｌ（平均±標準偏差）
敗血症：３９.９±７３.１ｎｇ/ｍｌ
平均間の有意な差なし、Ｐ＝０.８１
血漿中のｓＥＰＣＲレベルとｓＴＭレベルとの相関関係なし、ｒ2＝０.３４。
【００８２】
これらの結果を、図６にグラフで示す。狼瘡患者と同様に、敗血症に罹患した患者は、可溶性ＴＭレベルと相関せず、血漿ＥＰＣＲレベルにおいて非常に顕著な上昇を示す。
【００８３】
可溶性血漿ＥＰＣＲが、プロテインＣ活性化および活性化したプロテインＣ抗凝固活性の両方を阻害するという観察によって、これらの患者における上昇した血漿ＥＰＣＲレベルが、さらなる血栓の危険性を引き起こし、そして脈管損傷/応答の証拠を表すことが示
される。これらが示す状態の例は、内皮細胞刺激、アテローム発生、白血球接着、およびプラークの破裂に関連する障害を含む。
【００８４】
（実施例５：ヒヒ組織およびヒト組織におけるＥＰＣＲの選択的スプライシング形態の同定）
可溶性ＥＰＣＲイソ型が、選択的スプライシング機構によって生成され得るか否かを決定するための最初のアプローチとして、ＲＮＡを、ヒト組織およびヒヒ組織から単離し、そして逆転写酵素−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を遺伝子特異的プライマーを用いて実施した。ヒヒＥＰＣＲゲノム配列は公知ではないが、ヒヒとヒトとは進化のスケールにおいて密接に関連しているという論理に基づいて、ヒト配列に基づくプライマーを使用した。
【００８５】
一般にＲＴ−ＰＣＲ手順において、総ＲＮＡをホモジナイズした組織から単離する。ＲＮＡを、特定のアンチセンスプライマー、ヌクレオチド、および逆転写酵素と混合する。混合において、ＲＮＡは、逆転写酵素についての鋳型として作用し、第１鎖ｃＤＮＡを作製する。次いで、この新しいｃＤＮＡ鋳型を、特定のプライマーおよびＴａｑポリメラーゼを用いて従来のＰＣＲによって増幅する。ＥＰＣＲの膜形態（４２４ｂｐ）および推定の選択的スプライシング産物（６７４ｂｐ）の両方を増幅するプライマーを選択した。ＥＰＣＲの両方の形態に対応する産物を、種々のヒヒ組織（図４）ならびにヒトの肺および
胎盤から増幅した。逆転写酵素を含まないコントロール、および組織との反応における１,８８５ｂｐのバンドの欠失によって判断されるように、ゲノムＤＮＡに関する可能性の
ある夾雑は存在しないようであった。
【００８６】
ヒヒゲノムＤＮＡ配列が、選択的スプライシングのための適切なエキソン−イントロン境界およびイントロン−インフレームリーディング配列を有することを確認するために、ヒヒ腎臓ゲノムＤＮＡ由来のイントロン配列を、従来のＰＣＲによって増幅した。ゲノム構造は種間で保持されるという前提を立て、そしてイントロンＩＩＩに隣接するプライマー（ヒト配列）を使用した。これは、選択的スプライシング配列を含むと考えられるイントロン（ヒト配列）である。ヒヒ腎臓組織をホモジナイズし、そしてＤＮＡを抽出した。ＤＮＡを、特定のプライマーと混合し、そして産物をＰＣＲによって増幅した。ＤＮＡ産物を精製し、そしてアガロースゲルで電気泳動した。
【００８７】
（手順の詳細）
Ａ．ＥＰＣＲ ＥＬＩＳＡ：被覆する抗体は、ＥＰＣＲのリガンド結合ドメインに結合する１４９４ｍＡｂである。検出する抗体は、ビオチン化１４９５ｍＡｂであり、これはプロテインＣ/ＡＰＣ結合をブロックせず、そして１４９４ｍＡｂと交差反応しない。検
出系は、ストレプトアジビン−アルカリホスファターゼおよびＢｌｕｅＰｈｏｓ基質（ＫＰＬ製）である。
【００８８】
Ｂ．組織のＲＴ−ＰＣＲ：組織（５０〜１００ｍｇ）をＴｒｉｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）中にホモジナイズした。ＲＮＡを含む上層を、クロロホルムで抽出し、イソプロパノールで沈殿させ、洗浄し、そしてＤＥＰＣ−水中に溶解した。ＲＮＡ（１〜５μｇ）を、適切な緩衝液中で、製造業者の指示書に従って、ヌクレオチド、ＣＲＥＡアンチセンスプライマー、および逆転写酵素と混合した（第１鎖ｃＤＮＡ合成のためのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔTM Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ，Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）。ｃＤＮＡ産物を、ＣＲＥＳおよびＣＲＥＡプライマーを用いて、従来のＰＣＲによって、３０サイクル増幅した。ｃＤＮＡ産物を、標準的な手順を用いて、クロロホルム抽出およびアルコール沈殿によって精製し、水中に溶解し、そして２％アガロースゲルで電気泳動した。ゲルを、Ｖｉｓｔｒａ Ｇｒｅｅｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で染色し、そしてリン光画像機（ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ）（ＳｔｏｒｍTM ｓｃａｎｎｅｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．）で画像化した。
【００８９】
Ｃ．ヒヒゲノムＤＮＡのＰＣＲ：ヒヒ腎臓ＤＮＡ（８２ｍｇ）を、Ｔｒｉｚｏｌ試薬中にホモジナイズした。ＤＮＡを含む下層を、抽出し、沈殿させ、そして滅菌水中に溶解した。ＤＮＡを、緩衝液、ヌクレオチド、ならびにＨＲＴ−１およびＨＲＴ−２プライマーとの混合液中で、従来のＰＣＲによって、３０サイクル増幅した。増幅したＤＮＡを、標準的な手順を用いて、抽出し、沈殿させ、滅菌水中に溶解し、そして２％アガロースゲルで電気泳動した。単一のバンド（４６５ｂｐ）を、エチジウムブロミドで可視化し、切り出し、そしてＰＣＲ産物を、製造業者の指示書（Ｑｉａｇｅｎ）に従ってスピンカラムで精製した。ＰＣＲ産物を、同じプライマーを用いて配列決定した。
【００９０】
（Ｄ．プライマー配列）
ＣＲＥＳ：５'−ＴＣＧＴＧＣＧＣＣＴＧＧＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＧＣ−３'
（エキソンＩＩの末端近くの５'センスプライマー）
ＣＲＥＡ：５'−ＣＧＣＣＧＴＣＣＡＣＣＴＧＴＧＣＡＣＡＧＧＡＡＧ−３'
（エキソンＩＶ内の３'アンチセンスプライマー）
ＨＲＴ−１：５'−ＡＧＣＡＧＣＴＣＡＡＴＧＣＣＴＡＣＡＡＣＣＧ−３'
（エキソンＩＩＩの末端近くの５'センスプライマー）
ＨＲＴ−２：５'−ＣＣＧＴＡＧＡＡＧＧＡＣＡＣＧＴＧＴＣＣＡＣＣＴＧＣＣＧＣ−
３'
（エキソンＩＶ内の３'アンチセンスプライマー）
（ヒヒ組織に関する結果）
ゲルから切り出され、精製され、そして配列決定された腎臓ゲノムＤＮＡから増幅された単一のバンドが存在した。その配列は、ヒト配列に対して９２％同一であり、そしてエキソン−イントロン境界は保存された。このイントロン配列における高レベルの類似性は重要である。なぜなら、イントロン配列は、代表的には種間において十分には保存されないからである。終止コドンを有するイントロン内のインフレームリーディング配列もまた存在し、このことは、ヒヒの選択的にスプライシングした可溶性タンパク質中の特有の２２残基のカルボキシル末端テイルを予測する。
【００９１】
推定の可溶性ＥＰＣＲイソ型が、特有のカルボキシル末端テイルを有するという観察は、イソ型特異的抗体を使用するイソ型間の区別のための構造的差異を提供する。実用モデルとしては、タンパク質分解された可溶性ＥＰＣＲの血漿レベルが内皮損傷を報告する一方で、選択的スプライシングを受けた可溶性ＥＰＣＲのレベルが刺激に対する内皮応答を報告するというものである。可溶性ＥＰＣＲイソ型の相対的血漿レベルが、特定の病理学における大きな脈管の内皮機能不全および損傷に関する情報を提供することが期待される。
【００９２】
（ヒト組織に関する結果）
ヒト組織（胎盤、肺、および舌）由来のＲＴ−ＰＣＲ産物を、ＥＰＣＲに特異的なＣＲＥＳ/ＣＲＥＡプライマーを用いて電気泳動した。手順は、ヒヒ組織について使用された
手順と同じであった。ＥＰＣＲの膜イソ型（ｍＥＰＣＲ）および選択的スプライシングを受けた可溶性ＥＰＣＲイソ型（ｓＥＰＣＲ）に対応する産物を観察した。産物は、ヒヒ組織を用いて観察された産物と本質的に同じようである。唯一の差異は、胎盤組織がさらなる産物を有するようであることである。
【００９３】
（配列表）
【００９４】
【表２】
【００９５】
【表３】
【００９６】
【表４】
【００９７】
【表５】
【００９８】
【表６】
【００９９】
【表７】
【０１００】
【表８】
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】図１は、膜結合レセプターをタンパク質分解して細胞外ドメインを遊離しそして膜アンカーを残すこと、およびｍＲＮＡの選択的スプライシングによって、ＥＰＣＲに適用されるような可溶性レセプターを産生するための２つの既知のメカニズムの概略図であり、膜結合ＥＰＣＲ（ｍＥＰＣＲ）およびタンパク質分解血漿ＥＰＣＲ（ｐＥＰＣＲ）に特有の配列、ならびに可溶性ＥＰＣＲ（ｓＥＰＣＲ）に特有の配列を示す。
【図２】図２は、ｍＥＰＣＲおよびｓＥＰＣＲを比較する概略図であり、ヌクレオチドインサートおよびｓＥＰＣＲに特有のコードされたアミノ酸配列を示す。
【図３】図３は、選択的スプライシングによってヒト、ウシ、マウス、およびヒヒのＥＰＣＲに挿入された配列を示す。
【図４】図４ａは、可溶性血漿ＥＰＣＲがヒトプロテインＣおよびＡＰＣに結合することを示すグラフである。ＥＡ.ｈｙ９２６細胞を、氷上で30分間０〜５００ｎＭｒｓＥＰＣＲ（黒丸）または血漿ＥＰＣＲ（白丸）の存在下で、６０ｎＭ ｆｌ−ＡＰＣと共にインキュベートした。細胞を洗浄し、そして細胞結合した蛍光を、記載のようにフローサイトメトリーによって決定した。ｆｌ−ＡＰＣを添加しない場合での固有の細胞蛍光を、矢印で示す。プロットした平均細胞蛍光（ＭＣＦ）は、２連のＭＣＦ測定の平均を表す。 図４ｂおよび４ｃは、可溶性血漿ＥＰＣＲおよびｒｓＥＰＣＲが、細胞表面上でプロテインＣ活性化を阻害することを示すグラフである。図４ｂでは、ＥＡ.ｈｙ９２６細胞単層を、０.１μＭプロテインＣ単独（白四角）、または１μＭ ｒｓＥＰＣＲ（黒丸）、または２μｇ/ｍｌ １４９４ｍＡｂ（白丸）と共に、室温にて１５分間プレインキュベートした。プロテインＣ活性化を、トロンビン（２ｎＭ最終）の添加によって開始し、そして反応を、所定の時間で停止した。活性化プロテインＣを、アミド分解アッセイで決定し、そして活性速度をｍＯＤ/分で各時点についてプロットした。トロンビンを添加しないコントロールウェルを含ませた（黒四角）。各データ点は、３連のウェル測定の平均を表す。図４ｃでは、ＥＡ.ｈｙ９２６細胞単層を、０.１μＭのプロテインＣおよび示された濃度の血漿ＥＰＣＲ（白丸）またはｒｓＥＰＣＲ（黒丸）と共に、室温にて１５分間プレインキュベートした。トロンビン（最終２ｎＭ）を添加し、そして活性化を室温にて６０分間行った。上清を、アンチトロンビンおよびヘパリンの混合物に添加し、そして活性化プロテインＣ活性（ｍＯＤ/分）を、アミド分解アッセイで決定した。各データ点は、３連のウェル測定の平均を表す。 図４ｄは、可溶性血漿ＥＰＣＲがＡＰＣ抗凝固活性を阻害することを示すグラフである。ＡＰＣ（２５ｎＭ）の抗凝固活性を、４６０ｎＭの血漿ＥＰＣＲまたはｒｓＥＰＣＲの存在下で、１段階Ｘａ凝血アッセイを用いて決定した。この効果は、いずれかの可溶性ＥＰＣＲを、ＥＰＣＲへのＡＰＣの結合をブロックする、４２μｇ/ｍｌの１４９６ｍＡｂと共に、５分間プレインキュベートした場合には逆転した。データは、４〜６測定の平均±Ｓ.Ｄ.を表す。
【図５】図５は、狼瘡患者において、可溶性血漿ＴＭのレベルを可溶性血漿ＰＣＲと比較するグラフであり、ＴＭ値とＥＰＣＲ値との間に相関はないが、狼瘡患者の大多数が、可溶性血漿ＥＰＣＲの非常に上昇したレベルを示すことを証明する。
【図６】図６は、ｓＴＭ（正常）、ｓＴＭ（敗血症）、ｓＥＰＣＲ（正常）、およびｓＥＰＣＲ（敗血症）についての可溶性レセプター濃度（ｎｇ/ｍｌ）のグラフである。ｓＴＭとｓＥＰＣＲとの間に相関はない（ｒ2＝０．０３４）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００８−１６４６３５（Ｐ２００８−１６４６３５Ａ）
【公開日】平成２０年７月１７日（２００８．７．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−６６８６３（Ｐ２００８−６６８６３）
【出願日】平成２０年３月１４日（２００８．３．１４）
【分割の表示】特願２００６−２００１２８（Ｐ２００６−２００１２８）の分割
【原出願日】平成１０年６月２６日（１９９８．６．２６）
【出願人】（５９４００３６７６）オクラホマ メディカル リサーチ ファウンデーション (14)
【氏名又は名称原語表記】ＯＫＬＡＨＯＭＡ ＭＥＤＩＣＡＬ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ
【住所又は居所原語表記】８２５ Ｎ．Ｅ． １３ｔｈ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｏｋｌａｈｏｍａ Ｃｉｔｙ，Ｏｋｌａｈｏｍａ ７３１０４，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年７月１７日（２００８．７．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月１４日（２００８．３．１４）
【分割の表示】特願２００６−２００１２８（Ｐ２００６−２００１２８）の分割
【原出願日】平成１０年６月２６日（１９９８．６．２６）
【出願人】（５９４００３６７６）オクラホマ メディカル リサーチ ファウンデーション (14)
【氏名又は名称原語表記】ＯＫＬＡＨＯＭＡ ＭＥＤＩＣＡＬ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ
【住所又は居所原語表記】８２５ Ｎ．Ｅ． １３ｔｈ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｏｋｌａｈｏｍａ Ｃｉｔｙ，Ｏｋｌａｈｏｍａ ７３１０４，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【Ｆターム（参考）】
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