同位体標識トラッピング作用物および反応性代謝物の同定方法
本発明は、同位体標識されたトラッピング作用物（ｔｒａｐｐｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、反応性代謝物を検出する方法および薬物候補物を同定する方法に対向される。より具体的には、同位体標識トラッピング作用物および反応性代謝物の検出方法は、両、「ハード（ｈａｒｄ）」および「ソフト（ｓｏｆｔ）」反応性代謝物を検出し、それによって擬陽性物（ｆａｌｓｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅｓ）を除去するために使用されてもよい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対するクロス・リファレンス
本出願は、２００６年９月２９日提出の米国暫定出願第６０／８２７，５２６号からの優先権を請求するものであり、この内容は完全に引用によって本明細書に組み入れられている。
【０００２】
本発明は、同位体標識されたトラッピング作用物（ｔｒａｐｐｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、反応性代謝物を検出する方法および薬物候補物を同定する方法に対向される。より具体的には、同位体標識トラッピング作用物および反応性代謝物の検出方法は、両、「ハード（ｈａｒｄ）」および「ソフト（ｓｏｆｔ）」反応性代謝物を検出し、それによって擬陽性物（ｆａｌｓｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅｓ）を除去するために使用されてもよい。
【背景技術】
【０００３】
患者の罹病率と死亡率の１因、特異体質性薬物毒性は、臨床学的薬物開発および販売後の両方において重大な安全関心事のまま留まる。これらの特異体質性薬物反応は、使用の制限、そしてさらに市場からの撤退へと導くことがあり、これらは、結果的に製薬工業に対してより高い開発費用をもたらす。例えば、トログリタゾン（ｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）、ベノキサプロフェン（ｂｅｎｏｘａｐｒｏｆｅｎ）およびゾメピラク（ｚｏｍｅｐｉｒａｃ）は、許容しえない毒性プロフィルのためにそれらの発売後短期に市場から撤退された。
【０００４】
特異体質性薬物反応は、通常、高度の個々の感受性において示す稀な事象である。さらに、通常、これらの反応は用量依存的ではない。現在、ヒトにおいて独占的に起きるそのような反応を評価するために使用できる動物モデルは存在しない。したがって、特異体質性薬物毒性は前臨床研究では効果的に評価することはできず、そしてしばしば臨床試験においては注目されない。
【０００５】
現時点では、特異体質性薬物反応のメカニズムは十分に理解されていない。化学反応性の代謝物が特異体質性毒性、特に肝臓毒性に関与していることを示唆する相当量の証拠が存在する。特異体質性毒性に関連するすべての薬物は、チトクロームＰ４５０酵素（ＣＹＰ）によって、ならびにペルオキシダーゼ、シクロオキシゲナーゼおよびミエロペルオキシダーゼのような他の酸化酵素によって顕著に媒介される種々の代謝経路を介して反応性代謝物を生成する。そのような毒性に関連する薬物は最初に代謝的活性化を受けて、細胞タンパク質に共有結合する毒性の反応性代謝的を生成するという仮説が立てられた。これらの共有的に修飾されたタンパク質は免疫原性であり、その結果、免疫応答を惹起して特異体質性薬物反応をもたらす。もう１つの仮説は、反応性代謝物による細胞タンパク質の共有的修飾は、信号伝達カスケードと細胞の生活機能を損なって、臨床上観察される重篤な結果をもたらすことを述べている。かくして、反応性代謝物の同定方法についてのニーズが残されている。
【０００６】
化学反応性代謝物は、それらの化学的特性に基づいて２つのカテゴリー−「ソフト」および「ハード」反応性代謝物に分類することができる。「ソフト」反応性代謝物は、キノン、キノンイミン、イミノキノンメチド（ｍｅｔｈｉｄｅ）、エポキシド、アレーンオキシドおよびニトレニウム（ｎｉｔｒｅｎｉｕｍ）イオンを含む多数の求電子代謝物を含み、そしてシステインにおけるスルフヒドリル基のような「ソフト」求電子基（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｉｌｅｓ）と容易に反応する。これに対して、「ハード」反応性代謝物は、もっとも普通にはアルデヒドとして見られ、リジン、アルギニンおよび核酸のアミンのような
「ハード」求電子基と優先的に反応する。それらの不安定性のために、反応性代謝物の直接検出および特性決定は極端に困難であることが明らかになっている。通常利用されるアプローチは、捕捉分子により反応性代謝物をトラップして、安定な付加物の形成をもたらし、続いて、これが既知の検出方法、例えばタンデム質量分析によって特性決定されることである。
【０００７】
近年、特許文献１においてＡｖｅｒｙ，Ｍｉｃｈａｅｌ，Ｊ．は、反応性代謝物を生成する試験化合物を同定するための高処理スクリーニング法を開示した。この方法は、グルタチオンの存在下でミクロソームの薬物代謝酵素系とともに試験化合物をインキュベートし、そしてそれから形成されるグルタチオン付加物をタンデム質量分析を使用して検出することを含む。
【０００８】
しかしながら、この方法は、質量分光法による検出における普通の応答結果として形成される反応性代謝物ならびに非反応性成分（反応混合液の両、無反応性代謝物および成分の両方を含む）を同定して、擬陽性物をもたらすであろう。
【０００９】
Ｙａｎらは、特許文献２において、安定な同位体トラッピングおよび質量分光法を使用して反応性代謝物を同定する方法を開示している。しかしながら、Ｙａｎらにより開示された方法は、「ソフト」代謝物のみを検出するが、両、「ハード」および「ソフト」反応性代謝物を同時には検出しない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】欧州特許第１，１５０，１２０号
【特許文献２】米国特許公開第２００５ ０２８７６２３ Ａ１号
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、反応性代謝物を同定するための同位体標識トラッピング作用物、また６−アミノ−２−［２−（４−アミノ−４−カルボキシ−ブチリルアミノ）−３−メルカプト−プロピオニルアミノ］−ヘキサン酸として既知の、式（Ｉ）の化合物
【００１２】
【化１】
【００１３】
［式中、星印の基における炭素、窒素、酸素、硫黄および／または置換不可能な水素原子の１個以上が同位体標識されている］
に対向される。
【００１４】
本発明は、さらに、
（ａ）式（Ｉ）の化合物
【００１５】
【化２】
【００１６】
および／または式（Ｉ）の同位体標識化合物
【００１７】
【化３】
【００１８】
［式中、星印の基における炭素、窒素、酸素、硫黄および／または置換不可能な水素原子の１個以上が同位体標識されている］を、
試験化合物および薬物代謝酵素とともにインキュベートして、１種以上の付加物を含む生成物混合物を生成し；そして
（ｂ）既知の方法および／または本明細書に記述される方法にしたがって、例えばニュートラルロス（ｎｅｕｔｒａｌ ｌｏｓｓ）質量分光法によって該１種以上の付加物を検出する；
ことを含む、反応性代謝物を同定する方法に対向される。
【００１９】
本発明は、さらに、
（ａ）式（Ｉ）の化合物
【００２０】
【化４】
【００２１】
式（Ｉ）の同位体標識化合物
【００２２】
【化５】
【００２３】
［式中、星印の基における炭素、窒素、酸素、硫黄または置換不可能な水素原子の１個以上が同位体標識されている］
および薬物代謝酵素を含む混合物とともに試験化合物をインキュベートして、１種以上の付加物を含む生成物混合物を生成し；
（ｂ）段階（ａ）において生成された１種以上の付加物のニュートラルロス質量スペクトルにおいて１個以上の同位体二重線を検出し、ここで、二重線は、式（Ｉ）の化合物と式（Ｉ）の同位体標識化合物との間の質量における差異だけ質量において異なる；
ことを含む、試験化合物の反応性代謝物を検出する方法に対向される。
【００２４】
本発明は、さらに、式（Ｉ）の化合物および式（Ｉ）の同位体標識化合物［式中、星印の基における炭素、窒素、酸素、硫黄または置換不可能な水素原子の１個以上が同位体標識されている］の混合物を使用して、反応性代謝物（両、「ソフト」および／または「ハード」反応性代謝物を含む）を同定する方法に対向される。
【００２５】
本発明は、さらに、
（ａ）式（Ｉ）の非同位体標識化合物
【００２６】
【化６】
【００２７】
式（Ｉ）の同位体標識化合物
【００２８】
【化７】
【００２９】
［式中、星印の基における炭素、窒素、酸素、硫黄および／または置換不可能な水素原子の１個以上が同位体標識されている］
および薬物代謝酵素を含む混合物とともに試験化合物をインキュベートして、１種以上の付加物を含む生成物混合物を生成し；
（ｂ）段階（ａ）において生成された１種以上の付加物のニュートラルロス質量スペクトルを測定し；そして
（ｃ）段階（ｂ）のニュートラルロス質量スペクトルにおける１種以上の同位体二重線を検出し、ここで、同位体二重線は、式（Ｉ）の非同位体標識化合物と式（Ｉ）の同位体標識化合物との間の質量における差異だけ質量において異なる；
ことを含む、試験化合物の反応性代謝物を検出する方法に対向される。
【００３０】
本発明は、さらに、（ａ）反応性代謝物と式（Ｉ）の非同位体標識化合物の共有結合複合体、および（ｂ）反応性代謝物と式（Ｉ）の同位体標識化合物の共有結合複合体を含む混合物に対向される。
【００３１】
本発明は、さらに、
（ａ）式（Ｉ）の非同位体標識化合物
【００３２】
【化８】
【００３３】
式（Ｉ）の同位体標識化合物
【００３４】
【化９】
【００３５】
［式中、星印の基における炭素、窒素、酸素、硫黄および／または置換不可能な水素原子の１個以上が同位体標識されている］
および薬物代謝酵素とともに試験化合物をインキュベートして、生成物混合物を生成し；（ｂ）段階（ａ）において生成された生成物混合物のニュートラルロス質量スペクトルを測定し；そして
（ｃ）段階（ｂ）のニュートラルロス質量スペクトルにおける同位体二重線（ここで、同位体二重線は、式（Ｉ）の非同位体標識化合物と式（Ｉ）の同位体標識化合物との間の質量における差異だけ質量において異なる）の不在を検出する；
ことを含む、薬物候補物を同定する方法に対向される。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１Ａ】ジクロフェナク（ｄｉｃｌｏｆｅｎａｃ）についての１２９Ｄａのニュートラルロス走査の総イオンクロマトグラムを図示している。
【図１Ｂ】ジクロフェナクから得られた付加物Ｉのニュートラルロスタンデム質量スペクトルを図示している。
【図１Ｃ】ジクロフェナクから得られた付加物ＩＩのニュートラルロスタンデム質量スペクトルを図示している。
【図２Ａ】クロザピン（ｃｌｏｚａｐｉｎｅ）についての１２９Ｄａのニュートラルロス走査の総イオンクロマトグラムを図示している。
【図２Ｂ】クロザピンから得られた付加物Ｉのニュートラルロスタンデム質量スペクトルを図示している。
【図３Ａ】ｐ−クレゾールについての１２９Ｄａのニュートラルロス走査の総イオンクロマトグラムを図示している。
【図３Ｂ】ｐ−クレゾールから得られた付加物Ｉのニュートラルロスタンデム質量スペクトルを図示している。
【図３Ｃ】ｐ−クレゾールから得られた付加物ＩＩのニュートラルロスタンデム質量スペクトルを図示している。
【図４Ａ】オメプラゾール（ｏｍｅｐｒａｚｏｌｅ）についての１２９Ｄａのニュートラルロス走査の総イオンクロマトグラムを図示している。
【図４Ｂ】オメプラゾールから得られた付加物Ｉのニュートラルロスタンデム質量スペクトルを図示している。
【図５Ａ】フランについての１２９Ｄａのニュートラルロス走査の総イオンクロマトグラムを図示している。
【図５Ｂ】フランから得られた付加物Ｉのニュートラルロスタンデム質量スペクトルを図示している。
【図６Ａ】２−メチルフランについての１２９Ｄａのニュートラルロス走査の総イオンクロマトグラムを図示している。
【図６Ｂ】２−メチルフランから得られた異性付加物のＮＬタンデム質量スペクトル。
【図７Ａ】メントフランについての１２９Ｄａのニュートラルロス走査の総イオンクロマトグラムを図示している。
【図７Ｂ】メントフランから得られた付加物Ｉのニュートラルロスタンデム質量スペクトルを図示している。
【図８Ａ】２−［２−チエニル］−フランについての１２９Ｄａのニュートラルロス走査の総イオンクロマトグラムを図示している。
【図８Ｂ】２−［２−チエニル］−フランから得られた付加物Ｉのニュートラルロスタンデム質量スペクトルを図示している。
【図８Ｃ】２−［２−チエニル］−フランから得られた付加物ＩＩのニュートラルロスタンデム質量スペクトルを図示している。
【図８Ｄ】２−［２−チエニル］−フランから得られた付加物ＩＩＩのニュートラルロスタンデム質量スペクトルを図示している。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
発明の詳細な記述
本発明は、トラッピング作用物が反応性代謝物に結合することができる、同位体標識トラッピング作用物、また６−アミノ−２−［２−（４−アミノ−４−カルボキシ−ブチリルアミノ）−３−メルカプト−プロピオニルアミノ］−ヘキサン酸として既知の、式（Ｉ）の化合物
【００３８】
【化１０】
【００３９】
［式中、星印の基における炭素、窒素、酸素、硫黄および／または置換不可能な水素原子の１個以上が、好ましくは１個以上の１３Ｃ，１５Ｎ，１８Ｏ，２Ｈおよび／または３４Ｓ同位体により同位体標識されている］
に対向される。
【００４０】
本明細書で使用されるように、別に記されない限り、用語「置換不可能な水素」は、水溶液中で置換しないすべての水素原子を意味する。式（Ｉ）の化合物では、同位体標識されてもよい置換不可能な水素原子は、下記の構造において矢印によって指定される。
【００４１】
【化１１】
【００４２】
式（Ｉ）の化合物は、２個の「トラッピングゾーン（ｔｒａｐｐｉｎｇ ｚｏｎｅ）」を有し、これらは、個々に「ハード」および「ソフト」反応性代謝物をトラップする。より具体的には、式（Ｉ）の化合物におけるスルフヒドリル（−ＳＨ）基は、いわゆる「ソフト」反応性代謝物と反応し、そしてトラップするが、式（Ｉ）の化合物における−（ＣＨ２）４−ＮＨ２基は、いわゆる「ハード」反応性代謝物と反応し、そしてトラップする。したがって、式（Ｉ）の化合物および式（Ｉ）の同位体標識化合物は、同時に両「ハー
ド」および「ソフト」反応性代謝物をトラップすることができる。これはまた、図によって以下に示される。
【００４３】
【化１２】
【００４４】
本明細書で使用されるように、別に記されない限り、用語「反応性代謝物」は、「ソフト」および「ハード」反応性代謝物を含むであろう。
【００４５】
本明細書で使用されるように、別に記されない限り、用語「ソフト代謝物」は、システインにおけるスルフヒドリルおよび式（Ｉ）の化合物における−ＳＨ基のような「ソフト」求電子基と容易に反応する少なくとも１種の置換基を含むすべての求電子代謝物を意味する。そのような置換基の適当な例は、限定されるものではないがキノン、キノンイミン、イミノキノン、メチド、エポキシド、アレーンオキシド、ニトレニウムイオンなどを含む。
【００４６】
本明細書で使用されるように、別に記されない限り、用語「ハード代謝物」は、リジン、アルギニンまたは式（Ｉ）の化合物の−（ＣＨ２）４−ＮＨ２基のアミンのような「ハード」求電子基と容易に反応する少なくとも１種の置換基を含む求電子代謝物を意味する。そのような置換基の適当な例は、限定されるものではないがアルデヒドなどを含む。
【００４７】
反応性代謝物は、試験化合物に関連する多くの有害事象、特に重大かつ／または毒性有害事象に関与しているので、試験化合物によって生成されるすべての反応性代謝物を検出できることが高く望まれる。さらに、試験化合物がヒトに対する試験化合物の投与前に、反応性代謝物を生成するか否かを決定することが高く望まれる。
【００４８】
当業者は、必ずしもすべての試験化合物が反応性代謝物を生成するものではなく、そし
てさらにすべての試験化合物が両「ソフト」および「ハード」反応性代謝物を生成するものではないことを認識できる。若干の試験化合物は反応性代謝物を生成せず、若干の試験化合物はハード反応性代謝物のみを生成し、若干の試験化合物はソフト反応性代謝物を生成し、そして若干の試験化合物は、両ハードおよびソフト反応性代謝物を生成できる。したがって、本発明のトラッピング作用物および方法は、試験化合物によって生成されるいかなる種類の反応性代謝物をも検出できる。
【００４９】
さらに当業者は、本発明の方法が反応性代謝物を同定することに対向されつつ、また、試験化合物が反応性代謝物を生成するか否かを決定する方法を含むことを認識できる。ある実施態様では、本発明は、薬物候補物（例えば、反応性代謝物を生成しない試験化合物）を同定する方法に対向される。かくして、本発明の方法は、インキュベーション（本明細書でより詳細に記述されるような）が反応性代謝物と、したがって付加物をもたらさず、そして質量スペクトルが二重線を示さず、それによって試験化合物がいかなる検出可能な反応性代謝物をも生成しないことを指示する方法を含む。
【００５０】
「ソフト」代謝物については、グルタチオン、次の化学構造
【００５１】
【化１３】
【００５２】
の化合物は、「ソフト」反応性代謝物を検出するためにミクロソームインキュベーションにおいて使用されるもっとも普通のトラッピング作用物である。しかしながら、「ハード」反応性代謝物では、グルタチオンは、その低いトラッピング効率のために適当なトラッピング作用物ではない。むしろ、「ハード」反応性代謝物を検出するためには、替わりのトラッピング作用物、例えばセミカルバジド、メトキシルアミンおよびα−アセチリシン（α−ａｃｅｔｙｌｌｉｓｉｎｅ）が使用される。このことは、両「ハード」および「ソフト」反応性代謝物の検出のために、異なるトラッピング作用物による２つの別個の実験を必要とする。これに対して、式（Ｉ）の化合物、式（Ｉ）の同位体標識化合物および／または式（Ｉ）の非同位体標識化合物と式（Ｉ）の同位体標識化合物の混合物は、単一の実験において両「ソフト」および「ハード」反応性代謝物を検出するために使用することができる。
【００５３】
本明細書で使用されるように、別に記されない限り、用語「式（Ｉ）の同位体標識化合物」は、少なくとも１個の同位体、例えば、１３Ｃ，１５Ｎ，１８Ｏ，２Ｈ，３Ｈ，３４Ｓなどにより標識されている式（Ｉ）の化合物を意味する。好ましくは、同位体は、１３Ｃ，１５Ｎ，１８Ｏまたは２Ｈである。式（Ｉ）の同位体標識化合物の適当な例は、限定されるものではないが、そのシステインにおいて１３Ｃおよび／または１５Ｎにより標識された式（Ｉ）の化合物；その両システインおよびリジン基において同位体標識された式（Ｉ）の化合物；範囲１〜２８における単一または多数の位置において、好ましくは１〜１０位、より好ましくは３〜８位、もっとも好ましくは８位において標識された式（Ｉ）の化合物；などを含む。好ましくは、式（Ｉ）の同位体標識化合物は、１３Ｃ，１５Ｎ，１８Ｏおよび２Ｈからなる群から選ばれる少なくとも１個の同位体によって標識される。より好ましくは、式（Ｉ）の同位体標識化合物は２個の１５Ｎおよび６個の１３Ｃ同位体によって標識される。
【００５４】
ある実施態様では、式（Ｉ）の同位体標識化合物は、以下に示される化学構造（Ｉ−ＩＳ）において指示されるように同位体標識されている。
【００５５】
【化１４】
【００５６】
本明細書で使用されるように、別に記されない限り、用語「薬物代謝酵素」は、試験化合物を代謝することができるヒトまたは動物組織由来の、好ましくはヒト組織由来の、より好ましくはヒト肝臓組織由来のすべての酵素またはその混合物を意味する。（参照、例えば、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｚｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅｓ，Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｊａｅ Ｓ．Ｌｅｅ，Ｒ．Ｓｃｏｔｔ Ｏｂａｃｈ ａｎｄ Ｍｉｃｈａｅｌ Ｂ．Ｆｉｓｈｅｒ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．（２００３））．適当な例は、限定されるものではないが、肝臓ミクロソーム、チトクロームＰ４５０酵素またはチトクロームＰ４５０酵素の異なるイソ型の混合物、ペルオキシダーゼ、シクロオキシゲナーゼ、ミエロペルオキシダーゼなどを含む。好ましくは、薬物代謝酵素はヒト肝臓ミクロソーム、より好ましくは、チトクロームＰ４５０酵素である。当業者は、試験化合物をチトクロームＰ４５０酵素またはチトクロームＰ４５０酵素の異なるイソ型の混合物とともにインキュベートする場合、試験化合物をチトクロームＰ４５０酵素またはチトクロームＰ４５０酵素の異なるイソ型の混合物が、ＮＡＤＰＨ補因子またはＮＡＤＰＨ再生系と組み合わされてインキュベートされることを認識できる。
【００５７】
本明細書で使用されるように、別に記されない限り、用語「試験化合物」は、反応性代謝物の形成について試験されるすべての化学物質を意味する。好ましくは、試験化合物は製薬学的作用物、またはその塩、エステルまたはプロドラッグである。
【００５８】
本明細書で使用されるように、別に記されない限り、用語「薬物候補物」は、反応性代謝物を生成しないすべての化学物質または試験化合物を意味する。好ましくは、薬物候補物は製薬学的作用物、またはその塩、エステルまたはプロドラッグである。
【００５９】
本明細書で使用されるように、別に記されない限り、用語「付加物」は、反応性代謝物と式（Ｉ）の同位体標識化合物または式（Ｉ）の非同位体標識化合物とのすべての共有結
合複合体を意味する。
【００６０】
本明細書、特にスキームおよび実施例で使用される略語は次のとおりである：
ＡＰＣＩ−ＭＳ／ＭＳ ＝ 大気圧化学イオン化タンデム質量分析
ＣＹＰ ＝ チトクロームＰ４５０酵素
Ｄａ ＝ ダルトン
ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ ＝ エレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析
ＨＰＬＣ ＝ 高速液体クロマトグラフィー
ＭＳ ＝ 質量分光（分析）法
ＮＡＤＰＨ ＝ β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸
（還元型）
ＳＰＥ ＝ 固相抽出
【００６１】
ある実施態様では、本発明は、星印の基の炭素、窒素、酸素、硫黄および／または置換不可能な水素原子の１個以上が、好ましくは１個以上の１３Ｃ，１５Ｎ，１８Ｏ，２Ｈ，３Ｈおよび／または３４Ｓ同位体により同位体標識されている式（Ｉ）の同位体標識化合物に対向される。式（Ｉ）の同位体標識化合物は、既知の方法にしたがって、例えば、同位体置換によるか、または同位体標識された試薬／出発物質を使用するペプチドカップリング合成によって製造されてもよい。（参照、例えば、Ｏｔｔ，Ｄｏｎａｌｄ Ｇ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ ｗｉｔｈ Ｓｔａｂｌｅ Ｉｓｏｔｏｐｅｓ ｏｆ Ｃａｒｂｏｎ，Ｎｉｔｒｏｇｅｎ，ａｎｄ Ｏｘｙｇｅｎ，（１９８１），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ；Ｋｅｌｉｈｅｒ，Ｅｄｍｕｎｄ Ｊ．；Ｂｕｒｒｅｌ，Ｒｉｃｈａｒｄ Ｃ．；Ｃｈｏｂａｎｉａｎ，Ｈａｒｒｙ Ｒ．；Ｃｏｎｋｒｉｔｅ，Ｋａｒｉｎａ Ｌ．；Ｓｈｕｋｌａ，Ｒａｊｅｓｈ；Ｂａｌｄｗｉｎ，Ｊｏｈｎ Ｅ．；Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ ｏｆ ｆｏｕｒ ｓｔａｂｌｅ−ｉｓｏｔｏｐｅ ｌａｂｅｌｅｄ（１Ｒ）−ｍｅｎｔｈｙｌ（１Ｓ，２Ｓ）−（＋）−２−ｐｈｅｎｙｌｃｙｃｌｏｐｒｏｐａｎｅｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅｓ，Ｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（２００６），４（１４），ｐｐ２７７７−２７８４；Ｓｃｈｉｐｐｅｒｓ，Ｎｉｃｏｌｅ；Ｓｃｈｗａｃｋ，Ｗｏｌｆｇａｎｇ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ １５Ｎ−ｌａｂｅｌｌｅｄ ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅ ｉｍｉｄａｃｌｏｐｒｉｄ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌａｂｅｌｌｅｄ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ａｎｄ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｃｅｕｔｉｃａｌｓ，（２００６），４９（３），ｐｐ３０５−３１０；ａｎｄ Ｂｒｅｔｚ，Ｍｉｃｈａｅｌ；Ｂｅｙｅｒ，Ｍａｒｉｔａ；Ｃｒａｍｅｒ Ｂｅｎｅｄｉｋｔ；Ｈｕｍｐｆ，Ｈａｎｓ−Ｕｒｉｃｈ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｓｔａｂｌｅ ｉｓｏｔｏｐｅ ｌａｂｅｌｅｄ ３−ａｃｅｔｙｌｄｅｏｘｙｎｉｖａｌｅｎｏｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ＆ Ｆｏｏｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，（２００５），４９（１２），ｐｐ１１５１−１１５３．）
ある実施態様では、本発明は式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物に対向される。式（Ｉ−ＩＳ）の化合物は以下のスキーム１に略記されるように製造されてもよい。
【００６２】
【化１５】
【００６３】
したがって、２−アミノ−４−（１−カルボキシ−２−メルカプト−エチルカルバモイル）−酪酸が、既知の化学（例えば、Ｗａｄｅ，Ｌ．Ｇ．，Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｆｏｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎｓ，Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ，１９９９，ｐｐ．１３６−１３７）にしたがって同位体標識リジンと反応されて、式（Ｉ−ＩＳ）の化合物を生成する。
【００６４】
本発明は、反応性代謝物を検出するための、式（Ｉ）の化合物
【００６５】
【化１６】
【００６６】
または式（Ｉ）の同位体標識化合物
【００６７】
【化１７】
【００６８】
［式中、星印の基における炭素、窒素、酸素、硫黄または置換不可能な水素原子の１個以上は同位体標識されている］；
または式（Ｉ）の化合物および式（Ｉ）の同位体標識化合物の混合物；
の使用に対向される。
【００６９】
本発明は、さらに、同位体トラッピングおよび質量分光法を使用して反応性代謝物を検出する方法に対向され、ここで、本方法は擬陽性物を除去する。本発明は、さらに、低レベルにおける反応性代謝物を検出する高感度の方法を提供する。その上、本発明は、ＭＳパターン認識を使用して、手動様式または完全自動様式における反応性代謝物の検出に適用されてもよい。
【００７０】
本発明は、さらに、
（ａ）式（Ｉ）の化合物または式（Ｉ）の同位体標識化合物［式中、星印の基における炭素、窒素、酸素、硫黄および／または置換不可能な水素原子の１個以上が同位体標識されている］を、試験化合物および薬物代謝酵素とともにインキュベートして、１種以上の付加物を含む生成物混合物を生成し；そして
（ｂ）該付加物を検出する（既知の方法にしたがって）；
ことを含む、反応性代謝物を検出する方法に対向される。
【００７１】
例えば、安定な同位体トラッピングなしに（例えば、式（Ｉ）の同位体標識化合物のような同位体標識トラッピング作用物の使用なしに）反応性代謝物を検出する方法は、調査走査としてニュートラルロスを使用することによってＭＳ／ＭＳ全走査を開始できる３連の四重極質量分析計を用いる。このシステムを使用すれば、付加物のタンデムＭＳスペクトルが１回の実行において得ることができ、そして構造同定は、特徴的な生成物イオンを検査することによって達成できる。しかしながら、ニュートラルロスＭＳ走査に較べて典型的にＭＳ全走査により達成されるノイズに対するより小さいシグナル比率のために、ＭＳ全走査システムを使用して少い反応性代謝物を検出することは困難であろう。さらに、ＭＳ全走査は比較的時間と労力を集中する。
【００７２】
本発明は、さらに、
（ａ）式（Ｉ）の非同位体標識化合物、式（Ｉ）の同位体標識化合物［式中、星印の基に
おける炭素、窒素、酸素、硫黄および／または置換不可能な水素原子の１個以上が同位体標識されている］および薬物代謝酵素を含む混合物とともに試験化合物をインキュベートして、１種以上の付加物を含む生成物混合物を生成し；そして
（ｂ）段階（ａ）の付加物のニュートラルロス質量スペクトルにおいて１種以上の同位体二重線を検出し、ここで、二重線は、式（Ｉ）の非同位体標識化合物と式（Ｉ）の同位体標識化合物との間の質量における差異だけ質量において異なる；
ことを含む、試験化合物の反応性代謝物を検出する方法に対向される。
【００７３】
ある実施態様では、本発明は、
（ａ）式（Ｉ）の化合物
【００７４】
【化１８】
【００７５】
式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物
【００７６】
【化１９】
【００７７】
および薬物代謝酵素を含む混合物とともに試験化合物をインキュベートして、１種以上の付加物を含む生成物混合物を生成し；
（ｂ）段階（ａ）において生成された１種以上の付加物のニュートラルロス質量スペクトルを測定し；そして
（ｃ）段階（ｂ）のニュートラルロス質量スペクトルにおける１種以上の同位体二重線を
検出し、ここで、同位体二重線は、質量において８Ｄａだけ異なる；
ことを含む、試験化合物の反応性代謝物を検出する方法に対向される。
【００７８】
ある実施態様では、本発明は、
（ａ）式（Ｉ）の非同位体標識化合物、式（Ｉ）の同位体標識化合物［式中、星印の基における炭素、窒素、酸素、硫黄および／または置換不可能な水素原子の１個以上が同位体標識されている］、および薬物代謝酵素を含む混合物とともに試験化合物をインキュベートして、１種以上の付加物を含む生成物混合物を生成し；
（ｂ）段階（ａ）の１種以上の付加物を分離し（既知の方法にしたがって、好ましくは遠心分離によって）；
（ｃ）該分離された付加物のニュートラルロス質量スペクトルを測定し；
（ｄ）該分離付加物のニュートラルロス質量スペクトルにおける１種以上の同位体二重線を検出し、ここで、二重線は、式（Ｉ）の非同位体標識化合物と式（Ｉ）の同位体標識化合物との間の質量における差異だけ質量において異なる；
ことを含む、試験化合物反応性代謝物を検出する方法に対向される。
【００７９】
ある実施態様では、本発明は、
段階Ａ：
（ａ）試験化合物；
（ｂ）式（Ｉ）の化合物
【００８０】
【化２０】
【００８１】
（ｃ）式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物
【００８２】
【化２１】
【００８３】
（ここで、式（Ｉ）の化合物対式（Ｉ−ＩＳ）の化合物のモル比は約１：１である）；および
（ｄ）ヒト肝臓ミクロソーム、ＮＡＤＰＨ補因子と組み合わされたチトクロームＰ４５０酵素およびＮＡＤＰＨ再生系と組み合わされたチトクロームＰ４５０酵素からなる群から選ばれる薬物代謝酵素；
を含む混合物をインキュベートして、
（ａ）非反応性代謝物；
（ｂ）式（Ｉ）の化合物と反応性代謝物との間で形成される付加物；および
（ｃ）式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物と反応性代謝物との間で形成される付加物；
からなる群から選ばれる１種以上のインキュベーション生成物を含む生成物混合物を生成し；
段階Ｂ：段階（Ａ）において生成された生成物混合物のニュートラルロス質量スペクトルを測定し；そして
段階Ｃ：段階（Ｂ）のニュートラルロス質量スペクトルにおける１種以上の同位体二重線を検出し、ここで、同位体二重線は、質量において８Ｄａだけ異なる；
ことを含む、試験化合物の反応性代謝物を検出する方法に対向される。
【００８４】
本発明のある実施態様では、式（Ｉ）の同位体標識化合物は、１３Ｃ，１５Ｎ，１８Ｏおよび２Ｈからなる群から選ばれる少なくとも１個の同位体により標識される。本発明のその他の実施態様では、式（Ｉ）の同位体標識化合物は、１〜２８個の同位体、好ましくは１〜１０個の同位体により標識される。本発明のその他の実施態様では、式（Ｉ）の同位体標識化合物は、６個の１３Ｃおよび２個の１５Ｎ原子により標識される。本発明のその他の実施態様では、式（Ｉ）の同位体標識化合物は、式（Ｉ−ＩＳ）の化合物である。
【００８５】
【化２２】
【００８６】
本発明のある実施態様では、ニュートラルロス質量スペクトルは１２９Ｄａのロス（式（Ｉ）の非同位体標識または同位体標識化合物の−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯ２Ｈ部分のロスに対応する）を検出するために使用される。
【００８７】
本発明のある実施態様では、同位体二重線は、ＡＰＣＩ−ＭＳ／ＭＳ、ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳなど；好ましくは、ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにより検出される。本発明のその他の実施態様では、ニュートラルロス質量スペクトルにおける同位体二重線は、１〜２８の質量ユニット、好ましくは２〜１０質量ユニット、より好ましくは８質量ユニットの質量だけ異なる。
【００８８】
本発明のある実施態様では、薬物代謝酵素は、ヒト肝臓ミクロソーム、チトクロームＰ４５０酵素、ペルオキシダーゼ、シクロオキシゲナーゼおよびミエロペルオキシダーゼからなる群から選ばれる。好ましくは、薬物代謝酵素はチトクロームＰ４５０酵素である。
【００８９】
ある実施態様では、本発明は、薬物代謝酵素、例えば、Ｓ９、組み換え酵素またはミクロソーム酵素を含有する細胞のすべての画分とともに試験化合物をインキュベートすることによって形成される反応性代謝物を検出するために適用される。ある実施態様では、本発明の方法は、試験化合物がヒト被験者において反応性代謝物を形成するか否か（ヒトに対する試験化合物の投与後に）を予測するために適用される。
【００９０】
当業者は、略語「Ｓ９」が、ミクロソームとサイトゾルの混合物であるＳ９画分（ミトコンドリア後上澄液画分）を指すことを理解できる。したがって、それは、Ｐ４５０酵素、フラビン−モノオキシゲナーゼ、カルボキシエステラーゼ、エポキシドヒドロラーゼ、ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼ、メチルトランスフェラーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼおよび他の薬物代謝酵素を含む広範なフェースＩおよびフェースＩＩ酵素を含有する。
【００９１】
本発明は、さらに、（ａ）反応性代謝物と式（Ｉ）の非同位体標識化合物の共有結合複合体、および（ｂ）反応性代謝物と式（Ｉ）の同位体標識化合物［式中、星印の基における炭素、窒素、酸素、硫黄および／または置換不可能な水素原子の１個以上が同位体標識されている］の共有結合複合体を含む、混合物に対向される。
【００９２】
本発明のある実施態様では、式（Ｉ）の非同位体標識化合物および式（Ｉ）の同位体標
識化合物のモル比は、約１：１〜約１：２の範囲、好ましくは約１：１〜約１：１．５の範囲、より好ましくは約１：１である。
【００９３】
本発明のある実施態様では、反応性代謝物と式（Ｉ）の非同位体標識化合物の共有結合複合体、および反応性代謝物と式（Ｉ）の同位体標識化合物の共有結合複合体のモル比は、約１：１〜約１：２の範囲、好ましくは約１：１〜約１：１．５の範囲、より好ましくは約１：１である。
【００９４】
本発明はさらに、反応性代謝物を検出する方法に対向される。より具体的には、本発明の方法では、試験化合物は、
（ａ）式（Ｉ）の非同位体標識化合物；
（ｂ）式（Ｉ）の同位体標識化合物［式中、式（Ｉ）の同位体標識化合物は、６個の１３Ｃおよび２個の１５Ｎ原子を含有する］、ここで、式（Ｉ）の非同位体標識化合物対式（Ｉ）の同位体標識化合物のモル比は約１：１（約同じ強度を有する質量スペクトルにおける二重線を生じるために）である；および
（ｃ）薬物代謝酵素、例えば、ヒト肝臓ミクロソーム、ＮＡＤＰＨ補因子と組み合わされたチトクロームＰ４５０酵素（ＣＹＰ）（ミクロソームの、肝細胞などの、精製、組み換え体）、ＮＡＤＰＨ再生系、ペルオキシダーゼ、シクロオキシゲナーゼ、ミエロペルオキシダーゼなどと組み合わされたチトクロームＰ４５０酵素（ＣＹＰ）（ミクロソームの、肝細胞などの、精製、組み換え体）；好ましくはヒト肝臓ミクロソーム；
を含む混合物とともに、既知の方法にしたがってインキュベートされて、
（ａ）非反応性代謝物；
（ｂ）式（Ｉ）の非同位体標識化合物と反応性代謝物との間で形成される付加物；および（ｃ）式（Ｉ）の同位体標識化合物と反応性代謝物との間で形成される付加物；
からなる群から選ばれる１種以上のインキュベーション生成物を含む生成物混合物を生成する。
【００９５】
当業者は、上記インキュベーションの結果として生成される非反応性（安定な）代謝物が、式（Ｉ）の非同位体標識化合物かまたは式（Ｉ）の同位体標識化合物のいずれかと反応せず、むしろ無変化のまま生成物混合物中に残ることを認識できる。
【００９６】
好ましくは、式（Ｉ）の同位体標識化合物は、安定であるよう選ばれた１個以上の同位体により標識される。適当な同位体は、限定されるものではないが、１３Ｃ，１５Ｎ，２Ｈ，３Ｈ，１８Ｏ，３４Ｓなどを含む。好ましくは、同位体は、１３Ｃ，１５Ｎ，１８Ｏおよび２Ｈ、より好ましくは１３Ｃおよび１５Ｎからなる群から選ばれる。好ましくは、式（Ｉ）の同位体標識化合物は、式（Ｉ）の非同位体標識化合物とは、１〜２８質量ユニット、より好ましくは２〜１０質量ユニット、もっとも好ましくは８質量ユニットだけ質量において異なる。
【００９７】
インキュベーション生成物（非反応性代謝物、反応性代謝物と式（Ｉ）の非同位体標識化合物との間で形成される付加物および／または反応性代謝物と式（Ｉ）の同位体標識化合物との間で形成される付加物）の１種以上を含有する生成物混合物は、好ましくは、既知の方法により、例えば、遠心分離、ＳＰＥまたは液・液抽出によって精製および濃縮されて、生成物濃縮物を生成する。次いで、生成物濃縮物は、質量分光分析法における使用のために適当な（すなわち、質量分析計への注入のために適当な）溶媒、例えば、水中５％アセトニトリル、水中５％メタノールなどに溶解される。
【００９８】
好ましくは、生成物混合物は、既知の方法により、例えば、液体クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、毛管電気泳動、または他の分離技術によって個々の付加物成分に分離される。次いで、ニュートラルロス質量スペクトルが、各付加物または付加物成分について測定さ
れる。ニュートラルロス質量スペクトルは、すべてのイオン化源を使用する、既知の方法にしたがって、例えば、ＡＰＣＩ−ＭＳ／ＭＳ、ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳなど；好ましくは、ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳによって測定されてもよい。あるいはまた、分離および質量スペクトル測定は、ＬＣ／ＭＳのようなループシステムなどを使用して１段階で完結されてもよい。
【００９９】
反応性代謝物が試験化合物から生成され、そして存在する（式（Ｉ）の非同位体標識化合物および式（Ｉ）の同位体標識化合物との付加物として）場合、対応する質量スペクトルは、式（Ｉ）の非同位体標識化合物および式（Ｉ）の同位体標識化合物の間の質量における差異だけ、間を空けた１種以上の二重線を表すであろう。当業者は、二重線が、肉眼認識によるか、またはＭＳパターンを評価するコンピューターソフトウエアプログラムを使用して同定されてもよいことを認識できる。
【０１００】
例として、式（Ｉ）の同位体標識化合物が、式（Ｉ−ＩＳ）の化合物におけるように、６個の１３Ｃおよび２個の１５Ｎ原子により標識され、そして式（Ｉ）の非同位体標識化合物および式（Ｉ）の同位体標識化合物が、好ましくは約１：１のモル比で存在する場合、衝突誘起解離において、両、非同位体標識および同位体標識付加物は、ピログルタメートのニュートラルロス（１２９Ｄａ）を受けるであろう。結果として、反応性代謝物と式（Ｉ）の非同位体標識化合物および式（Ｉ）の同位体標識化合物との間で形成された付加物の質量スペクトルは、質量において８Ｄａだけ異なる２種の同位体分子イオンを表し、そして同位体二重線はほぼ等しい強度を示すであろう。該二重線ピークの一貫した８Ｄａの質量差異およびほぼ等しい強度は、それによって、反応性代謝物付加物を同定できる独特なＭＳ表示を提供するであろう。
【０１０１】
本発明の方法では、擬陽性物は、測定されたニュートラルロス質量スペクトルにおいて特徴的な二重線を表さないので、それらは容易に除去される。
【０１０２】
本発明の方法の自動化は、例えば、コンピューター補助のＭＳパターン認識を使用することによって達成されてもよい。例として、論理図式が、コンピューターをプログラムして反応性代謝物の自動検出を遂行するように工夫された。より具体的には、パターン認識プロセスは、次の段階：
１．ｍ／ｚ値についての誤差許容限度を定義し；
２．可能性のある同位体二重線についてのピーク強度比率の誤差範囲を定義し；
３．選択されたノイズ対シグナル設定により総イオンクロマトグラムにおけるクロマトグラフィーピークを決定し；
４．個々のクロマトグラフィーピークの主要な分子イオンのｍ／ｚ値を検出し；
５．定義された誤差許容限度を用いて適当なダルトン数だけ質量において異なる（選択された同位体種およびナンバーに基づいて）二重線を探索し；
６．同定された二重線の強度比率を決定し；
７．付加物を同定する；
ことからなる。
【０１０３】
このアプローチの使用では、二重線の強度比率および質量差異はパターン認識においてもっとも決定的なパラメーターである。強度比率の誤差範囲は、式（Ｉ）の非同位体標識化合物および式（Ｉ）の同位体標識化合物の純度によって決定されるが、一方、ｍ／ｚ値の誤差許容限度は質量分析計の性能に依存する。
【０１０４】
本発明の方法は、試験化合物が、１回の実験において「ハード」および／または「ソフト」反応性代謝物を生成できるか否かを決定するために意図される。当業者は、本発明の方法が、同時に両「ハード」および「ソフト」反応性代謝物を検出できるけれども、「ハ
ード」または「ソフト」いずれかの反応性代謝物が特定の試験化合物から形成されない場合でも、本方法がいずれのタイプの反応性代謝物が形成されたかを検出できることを認識できる。その上、反応性代謝物が形成されない場合には、本方法は特徴的な二重線のない質量スペクトルを作製するので、試験化合物を薬物候補物として同定することができる。
【０１０５】
本発明は、さらに、
（ａ）式（Ｉ）の非同位体標識化合物、式（Ｉ）の同位体標識化合物［式中、星印の基における炭素、窒素、酸素、硫黄および／または置換不可能な水素原子の１個以上が同位体標識されている］、および薬物代謝酵素を含む混合物とともに試験化合物をインキュベートして、生成物混合物を生成し；
（ｂ）段階（ａ）において生成された生成物混合物のニュートラルロス質量スペクトルを測定し；そして
（ｃ）段階（ｂ）のニュートラルロス質量スペクトルにおける同位体二重線の不在を検出する（ここで、同位体二重線は、式（Ｉ）の非同位体標識化合物と式（Ｉ）の同位体標識化合物との間の質量における差異だけ質量において異なる）；
ことを含む、薬物候補物（すなわち、反応性代謝物を生成しない試験化合物）を同定する方法に対向される。
【０１０６】
ある実施態様では、本発明は、
（ａ）式（Ｉ）の非同位体標識化合物
【０１０７】
【化２３】
【０１０８】
式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物
【０１０９】
【化２４】
【０１１０】
［式中、星印の基における炭素、窒素、酸素、硫黄または置換不可能な水素原子の１個以上が同位体標識されている］、
および薬物代謝酵素を含む混合物とともに試験化合物をインキュベートして、生成物混合物を生成し；
（ｂ）段階（ａ）において生成された生成物混合物のニュートラルロス質量スペクトルを測定し；そして
（ｃ）段階（ｂ）のニュートラルロス質量スペクトルにおける同位体二重線の不在を検出する（ここで、同位体二重線は、８Ｄａの質量における差異だけ質量において異なる）；ことを含む、薬物候補物を同定する方法に対向される。
【０１１１】
次の実施例は、本発明の理解を補助するために記述され、そしてその後に続く請求項に記述される本発明をいかなる点においても制約することを意図せず、かつ制約するものと考えてはならない。
【実施例】
【０１１２】
例１−標準操作
Ａ．インキュベーション＆安定な同位体トラッピング；
本明細書に記述されるすべてのミクロソームインキュベーションは水浴中３７℃において実施された。試験化合物は、１：１の等モル比で予め混合された式（Ｉ）の非同位体標識化合物と式（Ｉ−Ｓ）の同位体標識化合物を補足された５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．４）中でヒト肝臓ミクロソーム調製物（チトクロームＰ４５０酵素調製物）と混合された。得られる混合液は３７℃で５分間予め加温された。次いで、反応混合液に対して補因子−ＮＡＤＰＨ再生系−（反応を開始するために）が添加されて、１０００μｌの最終容量を得た。
【０１１３】
得られる反応混合液は、１０μＭ試験化合物、１ｍｇ／ｍｌのミクロソームタンパク質、式（Ｉ）の非同位体標識化合物と式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物の１ｍＭ混合液、１．３ｍＭ ＮＡＤＰ＋、３．３ｍＭグルコース−６−リン酸、０．４Ｕ／ｍｌのグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、３．３ｍＭ塩化マグネシウムを含有した。
【０１１４】
６０分のインキュベーション後、反応はトリクロロ酢酸（１０％）の１５０μｌの添加によって終結された。得られる混合液は１０，０００ｇ １５分間、４℃において遠心されて沈降タンパク質を沈殿させ、そして上澄液が固相抽出にかけられた。あるいはまた、反応混合液は液・液抽出にかけられて上澄液から代謝物を回収した。
【０１１５】
Ｂ．質量分析；
ＭＳ分析は、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ（Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ）Ｑｕａｔｔｒｏ Ｍｉｃｒｏ３連四重極質量分析計において実施された。ＥＳＩイオン源は正イオン方式で作動され、そして実験パラメーターは次のように設定された：毛管電位３．２ｋＶ、イオン源温度１２０℃、脱溶媒和（ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ）温度３００℃、サンプルコーン（ｃｏｎｅ）電位２６Ｖ。ニュートラルロス走査方式で収集される質量スペクトルは、２．０ｓにおいて範囲ｍ／ｚ４００−８００にわたって走査することによって得られた。
【０１１６】
Ｃ．ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析；
反応性代謝物の完全なプロファイリングのために、サンプルは最初に、自動サンプラーを備えたＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）によるクロマトグラフィー分離にかけられ、そして溶出液は、ニュートラルロス走査方式で作動されるＱｕａｔｔｒｏ Ｍｉｃｒｏ３連四重極質量分析計に導入された。Ａｇｉｌｅｎｔ Ｚｏｒｂａｘ ＳＢ Ｃ１８カラム（２．１ｘ５０ｍｍ）がクロマトグラフィー分離のために使用された。初発移動相は９５％水（０．５％酢酸）からなり、そして代謝物は９５％水〜９５％アセトニトリルの単一勾配を使用して流速０．３ｍｌ／分において７分かけて溶出された。７分時点で、カラムは、９５％アセトニトリルにより２分間フラッシュされ、その後、初期条件において再平衡化された。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析は純化されたサンプルの１０μｌ分量において実施された。データはＭｉｃｒｏｍａｓｓ製のＭａｓｓｌｙｎｘバージョン４．０ソフトウエアを使用して処理された。ポジティブピークが検出された後、続いて、ＭＳ／ＭＳスペクトルが得られて、付加物の構造がさらに確認された。ＣＩＤ（Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）スペクトルを得るために、質量分析計は多反応モニタリング（ＭＲＭ）方式で操作された。
【０１１７】
例２−９：ソフトおよび／またはハード反応性代謝物の検出
上記の例１に略記されたような操作に続いて、本発明の方法は、既知の試験化合物、より具体的には、「ソフト」および／または「ハード」代謝物を生成することが知られている試験化合物についての反応性代謝物の検出、１２９Ｄａのロスにおけるニュートラルロス質量スペクトルの走査、および対応する式（Ｉ）の非同位体標識化合物とは８Ｄａユニットだけ異なる式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物の使用に応用された。
【０１１８】
例２：ジクロフェナク
ジクロフェナクは、ソフト反応性代謝物の検出に対する本発明の方法の応用を例証するために試験化合物として選ばれた。
【０１１９】
ジクロフェナクの２種の反応性代謝物および対応する付加物の形成は、下記スキームＥ１に略記されているとおりである。以下に略記される反応において、ジクロフェナクの反応性代謝物は、−ＳＨ部分を介して式（Ｉ）の非同位体標識化合物および式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物との付加物を形成する。明らかにするために、式（Ｉ）の非同位体標識化合物との付加物のみが以下に示される。当業者は、式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物との付加物が、同位体標識においてのみ異なる同じ構造を有することを認識できる。
【０１２０】
【化２５】
【０１２１】
図１Ａは、反応混合物について得られた１２９Ｄａのニュートラルロス走査の総イオンクロマトグラム（ＭＳ）を示している。数種の成分がニュートラル走査に対する正の応答を示し、そしてその成分の２種が期待される同位体二重線（８Ｄａの質量差をもつ）を示した。付加物Ｉは５．９分の保持時間において溶出し、そして図１Ｂに示されるように、ｍ／ｚ６８８および６９６における特徴的な同位体二重線を表し、一方、付加物ＩＩは５．８分の保持時間において現れ、そして図１Ｃに示されるように、ｍ／ｚ６５４および６６２Ｄａにおける特徴的な同位体二重線を表した。
【０１２２】
例３：クロザピン
クロザピンは、ソフト反応性代謝物の検出に対する本発明の方法の応用を例証するために試験化合物として選ばれた。
【０１２３】
クロザピンの単一の反応性代謝物および対応する付加物の形成は、下記スキームＥ２に
略記されているとおりである。以下に略記される反応において、クロザピンの反応性代謝物は、−ＳＨ部分を介して式（Ｉ）の非同位体標識化合物および式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物との付加物を形成する。明らかにするために、式（Ｉ）の非同位体標識化合物との付加物のみが以下に示される。当業者は、式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物との付加物が、同位体標識においてのみ異なる同じ構造を有することを認識できる。
【０１２４】
【化２６】
【０１２５】
図２Ａは、反応混合物について得られた１２９Ｄａのニュートラルロス走査の総イオンクロマトグラム（ＭＳ）を示している。数種の成分がニュートラル走査に対する正の応答を示すが、５．４分の保持時間における１成分のみが、図２Ｂに示されるように、ｍ／ｚ７０３および７１１Ｄａにおける特徴的な同位体二重線を表した。
【０１２６】
例４：ｐ−クレゾール
ｐ−クレゾールは、ソフト反応性代謝物の検出に対する本発明の方法の応用を例証するために試験化合物として選ばれた。
【０１２７】
ｐ−クレゾールの２種の反応性代謝物および対応する付加物の形成は、下記スキームＥ３に略記されているとおりである。以下に略記される反応において、ｐ−クレゾールの反応性代謝物は、−ＳＨ部分を介して式（Ｉ）の非同位体標識化合物および式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物との付加物を形成する。明らかにするために、式（Ｉ）の非同位体標識化合物との付加物のみが以下に示される。当業者は、式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物との付加物が、同位体標識においてのみ異なる同じ構造を有することを認識できる。
【０１２８】
【化２７】
【０１２９】
図３Ａは、反応混合物について得られた１２９Ｄａのニュートラルロス走査の総イオンクロマトグラム（ＭＳ）を示している。２種の成分が特徴的な同位体二重線を示した。付加物Ｉは０．６４分の保持時間をもち、図３Ｂに示されるように、ｍ／ｚ４８５および４９３Ｄａにおける同位体二重線を示した。付加物ＩＩは０．７１分の保持時間をもち、図３Ｃに示されるように、ｍ／ｚ５０１および５０９Ｄａにおける同位体二重線を示した。
【０１３０】
例５：オメプラゾール
オメプラゾールは、ソフト反応性代謝物の検出に対する本発明の方法の応用を例証するために試験化合物として選ばれた。
【０１３１】
オメプラゾールの単一の反応性代謝物および対応する付加物の形成は、下記スキームＥ
４に略記されているとおりである。以下に略記される反応において、オメプラゾールの反応性代謝物は、−ＳＨ部分を介して式（Ｉ）の非同位体標識化合物および式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物との付加物を形成する。明らかにするために、式（Ｉ）の非同位体標識化合物との付加物のみが以下に示される。当業者は、式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物との付加物が、同位体標識においてのみ異なる同じ構造を有することを認識できる。
【０１３２】
【化２８】
【０１３３】
図４Ａは、反応混合物について得られた１２９Ｄａのニュートラルロス走査の総イオンクロマトグラム（ＭＳ）を示している。５．３分の保持時間における１成分のみが、図４Ｂに示されるように、ｍ／ｚ７２３および７３１Ｄａにおいて特徴的な同位体二重線を表した。
【０１３４】
例６：フラン
フランは、ハード反応性代謝物の検出に対する本発明の方法の応用を例証するために試験化合物として選ばれた。
【０１３５】
フランの単一の反応性代謝物および対応する付加物の形成は、下記スキームＥ５に略記されているとおりである。以下に略記される反応において、フランの反応性代謝物は、−ＳＨ部分と末端−ＮＨ２部分の両部分を介して式（Ｉ）の非同位体標識化合物および式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物との付加物を形成する。明らかにするために、式（Ｉ）の非同位体標識化合物との付加物のみが以下に示される。当業者は、式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物との付加物が、同位体標識においてのみ異なる同じ構造を有することを認識できる。
【０１３６】
【化２９】
【０１３７】
図５Ａは、反応混合物について得られた１２９Ｄａのニュートラルロス走査の総イオンクロマトグラム（ＭＳ）を示している。８．９分の保持時間において溶出される成分が、図５Ｂに示されるように、ｍ／ｚ４２７および４３５Ｄａにおける特徴的な同位体二重線を示した。
【０１３８】
例７：２−メチルフラン
２−メチルフランは、ハード反応性代謝物の検出に対する本発明の方法の応用を例証するために試験化合物として選ばれた。
【０１３９】
２−メチルフランの単一の反応性代謝物および対応する２種の構造異性体付加物の形成は、下記スキームＥ６に略記されているとおりである。以下に略記される反応において、２種メチルフランの反応性代謝物は、−ＳＨ部分と末端−ＮＨ２部分の両部分を介して式
（Ｉ）の非同位体標識化合物および式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物との２種の構造異性体付加物を形成する。明らかにするために、式（Ｉ）の非同位体標識化合物との付加物のみが以下に示される。当業者は、式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物との付加物が、同位体標識においてのみ異なる同じ構造を有することを認識できる。さらに、当業者は、この実験において形成された２種の構造異性体付加物がほぼ同一の質量スペクトルを生成することを認識できる。
【０１４０】
【化３０】
【０１４１】
図６Ａは、反応混合物について得られた１２９Ｄａのニュートラルロス走査の総イオンクロマトグラム（ＭＳ）を示している。５．６および５．９分の保持時間をもつ２種の異
性体付加物は、各々図６Ｂに示されるように、ｍ／ｚ４４１および４４９Ｄａにおける特徴的な同位体二重線を示した。
【０１４２】
例８：２−メントフラン
メントフランは、ハード反応性代謝物の検出に対する本発明の方法の応用を例証するために試験化合物として選ばれた。
【０１４３】
メントフランの単一反応性代謝物および対応する付加物の形成は、下記スキームＥ７に略記されているとおりである。以下に略記される反応において、メントフランの反応性代謝物は、末端−ＮＨ２部分を介して式（Ｉ）の非同位体標識化合物および式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物との付加物を形成する。明らかにするために、式（Ｉ）の非同位体標識化合物との付加物のみが以下に示される。当業者は、式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物との付加物が、同位体標識においてのみ異なる同じ構造を有することを認識できる。
【０１４４】
【化３１】
【０１４５】
図７Ａは、反応混合物について得られた１２９Ｄａのニュートラルロス走査の総イオンクロマトグラム（ＭＳ）を示している。５．９分の保持時間における１成分は、図７Ｂに示されるように、ｍ／ｚ５２７および５３５Ｄａにおける特徴的な同位体二重線を示した
。
【０１４６】
例９：２−（２−チエニル）−フラン
２−（２−チエニル）−フランは、両、ハードおよびソフト反応性代謝物の検出に対する本発明の方法の応用を例証するために試験化合物として選ばれた。
【０１４７】
２−（２−チエニル）−フランの反応性代謝物および続く式（Ｉ）の化合物および式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物（これ以降「トラッピング作用物ＧＳＫ」と呼ばれる）との付加物の形成は、下記スキームＥ８およびＥ９に略記されているとおりである。より具体的には、スキーム８は、ハード反応性代謝物（Ｈ１）を生成するフラン環の開環、ソフト反応性代謝物（Ｓ１）を生成するチオフェン環のエポキシ化、および対応する付加物の形成を示す。さらに、スキーム９は、反応性代謝物（Ｓ１）の異性化による第２のハード反応性代謝物（Ｈ２）の形成、およびその対応する付加物の形成を示す。（Ｈ１）反応性代謝物は、−ＳＨ部分と末端−ＮＨ２部分の両方を介して式（Ｉ）の非同位体標識化合物および式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物との付加物を形成し；（Ｓ１）反応性代謝物は、両−ＳＨ部分を介して式（Ｉ）の非同位体標識化合物および式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物との付加物を形成し；そして（Ｈ３）反応性代謝物は、末端−ＮＨ２部分を介して式（Ｉ）の非同位体標識化合物および式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物との付加物を形成する。明らかにするために、式（Ｉ）の非同位体標識化合物との付加物のみが以下に示される。当業者は、式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物との付加物が、同位体標識においてのみ異なる同じ構造を有することを認識できる。
【０１４８】
【化３２】
【０１４９】
【化３３】
【０１５０】
図８Ａは、反応混合物について得られた１２９Ｄａのニュートラルロス走査の総イオンクロマトグラム（ＭＳ）を示している。６．５分の保持時間をもつ付加物Ｉは、図８Ｂに示されるように、ｍ／ｚ５０９および５１７Ｄａにおける特徴的な同位体二重線を示し；付加物ＩＩは、図８Ｃに示されるように、ｍ／ｚ５２７および５３５Ｄａにおける特徴的な同位体二重線を示し；そして付加物ＩＩＩは、図８Ｄに示されるように、ｍ／ｚ４９５および５０３Ｄａにおける特徴的な同位体二重線を示した。
【０１５１】
前記明細書は、具体的な説明を目的として提供された実施例により、本発明の原理を教示しているが、本発明の実行が、次に示す請求項およびそれらの等価物の範囲内に入るような通常の変更、適合および／または修飾のすべてを包含することは理解できる。
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対するクロス・リファレンス
本出願は、２００６年９月２９日提出の米国暫定出願第６０／８２７，５２６号からの優先権を請求するものであり、この内容は完全に引用によって本明細書に組み入れられている。
【０００２】
本発明は、同位体標識されたトラッピング作用物（ｔｒａｐｐｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、反応性代謝物を検出する方法および薬物候補物を同定する方法に対向される。より具体的には、同位体標識トラッピング作用物および反応性代謝物の検出方法は、両、「ハード（ｈａｒｄ）」および「ソフト（ｓｏｆｔ）」反応性代謝物を検出し、それによって擬陽性物（ｆａｌｓｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅｓ）を除去するために使用されてもよい。
【背景技術】
【０００３】
患者の罹病率と死亡率の１因、特異体質性薬物毒性は、臨床学的薬物開発および販売後の両方において重大な安全関心事のまま留まる。これらの特異体質性薬物反応は、使用の制限、そしてさらに市場からの撤退へと導くことがあり、これらは、結果的に製薬工業に対してより高い開発費用をもたらす。例えば、トログリタゾン（ｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）、ベノキサプロフェン（ｂｅｎｏｘａｐｒｏｆｅｎ）およびゾメピラク（ｚｏｍｅｐｉｒａｃ）は、許容しえない毒性プロフィルのためにそれらの発売後短期に市場から撤退された。
【０００４】
特異体質性薬物反応は、通常、高度の個々の感受性において示す稀な事象である。さらに、通常、これらの反応は用量依存的ではない。現在、ヒトにおいて独占的に起きるそのような反応を評価するために使用できる動物モデルは存在しない。したがって、特異体質性薬物毒性は前臨床研究では効果的に評価することはできず、そしてしばしば臨床試験においては注目されない。
【０００５】
現時点では、特異体質性薬物反応のメカニズムは十分に理解されていない。化学反応性の代謝物が特異体質性毒性、特に肝臓毒性に関与していることを示唆する相当量の証拠が存在する。特異体質性毒性に関連するすべての薬物は、チトクロームＰ４５０酵素（ＣＹＰ）によって、ならびにペルオキシダーゼ、シクロオキシゲナーゼおよびミエロペルオキシダーゼのような他の酸化酵素によって顕著に媒介される種々の代謝経路を介して反応性代謝物を生成する。そのような毒性に関連する薬物は最初に代謝的活性化を受けて、細胞タンパク質に共有結合する毒性の反応性代謝的を生成するという仮説が立てられた。これらの共有的に修飾されたタンパク質は免疫原性であり、その結果、免疫応答を惹起して特異体質性薬物反応をもたらす。もう１つの仮説は、反応性代謝物による細胞タンパク質の共有的修飾は、信号伝達カスケードと細胞の生活機能を損なって、臨床上観察される重篤な結果をもたらすことを述べている。かくして、反応性代謝物の同定方法についてのニーズが残されている。
【０００６】
化学反応性代謝物は、それらの化学的特性に基づいて２つのカテゴリー−「ソフト」および「ハード」反応性代謝物に分類することができる。「ソフト」反応性代謝物は、キノン、キノンイミン、イミノキノンメチド（ｍｅｔｈｉｄｅ）、エポキシド、アレーンオキシドおよびニトレニウム（ｎｉｔｒｅｎｉｕｍ）イオンを含む多数の求電子代謝物を含み、そしてシステインにおけるスルフヒドリル基のような「ソフト」求電子基（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｉｌｅｓ）と容易に反応する。これに対して、「ハード」反応性代謝物は、もっとも普通にはアルデヒドとして見られ、リジン、アルギニンおよび核酸のアミンのような
「ハード」求電子基と優先的に反応する。それらの不安定性のために、反応性代謝物の直接検出および特性決定は極端に困難であることが明らかになっている。通常利用されるアプローチは、捕捉分子により反応性代謝物をトラップして、安定な付加物の形成をもたらし、続いて、これが既知の検出方法、例えばタンデム質量分析によって特性決定されることである。
【０００７】
近年、特許文献１においてＡｖｅｒｙ，Ｍｉｃｈａｅｌ，Ｊ．は、反応性代謝物を生成する試験化合物を同定するための高処理スクリーニング法を開示した。この方法は、グルタチオンの存在下でミクロソームの薬物代謝酵素系とともに試験化合物をインキュベートし、そしてそれから形成されるグルタチオン付加物をタンデム質量分析を使用して検出することを含む。
【０００８】
しかしながら、この方法は、質量分光法による検出における普通の応答結果として形成される反応性代謝物ならびに非反応性成分（反応混合液の両、無反応性代謝物および成分の両方を含む）を同定して、擬陽性物をもたらすであろう。
【０００９】
Ｙａｎらは、特許文献２において、安定な同位体トラッピングおよび質量分光法を使用して反応性代謝物を同定する方法を開示している。しかしながら、Ｙａｎらにより開示された方法は、「ソフト」代謝物のみを検出するが、両、「ハード」および「ソフト」反応性代謝物を同時には検出しない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】欧州特許第１，１５０，１２０号
【特許文献２】米国特許公開第２００５ ０２８７６２３ Ａ１号
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、反応性代謝物を同定するための同位体標識トラッピング作用物、また６−アミノ−２−［２−（４−アミノ−４−カルボキシ−ブチリルアミノ）−３−メルカプト−プロピオニルアミノ］−ヘキサン酸として既知の、式（Ｉ）の化合物
【００１２】
【化１】
【００１３】
［式中、星印の基における炭素、窒素、酸素、硫黄および／または置換不可能な水素原子の１個以上が同位体標識されている］
に対向される。
【００１４】
本発明は、さらに、
（ａ）式（Ｉ）の化合物
【００１５】
【化２】
【００１６】
および／または式（Ｉ）の同位体標識化合物
【００１７】
【化３】
【００１８】
［式中、星印の基における炭素、窒素、酸素、硫黄および／または置換不可能な水素原子の１個以上が同位体標識されている］を、
試験化合物および薬物代謝酵素とともにインキュベートして、１種以上の付加物を含む生成物混合物を生成し；そして
（ｂ）既知の方法および／または本明細書に記述される方法にしたがって、例えばニュートラルロス（ｎｅｕｔｒａｌ ｌｏｓｓ）質量分光法によって該１種以上の付加物を検出する；
ことを含む、反応性代謝物を同定する方法に対向される。
【００１９】
本発明は、さらに、
（ａ）式（Ｉ）の化合物
【００２０】
【化４】
【００２１】
式（Ｉ）の同位体標識化合物
【００２２】
【化５】
【００２３】
［式中、星印の基における炭素、窒素、酸素、硫黄または置換不可能な水素原子の１個以上が同位体標識されている］
および薬物代謝酵素を含む混合物とともに試験化合物をインキュベートして、１種以上の付加物を含む生成物混合物を生成し；
（ｂ）段階（ａ）において生成された１種以上の付加物のニュートラルロス質量スペクトルにおいて１個以上の同位体二重線を検出し、ここで、二重線は、式（Ｉ）の化合物と式（Ｉ）の同位体標識化合物との間の質量における差異だけ質量において異なる；
ことを含む、試験化合物の反応性代謝物を検出する方法に対向される。
【００２４】
本発明は、さらに、式（Ｉ）の化合物および式（Ｉ）の同位体標識化合物［式中、星印の基における炭素、窒素、酸素、硫黄または置換不可能な水素原子の１個以上が同位体標識されている］の混合物を使用して、反応性代謝物（両、「ソフト」および／または「ハード」反応性代謝物を含む）を同定する方法に対向される。
【００２５】
本発明は、さらに、
（ａ）式（Ｉ）の非同位体標識化合物
【００２６】
【化６】
【００２７】
式（Ｉ）の同位体標識化合物
【００２８】
【化７】
【００２９】
［式中、星印の基における炭素、窒素、酸素、硫黄および／または置換不可能な水素原子の１個以上が同位体標識されている］
および薬物代謝酵素を含む混合物とともに試験化合物をインキュベートして、１種以上の付加物を含む生成物混合物を生成し；
（ｂ）段階（ａ）において生成された１種以上の付加物のニュートラルロス質量スペクトルを測定し；そして
（ｃ）段階（ｂ）のニュートラルロス質量スペクトルにおける１種以上の同位体二重線を検出し、ここで、同位体二重線は、式（Ｉ）の非同位体標識化合物と式（Ｉ）の同位体標識化合物との間の質量における差異だけ質量において異なる；
ことを含む、試験化合物の反応性代謝物を検出する方法に対向される。
【００３０】
本発明は、さらに、（ａ）反応性代謝物と式（Ｉ）の非同位体標識化合物の共有結合複合体、および（ｂ）反応性代謝物と式（Ｉ）の同位体標識化合物の共有結合複合体を含む混合物に対向される。
【００３１】
本発明は、さらに、
（ａ）式（Ｉ）の非同位体標識化合物
【００３２】
【化８】
【００３３】
式（Ｉ）の同位体標識化合物
【００３４】
【化９】
【００３５】
［式中、星印の基における炭素、窒素、酸素、硫黄および／または置換不可能な水素原子の１個以上が同位体標識されている］
および薬物代謝酵素とともに試験化合物をインキュベートして、生成物混合物を生成し；（ｂ）段階（ａ）において生成された生成物混合物のニュートラルロス質量スペクトルを測定し；そして
（ｃ）段階（ｂ）のニュートラルロス質量スペクトルにおける同位体二重線（ここで、同位体二重線は、式（Ｉ）の非同位体標識化合物と式（Ｉ）の同位体標識化合物との間の質量における差異だけ質量において異なる）の不在を検出する；
ことを含む、薬物候補物を同定する方法に対向される。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１Ａ】ジクロフェナク（ｄｉｃｌｏｆｅｎａｃ）についての１２９Ｄａのニュートラルロス走査の総イオンクロマトグラムを図示している。
【図１Ｂ】ジクロフェナクから得られた付加物Ｉのニュートラルロスタンデム質量スペクトルを図示している。
【図１Ｃ】ジクロフェナクから得られた付加物ＩＩのニュートラルロスタンデム質量スペクトルを図示している。
【図２Ａ】クロザピン（ｃｌｏｚａｐｉｎｅ）についての１２９Ｄａのニュートラルロス走査の総イオンクロマトグラムを図示している。
【図２Ｂ】クロザピンから得られた付加物Ｉのニュートラルロスタンデム質量スペクトルを図示している。
【図３Ａ】ｐ−クレゾールについての１２９Ｄａのニュートラルロス走査の総イオンクロマトグラムを図示している。
【図３Ｂ】ｐ−クレゾールから得られた付加物Ｉのニュートラルロスタンデム質量スペクトルを図示している。
【図３Ｃ】ｐ−クレゾールから得られた付加物ＩＩのニュートラルロスタンデム質量スペクトルを図示している。
【図４Ａ】オメプラゾール（ｏｍｅｐｒａｚｏｌｅ）についての１２９Ｄａのニュートラルロス走査の総イオンクロマトグラムを図示している。
【図４Ｂ】オメプラゾールから得られた付加物Ｉのニュートラルロスタンデム質量スペクトルを図示している。
【図５Ａ】フランについての１２９Ｄａのニュートラルロス走査の総イオンクロマトグラムを図示している。
【図５Ｂ】フランから得られた付加物Ｉのニュートラルロスタンデム質量スペクトルを図示している。
【図６Ａ】２−メチルフランについての１２９Ｄａのニュートラルロス走査の総イオンクロマトグラムを図示している。
【図６Ｂ】２−メチルフランから得られた異性付加物のＮＬタンデム質量スペクトル。
【図７Ａ】メントフランについての１２９Ｄａのニュートラルロス走査の総イオンクロマトグラムを図示している。
【図７Ｂ】メントフランから得られた付加物Ｉのニュートラルロスタンデム質量スペクトルを図示している。
【図８Ａ】２−［２−チエニル］−フランについての１２９Ｄａのニュートラルロス走査の総イオンクロマトグラムを図示している。
【図８Ｂ】２−［２−チエニル］−フランから得られた付加物Ｉのニュートラルロスタンデム質量スペクトルを図示している。
【図８Ｃ】２−［２−チエニル］−フランから得られた付加物ＩＩのニュートラルロスタンデム質量スペクトルを図示している。
【図８Ｄ】２−［２−チエニル］−フランから得られた付加物ＩＩＩのニュートラルロスタンデム質量スペクトルを図示している。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
発明の詳細な記述
本発明は、トラッピング作用物が反応性代謝物に結合することができる、同位体標識トラッピング作用物、また６−アミノ−２−［２−（４−アミノ−４−カルボキシ−ブチリルアミノ）−３−メルカプト−プロピオニルアミノ］−ヘキサン酸として既知の、式（Ｉ）の化合物
【００３８】
【化１０】
【００３９】
［式中、星印の基における炭素、窒素、酸素、硫黄および／または置換不可能な水素原子の１個以上が、好ましくは１個以上の１３Ｃ，１５Ｎ，１８Ｏ，２Ｈおよび／または３４Ｓ同位体により同位体標識されている］
に対向される。
【００４０】
本明細書で使用されるように、別に記されない限り、用語「置換不可能な水素」は、水溶液中で置換しないすべての水素原子を意味する。式（Ｉ）の化合物では、同位体標識されてもよい置換不可能な水素原子は、下記の構造において矢印によって指定される。
【００４１】
【化１１】
【００４２】
式（Ｉ）の化合物は、２個の「トラッピングゾーン（ｔｒａｐｐｉｎｇ ｚｏｎｅ）」を有し、これらは、個々に「ハード」および「ソフト」反応性代謝物をトラップする。より具体的には、式（Ｉ）の化合物におけるスルフヒドリル（−ＳＨ）基は、いわゆる「ソフト」反応性代謝物と反応し、そしてトラップするが、式（Ｉ）の化合物における−（ＣＨ２）４−ＮＨ２基は、いわゆる「ハード」反応性代謝物と反応し、そしてトラップする。したがって、式（Ｉ）の化合物および式（Ｉ）の同位体標識化合物は、同時に両「ハー
ド」および「ソフト」反応性代謝物をトラップすることができる。これはまた、図によって以下に示される。
【００４３】
【化１２】
【００４４】
本明細書で使用されるように、別に記されない限り、用語「反応性代謝物」は、「ソフト」および「ハード」反応性代謝物を含むであろう。
【００４５】
本明細書で使用されるように、別に記されない限り、用語「ソフト代謝物」は、システインにおけるスルフヒドリルおよび式（Ｉ）の化合物における−ＳＨ基のような「ソフト」求電子基と容易に反応する少なくとも１種の置換基を含むすべての求電子代謝物を意味する。そのような置換基の適当な例は、限定されるものではないがキノン、キノンイミン、イミノキノン、メチド、エポキシド、アレーンオキシド、ニトレニウムイオンなどを含む。
【００４６】
本明細書で使用されるように、別に記されない限り、用語「ハード代謝物」は、リジン、アルギニンまたは式（Ｉ）の化合物の−（ＣＨ２）４−ＮＨ２基のアミンのような「ハード」求電子基と容易に反応する少なくとも１種の置換基を含む求電子代謝物を意味する。そのような置換基の適当な例は、限定されるものではないがアルデヒドなどを含む。
【００４７】
反応性代謝物は、試験化合物に関連する多くの有害事象、特に重大かつ／または毒性有害事象に関与しているので、試験化合物によって生成されるすべての反応性代謝物を検出できることが高く望まれる。さらに、試験化合物がヒトに対する試験化合物の投与前に、反応性代謝物を生成するか否かを決定することが高く望まれる。
【００４８】
当業者は、必ずしもすべての試験化合物が反応性代謝物を生成するものではなく、そし
てさらにすべての試験化合物が両「ソフト」および「ハード」反応性代謝物を生成するものではないことを認識できる。若干の試験化合物は反応性代謝物を生成せず、若干の試験化合物はハード反応性代謝物のみを生成し、若干の試験化合物はソフト反応性代謝物を生成し、そして若干の試験化合物は、両ハードおよびソフト反応性代謝物を生成できる。したがって、本発明のトラッピング作用物および方法は、試験化合物によって生成されるいかなる種類の反応性代謝物をも検出できる。
【００４９】
さらに当業者は、本発明の方法が反応性代謝物を同定することに対向されつつ、また、試験化合物が反応性代謝物を生成するか否かを決定する方法を含むことを認識できる。ある実施態様では、本発明は、薬物候補物（例えば、反応性代謝物を生成しない試験化合物）を同定する方法に対向される。かくして、本発明の方法は、インキュベーション（本明細書でより詳細に記述されるような）が反応性代謝物と、したがって付加物をもたらさず、そして質量スペクトルが二重線を示さず、それによって試験化合物がいかなる検出可能な反応性代謝物をも生成しないことを指示する方法を含む。
【００５０】
「ソフト」代謝物については、グルタチオン、次の化学構造
【００５１】
【化１３】
【００５２】
の化合物は、「ソフト」反応性代謝物を検出するためにミクロソームインキュベーションにおいて使用されるもっとも普通のトラッピング作用物である。しかしながら、「ハード」反応性代謝物では、グルタチオンは、その低いトラッピング効率のために適当なトラッピング作用物ではない。むしろ、「ハード」反応性代謝物を検出するためには、替わりのトラッピング作用物、例えばセミカルバジド、メトキシルアミンおよびα−アセチリシン（α−ａｃｅｔｙｌｌｉｓｉｎｅ）が使用される。このことは、両「ハード」および「ソフト」反応性代謝物の検出のために、異なるトラッピング作用物による２つの別個の実験を必要とする。これに対して、式（Ｉ）の化合物、式（Ｉ）の同位体標識化合物および／または式（Ｉ）の非同位体標識化合物と式（Ｉ）の同位体標識化合物の混合物は、単一の実験において両「ソフト」および「ハード」反応性代謝物を検出するために使用することができる。
【００５３】
本明細書で使用されるように、別に記されない限り、用語「式（Ｉ）の同位体標識化合物」は、少なくとも１個の同位体、例えば、１３Ｃ，１５Ｎ，１８Ｏ，２Ｈ，３Ｈ，３４Ｓなどにより標識されている式（Ｉ）の化合物を意味する。好ましくは、同位体は、１３Ｃ，１５Ｎ，１８Ｏまたは２Ｈである。式（Ｉ）の同位体標識化合物の適当な例は、限定されるものではないが、そのシステインにおいて１３Ｃおよび／または１５Ｎにより標識された式（Ｉ）の化合物；その両システインおよびリジン基において同位体標識された式（Ｉ）の化合物；範囲１〜２８における単一または多数の位置において、好ましくは１〜１０位、より好ましくは３〜８位、もっとも好ましくは８位において標識された式（Ｉ）の化合物；などを含む。好ましくは、式（Ｉ）の同位体標識化合物は、１３Ｃ，１５Ｎ，１８Ｏおよび２Ｈからなる群から選ばれる少なくとも１個の同位体によって標識される。より好ましくは、式（Ｉ）の同位体標識化合物は２個の１５Ｎおよび６個の１３Ｃ同位体によって標識される。
【００５４】
ある実施態様では、式（Ｉ）の同位体標識化合物は、以下に示される化学構造（Ｉ−ＩＳ）において指示されるように同位体標識されている。
【００５５】
【化１４】
【００５６】
本明細書で使用されるように、別に記されない限り、用語「薬物代謝酵素」は、試験化合物を代謝することができるヒトまたは動物組織由来の、好ましくはヒト組織由来の、より好ましくはヒト肝臓組織由来のすべての酵素またはその混合物を意味する。（参照、例えば、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｚｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅｓ，Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｊａｅ Ｓ．Ｌｅｅ，Ｒ．Ｓｃｏｔｔ Ｏｂａｃｈ ａｎｄ Ｍｉｃｈａｅｌ Ｂ．Ｆｉｓｈｅｒ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．（２００３））．適当な例は、限定されるものではないが、肝臓ミクロソーム、チトクロームＰ４５０酵素またはチトクロームＰ４５０酵素の異なるイソ型の混合物、ペルオキシダーゼ、シクロオキシゲナーゼ、ミエロペルオキシダーゼなどを含む。好ましくは、薬物代謝酵素はヒト肝臓ミクロソーム、より好ましくは、チトクロームＰ４５０酵素である。当業者は、試験化合物をチトクロームＰ４５０酵素またはチトクロームＰ４５０酵素の異なるイソ型の混合物とともにインキュベートする場合、試験化合物をチトクロームＰ４５０酵素またはチトクロームＰ４５０酵素の異なるイソ型の混合物が、ＮＡＤＰＨ補因子またはＮＡＤＰＨ再生系と組み合わされてインキュベートされることを認識できる。
【００５７】
本明細書で使用されるように、別に記されない限り、用語「試験化合物」は、反応性代謝物の形成について試験されるすべての化学物質を意味する。好ましくは、試験化合物は製薬学的作用物、またはその塩、エステルまたはプロドラッグである。
【００５８】
本明細書で使用されるように、別に記されない限り、用語「薬物候補物」は、反応性代謝物を生成しないすべての化学物質または試験化合物を意味する。好ましくは、薬物候補物は製薬学的作用物、またはその塩、エステルまたはプロドラッグである。
【００５９】
本明細書で使用されるように、別に記されない限り、用語「付加物」は、反応性代謝物と式（Ｉ）の同位体標識化合物または式（Ｉ）の非同位体標識化合物とのすべての共有結
合複合体を意味する。
【００６０】
本明細書、特にスキームおよび実施例で使用される略語は次のとおりである：
ＡＰＣＩ−ＭＳ／ＭＳ ＝ 大気圧化学イオン化タンデム質量分析
ＣＹＰ ＝ チトクロームＰ４５０酵素
Ｄａ ＝ ダルトン
ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ ＝ エレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析
ＨＰＬＣ ＝ 高速液体クロマトグラフィー
ＭＳ ＝ 質量分光（分析）法
ＮＡＤＰＨ ＝ β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸
（還元型）
ＳＰＥ ＝ 固相抽出
【００６１】
ある実施態様では、本発明は、星印の基の炭素、窒素、酸素、硫黄および／または置換不可能な水素原子の１個以上が、好ましくは１個以上の１３Ｃ，１５Ｎ，１８Ｏ，２Ｈ，３Ｈおよび／または３４Ｓ同位体により同位体標識されている式（Ｉ）の同位体標識化合物に対向される。式（Ｉ）の同位体標識化合物は、既知の方法にしたがって、例えば、同位体置換によるか、または同位体標識された試薬／出発物質を使用するペプチドカップリング合成によって製造されてもよい。（参照、例えば、Ｏｔｔ，Ｄｏｎａｌｄ Ｇ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ ｗｉｔｈ Ｓｔａｂｌｅ Ｉｓｏｔｏｐｅｓ ｏｆ Ｃａｒｂｏｎ，Ｎｉｔｒｏｇｅｎ，ａｎｄ Ｏｘｙｇｅｎ，（１９８１），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ；Ｋｅｌｉｈｅｒ，Ｅｄｍｕｎｄ Ｊ．；Ｂｕｒｒｅｌ，Ｒｉｃｈａｒｄ Ｃ．；Ｃｈｏｂａｎｉａｎ，Ｈａｒｒｙ Ｒ．；Ｃｏｎｋｒｉｔｅ，Ｋａｒｉｎａ Ｌ．；Ｓｈｕｋｌａ，Ｒａｊｅｓｈ；Ｂａｌｄｗｉｎ，Ｊｏｈｎ Ｅ．；Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ ｏｆ ｆｏｕｒ ｓｔａｂｌｅ−ｉｓｏｔｏｐｅ ｌａｂｅｌｅｄ（１Ｒ）−ｍｅｎｔｈｙｌ（１Ｓ，２Ｓ）−（＋）−２−ｐｈｅｎｙｌｃｙｃｌｏｐｒｏｐａｎｅｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅｓ，Ｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（２００６），４（１４），ｐｐ２７７７−２７８４；Ｓｃｈｉｐｐｅｒｓ，Ｎｉｃｏｌｅ；Ｓｃｈｗａｃｋ，Ｗｏｌｆｇａｎｇ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ １５Ｎ−ｌａｂｅｌｌｅｄ ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅ ｉｍｉｄａｃｌｏｐｒｉｄ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌａｂｅｌｌｅｄ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ａｎｄ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｃｅｕｔｉｃａｌｓ，（２００６），４９（３），ｐｐ３０５−３１０；ａｎｄ Ｂｒｅｔｚ，Ｍｉｃｈａｅｌ；Ｂｅｙｅｒ，Ｍａｒｉｔａ；Ｃｒａｍｅｒ Ｂｅｎｅｄｉｋｔ；Ｈｕｍｐｆ，Ｈａｎｓ−Ｕｒｉｃｈ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｓｔａｂｌｅ ｉｓｏｔｏｐｅ ｌａｂｅｌｅｄ ３−ａｃｅｔｙｌｄｅｏｘｙｎｉｖａｌｅｎｏｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ＆ Ｆｏｏｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，（２００５），４９（１２），ｐｐ１１５１−１１５３．）
ある実施態様では、本発明は式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物に対向される。式（Ｉ−ＩＳ）の化合物は以下のスキーム１に略記されるように製造されてもよい。
【００６２】
【化１５】
【００６３】
したがって、２−アミノ−４−（１−カルボキシ−２−メルカプト−エチルカルバモイル）−酪酸が、既知の化学（例えば、Ｗａｄｅ，Ｌ．Ｇ．，Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｆｏｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎｓ，Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ，１９９９，ｐｐ．１３６−１３７）にしたがって同位体標識リジンと反応されて、式（Ｉ−ＩＳ）の化合物を生成する。
【００６４】
本発明は、反応性代謝物を検出するための、式（Ｉ）の化合物
【００６５】
【化１６】
【００６６】
または式（Ｉ）の同位体標識化合物
【００６７】
【化１７】
【００６８】
［式中、星印の基における炭素、窒素、酸素、硫黄または置換不可能な水素原子の１個以上は同位体標識されている］；
または式（Ｉ）の化合物および式（Ｉ）の同位体標識化合物の混合物；
の使用に対向される。
【００６９】
本発明は、さらに、同位体トラッピングおよび質量分光法を使用して反応性代謝物を検出する方法に対向され、ここで、本方法は擬陽性物を除去する。本発明は、さらに、低レベルにおける反応性代謝物を検出する高感度の方法を提供する。その上、本発明は、ＭＳパターン認識を使用して、手動様式または完全自動様式における反応性代謝物の検出に適用されてもよい。
【００７０】
本発明は、さらに、
（ａ）式（Ｉ）の化合物または式（Ｉ）の同位体標識化合物［式中、星印の基における炭素、窒素、酸素、硫黄および／または置換不可能な水素原子の１個以上が同位体標識されている］を、試験化合物および薬物代謝酵素とともにインキュベートして、１種以上の付加物を含む生成物混合物を生成し；そして
（ｂ）該付加物を検出する（既知の方法にしたがって）；
ことを含む、反応性代謝物を検出する方法に対向される。
【００７１】
例えば、安定な同位体トラッピングなしに（例えば、式（Ｉ）の同位体標識化合物のような同位体標識トラッピング作用物の使用なしに）反応性代謝物を検出する方法は、調査走査としてニュートラルロスを使用することによってＭＳ／ＭＳ全走査を開始できる３連の四重極質量分析計を用いる。このシステムを使用すれば、付加物のタンデムＭＳスペクトルが１回の実行において得ることができ、そして構造同定は、特徴的な生成物イオンを検査することによって達成できる。しかしながら、ニュートラルロスＭＳ走査に較べて典型的にＭＳ全走査により達成されるノイズに対するより小さいシグナル比率のために、ＭＳ全走査システムを使用して少い反応性代謝物を検出することは困難であろう。さらに、ＭＳ全走査は比較的時間と労力を集中する。
【００７２】
本発明は、さらに、
（ａ）式（Ｉ）の非同位体標識化合物、式（Ｉ）の同位体標識化合物［式中、星印の基に
おける炭素、窒素、酸素、硫黄および／または置換不可能な水素原子の１個以上が同位体標識されている］および薬物代謝酵素を含む混合物とともに試験化合物をインキュベートして、１種以上の付加物を含む生成物混合物を生成し；そして
（ｂ）段階（ａ）の付加物のニュートラルロス質量スペクトルにおいて１種以上の同位体二重線を検出し、ここで、二重線は、式（Ｉ）の非同位体標識化合物と式（Ｉ）の同位体標識化合物との間の質量における差異だけ質量において異なる；
ことを含む、試験化合物の反応性代謝物を検出する方法に対向される。
【００７３】
ある実施態様では、本発明は、
（ａ）式（Ｉ）の化合物
【００７４】
【化１８】
【００７５】
式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物
【００７６】
【化１９】
【００７７】
および薬物代謝酵素を含む混合物とともに試験化合物をインキュベートして、１種以上の付加物を含む生成物混合物を生成し；
（ｂ）段階（ａ）において生成された１種以上の付加物のニュートラルロス質量スペクトルを測定し；そして
（ｃ）段階（ｂ）のニュートラルロス質量スペクトルにおける１種以上の同位体二重線を
検出し、ここで、同位体二重線は、質量において８Ｄａだけ異なる；
ことを含む、試験化合物の反応性代謝物を検出する方法に対向される。
【００７８】
ある実施態様では、本発明は、
（ａ）式（Ｉ）の非同位体標識化合物、式（Ｉ）の同位体標識化合物［式中、星印の基における炭素、窒素、酸素、硫黄および／または置換不可能な水素原子の１個以上が同位体標識されている］、および薬物代謝酵素を含む混合物とともに試験化合物をインキュベートして、１種以上の付加物を含む生成物混合物を生成し；
（ｂ）段階（ａ）の１種以上の付加物を分離し（既知の方法にしたがって、好ましくは遠心分離によって）；
（ｃ）該分離された付加物のニュートラルロス質量スペクトルを測定し；
（ｄ）該分離付加物のニュートラルロス質量スペクトルにおける１種以上の同位体二重線を検出し、ここで、二重線は、式（Ｉ）の非同位体標識化合物と式（Ｉ）の同位体標識化合物との間の質量における差異だけ質量において異なる；
ことを含む、試験化合物反応性代謝物を検出する方法に対向される。
【００７９】
ある実施態様では、本発明は、
段階Ａ：
（ａ）試験化合物；
（ｂ）式（Ｉ）の化合物
【００８０】
【化２０】
【００８１】
（ｃ）式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物
【００８２】
【化２１】
【００８３】
（ここで、式（Ｉ）の化合物対式（Ｉ−ＩＳ）の化合物のモル比は約１：１である）；および
（ｄ）ヒト肝臓ミクロソーム、ＮＡＤＰＨ補因子と組み合わされたチトクロームＰ４５０酵素およびＮＡＤＰＨ再生系と組み合わされたチトクロームＰ４５０酵素からなる群から選ばれる薬物代謝酵素；
を含む混合物をインキュベートして、
（ａ）非反応性代謝物；
（ｂ）式（Ｉ）の化合物と反応性代謝物との間で形成される付加物；および
（ｃ）式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物と反応性代謝物との間で形成される付加物；
からなる群から選ばれる１種以上のインキュベーション生成物を含む生成物混合物を生成し；
段階Ｂ：段階（Ａ）において生成された生成物混合物のニュートラルロス質量スペクトルを測定し；そして
段階Ｃ：段階（Ｂ）のニュートラルロス質量スペクトルにおける１種以上の同位体二重線を検出し、ここで、同位体二重線は、質量において８Ｄａだけ異なる；
ことを含む、試験化合物の反応性代謝物を検出する方法に対向される。
【００８４】
本発明のある実施態様では、式（Ｉ）の同位体標識化合物は、１３Ｃ，１５Ｎ，１８Ｏおよび２Ｈからなる群から選ばれる少なくとも１個の同位体により標識される。本発明のその他の実施態様では、式（Ｉ）の同位体標識化合物は、１〜２８個の同位体、好ましくは１〜１０個の同位体により標識される。本発明のその他の実施態様では、式（Ｉ）の同位体標識化合物は、６個の１３Ｃおよび２個の１５Ｎ原子により標識される。本発明のその他の実施態様では、式（Ｉ）の同位体標識化合物は、式（Ｉ−ＩＳ）の化合物である。
【００８５】
【化２２】
【００８６】
本発明のある実施態様では、ニュートラルロス質量スペクトルは１２９Ｄａのロス（式（Ｉ）の非同位体標識または同位体標識化合物の−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯ２Ｈ部分のロスに対応する）を検出するために使用される。
【００８７】
本発明のある実施態様では、同位体二重線は、ＡＰＣＩ−ＭＳ／ＭＳ、ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳなど；好ましくは、ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにより検出される。本発明のその他の実施態様では、ニュートラルロス質量スペクトルにおける同位体二重線は、１〜２８の質量ユニット、好ましくは２〜１０質量ユニット、より好ましくは８質量ユニットの質量だけ異なる。
【００８８】
本発明のある実施態様では、薬物代謝酵素は、ヒト肝臓ミクロソーム、チトクロームＰ４５０酵素、ペルオキシダーゼ、シクロオキシゲナーゼおよびミエロペルオキシダーゼからなる群から選ばれる。好ましくは、薬物代謝酵素はチトクロームＰ４５０酵素である。
【００８９】
ある実施態様では、本発明は、薬物代謝酵素、例えば、Ｓ９、組み換え酵素またはミクロソーム酵素を含有する細胞のすべての画分とともに試験化合物をインキュベートすることによって形成される反応性代謝物を検出するために適用される。ある実施態様では、本発明の方法は、試験化合物がヒト被験者において反応性代謝物を形成するか否か（ヒトに対する試験化合物の投与後に）を予測するために適用される。
【００９０】
当業者は、略語「Ｓ９」が、ミクロソームとサイトゾルの混合物であるＳ９画分（ミトコンドリア後上澄液画分）を指すことを理解できる。したがって、それは、Ｐ４５０酵素、フラビン−モノオキシゲナーゼ、カルボキシエステラーゼ、エポキシドヒドロラーゼ、ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼ、メチルトランスフェラーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼおよび他の薬物代謝酵素を含む広範なフェースＩおよびフェースＩＩ酵素を含有する。
【００９１】
本発明は、さらに、（ａ）反応性代謝物と式（Ｉ）の非同位体標識化合物の共有結合複合体、および（ｂ）反応性代謝物と式（Ｉ）の同位体標識化合物［式中、星印の基における炭素、窒素、酸素、硫黄および／または置換不可能な水素原子の１個以上が同位体標識されている］の共有結合複合体を含む、混合物に対向される。
【００９２】
本発明のある実施態様では、式（Ｉ）の非同位体標識化合物および式（Ｉ）の同位体標
識化合物のモル比は、約１：１〜約１：２の範囲、好ましくは約１：１〜約１：１．５の範囲、より好ましくは約１：１である。
【００９３】
本発明のある実施態様では、反応性代謝物と式（Ｉ）の非同位体標識化合物の共有結合複合体、および反応性代謝物と式（Ｉ）の同位体標識化合物の共有結合複合体のモル比は、約１：１〜約１：２の範囲、好ましくは約１：１〜約１：１．５の範囲、より好ましくは約１：１である。
【００９４】
本発明はさらに、反応性代謝物を検出する方法に対向される。より具体的には、本発明の方法では、試験化合物は、
（ａ）式（Ｉ）の非同位体標識化合物；
（ｂ）式（Ｉ）の同位体標識化合物［式中、式（Ｉ）の同位体標識化合物は、６個の１３Ｃおよび２個の１５Ｎ原子を含有する］、ここで、式（Ｉ）の非同位体標識化合物対式（Ｉ）の同位体標識化合物のモル比は約１：１（約同じ強度を有する質量スペクトルにおける二重線を生じるために）である；および
（ｃ）薬物代謝酵素、例えば、ヒト肝臓ミクロソーム、ＮＡＤＰＨ補因子と組み合わされたチトクロームＰ４５０酵素（ＣＹＰ）（ミクロソームの、肝細胞などの、精製、組み換え体）、ＮＡＤＰＨ再生系、ペルオキシダーゼ、シクロオキシゲナーゼ、ミエロペルオキシダーゼなどと組み合わされたチトクロームＰ４５０酵素（ＣＹＰ）（ミクロソームの、肝細胞などの、精製、組み換え体）；好ましくはヒト肝臓ミクロソーム；
を含む混合物とともに、既知の方法にしたがってインキュベートされて、
（ａ）非反応性代謝物；
（ｂ）式（Ｉ）の非同位体標識化合物と反応性代謝物との間で形成される付加物；および（ｃ）式（Ｉ）の同位体標識化合物と反応性代謝物との間で形成される付加物；
からなる群から選ばれる１種以上のインキュベーション生成物を含む生成物混合物を生成する。
【００９５】
当業者は、上記インキュベーションの結果として生成される非反応性（安定な）代謝物が、式（Ｉ）の非同位体標識化合物かまたは式（Ｉ）の同位体標識化合物のいずれかと反応せず、むしろ無変化のまま生成物混合物中に残ることを認識できる。
【００９６】
好ましくは、式（Ｉ）の同位体標識化合物は、安定であるよう選ばれた１個以上の同位体により標識される。適当な同位体は、限定されるものではないが、１３Ｃ，１５Ｎ，２Ｈ，３Ｈ，１８Ｏ，３４Ｓなどを含む。好ましくは、同位体は、１３Ｃ，１５Ｎ，１８Ｏおよび２Ｈ、より好ましくは１３Ｃおよび１５Ｎからなる群から選ばれる。好ましくは、式（Ｉ）の同位体標識化合物は、式（Ｉ）の非同位体標識化合物とは、１〜２８質量ユニット、より好ましくは２〜１０質量ユニット、もっとも好ましくは８質量ユニットだけ質量において異なる。
【００９７】
インキュベーション生成物（非反応性代謝物、反応性代謝物と式（Ｉ）の非同位体標識化合物との間で形成される付加物および／または反応性代謝物と式（Ｉ）の同位体標識化合物との間で形成される付加物）の１種以上を含有する生成物混合物は、好ましくは、既知の方法により、例えば、遠心分離、ＳＰＥまたは液・液抽出によって精製および濃縮されて、生成物濃縮物を生成する。次いで、生成物濃縮物は、質量分光分析法における使用のために適当な（すなわち、質量分析計への注入のために適当な）溶媒、例えば、水中５％アセトニトリル、水中５％メタノールなどに溶解される。
【００９８】
好ましくは、生成物混合物は、既知の方法により、例えば、液体クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、毛管電気泳動、または他の分離技術によって個々の付加物成分に分離される。次いで、ニュートラルロス質量スペクトルが、各付加物または付加物成分について測定さ
れる。ニュートラルロス質量スペクトルは、すべてのイオン化源を使用する、既知の方法にしたがって、例えば、ＡＰＣＩ−ＭＳ／ＭＳ、ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳなど；好ましくは、ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳによって測定されてもよい。あるいはまた、分離および質量スペクトル測定は、ＬＣ／ＭＳのようなループシステムなどを使用して１段階で完結されてもよい。
【００９９】
反応性代謝物が試験化合物から生成され、そして存在する（式（Ｉ）の非同位体標識化合物および式（Ｉ）の同位体標識化合物との付加物として）場合、対応する質量スペクトルは、式（Ｉ）の非同位体標識化合物および式（Ｉ）の同位体標識化合物の間の質量における差異だけ、間を空けた１種以上の二重線を表すであろう。当業者は、二重線が、肉眼認識によるか、またはＭＳパターンを評価するコンピューターソフトウエアプログラムを使用して同定されてもよいことを認識できる。
【０１００】
例として、式（Ｉ）の同位体標識化合物が、式（Ｉ−ＩＳ）の化合物におけるように、６個の１３Ｃおよび２個の１５Ｎ原子により標識され、そして式（Ｉ）の非同位体標識化合物および式（Ｉ）の同位体標識化合物が、好ましくは約１：１のモル比で存在する場合、衝突誘起解離において、両、非同位体標識および同位体標識付加物は、ピログルタメートのニュートラルロス（１２９Ｄａ）を受けるであろう。結果として、反応性代謝物と式（Ｉ）の非同位体標識化合物および式（Ｉ）の同位体標識化合物との間で形成された付加物の質量スペクトルは、質量において８Ｄａだけ異なる２種の同位体分子イオンを表し、そして同位体二重線はほぼ等しい強度を示すであろう。該二重線ピークの一貫した８Ｄａの質量差異およびほぼ等しい強度は、それによって、反応性代謝物付加物を同定できる独特なＭＳ表示を提供するであろう。
【０１０１】
本発明の方法では、擬陽性物は、測定されたニュートラルロス質量スペクトルにおいて特徴的な二重線を表さないので、それらは容易に除去される。
【０１０２】
本発明の方法の自動化は、例えば、コンピューター補助のＭＳパターン認識を使用することによって達成されてもよい。例として、論理図式が、コンピューターをプログラムして反応性代謝物の自動検出を遂行するように工夫された。より具体的には、パターン認識プロセスは、次の段階：
１．ｍ／ｚ値についての誤差許容限度を定義し；
２．可能性のある同位体二重線についてのピーク強度比率の誤差範囲を定義し；
３．選択されたノイズ対シグナル設定により総イオンクロマトグラムにおけるクロマトグラフィーピークを決定し；
４．個々のクロマトグラフィーピークの主要な分子イオンのｍ／ｚ値を検出し；
５．定義された誤差許容限度を用いて適当なダルトン数だけ質量において異なる（選択された同位体種およびナンバーに基づいて）二重線を探索し；
６．同定された二重線の強度比率を決定し；
７．付加物を同定する；
ことからなる。
【０１０３】
このアプローチの使用では、二重線の強度比率および質量差異はパターン認識においてもっとも決定的なパラメーターである。強度比率の誤差範囲は、式（Ｉ）の非同位体標識化合物および式（Ｉ）の同位体標識化合物の純度によって決定されるが、一方、ｍ／ｚ値の誤差許容限度は質量分析計の性能に依存する。
【０１０４】
本発明の方法は、試験化合物が、１回の実験において「ハード」および／または「ソフト」反応性代謝物を生成できるか否かを決定するために意図される。当業者は、本発明の方法が、同時に両「ハード」および「ソフト」反応性代謝物を検出できるけれども、「ハ
ード」または「ソフト」いずれかの反応性代謝物が特定の試験化合物から形成されない場合でも、本方法がいずれのタイプの反応性代謝物が形成されたかを検出できることを認識できる。その上、反応性代謝物が形成されない場合には、本方法は特徴的な二重線のない質量スペクトルを作製するので、試験化合物を薬物候補物として同定することができる。
【０１０５】
本発明は、さらに、
（ａ）式（Ｉ）の非同位体標識化合物、式（Ｉ）の同位体標識化合物［式中、星印の基における炭素、窒素、酸素、硫黄および／または置換不可能な水素原子の１個以上が同位体標識されている］、および薬物代謝酵素を含む混合物とともに試験化合物をインキュベートして、生成物混合物を生成し；
（ｂ）段階（ａ）において生成された生成物混合物のニュートラルロス質量スペクトルを測定し；そして
（ｃ）段階（ｂ）のニュートラルロス質量スペクトルにおける同位体二重線の不在を検出する（ここで、同位体二重線は、式（Ｉ）の非同位体標識化合物と式（Ｉ）の同位体標識化合物との間の質量における差異だけ質量において異なる）；
ことを含む、薬物候補物（すなわち、反応性代謝物を生成しない試験化合物）を同定する方法に対向される。
【０１０６】
ある実施態様では、本発明は、
（ａ）式（Ｉ）の非同位体標識化合物
【０１０７】
【化２３】
【０１０８】
式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物
【０１０９】
【化２４】
【０１１０】
［式中、星印の基における炭素、窒素、酸素、硫黄または置換不可能な水素原子の１個以上が同位体標識されている］、
および薬物代謝酵素を含む混合物とともに試験化合物をインキュベートして、生成物混合物を生成し；
（ｂ）段階（ａ）において生成された生成物混合物のニュートラルロス質量スペクトルを測定し；そして
（ｃ）段階（ｂ）のニュートラルロス質量スペクトルにおける同位体二重線の不在を検出する（ここで、同位体二重線は、８Ｄａの質量における差異だけ質量において異なる）；ことを含む、薬物候補物を同定する方法に対向される。
【０１１１】
次の実施例は、本発明の理解を補助するために記述され、そしてその後に続く請求項に記述される本発明をいかなる点においても制約することを意図せず、かつ制約するものと考えてはならない。
【実施例】
【０１１２】
例１−標準操作
Ａ．インキュベーション＆安定な同位体トラッピング；
本明細書に記述されるすべてのミクロソームインキュベーションは水浴中３７℃において実施された。試験化合物は、１：１の等モル比で予め混合された式（Ｉ）の非同位体標識化合物と式（Ｉ−Ｓ）の同位体標識化合物を補足された５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．４）中でヒト肝臓ミクロソーム調製物（チトクロームＰ４５０酵素調製物）と混合された。得られる混合液は３７℃で５分間予め加温された。次いで、反応混合液に対して補因子−ＮＡＤＰＨ再生系−（反応を開始するために）が添加されて、１０００μｌの最終容量を得た。
【０１１３】
得られる反応混合液は、１０μＭ試験化合物、１ｍｇ／ｍｌのミクロソームタンパク質、式（Ｉ）の非同位体標識化合物と式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物の１ｍＭ混合液、１．３ｍＭ ＮＡＤＰ＋、３．３ｍＭグルコース−６−リン酸、０．４Ｕ／ｍｌのグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、３．３ｍＭ塩化マグネシウムを含有した。
【０１１４】
６０分のインキュベーション後、反応はトリクロロ酢酸（１０％）の１５０μｌの添加によって終結された。得られる混合液は１０，０００ｇ １５分間、４℃において遠心されて沈降タンパク質を沈殿させ、そして上澄液が固相抽出にかけられた。あるいはまた、反応混合液は液・液抽出にかけられて上澄液から代謝物を回収した。
【０１１５】
Ｂ．質量分析；
ＭＳ分析は、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ（Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ）Ｑｕａｔｔｒｏ Ｍｉｃｒｏ３連四重極質量分析計において実施された。ＥＳＩイオン源は正イオン方式で作動され、そして実験パラメーターは次のように設定された：毛管電位３．２ｋＶ、イオン源温度１２０℃、脱溶媒和（ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ）温度３００℃、サンプルコーン（ｃｏｎｅ）電位２６Ｖ。ニュートラルロス走査方式で収集される質量スペクトルは、２．０ｓにおいて範囲ｍ／ｚ４００−８００にわたって走査することによって得られた。
【０１１６】
Ｃ．ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析；
反応性代謝物の完全なプロファイリングのために、サンプルは最初に、自動サンプラーを備えたＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）によるクロマトグラフィー分離にかけられ、そして溶出液は、ニュートラルロス走査方式で作動されるＱｕａｔｔｒｏ Ｍｉｃｒｏ３連四重極質量分析計に導入された。Ａｇｉｌｅｎｔ Ｚｏｒｂａｘ ＳＢ Ｃ１８カラム（２．１ｘ５０ｍｍ）がクロマトグラフィー分離のために使用された。初発移動相は９５％水（０．５％酢酸）からなり、そして代謝物は９５％水〜９５％アセトニトリルの単一勾配を使用して流速０．３ｍｌ／分において７分かけて溶出された。７分時点で、カラムは、９５％アセトニトリルにより２分間フラッシュされ、その後、初期条件において再平衡化された。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析は純化されたサンプルの１０μｌ分量において実施された。データはＭｉｃｒｏｍａｓｓ製のＭａｓｓｌｙｎｘバージョン４．０ソフトウエアを使用して処理された。ポジティブピークが検出された後、続いて、ＭＳ／ＭＳスペクトルが得られて、付加物の構造がさらに確認された。ＣＩＤ（Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）スペクトルを得るために、質量分析計は多反応モニタリング（ＭＲＭ）方式で操作された。
【０１１７】
例２−９：ソフトおよび／またはハード反応性代謝物の検出
上記の例１に略記されたような操作に続いて、本発明の方法は、既知の試験化合物、より具体的には、「ソフト」および／または「ハード」代謝物を生成することが知られている試験化合物についての反応性代謝物の検出、１２９Ｄａのロスにおけるニュートラルロス質量スペクトルの走査、および対応する式（Ｉ）の非同位体標識化合物とは８Ｄａユニットだけ異なる式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物の使用に応用された。
【０１１８】
例２：ジクロフェナク
ジクロフェナクは、ソフト反応性代謝物の検出に対する本発明の方法の応用を例証するために試験化合物として選ばれた。
【０１１９】
ジクロフェナクの２種の反応性代謝物および対応する付加物の形成は、下記スキームＥ１に略記されているとおりである。以下に略記される反応において、ジクロフェナクの反応性代謝物は、−ＳＨ部分を介して式（Ｉ）の非同位体標識化合物および式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物との付加物を形成する。明らかにするために、式（Ｉ）の非同位体標識化合物との付加物のみが以下に示される。当業者は、式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物との付加物が、同位体標識においてのみ異なる同じ構造を有することを認識できる。
【０１２０】
【化２５】
【０１２１】
図１Ａは、反応混合物について得られた１２９Ｄａのニュートラルロス走査の総イオンクロマトグラム（ＭＳ）を示している。数種の成分がニュートラル走査に対する正の応答を示し、そしてその成分の２種が期待される同位体二重線（８Ｄａの質量差をもつ）を示した。付加物Ｉは５．９分の保持時間において溶出し、そして図１Ｂに示されるように、ｍ／ｚ６８８および６９６における特徴的な同位体二重線を表し、一方、付加物ＩＩは５．８分の保持時間において現れ、そして図１Ｃに示されるように、ｍ／ｚ６５４および６６２Ｄａにおける特徴的な同位体二重線を表した。
【０１２２】
例３：クロザピン
クロザピンは、ソフト反応性代謝物の検出に対する本発明の方法の応用を例証するために試験化合物として選ばれた。
【０１２３】
クロザピンの単一の反応性代謝物および対応する付加物の形成は、下記スキームＥ２に
略記されているとおりである。以下に略記される反応において、クロザピンの反応性代謝物は、−ＳＨ部分を介して式（Ｉ）の非同位体標識化合物および式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物との付加物を形成する。明らかにするために、式（Ｉ）の非同位体標識化合物との付加物のみが以下に示される。当業者は、式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物との付加物が、同位体標識においてのみ異なる同じ構造を有することを認識できる。
【０１２４】
【化２６】
【０１２５】
図２Ａは、反応混合物について得られた１２９Ｄａのニュートラルロス走査の総イオンクロマトグラム（ＭＳ）を示している。数種の成分がニュートラル走査に対する正の応答を示すが、５．４分の保持時間における１成分のみが、図２Ｂに示されるように、ｍ／ｚ７０３および７１１Ｄａにおける特徴的な同位体二重線を表した。
【０１２６】
例４：ｐ−クレゾール
ｐ−クレゾールは、ソフト反応性代謝物の検出に対する本発明の方法の応用を例証するために試験化合物として選ばれた。
【０１２７】
ｐ−クレゾールの２種の反応性代謝物および対応する付加物の形成は、下記スキームＥ３に略記されているとおりである。以下に略記される反応において、ｐ−クレゾールの反応性代謝物は、−ＳＨ部分を介して式（Ｉ）の非同位体標識化合物および式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物との付加物を形成する。明らかにするために、式（Ｉ）の非同位体標識化合物との付加物のみが以下に示される。当業者は、式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物との付加物が、同位体標識においてのみ異なる同じ構造を有することを認識できる。
【０１２８】
【化２７】
【０１２９】
図３Ａは、反応混合物について得られた１２９Ｄａのニュートラルロス走査の総イオンクロマトグラム（ＭＳ）を示している。２種の成分が特徴的な同位体二重線を示した。付加物Ｉは０．６４分の保持時間をもち、図３Ｂに示されるように、ｍ／ｚ４８５および４９３Ｄａにおける同位体二重線を示した。付加物ＩＩは０．７１分の保持時間をもち、図３Ｃに示されるように、ｍ／ｚ５０１および５０９Ｄａにおける同位体二重線を示した。
【０１３０】
例５：オメプラゾール
オメプラゾールは、ソフト反応性代謝物の検出に対する本発明の方法の応用を例証するために試験化合物として選ばれた。
【０１３１】
オメプラゾールの単一の反応性代謝物および対応する付加物の形成は、下記スキームＥ
４に略記されているとおりである。以下に略記される反応において、オメプラゾールの反応性代謝物は、−ＳＨ部分を介して式（Ｉ）の非同位体標識化合物および式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物との付加物を形成する。明らかにするために、式（Ｉ）の非同位体標識化合物との付加物のみが以下に示される。当業者は、式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物との付加物が、同位体標識においてのみ異なる同じ構造を有することを認識できる。
【０１３２】
【化２８】
【０１３３】
図４Ａは、反応混合物について得られた１２９Ｄａのニュートラルロス走査の総イオンクロマトグラム（ＭＳ）を示している。５．３分の保持時間における１成分のみが、図４Ｂに示されるように、ｍ／ｚ７２３および７３１Ｄａにおいて特徴的な同位体二重線を表した。
【０１３４】
例６：フラン
フランは、ハード反応性代謝物の検出に対する本発明の方法の応用を例証するために試験化合物として選ばれた。
【０１３５】
フランの単一の反応性代謝物および対応する付加物の形成は、下記スキームＥ５に略記されているとおりである。以下に略記される反応において、フランの反応性代謝物は、−ＳＨ部分と末端−ＮＨ２部分の両部分を介して式（Ｉ）の非同位体標識化合物および式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物との付加物を形成する。明らかにするために、式（Ｉ）の非同位体標識化合物との付加物のみが以下に示される。当業者は、式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物との付加物が、同位体標識においてのみ異なる同じ構造を有することを認識できる。
【０１３６】
【化２９】
【０１３７】
図５Ａは、反応混合物について得られた１２９Ｄａのニュートラルロス走査の総イオンクロマトグラム（ＭＳ）を示している。８．９分の保持時間において溶出される成分が、図５Ｂに示されるように、ｍ／ｚ４２７および４３５Ｄａにおける特徴的な同位体二重線を示した。
【０１３８】
例７：２−メチルフラン
２−メチルフランは、ハード反応性代謝物の検出に対する本発明の方法の応用を例証するために試験化合物として選ばれた。
【０１３９】
２−メチルフランの単一の反応性代謝物および対応する２種の構造異性体付加物の形成は、下記スキームＥ６に略記されているとおりである。以下に略記される反応において、２種メチルフランの反応性代謝物は、−ＳＨ部分と末端−ＮＨ２部分の両部分を介して式
（Ｉ）の非同位体標識化合物および式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物との２種の構造異性体付加物を形成する。明らかにするために、式（Ｉ）の非同位体標識化合物との付加物のみが以下に示される。当業者は、式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物との付加物が、同位体標識においてのみ異なる同じ構造を有することを認識できる。さらに、当業者は、この実験において形成された２種の構造異性体付加物がほぼ同一の質量スペクトルを生成することを認識できる。
【０１４０】
【化３０】
【０１４１】
図６Ａは、反応混合物について得られた１２９Ｄａのニュートラルロス走査の総イオンクロマトグラム（ＭＳ）を示している。５．６および５．９分の保持時間をもつ２種の異
性体付加物は、各々図６Ｂに示されるように、ｍ／ｚ４４１および４４９Ｄａにおける特徴的な同位体二重線を示した。
【０１４２】
例８：２−メントフラン
メントフランは、ハード反応性代謝物の検出に対する本発明の方法の応用を例証するために試験化合物として選ばれた。
【０１４３】
メントフランの単一反応性代謝物および対応する付加物の形成は、下記スキームＥ７に略記されているとおりである。以下に略記される反応において、メントフランの反応性代謝物は、末端−ＮＨ２部分を介して式（Ｉ）の非同位体標識化合物および式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物との付加物を形成する。明らかにするために、式（Ｉ）の非同位体標識化合物との付加物のみが以下に示される。当業者は、式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物との付加物が、同位体標識においてのみ異なる同じ構造を有することを認識できる。
【０１４４】
【化３１】
【０１４５】
図７Ａは、反応混合物について得られた１２９Ｄａのニュートラルロス走査の総イオンクロマトグラム（ＭＳ）を示している。５．９分の保持時間における１成分は、図７Ｂに示されるように、ｍ／ｚ５２７および５３５Ｄａにおける特徴的な同位体二重線を示した
。
【０１４６】
例９：２−（２−チエニル）−フラン
２−（２−チエニル）−フランは、両、ハードおよびソフト反応性代謝物の検出に対する本発明の方法の応用を例証するために試験化合物として選ばれた。
【０１４７】
２−（２−チエニル）−フランの反応性代謝物および続く式（Ｉ）の化合物および式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物（これ以降「トラッピング作用物ＧＳＫ」と呼ばれる）との付加物の形成は、下記スキームＥ８およびＥ９に略記されているとおりである。より具体的には、スキーム８は、ハード反応性代謝物（Ｈ１）を生成するフラン環の開環、ソフト反応性代謝物（Ｓ１）を生成するチオフェン環のエポキシ化、および対応する付加物の形成を示す。さらに、スキーム９は、反応性代謝物（Ｓ１）の異性化による第２のハード反応性代謝物（Ｈ２）の形成、およびその対応する付加物の形成を示す。（Ｈ１）反応性代謝物は、−ＳＨ部分と末端−ＮＨ２部分の両方を介して式（Ｉ）の非同位体標識化合物および式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物との付加物を形成し；（Ｓ１）反応性代謝物は、両−ＳＨ部分を介して式（Ｉ）の非同位体標識化合物および式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物との付加物を形成し；そして（Ｈ３）反応性代謝物は、末端−ＮＨ２部分を介して式（Ｉ）の非同位体標識化合物および式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物との付加物を形成する。明らかにするために、式（Ｉ）の非同位体標識化合物との付加物のみが以下に示される。当業者は、式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物との付加物が、同位体標識においてのみ異なる同じ構造を有することを認識できる。
【０１４８】
【化３２】
【０１４９】
【化３３】
【０１５０】
図８Ａは、反応混合物について得られた１２９Ｄａのニュートラルロス走査の総イオンクロマトグラム（ＭＳ）を示している。６．５分の保持時間をもつ付加物Ｉは、図８Ｂに示されるように、ｍ／ｚ５０９および５１７Ｄａにおける特徴的な同位体二重線を示し；付加物ＩＩは、図８Ｃに示されるように、ｍ／ｚ５２７および５３５Ｄａにおける特徴的な同位体二重線を示し；そして付加物ＩＩＩは、図８Ｄに示されるように、ｍ／ｚ４９５および５０３Ｄａにおける特徴的な同位体二重線を示した。
【０１５１】
前記明細書は、具体的な説明を目的として提供された実施例により、本発明の原理を教示しているが、本発明の実行が、次に示す請求項およびそれらの等価物の範囲内に入るような通常の変更、適合および／または修飾のすべてを包含することは理解できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）の同位体標識化合物
【化１】
［式中、星印の基における炭素、窒素、酸素、硫黄または置換不可能な水素原子の１個以上が同位体標識されている］。
【請求項２】
式（Ｉ）の同位体標識化合物は、１３Ｃ，１５Ｎ，１８Ｏおよび２Ｈからなる群から選ばれる少なくとも１個の同位体により標識されている、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
式（Ｉ）の同位体標識化合物は、１３Ｃおよび１５Ｎからなる群から選ばれる１〜１０個の同位体により標識されている、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
６個の炭素原子が１３Ｃ同位体により同位体標識され、そして２個の窒素原子が１５Ｎ同位体により標識されている、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物
【化２】
【請求項６】
（ａ）式（Ｉ）の化合物
【化３】
および薬物代謝酵素とともに試験化合物をインキュベートして、１種以上の付加物を含む生成物混合物を生成し；そして
（ｂ）段階（ａ）の付加物を検出する；
ことを含む、試験化合物の反応性代謝物を検出する方法。
【請求項７】
（ａ）式（Ｉ）の同位体標識化合物
【化４】
［式中、星印の基における炭素、窒素、酸素、硫黄または置換不可能な水素原子の１個以上が同位体標識されている］および薬物代謝酵素とともに試験化合物をインキュベートして、１種以上の付加物を含む生成物混合物を生成し；そして
（ｂ）段階（ａ）の１種以上の付加物を検出する；
ことを含む、試験化合物の反応性代謝物を検出する方法。
【請求項８】
（ａ）式（Ｉ）の化合物
【化５】
式（Ｉ）の同位体標識化合物
【化６】
［式中、星印の基における炭素、窒素、酸素、硫黄または置換不可能な水素原子の１個以上が同位体標識されている］
および薬物代謝酵素を含む混合物とともに試験化合物をインキュベートして、１種以上の付加物を含む生成物混合物を生成し；
（ｂ）段階（ａ）の１種以上の付加物を検出する；
ことを含む、試験化合物の反応性代謝物を検出する方法。
【請求項９】
（ａ）式（Ｉ）の化合物
【化７】
式（Ｉ）の同位体標識化合物
【化８】
［式中、星印の基における炭素、窒素、酸素、硫黄または置換不可能な水素原子の１個以上が同位体標識されている］
および薬物代謝酵素を含む混合物とともに試験化合物をインキュベートして、１種以上の付加物を含む生成物混合物を生成し；
（ｂ）段階（ａ）において生成された１種以上の付加物のニュートラルロス質量スペクトルにおいて１種以上の同位体二重線を検出し、ここで、二重線は、式（Ｉ）の化合物と式（Ｉ）の同位体標識化合物との間の質量における差異だけ質量において異なる；
ことを含む、試験化合物の反応性代謝物を検出する方法。
【請求項１０】
式（Ｉ）の同位体標識化合物は、１３Ｃ，１５Ｎ，１８Ｏおよび２Ｈからなる群から選ばれる少なくとも１個の同位体により標識されている、請求項９の方法。
【請求項１１】
式（Ｉ）の同位体標識化合物は、１３Ｃおよび１５Ｎからなる群から選ばれる１〜１０個の同位体により標識されている、請求項１０の方法。
【請求項１２】
式（Ｉ）の同位体標識化合物は、６個の１３Ｃ原子および２個の１５Ｎ原子により標識されている、請求項９の方法。
【請求項１３】
式（Ｉ）の同位体標識化合物に対する 式（Ｉ）の化合物のモル比は約１：１である、請求項９の方法。
【請求項１４】
同位体二重線が８質量ユニットの質量だけ異なる、請求項１３の方法。
【請求項１５】
薬物代謝酵素がヒト肝臓ミクロソームである、請求項９の方法。
【請求項１６】
薬物代謝酵素が、ＮＡＤＰＨ補因子と組み合わされたチトクロームＰ４５０酵素またはＮＡＤＰＨ再生系と組み合わされたチトクロームＰ４５０酵素である、請求項９の方法。
【請求項１７】
ニュートラルロス質量スペクトルがＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳまたはＬＳ／ＭＳを使用して測定される、請求項９の方法。
【請求項１８】
式（Ｉ）の同位体標識化合物が、式（Ｉ−ＩＳ）の化合物
【化９】
である、請求項９の方法。
【請求項１９】
式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物に対する式（Ｉ）の化合物のモル比は約１：１である、請求項１８の方法。
【請求項２０】
薬物代謝酵素が、ヒト肝臓ミクロソーム、ＮＡＤＰＨ補因子と組み合わされたチトクロームＰ４５０酵素およびＮＡＤＰＨ再生系と組み合わされたチトクロームＰ４５０酵素からなる群から選ばれる、請求項１９の方法。
【請求項２１】
ニュートラルロス質量スペクトルがＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳまたはＬＳ／ＭＳを使用して測定される、請求項２０の方法。
【請求項２２】
式（Ｉ）の化合物
【化１０】
および式（Ｉ）の同位体標識化合物
【化１１】
［式中、星印の基における炭素、窒素、酸素、硫黄または置換不可能な水素原子の１個以上が同位体標識されている］
を含む混合物。
【請求項２３】
式（Ｉ）の同位体標識化合物に対する式（Ｉ）の化合物のモル比は約１：１である、請求項２２の混合物。
【請求項２４】
式（Ｉ）の同位体標識化合物は、６個の１３Ｃ原子および２個の１５Ｎ原子により標識されている、請求項２３の化合物。
【請求項２５】
（ａ）反応性代謝物および式（Ｉ）の化合物
【化１２】
の共有結合複合体、
および（ｂ）反応性代謝物および式（Ｉ）の同位体標識化合物
【化１３】
［式中、星印の基における炭素、窒素、酸素、硫黄または置換不可能な水素原子の１個以上が同位体標識されている］
の共有結合複合体を含む混合物。
【請求項２６】
式（Ｉ）の同位体標識化合物が、式（Ｉ−ＩＳ）の化合物
【化１４】
である、請求項２５の混合物。
【請求項２７】
反応性代謝物および式（Ｉ）の非同位体標識化合物の共有結合複合体、および反応性代謝物および式（Ｉ）の同位体標識化合物の共有結合複合体のモル比は約１：１である、請求項２５の混合物。
【請求項２８】
（ａ）式（Ｉ）の化合物
【化１５】
式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物
【化１６】
および薬物代謝酵素を含む混合物とともに試験化合物をインキュベートして、１種以上の付加物を含む生成物混合物を生成し；
（ｂ）段階（ａ）において生成された１種以上の付加物のニュートラルロス質量スペクトルを測定し；そして
（ｃ）段階（ｂ）のニュートラルロス質量スペクトルにおける１種以上の同位体二重線を検出し、ここで、同位体二重線は、質量において８Ｄａだけ異なる；
ことを含む、試験化合物の反応性代謝物を検出する方法。
【請求項２９】
段階Ａ：
（ａ）試験化合物；
（ｂ）式（Ｉ）の化合物
【化１７】
（ｃ）式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物
【化１８】
（ここで、式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物に対する式（Ｉ）の化合物のモル比は約１：１である）；および
（ｄ）ヒト肝臓ミクロソーム、ＮＡＤＰＨ補因子と組み合わされたチトクロームＰ４５０酵素およびＮＡＤＰＨ再生系と組み合わされたチトクロームＰ４５０酵素からなる群から選ばれる薬物代謝酵素；
を含む混合物をインキュベートして、
（ａ）非反応性代謝物；
（ｂ）式（Ｉ）の化合物と反応性代謝物との間で形成される付加物；および
（ｃ）式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物と反応性代謝物との間で形成される付加物；
からなる群から選ばれる１種以上のインキュベーション生成物を含む生成物混合物を生成し；
段階Ｂ：段階（Ａ）において生成された生成物混合物のニュートラルロス質量スペクトルを測定し；そして
段階Ｃ：段階（Ｂ）のニュートラルロス質量スペクトルにおける１種以上の同位体二重線を検出し、ここで、同位体二重線は、質量において８Ｄａだけ異なる；
ことを含む、試験化合物の反応性代謝物を検出する方法。
【請求項３０】
（ａ）式（Ｉ）の非同位体標識化合物
【化１９】
式（Ｉ）の同位体標識化合物
【化２０】
［式中、星印の基における炭素、窒素、酸素、硫黄および／または置換不可能な水素原子の１個以上が同位体標識されている］、
および薬物代謝酵素を含む混合物とともに試験化合物をインキュベートして、１種以上の付加物を含む生成物混合物を生成し；
（ｂ）段階（ａ）の１種以上の付加物を分離し；
（ｃ）該分離された付加物のニュートラルロス質量スペクトルを測定し；
（ｄ）該分離付加物のニュートラルロス質量スペクトルにおける１種以上の同位体二重線を検出し、ここで、二重線は、式（Ｉ）の非同位体標識化合物と式（Ｉ）の同位体標識化合物との間の質量における差異だけ質量において異なる；
ことを含む、試験化合物の反応性代謝物を検出する方法。
【請求項３１】
（ａ）式（Ｉ）の非同位体標識化合物
【化２１】
式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物
【化２２】
（ここで、式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物に対する式（Ｉ）の化合物のモル比は約１：１である）；
および薬物代謝酵素を含む混合物とともに試験化合物をインキュベートして、１種以上の付加物を含む生成物混合物を生成し；
（ｂ）段階（ａ）の１種以上の付加物を分離し；
（ｃ）該分離された付加物のニュートラルロス質量スペクトルを測定し；
（ｄ）該分離付加物のニュートラルロス質量スペクトルにおける１種以上の同位体二重線を検出し、ここで、二重線は８Ｄａだけ質量において異なる；
ことを含む、試験化合物の反応性代謝物を検出する方法。
【請求項３２】
（ａ）式（Ｉ）の非同位体標識化合物
【化２３】
式（Ｉ）の同位体標識化合物
【化２４】
［式中、星印の基における炭素、窒素、酸素、硫黄または置換不可能な水素原子の１個以上が同位体標識されている］、
および薬物代謝酵素を含む混合物とともに試験化合物をインキュベートして、生成物混合物を生成し；
（ｂ）段階（ａ）において生成された生成物混合物のニュートラルロス質量スペクトルを測定し；そして
（ｃ）段階（ｂ）のニュートラルロス質量スペクトルにおける同位体二重線の不在を検出する；
ことを含む、薬物候補物を同定する方法。
【請求項３３】
式（Ｉ）の同位体標識化合物は、６個の１３Ｃ原子および２個の１５Ｎ原子により標識されている、請求項３２の方法。
【請求項３４】
式（Ｉ）の同位体標識化合物に対する式（Ｉ）の化合物のモル比は約１：１である、請求項３３の方法。
【請求項３５】
薬物代謝酵素が、ＮＡＤＰＨ補因子と組み合わされたチトクロームＰ４５０酵素またはＮＡＤＰＨ再生系と組み合わされたチトクロームＰ４５０酵素である、請求項３４の方法。
【請求項３６】
ニュートラルロス質量スペクトルがＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳまたはＬＳ／ＭＳを使用して測定される、請求項３５の方法。
【請求項３７】
（ａ）式（Ｉ）の非同位体標識化合物
【化２５】
式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物
【化２６】
および薬物代謝酵素を含む混合物とともに試験化合物をインキュベートして、生成物混合物を生成し；
（ｂ）段階（ａ）において生成された生成物混合物のニュートラルロス質量スペクトルを測定し；そして
（ｃ）段階（ｂ）のニュートラルロス質量スペクトルにおける同位体二重線の不在を検出する；
ことを含む、薬物候補物を同定する方法。
【請求項３８】
式（Ｉ）の同位体標識化合物に対する式（Ｉ）の化合物のモル比は約１：１である、請求項３７の方法。
【請求項３９】
薬物代謝酵素が、ＮＡＤＰＨ補因子と組み合わされたチトクロームＰ４５０酵素またはＮＡＤＰＨ再生系と組み合わされたチトクロームＰ４５０酵素である、請求項３８の方法。
【請求項４０】
ニュートラルロス質量スペクトルがＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳまたはＬＳ／ＭＳを使用して測定される、請求項３９の方法。
【請求項１】
式（Ｉ）の同位体標識化合物
【化１】
［式中、星印の基における炭素、窒素、酸素、硫黄または置換不可能な水素原子の１個以上が同位体標識されている］。
【請求項２】
式（Ｉ）の同位体標識化合物は、１３Ｃ，１５Ｎ，１８Ｏおよび２Ｈからなる群から選ばれる少なくとも１個の同位体により標識されている、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
式（Ｉ）の同位体標識化合物は、１３Ｃおよび１５Ｎからなる群から選ばれる１〜１０個の同位体により標識されている、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
６個の炭素原子が１３Ｃ同位体により同位体標識され、そして２個の窒素原子が１５Ｎ同位体により標識されている、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物
【化２】
【請求項６】
（ａ）式（Ｉ）の化合物
【化３】
および薬物代謝酵素とともに試験化合物をインキュベートして、１種以上の付加物を含む生成物混合物を生成し；そして
（ｂ）段階（ａ）の付加物を検出する；
ことを含む、試験化合物の反応性代謝物を検出する方法。
【請求項７】
（ａ）式（Ｉ）の同位体標識化合物
【化４】
［式中、星印の基における炭素、窒素、酸素、硫黄または置換不可能な水素原子の１個以上が同位体標識されている］および薬物代謝酵素とともに試験化合物をインキュベートして、１種以上の付加物を含む生成物混合物を生成し；そして
（ｂ）段階（ａ）の１種以上の付加物を検出する；
ことを含む、試験化合物の反応性代謝物を検出する方法。
【請求項８】
（ａ）式（Ｉ）の化合物
【化５】
式（Ｉ）の同位体標識化合物
【化６】
［式中、星印の基における炭素、窒素、酸素、硫黄または置換不可能な水素原子の１個以上が同位体標識されている］
および薬物代謝酵素を含む混合物とともに試験化合物をインキュベートして、１種以上の付加物を含む生成物混合物を生成し；
（ｂ）段階（ａ）の１種以上の付加物を検出する；
ことを含む、試験化合物の反応性代謝物を検出する方法。
【請求項９】
（ａ）式（Ｉ）の化合物
【化７】
式（Ｉ）の同位体標識化合物
【化８】
［式中、星印の基における炭素、窒素、酸素、硫黄または置換不可能な水素原子の１個以上が同位体標識されている］
および薬物代謝酵素を含む混合物とともに試験化合物をインキュベートして、１種以上の付加物を含む生成物混合物を生成し；
（ｂ）段階（ａ）において生成された１種以上の付加物のニュートラルロス質量スペクトルにおいて１種以上の同位体二重線を検出し、ここで、二重線は、式（Ｉ）の化合物と式（Ｉ）の同位体標識化合物との間の質量における差異だけ質量において異なる；
ことを含む、試験化合物の反応性代謝物を検出する方法。
【請求項１０】
式（Ｉ）の同位体標識化合物は、１３Ｃ，１５Ｎ，１８Ｏおよび２Ｈからなる群から選ばれる少なくとも１個の同位体により標識されている、請求項９の方法。
【請求項１１】
式（Ｉ）の同位体標識化合物は、１３Ｃおよび１５Ｎからなる群から選ばれる１〜１０個の同位体により標識されている、請求項１０の方法。
【請求項１２】
式（Ｉ）の同位体標識化合物は、６個の１３Ｃ原子および２個の１５Ｎ原子により標識されている、請求項９の方法。
【請求項１３】
式（Ｉ）の同位体標識化合物に対する 式（Ｉ）の化合物のモル比は約１：１である、請求項９の方法。
【請求項１４】
同位体二重線が８質量ユニットの質量だけ異なる、請求項１３の方法。
【請求項１５】
薬物代謝酵素がヒト肝臓ミクロソームである、請求項９の方法。
【請求項１６】
薬物代謝酵素が、ＮＡＤＰＨ補因子と組み合わされたチトクロームＰ４５０酵素またはＮＡＤＰＨ再生系と組み合わされたチトクロームＰ４５０酵素である、請求項９の方法。
【請求項１７】
ニュートラルロス質量スペクトルがＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳまたはＬＳ／ＭＳを使用して測定される、請求項９の方法。
【請求項１８】
式（Ｉ）の同位体標識化合物が、式（Ｉ−ＩＳ）の化合物
【化９】
である、請求項９の方法。
【請求項１９】
式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物に対する式（Ｉ）の化合物のモル比は約１：１である、請求項１８の方法。
【請求項２０】
薬物代謝酵素が、ヒト肝臓ミクロソーム、ＮＡＤＰＨ補因子と組み合わされたチトクロームＰ４５０酵素およびＮＡＤＰＨ再生系と組み合わされたチトクロームＰ４５０酵素からなる群から選ばれる、請求項１９の方法。
【請求項２１】
ニュートラルロス質量スペクトルがＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳまたはＬＳ／ＭＳを使用して測定される、請求項２０の方法。
【請求項２２】
式（Ｉ）の化合物
【化１０】
および式（Ｉ）の同位体標識化合物
【化１１】
［式中、星印の基における炭素、窒素、酸素、硫黄または置換不可能な水素原子の１個以上が同位体標識されている］
を含む混合物。
【請求項２３】
式（Ｉ）の同位体標識化合物に対する式（Ｉ）の化合物のモル比は約１：１である、請求項２２の混合物。
【請求項２４】
式（Ｉ）の同位体標識化合物は、６個の１３Ｃ原子および２個の１５Ｎ原子により標識されている、請求項２３の化合物。
【請求項２５】
（ａ）反応性代謝物および式（Ｉ）の化合物
【化１２】
の共有結合複合体、
および（ｂ）反応性代謝物および式（Ｉ）の同位体標識化合物
【化１３】
［式中、星印の基における炭素、窒素、酸素、硫黄または置換不可能な水素原子の１個以上が同位体標識されている］
の共有結合複合体を含む混合物。
【請求項２６】
式（Ｉ）の同位体標識化合物が、式（Ｉ−ＩＳ）の化合物
【化１４】
である、請求項２５の混合物。
【請求項２７】
反応性代謝物および式（Ｉ）の非同位体標識化合物の共有結合複合体、および反応性代謝物および式（Ｉ）の同位体標識化合物の共有結合複合体のモル比は約１：１である、請求項２５の混合物。
【請求項２８】
（ａ）式（Ｉ）の化合物
【化１５】
式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物
【化１６】
および薬物代謝酵素を含む混合物とともに試験化合物をインキュベートして、１種以上の付加物を含む生成物混合物を生成し；
（ｂ）段階（ａ）において生成された１種以上の付加物のニュートラルロス質量スペクトルを測定し；そして
（ｃ）段階（ｂ）のニュートラルロス質量スペクトルにおける１種以上の同位体二重線を検出し、ここで、同位体二重線は、質量において８Ｄａだけ異なる；
ことを含む、試験化合物の反応性代謝物を検出する方法。
【請求項２９】
段階Ａ：
（ａ）試験化合物；
（ｂ）式（Ｉ）の化合物
【化１７】
（ｃ）式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物
【化１８】
（ここで、式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物に対する式（Ｉ）の化合物のモル比は約１：１である）；および
（ｄ）ヒト肝臓ミクロソーム、ＮＡＤＰＨ補因子と組み合わされたチトクロームＰ４５０酵素およびＮＡＤＰＨ再生系と組み合わされたチトクロームＰ４５０酵素からなる群から選ばれる薬物代謝酵素；
を含む混合物をインキュベートして、
（ａ）非反応性代謝物；
（ｂ）式（Ｉ）の化合物と反応性代謝物との間で形成される付加物；および
（ｃ）式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物と反応性代謝物との間で形成される付加物；
からなる群から選ばれる１種以上のインキュベーション生成物を含む生成物混合物を生成し；
段階Ｂ：段階（Ａ）において生成された生成物混合物のニュートラルロス質量スペクトルを測定し；そして
段階Ｃ：段階（Ｂ）のニュートラルロス質量スペクトルにおける１種以上の同位体二重線を検出し、ここで、同位体二重線は、質量において８Ｄａだけ異なる；
ことを含む、試験化合物の反応性代謝物を検出する方法。
【請求項３０】
（ａ）式（Ｉ）の非同位体標識化合物
【化１９】
式（Ｉ）の同位体標識化合物
【化２０】
［式中、星印の基における炭素、窒素、酸素、硫黄および／または置換不可能な水素原子の１個以上が同位体標識されている］、
および薬物代謝酵素を含む混合物とともに試験化合物をインキュベートして、１種以上の付加物を含む生成物混合物を生成し；
（ｂ）段階（ａ）の１種以上の付加物を分離し；
（ｃ）該分離された付加物のニュートラルロス質量スペクトルを測定し；
（ｄ）該分離付加物のニュートラルロス質量スペクトルにおける１種以上の同位体二重線を検出し、ここで、二重線は、式（Ｉ）の非同位体標識化合物と式（Ｉ）の同位体標識化合物との間の質量における差異だけ質量において異なる；
ことを含む、試験化合物の反応性代謝物を検出する方法。
【請求項３１】
（ａ）式（Ｉ）の非同位体標識化合物
【化２１】
式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物
【化２２】
（ここで、式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物に対する式（Ｉ）の化合物のモル比は約１：１である）；
および薬物代謝酵素を含む混合物とともに試験化合物をインキュベートして、１種以上の付加物を含む生成物混合物を生成し；
（ｂ）段階（ａ）の１種以上の付加物を分離し；
（ｃ）該分離された付加物のニュートラルロス質量スペクトルを測定し；
（ｄ）該分離付加物のニュートラルロス質量スペクトルにおける１種以上の同位体二重線を検出し、ここで、二重線は８Ｄａだけ質量において異なる；
ことを含む、試験化合物の反応性代謝物を検出する方法。
【請求項３２】
（ａ）式（Ｉ）の非同位体標識化合物
【化２３】
式（Ｉ）の同位体標識化合物
【化２４】
［式中、星印の基における炭素、窒素、酸素、硫黄または置換不可能な水素原子の１個以上が同位体標識されている］、
および薬物代謝酵素を含む混合物とともに試験化合物をインキュベートして、生成物混合物を生成し；
（ｂ）段階（ａ）において生成された生成物混合物のニュートラルロス質量スペクトルを測定し；そして
（ｃ）段階（ｂ）のニュートラルロス質量スペクトルにおける同位体二重線の不在を検出する；
ことを含む、薬物候補物を同定する方法。
【請求項３３】
式（Ｉ）の同位体標識化合物は、６個の１３Ｃ原子および２個の１５Ｎ原子により標識されている、請求項３２の方法。
【請求項３４】
式（Ｉ）の同位体標識化合物に対する式（Ｉ）の化合物のモル比は約１：１である、請求項３３の方法。
【請求項３５】
薬物代謝酵素が、ＮＡＤＰＨ補因子と組み合わされたチトクロームＰ４５０酵素またはＮＡＤＰＨ再生系と組み合わされたチトクロームＰ４５０酵素である、請求項３４の方法。
【請求項３６】
ニュートラルロス質量スペクトルがＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳまたはＬＳ／ＭＳを使用して測定される、請求項３５の方法。
【請求項３７】
（ａ）式（Ｉ）の非同位体標識化合物
【化２５】
式（Ｉ−ＩＳ）の同位体標識化合物
【化２６】
および薬物代謝酵素を含む混合物とともに試験化合物をインキュベートして、生成物混合物を生成し；
（ｂ）段階（ａ）において生成された生成物混合物のニュートラルロス質量スペクトルを測定し；そして
（ｃ）段階（ｂ）のニュートラルロス質量スペクトルにおける同位体二重線の不在を検出する；
ことを含む、薬物候補物を同定する方法。
【請求項３８】
式（Ｉ）の同位体標識化合物に対する式（Ｉ）の化合物のモル比は約１：１である、請求項３７の方法。
【請求項３９】
薬物代謝酵素が、ＮＡＤＰＨ補因子と組み合わされたチトクロームＰ４５０酵素またはＮＡＤＰＨ再生系と組み合わされたチトクロームＰ４５０酵素である、請求項３８の方法。
【請求項４０】
ニュートラルロス質量スペクトルがＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳまたはＬＳ／ＭＳを使用して測定される、請求項３９の方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【公表番号】特表２０１０−５０４９９１（Ｐ２０１０−５０４９９１Ａ）
【公表日】平成２２年２月１８日（２０１０．２．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５３０５４２（Ｐ２００９−５３０５４２）
【出願日】平成１９年９月２４日（２００７．９．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０７９２９８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０４２６３４
【国際公開日】平成２０年４月１０日（２００８．４．１０）
【出願人】（３９００３３００８）ジヤンセン・フアーマシユーチカ・ナームローゼ・フエンノートシヤツプ (616)
【氏名又は名称原語表記】ＪＡＮＳＳＥＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡ ＮＡＡＭＬＯＺＥ ＶＥＮＮＯＯＴＳＣＨＡＰ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年２月１８日（２０１０．２．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年９月２４日（２００７．９．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０７９２９８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０４２６３４
【国際公開日】平成２０年４月１０日（２００８．４．１０）
【出願人】（３９００３３００８）ジヤンセン・フアーマシユーチカ・ナームローゼ・フエンノートシヤツプ (616)
【氏名又は名称原語表記】ＪＡＮＳＳＥＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡ ＮＡＡＭＬＯＺＥ ＶＥＮＮＯＯＴＳＣＨＡＰ
【Ｆターム（参考）】
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