合成リポペプチドおよびその医薬用途
【課題】現在有効な予防手段がないマイコプラズマ肺炎に対し、安全かつ有効なワクチンの開発に資する抗原および当該抗原を用いるワクチンなどを提供する。
【解決手段】Ｓ−（２，３−ビスパルミトイルオキシプロピル）システイニルペプチドおよびＳ−（２，３−ビスパルミトイルオキシプロピル）−Ｎ−パルミトイル−システイニルペプチドを代表とするマイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に由来する合成リポペプチド、当該リポペプチドを含有するトールライクレセプターの活性化剤、当該リポペプチドを含有する転写因子誘導剤、当該リポペプチドおよび医薬として許容され得る担体を含有するワクチン組成物。
【解決手段】Ｓ−（２，３−ビスパルミトイルオキシプロピル）システイニルペプチドおよびＳ−（２，３−ビスパルミトイルオキシプロピル）−Ｎ−パルミトイル−システイニルペプチドを代表とするマイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に由来する合成リポペプチド、当該リポペプチドを含有するトールライクレセプターの活性化剤、当該リポペプチドを含有する転写因子誘導剤、当該リポペプチドおよび医薬として許容され得る担体を含有するワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、感染症予防に適用しうる新規な合成リポペプチドおよびそれを有効成分として含有してなるワクチン組成物などに関する。
【背景技術】
【０００２】
マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）は、マイコプラズマ肺炎の起因菌である。この起因菌は、気管支上皮細胞に付着した後、サイトカインをはじめ、様々な宿主免疫応答を誘導するが、その機序は明らかになっていない。当該菌は、直径１２５〜１５３ｎｍ程度でウィルス程度の小さな病原体であるが、増殖するためにはウィルスとは異なり生きた細胞を必要とせず、また、一部の抗生物質が有効だったことから、細菌に分類されていた時期もあるが、最近では別の綱に分類されている。
【０００３】
マイコプラズマ属の菌は、細菌の特徴である細胞壁を持っていない。細菌感染症治療の第一選択として使われるβ−ラクタム系の抗生物質（ペニシリン系、セフェム系など）は細菌の細胞壁を障害して菌を殺す作用を持つが、細胞壁を持たないマイコプラズマには無効である。有効な抗生物質は、タンパク合成阻害剤のマクロライド系抗生剤やテトラサイクリン系抗生物質、またはＤＮＡ複製を抑制するニューキノロン系抗生物質である。
【０００４】
臨床の現場では、臨床症状から判断してマイコプラズマ感染症が疑われた場合、マクロライドなどのタンパク質合成阻害剤が処方されている。しかし、これら抗生物質の多用により、抗生物質抵抗性のマイコプラズマ・ニューモニエの出現が報告されている。本症の治療において、早期診断・早期治療をすることが病状の遷延化や流行を防止するために必要とされるが、診断が確定するまでの日数がかかる場合が多い。近年、細菌性肺炎が激減した中で、肺炎全体に占めるマイコプラズマ肺炎の比率は高まっている。
【０００５】
一方、非特許文献１に記載されているように、トールライクレセプター（Ｔｏｌｌ Ｌｉｋｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＬＲ））と呼ばれる受容体ファミリーが細菌の様々な菌体成分を認識し、最終的に転写因子であるＮＦ−κＢを活性化することにより自然免疫を誘導することが報告されている。
【０００６】
本発明者らは、既にマイコプラズマ・ニューモニエ由来のＦ０Ｆ１型ＡＴＰアーゼのサブユニットｂであるリポプロテイン（非特許文献２）が、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２およびＴＬＲ６依存的に転写因子ＮＦ−κＢを活性化することを報告し（非特許文献３）、特許出願（特願２００５−１５２０６８、ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３１０８３０）を行った。さらに、当該リポプロテインの一部を合成し、得られたＦＡＭ−２０、ＦＡＭ−５と称する化合物を含む合成リポペプチド類が、天然型のリポプロテインと同等の活性を示すことを見出し、特許出願（特願２００５−３１１９６６）を行った。
【０００７】
【非特許文献１】Ａｋｉｒａ，Ｓ．＆Ｔａｋｅｄａ，Ｋ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．４，ｐｐ．４９９−５１１（２００４）
【非特許文献２】Ｇｅｏｒｇｅ Ｐｙｒｏｗｏｌａｋｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２６７３，Ｎｏ．３８，Ｉｓｓｕｅ ｏｆ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １８，ｐｐ．２４７９２−２４７９６（１９９８）
【非特許文献３】Ｔａｋａｓｈｉ Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｙｕｔａｋａ Ｋｉｄａ ａｎｄ Ｋｏｉｃｈｉ Ｋｕｗａｎｏ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１７５：４６４１−４６４６（２００５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、現在有効な予防手段がないマイコプラズマ肺炎に対し、さらに安全かつ有効なワクチンの開発に資する合成リポペプチドおよび当該合成リポペプチドを含有してなるワクチン組成物等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、転写因子ＮＦ−κＢを有効に活性化させるマイコプラズマ・ニューモニエ由来の菌体構成物質をさらに鋭意探索し、ＮＦ−κＢを活性化するリポプロテインＮ−ＡＬＰ１およびＮ−ＡＬＰ２を単離、精製することに成功し（図１）、本発明を完成するに至った。
本発明は、以下のものを提供する：
［１］下記式（１）
【００１０】
【化１】
【００１１】
（式中、
Ｘは、配列番号３または４で表されるアミノ酸配列を有するペプチド部分であり、
Ｙは、水素またはＲ３ＣＯであり、
Ｒ１ＣＯ、Ｒ２ＣＯおよびＲ３ＣＯは、同一または異なって、アシル基を示し、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、水素、または炭素数１から２９までのアルキル基を示す）
で表されるリポペプチド。
［２］前記Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が、炭素数７から１９までのアルキル基である、［１］記載のリポペプチド。
［３］前記Ｒ１ＣＯ、Ｒ２ＣＯおよびＲ３ＣＯが、パルミトイル基である、［１］または［２］に記載のリポペプチド。
［４］下記式（２）
【００１２】
【化２】
【００１３】
（式中、
Ｘ’は、配列番号１〜４のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するペプチド部分であり、
Ｙは、水素またはＲ３ＣＯであり、
Ｒ１ＣＯ、Ｒ２ＣＯおよびＲ３ＣＯは、同一または異なって、アシル基を示し、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、水素、または炭素数１から２９までのアルキル基を示す）
で表されるリポペプチドを含有する、トールライクレセプター（ＴＬＲ）の活性化剤。
［５］前記ＴＬＲが、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２およびＴＬＲ６からなる群より選ばれる少なくとも１種である、［４］記載の活性化剤。
［６］下記式（２）
【００１４】
【化３】
【００１５】
（式中、
Ｘ’は、配列番号１〜４のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するペプチド部分であり、
Ｙは、水素またはＲ３ＣＯであり、
Ｒ１ＣＯ、Ｒ２ＣＯおよびＲ３ＣＯは、同一または異なって、アシル基を示し、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、水素、または炭素数１から２９までのアルキル基を示す）
で表されるリポペプチドを含有する、転写因子誘導剤。
［７］前記転写因子がＮＦ−κＢである、［６］記載の転写因子誘導剤。
［８］下記式（２）
【００１６】
【化４】
【００１７】
（式中、
Ｘ’は、配列番号１〜４のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するペプチド部分であり、
Ｙは、水素またはＲ３ＣＯであり、
Ｒ１ＣＯ、Ｒ２ＣＯおよびＲ３ＣＯは、同一または異なって、アシル基を示し、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、水素、または炭素数１から２９までのアルキル基を示す）
で表されるリポペプチドおよび医薬として許容され得る担体を含有する、ワクチン組成物。
［９］アジュバントをさらに含有する、［８］記載の組成物。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のリポペプチドは、マイコプラズマ・ニューモニエ由来のリポプロテインＮ−ＡＬＰ１およびＮ−ＡＬＰ２を最適化することにより得られたものである。本発明のリポペプチドおよびＴＬＲの活性化剤は、マイコプラズマ肺炎の発症機序の解明、ならびに、ＴＬＲを介した先天性免疫応答の研究の進展に寄与することができる。本発明の活性化剤は、ＴＬＲを介した免疫賦活剤としても有用である。
【００１９】
本発明の転写因子誘導剤によれば、マイコプラズマ感染における宿主応答およびマイコプラズマ肺炎の発症機序の解明、ならびに、ＴＬＲを介してＮＦ−κＢが関与する転写誘導の研究の進展に寄与することができる。
【００２０】
本発明のワクチン組成物によれば、従来有効な予防および改善手段が存在していなかったマイコプラズマ肺炎を予防し、またはその症状を軽減することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明において、マイコプラズマ・ニューモニエとは、ヒトマイコプラズマ肺炎の起因菌であり、現在までに単離・同定された菌株ばかりでなく、現在未同定であってもマイコプラズマ肺炎の発症に関与する限り、これらすべての菌を包含するものである。当該マイコプラズマは、抗生物質耐性菌株であってもよい。
【００２２】
本発明のリポペプチドは、下記式（１）
【００２３】
【化５】
【００２４】
で表される。
【００２５】
式（１）中、ペプチド部分Ｘは、そのアミノ酸配列のＮ末端に位置するアミノ酸（Ａｌａ）を介してシステイン残基とペプチド結合し、該システイン残基は、その側鎖に由来するＳを介して、プロピル誘導体とスルフィドを形成している。
本発明においては、アミノ酸はＬ体、Ｄ体およびＤＬ体を包含するものであるが、通常、Ｌ体を用いる。前記プロピル誘導体中の不斉中心は、Ｒ配置、Ｓ配置、またはＲＳ配置のいずれであってもよい。
【００２６】
式（１）中、Ｘは、配列番号３または配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するペプチド部分である。
【００２７】
前記アミノ酸配列において、１ないし数個のアミノ酸残基が置換または付加されたアミノ酸配列からなる変異ペプチドも、式（１）のリポペプチドが自然免疫を誘導する限りにおいて本発明に含まれる。ここで、自然免疫の誘導は、後述するレポーターアッセイによりＴＬＲの発現を介してＮＦ−κＢの発現の程度を指標にすることができる。
【００２８】
１ないし数個（好ましくは１または２個）のアミノ酸残基の置換としては、保存的アミノ酸置換が挙げられる。保存的アミノ酸置換とは、特定のアミノ酸を、そのアミノ酸の側鎖と同様の性質の側鎖を有するアミノ酸で置換することをいう。具体的には、保存的アミノ酸置換では、特定のアミノ酸は、そのアミノ酸と同じグループに属する他のアミノ酸により置換される。同様の性質の側鎖を有するアミノ酸のグループは、当該分野で公知である。例えば、このようなアミノ酸のグループとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、中性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）が挙げられる。また、中性側鎖を有するアミノ酸は、さらに、極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、および非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）に分類することもできる。また、他のグループとして、例えば、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）、水酸基（アルコール性水酸基、フェノール性水酸基）を含む側鎖を有するアミノ酸（例えば、セリン、トレオニン、チロシン）なども挙げることができる。
【００２９】
１ないし数個（好ましくは１または２個）のアミノ酸残基の付加としては、配列番号３および４に示すアミノ酸配列のＣ末端側に、例えば、Ｌｅｕ Ｌｅｕ ＴｒｐまたはＬｅｕ Ｔｒｐ Ｖａｌからなるアミノ酸残基を付加することが挙げられる。また、リポペプチドの水溶解性を増強するため、アミノ酸配列のＣ末端側に塩基性アミノ酸であるアルギニン（Ａｒｇ）またはリジン（Ｌｙｓ）を３ないし４残基付加してもよい。
【００３０】
さらに、前記アミノ酸配列において、１ないし数個（好ましくは１〜１０個）のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列からなる変異ペプチドも、式（１）のリポペプチドが自然免疫を誘導する限りにおいて本発明に含まれる。
【００３１】
１ないし数個のアミノ酸残基の欠失としては、配列番号３および４に示すアミノ酸配列の中から、任意（好ましくは１または２個）のアミノ酸残基を選択して欠失させることが挙げられる。あるいは、配列番号３または４のアミノ酸配列において、示されるアミノ酸配列のＣ末端から連続して数個のアミノ酸配列の欠失であってもよく、例えば３〜１０個の欠失が例示される。
【００３２】
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、同一または異なって、水素、炭素数１から２９までのアルキル基であるが、当該アルキル基は不飽和結合（二重結合、三重結合）を任意の数有していてもよく、従って、炭素数２から２９までのアルケニルまたはアルキニル基も本発明の炭素数２から２９までのアルキル基に包含される。これらは、直鎖状であっても分岐鎖状であってもよく、また環状であってもよい。さらに、鎖中にシクロプロパン環などの環を含んでいてもよい。本発明においては、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、生体内で自然免疫を効率的に誘導するという観点から、飽和脂肪酸を構成する炭素数１から２９までのアルキル基が好ましく、より好ましくは炭素数７から１９までのアルキル基であり、具体的には、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシルなどが挙げられる。
【００３３】
Ｙは、水素またはＲ３ＣＯである。
なお、本明細書中、Ｙが水素の場合の式（１）（または後述の式（２））の化合物を「ジアシル体」とも称し、ＹがＲ３ＣＯである場合の式（１）（または後述の式（２））の化合物を「トリアシル体」とも称する。
【００３４】
Ｒ１ＣＯ、Ｒ２ＣＯおよびＲ３ＣＯは、同一または異なって、アシル基であり、好ましくは同一のアシル基である。アシル基はそれぞれ飽和でも不飽和でもよく、具体的には、オクタノイル、ノナノイル、デカノイル、ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル、ベヘノイル、シス−バクセノイル、９，１０−メチレン−ヘキサデカノイル、パルミトレイルなどが好適な例として挙げられる。中でも、マイコプラズマ・ニューモニエ菌体で見出されるリポプロテインの構成成分である、パルミトイル基が最も好ましい。
【００３５】
本発明の好ましいリポペプチドは、下記式
【００３６】
【化６】
【００３７】
および
【００３８】
【化７】
【００３９】
で表される、Ｓ−（２，３−ビスパルミトイルオキシプロピル）システイニルペプチド（ジアシル体；ここで、ペプチドは配列番号３または配列番号４で表されるアミノ酸配列を有する）ならびに下記式
【００４０】
【化８】
【００４１】
および
【００４２】
【化９】
【００４３】
で表される、Ｓ−（２，３−ビスパルミトイルオキシプロピル）−Ｎ−パルミトイル−システイニルペプチド（トリアシル体）
ここで、上記化６〜化９の構造式におけるペプチド鎖を構成する各記号は、以下のアミノ酸の残基を意味する。Ａ：アラニン；Ｅ：グルタミン酸；Ｆ：フェニルアラニン；Ｇ：グリシン；Ｉ：イソロイシン；Ｋ：リジン；Ｌ：ロイシン；Ｎ：アスパラギン；Ｐ：プロリン；Ｑ：グルタミン；Ｒ：アルギニン；Ｓ：セリン；Ｔ：トレオニン；Ｖ：バリン；Ｙ：チロシン。
【００４４】
上記４種のリポペプチドは、実施例に記載した方法により製造することができる。また、他のリポペプチドも、該当する脂肪酸（オクタン酸、デカン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸等）を用いて、実施例に準じた方法により、当業者であれば容易に合成することができる。
【００４５】
本発明は、下記式（２）
【００４６】
【化１０】
【００４７】
で表されるリポペプチドを含有する、トールライクレセプター（ＴＬＲ）の活性化剤を提供する。
【００４８】
式（２）中、Ｘ’は、そのアミノ酸配列のＮ末端に位置するアミノ酸（Ａｌａ）を介してシステイン残基とペプチド結合し、該システイン残基は、その側鎖に由来するＳを介して、プロピル誘導体とスルフィドを形成している。該プロピル誘導体中の不斉中心は、Ｒ配置、Ｓ配置、またはＲＳ配置のいずれであってもよい。
【００４９】
式（２）中、Ｘ’は、配列番号１〜４のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するペプチド部分である。配列番号３または４のアミノ酸配列を有するペプチド部分は、式（１）のＸにおいて説明した通りである。
【００５０】
また、前記配列番号１または２のアミノ酸配列において、１ないし数個のアミノ酸残基が置換または付加されたアミノ酸配列からなる変異ペプチドも、式（２）のリポペプチドが自然免疫を誘導する限りにおいて本発明に含まれる。ここで、自然免疫の誘導は、後述するレポーターアッセイによりＴＬＲの発現を介したＮＦ−κＢの発現の程度を指標にすることができる。
【００５１】
ここで、１ないし数個（好ましくは１または２個）のアミノ酸残基の置換または１ないし数個（好ましくは１〜４個）のアミノ酸残基の付加としては、式（１）の化合物のＸにおいて挙げられた、アミノ酸残基の置換または付加が挙げられる。
【００５２】
さらに、前記配列番号１または２のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列からなる変異ペプチドも、式（１）のリポペプチドが自然免疫を誘導する限りにおいて本発明に含まれる。
【００５３】
１以上（好ましくは１〜３４５個または１〜２９２個）のアミノ酸残基の欠失としては、配列番号１または２に示すいずれかのアミノ酸配列の中から、任意のアミノ酸残基を選択して欠失させることが挙げられる。あるいは、配列番号１または２のアミノ酸配列において、示されるアミノ酸配列のＣ末端から連続して数個〜数百個のアミノ酸配列の欠失であってもよく、例えばそれぞれ３〜３４５個または３〜２９２個の欠失が例示される。
【００５４】
式（２）中、Ｙ、Ｒ１ＣＯ、Ｒ２ＣＯおよびＲ３ＣＯ、ならびにＲ１、Ｒ２およびＲ３は、式（１）の化合物で説明したとおりである。
【００５５】
式（２）で表されるリポペプチドのうち、ペプチドが配列番号３または配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するリポペプチドは、式（１）で表されるリポペプチドと同様の方法で製造することができる。
【００５６】
また、式（２）で表されるリポペプチドのうち、ペプチドが配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するリポペプチドも、式（１）で表されるリポペプチドと同様の方法で製造することができる。このうち、ＹがＲ３ＣＯであるリポペプチドは、天然のリポプロテインＮ−ＡＬＰ１またはＮ−ＡＬＰ２と同様の構造を有すると推定されるため（本願実施例参照）、マイコプラズマの菌体成分を抽出し、ついで分画し、精製することによっても得られる。
【００５７】
菌体成分の抽出方法としては、通常、超音波破砕、各種界面活性剤による溶解などの方法が用いられる。界面活性剤による溶解方法としては、好ましくは、菌体をＴｒｉｔｏｎ−Ｘ（登録商標）１１４（以下、ＴＸ−１１４と略する）で処理する方法が挙げられる。ＴＸ−１１４は、Ｓｉｇｍａ社から市販されている。ＴＸ−１１４は、その水溶物が３７℃で水層と界面活性剤層に分離することから、菌体のタンパク質を親水性と疎水性のものに分離するのに適している。具体例として、２％ＴＸ−１１４水溶液にマイコプラズマの菌体を溶解し、約１２，０００ｒｐｍ、３７℃で約５分間遠心分離することにより水層と界面活性剤層に分離することができる。界面活性剤層を分取し、これにメタノールを加えることによりタンパク質を析出させ、遠心分離により上清を回収して可溶画分として得ることができる。このようにして得られた可溶画分は、膜結合リポプロテイン（ＬＡＭＰ）を豊富に含有しており、これを分画することにより、活性成分が得られる。分画は通常、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（μＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ Ｃ１８ ３００Ａ（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）溶出条件：０％から１００％の２−プロパノールのリニアグラジエント、液量は１ｍｌ／ｍｉｎ、溶出時間：好ましくは６０分程度）にて行うのが好ましい。得られた画分のＴＬＲの活性化は、後述するレポーターベクターを用いたレポーターアッセイにより確認することができる。
【００５８】
さらに、式（２）で表されるリポペプチドのうち、ペプチドが配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するリポペプチドは、常法により、菌体成分から得られたＮ−ＡＬＰ遺伝子と、任意の発現ベクターとを用いて構築したＮ−ＡＬＰ発現ベクターにより発現、精製したＮ−ＡＬＰを用いて製造することもできる。
【００５９】
本発明において、トールライクレセプター（ＴＬＲ）とは、微生物の侵入や感染を防御するため、先天性免疫（自然免疫ともいう）の誘導経路に介在する受容体ファミリーである。ヒトＴＬＲファミリーは、ＴＬＲ１〜１１のメンバーから構成されている。
【００６０】
本発明のＴＬＲ活性化剤により活性化されるＴＬＲは、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２およびＴＬＲ６を活性化させることが好ましい。特に、本発明の剤が含む式（２）の化合物において、ジアシル体の場合は、本発明のＴＬＲ活性化剤は、ＴＬＲ１およびＴＬＲ２、ＴＬＲ２およびＴＬＲ６を活性化することができ、一方、式（２）で表される化合物において、トリアシル体の場合は、ＴＬＲ１およびＴＬＲ２を選択的に活性化することができる。
【００６１】
本発明のリポペプチドのうち、ジアシル体は、他のマイコプラズマ（マイコプラズマ・ファーメンタスおよびマイコプラズマ・サリバリウム）由来の、Ｎ−アシル化されないリポプロテインまたはリポペプチド（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：６５３８−４４（２０００）およびＪ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：１９５１−８（１９９７）参照）と同様に、ＴＬＲ１およびＴＬＲ２に加えて、ＴＬＲ２およびＴＬＲ６をも活性化するものであるが、トリアシル体は、ＴＬＲ１およびＴＬＲ２のみを活性化することができる。
【００６２】
ＴＬＲを介した自然免疫の誘導は、その後の獲得免疫にも重要な役割を担うことから、本発明により得られるＴＬＲ活性化剤は、マイコプラズマ肺炎の予防または症状軽減への開発応用が期待される。例えば、本発明の剤は、ＴＬＲシグナル経路を阻害することが可能な抗体の産生を誘導するため、ワクチン接種用注射剤の候補となり得る。
【００６３】
本発明は、式（２）で表されるリポペプチドを含有する、転写因子誘導剤を提供する。式（２）で表されるリポペプチドは、前記定義した通りである。
【００６４】
式（２）で表されるリポペプチドは、ＴＬＲを活性化するため、ＴＬＲを介したシグナル伝達機構に関与する。従って、本発明の転写因子誘導剤は、ＴＬＲを介したシグナル伝達により、そのシグナルの下流に位置する転写因子を誘導する作用を有する。このような転写因子としては、ＴＬＲのシグナル経路に関与する因子であれば特に限定されるものではないが、ＮＦ−κＢが好ましい。なお、ＮＦ−κＢは、炎症や免疫反応に関与する炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８など）や接着因子（ＶＣＡＭ、ＩＣＡＭ、ＥＬＡＭなど）の遺伝子を制御する遺伝子に結合し、これらの働きを制御する転写因子である。
【００６５】
式（２）で表されるリポペプチドを含有する、ＴＬＲ活性化剤および転写因子誘導剤の作用は、レポーターアッセイにより測定することができる。具体的には、ＴＬＲおよびドミナントネガティブＴＬＲを、腎臓由来の細胞株でベクターの導入効率が高いという特徴をもつ２９３Ｔ細胞に発現（ドミナントネガティブ発現ベクターは、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ１（Ｓｉｇｍａ）にＴＬＲ１およびＴＬＲ６のＴＩＲドメインを欠損させたものを導入して作製することができる）させることにより確認することができる。
【００６６】
詳しくは、１〜４×１０５個の２９３Ｔ細胞に０．１μｇのレポーターベクター（転写因子ＮＦ−κＢ結合領域の下流にルシフェラーゼ遺伝子を結合させたベクター等）をＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて導入し、すでにＴＬＲ１とＴＬＲ２、およびＴＬＲ２とＴＬＲ６に依存的にＮＦ−κＢを誘導することがそれぞれ知られている（Ｓ）−［２，３−Ｂｉｓ（ｐａｌｍｉｔｏｙｌｏｘｙ）−（２−ＲＳ）−ｐｒｏｐｙｌ］−Ｎ−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−（Ｒ）−Ｃｙｓ−（Ｓ）−Ｓｅｒ−（Ｓ）−Ｌｙｓ４−ＯＨ・３ＨＣｌ（Ｐａｍ３ＣＳＫ４，ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＭ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅ ２（ＭＡＬＰ−２、松本美佐子博士（大阪府立成人病センター）から分与。Ｎｉｓｈｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．，Ｍ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｔ．Ｔａｋａｏ，Ｍ．Ｈｏｓｈｉｎｏ，Ｙ．Ｓｈｉｍｏｎｉｓｈｉ，Ｓ．Ｔｓｕｊｉ，Ｎ．Ａ．Ｂｅｇｕｍ，Ｏ．Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｓ．Ａｋｉｒａ，Ｋ．Ｔｏｙｏｓｈｉｍａ，ａｎｄ Ｔ．Ｓｅｙａ．２００１．，Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｍ１６１ Ａｇ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２：ｒｏｌｅ ｏｆ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｐｏｒｔｉｏｎ ｉｎ ｉｔｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：２６１０）で刺激し、レポーターの発現量（例えば、ルシフェラーゼ活性）の上昇を測定することにより、ＴＬＲ１およびＴＬＲ６の発現を確認することができる。
【００６７】
本発明の活性化剤または誘導剤を含有する試料を、転写因子ＮＦ−κＢ結合領域の下流にルシフェラーゼ遺伝子を結合させたレポーターベクター（たとえば、市販されているｐＮＦ−κＢ−ｌｕｃ（Ｓｉｇｍａ））を導入した細胞と接触させ、ＴＬＲの活性化を介したＮＦ−κＢの誘導能をルシフェラーゼ活性の測定により確認することができる。一例としては、４×１０５個の２９３Ｔ細胞に０．１μｇのレポーターベクターｐＮＦ−κＢ−ｌｕｃ（Ｓｉｇｍａ）をＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて導入し、４８時間後、前記試料を最終濃度０．５％になるように添加し、８時間経過後、ルシフェラーゼ活性をＤｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により測定する方法が挙げられる。
【００６８】
本発明のＴＬＲ活性化剤または転写因子誘導剤に含まれる式（２）で表されるリポペプチドの含有量は、通常、０．０１〜１００重量％、好ましくは０．１〜９０重量％、より好ましくは１〜１０重量％である。また、本発明の剤は、天然のリポプロテインＮ−ＡＬＰ１および／またはＮ−ＡＬＰ２そのものであってもよい。
【００６９】
本発明の活性化剤または誘導剤は、さらに任意の担体を含んでいても良い。例えば、注射剤や研究用試薬として液剤を製造する場合、当該担体としては、安息香酸ナトリウム等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム等の安定剤、水、生理食塩水等の希釈剤等およびこれらの組合せが挙げられるが、それらに限定されない。また、本発明の活性化剤または誘導剤の剤形としては、注射剤や研究用試薬としての使用に適した剤形であることが好ましく、例えば液剤（例、注射剤、点滴剤等）または固体（凍結乾燥製剤を含む）が挙げられるが、それらに限定されない。
【００７０】
本発明の活性化剤または誘導剤は、前記リポペプチドを有効成分として、常法により製造することができる。
【００７１】
本発明の剤が含む好ましいリポペプチドは、Ｓ−（２，３−ビスパルミトイルオキシプロピル）システイニルペプチド（ジアシル体；ここで、ペプチドは配列番号１〜４で表されるアミノ酸配列を有する）およびＳ−（２，３−ビスパルミトイルオキシプロピル）−Ｎ−パルミトイル−システイニルペプチド（トリアシル体；ここで、ペプチドは配列番号１〜４で表されるアミノ酸配列を有する）である。これらのリポペプチドは、単独で、または２種以上を組み合わせて本発明の剤に含んでいてもよい。
【００７２】
また、配列番号１および２で表されるアミノ酸配列を有するペプチドは、実施例に記載された方法で合成しても、マイコプラズマ・ニューモニエのＬＡＭＰから抽出してもよく、またＮ−ＡＬＰ発現ベクターを用いて発現、精製してもよい。
【００７３】
本発明の活性化剤または誘導剤が作用する細胞としては特に限定されず、ＴＬＲを発現していることが従来公知な細胞または将来発見され得る細胞全てが含まれる。中でもＴＬＲ１、ＴＬＲ２およびＴＬＲ６を発現している細胞が好ましく、例えば、樹状細胞、マクロファージが挙げられる。
【００７４】
本発明は、式（２）で表されるリポペプチドおよび医薬として許容され得る担体を含有する、ワクチン組成物を提供する。
【００７５】
式（２）で表されるリポペプチドは、前記定義した通りである。当該リポペプチドは１種のみを選択してもよいが、ワクチン組成物においては、２種以上のリポペプチドを適宜選択して含有するワクチン組成物が好ましい。さらには、マイコプラズマ・ニューモニエ由来のＮ−ＡＬＰ１および／またはＮ−ＡＬＰ２を含有していてもよい。抗原として多種類のリポペプチドを含有するワクチン組成物は、様々な接種対象者における獲得免疫を惹起させることが可能である。
【００７６】
前記医薬として許容され得る担体としては、ワクチンの製造に通常用いられる担体を限定なく使用することができ、具体的には、食塩水、緩衝化食塩水、デキストロース、水、グリセロール、等張水性緩衝液およびそれらの組合せが挙げられる。担体は、好ましくは滅菌されたものである。また、これに乳化剤、保存剤（例、チメロサール）、等張化剤、ｐＨ調整剤および不活化剤（例、ホルマリン）等が適宜配合される。
【００７７】
本発明の組成物は、ワクチンの投与様式に適合した形態を有することが好ましく、例えば、注射可能な形態として、溶液、懸濁液または乳化液が挙げられる。あるいは、液体溶液、懸濁液または乳化液に供せられる形態として、凍結乾燥製剤等の固体形態が挙げられる。
【００７８】
本発明の組成物は、製薬上許容可能で且つ活性成分と相溶性であるアジュバントをさらに含有することが好ましい。アジュバントは、一般には、宿主の免疫応答を非特異的に増強する物質であり、多数の種々のアジュバントが当技術分野で公知である。アジュバントの例としては以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン、Ｑｕｉｌｌ Ａ（登録商標）、リゾレシチン、サポニン誘導体、プルロニックポリオール、モンタニドＩＳＡ−５０（Ｓｅｐｐｉｃ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）、Ｂａｙｏｌ（登録商標）およびＭａｒｋｏｌ（登録商標）。
【００７９】
ワクチン組成物は、前記リポペプチドを有効成分として、前記担体および好ましくはアジュバントとともに常法により製造することができる。当該リポペプチドは、ワクチン中に０．００１〜９９．９重量％含有されていればよい。
【００８０】
本発明のワクチン組成物は、様々な経路により接種することができる。例えば、皮内、皮下、鼻腔内、筋肉内、腹腔内、および経口経路等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８１】
また、本発明は、本発明のワクチン組成物の１または２以上の成分を包含する１または２以上の容器からなるキットを提供する。
【００８２】
ワクチン組成物およびキットを用いて、マイコプラズマ肺炎を予防またはその症状を軽減することができる。本発明は、有効免疫感作量の本発明のワクチン組成物を対象に投与することを包含するマイコプラズマ肺炎の予防または軽減方法を提供する。
【００８３】
ワクチンの投与方法としては、前記接種方法に例示した通りである。投与量は、対象の年齢、性別、体重、薬物への忍容性等を考慮して決められるが、通常０．００１ｍｇ〜１，０００ｍｇを１回または２回以上投与することができる。好ましくは複数回の投与であり、この場合、２〜４週間の間隔をあけて投与することが好ましい。
【００８４】
また、本発明のワクチン組成物が適用される生物としては特に限定されず、例えば、ヒトを含む動物（例、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類等）が挙げられる。
【実施例】
【００８５】
以下、実施例により本発明をさらに説明するが、本発明はいかなる意味においてもこれらに限定されない。
【００８６】
（１）Ｓ−（２，３−ビスパルミトイルオキシプロピル）システイニルペプチドおよびＳ−（２，３−ビスパルミトイルオキシプロピル）−Ｎ−パルミトイル−システイニルペプチドの合成
【００８７】
Ｓ−（２，３−ビスパルミトイルオキシプロピル）システイニルペプチドおよびＳ−（２，３−ビスパルミトイルオキシプロピル）−Ｎ−パルミトイル−システイニルペプチド（図２）は、下記文献：
Metzger, J.W., K.-H.Wiesmuller, and G. Jung. Synthesis of N-Fmoc protected derivatives of S-(2,3-dihydroxypropyl)-cysteine and their application in peptide synthesis. Int. J. Pept. Protein Res. 38:545-554 (1991)、および
Metzger, J.W., A.G. Beck-Sickinger, M. Loleit, M. Eckert, W.G. Bessler, and G. Jung. Synthetic S-(2,3-dihydroxypropyl)-cysteinyl peptides derived from the N-terminus of the cytochrome subunit of the photoreaction centre of Rhodopseudomonas viridis enhance murine splenocyte proliferation. J. Pept. Sci. 3:184-190 (1995) に記載の方法に基づいて合成した。
【００８８】
ペプチド合成は、９−ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ（Ｆｍｏｃ）法に従い、自動化シンセサイザ（モデル４３３Ａ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使って合成した。ｔｅｒｔ−ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌによって保護されたＦｍｏｃ−レジンを充填したＷａｎｇ−ＰＨＢ樹脂を固相化の支持体として使った。０．１ｍＭアミノ酸をそれぞれの結合に使用した。使用したアミノ酸（側鎖の保護基）の例を次に示す。アスパラギン（ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌ）、セリン（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ）、リジン（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｏｘｙ−ｃａｒｂｏｎｙｌ）等。樹脂（レジン）に結合したＦｍｏｃ−アミノ酸の遊離は、ピペリジンを使用して行った。アミノ酸の結合には２−（１Ｈ−ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌ−１−ｙｌ）−１，１，３，３−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｕｒｏｎｉｕｍ ｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｂｏｒａｔｅおよびｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ（ＨＯＢｔ）を使った。樹脂に結合したアミノ酸１４個からなるペプチド（Ｎ１４−ｍｅｒペプチド）とＦｍｏｃ−（２，３−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ）−Ｌ−Ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ＯＨの結合は、ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ／ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ（１：２）中で、１２時間反応させて行った。５％フェノール含有ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）、５％ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌｅ、５％ｅｔｈａｎｅｄｉｔｈｉｏｌｅ、および７％水を用いて、樹脂からのペプチドの切り出しおよびすべての保護基の除去を行った。合成の進行を、エレクトロスプレーイオン化質量分析機によってモニターした。
【００８９】
得られた化合物がＳ−（２，３−ビスパルミトイルオキシプロピル）システイニルペプチドおよびＳ−（２，３−ビスパルミトイルオキシプロピル）−Ｎ−パルミトイル−システイニルペプチドであることは、質量分析により確認した。以下の実験用には、Ｓ−（２，３−ビスパルミトイルオキシプロピル）システイニルペプチド（以下、ジパルミトイル体と記載）およびＳ−（２，３−ビスパルミトイルオキシプロピル）−Ｎ−パルミトイル−システイニルペプチド（以下、トリパルミトイル体と記載）を精製し、秤量して用いた。
【００９０】
（２）マイコプラズマ・ニューモニエおよびＬＡＭＰｓの精製
マイコプラズマ・ニューモニエＭ１２９（ＡＴＣＣ ２９４３２）を、２０％ウマ血清を補足したＰＰＬＯ培地を含むフラスコ中で、３７℃で４８時間培養した。フラスコに付着した細胞をＰＢＳ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）で２回洗浄した後、掻き出し、４℃、１２０００×ｇで１０分間遠心分離することにより回収した。細胞を、６０℃で３０分の熱処理により不活化した。これらの細胞を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび１ｍＭ ＥＤＴＡを含む溶液（ＴＢＳＥ）中に、２ｍｇタンパク質／ｍｌの濃度となるように懸濁し、ＴＸ−１１４（Ｓｉｇｍａ社製）を２％となるように加え、４℃で１時間インキュベートすることによりマイコプラズマの菌体を溶解した。３７℃で１０分間インキュベートした後、溶解液を、１０，０００×ｇ、３７℃で２０分間遠心分離して水層と界面活性剤層に分離し、界面活性剤層を分取した。ＴＢＳＥで２回洗浄した後、得られた界面活性剤層（０．１ｍｌ）にメタノール（０．２５ｍｌ）を加えて−２０℃で終夜インキュベートすることでタンパク質を析出させ、遠心分離した。残渣をＰＢＳで懸濁して５分間超音波破砕（Ｓｏｎｉｆｅｒ ｃｅｌｌ ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ ２００，Ｂｒａｎｓｏｎ，Ｄａｎｂｕｒｙ，ＣＴ）することによりＬＡＭＰを得た。
【００９１】
（３）レポーターアッセイ
ＮＦ−κＢ結合領域の下流にルシフェラーゼ遺伝子を結合させたレポーターベクターｐＮＦ−κＢ−ｌｕｃは、Ｓｉｇｍａ社から購入した。１×１０５個の２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１１２６８）（１０％ ＦＣＳ，２ｍＭ Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，１００Ｕ／ｍｌ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ Ｇ，および１００μｇ／ｍｌ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含有するＲＰＭＩ１６４０培地で培養）に０．１μｇのｐＮＦ−κＢ−ｌｕｃをＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて導入した。４８時間培養後、各リポペプチドを種々の濃度（０．００１〜１０，０００ｎｇ／ｍｌ）になるように培地に添加し、さらに８時間培養後、ルシフェラーゼ活性をＤｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により測定した。
【００９２】
（４）ＮＦ−κＢ誘導のＴＬＲ依存性
マイコプラズマ・ニューモニエ由来の物質によって、ＴＬＲ２依存的にＮＦ−κＢを誘導するか確認するため、２９３Ｔ細胞にＴＬＲ２を強発現させた。すなわち、１×１０５個の２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１１２６８）（１０％ ＦＣＳ，２ｍＭ Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，１００Ｕ／ｍｌ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ Ｇおよび１００μｇ／ｍｌ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含有するＤ−ＭＥＭで培養）に０．０１μｇのレポーターベクターｐＮＦ−κＢ−ｌｕｃおよび０．０１〜０．１μｇのＴＬＲ２発現ベクター（ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ１（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）にＴＬＲ２の配列を挿入したもの）を、ＦｕＧＥＮＥ６を用いて導入した。
【００９３】
熱不活化マイコプラズマ・ニューモニエおよびＬＡＭＰｓは、ＴＬＲ２を強発現させた２９３Ｔ細胞においてルシフェラーゼ活性を増強した（図３）。マイコプラズマ・ニューモニエおよびＬＡＭＰｓによるＮＦ−κＢ誘導はＴＬＲ２依存性であることが明らかになった。次に、ＴＬＲ１，６依存性を検討するため、ＴＬＲ２を発現させた２９３Ｔ細胞に、ドミナントネガティブ（ＤＮ）ＴＬＲ６またはＤＮＴＬＲ１を強発現させた。マイコプラズマ・ニューモニエおよびＬＡＭＰｓの刺激は、ＤＮＴＬＲ１によりほぼ阻害されたが、ＤＮＴＬＲ６では、３０〜４０％の抑制であった（図４）。つまり、ＤＮＴＬＲ６非依存性のシグナルが存在することが示唆された。
【００９４】
ＬＡＭＰｓを高速液体クロマトグラフィーで分画して、各フラクションのＮＦ−κＢ誘導を調べた。フラクション６２および６９に強いＮＦ−κＢ誘導活性を観察した（図５）。フラクション６２をＳＤＳ−ＰＡＧＥ展開し、ゲルより抽出した成分のルシフェラーゼ活性を示す（図６）。分子量２１ｋＤａのタンパク質および分子量３７ｋＤａのタンパク質に強いルシフェラーゼ活性を見出した。分子量２１ｋＤａのタンパク質は既に報告したＦ０Ｆ１型ＡＴＰアーゼのサブユニットｂである。そこで、分子量３７ｋＤａのタンパク質をペプチドマスフィンガプリンティングで検討したところ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ（Ｍ．）ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍのＭＧ−４１２のホモログであった。さらに、フラクション６９を同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥ展開し、ゲルより抽出した成分のルシフェラーゼ活性を検討した。分子量６ｋＤａのタンパク質に強いルシフェラーゼ活性を認めた（図７）。これは、ＭＳ／ＭＳ解析により、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍのＭＧ−１４９のホモログであることが明らかとなった。Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍのＭＧ−４１２、ＭＧ−１４９のホモログをそれぞれ、Ｎ−ＡＬＰ１、Ｎ−ＡＬＰ２とした。
【００９５】
Ｎ−ＡＬＰ１、Ｎ−ＡＬＰ２のＴＬＲ依存性を検討した（図８）。両者ともＤＮＴＬＲ１によりほぼ阻害されたが、ＤＮＴＬＲ６では、２０〜３０％の抑制であった。次に、Ｎ−ＡＬＰ１、Ｎ−ＡＬＰ２のリパーゼ感受性、プロテアーゼ感受性について検討を行った。リパーゼの処理によりルシフェラーゼ活性は６０〜７０％抑制された。一方、プロテアーゼ処理によって、その活性は３０〜４０％抑制された（図９）。
【００９６】
配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを含むジパルミトイル体およびトリパルミトイル体がＴＬＲ２依存的にＮＦ−κＢを誘導するか調べた。両者とも濃度依存的にルシフェラーゼ活性を増強させた（図１０）。ただし、トリパルミトイル体の活性はジパルミトイル体の活性より低い傾向にあった。
【００９７】
さらに配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを含むジパルミトイル体およびトリパルミトイル体がＴＬＲ２依存的にＮＦ−κＢを誘導するか調べた。同様に両者とも濃度依存的にルシフェラーゼ活性を増強させた（図１１）。ただし、トリパルミトイル体の活性は、その濃度１〜１００ｎｇ／ｍｌではジパルミトイル体の活性より低い傾向にあった。
【００９８】
次に、ＴＬＲ依存性を検討するため、ＴＬＲ２を発現させた２９３Ｔ細胞に、ＤＮＴＬＲ６またはＤＮＴＬＲ１を強発現させた。発現ベクターを導入して４８時間培養し、各リポペプチドを最終濃度０．５％になるように培地に添加して、さらに８時間培養後、ルシフェラーゼ活性をＤｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ により測定した。
【００９９】
図１２に示すように、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを含むジパルミトイル体およびトリパルミトイル体についてＴＬＲ依存性を検討したところ、ジパルミトイル体のＮＦ−κＢの誘導はＴＬＲ１およびＴＬＲ６に依存性であった。しかし、トリパルミトイル体はＴＬＲ１依存性であったが、ＴＬＲ６非依存性であった。
【０１００】
同様に、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを含むジパルミトイル体およびトリパルミトイル体についてＴＬＲ依存性を検討した。図１３に示すように、ジパルミトイル体のＮＦ−κＢの誘導はＴＬＲ１およびＴＬＲ６に依存性であった。しかし、トリパルミトイル体はＴＬＲ１依存性であったが、ＴＬＲ６非依存性であった。
【０１０１】
これらの結果から、アシル鎖を２本有するジパルミトイル体によるＮＦ−κＢの誘導能はＴＬＲ１、ＴＬＲ２およびＴＬＲ６に依存性であるが、アシル鎖を３本有するトリパルミトイル体によるＮＦ−κＢの誘導能はＴＬＲ１、ＴＬＲ２依存性であることが明らかとなった。既述の図８の結果から、Ｎ−ＡＬＰ１、Ｎ−ＡＬＰ２はＴＬＲ１、ＴＬＲ２依存性、ＴＬＲ６非依存性であったことから、両者ともアシル鎖を３本有するリポプロテインであろうと推定される。
【産業上の利用可能性】
【０１０２】
本発明によれば、Ｓ−（２，３−ビスパルミトイルオキシプロピル）システイニルペプチドおよびＳ−（２，３−ビスパルミトイルオキシプロピル）−Ｎ−パルミトイル−システイニルペプチド等のマイコプラズマ・ニューモニエ菌体由来のリポペプチドは、ＴＬＲ活性化剤として、また、転写因子（特に、ＮＦ−κＢ）誘導剤として有用である。かかるリポペプチドを有効成分として含有するワクチン組成物は、マイコプラズマ肺炎の予防または症状の軽減に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】図１は、リポプロテインＮ−ＡＬＰ１およびＮ−ＡＬＰ２のアミノ酸配列を示す。配列中の箱は、シグナル配列を示す。＊は、脂質が結合するシステイン残基を示す。イタリック文字で表されたアミノ酸は、推定される膜貫通ドメインを示す。
【図２】図２は、Ｓ−（２，３−ビスパルミトイルオキシプロピル）システイニルペプチドおよびＳ−（２，３−ビスパルミトイルオキシプロピル）−Ｎ−パルミトイル−システイニルペプチドの構造を示す。Ｘは、各配列番号で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを示す。
【図３】図３は、マイコプラズマ・ニューモニエおよびＬＡＭＰが、ＴＬＲ２依存性にＮＦ−κＢを活性化することを示すグラフである。縦軸はルシフェラーゼ相対活性を示す。
【図４】図４は、マイコプラズマ・ニューモニエおよびＬＡＭＰによる、ＮＦ−κＢ活性化のＴＬＲ１、６依存性を示すグラフである。縦軸はルシフェラーゼ相対活性を示す。
【図５】図５は、ＬＡＭＰの高速液体クロマトグラフィー（溶離液：０％から１００％の２−プロパノールのリニアグラジエント）により溶出された画分の活性を示すグラフである。縦軸はルシフェラーゼ相対活性を、横軸は画分の分画番号を示す。
【図６】図６は、画分６２のＳＤＳ−ＰＡＧＥ展開図、およびゲルより抽出した成分のルシフェラーゼ活性を示すグラフである。縦軸は分子量（ｋＤａ）を示し、横軸はルシフェラーゼ相対活性を示す。
【図７】図７は、画分６９のＳＤＳ−ＰＡＧＥ展開図、およびゲルより抽出した成分のルシフェラーゼ活性を示すグラフである。縦軸は分子量（ｋＤａ）を示し、横軸はルシフェラーゼ相対活性を示す。
【図８】図８は、Ｎ−ＡＬＰ１、Ｎ−ＡＬＰ２によるＮＦ−κＢ活性化のＴＬＲ１、６依存性を示すグラフである。縦軸はルシフェラーゼ相対活性を示す。
【図９】図９は、Ｎ−ＡＬＰ１、Ｎ−ＡＬＰ２のリポプロテインリパーゼ、プロテイナーゼ感受性を示すグラフである。縦軸はルシフェラーゼ相対活性を示す。
【図１０】図１０は、Ｓ−（２，３−ビスパルミトイルオキシプロピル）システイニルペプチドおよびＳ−（２，３−ビスパルミトイルオキシプロピル）−Ｎ−パルミトイル−システイニルペプチド（ペプチドは配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する）が濃度依存的にＴＬＲ２発現２９３Ｔ細胞を刺激して、ＮＦ−κＢ誘導能が増強されることを示すグラフである。縦軸はルシフェラーゼ相対活性を示す。横軸は合成リポペプチド（ｎｇ／ｍｌ）の添加濃度を示す。
【図１１】図１１は、Ｓ−（２，３−ビスパルミトイルオキシプロピル）システイニルペプチドおよびＳ−（２，３−ビスパルミトイルオキシプロピル）−Ｎ−パルミトイル−システイニルペプチド（ペプチドは配列番号４で表されるアミノ酸配列を有する）が濃度依存的にＴＬＲ２発現２９３Ｔ細胞を刺激して、ＮＦ−κＢ誘導能が増強されることを示すグラフである。縦軸はルシフェラーゼ相対活性を示す。横軸は合成リポペプチド（ｎｇ／ｍｌ）の添加濃度を示す。
【図１２】図１２は、Ｓ−（２，３−ビスパルミトイルオキシプロピル）システイニルペプチドおよびＳ−（２，３−ビスパルミトイルオキシプロピル）−Ｎ−パルミトイル−システイニルペプチド（ペプチドは配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する）によるＮＦ−κＢ活性化のＴＬＲ１、６依存性を調べたグラフである。縦軸はルシフェラーゼ相対活性を示す。
【図１３】図１３は、Ｓ−（２，３−ビスパルミトイルオキシプロピル）システイニルペプチドおよびＳ−（２，３−ビスパルミトイルオキシプロピル）−Ｎ−パルミトイル−システイニルペプチド（ペプチドは配列番号４で表されるアミノ酸配列を有する）によるＮＦ−κＢ活性化のＴＬＲ１、６依存性を調べたグラフである。縦軸はルシフェラーゼ相対活性を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、感染症予防に適用しうる新規な合成リポペプチドおよびそれを有効成分として含有してなるワクチン組成物などに関する。
【背景技術】
【０００２】
マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）は、マイコプラズマ肺炎の起因菌である。この起因菌は、気管支上皮細胞に付着した後、サイトカインをはじめ、様々な宿主免疫応答を誘導するが、その機序は明らかになっていない。当該菌は、直径１２５〜１５３ｎｍ程度でウィルス程度の小さな病原体であるが、増殖するためにはウィルスとは異なり生きた細胞を必要とせず、また、一部の抗生物質が有効だったことから、細菌に分類されていた時期もあるが、最近では別の綱に分類されている。
【０００３】
マイコプラズマ属の菌は、細菌の特徴である細胞壁を持っていない。細菌感染症治療の第一選択として使われるβ−ラクタム系の抗生物質（ペニシリン系、セフェム系など）は細菌の細胞壁を障害して菌を殺す作用を持つが、細胞壁を持たないマイコプラズマには無効である。有効な抗生物質は、タンパク合成阻害剤のマクロライド系抗生剤やテトラサイクリン系抗生物質、またはＤＮＡ複製を抑制するニューキノロン系抗生物質である。
【０００４】
臨床の現場では、臨床症状から判断してマイコプラズマ感染症が疑われた場合、マクロライドなどのタンパク質合成阻害剤が処方されている。しかし、これら抗生物質の多用により、抗生物質抵抗性のマイコプラズマ・ニューモニエの出現が報告されている。本症の治療において、早期診断・早期治療をすることが病状の遷延化や流行を防止するために必要とされるが、診断が確定するまでの日数がかかる場合が多い。近年、細菌性肺炎が激減した中で、肺炎全体に占めるマイコプラズマ肺炎の比率は高まっている。
【０００５】
一方、非特許文献１に記載されているように、トールライクレセプター（Ｔｏｌｌ Ｌｉｋｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＬＲ））と呼ばれる受容体ファミリーが細菌の様々な菌体成分を認識し、最終的に転写因子であるＮＦ−κＢを活性化することにより自然免疫を誘導することが報告されている。
【０００６】
本発明者らは、既にマイコプラズマ・ニューモニエ由来のＦ０Ｆ１型ＡＴＰアーゼのサブユニットｂであるリポプロテイン（非特許文献２）が、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２およびＴＬＲ６依存的に転写因子ＮＦ−κＢを活性化することを報告し（非特許文献３）、特許出願（特願２００５−１５２０６８、ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３１０８３０）を行った。さらに、当該リポプロテインの一部を合成し、得られたＦＡＭ−２０、ＦＡＭ−５と称する化合物を含む合成リポペプチド類が、天然型のリポプロテインと同等の活性を示すことを見出し、特許出願（特願２００５−３１１９６６）を行った。
【０００７】
【非特許文献１】Ａｋｉｒａ，Ｓ．＆Ｔａｋｅｄａ，Ｋ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．４，ｐｐ．４９９−５１１（２００４）
【非特許文献２】Ｇｅｏｒｇｅ Ｐｙｒｏｗｏｌａｋｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２６７３，Ｎｏ．３８，Ｉｓｓｕｅ ｏｆ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １８，ｐｐ．２４７９２−２４７９６（１９９８）
【非特許文献３】Ｔａｋａｓｈｉ Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｙｕｔａｋａ Ｋｉｄａ ａｎｄ Ｋｏｉｃｈｉ Ｋｕｗａｎｏ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１７５：４６４１−４６４６（２００５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、現在有効な予防手段がないマイコプラズマ肺炎に対し、さらに安全かつ有効なワクチンの開発に資する合成リポペプチドおよび当該合成リポペプチドを含有してなるワクチン組成物等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、転写因子ＮＦ−κＢを有効に活性化させるマイコプラズマ・ニューモニエ由来の菌体構成物質をさらに鋭意探索し、ＮＦ−κＢを活性化するリポプロテインＮ−ＡＬＰ１およびＮ−ＡＬＰ２を単離、精製することに成功し（図１）、本発明を完成するに至った。
本発明は、以下のものを提供する：
［１］下記式（１）
【００１０】
【化１】
【００１１】
（式中、
Ｘは、配列番号３または４で表されるアミノ酸配列を有するペプチド部分であり、
Ｙは、水素またはＲ３ＣＯであり、
Ｒ１ＣＯ、Ｒ２ＣＯおよびＲ３ＣＯは、同一または異なって、アシル基を示し、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、水素、または炭素数１から２９までのアルキル基を示す）
で表されるリポペプチド。
［２］前記Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が、炭素数７から１９までのアルキル基である、［１］記載のリポペプチド。
［３］前記Ｒ１ＣＯ、Ｒ２ＣＯおよびＲ３ＣＯが、パルミトイル基である、［１］または［２］に記載のリポペプチド。
［４］下記式（２）
【００１２】
【化２】
【００１３】
（式中、
Ｘ’は、配列番号１〜４のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するペプチド部分であり、
Ｙは、水素またはＲ３ＣＯであり、
Ｒ１ＣＯ、Ｒ２ＣＯおよびＲ３ＣＯは、同一または異なって、アシル基を示し、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、水素、または炭素数１から２９までのアルキル基を示す）
で表されるリポペプチドを含有する、トールライクレセプター（ＴＬＲ）の活性化剤。
［５］前記ＴＬＲが、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２およびＴＬＲ６からなる群より選ばれる少なくとも１種である、［４］記載の活性化剤。
［６］下記式（２）
【００１４】
【化３】
【００１５】
（式中、
Ｘ’は、配列番号１〜４のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するペプチド部分であり、
Ｙは、水素またはＲ３ＣＯであり、
Ｒ１ＣＯ、Ｒ２ＣＯおよびＲ３ＣＯは、同一または異なって、アシル基を示し、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、水素、または炭素数１から２９までのアルキル基を示す）
で表されるリポペプチドを含有する、転写因子誘導剤。
［７］前記転写因子がＮＦ−κＢである、［６］記載の転写因子誘導剤。
［８］下記式（２）
【００１６】
【化４】
【００１７】
（式中、
Ｘ’は、配列番号１〜４のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するペプチド部分であり、
Ｙは、水素またはＲ３ＣＯであり、
Ｒ１ＣＯ、Ｒ２ＣＯおよびＲ３ＣＯは、同一または異なって、アシル基を示し、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、水素、または炭素数１から２９までのアルキル基を示す）
で表されるリポペプチドおよび医薬として許容され得る担体を含有する、ワクチン組成物。
［９］アジュバントをさらに含有する、［８］記載の組成物。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のリポペプチドは、マイコプラズマ・ニューモニエ由来のリポプロテインＮ−ＡＬＰ１およびＮ−ＡＬＰ２を最適化することにより得られたものである。本発明のリポペプチドおよびＴＬＲの活性化剤は、マイコプラズマ肺炎の発症機序の解明、ならびに、ＴＬＲを介した先天性免疫応答の研究の進展に寄与することができる。本発明の活性化剤は、ＴＬＲを介した免疫賦活剤としても有用である。
【００１９】
本発明の転写因子誘導剤によれば、マイコプラズマ感染における宿主応答およびマイコプラズマ肺炎の発症機序の解明、ならびに、ＴＬＲを介してＮＦ−κＢが関与する転写誘導の研究の進展に寄与することができる。
【００２０】
本発明のワクチン組成物によれば、従来有効な予防および改善手段が存在していなかったマイコプラズマ肺炎を予防し、またはその症状を軽減することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明において、マイコプラズマ・ニューモニエとは、ヒトマイコプラズマ肺炎の起因菌であり、現在までに単離・同定された菌株ばかりでなく、現在未同定であってもマイコプラズマ肺炎の発症に関与する限り、これらすべての菌を包含するものである。当該マイコプラズマは、抗生物質耐性菌株であってもよい。
【００２２】
本発明のリポペプチドは、下記式（１）
【００２３】
【化５】
【００２４】
で表される。
【００２５】
式（１）中、ペプチド部分Ｘは、そのアミノ酸配列のＮ末端に位置するアミノ酸（Ａｌａ）を介してシステイン残基とペプチド結合し、該システイン残基は、その側鎖に由来するＳを介して、プロピル誘導体とスルフィドを形成している。
本発明においては、アミノ酸はＬ体、Ｄ体およびＤＬ体を包含するものであるが、通常、Ｌ体を用いる。前記プロピル誘導体中の不斉中心は、Ｒ配置、Ｓ配置、またはＲＳ配置のいずれであってもよい。
【００２６】
式（１）中、Ｘは、配列番号３または配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するペプチド部分である。
【００２７】
前記アミノ酸配列において、１ないし数個のアミノ酸残基が置換または付加されたアミノ酸配列からなる変異ペプチドも、式（１）のリポペプチドが自然免疫を誘導する限りにおいて本発明に含まれる。ここで、自然免疫の誘導は、後述するレポーターアッセイによりＴＬＲの発現を介してＮＦ−κＢの発現の程度を指標にすることができる。
【００２８】
１ないし数個（好ましくは１または２個）のアミノ酸残基の置換としては、保存的アミノ酸置換が挙げられる。保存的アミノ酸置換とは、特定のアミノ酸を、そのアミノ酸の側鎖と同様の性質の側鎖を有するアミノ酸で置換することをいう。具体的には、保存的アミノ酸置換では、特定のアミノ酸は、そのアミノ酸と同じグループに属する他のアミノ酸により置換される。同様の性質の側鎖を有するアミノ酸のグループは、当該分野で公知である。例えば、このようなアミノ酸のグループとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、中性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）が挙げられる。また、中性側鎖を有するアミノ酸は、さらに、極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、および非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）に分類することもできる。また、他のグループとして、例えば、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）、水酸基（アルコール性水酸基、フェノール性水酸基）を含む側鎖を有するアミノ酸（例えば、セリン、トレオニン、チロシン）なども挙げることができる。
【００２９】
１ないし数個（好ましくは１または２個）のアミノ酸残基の付加としては、配列番号３および４に示すアミノ酸配列のＣ末端側に、例えば、Ｌｅｕ Ｌｅｕ ＴｒｐまたはＬｅｕ Ｔｒｐ Ｖａｌからなるアミノ酸残基を付加することが挙げられる。また、リポペプチドの水溶解性を増強するため、アミノ酸配列のＣ末端側に塩基性アミノ酸であるアルギニン（Ａｒｇ）またはリジン（Ｌｙｓ）を３ないし４残基付加してもよい。
【００３０】
さらに、前記アミノ酸配列において、１ないし数個（好ましくは１〜１０個）のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列からなる変異ペプチドも、式（１）のリポペプチドが自然免疫を誘導する限りにおいて本発明に含まれる。
【００３１】
１ないし数個のアミノ酸残基の欠失としては、配列番号３および４に示すアミノ酸配列の中から、任意（好ましくは１または２個）のアミノ酸残基を選択して欠失させることが挙げられる。あるいは、配列番号３または４のアミノ酸配列において、示されるアミノ酸配列のＣ末端から連続して数個のアミノ酸配列の欠失であってもよく、例えば３〜１０個の欠失が例示される。
【００３２】
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、同一または異なって、水素、炭素数１から２９までのアルキル基であるが、当該アルキル基は不飽和結合（二重結合、三重結合）を任意の数有していてもよく、従って、炭素数２から２９までのアルケニルまたはアルキニル基も本発明の炭素数２から２９までのアルキル基に包含される。これらは、直鎖状であっても分岐鎖状であってもよく、また環状であってもよい。さらに、鎖中にシクロプロパン環などの環を含んでいてもよい。本発明においては、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、生体内で自然免疫を効率的に誘導するという観点から、飽和脂肪酸を構成する炭素数１から２９までのアルキル基が好ましく、より好ましくは炭素数７から１９までのアルキル基であり、具体的には、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシルなどが挙げられる。
【００３３】
Ｙは、水素またはＲ３ＣＯである。
なお、本明細書中、Ｙが水素の場合の式（１）（または後述の式（２））の化合物を「ジアシル体」とも称し、ＹがＲ３ＣＯである場合の式（１）（または後述の式（２））の化合物を「トリアシル体」とも称する。
【００３４】
Ｒ１ＣＯ、Ｒ２ＣＯおよびＲ３ＣＯは、同一または異なって、アシル基であり、好ましくは同一のアシル基である。アシル基はそれぞれ飽和でも不飽和でもよく、具体的には、オクタノイル、ノナノイル、デカノイル、ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル、ベヘノイル、シス−バクセノイル、９，１０−メチレン−ヘキサデカノイル、パルミトレイルなどが好適な例として挙げられる。中でも、マイコプラズマ・ニューモニエ菌体で見出されるリポプロテインの構成成分である、パルミトイル基が最も好ましい。
【００３５】
本発明の好ましいリポペプチドは、下記式
【００３６】
【化６】
【００３７】
および
【００３８】
【化７】
【００３９】
で表される、Ｓ−（２，３−ビスパルミトイルオキシプロピル）システイニルペプチド（ジアシル体；ここで、ペプチドは配列番号３または配列番号４で表されるアミノ酸配列を有する）ならびに下記式
【００４０】
【化８】
【００４１】
および
【００４２】
【化９】
【００４３】
で表される、Ｓ−（２，３−ビスパルミトイルオキシプロピル）−Ｎ−パルミトイル−システイニルペプチド（トリアシル体）
ここで、上記化６〜化９の構造式におけるペプチド鎖を構成する各記号は、以下のアミノ酸の残基を意味する。Ａ：アラニン；Ｅ：グルタミン酸；Ｆ：フェニルアラニン；Ｇ：グリシン；Ｉ：イソロイシン；Ｋ：リジン；Ｌ：ロイシン；Ｎ：アスパラギン；Ｐ：プロリン；Ｑ：グルタミン；Ｒ：アルギニン；Ｓ：セリン；Ｔ：トレオニン；Ｖ：バリン；Ｙ：チロシン。
【００４４】
上記４種のリポペプチドは、実施例に記載した方法により製造することができる。また、他のリポペプチドも、該当する脂肪酸（オクタン酸、デカン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸等）を用いて、実施例に準じた方法により、当業者であれば容易に合成することができる。
【００４５】
本発明は、下記式（２）
【００４６】
【化１０】
【００４７】
で表されるリポペプチドを含有する、トールライクレセプター（ＴＬＲ）の活性化剤を提供する。
【００４８】
式（２）中、Ｘ’は、そのアミノ酸配列のＮ末端に位置するアミノ酸（Ａｌａ）を介してシステイン残基とペプチド結合し、該システイン残基は、その側鎖に由来するＳを介して、プロピル誘導体とスルフィドを形成している。該プロピル誘導体中の不斉中心は、Ｒ配置、Ｓ配置、またはＲＳ配置のいずれであってもよい。
【００４９】
式（２）中、Ｘ’は、配列番号１〜４のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するペプチド部分である。配列番号３または４のアミノ酸配列を有するペプチド部分は、式（１）のＸにおいて説明した通りである。
【００５０】
また、前記配列番号１または２のアミノ酸配列において、１ないし数個のアミノ酸残基が置換または付加されたアミノ酸配列からなる変異ペプチドも、式（２）のリポペプチドが自然免疫を誘導する限りにおいて本発明に含まれる。ここで、自然免疫の誘導は、後述するレポーターアッセイによりＴＬＲの発現を介したＮＦ−κＢの発現の程度を指標にすることができる。
【００５１】
ここで、１ないし数個（好ましくは１または２個）のアミノ酸残基の置換または１ないし数個（好ましくは１〜４個）のアミノ酸残基の付加としては、式（１）の化合物のＸにおいて挙げられた、アミノ酸残基の置換または付加が挙げられる。
【００５２】
さらに、前記配列番号１または２のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列からなる変異ペプチドも、式（１）のリポペプチドが自然免疫を誘導する限りにおいて本発明に含まれる。
【００５３】
１以上（好ましくは１〜３４５個または１〜２９２個）のアミノ酸残基の欠失としては、配列番号１または２に示すいずれかのアミノ酸配列の中から、任意のアミノ酸残基を選択して欠失させることが挙げられる。あるいは、配列番号１または２のアミノ酸配列において、示されるアミノ酸配列のＣ末端から連続して数個〜数百個のアミノ酸配列の欠失であってもよく、例えばそれぞれ３〜３４５個または３〜２９２個の欠失が例示される。
【００５４】
式（２）中、Ｙ、Ｒ１ＣＯ、Ｒ２ＣＯおよびＲ３ＣＯ、ならびにＲ１、Ｒ２およびＲ３は、式（１）の化合物で説明したとおりである。
【００５５】
式（２）で表されるリポペプチドのうち、ペプチドが配列番号３または配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するリポペプチドは、式（１）で表されるリポペプチドと同様の方法で製造することができる。
【００５６】
また、式（２）で表されるリポペプチドのうち、ペプチドが配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するリポペプチドも、式（１）で表されるリポペプチドと同様の方法で製造することができる。このうち、ＹがＲ３ＣＯであるリポペプチドは、天然のリポプロテインＮ−ＡＬＰ１またはＮ−ＡＬＰ２と同様の構造を有すると推定されるため（本願実施例参照）、マイコプラズマの菌体成分を抽出し、ついで分画し、精製することによっても得られる。
【００５７】
菌体成分の抽出方法としては、通常、超音波破砕、各種界面活性剤による溶解などの方法が用いられる。界面活性剤による溶解方法としては、好ましくは、菌体をＴｒｉｔｏｎ−Ｘ（登録商標）１１４（以下、ＴＸ−１１４と略する）で処理する方法が挙げられる。ＴＸ−１１４は、Ｓｉｇｍａ社から市販されている。ＴＸ−１１４は、その水溶物が３７℃で水層と界面活性剤層に分離することから、菌体のタンパク質を親水性と疎水性のものに分離するのに適している。具体例として、２％ＴＸ−１１４水溶液にマイコプラズマの菌体を溶解し、約１２，０００ｒｐｍ、３７℃で約５分間遠心分離することにより水層と界面活性剤層に分離することができる。界面活性剤層を分取し、これにメタノールを加えることによりタンパク質を析出させ、遠心分離により上清を回収して可溶画分として得ることができる。このようにして得られた可溶画分は、膜結合リポプロテイン（ＬＡＭＰ）を豊富に含有しており、これを分画することにより、活性成分が得られる。分画は通常、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（μＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ Ｃ１８ ３００Ａ（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）溶出条件：０％から１００％の２−プロパノールのリニアグラジエント、液量は１ｍｌ／ｍｉｎ、溶出時間：好ましくは６０分程度）にて行うのが好ましい。得られた画分のＴＬＲの活性化は、後述するレポーターベクターを用いたレポーターアッセイにより確認することができる。
【００５８】
さらに、式（２）で表されるリポペプチドのうち、ペプチドが配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するリポペプチドは、常法により、菌体成分から得られたＮ−ＡＬＰ遺伝子と、任意の発現ベクターとを用いて構築したＮ−ＡＬＰ発現ベクターにより発現、精製したＮ−ＡＬＰを用いて製造することもできる。
【００５９】
本発明において、トールライクレセプター（ＴＬＲ）とは、微生物の侵入や感染を防御するため、先天性免疫（自然免疫ともいう）の誘導経路に介在する受容体ファミリーである。ヒトＴＬＲファミリーは、ＴＬＲ１〜１１のメンバーから構成されている。
【００６０】
本発明のＴＬＲ活性化剤により活性化されるＴＬＲは、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２およびＴＬＲ６を活性化させることが好ましい。特に、本発明の剤が含む式（２）の化合物において、ジアシル体の場合は、本発明のＴＬＲ活性化剤は、ＴＬＲ１およびＴＬＲ２、ＴＬＲ２およびＴＬＲ６を活性化することができ、一方、式（２）で表される化合物において、トリアシル体の場合は、ＴＬＲ１およびＴＬＲ２を選択的に活性化することができる。
【００６１】
本発明のリポペプチドのうち、ジアシル体は、他のマイコプラズマ（マイコプラズマ・ファーメンタスおよびマイコプラズマ・サリバリウム）由来の、Ｎ−アシル化されないリポプロテインまたはリポペプチド（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：６５３８−４４（２０００）およびＪ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：１９５１−８（１９９７）参照）と同様に、ＴＬＲ１およびＴＬＲ２に加えて、ＴＬＲ２およびＴＬＲ６をも活性化するものであるが、トリアシル体は、ＴＬＲ１およびＴＬＲ２のみを活性化することができる。
【００６２】
ＴＬＲを介した自然免疫の誘導は、その後の獲得免疫にも重要な役割を担うことから、本発明により得られるＴＬＲ活性化剤は、マイコプラズマ肺炎の予防または症状軽減への開発応用が期待される。例えば、本発明の剤は、ＴＬＲシグナル経路を阻害することが可能な抗体の産生を誘導するため、ワクチン接種用注射剤の候補となり得る。
【００６３】
本発明は、式（２）で表されるリポペプチドを含有する、転写因子誘導剤を提供する。式（２）で表されるリポペプチドは、前記定義した通りである。
【００６４】
式（２）で表されるリポペプチドは、ＴＬＲを活性化するため、ＴＬＲを介したシグナル伝達機構に関与する。従って、本発明の転写因子誘導剤は、ＴＬＲを介したシグナル伝達により、そのシグナルの下流に位置する転写因子を誘導する作用を有する。このような転写因子としては、ＴＬＲのシグナル経路に関与する因子であれば特に限定されるものではないが、ＮＦ−κＢが好ましい。なお、ＮＦ−κＢは、炎症や免疫反応に関与する炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８など）や接着因子（ＶＣＡＭ、ＩＣＡＭ、ＥＬＡＭなど）の遺伝子を制御する遺伝子に結合し、これらの働きを制御する転写因子である。
【００６５】
式（２）で表されるリポペプチドを含有する、ＴＬＲ活性化剤および転写因子誘導剤の作用は、レポーターアッセイにより測定することができる。具体的には、ＴＬＲおよびドミナントネガティブＴＬＲを、腎臓由来の細胞株でベクターの導入効率が高いという特徴をもつ２９３Ｔ細胞に発現（ドミナントネガティブ発現ベクターは、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ１（Ｓｉｇｍａ）にＴＬＲ１およびＴＬＲ６のＴＩＲドメインを欠損させたものを導入して作製することができる）させることにより確認することができる。
【００６６】
詳しくは、１〜４×１０５個の２９３Ｔ細胞に０．１μｇのレポーターベクター（転写因子ＮＦ−κＢ結合領域の下流にルシフェラーゼ遺伝子を結合させたベクター等）をＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて導入し、すでにＴＬＲ１とＴＬＲ２、およびＴＬＲ２とＴＬＲ６に依存的にＮＦ−κＢを誘導することがそれぞれ知られている（Ｓ）−［２，３−Ｂｉｓ（ｐａｌｍｉｔｏｙｌｏｘｙ）−（２−ＲＳ）−ｐｒｏｐｙｌ］−Ｎ−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−（Ｒ）−Ｃｙｓ−（Ｓ）−Ｓｅｒ−（Ｓ）−Ｌｙｓ４−ＯＨ・３ＨＣｌ（Ｐａｍ３ＣＳＫ４，ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＭ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅ ２（ＭＡＬＰ−２、松本美佐子博士（大阪府立成人病センター）から分与。Ｎｉｓｈｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．，Ｍ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｔ．Ｔａｋａｏ，Ｍ．Ｈｏｓｈｉｎｏ，Ｙ．Ｓｈｉｍｏｎｉｓｈｉ，Ｓ．Ｔｓｕｊｉ，Ｎ．Ａ．Ｂｅｇｕｍ，Ｏ．Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｓ．Ａｋｉｒａ，Ｋ．Ｔｏｙｏｓｈｉｍａ，ａｎｄ Ｔ．Ｓｅｙａ．２００１．，Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｍ１６１ Ａｇ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２：ｒｏｌｅ ｏｆ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｐｏｒｔｉｏｎ ｉｎ ｉｔｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：２６１０）で刺激し、レポーターの発現量（例えば、ルシフェラーゼ活性）の上昇を測定することにより、ＴＬＲ１およびＴＬＲ６の発現を確認することができる。
【００６７】
本発明の活性化剤または誘導剤を含有する試料を、転写因子ＮＦ−κＢ結合領域の下流にルシフェラーゼ遺伝子を結合させたレポーターベクター（たとえば、市販されているｐＮＦ−κＢ−ｌｕｃ（Ｓｉｇｍａ））を導入した細胞と接触させ、ＴＬＲの活性化を介したＮＦ−κＢの誘導能をルシフェラーゼ活性の測定により確認することができる。一例としては、４×１０５個の２９３Ｔ細胞に０．１μｇのレポーターベクターｐＮＦ−κＢ−ｌｕｃ（Ｓｉｇｍａ）をＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて導入し、４８時間後、前記試料を最終濃度０．５％になるように添加し、８時間経過後、ルシフェラーゼ活性をＤｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により測定する方法が挙げられる。
【００６８】
本発明のＴＬＲ活性化剤または転写因子誘導剤に含まれる式（２）で表されるリポペプチドの含有量は、通常、０．０１〜１００重量％、好ましくは０．１〜９０重量％、より好ましくは１〜１０重量％である。また、本発明の剤は、天然のリポプロテインＮ−ＡＬＰ１および／またはＮ−ＡＬＰ２そのものであってもよい。
【００６９】
本発明の活性化剤または誘導剤は、さらに任意の担体を含んでいても良い。例えば、注射剤や研究用試薬として液剤を製造する場合、当該担体としては、安息香酸ナトリウム等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム等の安定剤、水、生理食塩水等の希釈剤等およびこれらの組合せが挙げられるが、それらに限定されない。また、本発明の活性化剤または誘導剤の剤形としては、注射剤や研究用試薬としての使用に適した剤形であることが好ましく、例えば液剤（例、注射剤、点滴剤等）または固体（凍結乾燥製剤を含む）が挙げられるが、それらに限定されない。
【００７０】
本発明の活性化剤または誘導剤は、前記リポペプチドを有効成分として、常法により製造することができる。
【００７１】
本発明の剤が含む好ましいリポペプチドは、Ｓ−（２，３−ビスパルミトイルオキシプロピル）システイニルペプチド（ジアシル体；ここで、ペプチドは配列番号１〜４で表されるアミノ酸配列を有する）およびＳ−（２，３−ビスパルミトイルオキシプロピル）−Ｎ−パルミトイル−システイニルペプチド（トリアシル体；ここで、ペプチドは配列番号１〜４で表されるアミノ酸配列を有する）である。これらのリポペプチドは、単独で、または２種以上を組み合わせて本発明の剤に含んでいてもよい。
【００７２】
また、配列番号１および２で表されるアミノ酸配列を有するペプチドは、実施例に記載された方法で合成しても、マイコプラズマ・ニューモニエのＬＡＭＰから抽出してもよく、またＮ−ＡＬＰ発現ベクターを用いて発現、精製してもよい。
【００７３】
本発明の活性化剤または誘導剤が作用する細胞としては特に限定されず、ＴＬＲを発現していることが従来公知な細胞または将来発見され得る細胞全てが含まれる。中でもＴＬＲ１、ＴＬＲ２およびＴＬＲ６を発現している細胞が好ましく、例えば、樹状細胞、マクロファージが挙げられる。
【００７４】
本発明は、式（２）で表されるリポペプチドおよび医薬として許容され得る担体を含有する、ワクチン組成物を提供する。
【００７５】
式（２）で表されるリポペプチドは、前記定義した通りである。当該リポペプチドは１種のみを選択してもよいが、ワクチン組成物においては、２種以上のリポペプチドを適宜選択して含有するワクチン組成物が好ましい。さらには、マイコプラズマ・ニューモニエ由来のＮ−ＡＬＰ１および／またはＮ−ＡＬＰ２を含有していてもよい。抗原として多種類のリポペプチドを含有するワクチン組成物は、様々な接種対象者における獲得免疫を惹起させることが可能である。
【００７６】
前記医薬として許容され得る担体としては、ワクチンの製造に通常用いられる担体を限定なく使用することができ、具体的には、食塩水、緩衝化食塩水、デキストロース、水、グリセロール、等張水性緩衝液およびそれらの組合せが挙げられる。担体は、好ましくは滅菌されたものである。また、これに乳化剤、保存剤（例、チメロサール）、等張化剤、ｐＨ調整剤および不活化剤（例、ホルマリン）等が適宜配合される。
【００７７】
本発明の組成物は、ワクチンの投与様式に適合した形態を有することが好ましく、例えば、注射可能な形態として、溶液、懸濁液または乳化液が挙げられる。あるいは、液体溶液、懸濁液または乳化液に供せられる形態として、凍結乾燥製剤等の固体形態が挙げられる。
【００７８】
本発明の組成物は、製薬上許容可能で且つ活性成分と相溶性であるアジュバントをさらに含有することが好ましい。アジュバントは、一般には、宿主の免疫応答を非特異的に増強する物質であり、多数の種々のアジュバントが当技術分野で公知である。アジュバントの例としては以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン、Ｑｕｉｌｌ Ａ（登録商標）、リゾレシチン、サポニン誘導体、プルロニックポリオール、モンタニドＩＳＡ−５０（Ｓｅｐｐｉｃ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）、Ｂａｙｏｌ（登録商標）およびＭａｒｋｏｌ（登録商標）。
【００７９】
ワクチン組成物は、前記リポペプチドを有効成分として、前記担体および好ましくはアジュバントとともに常法により製造することができる。当該リポペプチドは、ワクチン中に０．００１〜９９．９重量％含有されていればよい。
【００８０】
本発明のワクチン組成物は、様々な経路により接種することができる。例えば、皮内、皮下、鼻腔内、筋肉内、腹腔内、および経口経路等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８１】
また、本発明は、本発明のワクチン組成物の１または２以上の成分を包含する１または２以上の容器からなるキットを提供する。
【００８２】
ワクチン組成物およびキットを用いて、マイコプラズマ肺炎を予防またはその症状を軽減することができる。本発明は、有効免疫感作量の本発明のワクチン組成物を対象に投与することを包含するマイコプラズマ肺炎の予防または軽減方法を提供する。
【００８３】
ワクチンの投与方法としては、前記接種方法に例示した通りである。投与量は、対象の年齢、性別、体重、薬物への忍容性等を考慮して決められるが、通常０．００１ｍｇ〜１，０００ｍｇを１回または２回以上投与することができる。好ましくは複数回の投与であり、この場合、２〜４週間の間隔をあけて投与することが好ましい。
【００８４】
また、本発明のワクチン組成物が適用される生物としては特に限定されず、例えば、ヒトを含む動物（例、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類等）が挙げられる。
【実施例】
【００８５】
以下、実施例により本発明をさらに説明するが、本発明はいかなる意味においてもこれらに限定されない。
【００８６】
（１）Ｓ−（２，３−ビスパルミトイルオキシプロピル）システイニルペプチドおよびＳ−（２，３−ビスパルミトイルオキシプロピル）−Ｎ−パルミトイル−システイニルペプチドの合成
【００８７】
Ｓ−（２，３−ビスパルミトイルオキシプロピル）システイニルペプチドおよびＳ−（２，３−ビスパルミトイルオキシプロピル）−Ｎ−パルミトイル−システイニルペプチド（図２）は、下記文献：
Metzger, J.W., K.-H.Wiesmuller, and G. Jung. Synthesis of N-Fmoc protected derivatives of S-(2,3-dihydroxypropyl)-cysteine and their application in peptide synthesis. Int. J. Pept. Protein Res. 38:545-554 (1991)、および
Metzger, J.W., A.G. Beck-Sickinger, M. Loleit, M. Eckert, W.G. Bessler, and G. Jung. Synthetic S-(2,3-dihydroxypropyl)-cysteinyl peptides derived from the N-terminus of the cytochrome subunit of the photoreaction centre of Rhodopseudomonas viridis enhance murine splenocyte proliferation. J. Pept. Sci. 3:184-190 (1995) に記載の方法に基づいて合成した。
【００８８】
ペプチド合成は、９−ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ（Ｆｍｏｃ）法に従い、自動化シンセサイザ（モデル４３３Ａ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使って合成した。ｔｅｒｔ−ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌによって保護されたＦｍｏｃ−レジンを充填したＷａｎｇ−ＰＨＢ樹脂を固相化の支持体として使った。０．１ｍＭアミノ酸をそれぞれの結合に使用した。使用したアミノ酸（側鎖の保護基）の例を次に示す。アスパラギン（ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌ）、セリン（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ）、リジン（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｏｘｙ−ｃａｒｂｏｎｙｌ）等。樹脂（レジン）に結合したＦｍｏｃ−アミノ酸の遊離は、ピペリジンを使用して行った。アミノ酸の結合には２−（１Ｈ−ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌ−１−ｙｌ）−１，１，３，３−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｕｒｏｎｉｕｍ ｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｂｏｒａｔｅおよびｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ（ＨＯＢｔ）を使った。樹脂に結合したアミノ酸１４個からなるペプチド（Ｎ１４−ｍｅｒペプチド）とＦｍｏｃ−（２，３−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ）−Ｌ−Ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ＯＨの結合は、ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ／ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ（１：２）中で、１２時間反応させて行った。５％フェノール含有ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）、５％ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌｅ、５％ｅｔｈａｎｅｄｉｔｈｉｏｌｅ、および７％水を用いて、樹脂からのペプチドの切り出しおよびすべての保護基の除去を行った。合成の進行を、エレクトロスプレーイオン化質量分析機によってモニターした。
【００８９】
得られた化合物がＳ−（２，３−ビスパルミトイルオキシプロピル）システイニルペプチドおよびＳ−（２，３−ビスパルミトイルオキシプロピル）−Ｎ−パルミトイル−システイニルペプチドであることは、質量分析により確認した。以下の実験用には、Ｓ−（２，３−ビスパルミトイルオキシプロピル）システイニルペプチド（以下、ジパルミトイル体と記載）およびＳ−（２，３−ビスパルミトイルオキシプロピル）−Ｎ−パルミトイル−システイニルペプチド（以下、トリパルミトイル体と記載）を精製し、秤量して用いた。
【００９０】
（２）マイコプラズマ・ニューモニエおよびＬＡＭＰｓの精製
マイコプラズマ・ニューモニエＭ１２９（ＡＴＣＣ ２９４３２）を、２０％ウマ血清を補足したＰＰＬＯ培地を含むフラスコ中で、３７℃で４８時間培養した。フラスコに付着した細胞をＰＢＳ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）で２回洗浄した後、掻き出し、４℃、１２０００×ｇで１０分間遠心分離することにより回収した。細胞を、６０℃で３０分の熱処理により不活化した。これらの細胞を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび１ｍＭ ＥＤＴＡを含む溶液（ＴＢＳＥ）中に、２ｍｇタンパク質／ｍｌの濃度となるように懸濁し、ＴＸ−１１４（Ｓｉｇｍａ社製）を２％となるように加え、４℃で１時間インキュベートすることによりマイコプラズマの菌体を溶解した。３７℃で１０分間インキュベートした後、溶解液を、１０，０００×ｇ、３７℃で２０分間遠心分離して水層と界面活性剤層に分離し、界面活性剤層を分取した。ＴＢＳＥで２回洗浄した後、得られた界面活性剤層（０．１ｍｌ）にメタノール（０．２５ｍｌ）を加えて−２０℃で終夜インキュベートすることでタンパク質を析出させ、遠心分離した。残渣をＰＢＳで懸濁して５分間超音波破砕（Ｓｏｎｉｆｅｒ ｃｅｌｌ ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ ２００，Ｂｒａｎｓｏｎ，Ｄａｎｂｕｒｙ，ＣＴ）することによりＬＡＭＰを得た。
【００９１】
（３）レポーターアッセイ
ＮＦ−κＢ結合領域の下流にルシフェラーゼ遺伝子を結合させたレポーターベクターｐＮＦ−κＢ−ｌｕｃは、Ｓｉｇｍａ社から購入した。１×１０５個の２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１１２６８）（１０％ ＦＣＳ，２ｍＭ Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，１００Ｕ／ｍｌ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ Ｇ，および１００μｇ／ｍｌ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含有するＲＰＭＩ１６４０培地で培養）に０．１μｇのｐＮＦ−κＢ−ｌｕｃをＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて導入した。４８時間培養後、各リポペプチドを種々の濃度（０．００１〜１０，０００ｎｇ／ｍｌ）になるように培地に添加し、さらに８時間培養後、ルシフェラーゼ活性をＤｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により測定した。
【００９２】
（４）ＮＦ−κＢ誘導のＴＬＲ依存性
マイコプラズマ・ニューモニエ由来の物質によって、ＴＬＲ２依存的にＮＦ−κＢを誘導するか確認するため、２９３Ｔ細胞にＴＬＲ２を強発現させた。すなわち、１×１０５個の２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１１２６８）（１０％ ＦＣＳ，２ｍＭ Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，１００Ｕ／ｍｌ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ Ｇおよび１００μｇ／ｍｌ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含有するＤ−ＭＥＭで培養）に０．０１μｇのレポーターベクターｐＮＦ−κＢ−ｌｕｃおよび０．０１〜０．１μｇのＴＬＲ２発現ベクター（ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ１（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）にＴＬＲ２の配列を挿入したもの）を、ＦｕＧＥＮＥ６を用いて導入した。
【００９３】
熱不活化マイコプラズマ・ニューモニエおよびＬＡＭＰｓは、ＴＬＲ２を強発現させた２９３Ｔ細胞においてルシフェラーゼ活性を増強した（図３）。マイコプラズマ・ニューモニエおよびＬＡＭＰｓによるＮＦ−κＢ誘導はＴＬＲ２依存性であることが明らかになった。次に、ＴＬＲ１，６依存性を検討するため、ＴＬＲ２を発現させた２９３Ｔ細胞に、ドミナントネガティブ（ＤＮ）ＴＬＲ６またはＤＮＴＬＲ１を強発現させた。マイコプラズマ・ニューモニエおよびＬＡＭＰｓの刺激は、ＤＮＴＬＲ１によりほぼ阻害されたが、ＤＮＴＬＲ６では、３０〜４０％の抑制であった（図４）。つまり、ＤＮＴＬＲ６非依存性のシグナルが存在することが示唆された。
【００９４】
ＬＡＭＰｓを高速液体クロマトグラフィーで分画して、各フラクションのＮＦ−κＢ誘導を調べた。フラクション６２および６９に強いＮＦ−κＢ誘導活性を観察した（図５）。フラクション６２をＳＤＳ−ＰＡＧＥ展開し、ゲルより抽出した成分のルシフェラーゼ活性を示す（図６）。分子量２１ｋＤａのタンパク質および分子量３７ｋＤａのタンパク質に強いルシフェラーゼ活性を見出した。分子量２１ｋＤａのタンパク質は既に報告したＦ０Ｆ１型ＡＴＰアーゼのサブユニットｂである。そこで、分子量３７ｋＤａのタンパク質をペプチドマスフィンガプリンティングで検討したところ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ（Ｍ．）ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍのＭＧ−４１２のホモログであった。さらに、フラクション６９を同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥ展開し、ゲルより抽出した成分のルシフェラーゼ活性を検討した。分子量６ｋＤａのタンパク質に強いルシフェラーゼ活性を認めた（図７）。これは、ＭＳ／ＭＳ解析により、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍのＭＧ−１４９のホモログであることが明らかとなった。Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍのＭＧ−４１２、ＭＧ−１４９のホモログをそれぞれ、Ｎ−ＡＬＰ１、Ｎ−ＡＬＰ２とした。
【００９５】
Ｎ−ＡＬＰ１、Ｎ−ＡＬＰ２のＴＬＲ依存性を検討した（図８）。両者ともＤＮＴＬＲ１によりほぼ阻害されたが、ＤＮＴＬＲ６では、２０〜３０％の抑制であった。次に、Ｎ−ＡＬＰ１、Ｎ−ＡＬＰ２のリパーゼ感受性、プロテアーゼ感受性について検討を行った。リパーゼの処理によりルシフェラーゼ活性は６０〜７０％抑制された。一方、プロテアーゼ処理によって、その活性は３０〜４０％抑制された（図９）。
【００９６】
配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを含むジパルミトイル体およびトリパルミトイル体がＴＬＲ２依存的にＮＦ−κＢを誘導するか調べた。両者とも濃度依存的にルシフェラーゼ活性を増強させた（図１０）。ただし、トリパルミトイル体の活性はジパルミトイル体の活性より低い傾向にあった。
【００９７】
さらに配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを含むジパルミトイル体およびトリパルミトイル体がＴＬＲ２依存的にＮＦ−κＢを誘導するか調べた。同様に両者とも濃度依存的にルシフェラーゼ活性を増強させた（図１１）。ただし、トリパルミトイル体の活性は、その濃度１〜１００ｎｇ／ｍｌではジパルミトイル体の活性より低い傾向にあった。
【００９８】
次に、ＴＬＲ依存性を検討するため、ＴＬＲ２を発現させた２９３Ｔ細胞に、ＤＮＴＬＲ６またはＤＮＴＬＲ１を強発現させた。発現ベクターを導入して４８時間培養し、各リポペプチドを最終濃度０．５％になるように培地に添加して、さらに８時間培養後、ルシフェラーゼ活性をＤｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ により測定した。
【００９９】
図１２に示すように、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを含むジパルミトイル体およびトリパルミトイル体についてＴＬＲ依存性を検討したところ、ジパルミトイル体のＮＦ−κＢの誘導はＴＬＲ１およびＴＬＲ６に依存性であった。しかし、トリパルミトイル体はＴＬＲ１依存性であったが、ＴＬＲ６非依存性であった。
【０１００】
同様に、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを含むジパルミトイル体およびトリパルミトイル体についてＴＬＲ依存性を検討した。図１３に示すように、ジパルミトイル体のＮＦ−κＢの誘導はＴＬＲ１およびＴＬＲ６に依存性であった。しかし、トリパルミトイル体はＴＬＲ１依存性であったが、ＴＬＲ６非依存性であった。
【０１０１】
これらの結果から、アシル鎖を２本有するジパルミトイル体によるＮＦ−κＢの誘導能はＴＬＲ１、ＴＬＲ２およびＴＬＲ６に依存性であるが、アシル鎖を３本有するトリパルミトイル体によるＮＦ−κＢの誘導能はＴＬＲ１、ＴＬＲ２依存性であることが明らかとなった。既述の図８の結果から、Ｎ−ＡＬＰ１、Ｎ−ＡＬＰ２はＴＬＲ１、ＴＬＲ２依存性、ＴＬＲ６非依存性であったことから、両者ともアシル鎖を３本有するリポプロテインであろうと推定される。
【産業上の利用可能性】
【０１０２】
本発明によれば、Ｓ−（２，３−ビスパルミトイルオキシプロピル）システイニルペプチドおよびＳ−（２，３−ビスパルミトイルオキシプロピル）−Ｎ−パルミトイル−システイニルペプチド等のマイコプラズマ・ニューモニエ菌体由来のリポペプチドは、ＴＬＲ活性化剤として、また、転写因子（特に、ＮＦ−κＢ）誘導剤として有用である。かかるリポペプチドを有効成分として含有するワクチン組成物は、マイコプラズマ肺炎の予防または症状の軽減に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】図１は、リポプロテインＮ−ＡＬＰ１およびＮ−ＡＬＰ２のアミノ酸配列を示す。配列中の箱は、シグナル配列を示す。＊は、脂質が結合するシステイン残基を示す。イタリック文字で表されたアミノ酸は、推定される膜貫通ドメインを示す。
【図２】図２は、Ｓ−（２，３−ビスパルミトイルオキシプロピル）システイニルペプチドおよびＳ−（２，３−ビスパルミトイルオキシプロピル）−Ｎ−パルミトイル−システイニルペプチドの構造を示す。Ｘは、各配列番号で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを示す。
【図３】図３は、マイコプラズマ・ニューモニエおよびＬＡＭＰが、ＴＬＲ２依存性にＮＦ−κＢを活性化することを示すグラフである。縦軸はルシフェラーゼ相対活性を示す。
【図４】図４は、マイコプラズマ・ニューモニエおよびＬＡＭＰによる、ＮＦ−κＢ活性化のＴＬＲ１、６依存性を示すグラフである。縦軸はルシフェラーゼ相対活性を示す。
【図５】図５は、ＬＡＭＰの高速液体クロマトグラフィー（溶離液：０％から１００％の２−プロパノールのリニアグラジエント）により溶出された画分の活性を示すグラフである。縦軸はルシフェラーゼ相対活性を、横軸は画分の分画番号を示す。
【図６】図６は、画分６２のＳＤＳ−ＰＡＧＥ展開図、およびゲルより抽出した成分のルシフェラーゼ活性を示すグラフである。縦軸は分子量（ｋＤａ）を示し、横軸はルシフェラーゼ相対活性を示す。
【図７】図７は、画分６９のＳＤＳ−ＰＡＧＥ展開図、およびゲルより抽出した成分のルシフェラーゼ活性を示すグラフである。縦軸は分子量（ｋＤａ）を示し、横軸はルシフェラーゼ相対活性を示す。
【図８】図８は、Ｎ−ＡＬＰ１、Ｎ−ＡＬＰ２によるＮＦ−κＢ活性化のＴＬＲ１、６依存性を示すグラフである。縦軸はルシフェラーゼ相対活性を示す。
【図９】図９は、Ｎ−ＡＬＰ１、Ｎ−ＡＬＰ２のリポプロテインリパーゼ、プロテイナーゼ感受性を示すグラフである。縦軸はルシフェラーゼ相対活性を示す。
【図１０】図１０は、Ｓ−（２，３−ビスパルミトイルオキシプロピル）システイニルペプチドおよびＳ−（２，３−ビスパルミトイルオキシプロピル）−Ｎ−パルミトイル−システイニルペプチド（ペプチドは配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する）が濃度依存的にＴＬＲ２発現２９３Ｔ細胞を刺激して、ＮＦ−κＢ誘導能が増強されることを示すグラフである。縦軸はルシフェラーゼ相対活性を示す。横軸は合成リポペプチド（ｎｇ／ｍｌ）の添加濃度を示す。
【図１１】図１１は、Ｓ−（２，３−ビスパルミトイルオキシプロピル）システイニルペプチドおよびＳ−（２，３−ビスパルミトイルオキシプロピル）−Ｎ−パルミトイル−システイニルペプチド（ペプチドは配列番号４で表されるアミノ酸配列を有する）が濃度依存的にＴＬＲ２発現２９３Ｔ細胞を刺激して、ＮＦ−κＢ誘導能が増強されることを示すグラフである。縦軸はルシフェラーゼ相対活性を示す。横軸は合成リポペプチド（ｎｇ／ｍｌ）の添加濃度を示す。
【図１２】図１２は、Ｓ−（２，３−ビスパルミトイルオキシプロピル）システイニルペプチドおよびＳ−（２，３−ビスパルミトイルオキシプロピル）−Ｎ−パルミトイル−システイニルペプチド（ペプチドは配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する）によるＮＦ−κＢ活性化のＴＬＲ１、６依存性を調べたグラフである。縦軸はルシフェラーゼ相対活性を示す。
【図１３】図１３は、Ｓ−（２，３−ビスパルミトイルオキシプロピル）システイニルペプチドおよびＳ−（２，３−ビスパルミトイルオキシプロピル）−Ｎ−パルミトイル−システイニルペプチド（ペプチドは配列番号４で表されるアミノ酸配列を有する）によるＮＦ−κＢ活性化のＴＬＲ１、６依存性を調べたグラフである。縦軸はルシフェラーゼ相対活性を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）
【化１】
（式中、
Ｘは、配列番号３または４で表されるアミノ酸配列を有するペプチド部分であり、
Ｙは、水素またはＲ３ＣＯであり、
Ｒ１ＣＯ、Ｒ２ＣＯおよびＲ３ＣＯは、同一または異なって、アシル基を示し、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、水素、または炭素数１から２９までのアルキル基を示す）
で表されるリポペプチド。
【請求項２】
前記Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が、炭素数７から１９までのアルキル基である、請求項１記載のリポペプチド。
【請求項３】
前記Ｒ１ＣＯ、Ｒ２ＣＯおよびＲ３ＣＯが、パルミトイル基である、請求項１または２に記載のリポペプチド。
【請求項４】
下記式（２）
【化２】
（式中、
Ｘ’は、配列番号１〜４のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するペプチド部分であり、
Ｙは、水素またはＲ３ＣＯであり、
Ｒ１ＣＯ、Ｒ２ＣＯおよびＲ３ＣＯは、同一または異なって、アシル基を示し、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、水素、または炭素数１から２９までのアルキル基を示す）
で表されるリポペプチドを含有する、トールライクレセプター（ＴＬＲ）の活性化剤。
【請求項５】
前記ＴＬＲが、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２およびＴＬＲ６からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項４記載の活性化剤。
【請求項６】
下記式（２）
【化３】
（式中、
Ｘ’は、配列番号１〜４のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するペプチド部分であり、
Ｙは、水素またはＲ３ＣＯであり、
Ｒ１ＣＯ、Ｒ２ＣＯおよびＲ３ＣＯは、同一または異なって、アシル基を示し、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、水素、または炭素数１から２９までのアルキル基を示す）
で表されるリポペプチドを含有する、転写因子誘導剤。
【請求項７】
前記転写因子がＮＦ−κＢである、請求項６記載の転写因子誘導剤。
【請求項８】
下記式（２）
【化４】
（式中、
Ｘ’は、配列番号１〜４のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するペプチド部分であり、
Ｙは、水素またはＲ３ＣＯであり、
Ｒ１ＣＯ、Ｒ２ＣＯおよびＲ３ＣＯは、同一または異なって、アシル基を示し、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、水素、または炭素数１から２９までのアルキル基を示す）
で表されるリポペプチドおよび医薬として許容され得る担体を含有する、ワクチン組成物。
【請求項９】
アジュバントをさらに含有する、請求項８記載の組成物。
【請求項１】
下記式（１）
【化１】
（式中、
Ｘは、配列番号３または４で表されるアミノ酸配列を有するペプチド部分であり、
Ｙは、水素またはＲ３ＣＯであり、
Ｒ１ＣＯ、Ｒ２ＣＯおよびＲ３ＣＯは、同一または異なって、アシル基を示し、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、水素、または炭素数１から２９までのアルキル基を示す）
で表されるリポペプチド。
【請求項２】
前記Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が、炭素数７から１９までのアルキル基である、請求項１記載のリポペプチド。
【請求項３】
前記Ｒ１ＣＯ、Ｒ２ＣＯおよびＲ３ＣＯが、パルミトイル基である、請求項１または２に記載のリポペプチド。
【請求項４】
下記式（２）
【化２】
（式中、
Ｘ’は、配列番号１〜４のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するペプチド部分であり、
Ｙは、水素またはＲ３ＣＯであり、
Ｒ１ＣＯ、Ｒ２ＣＯおよびＲ３ＣＯは、同一または異なって、アシル基を示し、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、水素、または炭素数１から２９までのアルキル基を示す）
で表されるリポペプチドを含有する、トールライクレセプター（ＴＬＲ）の活性化剤。
【請求項５】
前記ＴＬＲが、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２およびＴＬＲ６からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項４記載の活性化剤。
【請求項６】
下記式（２）
【化３】
（式中、
Ｘ’は、配列番号１〜４のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するペプチド部分であり、
Ｙは、水素またはＲ３ＣＯであり、
Ｒ１ＣＯ、Ｒ２ＣＯおよびＲ３ＣＯは、同一または異なって、アシル基を示し、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、水素、または炭素数１から２９までのアルキル基を示す）
で表されるリポペプチドを含有する、転写因子誘導剤。
【請求項７】
前記転写因子がＮＦ−κＢである、請求項６記載の転写因子誘導剤。
【請求項８】
下記式（２）
【化４】
（式中、
Ｘ’は、配列番号１〜４のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するペプチド部分であり、
Ｙは、水素またはＲ３ＣＯであり、
Ｒ１ＣＯ、Ｒ２ＣＯおよびＲ３ＣＯは、同一または異なって、アシル基を示し、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、水素、または炭素数１から２９までのアルキル基を示す）
で表されるリポペプチドおよび医薬として許容され得る担体を含有する、ワクチン組成物。
【請求項９】
アジュバントをさらに含有する、請求項８記載の組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２００８−２４６１９（Ｐ２００８−２４６１９Ａ）
【公開日】平成２０年２月７日（２００８．２．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１９７４２１（Ｐ２００６−１９７４２１）
【出願日】平成１８年７月１９日（２００６．７．１９）
【出願人】（５９９０４５９０３）学校法人 久留米大学 (72)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年２月７日（２００８．２．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年７月１９日（２００６．７．１９）
【出願人】（５９９０４５９０３）学校法人 久留米大学 (72)
【Ｆターム（参考）】
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