吸着したポリペプチド含有分子を有する微粒子
界面活性剤を使用せずに形成された吸着ポリペプチド含有分子を有する微粒子、そのような微粒子組成物を生成する方法、およびその使用が、開示される、この微粒子は、ポリマー（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリシアノアクリレートなど）である。好ましいポリマーは、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）であり、より好ましくは、４０：６０〜６０：４０の範囲にあるラクチド／グリコリドモル比を有しかつ２０，０００ダルトン〜７０，０００ダルトンの範囲にある分子量を有するポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）である。好ましいポリペプチド含有分子は、細菌抗原およびウイルス抗原である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の陳述）
本願は、２００２年２月２０日出願の米国仮特許出願番号６０／３５８，３１５号（発明の名称「吸着したポリペプチド含有分子を有する微粒子」）に対する優先権を請求する。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、一般に、薬学的組成物に関する。特に、本発明は、界面活性剤を使用せずに形成される吸着したポリペプチド含有分子を有する生分解性微粒子に関し、そのような微粒子を調製するための方法に関し、そしてそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
粒子状キャリアは、十分な免疫応答を惹起する試みにおいて、吸着した抗原または捕捉した抗原とともに使用されている。そのようなキャリアは、複数のコピーの選択抗原を免疫系に提示し、局所リンパ節における抗原の捕捉および保持を促進する。これらの粒子は、マクロファージにより食菌され得、そしてサイトカイン放出を介して抗原提示を増強し得る。
【０００４】
例えば、共有に係る国際特許出願ＷＯ９８／３３４８７（ＰＣＴ／ＵＳ９８／０１７３８）および同時係属中の米国特許出願番号０９／０１５，６５２号（１９９８年１月２９日出願）は、免疫応答（細胞媒介性免疫応答を含む）を刺激するための抗原吸着微粒子および抗原カプセル化微粒子の使用、ならびにそれらの微粒子の生成方法を記載する。それらの微粒子を形成するために使用されるポリマーとしては、ポリ（ラクチド）およびポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（本明細書中で「ＰＬＧ」とも呼ばれる）が挙げられる。
【０００５】
共有に係る国際特許出願ＷＯ００／０６１２３（ＰＣＴ／ＵＳ９９／１７３０８）および同時係属中の米国特許出願番号０９／７１５，９０２号は、吸着した微粒子（ポリヌクレオチドおよびポリペプチド抗原を含む）を有する微粒子の生成方法を開示する。その微粒子は、例えば、ポリマー（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）（例えば、ＰＬＧ、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物など））を包含し、例えば、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、または非イオン性界面活性剤を使用して形成される。アニオン性界面活性剤を含む微粒子（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含むＰＬＧ微粒子）が、正荷電高分子（例えば、ポリペプチド）の使用のために提唱される。カチオン性界面活性剤を含む微粒子（例えば、ＣＴＡＢ（セトリミドまたはセチルトリメチルアンモニウムブロミドとしても公知）を含むＰＬＧ微粒子）が、負荷電高分子（例えば、ＤＮＡ）の使用のために提唱される。免疫応答（細胞媒介性免疫応答を含む）を刺激するためのそのような微粒子の使用もまた、開示される。
【０００６】
しかし、上記の参考文献の各々において、高分子吸着微粒子の調製の間に、１種以上の界面活性剤が使用される。不幸なことに、界面活性剤の使用は、数ある結果のうちでも製品登録の間にさらなる規制精査をもたらす、毒物学的問題を引き起こし得る。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明者らは、吸着したポリペプチド含有分子を有する微粒子が、界面活性剤の非存在下で形成され得ることを、思いもかけずに見出した。
【０００８】
例えば、本発明の第１局面によると、（ａ）ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物、およびポリシアノアクリレートからなる群より選択されるポリマーを含む、微粒子と、（ｂ）その微粒子に吸着したポリペプチド含有分子とを含む、生理活性微粒子組成物が提供される。この微粒子組成物は、アニオン性界面活性剤の非存在下で形成され、好ましくは、すべての界面活性剤（アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、および両性界面活性剤を含む）の非存在下で形成される。
【０００９】
好ましいポリマーは、ポリ（α−ヒドロキシ酸）であり、より好ましくは、ポリ（Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）、およびポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリドからなる群より選択されるポリ（α−ヒドロキシ酸）である。より好ましいのは、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）ポリマーである。好ましいポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）ポリマーは、２５：７５〜７５：２５（より好ましくは、４０：６０〜６０：４０）の範囲にあるラクチド／グリコリドモル比を有し、かつ１０，０００ダルトン〜１００，０００ダルトン（より好ましくは、３０，０００ダルトン〜７０，０００ダルトン）の範囲にある分子量を有する、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）ポリマーである。
【００１０】
好ましい生理活性ポリペプチド含有分子としては、細菌抗原およびウイルス抗原が挙げられる。ＨＩＶ抗原（例えば、ｇｐ４１抗原、ｇｐ１２０抗原、ｇｐ１４０抗原、ｐ２４ｇａｇ抗原、およびｐ５５ｇａｇ抗原）、髄膜炎Ｂ群抗原（例えば、髄膜炎Ｂ群抗原組換えタンパク質２８７抗原）、鎖球菌抗原（例えば、Ｂ群連鎖球菌抗原）、およびインフルエンザＡ型赤血球凝集素抗原が、特に好ましい。
【００１１】
いくつかの実施形態において、さらなる生理活性高分子を備えた微粒子組成物が、提供され、そのさらなる生理活性高分子は、この微粒子に結合されていても結合されていなくてもよく、かつポリマー内に捕捉さえされてもよい。例えば、この微粒子組成物は、アジュバント（特に、Ｔｈ１刺激アジュバント）を備えて提供され得る。好ましいアジュバントとしては、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ＬＴＫ６３、ＬＴＲ７２、ＭＰＬ、アミノアルキルグルコサミニドアミノアルキルグルコサミド４−リン酸（ＡＧＰ）、イミダゾキノリンアジュバント、リポ多糖模倣アジュバント、ＱＳ２１、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）およびアルミニウム塩（リン酸アルミニウムを含む）が挙げられる。
【００１２】
本発明の別の局面によると、薬学的に受容可能な賦形剤が、上記の微粒子組成物に添加される。
【００１３】
本発明の別の局面は、脊椎動物被検体にポリペプチド含有分子を送達する方法に関し、この方法は、上記微粒子組成物を、その脊椎動物被検体に投与する工程を包含する。
【００１４】
本発明の他の局面において、上記微粒子組成物は、疾患の診断において、疾患の処置において、ワクチンにおいて、そして／または免疫応答の惹起において、使用される。
【００１５】
例えば、さらなる局面において、本発明は、脊椎動物被検体において細胞性免疫応答および／または体液性免疫応答を惹起するための方法に関し、この方法は、治療有効量の上記微粒子組成物を脊椎動物被検体に投与する工程を包含する。
【００１６】
本発明の別の局面は、免疫方法に関し、この方法は、治療有効量の上記微粒子組成物を脊椎動物被検体に投与する工程を包含する。
【００１７】
本発明のなお他の局面は、微粒子の生成方法に関する。一般に、これらの方法は、（ａ）（ｉ）ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクタム、ポリオルトエステル、ポリ無水物、およびポリシアノアクリレートからなる群より選択されるポリマーと、（ｉｉ）有機溶媒と、（ｉｉｉ）水とを含むエマルジョンを形成する工程；ならびにその後、（ｂ）上記有機溶媒の除去を包含する。この方法は、アニオン性界面活性剤を含まない組成物を使用して実行され、好ましくは、すべての界面活性剤（アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、および両性界面活性剤を含む）を含まない。
【００１８】
好ましくは、このエマルジョンは、水中油中水エマルジョンであり、この水中油中水エマルジョンは、（ａ）ポリマーと有機溶媒とを含む有機相を、水を含む第１水相を用いて乳化して、油中水エマルジョンを形成する工程；ならびに（ｂ）水を含む第２水相を、上記工程（ａ）において形成されたエマルジョンを用いて乳化して、水中油中水エマルジョンを形成する工程、を包含するプロセスによって形成される。一般に、これらの微粒子組成物は、その後、生理活性ポリペプチド含有分子（例えば、上記に考察される生理活性ポリペプチド含有分子）と混合されて、生理活性組成物を生成する。
【００１９】
上記のような二重乳化技術が好ましいが、一重乳化技術もまた、本発明の微粒子組成物を形成するために使用され得る。
【００２０】
本発明のなお他の局面は、微粒子組成物を生成する方法に関し、この方法は、（１）乳化プロセスにおいて微粒子を形成する工程であって、この微粒子は、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクタム、ポリオルトエステル、ポリ無水物、およびポリシアノアクリレートからなる群より選択されるポリマーを含む、工程；ならびに（２）生理活性ポリペプチド含有分子をその微粒子表面上に吸着させる工程、を包含する。この方法は、アニオン性界面活性剤を含まない組成物を使用して実行され、好ましくは、すべての界面活性剤（アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、および両性界面活性剤を含む）を含まない。
【００２１】
本発明の利点は、ヒト投与のための微粒子組成物（特に、吸着したポリペプチド含有分子を含む、ヒト投与のための微粒子組成物）が、界面活性剤を使用することなく形成され得ることである。界面活性剤がないことは、有益である。それは、とりわけ、界面活性剤の添加が毒性の問題を惹起し、この問題は、本発明の微粒子組成物により克服されるからである。
【００２２】
本発明のこれらおよび他の実施形態、局面、および利点は、本明細書中の開示を考慮して、当業者に心に容易に浮かぶ。
【００２３】
（発明の詳細な説明）
本発明の粒子は、他に記載されない場合、当該分野の技術内で、化学、重合科学、生化学、分子生物学、免疫学および薬学の従来の方法を使用する。このような技術は、文献内で十分に説明されている。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．Ｋａｐｌａｎ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編，１９８６，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版，１９８９）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｄ Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｂｉｒｄｉ，Ｋ．Ｓ．編，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９７）およびＳｅｙｍｏｕｒ／Ｃａｒｒａｈｅｆ’ｓ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第４版，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ．，１９９６）を参照のこと。
【００２４】
本明細書中（上述または下述のいずれか）に引用される、全ての出版物、特許および特許出願は、それらの全体が、参考として本明細書により援用される。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容が他に明確に記載しない限り、複数の参照を含む。従って、例えば、用語「微粒子」とは、１つ以上の微粒子を言うなど。
【００２６】
（Ａ．定義）
本発明の記載において、以下の用語が利用され、そして以下に指示されるように定義されることが意図される。
【００２７】
他に記載されない限り、本明細書中の全てのパーセントおよび割合は、重量基準で示される。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、用語「微粒子」とは、約１０ｎｍ〜約１５０μｍの直径、より好ましくは、約２００ｎｍ〜約３０μｍの直径、そして最も好ましくは、約５００ｎｍ〜約１０μｍの直径の粒子を言う。好ましくは、微粒子は、針およびキャピラリーを塞ぐことなく、非経口投与または粘膜投与を可能にする直径である。微粒子のサイズは、当該技術で周知の技術（例えば、光子相関分光法、レーザー回折法および／または走査型電子顕微鏡）によって、容易に決定される。用語「粒子」はまた、本明細書中で規定されるような微粒子を示すために使用され得る。
【００２９】
本明細書中での使用のためのポリマー微粒子としては、滅菌可能、非毒性、および生分解性である材料から形成される。このような材料としては、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ＰＡＣＡ、およびポリシアノアクリレートが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、本発明とともに使用するための微粒子としては、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、特にポリ（ラクチド）（「ＰＬＡ」）またはＤ，Ｌ−ラクチドおよびグリコリドのコポリマーまたはグリコール酸（例えば、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（「ＰＬＧ」）、またはＤ，Ｌ−ラクチドおよびカプロラクトンのコポリマーから誘導されるポリマー微粒子である。ポリマー微粒子は、種々の分子量および、コポリマー（例えば、ＰＬＧ）の場合、種々のラクチド：グリコリドの比を有する任意の種々のポリマー出発材料に由来し得、これらの選択は、大部分は、同時投与されるポリペプチド含有分子に一部依存する、選択の問題である。これらのパラメータは、以下により十分に考察される。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、用語「界面活性剤」としては、洗浄剤、分散剤、懸濁剤、および乳化安定剤が挙げられる。微粒子処方物における使用のために、過去に提唱されたアニオン性界面活性剤としては、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、ＳＬＳ（ラウリル硫酸ナトリウム）、ＤＳＳ（ジスルホスクシナート）、硫酸化脂肪アルコールなどが挙げられるが、これらに限定されない。提唱されるカチオン性界面活性剤は、セトリミド（セチルトリメチル臭化アンモニウム、すなわち「ＣＴＡＢ」）、塩化ベンザルコニウム、ＤＤＡ（ジメチルジオクトデシル臭化アンモニウム）、ＤＯＴＡＰ（ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン）などが挙げられるが、これらに限定されない。提唱される非イオン性表面活性剤としては、ＰＶＡ、ポビドン（ポリビニルピロリドンすなわちＰＶＰとしてもまた知られる）、ソルビタンエステル、ポリソルビタン、ポリオキシエチル化グリコールモノエーテル、ポリオキシエチル化アルキルフェノール、ポリオキサマーなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、組成物が、わずかな量の界面活性剤のみ、または不純物量の界面活性剤のみを含む場合、組成物は「界面活性剤が無い」または組成物内に「界面活性剤の非存在」である。本明細書中で使用される場合、界面活性剤の「わずかな」量とは、組成物が、０．００００１：１未満の界面活性剤：ポリマー比（重量：重量）を含有することを意味する。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、用語「高分子」とは、医薬品、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ポリペプチド含有分子、ホルモン、酵素、転写メディエータまたは翻訳メディエータ、代謝経路における中間体、免疫調節薬、抗原、アジュバント、またはそれらの組み合わせを言うが、これらに限定されない。
【００３３】
用語「医薬品」とは、以下により詳細に考察される、生物学的に活性な化合物（例えば、抗生物質、抗ウイルス剤、増殖因子、ホルモンなど）を言う。
【００３４】
用語「アジュバント」とは、医薬品の活性を補助または改変する任意の物質を言い、免疫学的アジュバント（抗原に対する免疫応答を増加または多様化する）が挙げられるが、これに限定されない。
【００３５】
「ポリヌクレオチド」は、核酸ポリマーであり、この核酸ポリマーは、代表的に、生物学的に活性な（例えば、免疫原性または治療的）タンパク質またはポリペプチドをコードする。ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの性質に依存して、ポリヌクレオチドは、少なくとも１０ヌクレオチド（例えば、ここで、ポリヌクレオチドは、抗原をコードする）を含み得る。さらに、「ポリヌクレオチド」は、２本鎖配列と１本鎖配列の両方を含み得、そしてウイルス、原核生物のｍＲＮＡまたは真核生物に由来するｃＤＮＡ、ウイルス（例えば、ＲＮＡウイルスおよびＤＮＡウイルスならびにレトロウイルス）または原核生物ＤＮＡ由来のゲノムＲＮＡ配列およびゲノムＤＮＡ配列、および特に合成ＤＮＡ配列が挙げられるが、これらに限定されない。この用語はまた、任意のＤＮＡおよびＲＮＡの公知の塩基アナログを含む配列を表現する。この用語はさらに、天然配列に対して、好ましくは核酸分子が治療タンパク質または抗原性タンパク質をコードするような、改変（例えば、欠失、付加および置換（一般的に天然で保存的））を含む。これらの改変は、部位特異的突然変異誘発を介するように検討され得るか、または偶発的（例えば、抗原を生成する宿主の変異を介して）であり得る。
【００３６】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」とは、アミノ酸残基のポリマーを言い、そして産物の最小の長さに限定されない。従って、ペプチド、オリゴペプチド、ダイマー、マルチマーなどは、定義内に含まれる。全長タンパク質およびそのフラグメントの両方は、定義により含まれる。この用語はまた、ネイティブ配列に対して、好ましくはタンパク質が、免疫応答を誘発する能力を維持するか、またはこのタンパク質が投与される被験体において治療的効果を有するような、改変（例えば、欠失、付加および置換（一般的に天然で保存的））を含む。
「抗原」は、抗原が本発明に従って提示される場合の細胞性抗原特異的免疫応答、または体液性抗体応答を成すための宿主の免疫システムを刺激し得る、１つ以上のエピトープを含む分子を意味する。抗原は、それ自身によってか、または別の分子と組み合わせて存在する場合、細胞性応答または体液性応答を誘発し得る。正常に、エピトープは、約３〜１５アミノ酸、一般的には約５〜１５アミノ酸の間を含む。所定のタンパク質のエピトープは、当該分野で周知である、任意の数のエピトープマッピング技術を用いて同定され得る。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６（Ｇｌｅｎｎ Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ編，１９９６）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙを参照のこと。例えば、線状エピトープは、例えば、固体支持体上の多くのペプチド、そのタンパク質分子の部分に対応するペプチドを同時合成し、そしてペプチドが支持体になお接着されている間、ペプチドを抗体と反応させることにより、決定され得る。このような技術は、当該分野で公知であり、そして例えば、米国特許第４，７０８，８７１号；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３９９８−４００２；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８６）Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：７０９−７１５（全てそれらの全体が、参考として本明細書中に援用される）において記載される。同様に、コンフォメーショナルエピトープは、例えば、Ｘ線結晶学および２次元核磁気共鳴を用いて、アミノ酸の特異的なコンフォメーションを決定することによって、容易に同定され得る。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（上述）を参照のこと。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、用語「抗原」は、両方のサブユニット抗原（すなわち、抗原が天然で結合される全生物体、ならびに殺傷した、弱毒化した、また非活性化した細菌、ウイルス、寄生虫または他の微生物から分離された抗原）を示す。抗体（例えば、抗イディオタイプ抗体、またはそれらのフラグメント）および合成ペプチドミモトープ（抗原または抗原決定基を模倣し得る）はまた、本明細書中で使用される場合、抗原の定義において、表現され得る。同様に、治療タンパク質または免疫原タンパク質を発現するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、あるいはインビボ（例えば、遺伝子治療および核酸免疫化適用）の抗原決定基はまた、本明細書中で、抗原の定義中に含まれる。
【００３８】
さらに、本発明の目的のために、抗原は、任意の種々の公知のウイルス、細菌、寄生虫および真菌、ならびに任意の種々の腫瘍抗原に由来し得る。さらに、本発明の目的のために、「抗原」とは、そのタンパク質が免疫学的応答を誘発する能力を維持する限り、天然配列に対する改変（例えば、欠失、付加および置換（一般的に天然で保存的））を含むタンパク質をいう。これらの改変は、部位特異的突然変異誘発を介するとして検討され得るか、または偶発的（例えば、抗原を生成する宿主の変異を介して）であり得る。
【００３９】
抗原または組成物に対する「免疫学的応答」は、目的の組成物中に存在する分子に対する体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答の、被験体における発生である。本発明の目的のために、「体液性免疫応答」とは、抗体分子により媒介される免疫応答を言い、一方「細胞性免疫応答」とは、Ｔ−リンパ球および／または他の白血球細胞により媒介される免疫応答である。細胞性免疫の１つの重要な局面は、細胞溶解性Ｔ細胞（「ＣＴＬ」）による、抗原特異的な応答を含む。ＣＴＬは、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）によりコードされ、そして細胞の表面上で発現される、タンパク質と関連して提示されるペプチド抗原に対して特異性を有する。ＣＴＬは、細胞内微生物の細胞内破壊、またはこのような微生物に感染した細胞の溶解を助け、誘導し、そして促進する。細胞性免疫の別の局面は、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的応答を含む。ヘルパーＴ細胞は、この機能を刺激することを補助するように作用し、そしてそれらの表面上のＭＨＣ分子と結合して、ペプチド抗原を示す細胞に対して、非特異的エフェクター細胞の活性を集中する。「細胞性免疫応答」はまた、サイトカイン、ケモカインならびに、活性化Ｔ細胞および／または他のこのような白血球（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に由来する白血球を含む）により生成される他の分子の産生を言う。
【００４０】
細胞性免疫応答を誘発する、組成物（例えば、免疫原性組成物）またはワクチンは、細胞表面でＭＨＣ分子結合する抗原の提示により、脊椎動物被験体を感作するようにはたらき得る。細胞性媒介免疫応答は、それらの表面で、抗原を提示する細胞に、またはその近くに指向される。さらに、抗原特異的Ｔリンパ球が、生成され、免疫化宿主の将来の保護を可能にし得る。
【００４１】
細胞性媒介免疫学的応答を刺激するような、特定の抗原または組成物の能力は、感作された被験体中の抗原に特異的なＴリンパ球をアッセイするか、または、抗原での再刺激に応じたＴ細胞によるサイトカイン産生の測定による、多くのアッセイ（例えば、リンパ球増殖（リンパ球活性化）アッセイ、ＣＴＬ細胞傷害性細胞アッセイ）によって決定され得る。このようなアッセイは、当該分野で周知である。例えば、Ｅｒｉｃｋｓｏｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）１５１：４１８９−４１９９；Ｄｏｅら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４：２３６９−２３７６を参照のこと。
【００４２】
従って、本明細書で使用されるように、免疫応答は、ＣＴＬの産生、および／またはヘルパーＴ細胞の産生もしくは活性化を刺激するものであり得る。目的の抗原もまた、抗体媒介性の免疫応答を誘発し得る。従って、免疫応答は、１つ以上の以下の効果を含み得る：Ｂ細胞による抗体の産生；ならびに／あるいは抑制Ｔ細胞および／または目的の組成物またはワクチン中に存在する抗原（１つまたは複数）に特異的に指向されるγδ Ｔ細胞の活性化。これらの応答は、感染性を中和し、そして／あるいは抗体−補体、または抗体依存性の細胞毒性（ＡＤＣＣ）を媒介し、免疫化された宿主に対する保護を提供する役割を果たし得る。このような応答は、当該分野で周知の標準的な免疫学的検定および中和アッセイを用いて決定され得る。
【００４３】
微粒子に吸着した選択された抗原を含む組成物は、微粒子と共に送達されない場合の当量の抗原によって誘発される免疫応答よりも、より大きな免疫応答を誘発する能力を有する場合、「高められた免疫原性」を示す。従って、組成物は、微粒子への吸着の効力によってより強く免疫原性であるか、またはより低い用量の抗原が、投与された被検体における免疫応答を達成するのに必要とされるので、「高められた免疫原性」を示し得る。このような高められた免疫原性は、動物に対する微粒子／抗原組成物および抗原コントロールを投与し、そして、例えば、当該分野で周知の標準アッセイ（例えば、放射免疫測定およびＥＬＩＳＡ）を用いて、これらの２つに対する抗体力価を比較することによって、決定され得る。
【００４４】
本明細書で提供される組成物の「有効量」、「治療的有効量」または「薬学的有効量」との用語は、目的の状態を処置または診断するのに十分な組成物の量をいう。例えば、これらの発現は、所望の応答（例えば、免疫応答）および対応する予防効果または治療効果を提供するのに十分な量、あるいは治療タンパク質の送達の場合、以下に既定されるように、被検体の処置に影響を与えるのに十分な量をいい得る。以下に指摘されるように、必要とされる正確な量は、被検体の種、年齢、および全身状態、ならびに処置される状態の重篤度、目的の特定のポリペプチド、投与の様式などによって、被検体ごとに変動する。任意の個体の場合における適切な「有効」量は、当業者によって、日常的な実験を用いて決定され得る。
【００４５】
「脊椎動物被験体」とは、亜門網（ｓｕｂｐｈｙｌｕｍ ｃｏｒｄａｔａ）の任意のメンバーを意味し、これらのメンバーとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：哺乳動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウマ、およびヒト）；家畜（例えば、イヌおよびネコ）；ならびに飼い馴らされた鳥、野鳥および狩猟鳥含むトリ（例えば、ヒヨコを含む雄鶏および雌鶏、七面鳥ならびに他の家禽のトリ）。この用語は、特定の年齢を意味しない。従って、成熟動物および新生仔動物が対象とされることを意図する。
【００４６】
「薬学的に受容可能」または「薬理学的に受容可能」とは、生物学的でないかさもなければ所望でない物質を意味する。例えば、「薬学的に受容可能な」物質は、個体において任意の所望でない生物学的影響引き起こすことも、組成物中に含まれる任意の成分と有害な相互作用を起こすこともなく、微粒子処方物と共に個体に投与され得る。
【００４７】
「賦形剤」との用語は、完成された投薬形態で一般に提供される物質をいい、ビヒクル、結合剤、崩壊剤、充填剤（希釈剤）、潤滑剤（ｌｕｂｒｉｃａｎｔ）、潤滑剤（ｇｌｉｄａｎｔ）（流動促進剤）、圧縮補助剤、色素、甘味料、保存料、懸濁／分散剤、フィルム形成剤／コーティング剤、香料および印刷用インクが挙げられる。
【００４８】
「生理的ｐＨ」または「生理的範囲のｐＨ」とは、約７．２〜８．０を含む範囲のｐＨを意味し、より代表的には、約７．２〜７．６を含む範囲のｐＨを意味する。
【００４９】
本明細書中で使用される場合、「処置」（そのバリエーション、例えば、「処置する」または「処置した」を含む）とは、（ｉ）従来のワクチンにおいて見られるような、感染または再感染の予防、（ｉｉ）症状の低減または排除、および（ｉｉｉ）問題の病原体または障害の実質的な排除または完全な排除、のいずれかをいう。処置は、予防的に（感染前に）または治療的に（感染後に）影響を及ぼし得る。
【００５０】
本明細書中で使用される場合、「核酸」との句は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらから形成されるキメラをいう。
【００５１】
本明細書中で使用される場合、句「少なくとも１つのＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド」とは、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを含むポリヌクレオチドをいう。少なくとも１つのＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドは、複数のＣｐＧモチーフを含み得る。これらのオリゴヌクレオチドはまた、当該分野で「ＣｐＧオリゴヌクレオチド」としても公知である。本明細書中で使用される場合、「ＣｐＧモチーフ」との句は、グアニンヌクレオチドが後に続くシトシンヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドのジヌクレオチド部分をいう。５−メチルシトシンもまた、シトシンの代わりに使用され得る。
【００５２】
本発明のいくつかの実施形態に従って、ウイルス感染、真菌感染、マイコプラズマ感染、細菌感染、または原生動物感染、ならびに腫瘍に対して宿主動物を処置する（予防的におよび／または治療的に免疫することを含む）組成物および方法が提供される。本発明の方法は、哺乳動物、好ましくはヒトに、予防的および／または治療的に免疫を与えるのに有用である。本発明の方法はまた、ヒト以外の哺乳動物（生物医学的研究用途を含む）に対しても行われ得る。
【００５３】
（Ｂ．一般的な方法）
驚くべきことに、本発明者らは、微粒子が形成され得、そして、この微粒子へのポリペプチド含有分子の良好な吸着が、界面活性剤を用いることなく達成され得ることを見出した。結果として、広範種々の疾患の予防的または治療的な処置および／または診断のために、本発明の微粒子／ポリペプチド含有分子組成物を送達システムとして用いて、生物学的に活性なポリペプチド含有分子を被験体に送達し得る。理論に束縛されることは望まないが、本発明と組み合わせて使用されるポリマー物質（例えば、ＰＬＧ）は、代表的に、負に荷電した基を有し、この基が本発明の微粒子に正味の負の電荷を与えると考えられる。この純粋な負の電荷が、微粒子内の反発をもたらし、微粒子の形成時に、微粒子を安定化させる。さらに、この電荷はまた、ポリペプチド含有分子の正に荷電した領域を引き付け、ポリペプチド含有分子の微粒子への吸着を改善する。
【００５４】
本願内の多くの例示的な実施形態は、吸着されたポリペプチド含有分子を有する微粒子を含有する組成物に関する。
【００５５】
本発明は、広範種々の高分子の送達と組み合わせて使用され得、これらの高分子としては、医薬品（例えば、抗生物質および抗ウイルス剤、非ステロイド性抗炎症薬、鎮痛剤、血管拡張剤、心血管薬、向神経薬、神経遮断薬、抗うつ剤、抗パーキンソン薬、βブロッカー、カルシウムチャネルブロッカー、ブラジキニンインヒビター、ＡＣＥインヒビター、血管拡張剤、プロラクチンインヒビター、ステロイド、ホルモンアンタゴニスト、抗ヒスタミン剤、セロトニンアンタゴニスト、ヘパリン、化学治療剤、抗血管新生剤および増殖因子（ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２が挙げられるがこれらに限定されない）、ＦＧＦ、治療的タンパク質または免疫原性タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ワクチンにおける使用のための免疫原性タンパク質およびそのエピトープ、ホルモン（ペプチドホルモン（例えば、インスリン、プロインスリン）、成長ホルモン（例えば、ＨＲＨ、ＬＨＲＨ、ＥＧＦ、ソマトスタチン、ＳＮＸ−１１１、ＢＮＰ）、インスリン分泌トロピン（ＡＮＰ、ＦＳＨ、ＬＨ、ＰＳＨおよびｈＣＧ）、性腺刺激ホルモン（アンドロゲン、エストロゲンおよびプロゲステロン）、甲状腺刺激ホルモン（インヒビン、コレシストキニン、ＡＣＴＨ、ＣＲＦ、ダイノルフィン、エンドルフィン、エンドセリン、フィブロネクチンフラグメント、ガラニン、ガストリン、インスリン分泌トロピン、グルカゴン、ＧＴＰ結合タンパク質フラグメント、グアニリン、ロイコキニン、マガイニン（ｍａｇａｉｎｉｎ）、マストパラン、デルマセプチン（ｄｅｒｍａｓｅｐｔｉｎ）、システミン、ニューロメディン、ニューロテンシン、膵臓スタチン、膵臓ポリペプチド、サブスタンスＰ、セレクチン、サイモシンなど）、酵素、転写媒介物質または翻訳媒介物質、代謝経路における中間体、免疫調節因子（例えば、種々の任意のサイトカイン（インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、およびγ−インターフェロンを含む）、抗原およびアジュバントが挙げられる））。
【００５６】
本発明は、被験体へのポリペプチド含有分子の送達に、特によく適する。いくつかの特定の好ましい実施形態において、このポリペプチド含有分子は、ポリペプチド抗原分子である。吸着されたポリペプチド抗原分子を有する微粒子の１つの利点は、それらの示される、脊椎動物の被験体において細胞媒介性の免疫応答を生じる能力である。従って、従来の抗体応答に加え、本明細書中に記載されるシステムが、例えば、発現される抗原とＭＨＣクラスＩ分子との会合を提供し得、その結果、ＣＴＬの産生を刺激して、抗原の将来の認識を可能にする、目的の抗原へのインビボ細胞性免疫応答が増加され得る。さらに、この方法は、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的な応答を誘発し得る。従って、本発明の方法は、細胞性および／または体液性免疫応答が所望される任意のポリペプチド含有分子（好ましくは、抗体、ヘルパーＴ細胞エピトープおよび細胞障害性Ｔ細胞エピトープを誘導し得る、ウイルス病原体および細菌病原体由来の抗原）による使用を見出す。このような抗原としては、ヒトおよび動物のウイルスによりコードされるものが挙げられるがこれらに限定されず、そして、構造的タンパク質または非構造的タンパク質のいずれかに対応し得る。
【００５７】
従って、本発明の抗原／微粒子の、選択された抗原に対する細胞媒介性の免疫応答を誘発する能力は、広範種々の病原体による感染に対する強力なツールを提供する。従って、本発明の抗原／微粒子組成物は、ワクチン組成物に組み込まれ得る。
【００５８】
本発明の微粒子は、通常、乏しい免疫応答を誘発する細胞内ウイルスに対する免疫に、特に有用である。例えば、本発明は、疱疹ウイルスファミリー由来の広範な種々のポリペプチドに対する免疫応答を刺激する使用を見出し、これらのポリペプチドとしては、以下が挙げられる：単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）１型および２型（例えば、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２）由来のタンパク質、糖タンパク質ｇＢ、ｇＤおよびｇＨ；水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（ＣＭＶ ｇＢおよびＣＭＶ ｇＨを含む）由来の抗原；ならびに他のヒト疱疹ウイルス（例えば、ＨＨＶ６およびＨＨＶ７）由来の抗原。（例えば、サイトメガロウイルスの内容をコードするタンパク質の総説については、Ｃｈｅｅら、Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ（Ｊ．Ｋ．ＭｃＤｏｕｇａｌｌ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ １９９０）ｐｐ．１２５−１６９；種々のＨＳＶ−１コードタンパク質の考察については、ＭｃＧｅｏｃｈら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）６９：１５３１−１５７４；ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２ ｇＢおよびＨＳＶ−２ ｇＤのタンパク質ならびにそれらをコードする遺伝子の考察については、米国特許５，１７１，５６８号；ＥＢＶゲノムにおけるタンパク質コード配列の同定については、Ｂａｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）３１０：２０７−２１１；ならびに、ＶＺＶの総説については、ＤａｖｉｓｏｎおよびＳｃｏｔｔ、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）６７：１７５９−１８１６を参照のこと）。
【００５９】
肝炎ウイルスファミリー（Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、δ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）およびＧ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）を含む）由来の抗原はまた、本明細書中に記載される技術において簡便に使用され得る。例として、配列を得るための方法として、ＨＣＶのウイルスゲノム配列が公知である。例えば、国際公開番号ＷＯ ８９／０４６６９；ＷＯ ９０／１１０８９；およびＷＯ ９０／１４４３６を参照のこと。ＨＣＶゲノムは、いくつかのウイルスタンパク質（Ｅ１（Ｅとしても公知）およびＥ２（Ｅ２／ＮＳＩとしても公知）ならびにＮ−末端ヌクレオカプシドタンパク質（「コア」と称される）が挙げられる）をコードする。（ＨＣＶタンパク質（Ｅ１およびＥ２を含む）の考察については、Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（１９９１）１４：３８１−３８８を参照のこと）。これらのタンパク質の各々ならびにその抗原性フラグメントは、本発明の組成物および方法において使用を見出す。
【００６０】
同様に、ＨＤＶ由来のδ抗原の配列は既知であり（例えば、米国特許第号５，３７８，８１４を参照のこと）、そしてこの抗原はまた、本発明の組成物および方法において簡便に使用され得る。さらに、ＨＢＶ由来の抗原（例えば、コア抗原、表面抗原、ｓＡｇ）、ならびに前表面（ｐｒｅｓｕｒｆａｃｅ）配列（ｐｒｅ−Ｓ１およびｐｒｅ−Ｓ２（以前にｐｒｅ−Ｓと呼ばれる））、ならびに上記の組み合せ（例えば、ｓＡｇ／ｐｒｅ−Ｓ１、ｓＡｇ／ｐｒｅ−Ｓ２、ｓＡｇ／ｐｒｅ−Ｓｌ／ｐｒｅ−Ｓ２およびｐｒｅ−Ｓｌ／ｐｒｅ−Ｓ２）は、本明細書中における使用を見出す。例えば、ＨＢＶ構造の考察については「ＨＢＶ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｔｏ ｌｉｃｅｎｓｅ：ａ ｃａｓｅ ｓｔｕｄｙ」、Ｍａｃｋｅｔｔ，Ｍ．およびＷｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．、Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ，ｐｐ．１５９−１７６；ならびに米国特許第４，７２２，８４０号、同第５，０９８，７０４号、同第５，３２４，５１３号（その全体が本明細書中に参考として援用される）；Ｂｅａｍｅｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９５）６９：６８３３−６８３８、Ｂｉｒｎｂａｕｍら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．（１９９０）６４：３３１９−３３３０；ならびにＺｈｏｕら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９１）６５：５４５７−５４６４を参照のこと。
【００６１】
他のウイルス由来の抗原もまた、本発明の組成物および方法において使用を見出す：例えば、限定されないが、とりわけ、以下のファミリーのメンバー由来のタンパク質である：Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ポリオウイルスなど）；Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ；Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、風疹ウイルス、デング熱ウイルスなど）；Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ；Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ；Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ；Ｒｈａｂｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、狂犬病ウイルスなど）；Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、ＲＳウイルスなど）；Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、インフルエンザウイルスＡ型、Ｂ型およびＣ型など）；Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ；Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ；Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｄａｅ（例えば、ＨＴＬＶ−Ｉ；ＨＴＬＶ−ＩＩ；ＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶ、ＡＲＶ、ｈＴＬＲなどとしてもまた公知））（これらとしては以下が挙げられるがこれらに限定されない：単離体ＨＩＶＩＩＩｂ、ＨＩＶＳＦ２、ＨＩＶＬＡＶ、ＨＩＶＬＡＩ、ＨｌＶＭＮ由来の抗原）；ＨＩＶ−ＩＣＭ２３５、ＨＩＶ−１ＵＳ４；ＨＩＶ−２；サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ））。さらに、抗原はまた、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）およびダニ媒介性脳炎ウイルス由来であり得る。例えば、これらのウイルスおよび他のウイルスの説明について、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第３版（Ｗ．Ｋ．Ｊｏｋｌｉｋ編、１９８８）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２版（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編、１９９１）を参照のこと。
【００６２】
より具体的には、上記のＨＩＶ単離体（ＨＩＶの種々の遺伝的サブタイプのメンバーを含む）のいずれか由来のｇｐ１２０エンベロープタンパク質またはｇｐ１４０エンベロープタンパク質は公知であり、かつ報告されており（種々のＨＩＶ単離体のエンベロープ配列の比較については、例えば、Ｍｙｅｒｓら、Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ，Ｎｅｗ Ｍｅｘｉｃｏ（１９９２）；Ｍｙｅｒｓら、Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ａｎｄ Ａｉｄｓ，１９９０，Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ，Ｎｅｗ Ｍｅｘｉｃｏ：Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；およびＭｏｄｒｏｗら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．（１９８７）６１：５７０−５７８を参照のこと）、そして、これらの単離体のいずれか由来の抗原が、本発明の方法における使用を見出す。さらに、本発明は、種々のエンベロープタンパク質（例えば、ｇｐ１６０およびｇｐ４１）、ｇａｇ抗原（例えば、ｐ２４ｇａｇおよびｐ５５ｇａｇ）ならびにｐｏｌ領域およびｔａｔ領域由来のタンパク質のいずれかを含む、種々のＨＩＶ単離体のいずれか由来の他の免疫原性タンパク質に、等しく適用可能である。
【００６３】
インフルエンザウイルスは、本発明が特に有用であるウイルスの別の例である。特に、インフルエンザＡのエンベロープ糖タンパク質ＨＡおよびＮＡは、免疫応答を惹起するために特に目的とするものである。インフルエンザＡの多数のＨＡサブタイプが同定されている（Ｋａｗａｏｋａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９０）１７９：７５９−７６７；Ｗｅｂｓｔｅｒら、「Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ａｍｏｎｇ ｔｙｐｅ Ａ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓｅｓ」、ｐ．１２７−１６８：Ｐ．ＰａｌｅｓｅおよびＤ．Ｗ．Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ（編）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。従って、これらの単離体のいずれか由来のタンパク質はまた、本明細書中に記載される組成物および方法において使用され得る。
【００６４】
本明細書中に記載される組成物および方法はまた、多数の細菌抗原（例えば、ジフテリア、コレラ、結核、破傷風、百日咳、髄膜炎および他の病理的状態（限定することなく、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｙ）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉおよびＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｙａｆｌｕｅｎｚａ、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｂ型（ＨＩＢ）、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）ならびにこれらの組み合せを引き起こす生物由来の抗原）を伴う使用を見出す。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ Ｂ由来の抗原の例は、以下の共有に係る特許出願に開示される：ＰＣＴ／ＵＳ９９／０９３４６；ＰＣＴ ＩＢ９８／０１６６５；およびＰＣＴ ＩＢ９９／００１０３。寄生虫抗原の例としては、マラリアおよびライム病を引き起こす生物由来の抗原が挙げられる。
【００６５】
本願のいずれかに列挙される抗原を必ずしも排除しない、さらなる抗原としては以下が挙げられる：
− Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ由来のタンパク質抗原（例えば、以下の参考文献１〜７におけるもの）。
− Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ由来の外膜小胞（ＯＭＶ）調製物（例えば、以下の参考文献８、９、１０、１１などに開示されるもの）。
− Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５および／またはＹ由来の糖類抗原（例えば、血清型Ｃ由来の、以下の参考文献１２に開示されるオリゴ糖類（参考文献１３もまた参照のこと））。
− Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の糖類抗原（例えば、参考文献１４、１５、１６）。
− Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来の抗原（例えば、参考文献１、２、３）。
− Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の抗原（例えば、参考文献１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３）。
− Ｃｈｌａｆｎｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ由来の抗原（例えば、参考文献２４）。
− 不活化ウイルスのようなＡ型肝炎ウイルス由来の抗原（例えば、参考文献２５、２６）。
− 表面抗原および／またはコア抗原のようなＢ型肝炎ウイルス由来の抗原（例えば、参考文献２６、２７）。
− Ｃ型肝炎ウイルス由来の抗原（例えば、参考文献２８）。
− Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｕｔｕｓｓｉｓ由来の抗原（例えば、Ｂ．ｐｅｒｕｔｕｓｓｉｓ由来の百日咳全毒素（ｈｏｌｏｔｏｘｉｎ）（ＰＴ）および線維状赤血球凝集素（ＦＨＡ））これらはまた、必要に応じて、ペルタクチンおよび／または凝集原２および３と組み合される（例えば、参考文献２９および３０）。
− ジフテリアトキソイドのようなジフテリア抗原（例えば、参考文献３１の第３章）（例えば、ＣＲＭ１９７変異体（例えば、参考文献３２））。
− 破傷風トキソイドのような破傷風抗原（例えば、参考文献３１の第４章）。
− Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ由来のタンパク質抗原（例えば、ＣａｇＡ（例えば、参考文献３３）、ＶａｃＡ（例えば、参考文献３３）、ＮＡＰ（例えば、参考文献３４）、ＨｏｐＸ（例えば、参考文献３５）、ＨｏｐＹ（例えば、参考文献３５）および／またはウレア−ゼ）。
− Ｈａｅｎｉｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ由来の糖類抗原（例えば、参考文献１３）。
− Ｐｏｒｐｈｙｒａｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来の抗原（例えば、参考文献３６）。
− ＩＰＶまたはＯＰＶのようなポリオ抗原（例えば、参考文献３７、３８）。
− 狂犬病抗原（例えば、参考文献３９）（例えば、凍結乾燥して不活化したウイルス（例えば、参考文献４０、ＲａｂａｖｅｒｔＴＭ）。
− 麻疹、おたふくかぜおよび／または風疹抗原（例えば、参考文献３１の第９、１０および１１章）。
− 赤血球凝集素および／またはノイラミニダーゼ表面タンパク質のようなインフルエンザ抗原（例えば、参考文献３１の第１９章）。
− Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ由来の抗原（例えば、参考文献４１）。
− Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｂ群連鎖球菌）由来の抗原（例えば、参考文献４２、４３）。
− Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ａ群連鎖球菌）由来の抗原（例えば、参考文献４３、４４、４５）。
− Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来の抗原（例えば、参考文献４６）。
− １つ以上のこれらの抗原を含有する組成物。
【００６６】
糖類抗原または炭水化物抗原が使用される場合、免疫原性を増強するために、好ましくはキャリアタンパク質と結合体化される（例えば、参考文献４７〜５６）。好ましいキャリアタンパク質は、細菌毒素またはトキソイド（例えば、ジフテリアトキソイドまたは破傷風トキソイド）である。ＣＲＭ１９７ジフテリアトキソイドが特に好ましい。他の適切なキャリアタンパク質としては、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜タンパク質（例えば、参考文献５７）、合成ペプチド（例えば、参考文献５８、５９）、熱ショックタンパク質（例えば、参考文献６０）、百日咳タンパク質（例えば、参考文献６１、６２）、Ｈ．Ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のタンパク質Ｄ（例えば、参考文献６３）、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の毒素Ａまたは毒素Ｂ（例えば、参考文献６４）などが挙げられる。混合物が血清型Ａおよび血清型Ｃの両方由来の莢膜糖類を含む場合、ＭｅｎＡ糖類：ＭｅｎＣ糖類の割合（ｗ／ｗ）は、１より大きいことが好ましい（例えば、２：１、３：１、４：１、５：１、１０：１またはそれ以上）。Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの異なる血清型由来の糖類は、同じかまたは異なるキャリアタンパク質に結合体化され得る。
【００６７】
必要に応じて、任意の適切なリンカーとの任意の適切な結合体化反応が、使用され得る。
【００６８】
毒素タンパク質抗原は、必要な場合、解毒され得る（例えば、化学物質および／または手段による百日咳毒素の解毒（参考文献３０））。
【００６９】
以下を参照のこと：国際特許出願９９／２４５７８ （参考文献１）；国際特許出願ＷＯ９９／３６５４４（参考文献２）；国際特許出願ＷＯ９９／５７２８０（参考文献３）；国際特許出願ＷＯ００／２２４３０（参考文献４）；Ｔｅｔｔｅｌｉｎら（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：１８０９−１８１５（参考文献５）；国際特許出願ＷＯ９６／２９４１２（参考文献６）；Ｐｉｚｚａら（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：１８１６−１８２０（参考文献７）；国際特許出願ＰＣＴ／ＩＢＯ１／００１６６（参考文献８）；Ｂｊｕｎｅら（１９９１）Ｌａｎｃｅｔ ３３８（８７７５）：１０９３−１０９６（参考文献９）；Ｆｕｋａｓａｗａら（１９９０）Ｖａｃｃｉｎｅ １７：２９５１−２９５８（参考文献１０）；Ｒｏｓｅｎｑｖｉｓｔら（１９９８）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．９２：３２３−３３３（参考文献１１）；Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｏら（１９９２）Ｖａｃｃｉｎｅ １０：６９１−６９８（参考文献１２）；Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｏら（１９９９）Ｖａｃｃｉｎｅ １７：１２５１−１２６３（参考文献１３）；Ｗａｔｓｏｎ（２０００）Ｐａｄｉａｔｒ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ Ｊ １９：３３１−３３２（参考文献１４）；Ｒｕｂｉｎ（２０００）Ｐｅｄｉａｔｒ Ｃｌｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ ４７：２６９−２８５，ｖ（参考文献１５）；Ｊｅｄｒｚｅｊａｓ（２００１）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｒｅｖ ６５：１８７−２０７（参考文献１６）；ＧＢ−００１６３６３．４の優先権を主張し、２００１年７月３日に出願された国際特許出願（参考文献１７）；Ｋａｌｍａｎら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２１：３８５−３８９（参考文献１８）；Ｒｅａｄら（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２８：１３９７−４０６（参考文献１９）；Ｓｈｉｒａｉら（２０００）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８１（補遺３）：Ｓ５２４−Ｓ５２７（参考文献２０）；国際特許出願ＷＯ９９／２７１０５（参考文献２１）；国際特許出願ＷＯ００／２７９９４（参考文献２２）；国際特許出願ＷＯ００／３７４９４（参考文献２３）；国際特許出願ＷＯ９９／２８４７５（参考文献２４）；Ｂｅｌｌ（２０００）Ｐｅｄｉａｔｒ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ Ｊ １９：１１８７−１１８８（参考文献２５）；Ｉｗａｒｓｏｎ（１９９５）ＡＰＭＩＳ １０３：３２１−３２６（参考文献２６）；Ｇｅｒｌｉｃｈら（１９９０）Ｖａｃｃｉｎｅ ８ 補遺：Ｓ６３−６８および７９−８０（参考文献２７）；Ｈｓｕら（１９９９）Ｃｌｉｎ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ ３：９０１−９１５（参考文献２８）；Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎら（１９９６）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３４：３４９−３５５（参考文献２９）；Ｒａｐｐｕｏｌｉら（１９９１）ＴＩＢＴＥＣＨ ９：２３２−２３８（参考文献３０）；Ｖａｃｃｉｎｅｓ（１９８８）ＰｌｏｔｋｉｎおよびＭｏｒｔｉｍｅｒ編、ＩＳＢＮ ０−７２１６−１９４６−０（参考文献３１）；Ｄｅｌ Ｇｕｉｄｉｃｅら（１９９８）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９：１−７０（参考文献３２）；国際特許出願ＷＯ９３／１８１５０（参考文献３３）；国際特許出願ＷＯ９９／５３３１０（参考文献３４）；国際特許出願ＷＯ９８／０４７０２（参考文献３５）；Ｒｏｓｓら（２００１）Ｖａｃｃｉｎｅ １９：４１３５−４１４２（参考文献３６）；Ｓｕｔｔｅｒら（２０００）Ｐｅｄｉａｔｒ Ｃｌｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ ４７：２８７−３０８（参考文献３７）；ＺｉｍｍｅｒｍａｎおよびＳｐａｎｎ（１９９９）Ａｍ Ｆａｍ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ ５９：１１３−１１８、１２５−１２６（参考文献３８）；Ｄｒｅｅｓｅｎ（１９９７）Ｖａｃｃｉｎｅ １５ 補遺：Ｓ２−６（参考文献３９）；ＭＭＷＲ Ｍｏｒｂ Ｍｏｒｔａｌ Ｗｋｌｙ Ｒｅｐ（１９９８年１月１６日）；４７（１）：１２，１９（参考文献４０）；ＭｃＭｉｃｈａｅｌ（２０００）Ｖａｃｃｉｎｅ １９ 補遺１：Ｓ１０１−１０７（参考文献４１）；Ｓｃｈｕｃｈａｔ（１９９９）Ｌａｎｃｅｔ ３５３（９１４６）：５１−６（参考文献４２）；英国特許出願第００２６３３３．５号、同第００２８７２７．６号および同第０１０５６４０．７号（参考文献４３）；Ｄａｌｅ（１９９９）Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ Ｃｌｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ １３：２２７−４３，ｖｉｉｉ（参考文献４４）；Ｆｅｒｒｅｔｔｉら（２００１）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９８：４６５８−４６６３（参考文献４５）；Ｋｕｒｏｄａら（２００１）Ｌａｎｃｅｔ ３５７（９２６４）：１２２５−１２４０；１２１８−１２１９頁（参考文献４６）もまた参照のこと；Ｒａｍｓａｙら（２００１）Ｌａｎｃｅｔ ３５７（９２５１）：１９５−１９６（参考文献４７）；Ｌｉｎｄｂｅｒｇ（１９９９）Ｖａｃｃｉｎｅ １７補遺２：Ｓ２８−３６（参考文献４８）；ＢｕｔｔｅｒｙおよびＭｏｘｏｎ（２０００）Ｊ Ｒ Ｃｏｌｌ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ Ｌｏｎｄｏｎ ３４：１６３−１６８（参考文献４９）；ＡｈｍａｄおよびＣｈａｐｎｉｃｋ（１９９９）Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ Ｃｌｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ １３：１１３−１３３，ｖｉｉ（参考文献５０）；Ｇｏｌｄｂｌａｔｔ（１９９８）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４７：５６３−５６７（参考文献５１）；欧州特許第０ ４７７ ５０８号（参考文献５２）；米国特許第５，３０６，４９２号（参考文献５３）；国際特許出願ＷＯ９８／４２７２１（参考文献５４）；Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅｓ（Ｃｒｕｓｅら編）ＩＳＢＮ ３８０５５４９３２６（特に、第１０巻：４８−１１４）（参考文献５５）；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ（１９９６）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ＩＳＢＮ：０１２３４２３３６８および０１２３４２３３５Ｘ（参考文献５６）；欧州特許出願第０３７２５０１号（参考文献５７）；欧州特許出願第０３７８８８１号（参考文献５８）；欧州特許出願第０４２７３４７号（参考文献５９）；国際特許出願ＷＯ９３／１７７１２（参考文献６０）；国際特許出願ＷＯ９８／５８６６８（参考文献６１）；欧州特許出願第０４７１１７７号（参考文献６２）；国際特許出願ＷＯ／５６３６０（参考文献６３）；国際特許出願ＷＯ００／６１７６１（参考文献６４）。
【００７０】
ジフテリア抗原が組成物中に含有される場合、破傷風抗原および百日咳抗原を含有することもまた好ましい。同様に、破傷風抗原が含有される場合、ジフテリア抗原および百日咳抗原を含有することもまた好ましい。同様に、百日咳抗原が含有される場合、ジフテリア抗原および破傷風抗原を含有することもまた好ましい。
【００７１】
本発明を用いて、多様なポリペプチド含有効分子を送達し得、従って、多くの疾患を処置および／または診断し得ることは、容易に明らかである。いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチド含有分子／微粒子組成物は、部位特異的な標的化送達に使用され得る。例えば、ポリペプチド含有分子／微粒子組成物の静脈内投与は、肺、肝臓、脾臓、血液循環または骨髄の標的化に使用され得る。
【００７２】
吸着性微粒子の表面へのポリペプチド含有分子の吸着は、任意の結合相互作用機構（イオン結合、水素結合、共有結合、ファンデルワールス結合および親水性／疎水性相互作用を介する結合が挙げられるがこれらに限定されない）を介して生じる。
【００７３】
本発明とともに使用する微粒子を製造するための生分解性のポリマーは、例えば、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ（Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＢｉｒｍｉｎｇｈａｍ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）から市販されている。例えば、本明細書中の微粒子を形成するために有用なポリマーとしては、以下由来のホモポリマー、コポリマーおよびポリマーブレンドが挙げられる：ポリヒドロキシ酪酸（ポリヒドロキシブチレートとしても公知）；ポリヒドロキシ吉草酸（ポリヒドロキシバレレートとしても公知）；ポリグリコール酸（ＰＧＡ）（ポリグリコリドとしても公知）：ポリ乳酸（ＰＬＡ）（ポリラクチドとしても公知）；ポリジオキサノン；ポリカプロラクトン；ポリオルトエステル；およびポリ無水物。ポリ（α−ヒドロキシ酸）（例えば、ポリ（Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（両方とも、本明細書中で「ＰＬＡ」として公知）、ポリ（ヒドロキシブチレート）、Ｄ，Ｌ−ラクチドおよびグリコリドのコポリマー（例えば、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（本明細書中で「ＰＬＧ」と示す）または、Ｄ，Ｌ−ラクチドおよびカプロラクトンのコポリマーがより好ましい。本明細書中において使用するための特に好ましいポリマーは、ＰＬＡポリマーおよびＰＬＧポリマーである。これらのポリマーは、種々の分子量で利用可能であり、そして、所定の使用のための適切な分子量は、当業者によって容易に決定される。従って、例えば、ＰＬＡについて、適切な分子量は、約２０００〜５０００のオーダーである。ＰＬＧについての適切な分子量は、一般に、約１０，０００〜約２００，０００、好ましくは約１５，０００〜約１５０，０００の範囲である。
【００７４】
ＰＬＧのようなコポリマーを用いて微粒子を形成する場合、種々のラクチド：グリコール分子比が、本明細書中における使用に見出され、そしてこの比は、同時に投与されるポリペプチド含有分子および所望の分解速度に部分的に依存して、主に選択の問題である。例えば、５０％Ｄ，Ｌ−ラクチドおよび５０％グリコリドを含有する５０：５０のＰＬＧポリマーは、急速再吸収コポリマーを提供するが、ラクチド含量の増加に起因して、７５：２５ ＰＬＧは、よりゆっくり分解し、そして８５：１５および９０：１０は、なおよりゆっくり分解する。ラクチド：グリコリドの適切な比が、例えば、抗原の性質および問題の障害に基づいて、当業者によって容易に決定されることは明らかである。本発明の微粒子の分解速度はまた、ポリマー分子量およびポリマー結晶化度などの因子によって制御され得る。可動するラクチド：グリコリド比および分子量を有するＰＬＧコポリマーは、多くの供給元（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ（Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＢｉｒｍｉｎｇｈａｍ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）を含む）から市販されている。いくつかの例示的なＰＬＧコポリマーとしては、以下が挙げられる：（ａ）ＲＧ ５０２（５０：５０のラクチド／グリコリド分子比および１２，０００Ｄａの分子量を有するＰＬＧ）；（ｂ）ＲＧ ５０３（５０：５０のラクチド／グリコリド分子比および３４，０００Ｄａの分子量を有するＰＬＧ）；（ｃ）ＲＧ ５０４（５０：５０ ラクチド／グリコリド分子比および４８，０００Ｄａの分子量を有するＰＬＧ）、（ｄ）ＲＧ ７５２（７５：２５のラクチド／グリコリド分子比および２２，０００Ｄａの分子量を有するＰＬＧ）；ならびに（ｅ）ＲＧ ７５５（７５：２５のラクチド／グリコリド分子比および６８，０００Ｄａの分子量を有するＰＬＧ）。ＰＬＧポリマーはまた、当該分野で周知の技術（例えば、Ｔａｂａｔａら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．（１９８８）２２：８３７−８５８に記載される技術）を用いて、乳酸成分の単純な重縮合により合成され得る。現在、好ましいＰＬＧコポリマーは、２５：７５〜７５：２５、より好ましくは４０：６０〜６０：４０の範囲の分子ラクチド／グリコリド比を有し、１０，０００〜１００，０００ダルトン，より好ましくは２０，０００ダルトン〜７０，０００ダルトンの範囲の分子量を有するＰＬＧコポリマーである。
【００７５】
微粒子は、当該分野で周知のいくつかの方法のうちのいずれかを用いて調製される。例えば、いくつかの実施形態において、二重エマルジョン／溶媒蒸発技術（例えば、米国特許第３，５２３，９０７号およびＯｇａｗａら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．（１９８８）３６：１０９５−１１０３に記載される技術）を本明細書中で用いて、微粒子を製造し得る。これらの技術は、ポリマー溶液の液滴からなる第１のエマルジョンの形成を包含し、この第１のエマルジョンは、続いて粒子安定化剤／界面活性剤を含有する連続した水相と混合される。
【００７６】
他の実施形態において、微粒子はまた、以下の技術を用いて形成され得る：例えば、ＴｈｏｍａｓｉｎらＪ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ（１９９６）４１：１３１；米国特許第２，８００，４５７号；Ｍａｓｔｅｒｓ，Ｋ．（１９７６）Ｓｐｒａｙ Ｄｒｙｉｎｇ 第２版、Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されるようなスプレー乾燥およびコアセルベーション；エアサスペンションコーティング技術（例えば、Ｈａｌｌら（１９８０）Ｔｈｅ「Ｗｕｒｓｔｅｒ Ｐｒｏｃｅｓｓ」ｉｎ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｔｌｉｅｏｒｙ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａ．Ｆ．Ｋｙｄｏｎｉｅｕｓ編）、第２巻、ｐｐ．１３３−１５４（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ）およびＤｅａｓｙ，Ｐ．Ｂ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．（１９８８）Ｓ（２）：９９−１３９によって記載されるようなパンコーティングおよびＷｕｒｓｔｅｒコーティング；ならびに、例えば、Ｌｉｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８０）２１０：９０８−９１０によって記載されるようなイオン性のゲル化）。
【００７７】
好ましい実施形態において、改変された水中油中水（ｗ／ｏ／ｗ）溶媒蒸発技術を用いて微粒子を形成し得る。この型の技術は、例えば、Ｏ’Ｈａｇａｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９３）１１：９６５−９６９、ＰＣＴ／ＵＳ９９／１７３０８（ＷＯ ００／０６１２３）（Ｏ’Ｈａｇａｎら）およびＪｅｆｆｅｒｙら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９３）１０：３６２に記載されている。しかし、これらの技術は、本発明と組み合せて使用するために改変される。特に、これらの技術とは異なり、本発明のｗ／ｏ／ｗエマルジョンは、好ましくは界面活性剤（洗浄剤、分散剤、懸濁剤および乳化安定剤を含む）の非存在下で形成される。
【００７８】
より詳細には、ＰＬＧのような目的の粒子ポリマーは、酢酸エチル、ジメチルクロライド（塩化メチレンおよびジクロロメタンとも呼ばれる）、アセトニトリル、アセトン、クロロホルムなどのような有機溶媒中に溶解される。このポリマーは、代表的には、有機溶媒中、約１〜３０％、好ましくは約２〜１５％、より好ましくは約３〜１０％、および最も好ましくは約４〜６％の溶液で提供される。次いで、このポリマー溶液は、水溶液の第１の容量と合わせられ、そして乳化され、ｏ／ｗエマルジョンを形成する。この水溶液は、例えば、脱イオン水、正常生理食塩水、またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）のような緩衝溶液もしくはクエン酸ナトリウム／エチレンジアミン四酢酸（クエン酸ナトリウム／ＥＴＤＡ）緩衝溶液であり得る。後者の溶液が、（ａ）正常な生理学的流体と本質的に同じである張性（すなわち、重量オスモル濃度）を提供し得、かつ（ｂ）正常な生理学的条件と適合するｐＨを維持し得る。あるいは、本発明の組成物の張性および／またはｐＨ特性は、微粒子形成後および投与前に調節され得る。
【００７９】
好ましくは、ポリマー溶液 対 水溶液の容量比は、約５：１〜約２０：１の範囲であり、そしてより好ましくは、約１０：１である。乳化は、好ましくは、この仕事に適切であり、代表的には、例えば、ホモジナイザーのような高剪断デバイスである、任意の装置を使用して行われる。
【００８０】
次いで、ある容量のｏ／ｗエマルジョンは、好ましくは、より大容量の第２の水溶液（これは、例えば、脱イオン水、正常生理食塩水、または緩衝溶液でもあり得る）と合わせられる。第２の容量の水溶液とｏ／ｗエマルジョンの容量との比は、代表的には、約２：１〜１０：１の範囲であり、そしてより代表的には、約４：１である。次いで、混合物は、ホモジナイズされて、ｗ／ｏ／ｗダブルエマルジョンを生成する。次いで、有機溶媒は、蒸発される。
【００８１】
この処方パラメータは、操作され、０．２μｍ（２００ｎｍ）のオーダーである小さい微粒子〜５０μｍまたはよりそれ以上でさえある、より大きい微粒子の調製を可能にする。例えば、Ｊｅｆｆｅｒｙら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９３）１０：３６２−３６８；ＭｃＧｅｅら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐ．（１９９６）を参照のこと。例えば、撹拌を減少することにより、内相の容量が増加し、かつポリマー濃度が増加するので、より大きい微粒子が生じる。小さい粒子は、撹拌の増加ならびに低い水相容量および低ポリマー濃度によって生成される。
【００８２】
上記の工程を実施するために好ましい装置の１つが、図１に概略的に示されている。ここで、図１を参照すると、操作タンクアセンブリ（一般的に、数字１０２で表される）が示される。このタンクアセンブリ１０２は、「閉鎖系」であるように設計されているので、処理の間、無菌環境が維持される。装置の全ての部品および部分は、好ましくは、定置洗浄（ｃｌｅａｎ−ｉｎ−ｐｌａｃｅ）およびオートクレーブであるように選択される。１０４ａ〜１０４ｄのフィルターは全て、好ましくは、Ｓｕｐｅｒ−ＣｈｅｍｉｎｅｒｔＴＭのようなフルオロポリマーフィルターであり、全てのフルオロポリマーフィルターは、Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製である。最初に、脱イオン水１０６のような水溶液および塩化メチレン中のＰＬＧ溶液１０８のような有機ポリマー溶液を、濾過し、タンク１１０中に供給し、タンク１１０においてこれらをミキサー１１２を用いて連続的に混合する。次いで、この混合物を、インラインホモジナイザー１１４（例えば、Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ ＭＴ５０００のような、高速、高剪断でオートクレーブ可能であるインラインホモジナイザー）を介して供給し、ｏ／ｗエマルジョンを形成する。このエマルジョンを、インラインホモジナイザー１１４からエマージングした後に、例えば、水冷コンデンサ１１６によって冷却し、その後、タンク１１０に戻す。内容量が所望の程度まで乳化された後、さらなる水溶液（例えば、脱イオン水１０６）をタンク１１０に加え、その後、インラインミキサー１１４を介して内容量を再び供給することによって、ｗ／ｏ／ｗエマルジョンを形成する。得られたｗ／ｏ／ｗエマルジョンを、ディストリビュータ１１９を介して窒素と共にパージし、有機溶媒を除去する。この窒素含有（ｎｉｔｒｏｇｅｎ−ｌａｄｅｎ）溶媒蒸気を濾過し、コンデンサ１２０内で冷却し、容器１２２内にこの溶媒を捕捉する。容器１２２内において、このエマルジョンは、いくらか不安定であり、インライン混合によって同時に溶媒を除去することが所望され得る。
【００８３】
粒子サイズは、例えば、ヘリウム−ネオンレーザーを組み込んだ分光計を使用して、例えば、レーザー光散乱によって決定され得る。一般的には、粒子サイズは室温で決定され、問題のサンプルの複数回分析（例えば、５〜１０回）によってその粒子直径の平均値を得る。粒子サイズはまた、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を使用して、容易に決定される。
【００８４】
調製後、微粒子を、更なる使用のためにそのまま保存し得るかまたは凍結乾燥し得る。微粒子にポリペプチド含有分子を吸着させるために、微粒子調製物を目的のポリペプチド含有分子と単に混合し得、そして得られた処方物を使用前に再び凍結乾燥し得る。
【００８５】
代表的には、ポリペプチド含有分子を微粒子に加え、ポリペプチド含有分子を吸着した微粒子を得、この微粒子は、約０．０００１：１〜０．２５：１、より代表的には、０．００１：１〜０．１：１、なおより代表的には０．０５：１〜０．０１：１であるポリペプチド含有分子 対 微粒子の重量 対 重量比を有する。この微粒子のポリペプチド含有分子含量は、標準的な技術を使用して決定され得る。
【００８６】
ポリペプチド含有分子を吸着した微粒子に加え、本発明の組成物はまた、種々の他の高分子（さらなるポリペプチド含有分子、医薬品、ポリヌクレオチド、ホルモン、酵素、翻訳もしくは転写のメディエータ、代謝経路中間体、免疫調節物質、抗原、アジュバントあるいはこれらの組み合わせが挙げられる）を含み得る。例えば、本発明の微粒子は、その中に包埋またはカプセル化されるか、微粒子の表面に吸着されるか、あるいは溶液中または懸濁液中に含まれる追加高分子を有し得る。特に好ましい追加高分子は、アジュバントである。
【００８７】
一旦、吸着ポリペプチド含有分子を有する微粒子が生成されると、それらは、上記のような、広範な種々の障害を処置および／または診断するための、薬学的組成物（ワクチンを含む）へと処方される。この組成物は、一般には、１つ以上の薬学的に受容可能な賦形剤を含む。例えば、ビヒクル（例えば、水、生理食塩水、グリセロール、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、エタノールなど）が、使用され得る。他の賦形剤（例えば、湿潤剤または乳化剤、生物学的緩衝物質など）が、このようなビヒクル中に存在し得る。生物学的緩衝剤は、薬理学的に受容可能でありかつその処方物に望ましいｐＨ（すなわち、生理的範囲にあるｐＨ）を提供する、事実上任意の物質であり得る。緩衝溶液の例としては、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水、ハンクス緩衝化生理食塩水などが挙げられる。当該分野で公知の他の賦形剤もまた、最終投与形態（結合剤、崩壊剤、充填剤（希釈剤）、滑沢剤、流動促進剤（ｇｌｉｄａｎｔ）（流動増強剤（ｅｎｈａｎｃｅｒ））、着色料、圧縮助剤、甘味剤、保存剤、懸濁剤／分散剤、フィルム形成剤／コーティング剤、矯味矯臭剤（ｆｌａｖｏｒ）および印刷インクを含む）へと導入され得る。
【００８８】
アジュバントは、薬学的組成物の有効性を増強するために使用され得る。このアジュバントは、本発明の微粒子と同時に（例えば、同じ組成物中でか、または別の組成物中で）投与され得る。あるいは、このアジュバントは、本発明の微粒子組成物の前または後に投与され得る。いくつかの実施形態において、このアジュバント（例えば、免疫学的アジュバント）は、この微粒子中にカプセル化され得る。アジュバント（任意の高分子）は、当該分野で公知のいくつかの方法のうちのいずれかを使用して、この微粒子内にカプセル化され得る。例えば、米国特許第３，５２３，９０７号；Ｏｇａｗａら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．（１９８８）３６：１０９５〜１１０３；Ｏ’Ｈａｇａｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９３）１１：９６５〜９６９、およびＪｅｆｆｅｒｅｙら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９３）１０：３６２を参照のこと。あるいは、いくつかのアジュバント（特に、ポリペプチド含有アジュバント）は、上記のように微粒子上に吸着され得る。
【００８９】
免疫学的アジュバントとしては、（１）アルミニウム塩（ミョウバン）（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど）；（２）他の水中油エマルジョン処方物（他の特定の免疫刺激剤（例えば、ムラミルペプチド（下記参照）または細菌細胞壁成分）を含むかまたは含まない）（例えば、（ａ）ＭＦ５９（国際公開番号ＷＯ９０／１４８３７；Ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｓｉｇｎ：ｔｈｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｐｐｒｏａｃｈ，第１０章，ＰｏｗｅｌｌおよびＮｅｗｍａｎ編、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，１９９５）（Ｍｏｄｅｌ １１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ）のようなマイクロフルイダイザーを使用してμｍ未満の粒子へと処方された、５％ Ｓｑｕａｌｅｎｅ，０．５％ Ｔｗｅｅｎ ８０および０．５％ Ｓｐａｎ ８５（必要に応じて種々の量のＭＴＰ−ＰＥ（下記を参照のこと）を含むが、必要というわけではない）を含む）、（ｂ）ＳＡＦ（μｍ未満のエマルジョンへとマイクロフルイダイズされたかまたはより大きな粒径のエマルジョンを生じるようにボルテックスされた、１０％ Ｓｑｕａｌａｎｅ，０．４％ Ｔｗｅｅｎ ８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰ（下記を参照のこと）を含む）、ならびに（ｃ）ＲｉｂｉＴＭアジュバントシステム（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）（２％ Ｓｑｕａｌｅｎｅ，０．２％ Ｔｗｅｅｎ ８０、および１種以上の細菌細胞壁成分（モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）（好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘＴＭ）からなる群由来を含む）（本明細書における使用のために適切なμｍ未満の水中油エマルジョンのさらなる考察について、１９９８年１月２９日出願の共有に係る米国特許出願番号０９／０１５，７３６号を参照のこと）；（３）サポニンアジュバント（例えば、Ｑｕｉｌ ＡもしくはＱＳ２１（例えば、ＳｔｉｍｕｌｏｎＴＭ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ））が、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）のようなそれらから生じる粒子のために使用され得、このＩＳＣＯＭは、さらなる界面活性剤を回避し得る（例えば、ＷＯ００／０７６２１））；（４）完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；（５）サイトカイン（例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２（ＷＯ９９／４４６３６）など）、インターフェロン（例えば、γインターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）など；（６）モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）もしくは３−Ｏ−デアシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）（例えば、ＧＢ−２２２０２２１、ＥＰ−Ａ−０６８９４５４）（肺炎球菌糖質とともに使用した場合には、必要に応じてミョウバンの実質的不在下）（例えば、ＷＯ００／５６３５８）；（７）３ｄＭＰＬと、例えば、ＱＳ２１および／または水中油エマルジョンとの組み合わせ（例えば、ＥＰ−Ａ−０８３５３１８、ＥＰ−Ａ−０７３５８９８、ＥＰ−Ａ−０７６１２３１）；（８）ＣｐＧモチーフ（すなわち、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドを含み、５メチルシトシンが、シトシンの代わりに必要に応じて使用される）を含むオリゴヌクレオチド（Ｒｏｍａｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１９９７，３，８４９〜８５４；Ｗｅｉｎｅｒら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、１９９７，９４，１０８３３〜１０８３７；Ｄａｖｉｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８８，１６０，８７０〜８７６；Ｃｈｕら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９７，１８６，１６２３〜１６３１；Ｌｉｐｆｏｒｄら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７，２７，２３４０〜２３４４；Ｍｏｌｄｏｖｅａｎｕら、Ｖａｃｃｉｎｅ，１９８８，１６，１２１６〜１２２４；Ｋｒｉｅｇら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９５，３７４，５４６〜５４９；Ｋｌｉｎｍａｎら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ，１９９６，９３，２８７９〜２８８３；Ｂａｌｌａｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６，１５７，１８４０〜１８４５；Ｃｏｗｄｅｒｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６，１５６，４５７０〜４５７５；Ｈａｌｐｅｍら、Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６，１６７，７２〜７８；Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１９８８，７９，８６６〜８７３；Ｓｔａｃｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６，１５７，２１１６〜２１２２；Ｍｅｓｓｉｎａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９１，１４７，１７５９〜１７６４；Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６，１５７，４９１８〜４９２５；Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６，１５７，５３９４〜５４０２；Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８，１６０，４７５５〜４７６１；およびＹｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８，１６０，５８９８〜５９０６；国際特許出願ＷＯ９６／０２５５５、ＷＯ９８／１６２４７、ＷＯ９８／１８８１０、ＷＯ９８／４０１００、ＷＯ９８／５５４９５、ＷＯ９８／３７９１９およびＷＯ９８／５２５８１）；（９）ポリオキシエチレンエーテルまたはポリオキシエチレンエステル（例えば、ＷＯ９９／５２５４９）；（１０）オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（ＷＯ０１／２１２０７）、または少なくとも１つのさらなる非イオン性界面活性剤（例えば、オクトキシノール）と組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテル界面活性剤もしくはポリオキシエチレンアルキルエステル界面活性剤（ＷＯ０１／２１１５２）；（１１）サポニンおよび免疫刺激オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＷＯ００／６２８００）；（１２）免疫刺激剤および金属塩粒子（例えば、ＷＯ００／２３１−５）；（１３）サポニンおよび水中油エマルジョン（例えば、ＷＯ９９／１１２４１）；（１４）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（必要に応じて＋ステロール）（例えば、ＷＯ９８／５７６５９）；（１５）細菌ＡＤＰ−リボシル化毒素の解毒化変異体（例えば、コレラ毒素（ＣＴ）、破傷風毒素（ＰＴ）もしくはＥ．ｃｏｌｉ易熱性毒素（ＬＴ）（特に、ＬＴ−Ｋ６３（野生型アミノ酸６３位がリジンで置換されている）、ＬＴ−Ｒ７２（野生型アミノ酸７２位がアルギニンで置換されている）、ＣＴ−Ｓ１０９（野生型アミノ酸１０９位がセリンで置換されている）、およびＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９（野生型アミノ酸９位がリジンで置換され、１２９位がグリシンで置換されている）（例えば、国際特許公開番号ＷＯ９３／１３２０２およびＷＯ９２／１９２６５を参照のこと）；（１６）アミノアルキルグルコサミニド４−リン酸（ＡＧＰ）（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｄ．Ａ．ら；Ｂｉｏｏｒｇ，Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１９９９ Ａｕｇ ２；９（１５）：２２７３〜８を参照のこと）、（１７）イミダゾキノリン（例えば、イミキモド（ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）（Ｒ−８３７）およびレシキモド（ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ）（Ｒ−８４８））（例えば、Ｖａｓｉｌａｋｏｓ，Ｊ．Ｐ．ら、Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００ Ａｕｇ ２５；２０４（１）：６４〜７４を参照のこと）、（１８）リポ多糖模倣物（Ｈａｗｋｉｎｓ，Ｌ．Ｄ．ら；Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２００２ Ｆｅｂ．３００（２）：６５５〜６１に記載される非糖リン脂質（例えば、二糖を欠く簡易化（ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ）リピドＡアナログ）、ならびに（１９）この組成物の有効性を増強するための免疫刺激剤として作用する他の物質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９０】
ムラミルペプチドとしては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）などが挙げられる。
【００９１】
アジュバントのさらなる例について、Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ，Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ ｔｈｅ ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｐｏｗｅｌｌ，Ｍ．Ｆ．およびＮｅｗｍａｎ，Ｍ．Ｊ．編、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，１９９５を参照のこと。
【００９２】
この組成物は、「治療有効量」の目的のポリペプチド含有分子（ならびに他の任意の高分子）を含む。すなわち、十分量のこのポリペプチド含有分子が、目的の状態を処置または診断するために含められる。必要な正確な量は、例えば、とりわけ、処置される被検体；処置される被検体の年齢および全身状態；処置される状態の重篤度；免疫応答の場合は、その被検体の免疫系が抗体を合成する能力；望ましい防御の程度および選択される特定のポリペプチド含有分子およびその投与様式に依存して、変化する。適切な有効量は、当業者により容易に決定され得る。従って、「治療有効量」は、代表的には、慣用的試験を介して決定され得る比較的広範な範囲内にある。例えば、その高分子がポリペプチド抗原である場合、有効用量は、代表的には、１回の投与について送達される、約１μｇ〜約１００ｍｇ、好ましくは、約５μｇ〜約１ｍｇ、より好ましくは約５μｇ〜約１００μｇ、および最も好ましくは、約５μｇ〜約５０μｇの抗原である。
【００９３】
一旦処方されると、本発明の組成物は、（例えば、注射により）非経口投与され得る。この組成物は、皮下、腹腔内、静脈内、または筋肉内のいずれかで注射され得る。他の投与様式としては、鼻投与、直腸投与、膣投与、経口投与および肺投与、坐剤、および経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌまたはｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）適用が挙げられる。
【００９４】
投与処置は、単回投与スケジュールまたは多回投与スケジュールに沿ってであり得る。多回投与スケジュールは、一次投与治療単位が、１〜１０の別個の投与であり、その後、他の投与が、治療応答を維持および／または強化するように選択されたそれに続く時間間隔（例えば、２回目の投与について１〜４ヶ月、必要な場合は、数ヶ月後にその後の投与）で与えられ得る。その投与レジメンはまた、少なくとも一部、被検体の必要性により決定され得、実施者の判断に依存し得る。
【００９５】
さらに、予防処置（例えば、ワクチン中）が望ましい場合、本発明の組成物が、一般的には、目的の病原体に一次感染する前に投与される。治療処置（例えば、症状または再発の減少）が望ましい場合、本発明の組成物は、一般には、一次感染の後に投与される。
【００９６】
（Ｃ．実験）
下記にあるのは、本発明を実行するための特定の実施形態の例である。これらの実施例は、例示目的のためのみに提供され、本発明の範囲を限定することはいかなるようにも意図されない。使用した数字（例えば、量、温度など）に関して、精度を確保する努力を行ったが、いくらかの実験誤差および偏差が、当然、許容されるべきである。
【実施例】
【００９７】
（実施例１：界面活性剤を有さないＰＬＧ粒子の調製）
ＩＫＡホモジナイザー（Ｇｅｒｍａｎｙ）の小プローブを使用して、２．５ｍｌのＰＢＳをジメチルクロライド中、６％のＲＧ５０３（ラクチド／グリコリドのモル比が５０：５０であり、３４，０００ダルトンの分子量を有するＰＬＧポリマー、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍから市販されている）１０ｍｌと共に２３，０００ｒｐｍで２分間、ホモジナイズする。この最初のｏ／ｗエマルジョンを５０ｍｌの脱イオン水に加え、次いで、Ｏｍｍｉベンチトップホモジナイザー（Ｌａｂ Ｔｅｋ Ｉｎｃ、ＵＳ）の１０ｍｍプローブを使用して、１５，０００ｒｐｍで３０分間、氷浴でホモジナイズする。ホモジナイズしている間に溶媒が蒸発するのを防ぐために、容器を液体中に挿入したホモジナイザーと共に、Ｔｅｆｌｏｎテープを用いて封をする。Ｔｅｆｌｏｎテープを取り外し、そしてこの２番目のｗ／ｏ／ｗエマルジョンを、溶媒が蒸発するように、一晩中攪拌し続ける。翌日、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｓｉｚｅｒを使用して、粒子サイズを測定する。サイズの範囲は、代表的には０．５〜１ミクロンである。
【００９８】
（実施例２：ＰＬＧに対して０．０５％ｗｔ：ｗｔおよび０．５％ｗｔ：ｗｔのＤＳＳを有するＰＬＧ粒子の調製）
ＩＫＡホモジナイザー（Ｇｅｒｍａｎｙ）の小プローブを使用して、２．５ｍｌのＰＢＳをジメチルクロライド中、６％のＲＧ５０３（ラクチド／グリコリドのモル比が５０：５０であり、３４，０００ダルトンの分子量を有するＰＬＧポリマー、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍから市販されている）１０ｍｌと共に２３，０００ｒｐｍで２分間、ホモジナイズする。この最初のｏ／ｗエマルジョンを６μｇ／ｍｌまたは６０μｇ／ｍｌのいずれかのＤＳＳを含む（それぞれ０．０５％および０．５％となる）脱イオン水（５０ｍｌ）に加える。次いで、これをＯｍｍｉベンチトップホモジナイザー（Ｌａｂ Ｔｅｋ Ｉｎｃ、ＵＳ）の１０ｍｍプローブを使用して、１５，０００ｒｐｍで３０分間、氷浴でホモジナイズする。ホモジナイズしている間に溶媒が蒸発するのを防ぐために、容器を液体中に挿入したホモジナイザーと共に、Ｔｅｆｌｏｎテープを用いて封をする。Ｔｅｆｌｏｎテープを取り外し、そしてこの２番目のｗ／ｏ／ｗエマルジョンを、溶媒が蒸発するように、一晩中攪拌し続ける。翌日、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｓｉｚｅｒを使用して、粒子サイズを測定する。サイズの範囲は、代表的には０．５〜１ミクロンである。
【００９９】
（実施例３：ＰＬＧ粒子（従来の処方物）の調製）
ＩＫＡホモジナイザー（Ｇｅｒｍａｎｙ）の小プローブを使用して、２．５ｍｌのＰＢＳをジメチルクロライド中、６％のＲＧ５０３（ラクチド／グリコリドのモル比が５０：５０であり、３４，０００ダルトンの分子量を有するＰＬＧポリマー、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍから市販されている）１０ｍｌと共に２３，０００ｒｐｍで２分間、ホモジナイズする。この最初のｏ／ｗエマルジョンを１％ｗｔ：ｖｏｌのＤＳＳを含む脱イオン水（５０ｍｌ）に加える。次いで、これをＯｍｍｉベンチトップホモジナイザー（Ｌａｂ Ｔｅｋ Ｉｎｃ、ＵＳ）の１０ｍｍプローブを使用して、１０，０００ｒｐｍで３分間、室温でホモジナイズする。この２番目のｗ／ｏ／ｗエマルジョンを、溶媒が蒸発するように、一晩中攪拌し続ける。翌日、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｓｉｚｅｒを使用して、粒子サイズを測定する。サイズの範囲は、代表的には０．５〜１ミクロンである。
【０１００】
（実施例４：ＰＬＧ処方物へのタンパク質の吸着）
０％ｗｔ：ｗｔ、０．０５％ｗｔ：ｗｔ、および０．５％ｗｔ：ｗｔのＤＳＳを有するように作製したＰＬＧ粒子（上の実施例１および２に由来）に、以下のようにして、髄膜炎Ｂ ２８７タンパク質（Ｃｈｉｒｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ、Ｓｉｅｎａ、Ｉｔａｌｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ第２８７巻、１８１６（２０００））を吸着させた：
０％、０．０５％、および０．５％のＤＳＳを有するＰＬＧ粒子への直接的な結合：
１− 実施例１および２のそれぞれの処方物の懸濁液容量を測定し、ＰＬＧの開始重量を総容量で割ることにより、ＰＬＧ含量を測定した。
２− それぞれの処方物について、２００ｍｇのＰＬＧを含む特定の容量を３０ｍｌの遠心分離チューブに移し、そして２ｍｇの２８７タンパク質を加えた。
３− １ｍｌの１００ｍＭクエン酸（ｐＨ４．７５）を加えることで、緩衝液を１０ｍＭのクエン酸に調整し、総容量をＤＩ水で１０ｍｌまで増やした。
４− チューブを、４℃で一晩中、ラボロッカー上で揺らし続けた。
５− 翌日、２ｍｌのアリコートを分析用に採取し、残りの懸濁液をバイアル中に分注した。それぞれ、１用量あたりのＰＬＧ上のタンパク質が１μｇまたは１０μｇのいずれかである１２回分の投与量を含んでいた。
６− 凍結乾燥させる前に、水中２５％ｗｔ：ｖｏｌのマンニトール溶液（２１６μｌ）を各バイアルに加えた。
【０１０１】
（実施例５：従来の方法によって作製したＰＬＧ／ＤＳＳ処方物へのタンパク質の吸着）
１− 実施例３の懸濁液を、２５０ｍｌの水を使用して、遠心分離によって、２回洗浄した。
２− ペレットを１５ｍｌのＤＩ水に再懸濁し、水浴ソニケーターで２分間、超音波処理した。
３− ５ｍｌの懸濁液（２００ｍｇのＰＬＧを含む）を３０ｍｌの遠心分離チューブに移し、そして２ｍｇの２８７タンパク質を加えた。
４− １ｍｌの１０×ＰＢＳを加えることで緩衝液を調整し、ＤＩ水で容量を１０ｍｌまで増やした。
５− 懸濁液を４℃で一晩中、ラブロッカー上で揺らし続けた。
６− 翌日、１ｍｌのアリコートを分析用に採取し、残りの懸濁液を１２Ｍｗｔ．〜１４Ｍｗｔ．のカットオフ透析チューブに移し、１回につき４ＬのＤＩ水を４回交換して透析した。
７− 総容量を測定し、１ｍｌのアリコートを分析用に採取した。残りの懸濁液をバイアルに分注した。それぞれ、ＰＬＧ上のタンパク質を１μｇまたは１０μｇのいずれかの量を含んでいた。
８− 凍結乾燥させる前に、ＤＩ水中２５％のマンニトール溶液（２１６μｌ）を各バイアルに加えた。
【０１０２】
（実施例６：特徴付け）
１− 各懸濁液（実施例４の工程５由来）の１ｍｌを、１２Ｍｗｔ〜１４Ｍｗｔ．のカットオフ透析チューブ中で１回につき４Ｌの水を２回交換して、一晩透析し、凍結乾燥した。
２− 各懸濁液（実施例４の工程５由来）の残りの１ｍｌおよび実施例５の工程６由来のアリコートを、３０ｍｌの水を使用して、遠心分離によって洗浄し、凍結乾燥した。
３− 実施例５の工程７由来の１ｍｌのアリコートを凍結乾燥した。
４− 上記の工程１、工程２、および工程３の凍結乾燥された処方物（各５ｍｇ）を、各１ｍｌの０．２Ｎ ＮａＯＨ／５％ ＳＤＳによって加水分解し、Ｍｉｃｒｏ ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ、ＵＳＡ製）によって、タンパク質含量を測定した。
５− 各１０ｍｇの未洗浄の粒子（上記の工程１および工程３由来）を１ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、３７℃で１時間、揺らし続けた。そして、Ｍｉｃｒｏ ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ、ＵＳＡ製）によって上清中のタンパク質を測定することによって、バーストリリース（ｂｕｒｓｔ ｒｅｌｅａｓｅ）を決定した。
【０１０３】
【表１】
（実施例７：インビボのデータ）
実施例４の工程５および実施例５の工程７由来のＰＬＧ粒子上に吸着されたタンパク質を１０μｇまたは１μｇのいずれか含む１００μｌによって、１０匹のＣＤ１マウスの群をそれぞれ、０週間、３週間、および５週間間隔で筋肉内注射により免疫し、５週目および７週目に血清を収集した。
【０１０４】
ＭｅｎＢ特異的抗体を測定するために設計された酵素連結イムノソルベントアッセイを、５週目と７週目のマウスの血清に対して行った。Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｕ底プレート（Ｎａｌｇｅｎｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を精製した２８７タンパク質（１μｇ／ｍｌ）でコートした。血清を１：１００希釈および１：４００希釈（その後、連続して３倍希釈される）で試験した。西洋ワサビペルオキシダーゼと結合体化した抗マウスＩｇＧヤギ抗体（１：４０，０００に希釈されたＣＡＬＴＡＧ）を二次抗体として使用した。３７℃で１時間のインキュベーションの後で、プレートを洗浄して、未結合の抗体を取り除いた。ＴＭＢ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＫＰＬ）基質を使用してプレートを発色させ、２Ｎ ＨＣｌを加えることにより、発色反応を１５分後に止めた。報告する力価（幾何平均力価（ＧＭＴ）および標準誤差（ＳＴＥ））は、４５０ｎｍで最適な光学濃度である０．５ ＥＬＩＳＡ吸収単位を示す血清の希釈率の逆数である。
【０１０５】
【表２】
本発明の好ましい実施形態をいくらか詳細に記載したが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、明らかな変更がなされ得ることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】図１は、本発明の微粒子組成物の生成に適切な装置の模式図である。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の陳述）
本願は、２００２年２月２０日出願の米国仮特許出願番号６０／３５８，３１５号（発明の名称「吸着したポリペプチド含有分子を有する微粒子」）に対する優先権を請求する。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、一般に、薬学的組成物に関する。特に、本発明は、界面活性剤を使用せずに形成される吸着したポリペプチド含有分子を有する生分解性微粒子に関し、そのような微粒子を調製するための方法に関し、そしてそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
粒子状キャリアは、十分な免疫応答を惹起する試みにおいて、吸着した抗原または捕捉した抗原とともに使用されている。そのようなキャリアは、複数のコピーの選択抗原を免疫系に提示し、局所リンパ節における抗原の捕捉および保持を促進する。これらの粒子は、マクロファージにより食菌され得、そしてサイトカイン放出を介して抗原提示を増強し得る。
【０００４】
例えば、共有に係る国際特許出願ＷＯ９８／３３４８７（ＰＣＴ／ＵＳ９８／０１７３８）および同時係属中の米国特許出願番号０９／０１５，６５２号（１９９８年１月２９日出願）は、免疫応答（細胞媒介性免疫応答を含む）を刺激するための抗原吸着微粒子および抗原カプセル化微粒子の使用、ならびにそれらの微粒子の生成方法を記載する。それらの微粒子を形成するために使用されるポリマーとしては、ポリ（ラクチド）およびポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（本明細書中で「ＰＬＧ」とも呼ばれる）が挙げられる。
【０００５】
共有に係る国際特許出願ＷＯ００／０６１２３（ＰＣＴ／ＵＳ９９／１７３０８）および同時係属中の米国特許出願番号０９／７１５，９０２号は、吸着した微粒子（ポリヌクレオチドおよびポリペプチド抗原を含む）を有する微粒子の生成方法を開示する。その微粒子は、例えば、ポリマー（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）（例えば、ＰＬＧ、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物など））を包含し、例えば、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、または非イオン性界面活性剤を使用して形成される。アニオン性界面活性剤を含む微粒子（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含むＰＬＧ微粒子）が、正荷電高分子（例えば、ポリペプチド）の使用のために提唱される。カチオン性界面活性剤を含む微粒子（例えば、ＣＴＡＢ（セトリミドまたはセチルトリメチルアンモニウムブロミドとしても公知）を含むＰＬＧ微粒子）が、負荷電高分子（例えば、ＤＮＡ）の使用のために提唱される。免疫応答（細胞媒介性免疫応答を含む）を刺激するためのそのような微粒子の使用もまた、開示される。
【０００６】
しかし、上記の参考文献の各々において、高分子吸着微粒子の調製の間に、１種以上の界面活性剤が使用される。不幸なことに、界面活性剤の使用は、数ある結果のうちでも製品登録の間にさらなる規制精査をもたらす、毒物学的問題を引き起こし得る。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明者らは、吸着したポリペプチド含有分子を有する微粒子が、界面活性剤の非存在下で形成され得ることを、思いもかけずに見出した。
【０００８】
例えば、本発明の第１局面によると、（ａ）ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物、およびポリシアノアクリレートからなる群より選択されるポリマーを含む、微粒子と、（ｂ）その微粒子に吸着したポリペプチド含有分子とを含む、生理活性微粒子組成物が提供される。この微粒子組成物は、アニオン性界面活性剤の非存在下で形成され、好ましくは、すべての界面活性剤（アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、および両性界面活性剤を含む）の非存在下で形成される。
【０００９】
好ましいポリマーは、ポリ（α−ヒドロキシ酸）であり、より好ましくは、ポリ（Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）、およびポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリドからなる群より選択されるポリ（α−ヒドロキシ酸）である。より好ましいのは、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）ポリマーである。好ましいポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）ポリマーは、２５：７５〜７５：２５（より好ましくは、４０：６０〜６０：４０）の範囲にあるラクチド／グリコリドモル比を有し、かつ１０，０００ダルトン〜１００，０００ダルトン（より好ましくは、３０，０００ダルトン〜７０，０００ダルトン）の範囲にある分子量を有する、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）ポリマーである。
【００１０】
好ましい生理活性ポリペプチド含有分子としては、細菌抗原およびウイルス抗原が挙げられる。ＨＩＶ抗原（例えば、ｇｐ４１抗原、ｇｐ１２０抗原、ｇｐ１４０抗原、ｐ２４ｇａｇ抗原、およびｐ５５ｇａｇ抗原）、髄膜炎Ｂ群抗原（例えば、髄膜炎Ｂ群抗原組換えタンパク質２８７抗原）、鎖球菌抗原（例えば、Ｂ群連鎖球菌抗原）、およびインフルエンザＡ型赤血球凝集素抗原が、特に好ましい。
【００１１】
いくつかの実施形態において、さらなる生理活性高分子を備えた微粒子組成物が、提供され、そのさらなる生理活性高分子は、この微粒子に結合されていても結合されていなくてもよく、かつポリマー内に捕捉さえされてもよい。例えば、この微粒子組成物は、アジュバント（特に、Ｔｈ１刺激アジュバント）を備えて提供され得る。好ましいアジュバントとしては、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ＬＴＫ６３、ＬＴＲ７２、ＭＰＬ、アミノアルキルグルコサミニドアミノアルキルグルコサミド４−リン酸（ＡＧＰ）、イミダゾキノリンアジュバント、リポ多糖模倣アジュバント、ＱＳ２１、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）およびアルミニウム塩（リン酸アルミニウムを含む）が挙げられる。
【００１２】
本発明の別の局面によると、薬学的に受容可能な賦形剤が、上記の微粒子組成物に添加される。
【００１３】
本発明の別の局面は、脊椎動物被検体にポリペプチド含有分子を送達する方法に関し、この方法は、上記微粒子組成物を、その脊椎動物被検体に投与する工程を包含する。
【００１４】
本発明の他の局面において、上記微粒子組成物は、疾患の診断において、疾患の処置において、ワクチンにおいて、そして／または免疫応答の惹起において、使用される。
【００１５】
例えば、さらなる局面において、本発明は、脊椎動物被検体において細胞性免疫応答および／または体液性免疫応答を惹起するための方法に関し、この方法は、治療有効量の上記微粒子組成物を脊椎動物被検体に投与する工程を包含する。
【００１６】
本発明の別の局面は、免疫方法に関し、この方法は、治療有効量の上記微粒子組成物を脊椎動物被検体に投与する工程を包含する。
【００１７】
本発明のなお他の局面は、微粒子の生成方法に関する。一般に、これらの方法は、（ａ）（ｉ）ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクタム、ポリオルトエステル、ポリ無水物、およびポリシアノアクリレートからなる群より選択されるポリマーと、（ｉｉ）有機溶媒と、（ｉｉｉ）水とを含むエマルジョンを形成する工程；ならびにその後、（ｂ）上記有機溶媒の除去を包含する。この方法は、アニオン性界面活性剤を含まない組成物を使用して実行され、好ましくは、すべての界面活性剤（アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、および両性界面活性剤を含む）を含まない。
【００１８】
好ましくは、このエマルジョンは、水中油中水エマルジョンであり、この水中油中水エマルジョンは、（ａ）ポリマーと有機溶媒とを含む有機相を、水を含む第１水相を用いて乳化して、油中水エマルジョンを形成する工程；ならびに（ｂ）水を含む第２水相を、上記工程（ａ）において形成されたエマルジョンを用いて乳化して、水中油中水エマルジョンを形成する工程、を包含するプロセスによって形成される。一般に、これらの微粒子組成物は、その後、生理活性ポリペプチド含有分子（例えば、上記に考察される生理活性ポリペプチド含有分子）と混合されて、生理活性組成物を生成する。
【００１９】
上記のような二重乳化技術が好ましいが、一重乳化技術もまた、本発明の微粒子組成物を形成するために使用され得る。
【００２０】
本発明のなお他の局面は、微粒子組成物を生成する方法に関し、この方法は、（１）乳化プロセスにおいて微粒子を形成する工程であって、この微粒子は、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクタム、ポリオルトエステル、ポリ無水物、およびポリシアノアクリレートからなる群より選択されるポリマーを含む、工程；ならびに（２）生理活性ポリペプチド含有分子をその微粒子表面上に吸着させる工程、を包含する。この方法は、アニオン性界面活性剤を含まない組成物を使用して実行され、好ましくは、すべての界面活性剤（アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、および両性界面活性剤を含む）を含まない。
【００２１】
本発明の利点は、ヒト投与のための微粒子組成物（特に、吸着したポリペプチド含有分子を含む、ヒト投与のための微粒子組成物）が、界面活性剤を使用することなく形成され得ることである。界面活性剤がないことは、有益である。それは、とりわけ、界面活性剤の添加が毒性の問題を惹起し、この問題は、本発明の微粒子組成物により克服されるからである。
【００２２】
本発明のこれらおよび他の実施形態、局面、および利点は、本明細書中の開示を考慮して、当業者に心に容易に浮かぶ。
【００２３】
（発明の詳細な説明）
本発明の粒子は、他に記載されない場合、当該分野の技術内で、化学、重合科学、生化学、分子生物学、免疫学および薬学の従来の方法を使用する。このような技術は、文献内で十分に説明されている。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．Ｋａｐｌａｎ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編，１９８６，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版，１９８９）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｄ Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｂｉｒｄｉ，Ｋ．Ｓ．編，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９７）およびＳｅｙｍｏｕｒ／Ｃａｒｒａｈｅｆ’ｓ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第４版，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ．，１９９６）を参照のこと。
【００２４】
本明細書中（上述または下述のいずれか）に引用される、全ての出版物、特許および特許出願は、それらの全体が、参考として本明細書により援用される。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容が他に明確に記載しない限り、複数の参照を含む。従って、例えば、用語「微粒子」とは、１つ以上の微粒子を言うなど。
【００２６】
（Ａ．定義）
本発明の記載において、以下の用語が利用され、そして以下に指示されるように定義されることが意図される。
【００２７】
他に記載されない限り、本明細書中の全てのパーセントおよび割合は、重量基準で示される。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、用語「微粒子」とは、約１０ｎｍ〜約１５０μｍの直径、より好ましくは、約２００ｎｍ〜約３０μｍの直径、そして最も好ましくは、約５００ｎｍ〜約１０μｍの直径の粒子を言う。好ましくは、微粒子は、針およびキャピラリーを塞ぐことなく、非経口投与または粘膜投与を可能にする直径である。微粒子のサイズは、当該技術で周知の技術（例えば、光子相関分光法、レーザー回折法および／または走査型電子顕微鏡）によって、容易に決定される。用語「粒子」はまた、本明細書中で規定されるような微粒子を示すために使用され得る。
【００２９】
本明細書中での使用のためのポリマー微粒子としては、滅菌可能、非毒性、および生分解性である材料から形成される。このような材料としては、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ＰＡＣＡ、およびポリシアノアクリレートが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、本発明とともに使用するための微粒子としては、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、特にポリ（ラクチド）（「ＰＬＡ」）またはＤ，Ｌ−ラクチドおよびグリコリドのコポリマーまたはグリコール酸（例えば、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（「ＰＬＧ」）、またはＤ，Ｌ−ラクチドおよびカプロラクトンのコポリマーから誘導されるポリマー微粒子である。ポリマー微粒子は、種々の分子量および、コポリマー（例えば、ＰＬＧ）の場合、種々のラクチド：グリコリドの比を有する任意の種々のポリマー出発材料に由来し得、これらの選択は、大部分は、同時投与されるポリペプチド含有分子に一部依存する、選択の問題である。これらのパラメータは、以下により十分に考察される。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、用語「界面活性剤」としては、洗浄剤、分散剤、懸濁剤、および乳化安定剤が挙げられる。微粒子処方物における使用のために、過去に提唱されたアニオン性界面活性剤としては、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、ＳＬＳ（ラウリル硫酸ナトリウム）、ＤＳＳ（ジスルホスクシナート）、硫酸化脂肪アルコールなどが挙げられるが、これらに限定されない。提唱されるカチオン性界面活性剤は、セトリミド（セチルトリメチル臭化アンモニウム、すなわち「ＣＴＡＢ」）、塩化ベンザルコニウム、ＤＤＡ（ジメチルジオクトデシル臭化アンモニウム）、ＤＯＴＡＰ（ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン）などが挙げられるが、これらに限定されない。提唱される非イオン性表面活性剤としては、ＰＶＡ、ポビドン（ポリビニルピロリドンすなわちＰＶＰとしてもまた知られる）、ソルビタンエステル、ポリソルビタン、ポリオキシエチル化グリコールモノエーテル、ポリオキシエチル化アルキルフェノール、ポリオキサマーなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、組成物が、わずかな量の界面活性剤のみ、または不純物量の界面活性剤のみを含む場合、組成物は「界面活性剤が無い」または組成物内に「界面活性剤の非存在」である。本明細書中で使用される場合、界面活性剤の「わずかな」量とは、組成物が、０．００００１：１未満の界面活性剤：ポリマー比（重量：重量）を含有することを意味する。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、用語「高分子」とは、医薬品、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ポリペプチド含有分子、ホルモン、酵素、転写メディエータまたは翻訳メディエータ、代謝経路における中間体、免疫調節薬、抗原、アジュバント、またはそれらの組み合わせを言うが、これらに限定されない。
【００３３】
用語「医薬品」とは、以下により詳細に考察される、生物学的に活性な化合物（例えば、抗生物質、抗ウイルス剤、増殖因子、ホルモンなど）を言う。
【００３４】
用語「アジュバント」とは、医薬品の活性を補助または改変する任意の物質を言い、免疫学的アジュバント（抗原に対する免疫応答を増加または多様化する）が挙げられるが、これに限定されない。
【００３５】
「ポリヌクレオチド」は、核酸ポリマーであり、この核酸ポリマーは、代表的に、生物学的に活性な（例えば、免疫原性または治療的）タンパク質またはポリペプチドをコードする。ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの性質に依存して、ポリヌクレオチドは、少なくとも１０ヌクレオチド（例えば、ここで、ポリヌクレオチドは、抗原をコードする）を含み得る。さらに、「ポリヌクレオチド」は、２本鎖配列と１本鎖配列の両方を含み得、そしてウイルス、原核生物のｍＲＮＡまたは真核生物に由来するｃＤＮＡ、ウイルス（例えば、ＲＮＡウイルスおよびＤＮＡウイルスならびにレトロウイルス）または原核生物ＤＮＡ由来のゲノムＲＮＡ配列およびゲノムＤＮＡ配列、および特に合成ＤＮＡ配列が挙げられるが、これらに限定されない。この用語はまた、任意のＤＮＡおよびＲＮＡの公知の塩基アナログを含む配列を表現する。この用語はさらに、天然配列に対して、好ましくは核酸分子が治療タンパク質または抗原性タンパク質をコードするような、改変（例えば、欠失、付加および置換（一般的に天然で保存的））を含む。これらの改変は、部位特異的突然変異誘発を介するように検討され得るか、または偶発的（例えば、抗原を生成する宿主の変異を介して）であり得る。
【００３６】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」とは、アミノ酸残基のポリマーを言い、そして産物の最小の長さに限定されない。従って、ペプチド、オリゴペプチド、ダイマー、マルチマーなどは、定義内に含まれる。全長タンパク質およびそのフラグメントの両方は、定義により含まれる。この用語はまた、ネイティブ配列に対して、好ましくはタンパク質が、免疫応答を誘発する能力を維持するか、またはこのタンパク質が投与される被験体において治療的効果を有するような、改変（例えば、欠失、付加および置換（一般的に天然で保存的））を含む。
「抗原」は、抗原が本発明に従って提示される場合の細胞性抗原特異的免疫応答、または体液性抗体応答を成すための宿主の免疫システムを刺激し得る、１つ以上のエピトープを含む分子を意味する。抗原は、それ自身によってか、または別の分子と組み合わせて存在する場合、細胞性応答または体液性応答を誘発し得る。正常に、エピトープは、約３〜１５アミノ酸、一般的には約５〜１５アミノ酸の間を含む。所定のタンパク質のエピトープは、当該分野で周知である、任意の数のエピトープマッピング技術を用いて同定され得る。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６（Ｇｌｅｎｎ Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ編，１９９６）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙを参照のこと。例えば、線状エピトープは、例えば、固体支持体上の多くのペプチド、そのタンパク質分子の部分に対応するペプチドを同時合成し、そしてペプチドが支持体になお接着されている間、ペプチドを抗体と反応させることにより、決定され得る。このような技術は、当該分野で公知であり、そして例えば、米国特許第４，７０８，８７１号；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３９９８−４００２；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８６）Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：７０９−７１５（全てそれらの全体が、参考として本明細書中に援用される）において記載される。同様に、コンフォメーショナルエピトープは、例えば、Ｘ線結晶学および２次元核磁気共鳴を用いて、アミノ酸の特異的なコンフォメーションを決定することによって、容易に同定され得る。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（上述）を参照のこと。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、用語「抗原」は、両方のサブユニット抗原（すなわち、抗原が天然で結合される全生物体、ならびに殺傷した、弱毒化した、また非活性化した細菌、ウイルス、寄生虫または他の微生物から分離された抗原）を示す。抗体（例えば、抗イディオタイプ抗体、またはそれらのフラグメント）および合成ペプチドミモトープ（抗原または抗原決定基を模倣し得る）はまた、本明細書中で使用される場合、抗原の定義において、表現され得る。同様に、治療タンパク質または免疫原タンパク質を発現するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、あるいはインビボ（例えば、遺伝子治療および核酸免疫化適用）の抗原決定基はまた、本明細書中で、抗原の定義中に含まれる。
【００３８】
さらに、本発明の目的のために、抗原は、任意の種々の公知のウイルス、細菌、寄生虫および真菌、ならびに任意の種々の腫瘍抗原に由来し得る。さらに、本発明の目的のために、「抗原」とは、そのタンパク質が免疫学的応答を誘発する能力を維持する限り、天然配列に対する改変（例えば、欠失、付加および置換（一般的に天然で保存的））を含むタンパク質をいう。これらの改変は、部位特異的突然変異誘発を介するとして検討され得るか、または偶発的（例えば、抗原を生成する宿主の変異を介して）であり得る。
【００３９】
抗原または組成物に対する「免疫学的応答」は、目的の組成物中に存在する分子に対する体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答の、被験体における発生である。本発明の目的のために、「体液性免疫応答」とは、抗体分子により媒介される免疫応答を言い、一方「細胞性免疫応答」とは、Ｔ−リンパ球および／または他の白血球細胞により媒介される免疫応答である。細胞性免疫の１つの重要な局面は、細胞溶解性Ｔ細胞（「ＣＴＬ」）による、抗原特異的な応答を含む。ＣＴＬは、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）によりコードされ、そして細胞の表面上で発現される、タンパク質と関連して提示されるペプチド抗原に対して特異性を有する。ＣＴＬは、細胞内微生物の細胞内破壊、またはこのような微生物に感染した細胞の溶解を助け、誘導し、そして促進する。細胞性免疫の別の局面は、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的応答を含む。ヘルパーＴ細胞は、この機能を刺激することを補助するように作用し、そしてそれらの表面上のＭＨＣ分子と結合して、ペプチド抗原を示す細胞に対して、非特異的エフェクター細胞の活性を集中する。「細胞性免疫応答」はまた、サイトカイン、ケモカインならびに、活性化Ｔ細胞および／または他のこのような白血球（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に由来する白血球を含む）により生成される他の分子の産生を言う。
【００４０】
細胞性免疫応答を誘発する、組成物（例えば、免疫原性組成物）またはワクチンは、細胞表面でＭＨＣ分子結合する抗原の提示により、脊椎動物被験体を感作するようにはたらき得る。細胞性媒介免疫応答は、それらの表面で、抗原を提示する細胞に、またはその近くに指向される。さらに、抗原特異的Ｔリンパ球が、生成され、免疫化宿主の将来の保護を可能にし得る。
【００４１】
細胞性媒介免疫学的応答を刺激するような、特定の抗原または組成物の能力は、感作された被験体中の抗原に特異的なＴリンパ球をアッセイするか、または、抗原での再刺激に応じたＴ細胞によるサイトカイン産生の測定による、多くのアッセイ（例えば、リンパ球増殖（リンパ球活性化）アッセイ、ＣＴＬ細胞傷害性細胞アッセイ）によって決定され得る。このようなアッセイは、当該分野で周知である。例えば、Ｅｒｉｃｋｓｏｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）１５１：４１８９−４１９９；Ｄｏｅら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４：２３６９−２３７６を参照のこと。
【００４２】
従って、本明細書で使用されるように、免疫応答は、ＣＴＬの産生、および／またはヘルパーＴ細胞の産生もしくは活性化を刺激するものであり得る。目的の抗原もまた、抗体媒介性の免疫応答を誘発し得る。従って、免疫応答は、１つ以上の以下の効果を含み得る：Ｂ細胞による抗体の産生；ならびに／あるいは抑制Ｔ細胞および／または目的の組成物またはワクチン中に存在する抗原（１つまたは複数）に特異的に指向されるγδ Ｔ細胞の活性化。これらの応答は、感染性を中和し、そして／あるいは抗体−補体、または抗体依存性の細胞毒性（ＡＤＣＣ）を媒介し、免疫化された宿主に対する保護を提供する役割を果たし得る。このような応答は、当該分野で周知の標準的な免疫学的検定および中和アッセイを用いて決定され得る。
【００４３】
微粒子に吸着した選択された抗原を含む組成物は、微粒子と共に送達されない場合の当量の抗原によって誘発される免疫応答よりも、より大きな免疫応答を誘発する能力を有する場合、「高められた免疫原性」を示す。従って、組成物は、微粒子への吸着の効力によってより強く免疫原性であるか、またはより低い用量の抗原が、投与された被検体における免疫応答を達成するのに必要とされるので、「高められた免疫原性」を示し得る。このような高められた免疫原性は、動物に対する微粒子／抗原組成物および抗原コントロールを投与し、そして、例えば、当該分野で周知の標準アッセイ（例えば、放射免疫測定およびＥＬＩＳＡ）を用いて、これらの２つに対する抗体力価を比較することによって、決定され得る。
【００４４】
本明細書で提供される組成物の「有効量」、「治療的有効量」または「薬学的有効量」との用語は、目的の状態を処置または診断するのに十分な組成物の量をいう。例えば、これらの発現は、所望の応答（例えば、免疫応答）および対応する予防効果または治療効果を提供するのに十分な量、あるいは治療タンパク質の送達の場合、以下に既定されるように、被検体の処置に影響を与えるのに十分な量をいい得る。以下に指摘されるように、必要とされる正確な量は、被検体の種、年齢、および全身状態、ならびに処置される状態の重篤度、目的の特定のポリペプチド、投与の様式などによって、被検体ごとに変動する。任意の個体の場合における適切な「有効」量は、当業者によって、日常的な実験を用いて決定され得る。
【００４５】
「脊椎動物被験体」とは、亜門網（ｓｕｂｐｈｙｌｕｍ ｃｏｒｄａｔａ）の任意のメンバーを意味し、これらのメンバーとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：哺乳動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウマ、およびヒト）；家畜（例えば、イヌおよびネコ）；ならびに飼い馴らされた鳥、野鳥および狩猟鳥含むトリ（例えば、ヒヨコを含む雄鶏および雌鶏、七面鳥ならびに他の家禽のトリ）。この用語は、特定の年齢を意味しない。従って、成熟動物および新生仔動物が対象とされることを意図する。
【００４６】
「薬学的に受容可能」または「薬理学的に受容可能」とは、生物学的でないかさもなければ所望でない物質を意味する。例えば、「薬学的に受容可能な」物質は、個体において任意の所望でない生物学的影響引き起こすことも、組成物中に含まれる任意の成分と有害な相互作用を起こすこともなく、微粒子処方物と共に個体に投与され得る。
【００４７】
「賦形剤」との用語は、完成された投薬形態で一般に提供される物質をいい、ビヒクル、結合剤、崩壊剤、充填剤（希釈剤）、潤滑剤（ｌｕｂｒｉｃａｎｔ）、潤滑剤（ｇｌｉｄａｎｔ）（流動促進剤）、圧縮補助剤、色素、甘味料、保存料、懸濁／分散剤、フィルム形成剤／コーティング剤、香料および印刷用インクが挙げられる。
【００４８】
「生理的ｐＨ」または「生理的範囲のｐＨ」とは、約７．２〜８．０を含む範囲のｐＨを意味し、より代表的には、約７．２〜７．６を含む範囲のｐＨを意味する。
【００４９】
本明細書中で使用される場合、「処置」（そのバリエーション、例えば、「処置する」または「処置した」を含む）とは、（ｉ）従来のワクチンにおいて見られるような、感染または再感染の予防、（ｉｉ）症状の低減または排除、および（ｉｉｉ）問題の病原体または障害の実質的な排除または完全な排除、のいずれかをいう。処置は、予防的に（感染前に）または治療的に（感染後に）影響を及ぼし得る。
【００５０】
本明細書中で使用される場合、「核酸」との句は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらから形成されるキメラをいう。
【００５１】
本明細書中で使用される場合、句「少なくとも１つのＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド」とは、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを含むポリヌクレオチドをいう。少なくとも１つのＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドは、複数のＣｐＧモチーフを含み得る。これらのオリゴヌクレオチドはまた、当該分野で「ＣｐＧオリゴヌクレオチド」としても公知である。本明細書中で使用される場合、「ＣｐＧモチーフ」との句は、グアニンヌクレオチドが後に続くシトシンヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドのジヌクレオチド部分をいう。５−メチルシトシンもまた、シトシンの代わりに使用され得る。
【００５２】
本発明のいくつかの実施形態に従って、ウイルス感染、真菌感染、マイコプラズマ感染、細菌感染、または原生動物感染、ならびに腫瘍に対して宿主動物を処置する（予防的におよび／または治療的に免疫することを含む）組成物および方法が提供される。本発明の方法は、哺乳動物、好ましくはヒトに、予防的および／または治療的に免疫を与えるのに有用である。本発明の方法はまた、ヒト以外の哺乳動物（生物医学的研究用途を含む）に対しても行われ得る。
【００５３】
（Ｂ．一般的な方法）
驚くべきことに、本発明者らは、微粒子が形成され得、そして、この微粒子へのポリペプチド含有分子の良好な吸着が、界面活性剤を用いることなく達成され得ることを見出した。結果として、広範種々の疾患の予防的または治療的な処置および／または診断のために、本発明の微粒子／ポリペプチド含有分子組成物を送達システムとして用いて、生物学的に活性なポリペプチド含有分子を被験体に送達し得る。理論に束縛されることは望まないが、本発明と組み合わせて使用されるポリマー物質（例えば、ＰＬＧ）は、代表的に、負に荷電した基を有し、この基が本発明の微粒子に正味の負の電荷を与えると考えられる。この純粋な負の電荷が、微粒子内の反発をもたらし、微粒子の形成時に、微粒子を安定化させる。さらに、この電荷はまた、ポリペプチド含有分子の正に荷電した領域を引き付け、ポリペプチド含有分子の微粒子への吸着を改善する。
【００５４】
本願内の多くの例示的な実施形態は、吸着されたポリペプチド含有分子を有する微粒子を含有する組成物に関する。
【００５５】
本発明は、広範種々の高分子の送達と組み合わせて使用され得、これらの高分子としては、医薬品（例えば、抗生物質および抗ウイルス剤、非ステロイド性抗炎症薬、鎮痛剤、血管拡張剤、心血管薬、向神経薬、神経遮断薬、抗うつ剤、抗パーキンソン薬、βブロッカー、カルシウムチャネルブロッカー、ブラジキニンインヒビター、ＡＣＥインヒビター、血管拡張剤、プロラクチンインヒビター、ステロイド、ホルモンアンタゴニスト、抗ヒスタミン剤、セロトニンアンタゴニスト、ヘパリン、化学治療剤、抗血管新生剤および増殖因子（ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２が挙げられるがこれらに限定されない）、ＦＧＦ、治療的タンパク質または免疫原性タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ワクチンにおける使用のための免疫原性タンパク質およびそのエピトープ、ホルモン（ペプチドホルモン（例えば、インスリン、プロインスリン）、成長ホルモン（例えば、ＨＲＨ、ＬＨＲＨ、ＥＧＦ、ソマトスタチン、ＳＮＸ−１１１、ＢＮＰ）、インスリン分泌トロピン（ＡＮＰ、ＦＳＨ、ＬＨ、ＰＳＨおよびｈＣＧ）、性腺刺激ホルモン（アンドロゲン、エストロゲンおよびプロゲステロン）、甲状腺刺激ホルモン（インヒビン、コレシストキニン、ＡＣＴＨ、ＣＲＦ、ダイノルフィン、エンドルフィン、エンドセリン、フィブロネクチンフラグメント、ガラニン、ガストリン、インスリン分泌トロピン、グルカゴン、ＧＴＰ結合タンパク質フラグメント、グアニリン、ロイコキニン、マガイニン（ｍａｇａｉｎｉｎ）、マストパラン、デルマセプチン（ｄｅｒｍａｓｅｐｔｉｎ）、システミン、ニューロメディン、ニューロテンシン、膵臓スタチン、膵臓ポリペプチド、サブスタンスＰ、セレクチン、サイモシンなど）、酵素、転写媒介物質または翻訳媒介物質、代謝経路における中間体、免疫調節因子（例えば、種々の任意のサイトカイン（インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、およびγ−インターフェロンを含む）、抗原およびアジュバントが挙げられる））。
【００５６】
本発明は、被験体へのポリペプチド含有分子の送達に、特によく適する。いくつかの特定の好ましい実施形態において、このポリペプチド含有分子は、ポリペプチド抗原分子である。吸着されたポリペプチド抗原分子を有する微粒子の１つの利点は、それらの示される、脊椎動物の被験体において細胞媒介性の免疫応答を生じる能力である。従って、従来の抗体応答に加え、本明細書中に記載されるシステムが、例えば、発現される抗原とＭＨＣクラスＩ分子との会合を提供し得、その結果、ＣＴＬの産生を刺激して、抗原の将来の認識を可能にする、目的の抗原へのインビボ細胞性免疫応答が増加され得る。さらに、この方法は、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的な応答を誘発し得る。従って、本発明の方法は、細胞性および／または体液性免疫応答が所望される任意のポリペプチド含有分子（好ましくは、抗体、ヘルパーＴ細胞エピトープおよび細胞障害性Ｔ細胞エピトープを誘導し得る、ウイルス病原体および細菌病原体由来の抗原）による使用を見出す。このような抗原としては、ヒトおよび動物のウイルスによりコードされるものが挙げられるがこれらに限定されず、そして、構造的タンパク質または非構造的タンパク質のいずれかに対応し得る。
【００５７】
従って、本発明の抗原／微粒子の、選択された抗原に対する細胞媒介性の免疫応答を誘発する能力は、広範種々の病原体による感染に対する強力なツールを提供する。従って、本発明の抗原／微粒子組成物は、ワクチン組成物に組み込まれ得る。
【００５８】
本発明の微粒子は、通常、乏しい免疫応答を誘発する細胞内ウイルスに対する免疫に、特に有用である。例えば、本発明は、疱疹ウイルスファミリー由来の広範な種々のポリペプチドに対する免疫応答を刺激する使用を見出し、これらのポリペプチドとしては、以下が挙げられる：単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）１型および２型（例えば、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２）由来のタンパク質、糖タンパク質ｇＢ、ｇＤおよびｇＨ；水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（ＣＭＶ ｇＢおよびＣＭＶ ｇＨを含む）由来の抗原；ならびに他のヒト疱疹ウイルス（例えば、ＨＨＶ６およびＨＨＶ７）由来の抗原。（例えば、サイトメガロウイルスの内容をコードするタンパク質の総説については、Ｃｈｅｅら、Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ（Ｊ．Ｋ．ＭｃＤｏｕｇａｌｌ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ １９９０）ｐｐ．１２５−１６９；種々のＨＳＶ−１コードタンパク質の考察については、ＭｃＧｅｏｃｈら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）６９：１５３１−１５７４；ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２ ｇＢおよびＨＳＶ−２ ｇＤのタンパク質ならびにそれらをコードする遺伝子の考察については、米国特許５，１７１，５６８号；ＥＢＶゲノムにおけるタンパク質コード配列の同定については、Ｂａｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）３１０：２０７−２１１；ならびに、ＶＺＶの総説については、ＤａｖｉｓｏｎおよびＳｃｏｔｔ、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）６７：１７５９−１８１６を参照のこと）。
【００５９】
肝炎ウイルスファミリー（Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、δ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）およびＧ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）を含む）由来の抗原はまた、本明細書中に記載される技術において簡便に使用され得る。例として、配列を得るための方法として、ＨＣＶのウイルスゲノム配列が公知である。例えば、国際公開番号ＷＯ ８９／０４６６９；ＷＯ ９０／１１０８９；およびＷＯ ９０／１４４３６を参照のこと。ＨＣＶゲノムは、いくつかのウイルスタンパク質（Ｅ１（Ｅとしても公知）およびＥ２（Ｅ２／ＮＳＩとしても公知）ならびにＮ−末端ヌクレオカプシドタンパク質（「コア」と称される）が挙げられる）をコードする。（ＨＣＶタンパク質（Ｅ１およびＥ２を含む）の考察については、Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（１９９１）１４：３８１−３８８を参照のこと）。これらのタンパク質の各々ならびにその抗原性フラグメントは、本発明の組成物および方法において使用を見出す。
【００６０】
同様に、ＨＤＶ由来のδ抗原の配列は既知であり（例えば、米国特許第号５，３７８，８１４を参照のこと）、そしてこの抗原はまた、本発明の組成物および方法において簡便に使用され得る。さらに、ＨＢＶ由来の抗原（例えば、コア抗原、表面抗原、ｓＡｇ）、ならびに前表面（ｐｒｅｓｕｒｆａｃｅ）配列（ｐｒｅ−Ｓ１およびｐｒｅ−Ｓ２（以前にｐｒｅ−Ｓと呼ばれる））、ならびに上記の組み合せ（例えば、ｓＡｇ／ｐｒｅ−Ｓ１、ｓＡｇ／ｐｒｅ−Ｓ２、ｓＡｇ／ｐｒｅ−Ｓｌ／ｐｒｅ−Ｓ２およびｐｒｅ−Ｓｌ／ｐｒｅ−Ｓ２）は、本明細書中における使用を見出す。例えば、ＨＢＶ構造の考察については「ＨＢＶ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｔｏ ｌｉｃｅｎｓｅ：ａ ｃａｓｅ ｓｔｕｄｙ」、Ｍａｃｋｅｔｔ，Ｍ．およびＷｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．、Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ，ｐｐ．１５９−１７６；ならびに米国特許第４，７２２，８４０号、同第５，０９８，７０４号、同第５，３２４，５１３号（その全体が本明細書中に参考として援用される）；Ｂｅａｍｅｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９５）６９：６８３３−６８３８、Ｂｉｒｎｂａｕｍら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．（１９９０）６４：３３１９−３３３０；ならびにＺｈｏｕら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９１）６５：５４５７−５４６４を参照のこと。
【００６１】
他のウイルス由来の抗原もまた、本発明の組成物および方法において使用を見出す：例えば、限定されないが、とりわけ、以下のファミリーのメンバー由来のタンパク質である：Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ポリオウイルスなど）；Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ；Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、風疹ウイルス、デング熱ウイルスなど）；Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ；Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ；Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ；Ｒｈａｂｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、狂犬病ウイルスなど）；Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、ＲＳウイルスなど）；Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、インフルエンザウイルスＡ型、Ｂ型およびＣ型など）；Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ；Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ；Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｄａｅ（例えば、ＨＴＬＶ−Ｉ；ＨＴＬＶ−ＩＩ；ＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶ、ＡＲＶ、ｈＴＬＲなどとしてもまた公知））（これらとしては以下が挙げられるがこれらに限定されない：単離体ＨＩＶＩＩＩｂ、ＨＩＶＳＦ２、ＨＩＶＬＡＶ、ＨＩＶＬＡＩ、ＨｌＶＭＮ由来の抗原）；ＨＩＶ−ＩＣＭ２３５、ＨＩＶ−１ＵＳ４；ＨＩＶ−２；サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ））。さらに、抗原はまた、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）およびダニ媒介性脳炎ウイルス由来であり得る。例えば、これらのウイルスおよび他のウイルスの説明について、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第３版（Ｗ．Ｋ．Ｊｏｋｌｉｋ編、１９８８）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２版（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編、１９９１）を参照のこと。
【００６２】
より具体的には、上記のＨＩＶ単離体（ＨＩＶの種々の遺伝的サブタイプのメンバーを含む）のいずれか由来のｇｐ１２０エンベロープタンパク質またはｇｐ１４０エンベロープタンパク質は公知であり、かつ報告されており（種々のＨＩＶ単離体のエンベロープ配列の比較については、例えば、Ｍｙｅｒｓら、Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ，Ｎｅｗ Ｍｅｘｉｃｏ（１９９２）；Ｍｙｅｒｓら、Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ａｎｄ Ａｉｄｓ，１９９０，Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ，Ｎｅｗ Ｍｅｘｉｃｏ：Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；およびＭｏｄｒｏｗら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．（１９８７）６１：５７０−５７８を参照のこと）、そして、これらの単離体のいずれか由来の抗原が、本発明の方法における使用を見出す。さらに、本発明は、種々のエンベロープタンパク質（例えば、ｇｐ１６０およびｇｐ４１）、ｇａｇ抗原（例えば、ｐ２４ｇａｇおよびｐ５５ｇａｇ）ならびにｐｏｌ領域およびｔａｔ領域由来のタンパク質のいずれかを含む、種々のＨＩＶ単離体のいずれか由来の他の免疫原性タンパク質に、等しく適用可能である。
【００６３】
インフルエンザウイルスは、本発明が特に有用であるウイルスの別の例である。特に、インフルエンザＡのエンベロープ糖タンパク質ＨＡおよびＮＡは、免疫応答を惹起するために特に目的とするものである。インフルエンザＡの多数のＨＡサブタイプが同定されている（Ｋａｗａｏｋａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９０）１７９：７５９−７６７；Ｗｅｂｓｔｅｒら、「Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ａｍｏｎｇ ｔｙｐｅ Ａ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓｅｓ」、ｐ．１２７−１６８：Ｐ．ＰａｌｅｓｅおよびＤ．Ｗ．Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ（編）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。従って、これらの単離体のいずれか由来のタンパク質はまた、本明細書中に記載される組成物および方法において使用され得る。
【００６４】
本明細書中に記載される組成物および方法はまた、多数の細菌抗原（例えば、ジフテリア、コレラ、結核、破傷風、百日咳、髄膜炎および他の病理的状態（限定することなく、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｙ）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉおよびＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｙａｆｌｕｅｎｚａ、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｂ型（ＨＩＢ）、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）ならびにこれらの組み合せを引き起こす生物由来の抗原）を伴う使用を見出す。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ Ｂ由来の抗原の例は、以下の共有に係る特許出願に開示される：ＰＣＴ／ＵＳ９９／０９３４６；ＰＣＴ ＩＢ９８／０１６６５；およびＰＣＴ ＩＢ９９／００１０３。寄生虫抗原の例としては、マラリアおよびライム病を引き起こす生物由来の抗原が挙げられる。
【００６５】
本願のいずれかに列挙される抗原を必ずしも排除しない、さらなる抗原としては以下が挙げられる：
− Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ由来のタンパク質抗原（例えば、以下の参考文献１〜７におけるもの）。
− Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ由来の外膜小胞（ＯＭＶ）調製物（例えば、以下の参考文献８、９、１０、１１などに開示されるもの）。
− Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５および／またはＹ由来の糖類抗原（例えば、血清型Ｃ由来の、以下の参考文献１２に開示されるオリゴ糖類（参考文献１３もまた参照のこと））。
− Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の糖類抗原（例えば、参考文献１４、１５、１６）。
− Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来の抗原（例えば、参考文献１、２、３）。
− Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の抗原（例えば、参考文献１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３）。
− Ｃｈｌａｆｎｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ由来の抗原（例えば、参考文献２４）。
− 不活化ウイルスのようなＡ型肝炎ウイルス由来の抗原（例えば、参考文献２５、２６）。
− 表面抗原および／またはコア抗原のようなＢ型肝炎ウイルス由来の抗原（例えば、参考文献２６、２７）。
− Ｃ型肝炎ウイルス由来の抗原（例えば、参考文献２８）。
− Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｕｔｕｓｓｉｓ由来の抗原（例えば、Ｂ．ｐｅｒｕｔｕｓｓｉｓ由来の百日咳全毒素（ｈｏｌｏｔｏｘｉｎ）（ＰＴ）および線維状赤血球凝集素（ＦＨＡ））これらはまた、必要に応じて、ペルタクチンおよび／または凝集原２および３と組み合される（例えば、参考文献２９および３０）。
− ジフテリアトキソイドのようなジフテリア抗原（例えば、参考文献３１の第３章）（例えば、ＣＲＭ１９７変異体（例えば、参考文献３２））。
− 破傷風トキソイドのような破傷風抗原（例えば、参考文献３１の第４章）。
− Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ由来のタンパク質抗原（例えば、ＣａｇＡ（例えば、参考文献３３）、ＶａｃＡ（例えば、参考文献３３）、ＮＡＰ（例えば、参考文献３４）、ＨｏｐＸ（例えば、参考文献３５）、ＨｏｐＹ（例えば、参考文献３５）および／またはウレア−ゼ）。
− Ｈａｅｎｉｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ由来の糖類抗原（例えば、参考文献１３）。
− Ｐｏｒｐｈｙｒａｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来の抗原（例えば、参考文献３６）。
− ＩＰＶまたはＯＰＶのようなポリオ抗原（例えば、参考文献３７、３８）。
− 狂犬病抗原（例えば、参考文献３９）（例えば、凍結乾燥して不活化したウイルス（例えば、参考文献４０、ＲａｂａｖｅｒｔＴＭ）。
− 麻疹、おたふくかぜおよび／または風疹抗原（例えば、参考文献３１の第９、１０および１１章）。
− 赤血球凝集素および／またはノイラミニダーゼ表面タンパク質のようなインフルエンザ抗原（例えば、参考文献３１の第１９章）。
− Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ由来の抗原（例えば、参考文献４１）。
− Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｂ群連鎖球菌）由来の抗原（例えば、参考文献４２、４３）。
− Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ａ群連鎖球菌）由来の抗原（例えば、参考文献４３、４４、４５）。
− Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来の抗原（例えば、参考文献４６）。
− １つ以上のこれらの抗原を含有する組成物。
【００６６】
糖類抗原または炭水化物抗原が使用される場合、免疫原性を増強するために、好ましくはキャリアタンパク質と結合体化される（例えば、参考文献４７〜５６）。好ましいキャリアタンパク質は、細菌毒素またはトキソイド（例えば、ジフテリアトキソイドまたは破傷風トキソイド）である。ＣＲＭ１９７ジフテリアトキソイドが特に好ましい。他の適切なキャリアタンパク質としては、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜タンパク質（例えば、参考文献５７）、合成ペプチド（例えば、参考文献５８、５９）、熱ショックタンパク質（例えば、参考文献６０）、百日咳タンパク質（例えば、参考文献６１、６２）、Ｈ．Ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のタンパク質Ｄ（例えば、参考文献６３）、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の毒素Ａまたは毒素Ｂ（例えば、参考文献６４）などが挙げられる。混合物が血清型Ａおよび血清型Ｃの両方由来の莢膜糖類を含む場合、ＭｅｎＡ糖類：ＭｅｎＣ糖類の割合（ｗ／ｗ）は、１より大きいことが好ましい（例えば、２：１、３：１、４：１、５：１、１０：１またはそれ以上）。Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの異なる血清型由来の糖類は、同じかまたは異なるキャリアタンパク質に結合体化され得る。
【００６７】
必要に応じて、任意の適切なリンカーとの任意の適切な結合体化反応が、使用され得る。
【００６８】
毒素タンパク質抗原は、必要な場合、解毒され得る（例えば、化学物質および／または手段による百日咳毒素の解毒（参考文献３０））。
【００６９】
以下を参照のこと：国際特許出願９９／２４５７８ （参考文献１）；国際特許出願ＷＯ９９／３６５４４（参考文献２）；国際特許出願ＷＯ９９／５７２８０（参考文献３）；国際特許出願ＷＯ００／２２４３０（参考文献４）；Ｔｅｔｔｅｌｉｎら（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：１８０９−１８１５（参考文献５）；国際特許出願ＷＯ９６／２９４１２（参考文献６）；Ｐｉｚｚａら（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：１８１６−１８２０（参考文献７）；国際特許出願ＰＣＴ／ＩＢＯ１／００１６６（参考文献８）；Ｂｊｕｎｅら（１９９１）Ｌａｎｃｅｔ ３３８（８７７５）：１０９３−１０９６（参考文献９）；Ｆｕｋａｓａｗａら（１９９０）Ｖａｃｃｉｎｅ １７：２９５１−２９５８（参考文献１０）；Ｒｏｓｅｎｑｖｉｓｔら（１９９８）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．９２：３２３−３３３（参考文献１１）；Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｏら（１９９２）Ｖａｃｃｉｎｅ １０：６９１−６９８（参考文献１２）；Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｏら（１９９９）Ｖａｃｃｉｎｅ １７：１２５１−１２６３（参考文献１３）；Ｗａｔｓｏｎ（２０００）Ｐａｄｉａｔｒ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ Ｊ １９：３３１−３３２（参考文献１４）；Ｒｕｂｉｎ（２０００）Ｐｅｄｉａｔｒ Ｃｌｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ ４７：２６９−２８５，ｖ（参考文献１５）；Ｊｅｄｒｚｅｊａｓ（２００１）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｒｅｖ ６５：１８７−２０７（参考文献１６）；ＧＢ−００１６３６３．４の優先権を主張し、２００１年７月３日に出願された国際特許出願（参考文献１７）；Ｋａｌｍａｎら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２１：３８５−３８９（参考文献１８）；Ｒｅａｄら（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２８：１３９７−４０６（参考文献１９）；Ｓｈｉｒａｉら（２０００）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８１（補遺３）：Ｓ５２４−Ｓ５２７（参考文献２０）；国際特許出願ＷＯ９９／２７１０５（参考文献２１）；国際特許出願ＷＯ００／２７９９４（参考文献２２）；国際特許出願ＷＯ００／３７４９４（参考文献２３）；国際特許出願ＷＯ９９／２８４７５（参考文献２４）；Ｂｅｌｌ（２０００）Ｐｅｄｉａｔｒ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ Ｊ １９：１１８７−１１８８（参考文献２５）；Ｉｗａｒｓｏｎ（１９９５）ＡＰＭＩＳ １０３：３２１−３２６（参考文献２６）；Ｇｅｒｌｉｃｈら（１９９０）Ｖａｃｃｉｎｅ ８ 補遺：Ｓ６３−６８および７９−８０（参考文献２７）；Ｈｓｕら（１９９９）Ｃｌｉｎ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ ３：９０１−９１５（参考文献２８）；Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎら（１９９６）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３４：３４９−３５５（参考文献２９）；Ｒａｐｐｕｏｌｉら（１９９１）ＴＩＢＴＥＣＨ ９：２３２−２３８（参考文献３０）；Ｖａｃｃｉｎｅｓ（１９８８）ＰｌｏｔｋｉｎおよびＭｏｒｔｉｍｅｒ編、ＩＳＢＮ ０−７２１６−１９４６−０（参考文献３１）；Ｄｅｌ Ｇｕｉｄｉｃｅら（１９９８）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９：１−７０（参考文献３２）；国際特許出願ＷＯ９３／１８１５０（参考文献３３）；国際特許出願ＷＯ９９／５３３１０（参考文献３４）；国際特許出願ＷＯ９８／０４７０２（参考文献３５）；Ｒｏｓｓら（２００１）Ｖａｃｃｉｎｅ １９：４１３５−４１４２（参考文献３６）；Ｓｕｔｔｅｒら（２０００）Ｐｅｄｉａｔｒ Ｃｌｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ ４７：２８７−３０８（参考文献３７）；ＺｉｍｍｅｒｍａｎおよびＳｐａｎｎ（１９９９）Ａｍ Ｆａｍ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ ５９：１１３−１１８、１２５−１２６（参考文献３８）；Ｄｒｅｅｓｅｎ（１９９７）Ｖａｃｃｉｎｅ １５ 補遺：Ｓ２−６（参考文献３９）；ＭＭＷＲ Ｍｏｒｂ Ｍｏｒｔａｌ Ｗｋｌｙ Ｒｅｐ（１９９８年１月１６日）；４７（１）：１２，１９（参考文献４０）；ＭｃＭｉｃｈａｅｌ（２０００）Ｖａｃｃｉｎｅ １９ 補遺１：Ｓ１０１−１０７（参考文献４１）；Ｓｃｈｕｃｈａｔ（１９９９）Ｌａｎｃｅｔ ３５３（９１４６）：５１−６（参考文献４２）；英国特許出願第００２６３３３．５号、同第００２８７２７．６号および同第０１０５６４０．７号（参考文献４３）；Ｄａｌｅ（１９９９）Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ Ｃｌｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ １３：２２７−４３，ｖｉｉｉ（参考文献４４）；Ｆｅｒｒｅｔｔｉら（２００１）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９８：４６５８−４６６３（参考文献４５）；Ｋｕｒｏｄａら（２００１）Ｌａｎｃｅｔ ３５７（９２６４）：１２２５−１２４０；１２１８−１２１９頁（参考文献４６）もまた参照のこと；Ｒａｍｓａｙら（２００１）Ｌａｎｃｅｔ ３５７（９２５１）：１９５−１９６（参考文献４７）；Ｌｉｎｄｂｅｒｇ（１９９９）Ｖａｃｃｉｎｅ １７補遺２：Ｓ２８−３６（参考文献４８）；ＢｕｔｔｅｒｙおよびＭｏｘｏｎ（２０００）Ｊ Ｒ Ｃｏｌｌ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ Ｌｏｎｄｏｎ ３４：１６３−１６８（参考文献４９）；ＡｈｍａｄおよびＣｈａｐｎｉｃｋ（１９９９）Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ Ｃｌｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ １３：１１３−１３３，ｖｉｉ（参考文献５０）；Ｇｏｌｄｂｌａｔｔ（１９９８）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４７：５６３−５６７（参考文献５１）；欧州特許第０ ４７７ ５０８号（参考文献５２）；米国特許第５，３０６，４９２号（参考文献５３）；国際特許出願ＷＯ９８／４２７２１（参考文献５４）；Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅｓ（Ｃｒｕｓｅら編）ＩＳＢＮ ３８０５５４９３２６（特に、第１０巻：４８−１１４）（参考文献５５）；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ（１９９６）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ＩＳＢＮ：０１２３４２３３６８および０１２３４２３３５Ｘ（参考文献５６）；欧州特許出願第０３７２５０１号（参考文献５７）；欧州特許出願第０３７８８８１号（参考文献５８）；欧州特許出願第０４２７３４７号（参考文献５９）；国際特許出願ＷＯ９３／１７７１２（参考文献６０）；国際特許出願ＷＯ９８／５８６６８（参考文献６１）；欧州特許出願第０４７１１７７号（参考文献６２）；国際特許出願ＷＯ／５６３６０（参考文献６３）；国際特許出願ＷＯ００／６１７６１（参考文献６４）。
【００７０】
ジフテリア抗原が組成物中に含有される場合、破傷風抗原および百日咳抗原を含有することもまた好ましい。同様に、破傷風抗原が含有される場合、ジフテリア抗原および百日咳抗原を含有することもまた好ましい。同様に、百日咳抗原が含有される場合、ジフテリア抗原および破傷風抗原を含有することもまた好ましい。
【００７１】
本発明を用いて、多様なポリペプチド含有効分子を送達し得、従って、多くの疾患を処置および／または診断し得ることは、容易に明らかである。いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチド含有分子／微粒子組成物は、部位特異的な標的化送達に使用され得る。例えば、ポリペプチド含有分子／微粒子組成物の静脈内投与は、肺、肝臓、脾臓、血液循環または骨髄の標的化に使用され得る。
【００７２】
吸着性微粒子の表面へのポリペプチド含有分子の吸着は、任意の結合相互作用機構（イオン結合、水素結合、共有結合、ファンデルワールス結合および親水性／疎水性相互作用を介する結合が挙げられるがこれらに限定されない）を介して生じる。
【００７３】
本発明とともに使用する微粒子を製造するための生分解性のポリマーは、例えば、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ（Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＢｉｒｍｉｎｇｈａｍ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）から市販されている。例えば、本明細書中の微粒子を形成するために有用なポリマーとしては、以下由来のホモポリマー、コポリマーおよびポリマーブレンドが挙げられる：ポリヒドロキシ酪酸（ポリヒドロキシブチレートとしても公知）；ポリヒドロキシ吉草酸（ポリヒドロキシバレレートとしても公知）；ポリグリコール酸（ＰＧＡ）（ポリグリコリドとしても公知）：ポリ乳酸（ＰＬＡ）（ポリラクチドとしても公知）；ポリジオキサノン；ポリカプロラクトン；ポリオルトエステル；およびポリ無水物。ポリ（α−ヒドロキシ酸）（例えば、ポリ（Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（両方とも、本明細書中で「ＰＬＡ」として公知）、ポリ（ヒドロキシブチレート）、Ｄ，Ｌ−ラクチドおよびグリコリドのコポリマー（例えば、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（本明細書中で「ＰＬＧ」と示す）または、Ｄ，Ｌ−ラクチドおよびカプロラクトンのコポリマーがより好ましい。本明細書中において使用するための特に好ましいポリマーは、ＰＬＡポリマーおよびＰＬＧポリマーである。これらのポリマーは、種々の分子量で利用可能であり、そして、所定の使用のための適切な分子量は、当業者によって容易に決定される。従って、例えば、ＰＬＡについて、適切な分子量は、約２０００〜５０００のオーダーである。ＰＬＧについての適切な分子量は、一般に、約１０，０００〜約２００，０００、好ましくは約１５，０００〜約１５０，０００の範囲である。
【００７４】
ＰＬＧのようなコポリマーを用いて微粒子を形成する場合、種々のラクチド：グリコール分子比が、本明細書中における使用に見出され、そしてこの比は、同時に投与されるポリペプチド含有分子および所望の分解速度に部分的に依存して、主に選択の問題である。例えば、５０％Ｄ，Ｌ−ラクチドおよび５０％グリコリドを含有する５０：５０のＰＬＧポリマーは、急速再吸収コポリマーを提供するが、ラクチド含量の増加に起因して、７５：２５ ＰＬＧは、よりゆっくり分解し、そして８５：１５および９０：１０は、なおよりゆっくり分解する。ラクチド：グリコリドの適切な比が、例えば、抗原の性質および問題の障害に基づいて、当業者によって容易に決定されることは明らかである。本発明の微粒子の分解速度はまた、ポリマー分子量およびポリマー結晶化度などの因子によって制御され得る。可動するラクチド：グリコリド比および分子量を有するＰＬＧコポリマーは、多くの供給元（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ（Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＢｉｒｍｉｎｇｈａｍ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）を含む）から市販されている。いくつかの例示的なＰＬＧコポリマーとしては、以下が挙げられる：（ａ）ＲＧ ５０２（５０：５０のラクチド／グリコリド分子比および１２，０００Ｄａの分子量を有するＰＬＧ）；（ｂ）ＲＧ ５０３（５０：５０のラクチド／グリコリド分子比および３４，０００Ｄａの分子量を有するＰＬＧ）；（ｃ）ＲＧ ５０４（５０：５０ ラクチド／グリコリド分子比および４８，０００Ｄａの分子量を有するＰＬＧ）、（ｄ）ＲＧ ７５２（７５：２５のラクチド／グリコリド分子比および２２，０００Ｄａの分子量を有するＰＬＧ）；ならびに（ｅ）ＲＧ ７５５（７５：２５のラクチド／グリコリド分子比および６８，０００Ｄａの分子量を有するＰＬＧ）。ＰＬＧポリマーはまた、当該分野で周知の技術（例えば、Ｔａｂａｔａら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．（１９８８）２２：８３７−８５８に記載される技術）を用いて、乳酸成分の単純な重縮合により合成され得る。現在、好ましいＰＬＧコポリマーは、２５：７５〜７５：２５、より好ましくは４０：６０〜６０：４０の範囲の分子ラクチド／グリコリド比を有し、１０，０００〜１００，０００ダルトン，より好ましくは２０，０００ダルトン〜７０，０００ダルトンの範囲の分子量を有するＰＬＧコポリマーである。
【００７５】
微粒子は、当該分野で周知のいくつかの方法のうちのいずれかを用いて調製される。例えば、いくつかの実施形態において、二重エマルジョン／溶媒蒸発技術（例えば、米国特許第３，５２３，９０７号およびＯｇａｗａら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．（１９８８）３６：１０９５−１１０３に記載される技術）を本明細書中で用いて、微粒子を製造し得る。これらの技術は、ポリマー溶液の液滴からなる第１のエマルジョンの形成を包含し、この第１のエマルジョンは、続いて粒子安定化剤／界面活性剤を含有する連続した水相と混合される。
【００７６】
他の実施形態において、微粒子はまた、以下の技術を用いて形成され得る：例えば、ＴｈｏｍａｓｉｎらＪ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ（１９９６）４１：１３１；米国特許第２，８００，４５７号；Ｍａｓｔｅｒｓ，Ｋ．（１９７６）Ｓｐｒａｙ Ｄｒｙｉｎｇ 第２版、Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されるようなスプレー乾燥およびコアセルベーション；エアサスペンションコーティング技術（例えば、Ｈａｌｌら（１９８０）Ｔｈｅ「Ｗｕｒｓｔｅｒ Ｐｒｏｃｅｓｓ」ｉｎ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｔｌｉｅｏｒｙ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａ．Ｆ．Ｋｙｄｏｎｉｅｕｓ編）、第２巻、ｐｐ．１３３−１５４（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ）およびＤｅａｓｙ，Ｐ．Ｂ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．（１９８８）Ｓ（２）：９９−１３９によって記載されるようなパンコーティングおよびＷｕｒｓｔｅｒコーティング；ならびに、例えば、Ｌｉｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８０）２１０：９０８−９１０によって記載されるようなイオン性のゲル化）。
【００７７】
好ましい実施形態において、改変された水中油中水（ｗ／ｏ／ｗ）溶媒蒸発技術を用いて微粒子を形成し得る。この型の技術は、例えば、Ｏ’Ｈａｇａｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９３）１１：９６５−９６９、ＰＣＴ／ＵＳ９９／１７３０８（ＷＯ ００／０６１２３）（Ｏ’Ｈａｇａｎら）およびＪｅｆｆｅｒｙら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９３）１０：３６２に記載されている。しかし、これらの技術は、本発明と組み合せて使用するために改変される。特に、これらの技術とは異なり、本発明のｗ／ｏ／ｗエマルジョンは、好ましくは界面活性剤（洗浄剤、分散剤、懸濁剤および乳化安定剤を含む）の非存在下で形成される。
【００７８】
より詳細には、ＰＬＧのような目的の粒子ポリマーは、酢酸エチル、ジメチルクロライド（塩化メチレンおよびジクロロメタンとも呼ばれる）、アセトニトリル、アセトン、クロロホルムなどのような有機溶媒中に溶解される。このポリマーは、代表的には、有機溶媒中、約１〜３０％、好ましくは約２〜１５％、より好ましくは約３〜１０％、および最も好ましくは約４〜６％の溶液で提供される。次いで、このポリマー溶液は、水溶液の第１の容量と合わせられ、そして乳化され、ｏ／ｗエマルジョンを形成する。この水溶液は、例えば、脱イオン水、正常生理食塩水、またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）のような緩衝溶液もしくはクエン酸ナトリウム／エチレンジアミン四酢酸（クエン酸ナトリウム／ＥＴＤＡ）緩衝溶液であり得る。後者の溶液が、（ａ）正常な生理学的流体と本質的に同じである張性（すなわち、重量オスモル濃度）を提供し得、かつ（ｂ）正常な生理学的条件と適合するｐＨを維持し得る。あるいは、本発明の組成物の張性および／またはｐＨ特性は、微粒子形成後および投与前に調節され得る。
【００７９】
好ましくは、ポリマー溶液 対 水溶液の容量比は、約５：１〜約２０：１の範囲であり、そしてより好ましくは、約１０：１である。乳化は、好ましくは、この仕事に適切であり、代表的には、例えば、ホモジナイザーのような高剪断デバイスである、任意の装置を使用して行われる。
【００８０】
次いで、ある容量のｏ／ｗエマルジョンは、好ましくは、より大容量の第２の水溶液（これは、例えば、脱イオン水、正常生理食塩水、または緩衝溶液でもあり得る）と合わせられる。第２の容量の水溶液とｏ／ｗエマルジョンの容量との比は、代表的には、約２：１〜１０：１の範囲であり、そしてより代表的には、約４：１である。次いで、混合物は、ホモジナイズされて、ｗ／ｏ／ｗダブルエマルジョンを生成する。次いで、有機溶媒は、蒸発される。
【００８１】
この処方パラメータは、操作され、０．２μｍ（２００ｎｍ）のオーダーである小さい微粒子〜５０μｍまたはよりそれ以上でさえある、より大きい微粒子の調製を可能にする。例えば、Ｊｅｆｆｅｒｙら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９３）１０：３６２−３６８；ＭｃＧｅｅら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐ．（１９９６）を参照のこと。例えば、撹拌を減少することにより、内相の容量が増加し、かつポリマー濃度が増加するので、より大きい微粒子が生じる。小さい粒子は、撹拌の増加ならびに低い水相容量および低ポリマー濃度によって生成される。
【００８２】
上記の工程を実施するために好ましい装置の１つが、図１に概略的に示されている。ここで、図１を参照すると、操作タンクアセンブリ（一般的に、数字１０２で表される）が示される。このタンクアセンブリ１０２は、「閉鎖系」であるように設計されているので、処理の間、無菌環境が維持される。装置の全ての部品および部分は、好ましくは、定置洗浄（ｃｌｅａｎ−ｉｎ−ｐｌａｃｅ）およびオートクレーブであるように選択される。１０４ａ〜１０４ｄのフィルターは全て、好ましくは、Ｓｕｐｅｒ−ＣｈｅｍｉｎｅｒｔＴＭのようなフルオロポリマーフィルターであり、全てのフルオロポリマーフィルターは、Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製である。最初に、脱イオン水１０６のような水溶液および塩化メチレン中のＰＬＧ溶液１０８のような有機ポリマー溶液を、濾過し、タンク１１０中に供給し、タンク１１０においてこれらをミキサー１１２を用いて連続的に混合する。次いで、この混合物を、インラインホモジナイザー１１４（例えば、Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ ＭＴ５０００のような、高速、高剪断でオートクレーブ可能であるインラインホモジナイザー）を介して供給し、ｏ／ｗエマルジョンを形成する。このエマルジョンを、インラインホモジナイザー１１４からエマージングした後に、例えば、水冷コンデンサ１１６によって冷却し、その後、タンク１１０に戻す。内容量が所望の程度まで乳化された後、さらなる水溶液（例えば、脱イオン水１０６）をタンク１１０に加え、その後、インラインミキサー１１４を介して内容量を再び供給することによって、ｗ／ｏ／ｗエマルジョンを形成する。得られたｗ／ｏ／ｗエマルジョンを、ディストリビュータ１１９を介して窒素と共にパージし、有機溶媒を除去する。この窒素含有（ｎｉｔｒｏｇｅｎ−ｌａｄｅｎ）溶媒蒸気を濾過し、コンデンサ１２０内で冷却し、容器１２２内にこの溶媒を捕捉する。容器１２２内において、このエマルジョンは、いくらか不安定であり、インライン混合によって同時に溶媒を除去することが所望され得る。
【００８３】
粒子サイズは、例えば、ヘリウム−ネオンレーザーを組み込んだ分光計を使用して、例えば、レーザー光散乱によって決定され得る。一般的には、粒子サイズは室温で決定され、問題のサンプルの複数回分析（例えば、５〜１０回）によってその粒子直径の平均値を得る。粒子サイズはまた、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を使用して、容易に決定される。
【００８４】
調製後、微粒子を、更なる使用のためにそのまま保存し得るかまたは凍結乾燥し得る。微粒子にポリペプチド含有分子を吸着させるために、微粒子調製物を目的のポリペプチド含有分子と単に混合し得、そして得られた処方物を使用前に再び凍結乾燥し得る。
【００８５】
代表的には、ポリペプチド含有分子を微粒子に加え、ポリペプチド含有分子を吸着した微粒子を得、この微粒子は、約０．０００１：１〜０．２５：１、より代表的には、０．００１：１〜０．１：１、なおより代表的には０．０５：１〜０．０１：１であるポリペプチド含有分子 対 微粒子の重量 対 重量比を有する。この微粒子のポリペプチド含有分子含量は、標準的な技術を使用して決定され得る。
【００８６】
ポリペプチド含有分子を吸着した微粒子に加え、本発明の組成物はまた、種々の他の高分子（さらなるポリペプチド含有分子、医薬品、ポリヌクレオチド、ホルモン、酵素、翻訳もしくは転写のメディエータ、代謝経路中間体、免疫調節物質、抗原、アジュバントあるいはこれらの組み合わせが挙げられる）を含み得る。例えば、本発明の微粒子は、その中に包埋またはカプセル化されるか、微粒子の表面に吸着されるか、あるいは溶液中または懸濁液中に含まれる追加高分子を有し得る。特に好ましい追加高分子は、アジュバントである。
【００８７】
一旦、吸着ポリペプチド含有分子を有する微粒子が生成されると、それらは、上記のような、広範な種々の障害を処置および／または診断するための、薬学的組成物（ワクチンを含む）へと処方される。この組成物は、一般には、１つ以上の薬学的に受容可能な賦形剤を含む。例えば、ビヒクル（例えば、水、生理食塩水、グリセロール、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、エタノールなど）が、使用され得る。他の賦形剤（例えば、湿潤剤または乳化剤、生物学的緩衝物質など）が、このようなビヒクル中に存在し得る。生物学的緩衝剤は、薬理学的に受容可能でありかつその処方物に望ましいｐＨ（すなわち、生理的範囲にあるｐＨ）を提供する、事実上任意の物質であり得る。緩衝溶液の例としては、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水、ハンクス緩衝化生理食塩水などが挙げられる。当該分野で公知の他の賦形剤もまた、最終投与形態（結合剤、崩壊剤、充填剤（希釈剤）、滑沢剤、流動促進剤（ｇｌｉｄａｎｔ）（流動増強剤（ｅｎｈａｎｃｅｒ））、着色料、圧縮助剤、甘味剤、保存剤、懸濁剤／分散剤、フィルム形成剤／コーティング剤、矯味矯臭剤（ｆｌａｖｏｒ）および印刷インクを含む）へと導入され得る。
【００８８】
アジュバントは、薬学的組成物の有効性を増強するために使用され得る。このアジュバントは、本発明の微粒子と同時に（例えば、同じ組成物中でか、または別の組成物中で）投与され得る。あるいは、このアジュバントは、本発明の微粒子組成物の前または後に投与され得る。いくつかの実施形態において、このアジュバント（例えば、免疫学的アジュバント）は、この微粒子中にカプセル化され得る。アジュバント（任意の高分子）は、当該分野で公知のいくつかの方法のうちのいずれかを使用して、この微粒子内にカプセル化され得る。例えば、米国特許第３，５２３，９０７号；Ｏｇａｗａら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．（１９８８）３６：１０９５〜１１０３；Ｏ’Ｈａｇａｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９３）１１：９６５〜９６９、およびＪｅｆｆｅｒｅｙら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９３）１０：３６２を参照のこと。あるいは、いくつかのアジュバント（特に、ポリペプチド含有アジュバント）は、上記のように微粒子上に吸着され得る。
【００８９】
免疫学的アジュバントとしては、（１）アルミニウム塩（ミョウバン）（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど）；（２）他の水中油エマルジョン処方物（他の特定の免疫刺激剤（例えば、ムラミルペプチド（下記参照）または細菌細胞壁成分）を含むかまたは含まない）（例えば、（ａ）ＭＦ５９（国際公開番号ＷＯ９０／１４８３７；Ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｓｉｇｎ：ｔｈｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｐｐｒｏａｃｈ，第１０章，ＰｏｗｅｌｌおよびＮｅｗｍａｎ編、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，１９９５）（Ｍｏｄｅｌ １１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ）のようなマイクロフルイダイザーを使用してμｍ未満の粒子へと処方された、５％ Ｓｑｕａｌｅｎｅ，０．５％ Ｔｗｅｅｎ ８０および０．５％ Ｓｐａｎ ８５（必要に応じて種々の量のＭＴＰ−ＰＥ（下記を参照のこと）を含むが、必要というわけではない）を含む）、（ｂ）ＳＡＦ（μｍ未満のエマルジョンへとマイクロフルイダイズされたかまたはより大きな粒径のエマルジョンを生じるようにボルテックスされた、１０％ Ｓｑｕａｌａｎｅ，０．４％ Ｔｗｅｅｎ ８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰ（下記を参照のこと）を含む）、ならびに（ｃ）ＲｉｂｉＴＭアジュバントシステム（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）（２％ Ｓｑｕａｌｅｎｅ，０．２％ Ｔｗｅｅｎ ８０、および１種以上の細菌細胞壁成分（モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）（好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘＴＭ）からなる群由来を含む）（本明細書における使用のために適切なμｍ未満の水中油エマルジョンのさらなる考察について、１９９８年１月２９日出願の共有に係る米国特許出願番号０９／０１５，７３６号を参照のこと）；（３）サポニンアジュバント（例えば、Ｑｕｉｌ ＡもしくはＱＳ２１（例えば、ＳｔｉｍｕｌｏｎＴＭ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ））が、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）のようなそれらから生じる粒子のために使用され得、このＩＳＣＯＭは、さらなる界面活性剤を回避し得る（例えば、ＷＯ００／０７６２１））；（４）完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；（５）サイトカイン（例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２（ＷＯ９９／４４６３６）など）、インターフェロン（例えば、γインターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）など；（６）モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）もしくは３−Ｏ−デアシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）（例えば、ＧＢ−２２２０２２１、ＥＰ−Ａ−０６８９４５４）（肺炎球菌糖質とともに使用した場合には、必要に応じてミョウバンの実質的不在下）（例えば、ＷＯ００／５６３５８）；（７）３ｄＭＰＬと、例えば、ＱＳ２１および／または水中油エマルジョンとの組み合わせ（例えば、ＥＰ−Ａ−０８３５３１８、ＥＰ−Ａ−０７３５８９８、ＥＰ−Ａ−０７６１２３１）；（８）ＣｐＧモチーフ（すなわち、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドを含み、５メチルシトシンが、シトシンの代わりに必要に応じて使用される）を含むオリゴヌクレオチド（Ｒｏｍａｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１９９７，３，８４９〜８５４；Ｗｅｉｎｅｒら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、１９９７，９４，１０８３３〜１０８３７；Ｄａｖｉｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８８，１６０，８７０〜８７６；Ｃｈｕら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９７，１８６，１６２３〜１６３１；Ｌｉｐｆｏｒｄら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７，２７，２３４０〜２３４４；Ｍｏｌｄｏｖｅａｎｕら、Ｖａｃｃｉｎｅ，１９８８，１６，１２１６〜１２２４；Ｋｒｉｅｇら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９５，３７４，５４６〜５４９；Ｋｌｉｎｍａｎら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ，１９９６，９３，２８７９〜２８８３；Ｂａｌｌａｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６，１５７，１８４０〜１８４５；Ｃｏｗｄｅｒｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６，１５６，４５７０〜４５７５；Ｈａｌｐｅｍら、Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６，１６７，７２〜７８；Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１９８８，７９，８６６〜８７３；Ｓｔａｃｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６，１５７，２１１６〜２１２２；Ｍｅｓｓｉｎａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９１，１４７，１７５９〜１７６４；Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６，１５７，４９１８〜４９２５；Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６，１５７，５３９４〜５４０２；Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８，１６０，４７５５〜４７６１；およびＹｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８，１６０，５８９８〜５９０６；国際特許出願ＷＯ９６／０２５５５、ＷＯ９８／１６２４７、ＷＯ９８／１８８１０、ＷＯ９８／４０１００、ＷＯ９８／５５４９５、ＷＯ９８／３７９１９およびＷＯ９８／５２５８１）；（９）ポリオキシエチレンエーテルまたはポリオキシエチレンエステル（例えば、ＷＯ９９／５２５４９）；（１０）オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（ＷＯ０１／２１２０７）、または少なくとも１つのさらなる非イオン性界面活性剤（例えば、オクトキシノール）と組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテル界面活性剤もしくはポリオキシエチレンアルキルエステル界面活性剤（ＷＯ０１／２１１５２）；（１１）サポニンおよび免疫刺激オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＷＯ００／６２８００）；（１２）免疫刺激剤および金属塩粒子（例えば、ＷＯ００／２３１−５）；（１３）サポニンおよび水中油エマルジョン（例えば、ＷＯ９９／１１２４１）；（１４）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（必要に応じて＋ステロール）（例えば、ＷＯ９８／５７６５９）；（１５）細菌ＡＤＰ−リボシル化毒素の解毒化変異体（例えば、コレラ毒素（ＣＴ）、破傷風毒素（ＰＴ）もしくはＥ．ｃｏｌｉ易熱性毒素（ＬＴ）（特に、ＬＴ−Ｋ６３（野生型アミノ酸６３位がリジンで置換されている）、ＬＴ−Ｒ７２（野生型アミノ酸７２位がアルギニンで置換されている）、ＣＴ−Ｓ１０９（野生型アミノ酸１０９位がセリンで置換されている）、およびＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９（野生型アミノ酸９位がリジンで置換され、１２９位がグリシンで置換されている）（例えば、国際特許公開番号ＷＯ９３／１３２０２およびＷＯ９２／１９２６５を参照のこと）；（１６）アミノアルキルグルコサミニド４−リン酸（ＡＧＰ）（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｄ．Ａ．ら；Ｂｉｏｏｒｇ，Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１９９９ Ａｕｇ ２；９（１５）：２２７３〜８を参照のこと）、（１７）イミダゾキノリン（例えば、イミキモド（ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）（Ｒ−８３７）およびレシキモド（ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ）（Ｒ−８４８））（例えば、Ｖａｓｉｌａｋｏｓ，Ｊ．Ｐ．ら、Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００ Ａｕｇ ２５；２０４（１）：６４〜７４を参照のこと）、（１８）リポ多糖模倣物（Ｈａｗｋｉｎｓ，Ｌ．Ｄ．ら；Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２００２ Ｆｅｂ．３００（２）：６５５〜６１に記載される非糖リン脂質（例えば、二糖を欠く簡易化（ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ）リピドＡアナログ）、ならびに（１９）この組成物の有効性を増強するための免疫刺激剤として作用する他の物質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９０】
ムラミルペプチドとしては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）などが挙げられる。
【００９１】
アジュバントのさらなる例について、Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ，Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ ｔｈｅ ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｐｏｗｅｌｌ，Ｍ．Ｆ．およびＮｅｗｍａｎ，Ｍ．Ｊ．編、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，１９９５を参照のこと。
【００９２】
この組成物は、「治療有効量」の目的のポリペプチド含有分子（ならびに他の任意の高分子）を含む。すなわち、十分量のこのポリペプチド含有分子が、目的の状態を処置または診断するために含められる。必要な正確な量は、例えば、とりわけ、処置される被検体；処置される被検体の年齢および全身状態；処置される状態の重篤度；免疫応答の場合は、その被検体の免疫系が抗体を合成する能力；望ましい防御の程度および選択される特定のポリペプチド含有分子およびその投与様式に依存して、変化する。適切な有効量は、当業者により容易に決定され得る。従って、「治療有効量」は、代表的には、慣用的試験を介して決定され得る比較的広範な範囲内にある。例えば、その高分子がポリペプチド抗原である場合、有効用量は、代表的には、１回の投与について送達される、約１μｇ〜約１００ｍｇ、好ましくは、約５μｇ〜約１ｍｇ、より好ましくは約５μｇ〜約１００μｇ、および最も好ましくは、約５μｇ〜約５０μｇの抗原である。
【００９３】
一旦処方されると、本発明の組成物は、（例えば、注射により）非経口投与され得る。この組成物は、皮下、腹腔内、静脈内、または筋肉内のいずれかで注射され得る。他の投与様式としては、鼻投与、直腸投与、膣投与、経口投与および肺投与、坐剤、および経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌまたはｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）適用が挙げられる。
【００９４】
投与処置は、単回投与スケジュールまたは多回投与スケジュールに沿ってであり得る。多回投与スケジュールは、一次投与治療単位が、１〜１０の別個の投与であり、その後、他の投与が、治療応答を維持および／または強化するように選択されたそれに続く時間間隔（例えば、２回目の投与について１〜４ヶ月、必要な場合は、数ヶ月後にその後の投与）で与えられ得る。その投与レジメンはまた、少なくとも一部、被検体の必要性により決定され得、実施者の判断に依存し得る。
【００９５】
さらに、予防処置（例えば、ワクチン中）が望ましい場合、本発明の組成物が、一般的には、目的の病原体に一次感染する前に投与される。治療処置（例えば、症状または再発の減少）が望ましい場合、本発明の組成物は、一般には、一次感染の後に投与される。
【００９６】
（Ｃ．実験）
下記にあるのは、本発明を実行するための特定の実施形態の例である。これらの実施例は、例示目的のためのみに提供され、本発明の範囲を限定することはいかなるようにも意図されない。使用した数字（例えば、量、温度など）に関して、精度を確保する努力を行ったが、いくらかの実験誤差および偏差が、当然、許容されるべきである。
【実施例】
【００９７】
（実施例１：界面活性剤を有さないＰＬＧ粒子の調製）
ＩＫＡホモジナイザー（Ｇｅｒｍａｎｙ）の小プローブを使用して、２．５ｍｌのＰＢＳをジメチルクロライド中、６％のＲＧ５０３（ラクチド／グリコリドのモル比が５０：５０であり、３４，０００ダルトンの分子量を有するＰＬＧポリマー、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍから市販されている）１０ｍｌと共に２３，０００ｒｐｍで２分間、ホモジナイズする。この最初のｏ／ｗエマルジョンを５０ｍｌの脱イオン水に加え、次いで、Ｏｍｍｉベンチトップホモジナイザー（Ｌａｂ Ｔｅｋ Ｉｎｃ、ＵＳ）の１０ｍｍプローブを使用して、１５，０００ｒｐｍで３０分間、氷浴でホモジナイズする。ホモジナイズしている間に溶媒が蒸発するのを防ぐために、容器を液体中に挿入したホモジナイザーと共に、Ｔｅｆｌｏｎテープを用いて封をする。Ｔｅｆｌｏｎテープを取り外し、そしてこの２番目のｗ／ｏ／ｗエマルジョンを、溶媒が蒸発するように、一晩中攪拌し続ける。翌日、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｓｉｚｅｒを使用して、粒子サイズを測定する。サイズの範囲は、代表的には０．５〜１ミクロンである。
【００９８】
（実施例２：ＰＬＧに対して０．０５％ｗｔ：ｗｔおよび０．５％ｗｔ：ｗｔのＤＳＳを有するＰＬＧ粒子の調製）
ＩＫＡホモジナイザー（Ｇｅｒｍａｎｙ）の小プローブを使用して、２．５ｍｌのＰＢＳをジメチルクロライド中、６％のＲＧ５０３（ラクチド／グリコリドのモル比が５０：５０であり、３４，０００ダルトンの分子量を有するＰＬＧポリマー、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍから市販されている）１０ｍｌと共に２３，０００ｒｐｍで２分間、ホモジナイズする。この最初のｏ／ｗエマルジョンを６μｇ／ｍｌまたは６０μｇ／ｍｌのいずれかのＤＳＳを含む（それぞれ０．０５％および０．５％となる）脱イオン水（５０ｍｌ）に加える。次いで、これをＯｍｍｉベンチトップホモジナイザー（Ｌａｂ Ｔｅｋ Ｉｎｃ、ＵＳ）の１０ｍｍプローブを使用して、１５，０００ｒｐｍで３０分間、氷浴でホモジナイズする。ホモジナイズしている間に溶媒が蒸発するのを防ぐために、容器を液体中に挿入したホモジナイザーと共に、Ｔｅｆｌｏｎテープを用いて封をする。Ｔｅｆｌｏｎテープを取り外し、そしてこの２番目のｗ／ｏ／ｗエマルジョンを、溶媒が蒸発するように、一晩中攪拌し続ける。翌日、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｓｉｚｅｒを使用して、粒子サイズを測定する。サイズの範囲は、代表的には０．５〜１ミクロンである。
【００９９】
（実施例３：ＰＬＧ粒子（従来の処方物）の調製）
ＩＫＡホモジナイザー（Ｇｅｒｍａｎｙ）の小プローブを使用して、２．５ｍｌのＰＢＳをジメチルクロライド中、６％のＲＧ５０３（ラクチド／グリコリドのモル比が５０：５０であり、３４，０００ダルトンの分子量を有するＰＬＧポリマー、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍから市販されている）１０ｍｌと共に２３，０００ｒｐｍで２分間、ホモジナイズする。この最初のｏ／ｗエマルジョンを１％ｗｔ：ｖｏｌのＤＳＳを含む脱イオン水（５０ｍｌ）に加える。次いで、これをＯｍｍｉベンチトップホモジナイザー（Ｌａｂ Ｔｅｋ Ｉｎｃ、ＵＳ）の１０ｍｍプローブを使用して、１０，０００ｒｐｍで３分間、室温でホモジナイズする。この２番目のｗ／ｏ／ｗエマルジョンを、溶媒が蒸発するように、一晩中攪拌し続ける。翌日、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｓｉｚｅｒを使用して、粒子サイズを測定する。サイズの範囲は、代表的には０．５〜１ミクロンである。
【０１００】
（実施例４：ＰＬＧ処方物へのタンパク質の吸着）
０％ｗｔ：ｗｔ、０．０５％ｗｔ：ｗｔ、および０．５％ｗｔ：ｗｔのＤＳＳを有するように作製したＰＬＧ粒子（上の実施例１および２に由来）に、以下のようにして、髄膜炎Ｂ ２８７タンパク質（Ｃｈｉｒｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ、Ｓｉｅｎａ、Ｉｔａｌｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ第２８７巻、１８１６（２０００））を吸着させた：
０％、０．０５％、および０．５％のＤＳＳを有するＰＬＧ粒子への直接的な結合：
１− 実施例１および２のそれぞれの処方物の懸濁液容量を測定し、ＰＬＧの開始重量を総容量で割ることにより、ＰＬＧ含量を測定した。
２− それぞれの処方物について、２００ｍｇのＰＬＧを含む特定の容量を３０ｍｌの遠心分離チューブに移し、そして２ｍｇの２８７タンパク質を加えた。
３− １ｍｌの１００ｍＭクエン酸（ｐＨ４．７５）を加えることで、緩衝液を１０ｍＭのクエン酸に調整し、総容量をＤＩ水で１０ｍｌまで増やした。
４− チューブを、４℃で一晩中、ラボロッカー上で揺らし続けた。
５− 翌日、２ｍｌのアリコートを分析用に採取し、残りの懸濁液をバイアル中に分注した。それぞれ、１用量あたりのＰＬＧ上のタンパク質が１μｇまたは１０μｇのいずれかである１２回分の投与量を含んでいた。
６− 凍結乾燥させる前に、水中２５％ｗｔ：ｖｏｌのマンニトール溶液（２１６μｌ）を各バイアルに加えた。
【０１０１】
（実施例５：従来の方法によって作製したＰＬＧ／ＤＳＳ処方物へのタンパク質の吸着）
１− 実施例３の懸濁液を、２５０ｍｌの水を使用して、遠心分離によって、２回洗浄した。
２− ペレットを１５ｍｌのＤＩ水に再懸濁し、水浴ソニケーターで２分間、超音波処理した。
３− ５ｍｌの懸濁液（２００ｍｇのＰＬＧを含む）を３０ｍｌの遠心分離チューブに移し、そして２ｍｇの２８７タンパク質を加えた。
４− １ｍｌの１０×ＰＢＳを加えることで緩衝液を調整し、ＤＩ水で容量を１０ｍｌまで増やした。
５− 懸濁液を４℃で一晩中、ラブロッカー上で揺らし続けた。
６− 翌日、１ｍｌのアリコートを分析用に採取し、残りの懸濁液を１２Ｍｗｔ．〜１４Ｍｗｔ．のカットオフ透析チューブに移し、１回につき４ＬのＤＩ水を４回交換して透析した。
７− 総容量を測定し、１ｍｌのアリコートを分析用に採取した。残りの懸濁液をバイアルに分注した。それぞれ、ＰＬＧ上のタンパク質を１μｇまたは１０μｇのいずれかの量を含んでいた。
８− 凍結乾燥させる前に、ＤＩ水中２５％のマンニトール溶液（２１６μｌ）を各バイアルに加えた。
【０１０２】
（実施例６：特徴付け）
１− 各懸濁液（実施例４の工程５由来）の１ｍｌを、１２Ｍｗｔ〜１４Ｍｗｔ．のカットオフ透析チューブ中で１回につき４Ｌの水を２回交換して、一晩透析し、凍結乾燥した。
２− 各懸濁液（実施例４の工程５由来）の残りの１ｍｌおよび実施例５の工程６由来のアリコートを、３０ｍｌの水を使用して、遠心分離によって洗浄し、凍結乾燥した。
３− 実施例５の工程７由来の１ｍｌのアリコートを凍結乾燥した。
４− 上記の工程１、工程２、および工程３の凍結乾燥された処方物（各５ｍｇ）を、各１ｍｌの０．２Ｎ ＮａＯＨ／５％ ＳＤＳによって加水分解し、Ｍｉｃｒｏ ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ、ＵＳＡ製）によって、タンパク質含量を測定した。
５− 各１０ｍｇの未洗浄の粒子（上記の工程１および工程３由来）を１ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、３７℃で１時間、揺らし続けた。そして、Ｍｉｃｒｏ ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ、ＵＳＡ製）によって上清中のタンパク質を測定することによって、バーストリリース（ｂｕｒｓｔ ｒｅｌｅａｓｅ）を決定した。
【０１０３】
【表１】
（実施例７：インビボのデータ）
実施例４の工程５および実施例５の工程７由来のＰＬＧ粒子上に吸着されたタンパク質を１０μｇまたは１μｇのいずれか含む１００μｌによって、１０匹のＣＤ１マウスの群をそれぞれ、０週間、３週間、および５週間間隔で筋肉内注射により免疫し、５週目および７週目に血清を収集した。
【０１０４】
ＭｅｎＢ特異的抗体を測定するために設計された酵素連結イムノソルベントアッセイを、５週目と７週目のマウスの血清に対して行った。Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｕ底プレート（Ｎａｌｇｅｎｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を精製した２８７タンパク質（１μｇ／ｍｌ）でコートした。血清を１：１００希釈および１：４００希釈（その後、連続して３倍希釈される）で試験した。西洋ワサビペルオキシダーゼと結合体化した抗マウスＩｇＧヤギ抗体（１：４０，０００に希釈されたＣＡＬＴＡＧ）を二次抗体として使用した。３７℃で１時間のインキュベーションの後で、プレートを洗浄して、未結合の抗体を取り除いた。ＴＭＢ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＫＰＬ）基質を使用してプレートを発色させ、２Ｎ ＨＣｌを加えることにより、発色反応を１５分後に止めた。報告する力価（幾何平均力価（ＧＭＴ）および標準誤差（ＳＴＥ））は、４５０ｎｍで最適な光学濃度である０．５ ＥＬＩＳＡ吸収単位を示す血清の希釈率の逆数である。
【０１０５】
【表２】
本発明の好ましい実施形態をいくらか詳細に記載したが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、明らかな変更がなされ得ることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】図１は、本発明の微粒子組成物の生成に適切な装置の模式図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微粒子組成物であって、
（ａ）ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物、およびポリシアノアクリレートからなる群より選択されるポリマーを含む、微粒子と、
（ｂ）該微粒子に吸着したポリペプチド含有分子と、
を含み、該微粒子組成物は、界面活性剤の非存在下で形成される、微粒子組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の微粒子組成物であって、前記ポリマーは、ポリ（α−ヒドロキシ酸）を含む、微粒子組成物。
【請求項３】
請求項２に微粒子組成物であって、前記ポリ（α−ヒドロキシ酸）が、ポリ（Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）、およびポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）からなる群より選択される、微粒子組成物。
【請求項４】
請求項３に記載の微粒子組成物であって、前記ポリマーが、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）を含む、微粒子組成物。
【請求項５】
請求項４に記載の微粒子組成物であって、前記ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）が、２５：７５〜７５：２５の範囲にあるラクチド／グリコリドモル比を有し、かつ１０，０００ダルトン〜１００，０００ダルトンの範囲にある分子量を有する、微粒子組成物。
【請求項６】
請求項４に記載の微粒子組成物であって、前記ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）が、４０：６０〜６０：４０の範囲にあるラクチド／グリコリドモル比を有し、かつ２０，０００ダルトン〜７０，０００ダルトンの範囲にある分子量を有する、微粒子組成物。
【請求項７】
請求項１〜６のうちのいずれか１項に記載の微粒子組成物であって、前記ポリペプチド含有分子が、抗原である、微粒子組成物。
【請求項８】
請求項７に記載の微粒子組成物であって、前記抗原が、ＨＩＶ抗原、髄膜炎Ｂ群抗原、連鎖球菌抗原、Ｂ型肝炎ウイルス抗原、Ｃ型肝炎ウイルス抗原、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｂ型抗原、百日咳抗原、ジフテリア抗原、破傷風抗原、Ｈｅｌｉｃｏｂａｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ抗原、およびインフルエンザＡ型赤血球凝集素抗原から選択される、微粒子組成物。
【請求項９】
請求項７に記載の微粒子組成物であって、前記抗原が、ＨＩＶ ｇｐ４１抗原、ＨＩＶ ｇｐ１２０抗原、ＨＩＶ ｇｐ１４０抗原、ＨＩＶ ｐ２４ｇａｇ抗原、ＨＩＶ ｐ５５ｇａｇ抗原、髄膜炎Ｂ群組換えタンパク質２８７抗原、およびＢ群連鎖球菌抗原からなる群より選択される、微粒子組成物。
【請求項１０】
請求項１〜９のうちのいずれか１項に記載の微粒子組成物であって、薬学的に受容可能な賦形剤をさらに含む、微粒子組成物。
【請求項１１】
請求項１０に記載の微粒子組成物であって、さらなる生理活性高分子をさらに含み、該さらなる生理活性高分子は、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオシド、医薬品、ホルモン、酵素、転写媒介因子もしくは翻訳媒介因子、代謝経路中間体、免疫調節因子、およびアジュバントからなる群より選択される、微粒子組成物。
【請求項１２】
請求項１１に記載の微粒子組成物であって、前記さらなる生理活性高分子がアジュバントである、微粒子組成物。
【請求項１３】
請求項１２に記載の微粒子組成物であって、前記アジュバントが、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、二本鎖ＲＮＡアジュバント、アミノアルキルグルコサミド４−リン酸アジュバント、イミダゾキノリンアジュバント、リポ多糖模倣アジュバント、サポニンアジュバント、Ｅ．ｃｏｌｉ易熱性毒素アジュバント、モノホスホリルリピドＡアジュバント、およびアルミニウム塩からなる群より選択される構成要素である、微粒子組成物。
【請求項１４】
請求項１２に記載の微粒子組成物であって、前記アジュバントがリン酸アルミニウムである、微粒子組成物。
【請求項１５】
疾患診断のための、請求項１０〜１４のうちのいずれか１項に記載の微粒子組成物の使用。
【請求項１６】
疾患処置のための、請求項１０〜１４のうちのいずれか１項に記載の微粒子組成物の使用。
【請求項１７】
ワクチンのための、請求項１０〜１４のうちのいずれか１項に記載の微粒子組成物の使用。
【請求項１８】
免疫応答を惹起するための、請求項１０〜１４のうちのいずれか１項に記載の微粒子組成物の使用。
【請求項１９】
脊椎動物被検体に治療有効量のポリペプチド含有分子を送達する方法であって、該方法は、
請求項１０〜１４のうちのいずれか１項に記載の微粒子組成物を、該脊椎動物被検体に投与する工程
を包含する、方法。
【請求項２０】
請求項７に記載の微粒子組成物であって、前記抗原が、ポリペプチドに結合体化した多糖を含む、微粒子組成物。
【請求項２１】
請求項１７に記載の使用であって、前記ワクチンが非経口ワクチンである、使用。
【請求項２２】
微粒子組成物を生成するための方法であって、該方法は、
（ａ）界面活性剤を用いない乳化プロセスにより微粒子を形成する工程であって、該微粒子は、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクタム、ポリオルトエステル、ポリ無水物、およびポリシアノアクリレートからなる群より選択されるポリマーを含む、工程；ならびに
（ｂ）ポリペプチド含有分子を該微粒子表面上に吸着させて、該微粒子組成物を形成する工程、
を包含する、方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法であって、前記乳化プロセスは、
（ａ）有機溶媒、水、および前記ポリマーを含むエマルジョンを形成する工程；ならびに
（ｂ）該エマルジョンから該有機溶媒を除去して、微粒子を形成する工程、
を包含する、方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法であって、前記エマルジョンが、水中油中水エマルジョンであり、該水中油中水エマルジョンは、
（ａ）前記ポリマーと前記有機溶媒とを含む有機相を、水を含む第１水相を用いて乳化して、油中水エマルジョンを形成する工程；ならびに
（ｂ）水を含む第２水相を、該工程（ａ）において形成されたエマルジョンを用いて乳化して、水中油中水エマルジョンを形成する工程、
を包含するプロセスによって形成される、方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法であって、前記乳化工程が、高剪断ホモジナイザーにて実行される、方法。
【請求項２６】
請求項２２〜２５のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記ポリマーが、ポリ（α−ヒドロキシ酸）である、方法。
【請求項２７】
請求項２２〜２５のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記ポリマーが、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）である、方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法であって、前記ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）が、２５：７５〜７５：２５の範囲にあるラクチド／グリコリドモル比を有し、かつ１０，０００ダルトン〜１００，０００ダルトンの範囲にある分子量を有する、方法。
【請求項２９】
請求項２７に記載の方法であって、前記ポリマーが、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）であり、該ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）は、４０：６０〜６０：４０の範囲にあるラクチド／グリコリドモル比を有し、かつ２０，０００ダルトン〜７０，０００ダルトンの範囲にある分子量を有する、方法。
【請求項３０】
請求項２２〜２９のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記ポリペプチド含有分子が抗原である、方法。
【請求項３１】
請求項３０に記載の方法であって、前記抗原が、ＨＩＶ抗原、髄膜炎Ｂ群抗原、連鎖球菌抗原、Ｂ型肝炎ウイルス抗原、Ｃ型肝炎ウイルス抗原、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｂ型抗原、百日咳抗原、ジフテリア抗原、破傷風抗原、Ｈｅｌｉｃｏｂａｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ抗原、およびインフルエンザＡ型赤血球凝集素抗原から選択される、方法。
【請求項３２】
請求項３０に記載の方法であって、前記抗原が、ＨＩＶ ｇｐ４１抗原、ＨＩＶ ｇｐ１２０抗原、ＨＩＶ ｇｐ１４０抗原、ＨＩＶ ｐ２４ｇａｇ抗原、ＨＩＶ ｐ５５ｇａｇ抗原、髄膜炎Ｂ群組換えタンパク質２８７抗原、およびＢ群連鎖球菌抗原からなる群より選択される、方法。
【請求項３３】
請求項２２〜３２のうちのいずれか１項に記載のプロセスにより形成される、微粒子組成物。
【請求項３４】
請求項２２〜３２のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記吸着したポリペプチド含有分子と前記ポリマーとの重量対重量比が、０．００１：１と０．１：１との間の範囲にある、方法。
【請求項３５】
請求項１〜１４、２０および３３のうちのいずれか１項に記載の微粒子組成物であって、前記吸着したポリペプチド含有分子と前記ポリマーとの重量対重量比が、０．０１：１と０．０５：１との間の範囲にある、微粒子組成物。
【請求項１】
微粒子組成物であって、
（ａ）ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物、およびポリシアノアクリレートからなる群より選択されるポリマーを含む、微粒子と、
（ｂ）該微粒子に吸着したポリペプチド含有分子と、
を含み、該微粒子組成物は、界面活性剤の非存在下で形成される、微粒子組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の微粒子組成物であって、前記ポリマーは、ポリ（α−ヒドロキシ酸）を含む、微粒子組成物。
【請求項３】
請求項２に微粒子組成物であって、前記ポリ（α−ヒドロキシ酸）が、ポリ（Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）、およびポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）からなる群より選択される、微粒子組成物。
【請求項４】
請求項３に記載の微粒子組成物であって、前記ポリマーが、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）を含む、微粒子組成物。
【請求項５】
請求項４に記載の微粒子組成物であって、前記ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）が、２５：７５〜７５：２５の範囲にあるラクチド／グリコリドモル比を有し、かつ１０，０００ダルトン〜１００，０００ダルトンの範囲にある分子量を有する、微粒子組成物。
【請求項６】
請求項４に記載の微粒子組成物であって、前記ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）が、４０：６０〜６０：４０の範囲にあるラクチド／グリコリドモル比を有し、かつ２０，０００ダルトン〜７０，０００ダルトンの範囲にある分子量を有する、微粒子組成物。
【請求項７】
請求項１〜６のうちのいずれか１項に記載の微粒子組成物であって、前記ポリペプチド含有分子が、抗原である、微粒子組成物。
【請求項８】
請求項７に記載の微粒子組成物であって、前記抗原が、ＨＩＶ抗原、髄膜炎Ｂ群抗原、連鎖球菌抗原、Ｂ型肝炎ウイルス抗原、Ｃ型肝炎ウイルス抗原、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｂ型抗原、百日咳抗原、ジフテリア抗原、破傷風抗原、Ｈｅｌｉｃｏｂａｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ抗原、およびインフルエンザＡ型赤血球凝集素抗原から選択される、微粒子組成物。
【請求項９】
請求項７に記載の微粒子組成物であって、前記抗原が、ＨＩＶ ｇｐ４１抗原、ＨＩＶ ｇｐ１２０抗原、ＨＩＶ ｇｐ１４０抗原、ＨＩＶ ｐ２４ｇａｇ抗原、ＨＩＶ ｐ５５ｇａｇ抗原、髄膜炎Ｂ群組換えタンパク質２８７抗原、およびＢ群連鎖球菌抗原からなる群より選択される、微粒子組成物。
【請求項１０】
請求項１〜９のうちのいずれか１項に記載の微粒子組成物であって、薬学的に受容可能な賦形剤をさらに含む、微粒子組成物。
【請求項１１】
請求項１０に記載の微粒子組成物であって、さらなる生理活性高分子をさらに含み、該さらなる生理活性高分子は、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオシド、医薬品、ホルモン、酵素、転写媒介因子もしくは翻訳媒介因子、代謝経路中間体、免疫調節因子、およびアジュバントからなる群より選択される、微粒子組成物。
【請求項１２】
請求項１１に記載の微粒子組成物であって、前記さらなる生理活性高分子がアジュバントである、微粒子組成物。
【請求項１３】
請求項１２に記載の微粒子組成物であって、前記アジュバントが、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、二本鎖ＲＮＡアジュバント、アミノアルキルグルコサミド４−リン酸アジュバント、イミダゾキノリンアジュバント、リポ多糖模倣アジュバント、サポニンアジュバント、Ｅ．ｃｏｌｉ易熱性毒素アジュバント、モノホスホリルリピドＡアジュバント、およびアルミニウム塩からなる群より選択される構成要素である、微粒子組成物。
【請求項１４】
請求項１２に記載の微粒子組成物であって、前記アジュバントがリン酸アルミニウムである、微粒子組成物。
【請求項１５】
疾患診断のための、請求項１０〜１４のうちのいずれか１項に記載の微粒子組成物の使用。
【請求項１６】
疾患処置のための、請求項１０〜１４のうちのいずれか１項に記載の微粒子組成物の使用。
【請求項１７】
ワクチンのための、請求項１０〜１４のうちのいずれか１項に記載の微粒子組成物の使用。
【請求項１８】
免疫応答を惹起するための、請求項１０〜１４のうちのいずれか１項に記載の微粒子組成物の使用。
【請求項１９】
脊椎動物被検体に治療有効量のポリペプチド含有分子を送達する方法であって、該方法は、
請求項１０〜１４のうちのいずれか１項に記載の微粒子組成物を、該脊椎動物被検体に投与する工程
を包含する、方法。
【請求項２０】
請求項７に記載の微粒子組成物であって、前記抗原が、ポリペプチドに結合体化した多糖を含む、微粒子組成物。
【請求項２１】
請求項１７に記載の使用であって、前記ワクチンが非経口ワクチンである、使用。
【請求項２２】
微粒子組成物を生成するための方法であって、該方法は、
（ａ）界面活性剤を用いない乳化プロセスにより微粒子を形成する工程であって、該微粒子は、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクタム、ポリオルトエステル、ポリ無水物、およびポリシアノアクリレートからなる群より選択されるポリマーを含む、工程；ならびに
（ｂ）ポリペプチド含有分子を該微粒子表面上に吸着させて、該微粒子組成物を形成する工程、
を包含する、方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法であって、前記乳化プロセスは、
（ａ）有機溶媒、水、および前記ポリマーを含むエマルジョンを形成する工程；ならびに
（ｂ）該エマルジョンから該有機溶媒を除去して、微粒子を形成する工程、
を包含する、方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法であって、前記エマルジョンが、水中油中水エマルジョンであり、該水中油中水エマルジョンは、
（ａ）前記ポリマーと前記有機溶媒とを含む有機相を、水を含む第１水相を用いて乳化して、油中水エマルジョンを形成する工程；ならびに
（ｂ）水を含む第２水相を、該工程（ａ）において形成されたエマルジョンを用いて乳化して、水中油中水エマルジョンを形成する工程、
を包含するプロセスによって形成される、方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法であって、前記乳化工程が、高剪断ホモジナイザーにて実行される、方法。
【請求項２６】
請求項２２〜２５のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記ポリマーが、ポリ（α−ヒドロキシ酸）である、方法。
【請求項２７】
請求項２２〜２５のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記ポリマーが、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）である、方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法であって、前記ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）が、２５：７５〜７５：２５の範囲にあるラクチド／グリコリドモル比を有し、かつ１０，０００ダルトン〜１００，０００ダルトンの範囲にある分子量を有する、方法。
【請求項２９】
請求項２７に記載の方法であって、前記ポリマーが、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）であり、該ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）は、４０：６０〜６０：４０の範囲にあるラクチド／グリコリドモル比を有し、かつ２０，０００ダルトン〜７０，０００ダルトンの範囲にある分子量を有する、方法。
【請求項３０】
請求項２２〜２９のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記ポリペプチド含有分子が抗原である、方法。
【請求項３１】
請求項３０に記載の方法であって、前記抗原が、ＨＩＶ抗原、髄膜炎Ｂ群抗原、連鎖球菌抗原、Ｂ型肝炎ウイルス抗原、Ｃ型肝炎ウイルス抗原、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｂ型抗原、百日咳抗原、ジフテリア抗原、破傷風抗原、Ｈｅｌｉｃｏｂａｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ抗原、およびインフルエンザＡ型赤血球凝集素抗原から選択される、方法。
【請求項３２】
請求項３０に記載の方法であって、前記抗原が、ＨＩＶ ｇｐ４１抗原、ＨＩＶ ｇｐ１２０抗原、ＨＩＶ ｇｐ１４０抗原、ＨＩＶ ｐ２４ｇａｇ抗原、ＨＩＶ ｐ５５ｇａｇ抗原、髄膜炎Ｂ群組換えタンパク質２８７抗原、およびＢ群連鎖球菌抗原からなる群より選択される、方法。
【請求項３３】
請求項２２〜３２のうちのいずれか１項に記載のプロセスにより形成される、微粒子組成物。
【請求項３４】
請求項２２〜３２のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記吸着したポリペプチド含有分子と前記ポリマーとの重量対重量比が、０．００１：１と０．１：１との間の範囲にある、方法。
【請求項３５】
請求項１〜１４、２０および３３のうちのいずれか１項に記載の微粒子組成物であって、前記吸着したポリペプチド含有分子と前記ポリマーとの重量対重量比が、０．０１：１と０．０５：１との間の範囲にある、微粒子組成物。
【図１】
【公表番号】特表２００６−５０７２１３（Ｐ２００６−５０７２１３Ａ）
【公表日】平成１８年３月２日（２００６．３．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００３−５６９８０２（Ｐ２００３−５６９８０２）
【出願日】平成１５年２月２０日（２００３．２．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／００５０１７
【国際公開番号】ＷＯ２００３／０７０９０９
【国際公開日】平成１５年８月２８日（２００３．８．２８）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
ＴＥＦＬＯＮ
【出願人】（５９１０７６８１１）カイロン コーポレイション (265)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年３月２日（２００６．３．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年２月２０日（２００３．２．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／００５０１７
【国際公開番号】ＷＯ２００３／０７０９０９
【国際公開日】平成１５年８月２８日（２００３．８．２８）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
ＴＥＦＬＯＮ
【出願人】（５９１０７６８１１）カイロン コーポレイション (265)
【Ｆターム（参考）】
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