哺乳動物中の発光複合体の非侵襲的局在化
【課題】哺乳動物などの生体内の病原体とその他の物体を検出し、位置決めし
、追跡するための非侵襲的方法を提供すること。
【解決手段】生きている非ヒト哺乳類対象中の異種遺伝子の発現を検出するた
めの非侵襲的方法であって、該方法が、以下：導入遺伝子を含む細胞を有する非
ヒト哺乳類対象を提供する工程であって、ここで、（ｉ）該導入遺伝子が、生物
発光タンパク質または蛍光発生タンパク質をコードする異種遺伝子を含み、そし
て（ｉｉ）該対象は、不透明な組織を含む、工程；および不透明な組織を貫通す
る光子放射を光検出装置を用いて測定することによって、該異種遺伝子の発現を
検出する工程であって、ここで、該細胞による該異種遺伝子の発現が許容される
状況下に該対象が維持される、工程、を含む、方法。
、追跡するための非侵襲的方法を提供すること。
【解決手段】生きている非ヒト哺乳類対象中の異種遺伝子の発現を検出するた
めの非侵襲的方法であって、該方法が、以下：導入遺伝子を含む細胞を有する非
ヒト哺乳類対象を提供する工程であって、ここで、（ｉ）該導入遺伝子が、生物
発光タンパク質または蛍光発生タンパク質をコードする異種遺伝子を含み、そし
て（ｉｉ）該対象は、不透明な組織を含む、工程；および不透明な組織を貫通す
る光子放射を光検出装置を用いて測定することによって、該異種遺伝子の発現を
検出する工程であって、ここで、該細胞による該異種遺伝子の発現が許容される
状況下に該対象が維持される、工程、を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物対象中の発光体および発光性生物事象を検出し、位置決め
し、追跡するための非侵襲的な方法と組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
組識内の感染性因子を検出し定量するための現行の生体外方法では、感染性疾
患の進行をモニターする能力に限界がある。宿主における感染性因子の複製には
、しばしば一次、二次および三次複製部位が関与する。複製部位と、感染性因子
がそれらの部位を通過する過程は、接種経路、宿主がコードする因子、およびそ
の感染性因子の決定基に基づいて観測される。
【０００３】
考えられる複製部位と感染の進行は、経験から推定できる場合もある。しかし
感染部位と疾患の速度は、知られないか、あるいは大雑把にしか推定できないこ
との方が多いだろう。また感染性疾患の進行は、マウスの同系交配系でさえ、個
別的である場合が多く、実験的に感染させた宿主で疾患が平均してどのような経
過をたどるのかを決定するために、数多くの感染動物の連続的な生体外分析を行
なう必要がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
動物モデルにおける感染の進行を追跡する手段を持つことが望ましい。その追
跡を非侵襲的に行なうことができ、一匹の動物を必要な頻度で有害な影響を与え
ずに評価できれば、理想的である。本発明は、哺乳動物などの生体内の病原体と
その他の物体を検出し、位置決めし、追跡するための非侵襲的方法を提供するこ
とを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
１つの局面において、本発明は、次の工程からなる哺乳類対象中の生物適合体
の局在を検出する非侵襲的方法を提供する：（ａ）その対象に、その生物適合体
と発光成分の複合体を投与し、（ｂ）その複合体がその対象内で局在を達成しう
る期間の後、その対象を光検出装置の検出フィールド内に固定し、（ｃ）その対
象を固定状態に維持し、（ｄ）維持中に、その対象中に局在した発光成分からの
光子放射を、光子放射の画像を構築することができるまで、その光検出装置で測
定し、（ｅ）その画像を構築する。
【０００６】
１つの実施形態において、上記の方法は、工程（ｂ）から（ｅ）までを選択し
た間隔で反復することをさらに含み得、その反復が対象中の生物適合体の局在を
経時的に追跡するのに有効であり得る。
【０００７】
別の実施形態において、上記の方法は、その測定が増倍化電荷結合光検出素子
を用いて行われ得る。
【０００８】
別の実施形態において、上記の方法は、その投与が腫瘍細胞ターゲッティング
成分を含有する複合体の投与を含み得る、哺乳類対象中の腫瘍細胞の局在を検出
するための方法であり得る。
【０００９】
別の実施形態において、上記の方法は、その投与が炎症ターゲッティング成分
を含有する複合体の投与を含み得る、哺乳類対象中の炎症の局在を検出するため
の方法であり得る。
【００１０】
別の実施形態において、上記の方法は、その投与が感染ターゲッティング成分
を含有する複合体の投与を含み得る、哺乳類対象中の病原体による感染の局在を
検出するための方法であり得る。
【００１１】
別の実施形態において、上記の方法は、その投与が血栓性プラークターゲッテ
ィング成分を含有する複合体の投与を含み得る、哺乳類対象内の血栓性プラーク
の局在を検出するための方法であり得る。
【００１２】
別の実施形態において、上記の方法は、その投与が発光成分を含有する粒子で
ある複合体の投与を含み得る。
【００１３】
別の実施形態において、上記の方法は、動物モデル中の病原体による感染症の
局在を検出するための方法であり得、生物適合体がその病原体であり得る。好ま
しい実施形態において、その病原体がサルモネラであり得る。
【００１４】
別の実施形態において、上記の発光成分が発光性タンパク質であり得る。好ま
しい実施形態において、上記タンパク質がルシフェラーゼ、黄色蛍光タンパク質
およびフェレドキシンＩＶからなる群より選択され得る。別の好ましい実施形態
において、その投与が抗体断片と発光性タンパク質の融合タンパク質である複合
体の投与を含み得る。別の好ましい実施形態において、上記生物適合体が形質転
換細胞であり得、上記発光成分がその細胞から発現する異種遺伝子の産物であり
得る。さらに好ましい実施形態において、上記異種遺伝子の発現が活性化可能な
プロモーターの制御下にあり得る。
【００１５】
別の局面において、本発明は、哺乳類対象中の生物適合体のレベルを経時的に
検出する非侵襲的方法であって、（ａ）その対象に、その生物適合体と発光成分
の複合体を投与し、（ｂ）その対象を光検出装置の検出フィールド内に置き、（
ｃ）その対象をその装置の検出フィールド中に維持し、（ｄ）維持中に、その対
象中の発光成分からの光子放射を、その光検出装置で測定し、（ｅ）（ｂ）から
（ｄ）までの工程を、選択した間隔で反復することからなり、その反復が、その
対象中の生物適合体のレベルの経時変化を検出するのに有効である方法を提供す
る。
【００１６】
さらなる局面において、本発明は、次の工程からなる哺乳類対象における導入
遺伝子の組み込みを検出する非侵襲的方法を提供する：（ａ）その対象に、哺乳
類細胞中に有効に組み込まれ、かつ、導入遺伝子、発光性タンパク質をコードす
る遺伝子および活性化可能なプロモーターを含有するベクター構築物（ただし、
発光性タンパク質をコードする遺伝子はプロモーターの制御下にある）を投与し
、（ｂ）その構築物が組み込みを達成しうる期間の後、プロモーターを活性化し
、（ｃ）その対象を光検出装置の検出フィールド内に置き、（ｄ）その対象をそ
の光検出装置の検出フィールド内に維持し、（ｅ）維持中に、その対象中の、発
現した発光性タンパク質からの光子放射のレベルを、その光検出装置で測定し、
（ｆ）その光子放射のレベルがバックグラウンドより有意に高ければ、その導入
遺伝子の組み込みを確認する。
【００１７】
なおさらなる局面において、本発明は、次の工程からなる動物中のプロモータ
ー誘導事象の局在を検出する非侵襲的方法を提供する：（ａ）その事象に反応す
る誘導性プロモーターとその制御下にある発光性タンパク質をコードする異種遺
伝子とを持つトランスジェニック動物中で、その事象を誘発し、（ｂ）その動物
を光検出装置の検出フィールド内に置き、（ｃ）その動物を固定状態に維持し、
（ｄ）維持中に、その動物内に局在する発現した発光性タンパク質からの光子放
射を、光子放射の画像を構築することができるまで、その光検出装置で測定し、
（ｅ）その画像を構築する。
【００１８】
なおさらなる別の局面において、本発明は、発光性タンパク質を発現させる遺
伝子で形質転換されたサルモネラを提供する。
【００１９】
一態様として、本発明は、哺乳類対象内の生物適合体の局在を検出する非侵襲
的方法を包含する。その生物適合体は分子であってもよいし、巨大分子、細胞、
微生物（病原体を含む）、あるいは粒子などであってもよい。
【００２０】
この方法では、対象に当該物体と発光成分の複合体を投与する。発光成分は通
例、光を放射する分子または高分子（巨大分子）である。この成分は、放射吸収
の結果として発光したり（例えば蛍光性または燐光性分子）、あるいは化学反応
の結果として発光することができる（例えば生物発光タンパク質）。発光成分の
典型例は、ルシフェラーゼやエクオリンのような生物発光タンパク質および、黄
色蛍光タンパク質やフェレドキシンＩＶのような有色または蛍光タンパク質であ
る。
【００２１】
この成分は、物体の合成中に組み込んだり（例えば化学的または遺伝子的組み
込み、抗体断片と発光性タンパク質の融合タンパク質など）、合成後の化学的カ
ップリング、非共有結合的会合（例えばリポソームによる封入）、物体内でのｉ
ｎ ｓｉｔｕ合成（例えば形質転換細胞における異種生物発光タンパク質の発現
）、またはプロモーター誘導物質で剌激されたトランスジェニック動物の細胞に
おける生物発光タンパク質の活性化可能なプロモーター制御性のｉｎ ｓｉｔｕ
発現（例えばウイルスの感染によって刺激されたインターフェロン活性化プロモ
ーター）などといった様々な技術により、物体と複合させることができる。
【００２２】
対象中で複合体が局在できた期間の後、対象を、十分な量の光子放射を（その
光検出装置で）測定して画像を構築するのに有効な期間、光検出装置の検出フィ
ールド内に固定する。典型的な光検出装置は、画像処理装置に接続した増倍化電
荷結合素子（ＩＣＣＤ）カメラである。”固定されていない”対象が動く時間ス
ケールに比べて短い時間内に画像を構築できるのであれば、対象は撮像中本質的
に”固定されている”ことになり、特別な固定措置は必要ない。次に、光子放射
データから画像を構築する。
【００２３】
撮像工程を選択した間隔で繰り返し、各間隔に対応する画像を構築することに
より、上述の方法で、対象内の物体の局在を経時的に追跡することができる。
物体上にターゲッティング成分を結合したり、複合させたり、あるいは組み込む
ことにより、数多くの特定の応用に、上述の方法を使用することができる。ター
ゲッティング成分はその物体（例えば抗体または抗体断片）固有の特性であって
もよいし、あるいはターゲッティング成分を物体に複合させたり、結合したりま
たは組み込んでもよい（例えば抗体を含有するリポソーム）。ターゲッティング
成分の例には、抗体、抗体断片、酵素阻害因子、レセプター結合分子、種々の毒
素などがある。ターゲッティング成分の標的としては、炎症部位、感染部位、血
栓性プラーク、腫瘍細胞などを挙げることができる。これらの標的を特徴づける
、ターゲッティング成分による認識に適したマーカーは、よく知られている。
【００２４】
さらに、発光成分と複合した病原体（例えばサルモネラ）を物体として使用す
れば、この方法で、動物モデル内の病原体による感染部位を検出し、局在化（定
位）することができる。
【００２５】
関連する態様として、本発明は、哺乳類対象内の生体適合体のレベルを経時的
に検出する非侵襲的方法を包含する。この方法は上述の方法に似ているが、必ず
しも物体を画像の形で局在化するわけではなく、対象内での物体のレベルの変化
を経時的に検出するよう設計される。この方法は、物体（例えば発光性細菌）の
レベルに対する治療用物質（例えば抗生物質）の効果を経時的にモニターするの
に、とりわけ有用である。
【００２６】
もう１つの態様として、本発明は、哺乳類対象における導入遺伝子の組込みを
検出する非侵襲的方法を包含する。この方法では、哺乳類細胞に導入遺伝子を組
み込むのに有効なべクター構築物を、対象に投与する。そのような構築物は当技
術分野ではよく知られている。この構築物は、効果的な組込みに必要な要素に加
えて、導入遺伝子（例えば治療用遺伝子）と、発光性タンパク質をコードする遺
伝子とを、選択した活性化可能なプロモーターの制御下に含有する。その構築物
が組み込みを達成しうる期間の後、そのプロモーターを活性化する。例えば、イ
ンターフェロンプロモーターを使用した場合は、ポリイノシン−ポリシトシン二
重鎖（ポリＩＣ）を局所投与（例えば足蹠注射）することにより、インターフェ
ロン産生を刺激することができる。次に、対象を光検出装置（例えば光増倍性”
暗視”ゴーグルをつけた人）の検出フィールド内に置き、光子放射のレベルを測
定または評価する。そのレベルがバックグラウンドを超える場合（すなわち光が
”活性化した”領域に優先的に検出されうる場合）、その対象は当該導入遺伝子
を組込んでいると記録される。
【００２７】
関連する態様として、本発明は、発光性タンパク質をコードする遺伝子を誘導
性プロモーターの制御下に含む構築物でトランスジェニックまたはキメラにした
動物におけるプロモーター誘導事象の局在を検出する非侵襲的方法を包含する。
プロモーター誘導事象には、そのプロモーターを直接活性化する物質の投与、内
因性プロモーター活性化因子の産生を刺激する物質の投与（例えばＲＮＡウイル
ス感染によるインターフェロン産生の剌激）、内因性プロモーター活性化因子の
産生をもたらす状態に置くこと（例えば熱ショックまたはストレス）などがある
。この事象を誘発し、上述のように動物を撮像する。
【００２８】
さらなる態様として、本発明は、発光性タンパク質（例えばルシフェラーゼ）
を発現させる遺伝子で形質転換された病原体（例えばサルモネラ）を包含する。
【００２９】
またもう１つの側面として、本発明は、病原体による感染の蔓延を抑制するの
に有効な治療用化合物を同定する方法をも包含する。この方法では、病原体と発
光成分の複合体を対照動物と実験動物に投与し、その実験動物を治療用化合物候
補で処置し、上述の方法によって対照動物内と実験動物内の発光性病原体を局在
化し、その化合物が対照動物と比較して実験動物における病原体の蔓延または複
製を有意に抑制する効力をもつのであれば、その化合物を治療上有効であると認
める。複合体としては、蛍光標識された抗体、蛍光標識された粒子、蛍光標識さ
れた小分子などが挙げられる。
【００３０】
さらなる側面として、本発明は、発光成分と共役した物体を、様々な不透明度
を持つ媒質を通して局在化する方法を包含する。この方法では、光検出装置を用
いて、その媒質を透過した光子を検出し、その光子を経時的に積分し、積分した
その信号に基づいて画像を作成する。
【００３１】
さらなる態様として、本発明は、ある生物内の特定の部位で、選択した物質（
例えば溶存酸素またはカルシウム）の濃度を測定する方法を包含する。この方法
には、濃度センサー（すなわち発光する能力が選択した物質の濃度に依存する発
光性分子）を含有する物体（例えば細胞）が含まれる。その発光性分子を含有す
る物体を、動物内もしくは特定の組識または器官系（例えば脾臓）内に実質上均
一に分布するように投与する。その生物を撮像する。光放射の強度と局在は、選
択した物質の濃度と位置に相関する。別法として、当該物体は、第２の標識、例
えば濃度センサーとは異なる波長で発光することができる分子を含有する。この
第２標識を用いて宿主における物体の分布の非均一性を規格化すれば、選択した
物質の濃度をより正確に決定することができる。
【００３２】
もう１つの側面として、本発明は、腫瘍の増殖および／または転移性伝播を抑
制するのに有効な治療用化合物を同定する方法を包含する。この方法では、（ｉ
）発光成分で標識した腫瘍細胞または発光成分を含有する腫瘍細胞を実験動物群
と対照動物群に投与し、（ｉｉ）その実験群を選択した化合物で処置し、（ｉｉ
ｉ）腫瘍細胞に付随する発光性分子からの光子放射を光検出装置で撮像すること
によって、両群の動物中の腫瘍細胞を局在化し、（ｉｖ）その化合物が対照群と
比較して実験群における腫瘍の増殖および／または転移性伝播を有意に抑制でき
るならば、その化合物を治療上有効であると認める。
【００３３】
本発明の上記その他の目的と特徴は、下記の発明の詳細な説明を添付の図面と
合わせて読むことにより、より完全に理解されるだろう。
【発明の効果】
【００３４】
すなわち、本発明により、哺乳動物などの生体内の病原体とその他の物体を検
出し、位置決めし、追跡するための非侵襲的方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
（Ｉ．定義）
特に明示しない限り、本明細書で使用する用語はすべて、本発明の技術分野で
使用される通常の意味を持つ。
【００３６】
本明細書における不透明媒質とは「従来通りの」不透明な媒質を指し、必ずし
も完全に不透明であるとは限らない。したがって不透明媒質とは、一般に透明で
なく半透明でもないとみなされる媒質をいい、これには木片や哺乳動物の肉およ
び皮膚などが含まれる。
【００３７】
特に断わらない限り、ルシフェラーゼには原核生物ルシフェラーゼと真核生物
ルシフェラーゼが含まれ、また、赤色領域の波長で発光するルシフェラーゼのよ
うな光学特性が変異または変化した変種も含まれる。
【００３８】
生物適合体とは、哺乳動物に投与できる物体をいう。これには哺乳動物にとっ
て有害でありうる病原体も含まれる。発光性タンパク質を発現させる導入遺伝子
を含有する細胞を持つ動物の場合、生物適合体とは、その哺乳動物を構成する導
入遺伝子含有細胞を指す。
【００３９】
発光性とは、化学反応または放射線の吸収により光を発生しうることをいう。
【００４０】
本明細書において光とは、特に断わらない限り、約３００ｎｍと約１１００ｎ
ｍの間の波長を持つ電磁放射線をいう。
【００４１】
感染の蔓延とは、通常、最初の感染部位以外の宿主部位の、病原体による伝播
とコロニー形成を指す。ただしこの用語には、最初の感染部位における病原体の
大きさおよび／または数の増大も含まれうる。
【００４２】
ｌｕｘ−ルシフェラーゼおよび光子放射に関係する原核生物遺伝子。
【００４３】
ｌｕｃ−ルシフェラーゼおよび光子放射に関係する真核生物遺伝子。
【００４４】
プロモーター誘導事象とは、選択した誘導性プロモーターの直接的または間接
的誘導をもたらす事象を指す。
【００４５】
異種遺伝子とは、宿主生物中に形質移入された遺伝子を指す。通例、異種遺伝
子とは、形質移入または形質転換された細胞のゲノムＤＮＡに元来由来しない遺
伝子を指す。
【００４６】
（ＩＩ．発明の一般的概観）
本発明は、哺乳類対象中の発光性複合体の非侵襲的撮像および／または検出に
関する方法と組成物を包含する。この複合体は、生物適合体と発光成分とを含有
する。生物適合体には、環状有機分子などの小分子；タンパク質などの高分子；
ウイルス、細菌、酵母、カビなどの微生物；あらゆるタイプの病原体および病原
性物質；ビーズやリポソームなどの粒子が含まれるが、これらに限らない。また
、生物適合体は、撮像される哺乳類対象を構成する細胞の全部または一部であっ
てもよい。
【００４７】
発光能は、発光成分の複合体化によって物体に付与される。そのような成分に
は、蛍光分子、蛍光タンパク質、光子を放出する酵素反応、生物発光タンパク質
などの発光物質がある。複合体化（共役）には、化学的カップリング、融合タン
パク質の遺伝子操作、あるいは生物発光タンパク質を発現させる細胞、微生物ま
たは動物の形質転換が含まれうる。例えば、その物体が撮像する哺乳類対象を構
成する細胞である場合、その発光成分はその細胞に「共役（複合）」させた生物
発光タンパク質または蛍光タンパク質であってよく、それはトランスジェニック
動物またはキメラ動物の作出によりその細胞内に導入されたべクター構築物から
のプロモーター制御的発現の局在性による。
【００４８】
通例、発光性複合体を様々な方法で対象に投与し、その対象内で局在させ、そ
れを撮像する。撮像または対象からの光子放射の測定は数十分間続くことがある
ので、常にそうであるとは限らないが、通常は撮像工程中、対象を固定しておく
。
【００４９】
発光体の撮像は、極めて低レベルの光（通常は単一光子事象）を検出し、画像
の構築が可能になるまで光子放射を積分できる光検出器の使用を必要とする。そ
のような高感度光検出器の例には、単一光子事象を増幅した後、検出系に固有の
背景ノイズに対して単一光子を検出できる（例えば液体窒素で冷却された）カメ
ラまたはカメラ群で、その事象を検出する装置がある。
【００５０】
光子放射画像を作成したら、通例、放射された光子の発生源に関して準拠座標
系を与えるため（すなわち対象に関して発光性複合体を局在化するため）に、そ
れをその対象の”通常の”反射光画像に重ね合わせる。次に、そのような”合成
”画像を分析することにより、対象内の標的の位置および／または量を決定する
。
【００５１】
以下に、上述の段階と態様をより詳細に記述する。
【００５２】
（ＩＩＩ．発光体）
（Ａ．発光成分）
本発明の実施に有用な発光成分（ｌｉｇｈｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｍｏｉ
ｅｔｙ；ＬＧＭ）、発光分子または発光構築物は、その応用に応じて様々な形態
のいずれをとってもよい。これらに共通する特徴は、それらが発光性であるとい
うこと、すなわちそれらが電子的励起状態から、より低いエネルギー状態（通常
、基底状態）への遷移の結果として、原子または分子から紫外（ＵＶ）、可視お
よび／または赤外（ＩＲ）領域の電磁放射線を放射するということである。
【００５３】
発光成分の例には、蛍光分子、化学発光化合物、燐光化合物、生物発光化合物
などの光冷光（フォトルミネセンス）分子がある。
【００５４】
本発明との関連性が強いＬＧＭの２つの特徴は、そのサイズとスペクトル特性
である。これらについては、スペクトル特性に関する一般的議論の後、後述する
発光成分の特定のタイプに関連して議論する。
【００５５】
（１．スペクトル特性）
本発明の重要な側面は、非侵襲的に外部から検出できるように動物組識を貫通
しうる光を生成する発光成分の選択である。光が動物組識（ほとんど水からなる
）のような媒質を通過する能力は、主として、その光の強度と波長によって決ま
る。
【００５６】
単位体積中の発光強度が強いほど、その光は検出しやすくなる。単位体積中に
生成する光の強度は、後述する個々のＬＧＭのスペクトル特性と、単位体積中の
当該成分の濃度に依存する。したがって、通例、物体内または物体上に高濃度の
ＬＧＭを配置する共役法（例えばリポソームの高効率負荷や、細胞内での生物発
光タンパク質の高レベル発現など）により、例えば各物体にＬＧＭを一つだけ共
役させる方法よりも深い組識層を通して検出することが容易な、より明るい発光
性複合体（ｌｉｇｈｔ−ｅｍｉｔｔｉｎｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ； ＬＥＣ）を
作成する。
【００５７】
組識層越しのＬＧＭの検出性を支配する第２の因子は、放射光の波長である。
ほとんどの組織は主として水からなっているので、動物組識の吸収特性を近似す
るには水を使用することができる。水が長波長光（赤色領域の光）を短波長光よ
り容易に透過させることはよく知られている。
【００５８】
したがって、通例、黄色から赤色（５５０〜１１００ｎｍ）の範囲の光を放射
するＬＧＭの方が、より短い波長で放射するＬＧＭより好ましい。後述するＬＧ
Ｍのいくつかはこの範囲で放射する。しかし、本発明の裏付けとして行なった後
述の実験によれば、４８６ｎｍ域で放射するＬＧＭで本発明を実施すると、それ
が最適な放射波長でないという事実にもかかわらず、良好な結果を得ることがで
きる。これらの結果は、これらの実験で使用したＬＥＣ（形質転換サルモネラ細
胞）内に比較的高濃度のＬＧＭ（ルシフェラーゼ分子）が存在することと、高感
度な検出器を使用したことが、その一因だと考えられる。より最適な放射波長を
持つＬＧＭを使用すれば、より低濃度のＬＧＭを持つＬＧＥで同様の検出結果が
得られることは、理解されるだろう。
【００５９】
（２．蛍光系成分）
蛍光は、放射線源の除去後極めて短い持続時間を持つ単一の電子励起状態から
生じる物質の発光である。励起光の一部はその蛍光分子によって熱に変換される
ので、放射される蛍光の波長は励起光の波長より長い（ストークスの法則）。
【００６０】
蛍光分子がルミネセンスを示すには光の入力が必要であるから、本発明におけ
る蛍光分子の使用は、生物発光分子の使用よりも複雑になるだろう。通例、対象
から検出される蛍光光子シグナルを汚染しないように、励起光を遮蔽する予防措
置がとられる。自明の予防措置としては、蛍光顕微鏡で使用されるような励起フ
ィルターを放射線源に設置することが挙げられる。適切に選択された励起フィル
ターは、蛍光成分によって放射される光子の波長と類似する波長を持つ光子の大
半を遮断する。また、蛍光光子の波長以外の波長を持つ光子の大半をふるい落と
すために、障壁フィルターを検出器に使用する。上述のようなフィルターは、Ｏ
ｍｅｇａ Ｏｐｔｉｃａｌ社（バーモント州ブラトルバロ）を含む様々な商業的
供給源から入手できる。
【００６１】
また、適切な励起波長に近く、蛍光放射波長には近くない高強度光を発生させ
るレーザーを使用して、蛍光成分を励起させることもできる。例えば共焦点顕微
鏡のようにレーザーが対象を走査できるように、ｘ−ｙ変換機構を使用してもよ
い。
【００６２】
もう１つの予防措置として、検出器の部位に到達した放射光子が、対象を完全
に通過したものだけとなるように、放射線源を対象の背後に設置し、遮蔽するこ
ともできる。さらに、蛍光成分を励起するために使用する光の波長に対して低い
感度を持つ検出器を選択してもよい。
【００６３】
上述の措置を賢明に適用すれば、本発明の方法による蛍光性ＬＧＭの検出が可
能である。
【００６４】
蛍光成分としては、フルオレセインのような小さい蛍光分子と、緑色蛍光タン
パク質（Ｃｈａｌｆｉｅら，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：８０２−８０
５；ＭｏｒｉｎおよびＨａｓｔｉｎｇｓ，１９７１，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉ
ｏｌ．７７：３１３）やルマジンおよび黄色蛍光タンパク質（Ｏ’Ｋａｎｅら，
１９９１，ＰＮＡＳ ８８：１１００−１１０４；Ｄａｕｂｎｅｒら，１９８７
，ＰＮＡＳ ８４：８９１２−８９１６）のような蛍光タンパク質が挙げられる
。また、ある種の有色タンパク質、例えばフェレドキシンＩＶ（Ｇｒａｂａｕら
，１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：３２９４−３２９９；その蛍光
性はまだ評価されていない）などにも蛍光性があって、本発明で使用できるかも
しれない。フェレドキシンＩＶは赤みがかった色を持ち、それは比較的長波長で
蛍光または反射して組識を貫通するのに有効な光を生じる可能性を示すので、特
に有望な候補である。さらに、この分子はタンパク質としては小さいので（９５
アミノ酸）、物体に共役させた時に、それらの機能に与える影響を最小限に抑え
ることができる。
【００６５】
小さい蛍光分子の利点は、それを結合させる物体の生物活性を妨害する可能性
が、より大きな発光成分よりも少ないということである。また、本発明での使用
に適した種々の励起および放射スペクトルを持つ市販の蛍光分子を入手すること
もできる。例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社（オレゴン州ユージーン
）は、ルシファーイエロー（４２８ｎｍで吸収し、５３５ｎｍで放射）やナイル
レッド（５５１ｎｍで吸収し、６３６ｎｍで放射）を含む多数の発蛍光団を販売
している。さらに、種々の結合法で使用できる様々な基で誘導体化された分子も
（例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社から）入手することができる。
【００６６】
（３．生物発光系成分）
化学発光（化学反応の結果としての発光）と生物発光（生体からの可視発光）
は、多くの側面から詳細に研究されている（例えばＣａｍｐｂｅｌｌ，１９８８
，Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐ
ｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（英
国チチェスター；Ｅｌｌｉｓ Ｈｏｒｗｏｏｄ社およびＶＣＨ出版社））。以下
に顕著な特徴を簡単に要約する。
【００６７】
生物発光分子は、光を放射するために放射エネルギーの入力を必要としない点
で、蛍光分子とは異なる。むしろ生物発光分子は、ＡＴＰなどの化学エネルギー
を利用して光を発生させる。蛍光成分に対する生物発光成分の利点は、そのシグ
ナルに事実上バックグラウンドがないということである。検出される光は、外来
の生物発光成分によって生成した光だけである。これに対して、蛍光分子を励起
するために使用される光は、しばしば意図する標的以外の物質の蛍光をもたらす
。これは”バックグラウンド”が生きている動物の内部環境のように複雑な場合
は、とくにそうである。
【００６８】
生物発光分子にはいくつかの種類が知られている。それらには、ルシフェラー
ゼファミリー（例えばＷｏｏｄら，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：７００
−７０２）や、エクオリンファミリー（例えばＰｒａｓｈｅｒら，Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．２６：１３２６−１３３２）がある。ルシフェラーゼファミリーの要素は、
種々の原核生物と真核生物で同定されている。原核発光（ｌｕｘ）系に関与する
ルシフェラーゼその他の酵素と、それに対応するｌｕｘ遺伝子は、ビブリオ（Ｖ
ｉｂｒｉｏ）属とフォトバクテリウム（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の海
生細菌およびキセノラブダス（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ）属の陸生細菌から単離
されている。
【００６９】
ルシフェラーゼ系（ｌｕｃ）を含有する代表的真核生物は、北アメリカホタル
Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓである。ホタルルシフェラーゼは詳細に研究
されており、ＡＴＰアッセイに広く使用されている。コメツキムシの一種 Ｐｙ
ｒｏｐｈｏｒｕｓ ｐｌａｇｉｏｐｈｔｈａｌａｍｕｓ由来のルシフェラーゼを
コードするｃＤＮＡが、クローン化され、発現されている（Ｗｏｏｄら，１９８
９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：７００−７０２）。この甲虫は、種の異なる要素
が異なる色の生物発光を放射する点で珍しい。互いに９５〜９９％の相同性を持
つ４種類のクローンが単離された。それらは５４６ｎｍ（緑色）、５６０ｎｍ（
黄緑色）、５７８ｎｍ（黄色）、および５９３ｎｍ（橙色）の光を放射する。最
後の種類（５９３ｎｍ）は、その放射光がそれより短い波長の光よりも容易に組
識を貫通する波長を持つので、本発明で発光成分として使用するには特に好都合
である。
【００７０】
ルシフェラーゼ類とエクオリン様分子は、ＡＴＰやＮＡＤ（Ｐ）Ｈなどのエネ
ルギー源と、ルシフェリンまたはコエレントリジン（ｃｏｅｌｅｎｔｒｉｚｉｎ
ｅ）と酸素などの基質を必要とする。
【００７１】
ルシフェラーゼ酵素を発光させるには、基質ルシフェリンをルシフェラーゼ酵
素に供給しなければならない。ルシフェラーゼ酵素がｌｕｘルシフェラーゼをコ
ードするｃＤＮＡを含有するベクターの発現産物として導入される場合、ルシフ
ェリンを供給する便利な方法は、ルシフェラーゼを発現させるだけでなく、ルシ
フェリンを合成するための生合成酵素をも発現させることである。そのような構
築物で形質転換された細胞では、生物発光に必要な外因性要素が酸素だけになる
。そのような方法（実施例１に詳述）を用いてｌｕｘ形質転換サルモネラを作成
し、それを使って本発明を裏付ける後述の実験を行なう。
【００７２】
土壌菌Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓから得たｌｕｘオペ
ロンをコードするプラスミド構築物（Ｆｒａｃｋｍａｎら，１９９０，Ｊ．Ｂａ
ｃｔ．１７２：５７６７−５７７３）は、ヘテロ二量体ルシフェラーゼの２つの
サブユニットと３つの補助タンパク質を発現させることにより、形質転換大腸菌
に光子放射能を付与する（Ｆｒａｃｋｍａｎら，１９９０）。Ｘ．ｌｕｍｉｎｅ
ｓｃｅｎｓのｌｕｘ遺伝子を発現させる大腸菌の最適な生物発光は３７℃で観察
され（ＳｚｉｔｔｎｅｒおよびＭｅｉｇｈｅｎ，１９９０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２６５：１６５８１−１６５８７；Ｘｉら，１９９１，Ｊ．Ｂａｃｔ．１
７３：１３９９−１４０５）、これは真核発光生物や他の原核発光生物由来のル
シフェラーゼの低い最適温度と対照的である（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，１９８８，Ｃ
ｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌ
ｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（英国チ
チェスター：Ｅｌｌｉｓ Ｈｏｒｗｏｏｄ社およびＶＣＨ出版社））。したがっ
てＸ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ由来のルシフェラーゼは、動物中での研究にマー
カーとして使用するのに適している。
【００７３】
上述または実施例１に記述するようなルシフェラーゼベクター構築物は、大半
の細菌と多くの真核細胞（ｌｕｃ構築物）を含む様々な宿主細胞の形質転換に使
用できる。また、ヘルペスウイルスやワクシニアウイルスのようなある種のウイ
ルスは、ルシフェラーゼを発現させるように遺伝子操作することができる。例え
ば、Ｋｏｖａｃｓ Ｓｚ．およびＭｅｔｔｅｎｌｉｅｔｅｒ，１９９１，Ｊ．Ｇ
ｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７２：２９９９−３００８には、ヘルペスウイルス内のホ
タルルシフェラーゼをコードする遺伝子の安定な発現が記述されている。Ｂｒａ
ｓｉｅｒおよびＲｏｎ，１９９２，Ｍｅｔｈ．ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１６：
３８６−３９６には、哺乳類細胞内でのルシフェラーゼ遺伝子構築物の使用が記
述されている。培養哺乳類細胞からのルシフェラーゼ発現は、ＣＣＤ撮像法で巨
視的（ＩｓｒａｅｌおよびＨｏｎｉｇｍａｎ，１９９１，Ｇｅｎｅ １０４：１
３９−１４５）にも微視的（Ｈｏｏｐｅｒら，１９９０，Ｊ．Ｂｉｏｌｕｍ．ａ
ｎｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍ．５：１２３−１３０）にも研究されている。
【００７４】
（Ｂ．物体）
本発明は、上述のような発光成分、発光性構築物または発光分子を含むように
修飾したまたは共役させた物体を包含する。そのような共役体または修飾体を、
発光体、発光性複合体（ＬＥＣ）または単に複合体という。これらの物体自体は
、例えば分子、高分子、粒子、微生物または細胞などの形態をとることができる
。発光成分を物体に共役させる方法は、その成分と物体の性質に依存する。代表
的な共役法については、後述の物体に関連して議論する。
【００７５】
（１．小分子）
本発明の実施に有用であろう小分子物体としては、病原体もしくは内因性リガ
ンドまたはレセプターと特異的に相互作用する化合物が挙げられる。そのような
分子の例には、薬物や治療用化合物；ある種のクモ、ヘビ、サソリ、渦鞭毛藻類
、海性巻貝、細菌を含む有毒生物の毒液中に存在するような毒素；ＮＧＦ、ＰＤ
ＧＦ、ＴＧＦ、ＴＮＦなどの増殖因子；サイトカイン；生理活性ペプチドなどが
あるが、これらに限るわけではない。
【００７６】
これらの小分子は、その小分子の生物活性が仮に妨害されるとしてもそれが最
小限であるような発光成分（例えば小さい蛍光分子（上述））と共役（結合）さ
せることが好ましい。結合の性質は通例化学的であり、当業者の知る様々な方法
のいずれで行なってもよい。
【００７７】
小分子物体は、形式的な結合操作が必要ないように、発光成分を含有するよう
合成することができる。また、発光成分と反応できる反応性基を持つ小分子物体
を合成したり、その逆を行なうこともできる。
【００７８】
本発明の発光成分と結合した小分子は、ヒトの疾患または状態の動物モデルで
使用してもよいし、処置すべきヒト対象で直接使用してもよい。例えば、腫瘍細
胞上に発現するレセプターに高い親和力で結合する小分子を動物モデルで使用す
ることにより、腫瘍を局在化し、その大きさの推定値を得たり、治療薬候補によ
る処置後の腫瘍の増殖または転移の変化をモニターすることができる。また、そ
のような分子を用いて、癌患者中の上述のような腫瘍の特徴をモニターすること
もできる。
【００７９】
（２．高分子）
ポリマーや生体ポリマーのような高分子は、本発明の実施に有用な物体のもう
１つの例である。代表的な高分子には、抗体、抗体断片、融合タンパク質、ある
種のベクター構築物がある。
【００８０】
商業的供給源から購入したり、当技術分野で知られる方法（Ｈａｒｌｏｗら，
１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，
第１０章，４０２頁，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）に
よって作成した抗体または抗体断片を用いて、それら抗体を発光成分と結合し、
その複合体を対象に例えば注射などによって投与し、その複合体を抗原の部位に
局在させ、その複合体を撮像することにより、哺乳類対象内の抗原を局在化する
ことができる。
【００８１】
抗体と抗体断片は、本発明での物体としての使用に関していくつかの利点を持
つ。これらはその性質上、それら自体がターゲッティング成分を構成する。さら
にその大きさゆえに、小さい蛍光分子、蛍光タンパク質および生物発光タンパク
質を含む数タイプの発光成分との結合に馴染みやすく、また、例えば細胞やリポ
ソームなどと比較して、迅速に拡散できる。
【００８２】
発光成分は抗体または断片に直接結合させることもできるし、例えば蛍光性の
二次抗体などを用いて間接的に結合させることもできる。直接的結合は、抗体ま
たは抗体断片に対する例えば発蛍光団の一般的な化学的結合によって、あるいは
遺伝子操作によって行なうことができる。蛍光タンパク質または生物発光タンパ
ク質に結合した抗体または抗体断片を含有するキメラまたは融合タンパク質を構
築することができる。例えばＣａｓａｄｅｉら，１９９０，ＰＡＮＳ ８７：２
０４７−２０５１には、エクオリンと抗体の融合タンパク質遺伝子を哺乳類細胞
内で発現させることができるベクター構築物の作成法が記述されている。
【００８３】
抗体を含有する複合体は、本発明の多くの応用に使用できる。例えば炎症部位
に発現するＥ−セレクチンに対する標識抗体を使用して、その炎症を局在化し、
抗炎症薬候補の効果をモニターすることができる。
【００８４】
ベクター構築物そのものも、本発明に応用できる高分子体となりうる。例えば
、発光性分子をコードする遺伝子と治療用遺伝子とを、選択したプロモーター（
すなわち当該治療用遺伝子が標的とする細胞内で発現するプロモーター）の制御
下に含有する真核発現ベクターを構築することができる。本発明の方法を用いて
アッセイされるその発光性分子の発現は、その治療用遺伝子の発現位置と発現レ
ベルを決定するために使用できる。その治療用遺伝子の発現が、処置される人ま
たは動物モデル内で直接的な表現型を持たない場合に、この方法はとりわけ有用
だろう。
【００８５】
（３．ウイルス）
本発明のある種の側面で有用なもう１つの物体はウイルスである。多くのウイ
ルスは哺乳類宿主に感染する病原体であるから、それらのウイルスを発光成分と
共役させ、初期感染部位と感染の蔓延を研究するために使用することができる。
また、発光成分で標識したウイルスは、感染もしくは感染の蔓延を抑制する薬物
のスクリーニングに使用することもできる。
【００８６】
ウイルスは、発光成分と結合した抗体を用いて間接的に標識したり、あるいは
例えばウイルス粒子を（Ｄｈａｗａｎら，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４
７（１）：１０２の方法などで）ビオチニル化した後、それらを検出可能成分（
例えば蛍光分子）と結合したストレプトアビジンにさらすことにより、間接的に
標識することができる。
【００８７】
別法として、ウイルス粒子をローダミンのような発蛍光団で、例えばＦａｎら
，１９９２，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．３０（４）：９０５の方法を用いて直
接標識してもよい。また、発光性タンパク質を発現させるようにウイルスを遺伝
子操作することもできる。ヘルペスやワクシニアのようなある種のウイルスのゲ
ノムは、本発明の裏付けとして行なった実験で使用したｌｕｘ遺伝子やｌｕｃ遺
伝子のような大きさの遺伝子を十分に順応させうるほどに大きい。
【００８８】
標識したウイルスを動物モデルで使用することにより、感染を局在化し、感染
の進行をモニターすることができ、また感染の蔓延を抑制するのに有効な薬物を
スクリーニングすることもできる。例えば、ヘルペスウイルス感染症は皮膚病変
として現われるが、このウイルスはヘルペス脳炎をも引き起こしうる。上述の方
法のいずれかで標識したウイルスを用いることにより、このような感染症を局在
化し、モニターすることができると共に、様々な抗ウイルス剤を中枢神経系（Ｃ
ＮＳ）感染症におけるその効力について調べることができる。
【００８９】
（４．粒子）
ビーズ、リポソームなどを含む粒子は、本発明の実施に有用なもう１つの物体
を構成する。これらはサイズが大きいので、粒子には、例えば小分子などの場合
よりも多数の発光成分を共役させることができる。これは、より短い露光時間で
、またはより厚い組識層を通して検出することができる、より高濃度の光放射を
もたらす。また、本質的に純粋なターゲッティング成分またはリガンド（例えば
抗原や抗体）をその表面に含むように、リポソームを構築することもできる。さ
らに、例えば生物発光タンパク質分子などを比較的高濃度に、リポソームに負荷
することもできる（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，１９８８，Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃ
ｅｎｃｅ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ
Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（英国チチェスター：Ｅｌｌｉｓ
Ｈｏｒｗｏｏｄ社およびＶＣＨ出版社））。
【００９０】
さらに、２種類のリポソームを、その両方が存在する場合にのみ光が生成する
ように、同じ細胞タイプに向かわせることもできる。例えば一方のリポソームに
ルシフェラーゼを担持させ、他方にルシフェリンを担持させることができる。こ
れらのリポソームはターゲッティング成分を保持してもよく、２つのリポソーム
上のターゲッティング成分は同じであってもよいし、異なってもよい。感染細胞
上のウイルスタンパク質は、感染した組識または器官の同定に使用できる。免疫
系の細胞は、単一のまたは複数の細胞表面マーカーを用いて局在化することがで
きる。
【００９１】
血中循環時間を延長し、血流によるターゲッティングを増進するには、リポソ
ームの表面を、例えばリン脂質−ポリエチレングリコール複合体の組み込みなど
によってコーティングすることが好ましい。このタイプのリポソームはよく知ら
れている。
【００９２】
（５．細胞）
細胞は、原核、真核共に、本発明の実施に有用なもう１つの物体を構成する。
細胞にも粒子と同様に比較的高濃度の発光成分を負荷できるが、細胞には、例え
ば異種遺伝子構築物で細胞をトランスフェクションすることによって、発光成分
を供給しうるという利点がある。また、”ターゲッティング成分”もしくは細胞
を対象内の所望の位置に導くのに有効な分子を発現させる細胞を選択することも
できる。別法として、適当なターゲッティング成分を発現させるベクター構築物
で細胞をトランスフェクションすることもできる。
【００９３】
使用する細胞タイプは、その応用に依存する。例えば後に詳述するように、サ
ルモネラなどの細菌細胞を使用することにより、高レベルな時間的空間的解像度
でその感染過程を研究し、その感染過程に対する薬物または治療剤の効果を評価
することができる。
【００９４】
細菌細胞は有効な物体を構成する。例えば、それらをトランスフェクションす
ることにより、高レベルの発光成分や高レベルのターゲッティングタンパク質を
容易に発現させることができる。また、表面結合型抗体を発現させる細菌を含む
大腸菌ライブラリーを得て、それをスクリーニングすることにより、選択した抗
原に対する抗体を発現させるコロニーを同定することも可能である（Ｓｔｒａｔ
ａｇｅｎｅ社，カリフォルニア州ラホーヤ）。次に、このコロニーから得た細菌
を、発光性タンパク質の遺伝子を含有する第２のプラスミドで形質転換し、形質
転換体を本発明の方法で上述のように使用することにより、哺乳類宿主内の当該
抗原を局在化できる。
【００９５】
病原性細菌を発光成分と共役させ、それを動物モデル内で使用することにより
、その感染過程を生体内で追跡したり、新しい抗生物質などの潜在的抗感染薬を
、その感染の抑制に関するそれらの効力について評価することができる。本発明
の裏付けとして行なった後述の実験によって、この応用の一例を説明する。
【００９６】
真核細胞も本発明のある側面で物体として有用である。所望の調節要素を含有
する適当な発現ベクターが市販されている。それらのベクターを用いて、初代培
養細胞、体細胞、リンパ細胞などを含む種々の真核細胞中で所望の発光性タンパ
ク質を発現させうる構築物を作成することができる。これらの細胞は、一過性発
現試験にも使用できるし、細胞系の場合は安定な形質転換体として選択すること
もできる。
【００９７】
形質転換細胞における発光性タンパク質の発現は、選択された様々なプロモー
ターのいずれかを用いて調節することができる。例えばその細胞を、発現したリ
ガンドまたはレセプターによって対象内のある部位に向かわせる発光体として使
用したい場合は、ＣＭＶプロモーターやＳＶ４０プロモーターなどの恒常的に活
性なプロモーターを使用すればよい。そのような構築物で形質転換した細胞は、
例えばその細胞を殺すことなどによって光の発生を阻害する化合物のアッセイに
も使用できる。
【００９８】
また、形質転換細胞が対象内に均一に分布し、ウイルスによる感染やサイトカ
インによる剌激を受けたときなど、一定の条件下でのみ発光性タンパク質が発現
するように、形質転換細胞を投与してもよい。これらの剌激やその他の剌激に関
係する因子に反応するプロモーターは、当技術分野で知られている。関連する側
面として、Ｔｅｔ系（ＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄ，１９９２，ＰＡＮＳ
８９：５５４７−５５５１）のような誘導性プロモーターを使用して、発光性タ
ンパク質の発現を一時的に活性化することもできる。
【００９９】
例えばｔａｔ反応性ＨＩＶ ＬＴＲ要素を含有する構築物でＣＤ４＋リンパ細
胞を形質転換し、それをＨＩＶ感染のアッセイとして使用することができる（Ｉ
ｓｒａｅｌおよびＨｏｎｉｇｍａｎ，１９９１，Ｇｅｎｅ １０４：１３９−１
４５）。そのような構築物で形質転換した細胞をＳＣＩＤ−ｈｕマウス（ＭｃＣ
ｕｎｅら，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１６３２−１６３９）に導入し
、それをヒトＨＩＶ感染症とＡＩＤＳのモデルとして使用することができる。
【０１００】
例えば恒常的に活性なプロモーターを用いて上述のように形質転換した腫瘍細
胞系は、腫瘍の増殖と転移をモニターするために使用できる。形質転換した腫瘍
細胞を動物モデルに注射し、腫瘍塊を形成させ、増殖阻害剤候補または転移阻害
剤候補で処置しながら、腫瘍の大きさと転移をモニターすることができる。
【０１０１】
腫瘍細胞は、様々な感染性因子または治療用化合物に感応する活性を持つ調節
可能なプロモーターを含有する構築物で形質転換された細胞から作成することも
できる。
【０１０２】
（６．細胞形質転換）
原核細胞と真核細胞の形質転換法は共に当技術分野でよく知られている（Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，第２巻）。適当な調節因子と多重クローニング
部位を持つベクターは広く市販されている（例えばカリフォルニア州ラホーヤの
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、カリフォルニア州パロアルトのＣｌｏｎｔｅｃｈ社）
（ＩＶ．発光性タンパク質をコードする遺伝子を含有するトランスジェニック
動物）
もう１つの側面として、本発明は、発光性タンパク質または発光性のタンパク
質複合体をコードする異種遺伝子構築物を含有するトランスジェニック動物を包
含する。この構築物は選択したプロモーターによって駆動され、例えば発光性タ
ンパク質の機能的発現に必要な種々の補助タンパク質や、選択マーカー、エンハ
ンサー要素などを含みうる。
【０１０３】
プロモーターの活性化は、発光性分子と補助タンパク質をコードする遺伝子の
発現量を増大させる。プロモーターの活性化は、選択した生物適合体またはその
一部とプロモーター要素の相互作用によって達成される。活性化がその動物の一
部でのみ起こる場合は、その部分の細胞のみが発光性タンパク質を発現させるだ
ろう。
【０１０４】
例えばインターフェロン誘導性プロモーター（３’−５’ポリＡ合成酵素のプ
ロモーターなど）を用いることにより、多数の異なるＲＮＡウイルスによるトラ
ンスジェニック細胞の感染を検出できる。
【０１０５】
関連する側面として、ある種の疾患状態で発現するプロモーターを用いて、ト
ランスジェニック動物内の患部を標識し、発光成分の発現を用いて、その疾患状
態に対する処置の効果をモニターすることができる。例えば、Ｅ−セレクチンは
生体内の炎症部位に発現する（ＰｏｂｅｒおよびＣｏｔｒａｎ，１９９１，Ｌａ
ｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６４：３０１−３０５）。したがってＥ−セレクチンプロモ
ーターを単離し、それを用いてルシフェラーゼ遺伝子の発現を推進することがで
きる。
【０１０６】
組識特異性プロモーターと共に本発明の方法を使用することも可能である。こ
れは、例えば体内の特定の器官または組識の変性を引き起こす発病プロセスを阻
害するのに有効な化合物のスクリーニングを可能にし、また発育中の動物などに
おける細胞（例えばニューロン）の追跡を可能にする。
【０１０７】
当技術分野では、本発明で使用できるプロモーターが数多く知られている。ま
た、プロモーター含有ゲノムＤＮＡを単離するために、その遺伝子のｃＤＮＡか
ら得られる情報を用いて、クローン化された遺伝子のプロモーターを単離する方
法も知られている。
【０１０８】
（Ｖ．発光性複合体の撮像）
対象内の意図する部位に局在した発光性複合体は、いくつかの方法で撮像でき
る。そのような撮像の指針と具体例を以下に記述する。
【０１０９】
（Ａ．発光性複合体の局在）
”標的型（ｔａｒｇｅｔｅｄ）”物体、すなわちターゲッティング成分（物体
を対象または動物内の特定の一部位または複数部位に局在させるように設計され
た分子または特徴）を含有する物体の場合、局在とは、対象内で束縛された”局
在型”物体と束縛されていない”遊離型”物体の間の平衡が本質的に成立した状
態を指す。そのような平衡に到達する速度は投与経路に依存する。例えば血栓を
局在化するために静脈内注射によって投与された複合体は、注射後数分以内にそ
の血栓で局在または蓄積を達成するだろう。一方、腸内の感染を局在化するため
に経口投与された複合体は、局在を達成するのに数時間を要するだろう。
【０１１０】
また、局在という用語は、単に、物体を投与した後選択した時間におけるその
物体の対象または動物内での位置をさす場合もある。例えば、本明細書に詳述す
る実験では、サルモネラを（例えば経口的に）投与し、その蔓延を時間の関数と
して追跡する。この場合、その物体は、それが投与した細菌の最初の位置を標識
し、その後の蔓延または後退を撮像によって追跡できる限りは、経口投与後直ち
に”局在型”となりうる。
【０１１１】
関連する側面として、例えば発光成分を発現させる、注射された腫瘍細胞の局
在は、その動物内のある部位にそれらの細胞が定着し、腫瘍塊を形成することか
らなるだろう。
【０１１２】
もう１つの例として、局在は物体が投与後に分布した状態になった時に達成さ
れる。例えば、対象または動物じゅうの様々な器官における酸素濃度を測定する
ために投与された複合体の場合、その複合体は、それがその対象または動物内で
本質的に定常的分布状態に到達した時に、”局在型”あるいは有益となる。
【０１１３】
上述のいずれの場合にも、当業者は、局在を達成するための時間を適切に見積
もることができる。また、時間の関数としての局在の状態は、発光性複合体を本
発明の方法に従って撮像することにより、追跡することができる。
【０１１４】
（Ｂ．光検出装置）
本発明の重要な側面は、哺乳動物内からの微弱な光を妥当な時間で（好ましく
は約３０分以内に）撮像することができ、その装置からの信号を使って画像を構
築できるほど充分に感度の高い光検出装置の選択である。
【０１１５】
極めて明るい発光成分を使用できる場合および／または撮像する対象または動
物の表面近くに局在した発光性複合体を検出することが可能な場合は、”暗視”
ゴーグルや、シリコン増倍管（ＳＩＴ）カメラ（例えば浜松ホトニクスシステム
ズ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ）社，ニュージャ
ージー州ブリッジウォーター）などの一般的高感度ビデオカメラを使用できる。
しかし、より一般的には、もっと高感度な光検出法が必要である。
【０１１６】
本発明を実施する際に直面するような極めて低い光レベルでは、単位面積あた
りの光子束があまりに低くなるので、撮影対象がもはや連続的でないように見え
る。その代わりに、それは時間的にも空間的にも互いに独立した個々の光子によ
って表される。モニターで見ると、そのような画像は、それぞれが検出された単
一光子を表わす瞬く光の点のように見える。
【０１１７】
検出されたこれらの光子をデジタル画像処理装置で経時的に累積することによ
り、画像を獲得し、構築することができる。各画像点での信号に強度値を割り当
てる従来のカメラとは対照的に、光子カウント撮像法では、信号の強度は意味を
持たない。その目的は、単に信号（光子）の存在を検出し、その位置に関して信
号の発生数を経時的に計数することである。
【０１１８】
後述する少なくとも２種類の光検出装置により、個々の光子を検出し、画像処
理装置で分析できる信号を作成することができる。
【０１１９】
（１．ノイズ低減型光検出装置）
第１の種類は、光子信号の増幅とは対照的に、光子検出器内のバックグラウン
ドノイズを減少させることによって感度を得る装置である。ノイズは主として検
出器アレイを冷却することによって低減される。この装置には、”バック薄型”
冷却ＣＣＤカメラと呼ばれる電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラが含まれる。より高
感度な装置では、例えばＣＣＤアレイの温度を約−１２０℃まで下げる液体窒素
を用いて、冷却が行われる。”バック薄型”とは、光子が検出されるためにたど
る光路長を短くすることによって、量子効率を増大させる超薄型バックプレート
を指す。とりわけ高感度なバック薄型低温ＣＣＤカメラは、Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒ
ｉｃｓ社（アリゾナ州トゥーソン）から入手できるシリーズ２００カメラ”ＴＥ
ＣＨ ５１２”である。
【０１２０】
（２．光子増幅装置）
第２の種類の高感度光検出器には、光子が検出スクリーンに命中する前に光子
を増幅する装置が含まれる。この種類には、マイクロチャネル増倍装置のような
増倍装置を持つＣＣＤカメラが含まれる。マイクロチャネル増倍装置は通例、カ
メラの検出スクリーンに対して垂直かつ同延的なチャネルの金属アレイを含有す
る。マイクロチャネルアレイは撮像しようとする試料、対象または動物とカメラ
の間に設置される。このアレイのチャネルに侵入する光子の大半は、チャネルを
抜け出す前にチャネルの側面と接触する。アレイを横切ってかけられた電圧は、
各光子衝突から多くの電子を放出させる。このような衝突から生じた電子は、そ
れらが発生したチャネルから”散弾銃”式に抜け出して、カメラによって検出さ
れる。
【０１２１】
第１段階で生成した電子が、今度は第２段階で増幅された電子の信号をもたら
すように、増倍マイクロチャネルアレイを直列に設置すれば、さらに高感度を得
ることができる。しかし感度を増大させると、空間的解像度が犠牲になり、その
空間的解像度は増幅段階を追加するごとに低下する。
【０１２２】
マイクロチャネル増倍装置型の単一光子検出装置の典型例は、Ｈａｍａｍａｔ
ｓｕ社から入手できるＣ２４００シリーズである。
【０１２３】
（３．画像処理装置）
光子を計数する光検出装置によって生成した信号は、例えばモニターに表示し
たり、ビデオプリンターでプリントできる画像を構築するために、画像処理装置
で処理する必要がある。そのような画像処理装置は、通例、上述の高感度光子計
数カメラを含むシステムの一部として販売されており、したがって同じ供給者（
例えばＰｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ社やＨａｍａｍａｔｓｕ社）から入手できる。
他の業者から入手した画像処理装置も使用できるが、一般的には、機能的なシス
テムを構築するのに、より多くの努力が必要になる。
【０１２４】
画像処理装置は通常、ＩＢＭ互換ＰＣやアップルマッキントッシュ（Ａｐｐｌ
ｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ社，カリフォルニア州キューパーティーノ）のようなパー
ソナルコンピューターに接続する。このパーソナルコンピューターは購入した撮
像システムの一部として含まれている場合もあるし、含まれていない場合もある
。画像がデジタルファイルの形になったら、それを様々な画像処理プログラム（
例えばＡｄｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ社（カリフォルニア州マウンテンビュー）の
”ＡＤＯＢＥ ＰＨＯＴＯＳＨＯＰ”など）で操作し、印刷することができる。
【０１２５】
（Ｃ．装置の検出フィールドにおける対象の固定）
（１．装置の検出フィールド）
装置の検出フィールドとは、光子放射の一貫した測定値が得られる領域をいう
。光学レンズを使用するカメラの場合、検出フィールドとは、単に、そのレンズ
がそのカメラに与える視野である。また、光検出装置が”暗視”ゴーグルである
場合、検出フィールドとはそのゴーグルの視野である。
【０１２６】
また、検出フィールドは、密に充填されたアレイ状に配置した光ファイバーケ
ーブルの末端が規定する表面であってもよい。そのアレイは、ケーブルの末端が
カバーする領域（ケーブル間の空隙と相反する）が最大になるように構築され、
対象に極めて近接して設置される。例えば、プレクシグラスなどの透明素材を対
象に隣接して設置し、その透明素材に隣接して、対象とは反対側から、アレイを
固定することができる。
【０１２７】
アレイの反対側にある光ファイバーケーブルの末端は、マイクロチャネル増倍
装置の入力末端などの検出装置または増倍装置に直接接続することができ、そう
すればレンズの必要がなくなる。
【０１２８】
この方法の利点は、対照と検出器の間の空隙の大半を排除することにより、か
つ／または、レンズを排除することにより、光子の散乱および／または損失が減
少することにある。本発明の裏付けとして行なった実験で使用した６０ｍｍ Ａ
Ｆニッコールマクロレンズのような高透過性レンズでさえ、フロントレンズ要素
に到達する光の一部しか透過させない。
【０１２９】
より強度の強いＬＧＭの場合、光ダイオードアレイを光子放射の測定に使用で
きる。光ダイオードアレイを比較的柔軟なシートに組み込めば、実施者は、その
アレイを対象のまわりに部分的に”巻き付ける”ことができる。この方法も光子
の損失を最小限にし、さらに生物発光の三次元画像を得る手段にもなる。
【０１３０】
複数の検出器を対象の周囲に設置する方法や、走査型の検出器または検出器群
などを含む他の方法を使用して、三次元画像を作成してもよい。
【０１３１】
動物または対象の全体が光検出装置の検出フィールド内にある必要はないとい
うことは理解されるだろう。例えば対象の特定の領域に局在することがわかって
いる発光性複合体を測定する場合、所望の情報を得るには、その領域とその周囲
の十分な”暗”帯域からの光だけを測定すれば足りる。
【０１３２】
（２．対象の固定）
対象の２次元または３次元画像を作成したい場合、光子放射を測定している間
は、対象を光検出装置の検出フィールド内に固定しておく場合がある。約２０ミ
リ秒未満で測定した光子放射から画像を構築できるほどに信号が明るく、対象が
特に動揺していない場合は、測定期間の開始時に対象が検出装置のフィールド内
にあることを保証する以外に、特別な固定措置は必要ないだろう。
【０１３３】
これに対して、光子放射測定に約２０ｍｓｅｃ以上を要し、対象が動揺してい
る場合は、構築された画像に空間情報が保存されるように、その対象の動揺の程
度に合わせて、光子放射測定中、対象の不動を保証するための予防措置を考慮す
る必要がある。例えば対象が人で、光子放射測定時間が数秒程度の場合は、その
対象に光子放射測定（撮像）の間できるだけじっとしておいてくれるように頼む
だけでよいだろう。これに対し、対象がマウスのような動物である場合は、その
対象を例えば麻酔や機械的拘束具を用いて固定できる。
【０１３４】
様々な拘束具を作成することができる。例えば、プレクシグラスシートを発泡
材クッション上に固定して、マウスを数十秒ないし数分間固定するのに有効な拘
束具を作ることができる。そのクッションは、一端に、動物の頭部用のくぼみを
持つ。動物は、その頭部がくぼみの上になり、息は自由にできるが、その体の動
きは発泡材クッションによって束縛されるように、プレクシグラスの下に置かれ
る。
【０１３５】
対象または動物から放射され光の総量のみを測定したい場合は、光子放射測定
期間が長くても、その対象を固定する必要はない。必要なことは、撮像の間、対
象を光検出器の検出フィールドに閉じ込めておくことだけである。しかし、その
ような測定中、対象を固定しておけば、検出される光子が通過する組識の厚さが
動物間でより均一になるから、得られる結果の整合性が向上するであろうことは
理解されるだろう。
【０１３６】
（Ｄ．撮像中のその他の問題）
（１．蛍光発生成分）
蛍光発生成分の可視化には、光検出器と共に、励起光源が必要である。またそ
の励起光源が、発光成分からの光子放射を測定している間、点灯されることも理
解されるだろう。
【０１３７】
発蛍光団の適切な選択、光源の設置、およびフィルターの選択と設置は、すべ
て情報に富む画像の構築を容易にするが、これらについては蛍光発生成分に関す
る項で上述した通りである。
【０１３８】
（２．高解像度画像）
組識による光散乱は、総光子放射の測定によるＬＧＭの撮像で得ることができ
る解像度を制限する。本発明が、対象内の選択した点に集中させることができ、
しかも組織内で有意に散乱しない外部源に、ＬＧＭの発光を同期させることによ
って、解像度のより高い画像を構築できる態様をも包含することは、理解される
だろう。例えば、集束させた超音波信号を使って、撮像する対象を三次元的に走
査することができる。超音波の焦点内にある領域からの発光は、その超音波によ
って光に与えられた特徴的な振動により、他の光子放射から分離することができ
る（例えばＨｏｕｓｔｏｎおよびＭｏｅｒｎｅｒ，米国特許第４，６１４，１１
６号，１９８６年９月３０日発行）
（Ｅ．光子放射画像の構築）
発光成分が例外的に明るいため、かつ／または、発光性複合体が対象の表面近
くに局在するために、”暗視”ゴーグルまたは高感度ビデオカメラを使って画像
を得た場合は、単に画像を見るか、ビデオモニターに表示するだけである。所望
であれば、分析または印刷用に個々のビデオフレームをメモリーに保存でき、か
つ／または、コンピューターで分析と印刷用に画像をデジタル化できる画像処理
装置に、ビデオカメラからの信号を迂回させることができる。
【０１３９】
また、光子計数法を使用する場合は、光子放射の測定により、各ピクセル位置
で検出した光子の数を表わす数字の配列が、画像処理装置内に生成する。これら
の数字を用いて、通常は光子数を（一定の予め選択した値、またはいずれかのピ
クセルで検出された最大数に対して）規格化し、その規格化した数値を明るさ（
グレースケール） または色（擬似色）に変換して、それをモニターに表示する
ことにより、画像を作成する。擬似色表示の場合、典型的な色の割り当ては次の
通りである。ゼロ光子カウントのピクセルには黒色を、低いカウントには青色を
、カウントが増加するほど波長の長い色を割り当て、最高光子カウントには赤色
を割り当てる。モニター上の色の位置は光子放射の分布を表わし、したがって発
光性複合体の位置を表わす。
【０１４０】
複合体に対して準拠座標系を与えるために、通常は、光子放射を測定した（ま
だ固定されている）対象のグレースケール画像を構築する。このような画像は、
例えばかすかなルームライトのなかで撮像室または撮像箱に向かって扉をあけ、
反射した光子を（通例、光子放射を測定するのに要する時間のごく一部に相当す
る時間）測定することによって構築できる。このグレースケール像は、光子放射
を測定する前に構築してもよいし、光子放射を測定した後に構築してもよい。
【０１４１】
通例、光子放射の画像をグレースケール像に重ね合せることにより、対象に関
する光子放射の合成画像を作成する。
【０１４２】
例えば選択した生物適合成分の分布および／または局在に対するある処置の効
果を記録するために、発光性複合体の局在および／または発光性複合体からの信
号を経時的に追跡したい場合は、光子放射の測定または撮像を選択した時間間隔
で反復することにより、一連の画像を構築することができる。間隔は数分程度の
短いものであってもよいし、数日または数週間程度に長いものであってもよい。
【０１４３】
（ＶＩ．光子放射画像の分析）
本発明の方法および／または本発明の組成物を使用して作成した画像は、様々
な方法で分析できる。それは、単純な視覚的検査、頭脳評価および／またはハー
ドコピーの印刷から、複雑なデジタル画像分析まで様々である。分析によって得
られる情報の解釈は、観察する現象と使用した物体に依存する。
【０１４４】
下記の実験は本発明の応用例の一つ（生体ラットにおけるサルモネラ感染の追
跡）であり、本発明の方法で得られる画像を、どのように分析できるかを例示す
るものである。
【０１４５】
（ＶＩＩ．生体マウス内の発光性サルモネラの撮像）
本発明の裏付けとして行なった実験では、マウスにおけるネズミチフス菌（Ｓ
ａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）感染（ヒトチフスの動物モデル
）の分布を特徴づける。マウス病原性ネズミチフス菌ＳＬ１３４４（Ｈｏｉｓｅ
ｔｈおよびＳｔｏｃｋｅｒ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ ２９１：２３８−２３９
）、ＳＬ１３４４の非侵入性突然変異体ＢＪ６６、およびサルモネラの低病原性
ＬＴ−２株ＬＢ５０００を、それぞれｌｕｘオペロンを含有するプラスミドで標
識し、マウスにおけるサルモネラ感染を局在化する実験に使用した。
【０１４６】
（Ａ．発光性サルモネラの構築）
（１．サルモネラ株）
マウスに対する経口および腹腔内接種によって明らかになる病原性表現型が異
なる３株のネズミチフス菌を、形質転換のために選択した。
【０１４７】
ここで使用した最も病原性の高い表現型はＳＬ１３４４であり、これはもとも
と子牛の致死的感染症から得られたマウス株である（ＨｏｉｓｅｔｈおよびＳｔ
ｏｃｋｅｒ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ ２９１：２３８−２３９）。この株をマ
ウスに経口接種すると、細菌はリンパ系を通って全身に転移し、肝臓、脾臓およ
び骨髄のコロニー形成をもたらす（ＣａｒｔｅｒおよびＣｏｌｌｉｎｓ，１９７
４，Ｊ．Ｅｘｐｅｒ．Ｍｅｄ．１３９：１１８９−１２０３；Ｆｉｎｌａｙおよ
びＦａｌｋｏｗ，１９８９，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３：１８３３−１８
４１とＨｓｕ，１９８９，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５３：３９０−４０９
の総説をも参照のこと）。
【０１４８】
ＳＬ１３４４の非侵入性突然変異体ＢＪ６６も評価する。ＢＪ６６の経口接種
は通常、マウスにおける全身性感染を引き起こさないが、この株を腹腔内接種す
ると、全身性感染が起こる。
【０１４９】
サルモネラの低病原性ＬＴ−２株ＬＢ５０００も調べる。ＬＴ−２株は、マウ
スに対する病原性が減少しているまたは変動することが知られている研究室株で
ある。ＬＢ５０００は複数の栄養要求性突然変異を含有し、ストレプトマイシン
耐性であり、経口または腹腔内接種後、マウスから浄化される。
【０１５０】
（２．ｌｕｘオペロンによるサルモネラ株の形質転換）
上記３株のそれぞれを、ｌｕｘオペロンをコードするプラスミドで、実施例１
に詳述するように形質転換する。土壌菌Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅ
ｓｃｅｎｓ（Ｆｒａｃｋｍａｎら，１９９０）から得られたこのプラスミドは、
ヘテロ二量体ルシフェラーゼの２つのサブユニットと、３つの補助タンパク質ｌ
ｕｘＣ、ｌｕｘＤおよびｌｕｘＥの発現によって、大腸菌に光子を放射する能力
を与える。
【０１５１】
ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤおよびｌｕｘＥが含まれるので、そのルシフェラーゼ発現
細胞には、脂肪族アルデヒド基質ルシフェリンを与える必要がない。本明細書に
記述するような生体系内の真核ルシフェラーゼに基質を供給することは困難だろ
うから、Ｘ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓの全ｌｕｘオペロンを使用する。このオペ
ロンは、当該脂肪族アルデヒド基質を生合成するための酵素をもコードする。
【０１５２】
α−βヘテロ二量体混合機能オキシダーゼであるＸ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ
ルシフェラーゼは、還元型フラビンと長鎖アルデヒドの酸化型フラビンと対応す
る長鎖脂肪酸への酸化を触媒する。アルデヒドの脂肪酸からの生成と再生には、
脂肪酸レダクターゼ複合体が必要であり、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ： フラビンオキシド
レダクターゼが還元型フラビンを供給する。
【０１５３】
Ｘ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓのｌｕｘ遺伝子を発現させる大腸菌にとって最適
な生物発光条件は３７℃である（ＳｚｉｔｔｎｅｒおよびＭｅｉｇｈｅｎ，１９
９０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１６５８１−１６５８７，Ｘｉら，１
９９１，Ｊ．Ｂａｃｔ．１７３：１３９９−１４０５）。これに対し、真核発光
生物と他の原核発光生物に由来するルシフェラーゼ類は通例、より低い最適温度
条件を持つ（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，１９８８，Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃ
ｅ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（英国チチェスター：Ｅｌｌｉｓ Ｈｏｒ
ｗｏｏｄ社およびＶＣＨ出版社））。したがってＸ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ由
来のルシフェラーゼは、動物内での研究にマーカーとして使用するのに適してい
る。
【０１５４】
全Ｘ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ ｌｕｘオペロンを含有し、かつ、サルモネラ
にアンピシリン耐性とカルベニシリン耐性を付与するプラスミドｐＧＳＬ１（Ｆ
ｒａｃｋｍａｎら，１９９０）を用いて、上記３株をエレクトロポレーションに
よって形質転換する。このＸ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ ｌｕｘオペロンは、ｌ
ｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤおよびｌｕｘＥ遺伝子を含有する（Ｆｒ
ａｃｋｍａｎら，１９９０）。ｌｕｘＡとｌｕｘＢはヘテロ二量体ルシフェラー
ゼの２つのサブユニットをコードし、ｌｕｘＣとｌｕｘＤはルシフェラーゼ基質
の生合成酵素をコードし、ｌｕｘＥは調節遺伝子である。培養中の細胞に外から
ルシフェリンを供給したり、動物を基質で処置するのとは対照的に、基質生合成
用遺伝子の包含は、ルシフェラーゼに基質を提供する便利な手段である。
【０１５５】
（Ｂ．形質転換したサルモネラの試験管内での特徴づけ）
（１．付着性と侵入性）
上記ｌｕｘプラスミドを含有する３つのサルモネラ株の付着性と侵入性を、Ｆ
ｉｎｌａｙおよびＦａｌｋｏｗ，１９８９，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３：
１８３３−１８４１に記述されているような一般的な侵入アッセイ（実施例２に
詳述）により、培養中で互いに比較、またそれらの非発光性親株と比較する。
【０１５６】
このアッセイでは、上皮細胞系および腹腔マクロファージと共に培養した後、
付着細菌と細胞内細菌を定量する。付着細菌と細胞内細菌は、生きている細胞か
らの光子の放出と、溶解してその細胞溶解液をカルベニシリン含有プレートで培
養した後のコロニー形成単位との両者によって、検出、定量する。
【０１５７】
このアッセイの一部の結果を図２Ａ〜２Ｅに示し、実施例８で考察する。ｌｕ
ｘ発現プラスミドで形質転換した上記３株の表現型は、親サルモネラ株と比較し
て有意に変化しない。また、ＨＥｐ−２細胞とマクロファージからの生物発光の
強度とＣＦＵの間には良好な相関が認められる。これらの結果は、細胞内細菌の
指標としての発光が、培養内の細菌の侵入性をアッセイする迅速な方法であるこ
とを示している。
【０１５８】
ＢＪ６６のＨＥｐ−２に対する付着性はＳＬ１３４４と比較して低かったが、
マウス腹腔マクロファージの初代培養におけるこれら２株の付着性は同等だった
。
【０１５９】
（２．光放射）
系の酸素要求性を調べるため、実施例３に詳述するように、細菌の１０倍連続
希釈液をガラス製毛細管内に入れ、撮像する。
【０１６０】
図３に、そのような実験の一つで作成した画像を示す。発光は、空気飽和培地
中に少数の細菌を含む管でさえ、空気−液体界面でのみ検出される（５１中に０
．１ｍｌの空気飽和緩衝液で最終Ｏ２濃度は５ｎＭになる）。
【０１６１】
これらの結果から、酸素がおそらくは発光にとって制限因子であることは明ら
かである。
【０１６２】
（３．動物組識を貫通する光透過）
光が動物組識を貫通する程度を決定するために、発光性サルモネラから放射さ
れ組識を透過した光を、単一光子を検出するために高速同時検出器を切ったシン
チレーション計数器を用いて定量する。このタイプの光電子増倍管の暗電流によ
るバックグラウンドは有意であるので、このアッセイは、比較的強い光子放射を
伴う試料に限定される。
【０１６３】
透明度の異なる４タイプの組識：ヒヨコ胸部の筋肉、ヒヨコ胸部の皮膚、子ヒ
ツジの腎臓、および子ヒツジの腎臓から得た腎臓髄質、をこの方法で比較する。
組識を貫通して検出できる光子の数は、組識を通さない対照より約１０倍少ない
。
【０１６４】
（４．ｌｕｘサルモネラの生体内での特徴づけ）
（ａ．経口投与）
経口接種はマウスやヒトにとって自然なサルモネラ感染経路であり、より遅延
性の疾患進行をもたらす。この接種経路によるサルモネラ感染の進行を研究する
ために、２系統のマウスを３株のサルモネラに感染させる。耐性動物を用いて得
た結果については、下記”耐性マウスの感染”という見出しの項で議論する。
【０１６５】
実施例５に記述するように、Ｂａｌｂ／ｃマウスを病原性ＳＬ１３４４ｌｕｘ
、非侵入性ＢＬ６６ｌｕｘおよび低病原性ＬＢ５０００ｌｕｘサルモネラに経口
的に感染させる。その感染の進行を外部撮像法（”材料と方法”の項）によって
８日間にわたって追跡する。
【０１６６】
典型的な画像を図５Ａ〜Ｆに示す。接種後（ｐ．ｉ．）２４時間の時点で、生
物発光シグナルはすべての感染動物内で単一の病巣に局在する（図５Ａ、５Ｃお
よび５Ｅ）。接種後７日までには、低病原性ＬＢ５０００ｌｕｘに感染したすべ
ての動物で、生物発光が消える（図５Ｂ）。これに対し、病原性ＳＬ１３４４ｌ
ｕｘに感染した動物の場合、蔓延が始まる時点は動物ごとにかなり変動するもの
の、しばしば腹腔の大半に蔓延する激しい感染を示す（図５Ｆ）。ＢＪ６６ｌｕ
ｘによる感染は通例、持続し、単一の部位に局在したままとなる（図５Ｄ）。
【０１６７】
（ｂ．腹腔内接種）
サルモネラの複製部位にルシフェリンの酸化とそれに続く発光（Ｃａｍｐｂｅ
ｌｌ，１９８８，Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ
ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄ
ｉｃｉｎｅ（英国チチェスター：Ｅｌｌｉｓ Ｈｏｒｗｏｏｄ社およびＶＣＨ出
版社））に足るＯ２が存在するかどうかを評価するために、呼吸している動物の
組識からの光放射を測定する。発光性のＳＬ１３４４ｌｕｘとＬＢ５０００ｌｕ
ｘを２群のＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔内に接種する。接種後（ｐ．ｉ．）３２時
間の時点で、透過した光子を撮像する（図６）。
【０１６８】
ＳＬ１３４４ｌｕｘに感染したマウス（図の左側）では、透過した光子が大き
な表面上に確認され、様々な強度の焦点が見える。これらの画像は播種性感染を
示し、内臓（おそらくは肝臓と腸間膜リンパ節を含む）の広範なコロニー形成と
合致する。これに対し、ＬＢ５０００ｌｕｘに感染した動物からの透過光子の分
布は極めて制限されており、限定的感染を示す。
【０１６９】
ＬＢ５０００ｌｕｘ感染マウスは接種後数週間にわたって健康を維持したが、
ＳＬ１３４４ｌｕｘ感染マウスは接種後４日でほぼ瀕死状態になり、安楽死させ
た。
【０１７０】
これらの実験は、血中または組識中のＯ２レベルが、サルモネラから発現した
ｌｕｘルシフェラーゼの生物発光にとって十分であることを示している。また、
これらの実験は、病原性が減少した研究室株ＬＢ５０００と比較して病原性株Ｓ
Ｌ１３４４の侵入性が強いこととも合致している。
【０１７１】
（ｃ．耐性マウスの感染）
Ｉｔｙ遺伝子座がヘテロ接合性を示すマウス（Ｉｔｙ ｒ／ｓ）は、ネズミチ
フス菌による全身性感染症に対して耐性である（ＰｌａｎｔおよびＧｌｙｎｎ，
１９７６，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１３３：７２−７８）。Ｂｃｇ（Ｇｒｏ
ｓら，１９８１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７：２４１７−２４２１）またはＬ
ｓｈ（Ｂｒａｄｌｅｙ，１９７７，Ｃｌｉｎ．ａｎｄ Ｅｘｐｅｒ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．３０：１３０−１４０）とも呼ばれるこの遺伝子座は、鼡らい菌（Ｍｙｃ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅｍｕｒｉｕｍ；Ｆｏｒｇｅｔら，１９８１
，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：４２−４７）、ウシ結核菌（Ｍ．ｂｏ
ｖｉｓ；Ｓｋａｍｅｎｅら，１９８４，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．１９：１１７
−１２０，ＳｋａｍｅｎｅおよびＰｉｅｔｒａｎｇｅｌｉ，１９９１，Ｎａｔｕ
ｒｅ ２９７：５０６−５０９）およびバテー杆菌（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕ
ａｒｅ；Ｇｏｔｏら，１９８９，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ３０：２１８
−２２１）のようなある種の細胞内病原体の発病プロセスを調節する。細胞内病
原体に対する耐性と感受性の同様な遺伝子制御はヒトにも存在するようである（
ヒト結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｕｃｕｌｏｓｉｓ；Ｓｔｅａｄ，１９９２，Ａｎｎ
ａｌｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１１６：９３７−９４１，Ｓｔｅａｄら
，１９９０，Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２２：４２２−４２７）とらい菌
（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ））。
【０１７２】
Ｉｔｙ遺伝子座はマウスの第１染色体に２つの対立遺伝子型、Ｉｔｙｒ（耐性
、優性）とＩｔｙｓ（感受性、劣性）で存在する。Ｉｔｙ遺伝子座にコードされ
ている遺伝子は、マクロファージが内部移行した病原体を破壊する能力に影響を
与え（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌら，１９９１，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．３０：２
４１−２４８（１９９１）による総説がある；Ｓｋａｍｅｎｅら，１９８４，Ｉ
ｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．１９：１１７−１２０とＳｋａｍｅｎｅおよびＰｉｅｔ
ｒａｎｇｅｌｉ，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ ２９７：５０６−５０９をも参照の
こと）、それがマクロファージ媒介性とされる感染宿主内の他の部位への病原体
の輸送という下流の機能に影響を及ぼすようである。Ｂａｌｂ／ｃマウスはＩｔ
ｙｓ／ｓであり、１２９マウスはＩｔｙｒ／ｒである。ここに詳述する実験では
、ヘテロ接合性Ｂａｌｂ／ｃＸ１２９マウス（Ｉｔｙｒ／ｓ）を使用する。
【０１７３】
実施例７に詳述するように、耐性１２９ＸＢａｌｂ／ｃ（Ｉｔｙｒ／ｓ）生存
マウスを、１Ｘ１０７個のＳＬ１３４４ｌｕｘサルモネラの胃内接種によって感
染させる。そのマウスを注射後８日間（８ ｄ．ｐ．ｉ）にわたって毎日撮像す
る。
【０１７４】
図７Ａ（第１日）と図７Ｂ（第８日）に結果を示す。外部撮像法によって検出
される発光は接種後２４時間の時点で明白であり、全ての動物で単一の部位に局
在しているようであった。その発光シグナルは試験期間（接種後８日まで）中常
に存在する。発光の強度と発光源の位置は、一匹のマウス内で経時的にいくらか
変動し、またマウスごとにも変動しうる。いずれの感染動物でも発光組識は盲腸
であり（下記参照）、所在の変動性は（おそらくは強度の変動性も）齧歯類の内
部器官が正しい位置に強く固定されていないという事実によるのだろう。
【０１７５】
これらの動物で観察された明らかな限定的感染は、このＩｔｙ制限がマクロフ
ァージ輸送を遮断するという解釈を裏付けている。しかし１０日間というこの感
染の持続性は、腸粘膜に対する付着があることと、発光性の糞粒によって立証さ
れるように、これらの動物の糞内に細菌の脱離が長期間続くことを示唆している
。これらの結果は、生体内におけるこのサルモネラの発光性表現型が、Ｉｔｙ制
限動物中で８日間にわたって保たれることと、経口接種後の局在が可能であるこ
とを示している。
【０１７６】
（ｄ．経口接種後の内部撮像）
腹腔内の発光シグナルをさらに局在化するため、感染マウスを腹壁切開後に撮
像する（図８）。経口経路で感染させた動物のいずれにおいても、主な疾患症状
は盲腸の拡張である（図８Ａ〜Ｃ）。”外部”画像（図８Ａ）は限局的な発光を
示し、それは腹壁切開後の画像（図８Ｂ）で盲腸にあたることがわかる。
【０１７７】
腸内に空気を注入すると、消化路の他の領域における細菌の存在が確認される
。結腸と直腸内の細菌はルシフェラーゼを発現させているらしいが、それらの部
位からの発光は、低い酸素濃度によって制限されているらしい。
【０１７８】
経口接種試験で得た画像は、接種後２日および接種後７日の発光シグナルが、
ＬＢ５０００ｌｕｘに感染したマウスを除いて、ほとんど完全に各動物の盲腸に
局在することを示している（Ｐｏｐｅｓｋｏら，１９９０，Ａ Ｃｏｌｏｕｒ
Ａｌｔａｓ ｏｆ Ａｎａｔｏｍｙ ｏｆ Ｓｍａｌｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ａｎｉｍａｌｓ Ｖｏｌ．Ｔｗｏ：Ｒａｔ Ｍｏｕｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ（英
国ロンドン：Ｗｏｌｆｅ））。発光は数匹の結腸にも見える。接種後７日までに
、ＬＢ５０００ｌｕｘ感染動物内に発光は認められなくなる。これらのマウスの
器官中に存在するＣＦＵを接種後２日と５日に測定する。
【０１７９】
侵入性株ＳＬ１３４４ｌｕｘを胃内に感染させた動物では、盲腸内の発光が初
期に現われ、その後、全身性の感染が起こる。これに対し、非侵入性ＢＪ６６ｌ
ｕｘ株による感染は盲腸からの持続的な発光をもたらし、それが全試験期間（８
日間）にわたって維持される動物もある。接種後８日までに、腹部表面の大半に
発光が検出され、それはＳＬ１３４４ｌｕｘ感染マウスにおける腹腔内接種後の
光子の分布に似ている。
【０１８０】
ＳＬ１３４４ｌｕｘによる感染は、予想通り、光子を放射する表面積が増大し
、そこから放射される光子を累進的に増やしながら、全身性となるようである。
いずれの株による感染でも、発光は腹部上に局在し、この領域の外側からの発光
はほとんど検出されないようである。大量の透過光子が腹部上に単一の焦点とし
て局在し、このことは、たとえ感染が全身性であっても、複製の大半が腸を取り
巻く領域にあることを示唆している。
【０１８１】
盲腸上に発光が局在することは、腸のこの領域に大量の生物が存在することを
示すだけでなく、発光するに足る酸素が得られるように、サルモネラがその粘膜
の細胞に結合することをも示唆している。ルシフェラーゼからの光子の放射は酸
素依存性であり、盲腸または小腸の管腔内の予想酸素レベルは、発光に必要なレ
ベルより低い。ルシフェラーゼ反応は、細菌が腸上皮の細胞から酸素を得られな
い限り、腸内では機能しないと予想される。
【０１８２】
したがって全身性感染は侵入性表現型に関係し、腸の上皮細胞への単なる付着
とは関係しないと思われる。これらの実験は、盲腸がこの発病プロセスの保菌状
態で、あるいは播種部位として、何らかの役割を持つことを含意している。
【０１８３】
異なる組識への感染の進行をモニターすれば、発病プロセスにおけるこれらの
段階についての理解を著しく深めることができ、選択した段階でその病原体を抑
制するのに有効な化合物のスクリーニングが可能になるだろう。
【０１８４】
（ｅ．腹腔内接種後の内部撮像）
ＳＬ１３４４ｌｕｘを腹腔内に感染させたマウスを腹壁切開の前後に撮像する
（実施例９）。その結果を図９に示す。その画像は、腹部の大部分に、複数の透
過光子焦点を伴う発光を示す。盲腸は発光性サルモネラを含有しないようである
。これらの実験から得られた結果は、すべてのサルモネラ株が、感染の初期相で
発光するに足るＯ２を持つことを示している。しかし、その後の時点での全身性
感染はＳＬ１３４４ｌｕｘ感染マウスにのみ認められるので、サルモネラの粘膜
の細胞への侵入と、その後の全身性感染は、侵入性表現型を持つ株に限られるよ
うである。
【０１８５】
（ｆ．サルモネラ感染に対するシプロフロキサシンの影響）
非侵襲的撮像法が薬物に対する感染症の反応を追跡するのに有用であることを
示すために、実施例１０に詳述する実験を行なう。マウスにＳＬ１３４４ｌｕｘ
を経口接種し、サルモネラ感染症に有効な抗生物質シプロフロキサシン１００ｍ
ｇで処置する。処置後の選択した時期に、それらのマウスを撮像し、光子放射を
測定することによって感染の程度を定量する。処置マウス内の光子放射を、処置
開始前の値および感染したが処置していない対照マウスからの値と比較する。こ
のような実験の一つで得た結果を図１０Ａ〜Ｅに示し、実施例１０で考察する。
抗生物質で処置したマウスにおける感染症は、処置マウスにおける０時間での病
原体レベルおよび対照マウス内の病原体レベルと比較して、処置期間中常に低い
。
【０１８６】
（ｇ．カルベニシリン選択の効果）
Ｄｕｃｌｕｚｅａｕら，１９７０，Ｚｅｕｔ．Ｂａｋｔ．５３１３：５３３−
５４８は、抗生物質による動物の処置がサルモネラによる盲腸のコロニー形成を
促進することを示した。本実験におけるマウスは、ルシフェラーゼクローンを含
有するＡｍｐｒサルモネラを選択するために、カルベニシリンの筋肉内注射とい
う抗生物質措置をして維持される。この処置は、胃腸感染症の経過を変化させる
かもしれないが、サルモネラが盲腸を裏打ちする細胞と結合できるという観察結
果は、酸素を発光に利用できるということを示している。盲腸の管腔は一般に嫌
気環境であると考えられているから、この観察結果は注目に値する。
【０１８７】
（ＶＩＩＩ．応用）
生物発光技術は様々な宿主−病原体系に広く適用できると共に、例えば生きて
いる哺乳動物内での腫瘍の進行や遺伝子発現などに関する他の生物学的事象の時
間的空間的評価をも可能にするだろう。またこれは、医薬の開発とスクリーニン
グにも応用できる。病原体の生体内撮像を広範に使用すれば、病原および／また
はリアルタイム試験抗菌剤に関する実験に必要な動物数と時間を減らすことがで
きるだろう。また、発光性細菌は環境分析に使用されているが、生物発光性生物
は生きている動物内のバイオセンサーとして有用だろう。例えばＫｏｒｐｅｌａ
らは、胃腸路の管腔内では酸素供給が制限されているため、酸素が（おそらくは
上皮細胞または他の細胞タイプから）直接的にサルモネラに接近できる部位に、
生物発光が限定されたことを示している。Ｋｏｒｐｅｌａら，１９８９，Ｊ．Ｂ
ｉｏｌｕｍ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍ．４：５５１−５５４。この酸素要求性は、親密
な細胞−細胞相互作用の指標として、あるいは生きている動物中の様々な部位に
おける酸素濃度を調べるためのバイオセンサーとして利用できるだろう。以下、
この技術の典型的応用例を例示のためにいくつか記述するが、これらは決して本
発明の限定を意図するものではない。
【０１８８】
（Ａ．酸素レベルの測定）
上に要約した実験で明示されたようにルシフェラーゼの発光に酸素が必要であ
るということは、本発明を、対象内の酸素濃度の空間的勾配の測定法として利用
できるということを示している。１０〜１ｍＭの範囲の酸素レベルを測定するた
めに、発光性細菌が使用されている。これらの研究によれば、０．１ｎＭが検出
下限だと予想される（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，１９８８，Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓ
ｃｅｎｃｅ．Ｐｒｉｎｇｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ
Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（英国チチェスター：Ｅｌｌｉｓ
Ｈｏｒｗｏｏｄ社およびＶＣＨ出版社））。本明細書に記述する撮像法は、生
きている動物内の様々な部位における酸素レベルを調べるのに利用できる。例え
ばＯ２中で、またはＣａ２＋依存的に光を放射するように操作された微生物を、
ちょうど発光性細菌が環境分析に使用されるように（Ｇｕｚｚｏら，１９９２，
Ｔｏｘ．Ｌｅｔｔ．６４／６５：６８７−６９３；Ｋｏｒｐｅｌａら，１９８９
，Ｊ．Ｂｉｏｌｕｍ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍ．４：５５１−５５４；Ｊａｓｓｉｍら
，１９９０，Ｊ．Ｂｉｏｌｕｍ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍ．５：１１５−１２２）、対
象内のバイオセンサーとして使用することができるだろう。Ｏ２濃度に関する発
光のダイナミックレンジは、Ｏ２プローブよりはるかに広く、より低いＯ２濃度
に達する（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，１９８８，Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ
．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（英国チチェスター：Ｅｌｌｉｓ Ｈｏｒｗ
ｏｏｄ社およびＶＣＨ出版社））。さらに、Ｏ２濃度に比例する発光は、３０ｎ
Ｍから８ｍＭまでの範囲にわたって直線的であり、１／２最大発光には９ｍＭ
Ｏ２が必要である。
【０１８９】
（Ｂ．腫瘍細胞の局在）
対象内の腫瘍の増殖と転移的蔓延は、本発明の方法と組成物を用いてモニター
できる。特にその個体が原発腫瘍を持つと診断される場合は、その腫瘍の細胞に
対するＬＥＣを用いて、腫瘍の境界を明確にし、かつ、その原発腫瘍塊から細胞
が離れた部位に移動し、定着したかどうかを決定することができる。
【０１９０】
例えば、腫瘍抗原に対する抗体を含有しかつＬＧＭが添加されているリポソー
ムなどのＬＥＣを、対象に投与し、対象内の腫瘍細胞に結合させ、撮像し、その
光子放出の領域を腫瘍細胞の領域と相関させることができる。
【０１９１】
関連する側面として、上述のような腫瘍局在性ＬＥＣを使用した画像を、選択
した時間間隔で作成することにより、ある対象内で腫瘍の増殖、進行および転移
を経時的にモニターすることができる。このようなモニタリングは、抗腫瘍療法
の結果の記録に、あるいは腫瘍の増殖または転移を抑制するのに有用だと推定さ
れる治療用化合物のスクリーニングの一部として有用だろう。
【０１９２】
また、腫瘍細胞を恒常的に活性なプロモーターの制御下にあるルシフェラーゼ
構築物で形質転換し、それを使って、上述のように、動物モデル中に発光性腫瘍
を誘導することもできる。そのような動物モデルは、抗腫瘍化合物候補の効果を
評価するのに使用できる。
【０１９３】
（Ｃ．炎症の局在）
上述と同様の方法で、本発明の組成物と方法を使用することにより、炎症部位
を特定し、炎症を経時的にモニターし、かつ／または、抗炎症性化合物候補のス
クリーニングを行なうことができる。炎症部位に向かわせるのに有用な分子には
、セレクチンに結合するＥＬＡＮタンパク質ファミリーがある。ＥＬＡＮ分子を
本発明の物体上にターゲッティング成分として組み込み、それを使って、炎症部
位を標的にすることができる。
【０１９４】
また、Ｅ−セレクチンプロモーターの制御下にルシフェラーゼを持つよう遺伝
子組換えした動物を作出することにより、抗炎症性物質候補を研究するための動
物モデルを作出することができる。Ｅ−セレクチンは炎症部位に発現するので、
炎症部位にあるトランスジェニック細胞はルシフェラーゼを発現させるだろう。
【０１９５】
この系は、抗炎症性物質のスクリーニングに使用できる。炎症性剌激を対照動
物と実験動物に投与し、処置動物内で誘導される発光に対する抗炎症性化合物候
補の影響を対照動物と比較することにより、それら抗炎症性化合物候補の効果を
評価することができる。
【０１９６】
（Ｄ．感染の局在）
本発明を裏付けるために行なった上述の実験で例証されるように、ＬＧＣは、
病原体による対象の感染の経過を追跡するのに有効に利用できる。本明細書に詳
述する実験では、ＬＧＣは、ルシフェラーゼを発現させるように形質転換された
病原性細胞（サルモネラ）である。このような系は、感染とその後の感染の蔓延
をヒト疾患の動物モデルで研究するのに理想的である。このような系によれば、
病因の研究に熱や腫脹などの伝統的な全身症状ではなく感染部位と疾患の進行部
位を用いて、感染性疾患の進行をモニターすることができる。
【０１９７】
抗感染薬の効力をモニターするために外部撮像法を使用すれば、生きている個
々の動物中で時間的空間的評価を行なうことができ、それによって病原および／
または試験抗感染薬に関する実験に必要な動物の数を減らすことができる。
【０１９８】
以下、実施例により本発明を説明するが、これらは決して本発明の限定を意図
するものではない。
【０１９９】
（材料と方法）
（Ａ．細胞）
サルモネラ株ＳＬ１３４４とＬＢ５０００は Ｂ．Ａ．Ｄ．Ｓｔｏｃｋｅｒ（
スタンフォード大学；ＨｏｉｓｅｔｈおよびＳｔｏｃｋｅｒ，１９８１，Ｎａｔ
ｕｒｅ ２９１：２３８−２３９）から入手した。サルモネラ株ＢＪ６６はＢ．
Ｄ．Ｊｏｎｅｓ（スタンフォード大学）から入手した。
【０２００】
ＨＥｐ−２細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅ
ｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；メリーランド州ロックビル・パークローンドライブ１２
３０１；受託番号ＣＣＬ−２３）から入手した。
【０２０１】
マウス腹腔マクロファージは、安楽死させたＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔を７ｍ
ｌの生育培地で洗浄することによって得た（ＭａｘｉｍｏｗおよびＢｌｏｏｍ，
１９３１，Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ，Ｓａｕｎｄｅｒｓ，
フィラデルフィア）。
【０２０２】
（Ｂ．静置培養）
１００ｍｇ／ｍｌのカルベニシリンを含むＬＢブロス３ｍｌに、定常期培養か
ら得た細菌懸濁液６μｌを接種し、その細菌を７ｍｌの静置培養管中３７℃で終
夜生育することにより、低酸素（静置）培養を調製した。
【０２０３】
（Ｃ．マウス）
Ｂａｌｂ／ｃ（Ｉｔｙｓ／ｓ）マウスは、スタンフォード大学の腫瘍学科（ｔ
ｈｅ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）から入手した。１２９
ＸＢａｌｂ／ｃ（Ｉｔｙｒ／ｓ）マウスはスタンフォードトランスジェニック動
物施設（ｔｈｅ Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌ Ｆ
ａｃｉｌｉｔｙ；カリフォルニア州スタンフォード）から入手した。動物はすべ
て、光周期、給餌法および温度条件を同一にして、スタンフォード大学研究動物
施設（ｔｈｅ Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ａｎｉｍａｌ Ｆａｃｉｌｉｔｙ；カリフォルニア州スタンフォード）で飼育し
た。
【０２０４】
麻酔は動物の腹腔内に３３μｇ／ｋｇ−体重のネンブタールを注射することに
よって行った。
【０２０５】
安楽死は、スタンフォード大学研究動物施設が推奨するプロトコールに従って
、ＣＯ２による窒息または頚椎脱臼によって行った。頚椎脱臼は、窒息による生
理学的変化が実験結果に影響を与えるかもしれない場合に使用した。
【０２０６】
ｌｕｘ形質転換サルモネラに感染したマウスには、ｌｕｘオペロンを含有する
Ａｍｐｒプラスミドが保持されるような選択圧を発光性サルモネラに与え続ける
ために、カルベニシリンの筋肉内（ｉ．ｍ．）注射（体重１ｋｇあたり１２５ｍ
ｇ）を毎日施した。
【０２０７】
（Ｄ．撮像）
撮像すべき動物または対象を、２段階マイクロチャネル増感ヘッドを持つ電荷
結合素子（ＣＣＤ）カメラ（モデルＣ２４００−４０，Ｈａｍａｍａｔｓｕ社）
と扉とを持つ光を通さない箱の中に固定した。そのカメラを、箱の外へ通じるケ
ーブルを介して”ＡＲＧＵＳ５０”画像処理装置（Ｈａｍａｍａｔｓｕ社）に接
続した。
【０２０８】
上述のＩＣＣＤシステムは、いったん１０〜３０光子の域値に到達すれば、単
一光子を検出できる。このシステムの信号対雑音比は、信号強度に依存して２：
１から１Ｘ１０４：１までに及んだ。
【０２０９】
グレースケール画像は、かすかなルームライトの中でライトボックスの扉をあ
け、８〜６４フレーム間積分することによって得た。グレースケール画像のゲイ
ンは、その画像が最適となるように設定した（通例、０〜１０，０００ボルトの
スケールで３０００ボルト）。
【０２１０】
生物発光データは、外部照射の不在下に得た。露出設定は次の通りとした：黒
レベルはカメラ／画像処理装置によって自動的に設定、ゲインは増倍装置コント
ローラーで自動的に設定、Ｆストップは２．８に設定した。６０ｍｍ”ＡＦニッ
コール”マクロレンズを使用した（ニコン（Ｎｉｋｏｎ）社，ニューヨーク州メ
ルヴィル）。
【０２１１】
生物発光画像は、選択した時間（通例５分間）光子を積分することによって作
成した。データは、いずれの動物についても、１ピクセルあたり０〜３ビットの
最低ビットレンジ設定で表わす。生物発光シグナルの分解能を０〜３のビットレ
ンジにできなかった他の物体（すなわち２４ウェルプレート）の画像については
、レンジを生物発光シグナルの局在化が可能な設定（通例１〜７）に増やした。
５分間の撮像で付加的な情報が得られなかった場合は、物体をより短い時間で撮
像した。
【０２１２】
外部撮像とは、動物の非侵襲的撮像を指す。内部撮像とは、動物の部分的切開
（通例、腹壁切開）後の撮像を指す。内部撮像は、外部撮像で局在化した光子放
射の光源を確認するために、選択した動物で行なう。
【０２１３】
生物発光画像データは、検出された光子の強度を表わす擬似色発光画像として
表わす。通例、青色（低強度）から赤色（高強度）までの６つの強度レベルを使
用する。
【０２１４】
ここに掲載する図を作成するために、グレースケール画像と生物発光画像を画
像処理装置を使って重ね合せることにより、空間的準拠座標系を与える合成画像
を作成した。
【０２１５】
合成画像はＲＧＢ ＣＲＴ（赤、緑、青；ブラウン管）モニターに表示し、そ
のモニターを撮影してハードコピーを作った。また画像処理装置画像をデジタル
ファイルとして保存し、そのファイルをコンピューターに移し、それをそのコン
ピューターに接続したカラープリンターで印刷することによっても、ハードコピ
ーを作成した。別法として、ビデオプリンターを使用してビデオ信号を直接印刷
することにより、ハードコピーを作成してもよい。
【実施例】
【０２１６】
（実施例１）
（ｐＣＧＬＳ１ｌｕｘプラスミドによるサルモネラの形質転換）
サルモネラ株ＳＬ１３４４、ＢＪ６６およびＬＢ５０００を、Ｘｅｎｏｒｈａ
ｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ由来のｌｕｘオペロン（Ｆｒａｃｋｍａｎら
，１９９０）をコードするｐＵＣ１８系ベクターｐＣＧＬＳ１で形質転換した。
【０２１７】
（Ａ．ｐＣＧＬＳ１プラスミド）
ｐＣＧＬＳ１プラスミドの概略を図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃに示す。このプラス
ミドは、土壌菌Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ由来のｌｕｘ
遺伝子をコードする〜１１ｋｂ領域（図１Ａ；Ｆｒａｃｋｍａｎら，１９９０）
を、ｐＵＣ１８（図１Ｃ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社，カリフォルニア州パロアルト）
のＢａｍ ＨＩ部位（図１Ｂ）にクローニングすることによって構築した。この
べクターの構築はＦｒａｃｋｍａｎらの報文（１９９０）に記述されている。
【０２１８】
図１Ａ中の制限酵素部位は、次のように記載されている：Ｂｓ，Ｂｓｔ ＥＩ
Ｉ；Ｃ，Ｃｌａ Ｉ；Ｅ，Ｅｃｏ ＲＩ；Ｈ，Ｈｉｎｄ ＩＩＩ；Ｍ，Ｍｌｕ
Ｉ；Ｓ，Ｓｃａ Ｉ；Ｘ，Ｘｂａ Ｉ；Ｂ／Ｓａ，Ｂａｍ ＨＩおよびＳａｕ
３Ａ接合点。多重クローニング部位（ＭＣＳ）を含む配列を図１Ｂに記載し、そ
のＢａｍ ＨＩ部位を太字で示す。
【０２１９】
挿入物を含まないｐＵＣ１８ベクターの図解を図１Ｃに示す。印を付けた要素
には、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｐ）、ｌａｃ Ｚ遺伝子（ｌａｃ Ｚ）およ
び大腸菌の複製起点（Ｏｒｉ）が含まれる。非修飾ｐＵＣ１８ベクターのサイズ
は約２．７ｋｂである。
【０２２０】
（Ｂ．サルモネラの形質転換）
サルモネラ株Ｓｌ１３４４、ＢＪ６６およびＬＢ５０００のエレクトロコンピ
テント細胞を一般的な方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，第２巻）で作
成し、使用直前まで−８０℃で保存した。エレクトロポレーションは次のように
行なった。１μｌのプラスミド（０．２μｇ／ｍｌ）を、１０％グリセロールに
懸濁した４０μｌの氷冷エレクトロコンピテント細胞に加えた。その懸濁液を１
分間穏やかに混合し、間隙１ｍｍのエレクトロポレーションキュベットに入れ、
Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｇｅｎｅ−Ｐｌｕｓｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ社，カリフォルニア州ハーキュリーズ）を使って電気穿孔した。設定は
、２．５キロボルト、４００オームおよび２５マイクロファラドとした。
【０２２１】
ルリア−べルチーニ（ＬＢ）ブロス中３７℃で１時間攪拌培養した後、１００
μｇ／ｍｌカルベニシリンを含む（ＬＢ）寒天上に細胞をまき、終夜生育した。
【０２２２】
標識されたサルモネラの生物発光を最大にするため、ｌｕｘオペロンを高コピ
ー数プラスミド上に維持し、単一コピー遺伝子として組み込まれないようにした
。しかしプラスミドは、この研究で使用したＳＬ１３４４やＢＪ６６のようなｒ
ｅｃＡ株では特に、細菌細胞による修飾を受ける。ｒｅｃＡ遺伝子座は、ｌｕｘ
オペロンとβ−ラクタマーゼを含有するプラスミドの領域を欠失させうるリコン
ビナーゼをコードする。したがって培養細胞から回収したサルモネラをカルベニ
シリンの存在下と不在下の両方で平板培養し、生物発光が失われる頻度を決定す
るために撮像した。ゲンタマイシン処理し溶解したＨＥｐ−２細胞とマクロファ
ージから回収されるコロニーはすべて、アンピシリン耐性（Ａｍｐｒ）かつ生物
発光性だった。したがって、ｌｕｘ遺伝子は哺乳類細胞との同時培養中に失われ
ないようだった。
【０２２３】
コロニーを暗室での視認によって発光について検査した。５つの形質転換体が
高レベルの発光を持つと同定された。これらのうち３つ（ＳＬ１３４４、ＢＪ６
６およびＬＢ５０００株からそれぞれ１つ）を、以降の実験のために選択した。
それらをそれぞれＳＬ１３４４ｌｕｘ、ＢＪ６６ｌｕｘおよびＬＢ５０００ｌｕ
ｘと名づけた。
【０２２４】
（実施例２）
（通常のサルモネラおよび形質転換したサルモネラの侵入能力）
６株のサルモネラ（ＳＬ１３４４ｌｕｘ、ＬＢ５０００ｌｕｘ、ＢＪ６６ｌｕ
ｘ、ＳＬ１３４４、ＬＢ５０００およびＢＪ６６）の侵入能力を、２種類の細菌
付着および侵入アッセイで測定した。コロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイは、
基本的に既に記述されている方法（ＦｉｎｌａｙおよびＦａｌｋｏｗ，１９８９
，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３：１８３３−１８４１）に変更（Ｌｅｅら，
１９９０，ＰＮＡＳ ８７：４３０４−４３０８）を加えて行なった。生物発光
アッセイは、細胞の数をＣＦＵではなく生物発光を用いて定量する点以外は、基
本的にＣＦＵアッセイと同様に行なった。
【０２２５】
簡単に述べると、ＨＥ−ｐ細胞と初代マウス腹腔マクロファージを２４ウェル
組識培養皿に、２０ｍＭグルタミン（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ社）および５％ウシ胎
児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ社，ユタ州ローガン）を添加したＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ
／ＢＲＬ社，ニューヨーク州グランドアイランド）中、１Ｘ１０５細胞／ウェル
の濃度で接種した。細胞を接種した２４時間後（ＨＥｐ−２）または数日間後（
マクロファージ）に、静置培養からの細菌（上記”材料と方法”の項参照）を、
１ウェルあたり１Ｘ１０６個（感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ）１０）または１Ｘ１０
７個（ｍ．ｏ．ｉ＝１００，図２Ｂ〜Ｅの右側の柱）の密度で接種し、Ｂｅｃｋ
ｍａｎ臨床用遠心器（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社，メリーラン
ド州コロンビア）を用いて、１０００ｒｐｍ（１８５Ｘｇ）で５分間、細胞単層
上に遠心した。培地を、ゲンタマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ）を含む（侵入アッ
セイ）または含まない（付着アッセイ）ＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ社）
で置換した。その共存培養を５％ＣＯ２中３５℃で合計３．５時間培養した。
【０２２６】
培養培地中のゲンタマイシンはＨｅｐ−２細胞によって内部移行されなかった
細菌を、ＨＥｐ−２細胞の表面に付着しているものを含めて殺す。したがって、
付着アッセイ（ゲンタマイシンを含まない）でのシグナルが、付着細菌と内部移
行細菌の両方を表わすのに対し、侵入アッセイ（ゲンタマイシンを含む）でのシ
グナルは内部移行された細菌のみを表わす。
【０２２７】
付着と侵入を、３時点（接種の１．５時間後、３．０時間後および３．５時間
後）で発光性細菌細胞を撮像することによりアッセイした。第１時点での撮像に
先立って、付着していない細菌を除去するために細胞単層をリン酸緩衝食塩水（
ＰＢＳ）で３回洗浄し、新しいＲＰＭＩを加えた。発光は３０秒間の露光時間で
記録した。第２および第３時点での画像も同じ露光時間を用いて得たが、最初に
細胞を洗うことはしなかった。
【０２２８】
図２Ａは、最後の時点で記録したデータを、その培養皿ウェルのグレースケー
ル画像に重ね合せた擬似色発光画像として表示したものである。細胞タイプ、サ
ルモネラ株およびゲンタマイシンの用法を図中に示す。このデータを光子カウン
トの相対強度として図２Ｂと２Ｄのグラフにも要約する。
【０２２９】
３．５時間時点での撮像後、組識培養細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ中の
０．２％”トリトン Ｘ−１００”で溶解した。溶解によって放出された付着細
菌および／または細胞内細菌をＬＢ寒天プレートまたはＬＢ−カルベニシリン寒
天プレートにまき、３５℃で１８時間培養した。各ウェルから放出された細菌の
数を、コロニー形成単位（ＣＦＵ，ＦｉｎｌａｙおよびＦａｌｋｏｗ，１９８９
，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３：１８３３−１８４１；Ｌｅｅら，１９９０
，ＰＮＡＳ ８７：４３０４−４３０９）の数を数えることによって決定した。
これらのデータを、ゲンタマイシンと共にまたはゲンタマイシンなしで３．５時
間培養した後の共存培養から回収された１ｍｌあたりの総細菌コロニーとして表
わし、図２Ｃおよび２Ｅのグラフに要約する。
【０２３０】
生物発光アッセイとＣＦＵアッセイの両方から得られたデータは、（ｉ）ｌｕ
ｘ遺伝子で形質転換されたサルモネラが親系と類似する感染力を持つことと、（
ｉｉ）発光検出とＣＦＵ決定がＨＥｐ−２細胞とマクロファージにおける２つの
サルモネラ株の侵入力について同等な推定値を与えることを示している。ＣＦＵ
に対する生物発光の比率はマクロファージ培養の方が低く、これはおそらくサル
モネラがマクロファージの細胞下区画に侵入するためだろう。
【０２３１】
（実施例３）
（形質転換したサルモネラの試験管内発光）
ＬＢ５０００ｌｕｘサルモネラの４つの１０倍連続希釈液１０μｌ（１ｍｌあ
たり１０６細胞から１０３細胞まで）を４本の１００μｌガラス製毛細管（Ｂｅ
ｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社のＣａｌｙ−Ａｄａｍｓ事業部，ニュージャー
ジー州パーシッパニー）に入れた。その細菌懸濁液は、毛細管中で両端に空気の
ポケットを持つ液体の柱を形成した。各毛細管の一端をクリトシール（ｃｒｉｔ
ｏｓｅａｌ；Ｃｌａｙ−Ａｄａｍｓ社）で密封した。希釈液の作成に使用した培
地は、空気に曝すことによりＯ２で飽和させた。
【０２３２】
その毛細管を透明なプラスチック製のラップで包み、上述のように３０秒間撮
像することにより、発光を測定した。典型的な画像を図３Ａに示す。４本の毛細
管を示す。これらは（上から下へ）１０６、１０５、１０４および１０３サルモ
ネラ細胞／ｍｌ（１０４、１０３、１０２および１０細胞／管）を含む。発光は
、１０４細胞／ｍｌ（１００細胞）しか含まない懸濁液でも検出できた。しかし
その発光は空気／液体界面に限定され、この発光反応が比較的高レベルの酸素を
必要とすることが示唆される。細胞の多くはおそらく液体柱の中にあり、空気／
液体界面にはないだろうから、このデータは、図３Ａに示す毛細管中の発光が、
各管中の総細胞数よりかなり少ない細胞から生じることを示唆している。
【０２３３】
（実施例４）
（動物組識を貫通する発光の試験管内検出）
ＬＢ５０００ｌｕｘサルモネラの連続希釈液を含む内径３．５ｍｍのガラス製
毛細管で構成された微量試験管を、基本的に上記実施例３に記述したように調製
した。ただし、本実施例では細菌懸濁液を毛細管の密封した末端に接触させ、上
端のみを空気にさらした。その管を半透明のプラスチック製シンチレーションバ
イアルに入れ、次に挙げる動物組識の一つでそのまわりを囲んだ：ヒヨコ胸筋、
ヒヨコ皮膚、子ヒツジ腎臓または子ヒツジ腎臓髄質。いずれの組識も地元のスー
パーマーケット（Ｓａｆｅｗａｙ社，カリフォルニア州マウンテンヴュー）の食
肉部門から入手した。
【０２３４】
組識で囲まれた毛細管を含むバイアルの図を図４に示す。バイアル１は直径約
１．４ｃｍで、蓋２を含む。そのバイアルをその上部分３に沿って、不透明な素
材（すなわち黒テープ）で覆う。動物組識４を、バイアルの底から不透明被覆３
の下端のすぐ上までになるよう、バイアルに入れる。微量試験管５の底を栓７（
すなわちクリトシール（ｃｒｙｔｏｓｅａｌ）栓）で密封し、それをバイアルの
中心に、栓をした末端がバイアルの底に接触するか、きわめて接近するように置
く。細菌懸濁液６は毛細管の底から上方約１ｃｍに達する。
【０２３５】
組識を含むバイアルと組識を含まないバイアルおよび細菌を含むバイアルと細
菌を含まないバイアルから放射された光子を、高速同時弁別器を無効にした液体
シンチレーションカウンター（モデル１２１９ Ｒａｃｋｂｅｔａ，ＬＫＢ／Ｗ
ａｌｌａｃ社，メリーランド州ゲーサーズバーグ）でカウントした。
【０２３６】
組識を含まない対照は、細菌懸濁液をシンチレーションバイアルに直接入れて
アッセイした。いずれの実験も３回ずつ行なった。
【０２３７】
各実験では、各カウントごとにバイアルを９０℃回転させて、バイアルを２、
３回カウントすることにより、考えうる組識の厚さの不一致の影響について検証
した。有意差は検出されなかった。
【０２３８】
その結果を下記表１に要約する。
【０２３９】
【表１】
【０２４０】
腎臓組識内の１Ｘ１０３個のＬＢ５０００ｌｕｘについてのシグナルは、シン
チレーションカウンター中の光電子増倍管（ＰＭＴ）でバックグランドレベルか
、それに近かった。このタイプの検出におけるバックグラウンドはＰＭＴの暗電
流によるものであり、この試験はかなり強いシグナルの分析に限定される。
【０２４１】
約１Ｘ１０７個のＬＢ５０００ｌｕｘからの生物発光は、０．５ｃｍの鳥類筋
肉、皮膚、ヒツジ腎臓髄質およびヒツジ腎臓を通して検出できた。これらの結果
は、標識したサルモネラからの生物発光が様々な不透明度の動物組識を通して検
出できることを示している。（図３Ａで示したように）毛細管内では酸素が制限
されていたと思われるので、このアッセイで表示している数よりも少ない数の生
物発光性サルモネラが、組識を通して検出できると考えられる。
【０２４２】
（実施例５）
（生物発光性サルモネラの生体内検出）
感染中のサルモネラに対する酸素の利用性を評価するために、野生型ＳＬ１３
４４ ｌｕｘをＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内（ｉ．ｐ．）に接種した。接種の２
４時間後、麻酔したラットで、細菌によって内部に放出され腹壁を透過した光子
を、増倍化ＣＣＤカメラで外部から検出し、局在化した（図３Ｂ）。全身性サル
モネラ感染には、リンパ節、脾臓、肝臓のコロニー形成が関与すると思われる。
野生型ＳＬ１３４４ ｌｕｘの腹腔内接種によって感染させたマウスの腹部画像
は、腹部表面のほとんどに透過光子が様々な強度の焦点を作っていることを示し
た（図３Ｂ）。これらの結果は、おそらくは肝臓と腸間膜リンパ節を含む内臓の
広範なコロニー形成と合致し、利用可能な酸素のレベルはいくつかの組識で標識
病原体からの発光を外部から検出するのに十分でありうることを示している。
【０２４３】
（実施例６）
（Ｂａｌｂ／ｃマウスに経口投与したｌｕｘサルモネラの検出）
病原性ＳＬ１３４４ｌｕｘ、非侵入性ＢＪ６６ｌｕｘおよび低病原性ＬＢ５０
００ｌｕｘサルモネラ１Ｘ１０７個の懸濁液５０μｌを経口的に与えることによ
って、Ｂａｌｂ／ｃマウスを感染させた。感染時に４〜６週齢だったそれらのマ
ウスを、５分間の積分時間で毎日撮像した（光子放射を５分間測定した）。撮像
に先立って、マウスを３３μｇ／ｋｇ−体重のネンブタールで麻酔した。
【０２４４】
典型的な画像を図５Ａ〜Ｆに示す。接種後（ｐ．ｉ．）２４時間の時点で、生
物発光シグナルはいずれの感染動物でも単一の焦点に局在した（図５Ａ、５Ｃお
よび５Ｅ）。生物発光は、低病原性ＬＢ５０００ｌｕｘに感染したすべての動物
で、接種後７日までに消失した（図５Ｂ）。野生型ＳＬ１３４４ ｌｕｘに感染
したＢＡＬＢ／ｃマウスでは、生物発光が試験期間中常に検出され、第８日では
透過光子の焦点が複数認められた。これらの動物では、感染がしばしば腹腔のほ
とんどに広がった（図５Ｆ）。これらの動物の３分の１では、第８日に透過光子
が腹部領域の大半で認められ、それは腹腔内接種後の光子の分布と似ていた（図
３Ｂと５Ｆを参照のこと）。ＢＪ６６ ｌｕｘによる感染の蔓延はかなり変動的
だったが、通例、その感染は持続し、最初の部位に局在したままだった（図５Ｄ
）。
【０２４５】
耐性ＢＡＬＢ／ｃＸ１２９マウスを野生型ＳＬ１３４４ ｌｕｘに感染させた
ところ、１０匹のマウス群で、その生物発光シグナルはその試験期間中常に局在
し、持続性を保っていた。この結果は、ＳＬ１３４４ ｌｕｘに感染した感受性
マウス（ｌｙｔｒ／ｓ）に観察された播種性生物発光とは対照的であった（実施
例８と図７Ａおよび７Ｂを参照のこと）が、侵入性の低いＢＪ６６ ｌｕｘによ
る感受性ＢＡＬＢ／ｃマウスの持続性感染とは似ていた。対照として、持続的に
感染した耐性ＢＡＬＢ／ｃＸ１２９マウスから得たサルモネラを培養したところ
、８日後に回収したコロニーの８０〜９０％はＡｍｐｒだった。これらのうち９
０％以上は生物発光性であり、観察された相違がｌｕｘプラスミドの有意な減少
によるのではなく、むしろ細菌株の病原性が真に相違するためであることが示唆
された。
【０２４６】
（実施例７）
（サルモネラの病原性株および低病原性株の腹腔内接種後の感染の検出）
１００μｌ懸濁液中の１Ｘ１０７細菌細胞を同時に空気を注入することなく腹
腔内（ｉ．ｐ．）接種することによって、Ｂａｌｂ／ｃマウスを病原性（ＳＬ１
３４４ｌｕｘ）または低病原性（ＬＢ５０００ｌｕｘ）サルモネラに感染させた
。
【０２４７】
接種後（ｐ．ｉ．）３２時間の時点で、上述のようにマウスを麻酔し、撮像し
た。その結果を図６に示す。この図の左側の２匹のマウス（病原性ＳＬ１３４４
ｌｕｘに感染）では広範な感染が明らかである。これに対して、低病原性ＬＢ５
０００ｌｕｘ株を注射した右側のマウスでは、発光はあったとしてもほとんど検
出されない。
【０２４８】
（実施例８）
（サルモネラ経口接種後の耐性マウスにおける全身性感染の検出）
耐性１２９ＸＢａｌｂ／ｃ（Ｉｔｙｒ／ｓ）生存マウスを、１Ｘ１０７個のＳ
Ｌ１３４４ｌｕｘサルモネラの胃内接種によって感染させた。細菌は麻酔下に胃
内給餌チューブを通して与えた。注入後８日間（８ ｄ．ｐ．ｉ）、動物を毎日
撮像した。
【０２４９】
結果を図７Ａと７Ｂに示す。一組３匹のマウスを感染させ、８日間毎日撮像し
た。第１日の典型的画像（図７Ａ）と第８日の典型的画像（図７Ｂ）を示す。こ
れらのデータは、全身性サルモネラ感染症に対して耐性なマウスは盲腸に局在し
た慢性感染症を持つが、その感染は腹腔内に蔓延しないことを示している。
【０２５０】
（実施例９）
（サルモネラ経口接種後の腹壁切開後撮像）
腹腔内の発光シグナルの位置を正確に特定し、その位置を非侵襲的撮像法で得
たものと比較するために、サルモネラの経口接種後に腹壁切開を行なった。実施
例８に記述したように、動物に接種した。選択した期間（通例７日）の後、上述
のようにマウスを麻酔し、外部から撮像した。典型的画像を図８Ａに示す。外部
撮像の後、腹腔を開き、図８Ｂに例示するように動物を再び撮像した。場合によ
り、盲腸（Ｃ）の前後の腸管腔に空気を注入してから、３回目の撮像を行なった
（図８Ｃ）。最後の撮像後、直ちにマウスを安楽死させた。
【０２５１】
経口接種後の感染初期に感受性マウス中で生物発光が限局的に観察された場合
はいずれも、光子はほとんどもっぱら盲腸から生じており、限局的生物発光の正
確な局在と強度の変動は、盲腸の位置が変動しやすいためであった。感染耐性Ｂ
ＡＬＢ／ｃＸ１２９マウスに観察された限局的な生物発光も、同様に盲腸に局在
した。これに対して、ＳＬ１３４４ ｌｕｘに腹腔内感染させた動物では、その
ような局在が観察されなかった（図３Ｂ）。野生型ＳＬ１３４４ ｌｕｘを経口
接種した感染感受性マウスの後期では、生物発光が多極性であったが、追加され
た発光の焦点は腹壁切開後に明白にならなかった。病原性の低いＬＢ５０００
ｌｕｘに感染したマウスでは、第７日の時点で、生物発光が、いずれの組識また
は器官にも、皮膚および腹壁の除去後、限局的にさえ、検出できなかった。
【０２５２】
どの感染動物の脾臓または血流にも、生物発光は光学的に検出されなかった。
肝臓からの生物発光は疾患後期にのみ認められた。また、胃腸路からの生物発光
は疾患の初期には盲腸に限られた。このパターンは、異なる組識におけるサルモ
ネラの数の相違もしくは利用できる酸素の欠如によるのだろう。経口感染したマ
ウスの破砕した器官中に存在するＡｍｐｒ ｃｆｕを定量することにより、標識
サルモネラＳＬ１３４４ ｌｕｘの分布を調べた。第７日にＳＬ１３４４ ｌｕ
ｘ感染ＢＡＬＢ／ｃマウスの肝臓、脾臓および肺から得たａｍｐｒ細菌コロニー
は、いずれも、その９０％以上が１．９Ｘ１０３〜＞１．０Ｘ１０５の範囲の総
ｃｆｕを示し、生体内では検出可能な光子放射を伴わなかった（表２）。これに
対して、盲腸からの生物発光は検出可能であり、この組識は＞１．０Ｘ１０８の
総ｃｆｕを含有した。ＬＢ５０００ ｌｕｘ感染マウスでは、どの組識にもｃｆ
ｕが検出されなかった。これらの結果は、現在の実験系を使用した場合、組識中
１Ｘ１０６生物がほぼこの放射波長での検出限界であることを示唆している。
【０２５３】
酸素はルシフェラーゼ反応に必須の基質であるから、酸素化された微小環境中
に存在するサルモネラだけが生物発光するはずである。したがって、胃腸路の管
腔の嫌気環境にサルモネラからの生物発光がないことは予想できることであり、
腸管腔を空気にさらせば、それまでは酸素がないために検出できなかった細菌の
存在が明らかになるはずである。この見解の裏付けとして、盲腸だけに検出可能
な生物発光を持つ一匹の動物が、空気にさらされたときに迅速に生物発光性にな
る糞粒を排泄した。腸管腔内に非発光性のルシフェラーゼ発現細菌が存在するこ
とを示すこの事実と、この組織内の好気地帯と嫌気地帯の明確な描写から、腸管
腔に空気を注入すれば、さらなる細菌の存在が明らかになるであろうことが示唆
された。同様の生物発光パターンを示す別の動物の回腸と結腸の管腔に空気を注
入したところ、注射部位近くで光子が検出可能になった（図８）。最後に、盲腸
生物発光をＡ示す第３のマウスを殺すと、生物発光は迅速に消滅した。明確な好
気環境地帯と嫌気環境地帯を欠くため、他の組識部位に空気を注射した。
【０２５４】
【表２】
【０２５５】
（実施例１０）
（サルモネラ腹腔内接種後の腹壁切開後撮像）
実施例７に記述したように、１Ｘ１０７個のサルモネラ（ＳＬ１３４４ｌｕｘ
）を腹腔内接種することにより、Ｂａｌｂ／ｃマウスを感染させた。そのような
一匹の典型的画像を図９Ａ、９Ｂおよび９Ｃに示す。
【０２５６】
注射後（ｐ．ｉ）２４時間の時点で、動物を麻酔し、５分間撮像した（図９Ａ
）。腹腔を開き、そのマウスを再び５分間撮像した（図９Ｂ）。盲腸を左側に引
き寄せ、その動物を再び５分間撮像した（図９Ａ）。
【０２５７】
その結果から、非侵襲的撮像法で得られた感染部位の局在は、腹腔を開いて明
らかになった部位とよく相関することがわかる。
【０２５８】
（実施例１１）
（ＳＬ１３４４ｌｕｘサルモネラからの生物発光に対するシプロフロキサシン
の影響）
生体内撮像法の有用性を立証するために、感染した動物を、全身性サルモネラ
感染症に有効であることが知られている抗生物質シプロフロキサシンで処置した
。Ｍａｇａｌｉａｎｅｓら，１９９３，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎ
ｔｓ Ｃｈｅｍｏ．３７：２２９３。
【０２５９】
Ｂａｌｂｃマウスの実験群と対照群にＳＬ１３４４ｌｕｘを経口接種した。接
種の８日後に、実験群のマウスに１００ｍｇのシプロフロキサシン塩酸塩（３ｍ
ｇ／ｋｇ−体重；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社，ミズーリ州セントルイス）
を腹腔内注射した。実験群の処置後、両群の動物を、処置後５．５時間にわたっ
て数回（上述のように）撮像した。
【０２６０】
典型的画像を図１０Ｂ〜Ｅに示す。図１０Ｂと１０Ｄは、それぞれ実験群の処
置を開始する直前の対照群と処置群を代表する動物の合成画像である。図１０Ｃ
と１０Ｅは、処置の開始後５．５時間の同じ動物の合成画像である。対照の生物
発光が７．５倍まで増大したのに対して、シプロフロキサシン処置動物の腹部上
の生物発光はこの期間中に検出不能なレベルにまで減少した。腹部領域上に検出
される光子の総数を決定し、ｔ＝０での値に対して規格化し、処置後の時間に関
して図１０Ａにプロットした。
【０２６１】
このデータは、本発明の方法と組成物を、生体内感染の蔓延に対する薬物の効
果の評価に使用できることを示している。
【０２６２】
特定の方法と態様に関して本発明を説明したが、本発明から逸脱することなく
様々な変更や改変を施しうることは理解されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【０２６３】
【図１】図１は、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ＳＬ１３４４株、ＢＪ６６株およびＬＢ５０００株を形質転換してＳＬ１３４４ｌｕｘ株、ＢＪ６６ｌｕｘ株およびＬＢ５０００ｌｕｘ株を作出するために使用したｌｕｘ ｐＣＧＬＳ１プラスミドのマップである。
【図２Ａ】図２Ａは、サルモネラＳＬ１３４４ｌｕｘ株とＢＪ６６ｌｕｘ株によるマクロファージとＨＥｐ−２細胞の接着および侵入を測定したアッセイの結果を示す。図２Ａは、アッセイ皿のウェル内で局在化した発光性細菌細胞を示す。光子を１分間にわたって積分することによって得た擬似色像を、アッセイ皿のグレースケール像に重ね合せることにより、表記の”合成画像”を作成した。
【図２Ｂ】図２Ｂは、サルモネラＳＬ１３４４ｌｕｘ株とＢＪ６６ｌｕｘ株によるマクロファージとＨＥｐ−２細胞の接着および侵入を測定したアッセイの結果を示す。図２Ｂは、ゲンタマイシンで処理しなかったウェルの相対光強度を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、サルモネラＳＬ１３４４ｌｕｘ株とＢＪ６６ｌｕｘ株によるマクロファージとＨＥｐ−２細胞の接着および侵入を測定したアッセイの結果を示す。図２Ｃは、図２Ｂで撮像したウェルと同じウェルから単離された１ｍｌあたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数を示す。
【図２Ｄ】図２Ｄは、サルモネラＳＬ１３４４ｌｕｘ株とＢＪ６６ｌｕｘ株によるマクロファージとＨＥｐ−２細胞の接着および侵入を測定したアッセイの結果を示す。図２Ｄは、ゲンタマイシンで処理したウェルの相対光強度を示す。
【図２Ｅ】図２Ｅは、サルモネラＳＬ１３４４ｌｕｘ株とＢＪ６６ｌｕｘ株によるマクロファージとＨＥｐ−２細胞の接着および侵入を測定したアッセイの結果を示す。図２Ｅは、図２Ｄで撮像したウェルと同じウェルから単離された１ｍｌあたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、ＬＢ５０００ｌｕｘ細菌懸濁液の希釈液を含有する４つのガラス製毛細管の合成画像である。発光は３０秒間の積分によって測定した。各毛細管内の懸濁液の両側には空気ポケットが存在する。
【図３Ｂ】図３Ｂは、マウスの腹腔内に野生型ＳＬ１３４４ｌｕｘを接種した後の生物発光の分布を表わす。
【図４】図４は、ＬＢ５０００ｌｕｘが生成した光の透過を、動物組識越しに調べるために使用したバイアルの概略図である。
【図５Ａ】図５Ａは、低病原性ＬＢ５０００ｌｕｘサルモネラを経口接種し、図に表示した時間に撮像したＢａｌｂ／ｃマウスの合成画像である。発光シグナルを５分間積分した。
【図５Ｂ】図５Ｂは、低病原性ＬＢ５０００ｌｕｘサルモネラを経口接種し、図に表示した時間に撮像したＢａｌｂ／ｃマウスの合成画像である。発光シグナルを５分間積分した。
【図５Ｃ】図５Ｃは、非侵入性ＢＪ６６ｌｕｘサルモネラを経口接種し、図に表示した時間に撮像したＢａｌｂ／ｃマウスの合成画像である。発光シグナルを５分間積分した。
【図５Ｄ】図５Ｄは、非侵入性ＢＪ６６ｌｕｘサルモネラを経口接種し、図に表示した時間に撮像したＢａｌｂ／ｃマウスの合成画像である。発光シグナルを５分間積分した。
【図５Ｅ】図５Ｅは、病原性ＳＬ１３４４ｌｕｘサルモネラを経口接種し、図に表示した時間に撮像したＢａｌｂ／ｃマウスの合成画像である。発光シグナルを５分間積分した。
【図５Ｆ】図５Ｆは、病原性ＳＬ１３４４ｌｕｘサルモネラを経口接種し、図に表示した時間に撮像したＢａｌｂ／ｃマウスの合成画像である。発光シグナルを５分間積分した。
【図６】図６は、病原性ＳＬ１３４４ｌｕｘ細菌株（左の２匹）または低病原性ＳＬ５０００ｌｕｘ細菌株（右の２匹）を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した３２時間後のマウスにおけるサルモネラの分布を示す合成画像である。
【図７】図７Ａと７Ｂは、全身性サルモネラ感染症に対して耐性なマウス（１２９ＸＢａｌｂ／ｃ，Ｉｔｙｒ／ｓ）における病原性サルモネラの分布を示す。図７Ａは第１日、図７Ｂは第８日である。
【図８Ａ】図８Ａは、病原性が減少したサルモネラ突然変異体（ＢＪ６６ｌｕｘ）の経口接種７日後の分布を示す。図８Ａは発光の外部非侵襲的撮像を示す。記号を付した器官は、Ｃ−盲腸、Ｌ−肝臓、Ｉ−小腸、Ｓｐ−脾臓である。
【図８Ｂ】図８Ｂは、病原性が減少したサルモネラ突然変異体（ＢＪ６６ｌｕｘ）の経口接種７日後の分布を示す。図８Ｂは図８Ａと同じ動物を腹壁切開後に撮像したものである。記号を付した器官は、Ｃ−盲腸、Ｌ−肝臓、Ｉ−小腸、Ｓｐ−脾臓である。
【図８Ｃ】図８Ｃは、病原性が減少したサルモネラ突然変異体（ＢＪ６６ｌｕｘ）の経口接種７日後の分布を示す。記号を付した器官は、Ｃ−盲腸、Ｌ−肝臓、Ｉ−小腸、Ｓｐ−脾臓である。図８Ｃは、盲腸の前方と後方の腸管腔内に空気を注入した後に作成した腹壁切開後の画像を示す。
【図９Ａ】図９Ａは、ＳＬ１３４４ｌｕｘの腹腔内接種後の感受性Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるサルモネラＳＬ１３４４ｌｕｘの分布を示す。図９Ａは腹腔を開く前に撮像した。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ＳＬ１３４４ｌｕｘの腹腔内接種後の感受性Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるサルモネラＳＬ１３４４ｌｕｘの分布を示す。図９Ｂは腹腔を開いた後に撮像した。
【図９Ｃ】図９Ｃは、ＳＬ１３４４ｌｕｘの腹腔内接種後の感受性Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるサルモネラＳＬ１３４４ｌｕｘの分布を示す。図９Ｃは盲腸を左側に引き寄せた後に撮像した。
【図１０Ａ】図１０Ａは、経口接種マウス中のＳＬ１３４４ｌｕｘサルモネラからの生物発光に対するシプロフロキサシン処置の影響を表わす。図１０Ａは、処置動物と無処置動物について、腹部領域から測定された相対生物発光を、処置開始後の時間の関数として表わすグラフである。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、経口接種マウス中のＳＬ１３４４ｌｕｘサルモネラからの生物発光に対するシプロフロキサシン処置の影響を表わす。図１０Ｂは、ＳＬ１３４４ｌｕｘサルモネラを経口接種した８日後の、シプロフロキサシンで処置する前のマウスの合成画像である。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、経口接種マウス中のＳＬ１３４４ｌｕｘサルモネラからの生物発光に対するシプロフロキサシン処置の影響を表わす。図１０Ｃは、同じマウスの対照の５．５時間後（処置なし）の合成画像である。
【図１０Ｄ】図１０Ｄは、経口接種マウス中のＳＬ１３４４ｌｕｘサルモネラからの生物発光に対するシプロフロキサシン処置の影響を表わす。図１０Ｄは、ＳＬ１３４４ｌｕｘサルモネラを経口接種した８日後の、シプロフロキサシンで処置する前のマウスの合成画像である。
【図１０Ｅ】図１０Ｅは、経口接種マウス中のＳＬ１３４４ｌｕｘサルモネラからの生物発光に対するシプロフロキサシン処置の影響を表わす。図１０Ｅは、同じマウスの処置後５．５時間（図ｌ０Ｅ）の合成画像である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物対象中の発光体および発光性生物事象を検出し、位置決め
し、追跡するための非侵襲的な方法と組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
組識内の感染性因子を検出し定量するための現行の生体外方法では、感染性疾
患の進行をモニターする能力に限界がある。宿主における感染性因子の複製には
、しばしば一次、二次および三次複製部位が関与する。複製部位と、感染性因子
がそれらの部位を通過する過程は、接種経路、宿主がコードする因子、およびそ
の感染性因子の決定基に基づいて観測される。
【０００３】
考えられる複製部位と感染の進行は、経験から推定できる場合もある。しかし
感染部位と疾患の速度は、知られないか、あるいは大雑把にしか推定できないこ
との方が多いだろう。また感染性疾患の進行は、マウスの同系交配系でさえ、個
別的である場合が多く、実験的に感染させた宿主で疾患が平均してどのような経
過をたどるのかを決定するために、数多くの感染動物の連続的な生体外分析を行
なう必要がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
動物モデルにおける感染の進行を追跡する手段を持つことが望ましい。その追
跡を非侵襲的に行なうことができ、一匹の動物を必要な頻度で有害な影響を与え
ずに評価できれば、理想的である。本発明は、哺乳動物などの生体内の病原体と
その他の物体を検出し、位置決めし、追跡するための非侵襲的方法を提供するこ
とを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
１つの局面において、本発明は、次の工程からなる哺乳類対象中の生物適合体
の局在を検出する非侵襲的方法を提供する：（ａ）その対象に、その生物適合体
と発光成分の複合体を投与し、（ｂ）その複合体がその対象内で局在を達成しう
る期間の後、その対象を光検出装置の検出フィールド内に固定し、（ｃ）その対
象を固定状態に維持し、（ｄ）維持中に、その対象中に局在した発光成分からの
光子放射を、光子放射の画像を構築することができるまで、その光検出装置で測
定し、（ｅ）その画像を構築する。
【０００６】
１つの実施形態において、上記の方法は、工程（ｂ）から（ｅ）までを選択し
た間隔で反復することをさらに含み得、その反復が対象中の生物適合体の局在を
経時的に追跡するのに有効であり得る。
【０００７】
別の実施形態において、上記の方法は、その測定が増倍化電荷結合光検出素子
を用いて行われ得る。
【０００８】
別の実施形態において、上記の方法は、その投与が腫瘍細胞ターゲッティング
成分を含有する複合体の投与を含み得る、哺乳類対象中の腫瘍細胞の局在を検出
するための方法であり得る。
【０００９】
別の実施形態において、上記の方法は、その投与が炎症ターゲッティング成分
を含有する複合体の投与を含み得る、哺乳類対象中の炎症の局在を検出するため
の方法であり得る。
【００１０】
別の実施形態において、上記の方法は、その投与が感染ターゲッティング成分
を含有する複合体の投与を含み得る、哺乳類対象中の病原体による感染の局在を
検出するための方法であり得る。
【００１１】
別の実施形態において、上記の方法は、その投与が血栓性プラークターゲッテ
ィング成分を含有する複合体の投与を含み得る、哺乳類対象内の血栓性プラーク
の局在を検出するための方法であり得る。
【００１２】
別の実施形態において、上記の方法は、その投与が発光成分を含有する粒子で
ある複合体の投与を含み得る。
【００１３】
別の実施形態において、上記の方法は、動物モデル中の病原体による感染症の
局在を検出するための方法であり得、生物適合体がその病原体であり得る。好ま
しい実施形態において、その病原体がサルモネラであり得る。
【００１４】
別の実施形態において、上記の発光成分が発光性タンパク質であり得る。好ま
しい実施形態において、上記タンパク質がルシフェラーゼ、黄色蛍光タンパク質
およびフェレドキシンＩＶからなる群より選択され得る。別の好ましい実施形態
において、その投与が抗体断片と発光性タンパク質の融合タンパク質である複合
体の投与を含み得る。別の好ましい実施形態において、上記生物適合体が形質転
換細胞であり得、上記発光成分がその細胞から発現する異種遺伝子の産物であり
得る。さらに好ましい実施形態において、上記異種遺伝子の発現が活性化可能な
プロモーターの制御下にあり得る。
【００１５】
別の局面において、本発明は、哺乳類対象中の生物適合体のレベルを経時的に
検出する非侵襲的方法であって、（ａ）その対象に、その生物適合体と発光成分
の複合体を投与し、（ｂ）その対象を光検出装置の検出フィールド内に置き、（
ｃ）その対象をその装置の検出フィールド中に維持し、（ｄ）維持中に、その対
象中の発光成分からの光子放射を、その光検出装置で測定し、（ｅ）（ｂ）から
（ｄ）までの工程を、選択した間隔で反復することからなり、その反復が、その
対象中の生物適合体のレベルの経時変化を検出するのに有効である方法を提供す
る。
【００１６】
さらなる局面において、本発明は、次の工程からなる哺乳類対象における導入
遺伝子の組み込みを検出する非侵襲的方法を提供する：（ａ）その対象に、哺乳
類細胞中に有効に組み込まれ、かつ、導入遺伝子、発光性タンパク質をコードす
る遺伝子および活性化可能なプロモーターを含有するベクター構築物（ただし、
発光性タンパク質をコードする遺伝子はプロモーターの制御下にある）を投与し
、（ｂ）その構築物が組み込みを達成しうる期間の後、プロモーターを活性化し
、（ｃ）その対象を光検出装置の検出フィールド内に置き、（ｄ）その対象をそ
の光検出装置の検出フィールド内に維持し、（ｅ）維持中に、その対象中の、発
現した発光性タンパク質からの光子放射のレベルを、その光検出装置で測定し、
（ｆ）その光子放射のレベルがバックグラウンドより有意に高ければ、その導入
遺伝子の組み込みを確認する。
【００１７】
なおさらなる局面において、本発明は、次の工程からなる動物中のプロモータ
ー誘導事象の局在を検出する非侵襲的方法を提供する：（ａ）その事象に反応す
る誘導性プロモーターとその制御下にある発光性タンパク質をコードする異種遺
伝子とを持つトランスジェニック動物中で、その事象を誘発し、（ｂ）その動物
を光検出装置の検出フィールド内に置き、（ｃ）その動物を固定状態に維持し、
（ｄ）維持中に、その動物内に局在する発現した発光性タンパク質からの光子放
射を、光子放射の画像を構築することができるまで、その光検出装置で測定し、
（ｅ）その画像を構築する。
【００１８】
なおさらなる別の局面において、本発明は、発光性タンパク質を発現させる遺
伝子で形質転換されたサルモネラを提供する。
【００１９】
一態様として、本発明は、哺乳類対象内の生物適合体の局在を検出する非侵襲
的方法を包含する。その生物適合体は分子であってもよいし、巨大分子、細胞、
微生物（病原体を含む）、あるいは粒子などであってもよい。
【００２０】
この方法では、対象に当該物体と発光成分の複合体を投与する。発光成分は通
例、光を放射する分子または高分子（巨大分子）である。この成分は、放射吸収
の結果として発光したり（例えば蛍光性または燐光性分子）、あるいは化学反応
の結果として発光することができる（例えば生物発光タンパク質）。発光成分の
典型例は、ルシフェラーゼやエクオリンのような生物発光タンパク質および、黄
色蛍光タンパク質やフェレドキシンＩＶのような有色または蛍光タンパク質であ
る。
【００２１】
この成分は、物体の合成中に組み込んだり（例えば化学的または遺伝子的組み
込み、抗体断片と発光性タンパク質の融合タンパク質など）、合成後の化学的カ
ップリング、非共有結合的会合（例えばリポソームによる封入）、物体内でのｉ
ｎ ｓｉｔｕ合成（例えば形質転換細胞における異種生物発光タンパク質の発現
）、またはプロモーター誘導物質で剌激されたトランスジェニック動物の細胞に
おける生物発光タンパク質の活性化可能なプロモーター制御性のｉｎ ｓｉｔｕ
発現（例えばウイルスの感染によって刺激されたインターフェロン活性化プロモ
ーター）などといった様々な技術により、物体と複合させることができる。
【００２２】
対象中で複合体が局在できた期間の後、対象を、十分な量の光子放射を（その
光検出装置で）測定して画像を構築するのに有効な期間、光検出装置の検出フィ
ールド内に固定する。典型的な光検出装置は、画像処理装置に接続した増倍化電
荷結合素子（ＩＣＣＤ）カメラである。”固定されていない”対象が動く時間ス
ケールに比べて短い時間内に画像を構築できるのであれば、対象は撮像中本質的
に”固定されている”ことになり、特別な固定措置は必要ない。次に、光子放射
データから画像を構築する。
【００２３】
撮像工程を選択した間隔で繰り返し、各間隔に対応する画像を構築することに
より、上述の方法で、対象内の物体の局在を経時的に追跡することができる。
物体上にターゲッティング成分を結合したり、複合させたり、あるいは組み込む
ことにより、数多くの特定の応用に、上述の方法を使用することができる。ター
ゲッティング成分はその物体（例えば抗体または抗体断片）固有の特性であって
もよいし、あるいはターゲッティング成分を物体に複合させたり、結合したりま
たは組み込んでもよい（例えば抗体を含有するリポソーム）。ターゲッティング
成分の例には、抗体、抗体断片、酵素阻害因子、レセプター結合分子、種々の毒
素などがある。ターゲッティング成分の標的としては、炎症部位、感染部位、血
栓性プラーク、腫瘍細胞などを挙げることができる。これらの標的を特徴づける
、ターゲッティング成分による認識に適したマーカーは、よく知られている。
【００２４】
さらに、発光成分と複合した病原体（例えばサルモネラ）を物体として使用す
れば、この方法で、動物モデル内の病原体による感染部位を検出し、局在化（定
位）することができる。
【００２５】
関連する態様として、本発明は、哺乳類対象内の生体適合体のレベルを経時的
に検出する非侵襲的方法を包含する。この方法は上述の方法に似ているが、必ず
しも物体を画像の形で局在化するわけではなく、対象内での物体のレベルの変化
を経時的に検出するよう設計される。この方法は、物体（例えば発光性細菌）の
レベルに対する治療用物質（例えば抗生物質）の効果を経時的にモニターするの
に、とりわけ有用である。
【００２６】
もう１つの態様として、本発明は、哺乳類対象における導入遺伝子の組込みを
検出する非侵襲的方法を包含する。この方法では、哺乳類細胞に導入遺伝子を組
み込むのに有効なべクター構築物を、対象に投与する。そのような構築物は当技
術分野ではよく知られている。この構築物は、効果的な組込みに必要な要素に加
えて、導入遺伝子（例えば治療用遺伝子）と、発光性タンパク質をコードする遺
伝子とを、選択した活性化可能なプロモーターの制御下に含有する。その構築物
が組み込みを達成しうる期間の後、そのプロモーターを活性化する。例えば、イ
ンターフェロンプロモーターを使用した場合は、ポリイノシン−ポリシトシン二
重鎖（ポリＩＣ）を局所投与（例えば足蹠注射）することにより、インターフェ
ロン産生を刺激することができる。次に、対象を光検出装置（例えば光増倍性”
暗視”ゴーグルをつけた人）の検出フィールド内に置き、光子放射のレベルを測
定または評価する。そのレベルがバックグラウンドを超える場合（すなわち光が
”活性化した”領域に優先的に検出されうる場合）、その対象は当該導入遺伝子
を組込んでいると記録される。
【００２７】
関連する態様として、本発明は、発光性タンパク質をコードする遺伝子を誘導
性プロモーターの制御下に含む構築物でトランスジェニックまたはキメラにした
動物におけるプロモーター誘導事象の局在を検出する非侵襲的方法を包含する。
プロモーター誘導事象には、そのプロモーターを直接活性化する物質の投与、内
因性プロモーター活性化因子の産生を刺激する物質の投与（例えばＲＮＡウイル
ス感染によるインターフェロン産生の剌激）、内因性プロモーター活性化因子の
産生をもたらす状態に置くこと（例えば熱ショックまたはストレス）などがある
。この事象を誘発し、上述のように動物を撮像する。
【００２８】
さらなる態様として、本発明は、発光性タンパク質（例えばルシフェラーゼ）
を発現させる遺伝子で形質転換された病原体（例えばサルモネラ）を包含する。
【００２９】
またもう１つの側面として、本発明は、病原体による感染の蔓延を抑制するの
に有効な治療用化合物を同定する方法をも包含する。この方法では、病原体と発
光成分の複合体を対照動物と実験動物に投与し、その実験動物を治療用化合物候
補で処置し、上述の方法によって対照動物内と実験動物内の発光性病原体を局在
化し、その化合物が対照動物と比較して実験動物における病原体の蔓延または複
製を有意に抑制する効力をもつのであれば、その化合物を治療上有効であると認
める。複合体としては、蛍光標識された抗体、蛍光標識された粒子、蛍光標識さ
れた小分子などが挙げられる。
【００３０】
さらなる側面として、本発明は、発光成分と共役した物体を、様々な不透明度
を持つ媒質を通して局在化する方法を包含する。この方法では、光検出装置を用
いて、その媒質を透過した光子を検出し、その光子を経時的に積分し、積分した
その信号に基づいて画像を作成する。
【００３１】
さらなる態様として、本発明は、ある生物内の特定の部位で、選択した物質（
例えば溶存酸素またはカルシウム）の濃度を測定する方法を包含する。この方法
には、濃度センサー（すなわち発光する能力が選択した物質の濃度に依存する発
光性分子）を含有する物体（例えば細胞）が含まれる。その発光性分子を含有す
る物体を、動物内もしくは特定の組識または器官系（例えば脾臓）内に実質上均
一に分布するように投与する。その生物を撮像する。光放射の強度と局在は、選
択した物質の濃度と位置に相関する。別法として、当該物体は、第２の標識、例
えば濃度センサーとは異なる波長で発光することができる分子を含有する。この
第２標識を用いて宿主における物体の分布の非均一性を規格化すれば、選択した
物質の濃度をより正確に決定することができる。
【００３２】
もう１つの側面として、本発明は、腫瘍の増殖および／または転移性伝播を抑
制するのに有効な治療用化合物を同定する方法を包含する。この方法では、（ｉ
）発光成分で標識した腫瘍細胞または発光成分を含有する腫瘍細胞を実験動物群
と対照動物群に投与し、（ｉｉ）その実験群を選択した化合物で処置し、（ｉｉ
ｉ）腫瘍細胞に付随する発光性分子からの光子放射を光検出装置で撮像すること
によって、両群の動物中の腫瘍細胞を局在化し、（ｉｖ）その化合物が対照群と
比較して実験群における腫瘍の増殖および／または転移性伝播を有意に抑制でき
るならば、その化合物を治療上有効であると認める。
【００３３】
本発明の上記その他の目的と特徴は、下記の発明の詳細な説明を添付の図面と
合わせて読むことにより、より完全に理解されるだろう。
【発明の効果】
【００３４】
すなわち、本発明により、哺乳動物などの生体内の病原体とその他の物体を検
出し、位置決めし、追跡するための非侵襲的方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
（Ｉ．定義）
特に明示しない限り、本明細書で使用する用語はすべて、本発明の技術分野で
使用される通常の意味を持つ。
【００３６】
本明細書における不透明媒質とは「従来通りの」不透明な媒質を指し、必ずし
も完全に不透明であるとは限らない。したがって不透明媒質とは、一般に透明で
なく半透明でもないとみなされる媒質をいい、これには木片や哺乳動物の肉およ
び皮膚などが含まれる。
【００３７】
特に断わらない限り、ルシフェラーゼには原核生物ルシフェラーゼと真核生物
ルシフェラーゼが含まれ、また、赤色領域の波長で発光するルシフェラーゼのよ
うな光学特性が変異または変化した変種も含まれる。
【００３８】
生物適合体とは、哺乳動物に投与できる物体をいう。これには哺乳動物にとっ
て有害でありうる病原体も含まれる。発光性タンパク質を発現させる導入遺伝子
を含有する細胞を持つ動物の場合、生物適合体とは、その哺乳動物を構成する導
入遺伝子含有細胞を指す。
【００３９】
発光性とは、化学反応または放射線の吸収により光を発生しうることをいう。
【００４０】
本明細書において光とは、特に断わらない限り、約３００ｎｍと約１１００ｎ
ｍの間の波長を持つ電磁放射線をいう。
【００４１】
感染の蔓延とは、通常、最初の感染部位以外の宿主部位の、病原体による伝播
とコロニー形成を指す。ただしこの用語には、最初の感染部位における病原体の
大きさおよび／または数の増大も含まれうる。
【００４２】
ｌｕｘ−ルシフェラーゼおよび光子放射に関係する原核生物遺伝子。
【００４３】
ｌｕｃ−ルシフェラーゼおよび光子放射に関係する真核生物遺伝子。
【００４４】
プロモーター誘導事象とは、選択した誘導性プロモーターの直接的または間接
的誘導をもたらす事象を指す。
【００４５】
異種遺伝子とは、宿主生物中に形質移入された遺伝子を指す。通例、異種遺伝
子とは、形質移入または形質転換された細胞のゲノムＤＮＡに元来由来しない遺
伝子を指す。
【００４６】
（ＩＩ．発明の一般的概観）
本発明は、哺乳類対象中の発光性複合体の非侵襲的撮像および／または検出に
関する方法と組成物を包含する。この複合体は、生物適合体と発光成分とを含有
する。生物適合体には、環状有機分子などの小分子；タンパク質などの高分子；
ウイルス、細菌、酵母、カビなどの微生物；あらゆるタイプの病原体および病原
性物質；ビーズやリポソームなどの粒子が含まれるが、これらに限らない。また
、生物適合体は、撮像される哺乳類対象を構成する細胞の全部または一部であっ
てもよい。
【００４７】
発光能は、発光成分の複合体化によって物体に付与される。そのような成分に
は、蛍光分子、蛍光タンパク質、光子を放出する酵素反応、生物発光タンパク質
などの発光物質がある。複合体化（共役）には、化学的カップリング、融合タン
パク質の遺伝子操作、あるいは生物発光タンパク質を発現させる細胞、微生物ま
たは動物の形質転換が含まれうる。例えば、その物体が撮像する哺乳類対象を構
成する細胞である場合、その発光成分はその細胞に「共役（複合）」させた生物
発光タンパク質または蛍光タンパク質であってよく、それはトランスジェニック
動物またはキメラ動物の作出によりその細胞内に導入されたべクター構築物から
のプロモーター制御的発現の局在性による。
【００４８】
通例、発光性複合体を様々な方法で対象に投与し、その対象内で局在させ、そ
れを撮像する。撮像または対象からの光子放射の測定は数十分間続くことがある
ので、常にそうであるとは限らないが、通常は撮像工程中、対象を固定しておく
。
【００４９】
発光体の撮像は、極めて低レベルの光（通常は単一光子事象）を検出し、画像
の構築が可能になるまで光子放射を積分できる光検出器の使用を必要とする。そ
のような高感度光検出器の例には、単一光子事象を増幅した後、検出系に固有の
背景ノイズに対して単一光子を検出できる（例えば液体窒素で冷却された）カメ
ラまたはカメラ群で、その事象を検出する装置がある。
【００５０】
光子放射画像を作成したら、通例、放射された光子の発生源に関して準拠座標
系を与えるため（すなわち対象に関して発光性複合体を局在化するため）に、そ
れをその対象の”通常の”反射光画像に重ね合わせる。次に、そのような”合成
”画像を分析することにより、対象内の標的の位置および／または量を決定する
。
【００５１】
以下に、上述の段階と態様をより詳細に記述する。
【００５２】
（ＩＩＩ．発光体）
（Ａ．発光成分）
本発明の実施に有用な発光成分（ｌｉｇｈｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｍｏｉ
ｅｔｙ；ＬＧＭ）、発光分子または発光構築物は、その応用に応じて様々な形態
のいずれをとってもよい。これらに共通する特徴は、それらが発光性であるとい
うこと、すなわちそれらが電子的励起状態から、より低いエネルギー状態（通常
、基底状態）への遷移の結果として、原子または分子から紫外（ＵＶ）、可視お
よび／または赤外（ＩＲ）領域の電磁放射線を放射するということである。
【００５３】
発光成分の例には、蛍光分子、化学発光化合物、燐光化合物、生物発光化合物
などの光冷光（フォトルミネセンス）分子がある。
【００５４】
本発明との関連性が強いＬＧＭの２つの特徴は、そのサイズとスペクトル特性
である。これらについては、スペクトル特性に関する一般的議論の後、後述する
発光成分の特定のタイプに関連して議論する。
【００５５】
（１．スペクトル特性）
本発明の重要な側面は、非侵襲的に外部から検出できるように動物組識を貫通
しうる光を生成する発光成分の選択である。光が動物組識（ほとんど水からなる
）のような媒質を通過する能力は、主として、その光の強度と波長によって決ま
る。
【００５６】
単位体積中の発光強度が強いほど、その光は検出しやすくなる。単位体積中に
生成する光の強度は、後述する個々のＬＧＭのスペクトル特性と、単位体積中の
当該成分の濃度に依存する。したがって、通例、物体内または物体上に高濃度の
ＬＧＭを配置する共役法（例えばリポソームの高効率負荷や、細胞内での生物発
光タンパク質の高レベル発現など）により、例えば各物体にＬＧＭを一つだけ共
役させる方法よりも深い組識層を通して検出することが容易な、より明るい発光
性複合体（ｌｉｇｈｔ−ｅｍｉｔｔｉｎｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ； ＬＥＣ）を
作成する。
【００５７】
組識層越しのＬＧＭの検出性を支配する第２の因子は、放射光の波長である。
ほとんどの組織は主として水からなっているので、動物組識の吸収特性を近似す
るには水を使用することができる。水が長波長光（赤色領域の光）を短波長光よ
り容易に透過させることはよく知られている。
【００５８】
したがって、通例、黄色から赤色（５５０〜１１００ｎｍ）の範囲の光を放射
するＬＧＭの方が、より短い波長で放射するＬＧＭより好ましい。後述するＬＧ
Ｍのいくつかはこの範囲で放射する。しかし、本発明の裏付けとして行なった後
述の実験によれば、４８６ｎｍ域で放射するＬＧＭで本発明を実施すると、それ
が最適な放射波長でないという事実にもかかわらず、良好な結果を得ることがで
きる。これらの結果は、これらの実験で使用したＬＥＣ（形質転換サルモネラ細
胞）内に比較的高濃度のＬＧＭ（ルシフェラーゼ分子）が存在することと、高感
度な検出器を使用したことが、その一因だと考えられる。より最適な放射波長を
持つＬＧＭを使用すれば、より低濃度のＬＧＭを持つＬＧＥで同様の検出結果が
得られることは、理解されるだろう。
【００５９】
（２．蛍光系成分）
蛍光は、放射線源の除去後極めて短い持続時間を持つ単一の電子励起状態から
生じる物質の発光である。励起光の一部はその蛍光分子によって熱に変換される
ので、放射される蛍光の波長は励起光の波長より長い（ストークスの法則）。
【００６０】
蛍光分子がルミネセンスを示すには光の入力が必要であるから、本発明におけ
る蛍光分子の使用は、生物発光分子の使用よりも複雑になるだろう。通例、対象
から検出される蛍光光子シグナルを汚染しないように、励起光を遮蔽する予防措
置がとられる。自明の予防措置としては、蛍光顕微鏡で使用されるような励起フ
ィルターを放射線源に設置することが挙げられる。適切に選択された励起フィル
ターは、蛍光成分によって放射される光子の波長と類似する波長を持つ光子の大
半を遮断する。また、蛍光光子の波長以外の波長を持つ光子の大半をふるい落と
すために、障壁フィルターを検出器に使用する。上述のようなフィルターは、Ｏ
ｍｅｇａ Ｏｐｔｉｃａｌ社（バーモント州ブラトルバロ）を含む様々な商業的
供給源から入手できる。
【００６１】
また、適切な励起波長に近く、蛍光放射波長には近くない高強度光を発生させ
るレーザーを使用して、蛍光成分を励起させることもできる。例えば共焦点顕微
鏡のようにレーザーが対象を走査できるように、ｘ−ｙ変換機構を使用してもよ
い。
【００６２】
もう１つの予防措置として、検出器の部位に到達した放射光子が、対象を完全
に通過したものだけとなるように、放射線源を対象の背後に設置し、遮蔽するこ
ともできる。さらに、蛍光成分を励起するために使用する光の波長に対して低い
感度を持つ検出器を選択してもよい。
【００６３】
上述の措置を賢明に適用すれば、本発明の方法による蛍光性ＬＧＭの検出が可
能である。
【００６４】
蛍光成分としては、フルオレセインのような小さい蛍光分子と、緑色蛍光タン
パク質（Ｃｈａｌｆｉｅら，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：８０２−８０
５；ＭｏｒｉｎおよびＨａｓｔｉｎｇｓ，１９７１，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉ
ｏｌ．７７：３１３）やルマジンおよび黄色蛍光タンパク質（Ｏ’Ｋａｎｅら，
１９９１，ＰＮＡＳ ８８：１１００−１１０４；Ｄａｕｂｎｅｒら，１９８７
，ＰＮＡＳ ８４：８９１２−８９１６）のような蛍光タンパク質が挙げられる
。また、ある種の有色タンパク質、例えばフェレドキシンＩＶ（Ｇｒａｂａｕら
，１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：３２９４−３２９９；その蛍光
性はまだ評価されていない）などにも蛍光性があって、本発明で使用できるかも
しれない。フェレドキシンＩＶは赤みがかった色を持ち、それは比較的長波長で
蛍光または反射して組識を貫通するのに有効な光を生じる可能性を示すので、特
に有望な候補である。さらに、この分子はタンパク質としては小さいので（９５
アミノ酸）、物体に共役させた時に、それらの機能に与える影響を最小限に抑え
ることができる。
【００６５】
小さい蛍光分子の利点は、それを結合させる物体の生物活性を妨害する可能性
が、より大きな発光成分よりも少ないということである。また、本発明での使用
に適した種々の励起および放射スペクトルを持つ市販の蛍光分子を入手すること
もできる。例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社（オレゴン州ユージーン
）は、ルシファーイエロー（４２８ｎｍで吸収し、５３５ｎｍで放射）やナイル
レッド（５５１ｎｍで吸収し、６３６ｎｍで放射）を含む多数の発蛍光団を販売
している。さらに、種々の結合法で使用できる様々な基で誘導体化された分子も
（例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社から）入手することができる。
【００６６】
（３．生物発光系成分）
化学発光（化学反応の結果としての発光）と生物発光（生体からの可視発光）
は、多くの側面から詳細に研究されている（例えばＣａｍｐｂｅｌｌ，１９８８
，Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐ
ｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（英
国チチェスター；Ｅｌｌｉｓ Ｈｏｒｗｏｏｄ社およびＶＣＨ出版社））。以下
に顕著な特徴を簡単に要約する。
【００６７】
生物発光分子は、光を放射するために放射エネルギーの入力を必要としない点
で、蛍光分子とは異なる。むしろ生物発光分子は、ＡＴＰなどの化学エネルギー
を利用して光を発生させる。蛍光成分に対する生物発光成分の利点は、そのシグ
ナルに事実上バックグラウンドがないということである。検出される光は、外来
の生物発光成分によって生成した光だけである。これに対して、蛍光分子を励起
するために使用される光は、しばしば意図する標的以外の物質の蛍光をもたらす
。これは”バックグラウンド”が生きている動物の内部環境のように複雑な場合
は、とくにそうである。
【００６８】
生物発光分子にはいくつかの種類が知られている。それらには、ルシフェラー
ゼファミリー（例えばＷｏｏｄら，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：７００
−７０２）や、エクオリンファミリー（例えばＰｒａｓｈｅｒら，Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．２６：１３２６−１３３２）がある。ルシフェラーゼファミリーの要素は、
種々の原核生物と真核生物で同定されている。原核発光（ｌｕｘ）系に関与する
ルシフェラーゼその他の酵素と、それに対応するｌｕｘ遺伝子は、ビブリオ（Ｖ
ｉｂｒｉｏ）属とフォトバクテリウム（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の海
生細菌およびキセノラブダス（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ）属の陸生細菌から単離
されている。
【００６９】
ルシフェラーゼ系（ｌｕｃ）を含有する代表的真核生物は、北アメリカホタル
Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓである。ホタルルシフェラーゼは詳細に研究
されており、ＡＴＰアッセイに広く使用されている。コメツキムシの一種 Ｐｙ
ｒｏｐｈｏｒｕｓ ｐｌａｇｉｏｐｈｔｈａｌａｍｕｓ由来のルシフェラーゼを
コードするｃＤＮＡが、クローン化され、発現されている（Ｗｏｏｄら，１９８
９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：７００−７０２）。この甲虫は、種の異なる要素
が異なる色の生物発光を放射する点で珍しい。互いに９５〜９９％の相同性を持
つ４種類のクローンが単離された。それらは５４６ｎｍ（緑色）、５６０ｎｍ（
黄緑色）、５７８ｎｍ（黄色）、および５９３ｎｍ（橙色）の光を放射する。最
後の種類（５９３ｎｍ）は、その放射光がそれより短い波長の光よりも容易に組
識を貫通する波長を持つので、本発明で発光成分として使用するには特に好都合
である。
【００７０】
ルシフェラーゼ類とエクオリン様分子は、ＡＴＰやＮＡＤ（Ｐ）Ｈなどのエネ
ルギー源と、ルシフェリンまたはコエレントリジン（ｃｏｅｌｅｎｔｒｉｚｉｎ
ｅ）と酸素などの基質を必要とする。
【００７１】
ルシフェラーゼ酵素を発光させるには、基質ルシフェリンをルシフェラーゼ酵
素に供給しなければならない。ルシフェラーゼ酵素がｌｕｘルシフェラーゼをコ
ードするｃＤＮＡを含有するベクターの発現産物として導入される場合、ルシフ
ェリンを供給する便利な方法は、ルシフェラーゼを発現させるだけでなく、ルシ
フェリンを合成するための生合成酵素をも発現させることである。そのような構
築物で形質転換された細胞では、生物発光に必要な外因性要素が酸素だけになる
。そのような方法（実施例１に詳述）を用いてｌｕｘ形質転換サルモネラを作成
し、それを使って本発明を裏付ける後述の実験を行なう。
【００７２】
土壌菌Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓから得たｌｕｘオペ
ロンをコードするプラスミド構築物（Ｆｒａｃｋｍａｎら，１９９０，Ｊ．Ｂａ
ｃｔ．１７２：５７６７−５７７３）は、ヘテロ二量体ルシフェラーゼの２つの
サブユニットと３つの補助タンパク質を発現させることにより、形質転換大腸菌
に光子放射能を付与する（Ｆｒａｃｋｍａｎら，１９９０）。Ｘ．ｌｕｍｉｎｅ
ｓｃｅｎｓのｌｕｘ遺伝子を発現させる大腸菌の最適な生物発光は３７℃で観察
され（ＳｚｉｔｔｎｅｒおよびＭｅｉｇｈｅｎ，１９９０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２６５：１６５８１−１６５８７；Ｘｉら，１９９１，Ｊ．Ｂａｃｔ．１
７３：１３９９−１４０５）、これは真核発光生物や他の原核発光生物由来のル
シフェラーゼの低い最適温度と対照的である（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，１９８８，Ｃ
ｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌ
ｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（英国チ
チェスター：Ｅｌｌｉｓ Ｈｏｒｗｏｏｄ社およびＶＣＨ出版社））。したがっ
てＸ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ由来のルシフェラーゼは、動物中での研究にマー
カーとして使用するのに適している。
【００７３】
上述または実施例１に記述するようなルシフェラーゼベクター構築物は、大半
の細菌と多くの真核細胞（ｌｕｃ構築物）を含む様々な宿主細胞の形質転換に使
用できる。また、ヘルペスウイルスやワクシニアウイルスのようなある種のウイ
ルスは、ルシフェラーゼを発現させるように遺伝子操作することができる。例え
ば、Ｋｏｖａｃｓ Ｓｚ．およびＭｅｔｔｅｎｌｉｅｔｅｒ，１９９１，Ｊ．Ｇ
ｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７２：２９９９−３００８には、ヘルペスウイルス内のホ
タルルシフェラーゼをコードする遺伝子の安定な発現が記述されている。Ｂｒａ
ｓｉｅｒおよびＲｏｎ，１９９２，Ｍｅｔｈ．ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１６：
３８６−３９６には、哺乳類細胞内でのルシフェラーゼ遺伝子構築物の使用が記
述されている。培養哺乳類細胞からのルシフェラーゼ発現は、ＣＣＤ撮像法で巨
視的（ＩｓｒａｅｌおよびＨｏｎｉｇｍａｎ，１９９１，Ｇｅｎｅ １０４：１
３９−１４５）にも微視的（Ｈｏｏｐｅｒら，１９９０，Ｊ．Ｂｉｏｌｕｍ．ａ
ｎｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍ．５：１２３−１３０）にも研究されている。
【００７４】
（Ｂ．物体）
本発明は、上述のような発光成分、発光性構築物または発光分子を含むように
修飾したまたは共役させた物体を包含する。そのような共役体または修飾体を、
発光体、発光性複合体（ＬＥＣ）または単に複合体という。これらの物体自体は
、例えば分子、高分子、粒子、微生物または細胞などの形態をとることができる
。発光成分を物体に共役させる方法は、その成分と物体の性質に依存する。代表
的な共役法については、後述の物体に関連して議論する。
【００７５】
（１．小分子）
本発明の実施に有用であろう小分子物体としては、病原体もしくは内因性リガ
ンドまたはレセプターと特異的に相互作用する化合物が挙げられる。そのような
分子の例には、薬物や治療用化合物；ある種のクモ、ヘビ、サソリ、渦鞭毛藻類
、海性巻貝、細菌を含む有毒生物の毒液中に存在するような毒素；ＮＧＦ、ＰＤ
ＧＦ、ＴＧＦ、ＴＮＦなどの増殖因子；サイトカイン；生理活性ペプチドなどが
あるが、これらに限るわけではない。
【００７６】
これらの小分子は、その小分子の生物活性が仮に妨害されるとしてもそれが最
小限であるような発光成分（例えば小さい蛍光分子（上述））と共役（結合）さ
せることが好ましい。結合の性質は通例化学的であり、当業者の知る様々な方法
のいずれで行なってもよい。
【００７７】
小分子物体は、形式的な結合操作が必要ないように、発光成分を含有するよう
合成することができる。また、発光成分と反応できる反応性基を持つ小分子物体
を合成したり、その逆を行なうこともできる。
【００７８】
本発明の発光成分と結合した小分子は、ヒトの疾患または状態の動物モデルで
使用してもよいし、処置すべきヒト対象で直接使用してもよい。例えば、腫瘍細
胞上に発現するレセプターに高い親和力で結合する小分子を動物モデルで使用す
ることにより、腫瘍を局在化し、その大きさの推定値を得たり、治療薬候補によ
る処置後の腫瘍の増殖または転移の変化をモニターすることができる。また、そ
のような分子を用いて、癌患者中の上述のような腫瘍の特徴をモニターすること
もできる。
【００７９】
（２．高分子）
ポリマーや生体ポリマーのような高分子は、本発明の実施に有用な物体のもう
１つの例である。代表的な高分子には、抗体、抗体断片、融合タンパク質、ある
種のベクター構築物がある。
【００８０】
商業的供給源から購入したり、当技術分野で知られる方法（Ｈａｒｌｏｗら，
１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，
第１０章，４０２頁，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）に
よって作成した抗体または抗体断片を用いて、それら抗体を発光成分と結合し、
その複合体を対象に例えば注射などによって投与し、その複合体を抗原の部位に
局在させ、その複合体を撮像することにより、哺乳類対象内の抗原を局在化する
ことができる。
【００８１】
抗体と抗体断片は、本発明での物体としての使用に関していくつかの利点を持
つ。これらはその性質上、それら自体がターゲッティング成分を構成する。さら
にその大きさゆえに、小さい蛍光分子、蛍光タンパク質および生物発光タンパク
質を含む数タイプの発光成分との結合に馴染みやすく、また、例えば細胞やリポ
ソームなどと比較して、迅速に拡散できる。
【００８２】
発光成分は抗体または断片に直接結合させることもできるし、例えば蛍光性の
二次抗体などを用いて間接的に結合させることもできる。直接的結合は、抗体ま
たは抗体断片に対する例えば発蛍光団の一般的な化学的結合によって、あるいは
遺伝子操作によって行なうことができる。蛍光タンパク質または生物発光タンパ
ク質に結合した抗体または抗体断片を含有するキメラまたは融合タンパク質を構
築することができる。例えばＣａｓａｄｅｉら，１９９０，ＰＡＮＳ ８７：２
０４７−２０５１には、エクオリンと抗体の融合タンパク質遺伝子を哺乳類細胞
内で発現させることができるベクター構築物の作成法が記述されている。
【００８３】
抗体を含有する複合体は、本発明の多くの応用に使用できる。例えば炎症部位
に発現するＥ−セレクチンに対する標識抗体を使用して、その炎症を局在化し、
抗炎症薬候補の効果をモニターすることができる。
【００８４】
ベクター構築物そのものも、本発明に応用できる高分子体となりうる。例えば
、発光性分子をコードする遺伝子と治療用遺伝子とを、選択したプロモーター（
すなわち当該治療用遺伝子が標的とする細胞内で発現するプロモーター）の制御
下に含有する真核発現ベクターを構築することができる。本発明の方法を用いて
アッセイされるその発光性分子の発現は、その治療用遺伝子の発現位置と発現レ
ベルを決定するために使用できる。その治療用遺伝子の発現が、処置される人ま
たは動物モデル内で直接的な表現型を持たない場合に、この方法はとりわけ有用
だろう。
【００８５】
（３．ウイルス）
本発明のある種の側面で有用なもう１つの物体はウイルスである。多くのウイ
ルスは哺乳類宿主に感染する病原体であるから、それらのウイルスを発光成分と
共役させ、初期感染部位と感染の蔓延を研究するために使用することができる。
また、発光成分で標識したウイルスは、感染もしくは感染の蔓延を抑制する薬物
のスクリーニングに使用することもできる。
【００８６】
ウイルスは、発光成分と結合した抗体を用いて間接的に標識したり、あるいは
例えばウイルス粒子を（Ｄｈａｗａｎら，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４
７（１）：１０２の方法などで）ビオチニル化した後、それらを検出可能成分（
例えば蛍光分子）と結合したストレプトアビジンにさらすことにより、間接的に
標識することができる。
【００８７】
別法として、ウイルス粒子をローダミンのような発蛍光団で、例えばＦａｎら
，１９９２，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．３０（４）：９０５の方法を用いて直
接標識してもよい。また、発光性タンパク質を発現させるようにウイルスを遺伝
子操作することもできる。ヘルペスやワクシニアのようなある種のウイルスのゲ
ノムは、本発明の裏付けとして行なった実験で使用したｌｕｘ遺伝子やｌｕｃ遺
伝子のような大きさの遺伝子を十分に順応させうるほどに大きい。
【００８８】
標識したウイルスを動物モデルで使用することにより、感染を局在化し、感染
の進行をモニターすることができ、また感染の蔓延を抑制するのに有効な薬物を
スクリーニングすることもできる。例えば、ヘルペスウイルス感染症は皮膚病変
として現われるが、このウイルスはヘルペス脳炎をも引き起こしうる。上述の方
法のいずれかで標識したウイルスを用いることにより、このような感染症を局在
化し、モニターすることができると共に、様々な抗ウイルス剤を中枢神経系（Ｃ
ＮＳ）感染症におけるその効力について調べることができる。
【００８９】
（４．粒子）
ビーズ、リポソームなどを含む粒子は、本発明の実施に有用なもう１つの物体
を構成する。これらはサイズが大きいので、粒子には、例えば小分子などの場合
よりも多数の発光成分を共役させることができる。これは、より短い露光時間で
、またはより厚い組識層を通して検出することができる、より高濃度の光放射を
もたらす。また、本質的に純粋なターゲッティング成分またはリガンド（例えば
抗原や抗体）をその表面に含むように、リポソームを構築することもできる。さ
らに、例えば生物発光タンパク質分子などを比較的高濃度に、リポソームに負荷
することもできる（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，１９８８，Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃ
ｅｎｃｅ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ
Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（英国チチェスター：Ｅｌｌｉｓ
Ｈｏｒｗｏｏｄ社およびＶＣＨ出版社））。
【００９０】
さらに、２種類のリポソームを、その両方が存在する場合にのみ光が生成する
ように、同じ細胞タイプに向かわせることもできる。例えば一方のリポソームに
ルシフェラーゼを担持させ、他方にルシフェリンを担持させることができる。こ
れらのリポソームはターゲッティング成分を保持してもよく、２つのリポソーム
上のターゲッティング成分は同じであってもよいし、異なってもよい。感染細胞
上のウイルスタンパク質は、感染した組識または器官の同定に使用できる。免疫
系の細胞は、単一のまたは複数の細胞表面マーカーを用いて局在化することがで
きる。
【００９１】
血中循環時間を延長し、血流によるターゲッティングを増進するには、リポソ
ームの表面を、例えばリン脂質−ポリエチレングリコール複合体の組み込みなど
によってコーティングすることが好ましい。このタイプのリポソームはよく知ら
れている。
【００９２】
（５．細胞）
細胞は、原核、真核共に、本発明の実施に有用なもう１つの物体を構成する。
細胞にも粒子と同様に比較的高濃度の発光成分を負荷できるが、細胞には、例え
ば異種遺伝子構築物で細胞をトランスフェクションすることによって、発光成分
を供給しうるという利点がある。また、”ターゲッティング成分”もしくは細胞
を対象内の所望の位置に導くのに有効な分子を発現させる細胞を選択することも
できる。別法として、適当なターゲッティング成分を発現させるベクター構築物
で細胞をトランスフェクションすることもできる。
【００９３】
使用する細胞タイプは、その応用に依存する。例えば後に詳述するように、サ
ルモネラなどの細菌細胞を使用することにより、高レベルな時間的空間的解像度
でその感染過程を研究し、その感染過程に対する薬物または治療剤の効果を評価
することができる。
【００９４】
細菌細胞は有効な物体を構成する。例えば、それらをトランスフェクションす
ることにより、高レベルの発光成分や高レベルのターゲッティングタンパク質を
容易に発現させることができる。また、表面結合型抗体を発現させる細菌を含む
大腸菌ライブラリーを得て、それをスクリーニングすることにより、選択した抗
原に対する抗体を発現させるコロニーを同定することも可能である（Ｓｔｒａｔ
ａｇｅｎｅ社，カリフォルニア州ラホーヤ）。次に、このコロニーから得た細菌
を、発光性タンパク質の遺伝子を含有する第２のプラスミドで形質転換し、形質
転換体を本発明の方法で上述のように使用することにより、哺乳類宿主内の当該
抗原を局在化できる。
【００９５】
病原性細菌を発光成分と共役させ、それを動物モデル内で使用することにより
、その感染過程を生体内で追跡したり、新しい抗生物質などの潜在的抗感染薬を
、その感染の抑制に関するそれらの効力について評価することができる。本発明
の裏付けとして行なった後述の実験によって、この応用の一例を説明する。
【００９６】
真核細胞も本発明のある側面で物体として有用である。所望の調節要素を含有
する適当な発現ベクターが市販されている。それらのベクターを用いて、初代培
養細胞、体細胞、リンパ細胞などを含む種々の真核細胞中で所望の発光性タンパ
ク質を発現させうる構築物を作成することができる。これらの細胞は、一過性発
現試験にも使用できるし、細胞系の場合は安定な形質転換体として選択すること
もできる。
【００９７】
形質転換細胞における発光性タンパク質の発現は、選択された様々なプロモー
ターのいずれかを用いて調節することができる。例えばその細胞を、発現したリ
ガンドまたはレセプターによって対象内のある部位に向かわせる発光体として使
用したい場合は、ＣＭＶプロモーターやＳＶ４０プロモーターなどの恒常的に活
性なプロモーターを使用すればよい。そのような構築物で形質転換した細胞は、
例えばその細胞を殺すことなどによって光の発生を阻害する化合物のアッセイに
も使用できる。
【００９８】
また、形質転換細胞が対象内に均一に分布し、ウイルスによる感染やサイトカ
インによる剌激を受けたときなど、一定の条件下でのみ発光性タンパク質が発現
するように、形質転換細胞を投与してもよい。これらの剌激やその他の剌激に関
係する因子に反応するプロモーターは、当技術分野で知られている。関連する側
面として、Ｔｅｔ系（ＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄ，１９９２，ＰＡＮＳ
８９：５５４７−５５５１）のような誘導性プロモーターを使用して、発光性タ
ンパク質の発現を一時的に活性化することもできる。
【００９９】
例えばｔａｔ反応性ＨＩＶ ＬＴＲ要素を含有する構築物でＣＤ４＋リンパ細
胞を形質転換し、それをＨＩＶ感染のアッセイとして使用することができる（Ｉ
ｓｒａｅｌおよびＨｏｎｉｇｍａｎ，１９９１，Ｇｅｎｅ １０４：１３９−１
４５）。そのような構築物で形質転換した細胞をＳＣＩＤ−ｈｕマウス（ＭｃＣ
ｕｎｅら，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１６３２−１６３９）に導入し
、それをヒトＨＩＶ感染症とＡＩＤＳのモデルとして使用することができる。
【０１００】
例えば恒常的に活性なプロモーターを用いて上述のように形質転換した腫瘍細
胞系は、腫瘍の増殖と転移をモニターするために使用できる。形質転換した腫瘍
細胞を動物モデルに注射し、腫瘍塊を形成させ、増殖阻害剤候補または転移阻害
剤候補で処置しながら、腫瘍の大きさと転移をモニターすることができる。
【０１０１】
腫瘍細胞は、様々な感染性因子または治療用化合物に感応する活性を持つ調節
可能なプロモーターを含有する構築物で形質転換された細胞から作成することも
できる。
【０１０２】
（６．細胞形質転換）
原核細胞と真核細胞の形質転換法は共に当技術分野でよく知られている（Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，第２巻）。適当な調節因子と多重クローニング
部位を持つベクターは広く市販されている（例えばカリフォルニア州ラホーヤの
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、カリフォルニア州パロアルトのＣｌｏｎｔｅｃｈ社）
（ＩＶ．発光性タンパク質をコードする遺伝子を含有するトランスジェニック
動物）
もう１つの側面として、本発明は、発光性タンパク質または発光性のタンパク
質複合体をコードする異種遺伝子構築物を含有するトランスジェニック動物を包
含する。この構築物は選択したプロモーターによって駆動され、例えば発光性タ
ンパク質の機能的発現に必要な種々の補助タンパク質や、選択マーカー、エンハ
ンサー要素などを含みうる。
【０１０３】
プロモーターの活性化は、発光性分子と補助タンパク質をコードする遺伝子の
発現量を増大させる。プロモーターの活性化は、選択した生物適合体またはその
一部とプロモーター要素の相互作用によって達成される。活性化がその動物の一
部でのみ起こる場合は、その部分の細胞のみが発光性タンパク質を発現させるだ
ろう。
【０１０４】
例えばインターフェロン誘導性プロモーター（３’−５’ポリＡ合成酵素のプ
ロモーターなど）を用いることにより、多数の異なるＲＮＡウイルスによるトラ
ンスジェニック細胞の感染を検出できる。
【０１０５】
関連する側面として、ある種の疾患状態で発現するプロモーターを用いて、ト
ランスジェニック動物内の患部を標識し、発光成分の発現を用いて、その疾患状
態に対する処置の効果をモニターすることができる。例えば、Ｅ−セレクチンは
生体内の炎症部位に発現する（ＰｏｂｅｒおよびＣｏｔｒａｎ，１９９１，Ｌａ
ｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６４：３０１−３０５）。したがってＥ−セレクチンプロモ
ーターを単離し、それを用いてルシフェラーゼ遺伝子の発現を推進することがで
きる。
【０１０６】
組識特異性プロモーターと共に本発明の方法を使用することも可能である。こ
れは、例えば体内の特定の器官または組識の変性を引き起こす発病プロセスを阻
害するのに有効な化合物のスクリーニングを可能にし、また発育中の動物などに
おける細胞（例えばニューロン）の追跡を可能にする。
【０１０７】
当技術分野では、本発明で使用できるプロモーターが数多く知られている。ま
た、プロモーター含有ゲノムＤＮＡを単離するために、その遺伝子のｃＤＮＡか
ら得られる情報を用いて、クローン化された遺伝子のプロモーターを単離する方
法も知られている。
【０１０８】
（Ｖ．発光性複合体の撮像）
対象内の意図する部位に局在した発光性複合体は、いくつかの方法で撮像でき
る。そのような撮像の指針と具体例を以下に記述する。
【０１０９】
（Ａ．発光性複合体の局在）
”標的型（ｔａｒｇｅｔｅｄ）”物体、すなわちターゲッティング成分（物体
を対象または動物内の特定の一部位または複数部位に局在させるように設計され
た分子または特徴）を含有する物体の場合、局在とは、対象内で束縛された”局
在型”物体と束縛されていない”遊離型”物体の間の平衡が本質的に成立した状
態を指す。そのような平衡に到達する速度は投与経路に依存する。例えば血栓を
局在化するために静脈内注射によって投与された複合体は、注射後数分以内にそ
の血栓で局在または蓄積を達成するだろう。一方、腸内の感染を局在化するため
に経口投与された複合体は、局在を達成するのに数時間を要するだろう。
【０１１０】
また、局在という用語は、単に、物体を投与した後選択した時間におけるその
物体の対象または動物内での位置をさす場合もある。例えば、本明細書に詳述す
る実験では、サルモネラを（例えば経口的に）投与し、その蔓延を時間の関数と
して追跡する。この場合、その物体は、それが投与した細菌の最初の位置を標識
し、その後の蔓延または後退を撮像によって追跡できる限りは、経口投与後直ち
に”局在型”となりうる。
【０１１１】
関連する側面として、例えば発光成分を発現させる、注射された腫瘍細胞の局
在は、その動物内のある部位にそれらの細胞が定着し、腫瘍塊を形成することか
らなるだろう。
【０１１２】
もう１つの例として、局在は物体が投与後に分布した状態になった時に達成さ
れる。例えば、対象または動物じゅうの様々な器官における酸素濃度を測定する
ために投与された複合体の場合、その複合体は、それがその対象または動物内で
本質的に定常的分布状態に到達した時に、”局在型”あるいは有益となる。
【０１１３】
上述のいずれの場合にも、当業者は、局在を達成するための時間を適切に見積
もることができる。また、時間の関数としての局在の状態は、発光性複合体を本
発明の方法に従って撮像することにより、追跡することができる。
【０１１４】
（Ｂ．光検出装置）
本発明の重要な側面は、哺乳動物内からの微弱な光を妥当な時間で（好ましく
は約３０分以内に）撮像することができ、その装置からの信号を使って画像を構
築できるほど充分に感度の高い光検出装置の選択である。
【０１１５】
極めて明るい発光成分を使用できる場合および／または撮像する対象または動
物の表面近くに局在した発光性複合体を検出することが可能な場合は、”暗視”
ゴーグルや、シリコン増倍管（ＳＩＴ）カメラ（例えば浜松ホトニクスシステム
ズ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ）社，ニュージャ
ージー州ブリッジウォーター）などの一般的高感度ビデオカメラを使用できる。
しかし、より一般的には、もっと高感度な光検出法が必要である。
【０１１６】
本発明を実施する際に直面するような極めて低い光レベルでは、単位面積あた
りの光子束があまりに低くなるので、撮影対象がもはや連続的でないように見え
る。その代わりに、それは時間的にも空間的にも互いに独立した個々の光子によ
って表される。モニターで見ると、そのような画像は、それぞれが検出された単
一光子を表わす瞬く光の点のように見える。
【０１１７】
検出されたこれらの光子をデジタル画像処理装置で経時的に累積することによ
り、画像を獲得し、構築することができる。各画像点での信号に強度値を割り当
てる従来のカメラとは対照的に、光子カウント撮像法では、信号の強度は意味を
持たない。その目的は、単に信号（光子）の存在を検出し、その位置に関して信
号の発生数を経時的に計数することである。
【０１１８】
後述する少なくとも２種類の光検出装置により、個々の光子を検出し、画像処
理装置で分析できる信号を作成することができる。
【０１１９】
（１．ノイズ低減型光検出装置）
第１の種類は、光子信号の増幅とは対照的に、光子検出器内のバックグラウン
ドノイズを減少させることによって感度を得る装置である。ノイズは主として検
出器アレイを冷却することによって低減される。この装置には、”バック薄型”
冷却ＣＣＤカメラと呼ばれる電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラが含まれる。より高
感度な装置では、例えばＣＣＤアレイの温度を約−１２０℃まで下げる液体窒素
を用いて、冷却が行われる。”バック薄型”とは、光子が検出されるためにたど
る光路長を短くすることによって、量子効率を増大させる超薄型バックプレート
を指す。とりわけ高感度なバック薄型低温ＣＣＤカメラは、Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒ
ｉｃｓ社（アリゾナ州トゥーソン）から入手できるシリーズ２００カメラ”ＴＥ
ＣＨ ５１２”である。
【０１２０】
（２．光子増幅装置）
第２の種類の高感度光検出器には、光子が検出スクリーンに命中する前に光子
を増幅する装置が含まれる。この種類には、マイクロチャネル増倍装置のような
増倍装置を持つＣＣＤカメラが含まれる。マイクロチャネル増倍装置は通例、カ
メラの検出スクリーンに対して垂直かつ同延的なチャネルの金属アレイを含有す
る。マイクロチャネルアレイは撮像しようとする試料、対象または動物とカメラ
の間に設置される。このアレイのチャネルに侵入する光子の大半は、チャネルを
抜け出す前にチャネルの側面と接触する。アレイを横切ってかけられた電圧は、
各光子衝突から多くの電子を放出させる。このような衝突から生じた電子は、そ
れらが発生したチャネルから”散弾銃”式に抜け出して、カメラによって検出さ
れる。
【０１２１】
第１段階で生成した電子が、今度は第２段階で増幅された電子の信号をもたら
すように、増倍マイクロチャネルアレイを直列に設置すれば、さらに高感度を得
ることができる。しかし感度を増大させると、空間的解像度が犠牲になり、その
空間的解像度は増幅段階を追加するごとに低下する。
【０１２２】
マイクロチャネル増倍装置型の単一光子検出装置の典型例は、Ｈａｍａｍａｔ
ｓｕ社から入手できるＣ２４００シリーズである。
【０１２３】
（３．画像処理装置）
光子を計数する光検出装置によって生成した信号は、例えばモニターに表示し
たり、ビデオプリンターでプリントできる画像を構築するために、画像処理装置
で処理する必要がある。そのような画像処理装置は、通例、上述の高感度光子計
数カメラを含むシステムの一部として販売されており、したがって同じ供給者（
例えばＰｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ社やＨａｍａｍａｔｓｕ社）から入手できる。
他の業者から入手した画像処理装置も使用できるが、一般的には、機能的なシス
テムを構築するのに、より多くの努力が必要になる。
【０１２４】
画像処理装置は通常、ＩＢＭ互換ＰＣやアップルマッキントッシュ（Ａｐｐｌ
ｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ社，カリフォルニア州キューパーティーノ）のようなパー
ソナルコンピューターに接続する。このパーソナルコンピューターは購入した撮
像システムの一部として含まれている場合もあるし、含まれていない場合もある
。画像がデジタルファイルの形になったら、それを様々な画像処理プログラム（
例えばＡｄｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ社（カリフォルニア州マウンテンビュー）の
”ＡＤＯＢＥ ＰＨＯＴＯＳＨＯＰ”など）で操作し、印刷することができる。
【０１２５】
（Ｃ．装置の検出フィールドにおける対象の固定）
（１．装置の検出フィールド）
装置の検出フィールドとは、光子放射の一貫した測定値が得られる領域をいう
。光学レンズを使用するカメラの場合、検出フィールドとは、単に、そのレンズ
がそのカメラに与える視野である。また、光検出装置が”暗視”ゴーグルである
場合、検出フィールドとはそのゴーグルの視野である。
【０１２６】
また、検出フィールドは、密に充填されたアレイ状に配置した光ファイバーケ
ーブルの末端が規定する表面であってもよい。そのアレイは、ケーブルの末端が
カバーする領域（ケーブル間の空隙と相反する）が最大になるように構築され、
対象に極めて近接して設置される。例えば、プレクシグラスなどの透明素材を対
象に隣接して設置し、その透明素材に隣接して、対象とは反対側から、アレイを
固定することができる。
【０１２７】
アレイの反対側にある光ファイバーケーブルの末端は、マイクロチャネル増倍
装置の入力末端などの検出装置または増倍装置に直接接続することができ、そう
すればレンズの必要がなくなる。
【０１２８】
この方法の利点は、対照と検出器の間の空隙の大半を排除することにより、か
つ／または、レンズを排除することにより、光子の散乱および／または損失が減
少することにある。本発明の裏付けとして行なった実験で使用した６０ｍｍ Ａ
Ｆニッコールマクロレンズのような高透過性レンズでさえ、フロントレンズ要素
に到達する光の一部しか透過させない。
【０１２９】
より強度の強いＬＧＭの場合、光ダイオードアレイを光子放射の測定に使用で
きる。光ダイオードアレイを比較的柔軟なシートに組み込めば、実施者は、その
アレイを対象のまわりに部分的に”巻き付ける”ことができる。この方法も光子
の損失を最小限にし、さらに生物発光の三次元画像を得る手段にもなる。
【０１３０】
複数の検出器を対象の周囲に設置する方法や、走査型の検出器または検出器群
などを含む他の方法を使用して、三次元画像を作成してもよい。
【０１３１】
動物または対象の全体が光検出装置の検出フィールド内にある必要はないとい
うことは理解されるだろう。例えば対象の特定の領域に局在することがわかって
いる発光性複合体を測定する場合、所望の情報を得るには、その領域とその周囲
の十分な”暗”帯域からの光だけを測定すれば足りる。
【０１３２】
（２．対象の固定）
対象の２次元または３次元画像を作成したい場合、光子放射を測定している間
は、対象を光検出装置の検出フィールド内に固定しておく場合がある。約２０ミ
リ秒未満で測定した光子放射から画像を構築できるほどに信号が明るく、対象が
特に動揺していない場合は、測定期間の開始時に対象が検出装置のフィールド内
にあることを保証する以外に、特別な固定措置は必要ないだろう。
【０１３３】
これに対して、光子放射測定に約２０ｍｓｅｃ以上を要し、対象が動揺してい
る場合は、構築された画像に空間情報が保存されるように、その対象の動揺の程
度に合わせて、光子放射測定中、対象の不動を保証するための予防措置を考慮す
る必要がある。例えば対象が人で、光子放射測定時間が数秒程度の場合は、その
対象に光子放射測定（撮像）の間できるだけじっとしておいてくれるように頼む
だけでよいだろう。これに対し、対象がマウスのような動物である場合は、その
対象を例えば麻酔や機械的拘束具を用いて固定できる。
【０１３４】
様々な拘束具を作成することができる。例えば、プレクシグラスシートを発泡
材クッション上に固定して、マウスを数十秒ないし数分間固定するのに有効な拘
束具を作ることができる。そのクッションは、一端に、動物の頭部用のくぼみを
持つ。動物は、その頭部がくぼみの上になり、息は自由にできるが、その体の動
きは発泡材クッションによって束縛されるように、プレクシグラスの下に置かれ
る。
【０１３５】
対象または動物から放射され光の総量のみを測定したい場合は、光子放射測定
期間が長くても、その対象を固定する必要はない。必要なことは、撮像の間、対
象を光検出器の検出フィールドに閉じ込めておくことだけである。しかし、その
ような測定中、対象を固定しておけば、検出される光子が通過する組識の厚さが
動物間でより均一になるから、得られる結果の整合性が向上するであろうことは
理解されるだろう。
【０１３６】
（Ｄ．撮像中のその他の問題）
（１．蛍光発生成分）
蛍光発生成分の可視化には、光検出器と共に、励起光源が必要である。またそ
の励起光源が、発光成分からの光子放射を測定している間、点灯されることも理
解されるだろう。
【０１３７】
発蛍光団の適切な選択、光源の設置、およびフィルターの選択と設置は、すべ
て情報に富む画像の構築を容易にするが、これらについては蛍光発生成分に関す
る項で上述した通りである。
【０１３８】
（２．高解像度画像）
組識による光散乱は、総光子放射の測定によるＬＧＭの撮像で得ることができ
る解像度を制限する。本発明が、対象内の選択した点に集中させることができ、
しかも組織内で有意に散乱しない外部源に、ＬＧＭの発光を同期させることによ
って、解像度のより高い画像を構築できる態様をも包含することは、理解される
だろう。例えば、集束させた超音波信号を使って、撮像する対象を三次元的に走
査することができる。超音波の焦点内にある領域からの発光は、その超音波によ
って光に与えられた特徴的な振動により、他の光子放射から分離することができ
る（例えばＨｏｕｓｔｏｎおよびＭｏｅｒｎｅｒ，米国特許第４，６１４，１１
６号，１９８６年９月３０日発行）
（Ｅ．光子放射画像の構築）
発光成分が例外的に明るいため、かつ／または、発光性複合体が対象の表面近
くに局在するために、”暗視”ゴーグルまたは高感度ビデオカメラを使って画像
を得た場合は、単に画像を見るか、ビデオモニターに表示するだけである。所望
であれば、分析または印刷用に個々のビデオフレームをメモリーに保存でき、か
つ／または、コンピューターで分析と印刷用に画像をデジタル化できる画像処理
装置に、ビデオカメラからの信号を迂回させることができる。
【０１３９】
また、光子計数法を使用する場合は、光子放射の測定により、各ピクセル位置
で検出した光子の数を表わす数字の配列が、画像処理装置内に生成する。これら
の数字を用いて、通常は光子数を（一定の予め選択した値、またはいずれかのピ
クセルで検出された最大数に対して）規格化し、その規格化した数値を明るさ（
グレースケール） または色（擬似色）に変換して、それをモニターに表示する
ことにより、画像を作成する。擬似色表示の場合、典型的な色の割り当ては次の
通りである。ゼロ光子カウントのピクセルには黒色を、低いカウントには青色を
、カウントが増加するほど波長の長い色を割り当て、最高光子カウントには赤色
を割り当てる。モニター上の色の位置は光子放射の分布を表わし、したがって発
光性複合体の位置を表わす。
【０１４０】
複合体に対して準拠座標系を与えるために、通常は、光子放射を測定した（ま
だ固定されている）対象のグレースケール画像を構築する。このような画像は、
例えばかすかなルームライトのなかで撮像室または撮像箱に向かって扉をあけ、
反射した光子を（通例、光子放射を測定するのに要する時間のごく一部に相当す
る時間）測定することによって構築できる。このグレースケール像は、光子放射
を測定する前に構築してもよいし、光子放射を測定した後に構築してもよい。
【０１４１】
通例、光子放射の画像をグレースケール像に重ね合せることにより、対象に関
する光子放射の合成画像を作成する。
【０１４２】
例えば選択した生物適合成分の分布および／または局在に対するある処置の効
果を記録するために、発光性複合体の局在および／または発光性複合体からの信
号を経時的に追跡したい場合は、光子放射の測定または撮像を選択した時間間隔
で反復することにより、一連の画像を構築することができる。間隔は数分程度の
短いものであってもよいし、数日または数週間程度に長いものであってもよい。
【０１４３】
（ＶＩ．光子放射画像の分析）
本発明の方法および／または本発明の組成物を使用して作成した画像は、様々
な方法で分析できる。それは、単純な視覚的検査、頭脳評価および／またはハー
ドコピーの印刷から、複雑なデジタル画像分析まで様々である。分析によって得
られる情報の解釈は、観察する現象と使用した物体に依存する。
【０１４４】
下記の実験は本発明の応用例の一つ（生体ラットにおけるサルモネラ感染の追
跡）であり、本発明の方法で得られる画像を、どのように分析できるかを例示す
るものである。
【０１４５】
（ＶＩＩ．生体マウス内の発光性サルモネラの撮像）
本発明の裏付けとして行なった実験では、マウスにおけるネズミチフス菌（Ｓ
ａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）感染（ヒトチフスの動物モデル
）の分布を特徴づける。マウス病原性ネズミチフス菌ＳＬ１３４４（Ｈｏｉｓｅ
ｔｈおよびＳｔｏｃｋｅｒ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ ２９１：２３８−２３９
）、ＳＬ１３４４の非侵入性突然変異体ＢＪ６６、およびサルモネラの低病原性
ＬＴ−２株ＬＢ５０００を、それぞれｌｕｘオペロンを含有するプラスミドで標
識し、マウスにおけるサルモネラ感染を局在化する実験に使用した。
【０１４６】
（Ａ．発光性サルモネラの構築）
（１．サルモネラ株）
マウスに対する経口および腹腔内接種によって明らかになる病原性表現型が異
なる３株のネズミチフス菌を、形質転換のために選択した。
【０１４７】
ここで使用した最も病原性の高い表現型はＳＬ１３４４であり、これはもとも
と子牛の致死的感染症から得られたマウス株である（ＨｏｉｓｅｔｈおよびＳｔ
ｏｃｋｅｒ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ ２９１：２３８−２３９）。この株をマ
ウスに経口接種すると、細菌はリンパ系を通って全身に転移し、肝臓、脾臓およ
び骨髄のコロニー形成をもたらす（ＣａｒｔｅｒおよびＣｏｌｌｉｎｓ，１９７
４，Ｊ．Ｅｘｐｅｒ．Ｍｅｄ．１３９：１１８９−１２０３；Ｆｉｎｌａｙおよ
びＦａｌｋｏｗ，１９８９，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３：１８３３−１８
４１とＨｓｕ，１９８９，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５３：３９０−４０９
の総説をも参照のこと）。
【０１４８】
ＳＬ１３４４の非侵入性突然変異体ＢＪ６６も評価する。ＢＪ６６の経口接種
は通常、マウスにおける全身性感染を引き起こさないが、この株を腹腔内接種す
ると、全身性感染が起こる。
【０１４９】
サルモネラの低病原性ＬＴ−２株ＬＢ５０００も調べる。ＬＴ−２株は、マウ
スに対する病原性が減少しているまたは変動することが知られている研究室株で
ある。ＬＢ５０００は複数の栄養要求性突然変異を含有し、ストレプトマイシン
耐性であり、経口または腹腔内接種後、マウスから浄化される。
【０１５０】
（２．ｌｕｘオペロンによるサルモネラ株の形質転換）
上記３株のそれぞれを、ｌｕｘオペロンをコードするプラスミドで、実施例１
に詳述するように形質転換する。土壌菌Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅ
ｓｃｅｎｓ（Ｆｒａｃｋｍａｎら，１９９０）から得られたこのプラスミドは、
ヘテロ二量体ルシフェラーゼの２つのサブユニットと、３つの補助タンパク質ｌ
ｕｘＣ、ｌｕｘＤおよびｌｕｘＥの発現によって、大腸菌に光子を放射する能力
を与える。
【０１５１】
ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤおよびｌｕｘＥが含まれるので、そのルシフェラーゼ発現
細胞には、脂肪族アルデヒド基質ルシフェリンを与える必要がない。本明細書に
記述するような生体系内の真核ルシフェラーゼに基質を供給することは困難だろ
うから、Ｘ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓの全ｌｕｘオペロンを使用する。このオペ
ロンは、当該脂肪族アルデヒド基質を生合成するための酵素をもコードする。
【０１５２】
α−βヘテロ二量体混合機能オキシダーゼであるＸ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ
ルシフェラーゼは、還元型フラビンと長鎖アルデヒドの酸化型フラビンと対応す
る長鎖脂肪酸への酸化を触媒する。アルデヒドの脂肪酸からの生成と再生には、
脂肪酸レダクターゼ複合体が必要であり、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ： フラビンオキシド
レダクターゼが還元型フラビンを供給する。
【０１５３】
Ｘ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓのｌｕｘ遺伝子を発現させる大腸菌にとって最適
な生物発光条件は３７℃である（ＳｚｉｔｔｎｅｒおよびＭｅｉｇｈｅｎ，１９
９０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１６５８１−１６５８７，Ｘｉら，１
９９１，Ｊ．Ｂａｃｔ．１７３：１３９９−１４０５）。これに対し、真核発光
生物と他の原核発光生物に由来するルシフェラーゼ類は通例、より低い最適温度
条件を持つ（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，１９８８，Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃ
ｅ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（英国チチェスター：Ｅｌｌｉｓ Ｈｏｒ
ｗｏｏｄ社およびＶＣＨ出版社））。したがってＸ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ由
来のルシフェラーゼは、動物内での研究にマーカーとして使用するのに適してい
る。
【０１５４】
全Ｘ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ ｌｕｘオペロンを含有し、かつ、サルモネラ
にアンピシリン耐性とカルベニシリン耐性を付与するプラスミドｐＧＳＬ１（Ｆ
ｒａｃｋｍａｎら，１９９０）を用いて、上記３株をエレクトロポレーションに
よって形質転換する。このＸ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ ｌｕｘオペロンは、ｌ
ｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤおよびｌｕｘＥ遺伝子を含有する（Ｆｒ
ａｃｋｍａｎら，１９９０）。ｌｕｘＡとｌｕｘＢはヘテロ二量体ルシフェラー
ゼの２つのサブユニットをコードし、ｌｕｘＣとｌｕｘＤはルシフェラーゼ基質
の生合成酵素をコードし、ｌｕｘＥは調節遺伝子である。培養中の細胞に外から
ルシフェリンを供給したり、動物を基質で処置するのとは対照的に、基質生合成
用遺伝子の包含は、ルシフェラーゼに基質を提供する便利な手段である。
【０１５５】
（Ｂ．形質転換したサルモネラの試験管内での特徴づけ）
（１．付着性と侵入性）
上記ｌｕｘプラスミドを含有する３つのサルモネラ株の付着性と侵入性を、Ｆ
ｉｎｌａｙおよびＦａｌｋｏｗ，１９８９，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３：
１８３３−１８４１に記述されているような一般的な侵入アッセイ（実施例２に
詳述）により、培養中で互いに比較、またそれらの非発光性親株と比較する。
【０１５６】
このアッセイでは、上皮細胞系および腹腔マクロファージと共に培養した後、
付着細菌と細胞内細菌を定量する。付着細菌と細胞内細菌は、生きている細胞か
らの光子の放出と、溶解してその細胞溶解液をカルベニシリン含有プレートで培
養した後のコロニー形成単位との両者によって、検出、定量する。
【０１５７】
このアッセイの一部の結果を図２Ａ〜２Ｅに示し、実施例８で考察する。ｌｕ
ｘ発現プラスミドで形質転換した上記３株の表現型は、親サルモネラ株と比較し
て有意に変化しない。また、ＨＥｐ−２細胞とマクロファージからの生物発光の
強度とＣＦＵの間には良好な相関が認められる。これらの結果は、細胞内細菌の
指標としての発光が、培養内の細菌の侵入性をアッセイする迅速な方法であるこ
とを示している。
【０１５８】
ＢＪ６６のＨＥｐ−２に対する付着性はＳＬ１３４４と比較して低かったが、
マウス腹腔マクロファージの初代培養におけるこれら２株の付着性は同等だった
。
【０１５９】
（２．光放射）
系の酸素要求性を調べるため、実施例３に詳述するように、細菌の１０倍連続
希釈液をガラス製毛細管内に入れ、撮像する。
【０１６０】
図３に、そのような実験の一つで作成した画像を示す。発光は、空気飽和培地
中に少数の細菌を含む管でさえ、空気−液体界面でのみ検出される（５１中に０
．１ｍｌの空気飽和緩衝液で最終Ｏ２濃度は５ｎＭになる）。
【０１６１】
これらの結果から、酸素がおそらくは発光にとって制限因子であることは明ら
かである。
【０１６２】
（３．動物組識を貫通する光透過）
光が動物組識を貫通する程度を決定するために、発光性サルモネラから放射さ
れ組識を透過した光を、単一光子を検出するために高速同時検出器を切ったシン
チレーション計数器を用いて定量する。このタイプの光電子増倍管の暗電流によ
るバックグラウンドは有意であるので、このアッセイは、比較的強い光子放射を
伴う試料に限定される。
【０１６３】
透明度の異なる４タイプの組識：ヒヨコ胸部の筋肉、ヒヨコ胸部の皮膚、子ヒ
ツジの腎臓、および子ヒツジの腎臓から得た腎臓髄質、をこの方法で比較する。
組識を貫通して検出できる光子の数は、組識を通さない対照より約１０倍少ない
。
【０１６４】
（４．ｌｕｘサルモネラの生体内での特徴づけ）
（ａ．経口投与）
経口接種はマウスやヒトにとって自然なサルモネラ感染経路であり、より遅延
性の疾患進行をもたらす。この接種経路によるサルモネラ感染の進行を研究する
ために、２系統のマウスを３株のサルモネラに感染させる。耐性動物を用いて得
た結果については、下記”耐性マウスの感染”という見出しの項で議論する。
【０１６５】
実施例５に記述するように、Ｂａｌｂ／ｃマウスを病原性ＳＬ１３４４ｌｕｘ
、非侵入性ＢＬ６６ｌｕｘおよび低病原性ＬＢ５０００ｌｕｘサルモネラに経口
的に感染させる。その感染の進行を外部撮像法（”材料と方法”の項）によって
８日間にわたって追跡する。
【０１６６】
典型的な画像を図５Ａ〜Ｆに示す。接種後（ｐ．ｉ．）２４時間の時点で、生
物発光シグナルはすべての感染動物内で単一の病巣に局在する（図５Ａ、５Ｃお
よび５Ｅ）。接種後７日までには、低病原性ＬＢ５０００ｌｕｘに感染したすべ
ての動物で、生物発光が消える（図５Ｂ）。これに対し、病原性ＳＬ１３４４ｌ
ｕｘに感染した動物の場合、蔓延が始まる時点は動物ごとにかなり変動するもの
の、しばしば腹腔の大半に蔓延する激しい感染を示す（図５Ｆ）。ＢＪ６６ｌｕ
ｘによる感染は通例、持続し、単一の部位に局在したままとなる（図５Ｄ）。
【０１６７】
（ｂ．腹腔内接種）
サルモネラの複製部位にルシフェリンの酸化とそれに続く発光（Ｃａｍｐｂｅ
ｌｌ，１９８８，Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ
ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄ
ｉｃｉｎｅ（英国チチェスター：Ｅｌｌｉｓ Ｈｏｒｗｏｏｄ社およびＶＣＨ出
版社））に足るＯ２が存在するかどうかを評価するために、呼吸している動物の
組識からの光放射を測定する。発光性のＳＬ１３４４ｌｕｘとＬＢ５０００ｌｕ
ｘを２群のＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔内に接種する。接種後（ｐ．ｉ．）３２時
間の時点で、透過した光子を撮像する（図６）。
【０１６８】
ＳＬ１３４４ｌｕｘに感染したマウス（図の左側）では、透過した光子が大き
な表面上に確認され、様々な強度の焦点が見える。これらの画像は播種性感染を
示し、内臓（おそらくは肝臓と腸間膜リンパ節を含む）の広範なコロニー形成と
合致する。これに対し、ＬＢ５０００ｌｕｘに感染した動物からの透過光子の分
布は極めて制限されており、限定的感染を示す。
【０１６９】
ＬＢ５０００ｌｕｘ感染マウスは接種後数週間にわたって健康を維持したが、
ＳＬ１３４４ｌｕｘ感染マウスは接種後４日でほぼ瀕死状態になり、安楽死させ
た。
【０１７０】
これらの実験は、血中または組識中のＯ２レベルが、サルモネラから発現した
ｌｕｘルシフェラーゼの生物発光にとって十分であることを示している。また、
これらの実験は、病原性が減少した研究室株ＬＢ５０００と比較して病原性株Ｓ
Ｌ１３４４の侵入性が強いこととも合致している。
【０１７１】
（ｃ．耐性マウスの感染）
Ｉｔｙ遺伝子座がヘテロ接合性を示すマウス（Ｉｔｙ ｒ／ｓ）は、ネズミチ
フス菌による全身性感染症に対して耐性である（ＰｌａｎｔおよびＧｌｙｎｎ，
１９７６，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１３３：７２−７８）。Ｂｃｇ（Ｇｒｏ
ｓら，１９８１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７：２４１７−２４２１）またはＬ
ｓｈ（Ｂｒａｄｌｅｙ，１９７７，Ｃｌｉｎ．ａｎｄ Ｅｘｐｅｒ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．３０：１３０−１４０）とも呼ばれるこの遺伝子座は、鼡らい菌（Ｍｙｃ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅｍｕｒｉｕｍ；Ｆｏｒｇｅｔら，１９８１
，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：４２−４７）、ウシ結核菌（Ｍ．ｂｏ
ｖｉｓ；Ｓｋａｍｅｎｅら，１９８４，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．１９：１１７
−１２０，ＳｋａｍｅｎｅおよびＰｉｅｔｒａｎｇｅｌｉ，１９９１，Ｎａｔｕ
ｒｅ ２９７：５０６−５０９）およびバテー杆菌（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕ
ａｒｅ；Ｇｏｔｏら，１９８９，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ３０：２１８
−２２１）のようなある種の細胞内病原体の発病プロセスを調節する。細胞内病
原体に対する耐性と感受性の同様な遺伝子制御はヒトにも存在するようである（
ヒト結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｕｃｕｌｏｓｉｓ；Ｓｔｅａｄ，１９９２，Ａｎｎ
ａｌｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１１６：９３７−９４１，Ｓｔｅａｄら
，１９９０，Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２２：４２２−４２７）とらい菌
（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ））。
【０１７２】
Ｉｔｙ遺伝子座はマウスの第１染色体に２つの対立遺伝子型、Ｉｔｙｒ（耐性
、優性）とＩｔｙｓ（感受性、劣性）で存在する。Ｉｔｙ遺伝子座にコードされ
ている遺伝子は、マクロファージが内部移行した病原体を破壊する能力に影響を
与え（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌら，１９９１，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．３０：２
４１−２４８（１９９１）による総説がある；Ｓｋａｍｅｎｅら，１９８４，Ｉ
ｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．１９：１１７−１２０とＳｋａｍｅｎｅおよびＰｉｅｔ
ｒａｎｇｅｌｉ，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ ２９７：５０６−５０９をも参照の
こと）、それがマクロファージ媒介性とされる感染宿主内の他の部位への病原体
の輸送という下流の機能に影響を及ぼすようである。Ｂａｌｂ／ｃマウスはＩｔ
ｙｓ／ｓであり、１２９マウスはＩｔｙｒ／ｒである。ここに詳述する実験では
、ヘテロ接合性Ｂａｌｂ／ｃＸ１２９マウス（Ｉｔｙｒ／ｓ）を使用する。
【０１７３】
実施例７に詳述するように、耐性１２９ＸＢａｌｂ／ｃ（Ｉｔｙｒ／ｓ）生存
マウスを、１Ｘ１０７個のＳＬ１３４４ｌｕｘサルモネラの胃内接種によって感
染させる。そのマウスを注射後８日間（８ ｄ．ｐ．ｉ）にわたって毎日撮像す
る。
【０１７４】
図７Ａ（第１日）と図７Ｂ（第８日）に結果を示す。外部撮像法によって検出
される発光は接種後２４時間の時点で明白であり、全ての動物で単一の部位に局
在しているようであった。その発光シグナルは試験期間（接種後８日まで）中常
に存在する。発光の強度と発光源の位置は、一匹のマウス内で経時的にいくらか
変動し、またマウスごとにも変動しうる。いずれの感染動物でも発光組識は盲腸
であり（下記参照）、所在の変動性は（おそらくは強度の変動性も）齧歯類の内
部器官が正しい位置に強く固定されていないという事実によるのだろう。
【０１７５】
これらの動物で観察された明らかな限定的感染は、このＩｔｙ制限がマクロフ
ァージ輸送を遮断するという解釈を裏付けている。しかし１０日間というこの感
染の持続性は、腸粘膜に対する付着があることと、発光性の糞粒によって立証さ
れるように、これらの動物の糞内に細菌の脱離が長期間続くことを示唆している
。これらの結果は、生体内におけるこのサルモネラの発光性表現型が、Ｉｔｙ制
限動物中で８日間にわたって保たれることと、経口接種後の局在が可能であるこ
とを示している。
【０１７６】
（ｄ．経口接種後の内部撮像）
腹腔内の発光シグナルをさらに局在化するため、感染マウスを腹壁切開後に撮
像する（図８）。経口経路で感染させた動物のいずれにおいても、主な疾患症状
は盲腸の拡張である（図８Ａ〜Ｃ）。”外部”画像（図８Ａ）は限局的な発光を
示し、それは腹壁切開後の画像（図８Ｂ）で盲腸にあたることがわかる。
【０１７７】
腸内に空気を注入すると、消化路の他の領域における細菌の存在が確認される
。結腸と直腸内の細菌はルシフェラーゼを発現させているらしいが、それらの部
位からの発光は、低い酸素濃度によって制限されているらしい。
【０１７８】
経口接種試験で得た画像は、接種後２日および接種後７日の発光シグナルが、
ＬＢ５０００ｌｕｘに感染したマウスを除いて、ほとんど完全に各動物の盲腸に
局在することを示している（Ｐｏｐｅｓｋｏら，１９９０，Ａ Ｃｏｌｏｕｒ
Ａｌｔａｓ ｏｆ Ａｎａｔｏｍｙ ｏｆ Ｓｍａｌｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ａｎｉｍａｌｓ Ｖｏｌ．Ｔｗｏ：Ｒａｔ Ｍｏｕｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ（英
国ロンドン：Ｗｏｌｆｅ））。発光は数匹の結腸にも見える。接種後７日までに
、ＬＢ５０００ｌｕｘ感染動物内に発光は認められなくなる。これらのマウスの
器官中に存在するＣＦＵを接種後２日と５日に測定する。
【０１７９】
侵入性株ＳＬ１３４４ｌｕｘを胃内に感染させた動物では、盲腸内の発光が初
期に現われ、その後、全身性の感染が起こる。これに対し、非侵入性ＢＪ６６ｌ
ｕｘ株による感染は盲腸からの持続的な発光をもたらし、それが全試験期間（８
日間）にわたって維持される動物もある。接種後８日までに、腹部表面の大半に
発光が検出され、それはＳＬ１３４４ｌｕｘ感染マウスにおける腹腔内接種後の
光子の分布に似ている。
【０１８０】
ＳＬ１３４４ｌｕｘによる感染は、予想通り、光子を放射する表面積が増大し
、そこから放射される光子を累進的に増やしながら、全身性となるようである。
いずれの株による感染でも、発光は腹部上に局在し、この領域の外側からの発光
はほとんど検出されないようである。大量の透過光子が腹部上に単一の焦点とし
て局在し、このことは、たとえ感染が全身性であっても、複製の大半が腸を取り
巻く領域にあることを示唆している。
【０１８１】
盲腸上に発光が局在することは、腸のこの領域に大量の生物が存在することを
示すだけでなく、発光するに足る酸素が得られるように、サルモネラがその粘膜
の細胞に結合することをも示唆している。ルシフェラーゼからの光子の放射は酸
素依存性であり、盲腸または小腸の管腔内の予想酸素レベルは、発光に必要なレ
ベルより低い。ルシフェラーゼ反応は、細菌が腸上皮の細胞から酸素を得られな
い限り、腸内では機能しないと予想される。
【０１８２】
したがって全身性感染は侵入性表現型に関係し、腸の上皮細胞への単なる付着
とは関係しないと思われる。これらの実験は、盲腸がこの発病プロセスの保菌状
態で、あるいは播種部位として、何らかの役割を持つことを含意している。
【０１８３】
異なる組識への感染の進行をモニターすれば、発病プロセスにおけるこれらの
段階についての理解を著しく深めることができ、選択した段階でその病原体を抑
制するのに有効な化合物のスクリーニングが可能になるだろう。
【０１８４】
（ｅ．腹腔内接種後の内部撮像）
ＳＬ１３４４ｌｕｘを腹腔内に感染させたマウスを腹壁切開の前後に撮像する
（実施例９）。その結果を図９に示す。その画像は、腹部の大部分に、複数の透
過光子焦点を伴う発光を示す。盲腸は発光性サルモネラを含有しないようである
。これらの実験から得られた結果は、すべてのサルモネラ株が、感染の初期相で
発光するに足るＯ２を持つことを示している。しかし、その後の時点での全身性
感染はＳＬ１３４４ｌｕｘ感染マウスにのみ認められるので、サルモネラの粘膜
の細胞への侵入と、その後の全身性感染は、侵入性表現型を持つ株に限られるよ
うである。
【０１８５】
（ｆ．サルモネラ感染に対するシプロフロキサシンの影響）
非侵襲的撮像法が薬物に対する感染症の反応を追跡するのに有用であることを
示すために、実施例１０に詳述する実験を行なう。マウスにＳＬ１３４４ｌｕｘ
を経口接種し、サルモネラ感染症に有効な抗生物質シプロフロキサシン１００ｍ
ｇで処置する。処置後の選択した時期に、それらのマウスを撮像し、光子放射を
測定することによって感染の程度を定量する。処置マウス内の光子放射を、処置
開始前の値および感染したが処置していない対照マウスからの値と比較する。こ
のような実験の一つで得た結果を図１０Ａ〜Ｅに示し、実施例１０で考察する。
抗生物質で処置したマウスにおける感染症は、処置マウスにおける０時間での病
原体レベルおよび対照マウス内の病原体レベルと比較して、処置期間中常に低い
。
【０１８６】
（ｇ．カルベニシリン選択の効果）
Ｄｕｃｌｕｚｅａｕら，１９７０，Ｚｅｕｔ．Ｂａｋｔ．５３１３：５３３−
５４８は、抗生物質による動物の処置がサルモネラによる盲腸のコロニー形成を
促進することを示した。本実験におけるマウスは、ルシフェラーゼクローンを含
有するＡｍｐｒサルモネラを選択するために、カルベニシリンの筋肉内注射とい
う抗生物質措置をして維持される。この処置は、胃腸感染症の経過を変化させる
かもしれないが、サルモネラが盲腸を裏打ちする細胞と結合できるという観察結
果は、酸素を発光に利用できるということを示している。盲腸の管腔は一般に嫌
気環境であると考えられているから、この観察結果は注目に値する。
【０１８７】
（ＶＩＩＩ．応用）
生物発光技術は様々な宿主−病原体系に広く適用できると共に、例えば生きて
いる哺乳動物内での腫瘍の進行や遺伝子発現などに関する他の生物学的事象の時
間的空間的評価をも可能にするだろう。またこれは、医薬の開発とスクリーニン
グにも応用できる。病原体の生体内撮像を広範に使用すれば、病原および／また
はリアルタイム試験抗菌剤に関する実験に必要な動物数と時間を減らすことがで
きるだろう。また、発光性細菌は環境分析に使用されているが、生物発光性生物
は生きている動物内のバイオセンサーとして有用だろう。例えばＫｏｒｐｅｌａ
らは、胃腸路の管腔内では酸素供給が制限されているため、酸素が（おそらくは
上皮細胞または他の細胞タイプから）直接的にサルモネラに接近できる部位に、
生物発光が限定されたことを示している。Ｋｏｒｐｅｌａら，１９８９，Ｊ．Ｂ
ｉｏｌｕｍ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍ．４：５５１−５５４。この酸素要求性は、親密
な細胞−細胞相互作用の指標として、あるいは生きている動物中の様々な部位に
おける酸素濃度を調べるためのバイオセンサーとして利用できるだろう。以下、
この技術の典型的応用例を例示のためにいくつか記述するが、これらは決して本
発明の限定を意図するものではない。
【０１８８】
（Ａ．酸素レベルの測定）
上に要約した実験で明示されたようにルシフェラーゼの発光に酸素が必要であ
るということは、本発明を、対象内の酸素濃度の空間的勾配の測定法として利用
できるということを示している。１０〜１ｍＭの範囲の酸素レベルを測定するた
めに、発光性細菌が使用されている。これらの研究によれば、０．１ｎＭが検出
下限だと予想される（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，１９８８，Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓ
ｃｅｎｃｅ．Ｐｒｉｎｇｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ
Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（英国チチェスター：Ｅｌｌｉｓ
Ｈｏｒｗｏｏｄ社およびＶＣＨ出版社））。本明細書に記述する撮像法は、生
きている動物内の様々な部位における酸素レベルを調べるのに利用できる。例え
ばＯ２中で、またはＣａ２＋依存的に光を放射するように操作された微生物を、
ちょうど発光性細菌が環境分析に使用されるように（Ｇｕｚｚｏら，１９９２，
Ｔｏｘ．Ｌｅｔｔ．６４／６５：６８７−６９３；Ｋｏｒｐｅｌａら，１９８９
，Ｊ．Ｂｉｏｌｕｍ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍ．４：５５１−５５４；Ｊａｓｓｉｍら
，１９９０，Ｊ．Ｂｉｏｌｕｍ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍ．５：１１５−１２２）、対
象内のバイオセンサーとして使用することができるだろう。Ｏ２濃度に関する発
光のダイナミックレンジは、Ｏ２プローブよりはるかに広く、より低いＯ２濃度
に達する（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，１９８８，Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ
．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（英国チチェスター：Ｅｌｌｉｓ Ｈｏｒｗ
ｏｏｄ社およびＶＣＨ出版社））。さらに、Ｏ２濃度に比例する発光は、３０ｎ
Ｍから８ｍＭまでの範囲にわたって直線的であり、１／２最大発光には９ｍＭ
Ｏ２が必要である。
【０１８９】
（Ｂ．腫瘍細胞の局在）
対象内の腫瘍の増殖と転移的蔓延は、本発明の方法と組成物を用いてモニター
できる。特にその個体が原発腫瘍を持つと診断される場合は、その腫瘍の細胞に
対するＬＥＣを用いて、腫瘍の境界を明確にし、かつ、その原発腫瘍塊から細胞
が離れた部位に移動し、定着したかどうかを決定することができる。
【０１９０】
例えば、腫瘍抗原に対する抗体を含有しかつＬＧＭが添加されているリポソー
ムなどのＬＥＣを、対象に投与し、対象内の腫瘍細胞に結合させ、撮像し、その
光子放出の領域を腫瘍細胞の領域と相関させることができる。
【０１９１】
関連する側面として、上述のような腫瘍局在性ＬＥＣを使用した画像を、選択
した時間間隔で作成することにより、ある対象内で腫瘍の増殖、進行および転移
を経時的にモニターすることができる。このようなモニタリングは、抗腫瘍療法
の結果の記録に、あるいは腫瘍の増殖または転移を抑制するのに有用だと推定さ
れる治療用化合物のスクリーニングの一部として有用だろう。
【０１９２】
また、腫瘍細胞を恒常的に活性なプロモーターの制御下にあるルシフェラーゼ
構築物で形質転換し、それを使って、上述のように、動物モデル中に発光性腫瘍
を誘導することもできる。そのような動物モデルは、抗腫瘍化合物候補の効果を
評価するのに使用できる。
【０１９３】
（Ｃ．炎症の局在）
上述と同様の方法で、本発明の組成物と方法を使用することにより、炎症部位
を特定し、炎症を経時的にモニターし、かつ／または、抗炎症性化合物候補のス
クリーニングを行なうことができる。炎症部位に向かわせるのに有用な分子には
、セレクチンに結合するＥＬＡＮタンパク質ファミリーがある。ＥＬＡＮ分子を
本発明の物体上にターゲッティング成分として組み込み、それを使って、炎症部
位を標的にすることができる。
【０１９４】
また、Ｅ−セレクチンプロモーターの制御下にルシフェラーゼを持つよう遺伝
子組換えした動物を作出することにより、抗炎症性物質候補を研究するための動
物モデルを作出することができる。Ｅ−セレクチンは炎症部位に発現するので、
炎症部位にあるトランスジェニック細胞はルシフェラーゼを発現させるだろう。
【０１９５】
この系は、抗炎症性物質のスクリーニングに使用できる。炎症性剌激を対照動
物と実験動物に投与し、処置動物内で誘導される発光に対する抗炎症性化合物候
補の影響を対照動物と比較することにより、それら抗炎症性化合物候補の効果を
評価することができる。
【０１９６】
（Ｄ．感染の局在）
本発明を裏付けるために行なった上述の実験で例証されるように、ＬＧＣは、
病原体による対象の感染の経過を追跡するのに有効に利用できる。本明細書に詳
述する実験では、ＬＧＣは、ルシフェラーゼを発現させるように形質転換された
病原性細胞（サルモネラ）である。このような系は、感染とその後の感染の蔓延
をヒト疾患の動物モデルで研究するのに理想的である。このような系によれば、
病因の研究に熱や腫脹などの伝統的な全身症状ではなく感染部位と疾患の進行部
位を用いて、感染性疾患の進行をモニターすることができる。
【０１９７】
抗感染薬の効力をモニターするために外部撮像法を使用すれば、生きている個
々の動物中で時間的空間的評価を行なうことができ、それによって病原および／
または試験抗感染薬に関する実験に必要な動物の数を減らすことができる。
【０１９８】
以下、実施例により本発明を説明するが、これらは決して本発明の限定を意図
するものではない。
【０１９９】
（材料と方法）
（Ａ．細胞）
サルモネラ株ＳＬ１３４４とＬＢ５０００は Ｂ．Ａ．Ｄ．Ｓｔｏｃｋｅｒ（
スタンフォード大学；ＨｏｉｓｅｔｈおよびＳｔｏｃｋｅｒ，１９８１，Ｎａｔ
ｕｒｅ ２９１：２３８−２３９）から入手した。サルモネラ株ＢＪ６６はＢ．
Ｄ．Ｊｏｎｅｓ（スタンフォード大学）から入手した。
【０２００】
ＨＥｐ−２細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅ
ｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；メリーランド州ロックビル・パークローンドライブ１２
３０１；受託番号ＣＣＬ−２３）から入手した。
【０２０１】
マウス腹腔マクロファージは、安楽死させたＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔を７ｍ
ｌの生育培地で洗浄することによって得た（ＭａｘｉｍｏｗおよびＢｌｏｏｍ，
１９３１，Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ，Ｓａｕｎｄｅｒｓ，
フィラデルフィア）。
【０２０２】
（Ｂ．静置培養）
１００ｍｇ／ｍｌのカルベニシリンを含むＬＢブロス３ｍｌに、定常期培養か
ら得た細菌懸濁液６μｌを接種し、その細菌を７ｍｌの静置培養管中３７℃で終
夜生育することにより、低酸素（静置）培養を調製した。
【０２０３】
（Ｃ．マウス）
Ｂａｌｂ／ｃ（Ｉｔｙｓ／ｓ）マウスは、スタンフォード大学の腫瘍学科（ｔ
ｈｅ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）から入手した。１２９
ＸＢａｌｂ／ｃ（Ｉｔｙｒ／ｓ）マウスはスタンフォードトランスジェニック動
物施設（ｔｈｅ Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌ Ｆ
ａｃｉｌｉｔｙ；カリフォルニア州スタンフォード）から入手した。動物はすべ
て、光周期、給餌法および温度条件を同一にして、スタンフォード大学研究動物
施設（ｔｈｅ Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ａｎｉｍａｌ Ｆａｃｉｌｉｔｙ；カリフォルニア州スタンフォード）で飼育し
た。
【０２０４】
麻酔は動物の腹腔内に３３μｇ／ｋｇ−体重のネンブタールを注射することに
よって行った。
【０２０５】
安楽死は、スタンフォード大学研究動物施設が推奨するプロトコールに従って
、ＣＯ２による窒息または頚椎脱臼によって行った。頚椎脱臼は、窒息による生
理学的変化が実験結果に影響を与えるかもしれない場合に使用した。
【０２０６】
ｌｕｘ形質転換サルモネラに感染したマウスには、ｌｕｘオペロンを含有する
Ａｍｐｒプラスミドが保持されるような選択圧を発光性サルモネラに与え続ける
ために、カルベニシリンの筋肉内（ｉ．ｍ．）注射（体重１ｋｇあたり１２５ｍ
ｇ）を毎日施した。
【０２０７】
（Ｄ．撮像）
撮像すべき動物または対象を、２段階マイクロチャネル増感ヘッドを持つ電荷
結合素子（ＣＣＤ）カメラ（モデルＣ２４００−４０，Ｈａｍａｍａｔｓｕ社）
と扉とを持つ光を通さない箱の中に固定した。そのカメラを、箱の外へ通じるケ
ーブルを介して”ＡＲＧＵＳ５０”画像処理装置（Ｈａｍａｍａｔｓｕ社）に接
続した。
【０２０８】
上述のＩＣＣＤシステムは、いったん１０〜３０光子の域値に到達すれば、単
一光子を検出できる。このシステムの信号対雑音比は、信号強度に依存して２：
１から１Ｘ１０４：１までに及んだ。
【０２０９】
グレースケール画像は、かすかなルームライトの中でライトボックスの扉をあ
け、８〜６４フレーム間積分することによって得た。グレースケール画像のゲイ
ンは、その画像が最適となるように設定した（通例、０〜１０，０００ボルトの
スケールで３０００ボルト）。
【０２１０】
生物発光データは、外部照射の不在下に得た。露出設定は次の通りとした：黒
レベルはカメラ／画像処理装置によって自動的に設定、ゲインは増倍装置コント
ローラーで自動的に設定、Ｆストップは２．８に設定した。６０ｍｍ”ＡＦニッ
コール”マクロレンズを使用した（ニコン（Ｎｉｋｏｎ）社，ニューヨーク州メ
ルヴィル）。
【０２１１】
生物発光画像は、選択した時間（通例５分間）光子を積分することによって作
成した。データは、いずれの動物についても、１ピクセルあたり０〜３ビットの
最低ビットレンジ設定で表わす。生物発光シグナルの分解能を０〜３のビットレ
ンジにできなかった他の物体（すなわち２４ウェルプレート）の画像については
、レンジを生物発光シグナルの局在化が可能な設定（通例１〜７）に増やした。
５分間の撮像で付加的な情報が得られなかった場合は、物体をより短い時間で撮
像した。
【０２１２】
外部撮像とは、動物の非侵襲的撮像を指す。内部撮像とは、動物の部分的切開
（通例、腹壁切開）後の撮像を指す。内部撮像は、外部撮像で局在化した光子放
射の光源を確認するために、選択した動物で行なう。
【０２１３】
生物発光画像データは、検出された光子の強度を表わす擬似色発光画像として
表わす。通例、青色（低強度）から赤色（高強度）までの６つの強度レベルを使
用する。
【０２１４】
ここに掲載する図を作成するために、グレースケール画像と生物発光画像を画
像処理装置を使って重ね合せることにより、空間的準拠座標系を与える合成画像
を作成した。
【０２１５】
合成画像はＲＧＢ ＣＲＴ（赤、緑、青；ブラウン管）モニターに表示し、そ
のモニターを撮影してハードコピーを作った。また画像処理装置画像をデジタル
ファイルとして保存し、そのファイルをコンピューターに移し、それをそのコン
ピューターに接続したカラープリンターで印刷することによっても、ハードコピ
ーを作成した。別法として、ビデオプリンターを使用してビデオ信号を直接印刷
することにより、ハードコピーを作成してもよい。
【実施例】
【０２１６】
（実施例１）
（ｐＣＧＬＳ１ｌｕｘプラスミドによるサルモネラの形質転換）
サルモネラ株ＳＬ１３４４、ＢＪ６６およびＬＢ５０００を、Ｘｅｎｏｒｈａ
ｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ由来のｌｕｘオペロン（Ｆｒａｃｋｍａｎら
，１９９０）をコードするｐＵＣ１８系ベクターｐＣＧＬＳ１で形質転換した。
【０２１７】
（Ａ．ｐＣＧＬＳ１プラスミド）
ｐＣＧＬＳ１プラスミドの概略を図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃに示す。このプラス
ミドは、土壌菌Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ由来のｌｕｘ
遺伝子をコードする〜１１ｋｂ領域（図１Ａ；Ｆｒａｃｋｍａｎら，１９９０）
を、ｐＵＣ１８（図１Ｃ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社，カリフォルニア州パロアルト）
のＢａｍ ＨＩ部位（図１Ｂ）にクローニングすることによって構築した。この
べクターの構築はＦｒａｃｋｍａｎらの報文（１９９０）に記述されている。
【０２１８】
図１Ａ中の制限酵素部位は、次のように記載されている：Ｂｓ，Ｂｓｔ ＥＩ
Ｉ；Ｃ，Ｃｌａ Ｉ；Ｅ，Ｅｃｏ ＲＩ；Ｈ，Ｈｉｎｄ ＩＩＩ；Ｍ，Ｍｌｕ
Ｉ；Ｓ，Ｓｃａ Ｉ；Ｘ，Ｘｂａ Ｉ；Ｂ／Ｓａ，Ｂａｍ ＨＩおよびＳａｕ
３Ａ接合点。多重クローニング部位（ＭＣＳ）を含む配列を図１Ｂに記載し、そ
のＢａｍ ＨＩ部位を太字で示す。
【０２１９】
挿入物を含まないｐＵＣ１８ベクターの図解を図１Ｃに示す。印を付けた要素
には、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｐ）、ｌａｃ Ｚ遺伝子（ｌａｃ Ｚ）およ
び大腸菌の複製起点（Ｏｒｉ）が含まれる。非修飾ｐＵＣ１８ベクターのサイズ
は約２．７ｋｂである。
【０２２０】
（Ｂ．サルモネラの形質転換）
サルモネラ株Ｓｌ１３４４、ＢＪ６６およびＬＢ５０００のエレクトロコンピ
テント細胞を一般的な方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，第２巻）で作
成し、使用直前まで−８０℃で保存した。エレクトロポレーションは次のように
行なった。１μｌのプラスミド（０．２μｇ／ｍｌ）を、１０％グリセロールに
懸濁した４０μｌの氷冷エレクトロコンピテント細胞に加えた。その懸濁液を１
分間穏やかに混合し、間隙１ｍｍのエレクトロポレーションキュベットに入れ、
Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｇｅｎｅ−Ｐｌｕｓｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ社，カリフォルニア州ハーキュリーズ）を使って電気穿孔した。設定は
、２．５キロボルト、４００オームおよび２５マイクロファラドとした。
【０２２１】
ルリア−べルチーニ（ＬＢ）ブロス中３７℃で１時間攪拌培養した後、１００
μｇ／ｍｌカルベニシリンを含む（ＬＢ）寒天上に細胞をまき、終夜生育した。
【０２２２】
標識されたサルモネラの生物発光を最大にするため、ｌｕｘオペロンを高コピ
ー数プラスミド上に維持し、単一コピー遺伝子として組み込まれないようにした
。しかしプラスミドは、この研究で使用したＳＬ１３４４やＢＪ６６のようなｒ
ｅｃＡ株では特に、細菌細胞による修飾を受ける。ｒｅｃＡ遺伝子座は、ｌｕｘ
オペロンとβ−ラクタマーゼを含有するプラスミドの領域を欠失させうるリコン
ビナーゼをコードする。したがって培養細胞から回収したサルモネラをカルベニ
シリンの存在下と不在下の両方で平板培養し、生物発光が失われる頻度を決定す
るために撮像した。ゲンタマイシン処理し溶解したＨＥｐ−２細胞とマクロファ
ージから回収されるコロニーはすべて、アンピシリン耐性（Ａｍｐｒ）かつ生物
発光性だった。したがって、ｌｕｘ遺伝子は哺乳類細胞との同時培養中に失われ
ないようだった。
【０２２３】
コロニーを暗室での視認によって発光について検査した。５つの形質転換体が
高レベルの発光を持つと同定された。これらのうち３つ（ＳＬ１３４４、ＢＪ６
６およびＬＢ５０００株からそれぞれ１つ）を、以降の実験のために選択した。
それらをそれぞれＳＬ１３４４ｌｕｘ、ＢＪ６６ｌｕｘおよびＬＢ５０００ｌｕ
ｘと名づけた。
【０２２４】
（実施例２）
（通常のサルモネラおよび形質転換したサルモネラの侵入能力）
６株のサルモネラ（ＳＬ１３４４ｌｕｘ、ＬＢ５０００ｌｕｘ、ＢＪ６６ｌｕ
ｘ、ＳＬ１３４４、ＬＢ５０００およびＢＪ６６）の侵入能力を、２種類の細菌
付着および侵入アッセイで測定した。コロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイは、
基本的に既に記述されている方法（ＦｉｎｌａｙおよびＦａｌｋｏｗ，１９８９
，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３：１８３３−１８４１）に変更（Ｌｅｅら，
１９９０，ＰＮＡＳ ８７：４３０４−４３０８）を加えて行なった。生物発光
アッセイは、細胞の数をＣＦＵではなく生物発光を用いて定量する点以外は、基
本的にＣＦＵアッセイと同様に行なった。
【０２２５】
簡単に述べると、ＨＥ−ｐ細胞と初代マウス腹腔マクロファージを２４ウェル
組識培養皿に、２０ｍＭグルタミン（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ社）および５％ウシ胎
児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ社，ユタ州ローガン）を添加したＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ
／ＢＲＬ社，ニューヨーク州グランドアイランド）中、１Ｘ１０５細胞／ウェル
の濃度で接種した。細胞を接種した２４時間後（ＨＥｐ−２）または数日間後（
マクロファージ）に、静置培養からの細菌（上記”材料と方法”の項参照）を、
１ウェルあたり１Ｘ１０６個（感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ）１０）または１Ｘ１０
７個（ｍ．ｏ．ｉ＝１００，図２Ｂ〜Ｅの右側の柱）の密度で接種し、Ｂｅｃｋ
ｍａｎ臨床用遠心器（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社，メリーラン
ド州コロンビア）を用いて、１０００ｒｐｍ（１８５Ｘｇ）で５分間、細胞単層
上に遠心した。培地を、ゲンタマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ）を含む（侵入アッ
セイ）または含まない（付着アッセイ）ＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ社）
で置換した。その共存培養を５％ＣＯ２中３５℃で合計３．５時間培養した。
【０２２６】
培養培地中のゲンタマイシンはＨｅｐ−２細胞によって内部移行されなかった
細菌を、ＨＥｐ−２細胞の表面に付着しているものを含めて殺す。したがって、
付着アッセイ（ゲンタマイシンを含まない）でのシグナルが、付着細菌と内部移
行細菌の両方を表わすのに対し、侵入アッセイ（ゲンタマイシンを含む）でのシ
グナルは内部移行された細菌のみを表わす。
【０２２７】
付着と侵入を、３時点（接種の１．５時間後、３．０時間後および３．５時間
後）で発光性細菌細胞を撮像することによりアッセイした。第１時点での撮像に
先立って、付着していない細菌を除去するために細胞単層をリン酸緩衝食塩水（
ＰＢＳ）で３回洗浄し、新しいＲＰＭＩを加えた。発光は３０秒間の露光時間で
記録した。第２および第３時点での画像も同じ露光時間を用いて得たが、最初に
細胞を洗うことはしなかった。
【０２２８】
図２Ａは、最後の時点で記録したデータを、その培養皿ウェルのグレースケー
ル画像に重ね合せた擬似色発光画像として表示したものである。細胞タイプ、サ
ルモネラ株およびゲンタマイシンの用法を図中に示す。このデータを光子カウン
トの相対強度として図２Ｂと２Ｄのグラフにも要約する。
【０２２９】
３．５時間時点での撮像後、組識培養細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ中の
０．２％”トリトン Ｘ−１００”で溶解した。溶解によって放出された付着細
菌および／または細胞内細菌をＬＢ寒天プレートまたはＬＢ−カルベニシリン寒
天プレートにまき、３５℃で１８時間培養した。各ウェルから放出された細菌の
数を、コロニー形成単位（ＣＦＵ，ＦｉｎｌａｙおよびＦａｌｋｏｗ，１９８９
，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３：１８３３−１８４１；Ｌｅｅら，１９９０
，ＰＮＡＳ ８７：４３０４−４３０９）の数を数えることによって決定した。
これらのデータを、ゲンタマイシンと共にまたはゲンタマイシンなしで３．５時
間培養した後の共存培養から回収された１ｍｌあたりの総細菌コロニーとして表
わし、図２Ｃおよび２Ｅのグラフに要約する。
【０２３０】
生物発光アッセイとＣＦＵアッセイの両方から得られたデータは、（ｉ）ｌｕ
ｘ遺伝子で形質転換されたサルモネラが親系と類似する感染力を持つことと、（
ｉｉ）発光検出とＣＦＵ決定がＨＥｐ−２細胞とマクロファージにおける２つの
サルモネラ株の侵入力について同等な推定値を与えることを示している。ＣＦＵ
に対する生物発光の比率はマクロファージ培養の方が低く、これはおそらくサル
モネラがマクロファージの細胞下区画に侵入するためだろう。
【０２３１】
（実施例３）
（形質転換したサルモネラの試験管内発光）
ＬＢ５０００ｌｕｘサルモネラの４つの１０倍連続希釈液１０μｌ（１ｍｌあ
たり１０６細胞から１０３細胞まで）を４本の１００μｌガラス製毛細管（Ｂｅ
ｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社のＣａｌｙ−Ａｄａｍｓ事業部，ニュージャー
ジー州パーシッパニー）に入れた。その細菌懸濁液は、毛細管中で両端に空気の
ポケットを持つ液体の柱を形成した。各毛細管の一端をクリトシール（ｃｒｉｔ
ｏｓｅａｌ；Ｃｌａｙ−Ａｄａｍｓ社）で密封した。希釈液の作成に使用した培
地は、空気に曝すことによりＯ２で飽和させた。
【０２３２】
その毛細管を透明なプラスチック製のラップで包み、上述のように３０秒間撮
像することにより、発光を測定した。典型的な画像を図３Ａに示す。４本の毛細
管を示す。これらは（上から下へ）１０６、１０５、１０４および１０３サルモ
ネラ細胞／ｍｌ（１０４、１０３、１０２および１０細胞／管）を含む。発光は
、１０４細胞／ｍｌ（１００細胞）しか含まない懸濁液でも検出できた。しかし
その発光は空気／液体界面に限定され、この発光反応が比較的高レベルの酸素を
必要とすることが示唆される。細胞の多くはおそらく液体柱の中にあり、空気／
液体界面にはないだろうから、このデータは、図３Ａに示す毛細管中の発光が、
各管中の総細胞数よりかなり少ない細胞から生じることを示唆している。
【０２３３】
（実施例４）
（動物組識を貫通する発光の試験管内検出）
ＬＢ５０００ｌｕｘサルモネラの連続希釈液を含む内径３．５ｍｍのガラス製
毛細管で構成された微量試験管を、基本的に上記実施例３に記述したように調製
した。ただし、本実施例では細菌懸濁液を毛細管の密封した末端に接触させ、上
端のみを空気にさらした。その管を半透明のプラスチック製シンチレーションバ
イアルに入れ、次に挙げる動物組識の一つでそのまわりを囲んだ：ヒヨコ胸筋、
ヒヨコ皮膚、子ヒツジ腎臓または子ヒツジ腎臓髄質。いずれの組識も地元のスー
パーマーケット（Ｓａｆｅｗａｙ社，カリフォルニア州マウンテンヴュー）の食
肉部門から入手した。
【０２３４】
組識で囲まれた毛細管を含むバイアルの図を図４に示す。バイアル１は直径約
１．４ｃｍで、蓋２を含む。そのバイアルをその上部分３に沿って、不透明な素
材（すなわち黒テープ）で覆う。動物組識４を、バイアルの底から不透明被覆３
の下端のすぐ上までになるよう、バイアルに入れる。微量試験管５の底を栓７（
すなわちクリトシール（ｃｒｙｔｏｓｅａｌ）栓）で密封し、それをバイアルの
中心に、栓をした末端がバイアルの底に接触するか、きわめて接近するように置
く。細菌懸濁液６は毛細管の底から上方約１ｃｍに達する。
【０２３５】
組識を含むバイアルと組識を含まないバイアルおよび細菌を含むバイアルと細
菌を含まないバイアルから放射された光子を、高速同時弁別器を無効にした液体
シンチレーションカウンター（モデル１２１９ Ｒａｃｋｂｅｔａ，ＬＫＢ／Ｗ
ａｌｌａｃ社，メリーランド州ゲーサーズバーグ）でカウントした。
【０２３６】
組識を含まない対照は、細菌懸濁液をシンチレーションバイアルに直接入れて
アッセイした。いずれの実験も３回ずつ行なった。
【０２３７】
各実験では、各カウントごとにバイアルを９０℃回転させて、バイアルを２、
３回カウントすることにより、考えうる組識の厚さの不一致の影響について検証
した。有意差は検出されなかった。
【０２３８】
その結果を下記表１に要約する。
【０２３９】
【表１】
【０２４０】
腎臓組識内の１Ｘ１０３個のＬＢ５０００ｌｕｘについてのシグナルは、シン
チレーションカウンター中の光電子増倍管（ＰＭＴ）でバックグランドレベルか
、それに近かった。このタイプの検出におけるバックグラウンドはＰＭＴの暗電
流によるものであり、この試験はかなり強いシグナルの分析に限定される。
【０２４１】
約１Ｘ１０７個のＬＢ５０００ｌｕｘからの生物発光は、０．５ｃｍの鳥類筋
肉、皮膚、ヒツジ腎臓髄質およびヒツジ腎臓を通して検出できた。これらの結果
は、標識したサルモネラからの生物発光が様々な不透明度の動物組識を通して検
出できることを示している。（図３Ａで示したように）毛細管内では酸素が制限
されていたと思われるので、このアッセイで表示している数よりも少ない数の生
物発光性サルモネラが、組識を通して検出できると考えられる。
【０２４２】
（実施例５）
（生物発光性サルモネラの生体内検出）
感染中のサルモネラに対する酸素の利用性を評価するために、野生型ＳＬ１３
４４ ｌｕｘをＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内（ｉ．ｐ．）に接種した。接種の２
４時間後、麻酔したラットで、細菌によって内部に放出され腹壁を透過した光子
を、増倍化ＣＣＤカメラで外部から検出し、局在化した（図３Ｂ）。全身性サル
モネラ感染には、リンパ節、脾臓、肝臓のコロニー形成が関与すると思われる。
野生型ＳＬ１３４４ ｌｕｘの腹腔内接種によって感染させたマウスの腹部画像
は、腹部表面のほとんどに透過光子が様々な強度の焦点を作っていることを示し
た（図３Ｂ）。これらの結果は、おそらくは肝臓と腸間膜リンパ節を含む内臓の
広範なコロニー形成と合致し、利用可能な酸素のレベルはいくつかの組識で標識
病原体からの発光を外部から検出するのに十分でありうることを示している。
【０２４３】
（実施例６）
（Ｂａｌｂ／ｃマウスに経口投与したｌｕｘサルモネラの検出）
病原性ＳＬ１３４４ｌｕｘ、非侵入性ＢＪ６６ｌｕｘおよび低病原性ＬＢ５０
００ｌｕｘサルモネラ１Ｘ１０７個の懸濁液５０μｌを経口的に与えることによ
って、Ｂａｌｂ／ｃマウスを感染させた。感染時に４〜６週齢だったそれらのマ
ウスを、５分間の積分時間で毎日撮像した（光子放射を５分間測定した）。撮像
に先立って、マウスを３３μｇ／ｋｇ−体重のネンブタールで麻酔した。
【０２４４】
典型的な画像を図５Ａ〜Ｆに示す。接種後（ｐ．ｉ．）２４時間の時点で、生
物発光シグナルはいずれの感染動物でも単一の焦点に局在した（図５Ａ、５Ｃお
よび５Ｅ）。生物発光は、低病原性ＬＢ５０００ｌｕｘに感染したすべての動物
で、接種後７日までに消失した（図５Ｂ）。野生型ＳＬ１３４４ ｌｕｘに感染
したＢＡＬＢ／ｃマウスでは、生物発光が試験期間中常に検出され、第８日では
透過光子の焦点が複数認められた。これらの動物では、感染がしばしば腹腔のほ
とんどに広がった（図５Ｆ）。これらの動物の３分の１では、第８日に透過光子
が腹部領域の大半で認められ、それは腹腔内接種後の光子の分布と似ていた（図
３Ｂと５Ｆを参照のこと）。ＢＪ６６ ｌｕｘによる感染の蔓延はかなり変動的
だったが、通例、その感染は持続し、最初の部位に局在したままだった（図５Ｄ
）。
【０２４５】
耐性ＢＡＬＢ／ｃＸ１２９マウスを野生型ＳＬ１３４４ ｌｕｘに感染させた
ところ、１０匹のマウス群で、その生物発光シグナルはその試験期間中常に局在
し、持続性を保っていた。この結果は、ＳＬ１３４４ ｌｕｘに感染した感受性
マウス（ｌｙｔｒ／ｓ）に観察された播種性生物発光とは対照的であった（実施
例８と図７Ａおよび７Ｂを参照のこと）が、侵入性の低いＢＪ６６ ｌｕｘによ
る感受性ＢＡＬＢ／ｃマウスの持続性感染とは似ていた。対照として、持続的に
感染した耐性ＢＡＬＢ／ｃＸ１２９マウスから得たサルモネラを培養したところ
、８日後に回収したコロニーの８０〜９０％はＡｍｐｒだった。これらのうち９
０％以上は生物発光性であり、観察された相違がｌｕｘプラスミドの有意な減少
によるのではなく、むしろ細菌株の病原性が真に相違するためであることが示唆
された。
【０２４６】
（実施例７）
（サルモネラの病原性株および低病原性株の腹腔内接種後の感染の検出）
１００μｌ懸濁液中の１Ｘ１０７細菌細胞を同時に空気を注入することなく腹
腔内（ｉ．ｐ．）接種することによって、Ｂａｌｂ／ｃマウスを病原性（ＳＬ１
３４４ｌｕｘ）または低病原性（ＬＢ５０００ｌｕｘ）サルモネラに感染させた
。
【０２４７】
接種後（ｐ．ｉ．）３２時間の時点で、上述のようにマウスを麻酔し、撮像し
た。その結果を図６に示す。この図の左側の２匹のマウス（病原性ＳＬ１３４４
ｌｕｘに感染）では広範な感染が明らかである。これに対して、低病原性ＬＢ５
０００ｌｕｘ株を注射した右側のマウスでは、発光はあったとしてもほとんど検
出されない。
【０２４８】
（実施例８）
（サルモネラ経口接種後の耐性マウスにおける全身性感染の検出）
耐性１２９ＸＢａｌｂ／ｃ（Ｉｔｙｒ／ｓ）生存マウスを、１Ｘ１０７個のＳ
Ｌ１３４４ｌｕｘサルモネラの胃内接種によって感染させた。細菌は麻酔下に胃
内給餌チューブを通して与えた。注入後８日間（８ ｄ．ｐ．ｉ）、動物を毎日
撮像した。
【０２４９】
結果を図７Ａと７Ｂに示す。一組３匹のマウスを感染させ、８日間毎日撮像し
た。第１日の典型的画像（図７Ａ）と第８日の典型的画像（図７Ｂ）を示す。こ
れらのデータは、全身性サルモネラ感染症に対して耐性なマウスは盲腸に局在し
た慢性感染症を持つが、その感染は腹腔内に蔓延しないことを示している。
【０２５０】
（実施例９）
（サルモネラ経口接種後の腹壁切開後撮像）
腹腔内の発光シグナルの位置を正確に特定し、その位置を非侵襲的撮像法で得
たものと比較するために、サルモネラの経口接種後に腹壁切開を行なった。実施
例８に記述したように、動物に接種した。選択した期間（通例７日）の後、上述
のようにマウスを麻酔し、外部から撮像した。典型的画像を図８Ａに示す。外部
撮像の後、腹腔を開き、図８Ｂに例示するように動物を再び撮像した。場合によ
り、盲腸（Ｃ）の前後の腸管腔に空気を注入してから、３回目の撮像を行なった
（図８Ｃ）。最後の撮像後、直ちにマウスを安楽死させた。
【０２５１】
経口接種後の感染初期に感受性マウス中で生物発光が限局的に観察された場合
はいずれも、光子はほとんどもっぱら盲腸から生じており、限局的生物発光の正
確な局在と強度の変動は、盲腸の位置が変動しやすいためであった。感染耐性Ｂ
ＡＬＢ／ｃＸ１２９マウスに観察された限局的な生物発光も、同様に盲腸に局在
した。これに対して、ＳＬ１３４４ ｌｕｘに腹腔内感染させた動物では、その
ような局在が観察されなかった（図３Ｂ）。野生型ＳＬ１３４４ ｌｕｘを経口
接種した感染感受性マウスの後期では、生物発光が多極性であったが、追加され
た発光の焦点は腹壁切開後に明白にならなかった。病原性の低いＬＢ５０００
ｌｕｘに感染したマウスでは、第７日の時点で、生物発光が、いずれの組識また
は器官にも、皮膚および腹壁の除去後、限局的にさえ、検出できなかった。
【０２５２】
どの感染動物の脾臓または血流にも、生物発光は光学的に検出されなかった。
肝臓からの生物発光は疾患後期にのみ認められた。また、胃腸路からの生物発光
は疾患の初期には盲腸に限られた。このパターンは、異なる組識におけるサルモ
ネラの数の相違もしくは利用できる酸素の欠如によるのだろう。経口感染したマ
ウスの破砕した器官中に存在するＡｍｐｒ ｃｆｕを定量することにより、標識
サルモネラＳＬ１３４４ ｌｕｘの分布を調べた。第７日にＳＬ１３４４ ｌｕ
ｘ感染ＢＡＬＢ／ｃマウスの肝臓、脾臓および肺から得たａｍｐｒ細菌コロニー
は、いずれも、その９０％以上が１．９Ｘ１０３〜＞１．０Ｘ１０５の範囲の総
ｃｆｕを示し、生体内では検出可能な光子放射を伴わなかった（表２）。これに
対して、盲腸からの生物発光は検出可能であり、この組識は＞１．０Ｘ１０８の
総ｃｆｕを含有した。ＬＢ５０００ ｌｕｘ感染マウスでは、どの組識にもｃｆ
ｕが検出されなかった。これらの結果は、現在の実験系を使用した場合、組識中
１Ｘ１０６生物がほぼこの放射波長での検出限界であることを示唆している。
【０２５３】
酸素はルシフェラーゼ反応に必須の基質であるから、酸素化された微小環境中
に存在するサルモネラだけが生物発光するはずである。したがって、胃腸路の管
腔の嫌気環境にサルモネラからの生物発光がないことは予想できることであり、
腸管腔を空気にさらせば、それまでは酸素がないために検出できなかった細菌の
存在が明らかになるはずである。この見解の裏付けとして、盲腸だけに検出可能
な生物発光を持つ一匹の動物が、空気にさらされたときに迅速に生物発光性にな
る糞粒を排泄した。腸管腔内に非発光性のルシフェラーゼ発現細菌が存在するこ
とを示すこの事実と、この組織内の好気地帯と嫌気地帯の明確な描写から、腸管
腔に空気を注入すれば、さらなる細菌の存在が明らかになるであろうことが示唆
された。同様の生物発光パターンを示す別の動物の回腸と結腸の管腔に空気を注
入したところ、注射部位近くで光子が検出可能になった（図８）。最後に、盲腸
生物発光をＡ示す第３のマウスを殺すと、生物発光は迅速に消滅した。明確な好
気環境地帯と嫌気環境地帯を欠くため、他の組識部位に空気を注射した。
【０２５４】
【表２】
【０２５５】
（実施例１０）
（サルモネラ腹腔内接種後の腹壁切開後撮像）
実施例７に記述したように、１Ｘ１０７個のサルモネラ（ＳＬ１３４４ｌｕｘ
）を腹腔内接種することにより、Ｂａｌｂ／ｃマウスを感染させた。そのような
一匹の典型的画像を図９Ａ、９Ｂおよび９Ｃに示す。
【０２５６】
注射後（ｐ．ｉ）２４時間の時点で、動物を麻酔し、５分間撮像した（図９Ａ
）。腹腔を開き、そのマウスを再び５分間撮像した（図９Ｂ）。盲腸を左側に引
き寄せ、その動物を再び５分間撮像した（図９Ａ）。
【０２５７】
その結果から、非侵襲的撮像法で得られた感染部位の局在は、腹腔を開いて明
らかになった部位とよく相関することがわかる。
【０２５８】
（実施例１１）
（ＳＬ１３４４ｌｕｘサルモネラからの生物発光に対するシプロフロキサシン
の影響）
生体内撮像法の有用性を立証するために、感染した動物を、全身性サルモネラ
感染症に有効であることが知られている抗生物質シプロフロキサシンで処置した
。Ｍａｇａｌｉａｎｅｓら，１９９３，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎ
ｔｓ Ｃｈｅｍｏ．３７：２２９３。
【０２５９】
Ｂａｌｂｃマウスの実験群と対照群にＳＬ１３４４ｌｕｘを経口接種した。接
種の８日後に、実験群のマウスに１００ｍｇのシプロフロキサシン塩酸塩（３ｍ
ｇ／ｋｇ−体重；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社，ミズーリ州セントルイス）
を腹腔内注射した。実験群の処置後、両群の動物を、処置後５．５時間にわたっ
て数回（上述のように）撮像した。
【０２６０】
典型的画像を図１０Ｂ〜Ｅに示す。図１０Ｂと１０Ｄは、それぞれ実験群の処
置を開始する直前の対照群と処置群を代表する動物の合成画像である。図１０Ｃ
と１０Ｅは、処置の開始後５．５時間の同じ動物の合成画像である。対照の生物
発光が７．５倍まで増大したのに対して、シプロフロキサシン処置動物の腹部上
の生物発光はこの期間中に検出不能なレベルにまで減少した。腹部領域上に検出
される光子の総数を決定し、ｔ＝０での値に対して規格化し、処置後の時間に関
して図１０Ａにプロットした。
【０２６１】
このデータは、本発明の方法と組成物を、生体内感染の蔓延に対する薬物の効
果の評価に使用できることを示している。
【０２６２】
特定の方法と態様に関して本発明を説明したが、本発明から逸脱することなく
様々な変更や改変を施しうることは理解されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【０２６３】
【図１】図１は、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ＳＬ１３４４株、ＢＪ６６株およびＬＢ５０００株を形質転換してＳＬ１３４４ｌｕｘ株、ＢＪ６６ｌｕｘ株およびＬＢ５０００ｌｕｘ株を作出するために使用したｌｕｘ ｐＣＧＬＳ１プラスミドのマップである。
【図２Ａ】図２Ａは、サルモネラＳＬ１３４４ｌｕｘ株とＢＪ６６ｌｕｘ株によるマクロファージとＨＥｐ−２細胞の接着および侵入を測定したアッセイの結果を示す。図２Ａは、アッセイ皿のウェル内で局在化した発光性細菌細胞を示す。光子を１分間にわたって積分することによって得た擬似色像を、アッセイ皿のグレースケール像に重ね合せることにより、表記の”合成画像”を作成した。
【図２Ｂ】図２Ｂは、サルモネラＳＬ１３４４ｌｕｘ株とＢＪ６６ｌｕｘ株によるマクロファージとＨＥｐ−２細胞の接着および侵入を測定したアッセイの結果を示す。図２Ｂは、ゲンタマイシンで処理しなかったウェルの相対光強度を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、サルモネラＳＬ１３４４ｌｕｘ株とＢＪ６６ｌｕｘ株によるマクロファージとＨＥｐ−２細胞の接着および侵入を測定したアッセイの結果を示す。図２Ｃは、図２Ｂで撮像したウェルと同じウェルから単離された１ｍｌあたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数を示す。
【図２Ｄ】図２Ｄは、サルモネラＳＬ１３４４ｌｕｘ株とＢＪ６６ｌｕｘ株によるマクロファージとＨＥｐ−２細胞の接着および侵入を測定したアッセイの結果を示す。図２Ｄは、ゲンタマイシンで処理したウェルの相対光強度を示す。
【図２Ｅ】図２Ｅは、サルモネラＳＬ１３４４ｌｕｘ株とＢＪ６６ｌｕｘ株によるマクロファージとＨＥｐ−２細胞の接着および侵入を測定したアッセイの結果を示す。図２Ｅは、図２Ｄで撮像したウェルと同じウェルから単離された１ｍｌあたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、ＬＢ５０００ｌｕｘ細菌懸濁液の希釈液を含有する４つのガラス製毛細管の合成画像である。発光は３０秒間の積分によって測定した。各毛細管内の懸濁液の両側には空気ポケットが存在する。
【図３Ｂ】図３Ｂは、マウスの腹腔内に野生型ＳＬ１３４４ｌｕｘを接種した後の生物発光の分布を表わす。
【図４】図４は、ＬＢ５０００ｌｕｘが生成した光の透過を、動物組識越しに調べるために使用したバイアルの概略図である。
【図５Ａ】図５Ａは、低病原性ＬＢ５０００ｌｕｘサルモネラを経口接種し、図に表示した時間に撮像したＢａｌｂ／ｃマウスの合成画像である。発光シグナルを５分間積分した。
【図５Ｂ】図５Ｂは、低病原性ＬＢ５０００ｌｕｘサルモネラを経口接種し、図に表示した時間に撮像したＢａｌｂ／ｃマウスの合成画像である。発光シグナルを５分間積分した。
【図５Ｃ】図５Ｃは、非侵入性ＢＪ６６ｌｕｘサルモネラを経口接種し、図に表示した時間に撮像したＢａｌｂ／ｃマウスの合成画像である。発光シグナルを５分間積分した。
【図５Ｄ】図５Ｄは、非侵入性ＢＪ６６ｌｕｘサルモネラを経口接種し、図に表示した時間に撮像したＢａｌｂ／ｃマウスの合成画像である。発光シグナルを５分間積分した。
【図５Ｅ】図５Ｅは、病原性ＳＬ１３４４ｌｕｘサルモネラを経口接種し、図に表示した時間に撮像したＢａｌｂ／ｃマウスの合成画像である。発光シグナルを５分間積分した。
【図５Ｆ】図５Ｆは、病原性ＳＬ１３４４ｌｕｘサルモネラを経口接種し、図に表示した時間に撮像したＢａｌｂ／ｃマウスの合成画像である。発光シグナルを５分間積分した。
【図６】図６は、病原性ＳＬ１３４４ｌｕｘ細菌株（左の２匹）または低病原性ＳＬ５０００ｌｕｘ細菌株（右の２匹）を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した３２時間後のマウスにおけるサルモネラの分布を示す合成画像である。
【図７】図７Ａと７Ｂは、全身性サルモネラ感染症に対して耐性なマウス（１２９ＸＢａｌｂ／ｃ，Ｉｔｙｒ／ｓ）における病原性サルモネラの分布を示す。図７Ａは第１日、図７Ｂは第８日である。
【図８Ａ】図８Ａは、病原性が減少したサルモネラ突然変異体（ＢＪ６６ｌｕｘ）の経口接種７日後の分布を示す。図８Ａは発光の外部非侵襲的撮像を示す。記号を付した器官は、Ｃ−盲腸、Ｌ−肝臓、Ｉ−小腸、Ｓｐ−脾臓である。
【図８Ｂ】図８Ｂは、病原性が減少したサルモネラ突然変異体（ＢＪ６６ｌｕｘ）の経口接種７日後の分布を示す。図８Ｂは図８Ａと同じ動物を腹壁切開後に撮像したものである。記号を付した器官は、Ｃ−盲腸、Ｌ−肝臓、Ｉ−小腸、Ｓｐ−脾臓である。
【図８Ｃ】図８Ｃは、病原性が減少したサルモネラ突然変異体（ＢＪ６６ｌｕｘ）の経口接種７日後の分布を示す。記号を付した器官は、Ｃ−盲腸、Ｌ−肝臓、Ｉ−小腸、Ｓｐ−脾臓である。図８Ｃは、盲腸の前方と後方の腸管腔内に空気を注入した後に作成した腹壁切開後の画像を示す。
【図９Ａ】図９Ａは、ＳＬ１３４４ｌｕｘの腹腔内接種後の感受性Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるサルモネラＳＬ１３４４ｌｕｘの分布を示す。図９Ａは腹腔を開く前に撮像した。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ＳＬ１３４４ｌｕｘの腹腔内接種後の感受性Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるサルモネラＳＬ１３４４ｌｕｘの分布を示す。図９Ｂは腹腔を開いた後に撮像した。
【図９Ｃ】図９Ｃは、ＳＬ１３４４ｌｕｘの腹腔内接種後の感受性Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるサルモネラＳＬ１３４４ｌｕｘの分布を示す。図９Ｃは盲腸を左側に引き寄せた後に撮像した。
【図１０Ａ】図１０Ａは、経口接種マウス中のＳＬ１３４４ｌｕｘサルモネラからの生物発光に対するシプロフロキサシン処置の影響を表わす。図１０Ａは、処置動物と無処置動物について、腹部領域から測定された相対生物発光を、処置開始後の時間の関数として表わすグラフである。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、経口接種マウス中のＳＬ１３４４ｌｕｘサルモネラからの生物発光に対するシプロフロキサシン処置の影響を表わす。図１０Ｂは、ＳＬ１３４４ｌｕｘサルモネラを経口接種した８日後の、シプロフロキサシンで処置する前のマウスの合成画像である。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、経口接種マウス中のＳＬ１３４４ｌｕｘサルモネラからの生物発光に対するシプロフロキサシン処置の影響を表わす。図１０Ｃは、同じマウスの対照の５．５時間後（処置なし）の合成画像である。
【図１０Ｄ】図１０Ｄは、経口接種マウス中のＳＬ１３４４ｌｕｘサルモネラからの生物発光に対するシプロフロキサシン処置の影響を表わす。図１０Ｄは、ＳＬ１３４４ｌｕｘサルモネラを経口接種した８日後の、シプロフロキサシンで処置する前のマウスの合成画像である。
【図１０Ｅ】図１０Ｅは、経口接種マウス中のＳＬ１３４４ｌｕｘサルモネラからの生物発光に対するシプロフロキサシン処置の影響を表わす。図１０Ｅは、同じマウスの処置後５．５時間（図ｌ０Ｅ）の合成画像である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の工程からなる哺乳類対象中の生物適合体の局在を検出する非侵襲的方法：
（ａ）その対象に、その生物適合体と発光成分の複合体を投与し、
（ｂ）その複合体がその対象内で局在を達成しうる期間の後、その対象を光検出装置の検
出フィールド内に固定し、
（ｃ）その対象を固定状態に維持し、
（ｄ）当該維持中に、その対象中に局在した発光成分からの光子放射を、光子放射の画像
を構築することができるまで、その光検出装置で測定し、
（ｅ）その画像を構築する。
【請求項１】
次の工程からなる哺乳類対象中の生物適合体の局在を検出する非侵襲的方法：
（ａ）その対象に、その生物適合体と発光成分の複合体を投与し、
（ｂ）その複合体がその対象内で局在を達成しうる期間の後、その対象を光検出装置の検
出フィールド内に固定し、
（ｃ）その対象を固定状態に維持し、
（ｄ）当該維持中に、その対象中に局在した発光成分からの光子放射を、光子放射の画像
を構築することができるまで、その光検出装置で測定し、
（ｅ）その画像を構築する。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図５Ｅ】
【図５Ｆ】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１０Ｄ】
【図１０Ｅ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図５Ｅ】
【図５Ｆ】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１０Ｄ】
【図１０Ｅ】
【公開番号】特開２００７−２０９７６６（Ｐ２００７−２０９７６６Ａ）
【公開日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−４６３２１（Ｐ２００７−４６３２１）
【出願日】平成１９年２月２６日（２００７．２．２６）
【分割の表示】特願２００５−２０７９００（Ｐ２００５−２０７９００）の分割
【原出願日】平成７年１１月１７日（１９９５．１１．１７）
【出願人】（５９９１０８９７６）ザ・ボード・オブ・トラスティーズ・オブ・ザ・レランド・スタンフォード・ジュニア・ユニバーシティ (61)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＢＯＡＲＤ ＯＦ ＴＲＵＳＴＥＥＳ ＯＦ ＴＨＥ ＬＥＬＡＮＤ ＳＴＡＮＦＯＲＤ ＪＵＮＩＯＲ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年２月２６日（２００７．２．２６）
【分割の表示】特願２００５−２０７９００（Ｐ２００５−２０７９００）の分割
【原出願日】平成７年１１月１７日（１９９５．１１．１７）
【出願人】（５９９１０８９７６）ザ・ボード・オブ・トラスティーズ・オブ・ザ・レランド・スタンフォード・ジュニア・ユニバーシティ (61)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＢＯＡＲＤ ＯＦ ＴＲＵＳＴＥＥＳ ＯＦ ＴＨＥ ＬＥＬＡＮＤ ＳＴＡＮＦＯＲＤ ＪＵＮＩＯＲ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【Ｆターム（参考）】
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