合成ヘパラナーゼ分子及びその使用
本発明は、高収率異種発現系で発現させることができる、合成的に産生され、酵素的活性を有するヘパラナーゼ核酸分子及び該分子によりコードされるポリペプチドに関する。本明細書において、また、先行技術の方法と比較して高収率で生物学的活性を有するヘパラナーゼが産生される、異種発現系において哺乳類ヘパラナーゼを発現させる方法も提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高収率異種発現系で発現可能である、合成的に産生され、酵素的活性を有するヘパラナーゼ分子に関する。また、本明細書において、異種発現系で哺乳類ヘパラナーゼを発現させる方法も提供する。
【背景技術】
【０００２】
ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧｓ）は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）及び細胞表面上で見られる遍在性の高分子であり、細胞−細胞及び細胞−ＥＣＭ相互作用の維持に寄与する。ＨＳＰＧｓは、タンパク質コアに共有結合するいくつかのヘパラン硫酸（ＨＳ）鎖から構成される。ヘパラン硫酸は、フィブロネクチン、ラミニン及びコラーゲンなどの構造的ＥＣＭタンパク質の、細胞表面及び他のＥＣＭタンパク質との結合を促進するが、このことから、自己集合及びＥＣＭ成分の不溶性、細胞接着及び移動運動においてこのグリコサミノグリカンが果たす役割が示唆される。正しい細胞−細胞及び細胞−ＥＣＭ相互作用の維持は重要であるため、細胞外環境においてＨＳＰＧｓは、重大な構造的及び調整的役割を果たし、胚形成、形態形成及び発生から、炎症、血管新生及び癌転移にわたる範囲の重要な正常及び病的プロセスの調節を行う。
【０００３】
上述の構造的及び細胞マトリックスのアンカー的役割に加えて、ＨＳの構造多様性（Ｅｓｋｏら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０８：１６９−１７３（２００１）；Ｔｕｒｎｂｕｌｌら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１：７５−８２（２００１））により、ＨＳＰＧｓは、増殖因子、酵素及びケモカインなどの様々な細胞外シグナル伝達タンパク質と相互作用することが可能となる。繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ１及びＦＧＦ２）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子、形質転換成長因子β及び血小板由来増殖因子などの増殖因子は、腫瘍成長、侵襲及び血管新生において重要な役割を果たす。これらのシグナル伝達分子の拠点としての作用、これらの活性化又は安定化に加えて、ＨＳＰＧｓは、ＦＧＦ受容体の多様なアイソフォームへのＦＧＦ２の結合など、リガンド−受容体相互作用に関与し得る（Ｃｈａｎｇら、ＦＡＳＥＢ Ｊ．１４：１３７−１４４（２０００））。
【０００４】
ヘパラン硫酸は、血小板、胎盤栄養膜細胞及び白血球により放出されるエンドβ−Ｄ−グルクロニダーゼヘパラナーゼにより分解される。ヘパラナーゼは、加水分解酵素メカニズムを介してグリコシド結合を切断することにより、特異的にヘパラン硫酸を分解する。この分解の結果、ｂＦＧＦ、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）及び組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）が放出されるが、これらにより、血管新生が開始され得るか、又はＥＣＭ分解が可能となり得る。さらに、ヘパラナーゼによるＨＳ切断により、基底膜（ＢＭ）を介して細胞が移動し、ＥＣＭ障壁を横断できるようになる。ＨＳ分解は、細胞外の変化に細胞が素早く反応することができるようにすることにより、多数の生理学的プロセスにおいて重要な役割を果たす。従って、ヘパラナーゼ活性の阻害は、炎症、転移及び自己免疫疾患など、細胞移動の変化に関係する病変に影響を及ぼし得る。
【０００５】
このような極めて重要な役割のために、ヘパラナーゼは、抗腫瘍、抗転移又は抗炎症剤の開発のための、有力な新規ターゲットとなる。ヘパラナーゼは、単一遺伝子産物であり、関連タンパク質の複合ファミリーの一部ではないと思われるので、薬物開発の目的に対して、ＥＣＭ−調節酵素でもあるマトリックスメタロプロテアーゼを凌ぐ顕著な利点を有する。信頼できる高スループットのアッセイが不足していることと、その複雑な生合成との両方により、現在、薬物ターゲットとしてヘパラナーゼを活用することには障害が多く、活性タンパク質を大量に産生させることが困難となっている。
【０００６】
ヒトヘパラナーゼｃＤＮＡは、小胞体（ＥＲ）への移動の際にシグナルペプチダーゼにより除去されるシグナルペプチド配列を有する、プレプロタンパク質として最初に合成されるタンパク質をコードする。得られる６５ｋＤａのプロ型は、さらに、１５７個のＮ−末端アミノ酸を除去することによりプロセシングされ、成熟型の５０ｋＤヘパラナーゼとなる。この５０ｋＤタンパク質は、非プロセシング型の６５ｋＤａ前駆体よりも少なくとも１００倍高い特異的活性を有する（Ｖｌｏｄａｖｓｋｙら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５：７９３−８０２（１９９９））。興味深いことに、この５０ｋＤａタンパク質は、哺乳類細胞などで発現される場合、不活性である（Ｈｕｌｅｔｔら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５：８０３−８０９（１９９９））。この酵素の活性型が、未同定のタンパク質分解酵素による６ｋＤａの介在ペプチドの除去により生じる、５０ｋＤａ断片と８ｋＤａ断片との間のヘテロ二量体から構成されることが提案された（Ｆａｉｒｂａｎｋｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２９５８７−２９５９０（１９９９））。この仮説と一致して、ＭｃＫｅｎｚｉｅら（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．３７３：４２３−４３５（２００３））は、昆虫細胞において活性ヘテロ二量体ヘパラナーゼを産生させ、８ｋＤａサブユニットがヘパラナーゼ活性に必要であることを確認した。
【０００７】
内因性ヘパラナーゼは、様々なソースから精製することができる。しかし、ヘパラナーゼ発現レベルが低い場合は、煩雑で費用の高い精製法が必要となる。例えば、Ｔｏｙｏｓｈｉｍａ及びＮａｋａｊｉｍａ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２４１５３−２４１６０（１９９９））は、４つの異なるクロマトグラフィー段階を必要とし、少なくとも５日間かかる、血小板からの内因性ヒトヘパラナーゼの精製プロセスについて述べた。
【０００８】
内因性ヘパラナーゼの精製に対する他の欠点は、全体的な収率が特徴的に低いことである。例えば、Ｆａｉｒｂａｎｋｓら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，２９５８７−２９５９０（１９９９））は、血小板からヘパラナーゼをたった２２μｇのみ、６％の回収率で精製したことについて報告している。同様に、Ｆｕｋｓ及び共同研究者ら（米国特許第５，３６２，６４１号）は、ヒトヘパトーマ細胞株Ｓｋ−Ｈｅｐ−１由来のタンパク質 １．４ｋｇからヘパラナーゼを４０００倍精製し、１．９％の回収率で、精製ヘパラナーゼタンパク質をわずか６．５μｇのみ調製したことについて述べている。同じ細胞株からのヘパラナーゼの２４０，０００倍精製が、Ｐｅｃｋｅｒら（米国特許第５，９６８，８２２号）により開示された。しかし、このプロセスには、細胞培養物 ５００リットル超が必要であった。
【０００９】
ヒトヘパラナーゼ遺伝子の同定及びクローニング（Ｖｌｏｄａｖｋｓｙら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．５：７９３−８０２（１９９９）；Ｈｕｌｅｔｔら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．５：８０３−８０９（１９９９）；Ｔｏｙｏｓｈｉｍａ及びＮａｋａｊｉｍａ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２４１５３−２４１６０（１９９９））により、異種発現系におけるヘパラナーゼタンパク質の組み換え発現が可能となった。しかし、そのような異種発現系について、ヘパラナーゼ産生に関して、重大な欠点が知られている。例えば、Ｂｅｎ−Ａｒｔｚｉら（ＷＯ９９／５７２４４）は、細菌、哺乳類、酵母及び昆虫細胞における組み換えヒトヘパラナーゼの発現について述べている。ヘパラナーゼ発現は達成されたが、Ｅ．コリが宿主細胞であった場合、その組み換えタンパク質に付随する酵素活性は検出されず、酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（ピキア パストリス）でヘパラナーゼを発現させた場合、７０ｋＤａの非プロセシング前駆体のみが検出された。
【００１０】
Ｂｅｎ−Ａｒｔｚｉ及び共同研究者ら（前出）はまた、哺乳類細胞、すなわち、ヒト腎臓繊維芽細胞（２９３）、仔ハムスター腎臓細胞（ＢＨＬ２１）及びチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）における組み換えヘパラナーゼの発現について述べている。しかし、これらの発現系は、効率が低く、必要なコストが高いことが知られている。さらに、活性を有する成熟型タンパク質を得るための組み換え全長前駆体のプロセシングがこれらの細胞で観察されるという事実にもかかわらず、このプロセシング反応が効率的でないため、均質的にプロセシングされたタンパク質は得られない。さらに、ヘパラナーゼの分泌を促進する発現ベクターを使用しても、ＣＨＯ細胞の馴化培地において組み換えヘパラナーゼの産生は導かれず、ヘパラナーゼを分泌するために、カルシウムイオノフォア又はＰＭＡを添加することにより、さらに刺激を行う必要がある。この系で正しくプロセシングされるのは、分泌されたタンパク質のごく一部のみであると思われる。
【００１１】
Ｓｆ２１又はＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ（ハイファイブ）細胞などの昆虫細胞発現系におけるヘパラナーゼの産生が、この技術分野において述べられている（ＷＯ９９／５７２４４、ＷＯ９９／１１７９８、米国特許第５，９６８，８２２号；米国特許第６，３４８，３４４号；及び米国特許第６，１９０，８７５号）。しかし、増殖培地へと効率的に分泌されることがこのような方法で観察されるにもかかわらず、この酵素の特異的活性は非常に低く、正しいプロセシングは観察されなかった。例えば、Ｂｅｎ−Ａｒｔｚｉら（ＷＯ９９／５７２４４）は、昆虫細胞発現系で正しくプロセシングされたヘパラナーゼを生成させるために、そのヘパラナーゼタンパク質の位置１１９又は１５７の下流にプロテアーゼ切断部位を導入することについて述べている。しかし、これらのコンストラクトは、酵素的に活性であることが示されなかった。
【００１２】
ＭｃＫｅｎｚｉｅら（前出）は、昆虫細胞における活性を有するヘテロ二量体ヘパラナーゼの産生について述べた。しかし、この系は、２種類の異なる組み換えタンパク質（８ｋＤａ及び５０ｋＤａサブユニット）を同時に生成させる必要があるという欠点を有する。単離した８ｋＤａ及び５０ｋＤａドメインの混合の結果、ヘパラナーゼは活性化されないので、同時発現により活性を有するヘテロ二量体を成功裡に回収できるか否かは、おそらく、そのヘテロ二量体複合体の共翻訳的な形成に依存する。この複合体をグリカナーゼで処理することにより、それが解離し、５０ｋＤａサブユニットが沈降するが、このことから、安定性及び溶解性に乏しいことが示唆される。
【００１３】
活性又は不活性型でヘパラナーゼを得るための上述の方法にもかかわらず、高収率、低コストの異種発現系において発現させることができる、生物学的に活性を有するヘパラナーゼ分子を生成させることは利益があると思われる。前記分子は、転移成長及び／又は炎症を阻害及び／又は治療する、治療又は医薬品の開発のための阻害剤スクリーニングアッセイにおいて使用することができる。
【発明の開示】
【００１４】
本発明は、高収率の異種発現系で発現させることができる、生物学的に活性を有する哺乳類ヘパラナーゼをコードする合成核酸分子を提供する。本明細書で提供される合成ヘパラナーゼ分子は、哺乳類系で発現が低レベルであり異種発現系で正しくプロセシングされない野生型ヘパラナーゼを凌ぐ顕著な長所を与える。本発明の合成分子は、転移成長、自己免疫疾患及び／又は炎症を阻害及び／又は治療するための治療又は医薬品開発のための、阻害剤スクリーニングアッセイにおいて使用することができる。
【００１５】
本発明のある態様において、上記の合成核酸分子は、哺乳類ヘパラナーゼタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有し、このヌクレオチド配列は、エンドプロテアーゼにより認識される２個のコンセンサス切断部位を含有し、この切断部位は、本ヘパラナーゼタンパク質の残基１００及び１６８をコードするヌクレオチドの間に位置する。前記核酸分子は、適切な酵素とともにインキュベーションすると生物学的活性が可能となる、ヘパラナーゼタンパク質をコードする。
【００１６】
本発明はさらに、哺乳類ヘパラナーゼタンパク質をコードする部分を含有し、このタンパク質コード部分が、基本的に、約８ｋＤａのＮ−末端断片をコードするヌクレオチド配列と、リンカーと、約５０ｋＤａのＣ−末端断片をコードするヌクレオチド配列と、から構成され、該Ｎ−末端及びＣ−末端断片が、野生型ヘパラナーゼ断片と実質的に同様であるタンパク質断片をコードし、該コードされるヘパラナーゼタンパク質が構成的に活性を有する、合成哺乳類ヘパラナーゼ核酸分子に関する。
【００１７】
合成的に産生される、生物学的に活性を有する哺乳類ヘパラナーゼポリペプチド、及び適切な酵素とインキュベーションすると生物学的活性が可能となる、エンドプロテアーゼコンセンサス切断部位を含むヘパラナーゼポリペプチドもまた本明細書で提供する。
【００１８】
本発明はさらに、結果として生物学的に活性を有するヘパラナーゼが高レベルで発現される、異種発現系において哺乳類ヘパラナーゼを発現させるための方法を提供する。
【００１９】
本明細書を通して、及び添付の請求項で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、他に文脈が明確に指示を与えない限り、複数形の意味を含む。
【００２０】
本明細書を通して、及び添付の請求項で使用される場合、次の定義及び略語を適用する。
【００２１】
「保存的アミノ酸置換」は、あるアミノ酸残基を別の化学的に同等のアミノ酸残基に置換することを意味する。そのような保存的置換の例は、ある疎水性残基（イソロイシン、ロイシン、バリン又はメチオニン）を別のものへ置換すること；ある極性残基を同様の電荷の別の極性残基へ置換すること（例えば、リジンに対するアルギニン；アスパラギン酸に対するグルタミン酸）である。
【００２２】
「哺乳類」という用語は、ヒトを含むあらゆる哺乳動物を意味する。
【００２３】
「治療」という用語は、治療的処置及び予防的（Ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ又はＰｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）手段の両方を意味する。治療を必要とする者には、既に疾患に罹患している者ならびにその疾患に罹患する傾向がある者又はその疾患が予防されるべきである者が含まれる。「疾患」とは、本明細書中に記載の核酸分子及びポリペプチドを用いて同定した分子による治療が役立つあらゆる状態である。このような疾患には、これらに限定されないが、癌、炎症及び自己免疫疾患が含まれる。
【００２４】
「ベクター」という用語は、ＤＮＡ断片を宿主生物又は宿主組織に導入することができるある手段を意味する。プラスミド、ウイルス（アデノウイルスを含む。）、バクテリオファージ及びコスミドをはじめとした様々な種類のベクターがある。
【００２５】
「生物学的に活性を有する」とは、タンパク質が、天然に生じる分子又はそのアイソフォームに付随する構造的、調整的又は生物化学的機能を有することを意味する。ヘパラナーゼとの関連において、「生物学的に活性を有する」タンパク質は、ヘパラナーゼ酵素活性を含む。
【００２６】
「実質的に同様」とは、ある配列が参照配列と、少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％及びさらにより好ましくは９９％の相同性を共有することを意味する。本発明において、この参照配列は、この文章の文脈で示される場合、全長ヒトヘパラナーゼヌクレオチドもしくはアミノ酸配列又は８ｋＤａ（配列番号１５）もしくは５０ｋＤａ（配列番号１６）ヘパラナーゼフラグメントのヌクレオチドもしくはアミノ酸配列であり得る。このように、８ｋＤａヒトヘパラナーゼ断片（配列番号１５）と「実質的に同様」であるヘパラナーゼタンパク質配列は、この８ｋＤａヒトヘパラナーゼ断片と、少なくとも８０％の相同性、好ましくは９０％の相同性、より好ましくは９５％の相同性、さらにより好ましくは９９％の相同性を共有することとなる。あるヘパラナーゼタンパク質又はヌクレオチド配列が参照配列に対して「実質的に同様」であるか否かは、例えば、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＵＷＧＣＧ）から入手できるＧＡＰコンピュータープログラム、バージョン６．０などの配列解析ソフトウェアを用いた比較配列情報により決定することができる。ＧＡＰプログラムは、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１）により改訂された、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０）のアラインメント法を利用する。
【００２７】
「遺伝子」は、そのヌクレオチド配列がポリペプチド分子をコードする核酸分子を意味する。遺伝子は、中断されないヌクレオチド配列であり得るか、又は、イントロン、プロモーター領域、スプライシング部位及び反復配列などの介在部分を含み得る。遺伝子は、ＲＮＡであってもＤＮＡであってもよい。好ましい遺伝子は、本発明のペプチドをコードするものである。
【００２８】
「核酸」又は「核酸分子」という用語は、リボ核酸（ＲＮＡ）又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、プローブ、オリゴヌクレオチド、断片又はそれらの一部及びプライマーを意味するものとする。ＤＮＡは、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）又はゲノムＤＮＡ、例えば、本発明のペプチドをコードする遺伝子のいずれでもあり得る。
【００２９】
「野生型ヘパラナーゼ」又は「野生型タンパク質」もしくは「ｗｔタンパク質」は、アミノ酸又はそれらの変異型の天然に生じる配列を含むタンパク質を意味する。野生型ヒトヘパラナーゼのアミノ酸配列は、本分野において入手可能である（Ｖｌｏｄａｖｋｓｙら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．５：７９３−８０２（１９９９）；Ｈｕｌｅｔｔら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．５：８０３−８０９（１９９９）；Ｔｏｙｏｓｈｉｍａ及びＮａｋａｊｉｍａ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（３４）：２４１５３−２４１６０（１９９９）；（参照により、全体を本明細書に組込む。））。
【００３０】
「野生型ヘパラナーゼ遺伝子」は、ヒト由来のタンパク質又は、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）などの昆虫、ツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）などの両生類及びラット、マウス及びアカゲザルなどの哺乳類を含むがこれらに限定されない、別の生物から得られたタンパク質をはじめとする、天然に生じるヘパラナーゼタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する遺伝子を意味する。本ヒトヘパラナーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は、本分野で入手可能である（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ１５５５１０；Ｔｏｙｏｓｈｉｍａ及びＮａｋａｊｉｍａ、前出（参照により、全体を本明細書に組込む。））。
【００３１】
「実質的に他のタンパク質不含である」又は「実質的に精製された」とは、少なくとも９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９９％及びさらにより好ましくは９９．９％、他のタンパク質が含まれていないことを意味する。したがって、実質的に他のタンパク質不含のヘパラナーゼタンパク質調製物は、その総タンパク質のパーセンテージとして、非ヘパラナーゼタンパク質が、１０％を超えない、好ましくは５％を超えない、より好ましくは１％を超えない、さらにより好ましくは０．１％を超えない。あるヘパラナーゼタンパク質調製物が実質的に他のタンパク質不含であるか否かは、例えば、適切な検出方法（例えば銀染色又は免疫ブロッティングなど）と組み合わせたドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）などの従来のタンパク質純度評価技術により決定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
ヘパラナーゼは、加水分解酵素メカニズムを介してグリコシド結合を切断することによりヘパラン硫酸（ＨＳ）を分解する哺乳類酵素である。ＨＳ分解は、細胞−細胞及び細胞−ＥＣＭ相互作用を変更することで細胞外の変化に対して細胞が素早く反応できるようにすることによって、多くの生理学的プロセスにおいて重要な役割を果たす。これらの相互作用は重要なので、ヘパラナーゼ活性の阻害は、腫瘍細胞転移、Ｔ細胞介在遅延型過敏及び自己免疫疾患などのいくつかの病態に影響を及ぼし得る。
【００３３】
いくつかの証拠から、ヘパラナーゼが腫瘍細胞転移に関与することが示唆される。第一に、ヘパラナーゼの発現レベルは、いくつかの腫瘍及び腫瘍細胞株の転移能と相関がある。第二に、侵襲性の強い転移性疾患の患者では、その尿中において測定可能なヘパラナーゼ活性を有する。この所見は、全ての癌患者で見られるものではない。さらに、非−抗凝血剤ヘパリン誘導体によるヘパラナーゼ活性の阻害により、Ｂ１６メラノーマ、ルイス肺癌及び乳癌細胞による転移発生率が低下した。最後に、ヒトヘパラナーゼ遺伝子を用いた非転移性のマウス細胞に対する形質移入の結果、２種類のマウスモデルにおいて、死亡率及び転移発生が増加した。
【００３４】
ヒトヘパラナーゼは、いかなる他の既知のタンパク質とも実質的な相同性を共有しない。その発見時において、ヘパラナーゼ遺伝子が遺伝子ファミリーのメンバーではなく、むしろ、ＨＳＰＧ分解に関与する単一遺伝子又は少なくとも主要なエンドグルクロニダーゼであることが示唆された。アミノ酸レベルで３５％の相同性を共有する第二のヘパラナーゼ（ｈｐａ２）が後に同定されたが、しかし、ｈｐａ２は、その組織分布に基づき、異なる機能を果たすと思われる。転移成長におけるヘパラナーゼの役割を示す上記の証拠と合わせて、類似の作用を遂行する密接に関連するタンパク質が欠如していることにより、へパラナーゼはこれらの領域における治療法の開発のための優れたターゲットとなる。
【００３５】
図１は、ヒトヘパラナーゼの生合成を示す。簡潔に述べると、ヘパラナーゼｃＤＮＡは、ＥＲへの移動時にシグナルペプチダーゼにより除去されるシグナルペプチド配列（残基Ｍｅｔ１−Ａｌａ３５）を有するプレプロタンパク質として最初に合成されるタンパク質をコードする。その結果生じる６５ｋＤａプロ形態は、さらに、１５７のＮ−末端アミノ酸を除去することによりプロセシングされ、成熟型の５０ｋＤヘパラナーゼ（配列番号１６）となる。この５０ｋＤタンパク質は、非プロセシング型の６５ｋＤａ前駆体よりも少なくとも１００倍高い特異的活性を有する（Ｖｌｏｄａｖｓｋｙら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５：７９３−８０２（１９９９））。この酵素の活性型が、未同定のタンパク質分解酵素により６ｋＤａの介在ペプチド（残基Ｇｌｕ１０９−Ｇｌｎ１５７）（以下、「介在断片」又は「６ｋＤａ断片」と呼ぶ。）を除去することで生じる、５０ｋＤａ断片と８ｋＤａ断片（配列番号１５）との間のヘテロ二量体であることが提案された（Ｆａｉｒｂａｎｋｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２９５８７−２９５９０（１９９９））。
【００３６】
最近の証拠により８ｋＤａサブユニット（配列番号１５）がヘパラナーゼ活性に必要であることが示されているにもかかわらず（ＭｃＫｅｎｚｉｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．３７３：４２３−４３５（２００３））、ヘパラナーゼの活性化プロセスにおけるこの８ｋＤａサブユニットの役割は、本明細書中で開示される研究以前は、不明確なままであった：これは、不可欠なサブユニットとして働く、又は、あるいは、シャペロンとして作用する可能性があり、この機能が遂行された後は不必要となり得る。また、８ｋＤａサブユニット以外の他の成分がヘパラナーゼ活性の誘導に必要であるか否かも明確ではなかった。
【００３７】
多配列アラインメント及び二次構造予想から、いくつかのグリコシダーゼで見られるように、そのタンパク質がＴＩＭバレルフォールドを取ることによるヒトヘパラナーゼのモデルが導かれる（Ｈｕｌｅｔｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９：１５６５９−１５６６７（２０００））。この共通フォールドモチーフは、通常、８個の交互のα−へリックス及びβ−鎖からなる。５０ｋＤａ断片内で、明確な相同性が観察されるのは、ＴＩＭバレルフォールドの３番目のα／βユニットからのみであるが、このことから、ヘパラナーゼが６個のみのα／βユニットからなる新規フォールドを取るか、又は、このタンパク質の他の部分が、欠落ユニットに寄与するか、のいずれかが示唆される。８ｋＤａ断片がこの欠落構造エレメントに寄与し得ることが主張された（Ｈｕｌｅｔｔら、前出）。
【００３８】
この仮説に従い、本明細書中で述べるように、一緒に共有結合する８ｋＤａ及び５０ｋＤａサブユニットを有する１本鎖ヘパラナーゼ分子を設計するために、多配列アラインメント（図３Ａ及び３Ｂ）に基づきヘパラナーゼの二次構造のモデルを確立した。本発明は、８ｋＤａ及び５０ｋＤａ断片のリンカーとの連結の結果、タンパク質分解的プロセシングを必要としない構成的に活性を有する１本鎖ヘパラナーゼ分子が得られることを示す。本発明の典型的な実施形態において、Ｈｉｒｕｄｉｎａｒｉａ ｍａｎｉｌｌｅｎｓｉｓ（ヒルディナリア マニレンシス）ヒアルロニダーゼ由来のループを移植することにより、又は、３つのグリシン−セリンリピートを含有するリンカーを用いて、この２個の断片を連結した。
【００３９】
また、６ｋＤａ介在断片のＮ及びＣ−末端周囲のエンドプロテアーゼ切断部位を改変することにより、少なくとも部分的に精製されたタンパク質の両部位におけるタンパク質分解性のプロセシングによって、他の成分なしで、ヘパラナーゼ活性化が導かれることが、本明細書において示された。本発明のこの態様の典型的実施形態において、タバコエッチウイルスプロテアーゼ切断部位をこの６ｋＤａ介在断片のＮ及びＣ−末端に付加し、その結果、コードされるタンパク質の精製又は部分精製及びそれに続く適切な酵素とのインキュベーション後に、活性を有するヘパラナーゼが得られる。本発明は、ヒトヘパラナーゼが標準的なＴＩＭバレルフォールドを取ることの証拠を提供し、有利に、特異的な阻害剤の同定のための活性酵素分子の容易な産生方法を提供する。
【００４０】
異種発現系、特に昆虫細胞において生物学的に活性を有するヘパラナーゼを発現させるための、本発明の改変タンパク質、核酸分子及び方法は、特徴的に、０．５ｍｇ／ｌから５．０ｍｇ／ｌの回収率となる。さらに、これらのタンパク質は、効率的に、増殖培地に分泌され、哺乳類細胞においては、細胞内部又は細胞膜に会合して、真正のヒト酵素が主に得られる（Ｖｌｏｄａｖｓｋｙら、Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．１２：１２１−１２９（２００２））。
【００４１】
従って、本発明は、活性を有する哺乳類ヘパラナーゼをコードする合成核酸分子に関し、その核酸分子は、高収率異種発現系で発現させることができる。本明細書で提供される合成ヘパラナーゼ分子は、哺乳類系において発現レベルが低く、異種発現系において正しくプロセシングされない野生型ヘパラナーゼを凌ぐ顕著な長所を与える。本発明の合成分子は、転移成長及び／又は炎症を阻害及び／又は治療する治療又は医薬品の開発のための阻害剤スクリーニングアッセイにおいて使用することができる。前記合成分子はまた、自己免疫疾患の治療及び／又は予防のための治療又は医薬品開発においても有用である。
【００４２】
本発明のある態様において、哺乳類ヘパラナーゼタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する合成核酸分子が提供され、該ヌクレオチド配列は、エンドプロテアーゼにより認識される２個のコンセンサス切断部位を含有し、それらの切断部位は、本ヘパラナーゼタンパク質の残基１００及び１６８をコードするヌクレオチドの間に位置する。本発明のこの態様は、野生型ヘパラナーゼの生合成と同様の、本ヘパラナーゼタンパク質のタンパク質分解性プロセシングを遂行し、結果として生物学的に活性を有する酵素を得るための方法において使用することができる合成核酸分子を提供する。
【００４３】
上記核酸分子によりコードされる実質的に純粋なポリペプチドもまた、本明細書で提供する。
【００４４】
本発明の好ましい実施形態において、本哺乳類ヘパラナーゼタンパク質は、ヒトヘパラナーゼである。
【００４５】
この２個のコンセンサス切断部位は、コードされるタンパク質の精製又は部分精製及び適切な酵素とのインキュベーション後に、その結果得られる断片が、野生型８ｋＤａ断片（配列番号１５）と実質的に同様の少なくとも１つの断片と、野生型５０ｋＤａ断片（配列番号１６）と実質的に同様の少なくとも１つの断片と、を含有するという条件において、本ヘパラナーゼタンパク質の残基１００と１６８との間のいずれかの位置に導入することができる。本発明の好ましい実施形態において、本コンセンサス切断部位は、本ヒトヘパラナーゼタンパク質の残基Ｇ１１０及びＫ１５８の前に位置し、その結果、コードされるタンパク質の精製又は部分精製及びそれに続く適切な酵素とのインキュベーション後に、８ｋＤａの第一の断片、６ｋＤａの第二の「介在」断片及び５０ｋＤａの第三の断片が得られる。
【００４６】
活性を有するヘテロ二量体ヘパラナーゼを得るために、これらに限定されないが、タバコエッチウイルス、ピコルナウイルスの３Ｃプロテアーゼ、トロンビン、血液凝固因子Ｘａ及びエンテロキナーゼからの切断部位を含む、何らかのエンドプロテアーゼに対応する切断部位を、ヘパラナーゼ分子に導入することができることは、当業者により理解される。本発明の好ましい実施形態において、前記切断部位は、タバコエッチウイルス由来である。
【００４７】
本発明の別の態様において、哺乳類ヘパラナーゼタンパク質をコードする部分を含有し、そのタンパク質コード部分が、基本的に、約８ｋＤａのＮ−末端断片をコードするヌクレオチド配列と、リンカーと、約５０ｋＤａのＣ−末端断片をコードするヌクレオチド配列とから構成される、構成的に活性を有する１本鎖哺乳類ヘパラナーゼ核酸分子が提供される。本発明のこの態様は、タンパク質分解性プロセシングなしで構成的に活性を有するヘパラナーゼをコードし、その６ｋＤａ「介在」断片が実質的に除去されるように改変され、その介在断片がより小さいリンカーで置換される、合成遺伝子を提供する。
【００４８】
本発明のこの態様の好ましい実施形態において、本哺乳類ヘパラナーゼタンパク質は、ヒトヘパラナーゼである。
【００４９】
上記の構成的に活性を有する１本鎖哺乳類ヘパラナーゼ遺伝子によりコードされる精製された合成ヘパラナーゼタンパク質もまた、本明細書で提供される。
【００５０】
本発明のこの態様において、約１残基から約６７残基からなるペプチドをコードする何らかの配列を、リンカーとして使用することができる。前記リンカーは、合成するか、又は天然に生じるソースから単離することができる。本発明の典型的な実施形態において、本リンカーは、ヒアルロニダーゼタンパク質の中央ループ領域をコードするヌクレオチド配列を含む。このヒアルロニダーゼは、Ｈ．マニレンシス（Ｈ．ｍａｎｉｌｌｅｎｓｉｓ）由来であることがが好ましい。他の実施形態において、本リンカーは、（ＧｌｙＳｅｒ）３リンカーをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００５１】
本発明はさらに、本明細書を通じて開示される合成核酸分子を含有する組み換えベクターに関する。これらのベクターは、ＤＮＡ又はＲＮＡからなるものであり得る。殆どのクローニング目的に対して、ＤＮＡベクターが好ましい。代表的なベクターには、組み換えヘパラナーゼタンパク質をコードすることができる、プラスミド、改変ウイルス、バキュロウイルス、バクテリオファージ、コスミド、酵母人工染色体及びエピソーム性のＤＮＡもしくは統合ＤＮＡの他の型が含まれる。特定の遺伝子導入又は他の使用のための適切なベクターを決定することは、十分に熟練者の範囲内にある。
【００５２】
本明細書を通じて開示される本合成核酸分子を含有する発現ベクターは、組み換え宿主細胞における哺乳類ヘパラナーゼの高レベル発現に使用し得る。発現ベクターには、これらに限定されないが、クローニングベクター、改変クローニングベクター、特に設計したプラスミド又はウイルスが含まれ得る。また、様々な細菌発現ベクターも、必要ならば、細菌細胞において組み換えヘパラナーゼを発現させるために使用し得る。さらに、真菌細胞において組み換えヘパラナーゼを発現させるために、様々な真菌細胞発現ベクターを使用し得る。さらに、昆虫細胞において組み換えタンパク質を発現させるために、様々な昆虫細胞発現ベクターを使用し得る。本発明の好ましい実施形態において、ベクターは、バキュロウイルスベクターである。
【００５３】
本発明はまた、本発明の合成核酸分子を含有するベクターを用いて形質転換又は形質移入を行った宿主細胞にも関する。組み換え宿主細胞は、原核又は真核であり得、これらに限定されないが、Ｅ．コリなどの細菌、これらに限定されないがＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（ピキア パストリス）、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（ハンセヌラ ポリモルファ）及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｖｉｓｉａｅ（サッカロミセス セルビシエ）を含む酵母などの真菌細胞及び、これらに限定されないがショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）及びカイコ由来の細胞株を含む昆虫細胞が含まれる。このような組み換え宿主細胞は、哺乳類ヘパラナーゼ又は生物学的に同等の型を高レベルで産生させるための適切な条件下で培養することができる。本明細書中で定義する場合、「宿主細胞」という用語は、トランスジェニックヒト、トランスジェニックヒト胎児又はトランスジェニックヒト胚の身体における宿主細胞を含むものではない。
【００５４】
上記のごとく、本発明の合成分子は、高収率異種発現系で発現させることができるので、先行技術を凌ぐ顕著な長所を提供する。本明細書で提供される合成分子によりコードされるヘパラナーゼタンパク質は、正しくプロセシングされ、酵素的に活性を有し、高レベルで発現される。従って、本発明の好ましい実施形態において、選択される宿主細胞は、これらに限定されないが、昆虫細胞、細菌細胞及び酵母細胞を含む高収率異種発現系の一部である。本発明の特に好ましい実施形態において、宿主細胞は、昆虫細胞である。
【００５５】
本発明はまた、本明細書を通じて開示される核酸分子を含有する、組み換えベクター及び組み換え宿主細胞（両者とも原核及び真核である。）に関する。本発明の合成核酸分子、関連ベクター及び宿主は、癌、炎症及び／又は自己免疫の治療のために役立つ、ヘパラナーゼ活性の阻害剤を同定するためのスクリーニングアッセイにおいて有用である。
【００５６】
本発明の別の態様において、（ａ）哺乳類ヘパラナーゼタンパク質をコードし、エンドプロテアーゼにより認識される２個のコンセンサス切断部位を含有し、該切断部位が該ヘパラナーゼタンパク質の残基１００及び残基１６８をコードするヌクレオチドの間に位置するヌクレオチド配列を含有するベクターを用いて、非哺乳類細胞に対して形質転換又は形質移入を行うことと；
（ｂ）前記ヘパラナーゼタンパク質の発現を可能にする条件下で宿主細胞を培養することと；
（ｃ）前記細胞を崩壊させて、前記ヘパラナーゼタンパク質を少なくとも部分的に精製することと；
（ｄ）少なくとも部分的に精製したタンパク質をエンドプロテアーゼに曝露し、該ヘパラナーゼタンパク質をコンセンサス切断部位で切断することと、を含む、非哺乳類細胞において哺乳類ヘパラナーゼを発現させる方法が提供される。
【００５７】
本発明はまた、上記の方法により産生された、実質的に精製されたタンパク質も提供する。
【００５８】
本発明のこの態様の好ましい実施形態において、本哺乳類ヘパラナーゼは、ヒトヘパラナーゼである。さらに好ましい実施形態において、本コンセンサス切断部位は、ヒトヘパラナーゼの残基Ｇ１１０及びＫ１５８の前に位置する。
【００５９】
別の好ましい実施形態において、本切断部位は、タバコエッチ（ｔｏｂａｃｃｏ ｅｔｃｈ）タンパク質切断部位である。
【００６０】
本明細書において、（ａ）ヘパラナーゼタンパク質をコードする部分を含有し、該タンパク質コード部分が、基本的に、約８ｋＤａのＮ−末端断片をコードするヌクレオチド配列と、リンカーをコードするヌクレオチド配列と、約５０ｋＤａのＣ−末端断片をコードするヌクレオチド配列とから構成される、合成哺乳類ヘパラナーゼ遺伝子を含有するベクターを用いて、非哺乳類細胞に対して形質転換又は形質移入を行うことと；
（ｂ）前記ヘパラナーゼタンパク質の発現を可能にする条件下で宿主細胞を培養することと、を含む、非哺乳類細胞において、１本鎖の、構成的に活性を有する哺乳類ヘパラナーゼを発現させる方法もまた提供される。
【００６１】
本明細書において、上記の方法により産生された、実質的に精製されたタンパク質もまた提供される。本発明のさらなる実施形態において、本タンパク質は、野生型ヘパラナーゼに特異的な抗体に結合することができる。
【００６２】
本発明のこの態様の好ましい実施形態において、本リンカーは、ヒアルロニダーゼタンパク質の中央ループ領域を含有する。別の好ましい実施形態において、本リンカーは、（ＧｌｙＳｅｒ）３ペプチドを含有する。
【００６３】
本明細書中で言及した公表物は全て、本発明に関連して使用され得る方法及び材料を説明し開示する目的のために、参照により本明細書に組込む。明細書のいかなる開示内容も、本発明が先行技術の効力によってこのような開示に対して先行する権利を与えられていないことを認めるものではない。
【００６４】
付随する図面を参照して本発明の好ましい実施形態を説明してきたが、本発明がこれらの明確な実施形態に限定されず、添付の請求項において定義される本発明の範囲又は精神から逸脱することなく、当業者によりそれらにおいて様々な変更及び改変が行われ得ることを理解されたい。
【００６５】
次の実施例は、説明するものであり、本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００６６】
ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーからのヘパラナーゼのクローニング
ＴａＫａＲａ Ｔａｑポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．，Ｏｔｓｕ，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）を用いて、ＰＣＲにより、ヒトヘパラナーゼ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ１５５５１０）を正常ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）から増幅した。緩衝液条件は、供給者により示されたものであった。ｃＤＮＡテンプレートのＰＣＲ増幅は、９４℃、１分間を１サイクル、その後、９４℃にて３０秒間、５７℃にて３０秒間及び６８℃にて１１０秒間を３５サイクルで行うように構成した。増幅した断片をゲル精製し、リン酸化し、充填後、ｐＦＡＳＴ ＢＡＣ１のＢａｍＨＩ部位（バキュロウイルス発現）、又は、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ消化したｐｃＤＮＡ３ベクター（哺乳類細胞発現）のいずれかにクローニングした。ＰＣＲ増幅及びＫｏｚａｋ配列の同時最適化のために次のプライマーを使用した：ｈＨＥＰ１−２４ ＢａｍＨＩ ｏｐｔｉ
【００６７】
【化１】
；及びｈＨＥＰ ｒｅｖ １６３２
【００６８】
【化２】
【実施例２】
【００６９】
１本鎖ヘパラナーゼ分子の構築
次のコンストラクト（ｈｅｐＷＴ、ｈｅｐ１０９（配列番号１９、タンパク質配列番号２０に対応）、ｈｅｐ１０６（配列番号１８、タンパク質配列番号１７に対応）、ｈｅｐＧＳ３（配列番号２２、タンパク質配列番号２１に対応）、ｈｅｐＧＳ６（配列番号２４、タンパク質配列番号２６に対応）、ｈｅｐＧＳ４（配列番号２３、タンパク質配列番号２５に対応）及びｈｅｐＨｙａｌｕｒｏ（配列番号２８、タンパク質配列番号２７に対応）、直接的に８及び５０ｋＤａサブユニットを共有結合で連結しているもの（ｈｅｐ１０９及びｈｅｐ１０６）、これらのサブユニットをグリシン−セリンスペーサーを介して連結しているもの（ｈｅｐＧＳ３、ｈｅｐＧＳ４及びｈｅｐＧＳ６）又は酵素ヒアルロニダーゼからのループ領域を移植することにより連結しているもの（Ｈｙａｌｕｒｏ））を、指示したプライマーを用いて標準的なＰＣＲ突然変異誘発により生成させた：
ｈＨＥＰ１−２４ ＢａｍＨＩ ｏｐｔｉ（配列番号１）及びｈＨＥＰ ｒｅｖ １６３２（配列番号２）
ｈｅｐ１０９ Ｍ１＿Ｅ１０９−Ｑ１５７＿Ｉ５４３
突然変異誘発プライマー：ｈＨＥＰ ３０４／５０４
【００７０】
【化３】
ｈｅｐ１０６ Ｍ１＿Ｐ１０６−Ｋ１５８＿Ｉ５４３
突然変異誘発プライマー：ｈＨＥＰ ２９１／５０４ ｂｉｓ
【００７１】
【化４】
ｈｅｐＧＳ３ Ｍ１＿Ｅ１０９−（ＧＳ）３−Ｑ１５７＿Ｉ５４３
突然変異誘発プライマー：ｈＨＥＰ ３０４（ＧＳ３）５０４
【００７２】
【化５】
ｈｅｐＧＳ６ Ｍ１＿Ｅ１０９−（ＧＳ）６−Ｑ１５７＿Ｉ５４３
突然変異誘発プライマー：ｈＨＥＰ ３０４（ＧＳ６ Ａｌａ）
【００７３】
【化６】
ｈｅｐＧＳ４ Ｍ１＿Ｗ１１８−（ＧＳ）４−Ｅ１４３＿Ｉ５４３
突然変異誘発プライマー：ｈＨＥＰ３２９（ＧＳ４ Ａｌａ）
【００７４】
【化７】
ｈｅｐＨｙａｌｕｒｏ Ｍ１＿Ｗ１１８−（ＡＦＫＤＫＰＴ）（配列番号８）−Ｅ１４３＿Ｉ５４３
【００７５】
突然変異誘発プライマー：ｈＨＥＰ Ｈｙａｌｕｒｏ ５’−
【００７６】
【化８】
【実施例３】
【００７７】
改変プロテアーゼ切断部位を有するヘパラナーゼ分子の構築
アミノ酸Ｅ１０９とＧ１１０との間の、ＧＳリピート（Ｅ１０９−ＧＳＧＳＥＮＬＹＦＱ−ＧＳＧ−Ｇ１１０（配列番号１０）、ＱとＧとの間に切断されやすい結合がある。）に隣接する、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼに対するコンセンサス切断部位を挿入する改変ヘパラナーゼ分子を構築するために、テンプレートとしてｗｔヘパラナーゼを用い、プライマー、ｈＨＥＰ１−２４ ＢａｍＨＩ ｏｐｔｉ（配列番号１）及びｈＨＥＰ ｒｅｖ １６３２（配列番号２）及び突然変異誘発プライマー、ＴＥＶ １１０ｂｉｓ
【００７８】
【化９】
を用いてＰＣＲ突然変異誘発を行った。
【００７９】
残基Ｅ１０９／Ｇ１１０の間及びＱ１５７／Ｋ１５８の間の両方にＴＥＶ−切断部位を有する改変ヘパラナーゼを構築するために、ＴＥＶ１１０コンストラクト（配列番号３０、タンパク質配列番号３１に対応）をテンプレートとして使用し、ＰＣＲ突然変異誘発により、突然変異誘発プライマー、ＴＥＶ１５８ ｔｅｒ
【００８０】
【化１０】
を用いて、配列
【００８１】
【化１１】
を挿入し、ｈｅｐＴＥＶ１１０／１５８（配列番号２９及び３２）を作製した。
【００８２】
コンストラクトは全て、ＰＣＲにより突然変異が導入されていないことを確認するために両鎖において配列決定を行い、上述のようにｐＦＡＳＴＢＡＣ１にクローニングした。
【実施例４】
【００８３】
ＣＯＳ７細胞におけるヘパラナーゼ分子の一時的発現。
【００８４】
ダルベッコＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）中で細胞を増殖させた。全てのコンストラクトを、真核細胞発現プラスミドｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。各コンストラクトの形質移入効率を調べるために、レポーター遺伝子 β−ラクタマーゼ（ＢＬＡ）をコードするベクターを共形質移入した。同程度の形質移入効率にするために形質移入した各ベクターの量を調整した。ｆｕＧＥＮＥ６形質移入試薬（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、製造者の説明書に従い、ＣＯＳ７細胞の一時的形質移入を行った。形質移入から２４時間後、ＢＬＡ−陽性細胞の蛍光検出により効率を評価した。形質移入から９６時間後、細胞を回収し、完全プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含有する細胞溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ）中で再懸濁した。氷上で３０分間、細胞溶解を行った。１４０００ｒｐｍで３０分間遠心した後、ヘパラナーゼを含有する上清を回収し、下記で概説するように部分精製を行った。
【００８５】
一時的形質移入により、ヘパラナーゼコンストラクトを、内因性へパラナーゼ活性を欠くＣＯＳ７細胞で発現させた。ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーにより細胞溶解液からヘパラナーゼを抽出し、ウェスタンブロットで定量した。並行して、放射性又は蛍光分析のいずれかでヘパラナーゼ酵素活性を測定した（図５）。ウェスタンブロット分析から、ｗｔヘパラナーゼならびに１本鎖コンストラクトＧＳ３及びｈｙａｌｕｒｏが効率的に発現され、プロセシングされるが、一方で、コンストラクト１０６及びＧＳ４は、発現されるがプロセシングされないと結論付けた。コンストラクト１０９及びＧＳ６の発現レベルはきわめて低く、ウェスタンブロット分析により辛うじて検出できる程度であった。ｗｔ、ＧＳ３及びｈｙａｌｕｒｏコンストラクトのみが酵素活性を示した。発明者らは、１本鎖コンストラクト１０６及びＧＳ４は不活性であり、一方、１０９及びＧＳ６は、おそらく不安定であると結論付けた。ＧＳ３及びｈｙａｌｕｒｏは活性を有するが、切断部位に変更を導入したにもかかわらずプロセシングされるので、前駆体の固有の活性については結論を導くことはできなかった。従って、発明者らは、ヘパラナーゼプロセシングに関与する酵素を欠く細胞において発現を進めた。
【実施例５】
【００８６】
昆虫細胞におけるヘパラナーゼ分子の発現。
【００８７】
Ｂａｃ ｔｏ Ｂａｃ発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ヘパラナーゼコンストラクトを含有する組み換えバキュロウイルスを作製した。１０％ＦＢＳを含有するＧｒａｃｅ昆虫培地で増殖させたＳｆ９昆虫細胞（５０ｘ１０６細胞／Ｔ−１７５フラスコ）を感染させるために、組み換えバキュロウイルスを使用した。感染から４８時間後に細胞を回収し、５００ｇで５分間遠心した。ＣＯＳ７に対して使用した１５０ｍＭ ＮａＣｌのかわりに、可溶性分画におけるタンパク質の量を増加させる、５００ｍＭ ＮａＣｌを含有する細胞溶解緩衝液を使用すること以外、上述のようにして、細胞溶解液を調製した。
【００８８】
ＣＯＳ７細胞で産生した場合に酵素活性を示した３種類のヘパラナーゼコンストラクトをバキュロウイルス発現系に導入した。Ｓｆ９細胞においてタンパク質を発現させ、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。ウェスタンブロット分析により、ＣＯＳ７細胞で観察されたものと対照的に、ｗｔ又は突然変異ヘパラナーゼのプロセシングがこの発現系では起こらなかったことが示された。蛍光活性分析による精製１本鎖タンパク質の酵素活性の分析から、非プロセシングｗｔ酵素活性は非常に低く、一方、非プロセシングＧＳ３及びＨｙａｌｕｒｏタンパク質は、ＣＯＳ７細胞で産生された正しくプロセシングされた野生型酵素で観察されたものに匹敵する特異的活性を有し、活性が高いことが分かった。
【００８９】
ＧＳ３及びｈｙａｌｕｒｏは、酵素活性のｐＨ及びイオン強度依存性の点に関してＣＯＳ７細胞から抽出された野生型組み換え酵素と、又はＨＣＴ−１１６細胞から部分精製された真正のｗｔ酵素と非常に似ており、ヘパリンにより同様の効力で阻害された。
【００９０】
位置１０９／１１０及び１０９／１１０＋１５７／１５８においてＴＥＶ切断部位を有するコンストラクトを発現させ、ヘパリンアフィニティーカラムで精製し、室温にて一晩、５０ｍＭ Ｍｅｓ ｐＨ６．０、１０％ グリセロール、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ中のＴＥＶプロテアーゼ（０．５μＭ）を用いて消化した。両ケースにおいて完全なプロセシングが観察されたが、しかし、両方の切断ジャンクションにおいてＴＥＶ配列を有する二重変異体のみが、この処理により活性化され、このことから、Ｅ１０９／Ｇ１１０ジャンクションにおけるプロセシングのみでは、ヘパラナーゼ活性化を誘導するには十分でないことが示された。
【実施例６】
【００９１】
ヘパリンセファロースアフィニティークロマトグラフィーによる組み換えヘパラナーゼコンストラクトの精製。
【００９２】
ＣＯＳ７又はＳｆ９昆虫細胞からの細胞溶解液を重力により５００μｌ ヘパリンセファロース ＣＬ−６Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に通した。細胞溶解緩衝液２ｍＬでそのカラムを洗浄し、次に、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５００ｍＭ ＮａＣｌ ２ｍＬで洗浄し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１Ｍ ＮａＣｌ ２ｍＬでヘパラナーゼを溶出し、Ｂｉｏｍａｘ−３０Ｋ遠心分離濃縮装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）で約５倍に濃縮した。１０％グリセロールを添加し、−８０℃にて、そのタンパク質を分注して保存した。ＢＩＯ−ＲＡＤタンパク質アッセイによりタンパク質濃度を測定した。
【実施例７】
【００９３】
大規模発現及び精製
Ｓｆ２１（又はＳｆ９）細胞を血清不含培地（Ｓｆ−９００ ＩＩ ＳＦＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中での増殖に順応させた。１から１０の間の様々な感染の多重度でヘパラナーゼコンストラクトをコードする組み換えバキュロウイルスにより細胞を感染させた。滅菌空気の一定気流状態下、２７℃にて、感染細胞３Ｌをスピナーフラスコ中で増殖させた。感染４８時間から９６時間後、細胞を回収し、遠心により培地から分離した。合成及びｗｔヘパラナーゼが細胞ペレットと上清の両方で見られた。細胞ペレットから合成ヘパラナーゼを抽出するために、上記で概説したようにして細胞を溶解した。細胞溶解液又は未精製培地上清を０．２２μフィルターで濾過し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌで平衡化した２０ｍｌ−ＨｙｐｅｒＤ Ｈｅｐａｒｉｎ カラム（Ｂｉｏｓｅｐｒａ Ｉｎｃ．，Ｍａｒｌｂｏｒｏ，ＭＡ）に載せた。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５中の０．１５Ｍから１Ｍ ＮａＣｌの直線的グラディエントを用いて、合成又はｗｔヘパラナーゼを溶出した。組み換えタンパク質は、＞５００ｍＭのＮａＣｌ濃度で溶出した。集めたヘパラナーゼ含有Ｈｅｐａｒｉｎ−カラム分画を一晩、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５に対して透析し、同じ緩衝液で平衡化したＳｏｕｒｃｅ Ｓカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に載せた。ヘパラナーゼコンストラクトは、４００ｍＭから６００ｍＭ ＮａＣｌで溶出した。１５／３０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５サイズ排除カラムでのさらなるクロマトグラフィー段階により、タンパク質を均質になるように精製した。精製したタンパク質を分注し、液体窒素中で瞬時に冷凍し、−８０℃で保存した。
【実施例８】
【００９４】
ウェスタンブロッティング
５０ｋＤａサブユニット内に含有されるペプチド（アミノ酸２２５から２４１に対応し、そのＣ−末端にさらなる配列ＧＧＣを含有する、ＥＰＮＳＦＬＫＫＡＤＩＦＩＮＧＳＱ（配列番号１４））に対して、ウサギポリクローナル抗体を作製した。チオプロピルセファロースレジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に固定化した免疫原ペプチドを用いて抗血清を免疫精製した。ヘパリンカラムから溶出したタンパク質１０μｌを１０％ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、Ｐｒｏｔｒａｎ ＢＡ ８３ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅｎｉｔｒａｔｅ膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）に転写した。５％ミルクにより非特異的結合を飽和させた後、４℃にて一晩、５％ミルク、ＴＢＳ及び０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０中で１：５００希釈した上記のポリクローナル抗体とともにその膜をインキュベーションした。洗浄後、１：５０００に希釈した抗ウサギホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗体とともに、室温にて３０分間、その膜をインキュベーションした。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）により、免疫反応のあるバンドを検出した。最後に、ＢＩＯＭＡＸ ＭＲフィルム（Ｋｏｄａｋ）に１０秒間、その膜を曝露した。
【実施例９】
【００９５】
ヘパラン硫酸の蛍光標識
既に述べられているようにしてフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）でウシ腎臓由来のヘパラン硫酸ナトリウム塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を標識した（Ｔｏｙｏｓｈｉｍａ及びＮａｋａｊｉｍａ，Ｊ．，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２４１５３−２４１６０（１９９９））。ヘパラン硫酸 ５ｍｇとＦＩＴＣ５ｍｇとを、０．１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３ ｐＨ９．５ １ｍＬに溶解し、４℃にて一晩、暗所でインキュベーションした。次に、未処理ヘパラン硫酸からＦＩＴＣ標識ヘパラン硫酸（ＦＩＴＣ−ＨＳ）を分離するために、ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｇ−２５カラムにこの溶液を載せた。高分子量のヘパラン硫酸種を分離するために、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ＝７．５緩衝液中のＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００を介した第一のゲル濾過クロマトグラフィー段階にこのＦＩＴＣ−ＨＳを供した。着色した分画を集め、Ｂｉｏｍａｘ−１０Ｋ遠心濃縮装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濃縮し、一様な分子量のヘパラン硫酸種を得るために、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００（上記）で再びクロマトグラフィーを行った。ＨＰＬＣ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ＴＭ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）クロマトグラフィーシステムにより、溶出した分画を分析した。Ｌ−７４８５蛍光検出装置（Ｍｅｒｃｋ Ｈｉｔａｃｈｉ）により、各分画の蛍光を測定した。発明者らは、分子量が異なるヘパラン硫酸産物を含む４個の主要な分画を得た。Ｂｌｙｓｃａｎ Ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ Ｌｔｄ．，Ｂｅｌｆａｓｔ，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｉｒｅｌａｎｄ）により各分画におけるＦＩＴＣ−ＨＳの量を測定した。
【実施例１０】
【００９６】
蛍光分析。
【００９７】
このアッセイは、ＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィーによりモニターするＦＩＴＣ−ＨＳの分解に基づく。５０ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ６、１０％ グリセロール（ヘパラナーセ活性緩衝液、ＨＡＢ） ５０μｌ中で、ＦＩＴＣ−ＨＳ ５μｌとともに精製ヘパラナーゼ ８μをインキュベーションした。この反応混合物を室温にて一定の時間インキュベーションし、ヘパリン ５０μｇを添加することにより反応を停止させた。次に、この混合物をＵｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ遠心濾過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて濾過した。５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．５ １５０ｍＭ Ｎａ２ＳＯ４緩衝液中で平衡化し、Ｍｅｒｃｋ−Ｈｉｔａｃｈｉ ＨＰＬＣシステムに連結したＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ＴＭ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）カラムに２０μｌを注入した。Ｌ−７４８５蛍光検出装置により蛍光ヘパラン硫酸分解産物を検出した。そのままのＦＩＴＣ−ＨＳに対する、低分子量のヘパラン硫酸種における増加をモニタリングすることにより、ヘパラナーゼ活性を評価し、ピーク領域の積分により定量した。
【実施例１１】
【００９８】
ヘパラン硫酸の還元末端における放射性標識及びビオチン化
ウシ腎臓由来のヘパラン硫酸ナトリウム塩 １０ｍｇ（Ｓｉｇｍａ）を部分的に、Ｎ−デ−アセチル化し、既に述べられているようにして［３Ｈ］無水酢酸で再びアセチル化した（Ｆｒｅｅｍａｎ及びＰａｒｉｓｈ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３２５：２２９−２３７（１９９７））。次に、トリチウム化したヘパラン硫酸を、述べたように還元末端で還元的アミノ化した。トリチウム化し、還元的にアミノ化したヘパラン硫酸を、ＥＺ−Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、さらにビオチンに結合させた。このビオチン類似体は、ヘパラン硫酸分子の還元末端で生成されるアミノ基と反応し得るＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル部分を有する。発明者らは、還元的にアミノ化し、Ｈ２Ｏ １ｍＬに再懸濁したトリチウム化ヘパラン硫酸 約５ｍｇ（ヘパラン硫酸分子量の平均値を５００ｋＤａとして、１００Ｍ 推定最終濃度）において、回収率を計算した。この溶液 １００μｌに対して、ＥＺ−ＬｉｎｋＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ １ｍｇ（約１００倍モル過剰）及びリン酸緩衝液 ｐＨ７．５ ２０μｌを添加した。この反応混合液を室温にて一晩インキュベーションした。次に、ビオチン化したトリチウム化ヘパラン硫酸を未反応ビオチンから分離するために、この反応混合物をＰＤ−１０脱塩カラムにかけた。発明者らは、最終的に、４個の分画（各１ｍＬ）を得て、Ｒｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｃａｐａｃｉｔｙ Ｃｏａｔｅｄ Ｐｌａｔｅｓ（Ｐｉｅｒｃｅ）に固定化するために、それらの活性について試験した。
【実施例１２】
【００９９】
放射性アッセイ
このアッセイは、マイクロプレートに固定化したトリチウム化ヘパラン硫酸の分解に基づく。Ｒｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｃａｐａｃｉｔｙ Ｃｏａｔｅｄ Ｐｌａｔｅｓの各ウェルを、製造者の説明書に従い前処理した。最初に、ＰＤ−１０脱塩カラム後に得られた、トリチウム化したビオチン化ヘパラン硫酸の各分画の様々な量を、ＰＢＳ中で、最終体積１００μｌとなるように、各ウェルに添加（デュプリケート）した。１００ｘ１０３ｄ．ｐ．ｍ．に対応する分画２の体積で最大結合が得られることを見極めた後、いつもこの量を使用した。室温にて一晩この結合を行った。次にウェルをＰＢＳで３回洗浄し、ＨＡＢで２回洗浄した。精製ヘパラナーゼ １０μｌを各ウェルにＨＡＢ中で添加し、最終体積を１００μｌとした。このウェルを室温にて２時間から２４時間インキュベーションした。最終的に、各ウェルにおいてヘパラナーゼにより生じるトリチウム化ヘパラン硫酸産物による遊離放射性活性を測定し、緩衝液ブランクに対して正規化した。
【実施例１３】
【０１００】
ヘパラナーゼコンストラクトの特異的活性の測定。
【０１０１】
ＣＯＳ７細胞において一時的に発現させた、又はバキュロウイルス系において発現させたいずれかのヘパラナーゼコンストラクトの特異的活性を次のように測定した：
特異的活性＝正規化活性（ｄ．ｐ．ｍ．／μｌ）／正規化した濃度測定量（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｉｃ ｖｏｌｕｍｅ）（測定量／μｌ）
詳しく説明すると、放射性アッセイにおいて、直線的な用量−活性関係が見られるような方法において各調製物を滴定することにより部分精製ヘパラナーゼコンストラクトの活性を測定した。各調製物を用いてこれらの滴定を３回繰り返し、平均、正規化活性（ｄ．ｐ．ｍ．／μｌ）を計算した。ウェスタンブロッティング実験によりタンパク質発現を調べ：デンシトメトリーにより化学発光の読み出しを定量した。再び、実験を３回繰り返し、平均値を決定した。正規化した濃度測定量（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｉｃ ｖｏｌｕｍｅ）（測定量／μｌ）で正規化した活性（ｄ．ｐ．ｍ．／μｌ）を割ることにより、特異的活性を得た。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】図１は、哺乳類細胞におけるヒトヘパラナーゼの生合成を示す。
【図２Ａ】図２パネルＡは、改変ＴＥＶ切断部位を有するヘパラナーゼコンストラクトの概略図を示す。
【図２Ｂ】パネルＢ（左）は、ＣＯＳ７細胞（レーン１）、ｈｅｐＴＥＶ１１０（レーン２）、０．５μＭ ＴＥＶプロテアーゼとの１６時間インキュベーション後のｈｅｐＴＥＶ１１０（レーン３）又は０．５μＭ ＴＥＶプロテアーゼ無しでの１６時間インキュベーション後のｈｅｐＴＥＶ１１０（レーン４）、ｈｅｐＴＥＶ１１０／１５８（レーン５）、０．５μＭ ＴＥＶプロテアーゼとの１６時間インキュベーション後のｈｅｐＴＥＶ１１０／１５８（レーン６）、０．５μＭ ＴＥＶプロテアーゼ無しでの１６時間インキュベーション後のｈｅｐＴＥＶ１１０／１５８（レーン７）において発現された、正しくプロセシングされたｗｔヘパラナーゼのウェスタンブロット分析の結果を示す。パネルＢ（右）は、ｈｅｐＴＥＶ１１０（カラム１）、０．５μＭ ＴＥＶプロテアーゼとの１６時間インキュベーション後のｈｅｐＴＥＶ１１０（カラム２）又は０．５μＭ ＴＥＶプロテアーゼ無しでの１６時間インキュベーション後のｈｅｐＴＥＶ１１０（カラム３）、ｈｅｐＴＥＶ１１０／１５８（カラム４）、０．５μＭ ＴＥＶプロテアーゼとの１６時間インキュベーション後のｈｅｐＴＥＶ１１０／１５８（カラム５）、０．５μＭ ＴＥＶプロテアーゼ無しでの１６時間インキュベーション後のｈｅｐＴＥＶ１１０／１５８（カラム６）のヘパラナーゼ活性を示す。蛍光法を使用して、これらの試料のヘパラナーゼ活性を評価した。
【図３Ａ−１】パネルＡ：関連配列に対する、ヘパラナーゼの多配列アラインメント。予想される二次構造エレメントをアラインメントの上に示す（矢印＝β鎖、円柱＝へリックス）。この２つの切断部位の位置は、黒い三角印により示す。ヒアルロニダーゼ断片により置換される、除去されるヘパラナーゼ部分の領域を、灰色のボックスで囲む。
【図３Ａ−２】パネルＡ：関連配列に対する、ヘパラナーゼの多配列アラインメント。予想される二次構造エレメントをアラインメントの上に示す（矢印＝β鎖、円柱＝へリックス）。この２つの切断部位の位置は、黒い三角印により示す。ヒアルロニダーゼ断片により置換される、除去されるヘパラナーゼ部分の領域を、灰色のボックスで囲む。
【図３Ｂ】パネルＢ：ＴＩＭバレル構造の概略図。除去されるヘパラナーゼ部分の位置は、三角印で表す切断位置により示す。存在する場合は、その部分は、β／αユニット１及び２により基質（灰色の矢印）の結合を妨げる可能性が高い。より短いループ（点線）を設計することにより、この抑制を解除し、これにより、活性を有する酵素が得られ、同時に、その酵素の構造的完全性が維持される。
【図４Ａ】パネルＡ：本明細書で述べた１本鎖ヘパラナーゼコンストラクトの概略図。
【図４Ｂ】パネルＢ、左：ＣＯＳ７細胞において発現させたｗｔヘパラナーゼ又は１本鎖コンストラクトのウェスタンブロッティング分析。Ｂｌａは、レポーター遺伝子β−ラクタマーゼ（材料と方法セクションを参照のこと。）をコードするベクターのみを形質移入したＣＯＳ７細胞の部分精製細胞溶解液に相当する対照である。右：放射性アッセイを用いた同じ試料のヘパラナーゼ活性。全ての１本鎖コンストラクトの特異的活性は、ｗｔヘパラナーゼの特異的活性に対して正規化した。
【図５】左、ＣＯＳ７細胞で産生された、正しくプロセシングされたｗｔヘパラナーゼ又はＳｆ９細胞で発現されたｗｔヘパラナーゼ及び１本鎖コンストラクトのウェスタンブロット分析。右：放射性アッセイを用いた同じ試料のヘパラナーゼ活性。Ｓｆ９細胞で発現されたｗｔヘパラナーゼ及び１本鎖コンストラクトの特異的活性は、ＣＯＳ７細胞で産生された、正しくプロセシングされたｗｔヘパラナーゼの特異的活性に対して正規化した。
【図６】ＣＯＳ７細胞で産生された、正しくプロセシングされたｗｔヘパラナーゼ（黒丸）及び非プロセシングＦＩＴＣ−ＨＳ（白丸）と比較した、昆虫細胞で産生されたｈｅｐＧ３（白四角）及びｈｅｐＨｙａｌ（黒三角）１本鎖タンパク質とともに６時間インキュベーションを行った後に得られたＦＩＴＣ−ＨＳ分解産物のサイズ排除クロマトグラフィー。
【図７Ａ】ＣＯＳ７細胞で産生された野生型ヘパラナーゼ（黒丸）、昆虫細胞で産生されたｈｅｐＧ３（白四角）及びｈｅｐＨｙａｌ（黒三角）１本鎖コンストラクトの、蛍光活性分析を用いた、イオン強度依存性（パネルＡ）。ヘパリンにおいて、滴定実験で、次のＩＣ５０値が得られた：ｈｅｐｗｔ、０．９ｎｇ／μｌ；ｈｅｐＧＳ３、１．１ｎｇ／μｌ；ｈｅｐＨｙａｌ、１．５ｎｇ／μｌ。
【図７Ｂ】ＣＯＳ７細胞で産生された野生型ヘパラナーゼ（黒丸）、昆虫細胞で産生されたｈｅｐＧ３（白四角）及びｈｅｐＨｙａｌ（黒三角）１本鎖コンストラクトの、蛍光活性分析を用いた、ヘパリンによる阻害（パネルＢ）。ヘパリンにおいて、滴定実験で、次のＩＣ５０値が得られた：ｈｅｐｗｔ、０．９ｎｇ／μｌ；ｈｅｐＧＳ３、１．１ｎｇ／μｌ；ｈｅｐＨｙａｌ、１．５ｎｇ／μｌ。
【図７Ｃ】ＣＯＳ７細胞で産生された野生型ヘパラナーゼ（黒丸）、昆虫細胞で産生されたｈｅｐＧ３（白四角）及びｈｅｐＨｙａｌ（黒三角）１本鎖コンストラクトの、蛍光活性分析を用いた、ｐＨ依存性（パネルＣ）。ヘパリンにおいて、滴定実験で、次のＩＣ５０値が得られた：ｈｅｐｗｔ、０．９ｎｇ／μｌ；ｈｅｐＧＳ３、１．１ｎｇ／μｌ；ｈｅｐＨｙａｌ、１．５ｎｇ／μｌ。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高収率異種発現系で発現可能である、合成的に産生され、酵素的活性を有するヘパラナーゼ分子に関する。また、本明細書において、異種発現系で哺乳類ヘパラナーゼを発現させる方法も提供する。
【背景技術】
【０００２】
ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧｓ）は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）及び細胞表面上で見られる遍在性の高分子であり、細胞−細胞及び細胞−ＥＣＭ相互作用の維持に寄与する。ＨＳＰＧｓは、タンパク質コアに共有結合するいくつかのヘパラン硫酸（ＨＳ）鎖から構成される。ヘパラン硫酸は、フィブロネクチン、ラミニン及びコラーゲンなどの構造的ＥＣＭタンパク質の、細胞表面及び他のＥＣＭタンパク質との結合を促進するが、このことから、自己集合及びＥＣＭ成分の不溶性、細胞接着及び移動運動においてこのグリコサミノグリカンが果たす役割が示唆される。正しい細胞−細胞及び細胞−ＥＣＭ相互作用の維持は重要であるため、細胞外環境においてＨＳＰＧｓは、重大な構造的及び調整的役割を果たし、胚形成、形態形成及び発生から、炎症、血管新生及び癌転移にわたる範囲の重要な正常及び病的プロセスの調節を行う。
【０００３】
上述の構造的及び細胞マトリックスのアンカー的役割に加えて、ＨＳの構造多様性（Ｅｓｋｏら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０８：１６９−１７３（２００１）；Ｔｕｒｎｂｕｌｌら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１：７５−８２（２００１））により、ＨＳＰＧｓは、増殖因子、酵素及びケモカインなどの様々な細胞外シグナル伝達タンパク質と相互作用することが可能となる。繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ１及びＦＧＦ２）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子、形質転換成長因子β及び血小板由来増殖因子などの増殖因子は、腫瘍成長、侵襲及び血管新生において重要な役割を果たす。これらのシグナル伝達分子の拠点としての作用、これらの活性化又は安定化に加えて、ＨＳＰＧｓは、ＦＧＦ受容体の多様なアイソフォームへのＦＧＦ２の結合など、リガンド−受容体相互作用に関与し得る（Ｃｈａｎｇら、ＦＡＳＥＢ Ｊ．１４：１３７−１４４（２０００））。
【０００４】
ヘパラン硫酸は、血小板、胎盤栄養膜細胞及び白血球により放出されるエンドβ−Ｄ−グルクロニダーゼヘパラナーゼにより分解される。ヘパラナーゼは、加水分解酵素メカニズムを介してグリコシド結合を切断することにより、特異的にヘパラン硫酸を分解する。この分解の結果、ｂＦＧＦ、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）及び組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）が放出されるが、これらにより、血管新生が開始され得るか、又はＥＣＭ分解が可能となり得る。さらに、ヘパラナーゼによるＨＳ切断により、基底膜（ＢＭ）を介して細胞が移動し、ＥＣＭ障壁を横断できるようになる。ＨＳ分解は、細胞外の変化に細胞が素早く反応することができるようにすることにより、多数の生理学的プロセスにおいて重要な役割を果たす。従って、ヘパラナーゼ活性の阻害は、炎症、転移及び自己免疫疾患など、細胞移動の変化に関係する病変に影響を及ぼし得る。
【０００５】
このような極めて重要な役割のために、ヘパラナーゼは、抗腫瘍、抗転移又は抗炎症剤の開発のための、有力な新規ターゲットとなる。ヘパラナーゼは、単一遺伝子産物であり、関連タンパク質の複合ファミリーの一部ではないと思われるので、薬物開発の目的に対して、ＥＣＭ−調節酵素でもあるマトリックスメタロプロテアーゼを凌ぐ顕著な利点を有する。信頼できる高スループットのアッセイが不足していることと、その複雑な生合成との両方により、現在、薬物ターゲットとしてヘパラナーゼを活用することには障害が多く、活性タンパク質を大量に産生させることが困難となっている。
【０００６】
ヒトヘパラナーゼｃＤＮＡは、小胞体（ＥＲ）への移動の際にシグナルペプチダーゼにより除去されるシグナルペプチド配列を有する、プレプロタンパク質として最初に合成されるタンパク質をコードする。得られる６５ｋＤａのプロ型は、さらに、１５７個のＮ−末端アミノ酸を除去することによりプロセシングされ、成熟型の５０ｋＤヘパラナーゼとなる。この５０ｋＤタンパク質は、非プロセシング型の６５ｋＤａ前駆体よりも少なくとも１００倍高い特異的活性を有する（Ｖｌｏｄａｖｓｋｙら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５：７９３−８０２（１９９９））。興味深いことに、この５０ｋＤａタンパク質は、哺乳類細胞などで発現される場合、不活性である（Ｈｕｌｅｔｔら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５：８０３−８０９（１９９９））。この酵素の活性型が、未同定のタンパク質分解酵素による６ｋＤａの介在ペプチドの除去により生じる、５０ｋＤａ断片と８ｋＤａ断片との間のヘテロ二量体から構成されることが提案された（Ｆａｉｒｂａｎｋｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２９５８７−２９５９０（１９９９））。この仮説と一致して、ＭｃＫｅｎｚｉｅら（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．３７３：４２３−４３５（２００３））は、昆虫細胞において活性ヘテロ二量体ヘパラナーゼを産生させ、８ｋＤａサブユニットがヘパラナーゼ活性に必要であることを確認した。
【０００７】
内因性ヘパラナーゼは、様々なソースから精製することができる。しかし、ヘパラナーゼ発現レベルが低い場合は、煩雑で費用の高い精製法が必要となる。例えば、Ｔｏｙｏｓｈｉｍａ及びＮａｋａｊｉｍａ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２４１５３−２４１６０（１９９９））は、４つの異なるクロマトグラフィー段階を必要とし、少なくとも５日間かかる、血小板からの内因性ヒトヘパラナーゼの精製プロセスについて述べた。
【０００８】
内因性ヘパラナーゼの精製に対する他の欠点は、全体的な収率が特徴的に低いことである。例えば、Ｆａｉｒｂａｎｋｓら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，２９５８７−２９５９０（１９９９））は、血小板からヘパラナーゼをたった２２μｇのみ、６％の回収率で精製したことについて報告している。同様に、Ｆｕｋｓ及び共同研究者ら（米国特許第５，３６２，６４１号）は、ヒトヘパトーマ細胞株Ｓｋ−Ｈｅｐ−１由来のタンパク質 １．４ｋｇからヘパラナーゼを４０００倍精製し、１．９％の回収率で、精製ヘパラナーゼタンパク質をわずか６．５μｇのみ調製したことについて述べている。同じ細胞株からのヘパラナーゼの２４０，０００倍精製が、Ｐｅｃｋｅｒら（米国特許第５，９６８，８２２号）により開示された。しかし、このプロセスには、細胞培養物 ５００リットル超が必要であった。
【０００９】
ヒトヘパラナーゼ遺伝子の同定及びクローニング（Ｖｌｏｄａｖｋｓｙら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．５：７９３−８０２（１９９９）；Ｈｕｌｅｔｔら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．５：８０３−８０９（１９９９）；Ｔｏｙｏｓｈｉｍａ及びＮａｋａｊｉｍａ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２４１５３−２４１６０（１９９９））により、異種発現系におけるヘパラナーゼタンパク質の組み換え発現が可能となった。しかし、そのような異種発現系について、ヘパラナーゼ産生に関して、重大な欠点が知られている。例えば、Ｂｅｎ−Ａｒｔｚｉら（ＷＯ９９／５７２４４）は、細菌、哺乳類、酵母及び昆虫細胞における組み換えヒトヘパラナーゼの発現について述べている。ヘパラナーゼ発現は達成されたが、Ｅ．コリが宿主細胞であった場合、その組み換えタンパク質に付随する酵素活性は検出されず、酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（ピキア パストリス）でヘパラナーゼを発現させた場合、７０ｋＤａの非プロセシング前駆体のみが検出された。
【００１０】
Ｂｅｎ−Ａｒｔｚｉ及び共同研究者ら（前出）はまた、哺乳類細胞、すなわち、ヒト腎臓繊維芽細胞（２９３）、仔ハムスター腎臓細胞（ＢＨＬ２１）及びチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）における組み換えヘパラナーゼの発現について述べている。しかし、これらの発現系は、効率が低く、必要なコストが高いことが知られている。さらに、活性を有する成熟型タンパク質を得るための組み換え全長前駆体のプロセシングがこれらの細胞で観察されるという事実にもかかわらず、このプロセシング反応が効率的でないため、均質的にプロセシングされたタンパク質は得られない。さらに、ヘパラナーゼの分泌を促進する発現ベクターを使用しても、ＣＨＯ細胞の馴化培地において組み換えヘパラナーゼの産生は導かれず、ヘパラナーゼを分泌するために、カルシウムイオノフォア又はＰＭＡを添加することにより、さらに刺激を行う必要がある。この系で正しくプロセシングされるのは、分泌されたタンパク質のごく一部のみであると思われる。
【００１１】
Ｓｆ２１又はＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ（ハイファイブ）細胞などの昆虫細胞発現系におけるヘパラナーゼの産生が、この技術分野において述べられている（ＷＯ９９／５７２４４、ＷＯ９９／１１７９８、米国特許第５，９６８，８２２号；米国特許第６，３４８，３４４号；及び米国特許第６，１９０，８７５号）。しかし、増殖培地へと効率的に分泌されることがこのような方法で観察されるにもかかわらず、この酵素の特異的活性は非常に低く、正しいプロセシングは観察されなかった。例えば、Ｂｅｎ−Ａｒｔｚｉら（ＷＯ９９／５７２４４）は、昆虫細胞発現系で正しくプロセシングされたヘパラナーゼを生成させるために、そのヘパラナーゼタンパク質の位置１１９又は１５７の下流にプロテアーゼ切断部位を導入することについて述べている。しかし、これらのコンストラクトは、酵素的に活性であることが示されなかった。
【００１２】
ＭｃＫｅｎｚｉｅら（前出）は、昆虫細胞における活性を有するヘテロ二量体ヘパラナーゼの産生について述べた。しかし、この系は、２種類の異なる組み換えタンパク質（８ｋＤａ及び５０ｋＤａサブユニット）を同時に生成させる必要があるという欠点を有する。単離した８ｋＤａ及び５０ｋＤａドメインの混合の結果、ヘパラナーゼは活性化されないので、同時発現により活性を有するヘテロ二量体を成功裡に回収できるか否かは、おそらく、そのヘテロ二量体複合体の共翻訳的な形成に依存する。この複合体をグリカナーゼで処理することにより、それが解離し、５０ｋＤａサブユニットが沈降するが、このことから、安定性及び溶解性に乏しいことが示唆される。
【００１３】
活性又は不活性型でヘパラナーゼを得るための上述の方法にもかかわらず、高収率、低コストの異種発現系において発現させることができる、生物学的に活性を有するヘパラナーゼ分子を生成させることは利益があると思われる。前記分子は、転移成長及び／又は炎症を阻害及び／又は治療する、治療又は医薬品の開発のための阻害剤スクリーニングアッセイにおいて使用することができる。
【発明の開示】
【００１４】
本発明は、高収率の異種発現系で発現させることができる、生物学的に活性を有する哺乳類ヘパラナーゼをコードする合成核酸分子を提供する。本明細書で提供される合成ヘパラナーゼ分子は、哺乳類系で発現が低レベルであり異種発現系で正しくプロセシングされない野生型ヘパラナーゼを凌ぐ顕著な長所を与える。本発明の合成分子は、転移成長、自己免疫疾患及び／又は炎症を阻害及び／又は治療するための治療又は医薬品開発のための、阻害剤スクリーニングアッセイにおいて使用することができる。
【００１５】
本発明のある態様において、上記の合成核酸分子は、哺乳類ヘパラナーゼタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有し、このヌクレオチド配列は、エンドプロテアーゼにより認識される２個のコンセンサス切断部位を含有し、この切断部位は、本ヘパラナーゼタンパク質の残基１００及び１６８をコードするヌクレオチドの間に位置する。前記核酸分子は、適切な酵素とともにインキュベーションすると生物学的活性が可能となる、ヘパラナーゼタンパク質をコードする。
【００１６】
本発明はさらに、哺乳類ヘパラナーゼタンパク質をコードする部分を含有し、このタンパク質コード部分が、基本的に、約８ｋＤａのＮ−末端断片をコードするヌクレオチド配列と、リンカーと、約５０ｋＤａのＣ−末端断片をコードするヌクレオチド配列と、から構成され、該Ｎ−末端及びＣ−末端断片が、野生型ヘパラナーゼ断片と実質的に同様であるタンパク質断片をコードし、該コードされるヘパラナーゼタンパク質が構成的に活性を有する、合成哺乳類ヘパラナーゼ核酸分子に関する。
【００１７】
合成的に産生される、生物学的に活性を有する哺乳類ヘパラナーゼポリペプチド、及び適切な酵素とインキュベーションすると生物学的活性が可能となる、エンドプロテアーゼコンセンサス切断部位を含むヘパラナーゼポリペプチドもまた本明細書で提供する。
【００１８】
本発明はさらに、結果として生物学的に活性を有するヘパラナーゼが高レベルで発現される、異種発現系において哺乳類ヘパラナーゼを発現させるための方法を提供する。
【００１９】
本明細書を通して、及び添付の請求項で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、他に文脈が明確に指示を与えない限り、複数形の意味を含む。
【００２０】
本明細書を通して、及び添付の請求項で使用される場合、次の定義及び略語を適用する。
【００２１】
「保存的アミノ酸置換」は、あるアミノ酸残基を別の化学的に同等のアミノ酸残基に置換することを意味する。そのような保存的置換の例は、ある疎水性残基（イソロイシン、ロイシン、バリン又はメチオニン）を別のものへ置換すること；ある極性残基を同様の電荷の別の極性残基へ置換すること（例えば、リジンに対するアルギニン；アスパラギン酸に対するグルタミン酸）である。
【００２２】
「哺乳類」という用語は、ヒトを含むあらゆる哺乳動物を意味する。
【００２３】
「治療」という用語は、治療的処置及び予防的（Ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ又はＰｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）手段の両方を意味する。治療を必要とする者には、既に疾患に罹患している者ならびにその疾患に罹患する傾向がある者又はその疾患が予防されるべきである者が含まれる。「疾患」とは、本明細書中に記載の核酸分子及びポリペプチドを用いて同定した分子による治療が役立つあらゆる状態である。このような疾患には、これらに限定されないが、癌、炎症及び自己免疫疾患が含まれる。
【００２４】
「ベクター」という用語は、ＤＮＡ断片を宿主生物又は宿主組織に導入することができるある手段を意味する。プラスミド、ウイルス（アデノウイルスを含む。）、バクテリオファージ及びコスミドをはじめとした様々な種類のベクターがある。
【００２５】
「生物学的に活性を有する」とは、タンパク質が、天然に生じる分子又はそのアイソフォームに付随する構造的、調整的又は生物化学的機能を有することを意味する。ヘパラナーゼとの関連において、「生物学的に活性を有する」タンパク質は、ヘパラナーゼ酵素活性を含む。
【００２６】
「実質的に同様」とは、ある配列が参照配列と、少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％及びさらにより好ましくは９９％の相同性を共有することを意味する。本発明において、この参照配列は、この文章の文脈で示される場合、全長ヒトヘパラナーゼヌクレオチドもしくはアミノ酸配列又は８ｋＤａ（配列番号１５）もしくは５０ｋＤａ（配列番号１６）ヘパラナーゼフラグメントのヌクレオチドもしくはアミノ酸配列であり得る。このように、８ｋＤａヒトヘパラナーゼ断片（配列番号１５）と「実質的に同様」であるヘパラナーゼタンパク質配列は、この８ｋＤａヒトヘパラナーゼ断片と、少なくとも８０％の相同性、好ましくは９０％の相同性、より好ましくは９５％の相同性、さらにより好ましくは９９％の相同性を共有することとなる。あるヘパラナーゼタンパク質又はヌクレオチド配列が参照配列に対して「実質的に同様」であるか否かは、例えば、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＵＷＧＣＧ）から入手できるＧＡＰコンピュータープログラム、バージョン６．０などの配列解析ソフトウェアを用いた比較配列情報により決定することができる。ＧＡＰプログラムは、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１）により改訂された、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０）のアラインメント法を利用する。
【００２７】
「遺伝子」は、そのヌクレオチド配列がポリペプチド分子をコードする核酸分子を意味する。遺伝子は、中断されないヌクレオチド配列であり得るか、又は、イントロン、プロモーター領域、スプライシング部位及び反復配列などの介在部分を含み得る。遺伝子は、ＲＮＡであってもＤＮＡであってもよい。好ましい遺伝子は、本発明のペプチドをコードするものである。
【００２８】
「核酸」又は「核酸分子」という用語は、リボ核酸（ＲＮＡ）又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、プローブ、オリゴヌクレオチド、断片又はそれらの一部及びプライマーを意味するものとする。ＤＮＡは、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）又はゲノムＤＮＡ、例えば、本発明のペプチドをコードする遺伝子のいずれでもあり得る。
【００２９】
「野生型ヘパラナーゼ」又は「野生型タンパク質」もしくは「ｗｔタンパク質」は、アミノ酸又はそれらの変異型の天然に生じる配列を含むタンパク質を意味する。野生型ヒトヘパラナーゼのアミノ酸配列は、本分野において入手可能である（Ｖｌｏｄａｖｋｓｙら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．５：７９３−８０２（１９９９）；Ｈｕｌｅｔｔら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．５：８０３−８０９（１９９９）；Ｔｏｙｏｓｈｉｍａ及びＮａｋａｊｉｍａ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（３４）：２４１５３−２４１６０（１９９９）；（参照により、全体を本明細書に組込む。））。
【００３０】
「野生型ヘパラナーゼ遺伝子」は、ヒト由来のタンパク質又は、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）などの昆虫、ツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）などの両生類及びラット、マウス及びアカゲザルなどの哺乳類を含むがこれらに限定されない、別の生物から得られたタンパク質をはじめとする、天然に生じるヘパラナーゼタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する遺伝子を意味する。本ヒトヘパラナーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は、本分野で入手可能である（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ１５５５１０；Ｔｏｙｏｓｈｉｍａ及びＮａｋａｊｉｍａ、前出（参照により、全体を本明細書に組込む。））。
【００３１】
「実質的に他のタンパク質不含である」又は「実質的に精製された」とは、少なくとも９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９９％及びさらにより好ましくは９９．９％、他のタンパク質が含まれていないことを意味する。したがって、実質的に他のタンパク質不含のヘパラナーゼタンパク質調製物は、その総タンパク質のパーセンテージとして、非ヘパラナーゼタンパク質が、１０％を超えない、好ましくは５％を超えない、より好ましくは１％を超えない、さらにより好ましくは０．１％を超えない。あるヘパラナーゼタンパク質調製物が実質的に他のタンパク質不含であるか否かは、例えば、適切な検出方法（例えば銀染色又は免疫ブロッティングなど）と組み合わせたドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）などの従来のタンパク質純度評価技術により決定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
ヘパラナーゼは、加水分解酵素メカニズムを介してグリコシド結合を切断することによりヘパラン硫酸（ＨＳ）を分解する哺乳類酵素である。ＨＳ分解は、細胞−細胞及び細胞−ＥＣＭ相互作用を変更することで細胞外の変化に対して細胞が素早く反応できるようにすることによって、多くの生理学的プロセスにおいて重要な役割を果たす。これらの相互作用は重要なので、ヘパラナーゼ活性の阻害は、腫瘍細胞転移、Ｔ細胞介在遅延型過敏及び自己免疫疾患などのいくつかの病態に影響を及ぼし得る。
【００３３】
いくつかの証拠から、ヘパラナーゼが腫瘍細胞転移に関与することが示唆される。第一に、ヘパラナーゼの発現レベルは、いくつかの腫瘍及び腫瘍細胞株の転移能と相関がある。第二に、侵襲性の強い転移性疾患の患者では、その尿中において測定可能なヘパラナーゼ活性を有する。この所見は、全ての癌患者で見られるものではない。さらに、非−抗凝血剤ヘパリン誘導体によるヘパラナーゼ活性の阻害により、Ｂ１６メラノーマ、ルイス肺癌及び乳癌細胞による転移発生率が低下した。最後に、ヒトヘパラナーゼ遺伝子を用いた非転移性のマウス細胞に対する形質移入の結果、２種類のマウスモデルにおいて、死亡率及び転移発生が増加した。
【００３４】
ヒトヘパラナーゼは、いかなる他の既知のタンパク質とも実質的な相同性を共有しない。その発見時において、ヘパラナーゼ遺伝子が遺伝子ファミリーのメンバーではなく、むしろ、ＨＳＰＧ分解に関与する単一遺伝子又は少なくとも主要なエンドグルクロニダーゼであることが示唆された。アミノ酸レベルで３５％の相同性を共有する第二のヘパラナーゼ（ｈｐａ２）が後に同定されたが、しかし、ｈｐａ２は、その組織分布に基づき、異なる機能を果たすと思われる。転移成長におけるヘパラナーゼの役割を示す上記の証拠と合わせて、類似の作用を遂行する密接に関連するタンパク質が欠如していることにより、へパラナーゼはこれらの領域における治療法の開発のための優れたターゲットとなる。
【００３５】
図１は、ヒトヘパラナーゼの生合成を示す。簡潔に述べると、ヘパラナーゼｃＤＮＡは、ＥＲへの移動時にシグナルペプチダーゼにより除去されるシグナルペプチド配列（残基Ｍｅｔ１−Ａｌａ３５）を有するプレプロタンパク質として最初に合成されるタンパク質をコードする。その結果生じる６５ｋＤａプロ形態は、さらに、１５７のＮ−末端アミノ酸を除去することによりプロセシングされ、成熟型の５０ｋＤヘパラナーゼ（配列番号１６）となる。この５０ｋＤタンパク質は、非プロセシング型の６５ｋＤａ前駆体よりも少なくとも１００倍高い特異的活性を有する（Ｖｌｏｄａｖｓｋｙら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５：７９３−８０２（１９９９））。この酵素の活性型が、未同定のタンパク質分解酵素により６ｋＤａの介在ペプチド（残基Ｇｌｕ１０９−Ｇｌｎ１５７）（以下、「介在断片」又は「６ｋＤａ断片」と呼ぶ。）を除去することで生じる、５０ｋＤａ断片と８ｋＤａ断片（配列番号１５）との間のヘテロ二量体であることが提案された（Ｆａｉｒｂａｎｋｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２９５８７−２９５９０（１９９９））。
【００３６】
最近の証拠により８ｋＤａサブユニット（配列番号１５）がヘパラナーゼ活性に必要であることが示されているにもかかわらず（ＭｃＫｅｎｚｉｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．３７３：４２３−４３５（２００３））、ヘパラナーゼの活性化プロセスにおけるこの８ｋＤａサブユニットの役割は、本明細書中で開示される研究以前は、不明確なままであった：これは、不可欠なサブユニットとして働く、又は、あるいは、シャペロンとして作用する可能性があり、この機能が遂行された後は不必要となり得る。また、８ｋＤａサブユニット以外の他の成分がヘパラナーゼ活性の誘導に必要であるか否かも明確ではなかった。
【００３７】
多配列アラインメント及び二次構造予想から、いくつかのグリコシダーゼで見られるように、そのタンパク質がＴＩＭバレルフォールドを取ることによるヒトヘパラナーゼのモデルが導かれる（Ｈｕｌｅｔｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９：１５６５９−１５６６７（２０００））。この共通フォールドモチーフは、通常、８個の交互のα−へリックス及びβ−鎖からなる。５０ｋＤａ断片内で、明確な相同性が観察されるのは、ＴＩＭバレルフォールドの３番目のα／βユニットからのみであるが、このことから、ヘパラナーゼが６個のみのα／βユニットからなる新規フォールドを取るか、又は、このタンパク質の他の部分が、欠落ユニットに寄与するか、のいずれかが示唆される。８ｋＤａ断片がこの欠落構造エレメントに寄与し得ることが主張された（Ｈｕｌｅｔｔら、前出）。
【００３８】
この仮説に従い、本明細書中で述べるように、一緒に共有結合する８ｋＤａ及び５０ｋＤａサブユニットを有する１本鎖ヘパラナーゼ分子を設計するために、多配列アラインメント（図３Ａ及び３Ｂ）に基づきヘパラナーゼの二次構造のモデルを確立した。本発明は、８ｋＤａ及び５０ｋＤａ断片のリンカーとの連結の結果、タンパク質分解的プロセシングを必要としない構成的に活性を有する１本鎖ヘパラナーゼ分子が得られることを示す。本発明の典型的な実施形態において、Ｈｉｒｕｄｉｎａｒｉａ ｍａｎｉｌｌｅｎｓｉｓ（ヒルディナリア マニレンシス）ヒアルロニダーゼ由来のループを移植することにより、又は、３つのグリシン−セリンリピートを含有するリンカーを用いて、この２個の断片を連結した。
【００３９】
また、６ｋＤａ介在断片のＮ及びＣ−末端周囲のエンドプロテアーゼ切断部位を改変することにより、少なくとも部分的に精製されたタンパク質の両部位におけるタンパク質分解性のプロセシングによって、他の成分なしで、ヘパラナーゼ活性化が導かれることが、本明細書において示された。本発明のこの態様の典型的実施形態において、タバコエッチウイルスプロテアーゼ切断部位をこの６ｋＤａ介在断片のＮ及びＣ−末端に付加し、その結果、コードされるタンパク質の精製又は部分精製及びそれに続く適切な酵素とのインキュベーション後に、活性を有するヘパラナーゼが得られる。本発明は、ヒトヘパラナーゼが標準的なＴＩＭバレルフォールドを取ることの証拠を提供し、有利に、特異的な阻害剤の同定のための活性酵素分子の容易な産生方法を提供する。
【００４０】
異種発現系、特に昆虫細胞において生物学的に活性を有するヘパラナーゼを発現させるための、本発明の改変タンパク質、核酸分子及び方法は、特徴的に、０．５ｍｇ／ｌから５．０ｍｇ／ｌの回収率となる。さらに、これらのタンパク質は、効率的に、増殖培地に分泌され、哺乳類細胞においては、細胞内部又は細胞膜に会合して、真正のヒト酵素が主に得られる（Ｖｌｏｄａｖｓｋｙら、Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．１２：１２１−１２９（２００２））。
【００４１】
従って、本発明は、活性を有する哺乳類ヘパラナーゼをコードする合成核酸分子に関し、その核酸分子は、高収率異種発現系で発現させることができる。本明細書で提供される合成ヘパラナーゼ分子は、哺乳類系において発現レベルが低く、異種発現系において正しくプロセシングされない野生型ヘパラナーゼを凌ぐ顕著な長所を与える。本発明の合成分子は、転移成長及び／又は炎症を阻害及び／又は治療する治療又は医薬品の開発のための阻害剤スクリーニングアッセイにおいて使用することができる。前記合成分子はまた、自己免疫疾患の治療及び／又は予防のための治療又は医薬品開発においても有用である。
【００４２】
本発明のある態様において、哺乳類ヘパラナーゼタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する合成核酸分子が提供され、該ヌクレオチド配列は、エンドプロテアーゼにより認識される２個のコンセンサス切断部位を含有し、それらの切断部位は、本ヘパラナーゼタンパク質の残基１００及び１６８をコードするヌクレオチドの間に位置する。本発明のこの態様は、野生型ヘパラナーゼの生合成と同様の、本ヘパラナーゼタンパク質のタンパク質分解性プロセシングを遂行し、結果として生物学的に活性を有する酵素を得るための方法において使用することができる合成核酸分子を提供する。
【００４３】
上記核酸分子によりコードされる実質的に純粋なポリペプチドもまた、本明細書で提供する。
【００４４】
本発明の好ましい実施形態において、本哺乳類ヘパラナーゼタンパク質は、ヒトヘパラナーゼである。
【００４５】
この２個のコンセンサス切断部位は、コードされるタンパク質の精製又は部分精製及び適切な酵素とのインキュベーション後に、その結果得られる断片が、野生型８ｋＤａ断片（配列番号１５）と実質的に同様の少なくとも１つの断片と、野生型５０ｋＤａ断片（配列番号１６）と実質的に同様の少なくとも１つの断片と、を含有するという条件において、本ヘパラナーゼタンパク質の残基１００と１６８との間のいずれかの位置に導入することができる。本発明の好ましい実施形態において、本コンセンサス切断部位は、本ヒトヘパラナーゼタンパク質の残基Ｇ１１０及びＫ１５８の前に位置し、その結果、コードされるタンパク質の精製又は部分精製及びそれに続く適切な酵素とのインキュベーション後に、８ｋＤａの第一の断片、６ｋＤａの第二の「介在」断片及び５０ｋＤａの第三の断片が得られる。
【００４６】
活性を有するヘテロ二量体ヘパラナーゼを得るために、これらに限定されないが、タバコエッチウイルス、ピコルナウイルスの３Ｃプロテアーゼ、トロンビン、血液凝固因子Ｘａ及びエンテロキナーゼからの切断部位を含む、何らかのエンドプロテアーゼに対応する切断部位を、ヘパラナーゼ分子に導入することができることは、当業者により理解される。本発明の好ましい実施形態において、前記切断部位は、タバコエッチウイルス由来である。
【００４７】
本発明の別の態様において、哺乳類ヘパラナーゼタンパク質をコードする部分を含有し、そのタンパク質コード部分が、基本的に、約８ｋＤａのＮ−末端断片をコードするヌクレオチド配列と、リンカーと、約５０ｋＤａのＣ−末端断片をコードするヌクレオチド配列とから構成される、構成的に活性を有する１本鎖哺乳類ヘパラナーゼ核酸分子が提供される。本発明のこの態様は、タンパク質分解性プロセシングなしで構成的に活性を有するヘパラナーゼをコードし、その６ｋＤａ「介在」断片が実質的に除去されるように改変され、その介在断片がより小さいリンカーで置換される、合成遺伝子を提供する。
【００４８】
本発明のこの態様の好ましい実施形態において、本哺乳類ヘパラナーゼタンパク質は、ヒトヘパラナーゼである。
【００４９】
上記の構成的に活性を有する１本鎖哺乳類ヘパラナーゼ遺伝子によりコードされる精製された合成ヘパラナーゼタンパク質もまた、本明細書で提供される。
【００５０】
本発明のこの態様において、約１残基から約６７残基からなるペプチドをコードする何らかの配列を、リンカーとして使用することができる。前記リンカーは、合成するか、又は天然に生じるソースから単離することができる。本発明の典型的な実施形態において、本リンカーは、ヒアルロニダーゼタンパク質の中央ループ領域をコードするヌクレオチド配列を含む。このヒアルロニダーゼは、Ｈ．マニレンシス（Ｈ．ｍａｎｉｌｌｅｎｓｉｓ）由来であることがが好ましい。他の実施形態において、本リンカーは、（ＧｌｙＳｅｒ）３リンカーをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００５１】
本発明はさらに、本明細書を通じて開示される合成核酸分子を含有する組み換えベクターに関する。これらのベクターは、ＤＮＡ又はＲＮＡからなるものであり得る。殆どのクローニング目的に対して、ＤＮＡベクターが好ましい。代表的なベクターには、組み換えヘパラナーゼタンパク質をコードすることができる、プラスミド、改変ウイルス、バキュロウイルス、バクテリオファージ、コスミド、酵母人工染色体及びエピソーム性のＤＮＡもしくは統合ＤＮＡの他の型が含まれる。特定の遺伝子導入又は他の使用のための適切なベクターを決定することは、十分に熟練者の範囲内にある。
【００５２】
本明細書を通じて開示される本合成核酸分子を含有する発現ベクターは、組み換え宿主細胞における哺乳類ヘパラナーゼの高レベル発現に使用し得る。発現ベクターには、これらに限定されないが、クローニングベクター、改変クローニングベクター、特に設計したプラスミド又はウイルスが含まれ得る。また、様々な細菌発現ベクターも、必要ならば、細菌細胞において組み換えヘパラナーゼを発現させるために使用し得る。さらに、真菌細胞において組み換えヘパラナーゼを発現させるために、様々な真菌細胞発現ベクターを使用し得る。さらに、昆虫細胞において組み換えタンパク質を発現させるために、様々な昆虫細胞発現ベクターを使用し得る。本発明の好ましい実施形態において、ベクターは、バキュロウイルスベクターである。
【００５３】
本発明はまた、本発明の合成核酸分子を含有するベクターを用いて形質転換又は形質移入を行った宿主細胞にも関する。組み換え宿主細胞は、原核又は真核であり得、これらに限定されないが、Ｅ．コリなどの細菌、これらに限定されないがＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（ピキア パストリス）、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（ハンセヌラ ポリモルファ）及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｖｉｓｉａｅ（サッカロミセス セルビシエ）を含む酵母などの真菌細胞及び、これらに限定されないがショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）及びカイコ由来の細胞株を含む昆虫細胞が含まれる。このような組み換え宿主細胞は、哺乳類ヘパラナーゼ又は生物学的に同等の型を高レベルで産生させるための適切な条件下で培養することができる。本明細書中で定義する場合、「宿主細胞」という用語は、トランスジェニックヒト、トランスジェニックヒト胎児又はトランスジェニックヒト胚の身体における宿主細胞を含むものではない。
【００５４】
上記のごとく、本発明の合成分子は、高収率異種発現系で発現させることができるので、先行技術を凌ぐ顕著な長所を提供する。本明細書で提供される合成分子によりコードされるヘパラナーゼタンパク質は、正しくプロセシングされ、酵素的に活性を有し、高レベルで発現される。従って、本発明の好ましい実施形態において、選択される宿主細胞は、これらに限定されないが、昆虫細胞、細菌細胞及び酵母細胞を含む高収率異種発現系の一部である。本発明の特に好ましい実施形態において、宿主細胞は、昆虫細胞である。
【００５５】
本発明はまた、本明細書を通じて開示される核酸分子を含有する、組み換えベクター及び組み換え宿主細胞（両者とも原核及び真核である。）に関する。本発明の合成核酸分子、関連ベクター及び宿主は、癌、炎症及び／又は自己免疫の治療のために役立つ、ヘパラナーゼ活性の阻害剤を同定するためのスクリーニングアッセイにおいて有用である。
【００５６】
本発明の別の態様において、（ａ）哺乳類ヘパラナーゼタンパク質をコードし、エンドプロテアーゼにより認識される２個のコンセンサス切断部位を含有し、該切断部位が該ヘパラナーゼタンパク質の残基１００及び残基１６８をコードするヌクレオチドの間に位置するヌクレオチド配列を含有するベクターを用いて、非哺乳類細胞に対して形質転換又は形質移入を行うことと；
（ｂ）前記ヘパラナーゼタンパク質の発現を可能にする条件下で宿主細胞を培養することと；
（ｃ）前記細胞を崩壊させて、前記ヘパラナーゼタンパク質を少なくとも部分的に精製することと；
（ｄ）少なくとも部分的に精製したタンパク質をエンドプロテアーゼに曝露し、該ヘパラナーゼタンパク質をコンセンサス切断部位で切断することと、を含む、非哺乳類細胞において哺乳類ヘパラナーゼを発現させる方法が提供される。
【００５７】
本発明はまた、上記の方法により産生された、実質的に精製されたタンパク質も提供する。
【００５８】
本発明のこの態様の好ましい実施形態において、本哺乳類ヘパラナーゼは、ヒトヘパラナーゼである。さらに好ましい実施形態において、本コンセンサス切断部位は、ヒトヘパラナーゼの残基Ｇ１１０及びＫ１５８の前に位置する。
【００５９】
別の好ましい実施形態において、本切断部位は、タバコエッチ（ｔｏｂａｃｃｏ ｅｔｃｈ）タンパク質切断部位である。
【００６０】
本明細書において、（ａ）ヘパラナーゼタンパク質をコードする部分を含有し、該タンパク質コード部分が、基本的に、約８ｋＤａのＮ−末端断片をコードするヌクレオチド配列と、リンカーをコードするヌクレオチド配列と、約５０ｋＤａのＣ−末端断片をコードするヌクレオチド配列とから構成される、合成哺乳類ヘパラナーゼ遺伝子を含有するベクターを用いて、非哺乳類細胞に対して形質転換又は形質移入を行うことと；
（ｂ）前記ヘパラナーゼタンパク質の発現を可能にする条件下で宿主細胞を培養することと、を含む、非哺乳類細胞において、１本鎖の、構成的に活性を有する哺乳類ヘパラナーゼを発現させる方法もまた提供される。
【００６１】
本明細書において、上記の方法により産生された、実質的に精製されたタンパク質もまた提供される。本発明のさらなる実施形態において、本タンパク質は、野生型ヘパラナーゼに特異的な抗体に結合することができる。
【００６２】
本発明のこの態様の好ましい実施形態において、本リンカーは、ヒアルロニダーゼタンパク質の中央ループ領域を含有する。別の好ましい実施形態において、本リンカーは、（ＧｌｙＳｅｒ）３ペプチドを含有する。
【００６３】
本明細書中で言及した公表物は全て、本発明に関連して使用され得る方法及び材料を説明し開示する目的のために、参照により本明細書に組込む。明細書のいかなる開示内容も、本発明が先行技術の効力によってこのような開示に対して先行する権利を与えられていないことを認めるものではない。
【００６４】
付随する図面を参照して本発明の好ましい実施形態を説明してきたが、本発明がこれらの明確な実施形態に限定されず、添付の請求項において定義される本発明の範囲又は精神から逸脱することなく、当業者によりそれらにおいて様々な変更及び改変が行われ得ることを理解されたい。
【００６５】
次の実施例は、説明するものであり、本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００６６】
ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーからのヘパラナーゼのクローニング
ＴａＫａＲａ Ｔａｑポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．，Ｏｔｓｕ，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）を用いて、ＰＣＲにより、ヒトヘパラナーゼ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ１５５５１０）を正常ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）から増幅した。緩衝液条件は、供給者により示されたものであった。ｃＤＮＡテンプレートのＰＣＲ増幅は、９４℃、１分間を１サイクル、その後、９４℃にて３０秒間、５７℃にて３０秒間及び６８℃にて１１０秒間を３５サイクルで行うように構成した。増幅した断片をゲル精製し、リン酸化し、充填後、ｐＦＡＳＴ ＢＡＣ１のＢａｍＨＩ部位（バキュロウイルス発現）、又は、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ消化したｐｃＤＮＡ３ベクター（哺乳類細胞発現）のいずれかにクローニングした。ＰＣＲ増幅及びＫｏｚａｋ配列の同時最適化のために次のプライマーを使用した：ｈＨＥＰ１−２４ ＢａｍＨＩ ｏｐｔｉ
【００６７】
【化１】
；及びｈＨＥＰ ｒｅｖ １６３２
【００６８】
【化２】
【実施例２】
【００６９】
１本鎖ヘパラナーゼ分子の構築
次のコンストラクト（ｈｅｐＷＴ、ｈｅｐ１０９（配列番号１９、タンパク質配列番号２０に対応）、ｈｅｐ１０６（配列番号１８、タンパク質配列番号１７に対応）、ｈｅｐＧＳ３（配列番号２２、タンパク質配列番号２１に対応）、ｈｅｐＧＳ６（配列番号２４、タンパク質配列番号２６に対応）、ｈｅｐＧＳ４（配列番号２３、タンパク質配列番号２５に対応）及びｈｅｐＨｙａｌｕｒｏ（配列番号２８、タンパク質配列番号２７に対応）、直接的に８及び５０ｋＤａサブユニットを共有結合で連結しているもの（ｈｅｐ１０９及びｈｅｐ１０６）、これらのサブユニットをグリシン−セリンスペーサーを介して連結しているもの（ｈｅｐＧＳ３、ｈｅｐＧＳ４及びｈｅｐＧＳ６）又は酵素ヒアルロニダーゼからのループ領域を移植することにより連結しているもの（Ｈｙａｌｕｒｏ））を、指示したプライマーを用いて標準的なＰＣＲ突然変異誘発により生成させた：
ｈＨＥＰ１−２４ ＢａｍＨＩ ｏｐｔｉ（配列番号１）及びｈＨＥＰ ｒｅｖ １６３２（配列番号２）
ｈｅｐ１０９ Ｍ１＿Ｅ１０９−Ｑ１５７＿Ｉ５４３
突然変異誘発プライマー：ｈＨＥＰ ３０４／５０４
【００７０】
【化３】
ｈｅｐ１０６ Ｍ１＿Ｐ１０６−Ｋ１５８＿Ｉ５４３
突然変異誘発プライマー：ｈＨＥＰ ２９１／５０４ ｂｉｓ
【００７１】
【化４】
ｈｅｐＧＳ３ Ｍ１＿Ｅ１０９−（ＧＳ）３−Ｑ１５７＿Ｉ５４３
突然変異誘発プライマー：ｈＨＥＰ ３０４（ＧＳ３）５０４
【００７２】
【化５】
ｈｅｐＧＳ６ Ｍ１＿Ｅ１０９−（ＧＳ）６−Ｑ１５７＿Ｉ５４３
突然変異誘発プライマー：ｈＨＥＰ ３０４（ＧＳ６ Ａｌａ）
【００７３】
【化６】
ｈｅｐＧＳ４ Ｍ１＿Ｗ１１８−（ＧＳ）４−Ｅ１４３＿Ｉ５４３
突然変異誘発プライマー：ｈＨＥＰ３２９（ＧＳ４ Ａｌａ）
【００７４】
【化７】
ｈｅｐＨｙａｌｕｒｏ Ｍ１＿Ｗ１１８−（ＡＦＫＤＫＰＴ）（配列番号８）−Ｅ１４３＿Ｉ５４３
【００７５】
突然変異誘発プライマー：ｈＨＥＰ Ｈｙａｌｕｒｏ ５’−
【００７６】
【化８】
【実施例３】
【００７７】
改変プロテアーゼ切断部位を有するヘパラナーゼ分子の構築
アミノ酸Ｅ１０９とＧ１１０との間の、ＧＳリピート（Ｅ１０９−ＧＳＧＳＥＮＬＹＦＱ−ＧＳＧ−Ｇ１１０（配列番号１０）、ＱとＧとの間に切断されやすい結合がある。）に隣接する、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼに対するコンセンサス切断部位を挿入する改変ヘパラナーゼ分子を構築するために、テンプレートとしてｗｔヘパラナーゼを用い、プライマー、ｈＨＥＰ１−２４ ＢａｍＨＩ ｏｐｔｉ（配列番号１）及びｈＨＥＰ ｒｅｖ １６３２（配列番号２）及び突然変異誘発プライマー、ＴＥＶ １１０ｂｉｓ
【００７８】
【化９】
を用いてＰＣＲ突然変異誘発を行った。
【００７９】
残基Ｅ１０９／Ｇ１１０の間及びＱ１５７／Ｋ１５８の間の両方にＴＥＶ−切断部位を有する改変ヘパラナーゼを構築するために、ＴＥＶ１１０コンストラクト（配列番号３０、タンパク質配列番号３１に対応）をテンプレートとして使用し、ＰＣＲ突然変異誘発により、突然変異誘発プライマー、ＴＥＶ１５８ ｔｅｒ
【００８０】
【化１０】
を用いて、配列
【００８１】
【化１１】
を挿入し、ｈｅｐＴＥＶ１１０／１５８（配列番号２９及び３２）を作製した。
【００８２】
コンストラクトは全て、ＰＣＲにより突然変異が導入されていないことを確認するために両鎖において配列決定を行い、上述のようにｐＦＡＳＴＢＡＣ１にクローニングした。
【実施例４】
【００８３】
ＣＯＳ７細胞におけるヘパラナーゼ分子の一時的発現。
【００８４】
ダルベッコＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）中で細胞を増殖させた。全てのコンストラクトを、真核細胞発現プラスミドｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。各コンストラクトの形質移入効率を調べるために、レポーター遺伝子 β−ラクタマーゼ（ＢＬＡ）をコードするベクターを共形質移入した。同程度の形質移入効率にするために形質移入した各ベクターの量を調整した。ｆｕＧＥＮＥ６形質移入試薬（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、製造者の説明書に従い、ＣＯＳ７細胞の一時的形質移入を行った。形質移入から２４時間後、ＢＬＡ−陽性細胞の蛍光検出により効率を評価した。形質移入から９６時間後、細胞を回収し、完全プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含有する細胞溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ）中で再懸濁した。氷上で３０分間、細胞溶解を行った。１４０００ｒｐｍで３０分間遠心した後、ヘパラナーゼを含有する上清を回収し、下記で概説するように部分精製を行った。
【００８５】
一時的形質移入により、ヘパラナーゼコンストラクトを、内因性へパラナーゼ活性を欠くＣＯＳ７細胞で発現させた。ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーにより細胞溶解液からヘパラナーゼを抽出し、ウェスタンブロットで定量した。並行して、放射性又は蛍光分析のいずれかでヘパラナーゼ酵素活性を測定した（図５）。ウェスタンブロット分析から、ｗｔヘパラナーゼならびに１本鎖コンストラクトＧＳ３及びｈｙａｌｕｒｏが効率的に発現され、プロセシングされるが、一方で、コンストラクト１０６及びＧＳ４は、発現されるがプロセシングされないと結論付けた。コンストラクト１０９及びＧＳ６の発現レベルはきわめて低く、ウェスタンブロット分析により辛うじて検出できる程度であった。ｗｔ、ＧＳ３及びｈｙａｌｕｒｏコンストラクトのみが酵素活性を示した。発明者らは、１本鎖コンストラクト１０６及びＧＳ４は不活性であり、一方、１０９及びＧＳ６は、おそらく不安定であると結論付けた。ＧＳ３及びｈｙａｌｕｒｏは活性を有するが、切断部位に変更を導入したにもかかわらずプロセシングされるので、前駆体の固有の活性については結論を導くことはできなかった。従って、発明者らは、ヘパラナーゼプロセシングに関与する酵素を欠く細胞において発現を進めた。
【実施例５】
【００８６】
昆虫細胞におけるヘパラナーゼ分子の発現。
【００８７】
Ｂａｃ ｔｏ Ｂａｃ発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ヘパラナーゼコンストラクトを含有する組み換えバキュロウイルスを作製した。１０％ＦＢＳを含有するＧｒａｃｅ昆虫培地で増殖させたＳｆ９昆虫細胞（５０ｘ１０６細胞／Ｔ−１７５フラスコ）を感染させるために、組み換えバキュロウイルスを使用した。感染から４８時間後に細胞を回収し、５００ｇで５分間遠心した。ＣＯＳ７に対して使用した１５０ｍＭ ＮａＣｌのかわりに、可溶性分画におけるタンパク質の量を増加させる、５００ｍＭ ＮａＣｌを含有する細胞溶解緩衝液を使用すること以外、上述のようにして、細胞溶解液を調製した。
【００８８】
ＣＯＳ７細胞で産生した場合に酵素活性を示した３種類のヘパラナーゼコンストラクトをバキュロウイルス発現系に導入した。Ｓｆ９細胞においてタンパク質を発現させ、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。ウェスタンブロット分析により、ＣＯＳ７細胞で観察されたものと対照的に、ｗｔ又は突然変異ヘパラナーゼのプロセシングがこの発現系では起こらなかったことが示された。蛍光活性分析による精製１本鎖タンパク質の酵素活性の分析から、非プロセシングｗｔ酵素活性は非常に低く、一方、非プロセシングＧＳ３及びＨｙａｌｕｒｏタンパク質は、ＣＯＳ７細胞で産生された正しくプロセシングされた野生型酵素で観察されたものに匹敵する特異的活性を有し、活性が高いことが分かった。
【００８９】
ＧＳ３及びｈｙａｌｕｒｏは、酵素活性のｐＨ及びイオン強度依存性の点に関してＣＯＳ７細胞から抽出された野生型組み換え酵素と、又はＨＣＴ−１１６細胞から部分精製された真正のｗｔ酵素と非常に似ており、ヘパリンにより同様の効力で阻害された。
【００９０】
位置１０９／１１０及び１０９／１１０＋１５７／１５８においてＴＥＶ切断部位を有するコンストラクトを発現させ、ヘパリンアフィニティーカラムで精製し、室温にて一晩、５０ｍＭ Ｍｅｓ ｐＨ６．０、１０％ グリセロール、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ中のＴＥＶプロテアーゼ（０．５μＭ）を用いて消化した。両ケースにおいて完全なプロセシングが観察されたが、しかし、両方の切断ジャンクションにおいてＴＥＶ配列を有する二重変異体のみが、この処理により活性化され、このことから、Ｅ１０９／Ｇ１１０ジャンクションにおけるプロセシングのみでは、ヘパラナーゼ活性化を誘導するには十分でないことが示された。
【実施例６】
【００９１】
ヘパリンセファロースアフィニティークロマトグラフィーによる組み換えヘパラナーゼコンストラクトの精製。
【００９２】
ＣＯＳ７又はＳｆ９昆虫細胞からの細胞溶解液を重力により５００μｌ ヘパリンセファロース ＣＬ−６Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に通した。細胞溶解緩衝液２ｍＬでそのカラムを洗浄し、次に、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５００ｍＭ ＮａＣｌ ２ｍＬで洗浄し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１Ｍ ＮａＣｌ ２ｍＬでヘパラナーゼを溶出し、Ｂｉｏｍａｘ−３０Ｋ遠心分離濃縮装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）で約５倍に濃縮した。１０％グリセロールを添加し、−８０℃にて、そのタンパク質を分注して保存した。ＢＩＯ−ＲＡＤタンパク質アッセイによりタンパク質濃度を測定した。
【実施例７】
【００９３】
大規模発現及び精製
Ｓｆ２１（又はＳｆ９）細胞を血清不含培地（Ｓｆ−９００ ＩＩ ＳＦＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中での増殖に順応させた。１から１０の間の様々な感染の多重度でヘパラナーゼコンストラクトをコードする組み換えバキュロウイルスにより細胞を感染させた。滅菌空気の一定気流状態下、２７℃にて、感染細胞３Ｌをスピナーフラスコ中で増殖させた。感染４８時間から９６時間後、細胞を回収し、遠心により培地から分離した。合成及びｗｔヘパラナーゼが細胞ペレットと上清の両方で見られた。細胞ペレットから合成ヘパラナーゼを抽出するために、上記で概説したようにして細胞を溶解した。細胞溶解液又は未精製培地上清を０．２２μフィルターで濾過し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌで平衡化した２０ｍｌ−ＨｙｐｅｒＤ Ｈｅｐａｒｉｎ カラム（Ｂｉｏｓｅｐｒａ Ｉｎｃ．，Ｍａｒｌｂｏｒｏ，ＭＡ）に載せた。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５中の０．１５Ｍから１Ｍ ＮａＣｌの直線的グラディエントを用いて、合成又はｗｔヘパラナーゼを溶出した。組み換えタンパク質は、＞５００ｍＭのＮａＣｌ濃度で溶出した。集めたヘパラナーゼ含有Ｈｅｐａｒｉｎ−カラム分画を一晩、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５に対して透析し、同じ緩衝液で平衡化したＳｏｕｒｃｅ Ｓカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に載せた。ヘパラナーゼコンストラクトは、４００ｍＭから６００ｍＭ ＮａＣｌで溶出した。１５／３０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５サイズ排除カラムでのさらなるクロマトグラフィー段階により、タンパク質を均質になるように精製した。精製したタンパク質を分注し、液体窒素中で瞬時に冷凍し、−８０℃で保存した。
【実施例８】
【００９４】
ウェスタンブロッティング
５０ｋＤａサブユニット内に含有されるペプチド（アミノ酸２２５から２４１に対応し、そのＣ−末端にさらなる配列ＧＧＣを含有する、ＥＰＮＳＦＬＫＫＡＤＩＦＩＮＧＳＱ（配列番号１４））に対して、ウサギポリクローナル抗体を作製した。チオプロピルセファロースレジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に固定化した免疫原ペプチドを用いて抗血清を免疫精製した。ヘパリンカラムから溶出したタンパク質１０μｌを１０％ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、Ｐｒｏｔｒａｎ ＢＡ ８３ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅｎｉｔｒａｔｅ膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）に転写した。５％ミルクにより非特異的結合を飽和させた後、４℃にて一晩、５％ミルク、ＴＢＳ及び０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０中で１：５００希釈した上記のポリクローナル抗体とともにその膜をインキュベーションした。洗浄後、１：５０００に希釈した抗ウサギホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗体とともに、室温にて３０分間、その膜をインキュベーションした。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）により、免疫反応のあるバンドを検出した。最後に、ＢＩＯＭＡＸ ＭＲフィルム（Ｋｏｄａｋ）に１０秒間、その膜を曝露した。
【実施例９】
【００９５】
ヘパラン硫酸の蛍光標識
既に述べられているようにしてフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）でウシ腎臓由来のヘパラン硫酸ナトリウム塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を標識した（Ｔｏｙｏｓｈｉｍａ及びＮａｋａｊｉｍａ，Ｊ．，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２４１５３−２４１６０（１９９９））。ヘパラン硫酸 ５ｍｇとＦＩＴＣ５ｍｇとを、０．１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３ ｐＨ９．５ １ｍＬに溶解し、４℃にて一晩、暗所でインキュベーションした。次に、未処理ヘパラン硫酸からＦＩＴＣ標識ヘパラン硫酸（ＦＩＴＣ−ＨＳ）を分離するために、ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｇ−２５カラムにこの溶液を載せた。高分子量のヘパラン硫酸種を分離するために、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ＝７．５緩衝液中のＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００を介した第一のゲル濾過クロマトグラフィー段階にこのＦＩＴＣ−ＨＳを供した。着色した分画を集め、Ｂｉｏｍａｘ−１０Ｋ遠心濃縮装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濃縮し、一様な分子量のヘパラン硫酸種を得るために、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００（上記）で再びクロマトグラフィーを行った。ＨＰＬＣ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ＴＭ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）クロマトグラフィーシステムにより、溶出した分画を分析した。Ｌ−７４８５蛍光検出装置（Ｍｅｒｃｋ Ｈｉｔａｃｈｉ）により、各分画の蛍光を測定した。発明者らは、分子量が異なるヘパラン硫酸産物を含む４個の主要な分画を得た。Ｂｌｙｓｃａｎ Ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ Ｌｔｄ．，Ｂｅｌｆａｓｔ，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｉｒｅｌａｎｄ）により各分画におけるＦＩＴＣ−ＨＳの量を測定した。
【実施例１０】
【００９６】
蛍光分析。
【００９７】
このアッセイは、ＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィーによりモニターするＦＩＴＣ−ＨＳの分解に基づく。５０ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ６、１０％ グリセロール（ヘパラナーセ活性緩衝液、ＨＡＢ） ５０μｌ中で、ＦＩＴＣ−ＨＳ ５μｌとともに精製ヘパラナーゼ ８μをインキュベーションした。この反応混合物を室温にて一定の時間インキュベーションし、ヘパリン ５０μｇを添加することにより反応を停止させた。次に、この混合物をＵｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ遠心濾過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて濾過した。５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．５ １５０ｍＭ Ｎａ２ＳＯ４緩衝液中で平衡化し、Ｍｅｒｃｋ−Ｈｉｔａｃｈｉ ＨＰＬＣシステムに連結したＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ＴＭ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）カラムに２０μｌを注入した。Ｌ−７４８５蛍光検出装置により蛍光ヘパラン硫酸分解産物を検出した。そのままのＦＩＴＣ−ＨＳに対する、低分子量のヘパラン硫酸種における増加をモニタリングすることにより、ヘパラナーゼ活性を評価し、ピーク領域の積分により定量した。
【実施例１１】
【００９８】
ヘパラン硫酸の還元末端における放射性標識及びビオチン化
ウシ腎臓由来のヘパラン硫酸ナトリウム塩 １０ｍｇ（Ｓｉｇｍａ）を部分的に、Ｎ−デ−アセチル化し、既に述べられているようにして［３Ｈ］無水酢酸で再びアセチル化した（Ｆｒｅｅｍａｎ及びＰａｒｉｓｈ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３２５：２２９−２３７（１９９７））。次に、トリチウム化したヘパラン硫酸を、述べたように還元末端で還元的アミノ化した。トリチウム化し、還元的にアミノ化したヘパラン硫酸を、ＥＺ−Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、さらにビオチンに結合させた。このビオチン類似体は、ヘパラン硫酸分子の還元末端で生成されるアミノ基と反応し得るＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル部分を有する。発明者らは、還元的にアミノ化し、Ｈ２Ｏ １ｍＬに再懸濁したトリチウム化ヘパラン硫酸 約５ｍｇ（ヘパラン硫酸分子量の平均値を５００ｋＤａとして、１００Ｍ 推定最終濃度）において、回収率を計算した。この溶液 １００μｌに対して、ＥＺ−ＬｉｎｋＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ １ｍｇ（約１００倍モル過剰）及びリン酸緩衝液 ｐＨ７．５ ２０μｌを添加した。この反応混合液を室温にて一晩インキュベーションした。次に、ビオチン化したトリチウム化ヘパラン硫酸を未反応ビオチンから分離するために、この反応混合物をＰＤ−１０脱塩カラムにかけた。発明者らは、最終的に、４個の分画（各１ｍＬ）を得て、Ｒｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｃａｐａｃｉｔｙ Ｃｏａｔｅｄ Ｐｌａｔｅｓ（Ｐｉｅｒｃｅ）に固定化するために、それらの活性について試験した。
【実施例１２】
【００９９】
放射性アッセイ
このアッセイは、マイクロプレートに固定化したトリチウム化ヘパラン硫酸の分解に基づく。Ｒｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｃａｐａｃｉｔｙ Ｃｏａｔｅｄ Ｐｌａｔｅｓの各ウェルを、製造者の説明書に従い前処理した。最初に、ＰＤ−１０脱塩カラム後に得られた、トリチウム化したビオチン化ヘパラン硫酸の各分画の様々な量を、ＰＢＳ中で、最終体積１００μｌとなるように、各ウェルに添加（デュプリケート）した。１００ｘ１０３ｄ．ｐ．ｍ．に対応する分画２の体積で最大結合が得られることを見極めた後、いつもこの量を使用した。室温にて一晩この結合を行った。次にウェルをＰＢＳで３回洗浄し、ＨＡＢで２回洗浄した。精製ヘパラナーゼ １０μｌを各ウェルにＨＡＢ中で添加し、最終体積を１００μｌとした。このウェルを室温にて２時間から２４時間インキュベーションした。最終的に、各ウェルにおいてヘパラナーゼにより生じるトリチウム化ヘパラン硫酸産物による遊離放射性活性を測定し、緩衝液ブランクに対して正規化した。
【実施例１３】
【０１００】
ヘパラナーゼコンストラクトの特異的活性の測定。
【０１０１】
ＣＯＳ７細胞において一時的に発現させた、又はバキュロウイルス系において発現させたいずれかのヘパラナーゼコンストラクトの特異的活性を次のように測定した：
特異的活性＝正規化活性（ｄ．ｐ．ｍ．／μｌ）／正規化した濃度測定量（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｉｃ ｖｏｌｕｍｅ）（測定量／μｌ）
詳しく説明すると、放射性アッセイにおいて、直線的な用量−活性関係が見られるような方法において各調製物を滴定することにより部分精製ヘパラナーゼコンストラクトの活性を測定した。各調製物を用いてこれらの滴定を３回繰り返し、平均、正規化活性（ｄ．ｐ．ｍ．／μｌ）を計算した。ウェスタンブロッティング実験によりタンパク質発現を調べ：デンシトメトリーにより化学発光の読み出しを定量した。再び、実験を３回繰り返し、平均値を決定した。正規化した濃度測定量（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｉｃ ｖｏｌｕｍｅ）（測定量／μｌ）で正規化した活性（ｄ．ｐ．ｍ．／μｌ）を割ることにより、特異的活性を得た。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】図１は、哺乳類細胞におけるヒトヘパラナーゼの生合成を示す。
【図２Ａ】図２パネルＡは、改変ＴＥＶ切断部位を有するヘパラナーゼコンストラクトの概略図を示す。
【図２Ｂ】パネルＢ（左）は、ＣＯＳ７細胞（レーン１）、ｈｅｐＴＥＶ１１０（レーン２）、０．５μＭ ＴＥＶプロテアーゼとの１６時間インキュベーション後のｈｅｐＴＥＶ１１０（レーン３）又は０．５μＭ ＴＥＶプロテアーゼ無しでの１６時間インキュベーション後のｈｅｐＴＥＶ１１０（レーン４）、ｈｅｐＴＥＶ１１０／１５８（レーン５）、０．５μＭ ＴＥＶプロテアーゼとの１６時間インキュベーション後のｈｅｐＴＥＶ１１０／１５８（レーン６）、０．５μＭ ＴＥＶプロテアーゼ無しでの１６時間インキュベーション後のｈｅｐＴＥＶ１１０／１５８（レーン７）において発現された、正しくプロセシングされたｗｔヘパラナーゼのウェスタンブロット分析の結果を示す。パネルＢ（右）は、ｈｅｐＴＥＶ１１０（カラム１）、０．５μＭ ＴＥＶプロテアーゼとの１６時間インキュベーション後のｈｅｐＴＥＶ１１０（カラム２）又は０．５μＭ ＴＥＶプロテアーゼ無しでの１６時間インキュベーション後のｈｅｐＴＥＶ１１０（カラム３）、ｈｅｐＴＥＶ１１０／１５８（カラム４）、０．５μＭ ＴＥＶプロテアーゼとの１６時間インキュベーション後のｈｅｐＴＥＶ１１０／１５８（カラム５）、０．５μＭ ＴＥＶプロテアーゼ無しでの１６時間インキュベーション後のｈｅｐＴＥＶ１１０／１５８（カラム６）のヘパラナーゼ活性を示す。蛍光法を使用して、これらの試料のヘパラナーゼ活性を評価した。
【図３Ａ−１】パネルＡ：関連配列に対する、ヘパラナーゼの多配列アラインメント。予想される二次構造エレメントをアラインメントの上に示す（矢印＝β鎖、円柱＝へリックス）。この２つの切断部位の位置は、黒い三角印により示す。ヒアルロニダーゼ断片により置換される、除去されるヘパラナーゼ部分の領域を、灰色のボックスで囲む。
【図３Ａ−２】パネルＡ：関連配列に対する、ヘパラナーゼの多配列アラインメント。予想される二次構造エレメントをアラインメントの上に示す（矢印＝β鎖、円柱＝へリックス）。この２つの切断部位の位置は、黒い三角印により示す。ヒアルロニダーゼ断片により置換される、除去されるヘパラナーゼ部分の領域を、灰色のボックスで囲む。
【図３Ｂ】パネルＢ：ＴＩＭバレル構造の概略図。除去されるヘパラナーゼ部分の位置は、三角印で表す切断位置により示す。存在する場合は、その部分は、β／αユニット１及び２により基質（灰色の矢印）の結合を妨げる可能性が高い。より短いループ（点線）を設計することにより、この抑制を解除し、これにより、活性を有する酵素が得られ、同時に、その酵素の構造的完全性が維持される。
【図４Ａ】パネルＡ：本明細書で述べた１本鎖ヘパラナーゼコンストラクトの概略図。
【図４Ｂ】パネルＢ、左：ＣＯＳ７細胞において発現させたｗｔヘパラナーゼ又は１本鎖コンストラクトのウェスタンブロッティング分析。Ｂｌａは、レポーター遺伝子β−ラクタマーゼ（材料と方法セクションを参照のこと。）をコードするベクターのみを形質移入したＣＯＳ７細胞の部分精製細胞溶解液に相当する対照である。右：放射性アッセイを用いた同じ試料のヘパラナーゼ活性。全ての１本鎖コンストラクトの特異的活性は、ｗｔヘパラナーゼの特異的活性に対して正規化した。
【図５】左、ＣＯＳ７細胞で産生された、正しくプロセシングされたｗｔヘパラナーゼ又はＳｆ９細胞で発現されたｗｔヘパラナーゼ及び１本鎖コンストラクトのウェスタンブロット分析。右：放射性アッセイを用いた同じ試料のヘパラナーゼ活性。Ｓｆ９細胞で発現されたｗｔヘパラナーゼ及び１本鎖コンストラクトの特異的活性は、ＣＯＳ７細胞で産生された、正しくプロセシングされたｗｔヘパラナーゼの特異的活性に対して正規化した。
【図６】ＣＯＳ７細胞で産生された、正しくプロセシングされたｗｔヘパラナーゼ（黒丸）及び非プロセシングＦＩＴＣ−ＨＳ（白丸）と比較した、昆虫細胞で産生されたｈｅｐＧ３（白四角）及びｈｅｐＨｙａｌ（黒三角）１本鎖タンパク質とともに６時間インキュベーションを行った後に得られたＦＩＴＣ−ＨＳ分解産物のサイズ排除クロマトグラフィー。
【図７Ａ】ＣＯＳ７細胞で産生された野生型ヘパラナーゼ（黒丸）、昆虫細胞で産生されたｈｅｐＧ３（白四角）及びｈｅｐＨｙａｌ（黒三角）１本鎖コンストラクトの、蛍光活性分析を用いた、イオン強度依存性（パネルＡ）。ヘパリンにおいて、滴定実験で、次のＩＣ５０値が得られた：ｈｅｐｗｔ、０．９ｎｇ／μｌ；ｈｅｐＧＳ３、１．１ｎｇ／μｌ；ｈｅｐＨｙａｌ、１．５ｎｇ／μｌ。
【図７Ｂ】ＣＯＳ７細胞で産生された野生型ヘパラナーゼ（黒丸）、昆虫細胞で産生されたｈｅｐＧ３（白四角）及びｈｅｐＨｙａｌ（黒三角）１本鎖コンストラクトの、蛍光活性分析を用いた、ヘパリンによる阻害（パネルＢ）。ヘパリンにおいて、滴定実験で、次のＩＣ５０値が得られた：ｈｅｐｗｔ、０．９ｎｇ／μｌ；ｈｅｐＧＳ３、１．１ｎｇ／μｌ；ｈｅｐＨｙａｌ、１．５ｎｇ／μｌ。
【図７Ｃ】ＣＯＳ７細胞で産生された野生型ヘパラナーゼ（黒丸）、昆虫細胞で産生されたｈｅｐＧ３（白四角）及びｈｅｐＨｙａｌ（黒三角）１本鎖コンストラクトの、蛍光活性分析を用いた、ｐＨ依存性（パネルＣ）。ヘパリンにおいて、滴定実験で、次のＩＣ５０値が得られた：ｈｅｐｗｔ、０．９ｎｇ／μｌ；ｈｅｐＧＳ３、１．１ｎｇ／μｌ；ｈｅｐＨｙａｌ、１．５ｎｇ／μｌ。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類ヘパラナーゼタンパク質をコードするヌクレオチドの配列を含み、該ヌクレオチドの配列が、エンドプロテアーゼにより認識される２個のコンセンサス切断部位を含み、該切断部位が、前記ヘパラナーゼタンパク質の残基１００及び残基１６８をコードするヌクレオチド間に位置する、合成核酸分子。
【請求項２】
請求項１に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項３】
ベクターがバキュロウイルスベクターである、請求項２に記載のベクター。
【請求項４】
請求項３に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項５】
宿主細胞が、昆虫細胞である、請求項４に記載の宿主細胞。
【請求項６】
宿主細胞が、酵母細胞である、請求項４に記載の宿主細胞。
【請求項７】
酵母が、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（ピキア パストリス）、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（ハンセヌラ ポリモルファ）及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｖｉｓｉａｅ（サッカロミセス セルビシエ）からなる群から選択される、請求項６に記載の宿主細胞。
【請求項８】
ヘパラナーゼタンパク質が、ヒトヘパラナーゼである、請求項１に記載の合成核酸分子。
【請求項９】
コンセンサス切断部位が、ヒトヘパラナーゼタンパク質の残基Ｇ１１０及びＫ１５８の前に位置する、請求項８に記載の合成核酸分子。
【請求項１０】
コンセンサス切断部位が、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位、ピコルナウイルスの３Ｃプロテアーゼ切断部位、トロンビンプロテアーゼ切断部位、エンテロキナーゼ切断部位及び因子Ｘａ切断部位からなる群から選択される、請求項８に記載の合成核酸分子。
【請求項１１】
哺乳類ヘパラナーゼタンパク質をコードする部分を含み、該タンパク質コード部分が、約８ｋＤａのＮ−末端断片をコードするヌクレオチドの配列と、リンカーと、約５０ｋＤａのＣ−末端断片をコードするヌクレオチドの配列と、から実質的になり、前記Ｎ−末端及びＣ−末端断片が、野生型ヘパラナーゼ断片と実質的に同様であるタンパク質断片をコードし、該コードされるヘパラナーゼタンパク質が構成的に活性である、合成哺乳類ヘパラナーゼ核酸分子。
【請求項１２】
タンパク質コード部分が、ヒトヘパラナーゼをコードする、請求項１１に記載の遺伝子。
【請求項１３】
リンカーが、ヒアルロニダーゼタンパク質の中央ループ領域をコードするヌクレオチドの配列を含む、請求項１１に記載の遺伝子。
【請求項１４】
ヒアルロニダーゼが、Ｈ．マニレンシス（Ｈ．ｍａｎｉｌｌｅｎｓｉｓ）由来である、請求項１３に記載の遺伝子。
【請求項１５】
リンカーが、（ＧｌｙＳｅｒ）３リンカーをコードするヌクレオチドの配列を含む、請求項１２に記載の遺伝子。
【請求項１６】
請求項１２に記載の遺伝子を含むベクター。
【請求項１７】
請求項１６に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１８】
昆虫細胞又は酵母細胞である、請求項１７に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１２に記載の遺伝子によりコードされる、精製された合成ヘパラナーゼタンパク質。
【請求項２０】
（ａ）哺乳類ヘパラナーゼタンパク質をコードし、エンドプロテアーゼにより認識される２個のコンセンサス切断部位を含み、該切断部位が前記ヘパラナーゼタンパク質の残基１００と残基１６８との間に位置するヌクレオチドの配列を含むベクターを用いて、非哺乳類細胞に対して形質転換又は形質移入を行うことと；
（ｂ）前記ヘパラナーゼタンパク質の発現を可能にする条件下で前記宿主細胞を培養することと；
（ｃ）前記細胞を崩壊させて、少なくとも部分的に前記ヘパラナーゼタンパク質を精製することと；
（ｄ）少なくとも部分的に精製したヘパラナーゼタンパク質をエンドプロテアーゼに曝露し、前記ヘパラナーゼタンパク質を前記コンセンサス切断部位で切断することと、を含む、非哺乳類細胞において哺乳類ヘパラナーゼを発現させる方法。
【請求項２１】
ヘパラナーゼがヒトである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
（ａ）ヘパラナーゼタンパク質をコードする部分を含み、該タンパク質コード部分が、約８ｋＤａのＮ−末端断片をコードするヌクレオチドの配列と、リンカーをコードするヌクレオチドの配列と、約５０ｋＤａのＣ−末端断片をコードするヌクレオチドの配列と、から実質的になり、前記Ｎ−末端及びＣ−末端断片が、野生型断片と実質的に同様であるタンパク質断片をコードする、合成哺乳類ヘパラナーゼ遺伝子を含むベクターを用いて、非哺乳類細胞に対して形質転換又は形質移入を行うことと；
（ｂ）前記ヘパラナーゼタンパク質の発現を可能にする条件下で前記宿主細胞を培養することと、を含む、非哺乳類細胞において、１本鎖の、構成的に活性な哺乳類ヘパラナーゼを発現させる方法。
【請求項２３】
リンカーが、ヒアルロニダーゼタンパク質の中央ループ領域を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
リンカーが、中央（ＧｌｙＳｅｒ）３を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
請求項２２に記載の方法により産生される実質的に純粋なタンパク質。
【請求項１】
哺乳類ヘパラナーゼタンパク質をコードするヌクレオチドの配列を含み、該ヌクレオチドの配列が、エンドプロテアーゼにより認識される２個のコンセンサス切断部位を含み、該切断部位が、前記ヘパラナーゼタンパク質の残基１００及び残基１６８をコードするヌクレオチド間に位置する、合成核酸分子。
【請求項２】
請求項１に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項３】
ベクターがバキュロウイルスベクターである、請求項２に記載のベクター。
【請求項４】
請求項３に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項５】
宿主細胞が、昆虫細胞である、請求項４に記載の宿主細胞。
【請求項６】
宿主細胞が、酵母細胞である、請求項４に記載の宿主細胞。
【請求項７】
酵母が、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（ピキア パストリス）、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（ハンセヌラ ポリモルファ）及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｖｉｓｉａｅ（サッカロミセス セルビシエ）からなる群から選択される、請求項６に記載の宿主細胞。
【請求項８】
ヘパラナーゼタンパク質が、ヒトヘパラナーゼである、請求項１に記載の合成核酸分子。
【請求項９】
コンセンサス切断部位が、ヒトヘパラナーゼタンパク質の残基Ｇ１１０及びＫ１５８の前に位置する、請求項８に記載の合成核酸分子。
【請求項１０】
コンセンサス切断部位が、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位、ピコルナウイルスの３Ｃプロテアーゼ切断部位、トロンビンプロテアーゼ切断部位、エンテロキナーゼ切断部位及び因子Ｘａ切断部位からなる群から選択される、請求項８に記載の合成核酸分子。
【請求項１１】
哺乳類ヘパラナーゼタンパク質をコードする部分を含み、該タンパク質コード部分が、約８ｋＤａのＮ−末端断片をコードするヌクレオチドの配列と、リンカーと、約５０ｋＤａのＣ−末端断片をコードするヌクレオチドの配列と、から実質的になり、前記Ｎ−末端及びＣ−末端断片が、野生型ヘパラナーゼ断片と実質的に同様であるタンパク質断片をコードし、該コードされるヘパラナーゼタンパク質が構成的に活性である、合成哺乳類ヘパラナーゼ核酸分子。
【請求項１２】
タンパク質コード部分が、ヒトヘパラナーゼをコードする、請求項１１に記載の遺伝子。
【請求項１３】
リンカーが、ヒアルロニダーゼタンパク質の中央ループ領域をコードするヌクレオチドの配列を含む、請求項１１に記載の遺伝子。
【請求項１４】
ヒアルロニダーゼが、Ｈ．マニレンシス（Ｈ．ｍａｎｉｌｌｅｎｓｉｓ）由来である、請求項１３に記載の遺伝子。
【請求項１５】
リンカーが、（ＧｌｙＳｅｒ）３リンカーをコードするヌクレオチドの配列を含む、請求項１２に記載の遺伝子。
【請求項１６】
請求項１２に記載の遺伝子を含むベクター。
【請求項１７】
請求項１６に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１８】
昆虫細胞又は酵母細胞である、請求項１７に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１２に記載の遺伝子によりコードされる、精製された合成ヘパラナーゼタンパク質。
【請求項２０】
（ａ）哺乳類ヘパラナーゼタンパク質をコードし、エンドプロテアーゼにより認識される２個のコンセンサス切断部位を含み、該切断部位が前記ヘパラナーゼタンパク質の残基１００と残基１６８との間に位置するヌクレオチドの配列を含むベクターを用いて、非哺乳類細胞に対して形質転換又は形質移入を行うことと；
（ｂ）前記ヘパラナーゼタンパク質の発現を可能にする条件下で前記宿主細胞を培養することと；
（ｃ）前記細胞を崩壊させて、少なくとも部分的に前記ヘパラナーゼタンパク質を精製することと；
（ｄ）少なくとも部分的に精製したヘパラナーゼタンパク質をエンドプロテアーゼに曝露し、前記ヘパラナーゼタンパク質を前記コンセンサス切断部位で切断することと、を含む、非哺乳類細胞において哺乳類ヘパラナーゼを発現させる方法。
【請求項２１】
ヘパラナーゼがヒトである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
（ａ）ヘパラナーゼタンパク質をコードする部分を含み、該タンパク質コード部分が、約８ｋＤａのＮ−末端断片をコードするヌクレオチドの配列と、リンカーをコードするヌクレオチドの配列と、約５０ｋＤａのＣ−末端断片をコードするヌクレオチドの配列と、から実質的になり、前記Ｎ−末端及びＣ−末端断片が、野生型断片と実質的に同様であるタンパク質断片をコードする、合成哺乳類ヘパラナーゼ遺伝子を含むベクターを用いて、非哺乳類細胞に対して形質転換又は形質移入を行うことと；
（ｂ）前記ヘパラナーゼタンパク質の発現を可能にする条件下で前記宿主細胞を培養することと、を含む、非哺乳類細胞において、１本鎖の、構成的に活性な哺乳類ヘパラナーゼを発現させる方法。
【請求項２３】
リンカーが、ヒアルロニダーゼタンパク質の中央ループ領域を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
リンカーが、中央（ＧｌｙＳｅｒ）３を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
請求項２２に記載の方法により産生される実質的に純粋なタンパク質。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ−１】
【図３Ａ−２】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ−１】
【図３Ａ−２】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【公表番号】特表２００７−５０６４１６（Ｐ２００７−５０６４１６Ａ）
【公表日】平成１９年３月２２日（２００７．３．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５２７３２８（Ｐ２００６−５２７３２８）
【出願日】平成１６年９月１７日（２００４．９．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１０５１７
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０３０９６２
【国際公開日】平成１７年４月７日（２００５．４．７）
【出願人】（５０１２０９４２７）イステイチユート・デイ・リチエルケ・デイ・ビオロジア・モレコラーレ・ピ・アンジエレツテイ・エツセ・ピー・アー (90)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年３月２２日（２００７．３．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年９月１７日（２００４．９．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１０５１７
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０３０９６２
【国際公開日】平成１７年４月７日（２００５．４．７）
【出願人】（５０１２０９４２７）イステイチユート・デイ・リチエルケ・デイ・ビオロジア・モレコラーレ・ピ・アンジエレツテイ・エツセ・ピー・アー (90)
【Ｆターム（参考）】
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