吸着体およびそれを用いた精製方法
【課題】各種吸着体、特に治療用または医療用吸着体や抗体医薬品精製用吸着体に関し、高線速下での動的吸着容量が大きい吸着体を提供する。
【解決手段】メジアン粒径が３０μｍ以上６５μｍ以下である多孔質担体に、抗体結合性タンパク質リガンドを固定化することにより、高線速下での動的吸着容量が大きい吸着体を得ることができ、アフィニティークロマトグラフィーを用いた各種目的物の精製（特に、抗体医薬品精製）や、治療用（医療用）吸着体に好適に利用することができる。
【解決手段】メジアン粒径が３０μｍ以上６５μｍ以下である多孔質担体に、抗体結合性タンパク質リガンドを固定化することにより、高線速下での動的吸着容量が大きい吸着体を得ることができ、アフィニティークロマトグラフィーを用いた各種目的物の精製（特に、抗体医薬品精製）や、治療用（医療用）吸着体に好適に利用することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は各種吸着体、特に治療用（医療用）吸着体や抗体医薬品精製用吸着体に関する。
【背景技術】
【０００２】
吸着体、例えば各種クロマトグラフィー用吸着体やアフィニティー吸着体は、効率よく目的物を精製、または不要物濃度を低減できることから、従来より幅広い分野で使用されている。なかでも、アフィニティー吸着体は医療用吸着体や抗体医薬品精製用吸着体としての利用が進んできている。特に、リウマチ、血友病、拡張型心筋症の治療用（医療用）吸着体として、プロテインＡをアフィニティーリガンドとして多孔質担体に固定化した吸着体が注目されている（例えば非特許文献１、非特許文献２）。一方、免疫グロブリン（ＩｇＧ）を特異的に吸着、溶出できる吸着体として、プロテインＡをアフィニティーリガンドとして多孔質担体に固定化した吸着体（抗体医薬品精製用吸着体）が注目されている。通常これらアフィニティー吸着体は、カラムに充填されて用いられることから、動的吸着容量が重要視される。しかしながら、一般的なアフィニティー吸着体の動的吸着容量は、その静的吸着容量より小さく、特にその傾向は、吸着処理の線速が大きい場合に顕著であり、高価なアフィニティーリガンドを有効に活用できていないといえる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２００５． Ｖｏｌ．１０５１ Ｐ６３５−６４６
【非特許文献２】Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｅａｒｔ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｖｏｌ．１５２， Ｎｕｍｂｅｒ ４ ２００６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は従来の技術が有する上記課題に鑑みてなされたものであり、高線速下でも動的吸着容量が大きい吸着体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題を解決するために本発明者らは鋭意研究の結果、下記発明を提供した。
【０００６】
即ち本発明は、多孔質担体に抗体結合性タンパク質リガンドを固定してなる吸着体であって、メジアン粒径が３０μｍ以上６５μｍ以下である事をを特徴とする吸着体を提供する。
【０００７】
また本発明は、５％圧縮時の圧縮応力が０．０１ＭＰａ以上１ＭＰａ以下、１０％圧縮時の圧縮応力が０．０３ＭＰａ以上３ＭＰａ以下、および１５％圧縮時の圧縮応力が０．０６ＭＰａ以上５ＭＰａ以下であることを特徴とする、吸着体に関する。
【０００８】
また本発明は、５％圧縮時の圧縮応力が０．０２ＭＰａ以上１ＭＰａ以下、１０％圧縮時の圧縮応力が０．０６ＭＰａ以上３ＭＰａ以下、および１５％圧縮時の圧縮応力が０．１ＭＰａ以上５ＭＰａ以下であることを特徴とする、吸着体に関する。
【０００９】
また本発明は、樹脂含量が２％以上５０％以下であることを特徴とする吸着体に関する。
【００１０】
また本発明は、吸着体および／またはその前駆体が架橋されていることを特徴とする、吸着体に関する。
【００１１】
また本発明は、抗体結合性タンパク質リガンドの密度が１〜１０ｍｇ／ｍｌであることを特徴とする、吸着体に関する。
【００１２】
また本発明は、サイズ110kDaのデキストランに対するKavが0.65以上であることを特徴とする、吸着体に関する。
【００１３】
また本発明は、多孔質担体が炭水化物を含有することを特徴とする、吸着体に関する。
【００１４】
また本発明は、炭水化物が多糖類であることを特徴とする、吸着体に関する。
【００１５】
また本発明は、多糖類がセルロースおよび／またはセルロース誘導体であることを特徴とする請求項９に記載の吸着体に関する。
【００１６】
また本発明は、抗体結合性タンパク質リガンドがプロテインＡであることを特徴とする、吸着体に関する。
【００１７】
また本発明は、精製目的物の吸着量が精製用吸着体１ｍＬあたり１〜１００ｍｇであることを特徴とする、吸着体に関する。
【００１８】
また本発明は、動的吸着容量／静的吸着容量が０．７以上であることを特徴とする、吸着体に関する。
【００１９】
また本発明は、吸着体から精製目的物中にリークしたリガンドの濃度が、１００ｐｐｍ以下であることを特徴とする、吸着体に関する。
【００２０】
また本発明は、吸着体を用いた精製方法に関する。
【００２１】
また本発明は、直径２ｃｍ以上及び高さ５ｃｍ以上のカラムを用いることを特徴とする、精製方法に関する。
【００２２】
また本発明は、線速が１００〜１０００ｃｍ／ｈで通液する工程を有することを特徴とする、精製方法に関する。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、高線速下での動的吸着容量が大きい吸着体が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明者らは鋭意研究の結果、理由は定かではないが、驚くべきことに、多孔質担体に抗体結合性タンパク質リガンドを固定してなる吸着体であって、メジアン粒径が３０μｍ以上６５μｍ以下である事を特徴とする吸着体を提供することにより、高線速下での動的吸着容量が大きい吸着体が得られた。メジアン粒径が３０μｍ未満であれば、高線速下で使用した場合、圧密化が生じてしまい、またカラム底部の担持ろ材をすり抜け易くなる。また65μｍ以上であると、高線速下での動的吸着容量が小さくなる。また、メジアン粒径は４０μｍ以上６５μｍ以下であることが好ましく、５０μｍ以上６５μｍ以下であることがより好ましく、５５μｍ以上６５μｍ以下であることが特に好ましく、６０μｍ以上６５μｍ以下が最も好ましい。ここで、メジアン粒径とは、累積体積分布が５０％の時の粒径である（ｄ５０ｖ）。メジアン粒径は、ランダムに選んだ１００個以上の吸着体の粒径を測定して求めることができる。個々の多孔質担体の粒径は、個々の多孔質担体の顕微鏡写真を撮影して電子データーとして保存し、粒径測定ソフトウェア（メディアサイバーネティックス社製イメージプロプラス）を用いて、測定することができる。
【００２５】
吸着体は治療用（医療用）吸着体をはじめとする各種クロマトグラフィー用吸着体やアフィニティー吸着体として広く用いられているが、特に抗体医薬品精製の分野においては、抗体医薬品市場の大きな伸びに伴って、精製の大スケール化及び高線速化が積極的に行われている。精製の大スケール化及び高線速化に伴って、精製に用いられる吸着体、つまりは多孔質担体の強度を大きくする必要が生じる場合がある。また、本発明の吸着体は、通常産業用途に用いられているアフィニティー吸着体に比べると粒径が小さい傾向にある。そのため、本発明の吸着体は、高強度であることが好ましい。高強度であれば、高線速下での使用においても、圧密化が生じにくくなり、好ましい。本発明者らは強度の指標として、圧縮応力を用いている。本発明の吸着体は５％圧縮時の圧縮応力が０．０１ＭＰａ以上１ＭＰａ以下、１０％圧縮時の圧縮応力が０．０３ＭＰａ以上３ＭＰａ以下、および１５％圧縮時の圧縮応力が０．０６ＭＰａ以上５ＭＰａ以下であることが好ましい。これによれば、大スケール、高線速で精製を行っても圧密化を生じない吸着体が得られやすいため、好ましい。また、吸着体の５％圧縮時の圧縮応力が１ＭＰＡ以下、１０％圧縮時の圧縮応力が３ＭＰＡ以下、および１５％圧縮時の圧縮応力が５ＭＰＡ以下であれば、脆性が向上し、微粒子発生が抑制されやすいため、好ましい。
【００２６】
ここで、５％圧縮時の圧縮応力とは、吸着体が圧縮されて、初期体積より体積が５％減少した時の応力、１０％圧縮時の圧縮応力とは、吸着体が圧縮されて、初期体積より体積が１０％減少した時の応力、１５％圧縮時の圧縮応力とは、吸着体が圧縮されて、初期体積より体積が１５％減少した時の応力である。初期体積とは、吸着体を含むスラリーに振動を与えながら、吸着体の体積が減少しなくなるまで沈降させて充填した状態の体積である。圧縮時の圧縮応力は、以下の方法で測定しうるものである。
１） 内径１５ｍｍのガラス製メスシリンダーに吸着体の５０ｖｏｌ％のスラリーを投入する。
２） ガラス製メスシリンダーに振動を与えながら、吸着体の体積が減少しなくなるまで沈降させて充填し、多孔質担体体積が約４ｍＬとなるよう多孔質担体量を調整する。この時の体積を初期体積とする。
３） 金属製ピストン（メスシリンダーの内壁と摩擦を生じず、且つ吸着体が漏れないように加工したもの）を、２０Ｎ用ロードセルを装着したオートグラフ（ＳＨＩＭＡＤＺＵ製ＥＺ−ＴＥＳＴ）に取り付ける。
４） 吸着体の１２０ｖｏｌ％に相当する位置にピストンの底面を合わせる。
５） 気泡が入らないように、試験速度５ｍｍ／ｍｉｎでピストンを下降させ、多孔質担体を圧縮して体積を減少させる。
６） 任意の点の圧縮応力を測定する。
【００２７】
また、本発明の吸着体は、５％圧縮時の圧縮応力が０．０１ＭＰＡ以上１ＭＰＡ以下、１０％圧縮時の圧縮応力が０．０４ＭＰＡ以上３ＭＰＡ以下、および１５％圧縮時の圧縮応力が０．０６ＭＰＡ以上５ＭＰＡ以下であることがより好ましく、さらに、５％圧縮時の圧縮応力が０．０１ＭＰＡ以上１ＭＰＡ以下、１０％圧縮時の圧縮応力が０．０６ＭＰＡ以上３ＭＰＡ以下、および１５％圧縮時の圧縮応力が０．０７ＭＰＡ以上５ＭＰＡ以下であることが好ましい。特に、繰り返し使用に適しているという理由から、吸着体の５％圧縮時の圧縮応力が０．０２ＭＰＡ以上１ＭＰＡ以下、１０％圧縮時の圧縮応力が０．０６ＭＰＡ以上３ＭＰＡ以下、および１５％圧縮時の圧縮応力が０．０９ＭＰＡ以上５ＭＰＡ以下であることが特に好ましく、最も好ましくは、５％圧縮時の圧縮応力が０．０２ＭＰＡ以上１ＭＰＡ以下、１０％圧縮時の圧縮応力が０．０８ＭＰＡ以上３ＭＰＡ以下、および１５％圧縮時の圧縮応力が０．１１ＭＰＡ以上５ＭＰＡ以下である。また、コストの観点から、５％圧縮時の圧縮応力が０．５ＭＰＡ以下、１０％圧縮時の圧縮応力が１．５ＭＰＡ以下、および１５％圧縮時の圧縮応力が２．５ＭＰＡ以下であることが好ましく、５％圧縮時の圧縮応力が０．２ＭＰＡ以下、１０％圧縮時の圧縮応力が０．７ＭＰＡ以下、および１５％圧縮時の圧縮応力が２ＭＰＡ以下であることが好ましく、さらに５％圧縮時の圧縮応力が０．１ＭＰＡ以下、１０％圧縮時の圧縮応力が０．３ＭＰＡ以下、および１５％圧縮時の圧縮応力が２ＭＰＡ以下であることが特に好ましい。
【００２８】
プロテインＡをアフィニティーリガンドとして多孔質担体に固定化する方法としては、多孔質担体が含有するホルミル基と、プロテインＡのアミノ基との反応を利用する方法が挙げられ、本発明に好ましく用いる事ができる。
【００２９】
また、高強度を達成する方法としては特に限定は無いが、吸着体の樹脂含量を大きくすることが好ましい。本発明の吸着体の充填体積あたりの樹脂含量は、２％以上５０％以下であることが好ましい。充填体積あたりの樹脂含量が２％以上であれば、大スケール、高線速で精製を行っても圧密化を生じない吸着体が得られるため好ましい。また、充填体積あたりの樹脂含量が５０％以下であると、精製目的物を吸着させるに十分な大きさの孔を確保できるため好ましい。また、充填体積あたりの樹脂含量のより好ましい範囲は４％以上２５％以下、さらに好ましくは５％以上１５％以下であり、最も好ましくは８％以上１２％以下である。充填体積あたりの樹脂含量は、多孔質担体体積が減少しなくなるまで沈降させて充填し、多孔質担体体積が１ｍＬとなるよう多孔質担体量を調整する。この担体を１０５℃で１２時間乾燥させ、その乾燥重量から、充填体積あたりの乾燥重量パーセント、つまり樹脂含量を求めることができる。
【００３０】
また、高強度を達成しつつも多孔質担体の細孔径が小さくなり難いという利点から、架橋剤を作用させて多孔質担体の強度を大きくすることがより好ましい。すなわち、本発明の製造方法において、前記多孔質担体が架橋されていることが好ましい。本発明に用いることができる架橋剤や架橋反応条件に特に限定は無く、公知の技術を用いて行うことができる。例えば、エピクロロヒドリン、エピブロモヒドリン、ジクロロヒドリン等のハロヒドリンや、レソルシノールジグリシジルエーテル、ネオペンチルグリコールジグリシジルエーテル、１，６−ヘキサンジオールジグリシジルエーテル、ヒドロゲナートビスフェノールＡジグリシジルエーテル、グリセロールジグリシジルエーテル、グリセロールポリグリシジルエーテル、トリメチロールプロパンジグリシジルエーテル、ジグリシジルテレフタレート、ジグリシジルオルトフタレート、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ジエチレングリコールジグリシジルエーテル、プロピレングリコールジグリシジルエーテル等の２官能以上のエポキシ化合物を作用させることによって、架橋を行うことができる。
【００３１】
これら架橋剤を用いて、多孔質担体の強度を大きくする方法に特に限定は無いが、反応効率の観点から、これら架橋剤をアルカリ条件下で担体に作用させることが好ましい。架橋剤の投入方法には特に限定は無く、全使用量を反応初期から投入しても良いし、複数回に分けて反応を繰り返しても良く、また滴下ロート等を用いて、少量ずつ架橋剤を投入しても良く、また架橋剤が投入された反応容器に多孔質担体を投入しても良い。架橋反応の溶媒については特に限定は無いが、水、ヘプタン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジオキソラン等の汎用有機溶媒や、エタノール、メタノール、プロパノール等のアルコールや、これらの２種以上の混合溶媒を用いることができる。また、反応効率を高めるため、ソディウムボロヒドリド等の還元剤を共存させることがより好ましい。架橋反応時の温度については特に限定は無いが、反応速度的に有利であるという理由から０℃以上であることが好ましく、および／または安全性や多孔質担体へのダメージの観点から１００℃以下であることが好ましく、官能基が失活し難いという理由から７０℃以下であることがより好ましい。架橋反応は攪拌または振とうしながら行うことが好ましく、その１分間当りの回転数または回数は、特に限定は無いが、均一攪拌が可能で、且つ多孔質担体に物理的なダメージが加わらないという理由から１分間あたり１回以上１０００回以下であることが好ましく、より好ましくは１０回以上５００回以下、さらに好ましくは３０回以上３００回以下、特に好ましくは５０回以上２００回以下、最も好ましくは７５回以上１５０回以下であるが、各原料の比重の差や多孔質担体の強度に合わせて調整し、多孔質担体が反応液中で均一に分散されている状態となることが特に好ましい。架橋反応時間については、特に限定は無いが、官能基の失活や担体へのダメージが少ないという理由から、ハロヒドリンを用いる場合は、１時間以上８時間以下、２官能以上のエポキシ化合物を用いる場合は、１時間以上、１５時間未満であることが好ましく、架橋剤の反応性や、ｐＨや、反応温度に合わせて調整することが、より好ましい。
【００３２】
また、本発明の吸着体の抗体結合性タンパク質リガンドの密度に特に限定は無いが、吸着体１ｍＬ当り、１ｍｇ以上１０ｍｇ以下であることが好ましい。アミノ基含有リガンドの固定化量が吸着体１ｍＬ当り１ｍｇ以上であれば、目的物に対する吸着量が大きくなるため好ましく、１０ｍｇ以下であれば、製造コストを抑制できるたり、目的物の溶出がし易くなるため好ましい。より好ましいアミノ基含有リガンドの固定化量は、多孔質担体１ｍＬ当り３ｍｇ以上１０ｍｇ以下であり、さらに好ましくは４ｍｇ以上１０ｍｇ以下であり、特に好ましくは５ｍｇ以上９ｍｇ以下であり、最も好ましくは６ｍｇ以上８ｍｇ以下である。アミノ基含有リガンドの固定化量は、固定化反応後の反応液上清中のアミノ基含有リガンド由来の吸光度を測定することによって求めることができる。また、元素分析法を用いて、アミノ基含有リガンドの導入量を求めることが、より好ましい。例えば、アミノ基含有リガンドであれば、吸着体のＮ含量分析を行うことにより、アフィニティーリガンドの導入量を測定することができる。
【００３３】
また、本発明の吸着体はサイズ110kDaのデキストランに対するKavが0.65以上であること好ましい。 Ｋａｖとはゲル相分配係数をいい、所定の大きさの分子に対する溶出又は保持容量ＶＲ（Ｖｅとも表される。）、空隙容量Ｖｏ及びカラムの幾何容量Ｖｃから次式で算出される、カラムとは独立した変数である。
【００３４】
Ｋａｖ＝（ＶＲ−Ｖｏ）／（Ｖｃ−Ｖｏ）
（例えばＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ，Ｓｃａｌｅ−Ｕｐ ａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ（１９９７） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ．Ｇａｉｌ Ｓｏｆｅｒ ＆ Ｌａｒｓ Ｈａｇｅｌ ｅｄｓ．ＩＳＢＮ０−１２−６５４２６６−Ｘ，ｐ．３６８参照）。
【００３５】
サイズ110kDaのデキストランに対するKavが0.65以上であれば、目的物、特にIgG等の抗体に対する吸着量が大きくなる傾向があるため好ましい。また、サイズ110kDaのデキストランに対するKavが0.65以上が０．６５以上０．９８以下であることがより好ましい。サイズ110kDaのデキストランに対するKavが0.90以下であれば、吸着体の強度が大きくなる傾向があるため好ましい。特に好ましくは、サイズ110kDaのデキストランに対するKavが0.65以上0.85以下、最も好ましくは0.70以上0.80以下である。
【００３６】
また、本発明の多孔質担体の材質には特に限定は無く、例えば、多糖類、ポリスチレン、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリル酸エステル、ポリメタクリル酸エステル、ポリビニルアルコール、およびこれらの誘導体等を挙げることができる。これらは、ヒドロキシエチルメタクリレート等のヒドロキシ基を有する高分子材料やポリエチレンオキサイド鎖を有する単量体と他の重合性単量体との共重合のようなグラフト共重合体等のコーティング層を有していてもよい。これらの中で多糖類や、ポリビニルアルコール等が、担体表面に活性基を導入しやすいため、好ましく用いることができる。なかでも本発明の多孔質担体は炭水化物を含有することが好ましい。炭水化物は一般的に入手が容易であり、また安全性が高いため、好ましく用いることができる。
【００３７】
また、本発明に用いることができる炭水化物は、多糖類であることが好ましい。多糖類は産業的に容易に得ることが可能であり、また生体に対する安全性が高いため好ましい。本発明における前記多孔質担体に用いることができる多糖類に特に限定は無いが、例えば、アガロース、セルロース、デキストリン、デキストラン、キトサン、キチン、及びこれらの誘導体等を挙げることができる。
【００３８】
また、本発明の多孔質担体に用いることができる多糖に特に限定は無いが、セルロースおよび／またはセルロース誘導体を含有することがより好ましい。セルロースまたはセルロース誘導体を含有する多孔質担体は、機械的強度が比較的高く、強靱であるため破壊されたり微粒子を生じたりすることが少なく、カラムに充填した場合に液を高線速で流しても比較的圧密化し難いため好ましい。前記セルロース誘導体に特に限定は無いが、例えば、水酸基が、アシル基（炭素数１〜１０の鎖状もしくは分岐状のものであり、飽和、不飽和結合を含む、例えば、アセチル基）、アルキル基（炭素数１〜１０の鎖状もしくは分岐状のものであり、飽和、不飽和結合を含む、例えば、メチル基、エチル基）、カルボキシメチル基、カルボキシエチル基、シアノエチル基、アミノエチル基、ニトロ基、スルホ基、リン酸基などに置換されたものが挙げられる。なかでも、本発明に用いることができるセルロース誘導体は、コストや加工性に優れるという理由から、セルロースアセテート、セルロースアセテートプロピオネート、セルロースプロピオネート、酪酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、フタル酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロースが好ましい。また、これら置換基の置換度には特に限定は無いが、クロマトグラフィーにおける使用条件（温度や使用される液体）において、耐久性を有するように調整されていることが好ましい。本発明における多孔質担体に用いることができる多糖は、強度やコストの観点から、セルロースおよび／または再生セルロースであることが最も好ましい。
【００３９】
また、本発明の吸着体の用途に特に限定は無く、例えば、抗体精製用吸着体、抗体医薬品精製用吸着体、治療用（医療用）吸着体、アフィニティー吸着体、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー用の吸着体を挙げることができる。また、本発明の吸着体は、用途に合わせた抗体結合性タンパク質リガンドが固定化されていることが好ましい。本発明の抗体結合性タンパク質リガンドに特に限定は無いが、例えば、抗体に特異性の高い抗原やタンパク質や、プロテインＧ、Ｌやその変異体、抗体結合活性を有するペプチド等を挙げることができる。特に、免疫グロブリン（ＩｇＧ）等を特異的に吸着、溶出できる吸着体として、プロテインＡをアフィニティーリガンドとして担体に固定化した吸着体が注目されている。プロテインＡを固定化した吸着体は、リウマチ、血友病、拡張型心筋症の治療用吸着体として注目されている。また、抗体医薬精製の分野においては、ＩｇＧ等の抗体の精製を大スケール、高速、及び低コストで行える吸着体が望まれている。このような観点から、本発明の吸着体は、抗体結合性タンパク質リガンドとしてプロテインＡが導入された吸着体であることが、より好ましい。本発明に用いることができるプロテインＡに特に限定は無く、天然物、遺伝子組み換え物、単量体、多量体等を制限なく使用することができる。また、抗体結合ドメイン及びその変異体を含むものや、融合蛋白質等であってもよい。また、菌体抽出物もしくは培養上清より、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー及び膜分離技術を用いた分子量分画、分画沈殿法等の手法から選択される精製法を組合せ、および／または繰り返すことにより製造された、プロテインＡを用いることもできる。特に、国際公開特許公報ＷＯ２００６／００４０６７や米国特許公報ＵＳ５１５１３５０に記載されている方法で得られたプロテインＡであることが好ましい。
【００４０】
また、本発明の吸着体の、目的物の吸着量は、吸着体１ｍＬあたり１ｍｇ以上であることが好ましい。目的物の吸着量が、吸着体１ｍＬあたり１ｍｇ以上であれば、効率よく精製が行えるため好ましい。また目的物の吸着量が、吸着体１ｍＬあたり１００ｍｇ以下であれば、吸着した目的物を吸着体から溶出しやすいため好ましい。より好ましい吸着体の、目的物の吸着量は、吸着体１ｍＬあたり５ｍｇ以上９０ｍｇ以下であり、さらに好ましくは１０ｍｇ以上８０ｍｇ以下であり、特に好ましくは２０ｍｇ以上７０ｍｇ以下であり、最も好ましくは３０ｍｇ以上６０ｍｇ以下である。
【００４１】
目的物の吸着量の求め方としては、特に限定は無いが、静的吸着量や動的吸着量によって求めることができる。例えば、静的吸着量を測定する場合は、ｐＨ７．４のリン酸バッファー（シグマ社製）で置換した吸着体０．５ｍＬに対し、７０ｍｇの目的物を３５ｍＬのｐＨ７．４のリン酸バッファー（シグマ社製）に溶解させた溶液を接触させ、２５℃で２時間攪拌した後、上清中の目的物の減少量を測定することにより求めることができる。
【００４２】
また、目的物の動的吸着量及び目的物中にリークしたリガンドの濃度を求める方法の一例を以下に述べる。
（１）溶液作製
Ａ液としてｐＨ７．４リン酸バッファー（シグマ社製）、Ｂ液としてｐＨ３．５の３５ｍＭ酢酸ナトリウム（和光純薬工業社製の酢酸、酢酸ナトリウム、ＲＯ水で調整）、Ｃ液として１Ｍ酢酸（和光純薬工業社製酢酸とＲＯ水で調整）、Ｄ液として１ｍｇ／ｍＬのヒトポリクローナルＩｇＧ溶液（バクスター社製ガンマガードとＡ液で調整）、Ｅ液として６Ｍ尿素、Ｆ液としてＡ液に対して０．２ｖｏｌ％の界面活性剤（和光純薬工業社製ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）を添加した液、中和液として２Ｍのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（シグマ社製トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンとＲＯ水で調整）を作製し、各溶液を使用前に脱泡する。
（２）充填、準備
カラムクロマトグラフィー用装置として、ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ １００（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用い、直径０．５ｃｍ、高さ１５ｃｍのカラムに２２μｍのメッシュを取り付け、本発明の吸着体をそれぞれ３ｍＬ入れ、線速４００ｃｍ／ｈで２０％エタノール水溶液（和光純薬工業社製エタノールとＲＯ水で調整）を１時間通液して充填する。フラクションコレクターに１５ｍｌの採取用チューブをセットし、溶出液の採取用チューブについては、あらかじめ中和液を入れておく。
（３）洗浄
必要に応じて、Ｆ液、Ｂ液、Ａ液、Ｃ液、Ｅ液の順に、各液を線速３００ｃｍ／ｈで吸着体の３倍量を通液する。この通液サイクルを任意の回数、繰り返す。
（４）ＩｇＧ精製
Ａ液を線速３００ｃｍ／ｈで９ｍＬ通液し、次いでＤ液をＵＶをモニターしながら、ＩｇＧが１０％破過するまで線速３００ｃｍ／ｈで通液する。次いで、Ａ液を線速３００ｃｍ／ｈで３０ｍＬ通液し、Ｂ液を線速３００ｃｍ／ｈで３０ｍＬ通液してＩｇＧを溶出させる。次にＣ液を線速３００ｃｍ／ｈで９ｍＬ，Ｅ液を線速３００ｃｍ／ｈで９ｍＬ通液する。吸着体の充填終了後からの操作をさらに２回繰り返すことにより、溶出液中のＩｇＧ量とＩｇＧ中にリークしたリガンドの濃度を求めることができる。
【００４３】
また、本発明の吸着体は、動的吸着容量／静的吸着容量が０．７以上であることが好ましい。動的吸着容量／静的吸着容量が０．７以上であれば、高価なプロテインAを効率よく使用できるため、好ましい。また、動的吸着容量／静的吸着容量が０．８０以上であることがより好ましく、０．８５以上であることが特に好ましく、０．９０以上であることが最も好ましい。この動的吸着容量は、線速３００ｃｍで精製した時の５％ダイナミックバイディングキャパシティーとしている。
【００４４】
また、本発明の吸着体は、これを用いて治療や精製を行った場合、吸着体から目的物中にリークしたリガンドの濃度が、１００ｐｐｍ以下であることが好ましい。目的物中にリークしたリガンドの濃度が１００ｐｐｍ以下であれば、治療や精製の安全性を高めることができ、さらに目的物の純度を高めることができ、精製における後工程の煩雑さが軽減されるため好ましい。より好ましい目的物中にリークしたリガンドの濃度は、０ｐｐｍ以上８０ｐｐｍ以下、さらに好ましくは０ｐｐｍ以上６０ｐｐｍ以下、特に好ましくは０ｐｐｍ以上４０ｐｐｍ以下、最も好ましくは０ｐｐｍ以上２０ｐｐｍ以下である。目的物中にリークしたリガンドの濃度は、Ｓｔｅｉｎｄｌ Ｆ． ｅｔ ａｌ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３５ （２０００） ６１−６９、に記載の方法で求めることができる。
【００４５】
本発明の吸着体のアミノ基含有リガンドのリーク量をさらに低減するために、吸着体を洗浄することが好ましい。洗浄剤や洗浄方法に特に限定は無いが、水、酢酸、アルコール、各種有機溶剤、ｐＨ２〜５の液体、ｐＨ８〜１３の液体、塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウム、リン酸水素２ナトリウム、リン酸２水素ナトリウム、緩衝剤、界面活性剤、尿素、グアニジン、グアニジン塩酸塩、その他の再生剤等の、少なくとも１種を含有する溶液等を通液、または投入して攪拌することが好ましい。また、これらの洗浄液は交互に用いたり、繰り返し用いると、リガンドのリーク量がさらに減少するため好ましい。
【００４６】
本発明の吸着体及び／または本発明の製造方法により製造された吸着体は、アフィニティークロマトグラフィーを用いた各種目的物の精製（特に、抗体医薬品精製）や、治療用（医療用）吸着体に利用することができる。精製方法や治療方法には特に限定は無く、公知の方法を好適に用いる事ができる。
【００４７】
さらに、本発明の吸着体は、目的物の吸着量が大きいにも関わらず、精製を大スケール、高速且つ低コストで行うことを可能とする。よって、本発明の吸着体を用いた精製や治療は、直径０．５ｃｍ以上及び高さ３ｃｍ以上のカラムを用いることが好ましい。直径が０．５ｃｍ以上及び高さ３ｃｍ以上であれば、精製や治療を効率よく行うことができる。また、精製や治療の精度や効率の観点から、カラムの大きさは直径２０００ｃｍ以下及び高さ５０００ｃｍ以下であることが好ましい。より好ましいカラムの大きさは直径２ｃｍ以上２００ｃｍ以下、高さ５ｃｍ以上３００ｃｍ以下であり、さらに好ましくは直径５ｃｍ以上１００ｃｍ以下及び高さ８ｃｍ以上１５０ｃｍ以下であり、特に好ましくは直径１０ｃｍ以上８５ｃｍ以下及び高さ１２ｃｍ以上８５ｃｍ以下であり、最も好ましくは直径２０ｃｍ以上８５ｃｍ以下及び高さ１４ｃｍ以上３５ｃｍ以下である。
【００４８】
また、本発明の吸着体を用いた治療や精製は、線速１００ｃｍ／ｈ以上で通液する工程を有することが好ましい。線速１００ｃｍ／ｈ以上で通液する工程を有していれば、治療や精製を効率よく行うことができるため好ましい。また治療や精製の精度や装置の耐久性の観点から、本発明の吸着体を用いた治療や精製は、線速１０００ｃｍ／ｈ以下で行うことが好ましい。より好ましい精製の線速は１５０ｃｍ／ｈ以上８００ｃｍ／ｈ以下、さらに好ましくは２５０ｃｍ／ｈ以上７５０ｃｍ／ｈ以下、特に好ましくは３００ｃｍ／ｈ以上７５０ｃｍ／ｈ以下、最も好ましくは５００ｃｍ／ｈ以上７５０ｃｍ／ｈ以下である。
【００４９】
本発明の吸着体は、本発明を用いない場合に比べて、高線速下での動的吸着容量が著しく向上する。
【実施例】
【００５０】
以下、本発明を実施例をもとに説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、反応仕込み時の多孔質担体の体積は、特に記載が無い限り、自然沈降体積である。自然沈降体積とは、多孔質担体とＲＯ水のスラリーを、計量容器に投入し、振動の無い状態で２時間静置して求めたものである。また、官能基含量、ＩｇＧ吸着量における多孔質担体の体積は、特に記載が無い限り、多孔質担体とＲＯ水のスラリーを、計量容器に投入し、振動を与えながら、それ以上体積が減少しなくなるまで沈降させた状態の体積である。
【００５１】
（作製例１）
体積平均粒径が９２μｍ、樹脂含量が６％、排除限界分子量が５０００万の多孔質セルロース担体（チッソ社製ＣＫ−Ａ）を６３μｍのメッシュ（ＮＯＮＡＫＡ ＲＩＫＡＫＩ製、ワイヤ径４５μｍ）と分級機（筒井理化学器械社製３００−ＭＭ）を用いて、２時間、湿式分級を行い、メジアン粒径が６４μｍの多孔質担体Ａを得た。多孔質担体ＡとＲＯ水の１：１スラリーを、グラスフィルター（ＴＯＰ社製１７Ｇ−２）上で１５分間吸引ろ過（サクションドライ）した。得られたサクションドライ済みの多孔質担体Ａ２７４ｇをガラス製のセパラブルフラスコ（ＴＯＰ社製２Ｌ）に投入し、これに０．６Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（和光純薬工業社製水酸化ナトリウムとＲＯ水で調整）２７４ｍＬを加え、４０℃で３０分加温した。液温が４０℃に加温された後、水素化ホウ素ナトリウム（和光純薬工業社製）を５４８ｍｇ、架橋剤としてグリセロールポリグリシジルエーテルを含有するデナコールＥＸ−３１４（ナガセケムテックス社製）２７４ｍＬの順に加え、４０℃で５時間、１２０回／分で攪拌しながら反応させた。反応終了後、グラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ−２）上で吸引ろ過しながら、多孔質担体の２０倍体積量のＲＯ水で洗浄し、架橋多孔質担体を得た。この架橋多孔質担体の５％圧縮時の圧縮応力は０．０２０ＭＰａ、１０％圧縮時の圧縮応力は０．０４９ＭＰａ、１５％圧縮時の圧縮応力は０．０８０ＭＰａであった。
【００５２】
得られた架橋多孔質担体にＲＯ水を加えて、全量を架橋多孔質担体の２倍体積量とし、ガラス製ビーカー（１Ｌ）に入れ、アルミ箔２枚で封をして、オートクレーブ（サクラ社製 高圧滅菌器ネオクレーブ）を用いて１２０℃で４０分間加温した。室温まで放冷した後、グラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ−２）上で多孔質担体の５倍体積量のＲＯ水で洗浄し、エポキシ基がグリセリル基に変化した架橋多孔質担体を得た。この洗浄後の架橋多孔質担体について、再度同様の方法で更に架橋反応を行った。得られた架橋多孔質担体の５％圧縮時の圧縮応力は０．０２６ＭＰａ、１０％圧縮時の圧縮応力は０．０６３ＭＰａ、１５％圧縮時の圧縮応力は０．１０３ＭＰａである。
【００５３】
この架橋多孔質担体にＲＯ水を加えて、全量を架橋多孔質担体の２倍体積量とし、ガラス製ビーカー（１Ｌ）に入れ、アルミ箔２枚で封をして、オートクレーブ（サクラ社製 高圧滅菌器ネオクレーブ）を用いて１２０℃で４０分間加温した。室温まで放冷した後、グラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ−２）上で多孔質担体の５倍体積量のＲＯ水で洗浄し、エポキシ基がグリセリル基に変化した、多孔質担体Ｂを得た。
【００５４】
３５ｍＬの多孔質担体ＢにＲＯ水を加えて、全量を５２ｍＬとして、セパラブルフラスコ（ＴＯＰ社製５００ｍＬ）に入れた。次に１６ｇの過ヨウ素酸ナトリウム（和光純薬工業社製）をＲＯ水に溶解させ１４００ｍLにメスアップした。この過ヨウ素酸ナトリウム水溶液３５ｍLを５００ｍＬのセパラブルフラスコに加えて、２５℃で１５分、１５０回／分で攪拌しながら反応させた。反応後、グラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ−２）上で、多孔質担体の２０倍体積量のＲＯ水で洗浄し、多孔質担体Ｃを得た。得られたホルミル基含有多孔質担体のホルミル基含量を前述の方法で測定した結果、ホルミル基含量は多孔質担体１ｍＬあたり６８μｍｏｌであった。ホルミル基含量は、ｐＨ８の０．１Ｍリン酸バッファーで置換した多孔質担体２ｍＬと、フェニルヒドラジンを溶解したｐＨ８の０．１Ｍリン酸バッファー溶液２ｍＬとを接触させ、４０℃で１時間攪拌し、ＵＶ測定により反応液の上清の２７８ｎｍ付近の吸収極大の吸光度を測定し、これにより得られたフェニルヒドラジンの多孔質担体への吸着量として見積もった。この時、フェニルヒドラジンの投入量は予想ホルミル基含量の３倍モルとし、フェニルヒドラジンの投入量に対して、多孔質担体への吸着量が１５％以下、または４５％以上であった場合は、フェニルヒドラジンの投入量を見直し、再度測定を行うものとしている。
【００５５】
（作製例２）
作製例１で作製した多孔質担体Ｃ３０ｍLとＲＯ水との１：１スラリーを１５℃に調整した後、グラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ−２）上で１５分間吸引ろ過（サクションドライ）した。得られたサクションドライ済みの多孔質担体Ｃをガラス製のセパラブルフラスコ（ＴＯＰ社製５００ｍＬ）に全量投入した。その後、このセパラブルフラスコに３．６ｇのグルコサミン塩酸塩（協和発酵社製発酵グルコサミンＫ）を投入した。次いで、グルコサミン塩酸塩を溶解しながら１５℃のＲＯ水を加え、溶解後の反応液全量が５３ｍＬとなるように調整した。反応液を１５℃に調整した後、４Ｎの水酸化ナトリウム水溶液とＲＯ水を用いて、ｐＨを１１に調整した。次いで１５℃で５時間、１５０回／分で攪拌した。その後、水素化ホウ素ナトリウム（和光純薬工業社製）を０．１７ｇ添加し、１５℃で６０分間、１５０回／分で攪拌した。反応後、グラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ−２）上で、多孔質担体の４０倍体積量のＲＯ水で洗浄した。
【００５６】
「次いで、この洗浄後の多孔質担体をガラス製のセパラブルフラスコ（ＴＯＰ社製５００ｍＬ）に全量投入し、ＲＯ水を加えて、全量が５９ｍＬとなるように調整した。その後、水素化ホウ素ナトリウム（和光純薬工業社製）を０．１７ｇ添加し、２５℃で６０分間、１５０回／分で攪拌した。反応後、グラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ−２）上で、多孔質担体の４０倍体積量のＲＯ水で洗浄した。」
この「」内の操作を更にもう２回行い、多孔質担体Ｄを得た。非水滴定によりグルコサミンのアミノ基量を定量し、多孔質担体Ｄのグルコサミン固定化量を測定した結果、担体の１ｍＬあたり１８μmolであった。
【００５７】
（作製例３）
作製例２と同様の方法で作製した、２１ｍＬの多孔質担体ＤにＲＯ水を加えて、全量を３２ｍＬとして、セパラブルフラスコ（ＴＯＰ社製２Ｌ）に入れ、１５０回／分で攪拌しながら２５℃に調整した。次に３．４ｇの過ヨウ素酸ナトリウム（和光純薬工業社製）をＲＯ水に溶解させ３００ｍLにメスアップし、２５℃に調整した。この過ヨウ素酸ナトリウム水溶液２１ｍLをセパラブルフラスコに加えて、２５℃で1時間、１５０回／分で攪拌しながら反応させた。反応後、グラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ−２）上で、多孔質担体の４０倍体積量のＲＯ水で洗浄し、多孔質担体Ｅを得た。得られたホルミル基含有多孔質担体のホルミル基含量を前述の方法で測定した結果、ホルミル基含量は多孔質担体１ｍＬあたり６．７μｍｏｌであった。
【００５８】
（実施例１）
作製例３で作製したホルミル基含有多孔質担体１８ｍＬを、グラスフィルター（ＴＯＰ社製１７G−２）上で、０．５Ｍクエン酸三ナトリウム＋０．１５Ｍ食塩バッファー（和光純薬工業社製クエン酸三ナトリウム二水和物、塩化ナトリウム、ＲＯ水を用いて調整）５４ｍＬで置換した。置換後のホルミル基含有多孔質担体を１００ｍLのビーカー（岩城硝子製）に入れ、０．５Ｍクエン酸三ナトリウム＋０．１５Ｍ食塩バッファーを加えて全量を２４ｍＬとし、１５０回／分で攪拌しながら４℃に調整した。次に国際公開特許公報ＷＯ２００６／００４０６７に記載の方法で作製されたプロテインＡの濃度が５２．９ｍｇ／ｍＬのプロテインＡ含有溶液（カネカ社製プロテインＡ溶液ＰＮＸＬ３０）２．７４ｍＬをビーカーに加えた。４M水酸化ナトリウムと０．５Ｍクエン酸三ナトリウム＋０．１５Ｍ食塩バッファーを用いて、ｐHを１１に調整しながら、反応液全量を３２．８ｍLとした後、１５０回／分で攪拌しながら４℃で一晩反応した。
【００５９】
反応後、反応液のｐＨが６．８になるように４Ｍ塩酸（和光純薬工業社製塩酸とＲＯ水で調整）を用いて調整した後、５１ｍｇの水素化ホウ素ナトリウム（和光純薬工業社製）を添加し、１５０回／分で攪拌しながら４℃で１時間反応した。反応後、反応液の２７６ｎｍ付近の吸収極大の吸光度を測定した結果、アフィニティーリガンドであるプロテインＡの固定化量は、多孔質担体１ｍＬ当り、７．５ｍｇであることがわかった。反応後の多孔質担体をグラスフィルター（ＴＯＰ社製１７G―２）上で、多孔質担体の１０倍体積量のＲＯ水で洗浄した。
【００６０】
この洗浄した多孔質担体にＲＯ水を加えて３６ｍＬとし、１００ｍLビーカーに入れ、１５０回／分で攪拌しながら２５℃に調節した。その後、５１ｍｇの水素化ホウ素ナトリウム（和光純薬工業社製）を添加し、１５０回／分で攪拌しながら２５℃で１時間反応した。反応後、多孔質担体をグラスフィルター（ＴＯＰ社製１７G―２）上で、多孔質担体の１０倍体積量のＲＯ水で洗浄した。
【００６１】
次いで、多孔質担体をグラスフィルター（ＴＯＰ社製１７G―２）上で、３倍体積量の０．０１Ｍ塩酸（和光純薬工業社製塩酸とＲＯ水で調整）で置換した。次に、置換した多孔質担体に０．０１Ｍ塩酸を加えて全量を３６ｍＬとし、１００ｍLビーカーに入れ、１５０回／分で攪拌しながら２５℃で３０分間、酸洗浄を行った。
【００６２】
酸洗浄後、多孔質担体をグラスフィルター（ＴＯＰ社製１７G―２）上で、ろ過し、次いで、３倍体積量の０．０５Ｍ水酸化ナトリウム＋１Ｍ硫酸ナトリウム水溶液（和光純薬工業社製水酸化ナトリウム、硫酸ナトリウム、ＲＯ水で調整）で置換した。次に、置換した多孔質担体に０．０５Ｍ水酸化ナトリウム＋１Ｍ硫酸ナトリウム水溶液を加えて全量を３６ｍＬとし、１００ｍLビーカーに入れ、１５０回／分で攪拌しながら２５℃で２０分間、アルカリ洗浄を行った。アルカリ洗浄後、多孔質担体をグラスフィルター（ＴＯＰ社製１７G―２）上で、ろ過し、次いで、３倍体積量の０．５Ｍクエン酸三ナトリウム＋０．１５Ｍ食塩バッファーで置換し、中和した。中和後、多孔質担体をグラスフィルター（ＴＯＰ社製１７G―２）上で、ろ過し、次いで、ＲＯ水を用いて、洗浄ろ液の電導度が５μＳ／ｃｍ以下になるまで洗浄し、目的とするプロテインＡを固定化した吸着体を得た。洗浄ろ液の電導度は、導電率計（ＥＵＴＥＣＨ ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ製 ＥＣＴｅｓｔｒ１０ ｐｕｒｅ＋）で測定した。
【００６３】
続いて、２０％エタノール水溶液（日本薬局方のエタノールとＲＯ水で調整）で多孔質担体を置換し、さらに２０％エタノール水溶液を用いて、５０ｍＬのポリ容器（岩城硝子製遠沈管）に入れ、目的とするプロテインＡを固定化した吸着体を得た。
【００６４】
得られた吸着体の目的物としてヒトポリクローナルＩｇＧ（バクスター社製ガンマガード）を選択し、静的吸着量、動的吸着量、目的物中にリークしたリガンド量を求めた。静的吸着量は４５ｍｇ/ｍLであった。動的吸着量（５％ダイナミックバインディングキャパシティー）は、１回目４０ｍｇ／ｍL、２回目３９ｍｇ／ｍL、３回目４０ｍｇ／ｍLであった。また、精製ＩｇＧ中にリークしたリガンド濃度は、１回目が５２ｐｐｍ、２回目が２９ｐｐｍ、３回目が２０ｐｐｍであった。また、サイズ１１０ｋDaのデキストランに対するKavは０．７４であった。粒径と強度については、多孔質担体での測定値と差がみられなかった。
【００６５】
（比較例１）
作成例１での分級を９０μｍのメッシュ（ＮＯＮＡＫＡ ＲＩＫＡＫＩ製、ワイヤ径６３μｍ）で行った以外は、実施例１と同様の方法で、プロテインAを固定化した吸着体を得た。
【００６６】
この吸着体のメジアン粒径は７９μｍであった。ＩｇＧ動的吸着量（５％ダイナミックバインディングキャパシティー）は、１回目３３ｍｇ／ｍL、２回目３４ｍｇ／ｍL、３回目３４ｍｇ／ｍLであった。
＜動的吸着量、及び目的物中にリークしたリガンド濃度測定＞
（１）溶液作製
Ａ液としてｐＨ７．４リン酸バッファー（シグマ社製）、Ｂ液としてｐＨ３．５の３５ｍＭ酢酸ナトリウム（和光純薬工業社製の酢酸、酢酸ナトリウム、ＲＯ水で調整）、Ｃ液として１Ｍ酢酸（和光純薬工業社製酢酸とＲＯ水で調整）、Ｄ液として１ｍｇ／ｍＬのヒトポリクローナルＩｇＧ溶液（バクスター社製ガンマガードとＡ液で調整）、Ｅ液として６Ｍ尿素、Ｆ液としてＡ液に対して０．２ｖｏｌ％の界面活性剤（和光純薬工業社製ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）を添加した液、中和液として２Ｍのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（シグマ社製トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンとＲＯ水で調整）を作製し、各溶液を使用前に脱泡した。
（２）充填、準備
カラムクロマトグラフィー用装置として、ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ １００（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用い、直径０．５ｃｍ、高さ１５ｃｍのカラムに２２μｍのメッシュを取り付け、本発明の吸着体をそれぞれ３ｍＬ入れ、線速４００ｃｍ／ｈで２０％エタノール水溶液（和光純薬工業社製エタノールとＲＯ水で調整）を１時間通液して充填した。フラクションコレクターに１５ｍｌの採取用チューブをセットし、溶出液の採取用チューブについては、あらかじめ中和液を入れておいた。
（３）ＩｇＧ精製
Ａ液を線速３００ｃｍ／ｈで９ｍＬ通液し、次いでＤ液をＵＶをモニターしながら、ＩｇＧが１０％破過するまで線速３００ｃｍ／ｈで通液した。次いで、Ａ液を線速３００ｃｍ／ｈで３０ｍＬ通液し、Ｂ液を線速３００ｃｍ／ｈで３０ｍＬ通液してＩｇＧを溶出させた。次にＣ液を線速３００ｃｍ／ｈで９ｍＬ，Ｅ液を線速３００ｃｍ／ｈで９ｍＬ通液した。吸着体の充填終了後からの操作をさらに２回繰り返すことにより、溶出液中のＩｇＧ量と、ＩｇＧ中にリークしたリガンド濃度を求めた。
＜Ｋａｖ測定＞
（原理）
実施例１の吸着体のゲル相分配係数をゲル濾過で測定した。分子量の異なる２種類のデキストランを、吸着体を充填したカラムに流した。各デキストランの保持容量を検出して各Ｋａｖを算出し、Ｍｐ １１００００のＫａｖ値を報告した。Ｋａｖ測定に用いた機器、条件を表１に示す。
【００６７】
【表１】
【００６８】
（化合物）
充填時および選択性試験時の移動相は０．２０Ｍ ＮａＣｌの水溶液とした。
【００６９】
カラムの充填は、移動相への２％アセトン注入によって試験した。
【００７０】
選択性試験に用いたデキストランは以下の通りである。Ｋａｖ測定に用いた化合物を表２に示す。
【００７１】
【表２】
【００７２】
Ｍｐ＝１９６３００の場合に０．２５Ｍ ＮａＣｌで希釈した以外は、デキストランはすべて０．２０Ｍ ＮａＣｌ溶液で希釈し、カラムの総体積の標識として用いた。
【００７３】
（サンプルの前処理）
ガラスフィルター上にて吸着体の３倍量の０．２０Ｍ ＮａＣｌで吸着体を洗浄した後、吸着体と０．２０Ｍ ＮａＣｌとの１：１スラリーを形成させた。
【００７４】
（検量）
個々のマニュアルに従い、使用する機器を制御し、検量した。
【００７５】
（方法）
１回の分析は、１本のカラムを充填して、２回試験する（すなわちデキストランを２回
注入）ことからなる。
【００７６】
（カラムの充填）
カラムを底部アダプターによって充填チューブに接続した。充填チューブをポンプに接続し、ポンプで水を少量注入し、約０．５ｃｍの水で満たした。ゲルスラリーを移し、０．２Ｍ ＮａＣｌで満たし、フィルター及び底部アダプターをカラムに配設した。
【００７７】
約２２ｍｌ／分の流速で流し、カラムを直立させ、１０分間送液を続けた。ゲル面が低下すれば、パスツールピペットでゲルスラリーを追加し、ゲル相長さが３２３ｍｍとなるように調整した。上部アダプターのフィルター面をゲル面に合わせ、移動相のみの長さをゼロとした。ベッドが安定するまで１０ｍｌ／分の流量で添加し、ベッドの安定性を確認した。ゲル層の更なる圧縮が観察されなくなったら、安定であるとした。
【００７８】
（選択性試験）
１．カラムを、少なくとも１．５ＣＶの０．２０Ｍ ＮａＣｌで平衡化した。
２．５０μｌのデキストラン溶液を注入した。
３．移動相の１．３ＣＶによって溶出した。
工程２及び３はその後、デキストラン又はデキストランミックス＊ごとに繰り返した。
＊デキストランは、以下のプロトコルで混合してもよく、また１度に注入してもよい。
混合物１：天然デキストラン＋Ｍｐ６６７００
混合物２：０．２５Ｍ ＮａＣｌ中のＭｐ１９６３００
（解析）
各デキストランの保持容量は、得られたクロマトグラムのＲＩカーブから導出する。ここで、ピークは目的のデキストランの最大ＲＩとして定義する。デキストランに対するＫａｖは、以下の式によって算出される：
Ｋａｖ＝（ＶＲ−Ｖｏ）／（Ｖｃ−Ｖｏ）
式中、
ＶＲ＝（余分のカラムベッド体積（ｍｌ）のために調整された、溶出デキストランの保持容量）
Ｖｏ＝（余分のカラムベッド体積（ｍｌ）のために調整された、間隙容量（天然デキストランのための保持容量））
Ｖｃ＝（カラムの幾何学的体積（ベッド高（ｃｍ）、カラム表面積（ｃｍ２））。
【００７９】
Ｋａｖ値をその後デキストランのｌｏｇＭｐ上にプロットした。各デキストランにおけ
る２つの結果（４つの数値）を、１つのダイヤグラムにプロットした。２つのデキストラ
ン間の一次補間は、レポートされた１１００００（Ｍｐ値）の分子量に対応するＫａｖ値
として算出した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は各種吸着体、特に治療用（医療用）吸着体や抗体医薬品精製用吸着体に関する。
【背景技術】
【０００２】
吸着体、例えば各種クロマトグラフィー用吸着体やアフィニティー吸着体は、効率よく目的物を精製、または不要物濃度を低減できることから、従来より幅広い分野で使用されている。なかでも、アフィニティー吸着体は医療用吸着体や抗体医薬品精製用吸着体としての利用が進んできている。特に、リウマチ、血友病、拡張型心筋症の治療用（医療用）吸着体として、プロテインＡをアフィニティーリガンドとして多孔質担体に固定化した吸着体が注目されている（例えば非特許文献１、非特許文献２）。一方、免疫グロブリン（ＩｇＧ）を特異的に吸着、溶出できる吸着体として、プロテインＡをアフィニティーリガンドとして多孔質担体に固定化した吸着体（抗体医薬品精製用吸着体）が注目されている。通常これらアフィニティー吸着体は、カラムに充填されて用いられることから、動的吸着容量が重要視される。しかしながら、一般的なアフィニティー吸着体の動的吸着容量は、その静的吸着容量より小さく、特にその傾向は、吸着処理の線速が大きい場合に顕著であり、高価なアフィニティーリガンドを有効に活用できていないといえる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２００５． Ｖｏｌ．１０５１ Ｐ６３５−６４６
【非特許文献２】Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｅａｒｔ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｖｏｌ．１５２， Ｎｕｍｂｅｒ ４ ２００６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は従来の技術が有する上記課題に鑑みてなされたものであり、高線速下でも動的吸着容量が大きい吸着体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題を解決するために本発明者らは鋭意研究の結果、下記発明を提供した。
【０００６】
即ち本発明は、多孔質担体に抗体結合性タンパク質リガンドを固定してなる吸着体であって、メジアン粒径が３０μｍ以上６５μｍ以下である事をを特徴とする吸着体を提供する。
【０００７】
また本発明は、５％圧縮時の圧縮応力が０．０１ＭＰａ以上１ＭＰａ以下、１０％圧縮時の圧縮応力が０．０３ＭＰａ以上３ＭＰａ以下、および１５％圧縮時の圧縮応力が０．０６ＭＰａ以上５ＭＰａ以下であることを特徴とする、吸着体に関する。
【０００８】
また本発明は、５％圧縮時の圧縮応力が０．０２ＭＰａ以上１ＭＰａ以下、１０％圧縮時の圧縮応力が０．０６ＭＰａ以上３ＭＰａ以下、および１５％圧縮時の圧縮応力が０．１ＭＰａ以上５ＭＰａ以下であることを特徴とする、吸着体に関する。
【０００９】
また本発明は、樹脂含量が２％以上５０％以下であることを特徴とする吸着体に関する。
【００１０】
また本発明は、吸着体および／またはその前駆体が架橋されていることを特徴とする、吸着体に関する。
【００１１】
また本発明は、抗体結合性タンパク質リガンドの密度が１〜１０ｍｇ／ｍｌであることを特徴とする、吸着体に関する。
【００１２】
また本発明は、サイズ110kDaのデキストランに対するKavが0.65以上であることを特徴とする、吸着体に関する。
【００１３】
また本発明は、多孔質担体が炭水化物を含有することを特徴とする、吸着体に関する。
【００１４】
また本発明は、炭水化物が多糖類であることを特徴とする、吸着体に関する。
【００１５】
また本発明は、多糖類がセルロースおよび／またはセルロース誘導体であることを特徴とする請求項９に記載の吸着体に関する。
【００１６】
また本発明は、抗体結合性タンパク質リガンドがプロテインＡであることを特徴とする、吸着体に関する。
【００１７】
また本発明は、精製目的物の吸着量が精製用吸着体１ｍＬあたり１〜１００ｍｇであることを特徴とする、吸着体に関する。
【００１８】
また本発明は、動的吸着容量／静的吸着容量が０．７以上であることを特徴とする、吸着体に関する。
【００１９】
また本発明は、吸着体から精製目的物中にリークしたリガンドの濃度が、１００ｐｐｍ以下であることを特徴とする、吸着体に関する。
【００２０】
また本発明は、吸着体を用いた精製方法に関する。
【００２１】
また本発明は、直径２ｃｍ以上及び高さ５ｃｍ以上のカラムを用いることを特徴とする、精製方法に関する。
【００２２】
また本発明は、線速が１００〜１０００ｃｍ／ｈで通液する工程を有することを特徴とする、精製方法に関する。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、高線速下での動的吸着容量が大きい吸着体が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明者らは鋭意研究の結果、理由は定かではないが、驚くべきことに、多孔質担体に抗体結合性タンパク質リガンドを固定してなる吸着体であって、メジアン粒径が３０μｍ以上６５μｍ以下である事を特徴とする吸着体を提供することにより、高線速下での動的吸着容量が大きい吸着体が得られた。メジアン粒径が３０μｍ未満であれば、高線速下で使用した場合、圧密化が生じてしまい、またカラム底部の担持ろ材をすり抜け易くなる。また65μｍ以上であると、高線速下での動的吸着容量が小さくなる。また、メジアン粒径は４０μｍ以上６５μｍ以下であることが好ましく、５０μｍ以上６５μｍ以下であることがより好ましく、５５μｍ以上６５μｍ以下であることが特に好ましく、６０μｍ以上６５μｍ以下が最も好ましい。ここで、メジアン粒径とは、累積体積分布が５０％の時の粒径である（ｄ５０ｖ）。メジアン粒径は、ランダムに選んだ１００個以上の吸着体の粒径を測定して求めることができる。個々の多孔質担体の粒径は、個々の多孔質担体の顕微鏡写真を撮影して電子データーとして保存し、粒径測定ソフトウェア（メディアサイバーネティックス社製イメージプロプラス）を用いて、測定することができる。
【００２５】
吸着体は治療用（医療用）吸着体をはじめとする各種クロマトグラフィー用吸着体やアフィニティー吸着体として広く用いられているが、特に抗体医薬品精製の分野においては、抗体医薬品市場の大きな伸びに伴って、精製の大スケール化及び高線速化が積極的に行われている。精製の大スケール化及び高線速化に伴って、精製に用いられる吸着体、つまりは多孔質担体の強度を大きくする必要が生じる場合がある。また、本発明の吸着体は、通常産業用途に用いられているアフィニティー吸着体に比べると粒径が小さい傾向にある。そのため、本発明の吸着体は、高強度であることが好ましい。高強度であれば、高線速下での使用においても、圧密化が生じにくくなり、好ましい。本発明者らは強度の指標として、圧縮応力を用いている。本発明の吸着体は５％圧縮時の圧縮応力が０．０１ＭＰａ以上１ＭＰａ以下、１０％圧縮時の圧縮応力が０．０３ＭＰａ以上３ＭＰａ以下、および１５％圧縮時の圧縮応力が０．０６ＭＰａ以上５ＭＰａ以下であることが好ましい。これによれば、大スケール、高線速で精製を行っても圧密化を生じない吸着体が得られやすいため、好ましい。また、吸着体の５％圧縮時の圧縮応力が１ＭＰＡ以下、１０％圧縮時の圧縮応力が３ＭＰＡ以下、および１５％圧縮時の圧縮応力が５ＭＰＡ以下であれば、脆性が向上し、微粒子発生が抑制されやすいため、好ましい。
【００２６】
ここで、５％圧縮時の圧縮応力とは、吸着体が圧縮されて、初期体積より体積が５％減少した時の応力、１０％圧縮時の圧縮応力とは、吸着体が圧縮されて、初期体積より体積が１０％減少した時の応力、１５％圧縮時の圧縮応力とは、吸着体が圧縮されて、初期体積より体積が１５％減少した時の応力である。初期体積とは、吸着体を含むスラリーに振動を与えながら、吸着体の体積が減少しなくなるまで沈降させて充填した状態の体積である。圧縮時の圧縮応力は、以下の方法で測定しうるものである。
１） 内径１５ｍｍのガラス製メスシリンダーに吸着体の５０ｖｏｌ％のスラリーを投入する。
２） ガラス製メスシリンダーに振動を与えながら、吸着体の体積が減少しなくなるまで沈降させて充填し、多孔質担体体積が約４ｍＬとなるよう多孔質担体量を調整する。この時の体積を初期体積とする。
３） 金属製ピストン（メスシリンダーの内壁と摩擦を生じず、且つ吸着体が漏れないように加工したもの）を、２０Ｎ用ロードセルを装着したオートグラフ（ＳＨＩＭＡＤＺＵ製ＥＺ−ＴＥＳＴ）に取り付ける。
４） 吸着体の１２０ｖｏｌ％に相当する位置にピストンの底面を合わせる。
５） 気泡が入らないように、試験速度５ｍｍ／ｍｉｎでピストンを下降させ、多孔質担体を圧縮して体積を減少させる。
６） 任意の点の圧縮応力を測定する。
【００２７】
また、本発明の吸着体は、５％圧縮時の圧縮応力が０．０１ＭＰＡ以上１ＭＰＡ以下、１０％圧縮時の圧縮応力が０．０４ＭＰＡ以上３ＭＰＡ以下、および１５％圧縮時の圧縮応力が０．０６ＭＰＡ以上５ＭＰＡ以下であることがより好ましく、さらに、５％圧縮時の圧縮応力が０．０１ＭＰＡ以上１ＭＰＡ以下、１０％圧縮時の圧縮応力が０．０６ＭＰＡ以上３ＭＰＡ以下、および１５％圧縮時の圧縮応力が０．０７ＭＰＡ以上５ＭＰＡ以下であることが好ましい。特に、繰り返し使用に適しているという理由から、吸着体の５％圧縮時の圧縮応力が０．０２ＭＰＡ以上１ＭＰＡ以下、１０％圧縮時の圧縮応力が０．０６ＭＰＡ以上３ＭＰＡ以下、および１５％圧縮時の圧縮応力が０．０９ＭＰＡ以上５ＭＰＡ以下であることが特に好ましく、最も好ましくは、５％圧縮時の圧縮応力が０．０２ＭＰＡ以上１ＭＰＡ以下、１０％圧縮時の圧縮応力が０．０８ＭＰＡ以上３ＭＰＡ以下、および１５％圧縮時の圧縮応力が０．１１ＭＰＡ以上５ＭＰＡ以下である。また、コストの観点から、５％圧縮時の圧縮応力が０．５ＭＰＡ以下、１０％圧縮時の圧縮応力が１．５ＭＰＡ以下、および１５％圧縮時の圧縮応力が２．５ＭＰＡ以下であることが好ましく、５％圧縮時の圧縮応力が０．２ＭＰＡ以下、１０％圧縮時の圧縮応力が０．７ＭＰＡ以下、および１５％圧縮時の圧縮応力が２ＭＰＡ以下であることが好ましく、さらに５％圧縮時の圧縮応力が０．１ＭＰＡ以下、１０％圧縮時の圧縮応力が０．３ＭＰＡ以下、および１５％圧縮時の圧縮応力が２ＭＰＡ以下であることが特に好ましい。
【００２８】
プロテインＡをアフィニティーリガンドとして多孔質担体に固定化する方法としては、多孔質担体が含有するホルミル基と、プロテインＡのアミノ基との反応を利用する方法が挙げられ、本発明に好ましく用いる事ができる。
【００２９】
また、高強度を達成する方法としては特に限定は無いが、吸着体の樹脂含量を大きくすることが好ましい。本発明の吸着体の充填体積あたりの樹脂含量は、２％以上５０％以下であることが好ましい。充填体積あたりの樹脂含量が２％以上であれば、大スケール、高線速で精製を行っても圧密化を生じない吸着体が得られるため好ましい。また、充填体積あたりの樹脂含量が５０％以下であると、精製目的物を吸着させるに十分な大きさの孔を確保できるため好ましい。また、充填体積あたりの樹脂含量のより好ましい範囲は４％以上２５％以下、さらに好ましくは５％以上１５％以下であり、最も好ましくは８％以上１２％以下である。充填体積あたりの樹脂含量は、多孔質担体体積が減少しなくなるまで沈降させて充填し、多孔質担体体積が１ｍＬとなるよう多孔質担体量を調整する。この担体を１０５℃で１２時間乾燥させ、その乾燥重量から、充填体積あたりの乾燥重量パーセント、つまり樹脂含量を求めることができる。
【００３０】
また、高強度を達成しつつも多孔質担体の細孔径が小さくなり難いという利点から、架橋剤を作用させて多孔質担体の強度を大きくすることがより好ましい。すなわち、本発明の製造方法において、前記多孔質担体が架橋されていることが好ましい。本発明に用いることができる架橋剤や架橋反応条件に特に限定は無く、公知の技術を用いて行うことができる。例えば、エピクロロヒドリン、エピブロモヒドリン、ジクロロヒドリン等のハロヒドリンや、レソルシノールジグリシジルエーテル、ネオペンチルグリコールジグリシジルエーテル、１，６−ヘキサンジオールジグリシジルエーテル、ヒドロゲナートビスフェノールＡジグリシジルエーテル、グリセロールジグリシジルエーテル、グリセロールポリグリシジルエーテル、トリメチロールプロパンジグリシジルエーテル、ジグリシジルテレフタレート、ジグリシジルオルトフタレート、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ジエチレングリコールジグリシジルエーテル、プロピレングリコールジグリシジルエーテル等の２官能以上のエポキシ化合物を作用させることによって、架橋を行うことができる。
【００３１】
これら架橋剤を用いて、多孔質担体の強度を大きくする方法に特に限定は無いが、反応効率の観点から、これら架橋剤をアルカリ条件下で担体に作用させることが好ましい。架橋剤の投入方法には特に限定は無く、全使用量を反応初期から投入しても良いし、複数回に分けて反応を繰り返しても良く、また滴下ロート等を用いて、少量ずつ架橋剤を投入しても良く、また架橋剤が投入された反応容器に多孔質担体を投入しても良い。架橋反応の溶媒については特に限定は無いが、水、ヘプタン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジオキソラン等の汎用有機溶媒や、エタノール、メタノール、プロパノール等のアルコールや、これらの２種以上の混合溶媒を用いることができる。また、反応効率を高めるため、ソディウムボロヒドリド等の還元剤を共存させることがより好ましい。架橋反応時の温度については特に限定は無いが、反応速度的に有利であるという理由から０℃以上であることが好ましく、および／または安全性や多孔質担体へのダメージの観点から１００℃以下であることが好ましく、官能基が失活し難いという理由から７０℃以下であることがより好ましい。架橋反応は攪拌または振とうしながら行うことが好ましく、その１分間当りの回転数または回数は、特に限定は無いが、均一攪拌が可能で、且つ多孔質担体に物理的なダメージが加わらないという理由から１分間あたり１回以上１０００回以下であることが好ましく、より好ましくは１０回以上５００回以下、さらに好ましくは３０回以上３００回以下、特に好ましくは５０回以上２００回以下、最も好ましくは７５回以上１５０回以下であるが、各原料の比重の差や多孔質担体の強度に合わせて調整し、多孔質担体が反応液中で均一に分散されている状態となることが特に好ましい。架橋反応時間については、特に限定は無いが、官能基の失活や担体へのダメージが少ないという理由から、ハロヒドリンを用いる場合は、１時間以上８時間以下、２官能以上のエポキシ化合物を用いる場合は、１時間以上、１５時間未満であることが好ましく、架橋剤の反応性や、ｐＨや、反応温度に合わせて調整することが、より好ましい。
【００３２】
また、本発明の吸着体の抗体結合性タンパク質リガンドの密度に特に限定は無いが、吸着体１ｍＬ当り、１ｍｇ以上１０ｍｇ以下であることが好ましい。アミノ基含有リガンドの固定化量が吸着体１ｍＬ当り１ｍｇ以上であれば、目的物に対する吸着量が大きくなるため好ましく、１０ｍｇ以下であれば、製造コストを抑制できるたり、目的物の溶出がし易くなるため好ましい。より好ましいアミノ基含有リガンドの固定化量は、多孔質担体１ｍＬ当り３ｍｇ以上１０ｍｇ以下であり、さらに好ましくは４ｍｇ以上１０ｍｇ以下であり、特に好ましくは５ｍｇ以上９ｍｇ以下であり、最も好ましくは６ｍｇ以上８ｍｇ以下である。アミノ基含有リガンドの固定化量は、固定化反応後の反応液上清中のアミノ基含有リガンド由来の吸光度を測定することによって求めることができる。また、元素分析法を用いて、アミノ基含有リガンドの導入量を求めることが、より好ましい。例えば、アミノ基含有リガンドであれば、吸着体のＮ含量分析を行うことにより、アフィニティーリガンドの導入量を測定することができる。
【００３３】
また、本発明の吸着体はサイズ110kDaのデキストランに対するKavが0.65以上であること好ましい。 Ｋａｖとはゲル相分配係数をいい、所定の大きさの分子に対する溶出又は保持容量ＶＲ（Ｖｅとも表される。）、空隙容量Ｖｏ及びカラムの幾何容量Ｖｃから次式で算出される、カラムとは独立した変数である。
【００３４】
Ｋａｖ＝（ＶＲ−Ｖｏ）／（Ｖｃ−Ｖｏ）
（例えばＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ，Ｓｃａｌｅ−Ｕｐ ａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ（１９９７） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ．Ｇａｉｌ Ｓｏｆｅｒ ＆ Ｌａｒｓ Ｈａｇｅｌ ｅｄｓ．ＩＳＢＮ０−１２−６５４２６６−Ｘ，ｐ．３６８参照）。
【００３５】
サイズ110kDaのデキストランに対するKavが0.65以上であれば、目的物、特にIgG等の抗体に対する吸着量が大きくなる傾向があるため好ましい。また、サイズ110kDaのデキストランに対するKavが0.65以上が０．６５以上０．９８以下であることがより好ましい。サイズ110kDaのデキストランに対するKavが0.90以下であれば、吸着体の強度が大きくなる傾向があるため好ましい。特に好ましくは、サイズ110kDaのデキストランに対するKavが0.65以上0.85以下、最も好ましくは0.70以上0.80以下である。
【００３６】
また、本発明の多孔質担体の材質には特に限定は無く、例えば、多糖類、ポリスチレン、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリル酸エステル、ポリメタクリル酸エステル、ポリビニルアルコール、およびこれらの誘導体等を挙げることができる。これらは、ヒドロキシエチルメタクリレート等のヒドロキシ基を有する高分子材料やポリエチレンオキサイド鎖を有する単量体と他の重合性単量体との共重合のようなグラフト共重合体等のコーティング層を有していてもよい。これらの中で多糖類や、ポリビニルアルコール等が、担体表面に活性基を導入しやすいため、好ましく用いることができる。なかでも本発明の多孔質担体は炭水化物を含有することが好ましい。炭水化物は一般的に入手が容易であり、また安全性が高いため、好ましく用いることができる。
【００３７】
また、本発明に用いることができる炭水化物は、多糖類であることが好ましい。多糖類は産業的に容易に得ることが可能であり、また生体に対する安全性が高いため好ましい。本発明における前記多孔質担体に用いることができる多糖類に特に限定は無いが、例えば、アガロース、セルロース、デキストリン、デキストラン、キトサン、キチン、及びこれらの誘導体等を挙げることができる。
【００３８】
また、本発明の多孔質担体に用いることができる多糖に特に限定は無いが、セルロースおよび／またはセルロース誘導体を含有することがより好ましい。セルロースまたはセルロース誘導体を含有する多孔質担体は、機械的強度が比較的高く、強靱であるため破壊されたり微粒子を生じたりすることが少なく、カラムに充填した場合に液を高線速で流しても比較的圧密化し難いため好ましい。前記セルロース誘導体に特に限定は無いが、例えば、水酸基が、アシル基（炭素数１〜１０の鎖状もしくは分岐状のものであり、飽和、不飽和結合を含む、例えば、アセチル基）、アルキル基（炭素数１〜１０の鎖状もしくは分岐状のものであり、飽和、不飽和結合を含む、例えば、メチル基、エチル基）、カルボキシメチル基、カルボキシエチル基、シアノエチル基、アミノエチル基、ニトロ基、スルホ基、リン酸基などに置換されたものが挙げられる。なかでも、本発明に用いることができるセルロース誘導体は、コストや加工性に優れるという理由から、セルロースアセテート、セルロースアセテートプロピオネート、セルロースプロピオネート、酪酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、フタル酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロースが好ましい。また、これら置換基の置換度には特に限定は無いが、クロマトグラフィーにおける使用条件（温度や使用される液体）において、耐久性を有するように調整されていることが好ましい。本発明における多孔質担体に用いることができる多糖は、強度やコストの観点から、セルロースおよび／または再生セルロースであることが最も好ましい。
【００３９】
また、本発明の吸着体の用途に特に限定は無く、例えば、抗体精製用吸着体、抗体医薬品精製用吸着体、治療用（医療用）吸着体、アフィニティー吸着体、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー用の吸着体を挙げることができる。また、本発明の吸着体は、用途に合わせた抗体結合性タンパク質リガンドが固定化されていることが好ましい。本発明の抗体結合性タンパク質リガンドに特に限定は無いが、例えば、抗体に特異性の高い抗原やタンパク質や、プロテインＧ、Ｌやその変異体、抗体結合活性を有するペプチド等を挙げることができる。特に、免疫グロブリン（ＩｇＧ）等を特異的に吸着、溶出できる吸着体として、プロテインＡをアフィニティーリガンドとして担体に固定化した吸着体が注目されている。プロテインＡを固定化した吸着体は、リウマチ、血友病、拡張型心筋症の治療用吸着体として注目されている。また、抗体医薬精製の分野においては、ＩｇＧ等の抗体の精製を大スケール、高速、及び低コストで行える吸着体が望まれている。このような観点から、本発明の吸着体は、抗体結合性タンパク質リガンドとしてプロテインＡが導入された吸着体であることが、より好ましい。本発明に用いることができるプロテインＡに特に限定は無く、天然物、遺伝子組み換え物、単量体、多量体等を制限なく使用することができる。また、抗体結合ドメイン及びその変異体を含むものや、融合蛋白質等であってもよい。また、菌体抽出物もしくは培養上清より、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー及び膜分離技術を用いた分子量分画、分画沈殿法等の手法から選択される精製法を組合せ、および／または繰り返すことにより製造された、プロテインＡを用いることもできる。特に、国際公開特許公報ＷＯ２００６／００４０６７や米国特許公報ＵＳ５１５１３５０に記載されている方法で得られたプロテインＡであることが好ましい。
【００４０】
また、本発明の吸着体の、目的物の吸着量は、吸着体１ｍＬあたり１ｍｇ以上であることが好ましい。目的物の吸着量が、吸着体１ｍＬあたり１ｍｇ以上であれば、効率よく精製が行えるため好ましい。また目的物の吸着量が、吸着体１ｍＬあたり１００ｍｇ以下であれば、吸着した目的物を吸着体から溶出しやすいため好ましい。より好ましい吸着体の、目的物の吸着量は、吸着体１ｍＬあたり５ｍｇ以上９０ｍｇ以下であり、さらに好ましくは１０ｍｇ以上８０ｍｇ以下であり、特に好ましくは２０ｍｇ以上７０ｍｇ以下であり、最も好ましくは３０ｍｇ以上６０ｍｇ以下である。
【００４１】
目的物の吸着量の求め方としては、特に限定は無いが、静的吸着量や動的吸着量によって求めることができる。例えば、静的吸着量を測定する場合は、ｐＨ７．４のリン酸バッファー（シグマ社製）で置換した吸着体０．５ｍＬに対し、７０ｍｇの目的物を３５ｍＬのｐＨ７．４のリン酸バッファー（シグマ社製）に溶解させた溶液を接触させ、２５℃で２時間攪拌した後、上清中の目的物の減少量を測定することにより求めることができる。
【００４２】
また、目的物の動的吸着量及び目的物中にリークしたリガンドの濃度を求める方法の一例を以下に述べる。
（１）溶液作製
Ａ液としてｐＨ７．４リン酸バッファー（シグマ社製）、Ｂ液としてｐＨ３．５の３５ｍＭ酢酸ナトリウム（和光純薬工業社製の酢酸、酢酸ナトリウム、ＲＯ水で調整）、Ｃ液として１Ｍ酢酸（和光純薬工業社製酢酸とＲＯ水で調整）、Ｄ液として１ｍｇ／ｍＬのヒトポリクローナルＩｇＧ溶液（バクスター社製ガンマガードとＡ液で調整）、Ｅ液として６Ｍ尿素、Ｆ液としてＡ液に対して０．２ｖｏｌ％の界面活性剤（和光純薬工業社製ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）を添加した液、中和液として２Ｍのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（シグマ社製トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンとＲＯ水で調整）を作製し、各溶液を使用前に脱泡する。
（２）充填、準備
カラムクロマトグラフィー用装置として、ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ １００（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用い、直径０．５ｃｍ、高さ１５ｃｍのカラムに２２μｍのメッシュを取り付け、本発明の吸着体をそれぞれ３ｍＬ入れ、線速４００ｃｍ／ｈで２０％エタノール水溶液（和光純薬工業社製エタノールとＲＯ水で調整）を１時間通液して充填する。フラクションコレクターに１５ｍｌの採取用チューブをセットし、溶出液の採取用チューブについては、あらかじめ中和液を入れておく。
（３）洗浄
必要に応じて、Ｆ液、Ｂ液、Ａ液、Ｃ液、Ｅ液の順に、各液を線速３００ｃｍ／ｈで吸着体の３倍量を通液する。この通液サイクルを任意の回数、繰り返す。
（４）ＩｇＧ精製
Ａ液を線速３００ｃｍ／ｈで９ｍＬ通液し、次いでＤ液をＵＶをモニターしながら、ＩｇＧが１０％破過するまで線速３００ｃｍ／ｈで通液する。次いで、Ａ液を線速３００ｃｍ／ｈで３０ｍＬ通液し、Ｂ液を線速３００ｃｍ／ｈで３０ｍＬ通液してＩｇＧを溶出させる。次にＣ液を線速３００ｃｍ／ｈで９ｍＬ，Ｅ液を線速３００ｃｍ／ｈで９ｍＬ通液する。吸着体の充填終了後からの操作をさらに２回繰り返すことにより、溶出液中のＩｇＧ量とＩｇＧ中にリークしたリガンドの濃度を求めることができる。
【００４３】
また、本発明の吸着体は、動的吸着容量／静的吸着容量が０．７以上であることが好ましい。動的吸着容量／静的吸着容量が０．７以上であれば、高価なプロテインAを効率よく使用できるため、好ましい。また、動的吸着容量／静的吸着容量が０．８０以上であることがより好ましく、０．８５以上であることが特に好ましく、０．９０以上であることが最も好ましい。この動的吸着容量は、線速３００ｃｍで精製した時の５％ダイナミックバイディングキャパシティーとしている。
【００４４】
また、本発明の吸着体は、これを用いて治療や精製を行った場合、吸着体から目的物中にリークしたリガンドの濃度が、１００ｐｐｍ以下であることが好ましい。目的物中にリークしたリガンドの濃度が１００ｐｐｍ以下であれば、治療や精製の安全性を高めることができ、さらに目的物の純度を高めることができ、精製における後工程の煩雑さが軽減されるため好ましい。より好ましい目的物中にリークしたリガンドの濃度は、０ｐｐｍ以上８０ｐｐｍ以下、さらに好ましくは０ｐｐｍ以上６０ｐｐｍ以下、特に好ましくは０ｐｐｍ以上４０ｐｐｍ以下、最も好ましくは０ｐｐｍ以上２０ｐｐｍ以下である。目的物中にリークしたリガンドの濃度は、Ｓｔｅｉｎｄｌ Ｆ． ｅｔ ａｌ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３５ （２０００） ６１−６９、に記載の方法で求めることができる。
【００４５】
本発明の吸着体のアミノ基含有リガンドのリーク量をさらに低減するために、吸着体を洗浄することが好ましい。洗浄剤や洗浄方法に特に限定は無いが、水、酢酸、アルコール、各種有機溶剤、ｐＨ２〜５の液体、ｐＨ８〜１３の液体、塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウム、リン酸水素２ナトリウム、リン酸２水素ナトリウム、緩衝剤、界面活性剤、尿素、グアニジン、グアニジン塩酸塩、その他の再生剤等の、少なくとも１種を含有する溶液等を通液、または投入して攪拌することが好ましい。また、これらの洗浄液は交互に用いたり、繰り返し用いると、リガンドのリーク量がさらに減少するため好ましい。
【００４６】
本発明の吸着体及び／または本発明の製造方法により製造された吸着体は、アフィニティークロマトグラフィーを用いた各種目的物の精製（特に、抗体医薬品精製）や、治療用（医療用）吸着体に利用することができる。精製方法や治療方法には特に限定は無く、公知の方法を好適に用いる事ができる。
【００４７】
さらに、本発明の吸着体は、目的物の吸着量が大きいにも関わらず、精製を大スケール、高速且つ低コストで行うことを可能とする。よって、本発明の吸着体を用いた精製や治療は、直径０．５ｃｍ以上及び高さ３ｃｍ以上のカラムを用いることが好ましい。直径が０．５ｃｍ以上及び高さ３ｃｍ以上であれば、精製や治療を効率よく行うことができる。また、精製や治療の精度や効率の観点から、カラムの大きさは直径２０００ｃｍ以下及び高さ５０００ｃｍ以下であることが好ましい。より好ましいカラムの大きさは直径２ｃｍ以上２００ｃｍ以下、高さ５ｃｍ以上３００ｃｍ以下であり、さらに好ましくは直径５ｃｍ以上１００ｃｍ以下及び高さ８ｃｍ以上１５０ｃｍ以下であり、特に好ましくは直径１０ｃｍ以上８５ｃｍ以下及び高さ１２ｃｍ以上８５ｃｍ以下であり、最も好ましくは直径２０ｃｍ以上８５ｃｍ以下及び高さ１４ｃｍ以上３５ｃｍ以下である。
【００４８】
また、本発明の吸着体を用いた治療や精製は、線速１００ｃｍ／ｈ以上で通液する工程を有することが好ましい。線速１００ｃｍ／ｈ以上で通液する工程を有していれば、治療や精製を効率よく行うことができるため好ましい。また治療や精製の精度や装置の耐久性の観点から、本発明の吸着体を用いた治療や精製は、線速１０００ｃｍ／ｈ以下で行うことが好ましい。より好ましい精製の線速は１５０ｃｍ／ｈ以上８００ｃｍ／ｈ以下、さらに好ましくは２５０ｃｍ／ｈ以上７５０ｃｍ／ｈ以下、特に好ましくは３００ｃｍ／ｈ以上７５０ｃｍ／ｈ以下、最も好ましくは５００ｃｍ／ｈ以上７５０ｃｍ／ｈ以下である。
【００４９】
本発明の吸着体は、本発明を用いない場合に比べて、高線速下での動的吸着容量が著しく向上する。
【実施例】
【００５０】
以下、本発明を実施例をもとに説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、反応仕込み時の多孔質担体の体積は、特に記載が無い限り、自然沈降体積である。自然沈降体積とは、多孔質担体とＲＯ水のスラリーを、計量容器に投入し、振動の無い状態で２時間静置して求めたものである。また、官能基含量、ＩｇＧ吸着量における多孔質担体の体積は、特に記載が無い限り、多孔質担体とＲＯ水のスラリーを、計量容器に投入し、振動を与えながら、それ以上体積が減少しなくなるまで沈降させた状態の体積である。
【００５１】
（作製例１）
体積平均粒径が９２μｍ、樹脂含量が６％、排除限界分子量が５０００万の多孔質セルロース担体（チッソ社製ＣＫ−Ａ）を６３μｍのメッシュ（ＮＯＮＡＫＡ ＲＩＫＡＫＩ製、ワイヤ径４５μｍ）と分級機（筒井理化学器械社製３００−ＭＭ）を用いて、２時間、湿式分級を行い、メジアン粒径が６４μｍの多孔質担体Ａを得た。多孔質担体ＡとＲＯ水の１：１スラリーを、グラスフィルター（ＴＯＰ社製１７Ｇ−２）上で１５分間吸引ろ過（サクションドライ）した。得られたサクションドライ済みの多孔質担体Ａ２７４ｇをガラス製のセパラブルフラスコ（ＴＯＰ社製２Ｌ）に投入し、これに０．６Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（和光純薬工業社製水酸化ナトリウムとＲＯ水で調整）２７４ｍＬを加え、４０℃で３０分加温した。液温が４０℃に加温された後、水素化ホウ素ナトリウム（和光純薬工業社製）を５４８ｍｇ、架橋剤としてグリセロールポリグリシジルエーテルを含有するデナコールＥＸ−３１４（ナガセケムテックス社製）２７４ｍＬの順に加え、４０℃で５時間、１２０回／分で攪拌しながら反応させた。反応終了後、グラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ−２）上で吸引ろ過しながら、多孔質担体の２０倍体積量のＲＯ水で洗浄し、架橋多孔質担体を得た。この架橋多孔質担体の５％圧縮時の圧縮応力は０．０２０ＭＰａ、１０％圧縮時の圧縮応力は０．０４９ＭＰａ、１５％圧縮時の圧縮応力は０．０８０ＭＰａであった。
【００５２】
得られた架橋多孔質担体にＲＯ水を加えて、全量を架橋多孔質担体の２倍体積量とし、ガラス製ビーカー（１Ｌ）に入れ、アルミ箔２枚で封をして、オートクレーブ（サクラ社製 高圧滅菌器ネオクレーブ）を用いて１２０℃で４０分間加温した。室温まで放冷した後、グラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ−２）上で多孔質担体の５倍体積量のＲＯ水で洗浄し、エポキシ基がグリセリル基に変化した架橋多孔質担体を得た。この洗浄後の架橋多孔質担体について、再度同様の方法で更に架橋反応を行った。得られた架橋多孔質担体の５％圧縮時の圧縮応力は０．０２６ＭＰａ、１０％圧縮時の圧縮応力は０．０６３ＭＰａ、１５％圧縮時の圧縮応力は０．１０３ＭＰａである。
【００５３】
この架橋多孔質担体にＲＯ水を加えて、全量を架橋多孔質担体の２倍体積量とし、ガラス製ビーカー（１Ｌ）に入れ、アルミ箔２枚で封をして、オートクレーブ（サクラ社製 高圧滅菌器ネオクレーブ）を用いて１２０℃で４０分間加温した。室温まで放冷した後、グラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ−２）上で多孔質担体の５倍体積量のＲＯ水で洗浄し、エポキシ基がグリセリル基に変化した、多孔質担体Ｂを得た。
【００５４】
３５ｍＬの多孔質担体ＢにＲＯ水を加えて、全量を５２ｍＬとして、セパラブルフラスコ（ＴＯＰ社製５００ｍＬ）に入れた。次に１６ｇの過ヨウ素酸ナトリウム（和光純薬工業社製）をＲＯ水に溶解させ１４００ｍLにメスアップした。この過ヨウ素酸ナトリウム水溶液３５ｍLを５００ｍＬのセパラブルフラスコに加えて、２５℃で１５分、１５０回／分で攪拌しながら反応させた。反応後、グラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ−２）上で、多孔質担体の２０倍体積量のＲＯ水で洗浄し、多孔質担体Ｃを得た。得られたホルミル基含有多孔質担体のホルミル基含量を前述の方法で測定した結果、ホルミル基含量は多孔質担体１ｍＬあたり６８μｍｏｌであった。ホルミル基含量は、ｐＨ８の０．１Ｍリン酸バッファーで置換した多孔質担体２ｍＬと、フェニルヒドラジンを溶解したｐＨ８の０．１Ｍリン酸バッファー溶液２ｍＬとを接触させ、４０℃で１時間攪拌し、ＵＶ測定により反応液の上清の２７８ｎｍ付近の吸収極大の吸光度を測定し、これにより得られたフェニルヒドラジンの多孔質担体への吸着量として見積もった。この時、フェニルヒドラジンの投入量は予想ホルミル基含量の３倍モルとし、フェニルヒドラジンの投入量に対して、多孔質担体への吸着量が１５％以下、または４５％以上であった場合は、フェニルヒドラジンの投入量を見直し、再度測定を行うものとしている。
【００５５】
（作製例２）
作製例１で作製した多孔質担体Ｃ３０ｍLとＲＯ水との１：１スラリーを１５℃に調整した後、グラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ−２）上で１５分間吸引ろ過（サクションドライ）した。得られたサクションドライ済みの多孔質担体Ｃをガラス製のセパラブルフラスコ（ＴＯＰ社製５００ｍＬ）に全量投入した。その後、このセパラブルフラスコに３．６ｇのグルコサミン塩酸塩（協和発酵社製発酵グルコサミンＫ）を投入した。次いで、グルコサミン塩酸塩を溶解しながら１５℃のＲＯ水を加え、溶解後の反応液全量が５３ｍＬとなるように調整した。反応液を１５℃に調整した後、４Ｎの水酸化ナトリウム水溶液とＲＯ水を用いて、ｐＨを１１に調整した。次いで１５℃で５時間、１５０回／分で攪拌した。その後、水素化ホウ素ナトリウム（和光純薬工業社製）を０．１７ｇ添加し、１５℃で６０分間、１５０回／分で攪拌した。反応後、グラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ−２）上で、多孔質担体の４０倍体積量のＲＯ水で洗浄した。
【００５６】
「次いで、この洗浄後の多孔質担体をガラス製のセパラブルフラスコ（ＴＯＰ社製５００ｍＬ）に全量投入し、ＲＯ水を加えて、全量が５９ｍＬとなるように調整した。その後、水素化ホウ素ナトリウム（和光純薬工業社製）を０．１７ｇ添加し、２５℃で６０分間、１５０回／分で攪拌した。反応後、グラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ−２）上で、多孔質担体の４０倍体積量のＲＯ水で洗浄した。」
この「」内の操作を更にもう２回行い、多孔質担体Ｄを得た。非水滴定によりグルコサミンのアミノ基量を定量し、多孔質担体Ｄのグルコサミン固定化量を測定した結果、担体の１ｍＬあたり１８μmolであった。
【００５７】
（作製例３）
作製例２と同様の方法で作製した、２１ｍＬの多孔質担体ＤにＲＯ水を加えて、全量を３２ｍＬとして、セパラブルフラスコ（ＴＯＰ社製２Ｌ）に入れ、１５０回／分で攪拌しながら２５℃に調整した。次に３．４ｇの過ヨウ素酸ナトリウム（和光純薬工業社製）をＲＯ水に溶解させ３００ｍLにメスアップし、２５℃に調整した。この過ヨウ素酸ナトリウム水溶液２１ｍLをセパラブルフラスコに加えて、２５℃で1時間、１５０回／分で攪拌しながら反応させた。反応後、グラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ−２）上で、多孔質担体の４０倍体積量のＲＯ水で洗浄し、多孔質担体Ｅを得た。得られたホルミル基含有多孔質担体のホルミル基含量を前述の方法で測定した結果、ホルミル基含量は多孔質担体１ｍＬあたり６．７μｍｏｌであった。
【００５８】
（実施例１）
作製例３で作製したホルミル基含有多孔質担体１８ｍＬを、グラスフィルター（ＴＯＰ社製１７G−２）上で、０．５Ｍクエン酸三ナトリウム＋０．１５Ｍ食塩バッファー（和光純薬工業社製クエン酸三ナトリウム二水和物、塩化ナトリウム、ＲＯ水を用いて調整）５４ｍＬで置換した。置換後のホルミル基含有多孔質担体を１００ｍLのビーカー（岩城硝子製）に入れ、０．５Ｍクエン酸三ナトリウム＋０．１５Ｍ食塩バッファーを加えて全量を２４ｍＬとし、１５０回／分で攪拌しながら４℃に調整した。次に国際公開特許公報ＷＯ２００６／００４０６７に記載の方法で作製されたプロテインＡの濃度が５２．９ｍｇ／ｍＬのプロテインＡ含有溶液（カネカ社製プロテインＡ溶液ＰＮＸＬ３０）２．７４ｍＬをビーカーに加えた。４M水酸化ナトリウムと０．５Ｍクエン酸三ナトリウム＋０．１５Ｍ食塩バッファーを用いて、ｐHを１１に調整しながら、反応液全量を３２．８ｍLとした後、１５０回／分で攪拌しながら４℃で一晩反応した。
【００５９】
反応後、反応液のｐＨが６．８になるように４Ｍ塩酸（和光純薬工業社製塩酸とＲＯ水で調整）を用いて調整した後、５１ｍｇの水素化ホウ素ナトリウム（和光純薬工業社製）を添加し、１５０回／分で攪拌しながら４℃で１時間反応した。反応後、反応液の２７６ｎｍ付近の吸収極大の吸光度を測定した結果、アフィニティーリガンドであるプロテインＡの固定化量は、多孔質担体１ｍＬ当り、７．５ｍｇであることがわかった。反応後の多孔質担体をグラスフィルター（ＴＯＰ社製１７G―２）上で、多孔質担体の１０倍体積量のＲＯ水で洗浄した。
【００６０】
この洗浄した多孔質担体にＲＯ水を加えて３６ｍＬとし、１００ｍLビーカーに入れ、１５０回／分で攪拌しながら２５℃に調節した。その後、５１ｍｇの水素化ホウ素ナトリウム（和光純薬工業社製）を添加し、１５０回／分で攪拌しながら２５℃で１時間反応した。反応後、多孔質担体をグラスフィルター（ＴＯＰ社製１７G―２）上で、多孔質担体の１０倍体積量のＲＯ水で洗浄した。
【００６１】
次いで、多孔質担体をグラスフィルター（ＴＯＰ社製１７G―２）上で、３倍体積量の０．０１Ｍ塩酸（和光純薬工業社製塩酸とＲＯ水で調整）で置換した。次に、置換した多孔質担体に０．０１Ｍ塩酸を加えて全量を３６ｍＬとし、１００ｍLビーカーに入れ、１５０回／分で攪拌しながら２５℃で３０分間、酸洗浄を行った。
【００６２】
酸洗浄後、多孔質担体をグラスフィルター（ＴＯＰ社製１７G―２）上で、ろ過し、次いで、３倍体積量の０．０５Ｍ水酸化ナトリウム＋１Ｍ硫酸ナトリウム水溶液（和光純薬工業社製水酸化ナトリウム、硫酸ナトリウム、ＲＯ水で調整）で置換した。次に、置換した多孔質担体に０．０５Ｍ水酸化ナトリウム＋１Ｍ硫酸ナトリウム水溶液を加えて全量を３６ｍＬとし、１００ｍLビーカーに入れ、１５０回／分で攪拌しながら２５℃で２０分間、アルカリ洗浄を行った。アルカリ洗浄後、多孔質担体をグラスフィルター（ＴＯＰ社製１７G―２）上で、ろ過し、次いで、３倍体積量の０．５Ｍクエン酸三ナトリウム＋０．１５Ｍ食塩バッファーで置換し、中和した。中和後、多孔質担体をグラスフィルター（ＴＯＰ社製１７G―２）上で、ろ過し、次いで、ＲＯ水を用いて、洗浄ろ液の電導度が５μＳ／ｃｍ以下になるまで洗浄し、目的とするプロテインＡを固定化した吸着体を得た。洗浄ろ液の電導度は、導電率計（ＥＵＴＥＣＨ ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ製 ＥＣＴｅｓｔｒ１０ ｐｕｒｅ＋）で測定した。
【００６３】
続いて、２０％エタノール水溶液（日本薬局方のエタノールとＲＯ水で調整）で多孔質担体を置換し、さらに２０％エタノール水溶液を用いて、５０ｍＬのポリ容器（岩城硝子製遠沈管）に入れ、目的とするプロテインＡを固定化した吸着体を得た。
【００６４】
得られた吸着体の目的物としてヒトポリクローナルＩｇＧ（バクスター社製ガンマガード）を選択し、静的吸着量、動的吸着量、目的物中にリークしたリガンド量を求めた。静的吸着量は４５ｍｇ/ｍLであった。動的吸着量（５％ダイナミックバインディングキャパシティー）は、１回目４０ｍｇ／ｍL、２回目３９ｍｇ／ｍL、３回目４０ｍｇ／ｍLであった。また、精製ＩｇＧ中にリークしたリガンド濃度は、１回目が５２ｐｐｍ、２回目が２９ｐｐｍ、３回目が２０ｐｐｍであった。また、サイズ１１０ｋDaのデキストランに対するKavは０．７４であった。粒径と強度については、多孔質担体での測定値と差がみられなかった。
【００６５】
（比較例１）
作成例１での分級を９０μｍのメッシュ（ＮＯＮＡＫＡ ＲＩＫＡＫＩ製、ワイヤ径６３μｍ）で行った以外は、実施例１と同様の方法で、プロテインAを固定化した吸着体を得た。
【００６６】
この吸着体のメジアン粒径は７９μｍであった。ＩｇＧ動的吸着量（５％ダイナミックバインディングキャパシティー）は、１回目３３ｍｇ／ｍL、２回目３４ｍｇ／ｍL、３回目３４ｍｇ／ｍLであった。
＜動的吸着量、及び目的物中にリークしたリガンド濃度測定＞
（１）溶液作製
Ａ液としてｐＨ７．４リン酸バッファー（シグマ社製）、Ｂ液としてｐＨ３．５の３５ｍＭ酢酸ナトリウム（和光純薬工業社製の酢酸、酢酸ナトリウム、ＲＯ水で調整）、Ｃ液として１Ｍ酢酸（和光純薬工業社製酢酸とＲＯ水で調整）、Ｄ液として１ｍｇ／ｍＬのヒトポリクローナルＩｇＧ溶液（バクスター社製ガンマガードとＡ液で調整）、Ｅ液として６Ｍ尿素、Ｆ液としてＡ液に対して０．２ｖｏｌ％の界面活性剤（和光純薬工業社製ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）を添加した液、中和液として２Ｍのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（シグマ社製トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンとＲＯ水で調整）を作製し、各溶液を使用前に脱泡した。
（２）充填、準備
カラムクロマトグラフィー用装置として、ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ １００（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用い、直径０．５ｃｍ、高さ１５ｃｍのカラムに２２μｍのメッシュを取り付け、本発明の吸着体をそれぞれ３ｍＬ入れ、線速４００ｃｍ／ｈで２０％エタノール水溶液（和光純薬工業社製エタノールとＲＯ水で調整）を１時間通液して充填した。フラクションコレクターに１５ｍｌの採取用チューブをセットし、溶出液の採取用チューブについては、あらかじめ中和液を入れておいた。
（３）ＩｇＧ精製
Ａ液を線速３００ｃｍ／ｈで９ｍＬ通液し、次いでＤ液をＵＶをモニターしながら、ＩｇＧが１０％破過するまで線速３００ｃｍ／ｈで通液した。次いで、Ａ液を線速３００ｃｍ／ｈで３０ｍＬ通液し、Ｂ液を線速３００ｃｍ／ｈで３０ｍＬ通液してＩｇＧを溶出させた。次にＣ液を線速３００ｃｍ／ｈで９ｍＬ，Ｅ液を線速３００ｃｍ／ｈで９ｍＬ通液した。吸着体の充填終了後からの操作をさらに２回繰り返すことにより、溶出液中のＩｇＧ量と、ＩｇＧ中にリークしたリガンド濃度を求めた。
＜Ｋａｖ測定＞
（原理）
実施例１の吸着体のゲル相分配係数をゲル濾過で測定した。分子量の異なる２種類のデキストランを、吸着体を充填したカラムに流した。各デキストランの保持容量を検出して各Ｋａｖを算出し、Ｍｐ １１００００のＫａｖ値を報告した。Ｋａｖ測定に用いた機器、条件を表１に示す。
【００６７】
【表１】
【００６８】
（化合物）
充填時および選択性試験時の移動相は０．２０Ｍ ＮａＣｌの水溶液とした。
【００６９】
カラムの充填は、移動相への２％アセトン注入によって試験した。
【００７０】
選択性試験に用いたデキストランは以下の通りである。Ｋａｖ測定に用いた化合物を表２に示す。
【００７１】
【表２】
【００７２】
Ｍｐ＝１９６３００の場合に０．２５Ｍ ＮａＣｌで希釈した以外は、デキストランはすべて０．２０Ｍ ＮａＣｌ溶液で希釈し、カラムの総体積の標識として用いた。
【００７３】
（サンプルの前処理）
ガラスフィルター上にて吸着体の３倍量の０．２０Ｍ ＮａＣｌで吸着体を洗浄した後、吸着体と０．２０Ｍ ＮａＣｌとの１：１スラリーを形成させた。
【００７４】
（検量）
個々のマニュアルに従い、使用する機器を制御し、検量した。
【００７５】
（方法）
１回の分析は、１本のカラムを充填して、２回試験する（すなわちデキストランを２回
注入）ことからなる。
【００７６】
（カラムの充填）
カラムを底部アダプターによって充填チューブに接続した。充填チューブをポンプに接続し、ポンプで水を少量注入し、約０．５ｃｍの水で満たした。ゲルスラリーを移し、０．２Ｍ ＮａＣｌで満たし、フィルター及び底部アダプターをカラムに配設した。
【００７７】
約２２ｍｌ／分の流速で流し、カラムを直立させ、１０分間送液を続けた。ゲル面が低下すれば、パスツールピペットでゲルスラリーを追加し、ゲル相長さが３２３ｍｍとなるように調整した。上部アダプターのフィルター面をゲル面に合わせ、移動相のみの長さをゼロとした。ベッドが安定するまで１０ｍｌ／分の流量で添加し、ベッドの安定性を確認した。ゲル層の更なる圧縮が観察されなくなったら、安定であるとした。
【００７８】
（選択性試験）
１．カラムを、少なくとも１．５ＣＶの０．２０Ｍ ＮａＣｌで平衡化した。
２．５０μｌのデキストラン溶液を注入した。
３．移動相の１．３ＣＶによって溶出した。
工程２及び３はその後、デキストラン又はデキストランミックス＊ごとに繰り返した。
＊デキストランは、以下のプロトコルで混合してもよく、また１度に注入してもよい。
混合物１：天然デキストラン＋Ｍｐ６６７００
混合物２：０．２５Ｍ ＮａＣｌ中のＭｐ１９６３００
（解析）
各デキストランの保持容量は、得られたクロマトグラムのＲＩカーブから導出する。ここで、ピークは目的のデキストランの最大ＲＩとして定義する。デキストランに対するＫａｖは、以下の式によって算出される：
Ｋａｖ＝（ＶＲ−Ｖｏ）／（Ｖｃ−Ｖｏ）
式中、
ＶＲ＝（余分のカラムベッド体積（ｍｌ）のために調整された、溶出デキストランの保持容量）
Ｖｏ＝（余分のカラムベッド体積（ｍｌ）のために調整された、間隙容量（天然デキストランのための保持容量））
Ｖｃ＝（カラムの幾何学的体積（ベッド高（ｃｍ）、カラム表面積（ｃｍ２））。
【００７９】
Ｋａｖ値をその後デキストランのｌｏｇＭｐ上にプロットした。各デキストランにおけ
る２つの結果（４つの数値）を、１つのダイヤグラムにプロットした。２つのデキストラ
ン間の一次補間は、レポートされた１１００００（Ｍｐ値）の分子量に対応するＫａｖ値
として算出した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多孔質担体に抗体結合性タンパク質リガンドを固定してなる吸着体であって、メジアン粒径が３０μｍ以上６５μｍ以下である事を特徴とする吸着体。
【請求項２】
５％圧縮時の圧縮応力が０．０２ＭＰａ以上１ＭＰａ以下、１０％圧縮時の圧縮応力が０．０６ＭＰａ以上３ＭＰａ以下、および１５％圧縮時の圧縮応力が０．１ＭＰａ以上５ＭＰａ以下であることを特徴とする、請求項１に記載の吸着体。
【請求項３】
樹脂含量が２％以上５０％以下であることを特徴とする、請求項１または２に記載の吸着体。
【請求項４】
前記吸着体および／またはその前駆体が架橋されていることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の吸着体。
【請求項５】
前記抗体結合性タンパク質リガンドの密度が１〜１０ｍｇ／ｍｌであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の吸着体。
【請求項６】
サイズ110kDaのデキストランに対するKavが0.65以上であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の吸着体。
【請求項７】
前記多孔質担体が炭水化物を含有することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の吸着体。
【請求項８】
前記炭水化物が多糖類であることを特徴とする、請求項７に記載の吸着体。
【請求項９】
前記多糖類がセルロースまたはセルロース誘導体であることを特徴とする請求項８に記載の吸着体。
【請求項１０】
前記抗体結合性タンパク質リガンドがプロテインＡであることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の吸着体。
【請求項１１】
５％圧縮時の圧縮応力が０．０１ＭＰａ以上１ＭＰａ以下、１０％圧縮時の圧縮応力が０．０３ＭＰａ以上３ＭＰａ以下、および１５％圧縮時の圧縮応力が０．０６ＭＰａ以上５ＭＰａ以下であることを特徴とする、請求項１または２に記載の吸着体。
【請求項１２】
精製目的物の吸着量が精製用吸着体１ｍＬあたり１〜１００ｍｇであることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の吸着体。
【請求項１３】
動的吸着容量／静的吸着容量が０．７以上であることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の吸着体。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の吸着体を用いた精製方法。
【請求項１５】
直径２ｃｍ以上及び高さ５ｃｍ以上のカラムを用いることを特徴とする、請求項１４に記載の精製方法。
【請求項１６】
線速が１００〜１０００ｃｍ／ｈで通液する工程を有することを特徴とする、請求項１４または１５に記載の精製方法。
【請求項１】
多孔質担体に抗体結合性タンパク質リガンドを固定してなる吸着体であって、メジアン粒径が３０μｍ以上６５μｍ以下である事を特徴とする吸着体。
【請求項２】
５％圧縮時の圧縮応力が０．０２ＭＰａ以上１ＭＰａ以下、１０％圧縮時の圧縮応力が０．０６ＭＰａ以上３ＭＰａ以下、および１５％圧縮時の圧縮応力が０．１ＭＰａ以上５ＭＰａ以下であることを特徴とする、請求項１に記載の吸着体。
【請求項３】
樹脂含量が２％以上５０％以下であることを特徴とする、請求項１または２に記載の吸着体。
【請求項４】
前記吸着体および／またはその前駆体が架橋されていることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の吸着体。
【請求項５】
前記抗体結合性タンパク質リガンドの密度が１〜１０ｍｇ／ｍｌであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の吸着体。
【請求項６】
サイズ110kDaのデキストランに対するKavが0.65以上であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の吸着体。
【請求項７】
前記多孔質担体が炭水化物を含有することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の吸着体。
【請求項８】
前記炭水化物が多糖類であることを特徴とする、請求項７に記載の吸着体。
【請求項９】
前記多糖類がセルロースまたはセルロース誘導体であることを特徴とする請求項８に記載の吸着体。
【請求項１０】
前記抗体結合性タンパク質リガンドがプロテインＡであることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の吸着体。
【請求項１１】
５％圧縮時の圧縮応力が０．０１ＭＰａ以上１ＭＰａ以下、１０％圧縮時の圧縮応力が０．０３ＭＰａ以上３ＭＰａ以下、および１５％圧縮時の圧縮応力が０．０６ＭＰａ以上５ＭＰａ以下であることを特徴とする、請求項１または２に記載の吸着体。
【請求項１２】
精製目的物の吸着量が精製用吸着体１ｍＬあたり１〜１００ｍｇであることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の吸着体。
【請求項１３】
動的吸着容量／静的吸着容量が０．７以上であることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の吸着体。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の吸着体を用いた精製方法。
【請求項１５】
直径２ｃｍ以上及び高さ５ｃｍ以上のカラムを用いることを特徴とする、請求項１４に記載の精製方法。
【請求項１６】
線速が１００〜１０００ｃｍ／ｈで通液する工程を有することを特徴とする、請求項１４または１５に記載の精製方法。
【公開番号】特開２０１１−７２８８３（Ｐ２０１１−７２８８３Ａ）
【公開日】平成２３年４月１４日（２０１１．４．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２２５６２８（Ｐ２００９−２２５６２８）
【出願日】平成２１年９月２９日（２００９．９．２９）
【出願人】（００００００９４１）株式会社カネカ (3,932)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年４月１４日（２０１１．４．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年９月２９日（２００９．９．２９）
【出願人】（００００００９４１）株式会社カネカ (3,932)
【Ｆターム（参考）】
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