同じ属に属する菌またはウイルスの同定方法
【課題】 迅速、高感度かつ特異的に、同じ属に属する２種類以上の菌またはウイルスを同定する方法を提供すること。
【解決手段】 同じ属に属するｎ種類（ｎは２以上）の菌またはウイルスに由来する特定核酸中のそれぞれ一部の配列と相補的２本鎖を形成可能なｎ種類のオリゴヌクレオチドプローブを用いて、同じ属に属するｎ種類の菌またはウイルスを同定する方法であって、前記特定核酸の配列は同定する菌またはウイルス間で相同性の高い配列であり、前記オリゴヌクレオチドプローブは前記特定核酸中の一部の配列と相補的２本鎖を形成すると形成前と比較し蛍光特性が変化するプローブであり、前記オリゴヌクレオチドプローブによる蛍光特性の変化量は前記オリゴヌクレオチドプローブで同定する菌またはウイルスにより異なる、同定方法により前記課題を解決する。
【解決手段】 同じ属に属するｎ種類（ｎは２以上）の菌またはウイルスに由来する特定核酸中のそれぞれ一部の配列と相補的２本鎖を形成可能なｎ種類のオリゴヌクレオチドプローブを用いて、同じ属に属するｎ種類の菌またはウイルスを同定する方法であって、前記特定核酸の配列は同定する菌またはウイルス間で相同性の高い配列であり、前記オリゴヌクレオチドプローブは前記特定核酸中の一部の配列と相補的２本鎖を形成すると形成前と比較し蛍光特性が変化するプローブであり、前記オリゴヌクレオチドプローブによる蛍光特性の変化量は前記オリゴヌクレオチドプローブで同定する菌またはウイルスにより異なる、同定方法により前記課題を解決する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、迅速、高感度かつ特異的に、同じ属に属する２種類以上の菌またはウイルスを同定する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌は、抗酸性の性質を持つグラム陽性桿菌であり、抗酸菌とも呼ばれる。抗酸菌には重篤な病変を引き起こす病原菌が多く、その中でもＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（結核菌）はヒトに結核を引き起こす病原体であり、その検査は臨床上極めて重要である。また結核菌の他にも、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉなどの非結核性抗酸菌が、ヒトに病原性を示すことが知られている。
【０００３】
非結核性抗酸菌は結核菌と同様、ヒトの肺、リンパ節、皮膚などを冒し、特に肺に感染する症例が多い。非結核性抗酸菌は、結核菌のようにヒトからヒトへの感染は起こらないが、結核菌に対する薬剤に耐性を有しており、有効な薬剤はほとんどない。このように抗酸菌感染に対する治療法は菌種の違いにより異なることから、抗酸菌の検査では菌種を迅速に同定することが不可欠となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許２９８５４４６号公報
【特許文献２】特開２０００−０１４４００号公報
【特許文献３】特開２００５−２１８３１７号公報
【特許文献４】米国特許５９２５５１７号公報
【特許文献５】米国特許６１０３４７６号公報
【特許文献６】米国特許５２１００１５号公報
【特許文献７】米国特許５４８７９７２号公報
【特許文献８】特許３４３７８１６号公報
【特許文献９】米国特許５０１１７６９号公報
【特許文献１０】米国特許５４０３７１１号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｉｓｈｉｇｕｒｏ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３１４，７７−８６（２００３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
前述したように、抗酸菌の検査では、感染した抗酸菌の菌種により治療法が異なるため、菌種を迅速に同定することが不可欠である。抗酸菌の検査において、ヒトに結核を引き起こすＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（結核菌）の同定が重要なのはいうまでもないが、非結核性抗酸菌の中でも、出現頻度の高いＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉの同定は重要であり、特に出現頻度の高いＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍとＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅの同定が重要である。
【０００７】
感染した抗酸菌の菌種を同定する際、臨床症状から同定するのは極めて困難である。また一般に抗酸菌は発育が遅く、培養を用いた検査法ではかなりの時間を要する。したがって抗酸菌の菌種を迅速に同定するには、抗酸菌に由来する特定領域の核酸（特定核酸）を増幅させて検出する方法が有効である。
【０００８】
本出願人は以前、試料に含まれる特定領域の核酸（特定核酸）を、核酸と反応することにより蛍光特性が変化する蛍光色素の存在下で、ＰＣＲ法による増幅を行ない、前記蛍光特性の変化を測定することで、試料中の核酸を検出する方法を発明している（特許文献１）。また本出願人は以前、標的ＲＮＡに対して、プライマーセット（そのうちの一方はプロモーター配列を含む）、逆転写酵素および必要に応じてリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）により、プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを合成し、ＲＮＡポリメラーゼによって標的となるＲＮＡの特定塩基配列を含むＲＮＡを合成し、当該ＲＮＡを引き続きプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型とする連鎖反応により、簡便にＲＮＡを増幅する方法を発明している（特許文献２および非特許文献１）。さらに、特許文献２および非特許文献１では、前述の方法で増幅したＲＮＡの検出に、インターカレーター性蛍光色素で標識され、かつ標的ＲＮＡと相補的２本鎖を形成すると、当該相補的２本鎖部分に前記蛍光色素がインターカレートして蛍光特性が変化（蛍光強度が増加）するよう設計されたオリゴヌクレオチドプローブ（以下、ＩＮＡＦプローブとする）を用いており、前述したＲＮＡ増幅方法および前記プローブにより、簡便、一定温度、かつ一段階でのＲＮＡ増幅および検出を可能にしている。
【０００９】
特許文献２および非特許文献１で開示のＲＮＡ増幅検出法のうち、増幅したＲＮＡの検出に用いるＩＮＡＦプローブは、標識するインターカレーター性蛍光色素が同じであっても、標的ＲＮＡが異なると、その蛍光特性（蛍光強度の増加率）は異なる（特許文献３）。したがって、特許文献２および非特許文献１で開示のＲＮＡ増幅検出法を用いて菌またはウイルスの同定を行なおうとした場合、同定対象の菌またはウイルス由来の標的ＲＮＡがそれぞれ異なる（例えば、一方がｒＲＮＡで他方がｍＲＮＡ）のであれば、前記プローブの蛍光特性の違いから同定が可能といえる。しかしながら、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）またはリボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）を用いたマイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌間の同定、ｒＲＮＡまたはｒＤＮＡを用いたレジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）属菌間の同定、構造蛋白領域のＲＮＡを用いたノロウイルス（Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ）各遺伝子型間の同定等のように、同じ属に属する菌間またはウイルス間で塩基配列の相同性が極めて高い標的ＲＮＡ（または標的ＤＮＡ）を用いた、菌またはウイルスの同定の場合、標的ＲＮＡ（または標的ＤＮＡ）の検出に用いるオリゴヌクレオチドプローブの塩基配列も互いに極めて近い配列となるため、前記プローブの蛍光特性の違いによる菌またはウイルスの同定が可能か、不明であった。
【００１０】
そこで本発明の目的は、菌またはウイルスの同定に用いる標的核酸の塩基配列が、同定する菌またはウイルス間で相同性が極めて高い場合でも、菌またはウイルスの同定が可能な方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記目的に鑑みて鋭意検討した結果、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち本発明の第一の態様は、
同じ属に属するｎ種類（ｎは２以上）の菌またはウイルスに由来する特定核酸のそれぞれ一部の塩基配列と相補的２本鎖を形成可能なｎ種類のオリゴヌクレオチドプローブを用いて、同じ属に属するｎ種類の菌またはウイルスを同定する方法であって、
前記特定核酸の塩基配列は、同定する菌またはウイルス間で相同性の高い配列であり、
前記オリゴヌクレオチドプローブは、前記特定核酸の一部の塩基配列と相補的２本鎖を形成すると、形成前と比較し蛍光特性が変化するプローブであり、
前記オリゴヌクレオチドプローブによる蛍光特性の変化量は、前記オリゴヌクレオチドプローブで同定する菌またはウイルスにより異なる、
前記方法である。
【００１３】
また本発明の第二の態様は、
マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属するｎ種類（ｎは２以上）の菌に由来する特定核酸のそれぞれ一部の塩基配列と相補的２本鎖を形成可能なｎ種類のオリゴヌクレオチドプローブを用いて、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属するｎ種類の菌を同定する方法であって、
前記特定核酸はリボソームＲＮＡまたはリボソームＤＮＡであり、
前記オリゴヌクレオチドプローブは、前記リボソームＲＮＡまたはリボソームＤＮＡの一部の塩基配列と相補的２本鎖を形成すると、形成前と比較し蛍光特性が変化するプローブであり、
前記オリゴヌクレオチドプローブによる蛍光特性の変化量は、前記オリゴヌクレオチドプローブで同定する菌により異なる、
前記方法である。
【００１４】
また本発明の第三の態様は、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属するｎ種類の菌が、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）およびマイコバクテリウム・イントラセルラー（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）から選ばれるｎ種類の菌である、前記第二の態様に記載の方法である。
【００１５】
また本発明の第四の態様は、ｎ種類のオリゴヌクレオチドプローブが、共通のインターカレーター性蛍光色素で標識され、かつ特定核酸の一部の塩基配列と相補的２本鎖を形成すると、形成した相補的２本鎖部分に前記蛍光色素がインターカレートすることで、形成前と比較し蛍光特性が変化するプローブである、前記第一から第三の態様のいずれかに記載の方法である。
【００１６】
また本発明の第五の態様は、特定核酸がＲＮＡであり、前記ＲＮＡは、
（１）ＲＮＡを鋳型とする、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による特定核酸の塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成する工程、
（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性を有する酵素によるＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する工程（１本鎖ＤＮＡの生成）、
（３）１本鎖ＤＮＡを鋳型とする、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による、特定核酸の塩基配列、または特定核酸の塩基配列に相補的な配列のＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による前記２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物を生成する工程、および、
（５）当該ＲＮＡ転写産物が、前記ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を生成する工程におけるｃＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的にＲＮＡ転写産物を生成する工程、
により増幅されたＲＮＡである、前記第一から第四の態様のいずれかに記載の方法である。
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１８】
本発明の同定方法で同定するｎ種類（ｎは２以上）の菌またはウイルスは、同じ属に属していればよく、一例として、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属するｎ種類の菌、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）属に属するｎ種類の菌、ノロウイルス（Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ）属に属する遺伝子群／遺伝子型の異なるｎ種類のウイルス、サポウイルス（Ｓａｐｏｖｉｒｕｓ）属に属する遺伝子群／遺伝子型の異なるｎ種類のウイルス、ロタウイルス（Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）属に属する遺伝子型の異なるｎ種類のウイルス、パピローマウイルス（Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）属に属する遺伝子型の異なるｎ種類のウイルスがあげられる。
【００１９】
本発明の同定方法において、オリゴヌクレオチドプローブを用いて検出（同定）する特定核酸は、その塩基配列の相同性が、同定するｎ種類の菌またはウイルス間で高いことを特徴としている。本発明において相同性が高いとは、同定するｎ種類の菌またはウイルス間における特定核酸の塩基配列の相同性が８０％以上のことをいい、好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上である。なお、同定するｎ種類の菌またはウイルス間における特定核酸の塩基配列の相同性が１００％、すなわち完全一致の場合は、オリゴヌクレオチドプローブによる蛍光特性の変化量が各菌またはウイルス間で同等となることが予想されるため、好ましくないといえる。同定対象が同じ属に属する菌の場合における好ましい特定核酸の一例として、同定する菌間で相同性が高い、リボソームＲＮＡ（５ＳｒＲＮＡ、５．８ＳｒＲＮＡ、１６ＳｒＲＮＡ、１８ＳｒＲＮＡ、２３ＳｒＲＮＡ、２８ＳｒＲＮＡ）またはその遺伝子（リボソームＤＮＡ）の全領域または部分領域があげられる。なおリボソームＲＮＡは１菌あたりの発現コピー数も多いことから、高感度に菌を同定する点でも、好ましいといえる。同定対象がノロウイルス属に属するウイルスの場合の一例として、ＯＲＦ１のＲＮＡポリメラーゼ領域の全領域または部分領域、ＯＲＦ２である構造蛋白（ｃａｐｓｉｄ）領域の全領域または部分領域、ＲＮＡポリメラーゼ領域と構造蛋白領域とのジャンクション（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）領域があげられる。同定対象がサポウイルス属に属するウイルスの場合の特定核酸の一例として、構造蛋白領域の全領域または部分領域があげられる。同定対象がロタウイルス属に属するウイルスの場合の特定核酸の一例として、Ｐ（ｐｒｏｔｅａｓｅ−ｃｌｅａｖｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）領域の全領域または一部領域があげられる。同定対象がパピローマウイルス属に属するウイルスの場合の特定核酸の一例として、Ｌ１遺伝子領域の全領域または一部領域があげられる。
【００２０】
本発明の同定方法で用いるオリゴヌクレオチドプローブは、同定する菌またはウイルスに由来する特定核酸の一部の配列と相補的２本鎖を形成可能なプローブであり、同定する菌またはウイルスにそれぞれ対応したプローブを用意すればよい。なお、本発明の同定方法で使用するオリゴヌクレオチドプローブは、ストリンジェントな条件で相補的２本鎖を形成可能なプローブであると好ましい。ストリンジェントな条件の具体例としては、４２℃において、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％フィコール、０．１％ポリビニルピロリドン、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）、１５０ｍＭの塩化ナトリウムまたは７５ｍＭクエン酸ナトリウムが共存する条件があげられる。本発明の同定方法で使用するオリゴヌクレオチドプローブの具体例として、同定する菌が、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する主要な菌である、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（結核菌）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍおよびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅから選ばれるｎ種類（ｎは２以上）の菌である場合、配列番号１から７に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブから選ばれるｎ種類のプローブがあげられる。
【００２１】
本発明の同定方法で使用するオリゴヌクレオチドプローブは、同定する菌またはウイルスに由来する特定核酸の一部の配列と相補的２本鎖を形成すると、形成前と比較し蛍光特性が変化するプローブである。蛍光特性が変化するプローブの一例として、モレキュラービーコン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎ）プローブ（特許文献４および５）、ＴａｑＭａｎプローブ（特許文献６および７）、Ｑ−Ｐｒｏｂｅ（特許文献８）、サイクリングプローブ（特許文献９および１０）、インターカレーター性蛍光色素で標識されたプローブ（ＩＮＡＦプローブ、特許文献２および非特許文献１）があげられる。特にＩＮＡＦプローブは、特定核酸を増幅して菌またはウイルスの同定を行なう場合、当該特定核酸の増幅反応と同時並行で同定が行なえるため、好ましい。
【００２２】
本発明の好ましい同定方法で使用するＩＮＡＦプローブで標識するインターカレーター性蛍光色素は特に限定はなく、オキサゾールイエロー、チアゾールオレンジ、エチジウムブロマイドまたはこれらの誘導体を例示できる。一例として、オキサゾールイエローは、２本鎖核酸にインターカレートすることで５１０ｎｍの蛍光（励起波長４７０ｎｍ）が顕著に増加する色素である。前記蛍光色素は、同定対象の菌またはウイルスに由来する特定核酸の一部の配列と相補的２本鎖を形成可能なオリゴヌクレオチドの５’末端側、３’末端側、リン酸ジエステル部分、塩基部分のいずれかに、適当なリンカーを介して導入すればよい。なお、特定核酸の増幅反応と同時並行でＩＮＡＦプローブによる同定を行なう場合は、前記プローブの３’末端側水酸基に修飾処理を施すことで、３’末端側水酸基からの伸長を防止するのが好ましい。また、ｎ種類のオリゴヌクレオチドプローブに導入したインターカレーター性蛍光色素を共通にすると、同一の励起／蛍光波長でｎ種類の菌またはウイルスを同時に同定でき、蛍光検出装置の装置構成も簡素化できるため好ましい。
【００２３】
本発明の同定方法は、ｎ種類のオリゴヌクレオチドプローブによる蛍光特性の変化量の違いを検出することにより、菌またはウイルスを同定する方法である。蛍光特性の変化量の検出は、蛍光強度の絶対値で行なってもよいし、陰性試料での蛍光強度値に対する相対値（蛍光強度比）で行なってもよいし、特定核酸を増幅して菌またはウイルスの同定を行なう場合は特定核酸増幅前の試料での蛍光強度値に対する相対値（蛍光強度比）で行なってもよい。
【００２４】
本発明の同定方法では、喀痰、胃液、血液、尿、便、体腔液、組織、気管支洗浄液、気管支肺胞洗浄液等の生体由来の試料をそのまま特定核酸を含む試料として同定に用いてもよいし、前記生体由来の試料から公知の方法または公知の試薬を用いて核酸を抽出して得られた試料を、特定核酸を含む試料として同定に用いてもよい。なお、いずれの試料を用いた場合でも、特定核酸を適切な方法で増幅させると同時に、または増幅させてから、オリゴヌクレオチドプローブを用いて検出させると、菌またウイルスの同定をより高感度に行なえるため、好ましい。特定核酸を増幅させる方法としては、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ＡＭＰｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＲＣ法（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、特許文献２）、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｉｔｉｏｎ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法等の公知の方法を例示できるが、一定温度（比較的低温）で簡便かつ迅速に特定核酸の増幅が可能なＴＲＣ法、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法が好ましい。また、特定核酸を増幅させる際は、増幅のための酵素の活性を妨害する物質等を、あらかじめ除去または不活化させると好ましい。
【００２５】
前述した好ましい特定核酸の増幅方法は、ＲＮＡを増幅する方法であり、下記の（１）から（５）に示す工程により特定核酸（ＲＮＡ）の増幅を行なう。
（１）ＲＮＡを鋳型とする、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による特定核酸の塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成する工程、
（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性を有する酵素によるＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する工程（１本鎖ＤＮＡの生成）、
（３）１本鎖ＤＮＡを鋳型とする、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による、特定核酸の塩基配列、または特定核酸の塩基配列に相補的な配列のＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による前記２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物を生成する工程、および、
（５）当該ＲＮＡ転写産物が、前記ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を生成する工程におけるｃＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的にＲＮＡ転写産物を生成する工程。
【００２６】
前記増幅において、ＲＮＡを鋳型とするＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素（逆転写酵素）、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を有する酵素、１本鎖ＤＮＡを鋳型とするＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素およびＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により進行する。これらの酵素は、いくつかの活性を合わせ持つ酵素を使用してもよく、それぞれの活性を持つ複数の酵素を使用してもよい。一例として、ＲＮＡを鋳型とするＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮａｓｅ Ｈ活性および１本鎖ＤＮＡを鋳型とするＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性の三つの活性を有する逆転写酵素と、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、を組み合わせて使用することがあげられる。もっとも、前記逆転写酵素とＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素に、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を有する酵素を必要に応じてさらに添加してもよい。前記逆転写酵素の一例として、ＡＭＶ逆転写酵素、ＭＭＬＶ逆転写酵素、ＨＩＶ逆転写酵素およびこれらの誘導体があげられ、中でもＡＭＶ逆転写酵素およびその誘導体が好ましい。ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素としては、分子生物学実験などで汎用されているバクテリオファージ由来のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼおよびこれらの誘導体を例示できる。
【００２７】
前記増幅では試料および前記酵素に加え、さらに、緩衝剤、マグネシウム塩、カリウム塩、ヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）およびデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）を添加し、反応効率を調節するために必要に応じ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および糖等を添加し、適切な温度条件下で前記酵素による反応を進行させる。適切な温度条件の一例として、ＡＭＶ逆転写酵素とＴ７ ＲＮＡポリメラーゼとを用いた場合は、３５℃から６５℃までの範囲で行なえばよく、好ましくは４０℃から５０℃までの範囲である。
【００２８】
前記増幅では、特定核酸の一部の塩基配列と相同的な配列を有する第一のプライマーと、特定核酸の一部の塩基配列と相補的な配列を有する第二のプライマーを使用する（ここで前記第一または第二のプライマーのいずれか一方はその５’末端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が付加されている）。第一のプライマーにプロモーター配列が付加されている場合は、特定核酸の塩基配列と相同のＲＮＡ転写産物が生成され、第二のプライマーにプロモーター配列が付加されている場合は、特定核酸の塩基配列と相補的なＲＮＡ転写産物が生成される。プライマーに付加するプロモーター配列は、前記増幅で使用するＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素に応じた公知のプロモーター配列を使用すればよく、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素がＴ７ ＲＮＡポリメラーゼである場合はＴ７プロモーターを、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素がＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼである場合はＳＰ６プロモーターを、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素がＴ３ ＲＮＡポリメラーゼである場合はＴ３プロモーターを、それぞれ使用すればよい。なお前記プロモーター配列に加え、さらにエンハンサー配列等の転写効率に関わる付加配列を含んでいてもよい。
【００２９】
前述したプロモーター配列を付加した第一のプライマーと、第二のプライマーを使用して前記増幅を行なう場合は、ＲＮＡを鋳型とする、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成する工程（前記（１）の工程）に先立ち、または前記（１）の工程と同時に、第一のプライマーの塩基配列と相同な領域のうち、その５’末端周辺で特定核酸（ＲＮＡ）を切断するのが好ましい。当該切断により、ｃＤＮＡ合成後に、ｃＤＮＡにハイブリダイズした第一のプライマーのプロモーター配列に相補的なＤＮＡ鎖を、ｃＤＮＡの３’末端を伸長させることで効率的に合成でき、結果として機能的な２本鎖ＤＮＡプロモーター構造を効率的に形成することができるからである。特定核酸（ＲＮＡ）の切断方法は、第一のプライマーの塩基配列と相同な領域のうち、その５’末端周辺を特異的に切断できる方法であれば特に限定されない。特定核酸（ＲＮＡ）の切断方法の一例として、特定核酸（ＲＮＡ）のうち第一のプライマーの塩基配列と相同な領域の５’末端に重複し、かつ特定核酸（ＲＮＡ）の５’末端方向に隣接した領域の特定核酸（ＲＮＡ）と相補的２本鎖を形成可能なオリゴヌクレオチド（以下、「切断用オリゴヌクレオチド」とする）を添加することで、ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を形成させ、当該２本鎖中のＲＮＡ部分をリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性を有する酵素等により切断する方法があげられ、当該切断方法は簡便に切断でき、かつ切断位置も特異性を有していることから好ましい方法といえる。ちなみに、前記切断用オリゴヌクレオチドの３’末端側水酸基は、伸長反応を防止するために、例えばアミノ化等、適当な修飾を行なうとよい。
【００３０】
本発明の同定方法の一例である、特定核酸の増幅反応と同時並行でＩＮＡＦプローブによる検出を行なうことで菌またはウイルスの同定を行なう方法の場合、ＩＮＡＦプローブ、プライマーセット、酵素および酵素基質等を含む試薬類を投入した容器に、特定核酸を含む試料を分注し、適切な温度で反応させることで、特定核酸の増幅反応とＩＮＡＦプローブによる検出（同定）を同時に行なうことができる。さらに、前記容器の少なくとも一部を透明な材料とし、ＩＮＡＦプローブに導入したインターカレーター性蛍光色素が発する蛍光を外部から検出できるようにすると、特定核酸を含む試料を分注した後は、容器を密閉した状態で特定核酸の増幅反応とＩＮＡＦプローブによる検出（同定）とが行なえるため、試料間のコンタミネーションを防止することができる。
【発明の効果】
【００３１】
本発明は、同じ属に属するｎ種類（ｎは２以上）の菌またはウイルスに由来する特定核酸のそれぞれ一部の塩基配列と相補的２本鎖を形成可能なｎ種類のオリゴヌクレオチドプローブを用いて、同じ属に属するｎ種類の菌またはウイルスを同定する方法において、前記特定核酸の塩基配列が同定する菌またはウイルス間で相同性の高い配列であり、前記オリゴヌクレオチドプローブが前記特定核酸の一部の塩基配列と相補的２本鎖を形成すると形成前と比較し蛍光特性が変化するプローブであり、前記オリゴヌクレオチドプローブによる蛍光特性の変化量が前記オリゴヌクレオチドプローブで同定する菌またはウイルスにより異なる、ことを特徴としている。
【００３２】
本発明の同定方法は、例えばリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）といった同じ属に属する菌間で相同性が高い特定核酸を用いても、同じ属に属する菌間の同定が可能となる。そのため、同定の必要性は高いものの、これまで迅速簡便な同定方法がなかった、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する菌間の同定、特にｒＲＮＡ塩基配列の相同性が極めて高いマイコバクテリウム・アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）とマイコバクテリウム・イントラセルラー（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）との間の同定も、本発明の同定方法により迅速簡便に行なうことができる。
【実施例】
【００３３】
以下、特定核酸をリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）とし、同じ属に属する菌をマイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する菌とした場合の例を用いて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【００３４】
実施例１ インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドの調製
下記（Ａ）から（Ｇ）に示す、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（以下、ＩＮＡＦプローブとする）を非特許文献１に記載の方法を参照して作製した。
（Ａ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、５’末端から５番目のグアニンと６番目のアデニンとの間のリン酸ジエステル部分に、リンカーを介してオキサゾールイエローを標識して得られた、オリゴヌクレオチドプローブ。
（Ｂ）配列番号２に記載の塩基配列のうち、５’末端から１４番目のチミンと１５番目のアデニンとの間のリン酸ジエステル部分に、リンカーを介してオキサゾールイエローを標識して得られた、オリゴヌクレオチドプローブ。なお、配列番号２の５’末端から１２番目のｎは５−ニトロインドールヌクレオチドである。
（Ｃ）配列番号３に記載の配列のうち、５’末端から７番目のグアニンと８番目のシトシンとの間のリン酸ジエステル部分に、リンカーを介してオキサゾールイエローを標識して得られた、オリゴヌクレオチドプローブ。
（Ｄ）配列番号４に記載の配列のうち、５’末端から１２番目のアデニンの位置に、市販の試薬（Ｌａｂｅｌ−ＯＮ Ｒｅａｇｅｎｔｓ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）を用いてアミノ基を導入後、当該アミノ基にオキサゾールイエローを標識し、さらに３’末端をビオチンで修飾して得られた、オリゴヌクレオチドプローブ。
（Ｅ）配列番号５に記載の配列のうち、５’末端から１３番目のアデニンの位置に、市販の試薬（Ｌａｂｅｌ−ＯＮ Ｒｅａｇｅｎｔｓ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）を用いてアミノ基を導入後、当該アミノ基にオキサゾールイエローを標識し、さらに３’末端をビオチンで修飾して得られた、オリゴヌクレオチドプローブ。
（Ｆ）配列番号６に記載の配列のうち、５’末端から７番目のグアニンの位置に、市販の試薬（Ｌａｂｅｌ−ＯＮ Ｒｅａｇｅｎｔｓ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）を用いてアミノ基を導入後、当該アミノ基にオキサゾールイエローを標識し、さらに３’末端をビオチンで修飾して得られた、オリゴヌクレオチドプローブ。
（Ｇ）配列番号７に記載の配列のうち、５’末端から７番目のアデニンの位置に、市販の試薬（Ｌａｂｅｌ−ＯＮ Ｒｅａｇｅｎｔｓ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）を用いてアミノ基を導入後、当該アミノ基にオキサゾールイエローを標識し、さらに３’末端をビオチンで修飾して得られた、オリゴヌクレオチドプローブ。
【００３５】
実施例２ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍとＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅとの同時同定（その１）
実施例１で作製したＩＮＡＦプローブのうち、（Ａ）および（Ｂ）のプローブを用いて、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する菌に由来するｒＲＮＡの検出を行ない、検出性能と特異性について評価した。
（１）評価に用いるＲＮＡ試料を以下の方法で調製した。
（１−１）Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ １６ＳｒＲＮＡ、Ｍ．ａｖｉｕｍ １６ＳｒＲＮＡ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ １６ＳｒＲＮＡおよびＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ １６ＳｒＲＮＡ
各１６ＳｒＲＮＡ遺伝子（１６ＳｒＤＮＡ）をクローニングし、インビトロ転写後、精製することで標準ＲＮＡを調製し、当該標準ＲＮＡをＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２５Ｕ／μＬ リボヌクレアーゼインヒビター、５．０ｍＭ ＤＴＴ）を用いて一定の濃度に希釈することで、ＲＮＡ試料を調製した。
（１−２）Ｍ．ｆｌｏｒｅｎｔｉｎｕｍ ＲＮＡ
ＯＤ６００ｎｍが０．１のＭ．ｆｌｏｒｅｎｔｉｎｕｍ培養液を市販の抽出試薬（ＥＸＴＲＡＧＥＮ ＭＢ、東ソー製）で抽出することで、ＲＮＡ試料を調製した。
（２）下記に示す組成の反応液２０μＬを市販の０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｄｏｍｅ Ｃａｐ ＰＣＲ Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ製）に分注し、これに前記ＲＮＡ試料５μＬ（ＲＮＡ試料が１種類のとき）または各２．５μＬ（ＲＮＡ試料が２種類混合のとき）を添加した。
【００３６】
反応液の組成：濃度は酵素液添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６）
１７ｍＭ 塩化マグネシウム
１００ｍＭ 塩化カリウム
１ｍＭ ＤＴＴ
各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各３ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．６ｍＭ ＩＴＰ
０．１６μＭ 切断用オリゴヌクレオチドＤＮＡ（３’末端の水酸基をアミノ基で
修飾）
１μＭ 第一のプライマー（５’末端にＴ７プロモータ配列を付加）
１μＭ 第二のプライマー
５ｎＭ （Ａ）のＩＮＡＦプローブ
２１ｎＭ （Ｂ）のＩＮＡＦプローブ
１０％から１３％ ＤＭＳＯ
（４）前記反応液を４３℃で５分間保温後、予め４３℃で２分間保温した酵素液（組成は下記参照）５μＬを添加した。
【００３７】
酵素液の組成：反応時（３０μＬ中）の最終濃度
２．０％ ソルビトール
０．２１Ｕ／μＬ ＡＭＶ逆転写酵素（ライフサイエンス製）
２．３７または４．７３Ｕ／μＬ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
０．１２ｍｇ／ｍＬ 牛血清アルブミン
（５）引き続きＰＣＲチューブを直接検出可能な温調機能付き蛍光分光光度計に供し、４３℃から４６℃の一定温度でＲＮＡ増幅反応させると同時に、反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を３０分間経時的に検出した。
【００３８】
表１に、Ｍ．ａｖｉｕｍとＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅに対する検出性能評価およびＭ．ｆｌｏｒｅｎｔｉｎｕｍに対する特異性評価の結果を示す。なお、本実施例で使用したＲＮＡ試料は
（ｉ）Ｍ．ａｖｉｕｍ １６ＳｒＲＮＡ ５０コピー／テスト
（ｉｉ）Ｍ．ａｖｉｕｍ １６ＳｒＲＮＡ ５×１０７コピー／テスト
（ｉｉｉ）Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ １６ＳｒＲＮＡ １００コピー／テスト
（ｉｖ）Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ １６ＳｒＲＮＡ ５×１０７コピー／テスト
（ｖ）Ｍ．ａｖｉｕｍ １６ＳｒＲＮＡ ５０コピー／テストとＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ １６ＳｒＲＮＡ １００コピー／テストとの混合試料
（ｖｉ）Ｍ．ａｖｉｕｍ １６ＳｒＲＮＡ ５×１０７コピー／テストとＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ １６ＳｒＲＮＡ ５×１０７コピー／テストとの混合試料
（ｖｉｉ）Ｍ．ｆｌｏｒｅｎｔｉｎｕｍ培養液核酸抽出物
のいずれかであり、蛍光強度比は酵素添加３０分後における反応液の蛍光強度値を、酵素添加直後（０分）における蛍光強度値（バックグラウンド）で割った値である。
【００３９】
【表１】
【００４０】
（Ａ）および（Ｂ）のＩＮＡＦプローブを用いて、増幅したＲＮＡの検出を行なった結果、Ｍ．ａｖｉｕｍ １６ＳｒＲＮＡ試料（（ｉ）および（ｉｉ））はその量にかかわらず３０分後の蛍光強度比が約１．９であり、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ １６ＳｒＲＮＡ試料（（ｉｉｉ）および（ｉｖ））はその量にかかわらず３０分後の蛍光強度比が約２．８であり、Ｍ．ａｖｉｕｍ １６ＳｒＲＮＡとＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ １６Ｓ ｒＲＮＡとの混合試料（（ｖ）および（ｖｉ））はその量にかかわらず３０分後の蛍光強度比が約３．３以上であった。一方、Ｍ．ａｖｉｕｍ １６ＳｒＲＮＡやＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ １６ＳｒＲＮＡと塩基配列の相同性が非常に高いＭ．ｆｌｏｒｅｎｔｉｎｕｍ試料（ｖｉｉ）は蛍光強度の増加はほとんどなく、（Ａ）および（Ｂ）のＩＮＡＦプローブはＭ．ａｖｉｕｍ １６ＳｒＲＮＡおよびＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ １６ＳｒＲＮＡを特異的に検出することがわかる。
【００４１】
また表１の結果をまとめると、例えば、
（Ｉ）３０分後の蛍光強度比が１．２以下の試料をＭ．ａｖｉｕｍおよびＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ陰性、
（ＩＩ）３０分後の蛍光強度比が１．８から２．３の試料をＭ．ａｖｉｕｍ陽性、
（ＩＩＩ）３０分後の蛍光強度比が２．７から３．０の試料をＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ陽性、
（ＩＶ）３０分後の蛍光強度比が３．３以上の試料をＭ．ａｖｉｕｍおよびＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ陽性、
という判定基準を設けることで、（Ａ）および（Ｂ）のＩＮＡＦプローブにより、Ｍ．ａｖｉｕｍとＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅとを同時に同定することができることがわかる。また、（Ａ）および（Ｂ）のＩＮＡＦプローブを用いたＲＮＡ増幅検出法は、反応開始３０分で結果が分かることから迅速性があり、ＲＮＡ量５０から１００コピー／テストという低濃度であっても増幅検出可能であることから高感度であり、同属内の非常に相同性の高い菌に対しても蛍光強度がほとんど増加しないことから特異性が非常に高い方法といえる。
【００４２】
実施例３ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍとＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅの同時同定（その２）
実施例２に記載のＲＮＡ増幅検出法（条件［１］）のうち、
ＩＮＡＦプローブおよびその濃度を、
（Ｃ）のＩＮＡＦプローブ１２．５ｎＭおよび（Ｄ）のＩＮＡＦプローブ１２．５ｎＭ（条件［２］）、
（Ｄ）のＩＮＡＦプローブ１２．５ｎＭおよび（Ｅ）のＩＮＡＦプローブ１２．５ｎＭ（条件［３］）、
（Ｃ）のＩＮＡＦプローブ１２．５ｎＭのみ（条件［４］）、または
（Ｄ）のＩＮＡＦプローブ１２．５ｎＭのみ（条件［５］）、
とした他は、実施例２と同様にＲＮＡ増幅検出反応を実施した。なお、（Ｃ）のＩＮＡＦプローブはＭ．ａｖｉｕｍおよびＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅを特異的に検出するプローブであり、（Ｄ）のＩＮＡＦプローブはＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅを特異的に検出するプローブである。
【００４３】
表２に、Ｍ．ａｖｉｕｍとＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅに対する検出性能評価およびＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに対する特異性評価の結果を示す。なお、本実施例で使用したＲＮＡ試料は
（ｖｉｉｉ）Ｍ．ａｖｉｕｍ １６ＳｒＲＮＡ １０４コピー／テスト
（ｉｘ）Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ １６ＳｒＲＮＡ １０４コピー／テスト
（ｘ）Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ １０８コピー／テスト
のいずれかであり、蛍光強度比は酵素添加３０分後における反応液の蛍光強度値を、酵素添加直後（０分）における蛍光強度値（バックグラウンド）で割った値である。
【００４４】
【表２】
【００４５】
Ｍ．ａｖｉｕｍ １６ＳｒＲＮＡやＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ １６ＳｒＲＮＡと塩基配列の相同性が非常に高いＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ １６ＳｒＲＮＡ試料（ｘ）は蛍光強度の増加がほとんどなく、条件［２］および［３］は、Ｍ．ａｖｉｕｍ １６ＳｒＲＮＡおよびＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ １６ＳｒＲＮＡを特異的に検出することがわかる。一方、Ｍ．ａｖｉｕｍ １６ＳｒＲＮＡとＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ １６ＳｒＲＮＡとの同定については、条件［２］では前記（Ｉ）から（ＩＩＩ）の判定基準で同時に同定できるものの、条件［３］ではＭ．ａｖｉｕｍ １６ＳｒＲＮＡ試料（ｖｉｉｉ）を測定したときの蛍光強度比とＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ １６ＳｒＲＮＡ試料（ｉｘ）を測定したときの蛍光強度比がともに１．６６であるため同時同定は困難なことがわかる。
【００４６】
なお、条件［２］で使用したＩＮＡＦプローブをそれぞれ単独で使用すると（条件［４］および［５］）、Ｍ．ａｖｉｕｍ １６ＳｒＲＮＡ試料（ｖｉｉｉ）を測定したときの蛍光強度比とＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ １６ＳｒＲＮＡ試料（ｉｘ）を測定したときの蛍光強度比とにほとんど差が生じないことから、条件［２］は（Ｃ）のＩＮＡＦプローブと（Ｄ）のＩＮＡＦプローブとを組み合わせることで、はじめてＭ．ａｖｉｕｍ １６ＳｒＲＮＡとＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ １６ＳｒＲＮＡとの同時同定を可能にしていることがわかる。
【００４７】
実施例４ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓとＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅの同時同定
実施例２に記載のＲＮＡ増幅検出法（条件［１］）のうち、ＩＮＡＦプローブおよびその濃度を、（Ｄ）のＩＮＡＦプローブ２５ｎＭおよび（Ｆ）のＩＮＡＦプローブ５０ｎＭ（条件［６］）、とした他は、実施例２と同様にＲＮＡ増幅検出反応を実施した。
【００４８】
表３に、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓとＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅに対する検出性能評価およびＭ．ａｖｉｕｍとに対する特異性評価の結果を示す。なお、本実施例で使用したＲＮＡ試料は
（ｘｉ）Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ １６ＳｒＲＮＡ １０４コピー／テスト
（ｉｘ）Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ １６ＳｒＲＮＡ １０４コピー／テスト
（ｘｉｉ）Ｍ．ａｖｉｕｍ １６ＳｒＲＮＡ １０８コピー／テスト
（ｘｉｉｉ）Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ １６ＳｒＲＮＡ １０８コピー／テスト
のいずれかであり、蛍光強度比は酵素添加３０分後における反応液の蛍光強度値を、酵素添加直後（０分）における蛍光強度値（バックグラウンド）で割った値である。
【００４９】
【表３】
【００５０】
（Ｄ）および（Ｆ）のＩＮＡＦプローブを用いて、増幅したＲＮＡの検出を行なった結果、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ １６ＳｒＲＮＡ試料（ｘｉ）は３０分後の蛍光強度比が約２．４であり、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ １６ＳｒＲＮＡ試料（ｉｘ）は３０分後の蛍光強度比が約１．９である一方、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ １６ＳｒＲＮＡやＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ １６ＳｒＲＮＡと塩基配列の相同性が非常に高いＭ．ａｖｉｕｍ １６ＳｒＲＮＡ試料（ｘｉｉ）およびＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ １６ＳｒＲＮＡ試料（ｘｉｉｉ）は蛍光強度の増加がほとんどないことから、（Ｄ）および（Ｆ）のＩＮＡＦプローブはＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ １６ＳｒＲＮＡおよびＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ １６ＳｒＲＮＡを特異的に検出することがわかる。
【００５１】
また表３の結果をまとめると、例えば、
（Ｖ）３０分後の蛍光強度比が１．２以下の試料をＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓおよびＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ陰性、
（ＶＩ）３０分後の蛍光強度比が１．９前後の試料をＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ陽性、
（ＶＩＩ）３０分後の蛍光強度比が２．４前後の試料をＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ陽性、
という判定基準を設けることで、（Ｄ）および（Ｆ）のＩＮＡＦプローブにより、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓとＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅとを同時に同定することができることがわかる。
【００５２】
実施例５ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓとＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍの同時同定
実施例２に記載のＲＮＡ増幅検出法（条件［１］）のうち、ＩＮＡＦプローブおよびその濃度を、
（Ｅ）のＩＮＡＦプローブ２５ｎＭおよび（Ｇ）のＩＮＡＦプローブ１０ｎＭ（条件［７］）
（Ｅ）のＩＮＡＦプローブ２５ｎＭのみ（条件［８］）、または
（Ｇ）のＩＮＡＦプローブ１０ｎＭのみ（条件［９］）、
とした他は、実施例２と同様にＲＮＡ増幅検出反応を実施した。なお、（Ｅ）のＩＮＡＦプローブはＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを特異的に検出するプローブであり、（Ｇ）のＩＮＡＦプローブはＭ．ａｖｉｕｍを特異的に検出するプローブである。
【００５３】
表４に、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓとＭ．ａｖｉｕｍに対する検出性能評価およびＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅとに対する特異性評価の結果を示す。なお、本実施例で使用したＲＮＡ試料は
（ｘｉ）Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ １６ＳｒＲＮＡ １０４コピー／テスト
（ｖｉｉｉ）Ｍ．ａｖｉｕｍ １６ＳｒＲＮＡ １０４コピー／テスト
（ｘｉｖ）Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ １６ＳｒＲＮＡ １０８コピー／テスト
（ｘｉｉｉ）Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ １６ＳｒＲＮＡ １０８コピー／テスト
（ｘｖ）Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ １６ＳｒＲＮＡ １０３コピー／テスト
のいずれかであり、蛍光強度比は酵素添加３０分後における反応液の蛍光強度値を、酵素添加直後（０分）における蛍光強度値（バックグラウンド）で割った値である。
【００５４】
【表４】
【００５５】
（Ｅ）および（Ｇ）のＩＮＡＦプローブ（条件［７］）を用いて、増幅したＲＮＡの検出を行なった結果、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ １６ＳｒＲＮＡ試料（ｘｉ）は３０分後の蛍光強度比が約１．６であり、Ｍ．ａｖｉｕｍ １６ＳｒＲＮＡ試料（ｖｉｉｉ）は３０分後の蛍光強度比が約２．０である一方、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ １６ＳｒＲＮＡやＭ．ａｖｉｕｍ １６ＳｒＲＮＡと塩基配列の相同性が非常に高いＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ １６ＳｒＲＮＡ試料（ｘｉｖ）およびＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ １６ＳｒＲＮＡ試料（ｘｉｉｉ）は蛍光強度の増加がほとんどないことから、（Ｅ）および（Ｇ）のＩＮＡＦプローブはＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ １６ＳｒＲＮＡおよびＭ．ａｖｉｕｍ １６ＳｒＲＮＡを特異的に検出することがわかる。
【００５６】
また表４の結果をまとめると、例えば、
（ＶＩＩＩ）３０分後の蛍光強度比が１．２以下の試料をＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓおよびＭ．ａｖｉｕｍ陰性、
（ＩＸ）３０分後の蛍光強度比が１．６前後の試料をＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ陽性、
（Ｘ）３０分後の蛍光強度比が２．０前後の試料をＭ．ａｖｉｕｍ陽性、
という判定基準を設けることで、（Ｅ）および（Ｇ）のＩＮＡＦプローブにより、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓとＭ．ａｖｉｕｍとを同時同定することができることがわかる。
【００５７】
なお、条件［７］で使用したＩＮＡＦプローブをそれぞれ単独で使用すると（条件［８］および［９］）、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ １６ＳｒＲＮＡ試料（ｘｖ）を測定したときの蛍光強度比とＭ．ａｖｉｕｍ １６ＳｒＲＮＡ試料（ｖｉｉｉ）を測定したときの蛍光強度比とにほとんど差が生じないことから、条件［７］は（Ｅ）のＩＮＡＦプローブと（Ｇ）のＩＮＡＦプローブとを組み合わせることで、はじめてＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ １６ＳｒＲＮＡとＭ．ａｖｉｕｍ １６ＳｒＲＮＡとの同時同定を可能にしていることがわかる。
【００５８】
以上、実施例２から５の結果より、（Ａ）から（Ｇ）のＩＮＡＦプローブの中から２種類以上組み合わせてＲＮＡ増幅検出反応を行なうことで、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌間の同時同定が可能なことがわかる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、迅速、高感度かつ特異的に、同じ属に属する２種類以上の菌またはウイルスを同定する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌は、抗酸性の性質を持つグラム陽性桿菌であり、抗酸菌とも呼ばれる。抗酸菌には重篤な病変を引き起こす病原菌が多く、その中でもＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（結核菌）はヒトに結核を引き起こす病原体であり、その検査は臨床上極めて重要である。また結核菌の他にも、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉなどの非結核性抗酸菌が、ヒトに病原性を示すことが知られている。
【０００３】
非結核性抗酸菌は結核菌と同様、ヒトの肺、リンパ節、皮膚などを冒し、特に肺に感染する症例が多い。非結核性抗酸菌は、結核菌のようにヒトからヒトへの感染は起こらないが、結核菌に対する薬剤に耐性を有しており、有効な薬剤はほとんどない。このように抗酸菌感染に対する治療法は菌種の違いにより異なることから、抗酸菌の検査では菌種を迅速に同定することが不可欠となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許２９８５４４６号公報
【特許文献２】特開２０００−０１４４００号公報
【特許文献３】特開２００５−２１８３１７号公報
【特許文献４】米国特許５９２５５１７号公報
【特許文献５】米国特許６１０３４７６号公報
【特許文献６】米国特許５２１００１５号公報
【特許文献７】米国特許５４８７９７２号公報
【特許文献８】特許３４３７８１６号公報
【特許文献９】米国特許５０１１７６９号公報
【特許文献１０】米国特許５４０３７１１号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｉｓｈｉｇｕｒｏ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３１４，７７−８６（２００３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
前述したように、抗酸菌の検査では、感染した抗酸菌の菌種により治療法が異なるため、菌種を迅速に同定することが不可欠である。抗酸菌の検査において、ヒトに結核を引き起こすＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（結核菌）の同定が重要なのはいうまでもないが、非結核性抗酸菌の中でも、出現頻度の高いＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉの同定は重要であり、特に出現頻度の高いＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍとＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅの同定が重要である。
【０００７】
感染した抗酸菌の菌種を同定する際、臨床症状から同定するのは極めて困難である。また一般に抗酸菌は発育が遅く、培養を用いた検査法ではかなりの時間を要する。したがって抗酸菌の菌種を迅速に同定するには、抗酸菌に由来する特定領域の核酸（特定核酸）を増幅させて検出する方法が有効である。
【０００８】
本出願人は以前、試料に含まれる特定領域の核酸（特定核酸）を、核酸と反応することにより蛍光特性が変化する蛍光色素の存在下で、ＰＣＲ法による増幅を行ない、前記蛍光特性の変化を測定することで、試料中の核酸を検出する方法を発明している（特許文献１）。また本出願人は以前、標的ＲＮＡに対して、プライマーセット（そのうちの一方はプロモーター配列を含む）、逆転写酵素および必要に応じてリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）により、プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを合成し、ＲＮＡポリメラーゼによって標的となるＲＮＡの特定塩基配列を含むＲＮＡを合成し、当該ＲＮＡを引き続きプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型とする連鎖反応により、簡便にＲＮＡを増幅する方法を発明している（特許文献２および非特許文献１）。さらに、特許文献２および非特許文献１では、前述の方法で増幅したＲＮＡの検出に、インターカレーター性蛍光色素で標識され、かつ標的ＲＮＡと相補的２本鎖を形成すると、当該相補的２本鎖部分に前記蛍光色素がインターカレートして蛍光特性が変化（蛍光強度が増加）するよう設計されたオリゴヌクレオチドプローブ（以下、ＩＮＡＦプローブとする）を用いており、前述したＲＮＡ増幅方法および前記プローブにより、簡便、一定温度、かつ一段階でのＲＮＡ増幅および検出を可能にしている。
【０００９】
特許文献２および非特許文献１で開示のＲＮＡ増幅検出法のうち、増幅したＲＮＡの検出に用いるＩＮＡＦプローブは、標識するインターカレーター性蛍光色素が同じであっても、標的ＲＮＡが異なると、その蛍光特性（蛍光強度の増加率）は異なる（特許文献３）。したがって、特許文献２および非特許文献１で開示のＲＮＡ増幅検出法を用いて菌またはウイルスの同定を行なおうとした場合、同定対象の菌またはウイルス由来の標的ＲＮＡがそれぞれ異なる（例えば、一方がｒＲＮＡで他方がｍＲＮＡ）のであれば、前記プローブの蛍光特性の違いから同定が可能といえる。しかしながら、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）またはリボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）を用いたマイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌間の同定、ｒＲＮＡまたはｒＤＮＡを用いたレジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）属菌間の同定、構造蛋白領域のＲＮＡを用いたノロウイルス（Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ）各遺伝子型間の同定等のように、同じ属に属する菌間またはウイルス間で塩基配列の相同性が極めて高い標的ＲＮＡ（または標的ＤＮＡ）を用いた、菌またはウイルスの同定の場合、標的ＲＮＡ（または標的ＤＮＡ）の検出に用いるオリゴヌクレオチドプローブの塩基配列も互いに極めて近い配列となるため、前記プローブの蛍光特性の違いによる菌またはウイルスの同定が可能か、不明であった。
【００１０】
そこで本発明の目的は、菌またはウイルスの同定に用いる標的核酸の塩基配列が、同定する菌またはウイルス間で相同性が極めて高い場合でも、菌またはウイルスの同定が可能な方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記目的に鑑みて鋭意検討した結果、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち本発明の第一の態様は、
同じ属に属するｎ種類（ｎは２以上）の菌またはウイルスに由来する特定核酸のそれぞれ一部の塩基配列と相補的２本鎖を形成可能なｎ種類のオリゴヌクレオチドプローブを用いて、同じ属に属するｎ種類の菌またはウイルスを同定する方法であって、
前記特定核酸の塩基配列は、同定する菌またはウイルス間で相同性の高い配列であり、
前記オリゴヌクレオチドプローブは、前記特定核酸の一部の塩基配列と相補的２本鎖を形成すると、形成前と比較し蛍光特性が変化するプローブであり、
前記オリゴヌクレオチドプローブによる蛍光特性の変化量は、前記オリゴヌクレオチドプローブで同定する菌またはウイルスにより異なる、
前記方法である。
【００１３】
また本発明の第二の態様は、
マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属するｎ種類（ｎは２以上）の菌に由来する特定核酸のそれぞれ一部の塩基配列と相補的２本鎖を形成可能なｎ種類のオリゴヌクレオチドプローブを用いて、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属するｎ種類の菌を同定する方法であって、
前記特定核酸はリボソームＲＮＡまたはリボソームＤＮＡであり、
前記オリゴヌクレオチドプローブは、前記リボソームＲＮＡまたはリボソームＤＮＡの一部の塩基配列と相補的２本鎖を形成すると、形成前と比較し蛍光特性が変化するプローブであり、
前記オリゴヌクレオチドプローブによる蛍光特性の変化量は、前記オリゴヌクレオチドプローブで同定する菌により異なる、
前記方法である。
【００１４】
また本発明の第三の態様は、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属するｎ種類の菌が、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）およびマイコバクテリウム・イントラセルラー（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）から選ばれるｎ種類の菌である、前記第二の態様に記載の方法である。
【００１５】
また本発明の第四の態様は、ｎ種類のオリゴヌクレオチドプローブが、共通のインターカレーター性蛍光色素で標識され、かつ特定核酸の一部の塩基配列と相補的２本鎖を形成すると、形成した相補的２本鎖部分に前記蛍光色素がインターカレートすることで、形成前と比較し蛍光特性が変化するプローブである、前記第一から第三の態様のいずれかに記載の方法である。
【００１６】
また本発明の第五の態様は、特定核酸がＲＮＡであり、前記ＲＮＡは、
（１）ＲＮＡを鋳型とする、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による特定核酸の塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成する工程、
（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性を有する酵素によるＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する工程（１本鎖ＤＮＡの生成）、
（３）１本鎖ＤＮＡを鋳型とする、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による、特定核酸の塩基配列、または特定核酸の塩基配列に相補的な配列のＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による前記２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物を生成する工程、および、
（５）当該ＲＮＡ転写産物が、前記ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を生成する工程におけるｃＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的にＲＮＡ転写産物を生成する工程、
により増幅されたＲＮＡである、前記第一から第四の態様のいずれかに記載の方法である。
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１８】
本発明の同定方法で同定するｎ種類（ｎは２以上）の菌またはウイルスは、同じ属に属していればよく、一例として、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属するｎ種類の菌、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）属に属するｎ種類の菌、ノロウイルス（Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ）属に属する遺伝子群／遺伝子型の異なるｎ種類のウイルス、サポウイルス（Ｓａｐｏｖｉｒｕｓ）属に属する遺伝子群／遺伝子型の異なるｎ種類のウイルス、ロタウイルス（Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）属に属する遺伝子型の異なるｎ種類のウイルス、パピローマウイルス（Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）属に属する遺伝子型の異なるｎ種類のウイルスがあげられる。
【００１９】
本発明の同定方法において、オリゴヌクレオチドプローブを用いて検出（同定）する特定核酸は、その塩基配列の相同性が、同定するｎ種類の菌またはウイルス間で高いことを特徴としている。本発明において相同性が高いとは、同定するｎ種類の菌またはウイルス間における特定核酸の塩基配列の相同性が８０％以上のことをいい、好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上である。なお、同定するｎ種類の菌またはウイルス間における特定核酸の塩基配列の相同性が１００％、すなわち完全一致の場合は、オリゴヌクレオチドプローブによる蛍光特性の変化量が各菌またはウイルス間で同等となることが予想されるため、好ましくないといえる。同定対象が同じ属に属する菌の場合における好ましい特定核酸の一例として、同定する菌間で相同性が高い、リボソームＲＮＡ（５ＳｒＲＮＡ、５．８ＳｒＲＮＡ、１６ＳｒＲＮＡ、１８ＳｒＲＮＡ、２３ＳｒＲＮＡ、２８ＳｒＲＮＡ）またはその遺伝子（リボソームＤＮＡ）の全領域または部分領域があげられる。なおリボソームＲＮＡは１菌あたりの発現コピー数も多いことから、高感度に菌を同定する点でも、好ましいといえる。同定対象がノロウイルス属に属するウイルスの場合の一例として、ＯＲＦ１のＲＮＡポリメラーゼ領域の全領域または部分領域、ＯＲＦ２である構造蛋白（ｃａｐｓｉｄ）領域の全領域または部分領域、ＲＮＡポリメラーゼ領域と構造蛋白領域とのジャンクション（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）領域があげられる。同定対象がサポウイルス属に属するウイルスの場合の特定核酸の一例として、構造蛋白領域の全領域または部分領域があげられる。同定対象がロタウイルス属に属するウイルスの場合の特定核酸の一例として、Ｐ（ｐｒｏｔｅａｓｅ−ｃｌｅａｖｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）領域の全領域または一部領域があげられる。同定対象がパピローマウイルス属に属するウイルスの場合の特定核酸の一例として、Ｌ１遺伝子領域の全領域または一部領域があげられる。
【００２０】
本発明の同定方法で用いるオリゴヌクレオチドプローブは、同定する菌またはウイルスに由来する特定核酸の一部の配列と相補的２本鎖を形成可能なプローブであり、同定する菌またはウイルスにそれぞれ対応したプローブを用意すればよい。なお、本発明の同定方法で使用するオリゴヌクレオチドプローブは、ストリンジェントな条件で相補的２本鎖を形成可能なプローブであると好ましい。ストリンジェントな条件の具体例としては、４２℃において、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％フィコール、０．１％ポリビニルピロリドン、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）、１５０ｍＭの塩化ナトリウムまたは７５ｍＭクエン酸ナトリウムが共存する条件があげられる。本発明の同定方法で使用するオリゴヌクレオチドプローブの具体例として、同定する菌が、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する主要な菌である、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（結核菌）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍおよびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅから選ばれるｎ種類（ｎは２以上）の菌である場合、配列番号１から７に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブから選ばれるｎ種類のプローブがあげられる。
【００２１】
本発明の同定方法で使用するオリゴヌクレオチドプローブは、同定する菌またはウイルスに由来する特定核酸の一部の配列と相補的２本鎖を形成すると、形成前と比較し蛍光特性が変化するプローブである。蛍光特性が変化するプローブの一例として、モレキュラービーコン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎ）プローブ（特許文献４および５）、ＴａｑＭａｎプローブ（特許文献６および７）、Ｑ−Ｐｒｏｂｅ（特許文献８）、サイクリングプローブ（特許文献９および１０）、インターカレーター性蛍光色素で標識されたプローブ（ＩＮＡＦプローブ、特許文献２および非特許文献１）があげられる。特にＩＮＡＦプローブは、特定核酸を増幅して菌またはウイルスの同定を行なう場合、当該特定核酸の増幅反応と同時並行で同定が行なえるため、好ましい。
【００２２】
本発明の好ましい同定方法で使用するＩＮＡＦプローブで標識するインターカレーター性蛍光色素は特に限定はなく、オキサゾールイエロー、チアゾールオレンジ、エチジウムブロマイドまたはこれらの誘導体を例示できる。一例として、オキサゾールイエローは、２本鎖核酸にインターカレートすることで５１０ｎｍの蛍光（励起波長４７０ｎｍ）が顕著に増加する色素である。前記蛍光色素は、同定対象の菌またはウイルスに由来する特定核酸の一部の配列と相補的２本鎖を形成可能なオリゴヌクレオチドの５’末端側、３’末端側、リン酸ジエステル部分、塩基部分のいずれかに、適当なリンカーを介して導入すればよい。なお、特定核酸の増幅反応と同時並行でＩＮＡＦプローブによる同定を行なう場合は、前記プローブの３’末端側水酸基に修飾処理を施すことで、３’末端側水酸基からの伸長を防止するのが好ましい。また、ｎ種類のオリゴヌクレオチドプローブに導入したインターカレーター性蛍光色素を共通にすると、同一の励起／蛍光波長でｎ種類の菌またはウイルスを同時に同定でき、蛍光検出装置の装置構成も簡素化できるため好ましい。
【００２３】
本発明の同定方法は、ｎ種類のオリゴヌクレオチドプローブによる蛍光特性の変化量の違いを検出することにより、菌またはウイルスを同定する方法である。蛍光特性の変化量の検出は、蛍光強度の絶対値で行なってもよいし、陰性試料での蛍光強度値に対する相対値（蛍光強度比）で行なってもよいし、特定核酸を増幅して菌またはウイルスの同定を行なう場合は特定核酸増幅前の試料での蛍光強度値に対する相対値（蛍光強度比）で行なってもよい。
【００２４】
本発明の同定方法では、喀痰、胃液、血液、尿、便、体腔液、組織、気管支洗浄液、気管支肺胞洗浄液等の生体由来の試料をそのまま特定核酸を含む試料として同定に用いてもよいし、前記生体由来の試料から公知の方法または公知の試薬を用いて核酸を抽出して得られた試料を、特定核酸を含む試料として同定に用いてもよい。なお、いずれの試料を用いた場合でも、特定核酸を適切な方法で増幅させると同時に、または増幅させてから、オリゴヌクレオチドプローブを用いて検出させると、菌またウイルスの同定をより高感度に行なえるため、好ましい。特定核酸を増幅させる方法としては、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ＡＭＰｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＲＣ法（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、特許文献２）、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｉｔｉｏｎ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法等の公知の方法を例示できるが、一定温度（比較的低温）で簡便かつ迅速に特定核酸の増幅が可能なＴＲＣ法、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法が好ましい。また、特定核酸を増幅させる際は、増幅のための酵素の活性を妨害する物質等を、あらかじめ除去または不活化させると好ましい。
【００２５】
前述した好ましい特定核酸の増幅方法は、ＲＮＡを増幅する方法であり、下記の（１）から（５）に示す工程により特定核酸（ＲＮＡ）の増幅を行なう。
（１）ＲＮＡを鋳型とする、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による特定核酸の塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成する工程、
（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性を有する酵素によるＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する工程（１本鎖ＤＮＡの生成）、
（３）１本鎖ＤＮＡを鋳型とする、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による、特定核酸の塩基配列、または特定核酸の塩基配列に相補的な配列のＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による前記２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物を生成する工程、および、
（５）当該ＲＮＡ転写産物が、前記ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を生成する工程におけるｃＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的にＲＮＡ転写産物を生成する工程。
【００２６】
前記増幅において、ＲＮＡを鋳型とするＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素（逆転写酵素）、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を有する酵素、１本鎖ＤＮＡを鋳型とするＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素およびＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により進行する。これらの酵素は、いくつかの活性を合わせ持つ酵素を使用してもよく、それぞれの活性を持つ複数の酵素を使用してもよい。一例として、ＲＮＡを鋳型とするＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮａｓｅ Ｈ活性および１本鎖ＤＮＡを鋳型とするＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性の三つの活性を有する逆転写酵素と、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、を組み合わせて使用することがあげられる。もっとも、前記逆転写酵素とＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素に、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を有する酵素を必要に応じてさらに添加してもよい。前記逆転写酵素の一例として、ＡＭＶ逆転写酵素、ＭＭＬＶ逆転写酵素、ＨＩＶ逆転写酵素およびこれらの誘導体があげられ、中でもＡＭＶ逆転写酵素およびその誘導体が好ましい。ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素としては、分子生物学実験などで汎用されているバクテリオファージ由来のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼおよびこれらの誘導体を例示できる。
【００２７】
前記増幅では試料および前記酵素に加え、さらに、緩衝剤、マグネシウム塩、カリウム塩、ヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）およびデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）を添加し、反応効率を調節するために必要に応じ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および糖等を添加し、適切な温度条件下で前記酵素による反応を進行させる。適切な温度条件の一例として、ＡＭＶ逆転写酵素とＴ７ ＲＮＡポリメラーゼとを用いた場合は、３５℃から６５℃までの範囲で行なえばよく、好ましくは４０℃から５０℃までの範囲である。
【００２８】
前記増幅では、特定核酸の一部の塩基配列と相同的な配列を有する第一のプライマーと、特定核酸の一部の塩基配列と相補的な配列を有する第二のプライマーを使用する（ここで前記第一または第二のプライマーのいずれか一方はその５’末端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が付加されている）。第一のプライマーにプロモーター配列が付加されている場合は、特定核酸の塩基配列と相同のＲＮＡ転写産物が生成され、第二のプライマーにプロモーター配列が付加されている場合は、特定核酸の塩基配列と相補的なＲＮＡ転写産物が生成される。プライマーに付加するプロモーター配列は、前記増幅で使用するＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素に応じた公知のプロモーター配列を使用すればよく、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素がＴ７ ＲＮＡポリメラーゼである場合はＴ７プロモーターを、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素がＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼである場合はＳＰ６プロモーターを、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素がＴ３ ＲＮＡポリメラーゼである場合はＴ３プロモーターを、それぞれ使用すればよい。なお前記プロモーター配列に加え、さらにエンハンサー配列等の転写効率に関わる付加配列を含んでいてもよい。
【００２９】
前述したプロモーター配列を付加した第一のプライマーと、第二のプライマーを使用して前記増幅を行なう場合は、ＲＮＡを鋳型とする、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成する工程（前記（１）の工程）に先立ち、または前記（１）の工程と同時に、第一のプライマーの塩基配列と相同な領域のうち、その５’末端周辺で特定核酸（ＲＮＡ）を切断するのが好ましい。当該切断により、ｃＤＮＡ合成後に、ｃＤＮＡにハイブリダイズした第一のプライマーのプロモーター配列に相補的なＤＮＡ鎖を、ｃＤＮＡの３’末端を伸長させることで効率的に合成でき、結果として機能的な２本鎖ＤＮＡプロモーター構造を効率的に形成することができるからである。特定核酸（ＲＮＡ）の切断方法は、第一のプライマーの塩基配列と相同な領域のうち、その５’末端周辺を特異的に切断できる方法であれば特に限定されない。特定核酸（ＲＮＡ）の切断方法の一例として、特定核酸（ＲＮＡ）のうち第一のプライマーの塩基配列と相同な領域の５’末端に重複し、かつ特定核酸（ＲＮＡ）の５’末端方向に隣接した領域の特定核酸（ＲＮＡ）と相補的２本鎖を形成可能なオリゴヌクレオチド（以下、「切断用オリゴヌクレオチド」とする）を添加することで、ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を形成させ、当該２本鎖中のＲＮＡ部分をリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性を有する酵素等により切断する方法があげられ、当該切断方法は簡便に切断でき、かつ切断位置も特異性を有していることから好ましい方法といえる。ちなみに、前記切断用オリゴヌクレオチドの３’末端側水酸基は、伸長反応を防止するために、例えばアミノ化等、適当な修飾を行なうとよい。
【００３０】
本発明の同定方法の一例である、特定核酸の増幅反応と同時並行でＩＮＡＦプローブによる検出を行なうことで菌またはウイルスの同定を行なう方法の場合、ＩＮＡＦプローブ、プライマーセット、酵素および酵素基質等を含む試薬類を投入した容器に、特定核酸を含む試料を分注し、適切な温度で反応させることで、特定核酸の増幅反応とＩＮＡＦプローブによる検出（同定）を同時に行なうことができる。さらに、前記容器の少なくとも一部を透明な材料とし、ＩＮＡＦプローブに導入したインターカレーター性蛍光色素が発する蛍光を外部から検出できるようにすると、特定核酸を含む試料を分注した後は、容器を密閉した状態で特定核酸の増幅反応とＩＮＡＦプローブによる検出（同定）とが行なえるため、試料間のコンタミネーションを防止することができる。
【発明の効果】
【００３１】
本発明は、同じ属に属するｎ種類（ｎは２以上）の菌またはウイルスに由来する特定核酸のそれぞれ一部の塩基配列と相補的２本鎖を形成可能なｎ種類のオリゴヌクレオチドプローブを用いて、同じ属に属するｎ種類の菌またはウイルスを同定する方法において、前記特定核酸の塩基配列が同定する菌またはウイルス間で相同性の高い配列であり、前記オリゴヌクレオチドプローブが前記特定核酸の一部の塩基配列と相補的２本鎖を形成すると形成前と比較し蛍光特性が変化するプローブであり、前記オリゴヌクレオチドプローブによる蛍光特性の変化量が前記オリゴヌクレオチドプローブで同定する菌またはウイルスにより異なる、ことを特徴としている。
【００３２】
本発明の同定方法は、例えばリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）といった同じ属に属する菌間で相同性が高い特定核酸を用いても、同じ属に属する菌間の同定が可能となる。そのため、同定の必要性は高いものの、これまで迅速簡便な同定方法がなかった、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する菌間の同定、特にｒＲＮＡ塩基配列の相同性が極めて高いマイコバクテリウム・アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）とマイコバクテリウム・イントラセルラー（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）との間の同定も、本発明の同定方法により迅速簡便に行なうことができる。
【実施例】
【００３３】
以下、特定核酸をリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）とし、同じ属に属する菌をマイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する菌とした場合の例を用いて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【００３４】
実施例１ インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドの調製
下記（Ａ）から（Ｇ）に示す、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（以下、ＩＮＡＦプローブとする）を非特許文献１に記載の方法を参照して作製した。
（Ａ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、５’末端から５番目のグアニンと６番目のアデニンとの間のリン酸ジエステル部分に、リンカーを介してオキサゾールイエローを標識して得られた、オリゴヌクレオチドプローブ。
（Ｂ）配列番号２に記載の塩基配列のうち、５’末端から１４番目のチミンと１５番目のアデニンとの間のリン酸ジエステル部分に、リンカーを介してオキサゾールイエローを標識して得られた、オリゴヌクレオチドプローブ。なお、配列番号２の５’末端から１２番目のｎは５−ニトロインドールヌクレオチドである。
（Ｃ）配列番号３に記載の配列のうち、５’末端から７番目のグアニンと８番目のシトシンとの間のリン酸ジエステル部分に、リンカーを介してオキサゾールイエローを標識して得られた、オリゴヌクレオチドプローブ。
（Ｄ）配列番号４に記載の配列のうち、５’末端から１２番目のアデニンの位置に、市販の試薬（Ｌａｂｅｌ−ＯＮ Ｒｅａｇｅｎｔｓ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）を用いてアミノ基を導入後、当該アミノ基にオキサゾールイエローを標識し、さらに３’末端をビオチンで修飾して得られた、オリゴヌクレオチドプローブ。
（Ｅ）配列番号５に記載の配列のうち、５’末端から１３番目のアデニンの位置に、市販の試薬（Ｌａｂｅｌ−ＯＮ Ｒｅａｇｅｎｔｓ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）を用いてアミノ基を導入後、当該アミノ基にオキサゾールイエローを標識し、さらに３’末端をビオチンで修飾して得られた、オリゴヌクレオチドプローブ。
（Ｆ）配列番号６に記載の配列のうち、５’末端から７番目のグアニンの位置に、市販の試薬（Ｌａｂｅｌ−ＯＮ Ｒｅａｇｅｎｔｓ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）を用いてアミノ基を導入後、当該アミノ基にオキサゾールイエローを標識し、さらに３’末端をビオチンで修飾して得られた、オリゴヌクレオチドプローブ。
（Ｇ）配列番号７に記載の配列のうち、５’末端から７番目のアデニンの位置に、市販の試薬（Ｌａｂｅｌ−ＯＮ Ｒｅａｇｅｎｔｓ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）を用いてアミノ基を導入後、当該アミノ基にオキサゾールイエローを標識し、さらに３’末端をビオチンで修飾して得られた、オリゴヌクレオチドプローブ。
【００３５】
実施例２ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍとＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅとの同時同定（その１）
実施例１で作製したＩＮＡＦプローブのうち、（Ａ）および（Ｂ）のプローブを用いて、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する菌に由来するｒＲＮＡの検出を行ない、検出性能と特異性について評価した。
（１）評価に用いるＲＮＡ試料を以下の方法で調製した。
（１−１）Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ １６ＳｒＲＮＡ、Ｍ．ａｖｉｕｍ １６ＳｒＲＮＡ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ １６ＳｒＲＮＡおよびＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ １６ＳｒＲＮＡ
各１６ＳｒＲＮＡ遺伝子（１６ＳｒＤＮＡ）をクローニングし、インビトロ転写後、精製することで標準ＲＮＡを調製し、当該標準ＲＮＡをＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２５Ｕ／μＬ リボヌクレアーゼインヒビター、５．０ｍＭ ＤＴＴ）を用いて一定の濃度に希釈することで、ＲＮＡ試料を調製した。
（１−２）Ｍ．ｆｌｏｒｅｎｔｉｎｕｍ ＲＮＡ
ＯＤ６００ｎｍが０．１のＭ．ｆｌｏｒｅｎｔｉｎｕｍ培養液を市販の抽出試薬（ＥＸＴＲＡＧＥＮ ＭＢ、東ソー製）で抽出することで、ＲＮＡ試料を調製した。
（２）下記に示す組成の反応液２０μＬを市販の０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｄｏｍｅ Ｃａｐ ＰＣＲ Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ製）に分注し、これに前記ＲＮＡ試料５μＬ（ＲＮＡ試料が１種類のとき）または各２．５μＬ（ＲＮＡ試料が２種類混合のとき）を添加した。
【００３６】
反応液の組成：濃度は酵素液添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６）
１７ｍＭ 塩化マグネシウム
１００ｍＭ 塩化カリウム
１ｍＭ ＤＴＴ
各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各３ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．６ｍＭ ＩＴＰ
０．１６μＭ 切断用オリゴヌクレオチドＤＮＡ（３’末端の水酸基をアミノ基で
修飾）
１μＭ 第一のプライマー（５’末端にＴ７プロモータ配列を付加）
１μＭ 第二のプライマー
５ｎＭ （Ａ）のＩＮＡＦプローブ
２１ｎＭ （Ｂ）のＩＮＡＦプローブ
１０％から１３％ ＤＭＳＯ
（４）前記反応液を４３℃で５分間保温後、予め４３℃で２分間保温した酵素液（組成は下記参照）５μＬを添加した。
【００３７】
酵素液の組成：反応時（３０μＬ中）の最終濃度
２．０％ ソルビトール
０．２１Ｕ／μＬ ＡＭＶ逆転写酵素（ライフサイエンス製）
２．３７または４．７３Ｕ／μＬ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
０．１２ｍｇ／ｍＬ 牛血清アルブミン
（５）引き続きＰＣＲチューブを直接検出可能な温調機能付き蛍光分光光度計に供し、４３℃から４６℃の一定温度でＲＮＡ増幅反応させると同時に、反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を３０分間経時的に検出した。
【００３８】
表１に、Ｍ．ａｖｉｕｍとＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅに対する検出性能評価およびＭ．ｆｌｏｒｅｎｔｉｎｕｍに対する特異性評価の結果を示す。なお、本実施例で使用したＲＮＡ試料は
（ｉ）Ｍ．ａｖｉｕｍ １６ＳｒＲＮＡ ５０コピー／テスト
（ｉｉ）Ｍ．ａｖｉｕｍ １６ＳｒＲＮＡ ５×１０７コピー／テスト
（ｉｉｉ）Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ １６ＳｒＲＮＡ １００コピー／テスト
（ｉｖ）Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ １６ＳｒＲＮＡ ５×１０７コピー／テスト
（ｖ）Ｍ．ａｖｉｕｍ １６ＳｒＲＮＡ ５０コピー／テストとＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ １６ＳｒＲＮＡ １００コピー／テストとの混合試料
（ｖｉ）Ｍ．ａｖｉｕｍ １６ＳｒＲＮＡ ５×１０７コピー／テストとＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ １６ＳｒＲＮＡ ５×１０７コピー／テストとの混合試料
（ｖｉｉ）Ｍ．ｆｌｏｒｅｎｔｉｎｕｍ培養液核酸抽出物
のいずれかであり、蛍光強度比は酵素添加３０分後における反応液の蛍光強度値を、酵素添加直後（０分）における蛍光強度値（バックグラウンド）で割った値である。
【００３９】
【表１】
【００４０】
（Ａ）および（Ｂ）のＩＮＡＦプローブを用いて、増幅したＲＮＡの検出を行なった結果、Ｍ．ａｖｉｕｍ １６ＳｒＲＮＡ試料（（ｉ）および（ｉｉ））はその量にかかわらず３０分後の蛍光強度比が約１．９であり、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ １６ＳｒＲＮＡ試料（（ｉｉｉ）および（ｉｖ））はその量にかかわらず３０分後の蛍光強度比が約２．８であり、Ｍ．ａｖｉｕｍ １６ＳｒＲＮＡとＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ １６Ｓ ｒＲＮＡとの混合試料（（ｖ）および（ｖｉ））はその量にかかわらず３０分後の蛍光強度比が約３．３以上であった。一方、Ｍ．ａｖｉｕｍ １６ＳｒＲＮＡやＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ １６ＳｒＲＮＡと塩基配列の相同性が非常に高いＭ．ｆｌｏｒｅｎｔｉｎｕｍ試料（ｖｉｉ）は蛍光強度の増加はほとんどなく、（Ａ）および（Ｂ）のＩＮＡＦプローブはＭ．ａｖｉｕｍ １６ＳｒＲＮＡおよびＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ １６ＳｒＲＮＡを特異的に検出することがわかる。
【００４１】
また表１の結果をまとめると、例えば、
（Ｉ）３０分後の蛍光強度比が１．２以下の試料をＭ．ａｖｉｕｍおよびＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ陰性、
（ＩＩ）３０分後の蛍光強度比が１．８から２．３の試料をＭ．ａｖｉｕｍ陽性、
（ＩＩＩ）３０分後の蛍光強度比が２．７から３．０の試料をＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ陽性、
（ＩＶ）３０分後の蛍光強度比が３．３以上の試料をＭ．ａｖｉｕｍおよびＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ陽性、
という判定基準を設けることで、（Ａ）および（Ｂ）のＩＮＡＦプローブにより、Ｍ．ａｖｉｕｍとＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅとを同時に同定することができることがわかる。また、（Ａ）および（Ｂ）のＩＮＡＦプローブを用いたＲＮＡ増幅検出法は、反応開始３０分で結果が分かることから迅速性があり、ＲＮＡ量５０から１００コピー／テストという低濃度であっても増幅検出可能であることから高感度であり、同属内の非常に相同性の高い菌に対しても蛍光強度がほとんど増加しないことから特異性が非常に高い方法といえる。
【００４２】
実施例３ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍとＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅの同時同定（その２）
実施例２に記載のＲＮＡ増幅検出法（条件［１］）のうち、
ＩＮＡＦプローブおよびその濃度を、
（Ｃ）のＩＮＡＦプローブ１２．５ｎＭおよび（Ｄ）のＩＮＡＦプローブ１２．５ｎＭ（条件［２］）、
（Ｄ）のＩＮＡＦプローブ１２．５ｎＭおよび（Ｅ）のＩＮＡＦプローブ１２．５ｎＭ（条件［３］）、
（Ｃ）のＩＮＡＦプローブ１２．５ｎＭのみ（条件［４］）、または
（Ｄ）のＩＮＡＦプローブ１２．５ｎＭのみ（条件［５］）、
とした他は、実施例２と同様にＲＮＡ増幅検出反応を実施した。なお、（Ｃ）のＩＮＡＦプローブはＭ．ａｖｉｕｍおよびＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅを特異的に検出するプローブであり、（Ｄ）のＩＮＡＦプローブはＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅを特異的に検出するプローブである。
【００４３】
表２に、Ｍ．ａｖｉｕｍとＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅに対する検出性能評価およびＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに対する特異性評価の結果を示す。なお、本実施例で使用したＲＮＡ試料は
（ｖｉｉｉ）Ｍ．ａｖｉｕｍ １６ＳｒＲＮＡ １０４コピー／テスト
（ｉｘ）Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ １６ＳｒＲＮＡ １０４コピー／テスト
（ｘ）Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ １０８コピー／テスト
のいずれかであり、蛍光強度比は酵素添加３０分後における反応液の蛍光強度値を、酵素添加直後（０分）における蛍光強度値（バックグラウンド）で割った値である。
【００４４】
【表２】
【００４５】
Ｍ．ａｖｉｕｍ １６ＳｒＲＮＡやＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ １６ＳｒＲＮＡと塩基配列の相同性が非常に高いＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ １６ＳｒＲＮＡ試料（ｘ）は蛍光強度の増加がほとんどなく、条件［２］および［３］は、Ｍ．ａｖｉｕｍ １６ＳｒＲＮＡおよびＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ １６ＳｒＲＮＡを特異的に検出することがわかる。一方、Ｍ．ａｖｉｕｍ １６ＳｒＲＮＡとＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ １６ＳｒＲＮＡとの同定については、条件［２］では前記（Ｉ）から（ＩＩＩ）の判定基準で同時に同定できるものの、条件［３］ではＭ．ａｖｉｕｍ １６ＳｒＲＮＡ試料（ｖｉｉｉ）を測定したときの蛍光強度比とＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ １６ＳｒＲＮＡ試料（ｉｘ）を測定したときの蛍光強度比がともに１．６６であるため同時同定は困難なことがわかる。
【００４６】
なお、条件［２］で使用したＩＮＡＦプローブをそれぞれ単独で使用すると（条件［４］および［５］）、Ｍ．ａｖｉｕｍ １６ＳｒＲＮＡ試料（ｖｉｉｉ）を測定したときの蛍光強度比とＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ １６ＳｒＲＮＡ試料（ｉｘ）を測定したときの蛍光強度比とにほとんど差が生じないことから、条件［２］は（Ｃ）のＩＮＡＦプローブと（Ｄ）のＩＮＡＦプローブとを組み合わせることで、はじめてＭ．ａｖｉｕｍ １６ＳｒＲＮＡとＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ １６ＳｒＲＮＡとの同時同定を可能にしていることがわかる。
【００４７】
実施例４ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓとＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅの同時同定
実施例２に記載のＲＮＡ増幅検出法（条件［１］）のうち、ＩＮＡＦプローブおよびその濃度を、（Ｄ）のＩＮＡＦプローブ２５ｎＭおよび（Ｆ）のＩＮＡＦプローブ５０ｎＭ（条件［６］）、とした他は、実施例２と同様にＲＮＡ増幅検出反応を実施した。
【００４８】
表３に、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓとＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅに対する検出性能評価およびＭ．ａｖｉｕｍとに対する特異性評価の結果を示す。なお、本実施例で使用したＲＮＡ試料は
（ｘｉ）Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ １６ＳｒＲＮＡ １０４コピー／テスト
（ｉｘ）Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ １６ＳｒＲＮＡ １０４コピー／テスト
（ｘｉｉ）Ｍ．ａｖｉｕｍ １６ＳｒＲＮＡ １０８コピー／テスト
（ｘｉｉｉ）Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ １６ＳｒＲＮＡ １０８コピー／テスト
のいずれかであり、蛍光強度比は酵素添加３０分後における反応液の蛍光強度値を、酵素添加直後（０分）における蛍光強度値（バックグラウンド）で割った値である。
【００４９】
【表３】
【００５０】
（Ｄ）および（Ｆ）のＩＮＡＦプローブを用いて、増幅したＲＮＡの検出を行なった結果、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ １６ＳｒＲＮＡ試料（ｘｉ）は３０分後の蛍光強度比が約２．４であり、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ １６ＳｒＲＮＡ試料（ｉｘ）は３０分後の蛍光強度比が約１．９である一方、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ １６ＳｒＲＮＡやＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ １６ＳｒＲＮＡと塩基配列の相同性が非常に高いＭ．ａｖｉｕｍ １６ＳｒＲＮＡ試料（ｘｉｉ）およびＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ １６ＳｒＲＮＡ試料（ｘｉｉｉ）は蛍光強度の増加がほとんどないことから、（Ｄ）および（Ｆ）のＩＮＡＦプローブはＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ １６ＳｒＲＮＡおよびＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ １６ＳｒＲＮＡを特異的に検出することがわかる。
【００５１】
また表３の結果をまとめると、例えば、
（Ｖ）３０分後の蛍光強度比が１．２以下の試料をＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓおよびＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ陰性、
（ＶＩ）３０分後の蛍光強度比が１．９前後の試料をＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ陽性、
（ＶＩＩ）３０分後の蛍光強度比が２．４前後の試料をＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ陽性、
という判定基準を設けることで、（Ｄ）および（Ｆ）のＩＮＡＦプローブにより、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓとＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅとを同時に同定することができることがわかる。
【００５２】
実施例５ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓとＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍの同時同定
実施例２に記載のＲＮＡ増幅検出法（条件［１］）のうち、ＩＮＡＦプローブおよびその濃度を、
（Ｅ）のＩＮＡＦプローブ２５ｎＭおよび（Ｇ）のＩＮＡＦプローブ１０ｎＭ（条件［７］）
（Ｅ）のＩＮＡＦプローブ２５ｎＭのみ（条件［８］）、または
（Ｇ）のＩＮＡＦプローブ１０ｎＭのみ（条件［９］）、
とした他は、実施例２と同様にＲＮＡ増幅検出反応を実施した。なお、（Ｅ）のＩＮＡＦプローブはＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを特異的に検出するプローブであり、（Ｇ）のＩＮＡＦプローブはＭ．ａｖｉｕｍを特異的に検出するプローブである。
【００５３】
表４に、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓとＭ．ａｖｉｕｍに対する検出性能評価およびＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅとに対する特異性評価の結果を示す。なお、本実施例で使用したＲＮＡ試料は
（ｘｉ）Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ １６ＳｒＲＮＡ １０４コピー／テスト
（ｖｉｉｉ）Ｍ．ａｖｉｕｍ １６ＳｒＲＮＡ １０４コピー／テスト
（ｘｉｖ）Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ １６ＳｒＲＮＡ １０８コピー／テスト
（ｘｉｉｉ）Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ １６ＳｒＲＮＡ １０８コピー／テスト
（ｘｖ）Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ １６ＳｒＲＮＡ １０３コピー／テスト
のいずれかであり、蛍光強度比は酵素添加３０分後における反応液の蛍光強度値を、酵素添加直後（０分）における蛍光強度値（バックグラウンド）で割った値である。
【００５４】
【表４】
【００５５】
（Ｅ）および（Ｇ）のＩＮＡＦプローブ（条件［７］）を用いて、増幅したＲＮＡの検出を行なった結果、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ １６ＳｒＲＮＡ試料（ｘｉ）は３０分後の蛍光強度比が約１．６であり、Ｍ．ａｖｉｕｍ １６ＳｒＲＮＡ試料（ｖｉｉｉ）は３０分後の蛍光強度比が約２．０である一方、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ １６ＳｒＲＮＡやＭ．ａｖｉｕｍ １６ＳｒＲＮＡと塩基配列の相同性が非常に高いＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ １６ＳｒＲＮＡ試料（ｘｉｖ）およびＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ １６ＳｒＲＮＡ試料（ｘｉｉｉ）は蛍光強度の増加がほとんどないことから、（Ｅ）および（Ｇ）のＩＮＡＦプローブはＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ １６ＳｒＲＮＡおよびＭ．ａｖｉｕｍ １６ＳｒＲＮＡを特異的に検出することがわかる。
【００５６】
また表４の結果をまとめると、例えば、
（ＶＩＩＩ）３０分後の蛍光強度比が１．２以下の試料をＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓおよびＭ．ａｖｉｕｍ陰性、
（ＩＸ）３０分後の蛍光強度比が１．６前後の試料をＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ陽性、
（Ｘ）３０分後の蛍光強度比が２．０前後の試料をＭ．ａｖｉｕｍ陽性、
という判定基準を設けることで、（Ｅ）および（Ｇ）のＩＮＡＦプローブにより、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓとＭ．ａｖｉｕｍとを同時同定することができることがわかる。
【００５７】
なお、条件［７］で使用したＩＮＡＦプローブをそれぞれ単独で使用すると（条件［８］および［９］）、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ １６ＳｒＲＮＡ試料（ｘｖ）を測定したときの蛍光強度比とＭ．ａｖｉｕｍ １６ＳｒＲＮＡ試料（ｖｉｉｉ）を測定したときの蛍光強度比とにほとんど差が生じないことから、条件［７］は（Ｅ）のＩＮＡＦプローブと（Ｇ）のＩＮＡＦプローブとを組み合わせることで、はじめてＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ １６ＳｒＲＮＡとＭ．ａｖｉｕｍ １６ＳｒＲＮＡとの同時同定を可能にしていることがわかる。
【００５８】
以上、実施例２から５の結果より、（Ａ）から（Ｇ）のＩＮＡＦプローブの中から２種類以上組み合わせてＲＮＡ増幅検出反応を行なうことで、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌間の同時同定が可能なことがわかる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
同じ属に属するｎ種類（ｎは２以上）の菌またはウイルスに由来する特定核酸のそれぞれ一部の塩基配列と相補的２本鎖を形成可能なｎ種類のオリゴヌクレオチドプローブを用いて、同じ属に属するｎ種類の菌またはウイルスを同定する方法であって、
前記特定核酸の塩基配列は、同定する菌またはウイルス間で相同性の高い配列であり、
前記オリゴヌクレオチドプローブは、前記特定核酸の一部の塩基配列と相補的２本鎖を形成すると、形成前と比較し蛍光特性が変化するプローブであり、
前記オリゴヌクレオチドプローブによる蛍光特性の変化量は、前記オリゴヌクレオチドプローブで同定する菌またはウイルスにより異なる、
前記方法。
【請求項２】
マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属するｎ種類（ｎは２以上）の菌に由来する特定核酸のそれぞれ一部の塩基配列と相補的２本鎖を形成可能なｎ種類のオリゴヌクレオチドプローブを用いて、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属するｎ種類の菌を同定する方法であって、
前記特定核酸はリボソームＲＮＡまたはリボソームＤＮＡであり、
前記オリゴヌクレオチドプローブは、前記リボソームＲＮＡの一部の塩基配列と相補的２本鎖を形成すると、形成前と比較し蛍光特性が変化するプローブであり、
前記オリゴヌクレオチドプローブによる蛍光特性の変化量は、前記オリゴヌクレオチドプローブで同定する菌により異なる、
前記方法。
【請求項３】
マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属するｎ種類の菌が、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）およびマイコバクテリウム・イントラセルラー（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）から選ばれるｎ種類の菌である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ｎ種類のオリゴヌクレオチドプローブが、共通のインターカレーター性蛍光色素で標識され、かつ特定核酸の一部の塩基配列と相補的２本鎖を形成すると、形成した相補的２本鎖部分に前記蛍光色素がインターカレートすることで、形成前と比較し蛍光特性が変化するプローブである、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
特定核酸がＲＮＡであり、前記ＲＮＡは、
（１）ＲＮＡを鋳型とする、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による特定核酸の塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成する工程、
（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性を有する酵素によるＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する工程（１本鎖ＤＮＡの生成）、
（３）１本鎖ＤＮＡを鋳型とする、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による、特定核酸の塩基配列、または特定核酸の塩基配列に相補的な配列のＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による前記２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物を生成する工程、および、
（５）当該ＲＮＡ転写産物が、前記ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を生成する工程におけるｃＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的にＲＮＡ転写産物を生成する工程、
により増幅されたＲＮＡである、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項１】
同じ属に属するｎ種類（ｎは２以上）の菌またはウイルスに由来する特定核酸のそれぞれ一部の塩基配列と相補的２本鎖を形成可能なｎ種類のオリゴヌクレオチドプローブを用いて、同じ属に属するｎ種類の菌またはウイルスを同定する方法であって、
前記特定核酸の塩基配列は、同定する菌またはウイルス間で相同性の高い配列であり、
前記オリゴヌクレオチドプローブは、前記特定核酸の一部の塩基配列と相補的２本鎖を形成すると、形成前と比較し蛍光特性が変化するプローブであり、
前記オリゴヌクレオチドプローブによる蛍光特性の変化量は、前記オリゴヌクレオチドプローブで同定する菌またはウイルスにより異なる、
前記方法。
【請求項２】
マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属するｎ種類（ｎは２以上）の菌に由来する特定核酸のそれぞれ一部の塩基配列と相補的２本鎖を形成可能なｎ種類のオリゴヌクレオチドプローブを用いて、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属するｎ種類の菌を同定する方法であって、
前記特定核酸はリボソームＲＮＡまたはリボソームＤＮＡであり、
前記オリゴヌクレオチドプローブは、前記リボソームＲＮＡの一部の塩基配列と相補的２本鎖を形成すると、形成前と比較し蛍光特性が変化するプローブであり、
前記オリゴヌクレオチドプローブによる蛍光特性の変化量は、前記オリゴヌクレオチドプローブで同定する菌により異なる、
前記方法。
【請求項３】
マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属するｎ種類の菌が、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）およびマイコバクテリウム・イントラセルラー（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）から選ばれるｎ種類の菌である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ｎ種類のオリゴヌクレオチドプローブが、共通のインターカレーター性蛍光色素で標識され、かつ特定核酸の一部の塩基配列と相補的２本鎖を形成すると、形成した相補的２本鎖部分に前記蛍光色素がインターカレートすることで、形成前と比較し蛍光特性が変化するプローブである、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
特定核酸がＲＮＡであり、前記ＲＮＡは、
（１）ＲＮＡを鋳型とする、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による特定核酸の塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成する工程、
（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性を有する酵素によるＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する工程（１本鎖ＤＮＡの生成）、
（３）１本鎖ＤＮＡを鋳型とする、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による、特定核酸の塩基配列、または特定核酸の塩基配列に相補的な配列のＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による前記２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物を生成する工程、および、
（５）当該ＲＮＡ転写産物が、前記ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を生成する工程におけるｃＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的にＲＮＡ転写産物を生成する工程、
により増幅されたＲＮＡである、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【公開番号】特開２０１３−９３（Ｐ２０１３−９３Ａ）
【公開日】平成２５年１月７日（２０１３．１．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１３７１７４（Ｐ２０１１−１３７１７４）
【出願日】平成２３年６月２１日（２０１１．６．２１）
【出願人】（０００００３３００）東ソー株式会社 (1,901)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年１月７日（２０１３．１．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年６月２１日（２０１１．６．２１）
【出願人】（０００００３３００）東ソー株式会社 (1,901)
【Ｆターム（参考）】
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