可逆的に不死化された細胞及びそれに関連する方法
本発明は、可逆的に不死化された細胞の作製方法、上記の方法によって入手可能な細胞、１つ又はそれ以上の不死化タンパク質をコードする１つ又はそれ以上の核酸を含む真核細胞及びこれらの細胞を再分化する方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、可逆的に不死化された細胞の作製方法、上記方法によって入手可能な細胞、１つ又はそれ以上の不死化タンパク質をコードする１つ又はそれ以上の核酸を含む真核細胞及びこれらの細胞を再分化する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
早くも１９世紀には、摘出された動物心臓の鼓動を体外で維持する方法があった。２０世紀の初めには、組織培養の方法論を確立する実験が報告された。細胞培養技術は、１９４０年代及び１９５０年代に進歩してウイルス学における研究を支えた。動物細胞培養は、１９００年代中頃に一般的な実験室技術になった。
【０００３】
一般に、細胞培養の概念には、生体外培養のために組織から細胞、別名初代細胞（primary cells）を単離することが含まれる。このために、コラゲナーゼ、トリプシン又はプロナーゼのような酵素による酵素消化によって初代細胞を遊離してもよい。別法として、組織の断片を適切な増殖培地に置き、そして培養のための増殖用の細胞を入手することができる。
【０００４】
いくつかの腫瘍から誘導された細胞を除いて、ほとんどの初代細胞培養物は、限られた寿命を有する。さらにまた、多くの場合、初代細胞は、培養における増殖能が限られており、そして継代延長により複製老化を受けるか（すなわち内皮細胞、平滑筋細胞）又は全く増殖しない（例えば肝細胞、心筋細胞）。
【０００５】
従って、細胞に基づく実験は、複数のドナーを必要とし、そしてヒトの場合、細胞により重大な問題：ドナーの遺伝的差異、薬物乱用などが生じる。
【０００６】
多くの調査実験は、腫瘍から誘導された細胞株で実施する。しかし、腫瘍由来の細胞は、分化が不正確であることが多く、そして重要な組織特異的遺伝子の発現が遺伝的に不安定である。従って、それらの欠点を回避することによって初代細胞及び腫瘍由来の細胞株の利点を合わせた新たな細胞を提供することが望ましい。
【０００７】
初代細胞の増殖能が限られている一つの理由は、細胞分裂ごとに生じる進行性のテロメア短縮化であり、これは最終的に細胞老化に至る。ＳＶ４０ Ｔ抗原を発現させて第２の不可逆的な危機が生じる前にさらなる回数の細胞分裂により細胞を成長させることができる細胞の改変方法が報告されている。生体内で収穫された初代細胞をインビトロで無限に増殖するように誘導する方法を細胞不死化と称する。
【０００８】
いくつかの研究は、一連の増殖促進及び抗老化遺伝子を組み合わせて発現することが必要な段階的方法においてヒト細胞を形質転換することができることを示した。従って、適当な遺伝子操作により、培養において制御された細胞増殖を誘導することは可能でありうる。さらに、培養においてヒト不死化細胞株を樹立することは可能であった。ヒトテロメラーゼ触媒ユニットの発現により、増殖停止を阻止し、そしてヒト線維芽細胞及び上皮細胞を不死化することができる。しかし、ヒトテロメラーゼ触媒ユニット単独の発現では、限定数しか不死化することができなかった。ほとんどの細胞タイプは、ＳＶ４０ Ｔ抗原をコードしている遺伝子のような第２の遺伝子の発現を必要とする。培養における不死化細胞の連続増殖は、その初代細胞に相当する物と比較したときに組織特異的遺伝子の発現を下方制御する。２つの癌遺伝子（ＳＶ４０ Ｔ癌タンパク質及びＨ−ｒａｓの癌遺伝子対立遺伝子）と組み合わせたヒトテロメラーゼ触媒サブユニットの発現は、上皮細胞及び線維芽細胞のような正常なヒト細胞に直接的な腫瘍形成転換を生じることが報告されている。さらにまた、ヒトテロメラーゼ触媒ユニットが単独で又は１つ若しくはそれ以上の他の遺伝子と組み合わせて、腎近位尿細管上皮細胞で発現された場合にも初代ヒト細胞の不死化が報告されている。近位尿細管細胞を不死化するこの方法は、これらの細胞により十分に機能したが、ＨＵＶＥＣ、肝細胞、平滑筋細胞及び間葉性幹細胞を含むいくつかの他のヒト初代細胞では機能しなかった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、細胞又はその前駆体が種々の細胞タイプから誘導することができ、及び／又は複製老化を示すことなく増殖することができると同時に初代細胞の魅力的な性質、例えば安定な遺伝子型及びその分化レベルを有する細胞及びその作製方法を提供することが本発明の目的である。新規な細胞モデルの開発は、生物学的及び薬学的研究にとって、特に化合物プロファイリング、表現型スクリーニング、標的同定及び／又は標的検証にとって最も重要である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
驚くべきことに、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６／Ｅ７は、上皮細胞、内皮細胞及び肝細胞を含むいくつかの真核細胞中で発現されたときに、細胞を不死化できることが見出された（実施例を参照のこと）。
【００１１】
従って、第１の態様において、本発明は、可逆的に不死化された細胞の作製方法であって、
ａ）真核細胞を準備し、
ｂ）工程ａ）の細胞を遺伝子改変して細胞中で１つ又はそれ以上の不死化タンパク質をコードする１つ又はそれ以上の核酸の発現を可能にし；そして
ｃ）工程ｂ）の細胞中で１つ又はそれ以上の核酸を発現させる
ことを含む方法であって、
その際、１つ又はそれ以上の不死化タンパク質は、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６／Ｅ７又はその機能的に活性な変異体を含む前記方法に関する。
【００１２】
上に詳述したように、ヒト初代細胞の限られた増殖能は、現在、多くの用途におけるその使用を妨げている。細胞を不死化する方法は記載されてきたが、しかしながら、それらは上に詳述された欠点がある。本発明は、細胞を遺伝子改変によって可逆的に不死化された細胞を作製し、そして場合により１つ又はそれ以上の他の遺伝子と併せてＨＰＶ Ｅ６／Ｅ７を発現する新規な方法を開発して代替方法を提供し、そして好ましくはこれらの欠点を克服したことを開示している。
【００１３】
本発明の方法の工程ａ）では、被験者から得た後に直接用いることで真核細胞を準備してもよい。別法として、細胞を培養した後、工程ｂ）の遺伝子改変を実施してもよい。また、細胞は、細胞株から誘導してもよい。しかし、初代細胞、すなわち新たに単離された細胞、又は短期間、すなわち多くとも４週間、好ましくは多くとも３週間、より好ましくは少なくとも２週間、なおより好ましくは多くとも７、６、５、４、３、２又は１日培養された細胞が好ましい。
【００１４】
「真核細胞」という用語は、動物、植物、真菌及び原生生物から誘導された細胞を含む。これらの細胞は、膜内に囲まれた複雑な構造に組織化されている。
真核細胞は、核を有する原核細胞とは異なる。多くの真核細胞は、ミトコンドリア、葉緑体及びゴルジ体のような他の膜結合細胞小器官を含む。真核細胞中の細胞分裂は、核のない生物（原核生物）とは異なる。それは、微小管に誘導された運動による重複染色体の分離を含む。２つのタイプの分裂過程がある。有糸分裂では、１つ細胞が分裂して２つの遺伝的に同一の細胞を生じる。減数分裂は、有性生殖に必要である。
【００１５】
上に詳述したように、工程ａ）で得た細胞を工程ｂ）で遺伝子改変して細胞中で１つ又はそれ以上の不死化タンパク質をコードする１つ又はそれ以上の核酸の発現を可能にし、その際、１つ又はそれ以上の不死化タンパク質は、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６／Ｅ７を含む。遺伝子改変の方法、特に遺伝子の導入は、当業者によく知られている。
【００１６】
ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６／Ｅ７は、ＨＰＶによって発現される重要な発癌性タンパク質に相当する。癌及び前癌性病変に関連する身体的変化を生じることが知られているＨＰＶの菌株の中では、３つの癌タンパク質：Ｅ５、Ｅ６及びＥ７が認められている。従って、ＨＰＶ Ｅ６／Ｅ７という用語は、個々のもの又は融合タンパク質のずれかとしてのタンパク質の組み合わせのことである。
【００１７】
完全長ＨＰＶ Ｅ６遺伝子は、約１５０〜１６０個のアミノ酸のタンパク質をコードしており、それは亜鉛結合Ｃｙｓ−Ｘ−Ｘ−Ｃｙｓモチーフを含む２つのドメインを含む。Ｅ６は、細胞中で複数の役割があり、多くの他のタンパク質と相互作用すると考えられているため、特に興味深い。Ｅ６は、主に腫瘍抑制因子として作用するｐ５３又はｐＲＢタンパク質と結合することでそれらを不活性化することによって癌を生じる。腫瘍抑制タンパク質が不活性化されたとき、腫瘍成長は無制限に進行する。Ｅ６とｐ５３及びｐＲＢとの相互作用は、ユビキチン化及びユビキチンリガーゼによる分解のためにこれらのタンパク質をマークする。Ｅ６は、他の細胞タンパク質上で作用し、そしてテロメラーゼ活性に正の影響を与え、それにより細胞がチェックなしに分裂するのを通常阻止する道筋の１つを不活性化することがわかっている。さらに、Ｅ６は、細胞転写因子、Ｅ２Ｆ１／ＤＰ１と相互作用するとき転写補因子、具体的には転写活性化剤として作用することができる。
【００１８】
Ｅ６は、しばしばシグナル伝達タンパク質中に見出されるＰＤＺドメインに結合することもできる。これらの位置での結合は、ＤＬＧタンパク質の形質転換及びその抑制機能の破壊が起こる。また、Ｅ６タンパク質は、ＭＡＧＵＫ（膜結合性グアニル酸キナーゼファミリー）タンパク質とも相互作用し、通常、構造タンパク質であってＤＬＧの抑制活性に関与していると考えられる。Ｅ６がＭＡＧＩタンパク質上のＰＤＺドメインと複合体形成するとき、Ｅ６はその形状を変形させ、それによってその機能を妨げる。全体として、Ｅ６タンパク質は、癌に特有の高められた速度で細胞を増殖及び倍加させるようなやり方で正常なタンパク質活性を妨げる役割を果たす。
【００１９】
Ｅ７タンパク質は、約１００個のアミノ酸のサイズであり、そしてまたＥ６と同様に２部のＣｙｓ−Ｘ−Ｘ−Ｃｙｓドメインを含む。癌タンパク質として、Ｅ７は、網膜芽細胞腫腫瘍抑制遺伝子産物の活性形態、低リン酸化ｐＲＢと複合体を形成することにより機能し、そのタンパク質分解を促進する。Ｅ７／ｐＲＢ複合体の形成は、ｐＲＢとＥ２Ｆとの複合体形成を妨げる。それゆえ、Ｅ２ＦがｐＲＢとの不活性化された組み合わせから解放されると転写活性化剤としてその作用を続けてＤＮＡ合成及び細胞増殖を促進する。
【００２０】
ハイリスクＨＰＶ感染細胞では、Ｅ６及びＥ７は、通常、共発現される。ハイリスクＨＰＶ Ｅ７癌タンパク質は、ｐＲＢ並びに関連するｐＲＢファミリーメンバーｐ１０７及びｐ１３０．１７と結合して分解するだけでなく、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害剤を不活性化する。その結果、サイクリンＥ、サイクリンＡの発現が異常に増加し、そしてＥ２Ｆが介在するＣＤＫ２活性が異常になる。また、Ｅ２Ｆは、ｐ１４ＡＲＦを活性化してｐ５３を安定化することができる。細胞増殖を促進するＥ７と共同して、ハイリスクＨＰＶ Ｅ６癌タンパク質は、宿主細胞タンパク質、Ｅ６−ＡＰと相互作用することによってｐ５３の迅速なプロテアソーム分解を誘導する。Ｅ６又はＥ７の核酸又はアミノ酸配列は、同じものを含むか又は発現するあらゆるＨＰＶタイプから誘導してもよい。１００を超える異なるＨＰＶタイプが同定されており、数字で呼ばれている。タイプ１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６８、７３及び６８は、「ハイリスク」ＨＰＶ（癌に至ることがあるため）の例であり、そのため上記配列にとっての好ましい供給源である。ＨＰＶ Ｅ６／Ｅ７の非常に好ましいｃＤＮＡは、SEQ ID NO：４として表記される。
【００２１】
また、本発明は、ＨＰＶ Ｅ６／Ｅ７の機能的に活性な変異体を包含する。変異体は、Ｅ６／Ｅ７断片であってもよく、その際、断片は細胞をなお不死化することができる。これは、短いＣ末端及び／又はＮ末端欠失（例えば多くとも２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１個のアミノ酸の欠失）を有するＥ６／Ｅ７タンパク質を含んでもよい。別法として又はさらに、Ｅ６／Ｅ７タンパク質は、１つ又はそれ以上のアミノ酸置換を含んでもよい。しかし、アミノ酸が化学的に関連するアミノ酸で置換された同類アミノ酸置換（conservative amino acid substitution）は、好ましい。典型的な同類置換は、脂肪族アミノ酸の中からであり、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の中からであり、酸性残基を有するアミノ酸の中から、アミド誘導体の中から、塩基性残基を有するアミノ酸、又は芳香族残基を有するアミノ酸の中からである。Ｅ６／Ｅ７変異体は、場合により他の不死化タンパク質と組み合わせて細胞をなお不死化することができる場合、本発明により機能的に活性である。細胞を不死化する能力は、細胞の増殖に関して、そして本発明の実施例において記載されたように、例えば免疫染色により不死化細胞及び対照細胞の量を比較し、全ＲＮＡを測定し、細胞形態、細胞生存（場合により不利な条件下）又は細胞数を測定して試験することができる。本発明に関して、変異体の活性が配列変更のないＥ６／Ｅ７タンパク質の活性の少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、なおより好ましくは少なくとも８０％、とりわけ少なくとも９０％、特に少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％に達する場合、変異体は、細胞を不死化する能力を有する。
【００２２】
本発明の以下の説明において、Ｅ６／Ｅ７に関して提供されるすべての詳細は、特に明記しない限り、その機能的に活性な変異体にも関連する。
【００２３】
しかし、最も好ましくは、Ｅ６／Ｅ７は、自然発生Ｅ６／Ｅ７、なおより好ましくは、ＨＰＶ Ｅ６／Ｅ７であり、最も好ましくは、ｃＤＮＡによってコードされたＨＰＶ Ｅ６／Ｅ７は、SEQ ID NO：４として表記される。
【００２４】
「核酸」という用語は、本明細書において詳細に議論されたあらゆる核酸分子、好ましくはＤＮＡのことである。核酸分子は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ＲＮＡ又はそれらの組み合わせを含むさまざまな供給源から誘導してもよい。このような核酸配列は、ゲノムＤＮＡを含んでもよく、それは自然発生のイントロンを含んでもよいし又は含まなくてもよい。さらに、このようなゲノムＤＮＡは、プロモーター領域、ポリＡ配列又は他の関連配列と共に入手してもよい。ゲノムＤＮＡは、当分野でよく知られている手段によって適切な細胞から抽出し、そして精製してもよい。別法として、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を細胞から単離して使用し、逆転写又は他の手段によってｃＤＮＡを作製することができる。
【００２５】
遺伝子改変の前に、通常、興味の遺伝子、ここでは細胞中の１つ又はそれ以上の不死化タンパク質をコードする１つ又はそれ以上の核酸を単離する。その後、核酸、好ましくはＤＮＡ又はｃＤＮＡを、細胞の改変を可能にするやり方で処方する。例えばトランスフェクションによって、すなわち、非ウイルス的方法により細胞に核酸を導入する方法によって、又は形質導入、すなわち、ウイルスによる遺伝物質の挿入により生じる細胞の遺伝的変性によって真核細胞に外来ＤＮＡを導入する種々の方法がある。
【００２６】
多くの物質がトランスフェクション用の担体として使用されており、それは３種類：（カチオン性）ポリマー、リポソーム及びナノ粒子に分けることができる。これは、トランスフェクションによって、例えばリン酸カルシウム沈殿によって実施してもよい。別の方法は、カチオンポリマー、例えばＤＥＡＥ−デキストラン又はポリエチレンイミンの使用である。負に荷電されたＤＮＡはポリカチオンに結合し、そして複合体はエンドサイトーシスを介して細胞に取り込まれる。トランスフェクションに対する直接的なアプローチは遺伝子銃であり、ここでは、ＤＮＡを不活性固形物（一般に金）のナノ粒子に結合し、次いで、それを標的細胞の核に直接「注射する（shot）」。
【００２７】
トランスフェクションでは、遺伝子又はｃＤＮＡを適切なベクター中に移してもよい。ベクターは、プラスミド又はウイルスベクターであってもよい。核酸は、当業者に知られている制限酵素及びリガーゼを用いてベクター中に導入してもよい。ベクターを得たら、それを用いて興味の細胞を形質転換することができる。形質転換後、遺伝子改変された細胞を、ベクターの取込みに失敗したものから種々のやり方で選別する。１つの方法は、移植しようとした興味の遺伝子に固着することができるＤＮＡプローブを用いたスクリーニングである。もう１つは、マーカーの使用である。マーカー遺伝子を用いてベクターの存在を検査し、それにより感染及び組込みを確認してもよい。マーカー遺伝子の存在により、挿入物を発現するそれらの宿主細胞のみの選別及び増殖が保証される。典型的な選択遺伝子は、抗生物質並びに他の毒性物質、例えばヒスチジノール、プロマイシン、ハイグロマイシン、ネオマイシン、メトトレキセート及び細胞表面マーカーに対する耐性をもたらすタンパク質をコードしている。別法として、検出可能なタンパク質をコードする遺伝子を、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又は黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）を含む蛍光タンパク質のようなマーカーとして使用してもよい。
【００２８】
さらにまた、遺伝子又はｃＤＮＡを、核酸の有効な移入又は核酸の発現を可能する適切な要素と組み合わせてもよい。これらは、核酸の転写を制御する要素、例えばプロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択可能な要素及びレポーター遺伝子であってもよい。さらに、適切な制限酵素認識部位を、興味の核酸に加えてもよい。
【００２９】
さらにまた、キャッピング、スプライシング、ポリ（Ａ）末端付加によって翻訳を制御し、そして配列特異的な核外移行速度を変える要素が存在してもよい。
【００３０】
ベクターを用いる場合、１つ又はそれ以上の核酸が１つ又はそれ以上のベクターの一部であってもよい。複数のベクターを用いる場合、それらを同時に又は順次、細胞中に導入してもよい。ウイルスベクターは、細胞中に遺伝物質を送達するために一般に用いられる手段である。この方法は、生きている生物内（インビボ）で又は細胞培養（インビトロ）において実施することができる。ウイルスは特殊な分子機構を発達させてそれらが侵入する細胞内部にそれらのゲノムを有効に運ぶ。ウイルスによる遺伝子の送達は、形質導入と称し、そして感染細胞は形質導入されたと記載される。
【００３１】
当初、ウイルスベクターは、分子遺伝学実験用の裸のＤＮＡのトランスフェクションに対する代替物として開発された。遺伝子をコードするタンパク質は、一般に特定のタンパク質の機能を研究するためのウイルスベクターを用いて発現することができる。ウイルスベクター、とりわけレトロウイルスは、遺伝物質を細胞に移入するために広く用いられる（また、下記参照）。他のタイプのウイルスベクターは、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。ＡＡＶは、分裂及び非分裂細胞の両方に感染することができ、そしてそのゲノムを宿主細胞のそれに組み込むことができる。これらの特徴によりＡＡＶは、ウイルスベクターを作成するための非常に魅力的な候補物質となっている。非常に好ましいベクターの配列は、SEQ ID NO：６として表記される。
【００３２】
工程ｂ）において細胞を遺伝子改変した後、細胞中で１つ又はそれ以上の不死化タンパク質をコードする１つ又はそれ以上の核酸を発現する。細胞は、例えば、発現が構成的に活性なプロモーターによって制御される場合、なんらかのさらなる相互作用なしに、１つ又はそれ以上の不死化タンパク質をコードする１つ又はそれ以上の核酸を発現することができる。あるいは、例えば、誘導性プロモーターが１つ又はそれ以上の核酸に結合した場合、発現を誘導する必要がありうる。
【００３３】
この方法では、真核細胞、好ましくは下記定義された初代細胞を準備し、そして改変された細胞が不死化タンパク質ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６／Ｅ７をコードする１つ又はそれ以上の核酸を発現するように遺伝子改変する。さらに、また、１つ又はそれ以上の核酸は、ＳＶ４０ラージＴ抗原（ＴＡＧ）；テロメラーゼ触媒サブユニット（ＴＥＲＴ）；又はＳＶ４０ラージＴ抗原（ＴＡＧ）及びテロメラーゼ触媒サブユニット（ＴＥＲＴ）を含むさらなる不死化タンパク質をコードしてもよい。従って、ＨＰＶ Ｅ６／Ｅ７をコードする核酸は、遺伝子改変によって細胞中に導入された唯一の核酸であってもよい。
【００３４】
しかし、本発明の好ましい実施態様において、１つ又はそれ以上の不死化タンパク質は、
・ＨＰＶ Ｅ６／Ｅ７及びＳＶ４０ラージＴ抗原（ＴＡＧ）；又は
・ＨＰＶ Ｅ６／Ｅ７及びテロメラーゼ触媒サブユニット（ＴＥＲＴ）；又は
・ＨＰＶ Ｅ６／Ｅ７及びＳＶ４０ラージＴ抗原（ＴＡＧ）及びテロメラーゼ触媒サブユニット（ＴＥＲＴ）
を含むか又はそれらからなる。また、これらの機能的に活性な変異体も含まれる。
【００３５】
ＳＶ４０ラージＴ抗原（Simian Vacuolating Virus 40 Tag、ＴＡＧとも称する）は、さまざまな細胞タイプを形質転換することができる、ポリオーマウイルスＳＶ４０から誘導された癌遺伝子である六量体タンパク質である。ＴＡＧの形質転換活性は、ラージ部分における網膜芽腫（ｐＲＢ）及びｐ５３腫瘍抑制タンパク質のその摂動（perturbation）による。さらにＴＡＧは、その形質転換機能に寄与しうる転写補活性化因子ｐ３００及びＣＢＰを含むいくつかの他の細胞性因子と結合する。
【００３６】
ＴＡＧは、ＳＶ４０によるウイルス感染の際に転写される初期遺伝子の産物であり、そしてウイルスのゲノム複製及び宿主細胞周期の制御に関与している。ＳＶ４０は、二本鎖ＤＮＡウイルスであり、パポバウイルスファミリー、ポリオーマウイルス属に属する。ポリオーマウイルスは、多種多様な脊椎動物に感染し、それにより複数の部位で固形腫瘍を生じる。ＳＶ４０ ＤＮＡ複製は、ゲノムの起点領域（origin region）にＴＡＧが結合することによって開始される。ＴＡＧの機能は、リン酸化によって制御され、それはＳＶ４０起点への結合を弱める。ＴＡＧとＤＮＡポリメラーゼ−アルファとの間のタンパク質−タンパク質相互作用は、ウイルスゲノムの複製を直接刺激する。また、ＴＡＧは、腫瘍抑制タンパク質（ｐ５３、ｐ１０５）と結合して不活性化する。これにより細胞がＧ１期を離れてＳ期に入り、ＤＮＡ複製を促進する。
【００３７】
本明細書に使用される「テロメラーゼ触媒サブユニット」又は「ＴＥＲＴ」という用語は、テロメラーゼ触媒活性を有するポリペプチド配列のことである。テロメラーゼは、真核染色体の末端に見出される、テロメア領域中ＤＮＡ鎖の３'（「３'末端」）末端に特異的なＤＮＡ反復配列（すべての脊椎動物中の「ＴＴＡＧＧＧ」）を加えた酵素である。テロメアは、濃縮ＤＮＡ物質を含み、染色体に安定性を与える。酵素は、それ自体ＲＮＡ分子を担持する逆転写酵素であり、それはテロメアを延長するときにテンプレートとして用いられ、テロメアは複製周期の後ごとに短縮される。それは、それぞれ２分子のテロメラーゼ触媒サブユニット、別名テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）；テロメラーゼＲＮＡ（ｈＴＲ又はＴＥＲＣ）；及びジスケリン（dyskerin）からなる。ＴＥＲＴは、テンプレートとして一本鎖ＲＮＡを用いて一本鎖ＤＮＡを作成する逆転写酵素である。
【００３８】
また、本発明に関して、ＴＡＧ及び／又はＴＥＲＴの機能的に活性な変異体を用いてもよい。「変異体」及び「機能的に活性な」という用語は、Ｅ６／Ｅ７の変異体に関して上記定義された通りである。本発明の以下の説明において、Ｅ６／Ｅ７に関して記載されたすべての詳細は、特に明記しない限り、その機能的に活性な変異体にも関連する。
【００３９】
一実施例において、第１のベクターは、ＨＰＶ Ｅ６／Ｅ７をコードするポリヌクレオチドを含むのに対して、第２のベクターは、ＳＶ４０ラージＴ抗原（ＴＡＧ）；テロメラーゼ触媒サブユニット（ＴＥＲＴ）；又はＳＶ４０ラージＴ抗原（ＴＡＧ）及びテロメラーゼ触媒サブユニット（ＴＥＲＴ）をコードするポリヌクレオチドをコードする核酸を含む。
【００４０】
別の態様において、本発明は、可逆的に不死化された細胞の作製方法であって、
ａ）真核細胞を準備し、
ｂ）工程ａ）の細胞を遺伝子改変して細胞中で１つ又はそれ以上の不死化タンパク質をコードする１つ又はそれ以上の核酸の発現を可能にし；そして
ｃ）工程ｂ）の細胞中で１つ又はそれ以上の核酸を発現する、
ことを含み、
その際、１つ又はそれ以上の不死化タンパク質の少なくとも１つは、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６／Ｅ７、ＳＶ４０ラージＴ抗原及びテロメラーゼ触媒サブユニット（ＴＥＲＴ）、又はそれらのいずれかの機能的に活性な変異体からなる群より選ばれ、そして１つ又はそれ以上の不死化タンパク質をコードする１つ又はそれ以上の核酸の発現は、ＥＦ１アルファプロモーターによって制御されることを含む前記方法に関する。
【００４１】
驚くべきことに、プロモーターＥＦ１アルファ（詳細については、下記参照）は、他よりも良好な発現レベルを示すことが見出された。いくつかのプロモーターを異なる初代細胞において試験した。異なるプロモーターの制御下でＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）ｃＤＮＡを発現することによって、ＣＭＶ（サイトメガロウィルス）プロモーター及びＭＳＣＶ（マウスサイトメガロウィルス）プロモーターではそれぞれ極めて高い又は極めて低いレベルの発現となったのに対して、ＥＦ１アルファプロモーターでは中程度の発現レベルが得られることを示すことができた。本発明のこの態様のすべての用語は、この説明において詳述された通り定義される。
【００４２】
本発明のさらなる実施態様において、本発明の方法は、
ｄ）工程ｃ）の細胞を増殖させる
ことをさらに含む。
【００４３】
本発明によれば、工程ｃ）の細胞は、細胞生存度、増殖及び完全性を可能にする有効な条件下で細胞を増殖させてもよい。本明細書において、増殖とは、インビトロで培養することによるものである。増殖とは、細胞成長及び分裂の結果として細胞数が増加することであり、それは細胞培養によって達成してもよい。好ましくは、増殖とは、少なくとも１つの細胞の倍加である。増殖をモニタリングする可能な方法としては、増殖に関連する抗原の検出、ＤＮＡ合成の測定、及び細胞内環境の還元（reduction）の検出が含まれるが、それらに制限されるわけではない。ＤＮＡ合成は、例えば３Ｈ−チミジンの取り込み又は５−ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の取り込みを定量化することによって測定してもよい。細胞内環境の還元は、テトラゾリウム塩の還元によってモニターしてもよい。生存度は、生存及び複製するための細胞の能力のことである。細胞生存度を測定するために一般に用いられるアッセイには、トリパンブルー色素排除、ニュートラルレッド染色、クリスタルバイオレット包摂、及び51Ｃｒリリースが含まれるが、それらに制限されるわけではない。この方法によって産生された安定なクローンは、不死化されたら、培養において少なくとも２ヵ月間培養することができる。好ましい実施態様において、これらの安定なクローンは、少なくとも６ヵ月、好ましくは少なくとも１年、そして最も好ましくは少なくとも２年間、培養において継代することができる。これらの安定なクローンは、それが誘導された細胞タイプに関連する高レベルの機能及び特徴を有し続ける。
【００４４】
細胞培養のため、細胞は、細胞産生を助長する適切な条件下で増殖される。温度及びガス混合物を除いて、細胞培養系において最も一般に異なる要因は、増殖培地である。増殖培地の処方は、ｐＨ、グルコース濃度、増殖因子及びとりわけ他の栄養成分の存在で変えることができる。補充培地に用いられる増殖因子は、多くの場合、仔ウシ血清のような動物血液に由来する。培養条件は、各細胞タイプで広く変化し、そして特定の細胞タイプについての条件を変えることにより異なる表現型を発現することができる。
【００４５】
細胞は、懸濁液又は付着性の培養中で増殖することができる。いくつかの細胞は、血流中に存在する細胞のように表面に付着することなく懸濁液中で自然に生きている。また、可能な付着条件より高密度に増殖することができるように懸濁培養液中で生存することができるように改良された細胞もある。付着細胞は、組織培養プラスチックのような表面を必要とし、これは細胞外マトリックス成分でコートして付着性を高め、そして増殖及び分化に必要な他のシグナルを提供してもよい。固形組織から誘導されたほとんどの細胞は、付着性である。別のタイプの付着培養（adherent culture）は、器官型培養であり、それは二次元の培養皿とは対照的に三次元環境での細胞の増殖を含む。この三次元培養系は、生体内の組織に生化学的及び生理学的により類似しているが、多くの要因（例えば拡散）のため、維持するのが技術的に困難である。適切な方法及びその選択は、当業者に知られている。さらにまた、不死化細胞に適切な方法は、実施例にも記載した。
【００４６】
好ましい実施態様において、不死化タンパク質をコードする１つ又はそれ以上の核酸は、１つ又はそれ以上のレトロウイルスベクター、特に１つ又はそれ以上のレンチウイルスベクターを用いることによって導入される。
【００４７】
レトロウイルスは、現在の遺伝子移入アプローチの柱の１つである。モロニーマウス白血病ウイルスのような組換え型のレトロウイルスは、安定なやり方で宿主ゲノムに組み込む能力を有する。従って、好ましい実施態様において、不死化タンパク質をコードする１つ又はそれ以上の核酸は、１つ又はそれ以上のレトロウイルスベクター、特に１つ又はそれ以上のレンチウイルスベクターを用いることによって導入される。
【００４８】
レトロウイルスは、ウイルス逆転写酵素を用いることによって複製して宿主細胞中でそのＲＮＡをＤＮＡに転写する、ＲＮＡゲノムを有するウイルスである。次いで、ＤＮＡはインテグラーゼ酵素によって宿主のゲノムに組み込まれる。その後、ウイルスは、宿主細胞のＤＮＡの部分として複製する。レトロウイルスは、レトロウイルス科というウイルスファミリーに属するエンベロープウイルスである。ウイルスそれ自体は、その核酸をｍＲＮＡ（ビリオン中に5'cap及び3'PolyAを含む）ゲノムの形態で保存しており、そしてそのゲノムの細胞への送達手段として役立ち、偏性寄生生物として目標を定め、そして感染の構成要素となる。宿主の細胞中で、ＲＮＡ鎖がサイトゾル中で逆転写を受け、そして宿主のゲノムに組み込まれたら、この時点で、レトロウイルスＤＮＡをプロウイルスと称する。一般に、レトロウイルスは、外因性（以下の属、アルファレトロウイルス属、例えばトリ白血病ウイルス；ベータレトロウイルス属、例えばマウス乳癌ウイルス；ガンマレトロウイルス属、例えばマウス白血病ウイルス；デルタレトロウイルス属、例えばウシ白血病ウイルス；ヒトＴリンパ球向性ウイルス；イプシロンレトロウイルス属、例えばウォールアイ皮膚肉腫ウイルス；レンチウイルス、例えばヒト免疫不全ウイルス１の他にサル及びネコ免疫不全ウイルス；並びにスプマウイルス属、例えばチンパンジーフォーミーウイルスを含む）及び内因性（ガンマレトロウイルスに最も類似しているクラスＩ、ベータレトロウイルス及びアルファレトロウイルスに最も類似しているクラスＩＩ、及びスプマウイルスに最も類似しているクラスＩＩＩを含む）として特定化されている。
【００４９】
レンチウイルスは、一般に長い培養期間を特徴とするレトロウイルス科ファミリーのスローウイルス属である。レンチウイルスは、かなりの量の遺伝情報を宿主細胞のＤＮＡに送達することができるため、遺伝子送達ベクターの最も有効な方法の１つである。レンチウイルスは、主としてインビトロ系又は動物モデルに遺伝子産物を導入するために用いられる研究手段である。レンチウイルス感染は、他の遺伝子治療法よりも分裂及び非分裂細胞の高効率感染、導入遺伝子の長期的に安定な発現、及び低い免疫原性を含む利点を有する。レンチウイルスは、レトロウイルスのサブクラスである。それは、非分裂細胞のゲノム中に組み込む能力のため遺伝子送達ビヒクル（ベクター）として応用されており、他のレトロウイルスは、通常、分裂細胞しか感染させることができないので、これはレンチウイルスの独特な特徴である。ＲＮＡ形態のウイルスゲノムは、ウイルスが細胞に入ってＤＮＡを作製するときに逆転写され、それは次いで、ウイルスインテグラーゼ酵素によってランダムな位置でゲノム中に挿入される。従って、本発明の好ましい実施態様において、不死化タンパク質をコードする１つ又はそれ以上の核酸は、１つ又はそれ以上のレンチウイルスベクターを用いることによって導入される。レンチウイルスの５つの血清群が知られており、それらが関与する脊椎動物の宿主を反映している（霊長類、ヒツジ及びヤギ、ウマ、ネコ及びウシ）。ＨＩＶ、ＳＩＶ及びＦＩＶは、すべてレンチウイルスの例である。伝達は一般に感染粒子を介するが、レンチウイルスは、細胞外粒子を形成する必要なしに宿主細胞と直接接触している隣接細胞を感染させることができる。
【００５０】
好ましい実施態様において、本発明に関する真核細胞は、動物細胞、より好ましくは脊索動物細胞、なおより好ましくは脊椎動物、さらにより好ましくは哺乳動物細胞、特にヒト、霊長類又は齧歯類の細胞である。
【００５１】
さらに又は別法として、真核細胞は、初代細胞又は非初代細胞であってもよい。しかし、初代細胞、すなわち、本方法の使用直前に被験者から得た細胞を、可逆的に不死化された細胞の作製方法に使用することが好ましい。「初代細胞」という用語は、上記定義された通りである。
【００５２】
さらにまた、真核細胞は、あらゆる細胞タイプであってもよい。しかし、生殖系列細胞ではなく、体細胞、すなわち、生物の体を形成しているいずれかの細胞が好ましい。哺乳動物において、生殖系列細胞は、精子及び卵子である。哺乳動物の体中の他のすべての細胞タイプは、体細胞である。体細胞の例としては、内臓、皮膚、骨、血液及び結合組織に由来するものが含まれる。好ましくは、細胞は、分化細胞、すなわちすべての遺伝子の特定のサブセットを発現する特殊化された細胞タイプの細胞である。好ましい分化細胞には、内皮細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、肝細胞、有足細胞又は腎臓細胞が含まれる。
【００５３】
本発明の別の実施態様において、１つ又はそれ以上の不死化タンパク質をコードする１つ又はそれ以上の核酸の発現は、ＥＦ１アルファプロモーターによって制御される。
【００５４】
プロモーターは、特定の遺伝子の転写を促進するＤＮＡの領域である。プロモーターは、典型的には同じ鎖及び上流（センス鎖の５'領域の方）においてそれが制御する遺伝子の近くにある。プロモーターは、遺伝子／ＤＮＡの発現を意図する細胞に従って選ばれ、用いることができる。適切なプロモーターの例としては、例えば、ＥＦ１アルファ、ＰＧＫ、モロニーマウス白血病ウイルスプロモーター−エンハンサー要素、ヒトサイトメガロウィルスエンハンサー、ワクシニアＰ７．５プロモーター又は同様のものが含まれるが、しかし、ＥＦ１アルファプロモーターが好ましい。ＥＦ１アルファプロモーターは、レンチウイルスベクター及び真核細胞における発現に特に適切である。プロモーターは、真核ＥＦ１アルファプロモーター又は好ましくはヒトＥＦ１アルファプロモーターであってもよい。適切なプロモーターの配列は、SEQ ID NO：１として表記される。
【００５５】
本発明の別の実施態様において、１つ又はそれ以上の不死化タンパク質をコードする１つ又はそれ以上の核酸は、ｌｏｘＰ（locus of X-over P1）部位の横に位置しており、それはＣｒｅ又はＣｒｅ変異体の存在下で１つ又はそれ以上の核酸の除去を可能にする。
【００５６】
バクテリオファージＰ１からの３８ｋＤａリコンビナーゼ、Ｃｒｅは、そのエンドヌクレアーゼ活性を用いて２つの同一のｌｏｘＰ部位間の組換えに触媒作用を及ぼす。酵素Ｃｒｅは、補助タンパク質又は補因子を必要とせず、そしてインビトロで及び多種多様な細胞条件下で有効に機能する。Ｃｒｅによって認識される組換え部位は、ｌｏｘＰとして知られている二本鎖ＤＮＡ配列である。それぞれのｌｏｘＰ部位は、非対称の核領域によって分かれた２つの逆方向反復からなる。Ｃｒｅは、逆方向反復に結合し、そして核領域中でＤＮＡを切断してＤＮＡ鎖交換反応を促進する。本来のｌｏｘＰ配列は、３４ｂｐからなる。その横に位置する２組の１３ｂｐの回文の間に８ｂｐの非対称配列が存在する。詳細な構造を下に示す。
１３ｂｐ ８ｂｐ １３ｂｐ
ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡ−ＧＣＡＴＡＣＡＴ−ＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ
（SEQ ID NO：７）
好ましいｌｏｘＰ部位は、SEQ IDNO：２及び３として表記される。
【００５７】
Ｃｒｅ（環化組換え）タンパク質は、４つのサブユニット及び２つのドメインからなる：大きい方がカルボキシル（Ｃ末端）ドメイン、そして小さい方がアミノ（Ｎ末端基）ドメインである。総タンパク質は、３４３個のアミノ酸を有する。Ｃドメインは、ラムダファージから単離された酵素のインテグラーゼファミリーのドメインに構造が類似している。また、これは、酵素の触媒部位である。Ｃｒｅ変異体ポリペプチドは、特定のアミノ酸配列に関してＣｒｅと異なっていてもよいが、Ｃｒｅのリコンビナーゼ活性を維持している。一般に、基準ポリペプチド（reference polypeptide）及び変異体の配列が全体として密接に類似し、そして多くの領域で同一になるように違いは制限される。変異体及び基準ポリペプチドは、あらゆる組み合わせで１つ又はそれ以上の置換、付加又は欠失によってアミノ酸配列が異なっていてもよい。置換された又は挿入されたアミノ酸残基は、遺伝暗号によってコードされたものであってもよいし又はそうでなくてもよい。ポリペプチドの変異体は、自然発生であってもよいし、又は自然発生することが知られていない変異体であってもよい。
【００５８】
Ｃｒｅ／ｌｏｘ系は、ゲノムＤＮＡ中の部位特異的な組換え事象を制御する遺伝的手段として用いられる。この系により、研究者は、さまざまな遺伝子改変生物を操作して遺伝子発現を制御し、望ましくないＤＮＡ配列を欠失させ、そして染色体構造を改変することが可能になる。系はＣｒｅを含み、二本鎖ＤＮＡは、Ｃｒｅによって両方のｌｏｘＰ部位で切断され、次いで一緒に結合されて戻る。組換えの効率は、ｌｏｘＰ部位の方向に左右される。同じ染色体腕上の２つのｌｏｘ部位について、逆方向ｌｏｘＰ部位は、反転を生じるが、ｌｏｘＰ部位の同方向反復は、欠失事象が生じる。ｌｏｘＰ部位が異なる染色体上にある場合、Ｃｒｅにより誘導された組換えによって転座事象に触媒作用を及ぼすことが可能である。
【００５９】
別の態様において、本発明は、本発明の方法によって入手可能な細胞又はその子孫を提供する。
【００６０】
なお別の態様において、本発明は、１つ又はそれ以上の不死化タンパク質をコードする１つ又はそれ以上の核酸を含む真核細胞であって、その際、１つ又はそれ以上の不死化タンパク質の少なくとも１つが、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６／Ｅ７、ＳＶ４０ラージＴ抗原及びテロメラーゼ触媒サブユニット（ＴＥＲＴ）からなる群より選ばれ、そして１つ又はそれ以上の不死化タンパク質をコードする１つ又はそれ以上の核酸の発現がＥＦ１アルファプロモーターの制御下にある前記真核細胞を提供する。
【００６１】
さらに、細胞は、本発明に従って、可逆的に不死化された細胞の作製方法に関して上記詳述された特徴を有しうる。特に、細胞又はその子孫は、以下の性質の１つ又はそれ以上を特徴とすることがある：
ｉ）不死化タンパク質をコードする１つ又はそれ以上の核酸は、１つ又はそれ以上のレトロウイルスベクター、特に１つ又はそれ以上のレンチウイルスベクター上にある；
ｉｉ）細胞は、さらに遺伝子改変を含む；
ｉｉｉ）細胞は、哺乳動物細胞、特にヒト、霊長類又は齧歯類の細胞である；
ｉｖ）細胞は、初代細胞から誘導される；
ｖ）細胞は、分化細胞、特に内皮細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、肝細胞、有足細胞又は腎臓細胞から誘導される；
ｖｉ）１つ又はそれ以上の不死化タンパク質をコードする核酸の発現は、ＥＦ１アルファプロモーターの制御下にある；及び／又は
ｖｉｉ）１つ又はそれ以上の不死化タンパク質をコードする１つ又はそれ以上の核酸は、ｌｏｘＰ（locus of X-over P1）部位の横に位置する。
【００６２】
別の態様において、本発明は、本発明の細胞、又はその子孫を再分化する方法、１つ又はそれ以上の不死化タンパク質をコードする１つ又はそれ以上の核酸の発現を阻止することを含む方法を提供する。不死化細胞の使用は、このような方法に利用可能な初代細胞の不足を克服する手段を提供する。不死化が逆転された不死化細胞は、成長及び増殖の低下を示す。２〜３週間後、細胞は、細胞老化に一致する形態を発現し、細胞周期の制御が不死化細胞において無損傷のままであることを示唆している。さらに、不死化が逆転された細胞は、強化された分化機能を示す。不死化が逆転された細胞は、生物学的及び薬学的研究のため、特に化合物プロファイリング、表現型スクリーニング、標的同定及び／又は標的検証のための供給源として用いてもよい。このために、細胞をまず不死化し、そして再分化細胞が必要になるまで培養する（そして増殖させる）ことができる。これにより、多くの実験のための、そして長期間にわたる経済的かつ均一な細胞供給源の使用が確保され、それは望ましいことである。
【００６３】
細胞の再分化は、核酸の発現を阻止するなんらかの適切な方法によって実施してもよい。これは、アンチセンス核酸をそれぞれのｍＲＮＡに結合してその翻訳を阻止することによって実施してもよい。別法として、制御可能なプロモーター、例えば誘導性プロモーターを用いてもよい。その名称の通り、これらのプロモーターの活性は、生物的又は非生物的因子の有り又は無しによって誘導される。誘導性プロモーターは、それに実施可能に結合された遺伝子の発現を生物発育のある種の段階で又は特定の組織中でオン又はオフにすることができるため、遺伝子工学における非常に強力な手段である。誘導性プロモーターは、アルコール、テトラサイクリン、ステロイド、金属及び他の化合物の有り又は無しによってその転写活性が制御されるプロモーターを含む化学的に制御されるプロモーター；並びに光の有り又は無し及び温度の低い又は高いによってその転写活性が制御されるプロモーターを含む物理的に制御されるプロモーターに分類される。
【００６４】
細胞を再分化する方法の好ましい実施態様において、１つ又はそれ以上の不死化タンパク質をコードする１つ又はそれ以上の核酸は、ｌｏｘＰ（locus of X-over P1）部位の横に位置しており、そして阻止は、Ｃｒｅリコンビナーゼ又は機能的に活性なＣｒｅ変異体によって実施される。
【００６５】
好ましくは、ｌｏｘＰ部位を用いる場合、不死化過程は、細胞にＣｒｅ又はＣｒｅ変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを導入することによって逆転させることができる。１つ又はそれ以上の不死化タンパク質をコードする１つ又はそれ以上の核酸が、Ｃｒｅ介在性組換えによって細胞から除去されるとき、それぞれの細胞又はクローンの細胞型に特異な活性は、一般に上方制御される。また、細胞不死化に関与する遺伝子を除去すると細胞増殖の速度がかなり低下し、そして最終的に細胞老化に至る。
【００６６】
細胞を再分化する方法の別の好ましい実施態様では、レトロウイルスベクター、特にレンチウイルスベクターを用いてＣｒｅリコンビナーゼ遺伝子又は機能的に活性なＣｒｅ変異体遺伝子を細胞に導入する。ベクター及び核酸を移入する方法は、上記詳述した通りである。
【００６７】
別の態様において、本発明は、本発明に従って、細胞を再分化する方法によって入手可能な細胞、又はその子孫を提供する。
【００６８】
以下の図面及び実施例は、本発明の種々の実施態様を説明することを意図する。このように、議論された特定の改変は、本発明の範囲における制限と解釈すべきではない。本発明の範囲を逸脱することなく種々の同等物、変更及び改変を実施することができることは、当業者に明らかであり、そしてこのような同等の実施態様は、本明細書に含まれるものとすることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】ＶＥＣＴＡＬＹＳ系のｐＬＶ−ＥＦ１−Ｌｏｘ１−ＡｇＴ−Ｌｏｘ２レンチウイルスベクターの略図を示す。ｃＤＮＡは、両側にｌｏｘ部位を有するＥＦ１Ａプロモーターの制御下でレンチウイルスプラスミド中に作製され（図１）、それは、必要に応じて、「不死化遺伝子（immortogene）」を切除することができる。ＥＦ１＝ＥＦ１アルファプロモーターＡｇＴ＝ＳＶ４０ラージＴ抗原Ｔ＝ＳＶ４０スモールｔ抗原ＬＯＸ１／ＬＯＸ２＝Ｃｒｅリコンビナーゼ認識部位ＷＰＲＥ＝ウッドチャック転写後調節要素
【図２】初代培養された新生ラット有足細胞系統におけるシナプトポジンの発現を示す。Ａ：未分化初代有足細胞の位相コントラスト形態。標準条件下で増殖する未分化有足細胞の丸石形態を示す。細胞は、集密に達するにつれ単層を形成する。Ｂ：標準条件下で維持された樹状有足細胞は、非常に大きくかつ扁平状である。Ｃ：有足細胞特異的なタンパク質シナプトポジンは、標準培養条件で１４日後に発現を開始した（シナプトポジン−薄い灰色、そしてアクチンストレス線維−暗い灰色）。
【図３】分化した有足細胞のマーカーが、「不死化細胞」のＣｒｅ介在性切除後に再び現れるのを示している。Ａ：（位相コントラスト）：ＬＴ Ａｇ＋Ｅ６／Ｅ７の過剰発現によって誘導された活性な増殖中に未分化有足細胞の典型的な丸石形態。細胞は、集密に達するにつれ単層を形成する。Ｂ：Ｃｒｅリコンビナーゼの形質導入後の樹状有足細胞（大きくかつ扁平状）。Ｃ：ＬＴ Ａｇ（灰色）の核発現−１００％の細胞が陽性である。Ｄ：Ｃｒｅリコンビナーゼによる形質導入後、多くの細胞ではＳＶ４０ ＬＴ Ａｇ（矢印）が失われる。 注：矢印は、失われていると考えられる。Ｅ：シナプトポジン及びＷＴ１（Ｆ）は、再分化した有足細胞中で発現される。
【図４】初代（対照）及び不死化ヒト肝細胞の免疫細胞化学的な比較を示す。Ａ、Ｂ及びＣ−光学顕微鏡画像；Ｄ、Ｅ及びＦ−ＧＦＰ蛍光（各細胞タイプは、レンチウイルスＧＦＰにより形質導入された）。対照肝細胞は、大きな多角形の細胞であり（Ａ及びＤ）；ＳＶ４０ＬＴａｇの発現により極めて小さな卵形細胞に形質転換され（Ｂ及びＥ）；ＨＰＶ Ｅ６Ｅ７で形質導入した後は、対照細胞と比較してわずかに減少したサイズを有するが、ＳＶ４０ ＬＴａｇ不死化されたものよりもかなり大きい（ＦをＤ及びＥと比較する）。Ｇ−Ｉ：ｐ５３（灰色）の免疫染色。対照細胞におけるｐ５３基底レベルは非常に低く（Ｇ）、そしてＳＶ４０ ＬＴＡｇでは、極めて高レベルまで核中に蓄積され（Ｈ）；Ｅ６Ｅ７不死化細胞において、大半の細胞ではそのレベルは低い（Ｉ）。Ｊ−Ｌ：ＣＤＣ２、サイクリン依存性キナーゼ１（ＣＤＫ１）の免疫染色；初代肝細胞では、増殖しないので存在することができなかったが（Ｊ）、これに対して、ＡｇＴ不死化細胞（Ｋ）では、そしてまたＥ６Ｅ７不死化細胞（Ｌ）では、ＣＤＣ２発現は、ＣＤＣ２ ｍＲＮＡの増加に伴ってかなり増加した（表２参照）。
【図５】内皮細胞特異的マーカーが不死化されたＨＵＶＥＣ中で発現され続けることを示している。新たに単離されたＨＵＶＥＣ（左のパネル）、ＡｇＴ不死化（中央のパネル）、そしてＥ６Ｅ７不死化ＨＵＶＥＣ（右のパネル）。光学顕微鏡画像（Ａ、Ｂ及びＣ）。典型的な内皮マーカー、フォン・ウィルブランド因子（Ｄ−Ｆ：ｖＷＦ、薄い灰色）、そしてＰＥＣＡＭ（Ｇ−Ｉ、ＣＤ３１、暗い灰色）は、対照（Ｄ及びＧ）中、ＡｇＴ（Ｅ及びＨ）及びＥ６Ｅ７（Ｆ及びＩ）不死化細胞中で等しく発現された。核（暗い灰色）は、ヘキスト４２２で染色した。
【図６】ＳＶ４０ ＬＴ Ａｇ−及びＥ６／Ｅ７−に誘導された増殖の推定上の機構を示す。非増殖細胞では、ｃｄｃ２／ＣＤＫ１、サイクリンＡ及びＢ、ｃｄｃ２０の発現は、ｐ５３及び「リプレッサーＥ２Ｆ」によって抑制された。ＳＶ４０ ＬＴ Ａｇ及びＥ６／７不死化細胞では、ｐ５３及びＲｂは不活性化され、そしてＥ２Ｆは活性になり、そして、それ自体、ｃｄｃ２／ＣＤＫ１、サイクリンＡ及びＢ、ｃｄｃ２０の発現を誘導する。
【図７】ｐＬＶ−ＥＦ１−ＬＯＸ１−Ｅ６Ｅ７−ＬＯＸ２（Vectalys）を示す。
【００７０】
実施例
物質及び方法
レンチウイルスコンストラクト：すべてのｃＤＮＡは、VECTALYS（フランス）に注文した。レンチウイルス粒子は、標準プロトコールに従って生成し、そして１×１０6〜２×１０6ＴＵ／ｍｌのタイター（titer）を有した。感染効率は、レンチウイルスＧＦＰを用いて測定した。
【００７１】
初代細胞の標本及び培養条件：ラット糸球体上皮細胞の初代培養を産生するため、新生仔ラット腎臓から糸球体を単離した。細胞成分のうち９５％が糸球体であり、残りが尿細管を含む場合、良好な標本と考えられる。単離した後、コラーゲンコートした２４ウェルプレート上の１０％ＦＣＳ及び１％抗生物質入りのＤＭＥＭ中で糸球体を培養した。２４時間後、有足細胞前駆体が、付着した糸球体から外へ増殖し始めた。３日培養した後、増殖している上皮細胞をトリプシン処理し、そして２５μｍ孔径の篩に通過させて残っている糸球体核を除去し、それは主に糸球体間質及び内皮細胞からなる。ヒト由来の初代内皮細胞は、ヒト臍帯からルーチン的に獲得することができる。簡潔に言えば、温かいＰＢＳ、ｐＨ７．４を用いて臍帯静脈から血液産物をすすぎ、そして静脈に温かいコラゲナーゼＡ（Roche Diagnostics；ＰＢＳ中３２０Ｕ／ｍｌの濃度で使用）を充填した。温かいＰＢＳ中で２０分間インキュベーション後、消化物を熱失活ＦＣＳ（Gibco/Invitrogen社、カールスルーエ、ドイツによって供給された）を含む遠心管中に集めてコラゲナーゼ活性を無効化し、そして細胞を沈殿させた。上澄みを捨て、そしてＦＣＳ、ＥＣＧＳ／Ｈ、ｈＥＧＦ、ｈｂＦＧＦ及びＨＣ−５００を含む内皮細胞増殖培地（PromoCellからのMedium and SupplementPack）中に沈殿物を再懸濁し、そしてコラーゲン−ＩコートされたＴ７５フラスコ上で培養し、そして３７℃加湿インキュベーター中で４〜５日間、集密に増殖させた。細胞を大量に播種して細胞増殖を最小限にし、それによってＨＵＶＥＣがＣＤ１４を発現できるようにし、でなければそれは消失した。結果的に、すべての実験では、第１継代ＨＵＶＥＣのみを用いた。
【００７２】
初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）は、Cambrex（Weinheim、ドイツ）から入手し、そしてコラーゲン−Ｉコートされた皿（Becton Dickinson Labware、San Jose、米国）上のHCM Single Quots（Cambrex Bioproducts、ハイデルベルク、ドイツ）で補充されたＨＢＭ基礎肝細胞培地（Cambrex Bioproducts、ハイデルベルク、ドイツ）中で培養した。レトロウイルスコンストラクト及びウイルス感染：初代新生仔ラット有足細胞を（下記のように）単離し、そしてｌｏｘＰ部位の横に位置するＳＶ４０ ＬＴ抗原（ＬＴ Ａｇ）遺伝子を含む単一のレンチウイルスコンストラクト又はヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６及びＥ７を含むベクターを単独で又は組み合わせて感染させた。最初の１０日間のうちに、初代有足細胞は、その表現型及び形態を変え、そして増殖し始めた。細胞を３日毎に分け、そして安定なクロｚｐーンを単離し、そしてさらなる実験のため凍結した。これらの安定なクローンは、分化した有足細胞ではなく、最初に糸球体から増殖した細胞と形態学的に似ていた。Ｃｒｅリコンビナーゼを含むレンチウイルスベクターで感染後、細胞は増殖を終え、そして３〜１０日後、その形態を分化した有足細胞にとって特異的なものへと変えた。
【００７３】
同じ不死化方法を、ＨＵＶＥＣ及びヒト肝細胞に適用した。ＨＵＶＥＣは、高発現レベルのＬＴ Ａｇ又はＥ６／Ｅ７にもかかわらずその形態を変えなかったが、活発な増殖を開始した。ＬＴ Ａｇ又はＥ６／Ｅ７に感染した後の肝細胞は、その表現型を劇的に変え、そしてＣｒｅ挿入後、その正常なものを獲得した。
【００７４】
抗体：一次抗体：単クローン性ＷＴ−１（Ｆ−６）、ＣＤＣ２ ｐ３４（Ｂ−６）、ＰＣＡＭ−１（ＣＤ３１）、ＳＶ４０ Ｔ Ａｇ（Ｐａｂ １０８）及び多クローン性ｖＷＦ（Ｃ−２０）（Santa Cruz Biotechnology、ハイデルベルク、ドイツ）；多クローン性ＺＯ−１（Zymed、サンフランシスコ、ＣＡ）；単クローン性シナプトポジン（Progen、ハイデルベルク、ドイツ）；多クローン性ｐ５３（Cell Signalling）。
【００７５】
二次抗体：Alexa Fluor(R) 488ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）*２ｍｇ／ｍＬ*、Alexa Fluor(R) 594ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）*２ｍｇ／ｍＬ*、Alexa Fluor(R) 488ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）*２ｍｇ／ｍＬ*及びAlexa Fluor(R) 594ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）*２ｍｇ／ｍＬ*（Invitrogen、カールスルーエ、ドイツ）。
【００７６】
免疫染色：コラーゲンタイプＩコートされたチャンバースライド（VWR International 社、ダルムシュタット、ドイツ）上で増殖細胞の免疫蛍光染色を実施した。２０℃でメタノールを用いて５分間又はリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の４％ホルムアルデヒドを用いて５分間、細胞を固定し、続いてＰＢＳ中０．３％トライトンＸ−１００を用いて室温で１０〜１５分間、透過化処理した。ＰＢＳですすいだ後、非特異的結合部位を０．２％Tween 20（Serva、Amstetten、オーストリア）入りのSuperBlock（ＰＢＳ中のブロッキング緩衝液、Thermo Scientific、ブラウンシュヴァイク、ドイツ）で少なくとも３０分間ブロックした。ブロッキング溶液中に予め希釈した一次抗体を室温で６０分間又は４℃で一夜適用した。Alexa Fluor(R) 488 又は 594二次抗体（Invitrogen、カールスルーエ、ドイツ）を用いて抗原−抗体複合体を視覚化した。ニコン顕微鏡写真機を用いて画像を得、そしてAdobe Photoshop 6.0ソフトウェアで処理した。
【００７７】
全ＲＮＡの単離：培養された有足細胞、Huvecs及びＰＨＨから、RNeasy Kit（Qiagen、ヒルデン、ドイツ）を用いて全ＲＮＡを単離した。RNase-free DNase-Set（Qiagen、ヒルデン、ドイツ）を用いてゲノムＤＮＡ入りの潜在的サンプルコンタミネーションを除去した。質及び純度は、キャピラリー電気泳動（Caliper Lab Chip system Agilent 2100 Bio
analyser、Agilent Technologies社、Waldbronn、ドイツ）を用いて評価した。
【００７８】
定量的逆転写−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）：リアルタイム定量的ＰＣＲは、QuantiTect
Probe RT-PCR Kit（Qiagen、ヒルデン、ドイツ）を用いて実施した。各サンプルを四つ組で測定した。遺伝子発現の相対的定量のため、対照としてＧＡＰＤＨを用いてΔΔＣt法を使用した。標的及びハウスキーピング遺伝子の増幅は、Applera/Applied Biosystems（Foster City、米国）から入手した異なる蛍光標識Taq Manプローブを用いて同時に検出した。マルチプレックスＲＴ−ＰＣＲ内の標的及びハウスキーピング遺伝子の増幅直線性は、テンプレートの希釈によりＲＴ−ＰＣＲ反応を実施することによって評価した。ＲＴ−ＰＣＲ反応及びデータ収集は、iCycler-iQ-Thermocycler（Bio-Rad Laboratories社、ミュンヘン、ドイツ）において実施した。相対的遺伝子発現は、対照サンプルに対する誘導倍率（fold induction）として算出した。負の値は、対照サンプル中の発現レベルと比較した下方制御の倍率（fold down regulation）を示す。
【００７９】
スーパーアレイ−技術：ＰＣＲアレイは、焦点を絞った遺伝子パネルの発現を分析する手段である。それぞれ９６ウェル又は関連の、経路又は疾患に焦点を絞った遺伝子（例えば転写因子、細胞周期、幹細胞）の綿密に調査されたパネル用のSYBR Green最適化プライマーアッセイを含み、そしてSABiosciences（ＣＡ、米国）から入手した。
【００８０】
ＰＣＲアレイ（RT2 Profiler PCR Array System）では、リアルタイムＰＣＲ感受性及びマイクロアレイの多重遺伝子のプロファイリング能力を用いて遺伝子発現分析を実施する。実験者のｃＤＮＡテンプレート（RT2 First Strand Kit (C-03)）と適切なすぐに使用できるＰＣＲマスターミックスとを同じプレートの各ウェルに等体積のアリコートで単純に混合し、次いでリアルタイムＰＣＲサイクリングプログラムを実施する。プレートテンプレート及びリアルタイムＰＣＲサイクリングプログラム（Instrument-Specific Setup Instructions & Protocol Files）は、ファイルhttp://www.sabiosciences.com/pcrarrayprotocolfiles.php.を用いて入手可能である。
【００８１】
RT2-First Strand Kitは、有効な第１鎖（first strand）ｃＤＮＡ合成のための迅速かつ便利な方法を提供する。キットは、有効なゲノムＤＮＡ除去工程及び組み込まれた外部ＲＮＡ対照（built-in External RNA Control）も含む。このオールインワンキットは、SABiosciencesのRT2 ProfilerTM PCR Arrays 及び RT2 qPCR Primer AssaysによるリアルタイムＰＣＲベースの遺伝子発現分析のために設計され、そして最適化されている。キットは、逆転写前にＲＮＡサンプルから汚染ゲノムＤＮＡを効果的に除去するための独自の方法を含む。偏りのないやり方（unbiased manner）におけるランダム六量体及びオリゴ−ｄＴプライム逆転写及び逆転写酵素により最適な収量及び長さでｃＤＮＡ産物を合成する。組み込まれた外部ＲＮＡ対照は、逆転写効率をモニターし、そしてRT2 RNA QC PCR Array及びRT2 ProfilerTM PCR Arrayと共に用いたときに酵素阻害剤が混入した実験者のＲＮＡサンプルを試験するのに役立つ。マグネシウム及びヌクレオチド濃度及び他の緩衝液成分は、RT2 ProfilerTM PCR Arrays 及びRT2 qPCR Primer Assaysによる遺伝子発現分析に用いたときにRT2 SYBR Green qPCR Master Mixesと最も適合しうる。
【００８２】
RT2 SYBR Green／フルオレセインqPCRマスターミックスは、BioRad iCycler(R) 及び MyiQ(R)におけるリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応に必要なすべての試薬及び緩衝液：リアルタイムＰＣＲ緩衝液、高性能HotStart DNA Taqポリメラーゼ、ヌクレオチド、SYBR(R)Green色素、及び機器の光学的諸特性を規格化するために必要なフルオレセイン参照色素を含む。マスターミックスを実験者のテンプレート及びプライマーと共にＰＣＲ管に単に加える。化学修飾及び厳密に制御されたHotStart酵素によりプライマー二量体及び他の非特異的産物の増幅を防ぐことによってより正確なSYBR Greenの結果が独自に得られる。このRT2 qPCRマスターミックスは、BioRad iCycler(R)及びMyiQ(R)におけるSYBR Greenに基づく検出を用いたリアルタイムＰＣＲ適用に最も適している。
【００８３】
配列：
ＥＦ１アルファプロモーター（SEQ ID NO：１）
ＣＧＴＧＡＧＧＣＴＣＣＧＡＴＧＣＣＣＧＴＣＡＧＴＧＧＧＣＡＧＡＧＣＧＣＡＣＡＴＣＧＣＣＣＡＣＡＧＴＣＣＣＣＧＡＧＡＡＧＴＴＧＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＧＡＡＣＣＧＧＴＧＣＣＴＡＧＡＧＡＡＧＧＴＧＧＣＧＣＧＧＧＧＴＡＡＡＣＴＧＧＧＡＡＡＧＴＧＡＴＧＴＣＧＴＧＴＡＣＴＧＧＣＴＣＣＧＣＣＴＴＴＴＴＣＣＣＧＡＧＧＧＴＧＧＧＧＧＡＧＡＡＣＣＧＴＡＴＡＴＡＡＧＴＧＣＡＧＴＡＧＴＣＧＣＣＧＴＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＴＴＴＣＧＣＡＡＣＧＧＧＴＴＴＧＣＣＧＣＣＡＧＡＡＣＡＣＡＧＧ
【００８４】
ＬＯＸ１（SEQ ID NO：２）ＧＡＴＣＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ
【００８５】
ＬＯＸ２（SEQ ID NO：３）ＴＣＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ
【００８６】
ｃＤＮＡ Ｅ６／Ｅ７（SEQ ID NO：４）
ＡＴＧＴＴＴＣＡＧＧＡＣＣＣＡＣＡＧＧＡＧＣＧＡＣＣＣＧＧＡＡＡＧＴＴＡＣＣＡＣＡＧＴＴＡＴＧＣＡＣＡＧＡＧＣＴＧＣＡＡＡＣＡＡＣＴＡＴＡＣＡＴＧＡＴＡＴＡＡＴＡＴＴＡＧＡＡＴＧＴＧＴＧＴＡＣＴＧＣＡＡＧＣＡＡＣＡＧＴＴＡＣＴＧＣＧＡＣＧＴＧＡＧＧＴＡＴＡＴＧＡＣＴＴＴＧＣＴＴＴＴＣＧＧＧＡＴＴＴＡＴＧＣＡＴＡＧＴＡＴＡＴＡＧＡＧＡＴＧＧＧＡＡＴＣＣＡＴＡＴＧＣＴＧＴＡＴＧＴＧＡＴＡＡＡＴＧＴＴＴＡＡＡＧＴＴＴＴＡＴＴＣＴＡＡＡＡＴＴＡＧＴＧＡＧＴＡＴＡＧＡＣＡＴＴＡＴＴＧＴＴＡＴＡＧＴＧＴＧＴＡＴＧＧＡＡＣＡＡＣＡＴＴＡＧＡＡＣＡＧＣＡＡＴＡＣＡＡＣＡＡＡＣＣＧＴＴＧＴＧＴＧＡＴＴＴＧＴＴＡＡＴＴＡＧＧＴＧＴＡＴＴＡＡＣＴＧＴＣＡＡＡＡＧＣＣＡＣＴＧＴＧＴＣＣＴＧＡＡＧＡＡＡＡＧＣＡＡＡＧＡＣＡＴＣＴＧＧＡＣＡＡＡＡＡＧＣＡＡＡＧＡＴＴＣＣＡＴＡＡＴＡＴＡＡＧＧＧＧＴＣＧＧＴＧＧＡＣＣＧＧＴＣＧＡＴＧＴＡＴＧＴＣＴＴＧＴＴＧＣＡＧＡＴＣＡＴＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＴＡＧＡＧＡＡＡＣＣＣＡＧＣＴＧＴＡＡＴＣＡＴＧＣＡＴＧＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣＴＡＣＡＴＴＧＣＡＴＧＡＡＴＡＴＡＴＧＴＴＡＧＡＴＴＴＧＣＡＡＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＣＴＧＡＴＣＴＣＴＡＣＴＧＴＴＡＴＧＡＧＣＡＡＴＴＡＡＡＴＧＡＣＡＧＣＴＣＡＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＴＧＡＡＡＴＡＧＡＴＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＧＡＣＡＡＧＣＡＧＡＡＣＣＧＧＡＣＡＧＡＧＣＣＣＡＴＴＡＣＡＡＴＡＴＴＧＴＡＡＣＣＴＴＴＴＧＴＴＧＣＡＡＧＴＧＴＧＡＣＴＣＴＡＣＧＣＴＴＣＧＧＴＴＧＴＧＣＧＴＡＣＡＡＡＧＣＡＣＡＣＡＣＧＴＡＧＡＣＡＴＴＣＧＴＡＣＴＴＴＧＧＡＡＧＡＣＣＴＧＴＴＡＡＴＧＧＧＣＡＣＡＣＴＡＧＧＡＡＴＴＧＴＧＴＧＣＣＣＣＡＴＣＴＧＴＴＣＴＣＡＧＡＡＡＣＣＡＴＡＡ
【００８７】
ＷＰＲＥ（SEQ ID NO：５）
ＡＡＴＣＡＡＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＡＣＡＡＡＡＴＴＴＧＴＧＡＡＡＧＡＴＴＧＡＣＴＧＧＴＡＴＴＣＴＴＡＡＣＴＡＴＧＴＴＧＣＴＣＣＴＴＴＴＡＣＧＣＴＡＴＧＴＧＧＡＴＡＣＧＣＴＧＣＴＴＴＡＡＴＧＣＣＴＴＴＧＴＡＴＣＡＴＧＣＴＡＴＴＧＣＴＴＣＣＣＧＴＡＴＧＧＣＴＴＴＣＡＴＴＴＴＣＴＣＣＴＣＣＴＴＧＴＡＴＡＡＡＴＣＣＴＧＧＴＴＧＣＴＧＴＣＴＣＴＴＴＡＴＧＡＧＧＡＧＴＴＧＴＧＧＣＣＣＧＴＴＧＴＣＡＧＧＣＡＡＣＧＴＧＧＣＧＴＧＧＴＧＴＧＣＡＣＴＧＴＧＴＴＴＧＣＴＧＡＣＧＣＡＡＣＣＣＣＣＡＣＴＧＧＴＴＧＧＧＧＣＡＴＴＧＣＣＡＣＣＡＣＣＴＧＴＣＡＧＣＴＣＣＴＴＴＣＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＧＣＴＴＴＣＣＣＣＣＴＣＣＣＴＡＴＴＧＣＣＡＣＧＧＣＧＧＡＡＣＴＣＡＴＣＧＣＣＧＣＣＴＧＣＣＴＴＧＣＣＣＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＧＧＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＴＴＧＧＧＣＡＣＴＧＡＣＡＡＴＴＣＣＧＴＧＧＴＧＴＴＧＴＣＧＧＧＧＡＡＧＣＴＧＡＣＧＴＣＣＴＴＴＣＣＡＴＧＧＣＴＧＣＴＣＧＣＣＴＧＴＧＴＴＧＣＣＡＣＣＴＧＧＡＴＴＣＴＧＣＧＣＧＧＧＡＣＧＴＣＣＴＴＣＴＧＣＴＡＣＧＴＣＣＣＴＴＣＧＧＣＣＣＴＣＡＡＴＣＣＡＧＣＧＧＡＣＣＴＴＣＣＴＴＣＣＣＧＣＧＧＣＣＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＴＣＴＧＣＧＧＣＣＴＣＴＴＣＣＧＣＧＴＣＴＴＣＧＣＣＴＴＣＧＣＣＣＴＣＡＧＡＣＧＡＧＴＣＧＧＡＴＣＴＣＣＣＴＴＴＧＧＧＣＣＧＣＣＴＣＣＣＣＧＣＣＴＧ
【００８８】
Ｖｅｃｔｏｒ＿ｐＬＶ＿ＥＦ１ａ−Ｌｏｘ１−Ｅ６Ｅ７−Ｌｏｘ２＿ＷＰＲＥ
（SEQ ID NO：６）
ＣＧＣＧＴＣＧＴＧＡＧＧＣＴＣＣＧＡＴＧＣＣＣＧＴＣＡＧＴＧＧＧＣＡＧＡＧＣＧＣＡＣＡＴＣＧＣＣＣＡＣＡＧＴＣＣＣＣＧＡＧＡＡＧＴＴＧＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＧＡＡＣＣＧＧＴＧＣＣＴＡＧＡＧＡＡＧＧＴＧＧＣＧＣＧＧＧＧＴＡＡＡＣＴＧＧＧＡＡＡＧＴＧＡＴＧＴＣＧＴＧＴＡＣＴＧＧＣＴＣＣＧＣＣＴＴＴＴＴＣＣＣＧＡＧＧＧＴＧＧＧＧＧＡＧＡＡＣＣＧＴＡＴＡＴＡＡＧＴＧＣＡＧＴＡＧＴＣＧＣＣＧＴＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＴＴＴＣＧＣＡＡＣＧＧＧＴＴＴＧＣＣＧＣＣＡＧＡＡＣＡＣＡＧＧＡＴＣＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＧＡＴＣＣＧＴＴＴＡＡＡＣＴＴＧＣＴＧＣＧＡＣＧＣＧＴＡＣＴＡＧＴＡＴＧＴＴＴＣＡＧＧＡＣＣＣＡＣＡＧＧＡＧＣＧＡＣＣＣＧＧＡＡＡＧＴＴＡＣＣＡＣＡＧＴＴＡＴＧＣＡＣＡＧＡＧＣＴＧＣＡＡＡＣＡＡＣＴＡＴＡＣＡＴＧＡＴＡＴＡＡＴＡＴＴＡＧＡＡＴＧＴＧＴＧＴＡＣＴＧＣＡＡＧＣＡＡＣＡＧＴＴＡＣＴＧＣＧＡＣＧＴＧＡＧＧＴＡＴＡＴＧＡＣＴＴＴＧＣＴＴＴＴＣＧＧＧＡＴＴＴＡＴＧＣＡＴＡＧＴＡＴＡＴＡＧＡＧＡＴＧＧＧＡＡＴＣＣＡＴＡＴＧＣＴＧＴＡＴＧＴＧＡＴＡＡＡＴＧＴＴＴＡＡＡＧＴＴＴＴＡＴＴＣＴＡＡＡＡＴＴＡＧＴＧＡＧＴＡＴＡＧＡＣＡＴＴＡＴＴＧＴＴＡＴＡＧＴＧＴＧＴＡＴＧＧＡＡＣＡＡＣＡＴＴＡＧＡＡＣＡＧＣＡＡＴＡＣＡＡＣＡＡＡＣＣＧＴＴＧＴＧＴＧＡＴＴＴＧＴＴＡＡＴＴＡＧＧＴＧＴＡＴＴＡＡＣＴＧＴＣＡＡＡＡＧＣＣＡＣＴＧＴＧＴＣＣＴＧＡＡＧＡＡＡＡＧＣＡＡＡＧＡＣＡＴＣＴＧＧＡＣＡＡＡＡＡＧＣＡＡＡＧＡＴＴＣＣＡＴＡＡＴＡＴＡＡＧＧＧＧＴＣＧＧＴＧＧＡＣＣＧＧＴＣＧＡＴＧＴＡＴＧＴＣＴＴＧＴＴＧＣＡＧＡＴＣＡＴＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＴＡＧＡＧＡＡＡＣＣＣＡＧＣＴＧＴＡＡＴＣＡＴＧＣＡＴＧＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣＴＡＣＡＴＴＧＣＡＴＧＡＡＴＡＴＡＴＧＴＴＡＧＡＴＴＴＧＣＡＡＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＣＴＧＡＴＣＴＣＴＡＣＴＧＴＴＡＴＧＡＧＣＡＡＴＴＡＡＡＴＧＡＣＡＧＣＴＣＡＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＴＧＡＡＡＴＡＧＡＴＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＧＡＣＡＡＧＣＡＧＡＡＣＣＧＧＡＣＡＧＡＧＣＣＣＡＴＴＡＣＡＡＴＡＴＴＧＴＡＡＣＣＴＴＴＴＧＴＴＧＣＡＡＧＴＧＴＧＡＣＴＣＴＡＣＧＣＴＴＣＧＧＴＴＧＴＧＣＧＴＡＣＡＡＡＧＣＡＣＡＣＡＣＧＴＡＧＡＣＡＴＴＣＧＴＡＣＴＴＴＧＧＡＡＧＡＣＣＴＧＴＴＡＡＴＧＧＧＣＡＣＡＣＴＡＧＧＡＡＴＴＧＴＧＴＧＣＣＣＣＡＴＣＴＧＴＴＣＴＣＡＧＡＡＡＣＣＡＴＡＡＴＣＴＡＧＣＧＴＣＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＴＣＧＡＣＡＡＴＣＡＡＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＡＣＡＡＡＡＴＴＴＧＴＧＡＡＡＧＡＴＴＧＡＣＴＧＧＴＡＴＴＣＴＴＡＡＣＴＡＴＧＴＴＧＣＴＣＣＴＴＴＴＡＣＧＣＴＡＴＧＴＧＧＡＴＡＣＧＣＴＧＣＴＴＴＡＡＴＧＣＣＴＴＴＧＴＡＴＣＡＴＧＣＴＡＴＴＧＣＴＴＣＣＣＧＴＡＴＧＧＣＴＴＴＣＡＴＴＴＴＣＴＣＣＴＣＣＴＴＧＴＡＴＡＡＡＴＣＣＴＧＧＴＴＧＣＴＧＴＣＴＣＴＴＴＡＴＧＡＧＧＡＧＴＴＧＴＧＧＣＣＣＧＴＴＧＴＣＡＧＧＣＡＡＣＧＴＧＧＣＧＴＧＧＴＧＴＧＣＡＣＴＧＴＧＴＴＴＧＣＴＧＡＣＧＣＡＡＣＣＣＣＣＡＣＴＧＧＴＴＧＧＧＧＣＡＴＴＧＣＣＡＣＣＡＣＣＴＧＴＣＡＧＣＴＣＣＴＴＴＣＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＧＣＴＴＴＣＣＣＣＣＴＣＣＣＴＡＴＴＧＣＣＡＣＧＧＣＧＧＡＡＣＴＣＡＴＣＧＣＣＧＣＣＴＧＣＣＴＴＧＣＣＣＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＧＧＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＴＴＧＧＧＣＡＣＴＧＡＣＡＡＴＴＣＣＧＴＧＧＴＧＴＴＧＴＣＧＧＧＧＡＡＧＣＴＧＡＣＧＴＣＣＴＴＴＣＣＡＴＧＧＣＴＧＣＴＣＧＣＣＴＧＴＧＴＴＧＣＣＡＣＣＴＧＧＡＴＴＣＴＧＣＧＣＧＧＧＡＣＧＴＣＣＴＴＣＴＧＣＴＡＣＧＴＣＣＣＴＴＣＧＧＣＣＣＴＣＡＡＴＣＣＡＧＣＧＧＡＣＣＴＴＣＣＴＴＣＣＣＧＣＧＧＣＣＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＴＣＴＧＣＧＧＣＣＴＣＴＴＣＣＧＣＧＴＣＴＴＣＧＣＣＴＴＣＧＣＣＣＴＣＡＧＡＣＧＡＧＴＣＧＧＡＴＣＴＣＣＣＴＴＴＧＧＧＣＣＧＣＣＴＣＣＣＣＧＣＣＴＧＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴ
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【００８９】
結果
Ａ有足細胞
１９９７年にMundel P 等によって記載されたプロトコールに従って新生仔ラット腎糸球体から有足細胞を単離した。単離した後、コラーゲンコートされた２４ウェルプレート上の１０％ＦＣＳ入りのＤＭＥＭ中で糸球体を培養した。２４時間後、有足細胞前駆体は、付着した糸球体から外へ増殖し始めた（図２）。
【００９０】
この段階で、細胞に異なるレンチウイルスコンストラクトを形質導入し、そして培養を長期間（２〜４週間）継続した。急速に増殖している細胞の島を単離し、広げ、そしてＲＴ ＰＣＲ及び免疫染色を用いて特徴づけた。ＳＶ４０ ＬＴａｇの発現は、免疫染色によって制御した。細胞の１００％は、核中に大量のＳＶ４０ ＬＴ Ａｇを蓄積し（図３Ｃ）、形質導入されてない又はＧＦＰ形質導入された細胞では、染色を検出することができなかった（データは示さず）。ｈＴＥＲＴによる形質導入は、（定量的ＲＴ ＰＣＲデータによればｈＴＥＲＴは５００倍を超えて過剰発現されたが）増殖速度を高めるには不十分であり、そして数回試行した後、断念した。ＨＰＶ Ｅ６／Ｅ７単独による形質導入もまた、有足細胞不死化に十分でなかったが、ＳＶ４０ ＬＴ Ａｇと組み合わせて用いたとき、かなり多くの不死化クローンを増強した。１０回を超える継代後、細胞にレンチウイルスＣｒｅリコンビナーゼを形質導入した。３日後、特異的な抗ＳＶ４０ ＬＴａｇ抗体で染色した。多くの細胞は、ＬＴ Ａｇの有意な減少又は完全な欠如を示し、これはＣｒｅが細胞ゲノムから組込まれたコピーのすべて又は大多数を切除したことを示している（図３Ｄ）。ＬＴ Ａｇが減少した（すなわち陰性）細胞は、その増殖を停止し、３つはサイズが大きくなり、そして有足細胞の典型的な形態を獲得した（図３Ａ及びＢ）。切除効率は比較的低く、約３０〜５０％であった。有足細胞のいくつかの高度に特異的な遺伝子マーカー、例えば、ＷＴ１、シナプトポジンは、この細胞中で再発現されたが、ネフリン及びポドシンのような他のものは、極めて低いレベルでしか発現されなかった（図３Ｃ〜Ｆ及び表１）。
【００９１】
【表１】
【００９２】
結論
有足細胞は、良好に不死化することができるが、さらなる実験的使用のため「不死化遺伝子」の切除によって非増殖状態に戻らなければならない。目下、アデノウイルスＣｒｅを産生しており、そして切除効率を高める目的で試験する。切除しなければ、不死化細胞は、極めて急速に増殖し（倍加時間１２〜１５時間）そして有足細胞の多くの特異的マーカーを消失するか又は低下したレベルで発現する。
【００９３】
Ｂ 初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）
ＰＨＨをLonzaから購入し、そしてコラーゲンコートされたプレート上で培養した。細胞は増殖しないが、脱分化の明らかな徴候がなくても培養を１０〜１４日間持続することができる。ＰＨＨにＳＶ４０ ＬＴ Ａｇ又はＥ６／Ｅ７（ｈＴＥＲＴを用いない）を形質導入し、そして数日後、増殖が始まり、そのサイズは、時間と共に縮小し、そしてそれは容易に継代培養することができる。本発明者らは、これらの細胞を、２０回を超えて継代培養し、そしてその表現型は変化しなかったが、対照肝細胞と比較すると、それは明らかにその表現型を部分的に失った。特に、ＣＲＰ及びハプトグロビンのような肝細胞特異的マーカーの発現は、とりわけＳＶ４０ ＬＴ Ａｇ中で大きく低下しているが、Ｅ６／Ｅ７不死化細胞中では、ハプトグロビン発現は保たれており、そしてＣＲＰ発現は、なお比較的高く、初代細胞と比較して１０％である（表２）。重要なことに、肝細胞関連の転写因子ＨＮＦ４アルファの発現は、Ｅ６／Ｅ７形質導入ＰＨＨ中で２倍しか低下しておらず、そしてＳＶ４０ ＬＴ Ａｇ中ではより大きく８倍低下している。
【００９４】
【表２】
【００９５】
ｃＤＮＡアレイ分析は、ＳＶ４０ ＬＴ Ａｇ又はＥ６／Ｅ７ウイルス性初期タンパク質の過剰発現によって生じる不死化が、細胞周期の制御に関与することが知られているいくつかの遺伝子、すなわちＥ２Ｆ１転写因子、サイクリンＡ２、ＣＤＣ２／ＣＤＫ１−サイクリン依存性キナーゼ１の転写を強く誘導することを示している（表２）。トランスクリプトーム変化のより詳細な説明は、後に報告する。
【００９６】
ＳＶ４０ ＬＴ Ａｇは、核ｐ５３の巨大な蓄積、そしてＥ６／Ｅ７は、ｐ５３の分解及び消失をもたらした（図４）。
【００９７】
両方の場合、ｐ５３は、完全に不活性化され、そしてそのトランス活性化及びトランス抑制性を失う。特に、ＣＤＫ２の阻害剤、そしてｐ５３の直接標的の１つ、ｐ２１ＷＡＦ１（ＣＩＰ１又はＣＤＫＮ１Ａ）の発現は、核中でｐ５３の蓄積にもかかわらず、ＳＶ４０ ＬＴ Ａｇ不死化細胞中で変化しなかった（データは示さず）。一方、別のＣＤＫ阻害剤、ｐ１６ＩＮＫ４のｍＲＮＡ発現は、ＳＶ４０ ＬＴ Ａｇ及びＥ６／Ｅ７−不死化細胞中で強く上方制御された（データは示さず）。この複雑な現象の潜在的な機構は、公開されているが、明確な説明はない（Pei 及び Xiong, 2005）。
【００９８】
結論：初代ヒト肝細胞は、ＳＶ４０ ＬＴ Ａｇ又はヒト乳頭腫Ｅ６／Ｅ７初期タンパク質のいずれかのレンチウイルスが介在する送達により非常に有効に不死化することができる。得られた細胞株は、極めて急速に増殖し（倍加時間は、２０時間未満である）、そしてとりわけＥ６／Ｅ７に誘導された不死化の場合、肝細胞の多くの重要なマーカーを、なお保っていた。これらの細胞は、細胞分裂しない初代肝細胞の代わりにさまざまな生物学的目的に用いることができる。
Ｃ 初代内皮細胞
ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）をPromoCellから購入し、そしてＦＣＳ、ＥＣＧ、ｈＥＧＦ、ｈｂＦＧＦ及びＨＣ−５００を含む内皮細胞特異的培地を用いて、コラーゲンコートされたプレートにおいて培養した。準集密細胞にＳＶ４０ ＬＴ Ａｇ又はＥ６／Ｅ７レンチウイルス粒子のいずれかを形質導入した。ｈＴＥＲＴ単独の形質導入は、有効でなかった（他の試験細胞タイプにおいても同様）。ＳＶ４０ ＬＴ Ａｇ及びＥ６／Ｅ７−形質導入された細胞では、より速い増殖速度が見られたが、ｈＴＥＲＴでは見られなかった。ＦＡＣＳ分析は、両方の「不死化遺伝子」、ＬＴ Ａｇ及びＥ６／Ｅ７により、Ｓ−Ｇ２−Ｍ画分の増加に伴ってＧ１／Ｇ０画分の減少（６０から２０％まで）が生じることを示した。ＢｒｄＵ取り込み／染色（データは示さず）によりＦＡＣＳデータを確認した。驚くべきことに、非常により速い増殖速度にもかかわらず、内皮特異的マーカー、ＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ）及びｖＷＦは、不死化ＨＵＶＥＣ中において同じか又はさらにより高レベルで発現された（図５及び表３参照）。
【００９９】
【表３】
【０１００】
ＳＶ４０ ＬＴ Ａｇ及びＥ６／Ｅ７を過剰発現するＨＵＶＥＣの両方で、内皮特異的なＮＯＳ（ｅＮＯＳ）の中程度の減少が検出された。試験した他の初代細胞と同様に、ＳＶ４０ ＬＴ Ａｇは、核ｐ５３タンパク質における莫大な増加をもたらした、そしてＥ６／Ｅ７では減少した（データは示さず）。
【０１０１】
結論：不死化された初代内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、その主要な分化マーカーを維持するが親細胞より３〜５倍急速に増殖する。形態学的に、細胞サイズの縮小のみが示され、そして核多形性により非不死化細胞と区別される。それらは、さまざまな実験タイプに用いることができ、そこでは内皮「バックグラウンド」が必要とされる。
【０１０２】
不死化の効率。初期ウイルス性タンパク質ＳＶ４０ ＬＴ Ａｇ又はＨＰＶ Ｅ６／Ｅ７を過剰発現するためにレンチウイルス送達系を用いて、本発明者らは、異なる初代ヒト及び齧歯類細胞を不死化することができた。本発明の主要な目標は、初代ラット腎臓有足細胞を不死化することであった。驚くべきことに、レンチウイルスを齧歯類細胞に形質導入することは、初代ヒト細胞と比較してずっと困難であった。これにより、おそらく、なぜ本発明者らがＳＶ４０ ＬＴ Ａｇ又はＥ６／Ｅ７単独でラット腎臓細胞の不死化を達成することができなかったかを説明することができる。しかし、２つのレンチウイルスコンストラクトの組み合わせ（最初にＳＶ４０ ＬＴ Ａｇ、そして２日後にＥ６／Ｅ７を細胞に逐次形質導入した）により単離されたラット糸球体からいくつかの永続的な細胞株が得られた。急速に増殖する細胞は、分化マーカーを部分的に失っておりそして形態学的に有足細胞に似ていなかった。従って、Ｃｒｅリコンビナーゼを用いて「不死化遺伝子」を切除する必要があった。レンチウイルスＣｒｅにより形質導入すると、細胞は増殖を停止し、サイズが大きくなり、そしてネフリン（ＮＰＨＳ１）、シナプトポジン、ウィルムス腫瘍１（ＷＴ１）を含む主な有足細胞特異的マーカーを再発現した。残念なことに、主な有足細胞特異的遺伝子の１つ、ポドシン（ＮＰＨＳ２）は、Ｃｒｅ形質導入された細胞中で再び現れなかった。一般に、本発明者らは、新たに単離されたラット糸球体の有足細胞中でポドシンが短時間（多くとも７２時間）しか発現されなかったことを観察した。従って、作製された不死化細胞は、部分的に脱分化したと考えるべきである。ポドシン発現を急速に消失させるもの（多くの他の有足細胞特異的遺伝子が発現され続けるときに）は、今のところ明らかでない。
【０１０３】
最初に、本発明者らは、２つのさらなる遺伝子、テロメラーゼのヒト触媒サブユニット（ｈＴＥＲＴ）及び温度感受性（ｔｓ）ＳＶ４０ラージＴ抗原突然変異体を不死化に使用するつもりであった。これらのｃＤＮＡコンストラクトを含むレンチウイルス粒子を作製し、そして形質導入された細胞中でｈＴＥＲＴ及びＳＶ４０ ＬＴ Ａｇ−ｔｓの過剰発現が確認されたが、不死化は達成されなかった。ＨＵＶＥＣ、肝細胞、平滑筋細胞、間葉幹細胞を含むいくつかのヒト初代細胞でｈＴＥＲＴを試験したが、全く成功しなかった。従って、少なくとも上記の初代齧歯類及びヒト細胞においてｈＴＥＲＴ単独では不死化に不十分であると結論する必要があった。
【０１０４】
（上記の）初代ヒト細胞の不死化は、ＳＶ４０ ＬＴ Ａｇ及びＥ６／Ｅ７レンチウイルスコンストラクトにより達成に成功した。ＳＶ４０ ＬＴ Ａｇで不死化された細胞（細胞の由来に依存しない）は、Ｅ６／Ｅ７発現細胞よりもずっとより急速に増殖し、そして分化マーカーの部分的又は完全な喪失を伴って有意な核多形性を示す。Ｅ６／Ｅ７の発現により増殖が活性化されるが、分化の部分的喪失しか起こらず、従って新規な細胞株の世代にとってより適切な系となる。興味深いことに、ＨＵＶＥＣでは、実際に分化状態の喪失は見られず（図６及び表４参照）、そして「不死化遺伝子」を切除する必要なしに不死化細胞を直接用いることができる。
【０１０５】
不死化の機構。ラージＴ−抗原（ＬＴ Ａｇ）、ウイルス性癌タンパク質は、ＳＶ４０によってコードされた主要な初期遺伝子産物である。ＬＴ Ａｇ及びヘリカーゼファミリーＩＩＩのメンバー（ＡＡＡ＋スーパーファミリーの部分）。このタンパク質は、ウイルスＤＮＡ複製にとって重要である（Li 及び Kelly 1984; Neuwald 等 1999）。ＳＶ４０ ＬＴ Ａｇは、休止細胞の増殖を誘導し、いくつかの細胞タイプを形質転換し、そして実験動物における腫瘍形成を誘導する（Fanning 及び Knippers 1992）。ＬＴ Ａｇによって生じる不死化／形質転換の正確な機構は、なお明らかではないが、大多数のデータは、ｐ５３を含むいくつかの重要な細胞腫瘍抑制因子の機能への干渉を通して細胞周期チェックポイントを乗り越えることができることを示している（Srinivasan 等 1997; Pipas 1998; DeCaprio 1999; Kim 等 2001）。試験したすべての初代ヒト及び齧歯類細胞において、ＳＶ４０ ＬＴ Ａｇをコードするレンチウイルスによる形質導入によりｐ５３の核内蓄積が莫大になった（図３及び４）。反対に、ＨＰＶ Ｅ６／Ｅ７で形質導入された細胞では、核ｐ５３は消失した（図４）。興味深いことに、いくつかの他のウイルス性癌タンパク質（アデノウイルスＥ１Ｂ、Ｂ型肝炎ウイルスＸタンパク質、乳頭腫ウイルスＥ６、エプスタイン−バーウィルスＥＢＮＡ−５及びヒトＴリンパ球向性ウイルスｔａｘタンパク質）もまたｐ５３を標的とし、強化されたプロテアソーム分解を通してそれを不活性化する。しかし、ＳＶ４０ ＬＴ Ａｇは、主に異なる機構を用い；細胞のｐ５３を安定化する（タンパク質の半減期を高める）と同時にそのトランス活性化活性を阻害する（Deppert 等 1989; Pipas 及び Levine 2001）。ｐ５３安定化及び不活性化の機構は、ＳＶ４０ ＬＴ Ａｇとｐ５３との直接結合に左右される。近年では、ｐ５３はラージＴ抗原と共結晶化された。予期せぬことに、構造は、６つのｐ５３モノマーを結合しているＬＴ Ａｇの六量体複合体を示した。結合されたＳＶ４０ ＬＴは、ｐ５３制御遺伝子のプロモーター中でｐ５３ＤＮＡ−結合ドメインとｐ５３応答エレメントとの相互作用を阻止する。それは、ｐ５３のＤＮＡ−結合領域での劇的な立体配置的変化によって生じ、これは、ｐ５３内の独特の「メチオニンスイッチ」を通して部分的に達成される（Lilyestrom W 等, 2006）。
【０１０６】
ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）初期タンパク質Ｅ６の場合におけるｐ５３の不活性化は、ユビキチン経路を通してｐ５３分解が高められることにより生じる。Ｅ６は、細胞ユビキチン−リガーゼを通してｐ５３タンパク質に結合し、Ｅ６結合タンパク質（Ｅ６−ＡＰ）は、酵素のユビキチン複合体を集め、ｐ５３上でリシンをユビキチン化し、そしてそのタンパク質分解を開始する。
【０１０７】
ＨＰＶ Ｅ７は、網膜芽腫腫瘍抑制タンパク質ｐＲｂの機能を不活性化する。Ｅ７タンパク質は、主に核中に局在化されており、ここで網膜芽腫遺伝子産物ｐＲｂ（ポケットＲｂ）に結合して細胞周期のＳ期への進行を促進する（Zur Hausen, 2002）。正常細胞では、ｐＲｂは、初期Ｇ１期に低リン酸化され、そしてＥ２Ｆ転写因子に結合し、転写リプレッサーとして機能する複合体を形成する。９回リン酸化されると複合体は解離し、Ｅ２Ｆは転写活性化因子として作用することが可能になる。低リン酸化ｐＲｂと結合することによって、Ｅ７は、それとＥ２Ｆとの結合を妨げ、それによって細胞周期進行を促進する。さらに、Ｅ７に誘導されたユビキチン介在性ｐＲｂ分解は、細胞周期停止を有効に克服する際に不可欠であると考えられる（Fehrmann & Laimins, 2003）。
【０１０８】
従って、ＳＶ４０及びＨＰＶによる不死化に含まれる一般的な機構は、ｐ５３及びｐＲｂ不活性化である。非常に最近のデータは、ｐ５３が転写活性化だけでなく抑制にも介在していることを示している（Spurgers 等, 2006; Scian 等, 2008）。重要なことに、いくつかのｐ５３に依存して抑制された遺伝子（ｃｄｃ２、ｃｄｋ４、サイクリン２Ａ、ｃｄｃ２０、Spurgers 等, 2006参照）は、Ｅ２Ｆ１−３によってトランス活性化されることが示された（Zhu 等, 2004）。Ｅ２Ｆ１は、ｐＲｂから解離されると（ｐＲｂリン酸化又はウイルス性タンパク質によるｐＲｂの機能不活性化のいずれかの結果として）、それ自体の転写を活性化し（正のフィードバック）、そしてＧ１／Ｓ及びＧ２／Ｍ移行にとって重要な標的遺伝子（ｃｄｃ２、ｃｄｋ４、サイクリン２Ａ、ｃｄｃ２０）の転写を活性化する。
【０１０９】
本発明者らは、ＳＶ４０ ＬＴ Ａｇ又はＨＰＶ Ｅ６／Ｅ７によって不死化された異なる細胞タイプにおける増殖及び分化の制御に関与する２００を超える遺伝子の発現を分析した。すべての細胞タイプにおいて、Ｅ２Ｆ１、ｃｄｃ２／ｃｄｋ１及びサイクリンＡ２の増強された発現が見られ、そしていくつかの場合（例えば、初代ヒト肝細胞）、数百倍であった（表２参照）。上記のようなサイクリンＡ２及びｃｄｃ２／ｃｄｋ１は、ｐ５３によって転写的に抑制するか又はＥ２Ｆ１によって転写的に活性化することができる（図６）。従って、本発明者らは、ＳＶ４０及びＨＰＶが介在する不死化には２つの重要な事象：第１に、ｐ５３及びｐＲｂの不活性化（いくつかの群によって以前に示した）、そして第２に、Ｅ２Ｆそれ自体、そしてその標的、サイクリンＡ２、サイクリンＢ及びｃｄｃ２の転写を刺激することができる転写的に活性なＥ２Ｆタンパク質の放出が関与していることを提案する。最近示されたように、ｃｄｃ２／ｃｄｋ１は、哺乳動物細胞における唯一の必須な細胞周期Ｃｄｋである（Santamaria 等, 2007）。これらのデータは、Ｃｄｋ１が、不死化、そしておそらくまた二本鎖ＤＮＡ ＨＰＶ及びＳＶ４０ウイルスによっても生じる発癌の重要な調節因子とみなすことができることを示している。特異的ＣＤＫ１阻害剤は、確立されたＨＰＶ若しくはＳＶ４０病因又は突然変異したｐ５３若しくはＲｂによる腫瘍に対して非常に有効であると期待することができる。
【０１１０】
文献
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Zur Hausen H: Papillomaviruses and cancer: from basic studies to clinical application. Nat Rev Cancer. 2002 May; 2(5):342-50. Review.
【技術分野】
【０００１】
本発明は、可逆的に不死化された細胞の作製方法、上記方法によって入手可能な細胞、１つ又はそれ以上の不死化タンパク質をコードする１つ又はそれ以上の核酸を含む真核細胞及びこれらの細胞を再分化する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
早くも１９世紀には、摘出された動物心臓の鼓動を体外で維持する方法があった。２０世紀の初めには、組織培養の方法論を確立する実験が報告された。細胞培養技術は、１９４０年代及び１９５０年代に進歩してウイルス学における研究を支えた。動物細胞培養は、１９００年代中頃に一般的な実験室技術になった。
【０００３】
一般に、細胞培養の概念には、生体外培養のために組織から細胞、別名初代細胞（primary cells）を単離することが含まれる。このために、コラゲナーゼ、トリプシン又はプロナーゼのような酵素による酵素消化によって初代細胞を遊離してもよい。別法として、組織の断片を適切な増殖培地に置き、そして培養のための増殖用の細胞を入手することができる。
【０００４】
いくつかの腫瘍から誘導された細胞を除いて、ほとんどの初代細胞培養物は、限られた寿命を有する。さらにまた、多くの場合、初代細胞は、培養における増殖能が限られており、そして継代延長により複製老化を受けるか（すなわち内皮細胞、平滑筋細胞）又は全く増殖しない（例えば肝細胞、心筋細胞）。
【０００５】
従って、細胞に基づく実験は、複数のドナーを必要とし、そしてヒトの場合、細胞により重大な問題：ドナーの遺伝的差異、薬物乱用などが生じる。
【０００６】
多くの調査実験は、腫瘍から誘導された細胞株で実施する。しかし、腫瘍由来の細胞は、分化が不正確であることが多く、そして重要な組織特異的遺伝子の発現が遺伝的に不安定である。従って、それらの欠点を回避することによって初代細胞及び腫瘍由来の細胞株の利点を合わせた新たな細胞を提供することが望ましい。
【０００７】
初代細胞の増殖能が限られている一つの理由は、細胞分裂ごとに生じる進行性のテロメア短縮化であり、これは最終的に細胞老化に至る。ＳＶ４０ Ｔ抗原を発現させて第２の不可逆的な危機が生じる前にさらなる回数の細胞分裂により細胞を成長させることができる細胞の改変方法が報告されている。生体内で収穫された初代細胞をインビトロで無限に増殖するように誘導する方法を細胞不死化と称する。
【０００８】
いくつかの研究は、一連の増殖促進及び抗老化遺伝子を組み合わせて発現することが必要な段階的方法においてヒト細胞を形質転換することができることを示した。従って、適当な遺伝子操作により、培養において制御された細胞増殖を誘導することは可能でありうる。さらに、培養においてヒト不死化細胞株を樹立することは可能であった。ヒトテロメラーゼ触媒ユニットの発現により、増殖停止を阻止し、そしてヒト線維芽細胞及び上皮細胞を不死化することができる。しかし、ヒトテロメラーゼ触媒ユニット単独の発現では、限定数しか不死化することができなかった。ほとんどの細胞タイプは、ＳＶ４０ Ｔ抗原をコードしている遺伝子のような第２の遺伝子の発現を必要とする。培養における不死化細胞の連続増殖は、その初代細胞に相当する物と比較したときに組織特異的遺伝子の発現を下方制御する。２つの癌遺伝子（ＳＶ４０ Ｔ癌タンパク質及びＨ−ｒａｓの癌遺伝子対立遺伝子）と組み合わせたヒトテロメラーゼ触媒サブユニットの発現は、上皮細胞及び線維芽細胞のような正常なヒト細胞に直接的な腫瘍形成転換を生じることが報告されている。さらにまた、ヒトテロメラーゼ触媒ユニットが単独で又は１つ若しくはそれ以上の他の遺伝子と組み合わせて、腎近位尿細管上皮細胞で発現された場合にも初代ヒト細胞の不死化が報告されている。近位尿細管細胞を不死化するこの方法は、これらの細胞により十分に機能したが、ＨＵＶＥＣ、肝細胞、平滑筋細胞及び間葉性幹細胞を含むいくつかの他のヒト初代細胞では機能しなかった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、細胞又はその前駆体が種々の細胞タイプから誘導することができ、及び／又は複製老化を示すことなく増殖することができると同時に初代細胞の魅力的な性質、例えば安定な遺伝子型及びその分化レベルを有する細胞及びその作製方法を提供することが本発明の目的である。新規な細胞モデルの開発は、生物学的及び薬学的研究にとって、特に化合物プロファイリング、表現型スクリーニング、標的同定及び／又は標的検証にとって最も重要である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
驚くべきことに、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６／Ｅ７は、上皮細胞、内皮細胞及び肝細胞を含むいくつかの真核細胞中で発現されたときに、細胞を不死化できることが見出された（実施例を参照のこと）。
【００１１】
従って、第１の態様において、本発明は、可逆的に不死化された細胞の作製方法であって、
ａ）真核細胞を準備し、
ｂ）工程ａ）の細胞を遺伝子改変して細胞中で１つ又はそれ以上の不死化タンパク質をコードする１つ又はそれ以上の核酸の発現を可能にし；そして
ｃ）工程ｂ）の細胞中で１つ又はそれ以上の核酸を発現させる
ことを含む方法であって、
その際、１つ又はそれ以上の不死化タンパク質は、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６／Ｅ７又はその機能的に活性な変異体を含む前記方法に関する。
【００１２】
上に詳述したように、ヒト初代細胞の限られた増殖能は、現在、多くの用途におけるその使用を妨げている。細胞を不死化する方法は記載されてきたが、しかしながら、それらは上に詳述された欠点がある。本発明は、細胞を遺伝子改変によって可逆的に不死化された細胞を作製し、そして場合により１つ又はそれ以上の他の遺伝子と併せてＨＰＶ Ｅ６／Ｅ７を発現する新規な方法を開発して代替方法を提供し、そして好ましくはこれらの欠点を克服したことを開示している。
【００１３】
本発明の方法の工程ａ）では、被験者から得た後に直接用いることで真核細胞を準備してもよい。別法として、細胞を培養した後、工程ｂ）の遺伝子改変を実施してもよい。また、細胞は、細胞株から誘導してもよい。しかし、初代細胞、すなわち新たに単離された細胞、又は短期間、すなわち多くとも４週間、好ましくは多くとも３週間、より好ましくは少なくとも２週間、なおより好ましくは多くとも７、６、５、４、３、２又は１日培養された細胞が好ましい。
【００１４】
「真核細胞」という用語は、動物、植物、真菌及び原生生物から誘導された細胞を含む。これらの細胞は、膜内に囲まれた複雑な構造に組織化されている。
真核細胞は、核を有する原核細胞とは異なる。多くの真核細胞は、ミトコンドリア、葉緑体及びゴルジ体のような他の膜結合細胞小器官を含む。真核細胞中の細胞分裂は、核のない生物（原核生物）とは異なる。それは、微小管に誘導された運動による重複染色体の分離を含む。２つのタイプの分裂過程がある。有糸分裂では、１つ細胞が分裂して２つの遺伝的に同一の細胞を生じる。減数分裂は、有性生殖に必要である。
【００１５】
上に詳述したように、工程ａ）で得た細胞を工程ｂ）で遺伝子改変して細胞中で１つ又はそれ以上の不死化タンパク質をコードする１つ又はそれ以上の核酸の発現を可能にし、その際、１つ又はそれ以上の不死化タンパク質は、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６／Ｅ７を含む。遺伝子改変の方法、特に遺伝子の導入は、当業者によく知られている。
【００１６】
ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６／Ｅ７は、ＨＰＶによって発現される重要な発癌性タンパク質に相当する。癌及び前癌性病変に関連する身体的変化を生じることが知られているＨＰＶの菌株の中では、３つの癌タンパク質：Ｅ５、Ｅ６及びＥ７が認められている。従って、ＨＰＶ Ｅ６／Ｅ７という用語は、個々のもの又は融合タンパク質のずれかとしてのタンパク質の組み合わせのことである。
【００１７】
完全長ＨＰＶ Ｅ６遺伝子は、約１５０〜１６０個のアミノ酸のタンパク質をコードしており、それは亜鉛結合Ｃｙｓ−Ｘ−Ｘ−Ｃｙｓモチーフを含む２つのドメインを含む。Ｅ６は、細胞中で複数の役割があり、多くの他のタンパク質と相互作用すると考えられているため、特に興味深い。Ｅ６は、主に腫瘍抑制因子として作用するｐ５３又はｐＲＢタンパク質と結合することでそれらを不活性化することによって癌を生じる。腫瘍抑制タンパク質が不活性化されたとき、腫瘍成長は無制限に進行する。Ｅ６とｐ５３及びｐＲＢとの相互作用は、ユビキチン化及びユビキチンリガーゼによる分解のためにこれらのタンパク質をマークする。Ｅ６は、他の細胞タンパク質上で作用し、そしてテロメラーゼ活性に正の影響を与え、それにより細胞がチェックなしに分裂するのを通常阻止する道筋の１つを不活性化することがわかっている。さらに、Ｅ６は、細胞転写因子、Ｅ２Ｆ１／ＤＰ１と相互作用するとき転写補因子、具体的には転写活性化剤として作用することができる。
【００１８】
Ｅ６は、しばしばシグナル伝達タンパク質中に見出されるＰＤＺドメインに結合することもできる。これらの位置での結合は、ＤＬＧタンパク質の形質転換及びその抑制機能の破壊が起こる。また、Ｅ６タンパク質は、ＭＡＧＵＫ（膜結合性グアニル酸キナーゼファミリー）タンパク質とも相互作用し、通常、構造タンパク質であってＤＬＧの抑制活性に関与していると考えられる。Ｅ６がＭＡＧＩタンパク質上のＰＤＺドメインと複合体形成するとき、Ｅ６はその形状を変形させ、それによってその機能を妨げる。全体として、Ｅ６タンパク質は、癌に特有の高められた速度で細胞を増殖及び倍加させるようなやり方で正常なタンパク質活性を妨げる役割を果たす。
【００１９】
Ｅ７タンパク質は、約１００個のアミノ酸のサイズであり、そしてまたＥ６と同様に２部のＣｙｓ−Ｘ−Ｘ−Ｃｙｓドメインを含む。癌タンパク質として、Ｅ７は、網膜芽細胞腫腫瘍抑制遺伝子産物の活性形態、低リン酸化ｐＲＢと複合体を形成することにより機能し、そのタンパク質分解を促進する。Ｅ７／ｐＲＢ複合体の形成は、ｐＲＢとＥ２Ｆとの複合体形成を妨げる。それゆえ、Ｅ２ＦがｐＲＢとの不活性化された組み合わせから解放されると転写活性化剤としてその作用を続けてＤＮＡ合成及び細胞増殖を促進する。
【００２０】
ハイリスクＨＰＶ感染細胞では、Ｅ６及びＥ７は、通常、共発現される。ハイリスクＨＰＶ Ｅ７癌タンパク質は、ｐＲＢ並びに関連するｐＲＢファミリーメンバーｐ１０７及びｐ１３０．１７と結合して分解するだけでなく、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害剤を不活性化する。その結果、サイクリンＥ、サイクリンＡの発現が異常に増加し、そしてＥ２Ｆが介在するＣＤＫ２活性が異常になる。また、Ｅ２Ｆは、ｐ１４ＡＲＦを活性化してｐ５３を安定化することができる。細胞増殖を促進するＥ７と共同して、ハイリスクＨＰＶ Ｅ６癌タンパク質は、宿主細胞タンパク質、Ｅ６−ＡＰと相互作用することによってｐ５３の迅速なプロテアソーム分解を誘導する。Ｅ６又はＥ７の核酸又はアミノ酸配列は、同じものを含むか又は発現するあらゆるＨＰＶタイプから誘導してもよい。１００を超える異なるＨＰＶタイプが同定されており、数字で呼ばれている。タイプ１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６８、７３及び６８は、「ハイリスク」ＨＰＶ（癌に至ることがあるため）の例であり、そのため上記配列にとっての好ましい供給源である。ＨＰＶ Ｅ６／Ｅ７の非常に好ましいｃＤＮＡは、SEQ ID NO：４として表記される。
【００２１】
また、本発明は、ＨＰＶ Ｅ６／Ｅ７の機能的に活性な変異体を包含する。変異体は、Ｅ６／Ｅ７断片であってもよく、その際、断片は細胞をなお不死化することができる。これは、短いＣ末端及び／又はＮ末端欠失（例えば多くとも２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１個のアミノ酸の欠失）を有するＥ６／Ｅ７タンパク質を含んでもよい。別法として又はさらに、Ｅ６／Ｅ７タンパク質は、１つ又はそれ以上のアミノ酸置換を含んでもよい。しかし、アミノ酸が化学的に関連するアミノ酸で置換された同類アミノ酸置換（conservative amino acid substitution）は、好ましい。典型的な同類置換は、脂肪族アミノ酸の中からであり、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の中からであり、酸性残基を有するアミノ酸の中から、アミド誘導体の中から、塩基性残基を有するアミノ酸、又は芳香族残基を有するアミノ酸の中からである。Ｅ６／Ｅ７変異体は、場合により他の不死化タンパク質と組み合わせて細胞をなお不死化することができる場合、本発明により機能的に活性である。細胞を不死化する能力は、細胞の増殖に関して、そして本発明の実施例において記載されたように、例えば免疫染色により不死化細胞及び対照細胞の量を比較し、全ＲＮＡを測定し、細胞形態、細胞生存（場合により不利な条件下）又は細胞数を測定して試験することができる。本発明に関して、変異体の活性が配列変更のないＥ６／Ｅ７タンパク質の活性の少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、なおより好ましくは少なくとも８０％、とりわけ少なくとも９０％、特に少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％に達する場合、変異体は、細胞を不死化する能力を有する。
【００２２】
本発明の以下の説明において、Ｅ６／Ｅ７に関して提供されるすべての詳細は、特に明記しない限り、その機能的に活性な変異体にも関連する。
【００２３】
しかし、最も好ましくは、Ｅ６／Ｅ７は、自然発生Ｅ６／Ｅ７、なおより好ましくは、ＨＰＶ Ｅ６／Ｅ７であり、最も好ましくは、ｃＤＮＡによってコードされたＨＰＶ Ｅ６／Ｅ７は、SEQ ID NO：４として表記される。
【００２４】
「核酸」という用語は、本明細書において詳細に議論されたあらゆる核酸分子、好ましくはＤＮＡのことである。核酸分子は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ＲＮＡ又はそれらの組み合わせを含むさまざまな供給源から誘導してもよい。このような核酸配列は、ゲノムＤＮＡを含んでもよく、それは自然発生のイントロンを含んでもよいし又は含まなくてもよい。さらに、このようなゲノムＤＮＡは、プロモーター領域、ポリＡ配列又は他の関連配列と共に入手してもよい。ゲノムＤＮＡは、当分野でよく知られている手段によって適切な細胞から抽出し、そして精製してもよい。別法として、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を細胞から単離して使用し、逆転写又は他の手段によってｃＤＮＡを作製することができる。
【００２５】
遺伝子改変の前に、通常、興味の遺伝子、ここでは細胞中の１つ又はそれ以上の不死化タンパク質をコードする１つ又はそれ以上の核酸を単離する。その後、核酸、好ましくはＤＮＡ又はｃＤＮＡを、細胞の改変を可能にするやり方で処方する。例えばトランスフェクションによって、すなわち、非ウイルス的方法により細胞に核酸を導入する方法によって、又は形質導入、すなわち、ウイルスによる遺伝物質の挿入により生じる細胞の遺伝的変性によって真核細胞に外来ＤＮＡを導入する種々の方法がある。
【００２６】
多くの物質がトランスフェクション用の担体として使用されており、それは３種類：（カチオン性）ポリマー、リポソーム及びナノ粒子に分けることができる。これは、トランスフェクションによって、例えばリン酸カルシウム沈殿によって実施してもよい。別の方法は、カチオンポリマー、例えばＤＥＡＥ−デキストラン又はポリエチレンイミンの使用である。負に荷電されたＤＮＡはポリカチオンに結合し、そして複合体はエンドサイトーシスを介して細胞に取り込まれる。トランスフェクションに対する直接的なアプローチは遺伝子銃であり、ここでは、ＤＮＡを不活性固形物（一般に金）のナノ粒子に結合し、次いで、それを標的細胞の核に直接「注射する（shot）」。
【００２７】
トランスフェクションでは、遺伝子又はｃＤＮＡを適切なベクター中に移してもよい。ベクターは、プラスミド又はウイルスベクターであってもよい。核酸は、当業者に知られている制限酵素及びリガーゼを用いてベクター中に導入してもよい。ベクターを得たら、それを用いて興味の細胞を形質転換することができる。形質転換後、遺伝子改変された細胞を、ベクターの取込みに失敗したものから種々のやり方で選別する。１つの方法は、移植しようとした興味の遺伝子に固着することができるＤＮＡプローブを用いたスクリーニングである。もう１つは、マーカーの使用である。マーカー遺伝子を用いてベクターの存在を検査し、それにより感染及び組込みを確認してもよい。マーカー遺伝子の存在により、挿入物を発現するそれらの宿主細胞のみの選別及び増殖が保証される。典型的な選択遺伝子は、抗生物質並びに他の毒性物質、例えばヒスチジノール、プロマイシン、ハイグロマイシン、ネオマイシン、メトトレキセート及び細胞表面マーカーに対する耐性をもたらすタンパク質をコードしている。別法として、検出可能なタンパク質をコードする遺伝子を、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又は黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）を含む蛍光タンパク質のようなマーカーとして使用してもよい。
【００２８】
さらにまた、遺伝子又はｃＤＮＡを、核酸の有効な移入又は核酸の発現を可能する適切な要素と組み合わせてもよい。これらは、核酸の転写を制御する要素、例えばプロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択可能な要素及びレポーター遺伝子であってもよい。さらに、適切な制限酵素認識部位を、興味の核酸に加えてもよい。
【００２９】
さらにまた、キャッピング、スプライシング、ポリ（Ａ）末端付加によって翻訳を制御し、そして配列特異的な核外移行速度を変える要素が存在してもよい。
【００３０】
ベクターを用いる場合、１つ又はそれ以上の核酸が１つ又はそれ以上のベクターの一部であってもよい。複数のベクターを用いる場合、それらを同時に又は順次、細胞中に導入してもよい。ウイルスベクターは、細胞中に遺伝物質を送達するために一般に用いられる手段である。この方法は、生きている生物内（インビボ）で又は細胞培養（インビトロ）において実施することができる。ウイルスは特殊な分子機構を発達させてそれらが侵入する細胞内部にそれらのゲノムを有効に運ぶ。ウイルスによる遺伝子の送達は、形質導入と称し、そして感染細胞は形質導入されたと記載される。
【００３１】
当初、ウイルスベクターは、分子遺伝学実験用の裸のＤＮＡのトランスフェクションに対する代替物として開発された。遺伝子をコードするタンパク質は、一般に特定のタンパク質の機能を研究するためのウイルスベクターを用いて発現することができる。ウイルスベクター、とりわけレトロウイルスは、遺伝物質を細胞に移入するために広く用いられる（また、下記参照）。他のタイプのウイルスベクターは、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。ＡＡＶは、分裂及び非分裂細胞の両方に感染することができ、そしてそのゲノムを宿主細胞のそれに組み込むことができる。これらの特徴によりＡＡＶは、ウイルスベクターを作成するための非常に魅力的な候補物質となっている。非常に好ましいベクターの配列は、SEQ ID NO：６として表記される。
【００３２】
工程ｂ）において細胞を遺伝子改変した後、細胞中で１つ又はそれ以上の不死化タンパク質をコードする１つ又はそれ以上の核酸を発現する。細胞は、例えば、発現が構成的に活性なプロモーターによって制御される場合、なんらかのさらなる相互作用なしに、１つ又はそれ以上の不死化タンパク質をコードする１つ又はそれ以上の核酸を発現することができる。あるいは、例えば、誘導性プロモーターが１つ又はそれ以上の核酸に結合した場合、発現を誘導する必要がありうる。
【００３３】
この方法では、真核細胞、好ましくは下記定義された初代細胞を準備し、そして改変された細胞が不死化タンパク質ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６／Ｅ７をコードする１つ又はそれ以上の核酸を発現するように遺伝子改変する。さらに、また、１つ又はそれ以上の核酸は、ＳＶ４０ラージＴ抗原（ＴＡＧ）；テロメラーゼ触媒サブユニット（ＴＥＲＴ）；又はＳＶ４０ラージＴ抗原（ＴＡＧ）及びテロメラーゼ触媒サブユニット（ＴＥＲＴ）を含むさらなる不死化タンパク質をコードしてもよい。従って、ＨＰＶ Ｅ６／Ｅ７をコードする核酸は、遺伝子改変によって細胞中に導入された唯一の核酸であってもよい。
【００３４】
しかし、本発明の好ましい実施態様において、１つ又はそれ以上の不死化タンパク質は、
・ＨＰＶ Ｅ６／Ｅ７及びＳＶ４０ラージＴ抗原（ＴＡＧ）；又は
・ＨＰＶ Ｅ６／Ｅ７及びテロメラーゼ触媒サブユニット（ＴＥＲＴ）；又は
・ＨＰＶ Ｅ６／Ｅ７及びＳＶ４０ラージＴ抗原（ＴＡＧ）及びテロメラーゼ触媒サブユニット（ＴＥＲＴ）
を含むか又はそれらからなる。また、これらの機能的に活性な変異体も含まれる。
【００３５】
ＳＶ４０ラージＴ抗原（Simian Vacuolating Virus 40 Tag、ＴＡＧとも称する）は、さまざまな細胞タイプを形質転換することができる、ポリオーマウイルスＳＶ４０から誘導された癌遺伝子である六量体タンパク質である。ＴＡＧの形質転換活性は、ラージ部分における網膜芽腫（ｐＲＢ）及びｐ５３腫瘍抑制タンパク質のその摂動（perturbation）による。さらにＴＡＧは、その形質転換機能に寄与しうる転写補活性化因子ｐ３００及びＣＢＰを含むいくつかの他の細胞性因子と結合する。
【００３６】
ＴＡＧは、ＳＶ４０によるウイルス感染の際に転写される初期遺伝子の産物であり、そしてウイルスのゲノム複製及び宿主細胞周期の制御に関与している。ＳＶ４０は、二本鎖ＤＮＡウイルスであり、パポバウイルスファミリー、ポリオーマウイルス属に属する。ポリオーマウイルスは、多種多様な脊椎動物に感染し、それにより複数の部位で固形腫瘍を生じる。ＳＶ４０ ＤＮＡ複製は、ゲノムの起点領域（origin region）にＴＡＧが結合することによって開始される。ＴＡＧの機能は、リン酸化によって制御され、それはＳＶ４０起点への結合を弱める。ＴＡＧとＤＮＡポリメラーゼ−アルファとの間のタンパク質−タンパク質相互作用は、ウイルスゲノムの複製を直接刺激する。また、ＴＡＧは、腫瘍抑制タンパク質（ｐ５３、ｐ１０５）と結合して不活性化する。これにより細胞がＧ１期を離れてＳ期に入り、ＤＮＡ複製を促進する。
【００３７】
本明細書に使用される「テロメラーゼ触媒サブユニット」又は「ＴＥＲＴ」という用語は、テロメラーゼ触媒活性を有するポリペプチド配列のことである。テロメラーゼは、真核染色体の末端に見出される、テロメア領域中ＤＮＡ鎖の３'（「３'末端」）末端に特異的なＤＮＡ反復配列（すべての脊椎動物中の「ＴＴＡＧＧＧ」）を加えた酵素である。テロメアは、濃縮ＤＮＡ物質を含み、染色体に安定性を与える。酵素は、それ自体ＲＮＡ分子を担持する逆転写酵素であり、それはテロメアを延長するときにテンプレートとして用いられ、テロメアは複製周期の後ごとに短縮される。それは、それぞれ２分子のテロメラーゼ触媒サブユニット、別名テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）；テロメラーゼＲＮＡ（ｈＴＲ又はＴＥＲＣ）；及びジスケリン（dyskerin）からなる。ＴＥＲＴは、テンプレートとして一本鎖ＲＮＡを用いて一本鎖ＤＮＡを作成する逆転写酵素である。
【００３８】
また、本発明に関して、ＴＡＧ及び／又はＴＥＲＴの機能的に活性な変異体を用いてもよい。「変異体」及び「機能的に活性な」という用語は、Ｅ６／Ｅ７の変異体に関して上記定義された通りである。本発明の以下の説明において、Ｅ６／Ｅ７に関して記載されたすべての詳細は、特に明記しない限り、その機能的に活性な変異体にも関連する。
【００３９】
一実施例において、第１のベクターは、ＨＰＶ Ｅ６／Ｅ７をコードするポリヌクレオチドを含むのに対して、第２のベクターは、ＳＶ４０ラージＴ抗原（ＴＡＧ）；テロメラーゼ触媒サブユニット（ＴＥＲＴ）；又はＳＶ４０ラージＴ抗原（ＴＡＧ）及びテロメラーゼ触媒サブユニット（ＴＥＲＴ）をコードするポリヌクレオチドをコードする核酸を含む。
【００４０】
別の態様において、本発明は、可逆的に不死化された細胞の作製方法であって、
ａ）真核細胞を準備し、
ｂ）工程ａ）の細胞を遺伝子改変して細胞中で１つ又はそれ以上の不死化タンパク質をコードする１つ又はそれ以上の核酸の発現を可能にし；そして
ｃ）工程ｂ）の細胞中で１つ又はそれ以上の核酸を発現する、
ことを含み、
その際、１つ又はそれ以上の不死化タンパク質の少なくとも１つは、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６／Ｅ７、ＳＶ４０ラージＴ抗原及びテロメラーゼ触媒サブユニット（ＴＥＲＴ）、又はそれらのいずれかの機能的に活性な変異体からなる群より選ばれ、そして１つ又はそれ以上の不死化タンパク質をコードする１つ又はそれ以上の核酸の発現は、ＥＦ１アルファプロモーターによって制御されることを含む前記方法に関する。
【００４１】
驚くべきことに、プロモーターＥＦ１アルファ（詳細については、下記参照）は、他よりも良好な発現レベルを示すことが見出された。いくつかのプロモーターを異なる初代細胞において試験した。異なるプロモーターの制御下でＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）ｃＤＮＡを発現することによって、ＣＭＶ（サイトメガロウィルス）プロモーター及びＭＳＣＶ（マウスサイトメガロウィルス）プロモーターではそれぞれ極めて高い又は極めて低いレベルの発現となったのに対して、ＥＦ１アルファプロモーターでは中程度の発現レベルが得られることを示すことができた。本発明のこの態様のすべての用語は、この説明において詳述された通り定義される。
【００４２】
本発明のさらなる実施態様において、本発明の方法は、
ｄ）工程ｃ）の細胞を増殖させる
ことをさらに含む。
【００４３】
本発明によれば、工程ｃ）の細胞は、細胞生存度、増殖及び完全性を可能にする有効な条件下で細胞を増殖させてもよい。本明細書において、増殖とは、インビトロで培養することによるものである。増殖とは、細胞成長及び分裂の結果として細胞数が増加することであり、それは細胞培養によって達成してもよい。好ましくは、増殖とは、少なくとも１つの細胞の倍加である。増殖をモニタリングする可能な方法としては、増殖に関連する抗原の検出、ＤＮＡ合成の測定、及び細胞内環境の還元（reduction）の検出が含まれるが、それらに制限されるわけではない。ＤＮＡ合成は、例えば３Ｈ−チミジンの取り込み又は５−ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の取り込みを定量化することによって測定してもよい。細胞内環境の還元は、テトラゾリウム塩の還元によってモニターしてもよい。生存度は、生存及び複製するための細胞の能力のことである。細胞生存度を測定するために一般に用いられるアッセイには、トリパンブルー色素排除、ニュートラルレッド染色、クリスタルバイオレット包摂、及び51Ｃｒリリースが含まれるが、それらに制限されるわけではない。この方法によって産生された安定なクローンは、不死化されたら、培養において少なくとも２ヵ月間培養することができる。好ましい実施態様において、これらの安定なクローンは、少なくとも６ヵ月、好ましくは少なくとも１年、そして最も好ましくは少なくとも２年間、培養において継代することができる。これらの安定なクローンは、それが誘導された細胞タイプに関連する高レベルの機能及び特徴を有し続ける。
【００４４】
細胞培養のため、細胞は、細胞産生を助長する適切な条件下で増殖される。温度及びガス混合物を除いて、細胞培養系において最も一般に異なる要因は、増殖培地である。増殖培地の処方は、ｐＨ、グルコース濃度、増殖因子及びとりわけ他の栄養成分の存在で変えることができる。補充培地に用いられる増殖因子は、多くの場合、仔ウシ血清のような動物血液に由来する。培養条件は、各細胞タイプで広く変化し、そして特定の細胞タイプについての条件を変えることにより異なる表現型を発現することができる。
【００４５】
細胞は、懸濁液又は付着性の培養中で増殖することができる。いくつかの細胞は、血流中に存在する細胞のように表面に付着することなく懸濁液中で自然に生きている。また、可能な付着条件より高密度に増殖することができるように懸濁培養液中で生存することができるように改良された細胞もある。付着細胞は、組織培養プラスチックのような表面を必要とし、これは細胞外マトリックス成分でコートして付着性を高め、そして増殖及び分化に必要な他のシグナルを提供してもよい。固形組織から誘導されたほとんどの細胞は、付着性である。別のタイプの付着培養（adherent culture）は、器官型培養であり、それは二次元の培養皿とは対照的に三次元環境での細胞の増殖を含む。この三次元培養系は、生体内の組織に生化学的及び生理学的により類似しているが、多くの要因（例えば拡散）のため、維持するのが技術的に困難である。適切な方法及びその選択は、当業者に知られている。さらにまた、不死化細胞に適切な方法は、実施例にも記載した。
【００４６】
好ましい実施態様において、不死化タンパク質をコードする１つ又はそれ以上の核酸は、１つ又はそれ以上のレトロウイルスベクター、特に１つ又はそれ以上のレンチウイルスベクターを用いることによって導入される。
【００４７】
レトロウイルスは、現在の遺伝子移入アプローチの柱の１つである。モロニーマウス白血病ウイルスのような組換え型のレトロウイルスは、安定なやり方で宿主ゲノムに組み込む能力を有する。従って、好ましい実施態様において、不死化タンパク質をコードする１つ又はそれ以上の核酸は、１つ又はそれ以上のレトロウイルスベクター、特に１つ又はそれ以上のレンチウイルスベクターを用いることによって導入される。
【００４８】
レトロウイルスは、ウイルス逆転写酵素を用いることによって複製して宿主細胞中でそのＲＮＡをＤＮＡに転写する、ＲＮＡゲノムを有するウイルスである。次いで、ＤＮＡはインテグラーゼ酵素によって宿主のゲノムに組み込まれる。その後、ウイルスは、宿主細胞のＤＮＡの部分として複製する。レトロウイルスは、レトロウイルス科というウイルスファミリーに属するエンベロープウイルスである。ウイルスそれ自体は、その核酸をｍＲＮＡ（ビリオン中に5'cap及び3'PolyAを含む）ゲノムの形態で保存しており、そしてそのゲノムの細胞への送達手段として役立ち、偏性寄生生物として目標を定め、そして感染の構成要素となる。宿主の細胞中で、ＲＮＡ鎖がサイトゾル中で逆転写を受け、そして宿主のゲノムに組み込まれたら、この時点で、レトロウイルスＤＮＡをプロウイルスと称する。一般に、レトロウイルスは、外因性（以下の属、アルファレトロウイルス属、例えばトリ白血病ウイルス；ベータレトロウイルス属、例えばマウス乳癌ウイルス；ガンマレトロウイルス属、例えばマウス白血病ウイルス；デルタレトロウイルス属、例えばウシ白血病ウイルス；ヒトＴリンパ球向性ウイルス；イプシロンレトロウイルス属、例えばウォールアイ皮膚肉腫ウイルス；レンチウイルス、例えばヒト免疫不全ウイルス１の他にサル及びネコ免疫不全ウイルス；並びにスプマウイルス属、例えばチンパンジーフォーミーウイルスを含む）及び内因性（ガンマレトロウイルスに最も類似しているクラスＩ、ベータレトロウイルス及びアルファレトロウイルスに最も類似しているクラスＩＩ、及びスプマウイルスに最も類似しているクラスＩＩＩを含む）として特定化されている。
【００４９】
レンチウイルスは、一般に長い培養期間を特徴とするレトロウイルス科ファミリーのスローウイルス属である。レンチウイルスは、かなりの量の遺伝情報を宿主細胞のＤＮＡに送達することができるため、遺伝子送達ベクターの最も有効な方法の１つである。レンチウイルスは、主としてインビトロ系又は動物モデルに遺伝子産物を導入するために用いられる研究手段である。レンチウイルス感染は、他の遺伝子治療法よりも分裂及び非分裂細胞の高効率感染、導入遺伝子の長期的に安定な発現、及び低い免疫原性を含む利点を有する。レンチウイルスは、レトロウイルスのサブクラスである。それは、非分裂細胞のゲノム中に組み込む能力のため遺伝子送達ビヒクル（ベクター）として応用されており、他のレトロウイルスは、通常、分裂細胞しか感染させることができないので、これはレンチウイルスの独特な特徴である。ＲＮＡ形態のウイルスゲノムは、ウイルスが細胞に入ってＤＮＡを作製するときに逆転写され、それは次いで、ウイルスインテグラーゼ酵素によってランダムな位置でゲノム中に挿入される。従って、本発明の好ましい実施態様において、不死化タンパク質をコードする１つ又はそれ以上の核酸は、１つ又はそれ以上のレンチウイルスベクターを用いることによって導入される。レンチウイルスの５つの血清群が知られており、それらが関与する脊椎動物の宿主を反映している（霊長類、ヒツジ及びヤギ、ウマ、ネコ及びウシ）。ＨＩＶ、ＳＩＶ及びＦＩＶは、すべてレンチウイルスの例である。伝達は一般に感染粒子を介するが、レンチウイルスは、細胞外粒子を形成する必要なしに宿主細胞と直接接触している隣接細胞を感染させることができる。
【００５０】
好ましい実施態様において、本発明に関する真核細胞は、動物細胞、より好ましくは脊索動物細胞、なおより好ましくは脊椎動物、さらにより好ましくは哺乳動物細胞、特にヒト、霊長類又は齧歯類の細胞である。
【００５１】
さらに又は別法として、真核細胞は、初代細胞又は非初代細胞であってもよい。しかし、初代細胞、すなわち、本方法の使用直前に被験者から得た細胞を、可逆的に不死化された細胞の作製方法に使用することが好ましい。「初代細胞」という用語は、上記定義された通りである。
【００５２】
さらにまた、真核細胞は、あらゆる細胞タイプであってもよい。しかし、生殖系列細胞ではなく、体細胞、すなわち、生物の体を形成しているいずれかの細胞が好ましい。哺乳動物において、生殖系列細胞は、精子及び卵子である。哺乳動物の体中の他のすべての細胞タイプは、体細胞である。体細胞の例としては、内臓、皮膚、骨、血液及び結合組織に由来するものが含まれる。好ましくは、細胞は、分化細胞、すなわちすべての遺伝子の特定のサブセットを発現する特殊化された細胞タイプの細胞である。好ましい分化細胞には、内皮細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、肝細胞、有足細胞又は腎臓細胞が含まれる。
【００５３】
本発明の別の実施態様において、１つ又はそれ以上の不死化タンパク質をコードする１つ又はそれ以上の核酸の発現は、ＥＦ１アルファプロモーターによって制御される。
【００５４】
プロモーターは、特定の遺伝子の転写を促進するＤＮＡの領域である。プロモーターは、典型的には同じ鎖及び上流（センス鎖の５'領域の方）においてそれが制御する遺伝子の近くにある。プロモーターは、遺伝子／ＤＮＡの発現を意図する細胞に従って選ばれ、用いることができる。適切なプロモーターの例としては、例えば、ＥＦ１アルファ、ＰＧＫ、モロニーマウス白血病ウイルスプロモーター−エンハンサー要素、ヒトサイトメガロウィルスエンハンサー、ワクシニアＰ７．５プロモーター又は同様のものが含まれるが、しかし、ＥＦ１アルファプロモーターが好ましい。ＥＦ１アルファプロモーターは、レンチウイルスベクター及び真核細胞における発現に特に適切である。プロモーターは、真核ＥＦ１アルファプロモーター又は好ましくはヒトＥＦ１アルファプロモーターであってもよい。適切なプロモーターの配列は、SEQ ID NO：１として表記される。
【００５５】
本発明の別の実施態様において、１つ又はそれ以上の不死化タンパク質をコードする１つ又はそれ以上の核酸は、ｌｏｘＰ（locus of X-over P1）部位の横に位置しており、それはＣｒｅ又はＣｒｅ変異体の存在下で１つ又はそれ以上の核酸の除去を可能にする。
【００５６】
バクテリオファージＰ１からの３８ｋＤａリコンビナーゼ、Ｃｒｅは、そのエンドヌクレアーゼ活性を用いて２つの同一のｌｏｘＰ部位間の組換えに触媒作用を及ぼす。酵素Ｃｒｅは、補助タンパク質又は補因子を必要とせず、そしてインビトロで及び多種多様な細胞条件下で有効に機能する。Ｃｒｅによって認識される組換え部位は、ｌｏｘＰとして知られている二本鎖ＤＮＡ配列である。それぞれのｌｏｘＰ部位は、非対称の核領域によって分かれた２つの逆方向反復からなる。Ｃｒｅは、逆方向反復に結合し、そして核領域中でＤＮＡを切断してＤＮＡ鎖交換反応を促進する。本来のｌｏｘＰ配列は、３４ｂｐからなる。その横に位置する２組の１３ｂｐの回文の間に８ｂｐの非対称配列が存在する。詳細な構造を下に示す。
１３ｂｐ ８ｂｐ １３ｂｐ
ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡ−ＧＣＡＴＡＣＡＴ−ＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ
（SEQ ID NO：７）
好ましいｌｏｘＰ部位は、SEQ IDNO：２及び３として表記される。
【００５７】
Ｃｒｅ（環化組換え）タンパク質は、４つのサブユニット及び２つのドメインからなる：大きい方がカルボキシル（Ｃ末端）ドメイン、そして小さい方がアミノ（Ｎ末端基）ドメインである。総タンパク質は、３４３個のアミノ酸を有する。Ｃドメインは、ラムダファージから単離された酵素のインテグラーゼファミリーのドメインに構造が類似している。また、これは、酵素の触媒部位である。Ｃｒｅ変異体ポリペプチドは、特定のアミノ酸配列に関してＣｒｅと異なっていてもよいが、Ｃｒｅのリコンビナーゼ活性を維持している。一般に、基準ポリペプチド（reference polypeptide）及び変異体の配列が全体として密接に類似し、そして多くの領域で同一になるように違いは制限される。変異体及び基準ポリペプチドは、あらゆる組み合わせで１つ又はそれ以上の置換、付加又は欠失によってアミノ酸配列が異なっていてもよい。置換された又は挿入されたアミノ酸残基は、遺伝暗号によってコードされたものであってもよいし又はそうでなくてもよい。ポリペプチドの変異体は、自然発生であってもよいし、又は自然発生することが知られていない変異体であってもよい。
【００５８】
Ｃｒｅ／ｌｏｘ系は、ゲノムＤＮＡ中の部位特異的な組換え事象を制御する遺伝的手段として用いられる。この系により、研究者は、さまざまな遺伝子改変生物を操作して遺伝子発現を制御し、望ましくないＤＮＡ配列を欠失させ、そして染色体構造を改変することが可能になる。系はＣｒｅを含み、二本鎖ＤＮＡは、Ｃｒｅによって両方のｌｏｘＰ部位で切断され、次いで一緒に結合されて戻る。組換えの効率は、ｌｏｘＰ部位の方向に左右される。同じ染色体腕上の２つのｌｏｘ部位について、逆方向ｌｏｘＰ部位は、反転を生じるが、ｌｏｘＰ部位の同方向反復は、欠失事象が生じる。ｌｏｘＰ部位が異なる染色体上にある場合、Ｃｒｅにより誘導された組換えによって転座事象に触媒作用を及ぼすことが可能である。
【００５９】
別の態様において、本発明は、本発明の方法によって入手可能な細胞又はその子孫を提供する。
【００６０】
なお別の態様において、本発明は、１つ又はそれ以上の不死化タンパク質をコードする１つ又はそれ以上の核酸を含む真核細胞であって、その際、１つ又はそれ以上の不死化タンパク質の少なくとも１つが、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６／Ｅ７、ＳＶ４０ラージＴ抗原及びテロメラーゼ触媒サブユニット（ＴＥＲＴ）からなる群より選ばれ、そして１つ又はそれ以上の不死化タンパク質をコードする１つ又はそれ以上の核酸の発現がＥＦ１アルファプロモーターの制御下にある前記真核細胞を提供する。
【００６１】
さらに、細胞は、本発明に従って、可逆的に不死化された細胞の作製方法に関して上記詳述された特徴を有しうる。特に、細胞又はその子孫は、以下の性質の１つ又はそれ以上を特徴とすることがある：
ｉ）不死化タンパク質をコードする１つ又はそれ以上の核酸は、１つ又はそれ以上のレトロウイルスベクター、特に１つ又はそれ以上のレンチウイルスベクター上にある；
ｉｉ）細胞は、さらに遺伝子改変を含む；
ｉｉｉ）細胞は、哺乳動物細胞、特にヒト、霊長類又は齧歯類の細胞である；
ｉｖ）細胞は、初代細胞から誘導される；
ｖ）細胞は、分化細胞、特に内皮細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、肝細胞、有足細胞又は腎臓細胞から誘導される；
ｖｉ）１つ又はそれ以上の不死化タンパク質をコードする核酸の発現は、ＥＦ１アルファプロモーターの制御下にある；及び／又は
ｖｉｉ）１つ又はそれ以上の不死化タンパク質をコードする１つ又はそれ以上の核酸は、ｌｏｘＰ（locus of X-over P1）部位の横に位置する。
【００６２】
別の態様において、本発明は、本発明の細胞、又はその子孫を再分化する方法、１つ又はそれ以上の不死化タンパク質をコードする１つ又はそれ以上の核酸の発現を阻止することを含む方法を提供する。不死化細胞の使用は、このような方法に利用可能な初代細胞の不足を克服する手段を提供する。不死化が逆転された不死化細胞は、成長及び増殖の低下を示す。２〜３週間後、細胞は、細胞老化に一致する形態を発現し、細胞周期の制御が不死化細胞において無損傷のままであることを示唆している。さらに、不死化が逆転された細胞は、強化された分化機能を示す。不死化が逆転された細胞は、生物学的及び薬学的研究のため、特に化合物プロファイリング、表現型スクリーニング、標的同定及び／又は標的検証のための供給源として用いてもよい。このために、細胞をまず不死化し、そして再分化細胞が必要になるまで培養する（そして増殖させる）ことができる。これにより、多くの実験のための、そして長期間にわたる経済的かつ均一な細胞供給源の使用が確保され、それは望ましいことである。
【００６３】
細胞の再分化は、核酸の発現を阻止するなんらかの適切な方法によって実施してもよい。これは、アンチセンス核酸をそれぞれのｍＲＮＡに結合してその翻訳を阻止することによって実施してもよい。別法として、制御可能なプロモーター、例えば誘導性プロモーターを用いてもよい。その名称の通り、これらのプロモーターの活性は、生物的又は非生物的因子の有り又は無しによって誘導される。誘導性プロモーターは、それに実施可能に結合された遺伝子の発現を生物発育のある種の段階で又は特定の組織中でオン又はオフにすることができるため、遺伝子工学における非常に強力な手段である。誘導性プロモーターは、アルコール、テトラサイクリン、ステロイド、金属及び他の化合物の有り又は無しによってその転写活性が制御されるプロモーターを含む化学的に制御されるプロモーター；並びに光の有り又は無し及び温度の低い又は高いによってその転写活性が制御されるプロモーターを含む物理的に制御されるプロモーターに分類される。
【００６４】
細胞を再分化する方法の好ましい実施態様において、１つ又はそれ以上の不死化タンパク質をコードする１つ又はそれ以上の核酸は、ｌｏｘＰ（locus of X-over P1）部位の横に位置しており、そして阻止は、Ｃｒｅリコンビナーゼ又は機能的に活性なＣｒｅ変異体によって実施される。
【００６５】
好ましくは、ｌｏｘＰ部位を用いる場合、不死化過程は、細胞にＣｒｅ又はＣｒｅ変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを導入することによって逆転させることができる。１つ又はそれ以上の不死化タンパク質をコードする１つ又はそれ以上の核酸が、Ｃｒｅ介在性組換えによって細胞から除去されるとき、それぞれの細胞又はクローンの細胞型に特異な活性は、一般に上方制御される。また、細胞不死化に関与する遺伝子を除去すると細胞増殖の速度がかなり低下し、そして最終的に細胞老化に至る。
【００６６】
細胞を再分化する方法の別の好ましい実施態様では、レトロウイルスベクター、特にレンチウイルスベクターを用いてＣｒｅリコンビナーゼ遺伝子又は機能的に活性なＣｒｅ変異体遺伝子を細胞に導入する。ベクター及び核酸を移入する方法は、上記詳述した通りである。
【００６７】
別の態様において、本発明は、本発明に従って、細胞を再分化する方法によって入手可能な細胞、又はその子孫を提供する。
【００６８】
以下の図面及び実施例は、本発明の種々の実施態様を説明することを意図する。このように、議論された特定の改変は、本発明の範囲における制限と解釈すべきではない。本発明の範囲を逸脱することなく種々の同等物、変更及び改変を実施することができることは、当業者に明らかであり、そしてこのような同等の実施態様は、本明細書に含まれるものとすることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】ＶＥＣＴＡＬＹＳ系のｐＬＶ−ＥＦ１−Ｌｏｘ１−ＡｇＴ−Ｌｏｘ２レンチウイルスベクターの略図を示す。ｃＤＮＡは、両側にｌｏｘ部位を有するＥＦ１Ａプロモーターの制御下でレンチウイルスプラスミド中に作製され（図１）、それは、必要に応じて、「不死化遺伝子（immortogene）」を切除することができる。ＥＦ１＝ＥＦ１アルファプロモーターＡｇＴ＝ＳＶ４０ラージＴ抗原Ｔ＝ＳＶ４０スモールｔ抗原ＬＯＸ１／ＬＯＸ２＝Ｃｒｅリコンビナーゼ認識部位ＷＰＲＥ＝ウッドチャック転写後調節要素
【図２】初代培養された新生ラット有足細胞系統におけるシナプトポジンの発現を示す。Ａ：未分化初代有足細胞の位相コントラスト形態。標準条件下で増殖する未分化有足細胞の丸石形態を示す。細胞は、集密に達するにつれ単層を形成する。Ｂ：標準条件下で維持された樹状有足細胞は、非常に大きくかつ扁平状である。Ｃ：有足細胞特異的なタンパク質シナプトポジンは、標準培養条件で１４日後に発現を開始した（シナプトポジン−薄い灰色、そしてアクチンストレス線維−暗い灰色）。
【図３】分化した有足細胞のマーカーが、「不死化細胞」のＣｒｅ介在性切除後に再び現れるのを示している。Ａ：（位相コントラスト）：ＬＴ Ａｇ＋Ｅ６／Ｅ７の過剰発現によって誘導された活性な増殖中に未分化有足細胞の典型的な丸石形態。細胞は、集密に達するにつれ単層を形成する。Ｂ：Ｃｒｅリコンビナーゼの形質導入後の樹状有足細胞（大きくかつ扁平状）。Ｃ：ＬＴ Ａｇ（灰色）の核発現−１００％の細胞が陽性である。Ｄ：Ｃｒｅリコンビナーゼによる形質導入後、多くの細胞ではＳＶ４０ ＬＴ Ａｇ（矢印）が失われる。 注：矢印は、失われていると考えられる。Ｅ：シナプトポジン及びＷＴ１（Ｆ）は、再分化した有足細胞中で発現される。
【図４】初代（対照）及び不死化ヒト肝細胞の免疫細胞化学的な比較を示す。Ａ、Ｂ及びＣ−光学顕微鏡画像；Ｄ、Ｅ及びＦ−ＧＦＰ蛍光（各細胞タイプは、レンチウイルスＧＦＰにより形質導入された）。対照肝細胞は、大きな多角形の細胞であり（Ａ及びＤ）；ＳＶ４０ＬＴａｇの発現により極めて小さな卵形細胞に形質転換され（Ｂ及びＥ）；ＨＰＶ Ｅ６Ｅ７で形質導入した後は、対照細胞と比較してわずかに減少したサイズを有するが、ＳＶ４０ ＬＴａｇ不死化されたものよりもかなり大きい（ＦをＤ及びＥと比較する）。Ｇ−Ｉ：ｐ５３（灰色）の免疫染色。対照細胞におけるｐ５３基底レベルは非常に低く（Ｇ）、そしてＳＶ４０ ＬＴＡｇでは、極めて高レベルまで核中に蓄積され（Ｈ）；Ｅ６Ｅ７不死化細胞において、大半の細胞ではそのレベルは低い（Ｉ）。Ｊ−Ｌ：ＣＤＣ２、サイクリン依存性キナーゼ１（ＣＤＫ１）の免疫染色；初代肝細胞では、増殖しないので存在することができなかったが（Ｊ）、これに対して、ＡｇＴ不死化細胞（Ｋ）では、そしてまたＥ６Ｅ７不死化細胞（Ｌ）では、ＣＤＣ２発現は、ＣＤＣ２ ｍＲＮＡの増加に伴ってかなり増加した（表２参照）。
【図５】内皮細胞特異的マーカーが不死化されたＨＵＶＥＣ中で発現され続けることを示している。新たに単離されたＨＵＶＥＣ（左のパネル）、ＡｇＴ不死化（中央のパネル）、そしてＥ６Ｅ７不死化ＨＵＶＥＣ（右のパネル）。光学顕微鏡画像（Ａ、Ｂ及びＣ）。典型的な内皮マーカー、フォン・ウィルブランド因子（Ｄ−Ｆ：ｖＷＦ、薄い灰色）、そしてＰＥＣＡＭ（Ｇ−Ｉ、ＣＤ３１、暗い灰色）は、対照（Ｄ及びＧ）中、ＡｇＴ（Ｅ及びＨ）及びＥ６Ｅ７（Ｆ及びＩ）不死化細胞中で等しく発現された。核（暗い灰色）は、ヘキスト４２２で染色した。
【図６】ＳＶ４０ ＬＴ Ａｇ−及びＥ６／Ｅ７−に誘導された増殖の推定上の機構を示す。非増殖細胞では、ｃｄｃ２／ＣＤＫ１、サイクリンＡ及びＢ、ｃｄｃ２０の発現は、ｐ５３及び「リプレッサーＥ２Ｆ」によって抑制された。ＳＶ４０ ＬＴ Ａｇ及びＥ６／７不死化細胞では、ｐ５３及びＲｂは不活性化され、そしてＥ２Ｆは活性になり、そして、それ自体、ｃｄｃ２／ＣＤＫ１、サイクリンＡ及びＢ、ｃｄｃ２０の発現を誘導する。
【図７】ｐＬＶ−ＥＦ１−ＬＯＸ１−Ｅ６Ｅ７−ＬＯＸ２（Vectalys）を示す。
【００７０】
実施例
物質及び方法
レンチウイルスコンストラクト：すべてのｃＤＮＡは、VECTALYS（フランス）に注文した。レンチウイルス粒子は、標準プロトコールに従って生成し、そして１×１０6〜２×１０6ＴＵ／ｍｌのタイター（titer）を有した。感染効率は、レンチウイルスＧＦＰを用いて測定した。
【００７１】
初代細胞の標本及び培養条件：ラット糸球体上皮細胞の初代培養を産生するため、新生仔ラット腎臓から糸球体を単離した。細胞成分のうち９５％が糸球体であり、残りが尿細管を含む場合、良好な標本と考えられる。単離した後、コラーゲンコートした２４ウェルプレート上の１０％ＦＣＳ及び１％抗生物質入りのＤＭＥＭ中で糸球体を培養した。２４時間後、有足細胞前駆体が、付着した糸球体から外へ増殖し始めた。３日培養した後、増殖している上皮細胞をトリプシン処理し、そして２５μｍ孔径の篩に通過させて残っている糸球体核を除去し、それは主に糸球体間質及び内皮細胞からなる。ヒト由来の初代内皮細胞は、ヒト臍帯からルーチン的に獲得することができる。簡潔に言えば、温かいＰＢＳ、ｐＨ７．４を用いて臍帯静脈から血液産物をすすぎ、そして静脈に温かいコラゲナーゼＡ（Roche Diagnostics；ＰＢＳ中３２０Ｕ／ｍｌの濃度で使用）を充填した。温かいＰＢＳ中で２０分間インキュベーション後、消化物を熱失活ＦＣＳ（Gibco/Invitrogen社、カールスルーエ、ドイツによって供給された）を含む遠心管中に集めてコラゲナーゼ活性を無効化し、そして細胞を沈殿させた。上澄みを捨て、そしてＦＣＳ、ＥＣＧＳ／Ｈ、ｈＥＧＦ、ｈｂＦＧＦ及びＨＣ−５００を含む内皮細胞増殖培地（PromoCellからのMedium and SupplementPack）中に沈殿物を再懸濁し、そしてコラーゲン−ＩコートされたＴ７５フラスコ上で培養し、そして３７℃加湿インキュベーター中で４〜５日間、集密に増殖させた。細胞を大量に播種して細胞増殖を最小限にし、それによってＨＵＶＥＣがＣＤ１４を発現できるようにし、でなければそれは消失した。結果的に、すべての実験では、第１継代ＨＵＶＥＣのみを用いた。
【００７２】
初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）は、Cambrex（Weinheim、ドイツ）から入手し、そしてコラーゲン−Ｉコートされた皿（Becton Dickinson Labware、San Jose、米国）上のHCM Single Quots（Cambrex Bioproducts、ハイデルベルク、ドイツ）で補充されたＨＢＭ基礎肝細胞培地（Cambrex Bioproducts、ハイデルベルク、ドイツ）中で培養した。レトロウイルスコンストラクト及びウイルス感染：初代新生仔ラット有足細胞を（下記のように）単離し、そしてｌｏｘＰ部位の横に位置するＳＶ４０ ＬＴ抗原（ＬＴ Ａｇ）遺伝子を含む単一のレンチウイルスコンストラクト又はヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６及びＥ７を含むベクターを単独で又は組み合わせて感染させた。最初の１０日間のうちに、初代有足細胞は、その表現型及び形態を変え、そして増殖し始めた。細胞を３日毎に分け、そして安定なクロｚｐーンを単離し、そしてさらなる実験のため凍結した。これらの安定なクローンは、分化した有足細胞ではなく、最初に糸球体から増殖した細胞と形態学的に似ていた。Ｃｒｅリコンビナーゼを含むレンチウイルスベクターで感染後、細胞は増殖を終え、そして３〜１０日後、その形態を分化した有足細胞にとって特異的なものへと変えた。
【００７３】
同じ不死化方法を、ＨＵＶＥＣ及びヒト肝細胞に適用した。ＨＵＶＥＣは、高発現レベルのＬＴ Ａｇ又はＥ６／Ｅ７にもかかわらずその形態を変えなかったが、活発な増殖を開始した。ＬＴ Ａｇ又はＥ６／Ｅ７に感染した後の肝細胞は、その表現型を劇的に変え、そしてＣｒｅ挿入後、その正常なものを獲得した。
【００７４】
抗体：一次抗体：単クローン性ＷＴ−１（Ｆ−６）、ＣＤＣ２ ｐ３４（Ｂ−６）、ＰＣＡＭ−１（ＣＤ３１）、ＳＶ４０ Ｔ Ａｇ（Ｐａｂ １０８）及び多クローン性ｖＷＦ（Ｃ−２０）（Santa Cruz Biotechnology、ハイデルベルク、ドイツ）；多クローン性ＺＯ−１（Zymed、サンフランシスコ、ＣＡ）；単クローン性シナプトポジン（Progen、ハイデルベルク、ドイツ）；多クローン性ｐ５３（Cell Signalling）。
【００７５】
二次抗体：Alexa Fluor(R) 488ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）*２ｍｇ／ｍＬ*、Alexa Fluor(R) 594ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）*２ｍｇ／ｍＬ*、Alexa Fluor(R) 488ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）*２ｍｇ／ｍＬ*及びAlexa Fluor(R) 594ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）*２ｍｇ／ｍＬ*（Invitrogen、カールスルーエ、ドイツ）。
【００７６】
免疫染色：コラーゲンタイプＩコートされたチャンバースライド（VWR International 社、ダルムシュタット、ドイツ）上で増殖細胞の免疫蛍光染色を実施した。２０℃でメタノールを用いて５分間又はリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の４％ホルムアルデヒドを用いて５分間、細胞を固定し、続いてＰＢＳ中０．３％トライトンＸ−１００を用いて室温で１０〜１５分間、透過化処理した。ＰＢＳですすいだ後、非特異的結合部位を０．２％Tween 20（Serva、Amstetten、オーストリア）入りのSuperBlock（ＰＢＳ中のブロッキング緩衝液、Thermo Scientific、ブラウンシュヴァイク、ドイツ）で少なくとも３０分間ブロックした。ブロッキング溶液中に予め希釈した一次抗体を室温で６０分間又は４℃で一夜適用した。Alexa Fluor(R) 488 又は 594二次抗体（Invitrogen、カールスルーエ、ドイツ）を用いて抗原−抗体複合体を視覚化した。ニコン顕微鏡写真機を用いて画像を得、そしてAdobe Photoshop 6.0ソフトウェアで処理した。
【００７７】
全ＲＮＡの単離：培養された有足細胞、Huvecs及びＰＨＨから、RNeasy Kit（Qiagen、ヒルデン、ドイツ）を用いて全ＲＮＡを単離した。RNase-free DNase-Set（Qiagen、ヒルデン、ドイツ）を用いてゲノムＤＮＡ入りの潜在的サンプルコンタミネーションを除去した。質及び純度は、キャピラリー電気泳動（Caliper Lab Chip system Agilent 2100 Bio
analyser、Agilent Technologies社、Waldbronn、ドイツ）を用いて評価した。
【００７８】
定量的逆転写−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）：リアルタイム定量的ＰＣＲは、QuantiTect
Probe RT-PCR Kit（Qiagen、ヒルデン、ドイツ）を用いて実施した。各サンプルを四つ組で測定した。遺伝子発現の相対的定量のため、対照としてＧＡＰＤＨを用いてΔΔＣt法を使用した。標的及びハウスキーピング遺伝子の増幅は、Applera/Applied Biosystems（Foster City、米国）から入手した異なる蛍光標識Taq Manプローブを用いて同時に検出した。マルチプレックスＲＴ−ＰＣＲ内の標的及びハウスキーピング遺伝子の増幅直線性は、テンプレートの希釈によりＲＴ−ＰＣＲ反応を実施することによって評価した。ＲＴ−ＰＣＲ反応及びデータ収集は、iCycler-iQ-Thermocycler（Bio-Rad Laboratories社、ミュンヘン、ドイツ）において実施した。相対的遺伝子発現は、対照サンプルに対する誘導倍率（fold induction）として算出した。負の値は、対照サンプル中の発現レベルと比較した下方制御の倍率（fold down regulation）を示す。
【００７９】
スーパーアレイ−技術：ＰＣＲアレイは、焦点を絞った遺伝子パネルの発現を分析する手段である。それぞれ９６ウェル又は関連の、経路又は疾患に焦点を絞った遺伝子（例えば転写因子、細胞周期、幹細胞）の綿密に調査されたパネル用のSYBR Green最適化プライマーアッセイを含み、そしてSABiosciences（ＣＡ、米国）から入手した。
【００８０】
ＰＣＲアレイ（RT2 Profiler PCR Array System）では、リアルタイムＰＣＲ感受性及びマイクロアレイの多重遺伝子のプロファイリング能力を用いて遺伝子発現分析を実施する。実験者のｃＤＮＡテンプレート（RT2 First Strand Kit (C-03)）と適切なすぐに使用できるＰＣＲマスターミックスとを同じプレートの各ウェルに等体積のアリコートで単純に混合し、次いでリアルタイムＰＣＲサイクリングプログラムを実施する。プレートテンプレート及びリアルタイムＰＣＲサイクリングプログラム（Instrument-Specific Setup Instructions & Protocol Files）は、ファイルhttp://www.sabiosciences.com/pcrarrayprotocolfiles.php.を用いて入手可能である。
【００８１】
RT2-First Strand Kitは、有効な第１鎖（first strand）ｃＤＮＡ合成のための迅速かつ便利な方法を提供する。キットは、有効なゲノムＤＮＡ除去工程及び組み込まれた外部ＲＮＡ対照（built-in External RNA Control）も含む。このオールインワンキットは、SABiosciencesのRT2 ProfilerTM PCR Arrays 及び RT2 qPCR Primer AssaysによるリアルタイムＰＣＲベースの遺伝子発現分析のために設計され、そして最適化されている。キットは、逆転写前にＲＮＡサンプルから汚染ゲノムＤＮＡを効果的に除去するための独自の方法を含む。偏りのないやり方（unbiased manner）におけるランダム六量体及びオリゴ−ｄＴプライム逆転写及び逆転写酵素により最適な収量及び長さでｃＤＮＡ産物を合成する。組み込まれた外部ＲＮＡ対照は、逆転写効率をモニターし、そしてRT2 RNA QC PCR Array及びRT2 ProfilerTM PCR Arrayと共に用いたときに酵素阻害剤が混入した実験者のＲＮＡサンプルを試験するのに役立つ。マグネシウム及びヌクレオチド濃度及び他の緩衝液成分は、RT2 ProfilerTM PCR Arrays 及びRT2 qPCR Primer Assaysによる遺伝子発現分析に用いたときにRT2 SYBR Green qPCR Master Mixesと最も適合しうる。
【００８２】
RT2 SYBR Green／フルオレセインqPCRマスターミックスは、BioRad iCycler(R) 及び MyiQ(R)におけるリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応に必要なすべての試薬及び緩衝液：リアルタイムＰＣＲ緩衝液、高性能HotStart DNA Taqポリメラーゼ、ヌクレオチド、SYBR(R)Green色素、及び機器の光学的諸特性を規格化するために必要なフルオレセイン参照色素を含む。マスターミックスを実験者のテンプレート及びプライマーと共にＰＣＲ管に単に加える。化学修飾及び厳密に制御されたHotStart酵素によりプライマー二量体及び他の非特異的産物の増幅を防ぐことによってより正確なSYBR Greenの結果が独自に得られる。このRT2 qPCRマスターミックスは、BioRad iCycler(R)及びMyiQ(R)におけるSYBR Greenに基づく検出を用いたリアルタイムＰＣＲ適用に最も適している。
【００８３】
配列：
ＥＦ１アルファプロモーター（SEQ ID NO：１）
ＣＧＴＧＡＧＧＣＴＣＣＧＡＴＧＣＣＣＧＴＣＡＧＴＧＧＧＣＡＧＡＧＣＧＣＡＣＡＴＣＧＣＣＣＡＣＡＧＴＣＣＣＣＧＡＧＡＡＧＴＴＧＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＧＡＡＣＣＧＧＴＧＣＣＴＡＧＡＧＡＡＧＧＴＧＧＣＧＣＧＧＧＧＴＡＡＡＣＴＧＧＧＡＡＡＧＴＧＡＴＧＴＣＧＴＧＴＡＣＴＧＧＣＴＣＣＧＣＣＴＴＴＴＴＣＣＣＧＡＧＧＧＴＧＧＧＧＧＡＧＡＡＣＣＧＴＡＴＡＴＡＡＧＴＧＣＡＧＴＡＧＴＣＧＣＣＧＴＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＴＴＴＣＧＣＡＡＣＧＧＧＴＴＴＧＣＣＧＣＣＡＧＡＡＣＡＣＡＧＧ
【００８４】
ＬＯＸ１（SEQ ID NO：２）ＧＡＴＣＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ
【００８５】
ＬＯＸ２（SEQ ID NO：３）ＴＣＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ
【００８６】
ｃＤＮＡ Ｅ６／Ｅ７（SEQ ID NO：４）
ＡＴＧＴＴＴＣＡＧＧＡＣＣＣＡＣＡＧＧＡＧＣＧＡＣＣＣＧＧＡＡＡＧＴＴＡＣＣＡＣＡＧＴＴＡＴＧＣＡＣＡＧＡＧＣＴＧＣＡＡＡＣＡＡＣＴＡＴＡＣＡＴＧＡＴＡＴＡＡＴＡＴＴＡＧＡＡＴＧＴＧＴＧＴＡＣＴＧＣＡＡＧＣＡＡＣＡＧＴＴＡＣＴＧＣＧＡＣＧＴＧＡＧＧＴＡＴＡＴＧＡＣＴＴＴＧＣＴＴＴＴＣＧＧＧＡＴＴＴＡＴＧＣＡＴＡＧＴＡＴＡＴＡＧＡＧＡＴＧＧＧＡＡＴＣＣＡＴＡＴＧＣＴＧＴＡＴＧＴＧＡＴＡＡＡＴＧＴＴＴＡＡＡＧＴＴＴＴＡＴＴＣＴＡＡＡＡＴＴＡＧＴＧＡＧＴＡＴＡＧＡＣＡＴＴＡＴＴＧＴＴＡＴＡＧＴＧＴＧＴＡＴＧＧＡＡＣＡＡＣＡＴＴＡＧＡＡＣＡＧＣＡＡＴＡＣＡＡＣＡＡＡＣＣＧＴＴＧＴＧＴＧＡＴＴＴＧＴＴＡＡＴＴＡＧＧＴＧＴＡＴＴＡＡＣＴＧＴＣＡＡＡＡＧＣＣＡＣＴＧＴＧＴＣＣＴＧＡＡＧＡＡＡＡＧＣＡＡＡＧＡＣＡＴＣＴＧＧＡＣＡＡＡＡＡＧＣＡＡＡＧＡＴＴＣＣＡＴＡＡＴＡＴＡＡＧＧＧＧＴＣＧＧＴＧＧＡＣＣＧＧＴＣＧＡＴＧＴＡＴＧＴＣＴＴＧＴＴＧＣＡＧＡＴＣＡＴＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＴＡＧＡＧＡＡＡＣＣＣＡＧＣＴＧＴＡＡＴＣＡＴＧＣＡＴＧＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣＴＡＣＡＴＴＧＣＡＴＧＡＡＴＡＴＡＴＧＴＴＡＧＡＴＴＴＧＣＡＡＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＣＴＧＡＴＣＴＣＴＡＣＴＧＴＴＡＴＧＡＧＣＡＡＴＴＡＡＡＴＧＡＣＡＧＣＴＣＡＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＴＧＡＡＡＴＡＧＡＴＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＧＡＣＡＡＧＣＡＧＡＡＣＣＧＧＡＣＡＧＡＧＣＣＣＡＴＴＡＣＡＡＴＡＴＴＧＴＡＡＣＣＴＴＴＴＧＴＴＧＣＡＡＧＴＧＴＧＡＣＴＣＴＡＣＧＣＴＴＣＧＧＴＴＧＴＧＣＧＴＡＣＡＡＡＧＣＡＣＡＣＡＣＧＴＡＧＡＣＡＴＴＣＧＴＡＣＴＴＴＧＧＡＡＧＡＣＣＴＧＴＴＡＡＴＧＧＧＣＡＣＡＣＴＡＧＧＡＡＴＴＧＴＧＴＧＣＣＣＣＡＴＣＴＧＴＴＣＴＣＡＧＡＡＡＣＣＡＴＡＡ
【００８７】
ＷＰＲＥ（SEQ ID NO：５）
ＡＡＴＣＡＡＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＡＣＡＡＡＡＴＴＴＧＴＧＡＡＡＧＡＴＴＧＡＣＴＧＧＴＡＴＴＣＴＴＡＡＣＴＡＴＧＴＴＧＣＴＣＣＴＴＴＴＡＣＧＣＴＡＴＧＴＧＧＡＴＡＣＧＣＴＧＣＴＴＴＡＡＴＧＣＣＴＴＴＧＴＡＴＣＡＴＧＣＴＡＴＴＧＣＴＴＣＣＣＧＴＡＴＧＧＣＴＴＴＣＡＴＴＴＴＣＴＣＣＴＣＣＴＴＧＴＡＴＡＡＡＴＣＣＴＧＧＴＴＧＣＴＧＴＣＴＣＴＴＴＡＴＧＡＧＧＡＧＴＴＧＴＧＧＣＣＣＧＴＴＧＴＣＡＧＧＣＡＡＣＧＴＧＧＣＧＴＧＧＴＧＴＧＣＡＣＴＧＴＧＴＴＴＧＣＴＧＡＣＧＣＡＡＣＣＣＣＣＡＣＴＧＧＴＴＧＧＧＧＣＡＴＴＧＣＣＡＣＣＡＣＣＴＧＴＣＡＧＣＴＣＣＴＴＴＣＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＧＣＴＴＴＣＣＣＣＣＴＣＣＣＴＡＴＴＧＣＣＡＣＧＧＣＧＧＡＡＣＴＣＡＴＣＧＣＣＧＣＣＴＧＣＣＴＴＧＣＣＣＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＧＧＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＴＴＧＧＧＣＡＣＴＧＡＣＡＡＴＴＣＣＧＴＧＧＴＧＴＴＧＴＣＧＧＧＧＡＡＧＣＴＧＡＣＧＴＣＣＴＴＴＣＣＡＴＧＧＣＴＧＣＴＣＧＣＣＴＧＴＧＴＴＧＣＣＡＣＣＴＧＧＡＴＴＣＴＧＣＧＣＧＧＧＡＣＧＴＣＣＴＴＣＴＧＣＴＡＣＧＴＣＣＣＴＴＣＧＧＣＣＣＴＣＡＡＴＣＣＡＧＣＧＧＡＣＣＴＴＣＣＴＴＣＣＣＧＣＧＧＣＣＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＴＣＴＧＣＧＧＣＣＴＣＴＴＣＣＧＣＧＴＣＴＴＣＧＣＣＴＴＣＧＣＣＣＴＣＡＧＡＣＧＡＧＴＣＧＧＡＴＣＴＣＣＣＴＴＴＧＧＧＣＣＧＣＣＴＣＣＣＣＧＣＣＴＧ
【００８８】
Ｖｅｃｔｏｒ＿ｐＬＶ＿ＥＦ１ａ−Ｌｏｘ１−Ｅ６Ｅ７−Ｌｏｘ２＿ＷＰＲＥ
（SEQ ID NO：６）
ＣＧＣＧＴＣＧＴＧＡＧＧＣＴＣＣＧＡＴＧＣＣＣＧＴＣＡＧＴＧＧＧＣＡＧＡＧＣＧＣＡＣＡＴＣＧＣＣＣＡＣＡＧＴＣＣＣＣＧＡＧＡＡＧＴＴＧＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＧＡＡＣＣＧＧＴＧＣＣＴＡＧＡＧＡＡＧＧＴＧＧＣＧＣＧＧＧＧＴＡＡＡＣＴＧＧＧＡＡＡＧＴＧＡＴＧＴＣＧＴＧＴＡＣＴＧＧＣＴＣＣＧＣＣＴＴＴＴＴＣＣＣＧＡＧＧＧＴＧＧＧＧＧＡＧＡＡＣＣＧＴＡＴＡＴＡＡＧＴＧＣＡＧＴＡＧＴＣＧＣＣＧＴＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＴＴＴＣＧＣＡＡＣＧＧＧＴＴＴＧＣＣＧＣＣＡＧＡＡＣＡＣＡＧＧＡＴＣＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＧＡＴＣＣＧＴＴＴＡＡＡＣＴＴＧＣＴＧＣＧＡＣＧＣＧＴＡＣＴＡＧＴＡＴＧＴＴＴＣＡＧＧＡＣＣＣＡＣＡＧＧＡＧＣＧＡＣＣＣＧＧＡＡＡＧＴＴＡＣＣＡＣＡＧＴＴＡＴＧＣＡＣＡＧＡＧＣＴＧＣＡＡＡＣＡＡＣＴＡＴＡＣＡＴＧＡＴＡＴＡＡＴＡＴＴＡＧＡＡＴＧＴＧＴＧＴＡＣＴＧＣＡＡＧＣＡＡＣＡＧＴＴＡＣＴＧＣＧＡＣＧＴＧＡＧＧＴＡＴＡＴＧＡＣＴＴＴＧＣＴＴＴＴＣＧＧＧＡＴＴＴＡＴＧＣＡＴＡＧＴＡＴＡＴＡＧＡＧＡＴＧＧＧＡＡＴＣＣＡＴＡＴＧＣＴＧＴＡＴＧＴＧＡＴＡＡＡＴＧＴＴＴＡＡＡＧＴＴＴＴＡＴＴＣＴＡＡＡＡＴＴＡＧＴＧＡＧＴＡＴＡＧＡＣＡＴＴＡＴＴＧＴＴＡＴＡＧＴＧＴＧＴＡＴＧＧＡＡＣＡＡＣＡＴＴＡＧＡＡＣＡＧＣＡＡＴＡＣＡＡＣＡＡＡＣＣＧＴＴＧＴＧＴＧＡＴＴＴＧＴＴＡＡＴＴＡＧＧＴＧＴＡＴＴＡＡＣＴＧＴＣＡＡＡＡＧＣＣＡＣＴＧＴＧＴＣＣＴＧＡＡＧＡＡＡＡＧＣＡＡＡＧＡＣＡＴＣＴＧＧＡＣＡＡＡＡＡＧＣＡＡＡＧＡＴＴＣＣＡＴＡＡＴＡＴＡＡＧＧＧＧＴＣＧＧＴＧＧＡＣＣＧＧＴＣＧＡＴＧＴＡＴＧＴＣＴＴＧＴＴＧＣＡＧＡＴＣＡＴＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＴＡＧＡＧＡＡＡＣＣＣＡＧＣＴＧＴＡＡＴＣＡＴＧＣＡＴＧＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣＴＡＣＡＴＴＧＣＡＴＧＡＡＴＡＴＡＴＧＴＴＡＧＡＴＴＴＧＣＡＡＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＣＴＧＡＴＣＴＣＴＡＣＴＧＴＴＡＴＧＡＧＣＡＡＴＴＡＡＡＴＧＡＣＡＧＣＴＣＡＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＴＧＡＡＡＴＡＧＡＴＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＧＡＣＡＡＧＣＡＧＡＡＣＣＧＧＡＣＡＧＡＧＣＣＣＡＴＴＡＣＡＡＴＡＴＴＧＴＡＡＣＣＴＴＴＴＧＴＴＧＣＡＡＧＴＧＴＧＡＣＴＣＴＡＣＧＣＴＴＣＧＧＴＴＧＴＧＣＧＴＡＣＡＡＡＧＣＡＣＡＣＡＣＧＴＡＧＡＣＡＴＴＣＧＴＡＣＴＴＴＧＧＡＡＧＡＣＣＴＧＴＴＡＡＴＧＧＧＣＡＣＡＣＴＡＧＧＡＡＴＴＧＴＧＴＧＣＣＣＣＡＴＣＴＧＴＴＣＴＣＡＧＡＡＡＣＣＡＴＡＡＴＣＴＡＧＣＧＴＣＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＴＣＧＡＣＡＡＴＣＡＡＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＡＣＡＡＡＡＴＴＴＧＴＧＡＡＡＧＡＴＴＧＡＣＴＧＧＴＡＴＴＣＴＴＡＡＣＴＡＴＧＴＴＧＣＴＣＣＴＴＴＴＡＣＧＣＴＡＴＧＴＧＧＡＴＡＣＧＣＴＧＣＴＴＴＡＡＴＧＣＣＴＴＴＧＴＡＴＣＡＴＧＣＴＡＴＴＧＣＴＴＣＣＣＧＴＡＴＧＧＣＴＴＴＣＡＴＴＴＴＣＴＣＣＴＣＣＴＴＧＴＡＴＡＡＡＴＣＣＴＧＧＴＴＧＣＴＧＴＣＴＣＴＴＴＡＴＧＡＧＧＡＧＴＴＧＴＧＧＣＣＣＧＴＴＧＴＣＡＧＧＣＡＡＣＧＴＧＧＣＧＴＧＧＴＧＴＧＣＡＣＴＧＴＧＴＴＴＧＣＴＧＡＣＧＣＡＡＣＣＣＣＣＡＣＴＧＧＴＴＧＧＧＧＣＡＴＴＧＣＣＡＣＣＡＣＣＴＧＴＣＡＧＣＴＣＣＴＴＴＣＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＧＣＴＴＴＣＣＣＣＣＴＣＣＣＴＡＴＴＧＣＣＡＣＧＧＣＧＧＡＡＣＴＣＡＴＣＧＣＣＧＣＣＴＧＣＣＴＴＧＣＣＣＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＧＧＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＴＴＧＧＧＣＡＣＴＧＡＣＡＡＴＴＣＣＧＴＧＧＴＧＴＴＧＴＣＧＧＧＧＡＡＧＣＴＧＡＣＧＴＣＣＴＴＴＣＣＡＴＧＧＣＴＧＣＴＣＧＣＣＴＧＴＧＴＴＧＣＣＡＣＣＴＧＧＡＴＴＣＴＧＣＧＣＧＧＧＡＣＧＴＣＣＴＴＣＴＧＣＴＡＣＧＴＣＣＣＴＴＣＧＧＣＣＣＴＣＡＡＴＣＣＡＧＣＧＧＡＣＣＴＴＣＣＴＴＣＣＣＧＣＧＧＣＣＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＴＣＴＧＣＧＧＣＣＴＣＴＴＣＣＧＣＧＴＣＴＴＣＧＣＣＴＴＣＧＣＣＣＴＣＡＧＡＣＧＡＧＴＣＧＧＡＴＣＴＣＣＣＴＴＴＧＧＧＣＣＧＣＣＴＣＣＣＣＧＣＣＴＧＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴ
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【００８９】
結果
Ａ有足細胞
１９９７年にMundel P 等によって記載されたプロトコールに従って新生仔ラット腎糸球体から有足細胞を単離した。単離した後、コラーゲンコートされた２４ウェルプレート上の１０％ＦＣＳ入りのＤＭＥＭ中で糸球体を培養した。２４時間後、有足細胞前駆体は、付着した糸球体から外へ増殖し始めた（図２）。
【００９０】
この段階で、細胞に異なるレンチウイルスコンストラクトを形質導入し、そして培養を長期間（２〜４週間）継続した。急速に増殖している細胞の島を単離し、広げ、そしてＲＴ ＰＣＲ及び免疫染色を用いて特徴づけた。ＳＶ４０ ＬＴａｇの発現は、免疫染色によって制御した。細胞の１００％は、核中に大量のＳＶ４０ ＬＴ Ａｇを蓄積し（図３Ｃ）、形質導入されてない又はＧＦＰ形質導入された細胞では、染色を検出することができなかった（データは示さず）。ｈＴＥＲＴによる形質導入は、（定量的ＲＴ ＰＣＲデータによればｈＴＥＲＴは５００倍を超えて過剰発現されたが）増殖速度を高めるには不十分であり、そして数回試行した後、断念した。ＨＰＶ Ｅ６／Ｅ７単独による形質導入もまた、有足細胞不死化に十分でなかったが、ＳＶ４０ ＬＴ Ａｇと組み合わせて用いたとき、かなり多くの不死化クローンを増強した。１０回を超える継代後、細胞にレンチウイルスＣｒｅリコンビナーゼを形質導入した。３日後、特異的な抗ＳＶ４０ ＬＴａｇ抗体で染色した。多くの細胞は、ＬＴ Ａｇの有意な減少又は完全な欠如を示し、これはＣｒｅが細胞ゲノムから組込まれたコピーのすべて又は大多数を切除したことを示している（図３Ｄ）。ＬＴ Ａｇが減少した（すなわち陰性）細胞は、その増殖を停止し、３つはサイズが大きくなり、そして有足細胞の典型的な形態を獲得した（図３Ａ及びＢ）。切除効率は比較的低く、約３０〜５０％であった。有足細胞のいくつかの高度に特異的な遺伝子マーカー、例えば、ＷＴ１、シナプトポジンは、この細胞中で再発現されたが、ネフリン及びポドシンのような他のものは、極めて低いレベルでしか発現されなかった（図３Ｃ〜Ｆ及び表１）。
【００９１】
【表１】
【００９２】
結論
有足細胞は、良好に不死化することができるが、さらなる実験的使用のため「不死化遺伝子」の切除によって非増殖状態に戻らなければならない。目下、アデノウイルスＣｒｅを産生しており、そして切除効率を高める目的で試験する。切除しなければ、不死化細胞は、極めて急速に増殖し（倍加時間１２〜１５時間）そして有足細胞の多くの特異的マーカーを消失するか又は低下したレベルで発現する。
【００９３】
Ｂ 初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）
ＰＨＨをLonzaから購入し、そしてコラーゲンコートされたプレート上で培養した。細胞は増殖しないが、脱分化の明らかな徴候がなくても培養を１０〜１４日間持続することができる。ＰＨＨにＳＶ４０ ＬＴ Ａｇ又はＥ６／Ｅ７（ｈＴＥＲＴを用いない）を形質導入し、そして数日後、増殖が始まり、そのサイズは、時間と共に縮小し、そしてそれは容易に継代培養することができる。本発明者らは、これらの細胞を、２０回を超えて継代培養し、そしてその表現型は変化しなかったが、対照肝細胞と比較すると、それは明らかにその表現型を部分的に失った。特に、ＣＲＰ及びハプトグロビンのような肝細胞特異的マーカーの発現は、とりわけＳＶ４０ ＬＴ Ａｇ中で大きく低下しているが、Ｅ６／Ｅ７不死化細胞中では、ハプトグロビン発現は保たれており、そしてＣＲＰ発現は、なお比較的高く、初代細胞と比較して１０％である（表２）。重要なことに、肝細胞関連の転写因子ＨＮＦ４アルファの発現は、Ｅ６／Ｅ７形質導入ＰＨＨ中で２倍しか低下しておらず、そしてＳＶ４０ ＬＴ Ａｇ中ではより大きく８倍低下している。
【００９４】
【表２】
【００９５】
ｃＤＮＡアレイ分析は、ＳＶ４０ ＬＴ Ａｇ又はＥ６／Ｅ７ウイルス性初期タンパク質の過剰発現によって生じる不死化が、細胞周期の制御に関与することが知られているいくつかの遺伝子、すなわちＥ２Ｆ１転写因子、サイクリンＡ２、ＣＤＣ２／ＣＤＫ１−サイクリン依存性キナーゼ１の転写を強く誘導することを示している（表２）。トランスクリプトーム変化のより詳細な説明は、後に報告する。
【００９６】
ＳＶ４０ ＬＴ Ａｇは、核ｐ５３の巨大な蓄積、そしてＥ６／Ｅ７は、ｐ５３の分解及び消失をもたらした（図４）。
【００９７】
両方の場合、ｐ５３は、完全に不活性化され、そしてそのトランス活性化及びトランス抑制性を失う。特に、ＣＤＫ２の阻害剤、そしてｐ５３の直接標的の１つ、ｐ２１ＷＡＦ１（ＣＩＰ１又はＣＤＫＮ１Ａ）の発現は、核中でｐ５３の蓄積にもかかわらず、ＳＶ４０ ＬＴ Ａｇ不死化細胞中で変化しなかった（データは示さず）。一方、別のＣＤＫ阻害剤、ｐ１６ＩＮＫ４のｍＲＮＡ発現は、ＳＶ４０ ＬＴ Ａｇ及びＥ６／Ｅ７−不死化細胞中で強く上方制御された（データは示さず）。この複雑な現象の潜在的な機構は、公開されているが、明確な説明はない（Pei 及び Xiong, 2005）。
【００９８】
結論：初代ヒト肝細胞は、ＳＶ４０ ＬＴ Ａｇ又はヒト乳頭腫Ｅ６／Ｅ７初期タンパク質のいずれかのレンチウイルスが介在する送達により非常に有効に不死化することができる。得られた細胞株は、極めて急速に増殖し（倍加時間は、２０時間未満である）、そしてとりわけＥ６／Ｅ７に誘導された不死化の場合、肝細胞の多くの重要なマーカーを、なお保っていた。これらの細胞は、細胞分裂しない初代肝細胞の代わりにさまざまな生物学的目的に用いることができる。
Ｃ 初代内皮細胞
ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）をPromoCellから購入し、そしてＦＣＳ、ＥＣＧ、ｈＥＧＦ、ｈｂＦＧＦ及びＨＣ−５００を含む内皮細胞特異的培地を用いて、コラーゲンコートされたプレートにおいて培養した。準集密細胞にＳＶ４０ ＬＴ Ａｇ又はＥ６／Ｅ７レンチウイルス粒子のいずれかを形質導入した。ｈＴＥＲＴ単独の形質導入は、有効でなかった（他の試験細胞タイプにおいても同様）。ＳＶ４０ ＬＴ Ａｇ及びＥ６／Ｅ７−形質導入された細胞では、より速い増殖速度が見られたが、ｈＴＥＲＴでは見られなかった。ＦＡＣＳ分析は、両方の「不死化遺伝子」、ＬＴ Ａｇ及びＥ６／Ｅ７により、Ｓ−Ｇ２−Ｍ画分の増加に伴ってＧ１／Ｇ０画分の減少（６０から２０％まで）が生じることを示した。ＢｒｄＵ取り込み／染色（データは示さず）によりＦＡＣＳデータを確認した。驚くべきことに、非常により速い増殖速度にもかかわらず、内皮特異的マーカー、ＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ）及びｖＷＦは、不死化ＨＵＶＥＣ中において同じか又はさらにより高レベルで発現された（図５及び表３参照）。
【００９９】
【表３】
【０１００】
ＳＶ４０ ＬＴ Ａｇ及びＥ６／Ｅ７を過剰発現するＨＵＶＥＣの両方で、内皮特異的なＮＯＳ（ｅＮＯＳ）の中程度の減少が検出された。試験した他の初代細胞と同様に、ＳＶ４０ ＬＴ Ａｇは、核ｐ５３タンパク質における莫大な増加をもたらした、そしてＥ６／Ｅ７では減少した（データは示さず）。
【０１０１】
結論：不死化された初代内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、その主要な分化マーカーを維持するが親細胞より３〜５倍急速に増殖する。形態学的に、細胞サイズの縮小のみが示され、そして核多形性により非不死化細胞と区別される。それらは、さまざまな実験タイプに用いることができ、そこでは内皮「バックグラウンド」が必要とされる。
【０１０２】
不死化の効率。初期ウイルス性タンパク質ＳＶ４０ ＬＴ Ａｇ又はＨＰＶ Ｅ６／Ｅ７を過剰発現するためにレンチウイルス送達系を用いて、本発明者らは、異なる初代ヒト及び齧歯類細胞を不死化することができた。本発明の主要な目標は、初代ラット腎臓有足細胞を不死化することであった。驚くべきことに、レンチウイルスを齧歯類細胞に形質導入することは、初代ヒト細胞と比較してずっと困難であった。これにより、おそらく、なぜ本発明者らがＳＶ４０ ＬＴ Ａｇ又はＥ６／Ｅ７単独でラット腎臓細胞の不死化を達成することができなかったかを説明することができる。しかし、２つのレンチウイルスコンストラクトの組み合わせ（最初にＳＶ４０ ＬＴ Ａｇ、そして２日後にＥ６／Ｅ７を細胞に逐次形質導入した）により単離されたラット糸球体からいくつかの永続的な細胞株が得られた。急速に増殖する細胞は、分化マーカーを部分的に失っておりそして形態学的に有足細胞に似ていなかった。従って、Ｃｒｅリコンビナーゼを用いて「不死化遺伝子」を切除する必要があった。レンチウイルスＣｒｅにより形質導入すると、細胞は増殖を停止し、サイズが大きくなり、そしてネフリン（ＮＰＨＳ１）、シナプトポジン、ウィルムス腫瘍１（ＷＴ１）を含む主な有足細胞特異的マーカーを再発現した。残念なことに、主な有足細胞特異的遺伝子の１つ、ポドシン（ＮＰＨＳ２）は、Ｃｒｅ形質導入された細胞中で再び現れなかった。一般に、本発明者らは、新たに単離されたラット糸球体の有足細胞中でポドシンが短時間（多くとも７２時間）しか発現されなかったことを観察した。従って、作製された不死化細胞は、部分的に脱分化したと考えるべきである。ポドシン発現を急速に消失させるもの（多くの他の有足細胞特異的遺伝子が発現され続けるときに）は、今のところ明らかでない。
【０１０３】
最初に、本発明者らは、２つのさらなる遺伝子、テロメラーゼのヒト触媒サブユニット（ｈＴＥＲＴ）及び温度感受性（ｔｓ）ＳＶ４０ラージＴ抗原突然変異体を不死化に使用するつもりであった。これらのｃＤＮＡコンストラクトを含むレンチウイルス粒子を作製し、そして形質導入された細胞中でｈＴＥＲＴ及びＳＶ４０ ＬＴ Ａｇ−ｔｓの過剰発現が確認されたが、不死化は達成されなかった。ＨＵＶＥＣ、肝細胞、平滑筋細胞、間葉幹細胞を含むいくつかのヒト初代細胞でｈＴＥＲＴを試験したが、全く成功しなかった。従って、少なくとも上記の初代齧歯類及びヒト細胞においてｈＴＥＲＴ単独では不死化に不十分であると結論する必要があった。
【０１０４】
（上記の）初代ヒト細胞の不死化は、ＳＶ４０ ＬＴ Ａｇ及びＥ６／Ｅ７レンチウイルスコンストラクトにより達成に成功した。ＳＶ４０ ＬＴ Ａｇで不死化された細胞（細胞の由来に依存しない）は、Ｅ６／Ｅ７発現細胞よりもずっとより急速に増殖し、そして分化マーカーの部分的又は完全な喪失を伴って有意な核多形性を示す。Ｅ６／Ｅ７の発現により増殖が活性化されるが、分化の部分的喪失しか起こらず、従って新規な細胞株の世代にとってより適切な系となる。興味深いことに、ＨＵＶＥＣでは、実際に分化状態の喪失は見られず（図６及び表４参照）、そして「不死化遺伝子」を切除する必要なしに不死化細胞を直接用いることができる。
【０１０５】
不死化の機構。ラージＴ−抗原（ＬＴ Ａｇ）、ウイルス性癌タンパク質は、ＳＶ４０によってコードされた主要な初期遺伝子産物である。ＬＴ Ａｇ及びヘリカーゼファミリーＩＩＩのメンバー（ＡＡＡ＋スーパーファミリーの部分）。このタンパク質は、ウイルスＤＮＡ複製にとって重要である（Li 及び Kelly 1984; Neuwald 等 1999）。ＳＶ４０ ＬＴ Ａｇは、休止細胞の増殖を誘導し、いくつかの細胞タイプを形質転換し、そして実験動物における腫瘍形成を誘導する（Fanning 及び Knippers 1992）。ＬＴ Ａｇによって生じる不死化／形質転換の正確な機構は、なお明らかではないが、大多数のデータは、ｐ５３を含むいくつかの重要な細胞腫瘍抑制因子の機能への干渉を通して細胞周期チェックポイントを乗り越えることができることを示している（Srinivasan 等 1997; Pipas 1998; DeCaprio 1999; Kim 等 2001）。試験したすべての初代ヒト及び齧歯類細胞において、ＳＶ４０ ＬＴ Ａｇをコードするレンチウイルスによる形質導入によりｐ５３の核内蓄積が莫大になった（図３及び４）。反対に、ＨＰＶ Ｅ６／Ｅ７で形質導入された細胞では、核ｐ５３は消失した（図４）。興味深いことに、いくつかの他のウイルス性癌タンパク質（アデノウイルスＥ１Ｂ、Ｂ型肝炎ウイルスＸタンパク質、乳頭腫ウイルスＥ６、エプスタイン−バーウィルスＥＢＮＡ−５及びヒトＴリンパ球向性ウイルスｔａｘタンパク質）もまたｐ５３を標的とし、強化されたプロテアソーム分解を通してそれを不活性化する。しかし、ＳＶ４０ ＬＴ Ａｇは、主に異なる機構を用い；細胞のｐ５３を安定化する（タンパク質の半減期を高める）と同時にそのトランス活性化活性を阻害する（Deppert 等 1989; Pipas 及び Levine 2001）。ｐ５３安定化及び不活性化の機構は、ＳＶ４０ ＬＴ Ａｇとｐ５３との直接結合に左右される。近年では、ｐ５３はラージＴ抗原と共結晶化された。予期せぬことに、構造は、６つのｐ５３モノマーを結合しているＬＴ Ａｇの六量体複合体を示した。結合されたＳＶ４０ ＬＴは、ｐ５３制御遺伝子のプロモーター中でｐ５３ＤＮＡ−結合ドメインとｐ５３応答エレメントとの相互作用を阻止する。それは、ｐ５３のＤＮＡ−結合領域での劇的な立体配置的変化によって生じ、これは、ｐ５３内の独特の「メチオニンスイッチ」を通して部分的に達成される（Lilyestrom W 等, 2006）。
【０１０６】
ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）初期タンパク質Ｅ６の場合におけるｐ５３の不活性化は、ユビキチン経路を通してｐ５３分解が高められることにより生じる。Ｅ６は、細胞ユビキチン−リガーゼを通してｐ５３タンパク質に結合し、Ｅ６結合タンパク質（Ｅ６−ＡＰ）は、酵素のユビキチン複合体を集め、ｐ５３上でリシンをユビキチン化し、そしてそのタンパク質分解を開始する。
【０１０７】
ＨＰＶ Ｅ７は、網膜芽腫腫瘍抑制タンパク質ｐＲｂの機能を不活性化する。Ｅ７タンパク質は、主に核中に局在化されており、ここで網膜芽腫遺伝子産物ｐＲｂ（ポケットＲｂ）に結合して細胞周期のＳ期への進行を促進する（Zur Hausen, 2002）。正常細胞では、ｐＲｂは、初期Ｇ１期に低リン酸化され、そしてＥ２Ｆ転写因子に結合し、転写リプレッサーとして機能する複合体を形成する。９回リン酸化されると複合体は解離し、Ｅ２Ｆは転写活性化因子として作用することが可能になる。低リン酸化ｐＲｂと結合することによって、Ｅ７は、それとＥ２Ｆとの結合を妨げ、それによって細胞周期進行を促進する。さらに、Ｅ７に誘導されたユビキチン介在性ｐＲｂ分解は、細胞周期停止を有効に克服する際に不可欠であると考えられる（Fehrmann & Laimins, 2003）。
【０１０８】
従って、ＳＶ４０及びＨＰＶによる不死化に含まれる一般的な機構は、ｐ５３及びｐＲｂ不活性化である。非常に最近のデータは、ｐ５３が転写活性化だけでなく抑制にも介在していることを示している（Spurgers 等, 2006; Scian 等, 2008）。重要なことに、いくつかのｐ５３に依存して抑制された遺伝子（ｃｄｃ２、ｃｄｋ４、サイクリン２Ａ、ｃｄｃ２０、Spurgers 等, 2006参照）は、Ｅ２Ｆ１−３によってトランス活性化されることが示された（Zhu 等, 2004）。Ｅ２Ｆ１は、ｐＲｂから解離されると（ｐＲｂリン酸化又はウイルス性タンパク質によるｐＲｂの機能不活性化のいずれかの結果として）、それ自体の転写を活性化し（正のフィードバック）、そしてＧ１／Ｓ及びＧ２／Ｍ移行にとって重要な標的遺伝子（ｃｄｃ２、ｃｄｋ４、サイクリン２Ａ、ｃｄｃ２０）の転写を活性化する。
【０１０９】
本発明者らは、ＳＶ４０ ＬＴ Ａｇ又はＨＰＶ Ｅ６／Ｅ７によって不死化された異なる細胞タイプにおける増殖及び分化の制御に関与する２００を超える遺伝子の発現を分析した。すべての細胞タイプにおいて、Ｅ２Ｆ１、ｃｄｃ２／ｃｄｋ１及びサイクリンＡ２の増強された発現が見られ、そしていくつかの場合（例えば、初代ヒト肝細胞）、数百倍であった（表２参照）。上記のようなサイクリンＡ２及びｃｄｃ２／ｃｄｋ１は、ｐ５３によって転写的に抑制するか又はＥ２Ｆ１によって転写的に活性化することができる（図６）。従って、本発明者らは、ＳＶ４０及びＨＰＶが介在する不死化には２つの重要な事象：第１に、ｐ５３及びｐＲｂの不活性化（いくつかの群によって以前に示した）、そして第２に、Ｅ２Ｆそれ自体、そしてその標的、サイクリンＡ２、サイクリンＢ及びｃｄｃ２の転写を刺激することができる転写的に活性なＥ２Ｆタンパク質の放出が関与していることを提案する。最近示されたように、ｃｄｃ２／ｃｄｋ１は、哺乳動物細胞における唯一の必須な細胞周期Ｃｄｋである（Santamaria 等, 2007）。これらのデータは、Ｃｄｋ１が、不死化、そしておそらくまた二本鎖ＤＮＡ ＨＰＶ及びＳＶ４０ウイルスによっても生じる発癌の重要な調節因子とみなすことができることを示している。特異的ＣＤＫ１阻害剤は、確立されたＨＰＶ若しくはＳＶ４０病因又は突然変異したｐ５３若しくはＲｂによる腫瘍に対して非常に有効であると期待することができる。
【０１１０】
文献
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Deppert W, Steinmayer T, Richter W: Cooperation of SV40 large T antigen and the cellular protein p53 in maintenance of cell transformation. Oncogene. 1989 Sep;4(9):1103-10.
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Neuwald AF, Aravind L, Spouge JL, Koonin EV: AAA+: A class of chaperone-like ATPases associated with the assembly, operation, and disassembly of protein complexes. Genome Res. 1999 Jan;9(1):27-43.
Pei XH, Xiong Y: Biochemical and cellular mechanisms of mammalian CDK inhibitors: a few unresolved issues. Oncogene. 2005 Apr 18; 24(17):2787-95. Review.
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Scian MJ, Carchman EH, Mohanraj L, Stagliano KE, Anderson MA, Deb D, Crane BM, Kiyono T, Windle B, Deb SP, Deb S: Wild-type p53 and p73 negatively regulate expression of proliferation related genes. Oncogene. 2008 Apr 17;27(18):2583-93. Epub 2007 Nov 5.
Srinivasan A, McClellan AJ, Vartikar J, Marks I, Cantalupo P, Li Y, Whyte P, Rundell K, Brodsky JL, Pipas JM: The amino-terminal transforming region of simian virus 40 large T and small t antigens functions as a J domain. Mol Cell Biol. 1997 Aug; 17(8):4761-73.
Spurgers KB, Gold DL, Coombes KR, Bohnenstiehl NL, Mullins B, Meyn RE, Logothetis CJ, McDonnell TJ: Identification of cell cycle regulatory genes as principal targets of p53- mediated transcriptional repression. J Biol Chem. 2006 Sep 1;281(35):25134-42. Epub 2006 Jun 23.
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Zur Hausen H: Papillomaviruses and cancer: from basic studies to clinical application. Nat Rev Cancer. 2002 May; 2(5):342-50. Review.
【特許請求の範囲】
【請求項１】
可逆的に不死化された細胞の作製方法であって、
ａ）真核細胞を準備し、
ｂ）工程ａ）の細胞を遺伝子改変して細胞中で１つ又はそれ以上の不死化タンパク質をコードする１つ又はそれ以上の核酸の発現を可能にし；そして
ｃ）工程ｂ）の細胞中で１つ又はそれ以上の核酸を発現する
ことを含み、
その際、１つ又はそれ以上の不死化タンパク質は、場合により（ｉ）ＳＶ４０ラージＴ抗原（ＴＡＧ）又はその機能的に活性な変異体及び／又は（ｉｉ）テロメラーゼ触媒サブユニット（ＴＥＲＴ）又はその機能的に活性な変異体と組み合わせてヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６／Ｅ７又はその機能的に活性な変異体を含む前記方法。
【請求項２】
可逆的に不死化された細胞の作製方法であって、
ａ）真核細胞を準備し、
ｂ）工程ａ）の細胞を遺伝子改変して細胞中で１つ又はそれ以上の不死化タンパク質をコードする１つ又はそれ以上の核酸の発現を可能にし；そして
ｃ）工程ｂ）の細胞中で１つ又はそれ以上の核酸を発現する
ことを含み、
その際、１つ又はそれ以上の不死化タンパク質の少なくとも１つは、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６／Ｅ７、ＳＶ４０ラージＴ抗原及びテロメラーゼ触媒サブユニット（ＴＥＲＴ）、又はその機能的に活性な変異体からなる群より選ばれ、そして１つ又はそれ以上の不死化タンパク質をコードする１つ又はそれ以上の核酸の発現がＥＦ１アルファプロモーターによって制御される前記方法。
【請求項３】
方法が、さらに
ｄ）工程ｃ）の細胞を増殖させる
ことを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
不死化タンパク質をコードする１つ又はそれ以上の核酸が１つ又はそれ以上のレトロウイルスベクター、特に１つ又はそれ以上のレンチウイルスベクターを用いて導入される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
工程ａ）の細胞が、（ｉ）哺乳動物細胞、特にヒト、霊長類又は齧歯類細胞及び／又は（ｉｉ）初代細胞である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
工程ａ）の細胞が、分化細胞、特に内皮細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、肝細胞、有足細胞又は腎臓細胞である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
１つ又はそれ以上の不死化タンパク質をコードする１つ又はそれ以上の核酸の発現がＥＦ１アルファプロモーターによって制御される、請求項１又は３〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
１つ又はそれ以上の不死化タンパク質をコードする１つ又はそれ以上の核酸がｌｏｘＰ（locus of X-over P1）部位に隣接する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法によって入手可能な細胞、又はその子孫。
【請求項１０】
１つ又はそれ以上の不死化タンパク質をコードする１つ又はそれ以上の核酸を含む真核細胞であって、その際、１つ又はそれ以上の不死化タンパク質の少なくとも１つがヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６／Ｅ７、ＳＶ４０ラージＴ抗原及びテロメラーゼ触媒サブユニット（ＴＥＲＴ）からなる群より選ばれ、そして１つ又はそれ以上の不死化タンパク質をコードする１つ又はそれ以上の核酸の発現がＥＦ１アルファプロモーターによって制御される、前記真核細胞。
【請求項１１】
ｉ）不死化タンパク質をコードする１つ又はそれ以上の核酸が１つ又はそれ以上のレトロウイルスベクター、特に１つ又はそれ以上のレンチウイルスベクター上にある；
ｉｉ）細胞がさらに遺伝子改変を含む；
ｉｉｉ）細胞が哺乳動物細胞、特にヒト、霊長類又は齧歯類細胞である；
ｉｖ）細胞が初代細胞から誘導される；
ｖ）細胞が分化細胞、特に内皮細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、肝細胞、有足細胞又は腎臓細胞から誘導される；
ｖｉ）１つ又はそれ以上の不死化タンパク質をコードする核酸の発現がＥＦ１アルファプロモーターの制御下にある；及び／又は
ｖｉｉ）１つ又はそれ以上の不死化タンパク質をコードする１つ又はそれ以上の核酸がｌｏｘＰ（locus of X-over P1）部位の横に位置している、
請求項９若しくは１０に記載の細胞又はその子孫。
【請求項１２】
請求項９〜１１のいずれか１項に記載の細胞、又はその子孫を再分化する方法であって、１つ又はそれ以上の不死化タンパク質をコードする１つ又はそれ以上の核酸の発現を阻止することを含む前記方法。
【請求項１３】
１つ又はそれ以上の不死化タンパク質をコードする１つ又はそれ以上の核酸がｌｏｘＰ（locus of X-over P1）部位の横に位置しており、そして阻止がＣｒｅリコンビナーゼ又は機能的に活性なＣｒｅ変異体によって実施される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子又は機能的に活性なＣｒｅ変異体遺伝子がレトロウイルスベクター、特にレンチウイルスベクターを用いて細胞に導入される、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法によって入手可能な細胞、又はその子孫。
【請求項１】
可逆的に不死化された細胞の作製方法であって、
ａ）真核細胞を準備し、
ｂ）工程ａ）の細胞を遺伝子改変して細胞中で１つ又はそれ以上の不死化タンパク質をコードする１つ又はそれ以上の核酸の発現を可能にし；そして
ｃ）工程ｂ）の細胞中で１つ又はそれ以上の核酸を発現する
ことを含み、
その際、１つ又はそれ以上の不死化タンパク質は、場合により（ｉ）ＳＶ４０ラージＴ抗原（ＴＡＧ）又はその機能的に活性な変異体及び／又は（ｉｉ）テロメラーゼ触媒サブユニット（ＴＥＲＴ）又はその機能的に活性な変異体と組み合わせてヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６／Ｅ７又はその機能的に活性な変異体を含む前記方法。
【請求項２】
可逆的に不死化された細胞の作製方法であって、
ａ）真核細胞を準備し、
ｂ）工程ａ）の細胞を遺伝子改変して細胞中で１つ又はそれ以上の不死化タンパク質をコードする１つ又はそれ以上の核酸の発現を可能にし；そして
ｃ）工程ｂ）の細胞中で１つ又はそれ以上の核酸を発現する
ことを含み、
その際、１つ又はそれ以上の不死化タンパク質の少なくとも１つは、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６／Ｅ７、ＳＶ４０ラージＴ抗原及びテロメラーゼ触媒サブユニット（ＴＥＲＴ）、又はその機能的に活性な変異体からなる群より選ばれ、そして１つ又はそれ以上の不死化タンパク質をコードする１つ又はそれ以上の核酸の発現がＥＦ１アルファプロモーターによって制御される前記方法。
【請求項３】
方法が、さらに
ｄ）工程ｃ）の細胞を増殖させる
ことを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
不死化タンパク質をコードする１つ又はそれ以上の核酸が１つ又はそれ以上のレトロウイルスベクター、特に１つ又はそれ以上のレンチウイルスベクターを用いて導入される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
工程ａ）の細胞が、（ｉ）哺乳動物細胞、特にヒト、霊長類又は齧歯類細胞及び／又は（ｉｉ）初代細胞である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
工程ａ）の細胞が、分化細胞、特に内皮細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、肝細胞、有足細胞又は腎臓細胞である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
１つ又はそれ以上の不死化タンパク質をコードする１つ又はそれ以上の核酸の発現がＥＦ１アルファプロモーターによって制御される、請求項１又は３〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
１つ又はそれ以上の不死化タンパク質をコードする１つ又はそれ以上の核酸がｌｏｘＰ（locus of X-over P1）部位に隣接する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法によって入手可能な細胞、又はその子孫。
【請求項１０】
１つ又はそれ以上の不死化タンパク質をコードする１つ又はそれ以上の核酸を含む真核細胞であって、その際、１つ又はそれ以上の不死化タンパク質の少なくとも１つがヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６／Ｅ７、ＳＶ４０ラージＴ抗原及びテロメラーゼ触媒サブユニット（ＴＥＲＴ）からなる群より選ばれ、そして１つ又はそれ以上の不死化タンパク質をコードする１つ又はそれ以上の核酸の発現がＥＦ１アルファプロモーターによって制御される、前記真核細胞。
【請求項１１】
ｉ）不死化タンパク質をコードする１つ又はそれ以上の核酸が１つ又はそれ以上のレトロウイルスベクター、特に１つ又はそれ以上のレンチウイルスベクター上にある；
ｉｉ）細胞がさらに遺伝子改変を含む；
ｉｉｉ）細胞が哺乳動物細胞、特にヒト、霊長類又は齧歯類細胞である；
ｉｖ）細胞が初代細胞から誘導される；
ｖ）細胞が分化細胞、特に内皮細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、肝細胞、有足細胞又は腎臓細胞から誘導される；
ｖｉ）１つ又はそれ以上の不死化タンパク質をコードする核酸の発現がＥＦ１アルファプロモーターの制御下にある；及び／又は
ｖｉｉ）１つ又はそれ以上の不死化タンパク質をコードする１つ又はそれ以上の核酸がｌｏｘＰ（locus of X-over P1）部位の横に位置している、
請求項９若しくは１０に記載の細胞又はその子孫。
【請求項１２】
請求項９〜１１のいずれか１項に記載の細胞、又はその子孫を再分化する方法であって、１つ又はそれ以上の不死化タンパク質をコードする１つ又はそれ以上の核酸の発現を阻止することを含む前記方法。
【請求項１３】
１つ又はそれ以上の不死化タンパク質をコードする１つ又はそれ以上の核酸がｌｏｘＰ（locus of X-over P1）部位の横に位置しており、そして阻止がＣｒｅリコンビナーゼ又は機能的に活性なＣｒｅ変異体によって実施される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子又は機能的に活性なＣｒｅ変異体遺伝子がレトロウイルスベクター、特にレンチウイルスベクターを用いて細胞に導入される、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法によって入手可能な細胞、又はその子孫。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２０１２−５２５８２５（Ｐ２０１２−５２５８２５Ａ）
【公表日】平成２４年１０月２５日（２０１２．１０．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５０９００３（Ｐ２０１２−５０９００３）
【出願日】平成２２年５月４日（２０１０．５．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５５９９７
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１２８０２４
【国際公開日】平成２２年１１月１１日（２０１０．１１．１１）
【出願人】（５０４４５６７９８）サノフイ (433)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１０月２５日（２０１２．１０．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年５月４日（２０１０．５．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５５９９７
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１２８０２４
【国際公開日】平成２２年１１月１１日（２０１０．１１．１１）
【出願人】（５０４４５６７９８）サノフイ (433)
【Ｆターム（参考）】
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