合成抗体ファージライブラリー
【課題】新規抗原結合ポリペチドを発見するための供与源として使用することができ、大きな配列多様性の供与源を提供できる、変異体アミノ酸を抗体可変ドメインのＣＤＲに含める方法の提供。
【解決手段】変異体アミノ酸を抗体可変ドメインに含んでいるポリペプチド。異種ポリペチド、例えば少なくともファージまたはウイルスのコートタンパク質の一部、標識およびリンカーとの融合ポリペチド。これらのポリペチドを複数個含んでいるライブラリー。これらのポリペチドやライブラリーを生成して利用する方法および組成物。
【解決手段】変異体アミノ酸を抗体可変ドメインに含んでいるポリペプチド。異種ポリペチド、例えば少なくともファージまたはウイルスのコートタンパク質の一部、標識およびリンカーとの融合ポリペチド。これらのポリペチドを複数個含んでいるライブラリー。これらのポリペチドやライブラリーを生成して利用する方法および組成物。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のアミノ酸配列を含む変異体ＣＤＲＨ３領域を含んでいるポリペプチドであって、
（Ｘ１）ｎ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６、
式中、Ｘ１は、ＮＮＫ、ＮＮＳ、ＤＶＫ、ＮＶＴ、ＸＹＺのコドンセットによってコードされるいずれかの天然アミノ酸、またはトリプトファンもしくはグリシンもしくはその混合物であり、ｎは４から１４であり、
Ｘ２は、ＫＳＧ、ＤＶＫ、ＤＳＧ、ＮＶＴ、ＫＳＧ、ＮＮＳ、ＸＹＺ、ＮＮＫのコドンセットでコードされるいずれかの天然アミノ酸、またはチロシン、フェニルアラニン、セリン、アラニン、グリシン、ロイシンもしくはトリプトファンであり、
Ｘ３は、Ｘ２がフェニルアラニンまたはロイシンのときは存在せず、あるいは存在する場合には、アラニン、バリン、アスパラギン酸またはグリシンであり、
Ｘ４は、Ｘ２がフェニルアラニンまたはロイシンのときは存在せず、あるいは存在する場合はメチオニンであり、
Ｘ５はアスパラギン酸、アラニン、バリンまたはグリシンであり、
Ｘ６はチロシンまたはバリンであるポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドが重鎖抗体可変ドメインである請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
Ｘ３がアラニンであり、Ｘ４がメチオニンであり、Ｘ５がアスパラギン酸であり、Ｘ６がチロシンである請求項２に記載の抗体可変ドメイン。
【請求項４】
Ｘ２がチロシンである請求項２に記載の抗体可変ドメイン。
【請求項５】
Ｘ２がロイシンまたはフェニルアラニンであり、Ｘ３およびＸ４が存在せず、Ｘ５がアスパラギン酸であり、Ｘ６がチロシンである請求項２に記載の抗体可変ドメイン。
【請求項６】
ｎが６である請求項３に記載の抗体可変ドメイン。
【請求項７】
ｎが６である請求項５に記載の抗体可変ドメイン。
【請求項８】
ｎが６、７または８である請求項２に記載の抗体可変ドメイン。
【請求項９】
抗体４Ｄ５のＣＤＲＨ３においてＸ１がアミノ酸位置９５に対応し、ｎが６であり、Ｘ２がアミノ酸位置１００ａに対応し、Ｘ３がアミノ酸位置１００ｂに対応する、請求項２に記載の抗体可変ドメイン。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子を含む核酸。
【請求項１１】
請求項１０に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１２】
複製可能な発現ベクターである、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】
前記ベクターが、ｌａｃ Ｚプロモーター系、アルカリホスファターゼｐｈｏ Ａプロモーター（Ａｐ）、バクテリオファージλＰＬプロモーター（温度感受性プロモーター）、ｔａｃプロモーター、トリプトファンプロモーターおよびバクテリオファージＴ７プロモーターからなる群から選ばれるポリペプチドと結合したプロモーター領域を持つ、請求項１２に記載のベクター。
【請求項１４】
請求項１から９のいずれかに記載のポリペプチドがその表面に提示されているウイルス。
【請求項１５】
少なくとも１×１０８個の複数の請求項１から９のいずれかに記載の異なるポリペプチド配列を含むライブラリー。
【請求項１６】
請求項１２に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１７】
ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２またはＣＤＲＬ３からなる群から選ばれる少なくとも１つ、２つ、３つ、４つまたはすべての変異体ＣＤＲをさらに含み、少なくとも１つのＣＤＲは少なくとも１つの溶媒に露出した非常に多様なアミノ酸位置に変異体アミノ酸を有し、前記変異体アミノ酸は非ランダムコドンセットによってコードされ、前記非ランダムコドンセットによってコードされるアミノ酸の少なくとも７０％は周知の抗体可変ドメインにおけるその位置の対象アミノ酸である、請求項１から９のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１８】
前記非ランダムコドンセットによってコードされるアミノ酸が少なくとも５０％の公知の抗体可変ドメインの対応する位置で見られるアミノ酸を含む、請求項１７に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
前記変異体ＣＤＲがＣＤＲＨ１またはＣＤＲＨ２または両方である、請求項１から９および１７から１８のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項２０】
変異体ＣＤＲＨ３においてＸ１が抗体４Ｄ５のＣＤＲＨ３のアミノ酸９５に対応し、ｎが６であり、Ｘ２がアミノ酸１００ａに対応し、Ｘ３がアミノ酸１００ｂに対応し、Ｘ６がアミノ酸１０２に対応する、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
ＣＤＲＨ３においてＸ３がアラニンであり、Ｘ４がメチオニンであり、Ｘ５がアスパラギン酸であり、Ｘ６がチロシンである、請求項２０に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
ＣＤＲＨ３においてＸ２がフェニルアラニンまたはロイシンであり、Ｘ３およびＸ４が存在せず、Ｘ５がアスパラギン酸であり、Ｘ６がチロシンである、請求項２０に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
ＣＤＲＨ１がアミノ酸位置２８、３０、３１、３２および３３の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つまたはすべての位置に変異体アミノ酸を含み、ＣＤＲＨ２がアミノ酸位置５０、５２、５３、５４、５６および５８の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはすべての位置に変異体アミノ酸を含む、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
ＣＤＲＨ１およびＣＤＲＨ２の各変異体アミノ酸位置が変異体アミノ酸を有し、
１）ＣＤＲＨ１において、
ａ）位置２８の変異体アミノ酸はコドンセットＡＶＴまたはＷＣＣによってコードされるか、あるいはトレオニンであり、
ｂ）位置３０の変異体アミノ酸はコドンセットＲＶＭまたはＡＶＴによってコードされ、
ｃ）位置３１の変異体アミノ酸はコドンセットＲＶＭ、ＲＶＴまたはＲＲＴによってコードされ、
ｄ）位置３２の変異体アミノ酸はコドンセットＷＭＹによってコードされ、
ｅ）位置３３の変異体アミノ酸はコドンセットＫＶＫ、ＲＮＴ、ＤＭＴ、ＫＭＴまたはＫＧＧまたはコドンセットＫＭＴとＫＧＧの組合せによってコードされ、
また、
２）ＣＤＲＨ２において、
ａ）位置５０の変異体アミノ酸はコドンセットＫＤＴまたはＤＢＧまたはコドンセットＤＧＧとＤＨＴの組合せによってコードされ、
ｂ）位置５２の変異体アミノ酸はコドンセットＤＨＴまたはＤＭＴによってコードされ、
ｃ）位置５３の変異体アミノ酸はコドンセットＮＭＴまたはＤＭＴによってコードされ、
ｄ）位置５４の変異体アミノ酸はコドンセットＤＭＫ、ＤＭＴまたはＲＲＣによってコードされ、
ｅ）位置５６の変異体アミノ酸はコドンセットＤＭＫまたはＤＭＴによってコードされ、
ｆ）位置５８の変異体アミノ酸はコドンセットＤＭＴまたはＤＡＣによってコードされる、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
変異体ＣＤＲＨ３においてＸ１が抗体４Ｄ５のＣＤＲＨ３のアミノ酸位置９５に対応し、ｎが６であり、Ｘ２がアミノ酸位置１００ａに対応し、Ｘ３がアミノ酸位置１００ｂに対応し、Ｘ６がアミノ酸位置１０２に対応する、請求項２４に記載の抗体可変ドメイン。
【請求項２６】
ａ）請求項１から９および１７から２５のいずれかに記載の重鎖抗体可変ドメイン、
ｂ）変異体ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３またはその混合物を含む軽鎖抗体可変ドメインを含む
少なくとも２つの抗体可変ドメインを含むポリペプチドであって、
ｉ）少なくとも１つの変異体ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２またはＣＤＲＬ３またはその混合物は少なくとも１つの溶媒に露出した非常に多様なアミノ酸位置に変異体アミノ酸を有し、前記変異体アミノ酸は非ランダムコドンセットによってコードされ、前記非ランダムコドンセットによってコードされるアミノ酸の少なくとも７０％は周知の抗体可変ドメインにおけるその位置の対象アミノ酸であるポリペプチド。
【請求項２７】
ＣＤＲＬ１がアミノ酸位置２８、２９、３０、３１および３２の１つまたは複数の位置に変異体アミノ酸を含み、
ＣＤＲＬ２がアミノ酸位置５０および５３の１つまたは複数の位置に変異体アミノ酸を含み、
ＣＤＲＬ３がアミノ酸位置９１、９２、９３、９４および９６の１つまたは複数の位置に変異体アミノ酸を含む、請求項２６に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
各ＣＤＲの各変異体アミノ酸位置が変異体アミノ酸を有し、
１）ＣＤＲＬ１において、
ａ）位置２８の変異体アミノ酸はＲＤＴによってコードされ、
ｂ）位置２９の変異体アミノ酸はＲＫＴまたはＲＴＴによってコードされ、
ｃ）位置３０の変異体アミノ酸はＲＶＷによってコードされ、
ｄ）位置３１の変異体アミノ酸はコドンセットＲＶＷまたはＡＮＷによってコードされ、
ｅ）位置３２の変異体アミノ酸はコドンセットＤＨＴまたはＴＨＴによってコードされ、
２）ＣＤＲＬ２において、
ａ）位置５０の変異体アミノ酸はコドンセットＫＢＧによってコードされ、
ｂ）位置５３の変異体アミノ酸はコドンセットＡＶＣによってコードされ、
３）ＣＤＲＬ３において、
ａ）位置９１の変異体アミノ酸はコドンセットＫＭＴまたはＴＭＴまたはコドンセットＴＭＴとＳＲＴの組合せによってコードされ、
ｂ）位置９２の変異体アミノ酸はコドンセットＤＨＴまたはＤＭＣによってコードされ、
ｃ）位置９３の変異体アミノ酸はコドンセットＲＶＴまたはＤＨＴによってコードされ、
ｄ）位置９４の変異体アミノ酸はＮＨＴまたはＷＨＴによってコードされ、
ｅ）位置９６の変異体アミノ酸はコドンセットＹＨＴ、ＨＷＴ、ＨＴＴまたはＴＤＫまたはコドンセットＹＫＧとＴＷＴの組合せによってコードされる、請求項２６から２７のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項２９】
変異体ＣＤＲＨ３においてＸ１が抗体４Ｄ５のＣＤＲＨ３のアミノ酸位置９５に対応し、ｎが６であり、Ｘ２がアミノ酸位置１００ａに対応し、Ｘ３がアミノ酸位置１００ｂに対応し、Ｘ６がアミノ酸位置１０２に対応する、請求項２８に記載のポリペプチド。
【請求項３０】
さらに重鎖抗体可変ドメインのＣ末端領域と結合した二量体化ドメインを含む、請求項１から９および１７から２９のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項３１】
前記二量体化ドメインがロイシンジッパードメインまたは少なくとも１つのシステイン残基を含む配列を含む、請求項３０に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
前記二量体化ドメインが抗体からのヒンジ領域およびロイシンジッパーを含む、請求項３１に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
前記二量体化ドメインが単一のシステインである、請求項３０に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３からなる群から選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはすべてのＣＤＲを含むポリペプチドであって、
（ａ）ＣＤＲＬ１は、アミノ酸位置２８、２９、３０、３１および３２の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つまたはすべての位置に変異体アミノ酸を含み、
（ｂ）ＣＤＲＬ２は、アミノ酸位置５０および５３の少なくとも一方または両方の位置に変異体アミノ酸を含み、
（ｃ）ＣＤＲＬ３は、アミノ酸位置９１、９２、９３、９４および９６の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つまたはすべての位置に変異体アミノ酸を含み、
（ｄ）ＣＤＲＨ１は、アミノ酸位置２８、３０、３１、３２および３３の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つまたはすべての位置に変異体アミノ酸を含み、
（ｅ）ＣＤＲＨ２は、アミノ酸位置５０、５２、５３、５４、５６および５８の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはすべての位置に変異体アミノ酸を含み、
（ｆ）ＣＤＲＨ３は、アミノ酸位置９５、９６、９７、９８、９９、１００、１００ａ、１００ｂ、１００ｃ、１０１および１０２の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはすべての位置に変異体アミノ酸を含み、
前記アミノ酸位置は、カバットナンバリングシステムに対応し、（ａ）から（ｅ）の変異体アミノ酸のそれぞれは非ランダムコドンセットでコードされ、前記非ランダムコドンセットによってコードされるアミノ酸の少なくとも約５０％から９０％、またはすべてが抗体可変ドメインにおけるそのアミノ酸位置の対象アミノ酸であり、（ｆ）の少なくとも１つの変異体アミノ酸は、コドンセットＮＮＫ、ＮＮＳ、ＤＶＫ、ＸＹＺまたはＮＶＴまたはその混合体によってコードされるポリペプチド。
【請求項３５】
前記ポリペプチドが重鎖抗体可変ドメインまたは軽鎖抗体可変ドメイン、またはその両方を含む、請求項３４に記載のポリペプチド。
【請求項３６】
請求項１から９および１７から３５のいずれかに記載のポリペプチドを含む融合ポリペプチドであって、重鎖可変ドメインがウイルスコートタンパク質の少なくとも一部と融合している融合ポリペプチド。
【請求項３７】
前記ウイルスコートタンパク質がタンパク質ｐＩＩＩ、主コートタンパク質ｐＶＩＩＩ、Ｓｏｃ、Ｈｏｃ、ｇｐＤ、ｐｖ１およびその変異体からなる群から選択される、請求項３６に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３８】
前記重鎖可変ドメインとウイルスコートタンパク質との間に二量体化ドメインをさらに含む、請求項３６に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３９】
ペプチドタグと融合した軽鎖可変ドメインをさらに含む、請求項３５に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４０】
前記ペプチドタグがｇＤ、ｃ−ｍｙｃ、ｐｏｌｙ−ｈｉｓ、蛍光タンパク質およびβ−ガラクトシダーゼからなる群から選択される、請求項３９に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４１】
さらに単一の抗体鋳型からの各可変ドメインに対するＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３またはＦＲ４を含む、請求項１から９および１７から４０のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項４２】
各ＦＲが抗体４Ｄ５の配列（配列番号１）を有する、請求項４１に記載のポリペプチド。
【請求項４３】
抗体４Ｄ５の重鎖のアミノ酸位置４９、９３、９４または９７の１つ、２つ、３つまたはすべての位置の重鎖ＦＲ残基および軽鎖のアミノ酸位置６６が変更された、請求項４２に記載のポリペプチド。
【請求項４４】
位置４９の重鎖ＦＲがアラニンまたはグリシンであり、位置９３ではアラニンまたはセリンであり、位置９４ではアルギニンまたはリジンまたはトレオニンであり、位置７１ではアルギニン、バリンまたはアラニンである、請求項３６に記載のポリペプチド。
【請求項４５】
請求項１７から４４のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子を含む核酸。
【請求項４６】
請求項４５に記載の核酸を含むベクター。
【請求項４７】
複製可能な発現ベクターである、請求項４６に記載のベクター。
【請求項４８】
前記複製可能な発現ベクターがＭ１３、ｆ１、ｆｄ、Ｐｆ３ファージもしくはその誘導体、またはラムドイドファージ、例えばラムダ、２１、ｐｈｉ８０、ｐｈｉ８１、８２、４２４、４３４など、もしくはその誘導体である、請求項４７に記載のベクター。
【請求項４９】
請求項１７から４４のいずれかに記載のポリペプチドがその表面に提示されているウイルス。
【請求項５０】
請求項１７から４４のいずれかに記載の複数のポリペプチドを含むライブラリーであって、少なくとも１×１０８の異なる抗体可変ドメイン配列を有するライブラリー。
【請求項５１】
請求項４７に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項５２】
複数のポリペチドを含む組成物を作製する方法であって、
ａ）ＣＤＲＨ１またはＣＤＲＨ２またはＣＤＲＨ３またはその混合物の少なくとも１つの変異体ＣＤＲを含む複数のポリペプチドを作製するステップを含み、
ｉ）変異体ＣＤＲＨ３を含む複数のポリペプチドは、下記アミノ酸配列の１つまたは複数のアミノ酸位置を置換することによって形成され、
（Ｘ１）ｎ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６、
式中、Ｘ１は、ＮＮＫ、ＮＮＳ、ＤＶＫ、ＮＶＴ、ＸＹＺのコドンセットによってコードされるいずれかの天然アミノ酸、またはトリプトファンもしくはグリシンもしくはその混合物であり、ｎは４から１４であり、
Ｘ２は、ＫＳＧ、ＤＶＫ、ＤＳＧ、ＮＶＴ、ＫＳＧ、ＮＮＳ、ＸＹＺ、ＮＮＫのコドンセットでコードされるいずれかの天然アミノ酸、またはチロシン、フェニルアラニン、セリン、アラニン、グリシン、ロイシンもしくはトリプトファンであり、
Ｘ３は、Ｘ２がフェニルアラニンまたはロイシンのときは存在せず、あるいは存在する場合には、アラニン、バリン、アスパラギン酸またはグリシンであり、
Ｘ４は、Ｘ２がフェニルアラニンまたはロイシンのときは存在せず、あるいは存在する場合はメチオニンであり、
Ｘ５はアスパラギン酸、アラニン、バリンまたはグリシンであり、
Ｘ６はチロシンまたはバリンであり、
ｉｉ）少なくとも１つの溶媒に露出した非常に多様な位置に少なくとも１つの変異体アミノ酸を含む複数の変異体ＣＤＲＨ１またはＣＤＲＨ２またはその両方を形成するステップを含み、前記変異体アミノ酸は非ランダムコドンセットによってコードされ、前記非ランダムコドンセットによってコードされるアミノ酸の少なくとも７０％は周知の抗体可変ドメインにおけるその位置の対象アミノ酸である方法。
【請求項５３】
さらに、
ｉ）変異体ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２またはＣＤＲＬ３またはその混合物を含む複数のポリペプチドを生成するステップを含み、前記変異体ＣＤＲは溶媒に露出し非常に多様な位置の少なくとも１つの変異体アミノ酸で形成され、前記変異体アミノ酸は非ランダムコドンセットによってコードされ、前記非ランダムコドンセットによってコードされるアミノ酸の少なくとも７０％は周知の抗体可変ドメインにおけるその位置の対象アミノ酸である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
対象抗原に結合する抗原結合可変ドメインを選択する方法であって、
ａ）請求項１から９および１７から４４のいずれかに記載の複数のポリペプチドを含む組成物を作製するステップと、
ｂ）組成物から対象抗原に結合するポリペプチド結合体を選択するステップと、
ｃ）前記ポリペプチド結合体を非結合体から単離するステップと、
ｅ）単離されたポリペプチド結合体から高親和性結合体を同定するステップとを含む方法。
【請求項５５】
抗体可変ドメインのライブラリーから対象抗原に結合する抗原結合可変ドメインを選択する方法であって、
ａ）請求項１から９および１７から４４のいずれかに記載の抗体可変ドメインのライブラリーを対象抗原と接触させて結合体を形成するステップと、
ｂ）前記結合体を非結合体から分離し、この結合体を前記対象抗原から溶出させ、この結合体を濃度を段階的に約０．１ｎＭから１０００ｎＭまで下げた前記対象抗原の溶液でインキュベートするステップと、
ｃ）最も低い濃度の前記対象抗原と結合することができ、約０．１ｎＭから２００ｎＭの親和性を有する結合体を選択するステップとを含む方法。
【請求項５６】
前記対象抗原がＶＥＧＦ、ＩＧＦ−１またはＨｅｒ−２である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記対象抗原の濃度が約１００から２５０ｎＭである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記対象抗原の濃度が約２５から１００ｎＭである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
ポリペプチドのライブラリーから対象抗原に結合するポリペプチドを選択する方法であって、
ａ）請求項１から９および１７から４４のいずれかに記載の複数のポリペプチドを含んでいるライブラリーを結合に適した条件下で固定化対象抗原と接触させることにより対象抗原に結合するポリペプチド結合体を単離するステップと、
ｂ）前記ライブラリーのポリペプチド結合体を非結合体から分離し、前記対象抗原から結合体を溶出させて、結合体に富む小集団を得るステップと、
ｃ）任意選択に、各回、前の回の選択から得た結合体小集団を用いてａ）からｂ）のステップを少なくとも２回繰り返すステップとを含む方法。
【請求項６０】
請求項５９に記載の選択方法であって、さらに、
ｆ）前記ポリペプチド結合体の小集団を、結合して混合物を形成するのに適した条件下で０．１ｎＭから１０００ｎＭの濃度の標識された対象抗原とインキュベートするステップと、
ｇ）前記混合物を前記対象抗原上の標識と結合する固定化因子と接触させるステップと、
ｈ）標識された対象抗原と結合した前記ポリペプチド結合体を検出して、前記標識された対象抗原からこのポリペプチド結合体を溶出させるステップと、
ｉ）任意選択に、各回、前の回の選択から得た結合体小集団を用い、また前の回よりも低い濃度の標識対象抗原を用いてｆ）からｉ）のステップを少なくとも２回繰り返すステップとを含む方法。
【請求項６１】
前記混合物に過剰な量の非標識対象抗原を加え、標識された対象抗原から低親和性結合体を溶出させるのに十分な時間インキュベートするステップをさらに含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
対象抗原に結合する高親和性結合体を複製可能な発現ベクターのライブラリーから単離する方法であって、
ａ）請求項１から９および１７から４４のいずれかに記載の複数のポリペプチドを含むライブラリーを、少なくとも約０．１ｎＭから１０００ｎＭの濃度の前記対象抗原と接触させて、対象抗原に結合するポリペプチド結合体を単離するステップと、
ｂ）前記ポリペプチド結合体を前記対象抗原から分離してポリペプチド結合体に富む小集団を得るステップと、
ｃ）任意選択に、各回、前の回の選択から得た結合体小集団を用い、また前の回よりも低い濃度の対象抗原を用いてａ）からｂ）のステップを少なくとも２回繰り返して、最も低い濃度の対象抗原と結合するポリペプチド結合体を分離するステップとを含む方法。
【請求項６３】
請求項１から９および１７から４４のいずれかに記載の複数のポリペプチドを含んでいるライブラリーからポリペプチド結合体を選択するための検定法であって、
ａ）前記ライブラリーを、結合してポリペプチド結合体と標識された対象抗原の複合体を形成するのに適した条件下で、０．１ｎＭから１０００ｎＭの濃度の標識された対象抗原と接触させるステップと、
ｂ）前記複合体を単離し、前記ポリペプチド結合体を前記標識された対象抗原から分離して結合体に富む小集団を得るステップと、
ｃ）任意選択に、各回、前の回の選択から得た結合体小集団を用い、また前の回よりも低い濃度の対象抗原を用いてａ）からｂ）のステップを少なくとも２回繰り返すステップとを含む検定法。
【請求項６４】
前記ポリペプチド結合体と対象抗原の複合体に過剰な量の非標識対象抗原を加えるステップをさらに含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記ステップが２回繰り返され、対象の濃度が、第１回目の選択では約１００ｎＭから２５０ｎＭであり、第２回目の選択では約２５ｎＭから１００ｎＭであり、第３回目の選択では約０．１ｎＭから２５ｎＭである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
請求項１から９および１７から４４のいずれかに記載の複数のポリペプチドを含んでいるライブラリーをスクリーニングする方法であって、
ａ）前記ポリペプチドと対象抗原との結合に適した条件下で、前記ライブラリーの第１の試料をある濃度の前記対象抗原とインキュベートするステップと、
ｂ）前記ライブラリーの第２の試料を、対象抗原を加えないでインキュベートするステップと、
ｃ）第１と第２の試料のそれぞれを、前記ポリペプチドと固定化された対象抗原との結合に適した条件下で、この固定化対象抗原と接触させるステップと、
ｄ）各試料について、固定化された対象抗原に結合したポリペプチドを検出するステップと、
ｅ）第１の試料の結合したポリペプチドの量と第２の試料の結合したポリペプチドの量の比率を計算することによって、前記対象抗原に対するポリペプチドの親和性を決定するステップとを含む方法。
【請求項６７】
下記ステップ、
ａ）ＣＤＲＬ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１、Ｈ２およびＨ３からなる群から選択されるソース抗体の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはすべてのＣＤＲを含むソース抗体の軽鎖可変ドメイン、重鎖可変ドメインまたはその両方をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを構築するステップと、
ｂ）非ランダムコドンセットを用いて前記ソース抗体の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはすべてのＣＤＲを少なくとも１つの溶媒に露出する、非常に多様なアミノ酸位置で突然変異させるステップとを含み、前記非ランダムコドンセットによってコードされるアミノ酸の少なくとも５０％は天然抗体におけるその位置の対象アミノ酸である方法。
【請求項６８】
前記ＣＤＲＨ３が下記アミノ酸配列を含み、
（Ｘ１）ｎ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｄ−Ｘ５、
前記ＣＤＲＨ３を少なくとも１つのアミノ酸位置で突然変異させ、
前記突然変異は、下記突然変異からなる群から選択される方法：
Ｘ１は、ＮＮＫ、ＮＮＳ、ＤＶＫ、ＮＶＴ、ＸＹＺのコドンセットによってコードされるいずれかの天然アミノ酸、またはトリプトファンもしくはグリシンもしくはその混合物であり、ｎは４から１４であり、
Ｘ２は、ＫＳＧ、ＤＶＫ、ＤＳＧ、ＮＶＴ、ＫＳＧ、ＮＮＳ、ＸＹＺ、ＮＮＫのコドンセットでコードされるいずれかの天然アミノ酸、またはチロシン、フェニルアラニン、セリン、アラニン、グリシン、ロイシンもしくはトリプトファンであり、
Ｘ３はＸ２がフェニルアラニンまたはロイシンのときは存在せず、あるいは存在する場合には、アラニン、バリン、アスパラギン酸またはグリシンであり、
Ｘ４はＸ２がフェニルアラニンまたはロイシンのときは存在せず、あるいは存在する場合はメチオニンであり、
Ｘ５はアスパラギン酸、アラニン、バリンまたはグリシンであり、
Ｘ６はチロシンまたはバリンである
請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
ＣＤＲＨ１を抗体４Ｄ５のアミノ酸２８、３０、３１、３２および３３に対応するアミノ酸位置で突然変異させ、ＣＤＲＨ２を抗体４Ｄ５のアミノ酸位置５０、５２、５３、５４、５６および５８に対応するアミノ酸位置で突然変異させる、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
Ｘ１が抗体４Ｄ５のアミノ酸位置９５に対応しｎが６であり、Ｘ２が抗体４Ｄ５のアミノ酸位置１００ａに対応し、Ｘ３が抗体４Ｄ５のアミノ酸位置１００ｂに対応し、Ｘ４が抗体４Ｄ５のアミノ酸位置１００ｃに対応し、Ｘ５が抗体４Ｄ５のアミノ酸位置１０２に対応する、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
以下のアミノ酸配列を含む変異体ＣＤＲＨ３領域を含むポリペプチドであって、
（Ｘ１）ｎ−Ｘ２−Ａ−Ｍ−Ｄ−Ｙ、
式中、Ｘ１は、ＮＮＫ、ＮＮＳ、ＤＶＫ、ＮＶＴ、ＸＹＺのコドンセットによってコードされるいずれかの天然アミノ酸、またはトリプトファンもしくはグリシンもしくはその混合物であり、ｎは４から１４であり、
Ｘ２は、ＫＳＧ、ＤＶＫ、ＤＳＧ、ＮＶＴ、ＫＳＧ、ＮＮＳ、ＸＹＺ、ＮＮＫのコドンセットでコードされるいずれかの天然アミノ酸、またはチロシン、グリシン、フェニルアラニン、セリン、アラニン、ロイシンもしくはトリプトファンであり、
Ａはアラニンであり、Ｍはメチオニンであり、Ｄはアスパラギン酸であり、Ｙはチロシンであるポリペプチド。
【請求項７２】
以下のアミノ酸配列を含む変異体ＣＤＲＨ３領域を含むポリペプチドであって、
（Ｘ１）ｎ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６、
式中、Ｘ１は、ＮＮＫ、ＮＮＳ、ＤＶＫ、ＮＶＴ、ＸＹＺのコドンセットによってコードされるいずれかの天然アミノ酸、またはトリプトファンもしくはグリシンもしくはその混合物であり、ｎは４から１４であり、
Ｘ２はフェニルアラニンまたはロイシンであり、
Ｘ３は存在せず、
Ｘ４は存在せず、
Ｘ５はアスパラギン酸、アラニン、バリンまたはグリシンであり、
Ｘ６はチロシンまたはバリンであるポリペプチド。
【請求項７３】
Ｘ２がフェニルアラニンであり、Ｘ５がアスパラギン酸であり、Ｘ６がチロシンである、請求項７２に記載のポリペプチド。
【請求項７４】
位置９５がコドンセットＤＶＫ、ＮＶＴ、ＮＮＳ、ＸＹＺ、ＮＮＫによってコードされる変異体アミノ酸を持つことができ、またはトリプトファンであり、位置９６が、ＤＶＫ、ＮＶＴ、ＮＮＳ、ＸＹＺによってコードされてよく、またはグリシンもしくはトリプトファンであり、位置９７がＤＶＫ、ＮＶＴ、ＮＮＳ、ＸＹＺによってコードされてよく、またはトリプトファンであり、位置９８がＤＶＫ、ＮＶＴ、ＮＮＳ、ＸＹＺによってコードされてよく、またはトリプトファンであり、位置９９がＤＶＫ、ＮＶＴ、ＮＮＳ、ＸＹＺによってコードされてよく、位置１００がＤＶＫ、ＮＶＴ、ＮＮＳ、ＸＹＺによってコードされてよく、またはトリプトファンであり、位置１００ａが、ＤＶＫ、ＤＳＧ、ＫＳＧ、ＮＶＴ、ＮＮＳ、ＸＹＺによってコードされてよく、またはチロシン、グリシン、セリン、アラニン、トリプトファン、アスパラギン酸、メチオニン、フェニルアラニン、ロイシン、バリンでもよく、位置１００ｂが、ＤＳＧ、ＫＳＧ、ＸＹＺによってコードされてよく、またはアラニン、チロシン、グリシン、バリン、アスパラギン酸、メチオニンもしくはフェニルアラニンであり、位置１００ｃが、ＫＳＧ、ＸＹＺによってコードされてよく、またはメチオニン、フェニルアラニン、ロイシン、アラニン、グリシン、バリン、チロシン、アスパラギン酸であり、位置１０１が、ＫＳＧ、ＸＹＺによってコードされてよく、またはアスパラギン酸、メチオニン、アラニン、バリン、グリシン、チロシン、フェニルアラニン、ロイシンであり、位置１０２がＫＳＧもしくはＸＹＺによってコードされてよく、またはチロシン、アスパラギン酸、メチオニン、アラニン、バリン、グリシンである、請求項３５に記載のポリペプチド。
【請求項１】
以下のアミノ酸配列を含む変異体ＣＤＲＨ３領域を含んでいるポリペプチドであって、
（Ｘ１）ｎ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６、
式中、Ｘ１は、ＮＮＫ、ＮＮＳ、ＤＶＫ、ＮＶＴ、ＸＹＺのコドンセットによってコードされるいずれかの天然アミノ酸、またはトリプトファンもしくはグリシンもしくはその混合物であり、ｎは４から１４であり、
Ｘ２は、ＫＳＧ、ＤＶＫ、ＤＳＧ、ＮＶＴ、ＫＳＧ、ＮＮＳ、ＸＹＺ、ＮＮＫのコドンセットでコードされるいずれかの天然アミノ酸、またはチロシン、フェニルアラニン、セリン、アラニン、グリシン、ロイシンもしくはトリプトファンであり、
Ｘ３は、Ｘ２がフェニルアラニンまたはロイシンのときは存在せず、あるいは存在する場合には、アラニン、バリン、アスパラギン酸またはグリシンであり、
Ｘ４は、Ｘ２がフェニルアラニンまたはロイシンのときは存在せず、あるいは存在する場合はメチオニンであり、
Ｘ５はアスパラギン酸、アラニン、バリンまたはグリシンであり、
Ｘ６はチロシンまたはバリンであるポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドが重鎖抗体可変ドメインである請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
Ｘ３がアラニンであり、Ｘ４がメチオニンであり、Ｘ５がアスパラギン酸であり、Ｘ６がチロシンである請求項２に記載の抗体可変ドメイン。
【請求項４】
Ｘ２がチロシンである請求項２に記載の抗体可変ドメイン。
【請求項５】
Ｘ２がロイシンまたはフェニルアラニンであり、Ｘ３およびＸ４が存在せず、Ｘ５がアスパラギン酸であり、Ｘ６がチロシンである請求項２に記載の抗体可変ドメイン。
【請求項６】
ｎが６である請求項３に記載の抗体可変ドメイン。
【請求項７】
ｎが６である請求項５に記載の抗体可変ドメイン。
【請求項８】
ｎが６、７または８である請求項２に記載の抗体可変ドメイン。
【請求項９】
抗体４Ｄ５のＣＤＲＨ３においてＸ１がアミノ酸位置９５に対応し、ｎが６であり、Ｘ２がアミノ酸位置１００ａに対応し、Ｘ３がアミノ酸位置１００ｂに対応する、請求項２に記載の抗体可変ドメイン。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子を含む核酸。
【請求項１１】
請求項１０に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１２】
複製可能な発現ベクターである、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】
前記ベクターが、ｌａｃ Ｚプロモーター系、アルカリホスファターゼｐｈｏ Ａプロモーター（Ａｐ）、バクテリオファージλＰＬプロモーター（温度感受性プロモーター）、ｔａｃプロモーター、トリプトファンプロモーターおよびバクテリオファージＴ７プロモーターからなる群から選ばれるポリペプチドと結合したプロモーター領域を持つ、請求項１２に記載のベクター。
【請求項１４】
請求項１から９のいずれかに記載のポリペプチドがその表面に提示されているウイルス。
【請求項１５】
少なくとも１×１０８個の複数の請求項１から９のいずれかに記載の異なるポリペプチド配列を含むライブラリー。
【請求項１６】
請求項１２に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１７】
ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２またはＣＤＲＬ３からなる群から選ばれる少なくとも１つ、２つ、３つ、４つまたはすべての変異体ＣＤＲをさらに含み、少なくとも１つのＣＤＲは少なくとも１つの溶媒に露出した非常に多様なアミノ酸位置に変異体アミノ酸を有し、前記変異体アミノ酸は非ランダムコドンセットによってコードされ、前記非ランダムコドンセットによってコードされるアミノ酸の少なくとも７０％は周知の抗体可変ドメインにおけるその位置の対象アミノ酸である、請求項１から９のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１８】
前記非ランダムコドンセットによってコードされるアミノ酸が少なくとも５０％の公知の抗体可変ドメインの対応する位置で見られるアミノ酸を含む、請求項１７に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
前記変異体ＣＤＲがＣＤＲＨ１またはＣＤＲＨ２または両方である、請求項１から９および１７から１８のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項２０】
変異体ＣＤＲＨ３においてＸ１が抗体４Ｄ５のＣＤＲＨ３のアミノ酸９５に対応し、ｎが６であり、Ｘ２がアミノ酸１００ａに対応し、Ｘ３がアミノ酸１００ｂに対応し、Ｘ６がアミノ酸１０２に対応する、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
ＣＤＲＨ３においてＸ３がアラニンであり、Ｘ４がメチオニンであり、Ｘ５がアスパラギン酸であり、Ｘ６がチロシンである、請求項２０に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
ＣＤＲＨ３においてＸ２がフェニルアラニンまたはロイシンであり、Ｘ３およびＸ４が存在せず、Ｘ５がアスパラギン酸であり、Ｘ６がチロシンである、請求項２０に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
ＣＤＲＨ１がアミノ酸位置２８、３０、３１、３２および３３の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つまたはすべての位置に変異体アミノ酸を含み、ＣＤＲＨ２がアミノ酸位置５０、５２、５３、５４、５６および５８の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはすべての位置に変異体アミノ酸を含む、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
ＣＤＲＨ１およびＣＤＲＨ２の各変異体アミノ酸位置が変異体アミノ酸を有し、
１）ＣＤＲＨ１において、
ａ）位置２８の変異体アミノ酸はコドンセットＡＶＴまたはＷＣＣによってコードされるか、あるいはトレオニンであり、
ｂ）位置３０の変異体アミノ酸はコドンセットＲＶＭまたはＡＶＴによってコードされ、
ｃ）位置３１の変異体アミノ酸はコドンセットＲＶＭ、ＲＶＴまたはＲＲＴによってコードされ、
ｄ）位置３２の変異体アミノ酸はコドンセットＷＭＹによってコードされ、
ｅ）位置３３の変異体アミノ酸はコドンセットＫＶＫ、ＲＮＴ、ＤＭＴ、ＫＭＴまたはＫＧＧまたはコドンセットＫＭＴとＫＧＧの組合せによってコードされ、
また、
２）ＣＤＲＨ２において、
ａ）位置５０の変異体アミノ酸はコドンセットＫＤＴまたはＤＢＧまたはコドンセットＤＧＧとＤＨＴの組合せによってコードされ、
ｂ）位置５２の変異体アミノ酸はコドンセットＤＨＴまたはＤＭＴによってコードされ、
ｃ）位置５３の変異体アミノ酸はコドンセットＮＭＴまたはＤＭＴによってコードされ、
ｄ）位置５４の変異体アミノ酸はコドンセットＤＭＫ、ＤＭＴまたはＲＲＣによってコードされ、
ｅ）位置５６の変異体アミノ酸はコドンセットＤＭＫまたはＤＭＴによってコードされ、
ｆ）位置５８の変異体アミノ酸はコドンセットＤＭＴまたはＤＡＣによってコードされる、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
変異体ＣＤＲＨ３においてＸ１が抗体４Ｄ５のＣＤＲＨ３のアミノ酸位置９５に対応し、ｎが６であり、Ｘ２がアミノ酸位置１００ａに対応し、Ｘ３がアミノ酸位置１００ｂに対応し、Ｘ６がアミノ酸位置１０２に対応する、請求項２４に記載の抗体可変ドメイン。
【請求項２６】
ａ）請求項１から９および１７から２５のいずれかに記載の重鎖抗体可変ドメイン、
ｂ）変異体ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３またはその混合物を含む軽鎖抗体可変ドメインを含む
少なくとも２つの抗体可変ドメインを含むポリペプチドであって、
ｉ）少なくとも１つの変異体ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２またはＣＤＲＬ３またはその混合物は少なくとも１つの溶媒に露出した非常に多様なアミノ酸位置に変異体アミノ酸を有し、前記変異体アミノ酸は非ランダムコドンセットによってコードされ、前記非ランダムコドンセットによってコードされるアミノ酸の少なくとも７０％は周知の抗体可変ドメインにおけるその位置の対象アミノ酸であるポリペプチド。
【請求項２７】
ＣＤＲＬ１がアミノ酸位置２８、２９、３０、３１および３２の１つまたは複数の位置に変異体アミノ酸を含み、
ＣＤＲＬ２がアミノ酸位置５０および５３の１つまたは複数の位置に変異体アミノ酸を含み、
ＣＤＲＬ３がアミノ酸位置９１、９２、９３、９４および９６の１つまたは複数の位置に変異体アミノ酸を含む、請求項２６に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
各ＣＤＲの各変異体アミノ酸位置が変異体アミノ酸を有し、
１）ＣＤＲＬ１において、
ａ）位置２８の変異体アミノ酸はＲＤＴによってコードされ、
ｂ）位置２９の変異体アミノ酸はＲＫＴまたはＲＴＴによってコードされ、
ｃ）位置３０の変異体アミノ酸はＲＶＷによってコードされ、
ｄ）位置３１の変異体アミノ酸はコドンセットＲＶＷまたはＡＮＷによってコードされ、
ｅ）位置３２の変異体アミノ酸はコドンセットＤＨＴまたはＴＨＴによってコードされ、
２）ＣＤＲＬ２において、
ａ）位置５０の変異体アミノ酸はコドンセットＫＢＧによってコードされ、
ｂ）位置５３の変異体アミノ酸はコドンセットＡＶＣによってコードされ、
３）ＣＤＲＬ３において、
ａ）位置９１の変異体アミノ酸はコドンセットＫＭＴまたはＴＭＴまたはコドンセットＴＭＴとＳＲＴの組合せによってコードされ、
ｂ）位置９２の変異体アミノ酸はコドンセットＤＨＴまたはＤＭＣによってコードされ、
ｃ）位置９３の変異体アミノ酸はコドンセットＲＶＴまたはＤＨＴによってコードされ、
ｄ）位置９４の変異体アミノ酸はＮＨＴまたはＷＨＴによってコードされ、
ｅ）位置９６の変異体アミノ酸はコドンセットＹＨＴ、ＨＷＴ、ＨＴＴまたはＴＤＫまたはコドンセットＹＫＧとＴＷＴの組合せによってコードされる、請求項２６から２７のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項２９】
変異体ＣＤＲＨ３においてＸ１が抗体４Ｄ５のＣＤＲＨ３のアミノ酸位置９５に対応し、ｎが６であり、Ｘ２がアミノ酸位置１００ａに対応し、Ｘ３がアミノ酸位置１００ｂに対応し、Ｘ６がアミノ酸位置１０２に対応する、請求項２８に記載のポリペプチド。
【請求項３０】
さらに重鎖抗体可変ドメインのＣ末端領域と結合した二量体化ドメインを含む、請求項１から９および１７から２９のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項３１】
前記二量体化ドメインがロイシンジッパードメインまたは少なくとも１つのシステイン残基を含む配列を含む、請求項３０に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
前記二量体化ドメインが抗体からのヒンジ領域およびロイシンジッパーを含む、請求項３１に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
前記二量体化ドメインが単一のシステインである、請求項３０に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３からなる群から選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはすべてのＣＤＲを含むポリペプチドであって、
（ａ）ＣＤＲＬ１は、アミノ酸位置２８、２９、３０、３１および３２の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つまたはすべての位置に変異体アミノ酸を含み、
（ｂ）ＣＤＲＬ２は、アミノ酸位置５０および５３の少なくとも一方または両方の位置に変異体アミノ酸を含み、
（ｃ）ＣＤＲＬ３は、アミノ酸位置９１、９２、９３、９４および９６の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つまたはすべての位置に変異体アミノ酸を含み、
（ｄ）ＣＤＲＨ１は、アミノ酸位置２８、３０、３１、３２および３３の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つまたはすべての位置に変異体アミノ酸を含み、
（ｅ）ＣＤＲＨ２は、アミノ酸位置５０、５２、５３、５４、５６および５８の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはすべての位置に変異体アミノ酸を含み、
（ｆ）ＣＤＲＨ３は、アミノ酸位置９５、９６、９７、９８、９９、１００、１００ａ、１００ｂ、１００ｃ、１０１および１０２の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはすべての位置に変異体アミノ酸を含み、
前記アミノ酸位置は、カバットナンバリングシステムに対応し、（ａ）から（ｅ）の変異体アミノ酸のそれぞれは非ランダムコドンセットでコードされ、前記非ランダムコドンセットによってコードされるアミノ酸の少なくとも約５０％から９０％、またはすべてが抗体可変ドメインにおけるそのアミノ酸位置の対象アミノ酸であり、（ｆ）の少なくとも１つの変異体アミノ酸は、コドンセットＮＮＫ、ＮＮＳ、ＤＶＫ、ＸＹＺまたはＮＶＴまたはその混合体によってコードされるポリペプチド。
【請求項３５】
前記ポリペプチドが重鎖抗体可変ドメインまたは軽鎖抗体可変ドメイン、またはその両方を含む、請求項３４に記載のポリペプチド。
【請求項３６】
請求項１から９および１７から３５のいずれかに記載のポリペプチドを含む融合ポリペプチドであって、重鎖可変ドメインがウイルスコートタンパク質の少なくとも一部と融合している融合ポリペプチド。
【請求項３７】
前記ウイルスコートタンパク質がタンパク質ｐＩＩＩ、主コートタンパク質ｐＶＩＩＩ、Ｓｏｃ、Ｈｏｃ、ｇｐＤ、ｐｖ１およびその変異体からなる群から選択される、請求項３６に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３８】
前記重鎖可変ドメインとウイルスコートタンパク質との間に二量体化ドメインをさらに含む、請求項３６に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３９】
ペプチドタグと融合した軽鎖可変ドメインをさらに含む、請求項３５に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４０】
前記ペプチドタグがｇＤ、ｃ−ｍｙｃ、ｐｏｌｙ−ｈｉｓ、蛍光タンパク質およびβ−ガラクトシダーゼからなる群から選択される、請求項３９に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４１】
さらに単一の抗体鋳型からの各可変ドメインに対するＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３またはＦＲ４を含む、請求項１から９および１７から４０のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項４２】
各ＦＲが抗体４Ｄ５の配列（配列番号１）を有する、請求項４１に記載のポリペプチド。
【請求項４３】
抗体４Ｄ５の重鎖のアミノ酸位置４９、９３、９４または９７の１つ、２つ、３つまたはすべての位置の重鎖ＦＲ残基および軽鎖のアミノ酸位置６６が変更された、請求項４２に記載のポリペプチド。
【請求項４４】
位置４９の重鎖ＦＲがアラニンまたはグリシンであり、位置９３ではアラニンまたはセリンであり、位置９４ではアルギニンまたはリジンまたはトレオニンであり、位置７１ではアルギニン、バリンまたはアラニンである、請求項３６に記載のポリペプチド。
【請求項４５】
請求項１７から４４のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子を含む核酸。
【請求項４６】
請求項４５に記載の核酸を含むベクター。
【請求項４７】
複製可能な発現ベクターである、請求項４６に記載のベクター。
【請求項４８】
前記複製可能な発現ベクターがＭ１３、ｆ１、ｆｄ、Ｐｆ３ファージもしくはその誘導体、またはラムドイドファージ、例えばラムダ、２１、ｐｈｉ８０、ｐｈｉ８１、８２、４２４、４３４など、もしくはその誘導体である、請求項４７に記載のベクター。
【請求項４９】
請求項１７から４４のいずれかに記載のポリペプチドがその表面に提示されているウイルス。
【請求項５０】
請求項１７から４４のいずれかに記載の複数のポリペプチドを含むライブラリーであって、少なくとも１×１０８の異なる抗体可変ドメイン配列を有するライブラリー。
【請求項５１】
請求項４７に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項５２】
複数のポリペチドを含む組成物を作製する方法であって、
ａ）ＣＤＲＨ１またはＣＤＲＨ２またはＣＤＲＨ３またはその混合物の少なくとも１つの変異体ＣＤＲを含む複数のポリペプチドを作製するステップを含み、
ｉ）変異体ＣＤＲＨ３を含む複数のポリペプチドは、下記アミノ酸配列の１つまたは複数のアミノ酸位置を置換することによって形成され、
（Ｘ１）ｎ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６、
式中、Ｘ１は、ＮＮＫ、ＮＮＳ、ＤＶＫ、ＮＶＴ、ＸＹＺのコドンセットによってコードされるいずれかの天然アミノ酸、またはトリプトファンもしくはグリシンもしくはその混合物であり、ｎは４から１４であり、
Ｘ２は、ＫＳＧ、ＤＶＫ、ＤＳＧ、ＮＶＴ、ＫＳＧ、ＮＮＳ、ＸＹＺ、ＮＮＫのコドンセットでコードされるいずれかの天然アミノ酸、またはチロシン、フェニルアラニン、セリン、アラニン、グリシン、ロイシンもしくはトリプトファンであり、
Ｘ３は、Ｘ２がフェニルアラニンまたはロイシンのときは存在せず、あるいは存在する場合には、アラニン、バリン、アスパラギン酸またはグリシンであり、
Ｘ４は、Ｘ２がフェニルアラニンまたはロイシンのときは存在せず、あるいは存在する場合はメチオニンであり、
Ｘ５はアスパラギン酸、アラニン、バリンまたはグリシンであり、
Ｘ６はチロシンまたはバリンであり、
ｉｉ）少なくとも１つの溶媒に露出した非常に多様な位置に少なくとも１つの変異体アミノ酸を含む複数の変異体ＣＤＲＨ１またはＣＤＲＨ２またはその両方を形成するステップを含み、前記変異体アミノ酸は非ランダムコドンセットによってコードされ、前記非ランダムコドンセットによってコードされるアミノ酸の少なくとも７０％は周知の抗体可変ドメインにおけるその位置の対象アミノ酸である方法。
【請求項５３】
さらに、
ｉ）変異体ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２またはＣＤＲＬ３またはその混合物を含む複数のポリペプチドを生成するステップを含み、前記変異体ＣＤＲは溶媒に露出し非常に多様な位置の少なくとも１つの変異体アミノ酸で形成され、前記変異体アミノ酸は非ランダムコドンセットによってコードされ、前記非ランダムコドンセットによってコードされるアミノ酸の少なくとも７０％は周知の抗体可変ドメインにおけるその位置の対象アミノ酸である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
対象抗原に結合する抗原結合可変ドメインを選択する方法であって、
ａ）請求項１から９および１７から４４のいずれかに記載の複数のポリペプチドを含む組成物を作製するステップと、
ｂ）組成物から対象抗原に結合するポリペプチド結合体を選択するステップと、
ｃ）前記ポリペプチド結合体を非結合体から単離するステップと、
ｅ）単離されたポリペプチド結合体から高親和性結合体を同定するステップとを含む方法。
【請求項５５】
抗体可変ドメインのライブラリーから対象抗原に結合する抗原結合可変ドメインを選択する方法であって、
ａ）請求項１から９および１７から４４のいずれかに記載の抗体可変ドメインのライブラリーを対象抗原と接触させて結合体を形成するステップと、
ｂ）前記結合体を非結合体から分離し、この結合体を前記対象抗原から溶出させ、この結合体を濃度を段階的に約０．１ｎＭから１０００ｎＭまで下げた前記対象抗原の溶液でインキュベートするステップと、
ｃ）最も低い濃度の前記対象抗原と結合することができ、約０．１ｎＭから２００ｎＭの親和性を有する結合体を選択するステップとを含む方法。
【請求項５６】
前記対象抗原がＶＥＧＦ、ＩＧＦ−１またはＨｅｒ−２である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記対象抗原の濃度が約１００から２５０ｎＭである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記対象抗原の濃度が約２５から１００ｎＭである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
ポリペプチドのライブラリーから対象抗原に結合するポリペプチドを選択する方法であって、
ａ）請求項１から９および１７から４４のいずれかに記載の複数のポリペプチドを含んでいるライブラリーを結合に適した条件下で固定化対象抗原と接触させることにより対象抗原に結合するポリペプチド結合体を単離するステップと、
ｂ）前記ライブラリーのポリペプチド結合体を非結合体から分離し、前記対象抗原から結合体を溶出させて、結合体に富む小集団を得るステップと、
ｃ）任意選択に、各回、前の回の選択から得た結合体小集団を用いてａ）からｂ）のステップを少なくとも２回繰り返すステップとを含む方法。
【請求項６０】
請求項５９に記載の選択方法であって、さらに、
ｆ）前記ポリペプチド結合体の小集団を、結合して混合物を形成するのに適した条件下で０．１ｎＭから１０００ｎＭの濃度の標識された対象抗原とインキュベートするステップと、
ｇ）前記混合物を前記対象抗原上の標識と結合する固定化因子と接触させるステップと、
ｈ）標識された対象抗原と結合した前記ポリペプチド結合体を検出して、前記標識された対象抗原からこのポリペプチド結合体を溶出させるステップと、
ｉ）任意選択に、各回、前の回の選択から得た結合体小集団を用い、また前の回よりも低い濃度の標識対象抗原を用いてｆ）からｉ）のステップを少なくとも２回繰り返すステップとを含む方法。
【請求項６１】
前記混合物に過剰な量の非標識対象抗原を加え、標識された対象抗原から低親和性結合体を溶出させるのに十分な時間インキュベートするステップをさらに含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
対象抗原に結合する高親和性結合体を複製可能な発現ベクターのライブラリーから単離する方法であって、
ａ）請求項１から９および１７から４４のいずれかに記載の複数のポリペプチドを含むライブラリーを、少なくとも約０．１ｎＭから１０００ｎＭの濃度の前記対象抗原と接触させて、対象抗原に結合するポリペプチド結合体を単離するステップと、
ｂ）前記ポリペプチド結合体を前記対象抗原から分離してポリペプチド結合体に富む小集団を得るステップと、
ｃ）任意選択に、各回、前の回の選択から得た結合体小集団を用い、また前の回よりも低い濃度の対象抗原を用いてａ）からｂ）のステップを少なくとも２回繰り返して、最も低い濃度の対象抗原と結合するポリペプチド結合体を分離するステップとを含む方法。
【請求項６３】
請求項１から９および１７から４４のいずれかに記載の複数のポリペプチドを含んでいるライブラリーからポリペプチド結合体を選択するための検定法であって、
ａ）前記ライブラリーを、結合してポリペプチド結合体と標識された対象抗原の複合体を形成するのに適した条件下で、０．１ｎＭから１０００ｎＭの濃度の標識された対象抗原と接触させるステップと、
ｂ）前記複合体を単離し、前記ポリペプチド結合体を前記標識された対象抗原から分離して結合体に富む小集団を得るステップと、
ｃ）任意選択に、各回、前の回の選択から得た結合体小集団を用い、また前の回よりも低い濃度の対象抗原を用いてａ）からｂ）のステップを少なくとも２回繰り返すステップとを含む検定法。
【請求項６４】
前記ポリペプチド結合体と対象抗原の複合体に過剰な量の非標識対象抗原を加えるステップをさらに含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記ステップが２回繰り返され、対象の濃度が、第１回目の選択では約１００ｎＭから２５０ｎＭであり、第２回目の選択では約２５ｎＭから１００ｎＭであり、第３回目の選択では約０．１ｎＭから２５ｎＭである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
請求項１から９および１７から４４のいずれかに記載の複数のポリペプチドを含んでいるライブラリーをスクリーニングする方法であって、
ａ）前記ポリペプチドと対象抗原との結合に適した条件下で、前記ライブラリーの第１の試料をある濃度の前記対象抗原とインキュベートするステップと、
ｂ）前記ライブラリーの第２の試料を、対象抗原を加えないでインキュベートするステップと、
ｃ）第１と第２の試料のそれぞれを、前記ポリペプチドと固定化された対象抗原との結合に適した条件下で、この固定化対象抗原と接触させるステップと、
ｄ）各試料について、固定化された対象抗原に結合したポリペプチドを検出するステップと、
ｅ）第１の試料の結合したポリペプチドの量と第２の試料の結合したポリペプチドの量の比率を計算することによって、前記対象抗原に対するポリペプチドの親和性を決定するステップとを含む方法。
【請求項６７】
下記ステップ、
ａ）ＣＤＲＬ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１、Ｈ２およびＨ３からなる群から選択されるソース抗体の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはすべてのＣＤＲを含むソース抗体の軽鎖可変ドメイン、重鎖可変ドメインまたはその両方をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを構築するステップと、
ｂ）非ランダムコドンセットを用いて前記ソース抗体の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはすべてのＣＤＲを少なくとも１つの溶媒に露出する、非常に多様なアミノ酸位置で突然変異させるステップとを含み、前記非ランダムコドンセットによってコードされるアミノ酸の少なくとも５０％は天然抗体におけるその位置の対象アミノ酸である方法。
【請求項６８】
前記ＣＤＲＨ３が下記アミノ酸配列を含み、
（Ｘ１）ｎ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｄ−Ｘ５、
前記ＣＤＲＨ３を少なくとも１つのアミノ酸位置で突然変異させ、
前記突然変異は、下記突然変異からなる群から選択される方法：
Ｘ１は、ＮＮＫ、ＮＮＳ、ＤＶＫ、ＮＶＴ、ＸＹＺのコドンセットによってコードされるいずれかの天然アミノ酸、またはトリプトファンもしくはグリシンもしくはその混合物であり、ｎは４から１４であり、
Ｘ２は、ＫＳＧ、ＤＶＫ、ＤＳＧ、ＮＶＴ、ＫＳＧ、ＮＮＳ、ＸＹＺ、ＮＮＫのコドンセットでコードされるいずれかの天然アミノ酸、またはチロシン、フェニルアラニン、セリン、アラニン、グリシン、ロイシンもしくはトリプトファンであり、
Ｘ３はＸ２がフェニルアラニンまたはロイシンのときは存在せず、あるいは存在する場合には、アラニン、バリン、アスパラギン酸またはグリシンであり、
Ｘ４はＸ２がフェニルアラニンまたはロイシンのときは存在せず、あるいは存在する場合はメチオニンであり、
Ｘ５はアスパラギン酸、アラニン、バリンまたはグリシンであり、
Ｘ６はチロシンまたはバリンである
請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
ＣＤＲＨ１を抗体４Ｄ５のアミノ酸２８、３０、３１、３２および３３に対応するアミノ酸位置で突然変異させ、ＣＤＲＨ２を抗体４Ｄ５のアミノ酸位置５０、５２、５３、５４、５６および５８に対応するアミノ酸位置で突然変異させる、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
Ｘ１が抗体４Ｄ５のアミノ酸位置９５に対応しｎが６であり、Ｘ２が抗体４Ｄ５のアミノ酸位置１００ａに対応し、Ｘ３が抗体４Ｄ５のアミノ酸位置１００ｂに対応し、Ｘ４が抗体４Ｄ５のアミノ酸位置１００ｃに対応し、Ｘ５が抗体４Ｄ５のアミノ酸位置１０２に対応する、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
以下のアミノ酸配列を含む変異体ＣＤＲＨ３領域を含むポリペプチドであって、
（Ｘ１）ｎ−Ｘ２−Ａ−Ｍ−Ｄ−Ｙ、
式中、Ｘ１は、ＮＮＫ、ＮＮＳ、ＤＶＫ、ＮＶＴ、ＸＹＺのコドンセットによってコードされるいずれかの天然アミノ酸、またはトリプトファンもしくはグリシンもしくはその混合物であり、ｎは４から１４であり、
Ｘ２は、ＫＳＧ、ＤＶＫ、ＤＳＧ、ＮＶＴ、ＫＳＧ、ＮＮＳ、ＸＹＺ、ＮＮＫのコドンセットでコードされるいずれかの天然アミノ酸、またはチロシン、グリシン、フェニルアラニン、セリン、アラニン、ロイシンもしくはトリプトファンであり、
Ａはアラニンであり、Ｍはメチオニンであり、Ｄはアスパラギン酸であり、Ｙはチロシンであるポリペプチド。
【請求項７２】
以下のアミノ酸配列を含む変異体ＣＤＲＨ３領域を含むポリペプチドであって、
（Ｘ１）ｎ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６、
式中、Ｘ１は、ＮＮＫ、ＮＮＳ、ＤＶＫ、ＮＶＴ、ＸＹＺのコドンセットによってコードされるいずれかの天然アミノ酸、またはトリプトファンもしくはグリシンもしくはその混合物であり、ｎは４から１４であり、
Ｘ２はフェニルアラニンまたはロイシンであり、
Ｘ３は存在せず、
Ｘ４は存在せず、
Ｘ５はアスパラギン酸、アラニン、バリンまたはグリシンであり、
Ｘ６はチロシンまたはバリンであるポリペプチド。
【請求項７３】
Ｘ２がフェニルアラニンであり、Ｘ５がアスパラギン酸であり、Ｘ６がチロシンである、請求項７２に記載のポリペプチド。
【請求項７４】
位置９５がコドンセットＤＶＫ、ＮＶＴ、ＮＮＳ、ＸＹＺ、ＮＮＫによってコードされる変異体アミノ酸を持つことができ、またはトリプトファンであり、位置９６が、ＤＶＫ、ＮＶＴ、ＮＮＳ、ＸＹＺによってコードされてよく、またはグリシンもしくはトリプトファンであり、位置９７がＤＶＫ、ＮＶＴ、ＮＮＳ、ＸＹＺによってコードされてよく、またはトリプトファンであり、位置９８がＤＶＫ、ＮＶＴ、ＮＮＳ、ＸＹＺによってコードされてよく、またはトリプトファンであり、位置９９がＤＶＫ、ＮＶＴ、ＮＮＳ、ＸＹＺによってコードされてよく、位置１００がＤＶＫ、ＮＶＴ、ＮＮＳ、ＸＹＺによってコードされてよく、またはトリプトファンであり、位置１００ａが、ＤＶＫ、ＤＳＧ、ＫＳＧ、ＮＶＴ、ＮＮＳ、ＸＹＺによってコードされてよく、またはチロシン、グリシン、セリン、アラニン、トリプトファン、アスパラギン酸、メチオニン、フェニルアラニン、ロイシン、バリンでもよく、位置１００ｂが、ＤＳＧ、ＫＳＧ、ＸＹＺによってコードされてよく、またはアラニン、チロシン、グリシン、バリン、アスパラギン酸、メチオニンもしくはフェニルアラニンであり、位置１００ｃが、ＫＳＧ、ＸＹＺによってコードされてよく、またはメチオニン、フェニルアラニン、ロイシン、アラニン、グリシン、バリン、チロシン、アスパラギン酸であり、位置１０１が、ＫＳＧ、ＸＹＺによってコードされてよく、またはアスパラギン酸、メチオニン、アラニン、バリン、グリシン、チロシン、フェニルアラニン、ロイシンであり、位置１０２がＫＳＧもしくはＸＹＺによってコードされてよく、またはチロシン、アスパラギン酸、メチオニン、アラニン、バリン、グリシンである、請求項３５に記載のポリペプチド。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４Ａ】
【図３４Ｂ】
【図３４Ｃ】
【図３４Ｄ】
【図３５】
【図３６】
【図３７Ａ】
【図３７Ｂ】
【図３７Ｃ】
【図３７Ｄ】
【図３７Ｅ】
【図３７Ｆ】
【図３８Ａ】
【図３８Ｂ】
【図３８Ｃ】
【図３８Ｄ】
【図３８Ｅ】
【図３８Ｆ】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図４５】
【図４６】
【図４７】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４Ａ】
【図３４Ｂ】
【図３４Ｃ】
【図３４Ｄ】
【図３５】
【図３６】
【図３７Ａ】
【図３７Ｂ】
【図３７Ｃ】
【図３７Ｄ】
【図３７Ｅ】
【図３７Ｆ】
【図３８Ａ】
【図３８Ｂ】
【図３８Ｃ】
【図３８Ｄ】
【図３８Ｅ】
【図３８Ｆ】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図４５】
【図４６】
【図４７】
【公開番号】特開２０１０−２３３５７３（Ｐ２０１０−２３３５７３Ａ）
【公開日】平成２２年１０月２１日（２０１０．１０．２１）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１０−１１５６９０（Ｐ２０１０−１１５６９０）
【出願日】平成２２年５月１９日（２０１０．５．１９）
【分割の表示】特願２００４−５１０３９９（Ｐ２００４−５１０３９９）の分割
【原出願日】平成１５年６月３日（２００３．６．３）
【出願人】（５０９０１２６２５）ジェネンテック， インコーポレイテッド (357)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１０月２１日（２０１０．１０．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１１５６９０（Ｐ２０１０−１１５６９０）
【出願日】平成２２年５月１９日（２０１０．５．１９）
【分割の表示】特願２００４−５１０３９９（Ｐ２００４−５１０３９９）の分割
【原出願日】平成１５年６月３日（２００３．６．３）
【出願人】（５０９０１２６２５）ジェネンテック， インコーポレイテッド (357)
【Ｆターム（参考）】
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