哺乳動物細胞の培養において高生細胞密度を得るための方法
真核細胞の流加培養における生存率を高める方法を開示する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高濃度のグルコース添加により、流加細胞培養中で高い生細胞密度及び長い培養寿命を実現するための方法に関する。本方法は、対象とする分泌タンパク質の産生量を高めるうえで有用である。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物細胞の培養は、適当な翻訳後修飾がなされたタンパク質を生産することが可能であることから、多くの組換えタンパク質製造プロセスにおいて選択されている系である。製造需要が高まるにつれ、産物の収率を高めることによってプロセス効率を改善するとう強い動機づけがある。商業的な製造プロセスにおいて生物学的治療を目的としたタンパク質又は他のタンパク質の１Ｌ当たり数グラムの製造レベルを実現するには、哺乳動物細胞の培養及び操作方法を最適化することが不可欠である。現在の高密度、無タンパク質の哺乳動物細胞培養に内在する問題として細胞死の問題があり、一般的な流加バイオリアクターではアポトーシスによるものが最大でその８０％を占める。こうした細胞死は、栄養及び増殖因子の欠乏、酸素欠乏、毒素の蓄積、及び剪断応力といった諸条件に応じて誘導されるものである（Ｇｏｓｗａｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ６２：６３２〜６４０（１９９９））。アポトーシスは最大の生細胞密度を制限し、死滅期の開始を早め、異種由来タンパク質の収率を潜在的に低下させる（Ｃｈｉａｎｇ ａｎｄ Ｓｉｓｋ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ９１：７７９〜７９２（２００５）；Ｆｉｇｕｅｒｏａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．７３：２１１〜２２２（２００１），Ｍｅｔａｂ Ｅｎｇ ５：２３０〜２４５（２００３），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ８５：５８９〜６００（２００４）；Ｍｅｒｃｉｌｌｅ ａｎｄ Ｍａｓｓｉｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ４４：１１４０〜１１５４（１９９４））。
【０００３】
アポトーシスは細胞の内外で開始されるシグナル伝達経路の複雑なネットワークによって引き起こされるものであり、細胞死の最終ステージを媒介するシステインアスパラギン酸プロテアーゼ（カスパーゼ）が最終的に活性化される。これについては図１を参照されたい。哺乳動物の細胞培養における長期の産生培養の間に細胞生存率を維持する目的でアポトーシスを防止する様々な方法が用いられている（Ａｒｄｅｎ ａｎｄ Ｂｅｔｅｎｂａｕｇｈ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２２：１７４〜１８０（２００４）；Ｖｉｖｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔａｂ Ｅｎｇ ５：１２４〜１３２（２００３））。増殖因子、加水分解物、及び律速栄養素を培地に添加して細胞外環境を変化させることによってタンパク質の産生量が高まり、アポトーシスが減少する（Ｂｕｒｔｅａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ Ａｎｉｍ．３９：２９１〜２９６（２００３）；Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４８：５９〜７４（２００５））。細胞内からのアポトーシスのシグナル伝達カスケードを阻害する化学的及び遺伝子的手法を模索する研究者もいる（Ｓａｕｅｒｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ７７：７０４〜７１６（２００２），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ８１：３２９〜３４０（２００３））。
【０００４】
ガン細胞において発現量が増大している遺伝子の過剰発現が、カスパーゼ活性化の上流でアポトーシスを防止することによってバイオリアクター中で増殖させた細胞の生存期間を延ばしうることが研究者によって見出されている（Ｇｏｓｗａｍｉ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ；Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １６：８８〜９５（１９９８）；Ｍｅｅｎｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ８０：７０６〜７１６（２００２）；Ｔｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ７９：１４７〜１５９（２０００）、及び、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ６８：３１〜４３（２０００））。生産用細胞株におけるこれらのタンパク質の発現量の増大は、アポトーシスを引き起こす細胞内のシグナル伝達を効果的に抑制することによって細胞死を制限することにより、特定の場合において生存率を維持し生物治療物質の産生量を増大させた。
【０００５】
高密度、無タンパク質の哺乳動物細胞培養にやはり内在する問題点として、老廃物の蓄積及びそれが細胞増殖にもたらす悪影響がある。細胞培養における最も一般的な２つの老廃物は、乳酸及びアンモニアである。過剰な乳酸の蓄積の問題に対処するために多くの手法が考案されており、１）培地のグルコース濃度を低く維持する（Ｋｕｒｏｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＢｉｏｅｎｇ ４４：９５〜１０３（１９９４）；Ｘｉｅ ａｎｄ Ｗａｎｇ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ４３：１１７５〜１１８９（１９９３）；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｈｅｍ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ７９：１７１〜１８１（２００４）；Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ４６：５７９〜５８７（１９９５））、２）フルクトースなどの代替的な糖を添加する（Ｍａｒｔｉｎｅｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ６０：５０８〜５１７（１９９８），Ａｌｔａｍｉｒａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １１０：１７１〜１７９（２００４）ａｎｄ Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １２５：５４７〜５５６（２００６），Ｗａｌｓｃｈｉｎ ａｎｄ Ｗｕ，Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １３１：１６８〜１７６（２００７））、３）相同組み換え又はＳｉＲＮＡ技術により乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の発現を部分的にノックアウトする、４）ピルビン酸カルボキシラーゼの過剰発現、５）ピルビン酸脱水素酵素（ＰＤＨ）の活性化因子（ＰＤＨキナーゼ阻害を介した）であるジクロロ酢酸塩（ＤＣＡ）の使用、６）ＬＤＨ競合阻害剤であるオキサミン酸、及び７）灌流による除去（米国特許出願公開第２００９／００４２２５３Ａ１号）などが挙げられる。
【０００６】
当初は、多くのアポトーシス経路のタンパク質の固有の機能は、ミトコンドリア膜に結合してミトコンドリアの透過性を調節することによりアポトーシスを調節することと考えられていた。最近の研究により、アポトーシスを引き起こすシグナル伝達に関与する主要なタンパク質は、細胞の代謝及びエネルギー恒常性を制御するタンパク質と相互作用してこれらのタンパク質に影響を及ぼすことが示された。Ｍａｊｏｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔａｂ Ｅｎｇ ９：３１７〜３２６（２００７）（概論）、及びＷｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ７：１０２１〜１０２８（２００５）を参照されたい。最近の研究では、ＢｃＬ−ＸＬを過剰発現しているＣＨＯ細胞のマイクロアレイ分析により、糖新生の主要な酵素である乳酸脱水素酵素の発現量が増大していることが示された。
【０００７】
特定の細胞及びウイルスは、ミトコンドリアのアポトーシス経路において機能するアポトーシス耐性遺伝子を生産する。これらの遺伝子は、以下の３つのグループ、すなわち、１）経路の早期に働くもの（例えば、Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーのタンパク質）、２）経路の中期に働いてアポトソーム複合体を妨害又は阻害するもの（例えば、Ａｖｅｎ）、及び３）経路の後期に働くもの（例えば、ＸＩＡＰなどのカスパーゼ阻害因子）に分類することができる。これらの遺伝子の大半のものの機能は、哺乳動物の発現系においてこれらを過剰発現させることによって研究されており、特定の場合では、それぞれが経路の異なる部分に由来する２以上の遺伝子の過剰発現の組み合わせによる影響が調べられている。その例としては、１）ＣＨＯ細胞におけるＢｃＬ−ＸＬとＸＩＡＰの欠失突然変異（ＸＩＡＰΔ）との相加的効果（Ｆｉｇｕｅｒｏａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．５：２３０〜２４５（２００３））、２）ＢＨＫ細胞におけるＥ１Ｂ−１９ＫとＡｖｅｎ（Ｎｉｖｉｔｃｈａｎｙｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ９８：８２５〜８４１（２００７））、及び３）ＢｃＬ−ＸＬ、Ａｖｅｎ、及びＸＩＡＰΔ（Ｓａｕｅｒｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ，（２００３）；Ｓａｕｅｒｗａｌｄ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ９４：３６２〜３６９（２００６））が挙げられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、これらの研究では、細胞の細胞代謝状態に対するアポトーシス耐性遺伝子の影響については調べられていない。したがって、高い生細胞密度、寿命、及び生産性を実現するために栄養消費及び代謝産物の蓄積状態を最適化するための哺乳動物細胞の培養システムが求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一態様は、真核細胞の流加培養において高い生細胞密度を得るための方法であって、
ａ）１種以上の異種由来のアポトーシス耐性（アポトーシスR）遺伝子及び１種以上の対象遺伝子を発現する真核細胞株を培養する工程と、
ｂ）前記細胞培養の指数増殖期及び定常期に高グルコース添加培地を維持する工程と、を含む方法である。
【００１０】
本発明の別の態様は、真核細胞の流加培養において分泌タンパク質の産生量を高めるための方法であって、
ａ）１種以上の異種由来のアポトーシス耐性（アポトーシスR）遺伝子及び１種以上の対象遺伝子を発現する真核細胞株を培養する工程と、
ｂ）前記細胞培養の指数増殖期及び定常期に高グルコース添加培地を維持する工程と、を含む方法である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ミトコンドリアのアポトーシス経路の構成要素を示す図。
【図２Ａ】アポトーシス耐性細胞株の特性評価を示す図。
【図２Ｂ】アポトーシス耐性細胞株の特性評価を示す図。
【図２Ｃ】アポトーシス耐性細胞株の特性評価を示す図。
【図３】フローサイトメトリー分析によりＥＡ１６７及びＥＡＸ１９７のアポトーシス耐性を証明した図。
【図４Ａ】Ｅ１Ｂ１９Ｋ、Ｅ１Ｂ１９Ｋ＋ＡＶＥＮ、及び、Ｅ１Ｂ１９Ｋ＋ＡＶＥＮ＋ＸＩＡＰΔをトランスフェクトすることによって生成されたアポトーシス耐性細胞株の増殖プロファイルである。コントロール（●）、Ｅ６４（◆）、ＥＡ１６７（■）及びＥＡＸ１９７（▼）の震盪フラスコ回分培養を、生細胞密度及び生存率について観測した。
【図４Ｂ】Ｅ１Ｂ１９Ｋ、Ｅ１Ｂ１９Ｋ＋ＡＶＥＮ、及び、Ｅ１Ｂ１９Ｋ＋ＡＶＥＮ＋ＸＩＡＰΔをトランスフェクトすることによって生成されたアポトーシス耐性細胞株の増殖プロファイルである。コントロール（●）、Ｅ６４（◆）、ＥＡ１６７（■）及びＥＡＸ１９７（▼）の震盪フラスコ回分培養を、生細胞密度及び生存率について観測した。
【図４Ｃ】Ｅ１Ｂ１９Ｋ、Ｅ１Ｂ１９Ｋ＋ＡＶＥＮ、及び、Ｅ１Ｂ１９Ｋ＋ＡＶＥＮ＋ＸＩＡＰΔをトランスフェクトすることによって生成されたアポトーシス耐性細胞株の増殖プロファイルである。コントロール（●）、Ｅ６４（◆）、ＥＡ１６７（■）及びＥＡＸ１９７（▼）の震盪フラスコ回分培養を、生細胞密度及び生存率について観測した。
【図５Ａ】Ｅ１Ｂ１９Ｋ＋ＡＶＥＮ±ＸＩＡＰΔでトランスフェクトすることによって生成されたアポトーシス耐性細胞株の代謝産物のプロファイルである。コントロール（●）、ＥＡ１６７（■）及びＥＡＸ１９７（▼）の震盪フラスコ回分培養を、異なる代謝産物について観測した。
【図５Ｂ】Ｅ１Ｂ１９Ｋ＋ＡＶＥＮ±ＸＩＡＰΔでトランスフェクトすることによって生成されたアポトーシス耐性細胞株の代謝産物のプロファイルである。コントロール（●）、ＥＡ１６７（■）及びＥＡＸ１９７（▼）の震盪フラスコ回分培養を、異なる代謝産物について観測した。
【図５Ｃ】Ｅ１Ｂ１９Ｋ＋ＡＶＥＮ±ＸＩＡＰΔでトランスフェクトすることによって生成されたアポトーシス耐性細胞株の代謝産物のプロファイルである。コントロール（●）、ＥＡ１６７（■）及びＥＡＸ１９７（▼）の震盪フラスコ回分培養を、異なる代謝産物について観測した。
【図６Ａ】アポトーシス耐性細胞株に連日乳酸を補充した結果を示す図である。Ａ）コントロール（●）；ＥＡ１６７（無添加□、乳酸添加■）、及びＢ）ＥＡＸ１９７（無添加△、乳酸添加▼）。
【図６Ｂ】アポトーシス耐性細胞株に連日乳酸を補充した結果を示す図である。Ａ）コントロール（●）；ＥＡ１６７（無添加□、乳酸添加■）、及びＢ）ＥＡＸ１６７（添加△、乳酸無添加▼）。
【図７Ａ】添加乳酸の存在下又は不在下における、コントロール並びにアポトーシス耐性細胞株ＥＡ１６７及びＥＡＸ１９７の増殖及び代謝産物のプロファイルである。コントロール（●）、ＥＡ１６７（無添加□、乳酸添加■）、ＥＡＸ１９７（無添加▲、乳酸添加▼）。
【図７Ｂ】添加乳酸の存在下又は不在下における、コントロール並びにアポトーシス耐性細胞株ＥＡ１６７及びＥＡＸ１９７の増殖及び代謝産物のプロファイルである。コントロール（●）、ＥＡ１６７（無添加□、乳酸添加■）、ＥＡＸ１９７（無添加▲、乳酸添加▼）。
【図７Ｃ】添加乳酸の存在下又は不在下における、コントロール並びにアポトーシス耐性細胞株ＥＡ１６７及びＥＡＸ１９７の増殖及び代謝産物のプロファイルである。コントロール（●）、ＥＡ１６７（無添加□、乳酸添加■）、ＥＡＸ１９７（無添加▲、乳酸添加▼）。
【図７Ｄ】添加乳酸の存在下又は不在下における、コントロール並びにアポトーシス耐性細胞株ＥＡ１６７及びＥＡＸ１９７の増殖及び代謝産物のプロファイルである。コントロール（●）、ＥＡ１６７（無添加□、乳酸添加■）、ＥＡＸ１９７（無添加▲、乳酸添加▼）。
【図７Ｅ】添加乳酸の存在下又は不在下における、コントロール並びにアポトーシス耐性細胞株ＥＡ１６７及びＥＡＸ１９７の増殖及び代謝産物のプロファイルである。コントロール（●）、ＥＡ１６７（無添加□、乳酸添加■）、ＥＡＸ１９７（無添加▲、乳酸添加▼）。
【図７Ｆ】添加乳酸の存在下又は不在下における、コントロール並びにアポトーシス耐性細胞株ＥＡ１６７及びＥＡＸ１９７の増殖及び代謝産物のプロファイルである。コントロール（●）、ＥＡ１６７（無添加□、乳酸添加■）、ＥＡＸ１９７（無添加▲、乳酸添加▼）。
【図７Ｇ】添加乳酸の存在下又は不在下における、コントロール並びにアポトーシス耐性細胞株ＥＡ１６７及びＥＡＸ１９７の増殖及び代謝産物のプロファイルである。コントロール（●）、ＥＡ１６７（無添加□、乳酸添加■）、ＥＡＸ１９７（無添加▲、乳酸添加▼）。
【図８Ａ】乳酸添加時にアポトーシス耐性細胞株によって減少するアミノ酸のプロファイルを示す図である。コントロール（●）、ＥＡ１６７（無添加□、乳酸添加■）、ＥＡＸ１９７（無添加▲、乳酸添加▼）。
【図８Ｂ】乳酸添加時にアポトーシス耐性細胞株によって減少するアミノ酸のプロファイルを示す図である。コントロール（●）、ＥＡ１６７（無添加□、乳酸添加■）、ＥＡＸ１９７（無添加▲、乳酸添加▼）。
【図８Ｃ】乳酸添加時にアポトーシス耐性細胞株によって減少するアミノ酸のプロファイルを示す図である。コントロール（●）、ＥＡ１６７（無添加□、乳酸添加■）、ＥＡＸ１９７（無添加▲、乳酸添加▼）。
【図８Ｄ】乳酸添加時にアポトーシス耐性細胞株によって減少するアミノ酸のプロファイルを示す図である。コントロール（●）、ＥＡ１６７（無添加□、乳酸添加■）、ＥＡＸ１９７（無添加▲、乳酸添加▼）。
【図８Ｅ】乳酸添加時にアポトーシス耐性細胞株によって減少するアミノ酸のプロファイルを示す図である。コントロール（●）、ＥＡ１６７（無添加□、乳酸添加■）、ＥＡＸ１９７（無添加▲、乳酸添加▼）。
【図８Ｆ】乳酸添加時にアポトーシス耐性細胞株によって減少するアミノ酸のプロファイルを示す図である。コントロール（●）、ＥＡ１６７（無添加□、乳酸添加■）、ＥＡＸ１９７（無添加▲、乳酸添加▼）。
【図８Ｇ】乳酸添加時にアポトーシス耐性細胞株によって減少するアミノ酸のプロファイルを示す図である。コントロール（●）、ＥＡ１６７（無添加□、乳酸添加■）、ＥＡＸ１９７（無添加▲、乳酸添加▼）。
【図９Ａ】特別配合培地中、高濃度のグルコース中で培養されたコントロール及びアポトーシス耐性細胞株ＥＡＸ１９７の増殖プロファイル及び乳酸蓄積プロファイルである。アポトーシス耐性細胞株ＥＡＸ１９７（■）、コントロール細胞株（◇）。
【図９Ｂ】特別配合培地中、高濃度のグルコース中で培養されたコントロール及びアポトーシス耐性細胞株ＥＡＸ１９７の増殖プロファイル及び乳酸蓄積プロファイルである。アポトーシス耐性細胞株ＥＡＸ１９７（■）、コントロール細胞株（◇）。
【図９Ｃ】特別配合培地中、高濃度のグルコース中で培養されたコントロール及びアポトーシス耐性細胞株ＥＡＸ１９７の増殖プロファイル及び乳酸蓄積プロファイルである。アポトーシス耐性細胞株ＥＡＸ１９７（■）、コントロール細胞株（◇）。
【図９Ｄ】特別配合培地中、高濃度のグルコース中で培養されたコントロール及びアポトーシス耐性細胞株ＥＡＸ１９７の増殖プロファイル及び乳酸蓄積プロファイルである。アポトーシス耐性細胞株ＥＡＸ１９７（■）、コントロール細胞株（◇）。
【図１０Ａ】３０ｍＭ又は６０ｍＭのグルコースを含む特別配合培地中で培養されたＥＡＸ１９７及びコントロールホスト細胞株から生成された細胞株の抗体力価を示す図である。アポトーシス耐性細胞株ＥＡＸ１９７（■）、コントロール細胞株（□）。
【図１０Ｂ】３０ｍＭ又は６０ｍＭのグルコースを含む特別配合培地中で培養されたＥＡＸ１９７及びコントロールホスト細胞株から生成された細胞株の抗体力価を示す図である。アポトーシス耐性細胞株ＥＡＸ１９７（■）、コントロール細胞株（□）。
【図１１Ａ】３０ｍＭ又は６０ｍＭのグルコースを含む培地中に高細胞播種密度及び低細胞播種密度で播種した、アポトーシス耐性遺伝子Ｂｃｌ−２を有する細胞株のＶＣＤ及び力価を示す図。
【図１１Ｂ】３０ｍＭ又は６０ｍＭのグルコースを含む培地中に高細胞播種密度及び低細胞播種密度で播種した、アポトーシス耐性遺伝子Ｂｃｌ−２を有する細胞株のＶＣＤ及び力価を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書に引用される特許及び特許出願など（ただしこれらに限定されない）のすべての刊行物は、本明細書にそれらの全体が記載されているものと同様にして本願に援用するものである。
【００１３】
説明文中で使用する用語「流加細胞培養」とは、増殖を律速する栄養基質を培養に添加することに基づいた細胞培養プロセスを意味する。流加法は、バイオリアクター中で高い細胞密度に達するためにバイオ産業のプロセスで一般的に使用されている方法である。 HYPERLINK "http://en.wikipedia.org/wiki/Bioreactor" \o "Bioreactor" しかしながら、グルコースなどの栄養素を添加すると乳酸やアンモニアなどの代謝老廃物が形成される。濃度１８ｍＭの乳酸（Ｋｕｒａｎｏ ｅｔ ａｌ．，１９９０）及び８ｍＭのアンモニア（Ｈａｎｓｅｎ ａｎｄ Ｅｍｂｏｒｇ，１９９４）は真核細胞の増殖を阻害することが報告されている。
【００１４】
流加細胞培養における過剰な乳酸の蓄積の問題に対処するためにこれまでに多くの手法が考案されており、それらの手法について上記に述べた。本発明では、乳酸濃度を低下させて生細胞密度を高めることに代わる手法を提供する。この方法では、１種以上のアポトーシス耐性遺伝子をホスト細胞株で過剰発現させる。得られたアポトーシス耐性細胞株ではミトコンドリアでの呼吸が刺激され、乳酸の蓄積量が減少することになる。したがって、これらの細胞株は、高濃度のグルコースを添加しても生存することが可能である。その結果、これらのアポトーシス耐性細胞株の培養では高い生細胞密度に達することが可能である。これらの細胞株はまた、そのアポトーシス耐性のために長い寿命を有する。
【００１５】
本発明の方法は、チャイニーズハムスター子宮細胞（ＣＨＯ）、ミエローマ又はハイブリドーマ細胞培養などの流加細胞培養における生細胞の密度及び生存率を高めるうえで有用である。詳細には、本発明の方法はＣＨＯ細胞培養の積分生細胞数（ＩＶＣＣ）を高めるうえで有用である。本発明の方法は、１種以上の異種由来のアポトーシス耐性遺伝子（アポトーシスR）遺伝子及び１種以上の対象遺伝子を発現する細胞株を培養する工程と、細胞培養の指数増殖期及び定常期の間に高濃度のグルコースの培地への添加を維持する工程とを含む。これらの細胞系は、ペプチド、ペプチド融合体、増殖因子、ホルモン抗体、設計アンキリン反復タンパク質（DARPins）、及び治療、診断又は研究目的に有用な他のタンパク質などの対象タンパク質を発現する生産用細胞株の作出のめの優れたホストとなる。本発明の方法において有用なＣＨＯ細胞株としては、ＣＨＯ−Ｋ１（インビトロジェン社（Invitrogen）カリフォルニア州カールスバッド）及びＣＨＯＫ１ＳＶ（ロンザ・バイオロジックス社（Lonza Biologiｃｓ）英国、スラウ）が挙げられる。本発明の方法において有用なミエローマ株としては、ＮＳ０及びＳｐ２／０が挙げられる。
【００１６】
本発明の方法において有用な細胞株は、１種以上の異種由来のアポトーシス耐性遺伝子を発現する。詳細には、Ｅ１Ｂ１９Ｋ（配列番号１及び２）及びＡｖｅｎ（配列番号３及び４）が有用である。ＸＩＡＰΔ（配列番号：５及び６）をコードした遺伝子を使用することもできる。これらのアポトーシス耐性遺伝子は、それぞれアポトーシスを引き起こすシグナル伝達経路の早期、中期、及び後期に働く遺伝子を代表するものである。更に、Ｂｃｌ−２Δをコードする遺伝子を使用することもできる（配列番号７及び８）。アポトーシス耐性遺伝子の発現は、当業者には周知の形質移入（トランスフェクション）技術によって実現させることができる。ＭＤＭ２（配列番号９及び１０）及びＢｃｌ−ＸＬ（配列番号１１及び１２）などの、アポトーシスを引き起こすシグナル伝達経路の上記のステージからの他のアポトーシス耐性遺伝子も本発明の方法において有用である。
【００１７】
本発明においては、異種由来のアポトーシス耐性遺伝子を発現する細胞株の使用により、これらの細胞株の乳酸の分泌量が低減されるかあるいは蓄積された乳酸が消費されることによって、高濃度のグルコースの培養中への添加を維持しつつ、積分生細胞数（ＩＶＣＣ）の値がコントロール細胞株と比較して約２倍高い値に達する。培養中の生産用細胞株の生細胞密度を高めることにより、バイオリアクターの使用によって得られる産物の収率が高まる。このように生産性が高められることにより、複雑な生物製剤の製造コストが低減されると同時に、非生細胞の細胞溶解がないために優れた品質の産物が生産される（溶解した細胞は産物を分解するプロテアーゼを放出するため）。したがってこれらの細胞株は、対象タンパク質（単数又は複数）を発現する生産用細胞株を作出するための優れたホストとなる。
【００１８】
本発明の方法では、老廃物として蓄積される乳酸を消費する、又はその産生量が低減したアポトーシス耐性細胞株の能力によって、高濃度グルコース条件下、及びグルコース欠乏後の増殖を可能とする培養手法が与えられる。異なる実施形態において、本発明の方法は、流加細胞培養における高いピーク生細胞密度、長い寿命、高い分泌タンパク質力価、高い積分生細胞数、低い細胞カルシウム流束、及び高いミトコンドリア膜電位を与えるものである。更に、高濃度の有毒な乳酸及びアンモニアを制限するために用いられてきた流加培養法は、これらの細胞株の高い生産性にとって必要ではない可能性がある。
【００１９】
トランスフェクトした後、アポトーシス耐性導入遺伝子の染色体への組み込み部位によってその発現レベルが決まる。更に、複数のアポトーシス耐性遺伝子をトランスフェクトする場合、これらのタンパク質の多くは直接的又は間接的に相互作用することによって細胞の生理学的変化を引き起こすことから、特定のアポトーシス耐性導入遺伝子の発現レベルがその細胞が有する他のアポトーシス耐性タンパク質の活性に影響を及ぼしうる。したがって、複数の遺伝子を有する細胞株の全体のアポトーシス耐性に対する各アポトーシス耐性遺伝子の定量的寄与は、各アポトーシス耐性遺伝子の相乗効果のために決定することが困難である。更に、すべてのクローンが同じ導入遺伝子の集合をトランスフェクトされていたとしてもアポトーシス耐性に関しては各クローン間で大きなばらつきがある。後述する実施例に示される結果からは、試験した各アポトーシス耐性遺伝子は、各遺伝子をトランスフェクトしたホスト細胞株のアポトーシス耐性を高める方向に漸増する正の値を与えることが明らかである。上記の束縛条件内では、３重形質導入体は一般に２重形質導入体よりも優れており、２重形質導入体は１個のみのアポトーシス耐性遺伝子を過剰発現している形質導入体よりも優れていた。
【００２０】
したがって、適当な発現ベクターをトランスフェクトすることでＥ１Ｂ−１９Ｋ、Ａｖｅｎ及びＸＩＡＰΔを異なるレベルで発現するクローンが得られた。Ｅ１Ｂ−１９Ｋの発現レベルは比較的低く、Ｅ１Ｂ−１９Ｋを高い発現レベルで発現する稀なクローンは不安定であるか増殖性が低かった（データは示さず）。下記実施例において、Ｅ１Ｂ−１９Ｋを単独で発現しているＣＨＯ細胞では細胞死に対する保護は限定的なものに過ぎなかった（図４）。
【００２１】
Ｅ１Ｂ−１９Ｋを単独で発現している細胞株で得られた結果に対し、下記実施例において示されるデータは、Ａｖｅｎ（ＥＡ１６７）、又はＡｖｅｎ及びＸＩＡＰΔ（ＥＡＸ１９７）を同時に発現しているＣＨＯ Ｋ１細胞株では、生存率、細胞密度及びＩＶＣＣに向上が見られたことを示している。下記実施例に示される結果は、ＣＨＯ Ｋ１細胞株における２個のアポトーシス耐性遺伝子の発現により、スタウロスポリン及び長期の回分培養といった障害の存在下でカスパーゼ活性が大幅に低下し、ミトコンドリアの膜電位が高くなったことを更に示している。
【００２２】
下記実施例では、Ｂｃｌ−ＸＬの機能的ホモログであるＥ１Ｂ−１９ＫとＡｖｅｎ及びＸＩＡＰΔとの組み合わせの発現が細胞死を遅らせる効果について調べた。これらのトランスフェクト細胞におけるＸＩＡＰΔの発現レベルは、細胞内に既に存在する内因性の野生型ＸＩＡＰタンパク質に対して高くはなかったが、これはこのシステムにおいて２個のプラスミドをトランスフェクトするために必要な条件によるものと恐らく考えられる。しかしながら、ＥＡＸ１９７におけるＸＩＡＰΔの追加（Ａｖｅｎ及びＥ１Ｂ−１９Ｋに加えて）により、無添加（図５及び７）及び乳酸を添加した培養（図７）の両方で最大生細胞密度が一貫して向上した。実際、乳酸を添加したＥＡＸ１９７細胞株は、６０％以上の高い生存率を１４日間にわたって維持したが、これはＥＡ１６７細胞よりも２日長く、コントロール培養よりも４日間長かった。ＸＩＡＰΔを有することによりカスパーゼ活性に対する細胞の耐性が高まると考えられ、このことは図３に、スタウロスポリンによる処理後においてもＥＡＸ１９７のカスパーゼ活性が極めて低かったことにより実証されている。更に、ＸＩＡＰの突然変異（ＸＩＡＰΔ）の使用により、野生型ＸＩＡＰタンパク質と比較して高いアポトーシス耐性が与えられる。したがって、ＸＩＡＰの欠失突然変異（ＸＩＡＰΔ）の保護能力は、これらのＣＨＯ株においてこのタンパク質の発現レベルが高くなくとも充分なものである可能性がある。
【００２３】
下記実施例では、細胞の代謝における１種以上のアポトーシス耐性遺伝子の役割を調べた。Ａｖｅｎ及び／又はＸＩＡＰΔとともにＥ１Ｂ−１９Ｋを発現しているアポトーシス耐性細胞株において栄養素の消費量及び代謝産物の産生量を調べた。詳細には、２つの最も一般的な細胞培養の老廃物（すなわち乳酸とアンモニア）の蓄積量についてアポトーシス耐性細胞株とコントロール細胞株との間で比較を行った。下記に示すデータでは、ＣＤ−ＣＨＯ培地中の震盪フラスコ回分培養において、播種後６日目〜７日目にコントロール細胞株は２．８ｇ／Ｌ（３１ｍＭ）の乳酸及び１２ｍＭのアンモニア（図５）を蓄積したが、これらは細胞増殖を阻害することが報告されている濃度１８ｍＭの乳酸（Ｋｕｒａｎｏら、前出）及び８ｍＭのアンモニア（Ｈａｎｓｅｎ及びＥｍｂｏｒｇ、前出）を大幅に上回る濃度であった。これらの濃度は、ＣＨＯコントロール細胞株において播種後８日目に見られた生存率の低下の理由の一部となっていることが考えられる。
【００２４】
下記に示すデータは、アポトーシス抵抗細胞株がある程度の乳酸を初期に蓄積することを示しているが、これらの細胞株は指数増殖期に乳酸を消費しはじめ、ＶＣＤはコントロール培養を大幅に上回って増大し続けた。グルコースの枯渇後に直ちに乳酸を消費する能力、又はアポトーシス阻害性の増大、又は両方の因子が細胞増殖の継続に寄与していた。更に、アポトーシス耐性細胞は内因性の乳酸が枯渇した場合にのみ定常期に入った。乳酸の消費がこれらの操作された細胞株の一般的な特性であることを調べるため、アポトーシス耐性培養に外因性の乳酸を加えて欠乏した乳酸を補充した（図６）。下記実施例に示される結果は、アポトーシス耐性培養は添加された乳酸を消費し、コントロール培養と比較して高いＶＣＤ及び生存率を更に４〜７日間にわたって維持した（無添加及び乳酸添加培養を図７Ａ及びＢにそれぞれ示す）。このプロセスの更なる利点としては、アポトーシス耐性細胞株の培養中の乳酸が低濃度であることによって、浸透圧がより低く、ｐＨがより高くなることがあり、これらはいずれも産物の高い品質にとって極めて望ましい。
【００２５】
研究者によりこれまでに、ハイブリドーマ、ＮＳ０ミエローマ、及びＣＨＯの培養中において乳酸の消費が検出されている（ｄｅＺｅｎｇｏｔｉｔａ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，１９９５ ａｎｄ １９９７；Ｂｕｒｋｙ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｐａｓｃｏｅ ｅｔ ａｌ．，２００７）。しかしながら、これらの細胞は通常、指数増殖期では乳酸を産生し、定常期に消費へと移行するが、このことは、乳酸が中間の副産物及び炭水化物エネルギー源の両方でありうることを示唆するものである（Ｂｕｒｋｙ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｂｒｏｏｋｓ ｅｔ ａｌ．，１９８５）。下記に示す結果では、コントロールのＣＨＯ培養は、上記の実験において見られるように定常期において特に「高濃度」グルコース培地で（図９）一定量の乳酸を消費したようであった。これに対し、アポトーシス耐性細胞では、指数増殖期に乳酸が消費され、外因性の乳酸が欠乏した場合にのみ細胞が定常期に入るという大きく異なったプロファイルを示した。
【００２６】
乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）によって触媒されるピルビン酸の乳酸への変換は可逆反応であるが、平衡定数が３．６×１０4／Ｍと乳酸を生成する方向に大きく傾いている。しかしながら、解糖系がトリカルボン酸（ＴＣＡ）の需要を満たすことができない場合、乳酸はピルビン酸へとその反応を進めるＬＤＨの複数のアイソザイムの１つによって逆に変換される。アポトーシス耐性細胞株によって消費された乳酸は、ＴＣＡ回路に入って細胞のエネルギー及びアミノ酸の産生に使われるものと考えられる。興味深い点として、アポトーシス耐性培養のアンモニアのプロファイルは、無添加及び乳酸添加細胞株の両方においてアンモニアの産生量が繰り返し一時的に低下するとともに全体的にアミノ酸の産生量が減少し、コントロール培養のアンモニアプロファイルと大きく異なった。これは、アミノ酸がＴＣＡ回路でエネルギー源として使用されることによってアンモニアが蓄積したものと考えられる。したがって、アンモニアの産生量の減少は、アポトーシス耐性細胞では、コントロール細胞と比較してＴＣＡ回路におけるエネルギーの必要量の内、相対的に小さな割合がアミノ酸から得られている可能性を示唆しており、このことはアポトーシス耐性細胞が炭素源として乳酸もより多く消費していることを考えると妥当な結果である。しかしながらアンモニア産生量の低下は一時的なものであり、アポトーシス耐性細胞が依然、アミノ酸をエネルギー源として利用している可能性がある点は注意を要する。実際、いずれも分枝鎖アミノ酸であるイソロイシン、ロイシン、及びバリンの３種類のアミノ酸は、アポトーシス耐性細胞によってより急速に消費され、その消費量は乳酸添加培養で大きかった（図８Ａ〜Ｃ）。アポトーシス耐性細胞株はコントロール細胞株と比較して継続的な増殖を示したことから、これら３種類のアミノ酸が脂肪酸及びアポトーシス耐性細胞によって必要とされる他のタンパク質の構成単位を構成するとともに、ＴＣＡ回路のエネルギー源として異化反応に用いられている可能性がある。メチオニンについても幾分似た消費プロファイルが観察された（図８Ｄ）。
【００２７】
減少することが観察された上記のアミノ酸に対し、アラニン及びアスパラギン酸などの幾つかのアミノ酸がコントロール培養中に一時的に分泌された。ピルビン酸の一部が、アラニンアミノトランスフェラーゼによってアラニンに変換されている可能性がある。この経路はアポトーシス耐性細胞でより活性が高くなる場合があるので、コントロール細胞株に対してアラニン濃度がより大きな上昇につながる（図８Ｆ）。一方、アスパラギン酸は、アスパラギン酸アミノ酸ファミリーの第１のアミノ酸であり、アスパラギン酸トランスアミナーゼを用いてＴＣＡ回路の中間体であるオキザロ酢酸とグルタミン酸の変換によってα−ケトグルタル酸とともに生成する。その濃度は、コントロール細胞においてのみ最初の６日間上昇したのに対して、アポトーシス耐性細胞株では連続的に減少した。この反応は可逆反応であるため、増殖期の初期におけるアポトーシス耐性細胞株でのアスパラギン酸の欠乏は、アポトーシス耐性細胞株ではＴＣＡ回路における可逆的なオキザロ酢酸産物の産生量が制限されている可能性を示している。オキザロ酢酸がＴＣＡ回路の最初の段階においてアセチルＣｏＡとも反応することを考慮すると、アポトーシス耐性細胞株における乳酸からアセチルＣｏＡへのピルビン酸の流入量の増加は、オキザロ酢酸の需要を大きくしている可能性がある。これに対して、コントロール細胞株は乳酸を消費しておらず、したがってオキザロ酢酸からアスパラギン酸を生成しているため、コントロール細胞株ではアセチルＣｏＡに対する需要は低いものと考えられる。実際、こうしたアセチルＣｏＡに対する需要の不足は、細胞培養の最初の７日間にわたって見られた、アセチルＣｏＡに代わる副生成物としての乳酸のコントロール細胞内への蓄積を引き起こした可能性が考えられる。また、コントロール細胞における乳酸消費の不足がアセチルＣｏＡの供給を制限し、これにともなうアスパラギン酸の生成量の増加を引き起こした可能性も考えられる。
【００２８】
これらの結果は、アポトーシス耐性遺伝子を発現する細胞株ではＴＣＡ回路のエネルギー効率が高くなっていることを示すものであるが、こうした細胞反応の正確な解釈にはより詳細な代謝フラックスの分析が待たれるところである。消費される乳酸の運命には関係なく、本発明ではアポトーシス耐性細胞株は蓄積した乳酸を消費し、これにより細胞株の長い寿命及び高いＩＶＣＣに寄与するものである。
【００２９】
アポトーシス耐性細胞株が蓄積された乳酸を消費することによって寿命が延びるという点で独特であるならば、これらの細胞株は乳酸を含む培地又は標準よりも高い濃度のグルコースを含む培地中で培養できる可能性がある。乳酸が唯一の炭素源として与えられた場合には増殖及び生存率はいずれのタイプの細胞株においても支持されなかったが、乳酸がグルコースに加えて（データは示さず）一成分として与えられた場合、又は乳酸が老廃物として蓄積された場合には乳酸の消費が認められた。このことは、アポトーシス耐性細胞はピルビン酸から糖新生を行うことはできず、乳酸からエネルギーを得ることもできないが、グルコースが乳酸とともに与えられた場合には、細胞はグルコース及び培養に蓄積又は添加された乳酸の両方を消費することができることを示唆している。更に、高濃度（６０ｍＭ）のグルコースを含む培地では、アポトーシス耐性細胞株のＩＶＣＣ（並びにＶＣＤ及び生存率、図９Ａ〜Ｃ）はコントロール細胞株のＩＶＣＣ（並びにＶＣＤ及び生存率）よりも大幅に高かった。これは、高グルコース培地では、コントロール細胞株が２０ｍＭよりも高濃度の乳酸を蓄積したことによるものであり、高濃度の乳酸が毒性を示した可能性がある。これに対して、アポトーシス耐性細胞株では増殖期の初期に乳酸を消費することにより、より多くの生細胞を維持することが可能であったため、コントロールと比較して１７０％というＩＶＣＣの増大につながった（図９Ｃ）。
【００３０】
アポトーシス耐性細胞株は乳酸を消費して高いＩＶＣＣが実現されることから、治療用抗体などの対象とするタンパク質を発現するアポトーシス耐性ホスト細胞株由来の生産用細胞株では、コントロール細胞株に由来する生産用細胞株と比較して大幅に高い力価が実現された。このように高い力価は、治療用タンパク質又は他の対象とするタンパク質を生産する哺乳動物細胞株においてアポトーシス耐性遺伝子を使用することの潜在的な商業的利益を例証するものである。
【００３１】
次に、本発明を以下の具体的かつ非限定的な実施例を参照しながら説明する。
【実施例】
【００３２】
以下の実施例では、アポトーシス耐性遺伝子を過剰発現するＣＨＯ細胞株を震盪フラスコ培養中で、ピーク生細胞密度、寿命、カスパーゼ−３活性化、及びミトコンドリア膜電位（ＭＭＰ）について分析を行った。更に、これらの細胞株における栄養素の消費量及び代謝産物の産生量をコントロール細胞と比較することによって、アポトーシス耐性遺伝子の発現が哺乳動物細胞の培養システム中の栄養素の消費及び代謝産物の蓄積に与える影響について調べた。
【００３３】
材料及び方法
細胞培養：
コントロール細胞株Ｃ１０１３Ａとして指定したＣＨＯＫ１ＳＶ細胞株（ロンザ・バイオロジックス社（Lonza Biologics）英国、スラウ）を、３０ｍＭのグルコースを含み、６ｍＭのＬ−グルタミン（インビトロジェン社（Invitrogen）カタログ番号１０３１３〜０２１）を添加したＣＤ−ＣＨＯ培地（カタログ番号１０７４３〜０１１、インビトロジェン社（Invitrogen）カリフォルニア州カールスバッド）中で培養した。場合に応じて、６０ｍＭ（高グルコース培地として定義される）など異なる濃度のグルコースを含んだ別の無動物タンパク質培地を使用した。ウシ胎児血清はハイクローン・ラボ社（Hyclone Labs）（ユタ州ローガン）（カタログ番号ＳＨ３００７１．０３）より購入した。細胞培養をＣｅｄｅｘ自動細胞計数装置（イノバティス社（Innovatis）ドイツ）により観測した。積分生細胞数（ＩＶＣＣ、細胞・日／ｍｌ）を下式：
ＩＶＣＣ（ｄ１）＝［ＶＣＤ（ｄ０）＋ＶＣＤ（ｄ１）］／２＋ＶＣＤ（ｄ０）
（式中、ＶＣＤ＝生細胞密度）により計算した。
【００３４】
プラスミドの構築：
Ｅ１Ｂ−１９Ｋ（ＥＦ−１ａプロモーター）を単独で、又はＡｖｅｎ（ＣＭＶプロモーター）と組み合わせて構成的に発現するように設計した、これまでに述べられている（Ｎｉｖｉｔｃｈａｎｙｏｎｇ ｅｔ．ａｌ．，２００７）ｐＢＵＤＣＥ４．１ベクターを使用した。ＸＩＡＰΔ（ＣＭＶプロモーター）を発現するベクターは、サワーウォルド（Ｓａｕｅｒｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，２００２）により述べられるようなものを使用した。ブランクベクターとは最初のｐＢＵＤＣＥ４．１ベクターのことを指す。
【００３５】
グルタミンシンターゼ（ＧＳ）発現ベクター（ロンザ・バイオロジックス社（Lonza Biologics）英国、スラウより研究用ライセンスにて取得）に重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡをクローニングすることによってモデル抗体（抗体１）発現ベクターを構築した。
【００３６】
アポトーシス耐性細胞株の生成：
ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞株の指数増殖期の培養に、１）ｐＢＵＤＣＥ４．１、２）ｐＢＵＤＣＥ４．１−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ、３）ｐＢＵＤＣＥ４．１−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ−Ａｖｅｎ、並びに４）ｐＢＵＤＣＥ４．１−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ−Ａｖｅｎ及びｐＣＭＶ−ＸＩＡＰΔをトランスフェクトした。トランスフェクションは製造者の推奨するところにしたがってＦｕｇｅｎｅ（ロシュ社（）カタログ番号１８１５０７５、スイス、バーゼル）を使用して行った。トランスフェクトした２日後に、３００μｇ／ｍｌのゼオシン（上記のトランスフェクション１、２及び３に対し）、３００μｇ／ｍｌのゼオシン及び４００μｇ／ｍｌのハイグロマイシン（トランスフェクション４に対し）を含む増殖培地中、９６穴プレートに播いた（表１を参照）。各トランスフェクションから約２００個の抗生物質耐性クローンを増殖させて下記に述べるようにしてカスパーゼ３／７の活性について分析した。有望なクローンは、各抗生物質の不在下で１０代継代して安定性試験を行った。
【００３７】
【表１】
【００３８】
最初に、ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞株にブランクベクターをトランスフェクトし、ゼオシン耐性コロニーを選択することによってコントロール細胞株を作出した。これらの細胞株は、トランスフェクトしていないコントロールＣＨＯＫ１ＳＶと比較してＩＶＣＣが平均で約２０％低かったため、ＣＨＯＫ１ＳＶを後のすべての実験においてコントロール細胞株として用いた。次いで、最も有望なアポトーシス耐性細胞株であるＥＡＸ１９７及びコントロール細胞株を用い、ＧＳ発現ベクターを製造者の推奨するところにしたがって使用してモデル抗体を発現する生産用細胞株を作出した。細胞培養中の抗体をＮｅｐｈｅｌｏｍｅｔｒｙ（ベックマン・アレイ・システム社（Beckman Array System））によって測定した。
【００３９】
アポトーシス耐性細胞株の震盪フラスコ培養：
選択されたアポトーシス耐性細胞株を、６ｍＭのグルタミン及び必要な選択用抗生物質を添加したＣＤ−ＣＨＯ培地中で無添加の回分方式で培養した。一部の実験では、アポトーシス耐性細胞株の回分式培養に乳酸を添加して細胞株が消費した乳酸を補充した。更に、選択された抗体発現細胞株を、６ｍＭのグルタミン及び６０ｍＭのグルコースを添加した特別に配合した無動物タンパク質培地中で培養した。
【００４０】
カスパーゼ３／７活性のアッセイ：
約３×１０5個の各クローンの細胞を１ｍｌの増殖培地中、２４穴プレートに播種した。播種４日目後（ｄ４）に、約１×１０5個の細胞を３重に９６穴プレートに移した。スタウロスポリン（２μＭ ｆｃ）を添加し、細胞を１６時間インキュベートした後、ＡＰＯ−ＯＮＥキット（ビー・ディー・ラボ社（BD Labs））によりカスパーゼ３／７の活性についてアッセイした。この手順をスタウロスポリンを加えない点を除き、１０日目において繰り返した。４日目及び１０日目の両方においてカスパーゼ３／７の活性が有意に低かったクローンをＳＦ培地中で増殖させた。選択されたクローンのアポトーシス耐性を、フローサイトメトリー分析（下記を参照）及び場合によりミトコンドリア膜電位を測定することによって確認した。
【００４１】
フローサイトメトリーによるアポトーシス耐性クローンの分析：
指数増殖期の約１×１０6個の細胞を各震盪フラスコから抜き取って２４穴プレートに移し、スタウロスポリン（２μＭ ｆｃ）と１６時間インキュベートし、収穫してＰＢＳ中で１回洗った。次いで細胞をＣｙｔｏＰｅｒｍ（カタログ番号２０７５ＫＫ、ビー・ディー・バイオサイエンス社（BD BioScience））とインキュベートして固定するとともに細胞を透過性とした。ＰＢＳによる洗浄後、細胞をＦＩＴＣ標識抗カスパーゼ３（カタログ番号６８６５４、ビー・ディー・バイオサイエンス社（BD BioScience））抗体とインキュベートした後、フローサイトメトリーにより分析した。
【００４２】
ミトコンドリア膜電位（ＭＭＰ）アッセイ：
細胞を震盪フラスコ培養から播種後６日目に抜き取り、スタウロスポリン（５μＭ ｆｃ）と２時間インキュベートした。この後、細胞を洗い、製造者の推奨するところにしたがって親油性カチオン性色素であるＪＣ−１（ケイマン・ラボ社（Cayman Labs）ミシガン州アナーバー）で処理した。プレートをＦＬ５３５及びＦＬ５９５で読み取り、その比を計算した。
【００４３】
ウェスタンブロッティング：
示される細胞株から約１×１０7個の細胞を収穫し、ＰＢＳ中で洗浄し、１％ ＮＰ−４０、１２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｈｃｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．２ｍＭのＰＭＳＦ、及び１ｍＭのＥＤＴＡを含むＲＩＰＡバッファー中で溶解した。各試料からの細胞質タンパク質５０μｇを４〜１２％ ＮｕＰＡＧＥ勾配ゲルにロードし、Ｎｏｖｅｘシステム（インビトロジェン社（Invitrogen））でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。分離したタンパク質のバンドをニトロセルロース上に転写して、１）ヒトＥ１Ｂ−１９Ｋに対する抗マウス抗体（希釈率１：４０）（カタログ番号ＤＰ−１７、カルバイオケム社（CalBiochem）メリーランド州ギブスタウン）、２）ヒトＡｖｅｎに対する抗ウサギ抗体（希釈率１：１０００）（カタログ番号６１２５２１、ビー・ディー・バイオサイエンス社（BD BioScience）カリフォルニア州サンホセ）、及び３）ヒトＸＩＡＰに対する抗マウス抗体（カタログ番号６１６７１３、ビー・ディー・バイオサイエンス社）を用いて分析した。使用した抗体を含め、上記のプロトコールは、販売業者から購入した既知量の精製したＥ１Ｂ−１９Ｋ、Ａｖｅｎ、及びＸＩＡＰ（それぞれ約１０ｎｇ）を用いて最適化かつ標準化した。タンパク質のバンドはＥＣＬ検出キット（ジー・イー・ヘルスケア社（GE Healthcare）ニュージャージー州ピスカタウェイ）を使用して可視化した。
【００４４】
培地中の代謝産物濃度の測定：
すべての重要な代謝産物及び老廃物の濃度をＹＳＩ２７００自動分析装置を使用して測定した。アンモニアイオン濃度はフローインジェクション分析（Ｃａｍｐｍａｊｏ ｅｔ ａｌ，１９９４）により測定した。アミノ酸は逆相カラム（ウォーターズ社（Waters）マサチューセッツ州ミルフォード）を用い、ＨＰＬＣ（ウォーターズ社）によって測定した。
【００４５】
（実施例１）
アポトーシス耐性細胞株の生成及び特性評価
本実験で使用した細胞株、各細胞株を生成するためにそれぞれトランスフェクトした発現プラスミド、及び形質移入細胞（トランスフェクトーマ（Transfectoma））を単離するために使用した選択用物質のリストを上記表１に示す。表に示した細胞株は、各トランスフェクションから生成された多数のクローンの内の代表的なものである。各細胞株の名称は、ホスト細胞株にトランスフェクトされたアポトーシス耐性遺伝子に由来している。例えばＥＡＸ１９７は、Ｅ１Ｂ−１９Ｋ（Ｅ）、Ａｖｅｎ（Ａ）、及びＸＩＡＰΔ（Ｘ）をトランスフェクトした細胞株である。アポトーシス耐性（アポトーシスR）という表記は、これらのアポトーシス耐性遺伝子の１以上がトランスフェクトされた細胞株を指して用いる。
【００４６】
本実験で用いたすべてのアポトーシス耐性細胞株について、ウェスタンブロッティング、カスパーゼ３／７、及びミトコンドリア膜電位による特性評価を行った（データは示さず）。１重形質移入体Ｅ６４、又は２重形質移入体ＥＡ６３、ＥＡ１１２、ＥＡ１６７及びＥＡ１９０はいずれも、コントロールであるトランスフェクトされていない細胞株Ｃ１０１３Ａで見られたバックグラウンドレベルよりも高い発現レベルでＥ１Ｂ−１９Ｋを発現した。４つの２重形質移入体の内、細胞株ＥＡ１１２及びＥＡ１６７は、Ｅ１Ｂ−１９Ｋ（約１９ｋＤａ）及びＡｖｅｎ（約５５ｋＤａ）の両方を発現した。細胞株ＥＡ６３及びＥＡ１９０は、Ｅ１Ｂ−１９Ｋを高レベルで発現したが、Ａｖｅｎの発現レベルは極めて低かった。２重ベクターｐＢＵＤＣＥ４．１−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ−ＡｖｅｎとｐＣＭＶ−ＸＩＡＰΔをトランスフェクトすることによって生成された４つの細胞株、すなわちＥＡＸ６４、ＥＡＸ９９、ＥＡＸ１４８及びＥＡＸ１９７の内、ＥＡＸ１９７のみが３種類のタンパク質のすべてを検出可能なレベルで発現した。
【００４７】
トランスフェクトしていないコントロールのレーンＣ１０１３Ａを含むすべてのレーンにおいて組換えＡｖｅｎの上側に観察された約５５ｋＤａのバンドは、免疫後の血清では可視化されたが免疫前の血清では可視化されなかったことから内因性のＡｖｅｎタンパク質であると考えられた（Ｓａｕｅｒｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｃｈａｕ ｅｔ ａｌ．，２０００）。トランスフェクトされたＡｖｅｎ遺伝子は最初の６個のアミノ酸が欠失しているが、これらのアミノ酸の欠失はタンパク質の生物学的活性に影響しないことが示されている。このため、トランスフェクトされたＡｖｅｎは内因性のＡｖｅｎよりも若干小さい。Ａｖｅｎの分解産物である可能性のある４０ｋＤａのバンドがこのタンパク質をＥ１Ｂ−１９Ｋとともに過剰発現したすべての細胞株において観察された。同様のサイズの分解生成物が、ＡｖｅｎがＢｃｌ−ＸＬ（Ｓａｕｅｒｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，２００５）又はＢｃｌ−２（Ｆｉｇｕｅｒｏａ、未発表の観察）とともに過剰発現された場合に観察されている。更に、Ａｖｅｎの発現は、Ｅ１Ｂ−１９Ｋ、Ａｖｅｎ及びＸＩＡＰΔを過剰発現するＥＡＸ１９７を含む３重形質移入体において顕著に低かった。
【００４８】
興味深い点として、トランスフェクトしたＸＩＡＰΔの発現レベルは内因性の完全なＸＩＡＰタンパク質の発現レベルと比較して顕著に低かった。ＸＩＡＰとＸＩＡＰΔとの間の発現レベルの明瞭な差は、アポトーシス耐性タンパク質のこれら２つの形態の抗体結合効率の差によって一部説明することができる。内因性のＸＩＡＰと形質移入されたＸＩＡＰΔとの間の明瞭な発現レベルの差は、アポトーシスの防止におけるこのトランスフェクトタンパク質の寄与に疑問を投げかけるものである。実際、この実験は、所定のアポトーシス耐性遺伝子の発現レベルと、そのタンパク質が細胞株に与えることのできるアポトーシス阻害のレベルとの間には必ずしも直接的な相関が認められないことを示唆している。
【００４９】
カスパーゼ３／７の活性はアポトーシスに対する細胞株の耐性の大きさの指標を与えることから、カスパーゼ３／７活性についてＡＰＯ−ＯＮＥによりそれぞれのアポトーシス耐性細胞株を調べた。簡単に述べると、このアッセイでは、蛍光前駆基質であるＺ−ＤＥＶＤ−Ｒ１１０がカスパーゼ３／７によって用量依存的に開裂される。ＥＡ１６７及びＥＡＸ１９７並びにコントロール細胞株の指数増殖期の培養をスタウロスポリンで１６時間処理することによってアポトーシスを誘導した後、カスパーゼ３／７を測定した。スタウロスポリン処理したコントロール細胞のカスパーゼ３／７活性を任意に１００％に設定した。これらの条件下で、ＥＡ１６７及びＥＡＸ１９７細胞のカスパーゼ活性はそれぞれコントロールの３０％及び３５％であったが、このことはこれらの細胞株がアポトーシス誘導に対して少なくとも部分的に耐性を有することを示唆している（図２Ａ）。ＥＡ１６７及びＥＡＸ１９７のアポトーシス耐性の更なる根拠として、これら２つの細胞株とコントロール細胞株のスタウロスポリン処理培養をＦＩＴＣ結合抗カスパーゼ３抗体で標識した後、フローサイトメトリーで分析した。図３に見られるように、非処理又は溶媒（ＤＭＳＯ）処理によらず、３つの細胞株のすべてにおいてカスパーゼ３陽性細胞は集団の１％以下であった。しかしながら、スタウロスポリンによる処理後にはコントロール細胞集団の９１％がカスパーゼ３について陽性であった。これに対し、細胞株ＥＡＸ１９７に由来する集団のわずか９％、及び細胞株ＥＡ１６７に由来する集団の３０％がカスパーゼ３について陽性であり、これら２つの細胞株におけるアポトーシス耐性の表現型が証明された。
【００５０】
アポトーシスに対する耐性が寿命の増大につながるか否かを調べるため、複数のＥＡ細胞株を震盪フラスコ（回分方式）中で増殖させ、生細胞密度（ＶＣＤ）及び積分生細胞数（ＩＶＣＣ）の両方を観測した。細胞の比生産性（specific productivity）が変化しないものと仮定すると、積分生細胞数が大きくなると培養の体積生産性が向上する。したがってＩＶＣＣを、生産用細胞株の作出のためのホストとして機能しうる優れたアポトーシス耐性細胞株をスクリーニングするためのパラメータとして用いることができる。図２Ｂに示されるように、相対カスパーゼ３／７活性が低い細胞株は、ＩＶＣＣの高い細胞株を生成する傾向が見られた。ＥＡ細胞株のそれぞれはコントロールに対して低いカスパーゼ３／７活性を示したが、ＩＶＣＣとそれぞれの細胞株が有するカスパーゼ３／７のレベルとの間には厳密な相関は認められなかった。更に、特定のアポトーシス耐性細胞株はアポトーシス耐性の表現型の程度に関してその姉妹クローンよりも安定していた。ＥＡ１６７は強力な抗アポトーシス活性及び震盪フラスコ培養中での安定した増殖性の両方を有することから、この細胞株を更なる実験用に選択した。更に、ＥＡ１６７はこのパネルでは最も安定した細胞株であり、ウェスタンブロットによって検出されるようにＡｖｅｎを高レベルで発現する。
【００５１】
アポトーシス経路のシグナル伝達分子の多くがミトコンドリアと相互作用するかあるいはミトコンドリア内部に存在している。ミトコンドリアでこれらのタンパク質はミトコンドリアの膜と相互作用してミトコンドリアの透過性を調節することによりアポトーシスを制御する。したがって、ミトコンドリア膜電位（ＭＭＰ）は、コントロールに対するＥＡ１６７及びＥＡＸ１９７のアポトーシス耐性の特性を比較するための細胞生理学の別のモニターとして機能する。図２Ｃのアッセイの結果に見られるように、ＥＡ１６７及びＥＡＸ１９７はいずれもコントロール細胞株よりも高いＭＭＰを有していた。
【００５２】
（実施例２）
ＣＨＯＫ１ＳＶの生細胞密度に対するＥ１Ｂ−１９Ｋの影響
Ｅ１Ｂ−１９ＫをＡｖｅｎとともに過剰発現する２重形質移入体（ＥＡ１６７）、Ｅ１Ｂ−１９ＫをＡｖｅｎ及びＸＩＡＰΔとともに過剰発現する３重形質形質移入体（ＥＡＸ１９７）、並びにＥ１Ｂ−１９Ｋのみを過剰発現する形質移入体（Ｅ６４）を図４でコントロール（ホスト）細胞株と比較した。コントロール細胞株のピークＶＣＤは７．７×１０6細胞／ｍｌに達し、Ｅ６４（Ｅ１Ｂ−１９Ｋのみを発現）のピークＶＣＤは８．９×１０6細胞／ｍｌであったのに対して、ＥＡ１６７のピークＶＣＤは１．４×１０7細胞／ｍｌであり、ＥＡＸ１９７のピークＶＣＤは１．５×１０7細胞／ｍｌよりも高く、コントロール細胞株と比べて１９０％以上の増加を示した。ＥＡ１６７及びＥＡＸ１９７の生存率は、恐らく栄養素の枯渇のために播種後８日目又は９日目に急激に低下したが、コントロール及びＥ６４細胞株の生存率の低下はより緩慢であった（図４Ｂ）。ＩＶＣＣに対する正味の影響を図４Ｃに示す。コントロール細胞株のＩＶＣＣは４．９×１０7細胞・日／ｍｌであり、次がＥ６４ のＩＶＣＣ（５．２×１０7細胞・日／ｍｌ）であった。明らかに２つのアポトーシス耐性細胞株ＥＡ１６７（６．３×１０7細胞・日／ｍｌ）及びＥＡＸ１９７（６．６×１０7細胞・日／ｍｌ）のＩＶＣＣは、コントロール細胞株のＩＶＣＣよりも有意に高かった（ＥＡ１６７及びＥＡＸ１９７でそれぞれ１３６％及び１４０％）。
【００５３】
ＥＡ１６７及びＥＡＸ１９７以外にも、幾つかの他のアポトーシス耐性細胞株が同様に低い乳酸産生表現型を示した（データは示さず）。更に、低い乳酸産生特性を示す野生型細胞株も稀ではあるが報告されている（Ｐａｓｃｏｅ ｅｔ ａｌ，２００７）。
【００５４】
（実施例３）
アポトーシス細胞株の代謝プロファイル
アポトーシスからの保護を与えるアポトーシス耐性細胞株ＥＡ１６７及びＥＡＸ１９７の生理学的性質を回分培養中でコントロール細胞と比較するため、回分培養の開始時に与えられる主要な栄養素及びアミノ酸、すなわちグルコース、グルタミン酸及びグルタミンの濃度を観測した。更に、老廃物であるアンモニア及び乳酸の蓄積についても観測を行った。図５に、ＥＡＸ１９７及びＥＡ１６７並びにコントロール細胞株を市販のＣＤ−ＣＨＯ培地中、震盪フラスコ中で回分方式で培養した場合のこれらの代謝物質の濃度を示す。図５Ａに示されるように、グルコースは播種後６日目又は７日目までに３つの細胞株のすべての培地から急速に枯渇した。グルタミンの枯渇についてはアポトーシス耐性細胞株とコントロール細胞株との間に有意差は認められず、グルタミン酸濃度は全日数にわたって３つの細胞株で大きく変化しなかった。３つの細胞株のすべてにおいて、４日目までの細胞増殖期の初期において乳酸の蓄積が認められた（図５Ｂ）。コントロール細胞株では、乳酸は６日目まで増加し続けた（その時点で２．８ｇ／Ｌに達した）後、乳酸濃度に若干の低下が認められ、最終的に１．８ｇ／Ｌに達した。こうした量の乳酸は、培養のｐＨを低下させることが予想され、重炭酸塩を添加することによってｐＨが調節されているバイオリアクター中では浸透圧が上昇することになる。これらの特性のすべて及び他のストレス因子によって動物細胞にとって有毒な環境がもたらされうる。これに対して、アポトーシス耐性細胞株中の乳酸濃度は短期間増大した後、５日目以降は急速に低下し、７日目（ＥＡ１６７）又は８日目（ＥＡＸ１９７）までには乳酸は完全に消失した。興味深い点として、図５Ａにおいてこれら２つの細胞株では乳酸が０にまで低下した直後にＶＣＤが急激に低下しており、細胞生存率の低下が培地中に利用可能なグルコース又は乳酸がなくなったことによるものであることを示唆している。
【００５５】
アポトーシス耐性細胞株とコントロール細胞株との間に認められた別の差異はアンモニアのプロファイルである（図５Ｃ）。ＥＡ１６７及びＥＡＸ１９７中のアンモニア濃度は、乳酸濃度の低下が始まった６日目に若干低下し、その後やがて再び増大した。しかしながら、アポトーシス耐性細胞株の全体のアンモニア濃度はコントロール細胞株よりも低く、このことはアポトーシス耐性細胞株がコントロール細胞株と比較してより高いＩＶＣＣに達し、したがって全体の細胞増殖率がより高かったことから予想外の結果である（図４Ｃ）。
【００５６】
上記のデータから、アポトーシス耐性細胞株の特性がコントロール細胞株とは大きく異なっていることが明らかである。しかしながら、複数のクローンについて幾分異なる実験条件下で調べたところ、各アポトーシス耐性形質移入体間で幅広い表現型が観察された。表現型の変異はコントロール細胞株の単離クローンにおいても見られることから、適当なスクリーニング法を用いることによってコントロール細胞株から稀なアポトーシス耐性クローンを選択することが可能である。この点に関しては、マタノビッチ（Mattanovich）及びボース（Borth）（２００６）によって細胞分別を応用して所望の性質を有する稀な変異体を野生型（コントロール）細胞株から単離することについて概説されている。
【００５７】
（実施例４）
乳酸添加の影響
任意の時点においてある細胞培養中に存在する乳酸の量は、その細胞株によって分泌される乳酸の量から細胞株によって消費される乳酸の量を差し引いた量によって決まる。アポトーシス耐性細胞株が実際に乳酸を消費しているか否か、すなわちこれらの細胞株において正味の乳酸産生量が低下しているか否かを調べるため、３つの細胞株すべての培養を毎日観察し、アポトーシス耐性細胞株とコントロール細胞株との間で乳酸濃度に目立った差があれば外因性の乳酸を添加することによって埋めた。上記で観察したように、無添加のアポトーシス耐性細胞株ＥＡ１６７及びＥＡＸ１９７の乳酸濃度は５日目に低下しはじめ（図６Ａ及び６Ｂ）、７日目（ＥＡ１６７、無添加）又は８日目（ＥＡＸ１９７、無添加）までに乳酸は枯渇した。コントロール細胞株の乳酸プロファイルは６日目まで増加しつづけ、そこから次の３日間濃度は若干低下したが０にまで低下することはなかった。アポトーシス耐性細胞株を毎日観察し、個別の流加培養に７日目に２．５ｇ／Ｌ（ＥＡ１６７に対して、図６Ａ）及び８日目に２ｇ／Ｌ（ＥＡＸ１９７に対して、図６Ｂ）となるように乳酸を加えてコントロール細胞株の濃度と同様の濃度とした。補充分の乳酸の添加にも関わらず、アポトーシス耐性細胞株ではコントロールと比較して６日目〜１２日目にかけて乳酸濃度は大幅に急速に低下した。実際、ＥＡＸ１９７の流加培養では６日目〜７日目にかけて乳酸濃度が２．５〜０．２ｇ／Ｌにまで低下したのに対して、コントロール培養では同じ期間に乳酸濃度は２．７〜２．４ｇ／Ｌに低下したに過ぎなかった。したがって、乳酸はアポトーシス耐性細胞株ではコントロール細胞株と比較して補充分の乳酸の添加後少なくとも７日間にわたって加速した速度で消費されたものと考えられる。
【００５８】
ＶＣＤ及び細胞生存率に対する乳酸補充の影響をそれぞれ図７Ａ及び７Ｂに示す。上記で観察したように（図５Ａ）、無添加のアポトーシス耐性細胞株のＶＣＤは８日目（ＥＡ１６７）及び９日目（ＥＡＸ１９７）から急速に低下した。これは恐らく、グルコース及び／又は乳酸を含む１以上の不可欠な培地成分がこれらの培養中で枯渇したことによるものと考えられる。コントロール細胞株では７日目から緩慢な低下を示した。しかしながら、乳酸を補充した培養（ＥＡ１６７（乳酸添加）及びＥＡＸ１９７（乳酸添加））ではＶＣＤの低下はより緩やかであり、一方の細胞株（ＥＡＸ１９７（乳酸添加））では、ＶＣＤは、１４日目にこの培養が最終的に死滅するまで８×１０6〜１０×１０6細胞／ｍｌの間で安定した。図７Ｂに示される細胞生存率は、培地に乳酸を補充した２つのアポトーシス耐性培養において同様のより緩やかな低下を示した。これらの結果は、アポトーシス耐性細胞株が内因性及び補充された乳酸の両方を効率的に利用して正細胞密度及び生存率を維持することが可能であるのに対して、コントロール細胞株は同様の効率的な乳酸消費を行うことができないことを示唆している。この差は、無添加のアポトーシス耐性細胞株よりも約１８０〜２２０％高く、コントロール培養よりも約２３５％〜２５０％高かった乳酸添加アポトーシス耐性細胞株のＩＶＣＣに反映されている。
【００５９】
図７Ｄ〜Ｆに示される他の栄養素及び代謝産物の多くは、図５の無添加培養で上記に観察されたものと同様のプロファイルを示した。グルコース及びグルタミンは培養の初期の時点で急速に消費された。アポトーシス耐性細胞株のアンモニアのプロファイルもやはり、無補充及び乳酸補充培養の両方において乳酸の消費が始まった時点でわずかに低下した。上記の各実験と同様、各アポトーシス耐性細胞株の最終的なアンモニア濃度は、ＩＶＣＣが４つのアポトーシス耐性細胞株のすべてにおいて大幅に高かったにも関わらずコントロールの濃度よりも低かった。グルタミン酸の濃度は乳酸添加培養と無添加培養との間で異なり、無添加及びコントロール細胞株と比較して添加培養でグルタミン酸の枯渇は大幅に大きかった。
【００６０】
（実施例５）
アポトーシス耐性細胞株及びコントロール細胞株のアミノ酸プロファイル
２０種類のアミノ酸のそれぞれの濃度を、コントロール細胞株、並びに無添加及び乳酸添加アポトーシス耐性細胞株の培養において観測した。グルタミン及びグルタミン酸以外のアミノ酸の消費又は産生に関しては、表２に示されるように９種類の必須アミノ酸（フェニルアラニン、トレオニン、メチオニン、リジン、トリプトファン、ロイシン、イソロイシン、バリン及びヒスチジン）のいずれも枯渇しなかった点を最初に述べておく必要がある。アポトーシス耐性細胞株（無添加）及びコントロール細胞株の培養では、アスパラギン、セリン、トリプトファン及びシステイン（斜体で示す）はほぼ完全に枯渇した。興味深い点として、３種類の分枝鎖アミノ酸、すなわちイソロイシン、ロイシン及びバリン（表２に灰色の網かけで示す）はいずれも、コントロールと比較してアポトーシス耐性細胞株においてより速やかに培地から欠乏し、この欠乏は乳酸添加培養においてより顕著であった（図８Ａ〜Ｄ）。グルタミン酸に加え、これら３つのアミノ酸の最終濃度は乳酸添加培養において培地から大幅に低下した。消費率が高かった他のアミノ酸（最終濃度が培地中の最初の濃度の５０％以下）としては、チロシン、フェニルアラニン、メチオニン（図８Ｄ）及びアスパラギン酸（図８Ｅ）がある。
【００６１】
培地中に分泌されたアミノ酸についてコントロール細胞株とアポトーシス耐性細胞株との間で比較を行うのも考慮の対象として興味深い。図８Ｅに示されるように、コントロール細胞株が最初の６日間にわたって培地中にアスパラギン酸を蓄積したのに対して、４つのアポトーシス耐性細胞株培養のすべてにおいて同じ期間でアスパラギン酸濃度は低下した。更に、各アポトーシス耐性細胞株はコントロール細胞株と比較して最初の６日間にわたって大幅に多量のアラニンを分泌した（図８Ｆ）のに対して、これよりも遅い期間ではすべての細胞株がアラニンを消費した。更に、各アポトーシス耐性細胞株はコントロール細胞株と比較して細胞培養の全体を通じてより多くのホモシスチンを産生した（図８Ｇ）。
【００６２】
（実施例６）
高濃度グルコースの存在下での回分培養
アポトーシス耐性細胞株が乳酸を利用できるならば、有毒なレベルの乳酸が蓄積するためにコントロール細胞にとっては阻害性を示すようなグルコース濃度においてもこれらの細胞株は生存できる可能性がある。更に、これらの細胞株の増殖は乳酸を唯一の炭素源として含む培地によって支持されうる可能性がある。高濃度のグルコースなどのため浸透圧が維持できなくなるために上記の実験で使用したＣＤ−ＣＨＯ培地を使用することは不可能であり、そのためこれらの実験では新しい培地を使用する必要があった。したがって、上記の実験で最も高い持続的増殖性を示したＥＡＸ１９７の増殖速度論を、６０ｍＭのグルコース（高濃度グルコース）又は３０ｍＭの乳酸を含む特別に配合した無動物タンパク質培地中でコントロール細胞株と比較した。アポトーシス耐性細胞株及びコントロール細胞株のいずれにおいても、グルコースがまったく存在しない場合、すなわち乳酸のみが存在する場合には持続的増殖が見られなかった（データは示さず）。両方の細胞株を「高濃度」（６０ｍＭ）のグルコースを含む同じ特別配合培地中で培養したところ、ＥＡＸ１９７は、特に細胞培養の後期においてコントロール細胞株よりも高いＶＣＤ、生存率及びＩＶＣＣを示した（図９Ａ〜Ｃ）。ＥＡＸ１９７細胞株は、上記のＣＤ−ＣＨＯ培地中におけるよりもコントロールと比較した場合の全体のＩＶＣＣの増加率は低かった（１３０％）が、後期の高い生存率のためにその差は依然有意であった。高濃度グルコース中で培養したこれら２つの細胞株の乳酸プロファイルを図９Ｄに示す。ＩＶＣＣと同様、両細胞株の乳酸プロファイルは、ＣＤ−ＣＨＯ培地で観察されたものとは幾分異なっていた（図９Ｄ）。ＣＤ−ＣＨＯ培地を用いた上記の結果と同様、特別配合培地中のアポトーシス耐性細胞株ではコントロールよりも早期に正味の乳酸消費が開始され（２日目まで、図９Ｄに示される）、最大乳酸濃度は大幅に低かった（コントロール細胞株の２．４ｇ／Ｌに対して１．２ｇ／Ｌ）。コントロール細胞は、培地中の乳酸の消費も開始した５日目までは乳酸の正味の産生を示した。ＣＤ−ＣＨＯ培地は適当な組成を有する市販の配合物であるため、これらの異なる配合物中において乳酸消費プロファイルが異なる原因を理解する目的で２つの配合物中の培地成分の正確な比較を行うことはできなかった。
【００６３】
（実施例７）
高グルコース培地中のアポトーシス耐性細胞株の生産性
続いて、アポトーシス耐性細胞株であるＥＡＸ１９７及びコントロール細胞株をホストとして使用して、モデル抗体を発現する生産用細胞株を作出した。各細胞株について同数のクローンを調べ、各ホストから生成した最も優れたクローンを抗体の生産性について震盪フラスコ回分方式で比較した。高グルコース環境下における各細胞株の性能を比較するため、６０ｍＭ（高濃度）グルコースを含む特別配合培地を炭素源として使用した。標準培地（図１０Ａ）中では、ＥＡＸ１９７から誘導された生産用細胞株では力価が４８９ｍｇ／Ｌであり、３３７ｍｇ／Ｌの力価を示したコントロール細胞株と比較して１４５％の増加率であった。高グルコース培地（図１０Ｂ）中では同じ細胞株が６７８ｍｇ／Ｌの力価を示し、コントロール細胞株（３４８ｍｇ／Ｌ）の力価と比較して１７８％の増加率であった。産生量の向上は、ＥＡＸ１９７ではＩＶＣＣがコントロール細胞株に対して１８８％に増大していることに一部よるものである（データは示さず）。
【００６４】
（実施例８）
Ｅ１Ｂ１９Ｋ＋ＡＶＥＮ±ＸＩＡＰΔの過剰発現のアポトーシスの阻害に対する影響
ミトコンドリア内のアポトーシスカスケードの主要な活性化因子を図１に示した。アポトーシス耐性ＣＨＯ細胞株を作出するため、アポトーシスの早期、中期及び後期に働く３つのアポトーシス耐性遺伝子を選択した。これらの遺伝子は、Ｅ１Ｂ１９Ｋ（Ｅ）、ＡＶＥＮ（Ａ）及びＸＩＡＰΔ（Ｘ）である。広く用いられている形質移入（トランスフェクション）用ホスト細胞株であるＣＨＯＫ１ＳＶに、Ｅ１Ｂ１９Ｋ及びＡＶＥＮを、ＸＩＡＰΔとともに、又はＸＩＡＰΔ抜きでトランスフェクトした。多数の形質移入細胞をスクリーニングして各トランスフェクションから数個のクローンを更なる実験用に選択した。これらの細胞株の増殖プロファイルの実験により、これらの細胞株は極めて高いＶＣＤに達し、一般にそのＩＶＣＣはコントロールのＩＶＣＣの約２倍高いことが示された。アポトーシス耐性細胞株では播種後８日目までに生存率が低下したが、乳酸を消費することによって１０日目以降は生存率が回復した。Ｅ１Ｂ１９Ｋ＋ＡＶＥＮ±ＸＩＡＰΔを発現しているアポトーシス耐性細胞株の培養液は、アンモニア及び乳酸の濃度が低下しているか検出不能なレベルであり、グルタミン酸は培地から枯渇していた。
【００６５】
（実施例９）
抗体力価を高めるためのＢｃｌ−２ｄの使用
上記の結果は、アポトーシス耐性細胞株はコントロール細胞と比較して乳酸の蓄積量が少なく、アポトーシス耐性培養の生存率を高グルコース培地中で維持することが可能であることを示している。以下の震盪フラスコ回分培養実験では、Ｂｃｌ−２ｄ並びに抗体の重鎖及び軽鎖を発現するアポトーシス耐性細胞株（Ｃ２０８８Ｂ）を標準的濃度（４．８ｇ／Ｌ）及び高濃度（９．５ｇ／Ｌ）のグルコース中、異なる播種密度で播種した。この結果は、アポトーシス耐性細胞株は９．５ｇ／Ｌのグルコースを含む培地中に１ｅ６細胞／ｍｌの密度で播種した場合、播種後７日目に１４ｅ６細胞／ｍｌのピークＶＣＤ（図１１Ａ）、及び２ｇ／Ｌの抗体力価に達したことを示す。これに対して、標準条件下（接種密度０．３ｅ５細胞／ｍｌ及び４．８ｇ／Ｌ）で培養したＣ２０８８ＢはビークＶＣＤが７ｅ６細胞／ｍｌ、抗体力価は１ｇ／Ｌであった（図１１Ｂ）。これは、高グルコース条件では標準条件（すなわち、４．８ｇ／Ｌのグルコースを含む培地中、０．３ｅ５細胞／ｍｌの播種密度）と比較して抗体力価が２００％に増大することを意味する。
【００６６】
以上に本発明の全容を説明したが、本発明には、多くの変更及び改良を、添付の特許請求の範囲の趣旨及び範囲から逸脱することなく行いうることは当業者には明白であろう。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高濃度のグルコース添加により、流加細胞培養中で高い生細胞密度及び長い培養寿命を実現するための方法に関する。本方法は、対象とする分泌タンパク質の産生量を高めるうえで有用である。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物細胞の培養は、適当な翻訳後修飾がなされたタンパク質を生産することが可能であることから、多くの組換えタンパク質製造プロセスにおいて選択されている系である。製造需要が高まるにつれ、産物の収率を高めることによってプロセス効率を改善するとう強い動機づけがある。商業的な製造プロセスにおいて生物学的治療を目的としたタンパク質又は他のタンパク質の１Ｌ当たり数グラムの製造レベルを実現するには、哺乳動物細胞の培養及び操作方法を最適化することが不可欠である。現在の高密度、無タンパク質の哺乳動物細胞培養に内在する問題として細胞死の問題があり、一般的な流加バイオリアクターではアポトーシスによるものが最大でその８０％を占める。こうした細胞死は、栄養及び増殖因子の欠乏、酸素欠乏、毒素の蓄積、及び剪断応力といった諸条件に応じて誘導されるものである（Ｇｏｓｗａｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ６２：６３２〜６４０（１９９９））。アポトーシスは最大の生細胞密度を制限し、死滅期の開始を早め、異種由来タンパク質の収率を潜在的に低下させる（Ｃｈｉａｎｇ ａｎｄ Ｓｉｓｋ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ９１：７７９〜７９２（２００５）；Ｆｉｇｕｅｒｏａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．７３：２１１〜２２２（２００１），Ｍｅｔａｂ Ｅｎｇ ５：２３０〜２４５（２００３），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ８５：５８９〜６００（２００４）；Ｍｅｒｃｉｌｌｅ ａｎｄ Ｍａｓｓｉｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ４４：１１４０〜１１５４（１９９４））。
【０００３】
アポトーシスは細胞の内外で開始されるシグナル伝達経路の複雑なネットワークによって引き起こされるものであり、細胞死の最終ステージを媒介するシステインアスパラギン酸プロテアーゼ（カスパーゼ）が最終的に活性化される。これについては図１を参照されたい。哺乳動物の細胞培養における長期の産生培養の間に細胞生存率を維持する目的でアポトーシスを防止する様々な方法が用いられている（Ａｒｄｅｎ ａｎｄ Ｂｅｔｅｎｂａｕｇｈ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２２：１７４〜１８０（２００４）；Ｖｉｖｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔａｂ Ｅｎｇ ５：１２４〜１３２（２００３））。増殖因子、加水分解物、及び律速栄養素を培地に添加して細胞外環境を変化させることによってタンパク質の産生量が高まり、アポトーシスが減少する（Ｂｕｒｔｅａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ Ａｎｉｍ．３９：２９１〜２９６（２００３）；Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４８：５９〜７４（２００５））。細胞内からのアポトーシスのシグナル伝達カスケードを阻害する化学的及び遺伝子的手法を模索する研究者もいる（Ｓａｕｅｒｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ７７：７０４〜７１６（２００２），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ８１：３２９〜３４０（２００３））。
【０００４】
ガン細胞において発現量が増大している遺伝子の過剰発現が、カスパーゼ活性化の上流でアポトーシスを防止することによってバイオリアクター中で増殖させた細胞の生存期間を延ばしうることが研究者によって見出されている（Ｇｏｓｗａｍｉ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ；Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １６：８８〜９５（１９９８）；Ｍｅｅｎｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ８０：７０６〜７１６（２００２）；Ｔｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ７９：１４７〜１５９（２０００）、及び、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ６８：３１〜４３（２０００））。生産用細胞株におけるこれらのタンパク質の発現量の増大は、アポトーシスを引き起こす細胞内のシグナル伝達を効果的に抑制することによって細胞死を制限することにより、特定の場合において生存率を維持し生物治療物質の産生量を増大させた。
【０００５】
高密度、無タンパク質の哺乳動物細胞培養にやはり内在する問題点として、老廃物の蓄積及びそれが細胞増殖にもたらす悪影響がある。細胞培養における最も一般的な２つの老廃物は、乳酸及びアンモニアである。過剰な乳酸の蓄積の問題に対処するために多くの手法が考案されており、１）培地のグルコース濃度を低く維持する（Ｋｕｒｏｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＢｉｏｅｎｇ ４４：９５〜１０３（１９９４）；Ｘｉｅ ａｎｄ Ｗａｎｇ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ４３：１１７５〜１１８９（１９９３）；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｈｅｍ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ７９：１７１〜１８１（２００４）；Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ４６：５７９〜５８７（１９９５））、２）フルクトースなどの代替的な糖を添加する（Ｍａｒｔｉｎｅｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ６０：５０８〜５１７（１９９８），Ａｌｔａｍｉｒａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １１０：１７１〜１７９（２００４）ａｎｄ Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １２５：５４７〜５５６（２００６），Ｗａｌｓｃｈｉｎ ａｎｄ Ｗｕ，Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １３１：１６８〜１７６（２００７））、３）相同組み換え又はＳｉＲＮＡ技術により乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の発現を部分的にノックアウトする、４）ピルビン酸カルボキシラーゼの過剰発現、５）ピルビン酸脱水素酵素（ＰＤＨ）の活性化因子（ＰＤＨキナーゼ阻害を介した）であるジクロロ酢酸塩（ＤＣＡ）の使用、６）ＬＤＨ競合阻害剤であるオキサミン酸、及び７）灌流による除去（米国特許出願公開第２００９／００４２２５３Ａ１号）などが挙げられる。
【０００６】
当初は、多くのアポトーシス経路のタンパク質の固有の機能は、ミトコンドリア膜に結合してミトコンドリアの透過性を調節することによりアポトーシスを調節することと考えられていた。最近の研究により、アポトーシスを引き起こすシグナル伝達に関与する主要なタンパク質は、細胞の代謝及びエネルギー恒常性を制御するタンパク質と相互作用してこれらのタンパク質に影響を及ぼすことが示された。Ｍａｊｏｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔａｂ Ｅｎｇ ９：３１７〜３２６（２００７）（概論）、及びＷｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ７：１０２１〜１０２８（２００５）を参照されたい。最近の研究では、ＢｃＬ−ＸＬを過剰発現しているＣＨＯ細胞のマイクロアレイ分析により、糖新生の主要な酵素である乳酸脱水素酵素の発現量が増大していることが示された。
【０００７】
特定の細胞及びウイルスは、ミトコンドリアのアポトーシス経路において機能するアポトーシス耐性遺伝子を生産する。これらの遺伝子は、以下の３つのグループ、すなわち、１）経路の早期に働くもの（例えば、Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーのタンパク質）、２）経路の中期に働いてアポトソーム複合体を妨害又は阻害するもの（例えば、Ａｖｅｎ）、及び３）経路の後期に働くもの（例えば、ＸＩＡＰなどのカスパーゼ阻害因子）に分類することができる。これらの遺伝子の大半のものの機能は、哺乳動物の発現系においてこれらを過剰発現させることによって研究されており、特定の場合では、それぞれが経路の異なる部分に由来する２以上の遺伝子の過剰発現の組み合わせによる影響が調べられている。その例としては、１）ＣＨＯ細胞におけるＢｃＬ−ＸＬとＸＩＡＰの欠失突然変異（ＸＩＡＰΔ）との相加的効果（Ｆｉｇｕｅｒｏａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．５：２３０〜２４５（２００３））、２）ＢＨＫ細胞におけるＥ１Ｂ−１９ＫとＡｖｅｎ（Ｎｉｖｉｔｃｈａｎｙｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ９８：８２５〜８４１（２００７））、及び３）ＢｃＬ−ＸＬ、Ａｖｅｎ、及びＸＩＡＰΔ（Ｓａｕｅｒｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ，（２００３）；Ｓａｕｅｒｗａｌｄ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ９４：３６２〜３６９（２００６））が挙げられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、これらの研究では、細胞の細胞代謝状態に対するアポトーシス耐性遺伝子の影響については調べられていない。したがって、高い生細胞密度、寿命、及び生産性を実現するために栄養消費及び代謝産物の蓄積状態を最適化するための哺乳動物細胞の培養システムが求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一態様は、真核細胞の流加培養において高い生細胞密度を得るための方法であって、
ａ）１種以上の異種由来のアポトーシス耐性（アポトーシスR）遺伝子及び１種以上の対象遺伝子を発現する真核細胞株を培養する工程と、
ｂ）前記細胞培養の指数増殖期及び定常期に高グルコース添加培地を維持する工程と、を含む方法である。
【００１０】
本発明の別の態様は、真核細胞の流加培養において分泌タンパク質の産生量を高めるための方法であって、
ａ）１種以上の異種由来のアポトーシス耐性（アポトーシスR）遺伝子及び１種以上の対象遺伝子を発現する真核細胞株を培養する工程と、
ｂ）前記細胞培養の指数増殖期及び定常期に高グルコース添加培地を維持する工程と、を含む方法である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ミトコンドリアのアポトーシス経路の構成要素を示す図。
【図２Ａ】アポトーシス耐性細胞株の特性評価を示す図。
【図２Ｂ】アポトーシス耐性細胞株の特性評価を示す図。
【図２Ｃ】アポトーシス耐性細胞株の特性評価を示す図。
【図３】フローサイトメトリー分析によりＥＡ１６７及びＥＡＸ１９７のアポトーシス耐性を証明した図。
【図４Ａ】Ｅ１Ｂ１９Ｋ、Ｅ１Ｂ１９Ｋ＋ＡＶＥＮ、及び、Ｅ１Ｂ１９Ｋ＋ＡＶＥＮ＋ＸＩＡＰΔをトランスフェクトすることによって生成されたアポトーシス耐性細胞株の増殖プロファイルである。コントロール（●）、Ｅ６４（◆）、ＥＡ１６７（■）及びＥＡＸ１９７（▼）の震盪フラスコ回分培養を、生細胞密度及び生存率について観測した。
【図４Ｂ】Ｅ１Ｂ１９Ｋ、Ｅ１Ｂ１９Ｋ＋ＡＶＥＮ、及び、Ｅ１Ｂ１９Ｋ＋ＡＶＥＮ＋ＸＩＡＰΔをトランスフェクトすることによって生成されたアポトーシス耐性細胞株の増殖プロファイルである。コントロール（●）、Ｅ６４（◆）、ＥＡ１６７（■）及びＥＡＸ１９７（▼）の震盪フラスコ回分培養を、生細胞密度及び生存率について観測した。
【図４Ｃ】Ｅ１Ｂ１９Ｋ、Ｅ１Ｂ１９Ｋ＋ＡＶＥＮ、及び、Ｅ１Ｂ１９Ｋ＋ＡＶＥＮ＋ＸＩＡＰΔをトランスフェクトすることによって生成されたアポトーシス耐性細胞株の増殖プロファイルである。コントロール（●）、Ｅ６４（◆）、ＥＡ１６７（■）及びＥＡＸ１９７（▼）の震盪フラスコ回分培養を、生細胞密度及び生存率について観測した。
【図５Ａ】Ｅ１Ｂ１９Ｋ＋ＡＶＥＮ±ＸＩＡＰΔでトランスフェクトすることによって生成されたアポトーシス耐性細胞株の代謝産物のプロファイルである。コントロール（●）、ＥＡ１６７（■）及びＥＡＸ１９７（▼）の震盪フラスコ回分培養を、異なる代謝産物について観測した。
【図５Ｂ】Ｅ１Ｂ１９Ｋ＋ＡＶＥＮ±ＸＩＡＰΔでトランスフェクトすることによって生成されたアポトーシス耐性細胞株の代謝産物のプロファイルである。コントロール（●）、ＥＡ１６７（■）及びＥＡＸ１９７（▼）の震盪フラスコ回分培養を、異なる代謝産物について観測した。
【図５Ｃ】Ｅ１Ｂ１９Ｋ＋ＡＶＥＮ±ＸＩＡＰΔでトランスフェクトすることによって生成されたアポトーシス耐性細胞株の代謝産物のプロファイルである。コントロール（●）、ＥＡ１６７（■）及びＥＡＸ１９７（▼）の震盪フラスコ回分培養を、異なる代謝産物について観測した。
【図６Ａ】アポトーシス耐性細胞株に連日乳酸を補充した結果を示す図である。Ａ）コントロール（●）；ＥＡ１６７（無添加□、乳酸添加■）、及びＢ）ＥＡＸ１９７（無添加△、乳酸添加▼）。
【図６Ｂ】アポトーシス耐性細胞株に連日乳酸を補充した結果を示す図である。Ａ）コントロール（●）；ＥＡ１６７（無添加□、乳酸添加■）、及びＢ）ＥＡＸ１６７（添加△、乳酸無添加▼）。
【図７Ａ】添加乳酸の存在下又は不在下における、コントロール並びにアポトーシス耐性細胞株ＥＡ１６７及びＥＡＸ１９７の増殖及び代謝産物のプロファイルである。コントロール（●）、ＥＡ１６７（無添加□、乳酸添加■）、ＥＡＸ１９７（無添加▲、乳酸添加▼）。
【図７Ｂ】添加乳酸の存在下又は不在下における、コントロール並びにアポトーシス耐性細胞株ＥＡ１６７及びＥＡＸ１９７の増殖及び代謝産物のプロファイルである。コントロール（●）、ＥＡ１６７（無添加□、乳酸添加■）、ＥＡＸ１９７（無添加▲、乳酸添加▼）。
【図７Ｃ】添加乳酸の存在下又は不在下における、コントロール並びにアポトーシス耐性細胞株ＥＡ１６７及びＥＡＸ１９７の増殖及び代謝産物のプロファイルである。コントロール（●）、ＥＡ１６７（無添加□、乳酸添加■）、ＥＡＸ１９７（無添加▲、乳酸添加▼）。
【図７Ｄ】添加乳酸の存在下又は不在下における、コントロール並びにアポトーシス耐性細胞株ＥＡ１６７及びＥＡＸ１９７の増殖及び代謝産物のプロファイルである。コントロール（●）、ＥＡ１６７（無添加□、乳酸添加■）、ＥＡＸ１９７（無添加▲、乳酸添加▼）。
【図７Ｅ】添加乳酸の存在下又は不在下における、コントロール並びにアポトーシス耐性細胞株ＥＡ１６７及びＥＡＸ１９７の増殖及び代謝産物のプロファイルである。コントロール（●）、ＥＡ１６７（無添加□、乳酸添加■）、ＥＡＸ１９７（無添加▲、乳酸添加▼）。
【図７Ｆ】添加乳酸の存在下又は不在下における、コントロール並びにアポトーシス耐性細胞株ＥＡ１６７及びＥＡＸ１９７の増殖及び代謝産物のプロファイルである。コントロール（●）、ＥＡ１６７（無添加□、乳酸添加■）、ＥＡＸ１９７（無添加▲、乳酸添加▼）。
【図７Ｇ】添加乳酸の存在下又は不在下における、コントロール並びにアポトーシス耐性細胞株ＥＡ１６７及びＥＡＸ１９７の増殖及び代謝産物のプロファイルである。コントロール（●）、ＥＡ１６７（無添加□、乳酸添加■）、ＥＡＸ１９７（無添加▲、乳酸添加▼）。
【図８Ａ】乳酸添加時にアポトーシス耐性細胞株によって減少するアミノ酸のプロファイルを示す図である。コントロール（●）、ＥＡ１６７（無添加□、乳酸添加■）、ＥＡＸ１９７（無添加▲、乳酸添加▼）。
【図８Ｂ】乳酸添加時にアポトーシス耐性細胞株によって減少するアミノ酸のプロファイルを示す図である。コントロール（●）、ＥＡ１６７（無添加□、乳酸添加■）、ＥＡＸ１９７（無添加▲、乳酸添加▼）。
【図８Ｃ】乳酸添加時にアポトーシス耐性細胞株によって減少するアミノ酸のプロファイルを示す図である。コントロール（●）、ＥＡ１６７（無添加□、乳酸添加■）、ＥＡＸ１９７（無添加▲、乳酸添加▼）。
【図８Ｄ】乳酸添加時にアポトーシス耐性細胞株によって減少するアミノ酸のプロファイルを示す図である。コントロール（●）、ＥＡ１６７（無添加□、乳酸添加■）、ＥＡＸ１９７（無添加▲、乳酸添加▼）。
【図８Ｅ】乳酸添加時にアポトーシス耐性細胞株によって減少するアミノ酸のプロファイルを示す図である。コントロール（●）、ＥＡ１６７（無添加□、乳酸添加■）、ＥＡＸ１９７（無添加▲、乳酸添加▼）。
【図８Ｆ】乳酸添加時にアポトーシス耐性細胞株によって減少するアミノ酸のプロファイルを示す図である。コントロール（●）、ＥＡ１６７（無添加□、乳酸添加■）、ＥＡＸ１９７（無添加▲、乳酸添加▼）。
【図８Ｇ】乳酸添加時にアポトーシス耐性細胞株によって減少するアミノ酸のプロファイルを示す図である。コントロール（●）、ＥＡ１６７（無添加□、乳酸添加■）、ＥＡＸ１９７（無添加▲、乳酸添加▼）。
【図９Ａ】特別配合培地中、高濃度のグルコース中で培養されたコントロール及びアポトーシス耐性細胞株ＥＡＸ１９７の増殖プロファイル及び乳酸蓄積プロファイルである。アポトーシス耐性細胞株ＥＡＸ１９７（■）、コントロール細胞株（◇）。
【図９Ｂ】特別配合培地中、高濃度のグルコース中で培養されたコントロール及びアポトーシス耐性細胞株ＥＡＸ１９７の増殖プロファイル及び乳酸蓄積プロファイルである。アポトーシス耐性細胞株ＥＡＸ１９７（■）、コントロール細胞株（◇）。
【図９Ｃ】特別配合培地中、高濃度のグルコース中で培養されたコントロール及びアポトーシス耐性細胞株ＥＡＸ１９７の増殖プロファイル及び乳酸蓄積プロファイルである。アポトーシス耐性細胞株ＥＡＸ１９７（■）、コントロール細胞株（◇）。
【図９Ｄ】特別配合培地中、高濃度のグルコース中で培養されたコントロール及びアポトーシス耐性細胞株ＥＡＸ１９７の増殖プロファイル及び乳酸蓄積プロファイルである。アポトーシス耐性細胞株ＥＡＸ１９７（■）、コントロール細胞株（◇）。
【図１０Ａ】３０ｍＭ又は６０ｍＭのグルコースを含む特別配合培地中で培養されたＥＡＸ１９７及びコントロールホスト細胞株から生成された細胞株の抗体力価を示す図である。アポトーシス耐性細胞株ＥＡＸ１９７（■）、コントロール細胞株（□）。
【図１０Ｂ】３０ｍＭ又は６０ｍＭのグルコースを含む特別配合培地中で培養されたＥＡＸ１９７及びコントロールホスト細胞株から生成された細胞株の抗体力価を示す図である。アポトーシス耐性細胞株ＥＡＸ１９７（■）、コントロール細胞株（□）。
【図１１Ａ】３０ｍＭ又は６０ｍＭのグルコースを含む培地中に高細胞播種密度及び低細胞播種密度で播種した、アポトーシス耐性遺伝子Ｂｃｌ−２を有する細胞株のＶＣＤ及び力価を示す図。
【図１１Ｂ】３０ｍＭ又は６０ｍＭのグルコースを含む培地中に高細胞播種密度及び低細胞播種密度で播種した、アポトーシス耐性遺伝子Ｂｃｌ−２を有する細胞株のＶＣＤ及び力価を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書に引用される特許及び特許出願など（ただしこれらに限定されない）のすべての刊行物は、本明細書にそれらの全体が記載されているものと同様にして本願に援用するものである。
【００１３】
説明文中で使用する用語「流加細胞培養」とは、増殖を律速する栄養基質を培養に添加することに基づいた細胞培養プロセスを意味する。流加法は、バイオリアクター中で高い細胞密度に達するためにバイオ産業のプロセスで一般的に使用されている方法である。 HYPERLINK "http://en.wikipedia.org/wiki/Bioreactor" \o "Bioreactor" しかしながら、グルコースなどの栄養素を添加すると乳酸やアンモニアなどの代謝老廃物が形成される。濃度１８ｍＭの乳酸（Ｋｕｒａｎｏ ｅｔ ａｌ．，１９９０）及び８ｍＭのアンモニア（Ｈａｎｓｅｎ ａｎｄ Ｅｍｂｏｒｇ，１９９４）は真核細胞の増殖を阻害することが報告されている。
【００１４】
流加細胞培養における過剰な乳酸の蓄積の問題に対処するためにこれまでに多くの手法が考案されており、それらの手法について上記に述べた。本発明では、乳酸濃度を低下させて生細胞密度を高めることに代わる手法を提供する。この方法では、１種以上のアポトーシス耐性遺伝子をホスト細胞株で過剰発現させる。得られたアポトーシス耐性細胞株ではミトコンドリアでの呼吸が刺激され、乳酸の蓄積量が減少することになる。したがって、これらの細胞株は、高濃度のグルコースを添加しても生存することが可能である。その結果、これらのアポトーシス耐性細胞株の培養では高い生細胞密度に達することが可能である。これらの細胞株はまた、そのアポトーシス耐性のために長い寿命を有する。
【００１５】
本発明の方法は、チャイニーズハムスター子宮細胞（ＣＨＯ）、ミエローマ又はハイブリドーマ細胞培養などの流加細胞培養における生細胞の密度及び生存率を高めるうえで有用である。詳細には、本発明の方法はＣＨＯ細胞培養の積分生細胞数（ＩＶＣＣ）を高めるうえで有用である。本発明の方法は、１種以上の異種由来のアポトーシス耐性遺伝子（アポトーシスR）遺伝子及び１種以上の対象遺伝子を発現する細胞株を培養する工程と、細胞培養の指数増殖期及び定常期の間に高濃度のグルコースの培地への添加を維持する工程とを含む。これらの細胞系は、ペプチド、ペプチド融合体、増殖因子、ホルモン抗体、設計アンキリン反復タンパク質（DARPins）、及び治療、診断又は研究目的に有用な他のタンパク質などの対象タンパク質を発現する生産用細胞株の作出のめの優れたホストとなる。本発明の方法において有用なＣＨＯ細胞株としては、ＣＨＯ−Ｋ１（インビトロジェン社（Invitrogen）カリフォルニア州カールスバッド）及びＣＨＯＫ１ＳＶ（ロンザ・バイオロジックス社（Lonza Biologiｃｓ）英国、スラウ）が挙げられる。本発明の方法において有用なミエローマ株としては、ＮＳ０及びＳｐ２／０が挙げられる。
【００１６】
本発明の方法において有用な細胞株は、１種以上の異種由来のアポトーシス耐性遺伝子を発現する。詳細には、Ｅ１Ｂ１９Ｋ（配列番号１及び２）及びＡｖｅｎ（配列番号３及び４）が有用である。ＸＩＡＰΔ（配列番号：５及び６）をコードした遺伝子を使用することもできる。これらのアポトーシス耐性遺伝子は、それぞれアポトーシスを引き起こすシグナル伝達経路の早期、中期、及び後期に働く遺伝子を代表するものである。更に、Ｂｃｌ−２Δをコードする遺伝子を使用することもできる（配列番号７及び８）。アポトーシス耐性遺伝子の発現は、当業者には周知の形質移入（トランスフェクション）技術によって実現させることができる。ＭＤＭ２（配列番号９及び１０）及びＢｃｌ−ＸＬ（配列番号１１及び１２）などの、アポトーシスを引き起こすシグナル伝達経路の上記のステージからの他のアポトーシス耐性遺伝子も本発明の方法において有用である。
【００１７】
本発明においては、異種由来のアポトーシス耐性遺伝子を発現する細胞株の使用により、これらの細胞株の乳酸の分泌量が低減されるかあるいは蓄積された乳酸が消費されることによって、高濃度のグルコースの培養中への添加を維持しつつ、積分生細胞数（ＩＶＣＣ）の値がコントロール細胞株と比較して約２倍高い値に達する。培養中の生産用細胞株の生細胞密度を高めることにより、バイオリアクターの使用によって得られる産物の収率が高まる。このように生産性が高められることにより、複雑な生物製剤の製造コストが低減されると同時に、非生細胞の細胞溶解がないために優れた品質の産物が生産される（溶解した細胞は産物を分解するプロテアーゼを放出するため）。したがってこれらの細胞株は、対象タンパク質（単数又は複数）を発現する生産用細胞株を作出するための優れたホストとなる。
【００１８】
本発明の方法では、老廃物として蓄積される乳酸を消費する、又はその産生量が低減したアポトーシス耐性細胞株の能力によって、高濃度グルコース条件下、及びグルコース欠乏後の増殖を可能とする培養手法が与えられる。異なる実施形態において、本発明の方法は、流加細胞培養における高いピーク生細胞密度、長い寿命、高い分泌タンパク質力価、高い積分生細胞数、低い細胞カルシウム流束、及び高いミトコンドリア膜電位を与えるものである。更に、高濃度の有毒な乳酸及びアンモニアを制限するために用いられてきた流加培養法は、これらの細胞株の高い生産性にとって必要ではない可能性がある。
【００１９】
トランスフェクトした後、アポトーシス耐性導入遺伝子の染色体への組み込み部位によってその発現レベルが決まる。更に、複数のアポトーシス耐性遺伝子をトランスフェクトする場合、これらのタンパク質の多くは直接的又は間接的に相互作用することによって細胞の生理学的変化を引き起こすことから、特定のアポトーシス耐性導入遺伝子の発現レベルがその細胞が有する他のアポトーシス耐性タンパク質の活性に影響を及ぼしうる。したがって、複数の遺伝子を有する細胞株の全体のアポトーシス耐性に対する各アポトーシス耐性遺伝子の定量的寄与は、各アポトーシス耐性遺伝子の相乗効果のために決定することが困難である。更に、すべてのクローンが同じ導入遺伝子の集合をトランスフェクトされていたとしてもアポトーシス耐性に関しては各クローン間で大きなばらつきがある。後述する実施例に示される結果からは、試験した各アポトーシス耐性遺伝子は、各遺伝子をトランスフェクトしたホスト細胞株のアポトーシス耐性を高める方向に漸増する正の値を与えることが明らかである。上記の束縛条件内では、３重形質導入体は一般に２重形質導入体よりも優れており、２重形質導入体は１個のみのアポトーシス耐性遺伝子を過剰発現している形質導入体よりも優れていた。
【００２０】
したがって、適当な発現ベクターをトランスフェクトすることでＥ１Ｂ−１９Ｋ、Ａｖｅｎ及びＸＩＡＰΔを異なるレベルで発現するクローンが得られた。Ｅ１Ｂ−１９Ｋの発現レベルは比較的低く、Ｅ１Ｂ−１９Ｋを高い発現レベルで発現する稀なクローンは不安定であるか増殖性が低かった（データは示さず）。下記実施例において、Ｅ１Ｂ−１９Ｋを単独で発現しているＣＨＯ細胞では細胞死に対する保護は限定的なものに過ぎなかった（図４）。
【００２１】
Ｅ１Ｂ−１９Ｋを単独で発現している細胞株で得られた結果に対し、下記実施例において示されるデータは、Ａｖｅｎ（ＥＡ１６７）、又はＡｖｅｎ及びＸＩＡＰΔ（ＥＡＸ１９７）を同時に発現しているＣＨＯ Ｋ１細胞株では、生存率、細胞密度及びＩＶＣＣに向上が見られたことを示している。下記実施例に示される結果は、ＣＨＯ Ｋ１細胞株における２個のアポトーシス耐性遺伝子の発現により、スタウロスポリン及び長期の回分培養といった障害の存在下でカスパーゼ活性が大幅に低下し、ミトコンドリアの膜電位が高くなったことを更に示している。
【００２２】
下記実施例では、Ｂｃｌ−ＸＬの機能的ホモログであるＥ１Ｂ−１９ＫとＡｖｅｎ及びＸＩＡＰΔとの組み合わせの発現が細胞死を遅らせる効果について調べた。これらのトランスフェクト細胞におけるＸＩＡＰΔの発現レベルは、細胞内に既に存在する内因性の野生型ＸＩＡＰタンパク質に対して高くはなかったが、これはこのシステムにおいて２個のプラスミドをトランスフェクトするために必要な条件によるものと恐らく考えられる。しかしながら、ＥＡＸ１９７におけるＸＩＡＰΔの追加（Ａｖｅｎ及びＥ１Ｂ−１９Ｋに加えて）により、無添加（図５及び７）及び乳酸を添加した培養（図７）の両方で最大生細胞密度が一貫して向上した。実際、乳酸を添加したＥＡＸ１９７細胞株は、６０％以上の高い生存率を１４日間にわたって維持したが、これはＥＡ１６７細胞よりも２日長く、コントロール培養よりも４日間長かった。ＸＩＡＰΔを有することによりカスパーゼ活性に対する細胞の耐性が高まると考えられ、このことは図３に、スタウロスポリンによる処理後においてもＥＡＸ１９７のカスパーゼ活性が極めて低かったことにより実証されている。更に、ＸＩＡＰの突然変異（ＸＩＡＰΔ）の使用により、野生型ＸＩＡＰタンパク質と比較して高いアポトーシス耐性が与えられる。したがって、ＸＩＡＰの欠失突然変異（ＸＩＡＰΔ）の保護能力は、これらのＣＨＯ株においてこのタンパク質の発現レベルが高くなくとも充分なものである可能性がある。
【００２３】
下記実施例では、細胞の代謝における１種以上のアポトーシス耐性遺伝子の役割を調べた。Ａｖｅｎ及び／又はＸＩＡＰΔとともにＥ１Ｂ−１９Ｋを発現しているアポトーシス耐性細胞株において栄養素の消費量及び代謝産物の産生量を調べた。詳細には、２つの最も一般的な細胞培養の老廃物（すなわち乳酸とアンモニア）の蓄積量についてアポトーシス耐性細胞株とコントロール細胞株との間で比較を行った。下記に示すデータでは、ＣＤ−ＣＨＯ培地中の震盪フラスコ回分培養において、播種後６日目〜７日目にコントロール細胞株は２．８ｇ／Ｌ（３１ｍＭ）の乳酸及び１２ｍＭのアンモニア（図５）を蓄積したが、これらは細胞増殖を阻害することが報告されている濃度１８ｍＭの乳酸（Ｋｕｒａｎｏら、前出）及び８ｍＭのアンモニア（Ｈａｎｓｅｎ及びＥｍｂｏｒｇ、前出）を大幅に上回る濃度であった。これらの濃度は、ＣＨＯコントロール細胞株において播種後８日目に見られた生存率の低下の理由の一部となっていることが考えられる。
【００２４】
下記に示すデータは、アポトーシス抵抗細胞株がある程度の乳酸を初期に蓄積することを示しているが、これらの細胞株は指数増殖期に乳酸を消費しはじめ、ＶＣＤはコントロール培養を大幅に上回って増大し続けた。グルコースの枯渇後に直ちに乳酸を消費する能力、又はアポトーシス阻害性の増大、又は両方の因子が細胞増殖の継続に寄与していた。更に、アポトーシス耐性細胞は内因性の乳酸が枯渇した場合にのみ定常期に入った。乳酸の消費がこれらの操作された細胞株の一般的な特性であることを調べるため、アポトーシス耐性培養に外因性の乳酸を加えて欠乏した乳酸を補充した（図６）。下記実施例に示される結果は、アポトーシス耐性培養は添加された乳酸を消費し、コントロール培養と比較して高いＶＣＤ及び生存率を更に４〜７日間にわたって維持した（無添加及び乳酸添加培養を図７Ａ及びＢにそれぞれ示す）。このプロセスの更なる利点としては、アポトーシス耐性細胞株の培養中の乳酸が低濃度であることによって、浸透圧がより低く、ｐＨがより高くなることがあり、これらはいずれも産物の高い品質にとって極めて望ましい。
【００２５】
研究者によりこれまでに、ハイブリドーマ、ＮＳ０ミエローマ、及びＣＨＯの培養中において乳酸の消費が検出されている（ｄｅＺｅｎｇｏｔｉｔａ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，１９９５ ａｎｄ １９９７；Ｂｕｒｋｙ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｐａｓｃｏｅ ｅｔ ａｌ．，２００７）。しかしながら、これらの細胞は通常、指数増殖期では乳酸を産生し、定常期に消費へと移行するが、このことは、乳酸が中間の副産物及び炭水化物エネルギー源の両方でありうることを示唆するものである（Ｂｕｒｋｙ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｂｒｏｏｋｓ ｅｔ ａｌ．，１９８５）。下記に示す結果では、コントロールのＣＨＯ培養は、上記の実験において見られるように定常期において特に「高濃度」グルコース培地で（図９）一定量の乳酸を消費したようであった。これに対し、アポトーシス耐性細胞では、指数増殖期に乳酸が消費され、外因性の乳酸が欠乏した場合にのみ細胞が定常期に入るという大きく異なったプロファイルを示した。
【００２６】
乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）によって触媒されるピルビン酸の乳酸への変換は可逆反応であるが、平衡定数が３．６×１０4／Ｍと乳酸を生成する方向に大きく傾いている。しかしながら、解糖系がトリカルボン酸（ＴＣＡ）の需要を満たすことができない場合、乳酸はピルビン酸へとその反応を進めるＬＤＨの複数のアイソザイムの１つによって逆に変換される。アポトーシス耐性細胞株によって消費された乳酸は、ＴＣＡ回路に入って細胞のエネルギー及びアミノ酸の産生に使われるものと考えられる。興味深い点として、アポトーシス耐性培養のアンモニアのプロファイルは、無添加及び乳酸添加細胞株の両方においてアンモニアの産生量が繰り返し一時的に低下するとともに全体的にアミノ酸の産生量が減少し、コントロール培養のアンモニアプロファイルと大きく異なった。これは、アミノ酸がＴＣＡ回路でエネルギー源として使用されることによってアンモニアが蓄積したものと考えられる。したがって、アンモニアの産生量の減少は、アポトーシス耐性細胞では、コントロール細胞と比較してＴＣＡ回路におけるエネルギーの必要量の内、相対的に小さな割合がアミノ酸から得られている可能性を示唆しており、このことはアポトーシス耐性細胞が炭素源として乳酸もより多く消費していることを考えると妥当な結果である。しかしながらアンモニア産生量の低下は一時的なものであり、アポトーシス耐性細胞が依然、アミノ酸をエネルギー源として利用している可能性がある点は注意を要する。実際、いずれも分枝鎖アミノ酸であるイソロイシン、ロイシン、及びバリンの３種類のアミノ酸は、アポトーシス耐性細胞によってより急速に消費され、その消費量は乳酸添加培養で大きかった（図８Ａ〜Ｃ）。アポトーシス耐性細胞株はコントロール細胞株と比較して継続的な増殖を示したことから、これら３種類のアミノ酸が脂肪酸及びアポトーシス耐性細胞によって必要とされる他のタンパク質の構成単位を構成するとともに、ＴＣＡ回路のエネルギー源として異化反応に用いられている可能性がある。メチオニンについても幾分似た消費プロファイルが観察された（図８Ｄ）。
【００２７】
減少することが観察された上記のアミノ酸に対し、アラニン及びアスパラギン酸などの幾つかのアミノ酸がコントロール培養中に一時的に分泌された。ピルビン酸の一部が、アラニンアミノトランスフェラーゼによってアラニンに変換されている可能性がある。この経路はアポトーシス耐性細胞でより活性が高くなる場合があるので、コントロール細胞株に対してアラニン濃度がより大きな上昇につながる（図８Ｆ）。一方、アスパラギン酸は、アスパラギン酸アミノ酸ファミリーの第１のアミノ酸であり、アスパラギン酸トランスアミナーゼを用いてＴＣＡ回路の中間体であるオキザロ酢酸とグルタミン酸の変換によってα−ケトグルタル酸とともに生成する。その濃度は、コントロール細胞においてのみ最初の６日間上昇したのに対して、アポトーシス耐性細胞株では連続的に減少した。この反応は可逆反応であるため、増殖期の初期におけるアポトーシス耐性細胞株でのアスパラギン酸の欠乏は、アポトーシス耐性細胞株ではＴＣＡ回路における可逆的なオキザロ酢酸産物の産生量が制限されている可能性を示している。オキザロ酢酸がＴＣＡ回路の最初の段階においてアセチルＣｏＡとも反応することを考慮すると、アポトーシス耐性細胞株における乳酸からアセチルＣｏＡへのピルビン酸の流入量の増加は、オキザロ酢酸の需要を大きくしている可能性がある。これに対して、コントロール細胞株は乳酸を消費しておらず、したがってオキザロ酢酸からアスパラギン酸を生成しているため、コントロール細胞株ではアセチルＣｏＡに対する需要は低いものと考えられる。実際、こうしたアセチルＣｏＡに対する需要の不足は、細胞培養の最初の７日間にわたって見られた、アセチルＣｏＡに代わる副生成物としての乳酸のコントロール細胞内への蓄積を引き起こした可能性が考えられる。また、コントロール細胞における乳酸消費の不足がアセチルＣｏＡの供給を制限し、これにともなうアスパラギン酸の生成量の増加を引き起こした可能性も考えられる。
【００２８】
これらの結果は、アポトーシス耐性遺伝子を発現する細胞株ではＴＣＡ回路のエネルギー効率が高くなっていることを示すものであるが、こうした細胞反応の正確な解釈にはより詳細な代謝フラックスの分析が待たれるところである。消費される乳酸の運命には関係なく、本発明ではアポトーシス耐性細胞株は蓄積した乳酸を消費し、これにより細胞株の長い寿命及び高いＩＶＣＣに寄与するものである。
【００２９】
アポトーシス耐性細胞株が蓄積された乳酸を消費することによって寿命が延びるという点で独特であるならば、これらの細胞株は乳酸を含む培地又は標準よりも高い濃度のグルコースを含む培地中で培養できる可能性がある。乳酸が唯一の炭素源として与えられた場合には増殖及び生存率はいずれのタイプの細胞株においても支持されなかったが、乳酸がグルコースに加えて（データは示さず）一成分として与えられた場合、又は乳酸が老廃物として蓄積された場合には乳酸の消費が認められた。このことは、アポトーシス耐性細胞はピルビン酸から糖新生を行うことはできず、乳酸からエネルギーを得ることもできないが、グルコースが乳酸とともに与えられた場合には、細胞はグルコース及び培養に蓄積又は添加された乳酸の両方を消費することができることを示唆している。更に、高濃度（６０ｍＭ）のグルコースを含む培地では、アポトーシス耐性細胞株のＩＶＣＣ（並びにＶＣＤ及び生存率、図９Ａ〜Ｃ）はコントロール細胞株のＩＶＣＣ（並びにＶＣＤ及び生存率）よりも大幅に高かった。これは、高グルコース培地では、コントロール細胞株が２０ｍＭよりも高濃度の乳酸を蓄積したことによるものであり、高濃度の乳酸が毒性を示した可能性がある。これに対して、アポトーシス耐性細胞株では増殖期の初期に乳酸を消費することにより、より多くの生細胞を維持することが可能であったため、コントロールと比較して１７０％というＩＶＣＣの増大につながった（図９Ｃ）。
【００３０】
アポトーシス耐性細胞株は乳酸を消費して高いＩＶＣＣが実現されることから、治療用抗体などの対象とするタンパク質を発現するアポトーシス耐性ホスト細胞株由来の生産用細胞株では、コントロール細胞株に由来する生産用細胞株と比較して大幅に高い力価が実現された。このように高い力価は、治療用タンパク質又は他の対象とするタンパク質を生産する哺乳動物細胞株においてアポトーシス耐性遺伝子を使用することの潜在的な商業的利益を例証するものである。
【００３１】
次に、本発明を以下の具体的かつ非限定的な実施例を参照しながら説明する。
【実施例】
【００３２】
以下の実施例では、アポトーシス耐性遺伝子を過剰発現するＣＨＯ細胞株を震盪フラスコ培養中で、ピーク生細胞密度、寿命、カスパーゼ−３活性化、及びミトコンドリア膜電位（ＭＭＰ）について分析を行った。更に、これらの細胞株における栄養素の消費量及び代謝産物の産生量をコントロール細胞と比較することによって、アポトーシス耐性遺伝子の発現が哺乳動物細胞の培養システム中の栄養素の消費及び代謝産物の蓄積に与える影響について調べた。
【００３３】
材料及び方法
細胞培養：
コントロール細胞株Ｃ１０１３Ａとして指定したＣＨＯＫ１ＳＶ細胞株（ロンザ・バイオロジックス社（Lonza Biologics）英国、スラウ）を、３０ｍＭのグルコースを含み、６ｍＭのＬ−グルタミン（インビトロジェン社（Invitrogen）カタログ番号１０３１３〜０２１）を添加したＣＤ−ＣＨＯ培地（カタログ番号１０７４３〜０１１、インビトロジェン社（Invitrogen）カリフォルニア州カールスバッド）中で培養した。場合に応じて、６０ｍＭ（高グルコース培地として定義される）など異なる濃度のグルコースを含んだ別の無動物タンパク質培地を使用した。ウシ胎児血清はハイクローン・ラボ社（Hyclone Labs）（ユタ州ローガン）（カタログ番号ＳＨ３００７１．０３）より購入した。細胞培養をＣｅｄｅｘ自動細胞計数装置（イノバティス社（Innovatis）ドイツ）により観測した。積分生細胞数（ＩＶＣＣ、細胞・日／ｍｌ）を下式：
ＩＶＣＣ（ｄ１）＝［ＶＣＤ（ｄ０）＋ＶＣＤ（ｄ１）］／２＋ＶＣＤ（ｄ０）
（式中、ＶＣＤ＝生細胞密度）により計算した。
【００３４】
プラスミドの構築：
Ｅ１Ｂ−１９Ｋ（ＥＦ−１ａプロモーター）を単独で、又はＡｖｅｎ（ＣＭＶプロモーター）と組み合わせて構成的に発現するように設計した、これまでに述べられている（Ｎｉｖｉｔｃｈａｎｙｏｎｇ ｅｔ．ａｌ．，２００７）ｐＢＵＤＣＥ４．１ベクターを使用した。ＸＩＡＰΔ（ＣＭＶプロモーター）を発現するベクターは、サワーウォルド（Ｓａｕｅｒｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，２００２）により述べられるようなものを使用した。ブランクベクターとは最初のｐＢＵＤＣＥ４．１ベクターのことを指す。
【００３５】
グルタミンシンターゼ（ＧＳ）発現ベクター（ロンザ・バイオロジックス社（Lonza Biologics）英国、スラウより研究用ライセンスにて取得）に重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡをクローニングすることによってモデル抗体（抗体１）発現ベクターを構築した。
【００３６】
アポトーシス耐性細胞株の生成：
ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞株の指数増殖期の培養に、１）ｐＢＵＤＣＥ４．１、２）ｐＢＵＤＣＥ４．１−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ、３）ｐＢＵＤＣＥ４．１−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ−Ａｖｅｎ、並びに４）ｐＢＵＤＣＥ４．１−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ−Ａｖｅｎ及びｐＣＭＶ−ＸＩＡＰΔをトランスフェクトした。トランスフェクションは製造者の推奨するところにしたがってＦｕｇｅｎｅ（ロシュ社（）カタログ番号１８１５０７５、スイス、バーゼル）を使用して行った。トランスフェクトした２日後に、３００μｇ／ｍｌのゼオシン（上記のトランスフェクション１、２及び３に対し）、３００μｇ／ｍｌのゼオシン及び４００μｇ／ｍｌのハイグロマイシン（トランスフェクション４に対し）を含む増殖培地中、９６穴プレートに播いた（表１を参照）。各トランスフェクションから約２００個の抗生物質耐性クローンを増殖させて下記に述べるようにしてカスパーゼ３／７の活性について分析した。有望なクローンは、各抗生物質の不在下で１０代継代して安定性試験を行った。
【００３７】
【表１】
【００３８】
最初に、ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞株にブランクベクターをトランスフェクトし、ゼオシン耐性コロニーを選択することによってコントロール細胞株を作出した。これらの細胞株は、トランスフェクトしていないコントロールＣＨＯＫ１ＳＶと比較してＩＶＣＣが平均で約２０％低かったため、ＣＨＯＫ１ＳＶを後のすべての実験においてコントロール細胞株として用いた。次いで、最も有望なアポトーシス耐性細胞株であるＥＡＸ１９７及びコントロール細胞株を用い、ＧＳ発現ベクターを製造者の推奨するところにしたがって使用してモデル抗体を発現する生産用細胞株を作出した。細胞培養中の抗体をＮｅｐｈｅｌｏｍｅｔｒｙ（ベックマン・アレイ・システム社（Beckman Array System））によって測定した。
【００３９】
アポトーシス耐性細胞株の震盪フラスコ培養：
選択されたアポトーシス耐性細胞株を、６ｍＭのグルタミン及び必要な選択用抗生物質を添加したＣＤ−ＣＨＯ培地中で無添加の回分方式で培養した。一部の実験では、アポトーシス耐性細胞株の回分式培養に乳酸を添加して細胞株が消費した乳酸を補充した。更に、選択された抗体発現細胞株を、６ｍＭのグルタミン及び６０ｍＭのグルコースを添加した特別に配合した無動物タンパク質培地中で培養した。
【００４０】
カスパーゼ３／７活性のアッセイ：
約３×１０5個の各クローンの細胞を１ｍｌの増殖培地中、２４穴プレートに播種した。播種４日目後（ｄ４）に、約１×１０5個の細胞を３重に９６穴プレートに移した。スタウロスポリン（２μＭ ｆｃ）を添加し、細胞を１６時間インキュベートした後、ＡＰＯ−ＯＮＥキット（ビー・ディー・ラボ社（BD Labs））によりカスパーゼ３／７の活性についてアッセイした。この手順をスタウロスポリンを加えない点を除き、１０日目において繰り返した。４日目及び１０日目の両方においてカスパーゼ３／７の活性が有意に低かったクローンをＳＦ培地中で増殖させた。選択されたクローンのアポトーシス耐性を、フローサイトメトリー分析（下記を参照）及び場合によりミトコンドリア膜電位を測定することによって確認した。
【００４１】
フローサイトメトリーによるアポトーシス耐性クローンの分析：
指数増殖期の約１×１０6個の細胞を各震盪フラスコから抜き取って２４穴プレートに移し、スタウロスポリン（２μＭ ｆｃ）と１６時間インキュベートし、収穫してＰＢＳ中で１回洗った。次いで細胞をＣｙｔｏＰｅｒｍ（カタログ番号２０７５ＫＫ、ビー・ディー・バイオサイエンス社（BD BioScience））とインキュベートして固定するとともに細胞を透過性とした。ＰＢＳによる洗浄後、細胞をＦＩＴＣ標識抗カスパーゼ３（カタログ番号６８６５４、ビー・ディー・バイオサイエンス社（BD BioScience））抗体とインキュベートした後、フローサイトメトリーにより分析した。
【００４２】
ミトコンドリア膜電位（ＭＭＰ）アッセイ：
細胞を震盪フラスコ培養から播種後６日目に抜き取り、スタウロスポリン（５μＭ ｆｃ）と２時間インキュベートした。この後、細胞を洗い、製造者の推奨するところにしたがって親油性カチオン性色素であるＪＣ−１（ケイマン・ラボ社（Cayman Labs）ミシガン州アナーバー）で処理した。プレートをＦＬ５３５及びＦＬ５９５で読み取り、その比を計算した。
【００４３】
ウェスタンブロッティング：
示される細胞株から約１×１０7個の細胞を収穫し、ＰＢＳ中で洗浄し、１％ ＮＰ−４０、１２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｈｃｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．２ｍＭのＰＭＳＦ、及び１ｍＭのＥＤＴＡを含むＲＩＰＡバッファー中で溶解した。各試料からの細胞質タンパク質５０μｇを４〜１２％ ＮｕＰＡＧＥ勾配ゲルにロードし、Ｎｏｖｅｘシステム（インビトロジェン社（Invitrogen））でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。分離したタンパク質のバンドをニトロセルロース上に転写して、１）ヒトＥ１Ｂ−１９Ｋに対する抗マウス抗体（希釈率１：４０）（カタログ番号ＤＰ−１７、カルバイオケム社（CalBiochem）メリーランド州ギブスタウン）、２）ヒトＡｖｅｎに対する抗ウサギ抗体（希釈率１：１０００）（カタログ番号６１２５２１、ビー・ディー・バイオサイエンス社（BD BioScience）カリフォルニア州サンホセ）、及び３）ヒトＸＩＡＰに対する抗マウス抗体（カタログ番号６１６７１３、ビー・ディー・バイオサイエンス社）を用いて分析した。使用した抗体を含め、上記のプロトコールは、販売業者から購入した既知量の精製したＥ１Ｂ−１９Ｋ、Ａｖｅｎ、及びＸＩＡＰ（それぞれ約１０ｎｇ）を用いて最適化かつ標準化した。タンパク質のバンドはＥＣＬ検出キット（ジー・イー・ヘルスケア社（GE Healthcare）ニュージャージー州ピスカタウェイ）を使用して可視化した。
【００４４】
培地中の代謝産物濃度の測定：
すべての重要な代謝産物及び老廃物の濃度をＹＳＩ２７００自動分析装置を使用して測定した。アンモニアイオン濃度はフローインジェクション分析（Ｃａｍｐｍａｊｏ ｅｔ ａｌ，１９９４）により測定した。アミノ酸は逆相カラム（ウォーターズ社（Waters）マサチューセッツ州ミルフォード）を用い、ＨＰＬＣ（ウォーターズ社）によって測定した。
【００４５】
（実施例１）
アポトーシス耐性細胞株の生成及び特性評価
本実験で使用した細胞株、各細胞株を生成するためにそれぞれトランスフェクトした発現プラスミド、及び形質移入細胞（トランスフェクトーマ（Transfectoma））を単離するために使用した選択用物質のリストを上記表１に示す。表に示した細胞株は、各トランスフェクションから生成された多数のクローンの内の代表的なものである。各細胞株の名称は、ホスト細胞株にトランスフェクトされたアポトーシス耐性遺伝子に由来している。例えばＥＡＸ１９７は、Ｅ１Ｂ−１９Ｋ（Ｅ）、Ａｖｅｎ（Ａ）、及びＸＩＡＰΔ（Ｘ）をトランスフェクトした細胞株である。アポトーシス耐性（アポトーシスR）という表記は、これらのアポトーシス耐性遺伝子の１以上がトランスフェクトされた細胞株を指して用いる。
【００４６】
本実験で用いたすべてのアポトーシス耐性細胞株について、ウェスタンブロッティング、カスパーゼ３／７、及びミトコンドリア膜電位による特性評価を行った（データは示さず）。１重形質移入体Ｅ６４、又は２重形質移入体ＥＡ６３、ＥＡ１１２、ＥＡ１６７及びＥＡ１９０はいずれも、コントロールであるトランスフェクトされていない細胞株Ｃ１０１３Ａで見られたバックグラウンドレベルよりも高い発現レベルでＥ１Ｂ−１９Ｋを発現した。４つの２重形質移入体の内、細胞株ＥＡ１１２及びＥＡ１６７は、Ｅ１Ｂ−１９Ｋ（約１９ｋＤａ）及びＡｖｅｎ（約５５ｋＤａ）の両方を発現した。細胞株ＥＡ６３及びＥＡ１９０は、Ｅ１Ｂ−１９Ｋを高レベルで発現したが、Ａｖｅｎの発現レベルは極めて低かった。２重ベクターｐＢＵＤＣＥ４．１−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ−ＡｖｅｎとｐＣＭＶ−ＸＩＡＰΔをトランスフェクトすることによって生成された４つの細胞株、すなわちＥＡＸ６４、ＥＡＸ９９、ＥＡＸ１４８及びＥＡＸ１９７の内、ＥＡＸ１９７のみが３種類のタンパク質のすべてを検出可能なレベルで発現した。
【００４７】
トランスフェクトしていないコントロールのレーンＣ１０１３Ａを含むすべてのレーンにおいて組換えＡｖｅｎの上側に観察された約５５ｋＤａのバンドは、免疫後の血清では可視化されたが免疫前の血清では可視化されなかったことから内因性のＡｖｅｎタンパク質であると考えられた（Ｓａｕｅｒｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｃｈａｕ ｅｔ ａｌ．，２０００）。トランスフェクトされたＡｖｅｎ遺伝子は最初の６個のアミノ酸が欠失しているが、これらのアミノ酸の欠失はタンパク質の生物学的活性に影響しないことが示されている。このため、トランスフェクトされたＡｖｅｎは内因性のＡｖｅｎよりも若干小さい。Ａｖｅｎの分解産物である可能性のある４０ｋＤａのバンドがこのタンパク質をＥ１Ｂ−１９Ｋとともに過剰発現したすべての細胞株において観察された。同様のサイズの分解生成物が、ＡｖｅｎがＢｃｌ−ＸＬ（Ｓａｕｅｒｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，２００５）又はＢｃｌ−２（Ｆｉｇｕｅｒｏａ、未発表の観察）とともに過剰発現された場合に観察されている。更に、Ａｖｅｎの発現は、Ｅ１Ｂ−１９Ｋ、Ａｖｅｎ及びＸＩＡＰΔを過剰発現するＥＡＸ１９７を含む３重形質移入体において顕著に低かった。
【００４８】
興味深い点として、トランスフェクトしたＸＩＡＰΔの発現レベルは内因性の完全なＸＩＡＰタンパク質の発現レベルと比較して顕著に低かった。ＸＩＡＰとＸＩＡＰΔとの間の発現レベルの明瞭な差は、アポトーシス耐性タンパク質のこれら２つの形態の抗体結合効率の差によって一部説明することができる。内因性のＸＩＡＰと形質移入されたＸＩＡＰΔとの間の明瞭な発現レベルの差は、アポトーシスの防止におけるこのトランスフェクトタンパク質の寄与に疑問を投げかけるものである。実際、この実験は、所定のアポトーシス耐性遺伝子の発現レベルと、そのタンパク質が細胞株に与えることのできるアポトーシス阻害のレベルとの間には必ずしも直接的な相関が認められないことを示唆している。
【００４９】
カスパーゼ３／７の活性はアポトーシスに対する細胞株の耐性の大きさの指標を与えることから、カスパーゼ３／７活性についてＡＰＯ−ＯＮＥによりそれぞれのアポトーシス耐性細胞株を調べた。簡単に述べると、このアッセイでは、蛍光前駆基質であるＺ−ＤＥＶＤ−Ｒ１１０がカスパーゼ３／７によって用量依存的に開裂される。ＥＡ１６７及びＥＡＸ１９７並びにコントロール細胞株の指数増殖期の培養をスタウロスポリンで１６時間処理することによってアポトーシスを誘導した後、カスパーゼ３／７を測定した。スタウロスポリン処理したコントロール細胞のカスパーゼ３／７活性を任意に１００％に設定した。これらの条件下で、ＥＡ１６７及びＥＡＸ１９７細胞のカスパーゼ活性はそれぞれコントロールの３０％及び３５％であったが、このことはこれらの細胞株がアポトーシス誘導に対して少なくとも部分的に耐性を有することを示唆している（図２Ａ）。ＥＡ１６７及びＥＡＸ１９７のアポトーシス耐性の更なる根拠として、これら２つの細胞株とコントロール細胞株のスタウロスポリン処理培養をＦＩＴＣ結合抗カスパーゼ３抗体で標識した後、フローサイトメトリーで分析した。図３に見られるように、非処理又は溶媒（ＤＭＳＯ）処理によらず、３つの細胞株のすべてにおいてカスパーゼ３陽性細胞は集団の１％以下であった。しかしながら、スタウロスポリンによる処理後にはコントロール細胞集団の９１％がカスパーゼ３について陽性であった。これに対し、細胞株ＥＡＸ１９７に由来する集団のわずか９％、及び細胞株ＥＡ１６７に由来する集団の３０％がカスパーゼ３について陽性であり、これら２つの細胞株におけるアポトーシス耐性の表現型が証明された。
【００５０】
アポトーシスに対する耐性が寿命の増大につながるか否かを調べるため、複数のＥＡ細胞株を震盪フラスコ（回分方式）中で増殖させ、生細胞密度（ＶＣＤ）及び積分生細胞数（ＩＶＣＣ）の両方を観測した。細胞の比生産性（specific productivity）が変化しないものと仮定すると、積分生細胞数が大きくなると培養の体積生産性が向上する。したがってＩＶＣＣを、生産用細胞株の作出のためのホストとして機能しうる優れたアポトーシス耐性細胞株をスクリーニングするためのパラメータとして用いることができる。図２Ｂに示されるように、相対カスパーゼ３／７活性が低い細胞株は、ＩＶＣＣの高い細胞株を生成する傾向が見られた。ＥＡ細胞株のそれぞれはコントロールに対して低いカスパーゼ３／７活性を示したが、ＩＶＣＣとそれぞれの細胞株が有するカスパーゼ３／７のレベルとの間には厳密な相関は認められなかった。更に、特定のアポトーシス耐性細胞株はアポトーシス耐性の表現型の程度に関してその姉妹クローンよりも安定していた。ＥＡ１６７は強力な抗アポトーシス活性及び震盪フラスコ培養中での安定した増殖性の両方を有することから、この細胞株を更なる実験用に選択した。更に、ＥＡ１６７はこのパネルでは最も安定した細胞株であり、ウェスタンブロットによって検出されるようにＡｖｅｎを高レベルで発現する。
【００５１】
アポトーシス経路のシグナル伝達分子の多くがミトコンドリアと相互作用するかあるいはミトコンドリア内部に存在している。ミトコンドリアでこれらのタンパク質はミトコンドリアの膜と相互作用してミトコンドリアの透過性を調節することによりアポトーシスを制御する。したがって、ミトコンドリア膜電位（ＭＭＰ）は、コントロールに対するＥＡ１６７及びＥＡＸ１９７のアポトーシス耐性の特性を比較するための細胞生理学の別のモニターとして機能する。図２Ｃのアッセイの結果に見られるように、ＥＡ１６７及びＥＡＸ１９７はいずれもコントロール細胞株よりも高いＭＭＰを有していた。
【００５２】
（実施例２）
ＣＨＯＫ１ＳＶの生細胞密度に対するＥ１Ｂ−１９Ｋの影響
Ｅ１Ｂ−１９ＫをＡｖｅｎとともに過剰発現する２重形質移入体（ＥＡ１６７）、Ｅ１Ｂ−１９ＫをＡｖｅｎ及びＸＩＡＰΔとともに過剰発現する３重形質形質移入体（ＥＡＸ１９７）、並びにＥ１Ｂ−１９Ｋのみを過剰発現する形質移入体（Ｅ６４）を図４でコントロール（ホスト）細胞株と比較した。コントロール細胞株のピークＶＣＤは７．７×１０6細胞／ｍｌに達し、Ｅ６４（Ｅ１Ｂ−１９Ｋのみを発現）のピークＶＣＤは８．９×１０6細胞／ｍｌであったのに対して、ＥＡ１６７のピークＶＣＤは１．４×１０7細胞／ｍｌであり、ＥＡＸ１９７のピークＶＣＤは１．５×１０7細胞／ｍｌよりも高く、コントロール細胞株と比べて１９０％以上の増加を示した。ＥＡ１６７及びＥＡＸ１９７の生存率は、恐らく栄養素の枯渇のために播種後８日目又は９日目に急激に低下したが、コントロール及びＥ６４細胞株の生存率の低下はより緩慢であった（図４Ｂ）。ＩＶＣＣに対する正味の影響を図４Ｃに示す。コントロール細胞株のＩＶＣＣは４．９×１０7細胞・日／ｍｌであり、次がＥ６４ のＩＶＣＣ（５．２×１０7細胞・日／ｍｌ）であった。明らかに２つのアポトーシス耐性細胞株ＥＡ１６７（６．３×１０7細胞・日／ｍｌ）及びＥＡＸ１９７（６．６×１０7細胞・日／ｍｌ）のＩＶＣＣは、コントロール細胞株のＩＶＣＣよりも有意に高かった（ＥＡ１６７及びＥＡＸ１９７でそれぞれ１３６％及び１４０％）。
【００５３】
ＥＡ１６７及びＥＡＸ１９７以外にも、幾つかの他のアポトーシス耐性細胞株が同様に低い乳酸産生表現型を示した（データは示さず）。更に、低い乳酸産生特性を示す野生型細胞株も稀ではあるが報告されている（Ｐａｓｃｏｅ ｅｔ ａｌ，２００７）。
【００５４】
（実施例３）
アポトーシス細胞株の代謝プロファイル
アポトーシスからの保護を与えるアポトーシス耐性細胞株ＥＡ１６７及びＥＡＸ１９７の生理学的性質を回分培養中でコントロール細胞と比較するため、回分培養の開始時に与えられる主要な栄養素及びアミノ酸、すなわちグルコース、グルタミン酸及びグルタミンの濃度を観測した。更に、老廃物であるアンモニア及び乳酸の蓄積についても観測を行った。図５に、ＥＡＸ１９７及びＥＡ１６７並びにコントロール細胞株を市販のＣＤ−ＣＨＯ培地中、震盪フラスコ中で回分方式で培養した場合のこれらの代謝物質の濃度を示す。図５Ａに示されるように、グルコースは播種後６日目又は７日目までに３つの細胞株のすべての培地から急速に枯渇した。グルタミンの枯渇についてはアポトーシス耐性細胞株とコントロール細胞株との間に有意差は認められず、グルタミン酸濃度は全日数にわたって３つの細胞株で大きく変化しなかった。３つの細胞株のすべてにおいて、４日目までの細胞増殖期の初期において乳酸の蓄積が認められた（図５Ｂ）。コントロール細胞株では、乳酸は６日目まで増加し続けた（その時点で２．８ｇ／Ｌに達した）後、乳酸濃度に若干の低下が認められ、最終的に１．８ｇ／Ｌに達した。こうした量の乳酸は、培養のｐＨを低下させることが予想され、重炭酸塩を添加することによってｐＨが調節されているバイオリアクター中では浸透圧が上昇することになる。これらの特性のすべて及び他のストレス因子によって動物細胞にとって有毒な環境がもたらされうる。これに対して、アポトーシス耐性細胞株中の乳酸濃度は短期間増大した後、５日目以降は急速に低下し、７日目（ＥＡ１６７）又は８日目（ＥＡＸ１９７）までには乳酸は完全に消失した。興味深い点として、図５Ａにおいてこれら２つの細胞株では乳酸が０にまで低下した直後にＶＣＤが急激に低下しており、細胞生存率の低下が培地中に利用可能なグルコース又は乳酸がなくなったことによるものであることを示唆している。
【００５５】
アポトーシス耐性細胞株とコントロール細胞株との間に認められた別の差異はアンモニアのプロファイルである（図５Ｃ）。ＥＡ１６７及びＥＡＸ１９７中のアンモニア濃度は、乳酸濃度の低下が始まった６日目に若干低下し、その後やがて再び増大した。しかしながら、アポトーシス耐性細胞株の全体のアンモニア濃度はコントロール細胞株よりも低く、このことはアポトーシス耐性細胞株がコントロール細胞株と比較してより高いＩＶＣＣに達し、したがって全体の細胞増殖率がより高かったことから予想外の結果である（図４Ｃ）。
【００５６】
上記のデータから、アポトーシス耐性細胞株の特性がコントロール細胞株とは大きく異なっていることが明らかである。しかしながら、複数のクローンについて幾分異なる実験条件下で調べたところ、各アポトーシス耐性形質移入体間で幅広い表現型が観察された。表現型の変異はコントロール細胞株の単離クローンにおいても見られることから、適当なスクリーニング法を用いることによってコントロール細胞株から稀なアポトーシス耐性クローンを選択することが可能である。この点に関しては、マタノビッチ（Mattanovich）及びボース（Borth）（２００６）によって細胞分別を応用して所望の性質を有する稀な変異体を野生型（コントロール）細胞株から単離することについて概説されている。
【００５７】
（実施例４）
乳酸添加の影響
任意の時点においてある細胞培養中に存在する乳酸の量は、その細胞株によって分泌される乳酸の量から細胞株によって消費される乳酸の量を差し引いた量によって決まる。アポトーシス耐性細胞株が実際に乳酸を消費しているか否か、すなわちこれらの細胞株において正味の乳酸産生量が低下しているか否かを調べるため、３つの細胞株すべての培養を毎日観察し、アポトーシス耐性細胞株とコントロール細胞株との間で乳酸濃度に目立った差があれば外因性の乳酸を添加することによって埋めた。上記で観察したように、無添加のアポトーシス耐性細胞株ＥＡ１６７及びＥＡＸ１９７の乳酸濃度は５日目に低下しはじめ（図６Ａ及び６Ｂ）、７日目（ＥＡ１６７、無添加）又は８日目（ＥＡＸ１９７、無添加）までに乳酸は枯渇した。コントロール細胞株の乳酸プロファイルは６日目まで増加しつづけ、そこから次の３日間濃度は若干低下したが０にまで低下することはなかった。アポトーシス耐性細胞株を毎日観察し、個別の流加培養に７日目に２．５ｇ／Ｌ（ＥＡ１６７に対して、図６Ａ）及び８日目に２ｇ／Ｌ（ＥＡＸ１９７に対して、図６Ｂ）となるように乳酸を加えてコントロール細胞株の濃度と同様の濃度とした。補充分の乳酸の添加にも関わらず、アポトーシス耐性細胞株ではコントロールと比較して６日目〜１２日目にかけて乳酸濃度は大幅に急速に低下した。実際、ＥＡＸ１９７の流加培養では６日目〜７日目にかけて乳酸濃度が２．５〜０．２ｇ／Ｌにまで低下したのに対して、コントロール培養では同じ期間に乳酸濃度は２．７〜２．４ｇ／Ｌに低下したに過ぎなかった。したがって、乳酸はアポトーシス耐性細胞株ではコントロール細胞株と比較して補充分の乳酸の添加後少なくとも７日間にわたって加速した速度で消費されたものと考えられる。
【００５８】
ＶＣＤ及び細胞生存率に対する乳酸補充の影響をそれぞれ図７Ａ及び７Ｂに示す。上記で観察したように（図５Ａ）、無添加のアポトーシス耐性細胞株のＶＣＤは８日目（ＥＡ１６７）及び９日目（ＥＡＸ１９７）から急速に低下した。これは恐らく、グルコース及び／又は乳酸を含む１以上の不可欠な培地成分がこれらの培養中で枯渇したことによるものと考えられる。コントロール細胞株では７日目から緩慢な低下を示した。しかしながら、乳酸を補充した培養（ＥＡ１６７（乳酸添加）及びＥＡＸ１９７（乳酸添加））ではＶＣＤの低下はより緩やかであり、一方の細胞株（ＥＡＸ１９７（乳酸添加））では、ＶＣＤは、１４日目にこの培養が最終的に死滅するまで８×１０6〜１０×１０6細胞／ｍｌの間で安定した。図７Ｂに示される細胞生存率は、培地に乳酸を補充した２つのアポトーシス耐性培養において同様のより緩やかな低下を示した。これらの結果は、アポトーシス耐性細胞株が内因性及び補充された乳酸の両方を効率的に利用して正細胞密度及び生存率を維持することが可能であるのに対して、コントロール細胞株は同様の効率的な乳酸消費を行うことができないことを示唆している。この差は、無添加のアポトーシス耐性細胞株よりも約１８０〜２２０％高く、コントロール培養よりも約２３５％〜２５０％高かった乳酸添加アポトーシス耐性細胞株のＩＶＣＣに反映されている。
【００５９】
図７Ｄ〜Ｆに示される他の栄養素及び代謝産物の多くは、図５の無添加培養で上記に観察されたものと同様のプロファイルを示した。グルコース及びグルタミンは培養の初期の時点で急速に消費された。アポトーシス耐性細胞株のアンモニアのプロファイルもやはり、無補充及び乳酸補充培養の両方において乳酸の消費が始まった時点でわずかに低下した。上記の各実験と同様、各アポトーシス耐性細胞株の最終的なアンモニア濃度は、ＩＶＣＣが４つのアポトーシス耐性細胞株のすべてにおいて大幅に高かったにも関わらずコントロールの濃度よりも低かった。グルタミン酸の濃度は乳酸添加培養と無添加培養との間で異なり、無添加及びコントロール細胞株と比較して添加培養でグルタミン酸の枯渇は大幅に大きかった。
【００６０】
（実施例５）
アポトーシス耐性細胞株及びコントロール細胞株のアミノ酸プロファイル
２０種類のアミノ酸のそれぞれの濃度を、コントロール細胞株、並びに無添加及び乳酸添加アポトーシス耐性細胞株の培養において観測した。グルタミン及びグルタミン酸以外のアミノ酸の消費又は産生に関しては、表２に示されるように９種類の必須アミノ酸（フェニルアラニン、トレオニン、メチオニン、リジン、トリプトファン、ロイシン、イソロイシン、バリン及びヒスチジン）のいずれも枯渇しなかった点を最初に述べておく必要がある。アポトーシス耐性細胞株（無添加）及びコントロール細胞株の培養では、アスパラギン、セリン、トリプトファン及びシステイン（斜体で示す）はほぼ完全に枯渇した。興味深い点として、３種類の分枝鎖アミノ酸、すなわちイソロイシン、ロイシン及びバリン（表２に灰色の網かけで示す）はいずれも、コントロールと比較してアポトーシス耐性細胞株においてより速やかに培地から欠乏し、この欠乏は乳酸添加培養においてより顕著であった（図８Ａ〜Ｄ）。グルタミン酸に加え、これら３つのアミノ酸の最終濃度は乳酸添加培養において培地から大幅に低下した。消費率が高かった他のアミノ酸（最終濃度が培地中の最初の濃度の５０％以下）としては、チロシン、フェニルアラニン、メチオニン（図８Ｄ）及びアスパラギン酸（図８Ｅ）がある。
【００６１】
培地中に分泌されたアミノ酸についてコントロール細胞株とアポトーシス耐性細胞株との間で比較を行うのも考慮の対象として興味深い。図８Ｅに示されるように、コントロール細胞株が最初の６日間にわたって培地中にアスパラギン酸を蓄積したのに対して、４つのアポトーシス耐性細胞株培養のすべてにおいて同じ期間でアスパラギン酸濃度は低下した。更に、各アポトーシス耐性細胞株はコントロール細胞株と比較して最初の６日間にわたって大幅に多量のアラニンを分泌した（図８Ｆ）のに対して、これよりも遅い期間ではすべての細胞株がアラニンを消費した。更に、各アポトーシス耐性細胞株はコントロール細胞株と比較して細胞培養の全体を通じてより多くのホモシスチンを産生した（図８Ｇ）。
【００６２】
（実施例６）
高濃度グルコースの存在下での回分培養
アポトーシス耐性細胞株が乳酸を利用できるならば、有毒なレベルの乳酸が蓄積するためにコントロール細胞にとっては阻害性を示すようなグルコース濃度においてもこれらの細胞株は生存できる可能性がある。更に、これらの細胞株の増殖は乳酸を唯一の炭素源として含む培地によって支持されうる可能性がある。高濃度のグルコースなどのため浸透圧が維持できなくなるために上記の実験で使用したＣＤ−ＣＨＯ培地を使用することは不可能であり、そのためこれらの実験では新しい培地を使用する必要があった。したがって、上記の実験で最も高い持続的増殖性を示したＥＡＸ１９７の増殖速度論を、６０ｍＭのグルコース（高濃度グルコース）又は３０ｍＭの乳酸を含む特別に配合した無動物タンパク質培地中でコントロール細胞株と比較した。アポトーシス耐性細胞株及びコントロール細胞株のいずれにおいても、グルコースがまったく存在しない場合、すなわち乳酸のみが存在する場合には持続的増殖が見られなかった（データは示さず）。両方の細胞株を「高濃度」（６０ｍＭ）のグルコースを含む同じ特別配合培地中で培養したところ、ＥＡＸ１９７は、特に細胞培養の後期においてコントロール細胞株よりも高いＶＣＤ、生存率及びＩＶＣＣを示した（図９Ａ〜Ｃ）。ＥＡＸ１９７細胞株は、上記のＣＤ−ＣＨＯ培地中におけるよりもコントロールと比較した場合の全体のＩＶＣＣの増加率は低かった（１３０％）が、後期の高い生存率のためにその差は依然有意であった。高濃度グルコース中で培養したこれら２つの細胞株の乳酸プロファイルを図９Ｄに示す。ＩＶＣＣと同様、両細胞株の乳酸プロファイルは、ＣＤ−ＣＨＯ培地で観察されたものとは幾分異なっていた（図９Ｄ）。ＣＤ−ＣＨＯ培地を用いた上記の結果と同様、特別配合培地中のアポトーシス耐性細胞株ではコントロールよりも早期に正味の乳酸消費が開始され（２日目まで、図９Ｄに示される）、最大乳酸濃度は大幅に低かった（コントロール細胞株の２．４ｇ／Ｌに対して１．２ｇ／Ｌ）。コントロール細胞は、培地中の乳酸の消費も開始した５日目までは乳酸の正味の産生を示した。ＣＤ−ＣＨＯ培地は適当な組成を有する市販の配合物であるため、これらの異なる配合物中において乳酸消費プロファイルが異なる原因を理解する目的で２つの配合物中の培地成分の正確な比較を行うことはできなかった。
【００６３】
（実施例７）
高グルコース培地中のアポトーシス耐性細胞株の生産性
続いて、アポトーシス耐性細胞株であるＥＡＸ１９７及びコントロール細胞株をホストとして使用して、モデル抗体を発現する生産用細胞株を作出した。各細胞株について同数のクローンを調べ、各ホストから生成した最も優れたクローンを抗体の生産性について震盪フラスコ回分方式で比較した。高グルコース環境下における各細胞株の性能を比較するため、６０ｍＭ（高濃度）グルコースを含む特別配合培地を炭素源として使用した。標準培地（図１０Ａ）中では、ＥＡＸ１９７から誘導された生産用細胞株では力価が４８９ｍｇ／Ｌであり、３３７ｍｇ／Ｌの力価を示したコントロール細胞株と比較して１４５％の増加率であった。高グルコース培地（図１０Ｂ）中では同じ細胞株が６７８ｍｇ／Ｌの力価を示し、コントロール細胞株（３４８ｍｇ／Ｌ）の力価と比較して１７８％の増加率であった。産生量の向上は、ＥＡＸ１９７ではＩＶＣＣがコントロール細胞株に対して１８８％に増大していることに一部よるものである（データは示さず）。
【００６４】
（実施例８）
Ｅ１Ｂ１９Ｋ＋ＡＶＥＮ±ＸＩＡＰΔの過剰発現のアポトーシスの阻害に対する影響
ミトコンドリア内のアポトーシスカスケードの主要な活性化因子を図１に示した。アポトーシス耐性ＣＨＯ細胞株を作出するため、アポトーシスの早期、中期及び後期に働く３つのアポトーシス耐性遺伝子を選択した。これらの遺伝子は、Ｅ１Ｂ１９Ｋ（Ｅ）、ＡＶＥＮ（Ａ）及びＸＩＡＰΔ（Ｘ）である。広く用いられている形質移入（トランスフェクション）用ホスト細胞株であるＣＨＯＫ１ＳＶに、Ｅ１Ｂ１９Ｋ及びＡＶＥＮを、ＸＩＡＰΔとともに、又はＸＩＡＰΔ抜きでトランスフェクトした。多数の形質移入細胞をスクリーニングして各トランスフェクションから数個のクローンを更なる実験用に選択した。これらの細胞株の増殖プロファイルの実験により、これらの細胞株は極めて高いＶＣＤに達し、一般にそのＩＶＣＣはコントロールのＩＶＣＣの約２倍高いことが示された。アポトーシス耐性細胞株では播種後８日目までに生存率が低下したが、乳酸を消費することによって１０日目以降は生存率が回復した。Ｅ１Ｂ１９Ｋ＋ＡＶＥＮ±ＸＩＡＰΔを発現しているアポトーシス耐性細胞株の培養液は、アンモニア及び乳酸の濃度が低下しているか検出不能なレベルであり、グルタミン酸は培地から枯渇していた。
【００６５】
（実施例９）
抗体力価を高めるためのＢｃｌ−２ｄの使用
上記の結果は、アポトーシス耐性細胞株はコントロール細胞と比較して乳酸の蓄積量が少なく、アポトーシス耐性培養の生存率を高グルコース培地中で維持することが可能であることを示している。以下の震盪フラスコ回分培養実験では、Ｂｃｌ−２ｄ並びに抗体の重鎖及び軽鎖を発現するアポトーシス耐性細胞株（Ｃ２０８８Ｂ）を標準的濃度（４．８ｇ／Ｌ）及び高濃度（９．５ｇ／Ｌ）のグルコース中、異なる播種密度で播種した。この結果は、アポトーシス耐性細胞株は９．５ｇ／Ｌのグルコースを含む培地中に１ｅ６細胞／ｍｌの密度で播種した場合、播種後７日目に１４ｅ６細胞／ｍｌのピークＶＣＤ（図１１Ａ）、及び２ｇ／Ｌの抗体力価に達したことを示す。これに対して、標準条件下（接種密度０．３ｅ５細胞／ｍｌ及び４．８ｇ／Ｌ）で培養したＣ２０８８ＢはビークＶＣＤが７ｅ６細胞／ｍｌ、抗体力価は１ｇ／Ｌであった（図１１Ｂ）。これは、高グルコース条件では標準条件（すなわち、４．８ｇ／Ｌのグルコースを含む培地中、０．３ｅ５細胞／ｍｌの播種密度）と比較して抗体力価が２００％に増大することを意味する。
【００６６】
以上に本発明の全容を説明したが、本発明には、多くの変更及び改良を、添付の特許請求の範囲の趣旨及び範囲から逸脱することなく行いうることは当業者には明白であろう。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核細胞の流加培養における生細胞密度を高める方法であって、
ａ）１種以上の異種由来のアポトーシス耐性（アポトーシスR）遺伝子及び１種以上の対象遺伝子を発現する真核細胞株を培養する工程と、
ｂ）前記細胞培養の指数増殖期及び定常期に高グルコース添加培地を維持する工程と、を含む方法。
【請求項２】
前記真核細胞株が、チャイニーズハムスター子宮細胞（ＣＨＯ）株である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＣＨＯ細胞株がＣＨＯ−Ｋ１である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＣＨＯ細胞株がＣＨＯ−Ｋ１ＳＶである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記真核細胞株がミエローマ細胞株である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ミエローマ細胞株がＮＳ０である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ミエローマ細胞株がＳｐ２／０である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記真核細胞株がハイブリドーマである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記高グルコース添加培地が約６０ｍＭのグルコースを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記アポトーシス耐性遺伝子がＥ１Ｂ１９Ｋ及びＡＶＥＮを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記アポトーシスR耐性細胞遺伝子がＸＩＡＰをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記アポトーシスR耐性遺伝子がＢｃｌ−２Δを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＣＨＯ細胞株が、前記細胞培養の指数増殖期に蓄積した乳酸を消費する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞培養の指数増殖期における前記ＣＨＯ細胞株の乳酸分泌量が、１種以上のアポトーシス耐性細胞株を含有していないＣＨＯ細胞株よりも小さい、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ピーク生細胞密度（ＶＣＤ）が高められている、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞培養の寿命が延びている、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞培養の力価が高められている、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞培養の積分生細胞数（ＩＶＣＣ）が高められている、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
細胞のカルシウム流束が低下している、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
ミトコンドリア膜電位が高められている、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記対象遺伝子が抗体の重鎖及び抗体の軽鎖をコードしている、請求項１に記載の方法。
【請求項１】
真核細胞の流加培養における生細胞密度を高める方法であって、
ａ）１種以上の異種由来のアポトーシス耐性（アポトーシスR）遺伝子及び１種以上の対象遺伝子を発現する真核細胞株を培養する工程と、
ｂ）前記細胞培養の指数増殖期及び定常期に高グルコース添加培地を維持する工程と、を含む方法。
【請求項２】
前記真核細胞株が、チャイニーズハムスター子宮細胞（ＣＨＯ）株である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＣＨＯ細胞株がＣＨＯ−Ｋ１である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＣＨＯ細胞株がＣＨＯ−Ｋ１ＳＶである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記真核細胞株がミエローマ細胞株である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ミエローマ細胞株がＮＳ０である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ミエローマ細胞株がＳｐ２／０である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記真核細胞株がハイブリドーマである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記高グルコース添加培地が約６０ｍＭのグルコースを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記アポトーシス耐性遺伝子がＥ１Ｂ１９Ｋ及びＡＶＥＮを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記アポトーシスR耐性細胞遺伝子がＸＩＡＰをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記アポトーシスR耐性遺伝子がＢｃｌ−２Δを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＣＨＯ細胞株が、前記細胞培養の指数増殖期に蓄積した乳酸を消費する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞培養の指数増殖期における前記ＣＨＯ細胞株の乳酸分泌量が、１種以上のアポトーシス耐性細胞株を含有していないＣＨＯ細胞株よりも小さい、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ピーク生細胞密度（ＶＣＤ）が高められている、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞培養の寿命が延びている、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞培養の力価が高められている、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞培養の積分生細胞数（ＩＶＣＣ）が高められている、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
細胞のカルシウム流束が低下している、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
ミトコンドリア膜電位が高められている、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記対象遺伝子が抗体の重鎖及び抗体の軽鎖をコードしている、請求項１に記載の方法。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図７Ｅ】
【図７Ｆ】
【図７Ｇ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図８Ｅ】
【図８Ｆ】
【図８Ｇ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図９Ｄ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図７Ｅ】
【図７Ｆ】
【図７Ｇ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図８Ｅ】
【図８Ｆ】
【図８Ｇ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図９Ｄ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【公表番号】特表２０１１−５２４１７２（Ｐ２０１１−５２４１７２Ａ）
【公表日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１３７２２（Ｐ２０１１−５１３７２２）
【出願日】平成２１年６月１２日（２００９．６．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４７１７８
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１５２４１３
【国際公開日】平成２１年１２月１７日（２００９．１２．１７）
【出願人】（５０９０８７７５９）セントコア・オーソ・バイオテツク・インコーポレーテツド (77)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月１２日（２００９．６．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４７１７８
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１５２４１３
【国際公開日】平成２１年１２月１７日（２００９．１２．１７）
【出願人】（５０９０８７７５９）セントコア・オーソ・バイオテツク・インコーポレーテツド (77)
【Ｆターム（参考）】
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