嗅覚ＧＰＣＲを産生するための方法
【課題】細胞中で嗅覚ＧＰＣＲを産生するための強固で、確実かつ効率的な方法に対する大きな必要がある。
【解決手段】本発明は、細胞中で嗅覚ＧＰＣＲを産生するための方法を提供する。一般に、本方法は、嗅覚ＧＰＣＲをコードする核酸へ作動可能に連結したプロモーターを含有する発現カセットを大グリア細胞、例えばシュヴァン細胞もしくは希突起膠細胞中へ導入する工程、および嗅覚ＧＰＣＲを産生するために適切な条件下で前記細胞を維持する工程を包含する。さらに、嗅覚ＧＰＣＲをコードする組換え核酸を含有する大グリア細胞、嗅覚ＧＰＣＲ活性の調節因子についてスクリーニングする方法、および大グリア細胞中で嗅覚ＧＰＣＲを産生するためのキットも提供される。本発明は、香味料および芳香剤に関する研究において最も多く利用できるので、その結果として多種多様な研究および産業上の用途を有する。
【解決手段】本発明は、細胞中で嗅覚ＧＰＣＲを産生するための方法を提供する。一般に、本方法は、嗅覚ＧＰＣＲをコードする核酸へ作動可能に連結したプロモーターを含有する発現カセットを大グリア細胞、例えばシュヴァン細胞もしくは希突起膠細胞中へ導入する工程、および嗅覚ＧＰＣＲを産生するために適切な条件下で前記細胞を維持する工程を包含する。さらに、嗅覚ＧＰＣＲをコードする組換え核酸を含有する大グリア細胞、嗅覚ＧＰＣＲ活性の調節因子についてスクリーニングする方法、および大グリア細胞中で嗅覚ＧＰＣＲを産生するためのキットも提供される。本発明は、香味料および芳香剤に関する研究において最も多く利用できるので、その結果として多種多様な研究および産業上の用途を有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、以下の仮出願からの優先権の利益を主張する：米国特許商標庁に米国速達郵便で指示された日付に出願された、２００３年１１月２１日出願の米国仮出願番号第６０／５２３，９４０号。先の出願の開示は、本明細書中にその全体が参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、細胞中でＧＰＣＲタンパク質、詳細には嗅覚ＧＰＣＲタンパク質を産生するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
すべての動物は、環境内における化学的感覚情報の認識および識別を可能にする嗅覚感覚器である「鼻」を有している。例えばヒトは、他の動物に比較してニオイについて不良な感覚を有するが、それでもヒトは、１０，０００種を超える、典型的には４００Ｄａ未満の小さな有機分子である、揮発性化学物質（「臭気物質」）を感知する、すなわちニオイを嗅ぐことができる。これらの化学物質は構造が高度に相違しており、一連の多種多様な脂肪族系酸、アルコール、アルデヒド、ケトン、およびエステル；芳香環、脂環、多環および複素環の構造を備える化学物質；およびこれらのタイプ各々の無数の置換化学物質、ならびにそれらの組み合わせを含んでいる。注目すべきことに、これらの分子は嗅覚系によって検出されるだけではなく、嗅覚系自体によって識別される。
【０００４】
一部のニオイは望ましく、そして他のニオイは嫌われるので、新しいニオイを作り出す、ニオイを模倣する、そしてニオイの知覚を操作する能力は極めて望ましい。このために、ニオイの知覚に関する研究が近年強められてきた。ヒトおよび他の動物種では、嗅覚感覚ニューロンの特殊タイプの樹状突起である嗅覚繊毛上で極めて多数の臭気物質受容体が同定されている。これらの臭気物質受容体はＧタンパク質共役受容体のスーパーファミリーに特徴的な７回膜貫通ドメイントポロジーを示すので、したがって「嗅覚ＧＰＣＲ」と呼ばれている。各嗅覚感覚ニューロンは１つのタイプの嗅覚ＧＰＣＲしか発現せず、ヒトゲノムはおよそ５００種の活性嗅覚ＧＰＣＲをコードすると推定されている。
【０００５】
したがって、比較的少数の受容体によって極めて多数の化学物質を検出かつ識別することができる。これは各嗅覚ＧＰＣＲが１種より多くの臭気物質を認識し、各臭気物質が１種より多くの嗅覚ＧＰＣＲによって認識されるコンビナトリアル受容体コ―ディングスキーム（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｏｄｉｎｇ ｓｃｈｅｍｅ）を用いて達成される。そこで臭気物質は、活性化ＧＰＣＲの「フィンガープリント」によって特徴付けることができる。いったん決定されると、この「フィンガープリント」は臭気物質の正体（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）、ならびに類似の「フィンガープリント」、従ってニオイを示す他の分子を同定するための根拠を提供する。
アデノウイルスベクターを用いて外来的に導入された場合にその組換え嗅覚ＧＰＣＲは嗅覚感覚ニューロンによってインビボで高レベルで効率的に発現され得る（例、非特許文献１）という事実にもかかわらず、嗅覚ＧＰＣＲは、それらが細胞内でそれらの機能を提供する方法で、異種培養細胞系で容易に発現できないという点で極めて例外的である（例、非特許文献２）。この問題の正確な原因は不明ではあるが、１つの理論は、非内因性細胞中で発現したときに嗅覚ＧＰＣＲが細胞の原形質膜へ運ばれず、小胞体中に隔離されるようになるというものである。また別の理論は、機能的発現は正しい膜局在化のために必要とされる嗅覚特異的因子または非嗅覚細胞中での情報伝達機構への非効率な共役に起因する可能性があると示唆している（非特許文献３）。非内因性培養細胞中での組換え嗅覚ＧＰＣＲの非効率的および／または本質的に非機能的な発現を生じさせる機構とは無関係に、この問題に対する解決策はこれまで知られていない。本発明までは、嗅覚ＧＰＣＲはインビトロでは哺乳動物細胞中で発現するのが格別に困難であり、そしてそのような方法が極めて望ましいのではあるが、これまではそれらのＧＰＣＲを産生およびアッセイする強固で確実かつ効率的な方法はなかった。臭気物質の認識および識別を理解することにおける進歩は、嗅覚ＧＰＣＲを産生できないために強度に妨害されている（非特許文献４）。
さらに上記から、哺乳動物細胞中で嗅覚ＧＰＣＲを産生するための強固で、確実かつ効率的な方法に対する大きな必要がある。本発明は、この必要や他の必要を満たし、予想外に高水準の成功を生じさせる。
（文献）
目的の文献には下記の参考文献が含まれる：非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８および非特許文献１９；特許文献１および特許文献２；ならびに特許文献３、特許文献４および特許文献５。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００３／０１４３６７９号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００３／０１０５２８５号明細書
【特許文献３】米国特許第６，６１０，５１１号明細書
【特許文献４】米国特許第６，４９２，１４３号明細書
【特許文献５】米国特許第６，４１０，２４９号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｔｏｕｈａｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９９９年、９６：ｐ．４０４０−４０４５
【非特許文献２】ＭｃＣｌｉｎｔｏｃｋ、Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．、１９９７年、４８：ｐ．２７０−２７８
【非特許文献３】Ｋｒｉｅｇｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９９４年、２１９：ｐ．８２９−８３５
【非特許文献４】Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２００１年、４１３：ｐ．２１１−２１８
【非特許文献５】Ｚｏｚｕｌｙａら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００１年、２：ｐ．００１８．１−００１８．１２
【非特許文献６】Ｍｏｍｂａｉｒｔｓ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、１９９９年、２２：ｐ．４８７−５０９
【非特許文献７】Ｒａｍｉｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９３年、３６１：ｐ．３５３−３５６
【非特許文献８】Ｂｅｌｌｕｓｃｉｏら、Ｎｅｕｒｏｎ、１９８８年、２０：ｐ．６９−８１
【非特許文献９】Ｒｏｎｎｅｔら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２００２年、６４：ｐ．１８９−２２２
【非特許文献１０】Ｌｕら、Ｔｒａｆｆｉｃ、２００３年、４：ｐ．４１６−５３３
【非特許文献１１】Ｂｕｃｋ、Ｃｅｌｌ、２０００年、１００：ｐ．６１１−６１８
【非特許文献１２】Ｍａｌｎｉｃら、Ｃｅｌｌ、１９９９年、９６：ｐ．７１３−７２３
【非特許文献１３】Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２００１年、４１３：ｐ．２１１−２１８
【非特許文献１４】Ｚｈａｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９８年、２７９：ｐ．２３７−２４２
【非特許文献１５】Ｔｏｕｈａｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９９９年、９６：ｐ．４０４０−４０４５
【非特許文献１６】Ｓｋｌａｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、１９８６年、２６１：ｐ．１５５３８−１５５４３
【非特許文献１７】Ｄｒｙｅｒら、ＴｉＰＳ、１９９９年、２０：ｐ．４１３−４１７
【非特許文献１８】Ｉｖｉｃら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．、２００２年、５０：ｐ．５６−６８
【非特許文献１９】Ｆｕｃｈｓら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、２００１年 １０８：ｐ．１−１３
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、細胞中で嗅覚ＧＰＣＲを産生するための方法を提供する。一般に、本方法は、嗅覚ＧＰＣＲをコードする核酸へ作動可能に連結したプロモーターを含有する発現カセットを大グリア細胞、例えばシュヴァン（Ｓｃｈｗａｎｎ）細胞もしくは希突起膠細胞（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ）中へ導入する工程と、および嗅覚ＧＰＣＲを産生するために適切な条件下で前記細胞を維持する工程と、を含んでいる。さらに、嗅覚ＧＰＣＲをコードする組換え核酸を含有する大グリア細胞、嗅覚ＧＰＣＲ活性の調節因子についてスクリーニングする方法、および大グリア細胞中で嗅覚ＧＰＣＲを産生するためのキットも提供される。本発明は、香味料および芳香剤に関する研究において最も有用であるので、その結果として多種多様な研究および産業上の用途を有する。
本発明は、さらに以下の項目を提供する：
（項目１）
嗅覚ＧＰＣＲを産生する方法であって、
該嗅覚ＧＰＣＲをコードする核酸に作動可能に連結したプロモーターを含む発現カセットを、インビトロで大グリア細胞中へ導入する工程、および
該嗅覚ＧＰＣＲの産生に適した条件下で、該細胞を維持し、該嗅覚ＧＰＣＲを産生する工程、
を包含する、方法。
（項目２）
前記大グリア細胞がミエリン産生細胞である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記大グリア細胞がシュヴァン細胞、希突起膠細胞または嗅神経鞘細胞である、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記大グリア細胞が初代シュヴァン細胞である、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記細胞が不死化大グリア細胞である、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記嗅覚ＧＰＣＲが細胞表面で検出可能である、項目１に記載の方法。
（項目７）
嗅覚調節因子をスクリーニングする方法であって、
項目１に記載の方法に従って大グリア細胞中において嗅覚ＧＰＣＲを産生する工程であって、ここで、該嗅覚ＧＰＣＲがＧタンパク質へ共役されている、工程；
該細胞を候補因子と接触させる工程；および
該嗅覚ＧＰＣＲの活性に対する該候補因子の作用を評価する工程
を包含し、ここで、該嗅覚ＧＰＣＲの活性を調節する候補因子が嗅覚調節因子である、方法。
（項目８）
嗅覚ＧＰＣＲの調節因子をスクリーニングする方法であって、
項目１に記載の方法に従って大グリア細胞中において該嗅覚ＧＰＣＲを産生する工程であって、ここで、該嗅覚ＧＰＣＲがＧタンパク質へ共役されている、工程；
該細胞を候補因子と接触させる工程；および
該嗅覚ＧＰＣＲの活性に対する該候補因子の作用を評価する工程
を包含し、ここで、該嗅覚ＧＰＣＲの活性を調節する候補因子が該嗅覚ＧＰＣＲの調節因子である、方法。
（項目９）
前記因子が小有機分子である、項目７または項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記因子が臭気物質である、項目７または項目８に記載の方法。
（項目１１）
前記接触させる工程が前記嗅覚ＧＰＣＲの既知のアゴニストの存在下で実施される、項目７または項目８に記載の方法。
（項目１２）
前記調節因子が、アゴニスト、部分アゴニスト、インバースアゴニストおよびアンタゴニストからなる群から選択される、項目７または項目８に記載の方法。
（項目１３）
前記評価する工程がＧＴＰγＳ結合のレベルの測定を通して行われる、項目７または項目８に記載の方法。
（項目１４）
前記評価する工程が、環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）、環状ＧＭＰ（ｃＧＭＰ）、イノシトール１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、およびＣａ２＋の群から選択される第２メッセンジャーのレベルの測定を通して行われる、項目７または項目８に記載の方法。
（項目１５）
前記第２メッセンジャーがｃＡＭＰである、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
嗅覚ＧＰＣＲのリガンドをスクリーニングする方法であって、
項目１に記載の方法に従って大グリア細胞中において該嗅覚ＧＰＣＲを産生する工程；
該嗅覚ＧＰＣＲを候補因子と接触させる工程；および
該候補因子の該嗅覚ＧＰＣＲへの結合を評価する工程、
を包含する、方法。
（項目１７）
前記候補因子が標識される、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
嗅覚ＧＰＣＲのリガンドをスクリーニングする方法であって、
項目１に記載の方法に従って大グリア細胞中において該嗅覚ＧＰＣＲを産生する工程；
該嗅覚ＧＰＣＲを、該嗅覚ＧＰＣＲの標識された既知のリガンドの存在下で候補因子と接触させる工程；および
該嗅覚ＧＰＣＲの該標識された既知のリガンドの結合を評価する工程
を包含し、ここで、該候補因子の存在下での該標識された既知のリガンドの結合の減少は、該候補因子が該嗅覚ＧＰＣＲのリガンドであることの指標である、方法。
（項目１９）
嗅覚調節因子をスクリーニングする方法であって、
項目１に記載の方法に従って複数の異なる嗅覚ＧＰＣＲを産生する工程であって、ここで、該嗅覚ＧＰＣＲの各々がＧタンパク質へ共役されている、工程；
第１の因子によって活性化される異なる嗅覚ＧＰＣＲのセットを同定する工程であって、ここで、該第１の因子が既知の嗅覚調節因子である、工程；
該ＧＰＣＲのセットを第２の因子と接触させる工程；および
該第２の因子の該嗅覚ＧＰＣＲの活性に対する作用を評価する工程
を包含し、ここで、該第１の因子によって調節された該異なるＧＰＣＲセットの１つ以上のＧＰＣＲを調節する第２の因子が、嗅覚調節因子である、方法。
（項目２０）
前記セットが３つ以上のＧＰＣＲを含む、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
嗅覚ＧＰＣＲをコードする組換え核酸を含む大グリア細胞。
（項目２２）
大グリア細胞；および
嗅覚ＧＰＣＲをコードする核酸
を備える、キット。
（項目２３）
前記大グリア細胞を用いて前記嗅覚ＧＰＣＲを産生するための指示書をさらに備える、項目２２に記載のキット。
（項目２４）
サンプル中において目的の臭気物質を同定する方法であって、
サンプルを、項目１に記載の方法に従って複数の異なる嗅覚ＧＰＣＲを産生する複数の大グリア細胞と接触させる工程であって、ここで、該嗅覚ＧＰＣＲの各々がＧタンパク質へ共役されている、工程；および
該臭気物質の存在に対する該嗅覚ＧＰＣＲの活性化を評価する工程
を包含し、ここで、予め決定された嗅覚ＧＰＣＲのセットの活性化が、該サンプルにおける該臭気物質の存在を示す、方法。
（項目２５）
臭気物質の「フィンガープリント」を決定する方法であって、
サンプルを、項目１に記載の方法に従って複数の異なる嗅覚ＧＰＣＲを産生する複数の大グリア細胞と接触させる工程であって、ここで、該嗅覚ＧＰＣＲの各々がＧタンパク質へ共役されている、工程；および
該臭気物質による活性化に対する該嗅覚ＧＰＣＲの活性化を評価する工程
を包含し、ここで、該「フィンガープリント」が該臭気物質によって活性化された異なる嗅覚ＧＰＣＲのセットを含む、方法。
（項目２６）
前記接触させる工程が、前記複数の嗅覚ＧＰＣＲのうちの１つ以上の既知のアゴニストの存在下で実施される、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記複数の細胞が、細胞のアドレス指定可能なアレイであり、ここで、該アレイの各アドレスが単一の組換え嗅覚ＧＰＣＲを産生する大グリア細胞を含有する、項目２４〜２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記ＧＰＣＲ活性化が、ＧＰＣＲ活性化の発光レポーターを用いて評価される、項目２７に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は初代ラットシュヴァン細胞の表面上での組換えヒト嗅覚ＧＰＣＲの発現を示している４枚の写真パネルである。パネルＯＲ１は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｐ４７８９３を有する嗅覚ＧＰＣＲである。パネルＯＲ２は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０３６５０５を有する嗅覚ＧＰＣＲである。パネルＯＲ３は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＸＰ＿１６６８６８を有する嗅覚ＧＰＣＲである。ベクターは空の発現ベクターでネガティブコントロールである。嗅覚ＧＰＣＲは、ロドプシンシグナルペプチドおよびヘマグルチニン（ＨＡ）エピトープタグを含むＮ末端融合タンパク質としてＣＭＶプロモーターに基づく発現ベクターから発現させられる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
（定義）
本発明についてさらに詳細に説明する前に、本発明は当然ながら変動する可能性があるので、記載した特定の実施形態には限定されないことを理解されたい。さらに、本明細書で使用する用語は特定の実施形態を記載するためのみであって、限定することは企図されていないことも理解されたい。他に特別に規定しない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般に理解される意味と同一の意味を有する。
【００１１】
ある範囲の値が提供される場合は、その範囲の上限と下限との間に介在する各値ならびにその記載した範囲内の任意の他の記載した、もしくは介在する値の間に介在する値は、その状況が明白にそうでないことを指示しない限り下限の単位の１０分の１まで、本発明の範囲内に含まれると理解されている。これらの小さな範囲の上限および下限は小さな範囲内に独立して含まれる可能性があり、そしてさらに、記載された範囲内のいずれか具体的な限度が排除された、本発明の範囲内に含まれる。記載された範囲が一方もしくは両方の限度を含む場合は、それらの含まれた限度の一方もしくは両方を除外する範囲もまた本発明に含まれる。
【００１２】
本出願を通して、様々な出版物、特許および公表された特許出願が引用される。本特許出願において言及したこれらの出版物、特許および公表された特許出願の開示は、これによりそれらの全体が本発明の開示の中に参考として援用される。出版物、特許、または公表された特許出願についての本出願人による本明細書での引用は、前記出版物、特許、もしくは公表された特許出願が先行技術であることを本出願人が認めたわけではない。
【００１３】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する単数形の「１つの」「および」および「その」は、その内容が明白にそうでないことを指示していない限り、複数の対象を含むことに留意しなければならない。そこで、例えば「１つの因子」との言及は複数のそのような因子を含んでおり、そして「ＧＰＣＲ」との言及は１つ以上のＧＰＣＲおよび当業者には公知のそれらの同等物についての言及を含んでいる、などである。さらに、特許請求の範囲は任意の必要に応じた要素を排除するように起草できることも留意されたい。したがって、この陳述は「単独で」、「〜だけ」などの排他的な用語を請求項の構成要件の記載と、または「否定的」制限の使用と結び付けて使用するための記述の根拠として機能することが企図されている。
【００１４】
「Ｇタンパク質共役受容体」もしくは「ＧＰＣＲ」は、共通の構造モチーフを共有し、各々が１枚の膜にわたっている７つのαヘリックスを形成する２２〜２４の間の疎水性アミノ酸の７つの領域を有するポリペプチドである［各範囲は、番号、すなわち膜貫通−１（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ−１；ＴＭ１）、膜貫通−２（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ−２；ＴＭ２）などによって同定される］。膜貫通ヘリックスは、細胞膜の外側、すなわち「細胞外」側で膜貫通−２と膜貫通−３（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ−３）との間、膜貫通−４（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ−４）と膜貫通−５（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ−５）との間、および膜貫通−６（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ−６）と膜貫通−７（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ−７）との間のアミノ酸の領域によって連結されている［これらは、各々「細胞外」領域１、２および３（ＥＣ１、ＥＣ２およびＥＣ３）と呼ばれている］。膜貫通ヘリックスは、さらにまた細胞膜の内側、すなわち「細胞内」側で膜貫通−１と膜貫通−２との間、膜貫通−３と膜貫通−４との間、および膜貫通−５と膜貫通−６との間のアミノ酸の領域によって連結されている［これらは、各々「細胞内」領域１、２および３（ＩＣ１、ＩＣ２およびＩＣ３）と呼ばれている］。この受容体の「カルボキシ」（「Ｃ」）末端は細胞内の細胞内空間中に存在し、そしてこの受容体の「アミノ」（「Ｎ」）末端は細胞外の細胞外空間中に存在する。ＧＰＣＲの構造および分類は当技術分野において一般によく知られており、ＧＰＣＲについてのさらなる考察はＰｒｏｂｓｔ， ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １９９２ １１：１−２０；Ｍａｒｃｈｅｓｅ ｅｔ ａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２３：６０９−６１８，１９９４；ならびに以下の書籍：Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓによって出版されたＪｕｅｒｇｅｎ Ｗｅｓｓ（Ｅｄ） Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ（１ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｏｃｔｏｂｅｒ １５， １９９９）；Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓによって出版されたＫｅｖｉｎ Ｒ． Ｌｙｎｃｈ（Ｅｄ） Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ（Ｍａｒｃｈ １９９８）およびＣＲＣ Ｐｒｅｓｓによって出版されたＴａｔｓｕｙａ Ｈａｇａ（Ｅｄ）， Ｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２４， １９９９）；そしてＡｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓによって出版されたＳｔｅｖｅ Ｗａｔｓｏｎ（Ｅｄ） Ｇ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｎｋｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｆａｃｔｓｂｏｏｋ（１ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ；１９９４）の中に見いだすことができる。
【００１５】
「天然ＧＰＣＲ」（ｎａｔｉｖｅ ＧＰＣＲ）は、動物、例えばヒトもしくはマウスなどの哺乳動物によって産生されるＧＰＣＲである。天然ＧＰＣＲの詳細な説明は、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のワールドワイドウェブサイトで見いだされるＯｎ−ｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ ｄａｔａｂａｓｅ（ヒトにおけるメンデル性遺伝についてのオンラインデータベース）の中に見いだすことができる。天然ＧＰＣＲについての追加の説明は、ｐｒｉｍａｌｉｎｃ．ｃｏｍのワールドワイドウェブサイトおよび表１に記載した本方法において使用するための代表的ＧＰＣＲのリストに見いだすことができる。
【００１６】
用語「リガンド」は、ＧＰＣＲへ特異的に結合する分子を意味する。リガンドは、例えばポリペプチド、脂質、小分子または抗体などであってよい。「天然リガンド」（ｎａｔｉｖｅ ｌｉｇａｎｄ）は、天然ＧＰＣＲのための内因性の天然リガンドである。リガンドは、ＧＰＣＲ「アンタゴニスト」、「アゴニスト」、「部分アゴニスト」または「インバースアゴニスト」（ｉｎｖｅｒｓｅ ａｇｏｎｉｓｔ）などであってよい。
【００１７】
「調節因子」は、それが細胞中で発現するＧＰＣＲと接触した、例えば結合した場合にＧＰＣＲ細胞内応答を増加もしくは減少させるリガンドである。
【００１８】
用語「第２メッセンジャー」は、受容体活性化の結果として産生される細胞内応答を意味するものとする。第２メッセンジャーは、例えばイノシトール１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）、環状ＧＭＰ（ｃＧＭＰ）およびＣａ２＋を含むことができる。第２メッセンジャー応答を測定すると、受容体活性化を決定できる。さらに、第２メッセンジャー応答を測定すると、候補因子、例えばアゴニスト、部分アゴニスト、インバースアゴニスト、およびアンタゴニストを同定できる。
【００１９】
「アゴニスト」は、それがＧＰＣＲに結合するとＧＰＣＲ細胞内応答を活性化するリガンドである。
【００２０】
「部分アゴニスト」は、それがＧＰＣＲに結合すると、アゴニストより低い程度まで、ＧＰＣＲ細胞内応答を活性化するリガンドである。
【００２１】
「アンタゴニスト」は、アゴニストと同一部位でＧＰＣＲへ競合的に結合するが、ＧＰＣＲの活性形によって産生される細胞内応答を活性化しないリガンドである。アンタゴニストは、アゴニストもしくは部分アゴニストによる細胞内応答を通常は阻害する。アンタゴニストは、通常はアゴニストもしくは部分アゴニストの不在下ではベースライン細胞内応答を減少させない。
【００２２】
「インバースアゴニスト」は、ＧＰＣＲに結合し、アゴニストもしくは部分アゴニストの不在下で観察されたＧＰＣＲのベースライン（基底）細胞内応答を阻害するリガンドである。大多数の実施形態では、ベースライン細胞内応答はインバースアゴニストの存在下では、インバースアゴニストの不在下でのベースライン応答に比較して、少なくとも約３０％、少なくとも約５０％、もしくは少なくとも約７５％阻害される。
【００２３】
用語「臭気物質」は、嗅覚ＧＰＣＲを活性化する、既知または未知の構造の天然型もしくは化学合成された任意の化合物を含んでいる。上記の背景のセクションにおいて考察したように、臭気物質は、通常は揮発性の、４００Ｄａ未満の小有機分子である。香味料、香水、芳香、臭気、芳香剤は臭気物質のタイプである。「ニオイ」は、特定臭気物質に結び付いた感覚である。
【００２４】
本明細書で使用する用語「嗅覚ＧＰＣＲ活性に結び付いた現象」は、嗅覚ＧＰＣＲ活性に結び付いた、特にヒトもしくは動物モデルにおいて容易に評価できる特徴などの構造的、分子的、または機能的特徴をいう。そのような特徴には、ＧＰＣＲの活性化によって誘導された下流分子事象、およびニオイ、味、またはＧＰＣＲの活性化によって誘導されたその他の挙動的もしくは生理的事象などの感覚現象が含まれるが、それらに限定されない。
【００２５】
「欠失」は、親ＧＰＣＲポリペプチドもしくは核酸のアミノ酸配列もしくはヌクレオチド配列に比較してその中で１つ以上のアミノ酸もしくはヌクレオチド残基が各々欠如している、アミノ酸もしくはヌクレオチドのいずれかの配列における変化であると規定されている。ＧＰＣＲまたはそのフラグメントの状況においては、欠失は、約２個、約５個、約１０個、約２０個まで、約３０個までもしくは約５０個まで、またはそれ以上のアミノ酸の欠失を含んでいてよい。ＧＰＣＲもしくはそのフラグメントは１より多くの欠失を含有していてよい。
【００２６】
「挿入」もしくは「付加」は、親ＧＰＣＲのアミノ酸配列もしくはヌクレオチド配列に比較して、各々１つ以上のアミノ酸もしくはヌクレオチド残基の付加を生じさせている、アミノ酸もしくはヌクレオチド配列における変化である。「挿入」は、一般にポリペプチドのアミノ酸配列内の１つ以上のアミノ酸残基への付加をいうが、「付加」は挿入であってよい、またはＮ末端もしくはＣ末端、または両端で付加されたアミノ酸残基をいう。ＧＰＣＲまたはそのフラグメントの状況においては、挿入もしくは付加は、通常、約１個、約３個、約５個、約１０個、約２０個まで、約３０個まで、もしくは約５０個まで、またはそれ以上のアミノ酸の挿入もしくは付加である。ＧＰＣＲもしくはそのフラグメントは１より多くの挿入を含有していてよい。
【００２７】
「置換」は、各々親ＧＰＣＲもしくはそのフラグメントのアミノ酸配列もしくはヌクレオチド配列と比較して、相違するアミノ酸もしくはヌクレオチドによる１つ以上のアミノ酸もしくはヌクレオチドの置換の結果として生じる。ＧＰＣＲもしくはそのフラグメントは、ＧＰＣＲ活性へ実質的に作用を及ぼさない保存的アミノ酸置換を有する可能性があることは理解されている。保存的置換は、ｇｌｙ、ａｌａ；ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ；ａｓｐ、ｇｌｕ；ａｓｎ、ｇｌｎ；ｓｅｒ、ｔｈｒ；ｌｙｓ、ａｒｇ；およびｐｈｅ、ｔｙｒなどの組み合わせが企図されている。
【００２８】
用語「生物活性」ＧＰＣＲは、天然に存在するＧＰＣＲの構造的および生化学的機能を有するＧＰＣＲをいう。
【００２９】
本明細書で使用する用語「決定する工程」、「測定する工程」、「評価する工程」、および「アッセイする工程」は交換可能に使用され、定量的および定性的決定の両方を含んでいる。これらの状況におけるＧＰＣＲの「量」についての言及が定量的評価を必要とすることは意図されておらず、そして他に具体的に指示されない限り、定性的または定量的のいずれであってもよい。
【００３０】
本明細書で交換可能に使用される用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、任意の長さの高分子形のアミノ酸をいい、コードされたアミノ酸およびコードされたものではないアミノ酸、化学的もしくは生化学的に修飾もしくは誘導体化されたアミノ酸、ならびに修飾ペプチド主鎖を有するポリペプチドを含むことができる。この用語には、Ｎ末端メチオニン残基を備える、もしくは備えない、異種および同種リーダー配列との融合体である異種アミノ酸配列を備える融合タンパク質；免疫学的にタグ付けされたタンパク質；融合パートナーとして例えば蛍光タンパク質、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなどを含む融合タンパク質のような検出可能な融合パートナーを備える融合タンパク質などを含むがそれらに限定されない融合タンパク質が含まれる。
【００３１】
用語「核酸分子」および「ポリヌクレオチド」は交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはそれらのアナログのいずれかである、任意の長さの高分子形のヌクレオチドをいう。ポリヌクレオチドは任意の三次元構造を有していてよく、既知または未知の任意の機能を実行することができる。ポリヌクレオチドの非限定的例には、遺伝子、遺伝子フラグメント、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、制御領域、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマーが含まれる。核酸分子は、直鎖状であっても環状であってもよい。
【００３２】
本明細書で使用する用語「単離（された）」は、単離化合物の状況において使用する場合は、その中で化合物が自然に発生する環境とは相違する環境内にある目的の化合物をいう。「単離（された）」は、目的の化合物が実質的に富化されている、および／または目的の化合物が部分的もしくは実質的に精製されているサンプル内にある化合物を含むことが意図されている。
【００３３】
本明細書で使用する用語「実質的に純粋」は、その天然環境から取り出されており、自然にはそれに結び付いている他の成分を少なくとも６０％含まない、好ましくは７５％含まない、および最も好ましくは９０％含まない化合物をいう。
【００３４】
「コーディング配列」もしくは選択されたポリペプチドを「コードする」配列は、例えば適切な調節配列（もしくは「制御エレメント」の制御下に置かれたときに、宿主細胞中で（ＤＮＡの場合は）転写することができることおよび（ｍＲＮＡの場合は）ポリペプチドへ翻訳することのできる核酸分子である。コーディング配列の境界は、典型的には５’（アミノ）末端にある開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端にある翻訳停止コドンによって決定される。コーディング配列には、ウイルス由来ｃＤＮＡ、原核細胞もしくは真核細胞ｍＲＮＡ、ウイルスもしくは原核細胞ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列を含むことができるが、それらに限定されない。転写終結配列はコーディング配列に対して３’に位置していてよい。その他の「制御エレメント」はさらにまたコーディング配列と結び付いていてもよい。ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、所望のポリペプチドコーディング配列のＤＮＡコピーを表すために選択された細胞にとって好ましいコドンを使用することによって選択された細胞内での発現に最適化することができる。
【００３５】
「によってコードされた」は、ポリペプチド配列をコードする核酸配列をいい、このときポリペプチド配列もしくはその一部分は、核酸配列によってコードされたポリペプチドから少なくとも３〜５アミノ酸、より好ましくは少なくとも８〜１０アミノ酸、およびいっそうより好ましくは少なくとも１５〜２０アミノ酸の配列を含有している。さらに、その配列によってコードされたポリペプチドを用いて免疫学的に同定可能なポリペプチド配列も含まれる。
【００３６】
「作動可能に連結した」は、そのように記載された構成成分がそれらの通常の機能を実行できるように構成されているエレメントの配置をいう。コーディング配列へ作動可能に連結したプロモーターは、コーディング配列の発現を達成するであろう。プロモーターもしくはその他の制御エレメントは、それらがそれらの発現を指令するように機能する限り、コーディング配列と隣接している必要はない。例えば、介在する翻訳されないが転写される配列がプロモーター配列とコーディング配列との間に存在していてよく、プロモーター配列はそれでもまだコーディング配列と「作動可能に連結した」と見なすことができる。
【００３７】
「核酸構築物」は、自然には一緒に見いだされない１つ以上の機能的ユニットを含むように構築されている核酸配列を意味する。例には、環状、直鎖状、二本鎖、染色体外ＤＮＡ分子（プラスミド）、コスミド（ラムダファージ由来のＣＯＳ配列を含有するプラスミド）、非天然核酸配列を含むウイルスゲノムなどが含まれる。
【００３８】
「ベクター」は、遺伝子配列を宿主細胞へ移すことができる。典型的には、「ベクター構築物」、「発現ベクター」および「遺伝子移入ベクター」は目的の遺伝子の発現を指令できる、そしてベクターの全部もしくは一部分のゲノム組込み、または染色体外エレメントとしてのベクターの一過性もしくは遺伝性維持によって達成できる、遺伝子配列を宿主細胞へ移入できる任意の核酸構築物を意味している。そこで、この用語は、クローニングおよび発現ビヒクルならびに組込み型ベクターを含んでいる。
【００３９】
「発現カセット」は、発現カセットのプロモーターへ作動可能に連結した、目的の遺伝子／コーディング配列の発現を指令できる任意の核酸構築物を含んでいる。そのようなカセットは、宿主細胞中へ発現カセットを移入するために、「ベクター」、「ベクター構築物」、「発現ベクター」、もしくは「遺伝子移入ベクター」内へ構築することができる。そこで、この用語は、クローニングおよび発現ビヒクルならびにウイルスベクターを含んでいる。
【００４０】
第１ポリヌクレオチドは、それが第２ポリヌクレオチド、そのｃＤＮＡ、それらの相補体の１領域と同一もしくは実質的に同一のヌクレオチド配列を有する場合、またはそれが上述した配列同一性を表示する場合は、第２ポリヌクレオチドに「由来する」または「対応する」。
【００４１】
第１ポリペプチドは、それが（ｉ）第２ポリヌクレオチドに由来する第１ポリヌクレオチドによってコードされるかまたは（ｉｉ）上述したように第２ポリペプチドに対する配列同一性を表示する場合は、第２ポリペプチドに「由来する」、または「対応する」。
【００４２】
用語「投与する工程」などは、所望の薬理学的および／または生理学的作用を入手するためにＧＰＣＲ調節因子を添加する工程をいう。多数の実施形態では、本ＧＰＣＲ調節因子は揮発性であり、したがってそれらは食材または大気への添加によって直接的もしくは間接的のいずれかで、経口もしくは鼻腔内投与される。この作用は臭気の知覚を完全もしくは部分的に防止することができる、臭気物質の知覚を増加させることができる、または新しい臭気を発生させることができる。
【００４３】
用語「天然に存在しない」もしくは「組換え」は、人工的もしくはさもなければ天然では見いだされないことを意味する。組換え細胞は通常はその細胞内で見いだされない核酸を含有しており、組換え核酸は通常は自然では見いだされない２つ以上の核酸の融合体を含有しており、そして組換えポリペプチドは通常は組換え核酸によって産生される。
【００４４】
「被験体」、「個体」、「宿主」および「患者」は、本明細書では交換可能に使用され、嗅覚ＧＰＣＲを有する任意の動物、例えば哺乳動物、ヒトもしくは非ヒトをいう。一般に、被験体は哺乳動物被験体である。代表的な被験体には、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、およびウマを含むが必ずしもそれらに限定されず、特に関心対象となるのはヒトである。
【００４５】
（発明の詳細な説明）
本発明は、細胞中で嗅覚ＧＰＣＲを産生するための方法を提供する。一般に、本方法は、嗅覚ＧＰＣＲをコードする核酸へ作動可能に連結したプロモーターを含有する発現カセットを大グリア細胞、例えばシュヴァン細胞もしくは希突起膠細胞中へ導入する工程と、および嗅覚ＧＰＣＲを産生するために適切な条件下で前記細胞を維持する工程と、を含んでいる。さらに、嗅覚ＧＰＣＲをコードする組換え核酸を含有する大グリア細胞、嗅覚ＧＰＣＲ活性の調節因子についてスクリーニングする方法、および大グリア細胞中で嗅覚ＧＰＣＲを産生するためのキットも提供される。本発明は、例えば香味料および芳香剤の分析および同定において利用されるので、その結果として多種多様な研究および産業上の用途を有する。
【００４６】
要約のセクションに提供するより、そして上述した背景技術および用語の定義によって提供したよりもはるかに詳細に本発明を説明する際に、嗅覚ＧＰＣＲを産生する方法について最初に記載し、次に本発明の方法を実施する際に利用する組成物およびキットの説明を続ける。最後に、嗅覚ＧＰＣＲ活性の調節因子をスクリーニングする方法および臭気物質ミメティックをスクリーニングする方法について考察する。
【００４７】
（嗅覚ＧＰＣＲを産生するための方法）
１つの局面では、本発明は、細胞中で嗅覚ＧＰＣＲを産生する方法を提供する。これらの方法を記載する際に、本方法において使用するための組成物を最初に記載しよう。
【００４８】
（嗅覚Ｇタンパク質共役受容体）
用語「嗅覚Ｇタンパク質共役受容体」（もしくはその略語、例えば「嗅覚ＧＰＣＲ」）は、化学的感覚に含まれるＧＰＣＲスーパーファミリーの系統発生的に別個の当技術分野において認識されたサブファミリーの任意のメンバーをいう。嗅覚ＧＰＣＲは、それらの全体が本明細書に特別に援用されるＺｏｚｕｌｙａ ｅｔ ａｌ， （Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ． ２：００１８， ２００１）；Ｇｌｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ， （Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． １１：６８５−７０２， ２００１）およびＣｒａｓｔｏ ｅｔ ａｌ， （Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３０：３５４−６０， ２００２）を含む、極めて多種多様な出版物および公共データベース内で一般的および詳細に開示されている。特に、Ｓｅｎｓｅｌａｂ．ｍｅｄ．ｙａｌｅ．ｅｄｕのワールドワイドウェブサイトで見いだされる嗅覚ＧＰＣＲ配列のデータバース内で記載された嗅覚ＧＰＣＲが関心の対象である。本方法において使用するために適切な代表的な嗅覚ＧＰＣＲの非限定的リストは、特許請求の範囲の前に挿入した表１に提供した。表１は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのワールドワイドウェブサイトで見いだされるような、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベースからのタンパク質配列登録のアクセッション番号のリストである。表１に列挙したこれらのデータベース登録、特にそれらの登録に記載されたアミノ酸配列は、それらの全体が参考として本明細書に特別に援用される。
【００４９】
嗅覚ＧＰＣＲはヒト起源もしくは非ヒト動物起源のものであってよいことは明示的に企図されている。特定の実施形態では、非ヒト動物は、マウス、ラット、イヌ、またはニオイの識別的な鋭い感覚を備える任意の他の非ヒト動物であってよい。特定の実施形態では、嗅覚ＧＰＣＲは昆虫（例、カ、アリ、アブラムシ、カブトムシ、ハエ、スズメバチ、ミツバチ、クモ、あるいはヒトもしくは非ヒト動物へ疾患を伝播する、または農作物もしくは観賞用植物に対する損害を引き起こす任意の昆虫）起源のものであってよい。特定の実施形態では、嗅覚ＧＰＣＲはヒトのものである。
【００５０】
本方法では天然ＧＰＣＲおよび変更された天然嗅覚ＧＰＣＲの両方を使用できることが認識されている。したがって、用語「嗅覚Ｇタンパク質共役受容体」は、さらにまたそれが対応する天然ＧＰＣＲと同一リガンドに結合するように、変化した天然嗅覚ＧＰＣＲ（例、レポーターの付加などの付加、置換、欠失および挿入などによって変化した天然嗅覚ＧＰＣＲ）を含むことも企図されている。
【００５１】
このため用語「嗅覚Ｇタンパク質共役受容体」は、表１に列挙したＧＰＣＲポリペプチドの変異体を含んでいる。言い換えると、本方法では任意の嗅覚ＧＰＣＲの変異体を使用できる。このため特定の実施形態では、嗅覚ＧＰＣＲは天然配列（例、ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋデータベースなどに寄託された配列など）に比較して変化した配列を有していてよい。例えば、嗅覚ＧＰＣＲは、ポリペプチド内の任意の位置（例、Ｃ末端もしくはＮ末端、または内部位置）での任意の数のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有する天然ポリペプチドであってよい。
【００５２】
特定の実施形態では、嗅覚ＧＰＣＲは融合タンパク質であり、例えば親和性タグドメインもしくはレポータードメインを含有していてよい。適切な親和性タグには、他の部分、通常は他のポリペプチド、最も一般的には抗体へ特異的に結合することのできる任意のアミノ酸配列が含まれる。適切な親和性タグには、当技術分野において公知のように、エピトープタグ、例えば、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ（ヘマグルチニンインフルエンザウイルス由来）、ｍｙｃタグなどが含まれる。適切な親和性タグには、さらに当技術分野において公知のように、それらに対する結合基質、例えばＨＩＳ、ＧＳＴおよびＭＢＰタグが既知のドメイン、ならびにそれらに対する特異的結合パートナー、例えば抗体、詳細にはモノクローナル抗体を利用できる他のタンパク質由来のドメインが含まれる。適切な親和性タグには、さらに特異的に結合して適切な結合パートナー、例えばＩｇＧ Ｆｃ受容体を用いて検出できるＩｇＧ Ｆｃ領域などの任意のタンパク質−タンパク質相互作用ドメインが含まれる。そのような融合タンパク質が、Ｎ末端メチオニン残基が欠失しているかもしくは代替アミノ酸と置換されているＧＰＣＲとインフレームで融合された異種Ｎ末端ドメイン（例、エピトープタグ）を含有していてよいことは明示的に企図されている。特定の実施形態では、嗅覚ＧＰＣＲ融合タンパク質はそのＮ末端で、単独もしくはヘマグルチニンエピトープタグと組み合わせてロドプシンシグナルペプチドを含んでいてよい。特定の実施形態では、嗅覚ＧＰＣＲ融合タンパク質はアミノ酸配列ＭＮＧＴＥＧＰＮＦＹＶＰＦＳＮＫＴＧＶＶＹＰＹＤＶＰＤＹＡＫＬを有するＮ末端を含んでいてよいが、このときＭＮＧＴＥＧＰＮＦＹＶＰＦＳＮＫＴＧＶＶはロドプシンシグナルペプチドであり、ＹＰＹＤＶＰＤＹＡＫＬはヘマグルチニンエピトープタグである。融合タンパク質としての嗅覚ＧＰＣＲの発現を可能にする発現カセットを構築することは当業者の技術の範囲内に明確に含まれる（例えば、Ｋｒａｕｔｗｕｒｓｔ ｅｔ ａｌ， Ｃｅｌｌ ９５：９１７−９２６， １９９８を参照されたい）。目的のポリペプチドは最初に天然ポリペプチドから作製して、次に上述したとおり適切なレポーター／タグへ作動可能に連結させることができることは理解されている。他の実施形態では、嗅覚ＧＰＣＲはＧＰＣＲのフラグメントであってよく、このとき前記ＧＰＣＲフラグメントは生物活性である。
【００５３】
適切なレポータードメインには、ポリペプチドの存在を報告できる任意のドメインが含まれる。親和性タグを使用して例えばタグへ特異的に結合する標識抗体を用いてポリペプチドの存在を報告できることは認識されているが、発光レポータードメインはより日常的に使用される。適切な発光レポータードメインには、ルシフェラーゼ（例えば、ホタル、ウミホタル（Ｖａｒｇｕｌａ）、Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓもしくはＲｅｎｉｌｌａ ｍｕｅｌｌｅｒｉ由来）、およびそれらの発光改変体が含まれる。その他の適切なレポータードメインには、蛍光タンパク質（例えば、クラゲ、サンゴならびにＡｅｑｕｏｒｉａ種、Ｒｅｎｉｌｌａ種、Ｐｔｉｌｏｓａｒｃｕｓ種、Ｓｔｙｌａｔｕｌａ種などの他の腔腸動物由来）、またはそれらの発光改変体が含まれる。これらのレポータータンパク質の発光改変体は当技術分野において極めてよく知られており、天然レポータータンパク質に比較して、より明るい、より薄暗い場合がある、または相違する励起および／または発光スペクトルを有することがある。例えば、一部の改変体は、それらがもはや緑色に見えないように変化させられている、そして当技術分野において公知のように、ブルー、シアン、イエロー、強化イエロー、レッド（各々、ＢＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ｅＹＦＰおよびＲＦＰと名付ける）に見える、または他の発光スペクトルを有していることがある。他の適切なレポータードメインには、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、および分泌された胚アルカリホスファターゼなどの生化学的変化もしくは変色を通してポリペプチドの存在を報告できるドメインが含まれる。一部の実施形態では、レポータードメインはＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ（例、ｐＲＬＣＭＶ；Ｐｒｏｍｅｇａ社製、カタログ番号Ｅ２６６１）である。
【００５４】
さらに、当技術分野において公知のように、親和性タグもしくはレポータードメインは、嗅覚ＧＰＣＲ内の任意の位置に存在していてよい。しかし、大多数の実施形態では、それらは嗅覚ＧＰＣＲのＣ末端もしくはＮ末端に存在している。
【００５５】
多数の実施形態では、嗅覚ＧＰＣＲは嗅覚ＧＰＣＲのライブラリーのメンバーである。典型的には、ライブラリーは複数のメンバーを含有するが、このとき複数は２以上、５以上、約１０以上、約２０以上、約５０以上、約１００以上、約２００以上、約３００以上、約５００以上、約１，０００以上、または約１０，０００以上まででさえあってよい。このためライブラリーは、約５、約１０、約２０、約３０以上、約５０以上、約１００以上、約２００以上、通常は約５００以上まで、通常は約１，０００以上までの嗅覚ＧＰＣＲポリペプチドを含有していてよい。ライブラリーのメンバーは、正体が既知のもの、もしくは正体が知られていないもの、またはそれらの混合物であってよい。ライブラリーのメンバーは完全に１つの種由来であってよい、または複数の種由来であってよい。
【００５６】
（嗅覚Ｇタンパク質共役受容体をコードする核酸）
核酸を操作するための遺伝子コードおよび組換え技術は知られており、そして嗅覚ＧＰＣＲポリペプチドのアミノ酸配列は上述したので、嗅覚ＧＰＣＲポリペプチドをコードする核酸の設計および産生は当業者の技術の範囲内に明白に含まれている。特定の実施形態では、標準組換えＤＮＡテクノロジー（Ａｕｓｕｂｅｌ， ｅｔ ａｌ， Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ３ｒｄ ｅｄ．， Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， １９９５；Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｔｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， （１９８９） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．）法が使用される。例えば、嗅覚ＧＰＣＲコーディング配列は、本明細書において詳細に記載する必要のない多種多様な組み換え方法の１つもしくは組み合わせを用いてライブラリーの嗅覚ＧＰＣＲコーディング配列から単離することができる。タンパク質をコードする核酸配列中でのヌクレオチドの引き続いての置換、欠失、および／または付加は、さらにまた標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて実施することもできる。
【００５７】
例えば、部位特異的変異誘発およびサブクローニングを使用すると、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド中の核酸残基を導入する／欠失させる／置換することができる。他の実施形態では、ＰＣＲを使用できる。目的のポリペプチドをコードする核酸は、さらにまたオリゴヌクレオチドから完全に化学合成によって作製することもできる（例、Ｃｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ （２００２） ２９７：１０１６−８）。
【００５８】
特定の実施形態では、目的のポリペプチドをコードする核酸のコドンは、特定種、詳細には哺乳動物、例えばヒトもしくはマウス種の細胞中で発現させるために最適化される。
【００５９】
本発明は、さらに本核酸を含むベクター（さらに「構築物」とも呼ばれる）を提供する。本発明の多数の実施形態では、本核酸配列は、配列が例えば発現カセットを形成するためのプロモーターを含む発現制御配列へ作動可能に連結した後に宿主内で発現されるであろう。本発現カセットは、典型的には宿主染色体ＤＮＡのエピソームまたは一体部分のいずれかとして宿主細胞中で複製できる発現ベクター内に配置される。一般に、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列を用いて形質転換されたそれらの細胞の検出を許容するために、選択マーカー、例えばテトラサイクリンもしくはネオマイシンを含有するであろう（例えば、参照して本明細書に組み込まれる米国特許第４，７０４，３６２号を参照されたい）。単一および二重発現カセットを含むベクターは当技術分野においてよく公知の（Ａｕｓｕｂｅｌ， ｅｔ ａｌ， Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ３ｒｄ ｅｄ．， Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， １９９５；Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｔｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， （１９８９） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．）。適切なベクターには、ウイルスベクター、プラスミド、コスミド、人工染色体（ヒト人工染色体、細菌人工染色体、酵母人工染色体など）、ミニ染色体などが含まれる。レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスベクターが使用されてよい。
【００６０】
細胞中での目的のポリペプチドを産生するために、当業者は様々な発現ベクターを利用できる。１つの適切なベクターは、特定の実施形態において使用されるｐＣＭＶである。このベクターは、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定下で１９９８年１０月１３日にアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ、２０１１０−２２０９米国バージニア州マナッサス）へ寄託された。このＤＮＡは、ＡＴＣＣによって試験され、生存可能であると決定された。このＡＴＣＣは、ｐＣＭＶに次の寄託番号：ＡＴＣＣ番号２０３３５１を指定した。
【００６１】
本発現カセットは通常、嗅覚ＧＰＣＲをコードする単一オープンリーディングフレームを含んでいるが、しかし特定の実施形態では、嗅覚ＧＰＣＲを発現させるための宿主細胞が真核細胞、例えばヒト細胞などの哺乳動物細胞である可能性があるので、オープンリーディングフレームはイントロンによって中断されることがある。本発現カセットは、典型的には本核酸に加えて、ＲＮＡ安定性、翻訳効率などを指令することのできる３’および５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含有していてよい転写単位の一部である。発現カセットは、さらにまた本核酸に加えて転写ターミネーターを含有する核酸の一部であってもよい。
【００６２】
本発現カセットは、嗅覚ＧＰＣＲを融合タンパク質として発現させることのできる核酸配列を含んでいてよい。特定の実施形態では、嗅覚ＧＰＣＲ融合タンパク質はそのＮ末端で、ロドプシンシグナルペプチドおよび／またはヘマグルチニンエピトープタグを含んでいてよい。特定の実施形態では、嗅覚ＧＰＣＲ融合タンパク質はアミノ酸配列ＭＮＧＴＥＧＰＮＦＹＶＰＦＳＮＫＴＧＶＶＹＰＹＤＶＰＤＹＡＫＬを有するＮ末端を含んでいてよいが、このときＭＮＧＴＥＧＰＮＦＹＶＰＦＳＮＫＴＧＶＶはロドプシンシグナルペプチドであり、ＹＰＹＤＶＰＤＹＡＫＬはヘマグルチニンエピトープタグである。融合タンパク質としての嗅覚ＧＰＣＲの発現を可能にする発現カセットを構築することは当業者の技術の範囲内に明確に含まれる（例えば、Ｋｒａｕｔｗｕｒｓｔ ｅｔ ａｌ， Ｃｅｌｌ
９５：９１７−９２６， １９９８を参照されたい）。
【００６３】
真核細胞プロモーター（すなわち、真核細胞中で機能するプロモーター）は、ウイルスプロモーターおよび真核細胞遺伝子由来プロモーターを含む、大グリア細胞中で機能性である任意のプロモーターであってよい。代表的な真核細胞プロモーターには、次の：マウスメタロチオネインＩ遺伝子配列のプロモーター（Ｈａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎ． １：２７３−２８８， １９８２）；ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ， Ｃｅｌｌ ３１：３５５−３６５， １９８２）；ＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ （Ｌｏｎｄｏｎ） ２９０：３０４−３１０， １９８１）；酵母ｇａｌｌ遺伝子配列プロモーター（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ． （ＵＳＡ） ７９：６９７１−６９７５， １９８２；Ｓｉｌｖｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （ＵＳＡ）８１：５９５１−５９ＳＳ， １９８４）、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ−１プロモーター、エクジソン応答性プロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーターなどが含まれるが、それらに限定されない。ウイルスプロモーターは、それらは一般に特別に強力なプロモーターであるので、特に関心対象となることがある。特定の実施形態では、ウイルスプロモーターであるプロモーターが使用される。本発明において使用するためのプロモーターは、それらがその中に導入されている大グリア細胞（および／または動物）中で機能性であるように選択される。特定の実施形態では、プロモーターはＣＭＶプロモーターである。
【００６４】
特定の実施形態では、本ベクターはさらにまた選択可能なマーカーの発現も提供できる。適切なベクターおよび選択可能なマーカーは当技術分野においてよく知られており、Ａｕｓｕｂｅｌ， ｅｔ ａｌ （Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ３ｒｄ ｅｄ．， Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， １９９５）およびＳａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ， （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｔｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， （２００１） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．）の中で考察されている。多種多様な遺伝子が選択可能なマーカーとして使用されてきており、選択可能なマーカーとして本ベクター内で使用される特定遺伝子は主として便宜上選択されている。既知の選択可能なマーカー遺伝子には：チミジンキナーゼ遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＣＡＤ、アデノシンデアミナーゼ遺伝子、アスパラギンシンテターゼ遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、例えばｔｅｔｒ、ａｍｐｒ、Ｃｍｒまたはｃａｔ、ｋａｎｒもしくはｎｅｏｒ（アミノ配糖体ホスホトランスフェラーゼ遺伝子）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子などが含まれる。
【００６５】
上述したように、嗅覚ＧＰＣＲは、親和性ドメインおよび／またはレポータードメインを含有する融合タンパク質であってよい。例えばＧＰＣＲのＣ末端もしくはＮ末端で、レポーターもしくはタグとＧＰＣＲとの間の融合体を作製するための方法は、当業者の技術の範囲内に明確に含まれているので（例、ＭｃＬｅａｎ ｅｔ ａｌ， Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍａ． Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １９９９ ５６：１１８２−９１；Ｒａｍｓａｙ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ， ２００１， ３１５−３２３）、これ以上は説明しない。そのような融合タンパク質が、Ｎ末端メチオニン残基が欠失しているかもしくは代替アミノ酸と置換されているＧＰＣＲとインフレームで融合された異種Ｎ末端ドメイン（例、エピトープタグ）を含有していてよいことは明示的に企図されている。目的のポリペプチドは最初に天然ポリペプチドから作製して、次に上述した適切なレポーター／タグへ作動可能に連結させることができることは理解されている。
【００６６】
本核酸は、さらにまた通例は嗅覚ＧＰＣＲをコードする核酸の構築を促進するために、制限部位、多重クローニング部位、プライマー結合部位、ライゲーション可能な末端、組換え部位なども含有していてよい。
【００６７】
嗅覚ＧＰＣＲは目的のポリペプチドのライブラリーのメンバーであってよいので、そのような目的のポリペプチドをコードする核酸は、類似サイズの嗅覚ＧＰＣＲをコードする核酸のライブラリーであってもよい。
【００６８】
（宿主細胞）
本明細書に記載した方法は、一般に培養大グリア細胞（すなわち、インビトロで培養された初代もしくは不死大グリア細胞）中で嗅覚ＧＰＣＲを産生する工程を含んでいる。「大グリア細胞」は、シュヴァン細胞、希突起膠細胞および星状細胞ならびにそれらの誘導体を含む、様々なニューロン関連細胞タイプの任意の細胞を意味する。多数の実施形態では、適切な宿主細胞は、神経軸索の鞘を形成する物質であるミエリンを産生する「ミエリン産生」細胞であってよい。ミエリン産生大グリア細胞には、シュヴァン細胞、希突起膠細胞、ならびにミエリンを産生する所定タイプの星状細胞（例、嗅神経鞘細胞（ｏｌｆａｃｔｏｒｙ ｓｈｅａｔｈｉｎｇ ｃｅｌｌ））が含まれる。ミエリン産生細胞は、通常は、それらがミエリンの構成要素であるガラクトセレブロシド、ｇａｌＣを合成することによって同定できる。
【００６９】
用語「大グリア細胞」には、さらにまた癌性大グリア細胞、例えば神経鞘腫、神経線維腫、星状細胞腫細胞、および希突起膠細胞腫；不死性大グリア細胞、例えばＨＰＶ Ｅ６−Ｅ７、Ｔ抗原などの適切な腫瘍遺伝子の導入によって不死化された細胞など；大グリア細胞が相違する（非大グリア細胞）もしくは同様の（大グリア細胞）タイプの細胞と融合される細胞融合によって産生されたハイブリッド細胞；ならびに例えば外因性核酸を含有している細胞のような組換え大グリア細胞、または例えばミエリンの合成のために必要とされる遺伝子もしくはミエリンの合成を阻害する遺伝子などの内因性遺伝子内での「ノックアウト」を含む大グリア細胞の改変バージョンが含まれる。大グリア細胞は、通例は齧歯類（例、マウス）もしくはヒトなどの哺乳動物種由来である。代表的な非限定的細胞系には、ＲＮ２およびＥＪ（Ｃｏｕｌｔｅｒ−Ｍａｃｋｉｅ， Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １：４７７−４８７， １９８４）、ＲＮ２２（Ｋｒｅｉｄｅｒ， Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３９７：２３８−２４４， １９８６）、ならびにＨＯＧおよびＭＯ３．１３（Ｂｕｎｔｉｎｘ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｃｙｔｏｌｏｇｙ ３２：２５−３８， ２００３）が含まれる。嗅覚ＧＰＣＲ以外についての大グリア細胞組換え体は、用語「大グリア細胞」に含まれることが明示的に企図されている。
【００７０】
したがって、大グリア細胞を培養する方法は当技術分野においてよく知られているので（例えば、Ｍｏｓａｈｅｂｉ Ｇｌｉａ， ３４：８−１７， ２００１；Ｓｈｅｎ， Ｍｉｃｒｏｓｕｒｇｅｒｙ １９：３５６−６３， １９９９；Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ （Ｂｅｒｌ）， ７８：３１７−２４， １９８９；Ｂａｒｎｅｔｔ， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １５５：３３７−３５０， １９９３；およびＨｕｎｇ ｅｔ ａｌ， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２０：４７５−４８２， ２００２を参照されたい）、不死化ＨＥＩ１９３細胞などを含む嗅覚ＧＰＣＲを産生するために多種多様な適切な宿主細胞を利用できる。
【００７１】
詳細には、シュヴァン細胞は次の方法を用いて培養することができる：Ｈｕｎｇ， （Ｉｎｔ． Ｊ． Ｏｎｃｏｌ． ２０：４７５−８２， ２００２）；Ｈｕｎｇ， （Ｉｎｔ． Ｊ． Ｏｎｃｏｌ． １９９９ １４：４０９−１５）；Ｗｏｏｄ， （Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． １１５：３６１−７５， １９７６）；Ｗｏｏｄ， （Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ６０５：１−１４， １９９０）；およびＢｒｏｃｋｅｓ， （Ｊ． Ｅｘｐ． Ｂｉｏｌ． Ｄｅｃ；９５：２１５−３０， １９８１）。
【００７２】
追加の細胞系は当業者には明白になるであろう、そしてアメリカンタイプカルチャーコレクション（１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、バージニア州マナッサス２０１１０−２２０９）から入手できる。
【００７３】
（方法）
一般に本方法によると、嗅覚ＧＰＣＲ発現カセットがインビトロで大グリア細胞中に導入され、その細胞は嗅覚ＧＰＣＲを発現させるために適する条件に曝され、そしてＧＰＣＲは細胞内で発現して、細胞表面へ輸送される。
【００７４】
したがって、大多数の実施形態では、発現カセットは、ウイルス感染、トランスフェクション、接合、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈降、直接マイクロインジェクションなどを含む様々な方法を用いて宿主細胞中へ導入されてよい。方法の選択は、一般に形質転換される細胞のタイプおよび形質転換が発生させられる状況（例、インビトロなど）に依存する。これらの方法についての一般的考察は、Ａｕｓｕｂｅｌ， ｅｔ ａｌ， Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ３ｒｄ ｅｄ．， Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， １９９５の中に見いだすことができる。
【００７５】
細胞中へ嗅覚ＧＰＣＲの発現カセットを導入した後、細胞は、典型的にはポリペプチド発現を生じさせるためにインキュベートされる。これを実施するために、細胞は１２〜２４時間、２４〜４８時間、または４８〜９６時間以上にわたり適切な培地中でインキュベートすることができる。ポリペプチドの一過性発現は、この方法で実施されてよい。これは明示的に企図されているが、しかしポリペプチドの発現はまたは安定性であってもよい。安定性トランスフェクションでは、発現カセットは選択可能なマーカー遺伝子を含有しており、ポリペプチドを発現する安定性細胞系の樹立は選択可能なマーカー遺伝子のための選択を含んでいる。２つの発現カセットが１つの細胞中に導入された場合は、２つの発現カセットは通常は相違する２つの選択可能なマーカー遺伝子（例、ネオマイシン耐性遺伝子およびハイグロマイシン耐性遺伝子）を含有している。一過性および安定性トランスフェクションの方法は、当業者にはよく公知である。
【００７６】
嗅覚ＧＰＣＲは大グリア細胞中で産生され、そして通常は、ＧＰＣＲが原形質膜中に存在するように細胞表面へ輸送される。
【００７７】
（組成物）
また別の局面では、本発明は生物活性嗅覚ＧＰＣＲを産生する大グリア細胞を提供する。そのような細胞は、通常は嗅覚ＧＰＣＲをコードする組換え核酸を含有しており、そして通常はその細胞（すなわち、組換え核酸の不在下の大グリア細胞）中で産生しない嗅覚ＧＰＣＲを産生することができる。
【００７８】
上述したように、本発明は、通常はＧＰＣＲに特徴的な方法で細胞の原形質膜にわたる大グリア細胞の表面で存在する（すなわち、検出可能に存在する）嗅覚ＧＰＣＲを含有する大グリア細胞を提供する。したがって、本細胞は、それらがリガンドに結合できる、そして存在する場合は適切なＧタンパク質を介してシグナルを伝達することができる点で「活性」嗅覚ＧＰＣＲを含有している。そこで本細胞は、例えば以下で詳細に説明するスクリーニングアッセイなどの活性アッセイにおいて利用される。
【００７９】
本細胞は、通常はその中に同一発現カセットが産生させられている例えばＮＩＨ−３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞などのような非大グリア細胞のようなコントロール細胞のレベルより有意に高いレベルで嗅覚ＧＰＣＲを産生する。大多数の実施形態では、本細胞は、モルベースで、コントロール細胞より少なくとも５×（「５倍」）、少なくとも１０×、少なくとも５０×、少なくとも１００×、通常は少なくとも１，０００×以上までのより多くの嗅覚ＧＰＣＲを産生する。特定の実施形態では、本細胞は、モルベースで、コントロール細胞より少なくとも５×（「５倍」）、少なくとも１０×、少なくとも５０×、少なくとも１００×、通常は少なくとも１，０００×以上までのより多くの嗅覚ＧＰＣＲを細胞表面で産生する（例えば、免疫細胞化学的方法またはフローサイトメトリーによって決定した場合に）。本細胞が液体培地中で増殖させられる場合は、それらは通常、例えば１０μｇ／Ｌ超、１００μｇ／Ｌ超、１ｍｇ／Ｌ超、１０ｍｇ／Ｌ超もしくは約５０ｍｇ／Ｌ以上の有意な量で嗅覚ＧＰＣＲを産生する。特に、本細胞が液体培地中で増殖させられる場合は、それらは通常、例えば１０μｇ／Ｌ超、１００μｇ／Ｌ超、１ｍｇ／Ｌ超、１０ｍｇ／Ｌ超もしくは約５０ｍｇ／Ｌ以上の有意な量で細胞表面嗅覚ＧＰＣＲを産生する。
【００８０】
多数の様々な嗅覚ＧＰＣＲがあるので、本発明は様々な嗅覚ＧＰＣＲをコードする対応する複数の組換え核酸を含有する複数の大グリア細胞（すなわち、大グリア細胞のライブラリー）も提供する。これらの実施形態では、複数のうちの各大グリア細胞は、通常は単一嗅覚ＧＰＣＲのための組換え核酸を含有しており、そして各細胞は相違する核酸を含有する。したがって、本発明は大グリア細胞のライブラリーを提供するが、それらの細胞は２以上、５以上、約１０以上、約２０以上、約５０以上、約１００以上、約２００以上、約３００以上、約５００以上、約１，０００以上の相違する嗅覚ＧＰＣＲをコードする組換え核酸を含有している。嗅覚ＧＰＣＲは、正体が既知かもしくは正体が未知の嗅覚ＧＰＣＲ、またはそれらの混合物であってよい。嗅覚ＧＰＣＲは、単一種の動物由来であってよい、または２種、約５種まで、約１０種まで、約５０種まで、約１００種まで、もしくは約１，０００種までの動物由来のものであってよい。特定の実施形態では、嗅覚ＧＰＣＲはヒトのものである。
【００８１】
（キット）
本発明によって、さらにまた上述した本方法を実行するためのキットも提供される。本キットは、大グリア細胞、嗅覚ＧＰＣＲをコードする核酸および嗅覚ＧＰＣＲを含有する大グリア細胞のうちの１つ以上を少なくとも含んでいる。本キットの核酸は、他のプラスミド内へのライゲーションを促進するために制限部位、複数のクローニング部位、プライマー部位なども有してもよい。キットのその他のオプション構成要素には、本アッセイを実行するための、培養培地、ＧＰＣＲ活性を試験するための構成要素、およびＧタンパク質をコードする核酸などが含まれる。本キットの様々な構成要素は個別容器中に存在していてよい、または必要に応じて特定の適合する構成要素が単一容器中で事前に合わされていてよい。
【００８２】
上述の構成要素に加えて、本キットは、典型的には例えば嗅覚ＧＰＣＲを産生する方法などの本方法を実行するためにキットの構成要素を使用するための指示書をさらに含んでいる。本方法を実行するための指示書は，一般には適切な記録媒体上に記録されている。例えば、指示書は紙もしくはプラスチックなどの基材上に印刷されてよい。したがって、指示書は、キットもしくはその構成要素の容器のラベル表示（すなわち、パッケージングもしくはサブパッケージングと結び付けて）などにおいて包装添付文書としてキット内に存在してよい。他の実施形態では、指示書は例えばＣＤ−ＲＯＭ、ディスクなどのような適切なコンピュータ可読記憶媒体上に存在する電子記憶データファイルとして存在する。また別の実施形態では、キット内に実際的な指示書は存在しないが、例えばインターネットを介して遠隔起源から指示書を入手するための手段が提供される。この実施形態の例は、指示書を見ることができる、および／またはそれから指示書をダウンロードすることのできるウェブのアドレスを含んでいるキットである。指示書と同様に、指示書を入手するためのこの手段は適切な基材上に記録されている。
【００８３】
（嗅覚ＧＰＣＲ活性の調節因子を同定するための方法）
本発明は、嗅覚ＧＰＣＲ調節因子（すなわち、目的の嗅覚ＧＰＣＲの活性を増加もしくは減少させる化合物）をスクリーニングする方法を提供する。特定の実施形態では、嗅覚ＧＰＣＲ調節因子は、アゴニスト、部分アゴニスト、インバースアゴニスト、およびアンタゴニストからなる群から選択される。一般に、本方法は、上述した方法によって生物活性嗅覚ＧＰＣＲを産生する大グリア細胞（本明細書では「本大グリア細胞」と称する）を提供するために大グリア細胞中で嗅覚ＧＰＣＲを産生する工程と、該細胞を候補因子と接触させる工程と、嗅覚ＧＰＣＲの活性へ及ぼす候補因子の作用を評価する工程と、を含んでいる。
【００８４】
他の実施形態では、嗅覚ＧＰＣＲの調節因子（例、そのＧＰＣＲに対する天然もしくは合成リガンド）を、そのＧＰＣＲを産生する大グリア細胞と接触させることができ、そしてその調節因子が嗅覚ＧＰＣＲの活性に及ぼす作用を評価することができる。さらにまた、２種の嗅覚ＧＰＣＲ調節因子、例えば嗅覚ＧＰＣＲの活性化因子（例、そのＧＰＣＲに対するリガンド）およびその活性化因子の調節活性を遮断する物質を用いて実施されるアッセイも予期されている。
【００８５】
当技術分野において公知のように、本アッセイは、例えば３５Ｓ ＧＴＰγＳを用いる膜結合アッセイ、アデニリルシクラーゼアッセイ（例、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ社製のＦＬＡＳＨ ＰＬＡＴＥＴＭアデニリルシクラーゼキット；カタログ番号ＳＭＰ００４Ａを用いて）、細胞ベースｃＡＭＰアッセイ、レポーターベースアッセイ、ＡＰ１レポーターアッセイ、ＳＲＦ−ＬＵＣレポーターアッセイ、細胞内ＩＰ３蓄積アッセイ、細胞内カルシウム濃度を測定するための蛍光測定イメージングプレートリーダー（ＦＬＩＰＲ）アッセイなどの様々な方法を用いて実施することができる。
【００８６】
調節因子が嗅覚ＧＰＣＲ活性を増加させる実施形態では、嗅覚ＧＰＣＲの活性は、調節因子の存在下では、その因子の不在下における適切なコントロールに比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約５０％、少なくとも約８０％、少なくとも約１００％、少なくとも約５００％、または少なくとも約１０倍以上まで上昇する。適切なコントロールは、ＧＰＣＲに対する天然リガンドの存在下もしくは不在下にあってよい。
【００８７】
調節因子が嗅覚ＧＰＣＲ活性を減少させる実施形態では、嗅覚ＧＰＣＲの活性は、調節因子の存在下では、その因子の不在下における適切なコントロールに比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％以上まで減少する。適切なコントロールは、ＧＰＣＲに対する天然リガンドの存在下もしくは不在下にあってよい。
【００８８】
特定の実施形態では、これらの方法は、試験化合物、例えば候補因子の存在下もしくは不在下でＧＰＣＲ活性を測定する工程もまた含んでいる。これらのアッセイは、単離した本大グリア細胞（例、培養細胞）、本大グリア細胞から単離した膜、本大グリア細胞の抽出物を該ＧＰＣＲの活性を調節するために有効な量のＧＰＣＲ調節因子と接触させる工程を含んでいることがある。
【００８９】
したがって、本発明は、リガンド、例えばそのＧＰＣＲに対する天然リガンドの存在下もしくは不在下で嗅覚ＧＰＣＲの活性を減少させるための嗅覚ＧＰＣＲ活性の阻害剤、およびＧＰＣＲ活性の誘導因子を提供するが、このときＧＰＣＲはそのＧＰＣＲの天然リガンドである、もしくは天然リガンドではない化合物によって誘導される。
【００９０】
特定の実施形態では、ＧＰＣＲ活性はレポーターシグナルを評価することによって測定できる。これらの実施形態では、アッセイはハイスループットアッセイのために適切なフォーマット、例えば９６もしくは３８４ウェルフォーマットで実施することができ、そして適切なロボット（例、ピペッティングロボット）および器具類（レポーター活性を決定するための９６および３８４ウェルフォーマットの照度計もしくは蛍光リーダー）を使用できる。具体的に例示するためで限定するためではなく、レポーター活性を決定することは、Ｗａｌｌａｃ １４５０ Ｍｉｃｒｏｂｅｔａカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製）またはＣＣＤカメラを使用する照度計を使用できる。
【００９１】
関連実施形態では、本アッセイは、候補因子の嗅覚ＧＰＣＲへの結合が評価される結合アッセイであってよい。これらの実施形態では、候補因子は通常最初に標識され、本大グリア細胞と接触させられ、そして候補因子の大グリア細胞への結合が評価される。
【００９２】
（候補因子）
多種多様な試験化合物は、上記の方法によってスクリーニングすることができる。試験化合物は極めて多数の化学物質のクラスを含んでいるが、典型的にはそれらは有機分子、好ましくは小さい有機化合物である（すなわち、５０ダルトンより大きく、かつ約２，５００ダルトン未満（例、１００〜１，０００Ｄａ、通常は約５００Ｄａ未満）の分子量を有する化合物）。試験化合物は、タンパク質との構造的相互作用、詳細には水素結合のために必要な官能基を含んでおり、そして典型的には少なくとも１つのアミン、カルボニル、ヒドロキシルもしくはカルボキシル基、好ましくは化学官能基のうちの少なくとも２つを含んでいる。試験化合物は、しばしば環状炭素もしくは複素環の構造および／または上述した官能基の１つ以上で置換された芳香環もしくは多環芳香環構造を含んでいる。代表的および非限定的試験化合物は、脂肪族系酸、アルコール、ケトン、およびエステル；芳香環、脂環、多環および複素環の構造を備える化学物質；およびこれらのタイプ各々の無数の置換化学物質、ならびにそれらの組み合わせを含んでいる。試験化合物は、さらにまたペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造的アナログもしくはそれらの組み合わせを含む生体分子間でも見いだされる。さらにまた別の試験化合物は、ＧＰＣＲの天然リガンドの改変体を含んでいる。
【００９３】
試験化合物は、合成もしくは天然化合物のライブラリーを含む極めて広範囲の起源から入手できる。例えば、ランダム化オリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現を含む、広範囲の有機化合物および生体分子のランダム合成および指向性合成のために極めて多数の手段を利用することができる。あるいは、細菌、真菌、植物および動物抽出物の形状にある天然化合物のライブラリーを利用できる、または容易に産生できる。ライブラリーは、ニオイと結び付けられた天然または合成生成化合物を優先的に含んでいる可能性がある。さらに、天然もしくは合成生成ライブラリーおよび化合物は、従来型の化学的、物理的および生化学的手段を通して容易に改変され、コンビナトリアルライブラリーを生成するために使用できる。既知の薬理学的物質は、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などのような構造的アナログを産生するための指向性もしくはランダム化学修飾に曝すことができる。
【００９４】
関心対象であるのは、ポリペプチド、例えばタンパク質様物質である試験化合物である。目的の特定タイプのポリペプチド試験化合物は、ＧＰＣＲに対する抗体、またはそれらのＧＰＣＲ結合フラグメントである。この抗体はモノクローナルもしくはポリクローナルであってよく、当技術分野において公知の方法によって産生することができる。また別の試験化合物は、既知の天然リガンドのあるＧＰＣＲについては、例えば少なくとも１つのアミノ酸の置換、欠失もしくは付加によって変化させられているかまたは化学修飾された天然リガンドである、ＧＣＰＲの天然リガンドの改変体を含んでいる。特定の実施形態では、試験化合物はＧＰＣＲのリガンドであるとは知られていない内因性ポリペプチドを含んでいる。
【００９５】
試験化合物の上記の特性解析は、例示するためで限定的ではないことが企図されている。
【００９６】
（嗅覚ＧＰＣＲのリガンドとしての候補因子を同定する方法）
嗅覚ＧＰＣＲのリガンドは、候補因子と嗅覚ＧＰＣＲとを接触させる工程と、候補因子が嗅覚ＧＰＣＲへ結合するかどうかを決定する工程とによって同定できるが、このとき前記結合は候補因子が嗅覚ＧＰＣＲのリガンドであるという指標となる。特定の実施形態では、候補因子は標識することができる。特定の実施形態では、候補因子は放射標識することができる。
【００９７】
本候補因子内に組み込むことができる適切な放射性核種は、２Ｈ（ジュウテリウム）、３Ｈ（トリチウム）、１１Ｃ、１３Ｃ、１４Ｃ、１３Ｎ、１５Ｎ、１５Ｏ、１７Ｏ、１８Ｏ、１８Ｆ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、８２Ｂｒ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉおよび１３１Ｉを含むがそれらに限定されない。３Ｈ、１４Ｃ、８２Ｂｒ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓの組込みは、概して最も有用な可能性がある。
【００９８】
放射性同位体を有機化合物内に組み込むための合成方法は、本候補因子に適用することができ、当技術分野において周知である。これらの合成方法、例えば標的分子内への活性レベルのトリチウムの組込みは下記のとおりである：
Ａ． トリチウムガスを用いた触媒還元 − この手順は、通常は高比活性生成物を産生し、ハロゲン化もしくは未飽和前駆物質を必要とする。
Ｂ． 水素化ホウ素ナトリウム［３Ｈ］を用いた還元 − この手順は余り費用がかからず、アルデヒド、ケトン、ラクトン、エステルなどの還元性官能基を含有する前駆物質を必要とする。
Ｃ． 水素化アルミニウムリチウム［３Ｈ］を用いた還元 − この手順は、ほぼ理論的比活性で生成物を提供する。これもまた、アルデヒド、ケトン、ラクトン、エステルなどの還元性官能基を含有する前駆物質を必要とする。
Ｄ． トリチウムガス曝露による標識化 − この手順は、適切な触媒の存在下で置換可能な陽子を含有する前駆物質をトリチウムガスへ曝露させることを含んでいる。
Ｅ． ヨウ化メチル［３Ｈ］を用いたＮ−メチル化 − この手順は、高比活性ヨウ化メチル（３Ｈ）を用いて適切な前駆物質を処理することによって、通常はＯ−メチルもしくはＮ−メチル（３Ｈ）生成物を調製するために使用される。この方法は、一般に例えば約７０〜９０Ｃｉ／ｍｍｏｌなどのより高い比活性を可能にする。
【００９９】
１２５Ｉの活性レベルを標的分子中へ組み込むための合成方法は下記を含んでいる：
Ａ． サンドマイヤー（Ｓａｎｄｍｅｙｅｒ）および類似反応 − この手順はアリールもしくはヘテロアリールアミンをテトラフルオロホウ酸塩などのジアゾニウム塩へ、そして引き続きＮａ１２５Ｉを用いて１２５Ｉ標識化合物へ転換させる。代表的な手順は、Ｚｈｕ，Ｄ．−Ｇ． ａｎｄ ｃｏ−ｗｏｒｋｅｒｓ、Ｊ． Ｏｒｇ Ｃｈｅｍ．２００２，６７，９４３−９４８によって報告された。
Ｂ． フェノールのオルト１２５ヨウ素化 − この手順はＣｏｌｌｉｅｒ， Ｔ． Ｌ． ａｎｄ ｃｏ−ｗｏｒｋｅｒｓ、Ｊ． Ｌａｂｅｌｅｄ Ｃｏｍｐｄ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．１９９９，４２，Ｓ２６４−Ｓ２６６．によって報告されたように、フェノールのオルト位置での１２５Ｉの組込みを可能にする。
Ｃ． １２５Ｉを用いたアリールおよびヘテロアリールブロミドの置換 − この方法は、一般に２段階プロセスである。第１工程は、例えばＰｄ触媒反応［すなわち、Ｐｄ（Ｐｈ３Ｐ）４］を用いて、またはトリ−アルキルスズハライドもしくはヘキサアルキルジスズ［例、（ＣＨ３）３ＳｎＳｎ（ＣＨ３）３］の存在下でアリールもしくはヘテロアリールリチウムを通しての、アリールもしくはヘテロアリールブロミドから対応するトリーアルキルスズ中間物への変換である。代表的な手順は、Ｂａｓ， Ｍ．−Ｄ． ａｎｄ ｃｏ−ｗｏｒｋｅｒｓ、Ｊ． Ｌａｂｅｌｅｄ Ｃｏｍｐｄ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．２００１，４４，Ｓ２８０−Ｓ２８２によって報告された。
【０１００】
嗅覚ＧＰＣＲのリガンドは、あるいはまた嗅覚ＧＰＣＲの標識した既知のリガンドの存在下で候補因子と嗅覚ＧＰＣＲとを接触させることによって同定できるが、このとき候補因子の存在下での標識した既知のリガンドの結合の減少は候補因子が嗅覚ＧＰＣＲのリガンドであるという指標である。
【０１０１】
（臭気物質ミメティックを同定するための方法）
本発明はさらにまた、臭気物質ミメティックを同定する方法を提供するが、このときミメティックは特定臭気物質と類似の、実質的に同様もしくは同一の機能的特徴を有するが、該臭気物質とは相違する化学構造を有する合成もしくは天然化合物である。言い換えると、本発明は目的の臭気物質と同一の「ニオイがする」が、目的の臭気物質と同一の化学構造を有していない臭気物質ミメティックを同定する方法を提供する。一般に、これらの方法は、上述した方法を用いて１ライブラリーの嗅覚ＧＰＣＲを産生する工程と、目的の臭気物質によって活性化される１セットの嗅覚ＧＰＣＲを同定する工程と、および同一セットの嗅覚ＧＰＣＲを活性化する物質を同定するために該ライブラリーの嗅覚ＧＰＣＲを候補因子と接触させる工程と、を含んでいる。大多数の実施形態では、目的の臭気物質と同一セットの嗅覚ＧＰＣＲを活性化する因子は目的の臭気物質のミメティックである、すなわち目的の臭気物質と類似の臭気を有しているはずである。
【０１０２】
したがって、これらの方法は、上述した方法を用いて通常はライブラリー（例、１００以上、２００以上、３００以上、４００以上、５００以上、６００以上、通常は約１，０００以上まで）の様々な嗅覚ＧＰＣＲを産生する工程と、およびそれらが目的の臭気物質、例えば所望のニオイもしくは味覚を有する既知もしくは未知の化学構造の化合物によって活性化されるかどうかを決定するためにＧＰＣＲを評価する工程と、を含んでいる。多数の実施形態では、目的の臭気物質は１セットの嗅覚ＧＰＣＲを活性化するであろうが、このとき１セットは通常２〜５０、２〜２０または３〜１０種のメンバーを含有する。単一臭気物質によって活性化された嗅覚ＧＰＣＲのセットは「ＧＰＣＲフィンガープリント」を提供するが、このとき単一臭気物質はそれが活性化する嗅覚ＧＰＣＲのセットによって規定される。目的の臭気物質に対するミメティックは、目的の臭気物質と同一もしくはほぼ同一のＧＰＣＲフィンガープリントを有する因子を同定するために候補因子のライブラリーをスクリーニングすることによって同定することができる。
【０１０３】
例えば、臭気物質ミメティックは、目的の臭気物質のフィンガープリントに類似する、例えば該ミメティックは該臭気物質によって活性化された場合のＧＰＣＲまたはＧＰＣＲ活性の約６０％、約７５％、約８０％、約９０％、約９５％のＧＰＣＲを活性化する、活性化ＧＰＣＲの「フィンガープリント」を有すると同定できる。
【０１０４】
したがって、目的の臭気物質のミメティックを同定できる。
【０１０５】
（バイオセンシング法）
本発明は、バイオセンサーをさらに提供するが、このときバイオセンサーは、典型的には複数の相違する嗅覚ＧＰＣＲを産生する複数の大グリア細胞である。多数の実施形態では、細胞はアドレス指定可能なフォーマットで配列されるが、このときそのアレイの各アドレスは単一組換え嗅覚ＧＰＣＲを産生する大グリア細胞を含有している。典型的には、前記複数は２以上、５以上、約１０以上、約２０以上、約５０以上、約１００以上、約２００以上、約３００以上、約５００以上、約１，０００以上、または約１０，０００以上まででさえあってよい。このためバイオセンサーは、約５、約１０、約２０、約３０以上、約５０以上、約１００以上、約２００以上、通常は約５００以上まで、通常は約１，０００以上までの組換え嗅覚ＧＰＣＲを含有していてよい。嗅覚ＧＰＣＲは、正体が既知の、もしくは正体が知られていない嗅覚ＧＰＣＲ、またはそれらの混合物であってよい。嗅覚ＧＰＣＲは、単一種の動物由来であってよい、または２種、約５種まで、約１０種まで、約５０種まで、約１００種まで、もしくは約１，０００種までの動物由来であってよい。特定の実施形態では、嗅覚ＧＰＣＲはヒトのものである。
【０１０６】
本明細書に記載した方法は、単一組換え嗅覚ＧＰＣＲを産生する前記大グリア細胞を「親和性基材」へ結合させることを含んでいる。特定の実施形態では、前記親和性基材はアドレス指定可能である。特定の実施形態では、前記アドレス指定可能な親和性基材は空間的にアドレス指定可能である。親和性基材は固体、半固体、もしくは不溶性支持体を含有しており、前記組換え大グリア細胞の結合のために適切な任意の材料から製造され、使用された検出方法を妨害しない。当業者には理解されるように、可能な親和性基材の数は極めて多い。可能な基材には、ガラスまたは改変されたガラスかまたは機能化ガラス、プラスチック（アクリル、ポリスチレンおよびスチレンと他の物質とのコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、Ｔｅｆｌｏｎなどを含む）、多糖類、ナイロンもしくはニトロセルロース、樹脂、ケイ素またはシリコンもしくは改変シリコンを含むケイ素に基づく物質、炭素、金属、無機ガラス、プラスチック、セラミックおよび多種多様な他のポリマーが含まれるが、それらに限定されない。好ましい実施形態では、基材は光学的検出を許容するが、それら自体は感知できるほど蛍光を発することも発光することもない。さらに、当技術分野において公知のように、基材はデキストラン、アクリルアミド、ゼラチン、アガロース、ウシおよびその他の哺乳動物血清アルブミンを含むタンパク質などの生体適合性物質などのポリマーを含む任意の数の物質で被覆され得る。
【０１０７】
「空間的にアドレス指定可能な」親和性基材は、各領域が特定の事前に決定された場所（「アドレス」）にあるように、複数の別個の領域（例、複数の目的のポリペプチド結合領域）を有する。マルチウェルマイクロタイタープレートはアドレス指定可能であり（各ウェルが１つのアドレスを有する）、１アレイのキャピラリーカラムはアドレス指定可能であり、固体支持体（例、ナイロンもしくはニトロセルロース膜）上に配置された１アレイのサンプルはアドレス指定可能である。本明細書に記載の方法に使用するための親和性基材は、典型的には少なくとも４以上、少なくとも約１２、少なくとも約２４、少なくとも約４８、少なくとも約９６もしくは少なくとも約３８４のアドレス指定可能な領域を有する。特定の実施形態では、親和性基材は、ハイスループットアッセイのために適切なアドレス指定可能なフォーマットに、例えば２４、４８、９６もしくは３８４ウェルフォーマットにある。
【０１０８】
そのようなマルチウェルフォーマットは、ロボット（例、ピペッティングロボット）、およびその他の器具類（レポーター活性の決定のための９６もしくは３８４ウェルフォーマットの照度計（ｉｌｌｕｍｉｎａｔｏｒ）もしくは蛍光リーダー）による使用のために適切である。具体的に例示するためであって限定するためではなく、レポーター活性はＣＣＤカメラに基づく照度計を用いて測定できる。
【０１０９】
使用時には、そのようなバイオセンサーは通常はサンプルと接触させられ、そして組換え嗅覚ＧＰＣＲの各々の活性化が評価される。目的の臭気物質の存在は、事前に決定された嗅覚ＧＰＣＲのサブセットの活性化によって検出されるが、このとき事前に決定された嗅覚ＧＰＣＲのサブセットは、その臭気物質の以前に決定された「ＧＰＣＲフィンガープリント」に対応する。したがって、目的の臭気物質に対する事前に決定された嗅覚ＧＰＣＲのサブセットが該サンプルによって活性化された場合は、目的の臭気物質が該サンプル内に存在する。
【０１１０】
また別の使用時には、そのようなバイオセンサーは通常は臭気物質と接触させられ、そして組換えＧＰＣＲの各々の活性化が評価される。その臭気物質に対する「フィンガープリント」の同定は、活性化された嗅覚ＧＰＣＲのサブセットに基づいて指定される。前記の別の使用の変形では、前記接触させる工程は、バイオセンサーの嗅覚ＧＰＣＲに対する１つ以上のアゴニストの存在下で、臭気物質へ「フィンガープリント」を指定するまた別の手段を表す、前記１つ以上のアゴニストの存在下で該臭気物質によって活性化されたＧＰＣＲのサブセットを用いて実施されてよい。アゴニスト、インバースアゴニストもしくはアンタゴニストの存在下で１つ以上の嗅覚ＧＰＣＲの活性を臭気物質の「フィンガープリント」内へ組み込めることが企図されている。
【０１１１】
特定の実施形態では、ＧＰＣＲ活性化は、ＧＰＣＲ活性化の発光レポーターを用いて検出することができる。例えば、以下で説明するようなルシフェラーゼ／ＧＦＰに基づくアッセイ、またはその変形などの任意の発光レポーター（例、蛍光レポーターなど）アッセイをこれらのアッセイのために使用できる。
【０１１２】
特定の実施形態では、臭気物質への１つ以上の嗅覚ＧＰＣＲの活性化は、例えば例示するためであり限定するためではなく事前に規定された最高応答の０〜１０％、１１〜２５％、２６〜５０％、５１〜７５％、もしくは７６〜１００％のなどの特定レベルであるとスコア付けすることができる。臭気物質の「フィンガープリント」は、少なくとも一部には１つ以上の嗅覚ＧＰＣＲの活性化のレベルによって決定され得ることが企図されている。
【０１１３】
したがって、本発明は、嗅覚ＧＰＣＲを含有するアドレス指定可能な大グリア細胞のアレイを含有する発光バイオセンサーを提供するが、このとき目的の臭気物質は該バイオセンサーからの特定光パターンの発光によって検出することができる。
【０１１４】
特定の実施形態では、試験すべきサンプルは環境上の試験サンプル、例えばガス（呼吸可能な大気または起源もしくは組成が知られていないガスのサンプルなど）、液体（水または起源もしくは組成が知られていない液体のサンプルなど）、または任意の固体のサンプルである。
【０１１５】
上述したバイオセンサー法は、例えば、例えばニオイについての知識が犯罪の被疑者の逮捕を導くことのある犯罪現場；特定の化学物質、例えば生物学／化学戦物質が検出される可能性がある紛争地帯（例、戦場）；例えば特定の汚染物質または望ましい、もしくは望ましくないニオイを検出できる食品材料；および望ましい、もしくは望ましくない嗅覚感覚のどちらかへの特定の嗅覚ＧＰＣＲもしくは特定サブセットの嗅覚ＧＰＣＲの合理的指定において；および有害化学物質を監視することが望ましい研究所において；および一般に、目的の臭気物質を監視もしくは検出することが望ましい任意の状況において特に利用される。
【０１１６】
目的の臭気物質は、一般にヒト嗅覚系の嗅覚ＧＰＣＲによって検出できる任意の化合物、例えばニオイを嗅ぐことによって検出できる任意の化合物を含んでいる。臭気物質は、精製化合物の場合がある、または（例えば、複雑な組成の）未精製化合物の場合がある。そのような臭気物質は、脂肪族系酸、アルコール、ケトン、およびエステル；芳香環、脂環、多環および複素環の構造を備える化学物質；およびこれらのタイプ各々の無数の置換化学物質、ならびにそれらの組み合わせを含むがそれらに限定されない。
【０１１７】
（有用性）
嗅覚ＧＰＣＲを産生する本方法は、特に食品および芳香剤に関連する様々な研究および産業上の用途において利用される。
【０１１８】
多くの用途では、製品、例えば食品もしくは芳香剤を改良する、すなわち必要に応じて、上述した方法を用いて同定された嗅覚ＧＰＣＲ調節因子の添加によって、幾分望ましいものにすることができる。一般に、そのような調節因子は、通常は例えば食品材料または香水などの芳香剤のような製品と、それらの製品の味もしくはニオイを改良するために混合される。多数の実施形態では、調節因子は嗅覚ＧＰＣＲ活性の阻害剤であってよく、このために不愉快な味もしくはニオイを「マスキング」することができる。他の実施形態では、調節因子は特定の嗅覚ＧＰＣＲの活性因子であってよく、そしてそれが添加される物質にとっての新しい香味料もしくは芳香剤を改善もしくは添加するために使用できる。他の実施形態では、調節因子は特定の嗅覚ＧＰＣＲの活性因子であってよく、殺虫剤の有効性を改良するために使用できる。特定の実施形態では、毒物および医薬品などの一部の製品のニオイをそれらが間違って消費されないように望ましくないようにすることが有益である。この場合には、不愉快なニオイを提供する物質は上述した方法によって見いだし、そしてそれらの製品へ添加することができる。
【０１１９】
他の用途では、望ましい臭気物質（例、ある種の珍しい花から入手され、現代の多数の香水のための出発物質として使用される臭気物質）を提供する費用は、上述した方法を用いてその臭気物質のミメティックを同定することによって減少させることができる。そのような実施形態では、これらのミメティックは望ましい臭気物質より実質的に低い価格で製造することができ、そして例えば香水などの製品中に望ましい臭気物質を補給するか、または置換するために使用できる。
【０１２０】
他の用途では、個体によって生成された特定臭気物質の検出は、疾患もしくは障害に関連するので診断的もしくは予後的価値を有する可能性があり、このとき特定臭気物質の上昇もしくは減少は前記疾患もしくは障害と関連付けられている。
【０１２１】
当然ながら、上述した方法を用いて入手された嗅覚ＧＰＣＲ調節因子を様々な個体に投与することができる。一般に、そのような個体は哺乳動物もしくは哺乳類であり、このときこれらの用語は食肉目（例、イヌおよびネコ）、齧歯目（例、マウス、モルモット、およびラット）、および霊長目（例、ヒト、チンパンジー、およびサル）、ならびに例えばウシ、ヒツジ、ブタおよびウマなどの産業上重要な哺乳動物を含む哺乳綱に含まれる生物体を記載するために広範囲に使用されている。非哺乳類動物にもまた上述した方法を用いて入手された嗅覚ＧＰＣＲ調節因子を投与することができることが企図される。代表的および非限定的非哺乳類動物には、鳥類（例、ニワトリ）、爬虫類、魚類、節足動物、および昆虫類（例、カ、アリ、アブラムシ、カブトムシ、ハエ、スズメバチ、ミツバチ、クモ、あるいはヒトもしくは非ヒト動物へ疾患を伝播する、または農作物もしくは観賞用植物に対する損害を引き起こす任意の昆虫）が含まれる。多数の実施形態では、個体はヒトであろう。
【実施例】
【０１２２】
下記の実施例は、当業者に本発明の作製および使用方法についての完全な開示および説明を提供できるように記載するが、本発明者らが発明と見なしている範囲を限定することを企図しておらず、下記の実験が実施された実験のすべてである、またはそれらだけが実施された実験であることを表すことも企図していない。
【０１２３】
本発明はその特定の実施形態を参照しながら説明してきたが、当業者には、本発明の真の精神および範囲から逸脱せずに、様々な変更を加えたり、同等物を置換したりできることが理解されるはずである。さらに、本発明の目的、精神および範囲に、特定の状況、材料、組成物、工程、１つ以上の工程を適合させるために多数の改変を加えることができる。すべてのそのような改変は、本発明の範囲内にあることが企図されている。
【０１２４】
（実施例１：シュヴァン細胞中での嗅覚ＧＰＣＲの発現）
初代ラットシュヴァン細胞の単離：
シュヴァン細胞の調製は以前に記載されたとおりに実施した（例、Ｈｕｎｇ， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｏｎｃｏｌ． ２０：４７５−８２， ２００２；Ｈｕｎｇ， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｏｎｃｏｌ． １９９９ １４：４０９−１５；Ｗｏｏｄ， Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． １１５：３６１−７５， １９７６；Ｗｏｏｄ， Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ６０５：１−１４， １９９０；およびＢｒｏｃｋｅｓ， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｂｉｏｌ． Ｄｅｃ；９５：２１５−３０， １９８１など）。手短には、Ｐ１ラット新生児由来の坐骨神経を採取し、１０％熱不活化ウシ胎児血清を補給したダルベッコの改変イーグル培地中で細胞を維持した。２μＭフォルスコリンおよびウシ下垂体抽出物（Ｓｉｇｍａ社製）を用いてシュヴァン細胞を拡張（ｅｘｐａｎｄ）させた。第３継代まで細胞を増殖させ、保管するために冷凍した。
【０１２５】
嗅覚ＧＰＣＲの一過性トランスフェクション：
第５継代のシュヴァン細胞を１ウェル当たり８×１０４細胞でポリ−Ｄ−リジンを被覆した８ウェルチャンバースライド（Ｆａｌｃｏｎ社製）上に蒔いた。Ｆｕｇｅｎｅ ６試薬（Ｒｏｃｈｅ社製）およびＯｐｔｉｍｅｍ血清無含有培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、０．５μｇの嗅覚ＧＰＣＲ発現プラスミドによりシュヴァン細胞をトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞は、４時間にわたり３７℃の５％ ＣＯ２加湿インキュベーター内で維持した。ＰＢＳを用いて細胞を洗浄し、新鮮増殖培地と取り換えた。２４時間後、細胞を発現についてアッセイした。
【０１２６】
ＨＡ染色によって決定した嗅覚ＧＰＣＲの発現分析：
ＰＢＳＣＭ（ＰＢＳ＋０．５ｍＭ Ｃａ２＋＋１ｍＭ ＭｇＣｌ２）を用いてトランスフェクトした細胞を洗浄し、４％ホルマリンを用いて固定した。５０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ／ＰＢＳＣＭを用いて細胞をクエンチし、２回洗浄した。一次抗体抗マウスＨＡ（Ｒｏｃｈｅ社製）をブロッキングバッファー（トリトンなしのＰＢＳＣＭ中の２％ ＢＳＡ）中で１：１，０００に希釈し、細胞上に１時間放置した。ＰＢＳＣＭを用いて３回洗浄した後、二次抗体（Ａｌｅｘａ ４８８結合体化ロバ抗マウスＩｇＧ）１：２，０００およびＤＡＰＩ １：２，０００は暗所で３０分間にわたり細胞上に放置した。細胞はＰＢＳＣＭを用いて３回洗浄し、フルオロセーブ（ｆｌｏｕｒｏｓａｖｅ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）を被覆してカバースリップを被せた。細胞は適切なＵＶフィルターによって分析した。
【０１２７】
それらの表面上で嗅覚ＧＰＣＲを産生する細胞が観察された（図１を参照）。
【０１２８】
（実施例２：ＧＰＣＲ活性化のアッセイ）
受容体の発現：
大グリア細胞の一過性トランスフェクションは初代ラットシュヴァン細胞について実施例１に記載したとおりに実施できる。大グリア細胞系の安定性トランスフェクションは、本明細書に記載したとおりに実施できる。
【０１２９】
約１２×１０６個の大グリア細胞を１５ｃｍ組織培養プレート上に蒔き、１０％ウシ胎児血清および１％ピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミン、および抗生物質を含有するＤＭＥ高グルコース培地中で増殖させる。大グリア細胞を蒔いた２４時間後（または約８０％のコンフルエンシーまで）、１２μｇのＤＮＡを用いて細胞をトランスフェクトする。１２μｇのＤＮＡを６０μＬのリポフェクトアミンおよび血清を含有していない２ｍＬのＤＭＥ高グルコース培地と合わせる。プレートから培地を吸引し、血清を含有しない培地を用いて細胞を１回洗浄する。ＤＮＡ、リポフェクトアミン、および培地混合物を、血清を含有しない１０ｍＬの培地と一緒にプレートへ添加する。３７℃で４〜５時間インキュベートした後、培地を吸引し、血清を含有する培地２５ｍＬを添加する。トランスフェクションの２４時間後、培地を再び吸引し、血清を含有する新鮮培地を添加する。トランスフェクションの４８時間後、培地を吸引し、最終濃度５００μｇ／ｍＬで、ジェネティシン（Ｇ４１８薬）を含有する血清含有培地を添加する。トランスフェクトした細胞を、今度はＧ４１８耐性遺伝子を含有する陽性トランスフェクト細胞についての選択を受けさせる。培地は、選択が発生すると４〜５日間毎に取り換える。選択中、安定性プールを作製するために細胞を増殖させるかまたは安定性クローン選択のために細胞を分割する。
【０１３０】
膜結合アッセイ：
［３５Ｓ］ＧＴＰγＳアッセイ：Ｇタンパク質共役受容体がリガンド結合または構成性活性化のいずれかの結果として活性状態にある場合は、受容体はＧタンパク質に共役し、ＧＤＰの放出およびそれに続くＧＴＰのＧタンパク質への結合を刺激する。Ｇタンパク質受容体複合体のαサブユニットはＧＴＰａｓｅとして機能し、ＧＴＰからＧＤＰへ緩徐に加水分解し、その時点で受容体は通常不活性化される。活性化された受容体は、ＧＴＰをＧＤＰに置換し続ける。非加水分解性ＧＴＰアナログである［３５Ｓ］ＧＴＰγＳを利用すると、活性化受容体を発現する膜への［３５Ｓ］ＧＴＰγＳの強化された結合を証明することができる。活性化を測定するために［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を使用することの長所は：（ａ）これが一般にすべてのＧタンパク質共役受容体へ適用できること；
（ｂ）これは膜表面の近位に存在するので細胞内カスケードに影響を及ぼす分子を取り上げる可能性を低くさせることである。
【０１３１】
本アッセイは、Ｇタンパク質共役受容体が関連受容体を発現する膜への［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を刺激する能力を利用する。このため本アッセイは、内因性ＧＰＣＲおよび非内因性の構成的に活性化されたＧＰＣＲについて候補化合物をスクリーニングするために直接同定方法において使用できる。本アッセイは一般的であり、すべてのＧタンパク質共役受容体での新薬発見に適用される。
【０１３２】
［３５Ｓ］ＧＴＰγＳアッセイは２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１〜約２０ｍＭ ＭｇＣｌ２（この量は結果を最適化するために調整できるが、２０ｍＭが好ましい）ｐＨ７．４、約０．３〜約１．２ｎＭ［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ（この量は結果を最適化するために調整できるが、１．２が好ましい）および１２．５〜７５μｇ膜タンパク質（この量は最適化するために調整できる）を備える結合バッファーおよび１０μＭ ＧＤＰ（この量は最適化するために変更できる）中で１時間にわたりインキュベートする。コムギ胚芽凝集素ビーズ（２５μＬ；Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を次に添加し、この混合物を室温でさらに３０分間インキュベートする。これらのチューブを次に室温で５分間、１５００×ｇで遠心し、シンチレーションカウンターで計数する。
【０１３３】
アデニリルシクラーゼ
細胞ベースアッセイのために設計されたＦｌａｓｈ ＰｌａｔｅＴＭアデニリルシクラーゼキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ社製；カタログ番号ＳＭＰ００４Ａ）は粗原形質膜と一緒に使用するために改変することができる。Ｆｌａｓｈ Ｐｌａｔｅウェルは、ｃＡＭＰを認識する特異的抗体も含有するシンチラントコーティングを含有していてよい。ウェル内で生成されたｃＡＭＰは、ｃＡＭＰ抗体への放射性ｃＡＭＰトレーサーの結合について直接競合によって定量することができる。下記は、受容体を発現する細胞全体中でのｃＡＭＰレベルの変化を測定するための手短なプロトコールとして役立つ。
【０１３４】
一過性トランスフェクションの約２４時間後にトランスフェクトした細胞を採取した。注意深く培地を吸引して取り除き、廃棄した。各皿の細胞へ１０ｍＬのＰＢＳを穏やかに添加し、次に注意深く吸引する。１ｍＬのＳｉｇｍａ社製細胞解離バッファーおよび３ｍＬのＰＢＳを各プレートへ添加する。ピペットを用いてプレートから細胞を取り出し、５０ｍＬの円錐形遠心チューブ内へ細胞懸濁液を収集した。細胞は室温で５分間かけて１，１００ｒｐｍで遠心した。細胞ペレットを適切な容量のＰＢＳ（約３ｍＬ／プレート）中へ注意深く再懸濁させた。血球計数器を用いて細胞数を計数し、追加のＰＢＳを添加して適切な数の細胞（約５０μＬ／ウェルの最終容量）を得た。
【０１３５】
ｃＡＭＰ標準物質および検出用バッファー（１１ｍＬの検出用バッファーに対して１μＣｉのトレーサー［１２５Ｉ ｃＡＭＰ］５０μＬ）を含む）を調製し、製造業者の指示書にしたがって維持した。アッセイバッファーはスクリーニングのために新しく調製したが、５０μＬの刺激バッファー、３μＬの試験化合物（１２μＭのアッセイ最終濃度）および５０μＬの細胞を含有していた。アッセイバッファーは使用時まで氷上に保管した。５０μＬのｃＡＭＰ標準物質を適切なウェルへ添加し、次にウェルＨ−１１およびＨ１２へ５０μＬのＰＢＳＡを添加することによってアッセイを開始した。５０μＬの刺激バッファーを全ウェルへ添加した。試験化合物の１２μＭの最終アッセイ濃度および１００μＬの全アッセイ容量で、３μＬの化合物溶液を分注できるピン状ツールを用いてＤＭＳＯ（もしくは選択した候補化合物）を適切なウェルへ添加した。次に細胞をウェルへ添加し、室温で６０分間インキュベートした。トレーサーｃＡＭＰを含有する１００μＬの検出ミックスをウェルへ添加した。プレートをさらに２時間インキュベートし、次にＷａｌｌａｃ ＭｉｃｒｏＢｅｔａシンチレーションカウンターで計数した。ｃＡＭＰ／ウェルの数値は、各アッセイプレート内に含有された標準ｃＡＭＰ曲線から外挿した。
【０１３６】
Ｇｉ共役標的ＧＰＣＲに対する細胞ベースｃＡＭＰ：
ＴＳＨＲは、活性化されるとｃＡＭＰの蓄積を誘発するＧｓ共役ＧＰＣＲである。ＴＳＨＲは、アミノ酸残基６２３を突然変異させること（すなわち、アラニン残基をイソロイシン残基へ変化させること）によって構成的に活性化される。Ｇｉ共役受容体はアデニリルシクラーゼを阻害し、そしてこのためｃＡＭＰ産生のレベルを減少させると予想され、ｃＡＭＰレベルの評価を難題にする可能性がある。Ｇｉ共役受容体の構成的活性化の指標としてのｃＡＭＰの産生の減少を測定するために有効な技術は、ｃＡＭＰのベースラインレベルを確定するために、最も好ましくは「シグナルエンハンサー」としての非内因性の構成的に活性化されたＴＳＨＲ（ＴＳＨＲ−Ａ６２３Ｉ）（もしくは内因性の構成的に活性なＧｓ共役受容体）を、Ｇｉ連結標的ＧＰＣＲを用いてコトランスフェクトすることによって遂行できる。Ｇｉ共役受容体の非内因性バージョンを作製すると、標的ＧＰＣＲの非内因性バージョンは次にシグナルエンハンサーを用いてコトランスフェクトされ、スクリーニングのために使用できるのはこの物質である。本発明者らは、ｃＡＭＰアッセイが使用される場合はシグナルを効果的に産生するためにそのようなアプローチを利用する；このアプローチは、好ましくはＧｉ共役受容体に対する候補化合物の直接的同定において使用される。Ｇｉ共役ＧＰＣＲに対してこのアプローチを使用した場合は、標的ＧＰＣＲのインバースアゴニストはｃＡＭＰシグナルを増加させ、アゴニストはｃＡＭＰシグナルを減少させることが留意される。
【０１３７】
第１日には、大グリア細胞を２×１０４個／ウェルをプレーティングする。第２日に、２本の反応チューブを用意する（各チューブについて従うべき比率は１プレート当たりの比率である）：チューブＡは１．２ｍＬの血清無含有ＤＭＥＭ（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、カリフォルニア州アーヴィン）中で計４μｇのＤＮＡ（例、ｐＣＭＶベクター；変異したＴＨＳＲ（ＴＳＨＲ−Ａ６２３Ｉ）を有するｐＣＭＶベクター；ＴＳＨＲ−Ａ６２３ＩおよびＧＰＣＲ、など）に対して、哺乳動物細胞中へトランスフェクトした各受容体の２μｇのＤＮＡを混合することによって調製される；チューブＢは１．２ｍＬの血清無含有ＤＭＥＭ中に１２０μＬのリポフェクトアミン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製）を混合することによって調製される。チューブＡおよびＢを（数回）反転させ、室温で３０〜４５分間インキュベートすることによって混合する。この混合物を「トランスフェクション混合物」と呼ぶ。プレートに蒔いた大グリア細胞は、１×ＰＢＳを用いて洗浄し、その後に１０ｍＬの血清無含有ＤＭＥＭを添加する。２．４ｍＬのトランスフェクション混合物を次に細胞へ添加し、その後に３７℃／５％ ＣＯ２で４時間にわたりインキュベーションする。トランスフェクション混合物を吸引によって除去し、その後に２５ｍＬのＤＭＥＭ／１０％ウシ胎児血清を添加する。その後、細胞を３７℃／５％ ＣＯ２でインキュベートする。２４時間のインキュベーション後、細胞を採取し、分析に使用する。
【０１３８】
Ｆｌａｓｈ ＰｌａｔｅＴＭアデニリルシクラーゼキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ社製；カタログ番号ＳＭＰ００４Ａ）は細胞ベースアッセイのために設計されているが、当業者の必要に依存して粗原形質膜と一緒に使用するために改変され得る。Ｆｌａｓｈ Ｐｌａｔｅウェルは、ｃＡＭＰを認識する特異的抗体も含有する、シンチラントコーティングを含有する。ウェル内で産生されたｃＡＭＰは、ｃＡＭＰ抗体への放射性ｃＡＭＰトレーサーの結合について直接競合によって定量することができる。下記は、受容体を発現する細胞全体中でのｃＡＭＰレベルの変化を測定するための手短なプロトコールとして役立つ。
【０１３９】
トランスフェクトした細胞を、一過性トランスフェクションの約２４時間後に採取する。注意深く培地を吸引して取り除き、廃棄する。各皿の細胞へ１０ｍＬのＰＢＳを穏やかに添加し、次に注意深く吸引する。１ｍＬのＳｉｇｍａ社製細胞解離バッファーおよび３ｍＬのＰＢＳを各プレートへ添加する。ピペットを用いてプレートから細胞を取り出し、５０ｍＬの円錐形遠心チューブ内へ細胞懸濁液を回収する。細胞は室温で５分間１，１００ｒｐｍで遠心する。細胞ペレットを適切な容量のＰＢＳ（約３ｍＬ／プレート）中へ注意深く再懸濁する。血球計数器を用いて細胞数を計数し、追加のＰＢＳを添加して適切な数の細胞（約５０μＬ／ウェルの最終容量）を得る。
【０１４０】
ｃＡＭＰ標準物質および検出用バッファー（１１ｍＬの検出用バッファーに対して１μＣｉのトレーサー［１２５Ｉ ｃＡＭＰ（５０μＬ）］を含む）を調製し、製造業者の指示書にしたがって維持する。アッセイバッファーはスクリーニングのために新しく調製しなければならず、５０μＬの刺激バッファー、３μＬの試験化合物（１２μＭのアッセイ最終濃度）および５０μＬの細胞を含有していなければならない。アッセイバッファーは使用時まで氷上に保管され得る。５０μＬのｃＡＭＰ標準物質を適切なウェルへ添加し、次にウェルＨ−１１およびＨ１２へ５０μＬのＰＢＳＡを添加することによってアッセイを開始できる。５０μＬの刺激バッファーを全ウェルへ添加する。試験化合物の１２μＭの最終アッセイ濃度および１００μＬの全アッセイ容量で、３μＬの化合物溶液を分注できるピン状ツールを用いて選択した化合物（例、ＴＳＨ）を適切なウェルへ添加する。次に細胞をウェルへ添加し、室温で６０分間インキュベートする。トレーサーｃＡＭＰを含有する１００μＬの検出ミックスをウェルへ添加する。プレートをさらに２時間インキュベートし、次にＷａｌｌａｃ ＭｉｃｒｏＢｅｔａシンチレーションカウンターで計数した。ｃＡＭＰ／ウェルの値は、各アッセイプレート内に含有された標準ｃＡＭＰ曲線から外挿する。
【０１４１】
レポーターベースアッセイ：
Ｃｒｅ−Ｌｕｃレポーターアッセイ（Ｇｓ関連受容体）：大グリア細胞は１ウェル当たり２×１０４細胞の密度で９６ウェルプレート上に蒔き、製造業者の指示書にしたがって翌日、リポフェクトアミン試薬（ＢＲＬ社製）を用いてトランスフェクトした。ＤＮＡ／脂質混合物は各６ウェルトランスフェクションのために下記のとおりに調製する：１００μＬのＤＭＥＭ中の２６０ｎｇのプラスミドＤＮＡを１００μＬのＤＭＥＭ中の２μＬの脂質と穏やかに混合した（２６０ｎｇのプラスミドＤＮＡは２００ｎｇの８×ＣＲＥ−Ｌｕｃレポータープラスミド、内因性受容体もしくは非内因性受容体を含む５０ｎｇのｐＣＭＶまたはｐＣＭＶ単独、および１０ｎｇのＧＰＲＳ発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）中のＧＰＲＳ）から構成された。８×ＣＲＥ−Ｌｕｃ受容体プラスミドは下記のとおりに調製した：ベクターＳＲＩＦ−β−ｇａｌは、ｐβｇａｌ−Ｂａｓｉｃ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）中のＢｇｌＶ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位でラットソマトスタチンプロモーター（−７１／＋５１）をクローニングすることによって入手した。８コピーのｃＡＭＰ応答エレメントをＰＣＲによってアデノウイルステンプレートＡｄｐＣＦ１２６ＣＣＲＥ８（７ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １８８３（１９９６）を参照されたい）から入手し、Ｋｐｎ−ＢｇｌＶ部位でＳＲＩＦ−β−ｇａｌベクター内へクローニングすると、８×ＣＲＥ−β−ｇａｌレポーターベクターが生じた。この８×ＣＲＥ−Ｌｕｃレポータープラスミドは、８×ＣＲＥ−β−ｇａｌレポーターベクター内のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子をＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ部位でｐＧＬ３−ベーシックベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）から入手したルシフェラーゼ遺伝子と置換することによって作製した。室温での３０分間のインキュベーション後、４００μＬのＤＭＥＭを用いてＤＮＡ／脂質混合物を希釈し、希釈混合物１００μＬを各ウェルへ添加した。細胞培養インキュベーター内での４時間のインキュベーション後、各ウェルへ１０％ＦＣＳを含む１００μＬのＤＭＥＭを添加した。翌日、トランスフェクトした細胞は１０％ＦＣＳを含む２００μＬ／ウェルのＤＭＥＭに変更した。８時間後、ウェルは、ＰＢＳを用いた１回の洗浄後、フェノールレッドを含まない１００μＬ／ウェルのＤＭＥＭへ変更した。ルシフェラーゼ活性は、製造業者の指示書にしたがってＬｕｃＬｉｔｅ（商標）レポーター遺伝子アッセイキット（Ｐａｃｋａｒｄ社製）を用いて翌日測定し、１４５０ ＭｉｃｒｏＢｅｔａ（商標）シンチレーションおよびルミネセンスカウンター（Ｗａｌｌａｃ社製）上で読み取った。
【０１４２】
ＡＰ１レポーターアッセイ（Ｇｑ関連受容体）：
Ｇｑ刺激を検出する方法は、Ｇｑ依存性ホスホリパーゼＣがそれらのプロモーター中でＡＰ１エレメントを含有する遺伝子の活性化を誘発する既知の特性に左右される。ＰａｔｈｄｅｔｅｃｔＴＭＡＰ−１ ｃｉｓ−Ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製、カタログ番号２１９０７３）は、リン酸カルシウム沈降物の構成成分が４１０ｎｇのｐＡＰ１−Ｌｕｃ、８０ｎｇのｐＣＭＶ−受容体発現プラスミド、および２０ｎｇのＣＭＶ−ＳＥＡＰであった以外は、ＣＲＥＢレポーターアッセイに関して上述したプロトコールセットにしたがって使用できる。
【０１４３】
ＳＲＦ−Ｌｕｃレポーターアッセイ（Ｇｑ関連受容体）：
Ｇｑ刺激を検出する１つの方法は、Ｇｑ依存性ホスホリパーゼＣがそれらのプロモーター中で血清応答因子を含有する遺伝子の活性化を誘発する既知の特性に左右される。Ｐａｔｈｄｅｔｅｃｔ（商標）ＳＲＦ−Ｌｕｃ−Ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を使用すると、例えばＣＯＳ７細胞中でＧｑ共役活性についてアッセイすることができる。細胞は、Ｍａｍｍａｌｉａｎ ＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＴＭ
Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製、カタログ番号２００２８５）を製造業者の指示書にしたがって用いて、本システムのプラスミド構成成分および内因性もしくは非内因性ＧＰＣＲをコードする指定発現プラスミドを用いてトランスフェクトされる。手短には、４１０ｎｇのＳＲＦ−Ｌｕｃ、８０ｎｇのｐＣＭＶ−受容体発現プラスミドおよび２０ｎｇのＣＭＶ−ＳＥＡＰ（分泌アルカリホスファターゼ発現プラスミド；サンプル間のトランスフェクト効率における変動について対照するためにアルカリホスファターゼ活性はトランスフェクトした細胞の培地中で測定する）を製造業者の指示書にしたがってリン酸カルシウム沈降物中で結合させる。沈降物の半分を９６ウェルプレート上の３つのウェルの上方に同等に分布させ、血清無含有培地中で細胞を２４時間維持する。最後の５時間に、細胞を選択した化合物と一緒にインキュベートする。次いで細胞を溶解させ、ＬｕｃｌｉｔｅＴＭキット（Ｐａｃｋａｒｄ社製、カタログ番号６０１６９１１）ならびに「Ｔｒｉｌｕｘ １４５０ Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ」液体シンチレーションおよびルミネセンスカウンター（Ｗａｌｌａｃ社製）を製造業者の指示書にしたがって用いてルシフェラーゼ活性についてアッセイする。データは、ＧｒａｐｈＰａｄ ＰｒｉｓｍＴＭ２．０ａ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．社製）を用いて分析できる。
【０１４４】
細胞内イノシトール１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）蓄積アッセイ（Ｇｑ関連受容体）：
第１日に、受容体（内因性および／または非内因性）を含む細胞は２４ウェルプレート上で、通常は１ウェルに付き１×１０５細胞でプレートに蒔かれ得る（しかしこの数は最適化できる）。第２日に、細胞は１ウェルに付き５０μＬの血清無含有ＤＭＥＭ中の０．２５μｇのＤＮＡおよび１ウェルに付き５０μＬの血清無含有ＤＭＥＭ中の２μＬリポフェクトアミンを最初に混合することによってトランスフェクトすることができる。溶液を穏やかに混合し、室温で１５〜３０分間にわたりインキュベートする。細胞は０．５ｍＬのＰＢＳを用いて洗浄し、４００μＬの血清無含有培地をトランスフェクション培地と混合し、細胞に添加する。細胞を次に３７℃／５％ ＣＯ２で３〜４時間インキュベートし、トランスフェクション培地を除去し、１ｍＬ／ウェルの標準増殖培地と取り替える。
【０１４５】
第３日に、この細胞を３Ｈ−ミオ−イノシトールを用いて標識する。手短には、培地を除去し、０．５ｍＬのＰＢＳを用いて細胞を洗浄する。１ウェルに付き０．５ｍＬのイノシトール無含有／血清無含有培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）とともに１ウェルに付き０．２５μＣｉの３Ｈ−ミオ−イノシトールを添加し、細胞を３７℃／５％ＣＯ２で１６〜１８時間にわたりインキュベートする。第４日に、０．５ｍＬのＰＢＳを用いて細胞を洗浄し、１０μＭパルジリン、１０ｍＭ塩化リチウムを含むイノシトール無含有／血清無含有培地を含有する０．４５ｍＬのアッセイ培地、または０．４ｍＬのアッセイ培地および最終濃度が１０μＭになるような５０μＬの１０×ケタンセリン（ｋｅｔ）を添加する。この細胞を次に３７℃で３０分間インキュベートする。０．５ｍＬのＰＢＳを用いて細胞を洗浄し、１ウェルに付き２００μＬの新鮮／氷冷停止液（１Ｍ ＫＯＨ；１８ｍＭ ホウ酸ナトリウム溶液；３．８ｍＭ ＥＤＴＡ）を添加する。この溶液を氷上で５〜１０分間または細胞が溶解するまで維持し、次に２００μＬの新鮮／氷冷中和溶液（７．５％ＨＣｌ）によって中和する。
【０１４６】
この溶解液を１．５ｍＬのエッペンドルフチューブ内へ移し、チューブ１本に付き１ｍＬのクロロホルム／メタノール（１：２）を添加する。この溶液を１５秒間ボルテックスミキサーにかけ、上層をＢｉｏｒａｄ ＡＧ１−Ｘ８ＴＭアニオン交換樹脂（１００〜２００メッシュ）へ適用する。最初に、１：１．２５（Ｗ／Ｖ）で水を用いて樹脂を洗浄し、０．９ｍＬの上層をカラムへ入れる。１０ｍＬの５ｍＭミオ−イノシトールおよび１０ｍＬの５ｍＭホウ酸ナトリウム／６０ｍＭギ酸ナトリウムを用いてカラムを洗浄する。２ｍＬの０．１Ｍギ酸／１Ｍギ酸アンモニウムを含む１０ｍＬのシンチレーションカクテルを含有するシンチレーションバイアル内へイノシトールＴｒｉｓリン酸塩を溶出させる。このカラムは１０ｍＬの０．１Ｍギ酸／３Ｍギ酸アンモニウムを用いて洗浄する工程によって再生され、ｄｄＨ２Ｏを用いて２回すすぎ洗いし、４℃の水中へ保管される。
【０１４７】
細胞内カルシウム濃度を測定するための蛍光測定イメージングプレートリーダー（ＦＬＩＰＲ）アッセイ：
各クローン系から安定性にトランスフェクトした標的受容体（実験的）およびｐＣＭＶ（ネガティブコントロール）細胞を、翌日アッセイするために、完全培養培地（１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウムを含むＤＭＥＭ）を含むポリ−Ｄ−リジン前処理９６ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製、番号３５６６４０）内へ１ウェルにつき５．５×１０４細胞で播種する。Ｆｌｕｏ４−ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社製、番号Ｆ１４２０２）インキュベーションバッファーストック液を調製するために、１ｍｇ Ｆｌｕｏ４−ＡＭを４６７μＬのＤＭＳＯおよび４６７μＬのＰｌｕｏｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社製、番号Ｐ３０００）中へ溶解させて、−２０℃で１カ月間にわたり保管できる１ｍＭストック溶液を入手する。Ｆｌｕｏ４−ＡＭは、蛍光カルシウム指示染料である。
【０１４８】
候補化合物は、洗浄バッファー（１×ＨＢＳＳ／２．５ｍＭ プロベニシド（Ｐｒｏｂｅｎｉｃｉｄ）／２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４））中で調製される。
【０１４９】
アッセイ時に、培地をウェルから取り除き、この細胞に１００μＬの４μＭ Ｆｌｕｏ４−ＡＭ／２．５ｍＭ プロベニシド（Ｓｉｇｍａ社製、番号Ｐ８７６１）／２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／完全培地（ｐＨ７．４）を添加する。３７℃／５％ ＣＯ２でのインキュベーションを６０分間にわたり進行させる。
【０１５０】
１時間のインキュベーション後、Ｆｌｕｏ４−ＡＭインキュベーションバッファーを取り除き、１００μＬの洗浄バッファーを用いて細胞を２回洗浄する。各ウェル内に１００μＬの洗浄バッファーを放置する。プレートを６０分間にわたり３７℃／５％ＣＯ２に設定したインキュベーターに戻す。
【０１５１】
ＦＬＩＰＲ（蛍光測定イメージングプレートリーダー；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ社製）を、３０秒毎に５０μＬの候補化合物を添加し、その後の１５０秒間について候補化合物によって引き起こされる細胞内カルシウム濃度（［Ｃａ２＋］）の一過性変化を記録するようにプログラミングする。ＦＬＩＰＲソフトウエアを用いてアゴニスト活性を決定するために全蛍光変化数を使用する。機器のソフトウエアは、ゼロで同等の初期読み取り値を得るように蛍光読み取り値を標準化する。
【０１５２】
一部の実施形態では、標的受容体を含む細胞は、無差別Ｇα１５／１６またはキメラＧｑ／Ｇｉαユニットをさらに含んでいる。
【０１５３】
上記は安定性にトランスフェクトした細胞を用いてアゴニスト活性についてのＦＬＩＰＲアッセイを提供するが、当業者であればアンタゴニスト活性を特性解析するために本アッセイを容易に改変できるであろう。前記当業者は、あるいはまた一過性トランスフェクト細胞も使用できることを容易に理解するであろう。
【０１５４】
上記の試験結果および考察から、本発明が嗅覚ＧＰＣＲを産生するための重要な新規手段を提供することが明らかである。詳細には、本発明は嗅覚ＧＰＣＲ調節因子を見いだすための化学物質ライブラリーをスクリーニングするためのシステムを提供する。したがって、本方法およびシステムは、研究、食品および芳香剤の改良を含む様々な用途、およびその他の用途において利用される。したがって、本発明は当技術分野にとって有意な貢献を意味する。
【０１５５】
【表１−１】
【０１５６】
【表１−２】
【０１５７】
【表１−３】
【０１５８】
【表１−４】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、以下の仮出願からの優先権の利益を主張する：米国特許商標庁に米国速達郵便で指示された日付に出願された、２００３年１１月２１日出願の米国仮出願番号第６０／５２３，９４０号。先の出願の開示は、本明細書中にその全体が参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、細胞中でＧＰＣＲタンパク質、詳細には嗅覚ＧＰＣＲタンパク質を産生するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
すべての動物は、環境内における化学的感覚情報の認識および識別を可能にする嗅覚感覚器である「鼻」を有している。例えばヒトは、他の動物に比較してニオイについて不良な感覚を有するが、それでもヒトは、１０，０００種を超える、典型的には４００Ｄａ未満の小さな有機分子である、揮発性化学物質（「臭気物質」）を感知する、すなわちニオイを嗅ぐことができる。これらの化学物質は構造が高度に相違しており、一連の多種多様な脂肪族系酸、アルコール、アルデヒド、ケトン、およびエステル；芳香環、脂環、多環および複素環の構造を備える化学物質；およびこれらのタイプ各々の無数の置換化学物質、ならびにそれらの組み合わせを含んでいる。注目すべきことに、これらの分子は嗅覚系によって検出されるだけではなく、嗅覚系自体によって識別される。
【０００４】
一部のニオイは望ましく、そして他のニオイは嫌われるので、新しいニオイを作り出す、ニオイを模倣する、そしてニオイの知覚を操作する能力は極めて望ましい。このために、ニオイの知覚に関する研究が近年強められてきた。ヒトおよび他の動物種では、嗅覚感覚ニューロンの特殊タイプの樹状突起である嗅覚繊毛上で極めて多数の臭気物質受容体が同定されている。これらの臭気物質受容体はＧタンパク質共役受容体のスーパーファミリーに特徴的な７回膜貫通ドメイントポロジーを示すので、したがって「嗅覚ＧＰＣＲ」と呼ばれている。各嗅覚感覚ニューロンは１つのタイプの嗅覚ＧＰＣＲしか発現せず、ヒトゲノムはおよそ５００種の活性嗅覚ＧＰＣＲをコードすると推定されている。
【０００５】
したがって、比較的少数の受容体によって極めて多数の化学物質を検出かつ識別することができる。これは各嗅覚ＧＰＣＲが１種より多くの臭気物質を認識し、各臭気物質が１種より多くの嗅覚ＧＰＣＲによって認識されるコンビナトリアル受容体コ―ディングスキーム（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｏｄｉｎｇ ｓｃｈｅｍｅ）を用いて達成される。そこで臭気物質は、活性化ＧＰＣＲの「フィンガープリント」によって特徴付けることができる。いったん決定されると、この「フィンガープリント」は臭気物質の正体（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）、ならびに類似の「フィンガープリント」、従ってニオイを示す他の分子を同定するための根拠を提供する。
アデノウイルスベクターを用いて外来的に導入された場合にその組換え嗅覚ＧＰＣＲは嗅覚感覚ニューロンによってインビボで高レベルで効率的に発現され得る（例、非特許文献１）という事実にもかかわらず、嗅覚ＧＰＣＲは、それらが細胞内でそれらの機能を提供する方法で、異種培養細胞系で容易に発現できないという点で極めて例外的である（例、非特許文献２）。この問題の正確な原因は不明ではあるが、１つの理論は、非内因性細胞中で発現したときに嗅覚ＧＰＣＲが細胞の原形質膜へ運ばれず、小胞体中に隔離されるようになるというものである。また別の理論は、機能的発現は正しい膜局在化のために必要とされる嗅覚特異的因子または非嗅覚細胞中での情報伝達機構への非効率な共役に起因する可能性があると示唆している（非特許文献３）。非内因性培養細胞中での組換え嗅覚ＧＰＣＲの非効率的および／または本質的に非機能的な発現を生じさせる機構とは無関係に、この問題に対する解決策はこれまで知られていない。本発明までは、嗅覚ＧＰＣＲはインビトロでは哺乳動物細胞中で発現するのが格別に困難であり、そしてそのような方法が極めて望ましいのではあるが、これまではそれらのＧＰＣＲを産生およびアッセイする強固で確実かつ効率的な方法はなかった。臭気物質の認識および識別を理解することにおける進歩は、嗅覚ＧＰＣＲを産生できないために強度に妨害されている（非特許文献４）。
さらに上記から、哺乳動物細胞中で嗅覚ＧＰＣＲを産生するための強固で、確実かつ効率的な方法に対する大きな必要がある。本発明は、この必要や他の必要を満たし、予想外に高水準の成功を生じさせる。
（文献）
目的の文献には下記の参考文献が含まれる：非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８および非特許文献１９；特許文献１および特許文献２；ならびに特許文献３、特許文献４および特許文献５。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００３／０１４３６７９号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００３／０１０５２８５号明細書
【特許文献３】米国特許第６，６１０，５１１号明細書
【特許文献４】米国特許第６，４９２，１４３号明細書
【特許文献５】米国特許第６，４１０，２４９号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｔｏｕｈａｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９９９年、９６：ｐ．４０４０−４０４５
【非特許文献２】ＭｃＣｌｉｎｔｏｃｋ、Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．、１９９７年、４８：ｐ．２７０−２７８
【非特許文献３】Ｋｒｉｅｇｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９９４年、２１９：ｐ．８２９−８３５
【非特許文献４】Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２００１年、４１３：ｐ．２１１−２１８
【非特許文献５】Ｚｏｚｕｌｙａら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００１年、２：ｐ．００１８．１−００１８．１２
【非特許文献６】Ｍｏｍｂａｉｒｔｓ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、１９９９年、２２：ｐ．４８７−５０９
【非特許文献７】Ｒａｍｉｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９３年、３６１：ｐ．３５３−３５６
【非特許文献８】Ｂｅｌｌｕｓｃｉｏら、Ｎｅｕｒｏｎ、１９８８年、２０：ｐ．６９−８１
【非特許文献９】Ｒｏｎｎｅｔら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２００２年、６４：ｐ．１８９−２２２
【非特許文献１０】Ｌｕら、Ｔｒａｆｆｉｃ、２００３年、４：ｐ．４１６−５３３
【非特許文献１１】Ｂｕｃｋ、Ｃｅｌｌ、２０００年、１００：ｐ．６１１−６１８
【非特許文献１２】Ｍａｌｎｉｃら、Ｃｅｌｌ、１９９９年、９６：ｐ．７１３−７２３
【非特許文献１３】Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２００１年、４１３：ｐ．２１１−２１８
【非特許文献１４】Ｚｈａｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９８年、２７９：ｐ．２３７−２４２
【非特許文献１５】Ｔｏｕｈａｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９９９年、９６：ｐ．４０４０−４０４５
【非特許文献１６】Ｓｋｌａｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、１９８６年、２６１：ｐ．１５５３８−１５５４３
【非特許文献１７】Ｄｒｙｅｒら、ＴｉＰＳ、１９９９年、２０：ｐ．４１３−４１７
【非特許文献１８】Ｉｖｉｃら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．、２００２年、５０：ｐ．５６−６８
【非特許文献１９】Ｆｕｃｈｓら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、２００１年 １０８：ｐ．１−１３
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、細胞中で嗅覚ＧＰＣＲを産生するための方法を提供する。一般に、本方法は、嗅覚ＧＰＣＲをコードする核酸へ作動可能に連結したプロモーターを含有する発現カセットを大グリア細胞、例えばシュヴァン（Ｓｃｈｗａｎｎ）細胞もしくは希突起膠細胞（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ）中へ導入する工程と、および嗅覚ＧＰＣＲを産生するために適切な条件下で前記細胞を維持する工程と、を含んでいる。さらに、嗅覚ＧＰＣＲをコードする組換え核酸を含有する大グリア細胞、嗅覚ＧＰＣＲ活性の調節因子についてスクリーニングする方法、および大グリア細胞中で嗅覚ＧＰＣＲを産生するためのキットも提供される。本発明は、香味料および芳香剤に関する研究において最も有用であるので、その結果として多種多様な研究および産業上の用途を有する。
本発明は、さらに以下の項目を提供する：
（項目１）
嗅覚ＧＰＣＲを産生する方法であって、
該嗅覚ＧＰＣＲをコードする核酸に作動可能に連結したプロモーターを含む発現カセットを、インビトロで大グリア細胞中へ導入する工程、および
該嗅覚ＧＰＣＲの産生に適した条件下で、該細胞を維持し、該嗅覚ＧＰＣＲを産生する工程、
を包含する、方法。
（項目２）
前記大グリア細胞がミエリン産生細胞である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記大グリア細胞がシュヴァン細胞、希突起膠細胞または嗅神経鞘細胞である、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記大グリア細胞が初代シュヴァン細胞である、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記細胞が不死化大グリア細胞である、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記嗅覚ＧＰＣＲが細胞表面で検出可能である、項目１に記載の方法。
（項目７）
嗅覚調節因子をスクリーニングする方法であって、
項目１に記載の方法に従って大グリア細胞中において嗅覚ＧＰＣＲを産生する工程であって、ここで、該嗅覚ＧＰＣＲがＧタンパク質へ共役されている、工程；
該細胞を候補因子と接触させる工程；および
該嗅覚ＧＰＣＲの活性に対する該候補因子の作用を評価する工程
を包含し、ここで、該嗅覚ＧＰＣＲの活性を調節する候補因子が嗅覚調節因子である、方法。
（項目８）
嗅覚ＧＰＣＲの調節因子をスクリーニングする方法であって、
項目１に記載の方法に従って大グリア細胞中において該嗅覚ＧＰＣＲを産生する工程であって、ここで、該嗅覚ＧＰＣＲがＧタンパク質へ共役されている、工程；
該細胞を候補因子と接触させる工程；および
該嗅覚ＧＰＣＲの活性に対する該候補因子の作用を評価する工程
を包含し、ここで、該嗅覚ＧＰＣＲの活性を調節する候補因子が該嗅覚ＧＰＣＲの調節因子である、方法。
（項目９）
前記因子が小有機分子である、項目７または項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記因子が臭気物質である、項目７または項目８に記載の方法。
（項目１１）
前記接触させる工程が前記嗅覚ＧＰＣＲの既知のアゴニストの存在下で実施される、項目７または項目８に記載の方法。
（項目１２）
前記調節因子が、アゴニスト、部分アゴニスト、インバースアゴニストおよびアンタゴニストからなる群から選択される、項目７または項目８に記載の方法。
（項目１３）
前記評価する工程がＧＴＰγＳ結合のレベルの測定を通して行われる、項目７または項目８に記載の方法。
（項目１４）
前記評価する工程が、環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）、環状ＧＭＰ（ｃＧＭＰ）、イノシトール１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、およびＣａ２＋の群から選択される第２メッセンジャーのレベルの測定を通して行われる、項目７または項目８に記載の方法。
（項目１５）
前記第２メッセンジャーがｃＡＭＰである、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
嗅覚ＧＰＣＲのリガンドをスクリーニングする方法であって、
項目１に記載の方法に従って大グリア細胞中において該嗅覚ＧＰＣＲを産生する工程；
該嗅覚ＧＰＣＲを候補因子と接触させる工程；および
該候補因子の該嗅覚ＧＰＣＲへの結合を評価する工程、
を包含する、方法。
（項目１７）
前記候補因子が標識される、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
嗅覚ＧＰＣＲのリガンドをスクリーニングする方法であって、
項目１に記載の方法に従って大グリア細胞中において該嗅覚ＧＰＣＲを産生する工程；
該嗅覚ＧＰＣＲを、該嗅覚ＧＰＣＲの標識された既知のリガンドの存在下で候補因子と接触させる工程；および
該嗅覚ＧＰＣＲの該標識された既知のリガンドの結合を評価する工程
を包含し、ここで、該候補因子の存在下での該標識された既知のリガンドの結合の減少は、該候補因子が該嗅覚ＧＰＣＲのリガンドであることの指標である、方法。
（項目１９）
嗅覚調節因子をスクリーニングする方法であって、
項目１に記載の方法に従って複数の異なる嗅覚ＧＰＣＲを産生する工程であって、ここで、該嗅覚ＧＰＣＲの各々がＧタンパク質へ共役されている、工程；
第１の因子によって活性化される異なる嗅覚ＧＰＣＲのセットを同定する工程であって、ここで、該第１の因子が既知の嗅覚調節因子である、工程；
該ＧＰＣＲのセットを第２の因子と接触させる工程；および
該第２の因子の該嗅覚ＧＰＣＲの活性に対する作用を評価する工程
を包含し、ここで、該第１の因子によって調節された該異なるＧＰＣＲセットの１つ以上のＧＰＣＲを調節する第２の因子が、嗅覚調節因子である、方法。
（項目２０）
前記セットが３つ以上のＧＰＣＲを含む、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
嗅覚ＧＰＣＲをコードする組換え核酸を含む大グリア細胞。
（項目２２）
大グリア細胞；および
嗅覚ＧＰＣＲをコードする核酸
を備える、キット。
（項目２３）
前記大グリア細胞を用いて前記嗅覚ＧＰＣＲを産生するための指示書をさらに備える、項目２２に記載のキット。
（項目２４）
サンプル中において目的の臭気物質を同定する方法であって、
サンプルを、項目１に記載の方法に従って複数の異なる嗅覚ＧＰＣＲを産生する複数の大グリア細胞と接触させる工程であって、ここで、該嗅覚ＧＰＣＲの各々がＧタンパク質へ共役されている、工程；および
該臭気物質の存在に対する該嗅覚ＧＰＣＲの活性化を評価する工程
を包含し、ここで、予め決定された嗅覚ＧＰＣＲのセットの活性化が、該サンプルにおける該臭気物質の存在を示す、方法。
（項目２５）
臭気物質の「フィンガープリント」を決定する方法であって、
サンプルを、項目１に記載の方法に従って複数の異なる嗅覚ＧＰＣＲを産生する複数の大グリア細胞と接触させる工程であって、ここで、該嗅覚ＧＰＣＲの各々がＧタンパク質へ共役されている、工程；および
該臭気物質による活性化に対する該嗅覚ＧＰＣＲの活性化を評価する工程
を包含し、ここで、該「フィンガープリント」が該臭気物質によって活性化された異なる嗅覚ＧＰＣＲのセットを含む、方法。
（項目２６）
前記接触させる工程が、前記複数の嗅覚ＧＰＣＲのうちの１つ以上の既知のアゴニストの存在下で実施される、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記複数の細胞が、細胞のアドレス指定可能なアレイであり、ここで、該アレイの各アドレスが単一の組換え嗅覚ＧＰＣＲを産生する大グリア細胞を含有する、項目２４〜２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記ＧＰＣＲ活性化が、ＧＰＣＲ活性化の発光レポーターを用いて評価される、項目２７に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は初代ラットシュヴァン細胞の表面上での組換えヒト嗅覚ＧＰＣＲの発現を示している４枚の写真パネルである。パネルＯＲ１は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｐ４７８９３を有する嗅覚ＧＰＣＲである。パネルＯＲ２は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０３６５０５を有する嗅覚ＧＰＣＲである。パネルＯＲ３は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＸＰ＿１６６８６８を有する嗅覚ＧＰＣＲである。ベクターは空の発現ベクターでネガティブコントロールである。嗅覚ＧＰＣＲは、ロドプシンシグナルペプチドおよびヘマグルチニン（ＨＡ）エピトープタグを含むＮ末端融合タンパク質としてＣＭＶプロモーターに基づく発現ベクターから発現させられる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
（定義）
本発明についてさらに詳細に説明する前に、本発明は当然ながら変動する可能性があるので、記載した特定の実施形態には限定されないことを理解されたい。さらに、本明細書で使用する用語は特定の実施形態を記載するためのみであって、限定することは企図されていないことも理解されたい。他に特別に規定しない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般に理解される意味と同一の意味を有する。
【００１１】
ある範囲の値が提供される場合は、その範囲の上限と下限との間に介在する各値ならびにその記載した範囲内の任意の他の記載した、もしくは介在する値の間に介在する値は、その状況が明白にそうでないことを指示しない限り下限の単位の１０分の１まで、本発明の範囲内に含まれると理解されている。これらの小さな範囲の上限および下限は小さな範囲内に独立して含まれる可能性があり、そしてさらに、記載された範囲内のいずれか具体的な限度が排除された、本発明の範囲内に含まれる。記載された範囲が一方もしくは両方の限度を含む場合は、それらの含まれた限度の一方もしくは両方を除外する範囲もまた本発明に含まれる。
【００１２】
本出願を通して、様々な出版物、特許および公表された特許出願が引用される。本特許出願において言及したこれらの出版物、特許および公表された特許出願の開示は、これによりそれらの全体が本発明の開示の中に参考として援用される。出版物、特許、または公表された特許出願についての本出願人による本明細書での引用は、前記出版物、特許、もしくは公表された特許出願が先行技術であることを本出願人が認めたわけではない。
【００１３】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する単数形の「１つの」「および」および「その」は、その内容が明白にそうでないことを指示していない限り、複数の対象を含むことに留意しなければならない。そこで、例えば「１つの因子」との言及は複数のそのような因子を含んでおり、そして「ＧＰＣＲ」との言及は１つ以上のＧＰＣＲおよび当業者には公知のそれらの同等物についての言及を含んでいる、などである。さらに、特許請求の範囲は任意の必要に応じた要素を排除するように起草できることも留意されたい。したがって、この陳述は「単独で」、「〜だけ」などの排他的な用語を請求項の構成要件の記載と、または「否定的」制限の使用と結び付けて使用するための記述の根拠として機能することが企図されている。
【００１４】
「Ｇタンパク質共役受容体」もしくは「ＧＰＣＲ」は、共通の構造モチーフを共有し、各々が１枚の膜にわたっている７つのαヘリックスを形成する２２〜２４の間の疎水性アミノ酸の７つの領域を有するポリペプチドである［各範囲は、番号、すなわち膜貫通−１（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ−１；ＴＭ１）、膜貫通−２（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ−２；ＴＭ２）などによって同定される］。膜貫通ヘリックスは、細胞膜の外側、すなわち「細胞外」側で膜貫通−２と膜貫通−３（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ−３）との間、膜貫通−４（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ−４）と膜貫通−５（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ−５）との間、および膜貫通−６（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ−６）と膜貫通−７（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ−７）との間のアミノ酸の領域によって連結されている［これらは、各々「細胞外」領域１、２および３（ＥＣ１、ＥＣ２およびＥＣ３）と呼ばれている］。膜貫通ヘリックスは、さらにまた細胞膜の内側、すなわち「細胞内」側で膜貫通−１と膜貫通−２との間、膜貫通−３と膜貫通−４との間、および膜貫通−５と膜貫通−６との間のアミノ酸の領域によって連結されている［これらは、各々「細胞内」領域１、２および３（ＩＣ１、ＩＣ２およびＩＣ３）と呼ばれている］。この受容体の「カルボキシ」（「Ｃ」）末端は細胞内の細胞内空間中に存在し、そしてこの受容体の「アミノ」（「Ｎ」）末端は細胞外の細胞外空間中に存在する。ＧＰＣＲの構造および分類は当技術分野において一般によく知られており、ＧＰＣＲについてのさらなる考察はＰｒｏｂｓｔ， ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １９９２ １１：１−２０；Ｍａｒｃｈｅｓｅ ｅｔ ａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２３：６０９−６１８，１９９４；ならびに以下の書籍：Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓによって出版されたＪｕｅｒｇｅｎ Ｗｅｓｓ（Ｅｄ） Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ（１ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｏｃｔｏｂｅｒ １５， １９９９）；Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓによって出版されたＫｅｖｉｎ Ｒ． Ｌｙｎｃｈ（Ｅｄ） Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ（Ｍａｒｃｈ １９９８）およびＣＲＣ Ｐｒｅｓｓによって出版されたＴａｔｓｕｙａ Ｈａｇａ（Ｅｄ）， Ｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２４， １９９９）；そしてＡｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓによって出版されたＳｔｅｖｅ Ｗａｔｓｏｎ（Ｅｄ） Ｇ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｎｋｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｆａｃｔｓｂｏｏｋ（１ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ；１９９４）の中に見いだすことができる。
【００１５】
「天然ＧＰＣＲ」（ｎａｔｉｖｅ ＧＰＣＲ）は、動物、例えばヒトもしくはマウスなどの哺乳動物によって産生されるＧＰＣＲである。天然ＧＰＣＲの詳細な説明は、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のワールドワイドウェブサイトで見いだされるＯｎ−ｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ ｄａｔａｂａｓｅ（ヒトにおけるメンデル性遺伝についてのオンラインデータベース）の中に見いだすことができる。天然ＧＰＣＲについての追加の説明は、ｐｒｉｍａｌｉｎｃ．ｃｏｍのワールドワイドウェブサイトおよび表１に記載した本方法において使用するための代表的ＧＰＣＲのリストに見いだすことができる。
【００１６】
用語「リガンド」は、ＧＰＣＲへ特異的に結合する分子を意味する。リガンドは、例えばポリペプチド、脂質、小分子または抗体などであってよい。「天然リガンド」（ｎａｔｉｖｅ ｌｉｇａｎｄ）は、天然ＧＰＣＲのための内因性の天然リガンドである。リガンドは、ＧＰＣＲ「アンタゴニスト」、「アゴニスト」、「部分アゴニスト」または「インバースアゴニスト」（ｉｎｖｅｒｓｅ ａｇｏｎｉｓｔ）などであってよい。
【００１７】
「調節因子」は、それが細胞中で発現するＧＰＣＲと接触した、例えば結合した場合にＧＰＣＲ細胞内応答を増加もしくは減少させるリガンドである。
【００１８】
用語「第２メッセンジャー」は、受容体活性化の結果として産生される細胞内応答を意味するものとする。第２メッセンジャーは、例えばイノシトール１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）、環状ＧＭＰ（ｃＧＭＰ）およびＣａ２＋を含むことができる。第２メッセンジャー応答を測定すると、受容体活性化を決定できる。さらに、第２メッセンジャー応答を測定すると、候補因子、例えばアゴニスト、部分アゴニスト、インバースアゴニスト、およびアンタゴニストを同定できる。
【００１９】
「アゴニスト」は、それがＧＰＣＲに結合するとＧＰＣＲ細胞内応答を活性化するリガンドである。
【００２０】
「部分アゴニスト」は、それがＧＰＣＲに結合すると、アゴニストより低い程度まで、ＧＰＣＲ細胞内応答を活性化するリガンドである。
【００２１】
「アンタゴニスト」は、アゴニストと同一部位でＧＰＣＲへ競合的に結合するが、ＧＰＣＲの活性形によって産生される細胞内応答を活性化しないリガンドである。アンタゴニストは、アゴニストもしくは部分アゴニストによる細胞内応答を通常は阻害する。アンタゴニストは、通常はアゴニストもしくは部分アゴニストの不在下ではベースライン細胞内応答を減少させない。
【００２２】
「インバースアゴニスト」は、ＧＰＣＲに結合し、アゴニストもしくは部分アゴニストの不在下で観察されたＧＰＣＲのベースライン（基底）細胞内応答を阻害するリガンドである。大多数の実施形態では、ベースライン細胞内応答はインバースアゴニストの存在下では、インバースアゴニストの不在下でのベースライン応答に比較して、少なくとも約３０％、少なくとも約５０％、もしくは少なくとも約７５％阻害される。
【００２３】
用語「臭気物質」は、嗅覚ＧＰＣＲを活性化する、既知または未知の構造の天然型もしくは化学合成された任意の化合物を含んでいる。上記の背景のセクションにおいて考察したように、臭気物質は、通常は揮発性の、４００Ｄａ未満の小有機分子である。香味料、香水、芳香、臭気、芳香剤は臭気物質のタイプである。「ニオイ」は、特定臭気物質に結び付いた感覚である。
【００２４】
本明細書で使用する用語「嗅覚ＧＰＣＲ活性に結び付いた現象」は、嗅覚ＧＰＣＲ活性に結び付いた、特にヒトもしくは動物モデルにおいて容易に評価できる特徴などの構造的、分子的、または機能的特徴をいう。そのような特徴には、ＧＰＣＲの活性化によって誘導された下流分子事象、およびニオイ、味、またはＧＰＣＲの活性化によって誘導されたその他の挙動的もしくは生理的事象などの感覚現象が含まれるが、それらに限定されない。
【００２５】
「欠失」は、親ＧＰＣＲポリペプチドもしくは核酸のアミノ酸配列もしくはヌクレオチド配列に比較してその中で１つ以上のアミノ酸もしくはヌクレオチド残基が各々欠如している、アミノ酸もしくはヌクレオチドのいずれかの配列における変化であると規定されている。ＧＰＣＲまたはそのフラグメントの状況においては、欠失は、約２個、約５個、約１０個、約２０個まで、約３０個までもしくは約５０個まで、またはそれ以上のアミノ酸の欠失を含んでいてよい。ＧＰＣＲもしくはそのフラグメントは１より多くの欠失を含有していてよい。
【００２６】
「挿入」もしくは「付加」は、親ＧＰＣＲのアミノ酸配列もしくはヌクレオチド配列に比較して、各々１つ以上のアミノ酸もしくはヌクレオチド残基の付加を生じさせている、アミノ酸もしくはヌクレオチド配列における変化である。「挿入」は、一般にポリペプチドのアミノ酸配列内の１つ以上のアミノ酸残基への付加をいうが、「付加」は挿入であってよい、またはＮ末端もしくはＣ末端、または両端で付加されたアミノ酸残基をいう。ＧＰＣＲまたはそのフラグメントの状況においては、挿入もしくは付加は、通常、約１個、約３個、約５個、約１０個、約２０個まで、約３０個まで、もしくは約５０個まで、またはそれ以上のアミノ酸の挿入もしくは付加である。ＧＰＣＲもしくはそのフラグメントは１より多くの挿入を含有していてよい。
【００２７】
「置換」は、各々親ＧＰＣＲもしくはそのフラグメントのアミノ酸配列もしくはヌクレオチド配列と比較して、相違するアミノ酸もしくはヌクレオチドによる１つ以上のアミノ酸もしくはヌクレオチドの置換の結果として生じる。ＧＰＣＲもしくはそのフラグメントは、ＧＰＣＲ活性へ実質的に作用を及ぼさない保存的アミノ酸置換を有する可能性があることは理解されている。保存的置換は、ｇｌｙ、ａｌａ；ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ；ａｓｐ、ｇｌｕ；ａｓｎ、ｇｌｎ；ｓｅｒ、ｔｈｒ；ｌｙｓ、ａｒｇ；およびｐｈｅ、ｔｙｒなどの組み合わせが企図されている。
【００２８】
用語「生物活性」ＧＰＣＲは、天然に存在するＧＰＣＲの構造的および生化学的機能を有するＧＰＣＲをいう。
【００２９】
本明細書で使用する用語「決定する工程」、「測定する工程」、「評価する工程」、および「アッセイする工程」は交換可能に使用され、定量的および定性的決定の両方を含んでいる。これらの状況におけるＧＰＣＲの「量」についての言及が定量的評価を必要とすることは意図されておらず、そして他に具体的に指示されない限り、定性的または定量的のいずれであってもよい。
【００３０】
本明細書で交換可能に使用される用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、任意の長さの高分子形のアミノ酸をいい、コードされたアミノ酸およびコードされたものではないアミノ酸、化学的もしくは生化学的に修飾もしくは誘導体化されたアミノ酸、ならびに修飾ペプチド主鎖を有するポリペプチドを含むことができる。この用語には、Ｎ末端メチオニン残基を備える、もしくは備えない、異種および同種リーダー配列との融合体である異種アミノ酸配列を備える融合タンパク質；免疫学的にタグ付けされたタンパク質；融合パートナーとして例えば蛍光タンパク質、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなどを含む融合タンパク質のような検出可能な融合パートナーを備える融合タンパク質などを含むがそれらに限定されない融合タンパク質が含まれる。
【００３１】
用語「核酸分子」および「ポリヌクレオチド」は交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはそれらのアナログのいずれかである、任意の長さの高分子形のヌクレオチドをいう。ポリヌクレオチドは任意の三次元構造を有していてよく、既知または未知の任意の機能を実行することができる。ポリヌクレオチドの非限定的例には、遺伝子、遺伝子フラグメント、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、制御領域、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマーが含まれる。核酸分子は、直鎖状であっても環状であってもよい。
【００３２】
本明細書で使用する用語「単離（された）」は、単離化合物の状況において使用する場合は、その中で化合物が自然に発生する環境とは相違する環境内にある目的の化合物をいう。「単離（された）」は、目的の化合物が実質的に富化されている、および／または目的の化合物が部分的もしくは実質的に精製されているサンプル内にある化合物を含むことが意図されている。
【００３３】
本明細書で使用する用語「実質的に純粋」は、その天然環境から取り出されており、自然にはそれに結び付いている他の成分を少なくとも６０％含まない、好ましくは７５％含まない、および最も好ましくは９０％含まない化合物をいう。
【００３４】
「コーディング配列」もしくは選択されたポリペプチドを「コードする」配列は、例えば適切な調節配列（もしくは「制御エレメント」の制御下に置かれたときに、宿主細胞中で（ＤＮＡの場合は）転写することができることおよび（ｍＲＮＡの場合は）ポリペプチドへ翻訳することのできる核酸分子である。コーディング配列の境界は、典型的には５’（アミノ）末端にある開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端にある翻訳停止コドンによって決定される。コーディング配列には、ウイルス由来ｃＤＮＡ、原核細胞もしくは真核細胞ｍＲＮＡ、ウイルスもしくは原核細胞ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列を含むことができるが、それらに限定されない。転写終結配列はコーディング配列に対して３’に位置していてよい。その他の「制御エレメント」はさらにまたコーディング配列と結び付いていてもよい。ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、所望のポリペプチドコーディング配列のＤＮＡコピーを表すために選択された細胞にとって好ましいコドンを使用することによって選択された細胞内での発現に最適化することができる。
【００３５】
「によってコードされた」は、ポリペプチド配列をコードする核酸配列をいい、このときポリペプチド配列もしくはその一部分は、核酸配列によってコードされたポリペプチドから少なくとも３〜５アミノ酸、より好ましくは少なくとも８〜１０アミノ酸、およびいっそうより好ましくは少なくとも１５〜２０アミノ酸の配列を含有している。さらに、その配列によってコードされたポリペプチドを用いて免疫学的に同定可能なポリペプチド配列も含まれる。
【００３６】
「作動可能に連結した」は、そのように記載された構成成分がそれらの通常の機能を実行できるように構成されているエレメントの配置をいう。コーディング配列へ作動可能に連結したプロモーターは、コーディング配列の発現を達成するであろう。プロモーターもしくはその他の制御エレメントは、それらがそれらの発現を指令するように機能する限り、コーディング配列と隣接している必要はない。例えば、介在する翻訳されないが転写される配列がプロモーター配列とコーディング配列との間に存在していてよく、プロモーター配列はそれでもまだコーディング配列と「作動可能に連結した」と見なすことができる。
【００３７】
「核酸構築物」は、自然には一緒に見いだされない１つ以上の機能的ユニットを含むように構築されている核酸配列を意味する。例には、環状、直鎖状、二本鎖、染色体外ＤＮＡ分子（プラスミド）、コスミド（ラムダファージ由来のＣＯＳ配列を含有するプラスミド）、非天然核酸配列を含むウイルスゲノムなどが含まれる。
【００３８】
「ベクター」は、遺伝子配列を宿主細胞へ移すことができる。典型的には、「ベクター構築物」、「発現ベクター」および「遺伝子移入ベクター」は目的の遺伝子の発現を指令できる、そしてベクターの全部もしくは一部分のゲノム組込み、または染色体外エレメントとしてのベクターの一過性もしくは遺伝性維持によって達成できる、遺伝子配列を宿主細胞へ移入できる任意の核酸構築物を意味している。そこで、この用語は、クローニングおよび発現ビヒクルならびに組込み型ベクターを含んでいる。
【００３９】
「発現カセット」は、発現カセットのプロモーターへ作動可能に連結した、目的の遺伝子／コーディング配列の発現を指令できる任意の核酸構築物を含んでいる。そのようなカセットは、宿主細胞中へ発現カセットを移入するために、「ベクター」、「ベクター構築物」、「発現ベクター」、もしくは「遺伝子移入ベクター」内へ構築することができる。そこで、この用語は、クローニングおよび発現ビヒクルならびにウイルスベクターを含んでいる。
【００４０】
第１ポリヌクレオチドは、それが第２ポリヌクレオチド、そのｃＤＮＡ、それらの相補体の１領域と同一もしくは実質的に同一のヌクレオチド配列を有する場合、またはそれが上述した配列同一性を表示する場合は、第２ポリヌクレオチドに「由来する」または「対応する」。
【００４１】
第１ポリペプチドは、それが（ｉ）第２ポリヌクレオチドに由来する第１ポリヌクレオチドによってコードされるかまたは（ｉｉ）上述したように第２ポリペプチドに対する配列同一性を表示する場合は、第２ポリペプチドに「由来する」、または「対応する」。
【００４２】
用語「投与する工程」などは、所望の薬理学的および／または生理学的作用を入手するためにＧＰＣＲ調節因子を添加する工程をいう。多数の実施形態では、本ＧＰＣＲ調節因子は揮発性であり、したがってそれらは食材または大気への添加によって直接的もしくは間接的のいずれかで、経口もしくは鼻腔内投与される。この作用は臭気の知覚を完全もしくは部分的に防止することができる、臭気物質の知覚を増加させることができる、または新しい臭気を発生させることができる。
【００４３】
用語「天然に存在しない」もしくは「組換え」は、人工的もしくはさもなければ天然では見いだされないことを意味する。組換え細胞は通常はその細胞内で見いだされない核酸を含有しており、組換え核酸は通常は自然では見いだされない２つ以上の核酸の融合体を含有しており、そして組換えポリペプチドは通常は組換え核酸によって産生される。
【００４４】
「被験体」、「個体」、「宿主」および「患者」は、本明細書では交換可能に使用され、嗅覚ＧＰＣＲを有する任意の動物、例えば哺乳動物、ヒトもしくは非ヒトをいう。一般に、被験体は哺乳動物被験体である。代表的な被験体には、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、およびウマを含むが必ずしもそれらに限定されず、特に関心対象となるのはヒトである。
【００４５】
（発明の詳細な説明）
本発明は、細胞中で嗅覚ＧＰＣＲを産生するための方法を提供する。一般に、本方法は、嗅覚ＧＰＣＲをコードする核酸へ作動可能に連結したプロモーターを含有する発現カセットを大グリア細胞、例えばシュヴァン細胞もしくは希突起膠細胞中へ導入する工程と、および嗅覚ＧＰＣＲを産生するために適切な条件下で前記細胞を維持する工程と、を含んでいる。さらに、嗅覚ＧＰＣＲをコードする組換え核酸を含有する大グリア細胞、嗅覚ＧＰＣＲ活性の調節因子についてスクリーニングする方法、および大グリア細胞中で嗅覚ＧＰＣＲを産生するためのキットも提供される。本発明は、例えば香味料および芳香剤の分析および同定において利用されるので、その結果として多種多様な研究および産業上の用途を有する。
【００４６】
要約のセクションに提供するより、そして上述した背景技術および用語の定義によって提供したよりもはるかに詳細に本発明を説明する際に、嗅覚ＧＰＣＲを産生する方法について最初に記載し、次に本発明の方法を実施する際に利用する組成物およびキットの説明を続ける。最後に、嗅覚ＧＰＣＲ活性の調節因子をスクリーニングする方法および臭気物質ミメティックをスクリーニングする方法について考察する。
【００４７】
（嗅覚ＧＰＣＲを産生するための方法）
１つの局面では、本発明は、細胞中で嗅覚ＧＰＣＲを産生する方法を提供する。これらの方法を記載する際に、本方法において使用するための組成物を最初に記載しよう。
【００４８】
（嗅覚Ｇタンパク質共役受容体）
用語「嗅覚Ｇタンパク質共役受容体」（もしくはその略語、例えば「嗅覚ＧＰＣＲ」）は、化学的感覚に含まれるＧＰＣＲスーパーファミリーの系統発生的に別個の当技術分野において認識されたサブファミリーの任意のメンバーをいう。嗅覚ＧＰＣＲは、それらの全体が本明細書に特別に援用されるＺｏｚｕｌｙａ ｅｔ ａｌ， （Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ． ２：００１８， ２００１）；Ｇｌｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ， （Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． １１：６８５−７０２， ２００１）およびＣｒａｓｔｏ ｅｔ ａｌ， （Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３０：３５４−６０， ２００２）を含む、極めて多種多様な出版物および公共データベース内で一般的および詳細に開示されている。特に、Ｓｅｎｓｅｌａｂ．ｍｅｄ．ｙａｌｅ．ｅｄｕのワールドワイドウェブサイトで見いだされる嗅覚ＧＰＣＲ配列のデータバース内で記載された嗅覚ＧＰＣＲが関心の対象である。本方法において使用するために適切な代表的な嗅覚ＧＰＣＲの非限定的リストは、特許請求の範囲の前に挿入した表１に提供した。表１は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのワールドワイドウェブサイトで見いだされるような、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベースからのタンパク質配列登録のアクセッション番号のリストである。表１に列挙したこれらのデータベース登録、特にそれらの登録に記載されたアミノ酸配列は、それらの全体が参考として本明細書に特別に援用される。
【００４９】
嗅覚ＧＰＣＲはヒト起源もしくは非ヒト動物起源のものであってよいことは明示的に企図されている。特定の実施形態では、非ヒト動物は、マウス、ラット、イヌ、またはニオイの識別的な鋭い感覚を備える任意の他の非ヒト動物であってよい。特定の実施形態では、嗅覚ＧＰＣＲは昆虫（例、カ、アリ、アブラムシ、カブトムシ、ハエ、スズメバチ、ミツバチ、クモ、あるいはヒトもしくは非ヒト動物へ疾患を伝播する、または農作物もしくは観賞用植物に対する損害を引き起こす任意の昆虫）起源のものであってよい。特定の実施形態では、嗅覚ＧＰＣＲはヒトのものである。
【００５０】
本方法では天然ＧＰＣＲおよび変更された天然嗅覚ＧＰＣＲの両方を使用できることが認識されている。したがって、用語「嗅覚Ｇタンパク質共役受容体」は、さらにまたそれが対応する天然ＧＰＣＲと同一リガンドに結合するように、変化した天然嗅覚ＧＰＣＲ（例、レポーターの付加などの付加、置換、欠失および挿入などによって変化した天然嗅覚ＧＰＣＲ）を含むことも企図されている。
【００５１】
このため用語「嗅覚Ｇタンパク質共役受容体」は、表１に列挙したＧＰＣＲポリペプチドの変異体を含んでいる。言い換えると、本方法では任意の嗅覚ＧＰＣＲの変異体を使用できる。このため特定の実施形態では、嗅覚ＧＰＣＲは天然配列（例、ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋデータベースなどに寄託された配列など）に比較して変化した配列を有していてよい。例えば、嗅覚ＧＰＣＲは、ポリペプチド内の任意の位置（例、Ｃ末端もしくはＮ末端、または内部位置）での任意の数のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有する天然ポリペプチドであってよい。
【００５２】
特定の実施形態では、嗅覚ＧＰＣＲは融合タンパク質であり、例えば親和性タグドメインもしくはレポータードメインを含有していてよい。適切な親和性タグには、他の部分、通常は他のポリペプチド、最も一般的には抗体へ特異的に結合することのできる任意のアミノ酸配列が含まれる。適切な親和性タグには、当技術分野において公知のように、エピトープタグ、例えば、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ（ヘマグルチニンインフルエンザウイルス由来）、ｍｙｃタグなどが含まれる。適切な親和性タグには、さらに当技術分野において公知のように、それらに対する結合基質、例えばＨＩＳ、ＧＳＴおよびＭＢＰタグが既知のドメイン、ならびにそれらに対する特異的結合パートナー、例えば抗体、詳細にはモノクローナル抗体を利用できる他のタンパク質由来のドメインが含まれる。適切な親和性タグには、さらに特異的に結合して適切な結合パートナー、例えばＩｇＧ Ｆｃ受容体を用いて検出できるＩｇＧ Ｆｃ領域などの任意のタンパク質−タンパク質相互作用ドメインが含まれる。そのような融合タンパク質が、Ｎ末端メチオニン残基が欠失しているかもしくは代替アミノ酸と置換されているＧＰＣＲとインフレームで融合された異種Ｎ末端ドメイン（例、エピトープタグ）を含有していてよいことは明示的に企図されている。特定の実施形態では、嗅覚ＧＰＣＲ融合タンパク質はそのＮ末端で、単独もしくはヘマグルチニンエピトープタグと組み合わせてロドプシンシグナルペプチドを含んでいてよい。特定の実施形態では、嗅覚ＧＰＣＲ融合タンパク質はアミノ酸配列ＭＮＧＴＥＧＰＮＦＹＶＰＦＳＮＫＴＧＶＶＹＰＹＤＶＰＤＹＡＫＬを有するＮ末端を含んでいてよいが、このときＭＮＧＴＥＧＰＮＦＹＶＰＦＳＮＫＴＧＶＶはロドプシンシグナルペプチドであり、ＹＰＹＤＶＰＤＹＡＫＬはヘマグルチニンエピトープタグである。融合タンパク質としての嗅覚ＧＰＣＲの発現を可能にする発現カセットを構築することは当業者の技術の範囲内に明確に含まれる（例えば、Ｋｒａｕｔｗｕｒｓｔ ｅｔ ａｌ， Ｃｅｌｌ ９５：９１７−９２６， １９９８を参照されたい）。目的のポリペプチドは最初に天然ポリペプチドから作製して、次に上述したとおり適切なレポーター／タグへ作動可能に連結させることができることは理解されている。他の実施形態では、嗅覚ＧＰＣＲはＧＰＣＲのフラグメントであってよく、このとき前記ＧＰＣＲフラグメントは生物活性である。
【００５３】
適切なレポータードメインには、ポリペプチドの存在を報告できる任意のドメインが含まれる。親和性タグを使用して例えばタグへ特異的に結合する標識抗体を用いてポリペプチドの存在を報告できることは認識されているが、発光レポータードメインはより日常的に使用される。適切な発光レポータードメインには、ルシフェラーゼ（例えば、ホタル、ウミホタル（Ｖａｒｇｕｌａ）、Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓもしくはＲｅｎｉｌｌａ ｍｕｅｌｌｅｒｉ由来）、およびそれらの発光改変体が含まれる。その他の適切なレポータードメインには、蛍光タンパク質（例えば、クラゲ、サンゴならびにＡｅｑｕｏｒｉａ種、Ｒｅｎｉｌｌａ種、Ｐｔｉｌｏｓａｒｃｕｓ種、Ｓｔｙｌａｔｕｌａ種などの他の腔腸動物由来）、またはそれらの発光改変体が含まれる。これらのレポータータンパク質の発光改変体は当技術分野において極めてよく知られており、天然レポータータンパク質に比較して、より明るい、より薄暗い場合がある、または相違する励起および／または発光スペクトルを有することがある。例えば、一部の改変体は、それらがもはや緑色に見えないように変化させられている、そして当技術分野において公知のように、ブルー、シアン、イエロー、強化イエロー、レッド（各々、ＢＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ｅＹＦＰおよびＲＦＰと名付ける）に見える、または他の発光スペクトルを有していることがある。他の適切なレポータードメインには、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、および分泌された胚アルカリホスファターゼなどの生化学的変化もしくは変色を通してポリペプチドの存在を報告できるドメインが含まれる。一部の実施形態では、レポータードメインはＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ（例、ｐＲＬＣＭＶ；Ｐｒｏｍｅｇａ社製、カタログ番号Ｅ２６６１）である。
【００５４】
さらに、当技術分野において公知のように、親和性タグもしくはレポータードメインは、嗅覚ＧＰＣＲ内の任意の位置に存在していてよい。しかし、大多数の実施形態では、それらは嗅覚ＧＰＣＲのＣ末端もしくはＮ末端に存在している。
【００５５】
多数の実施形態では、嗅覚ＧＰＣＲは嗅覚ＧＰＣＲのライブラリーのメンバーである。典型的には、ライブラリーは複数のメンバーを含有するが、このとき複数は２以上、５以上、約１０以上、約２０以上、約５０以上、約１００以上、約２００以上、約３００以上、約５００以上、約１，０００以上、または約１０，０００以上まででさえあってよい。このためライブラリーは、約５、約１０、約２０、約３０以上、約５０以上、約１００以上、約２００以上、通常は約５００以上まで、通常は約１，０００以上までの嗅覚ＧＰＣＲポリペプチドを含有していてよい。ライブラリーのメンバーは、正体が既知のもの、もしくは正体が知られていないもの、またはそれらの混合物であってよい。ライブラリーのメンバーは完全に１つの種由来であってよい、または複数の種由来であってよい。
【００５６】
（嗅覚Ｇタンパク質共役受容体をコードする核酸）
核酸を操作するための遺伝子コードおよび組換え技術は知られており、そして嗅覚ＧＰＣＲポリペプチドのアミノ酸配列は上述したので、嗅覚ＧＰＣＲポリペプチドをコードする核酸の設計および産生は当業者の技術の範囲内に明白に含まれている。特定の実施形態では、標準組換えＤＮＡテクノロジー（Ａｕｓｕｂｅｌ， ｅｔ ａｌ， Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ３ｒｄ ｅｄ．， Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， １９９５；Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｔｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， （１９８９） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．）法が使用される。例えば、嗅覚ＧＰＣＲコーディング配列は、本明細書において詳細に記載する必要のない多種多様な組み換え方法の１つもしくは組み合わせを用いてライブラリーの嗅覚ＧＰＣＲコーディング配列から単離することができる。タンパク質をコードする核酸配列中でのヌクレオチドの引き続いての置換、欠失、および／または付加は、さらにまた標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて実施することもできる。
【００５７】
例えば、部位特異的変異誘発およびサブクローニングを使用すると、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド中の核酸残基を導入する／欠失させる／置換することができる。他の実施形態では、ＰＣＲを使用できる。目的のポリペプチドをコードする核酸は、さらにまたオリゴヌクレオチドから完全に化学合成によって作製することもできる（例、Ｃｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ （２００２） ２９７：１０１６−８）。
【００５８】
特定の実施形態では、目的のポリペプチドをコードする核酸のコドンは、特定種、詳細には哺乳動物、例えばヒトもしくはマウス種の細胞中で発現させるために最適化される。
【００５９】
本発明は、さらに本核酸を含むベクター（さらに「構築物」とも呼ばれる）を提供する。本発明の多数の実施形態では、本核酸配列は、配列が例えば発現カセットを形成するためのプロモーターを含む発現制御配列へ作動可能に連結した後に宿主内で発現されるであろう。本発現カセットは、典型的には宿主染色体ＤＮＡのエピソームまたは一体部分のいずれかとして宿主細胞中で複製できる発現ベクター内に配置される。一般に、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列を用いて形質転換されたそれらの細胞の検出を許容するために、選択マーカー、例えばテトラサイクリンもしくはネオマイシンを含有するであろう（例えば、参照して本明細書に組み込まれる米国特許第４，７０４，３６２号を参照されたい）。単一および二重発現カセットを含むベクターは当技術分野においてよく公知の（Ａｕｓｕｂｅｌ， ｅｔ ａｌ， Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ３ｒｄ ｅｄ．， Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， １９９５；Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｔｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， （１９８９） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．）。適切なベクターには、ウイルスベクター、プラスミド、コスミド、人工染色体（ヒト人工染色体、細菌人工染色体、酵母人工染色体など）、ミニ染色体などが含まれる。レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスベクターが使用されてよい。
【００６０】
細胞中での目的のポリペプチドを産生するために、当業者は様々な発現ベクターを利用できる。１つの適切なベクターは、特定の実施形態において使用されるｐＣＭＶである。このベクターは、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定下で１９９８年１０月１３日にアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ、２０１１０−２２０９米国バージニア州マナッサス）へ寄託された。このＤＮＡは、ＡＴＣＣによって試験され、生存可能であると決定された。このＡＴＣＣは、ｐＣＭＶに次の寄託番号：ＡＴＣＣ番号２０３３５１を指定した。
【００６１】
本発現カセットは通常、嗅覚ＧＰＣＲをコードする単一オープンリーディングフレームを含んでいるが、しかし特定の実施形態では、嗅覚ＧＰＣＲを発現させるための宿主細胞が真核細胞、例えばヒト細胞などの哺乳動物細胞である可能性があるので、オープンリーディングフレームはイントロンによって中断されることがある。本発現カセットは、典型的には本核酸に加えて、ＲＮＡ安定性、翻訳効率などを指令することのできる３’および５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含有していてよい転写単位の一部である。発現カセットは、さらにまた本核酸に加えて転写ターミネーターを含有する核酸の一部であってもよい。
【００６２】
本発現カセットは、嗅覚ＧＰＣＲを融合タンパク質として発現させることのできる核酸配列を含んでいてよい。特定の実施形態では、嗅覚ＧＰＣＲ融合タンパク質はそのＮ末端で、ロドプシンシグナルペプチドおよび／またはヘマグルチニンエピトープタグを含んでいてよい。特定の実施形態では、嗅覚ＧＰＣＲ融合タンパク質はアミノ酸配列ＭＮＧＴＥＧＰＮＦＹＶＰＦＳＮＫＴＧＶＶＹＰＹＤＶＰＤＹＡＫＬを有するＮ末端を含んでいてよいが、このときＭＮＧＴＥＧＰＮＦＹＶＰＦＳＮＫＴＧＶＶはロドプシンシグナルペプチドであり、ＹＰＹＤＶＰＤＹＡＫＬはヘマグルチニンエピトープタグである。融合タンパク質としての嗅覚ＧＰＣＲの発現を可能にする発現カセットを構築することは当業者の技術の範囲内に明確に含まれる（例えば、Ｋｒａｕｔｗｕｒｓｔ ｅｔ ａｌ， Ｃｅｌｌ
９５：９１７−９２６， １９９８を参照されたい）。
【００６３】
真核細胞プロモーター（すなわち、真核細胞中で機能するプロモーター）は、ウイルスプロモーターおよび真核細胞遺伝子由来プロモーターを含む、大グリア細胞中で機能性である任意のプロモーターであってよい。代表的な真核細胞プロモーターには、次の：マウスメタロチオネインＩ遺伝子配列のプロモーター（Ｈａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎ． １：２７３−２８８， １９８２）；ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ， Ｃｅｌｌ ３１：３５５−３６５， １９８２）；ＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ （Ｌｏｎｄｏｎ） ２９０：３０４−３１０， １９８１）；酵母ｇａｌｌ遺伝子配列プロモーター（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ． （ＵＳＡ） ７９：６９７１−６９７５， １９８２；Ｓｉｌｖｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （ＵＳＡ）８１：５９５１−５９ＳＳ， １９８４）、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ−１プロモーター、エクジソン応答性プロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーターなどが含まれるが、それらに限定されない。ウイルスプロモーターは、それらは一般に特別に強力なプロモーターであるので、特に関心対象となることがある。特定の実施形態では、ウイルスプロモーターであるプロモーターが使用される。本発明において使用するためのプロモーターは、それらがその中に導入されている大グリア細胞（および／または動物）中で機能性であるように選択される。特定の実施形態では、プロモーターはＣＭＶプロモーターである。
【００６４】
特定の実施形態では、本ベクターはさらにまた選択可能なマーカーの発現も提供できる。適切なベクターおよび選択可能なマーカーは当技術分野においてよく知られており、Ａｕｓｕｂｅｌ， ｅｔ ａｌ （Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ３ｒｄ ｅｄ．， Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， １９９５）およびＳａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ， （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｔｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， （２００１） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．）の中で考察されている。多種多様な遺伝子が選択可能なマーカーとして使用されてきており、選択可能なマーカーとして本ベクター内で使用される特定遺伝子は主として便宜上選択されている。既知の選択可能なマーカー遺伝子には：チミジンキナーゼ遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＣＡＤ、アデノシンデアミナーゼ遺伝子、アスパラギンシンテターゼ遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、例えばｔｅｔｒ、ａｍｐｒ、Ｃｍｒまたはｃａｔ、ｋａｎｒもしくはｎｅｏｒ（アミノ配糖体ホスホトランスフェラーゼ遺伝子）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子などが含まれる。
【００６５】
上述したように、嗅覚ＧＰＣＲは、親和性ドメインおよび／またはレポータードメインを含有する融合タンパク質であってよい。例えばＧＰＣＲのＣ末端もしくはＮ末端で、レポーターもしくはタグとＧＰＣＲとの間の融合体を作製するための方法は、当業者の技術の範囲内に明確に含まれているので（例、ＭｃＬｅａｎ ｅｔ ａｌ， Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍａ． Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １９９９ ５６：１１８２−９１；Ｒａｍｓａｙ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ， ２００１， ３１５−３２３）、これ以上は説明しない。そのような融合タンパク質が、Ｎ末端メチオニン残基が欠失しているかもしくは代替アミノ酸と置換されているＧＰＣＲとインフレームで融合された異種Ｎ末端ドメイン（例、エピトープタグ）を含有していてよいことは明示的に企図されている。目的のポリペプチドは最初に天然ポリペプチドから作製して、次に上述した適切なレポーター／タグへ作動可能に連結させることができることは理解されている。
【００６６】
本核酸は、さらにまた通例は嗅覚ＧＰＣＲをコードする核酸の構築を促進するために、制限部位、多重クローニング部位、プライマー結合部位、ライゲーション可能な末端、組換え部位なども含有していてよい。
【００６７】
嗅覚ＧＰＣＲは目的のポリペプチドのライブラリーのメンバーであってよいので、そのような目的のポリペプチドをコードする核酸は、類似サイズの嗅覚ＧＰＣＲをコードする核酸のライブラリーであってもよい。
【００６８】
（宿主細胞）
本明細書に記載した方法は、一般に培養大グリア細胞（すなわち、インビトロで培養された初代もしくは不死大グリア細胞）中で嗅覚ＧＰＣＲを産生する工程を含んでいる。「大グリア細胞」は、シュヴァン細胞、希突起膠細胞および星状細胞ならびにそれらの誘導体を含む、様々なニューロン関連細胞タイプの任意の細胞を意味する。多数の実施形態では、適切な宿主細胞は、神経軸索の鞘を形成する物質であるミエリンを産生する「ミエリン産生」細胞であってよい。ミエリン産生大グリア細胞には、シュヴァン細胞、希突起膠細胞、ならびにミエリンを産生する所定タイプの星状細胞（例、嗅神経鞘細胞（ｏｌｆａｃｔｏｒｙ ｓｈｅａｔｈｉｎｇ ｃｅｌｌ））が含まれる。ミエリン産生細胞は、通常は、それらがミエリンの構成要素であるガラクトセレブロシド、ｇａｌＣを合成することによって同定できる。
【００６９】
用語「大グリア細胞」には、さらにまた癌性大グリア細胞、例えば神経鞘腫、神経線維腫、星状細胞腫細胞、および希突起膠細胞腫；不死性大グリア細胞、例えばＨＰＶ Ｅ６−Ｅ７、Ｔ抗原などの適切な腫瘍遺伝子の導入によって不死化された細胞など；大グリア細胞が相違する（非大グリア細胞）もしくは同様の（大グリア細胞）タイプの細胞と融合される細胞融合によって産生されたハイブリッド細胞；ならびに例えば外因性核酸を含有している細胞のような組換え大グリア細胞、または例えばミエリンの合成のために必要とされる遺伝子もしくはミエリンの合成を阻害する遺伝子などの内因性遺伝子内での「ノックアウト」を含む大グリア細胞の改変バージョンが含まれる。大グリア細胞は、通例は齧歯類（例、マウス）もしくはヒトなどの哺乳動物種由来である。代表的な非限定的細胞系には、ＲＮ２およびＥＪ（Ｃｏｕｌｔｅｒ−Ｍａｃｋｉｅ， Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １：４７７−４８７， １９８４）、ＲＮ２２（Ｋｒｅｉｄｅｒ， Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３９７：２３８−２４４， １９８６）、ならびにＨＯＧおよびＭＯ３．１３（Ｂｕｎｔｉｎｘ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｃｙｔｏｌｏｇｙ ３２：２５−３８， ２００３）が含まれる。嗅覚ＧＰＣＲ以外についての大グリア細胞組換え体は、用語「大グリア細胞」に含まれることが明示的に企図されている。
【００７０】
したがって、大グリア細胞を培養する方法は当技術分野においてよく知られているので（例えば、Ｍｏｓａｈｅｂｉ Ｇｌｉａ， ３４：８−１７， ２００１；Ｓｈｅｎ， Ｍｉｃｒｏｓｕｒｇｅｒｙ １９：３５６−６３， １９９９；Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ （Ｂｅｒｌ）， ７８：３１７−２４， １９８９；Ｂａｒｎｅｔｔ， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １５５：３３７−３５０， １９９３；およびＨｕｎｇ ｅｔ ａｌ， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２０：４７５−４８２， ２００２を参照されたい）、不死化ＨＥＩ１９３細胞などを含む嗅覚ＧＰＣＲを産生するために多種多様な適切な宿主細胞を利用できる。
【００７１】
詳細には、シュヴァン細胞は次の方法を用いて培養することができる：Ｈｕｎｇ， （Ｉｎｔ． Ｊ． Ｏｎｃｏｌ． ２０：４７５−８２， ２００２）；Ｈｕｎｇ， （Ｉｎｔ． Ｊ． Ｏｎｃｏｌ． １９９９ １４：４０９−１５）；Ｗｏｏｄ， （Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． １１５：３６１−７５， １９７６）；Ｗｏｏｄ， （Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ６０５：１−１４， １９９０）；およびＢｒｏｃｋｅｓ， （Ｊ． Ｅｘｐ． Ｂｉｏｌ． Ｄｅｃ；９５：２１５−３０， １９８１）。
【００７２】
追加の細胞系は当業者には明白になるであろう、そしてアメリカンタイプカルチャーコレクション（１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、バージニア州マナッサス２０１１０−２２０９）から入手できる。
【００７３】
（方法）
一般に本方法によると、嗅覚ＧＰＣＲ発現カセットがインビトロで大グリア細胞中に導入され、その細胞は嗅覚ＧＰＣＲを発現させるために適する条件に曝され、そしてＧＰＣＲは細胞内で発現して、細胞表面へ輸送される。
【００７４】
したがって、大多数の実施形態では、発現カセットは、ウイルス感染、トランスフェクション、接合、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈降、直接マイクロインジェクションなどを含む様々な方法を用いて宿主細胞中へ導入されてよい。方法の選択は、一般に形質転換される細胞のタイプおよび形質転換が発生させられる状況（例、インビトロなど）に依存する。これらの方法についての一般的考察は、Ａｕｓｕｂｅｌ， ｅｔ ａｌ， Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ３ｒｄ ｅｄ．， Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， １９９５の中に見いだすことができる。
【００７５】
細胞中へ嗅覚ＧＰＣＲの発現カセットを導入した後、細胞は、典型的にはポリペプチド発現を生じさせるためにインキュベートされる。これを実施するために、細胞は１２〜２４時間、２４〜４８時間、または４８〜９６時間以上にわたり適切な培地中でインキュベートすることができる。ポリペプチドの一過性発現は、この方法で実施されてよい。これは明示的に企図されているが、しかしポリペプチドの発現はまたは安定性であってもよい。安定性トランスフェクションでは、発現カセットは選択可能なマーカー遺伝子を含有しており、ポリペプチドを発現する安定性細胞系の樹立は選択可能なマーカー遺伝子のための選択を含んでいる。２つの発現カセットが１つの細胞中に導入された場合は、２つの発現カセットは通常は相違する２つの選択可能なマーカー遺伝子（例、ネオマイシン耐性遺伝子およびハイグロマイシン耐性遺伝子）を含有している。一過性および安定性トランスフェクションの方法は、当業者にはよく公知である。
【００７６】
嗅覚ＧＰＣＲは大グリア細胞中で産生され、そして通常は、ＧＰＣＲが原形質膜中に存在するように細胞表面へ輸送される。
【００７７】
（組成物）
また別の局面では、本発明は生物活性嗅覚ＧＰＣＲを産生する大グリア細胞を提供する。そのような細胞は、通常は嗅覚ＧＰＣＲをコードする組換え核酸を含有しており、そして通常はその細胞（すなわち、組換え核酸の不在下の大グリア細胞）中で産生しない嗅覚ＧＰＣＲを産生することができる。
【００７８】
上述したように、本発明は、通常はＧＰＣＲに特徴的な方法で細胞の原形質膜にわたる大グリア細胞の表面で存在する（すなわち、検出可能に存在する）嗅覚ＧＰＣＲを含有する大グリア細胞を提供する。したがって、本細胞は、それらがリガンドに結合できる、そして存在する場合は適切なＧタンパク質を介してシグナルを伝達することができる点で「活性」嗅覚ＧＰＣＲを含有している。そこで本細胞は、例えば以下で詳細に説明するスクリーニングアッセイなどの活性アッセイにおいて利用される。
【００７９】
本細胞は、通常はその中に同一発現カセットが産生させられている例えばＮＩＨ−３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞などのような非大グリア細胞のようなコントロール細胞のレベルより有意に高いレベルで嗅覚ＧＰＣＲを産生する。大多数の実施形態では、本細胞は、モルベースで、コントロール細胞より少なくとも５×（「５倍」）、少なくとも１０×、少なくとも５０×、少なくとも１００×、通常は少なくとも１，０００×以上までのより多くの嗅覚ＧＰＣＲを産生する。特定の実施形態では、本細胞は、モルベースで、コントロール細胞より少なくとも５×（「５倍」）、少なくとも１０×、少なくとも５０×、少なくとも１００×、通常は少なくとも１，０００×以上までのより多くの嗅覚ＧＰＣＲを細胞表面で産生する（例えば、免疫細胞化学的方法またはフローサイトメトリーによって決定した場合に）。本細胞が液体培地中で増殖させられる場合は、それらは通常、例えば１０μｇ／Ｌ超、１００μｇ／Ｌ超、１ｍｇ／Ｌ超、１０ｍｇ／Ｌ超もしくは約５０ｍｇ／Ｌ以上の有意な量で嗅覚ＧＰＣＲを産生する。特に、本細胞が液体培地中で増殖させられる場合は、それらは通常、例えば１０μｇ／Ｌ超、１００μｇ／Ｌ超、１ｍｇ／Ｌ超、１０ｍｇ／Ｌ超もしくは約５０ｍｇ／Ｌ以上の有意な量で細胞表面嗅覚ＧＰＣＲを産生する。
【００８０】
多数の様々な嗅覚ＧＰＣＲがあるので、本発明は様々な嗅覚ＧＰＣＲをコードする対応する複数の組換え核酸を含有する複数の大グリア細胞（すなわち、大グリア細胞のライブラリー）も提供する。これらの実施形態では、複数のうちの各大グリア細胞は、通常は単一嗅覚ＧＰＣＲのための組換え核酸を含有しており、そして各細胞は相違する核酸を含有する。したがって、本発明は大グリア細胞のライブラリーを提供するが、それらの細胞は２以上、５以上、約１０以上、約２０以上、約５０以上、約１００以上、約２００以上、約３００以上、約５００以上、約１，０００以上の相違する嗅覚ＧＰＣＲをコードする組換え核酸を含有している。嗅覚ＧＰＣＲは、正体が既知かもしくは正体が未知の嗅覚ＧＰＣＲ、またはそれらの混合物であってよい。嗅覚ＧＰＣＲは、単一種の動物由来であってよい、または２種、約５種まで、約１０種まで、約５０種まで、約１００種まで、もしくは約１，０００種までの動物由来のものであってよい。特定の実施形態では、嗅覚ＧＰＣＲはヒトのものである。
【００８１】
（キット）
本発明によって、さらにまた上述した本方法を実行するためのキットも提供される。本キットは、大グリア細胞、嗅覚ＧＰＣＲをコードする核酸および嗅覚ＧＰＣＲを含有する大グリア細胞のうちの１つ以上を少なくとも含んでいる。本キットの核酸は、他のプラスミド内へのライゲーションを促進するために制限部位、複数のクローニング部位、プライマー部位なども有してもよい。キットのその他のオプション構成要素には、本アッセイを実行するための、培養培地、ＧＰＣＲ活性を試験するための構成要素、およびＧタンパク質をコードする核酸などが含まれる。本キットの様々な構成要素は個別容器中に存在していてよい、または必要に応じて特定の適合する構成要素が単一容器中で事前に合わされていてよい。
【００８２】
上述の構成要素に加えて、本キットは、典型的には例えば嗅覚ＧＰＣＲを産生する方法などの本方法を実行するためにキットの構成要素を使用するための指示書をさらに含んでいる。本方法を実行するための指示書は，一般には適切な記録媒体上に記録されている。例えば、指示書は紙もしくはプラスチックなどの基材上に印刷されてよい。したがって、指示書は、キットもしくはその構成要素の容器のラベル表示（すなわち、パッケージングもしくはサブパッケージングと結び付けて）などにおいて包装添付文書としてキット内に存在してよい。他の実施形態では、指示書は例えばＣＤ−ＲＯＭ、ディスクなどのような適切なコンピュータ可読記憶媒体上に存在する電子記憶データファイルとして存在する。また別の実施形態では、キット内に実際的な指示書は存在しないが、例えばインターネットを介して遠隔起源から指示書を入手するための手段が提供される。この実施形態の例は、指示書を見ることができる、および／またはそれから指示書をダウンロードすることのできるウェブのアドレスを含んでいるキットである。指示書と同様に、指示書を入手するためのこの手段は適切な基材上に記録されている。
【００８３】
（嗅覚ＧＰＣＲ活性の調節因子を同定するための方法）
本発明は、嗅覚ＧＰＣＲ調節因子（すなわち、目的の嗅覚ＧＰＣＲの活性を増加もしくは減少させる化合物）をスクリーニングする方法を提供する。特定の実施形態では、嗅覚ＧＰＣＲ調節因子は、アゴニスト、部分アゴニスト、インバースアゴニスト、およびアンタゴニストからなる群から選択される。一般に、本方法は、上述した方法によって生物活性嗅覚ＧＰＣＲを産生する大グリア細胞（本明細書では「本大グリア細胞」と称する）を提供するために大グリア細胞中で嗅覚ＧＰＣＲを産生する工程と、該細胞を候補因子と接触させる工程と、嗅覚ＧＰＣＲの活性へ及ぼす候補因子の作用を評価する工程と、を含んでいる。
【００８４】
他の実施形態では、嗅覚ＧＰＣＲの調節因子（例、そのＧＰＣＲに対する天然もしくは合成リガンド）を、そのＧＰＣＲを産生する大グリア細胞と接触させることができ、そしてその調節因子が嗅覚ＧＰＣＲの活性に及ぼす作用を評価することができる。さらにまた、２種の嗅覚ＧＰＣＲ調節因子、例えば嗅覚ＧＰＣＲの活性化因子（例、そのＧＰＣＲに対するリガンド）およびその活性化因子の調節活性を遮断する物質を用いて実施されるアッセイも予期されている。
【００８５】
当技術分野において公知のように、本アッセイは、例えば３５Ｓ ＧＴＰγＳを用いる膜結合アッセイ、アデニリルシクラーゼアッセイ（例、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ社製のＦＬＡＳＨ ＰＬＡＴＥＴＭアデニリルシクラーゼキット；カタログ番号ＳＭＰ００４Ａを用いて）、細胞ベースｃＡＭＰアッセイ、レポーターベースアッセイ、ＡＰ１レポーターアッセイ、ＳＲＦ−ＬＵＣレポーターアッセイ、細胞内ＩＰ３蓄積アッセイ、細胞内カルシウム濃度を測定するための蛍光測定イメージングプレートリーダー（ＦＬＩＰＲ）アッセイなどの様々な方法を用いて実施することができる。
【００８６】
調節因子が嗅覚ＧＰＣＲ活性を増加させる実施形態では、嗅覚ＧＰＣＲの活性は、調節因子の存在下では、その因子の不在下における適切なコントロールに比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約５０％、少なくとも約８０％、少なくとも約１００％、少なくとも約５００％、または少なくとも約１０倍以上まで上昇する。適切なコントロールは、ＧＰＣＲに対する天然リガンドの存在下もしくは不在下にあってよい。
【００８７】
調節因子が嗅覚ＧＰＣＲ活性を減少させる実施形態では、嗅覚ＧＰＣＲの活性は、調節因子の存在下では、その因子の不在下における適切なコントロールに比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％以上まで減少する。適切なコントロールは、ＧＰＣＲに対する天然リガンドの存在下もしくは不在下にあってよい。
【００８８】
特定の実施形態では、これらの方法は、試験化合物、例えば候補因子の存在下もしくは不在下でＧＰＣＲ活性を測定する工程もまた含んでいる。これらのアッセイは、単離した本大グリア細胞（例、培養細胞）、本大グリア細胞から単離した膜、本大グリア細胞の抽出物を該ＧＰＣＲの活性を調節するために有効な量のＧＰＣＲ調節因子と接触させる工程を含んでいることがある。
【００８９】
したがって、本発明は、リガンド、例えばそのＧＰＣＲに対する天然リガンドの存在下もしくは不在下で嗅覚ＧＰＣＲの活性を減少させるための嗅覚ＧＰＣＲ活性の阻害剤、およびＧＰＣＲ活性の誘導因子を提供するが、このときＧＰＣＲはそのＧＰＣＲの天然リガンドである、もしくは天然リガンドではない化合物によって誘導される。
【００９０】
特定の実施形態では、ＧＰＣＲ活性はレポーターシグナルを評価することによって測定できる。これらの実施形態では、アッセイはハイスループットアッセイのために適切なフォーマット、例えば９６もしくは３８４ウェルフォーマットで実施することができ、そして適切なロボット（例、ピペッティングロボット）および器具類（レポーター活性を決定するための９６および３８４ウェルフォーマットの照度計もしくは蛍光リーダー）を使用できる。具体的に例示するためで限定するためではなく、レポーター活性を決定することは、Ｗａｌｌａｃ １４５０ Ｍｉｃｒｏｂｅｔａカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製）またはＣＣＤカメラを使用する照度計を使用できる。
【００９１】
関連実施形態では、本アッセイは、候補因子の嗅覚ＧＰＣＲへの結合が評価される結合アッセイであってよい。これらの実施形態では、候補因子は通常最初に標識され、本大グリア細胞と接触させられ、そして候補因子の大グリア細胞への結合が評価される。
【００９２】
（候補因子）
多種多様な試験化合物は、上記の方法によってスクリーニングすることができる。試験化合物は極めて多数の化学物質のクラスを含んでいるが、典型的にはそれらは有機分子、好ましくは小さい有機化合物である（すなわち、５０ダルトンより大きく、かつ約２，５００ダルトン未満（例、１００〜１，０００Ｄａ、通常は約５００Ｄａ未満）の分子量を有する化合物）。試験化合物は、タンパク質との構造的相互作用、詳細には水素結合のために必要な官能基を含んでおり、そして典型的には少なくとも１つのアミン、カルボニル、ヒドロキシルもしくはカルボキシル基、好ましくは化学官能基のうちの少なくとも２つを含んでいる。試験化合物は、しばしば環状炭素もしくは複素環の構造および／または上述した官能基の１つ以上で置換された芳香環もしくは多環芳香環構造を含んでいる。代表的および非限定的試験化合物は、脂肪族系酸、アルコール、ケトン、およびエステル；芳香環、脂環、多環および複素環の構造を備える化学物質；およびこれらのタイプ各々の無数の置換化学物質、ならびにそれらの組み合わせを含んでいる。試験化合物は、さらにまたペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造的アナログもしくはそれらの組み合わせを含む生体分子間でも見いだされる。さらにまた別の試験化合物は、ＧＰＣＲの天然リガンドの改変体を含んでいる。
【００９３】
試験化合物は、合成もしくは天然化合物のライブラリーを含む極めて広範囲の起源から入手できる。例えば、ランダム化オリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現を含む、広範囲の有機化合物および生体分子のランダム合成および指向性合成のために極めて多数の手段を利用することができる。あるいは、細菌、真菌、植物および動物抽出物の形状にある天然化合物のライブラリーを利用できる、または容易に産生できる。ライブラリーは、ニオイと結び付けられた天然または合成生成化合物を優先的に含んでいる可能性がある。さらに、天然もしくは合成生成ライブラリーおよび化合物は、従来型の化学的、物理的および生化学的手段を通して容易に改変され、コンビナトリアルライブラリーを生成するために使用できる。既知の薬理学的物質は、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などのような構造的アナログを産生するための指向性もしくはランダム化学修飾に曝すことができる。
【００９４】
関心対象であるのは、ポリペプチド、例えばタンパク質様物質である試験化合物である。目的の特定タイプのポリペプチド試験化合物は、ＧＰＣＲに対する抗体、またはそれらのＧＰＣＲ結合フラグメントである。この抗体はモノクローナルもしくはポリクローナルであってよく、当技術分野において公知の方法によって産生することができる。また別の試験化合物は、既知の天然リガンドのあるＧＰＣＲについては、例えば少なくとも１つのアミノ酸の置換、欠失もしくは付加によって変化させられているかまたは化学修飾された天然リガンドである、ＧＣＰＲの天然リガンドの改変体を含んでいる。特定の実施形態では、試験化合物はＧＰＣＲのリガンドであるとは知られていない内因性ポリペプチドを含んでいる。
【００９５】
試験化合物の上記の特性解析は、例示するためで限定的ではないことが企図されている。
【００９６】
（嗅覚ＧＰＣＲのリガンドとしての候補因子を同定する方法）
嗅覚ＧＰＣＲのリガンドは、候補因子と嗅覚ＧＰＣＲとを接触させる工程と、候補因子が嗅覚ＧＰＣＲへ結合するかどうかを決定する工程とによって同定できるが、このとき前記結合は候補因子が嗅覚ＧＰＣＲのリガンドであるという指標となる。特定の実施形態では、候補因子は標識することができる。特定の実施形態では、候補因子は放射標識することができる。
【００９７】
本候補因子内に組み込むことができる適切な放射性核種は、２Ｈ（ジュウテリウム）、３Ｈ（トリチウム）、１１Ｃ、１３Ｃ、１４Ｃ、１３Ｎ、１５Ｎ、１５Ｏ、１７Ｏ、１８Ｏ、１８Ｆ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、８２Ｂｒ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉおよび１３１Ｉを含むがそれらに限定されない。３Ｈ、１４Ｃ、８２Ｂｒ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓの組込みは、概して最も有用な可能性がある。
【００９８】
放射性同位体を有機化合物内に組み込むための合成方法は、本候補因子に適用することができ、当技術分野において周知である。これらの合成方法、例えば標的分子内への活性レベルのトリチウムの組込みは下記のとおりである：
Ａ． トリチウムガスを用いた触媒還元 − この手順は、通常は高比活性生成物を産生し、ハロゲン化もしくは未飽和前駆物質を必要とする。
Ｂ． 水素化ホウ素ナトリウム［３Ｈ］を用いた還元 − この手順は余り費用がかからず、アルデヒド、ケトン、ラクトン、エステルなどの還元性官能基を含有する前駆物質を必要とする。
Ｃ． 水素化アルミニウムリチウム［３Ｈ］を用いた還元 − この手順は、ほぼ理論的比活性で生成物を提供する。これもまた、アルデヒド、ケトン、ラクトン、エステルなどの還元性官能基を含有する前駆物質を必要とする。
Ｄ． トリチウムガス曝露による標識化 − この手順は、適切な触媒の存在下で置換可能な陽子を含有する前駆物質をトリチウムガスへ曝露させることを含んでいる。
Ｅ． ヨウ化メチル［３Ｈ］を用いたＮ−メチル化 − この手順は、高比活性ヨウ化メチル（３Ｈ）を用いて適切な前駆物質を処理することによって、通常はＯ−メチルもしくはＮ−メチル（３Ｈ）生成物を調製するために使用される。この方法は、一般に例えば約７０〜９０Ｃｉ／ｍｍｏｌなどのより高い比活性を可能にする。
【００９９】
１２５Ｉの活性レベルを標的分子中へ組み込むための合成方法は下記を含んでいる：
Ａ． サンドマイヤー（Ｓａｎｄｍｅｙｅｒ）および類似反応 − この手順はアリールもしくはヘテロアリールアミンをテトラフルオロホウ酸塩などのジアゾニウム塩へ、そして引き続きＮａ１２５Ｉを用いて１２５Ｉ標識化合物へ転換させる。代表的な手順は、Ｚｈｕ，Ｄ．−Ｇ． ａｎｄ ｃｏ−ｗｏｒｋｅｒｓ、Ｊ． Ｏｒｇ Ｃｈｅｍ．２００２，６７，９４３−９４８によって報告された。
Ｂ． フェノールのオルト１２５ヨウ素化 − この手順はＣｏｌｌｉｅｒ， Ｔ． Ｌ． ａｎｄ ｃｏ−ｗｏｒｋｅｒｓ、Ｊ． Ｌａｂｅｌｅｄ Ｃｏｍｐｄ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．１９９９，４２，Ｓ２６４−Ｓ２６６．によって報告されたように、フェノールのオルト位置での１２５Ｉの組込みを可能にする。
Ｃ． １２５Ｉを用いたアリールおよびヘテロアリールブロミドの置換 − この方法は、一般に２段階プロセスである。第１工程は、例えばＰｄ触媒反応［すなわち、Ｐｄ（Ｐｈ３Ｐ）４］を用いて、またはトリ−アルキルスズハライドもしくはヘキサアルキルジスズ［例、（ＣＨ３）３ＳｎＳｎ（ＣＨ３）３］の存在下でアリールもしくはヘテロアリールリチウムを通しての、アリールもしくはヘテロアリールブロミドから対応するトリーアルキルスズ中間物への変換である。代表的な手順は、Ｂａｓ， Ｍ．−Ｄ． ａｎｄ ｃｏ−ｗｏｒｋｅｒｓ、Ｊ． Ｌａｂｅｌｅｄ Ｃｏｍｐｄ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．２００１，４４，Ｓ２８０−Ｓ２８２によって報告された。
【０１００】
嗅覚ＧＰＣＲのリガンドは、あるいはまた嗅覚ＧＰＣＲの標識した既知のリガンドの存在下で候補因子と嗅覚ＧＰＣＲとを接触させることによって同定できるが、このとき候補因子の存在下での標識した既知のリガンドの結合の減少は候補因子が嗅覚ＧＰＣＲのリガンドであるという指標である。
【０１０１】
（臭気物質ミメティックを同定するための方法）
本発明はさらにまた、臭気物質ミメティックを同定する方法を提供するが、このときミメティックは特定臭気物質と類似の、実質的に同様もしくは同一の機能的特徴を有するが、該臭気物質とは相違する化学構造を有する合成もしくは天然化合物である。言い換えると、本発明は目的の臭気物質と同一の「ニオイがする」が、目的の臭気物質と同一の化学構造を有していない臭気物質ミメティックを同定する方法を提供する。一般に、これらの方法は、上述した方法を用いて１ライブラリーの嗅覚ＧＰＣＲを産生する工程と、目的の臭気物質によって活性化される１セットの嗅覚ＧＰＣＲを同定する工程と、および同一セットの嗅覚ＧＰＣＲを活性化する物質を同定するために該ライブラリーの嗅覚ＧＰＣＲを候補因子と接触させる工程と、を含んでいる。大多数の実施形態では、目的の臭気物質と同一セットの嗅覚ＧＰＣＲを活性化する因子は目的の臭気物質のミメティックである、すなわち目的の臭気物質と類似の臭気を有しているはずである。
【０１０２】
したがって、これらの方法は、上述した方法を用いて通常はライブラリー（例、１００以上、２００以上、３００以上、４００以上、５００以上、６００以上、通常は約１，０００以上まで）の様々な嗅覚ＧＰＣＲを産生する工程と、およびそれらが目的の臭気物質、例えば所望のニオイもしくは味覚を有する既知もしくは未知の化学構造の化合物によって活性化されるかどうかを決定するためにＧＰＣＲを評価する工程と、を含んでいる。多数の実施形態では、目的の臭気物質は１セットの嗅覚ＧＰＣＲを活性化するであろうが、このとき１セットは通常２〜５０、２〜２０または３〜１０種のメンバーを含有する。単一臭気物質によって活性化された嗅覚ＧＰＣＲのセットは「ＧＰＣＲフィンガープリント」を提供するが、このとき単一臭気物質はそれが活性化する嗅覚ＧＰＣＲのセットによって規定される。目的の臭気物質に対するミメティックは、目的の臭気物質と同一もしくはほぼ同一のＧＰＣＲフィンガープリントを有する因子を同定するために候補因子のライブラリーをスクリーニングすることによって同定することができる。
【０１０３】
例えば、臭気物質ミメティックは、目的の臭気物質のフィンガープリントに類似する、例えば該ミメティックは該臭気物質によって活性化された場合のＧＰＣＲまたはＧＰＣＲ活性の約６０％、約７５％、約８０％、約９０％、約９５％のＧＰＣＲを活性化する、活性化ＧＰＣＲの「フィンガープリント」を有すると同定できる。
【０１０４】
したがって、目的の臭気物質のミメティックを同定できる。
【０１０５】
（バイオセンシング法）
本発明は、バイオセンサーをさらに提供するが、このときバイオセンサーは、典型的には複数の相違する嗅覚ＧＰＣＲを産生する複数の大グリア細胞である。多数の実施形態では、細胞はアドレス指定可能なフォーマットで配列されるが、このときそのアレイの各アドレスは単一組換え嗅覚ＧＰＣＲを産生する大グリア細胞を含有している。典型的には、前記複数は２以上、５以上、約１０以上、約２０以上、約５０以上、約１００以上、約２００以上、約３００以上、約５００以上、約１，０００以上、または約１０，０００以上まででさえあってよい。このためバイオセンサーは、約５、約１０、約２０、約３０以上、約５０以上、約１００以上、約２００以上、通常は約５００以上まで、通常は約１，０００以上までの組換え嗅覚ＧＰＣＲを含有していてよい。嗅覚ＧＰＣＲは、正体が既知の、もしくは正体が知られていない嗅覚ＧＰＣＲ、またはそれらの混合物であってよい。嗅覚ＧＰＣＲは、単一種の動物由来であってよい、または２種、約５種まで、約１０種まで、約５０種まで、約１００種まで、もしくは約１，０００種までの動物由来であってよい。特定の実施形態では、嗅覚ＧＰＣＲはヒトのものである。
【０１０６】
本明細書に記載した方法は、単一組換え嗅覚ＧＰＣＲを産生する前記大グリア細胞を「親和性基材」へ結合させることを含んでいる。特定の実施形態では、前記親和性基材はアドレス指定可能である。特定の実施形態では、前記アドレス指定可能な親和性基材は空間的にアドレス指定可能である。親和性基材は固体、半固体、もしくは不溶性支持体を含有しており、前記組換え大グリア細胞の結合のために適切な任意の材料から製造され、使用された検出方法を妨害しない。当業者には理解されるように、可能な親和性基材の数は極めて多い。可能な基材には、ガラスまたは改変されたガラスかまたは機能化ガラス、プラスチック（アクリル、ポリスチレンおよびスチレンと他の物質とのコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、Ｔｅｆｌｏｎなどを含む）、多糖類、ナイロンもしくはニトロセルロース、樹脂、ケイ素またはシリコンもしくは改変シリコンを含むケイ素に基づく物質、炭素、金属、無機ガラス、プラスチック、セラミックおよび多種多様な他のポリマーが含まれるが、それらに限定されない。好ましい実施形態では、基材は光学的検出を許容するが、それら自体は感知できるほど蛍光を発することも発光することもない。さらに、当技術分野において公知のように、基材はデキストラン、アクリルアミド、ゼラチン、アガロース、ウシおよびその他の哺乳動物血清アルブミンを含むタンパク質などの生体適合性物質などのポリマーを含む任意の数の物質で被覆され得る。
【０１０７】
「空間的にアドレス指定可能な」親和性基材は、各領域が特定の事前に決定された場所（「アドレス」）にあるように、複数の別個の領域（例、複数の目的のポリペプチド結合領域）を有する。マルチウェルマイクロタイタープレートはアドレス指定可能であり（各ウェルが１つのアドレスを有する）、１アレイのキャピラリーカラムはアドレス指定可能であり、固体支持体（例、ナイロンもしくはニトロセルロース膜）上に配置された１アレイのサンプルはアドレス指定可能である。本明細書に記載の方法に使用するための親和性基材は、典型的には少なくとも４以上、少なくとも約１２、少なくとも約２４、少なくとも約４８、少なくとも約９６もしくは少なくとも約３８４のアドレス指定可能な領域を有する。特定の実施形態では、親和性基材は、ハイスループットアッセイのために適切なアドレス指定可能なフォーマットに、例えば２４、４８、９６もしくは３８４ウェルフォーマットにある。
【０１０８】
そのようなマルチウェルフォーマットは、ロボット（例、ピペッティングロボット）、およびその他の器具類（レポーター活性の決定のための９６もしくは３８４ウェルフォーマットの照度計（ｉｌｌｕｍｉｎａｔｏｒ）もしくは蛍光リーダー）による使用のために適切である。具体的に例示するためであって限定するためではなく、レポーター活性はＣＣＤカメラに基づく照度計を用いて測定できる。
【０１０９】
使用時には、そのようなバイオセンサーは通常はサンプルと接触させられ、そして組換え嗅覚ＧＰＣＲの各々の活性化が評価される。目的の臭気物質の存在は、事前に決定された嗅覚ＧＰＣＲのサブセットの活性化によって検出されるが、このとき事前に決定された嗅覚ＧＰＣＲのサブセットは、その臭気物質の以前に決定された「ＧＰＣＲフィンガープリント」に対応する。したがって、目的の臭気物質に対する事前に決定された嗅覚ＧＰＣＲのサブセットが該サンプルによって活性化された場合は、目的の臭気物質が該サンプル内に存在する。
【０１１０】
また別の使用時には、そのようなバイオセンサーは通常は臭気物質と接触させられ、そして組換えＧＰＣＲの各々の活性化が評価される。その臭気物質に対する「フィンガープリント」の同定は、活性化された嗅覚ＧＰＣＲのサブセットに基づいて指定される。前記の別の使用の変形では、前記接触させる工程は、バイオセンサーの嗅覚ＧＰＣＲに対する１つ以上のアゴニストの存在下で、臭気物質へ「フィンガープリント」を指定するまた別の手段を表す、前記１つ以上のアゴニストの存在下で該臭気物質によって活性化されたＧＰＣＲのサブセットを用いて実施されてよい。アゴニスト、インバースアゴニストもしくはアンタゴニストの存在下で１つ以上の嗅覚ＧＰＣＲの活性を臭気物質の「フィンガープリント」内へ組み込めることが企図されている。
【０１１１】
特定の実施形態では、ＧＰＣＲ活性化は、ＧＰＣＲ活性化の発光レポーターを用いて検出することができる。例えば、以下で説明するようなルシフェラーゼ／ＧＦＰに基づくアッセイ、またはその変形などの任意の発光レポーター（例、蛍光レポーターなど）アッセイをこれらのアッセイのために使用できる。
【０１１２】
特定の実施形態では、臭気物質への１つ以上の嗅覚ＧＰＣＲの活性化は、例えば例示するためであり限定するためではなく事前に規定された最高応答の０〜１０％、１１〜２５％、２６〜５０％、５１〜７５％、もしくは７６〜１００％のなどの特定レベルであるとスコア付けすることができる。臭気物質の「フィンガープリント」は、少なくとも一部には１つ以上の嗅覚ＧＰＣＲの活性化のレベルによって決定され得ることが企図されている。
【０１１３】
したがって、本発明は、嗅覚ＧＰＣＲを含有するアドレス指定可能な大グリア細胞のアレイを含有する発光バイオセンサーを提供するが、このとき目的の臭気物質は該バイオセンサーからの特定光パターンの発光によって検出することができる。
【０１１４】
特定の実施形態では、試験すべきサンプルは環境上の試験サンプル、例えばガス（呼吸可能な大気または起源もしくは組成が知られていないガスのサンプルなど）、液体（水または起源もしくは組成が知られていない液体のサンプルなど）、または任意の固体のサンプルである。
【０１１５】
上述したバイオセンサー法は、例えば、例えばニオイについての知識が犯罪の被疑者の逮捕を導くことのある犯罪現場；特定の化学物質、例えば生物学／化学戦物質が検出される可能性がある紛争地帯（例、戦場）；例えば特定の汚染物質または望ましい、もしくは望ましくないニオイを検出できる食品材料；および望ましい、もしくは望ましくない嗅覚感覚のどちらかへの特定の嗅覚ＧＰＣＲもしくは特定サブセットの嗅覚ＧＰＣＲの合理的指定において；および有害化学物質を監視することが望ましい研究所において；および一般に、目的の臭気物質を監視もしくは検出することが望ましい任意の状況において特に利用される。
【０１１６】
目的の臭気物質は、一般にヒト嗅覚系の嗅覚ＧＰＣＲによって検出できる任意の化合物、例えばニオイを嗅ぐことによって検出できる任意の化合物を含んでいる。臭気物質は、精製化合物の場合がある、または（例えば、複雑な組成の）未精製化合物の場合がある。そのような臭気物質は、脂肪族系酸、アルコール、ケトン、およびエステル；芳香環、脂環、多環および複素環の構造を備える化学物質；およびこれらのタイプ各々の無数の置換化学物質、ならびにそれらの組み合わせを含むがそれらに限定されない。
【０１１７】
（有用性）
嗅覚ＧＰＣＲを産生する本方法は、特に食品および芳香剤に関連する様々な研究および産業上の用途において利用される。
【０１１８】
多くの用途では、製品、例えば食品もしくは芳香剤を改良する、すなわち必要に応じて、上述した方法を用いて同定された嗅覚ＧＰＣＲ調節因子の添加によって、幾分望ましいものにすることができる。一般に、そのような調節因子は、通常は例えば食品材料または香水などの芳香剤のような製品と、それらの製品の味もしくはニオイを改良するために混合される。多数の実施形態では、調節因子は嗅覚ＧＰＣＲ活性の阻害剤であってよく、このために不愉快な味もしくはニオイを「マスキング」することができる。他の実施形態では、調節因子は特定の嗅覚ＧＰＣＲの活性因子であってよく、そしてそれが添加される物質にとっての新しい香味料もしくは芳香剤を改善もしくは添加するために使用できる。他の実施形態では、調節因子は特定の嗅覚ＧＰＣＲの活性因子であってよく、殺虫剤の有効性を改良するために使用できる。特定の実施形態では、毒物および医薬品などの一部の製品のニオイをそれらが間違って消費されないように望ましくないようにすることが有益である。この場合には、不愉快なニオイを提供する物質は上述した方法によって見いだし、そしてそれらの製品へ添加することができる。
【０１１９】
他の用途では、望ましい臭気物質（例、ある種の珍しい花から入手され、現代の多数の香水のための出発物質として使用される臭気物質）を提供する費用は、上述した方法を用いてその臭気物質のミメティックを同定することによって減少させることができる。そのような実施形態では、これらのミメティックは望ましい臭気物質より実質的に低い価格で製造することができ、そして例えば香水などの製品中に望ましい臭気物質を補給するか、または置換するために使用できる。
【０１２０】
他の用途では、個体によって生成された特定臭気物質の検出は、疾患もしくは障害に関連するので診断的もしくは予後的価値を有する可能性があり、このとき特定臭気物質の上昇もしくは減少は前記疾患もしくは障害と関連付けられている。
【０１２１】
当然ながら、上述した方法を用いて入手された嗅覚ＧＰＣＲ調節因子を様々な個体に投与することができる。一般に、そのような個体は哺乳動物もしくは哺乳類であり、このときこれらの用語は食肉目（例、イヌおよびネコ）、齧歯目（例、マウス、モルモット、およびラット）、および霊長目（例、ヒト、チンパンジー、およびサル）、ならびに例えばウシ、ヒツジ、ブタおよびウマなどの産業上重要な哺乳動物を含む哺乳綱に含まれる生物体を記載するために広範囲に使用されている。非哺乳類動物にもまた上述した方法を用いて入手された嗅覚ＧＰＣＲ調節因子を投与することができることが企図される。代表的および非限定的非哺乳類動物には、鳥類（例、ニワトリ）、爬虫類、魚類、節足動物、および昆虫類（例、カ、アリ、アブラムシ、カブトムシ、ハエ、スズメバチ、ミツバチ、クモ、あるいはヒトもしくは非ヒト動物へ疾患を伝播する、または農作物もしくは観賞用植物に対する損害を引き起こす任意の昆虫）が含まれる。多数の実施形態では、個体はヒトであろう。
【実施例】
【０１２２】
下記の実施例は、当業者に本発明の作製および使用方法についての完全な開示および説明を提供できるように記載するが、本発明者らが発明と見なしている範囲を限定することを企図しておらず、下記の実験が実施された実験のすべてである、またはそれらだけが実施された実験であることを表すことも企図していない。
【０１２３】
本発明はその特定の実施形態を参照しながら説明してきたが、当業者には、本発明の真の精神および範囲から逸脱せずに、様々な変更を加えたり、同等物を置換したりできることが理解されるはずである。さらに、本発明の目的、精神および範囲に、特定の状況、材料、組成物、工程、１つ以上の工程を適合させるために多数の改変を加えることができる。すべてのそのような改変は、本発明の範囲内にあることが企図されている。
【０１２４】
（実施例１：シュヴァン細胞中での嗅覚ＧＰＣＲの発現）
初代ラットシュヴァン細胞の単離：
シュヴァン細胞の調製は以前に記載されたとおりに実施した（例、Ｈｕｎｇ， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｏｎｃｏｌ． ２０：４７５−８２， ２００２；Ｈｕｎｇ， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｏｎｃｏｌ． １９９９ １４：４０９−１５；Ｗｏｏｄ， Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． １１５：３６１−７５， １９７６；Ｗｏｏｄ， Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ６０５：１−１４， １９９０；およびＢｒｏｃｋｅｓ， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｂｉｏｌ． Ｄｅｃ；９５：２１５−３０， １９８１など）。手短には、Ｐ１ラット新生児由来の坐骨神経を採取し、１０％熱不活化ウシ胎児血清を補給したダルベッコの改変イーグル培地中で細胞を維持した。２μＭフォルスコリンおよびウシ下垂体抽出物（Ｓｉｇｍａ社製）を用いてシュヴァン細胞を拡張（ｅｘｐａｎｄ）させた。第３継代まで細胞を増殖させ、保管するために冷凍した。
【０１２５】
嗅覚ＧＰＣＲの一過性トランスフェクション：
第５継代のシュヴァン細胞を１ウェル当たり８×１０４細胞でポリ−Ｄ−リジンを被覆した８ウェルチャンバースライド（Ｆａｌｃｏｎ社製）上に蒔いた。Ｆｕｇｅｎｅ ６試薬（Ｒｏｃｈｅ社製）およびＯｐｔｉｍｅｍ血清無含有培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、０．５μｇの嗅覚ＧＰＣＲ発現プラスミドによりシュヴァン細胞をトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞は、４時間にわたり３７℃の５％ ＣＯ２加湿インキュベーター内で維持した。ＰＢＳを用いて細胞を洗浄し、新鮮増殖培地と取り換えた。２４時間後、細胞を発現についてアッセイした。
【０１２６】
ＨＡ染色によって決定した嗅覚ＧＰＣＲの発現分析：
ＰＢＳＣＭ（ＰＢＳ＋０．５ｍＭ Ｃａ２＋＋１ｍＭ ＭｇＣｌ２）を用いてトランスフェクトした細胞を洗浄し、４％ホルマリンを用いて固定した。５０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ／ＰＢＳＣＭを用いて細胞をクエンチし、２回洗浄した。一次抗体抗マウスＨＡ（Ｒｏｃｈｅ社製）をブロッキングバッファー（トリトンなしのＰＢＳＣＭ中の２％ ＢＳＡ）中で１：１，０００に希釈し、細胞上に１時間放置した。ＰＢＳＣＭを用いて３回洗浄した後、二次抗体（Ａｌｅｘａ ４８８結合体化ロバ抗マウスＩｇＧ）１：２，０００およびＤＡＰＩ １：２，０００は暗所で３０分間にわたり細胞上に放置した。細胞はＰＢＳＣＭを用いて３回洗浄し、フルオロセーブ（ｆｌｏｕｒｏｓａｖｅ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）を被覆してカバースリップを被せた。細胞は適切なＵＶフィルターによって分析した。
【０１２７】
それらの表面上で嗅覚ＧＰＣＲを産生する細胞が観察された（図１を参照）。
【０１２８】
（実施例２：ＧＰＣＲ活性化のアッセイ）
受容体の発現：
大グリア細胞の一過性トランスフェクションは初代ラットシュヴァン細胞について実施例１に記載したとおりに実施できる。大グリア細胞系の安定性トランスフェクションは、本明細書に記載したとおりに実施できる。
【０１２９】
約１２×１０６個の大グリア細胞を１５ｃｍ組織培養プレート上に蒔き、１０％ウシ胎児血清および１％ピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミン、および抗生物質を含有するＤＭＥ高グルコース培地中で増殖させる。大グリア細胞を蒔いた２４時間後（または約８０％のコンフルエンシーまで）、１２μｇのＤＮＡを用いて細胞をトランスフェクトする。１２μｇのＤＮＡを６０μＬのリポフェクトアミンおよび血清を含有していない２ｍＬのＤＭＥ高グルコース培地と合わせる。プレートから培地を吸引し、血清を含有しない培地を用いて細胞を１回洗浄する。ＤＮＡ、リポフェクトアミン、および培地混合物を、血清を含有しない１０ｍＬの培地と一緒にプレートへ添加する。３７℃で４〜５時間インキュベートした後、培地を吸引し、血清を含有する培地２５ｍＬを添加する。トランスフェクションの２４時間後、培地を再び吸引し、血清を含有する新鮮培地を添加する。トランスフェクションの４８時間後、培地を吸引し、最終濃度５００μｇ／ｍＬで、ジェネティシン（Ｇ４１８薬）を含有する血清含有培地を添加する。トランスフェクトした細胞を、今度はＧ４１８耐性遺伝子を含有する陽性トランスフェクト細胞についての選択を受けさせる。培地は、選択が発生すると４〜５日間毎に取り換える。選択中、安定性プールを作製するために細胞を増殖させるかまたは安定性クローン選択のために細胞を分割する。
【０１３０】
膜結合アッセイ：
［３５Ｓ］ＧＴＰγＳアッセイ：Ｇタンパク質共役受容体がリガンド結合または構成性活性化のいずれかの結果として活性状態にある場合は、受容体はＧタンパク質に共役し、ＧＤＰの放出およびそれに続くＧＴＰのＧタンパク質への結合を刺激する。Ｇタンパク質受容体複合体のαサブユニットはＧＴＰａｓｅとして機能し、ＧＴＰからＧＤＰへ緩徐に加水分解し、その時点で受容体は通常不活性化される。活性化された受容体は、ＧＴＰをＧＤＰに置換し続ける。非加水分解性ＧＴＰアナログである［３５Ｓ］ＧＴＰγＳを利用すると、活性化受容体を発現する膜への［３５Ｓ］ＧＴＰγＳの強化された結合を証明することができる。活性化を測定するために［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を使用することの長所は：（ａ）これが一般にすべてのＧタンパク質共役受容体へ適用できること；
（ｂ）これは膜表面の近位に存在するので細胞内カスケードに影響を及ぼす分子を取り上げる可能性を低くさせることである。
【０１３１】
本アッセイは、Ｇタンパク質共役受容体が関連受容体を発現する膜への［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を刺激する能力を利用する。このため本アッセイは、内因性ＧＰＣＲおよび非内因性の構成的に活性化されたＧＰＣＲについて候補化合物をスクリーニングするために直接同定方法において使用できる。本アッセイは一般的であり、すべてのＧタンパク質共役受容体での新薬発見に適用される。
【０１３２】
［３５Ｓ］ＧＴＰγＳアッセイは２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１〜約２０ｍＭ ＭｇＣｌ２（この量は結果を最適化するために調整できるが、２０ｍＭが好ましい）ｐＨ７．４、約０．３〜約１．２ｎＭ［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ（この量は結果を最適化するために調整できるが、１．２が好ましい）および１２．５〜７５μｇ膜タンパク質（この量は最適化するために調整できる）を備える結合バッファーおよび１０μＭ ＧＤＰ（この量は最適化するために変更できる）中で１時間にわたりインキュベートする。コムギ胚芽凝集素ビーズ（２５μＬ；Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を次に添加し、この混合物を室温でさらに３０分間インキュベートする。これらのチューブを次に室温で５分間、１５００×ｇで遠心し、シンチレーションカウンターで計数する。
【０１３３】
アデニリルシクラーゼ
細胞ベースアッセイのために設計されたＦｌａｓｈ ＰｌａｔｅＴＭアデニリルシクラーゼキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ社製；カタログ番号ＳＭＰ００４Ａ）は粗原形質膜と一緒に使用するために改変することができる。Ｆｌａｓｈ Ｐｌａｔｅウェルは、ｃＡＭＰを認識する特異的抗体も含有するシンチラントコーティングを含有していてよい。ウェル内で生成されたｃＡＭＰは、ｃＡＭＰ抗体への放射性ｃＡＭＰトレーサーの結合について直接競合によって定量することができる。下記は、受容体を発現する細胞全体中でのｃＡＭＰレベルの変化を測定するための手短なプロトコールとして役立つ。
【０１３４】
一過性トランスフェクションの約２４時間後にトランスフェクトした細胞を採取した。注意深く培地を吸引して取り除き、廃棄した。各皿の細胞へ１０ｍＬのＰＢＳを穏やかに添加し、次に注意深く吸引する。１ｍＬのＳｉｇｍａ社製細胞解離バッファーおよび３ｍＬのＰＢＳを各プレートへ添加する。ピペットを用いてプレートから細胞を取り出し、５０ｍＬの円錐形遠心チューブ内へ細胞懸濁液を収集した。細胞は室温で５分間かけて１，１００ｒｐｍで遠心した。細胞ペレットを適切な容量のＰＢＳ（約３ｍＬ／プレート）中へ注意深く再懸濁させた。血球計数器を用いて細胞数を計数し、追加のＰＢＳを添加して適切な数の細胞（約５０μＬ／ウェルの最終容量）を得た。
【０１３５】
ｃＡＭＰ標準物質および検出用バッファー（１１ｍＬの検出用バッファーに対して１μＣｉのトレーサー［１２５Ｉ ｃＡＭＰ］５０μＬ）を含む）を調製し、製造業者の指示書にしたがって維持した。アッセイバッファーはスクリーニングのために新しく調製したが、５０μＬの刺激バッファー、３μＬの試験化合物（１２μＭのアッセイ最終濃度）および５０μＬの細胞を含有していた。アッセイバッファーは使用時まで氷上に保管した。５０μＬのｃＡＭＰ標準物質を適切なウェルへ添加し、次にウェルＨ−１１およびＨ１２へ５０μＬのＰＢＳＡを添加することによってアッセイを開始した。５０μＬの刺激バッファーを全ウェルへ添加した。試験化合物の１２μＭの最終アッセイ濃度および１００μＬの全アッセイ容量で、３μＬの化合物溶液を分注できるピン状ツールを用いてＤＭＳＯ（もしくは選択した候補化合物）を適切なウェルへ添加した。次に細胞をウェルへ添加し、室温で６０分間インキュベートした。トレーサーｃＡＭＰを含有する１００μＬの検出ミックスをウェルへ添加した。プレートをさらに２時間インキュベートし、次にＷａｌｌａｃ ＭｉｃｒｏＢｅｔａシンチレーションカウンターで計数した。ｃＡＭＰ／ウェルの数値は、各アッセイプレート内に含有された標準ｃＡＭＰ曲線から外挿した。
【０１３６】
Ｇｉ共役標的ＧＰＣＲに対する細胞ベースｃＡＭＰ：
ＴＳＨＲは、活性化されるとｃＡＭＰの蓄積を誘発するＧｓ共役ＧＰＣＲである。ＴＳＨＲは、アミノ酸残基６２３を突然変異させること（すなわち、アラニン残基をイソロイシン残基へ変化させること）によって構成的に活性化される。Ｇｉ共役受容体はアデニリルシクラーゼを阻害し、そしてこのためｃＡＭＰ産生のレベルを減少させると予想され、ｃＡＭＰレベルの評価を難題にする可能性がある。Ｇｉ共役受容体の構成的活性化の指標としてのｃＡＭＰの産生の減少を測定するために有効な技術は、ｃＡＭＰのベースラインレベルを確定するために、最も好ましくは「シグナルエンハンサー」としての非内因性の構成的に活性化されたＴＳＨＲ（ＴＳＨＲ−Ａ６２３Ｉ）（もしくは内因性の構成的に活性なＧｓ共役受容体）を、Ｇｉ連結標的ＧＰＣＲを用いてコトランスフェクトすることによって遂行できる。Ｇｉ共役受容体の非内因性バージョンを作製すると、標的ＧＰＣＲの非内因性バージョンは次にシグナルエンハンサーを用いてコトランスフェクトされ、スクリーニングのために使用できるのはこの物質である。本発明者らは、ｃＡＭＰアッセイが使用される場合はシグナルを効果的に産生するためにそのようなアプローチを利用する；このアプローチは、好ましくはＧｉ共役受容体に対する候補化合物の直接的同定において使用される。Ｇｉ共役ＧＰＣＲに対してこのアプローチを使用した場合は、標的ＧＰＣＲのインバースアゴニストはｃＡＭＰシグナルを増加させ、アゴニストはｃＡＭＰシグナルを減少させることが留意される。
【０１３７】
第１日には、大グリア細胞を２×１０４個／ウェルをプレーティングする。第２日に、２本の反応チューブを用意する（各チューブについて従うべき比率は１プレート当たりの比率である）：チューブＡは１．２ｍＬの血清無含有ＤＭＥＭ（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、カリフォルニア州アーヴィン）中で計４μｇのＤＮＡ（例、ｐＣＭＶベクター；変異したＴＨＳＲ（ＴＳＨＲ−Ａ６２３Ｉ）を有するｐＣＭＶベクター；ＴＳＨＲ−Ａ６２３ＩおよびＧＰＣＲ、など）に対して、哺乳動物細胞中へトランスフェクトした各受容体の２μｇのＤＮＡを混合することによって調製される；チューブＢは１．２ｍＬの血清無含有ＤＭＥＭ中に１２０μＬのリポフェクトアミン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製）を混合することによって調製される。チューブＡおよびＢを（数回）反転させ、室温で３０〜４５分間インキュベートすることによって混合する。この混合物を「トランスフェクション混合物」と呼ぶ。プレートに蒔いた大グリア細胞は、１×ＰＢＳを用いて洗浄し、その後に１０ｍＬの血清無含有ＤＭＥＭを添加する。２．４ｍＬのトランスフェクション混合物を次に細胞へ添加し、その後に３７℃／５％ ＣＯ２で４時間にわたりインキュベーションする。トランスフェクション混合物を吸引によって除去し、その後に２５ｍＬのＤＭＥＭ／１０％ウシ胎児血清を添加する。その後、細胞を３７℃／５％ ＣＯ２でインキュベートする。２４時間のインキュベーション後、細胞を採取し、分析に使用する。
【０１３８】
Ｆｌａｓｈ ＰｌａｔｅＴＭアデニリルシクラーゼキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ社製；カタログ番号ＳＭＰ００４Ａ）は細胞ベースアッセイのために設計されているが、当業者の必要に依存して粗原形質膜と一緒に使用するために改変され得る。Ｆｌａｓｈ Ｐｌａｔｅウェルは、ｃＡＭＰを認識する特異的抗体も含有する、シンチラントコーティングを含有する。ウェル内で産生されたｃＡＭＰは、ｃＡＭＰ抗体への放射性ｃＡＭＰトレーサーの結合について直接競合によって定量することができる。下記は、受容体を発現する細胞全体中でのｃＡＭＰレベルの変化を測定するための手短なプロトコールとして役立つ。
【０１３９】
トランスフェクトした細胞を、一過性トランスフェクションの約２４時間後に採取する。注意深く培地を吸引して取り除き、廃棄する。各皿の細胞へ１０ｍＬのＰＢＳを穏やかに添加し、次に注意深く吸引する。１ｍＬのＳｉｇｍａ社製細胞解離バッファーおよび３ｍＬのＰＢＳを各プレートへ添加する。ピペットを用いてプレートから細胞を取り出し、５０ｍＬの円錐形遠心チューブ内へ細胞懸濁液を回収する。細胞は室温で５分間１，１００ｒｐｍで遠心する。細胞ペレットを適切な容量のＰＢＳ（約３ｍＬ／プレート）中へ注意深く再懸濁する。血球計数器を用いて細胞数を計数し、追加のＰＢＳを添加して適切な数の細胞（約５０μＬ／ウェルの最終容量）を得る。
【０１４０】
ｃＡＭＰ標準物質および検出用バッファー（１１ｍＬの検出用バッファーに対して１μＣｉのトレーサー［１２５Ｉ ｃＡＭＰ（５０μＬ）］を含む）を調製し、製造業者の指示書にしたがって維持する。アッセイバッファーはスクリーニングのために新しく調製しなければならず、５０μＬの刺激バッファー、３μＬの試験化合物（１２μＭのアッセイ最終濃度）および５０μＬの細胞を含有していなければならない。アッセイバッファーは使用時まで氷上に保管され得る。５０μＬのｃＡＭＰ標準物質を適切なウェルへ添加し、次にウェルＨ−１１およびＨ１２へ５０μＬのＰＢＳＡを添加することによってアッセイを開始できる。５０μＬの刺激バッファーを全ウェルへ添加する。試験化合物の１２μＭの最終アッセイ濃度および１００μＬの全アッセイ容量で、３μＬの化合物溶液を分注できるピン状ツールを用いて選択した化合物（例、ＴＳＨ）を適切なウェルへ添加する。次に細胞をウェルへ添加し、室温で６０分間インキュベートする。トレーサーｃＡＭＰを含有する１００μＬの検出ミックスをウェルへ添加する。プレートをさらに２時間インキュベートし、次にＷａｌｌａｃ ＭｉｃｒｏＢｅｔａシンチレーションカウンターで計数した。ｃＡＭＰ／ウェルの値は、各アッセイプレート内に含有された標準ｃＡＭＰ曲線から外挿する。
【０１４１】
レポーターベースアッセイ：
Ｃｒｅ−Ｌｕｃレポーターアッセイ（Ｇｓ関連受容体）：大グリア細胞は１ウェル当たり２×１０４細胞の密度で９６ウェルプレート上に蒔き、製造業者の指示書にしたがって翌日、リポフェクトアミン試薬（ＢＲＬ社製）を用いてトランスフェクトした。ＤＮＡ／脂質混合物は各６ウェルトランスフェクションのために下記のとおりに調製する：１００μＬのＤＭＥＭ中の２６０ｎｇのプラスミドＤＮＡを１００μＬのＤＭＥＭ中の２μＬの脂質と穏やかに混合した（２６０ｎｇのプラスミドＤＮＡは２００ｎｇの８×ＣＲＥ−Ｌｕｃレポータープラスミド、内因性受容体もしくは非内因性受容体を含む５０ｎｇのｐＣＭＶまたはｐＣＭＶ単独、および１０ｎｇのＧＰＲＳ発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）中のＧＰＲＳ）から構成された。８×ＣＲＥ−Ｌｕｃ受容体プラスミドは下記のとおりに調製した：ベクターＳＲＩＦ−β−ｇａｌは、ｐβｇａｌ−Ｂａｓｉｃ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）中のＢｇｌＶ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位でラットソマトスタチンプロモーター（−７１／＋５１）をクローニングすることによって入手した。８コピーのｃＡＭＰ応答エレメントをＰＣＲによってアデノウイルステンプレートＡｄｐＣＦ１２６ＣＣＲＥ８（７ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １８８３（１９９６）を参照されたい）から入手し、Ｋｐｎ−ＢｇｌＶ部位でＳＲＩＦ−β−ｇａｌベクター内へクローニングすると、８×ＣＲＥ−β−ｇａｌレポーターベクターが生じた。この８×ＣＲＥ−Ｌｕｃレポータープラスミドは、８×ＣＲＥ−β−ｇａｌレポーターベクター内のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子をＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ部位でｐＧＬ３−ベーシックベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）から入手したルシフェラーゼ遺伝子と置換することによって作製した。室温での３０分間のインキュベーション後、４００μＬのＤＭＥＭを用いてＤＮＡ／脂質混合物を希釈し、希釈混合物１００μＬを各ウェルへ添加した。細胞培養インキュベーター内での４時間のインキュベーション後、各ウェルへ１０％ＦＣＳを含む１００μＬのＤＭＥＭを添加した。翌日、トランスフェクトした細胞は１０％ＦＣＳを含む２００μＬ／ウェルのＤＭＥＭに変更した。８時間後、ウェルは、ＰＢＳを用いた１回の洗浄後、フェノールレッドを含まない１００μＬ／ウェルのＤＭＥＭへ変更した。ルシフェラーゼ活性は、製造業者の指示書にしたがってＬｕｃＬｉｔｅ（商標）レポーター遺伝子アッセイキット（Ｐａｃｋａｒｄ社製）を用いて翌日測定し、１４５０ ＭｉｃｒｏＢｅｔａ（商標）シンチレーションおよびルミネセンスカウンター（Ｗａｌｌａｃ社製）上で読み取った。
【０１４２】
ＡＰ１レポーターアッセイ（Ｇｑ関連受容体）：
Ｇｑ刺激を検出する方法は、Ｇｑ依存性ホスホリパーゼＣがそれらのプロモーター中でＡＰ１エレメントを含有する遺伝子の活性化を誘発する既知の特性に左右される。ＰａｔｈｄｅｔｅｃｔＴＭＡＰ−１ ｃｉｓ−Ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製、カタログ番号２１９０７３）は、リン酸カルシウム沈降物の構成成分が４１０ｎｇのｐＡＰ１−Ｌｕｃ、８０ｎｇのｐＣＭＶ−受容体発現プラスミド、および２０ｎｇのＣＭＶ−ＳＥＡＰであった以外は、ＣＲＥＢレポーターアッセイに関して上述したプロトコールセットにしたがって使用できる。
【０１４３】
ＳＲＦ−Ｌｕｃレポーターアッセイ（Ｇｑ関連受容体）：
Ｇｑ刺激を検出する１つの方法は、Ｇｑ依存性ホスホリパーゼＣがそれらのプロモーター中で血清応答因子を含有する遺伝子の活性化を誘発する既知の特性に左右される。Ｐａｔｈｄｅｔｅｃｔ（商標）ＳＲＦ−Ｌｕｃ−Ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を使用すると、例えばＣＯＳ７細胞中でＧｑ共役活性についてアッセイすることができる。細胞は、Ｍａｍｍａｌｉａｎ ＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＴＭ
Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製、カタログ番号２００２８５）を製造業者の指示書にしたがって用いて、本システムのプラスミド構成成分および内因性もしくは非内因性ＧＰＣＲをコードする指定発現プラスミドを用いてトランスフェクトされる。手短には、４１０ｎｇのＳＲＦ−Ｌｕｃ、８０ｎｇのｐＣＭＶ−受容体発現プラスミドおよび２０ｎｇのＣＭＶ−ＳＥＡＰ（分泌アルカリホスファターゼ発現プラスミド；サンプル間のトランスフェクト効率における変動について対照するためにアルカリホスファターゼ活性はトランスフェクトした細胞の培地中で測定する）を製造業者の指示書にしたがってリン酸カルシウム沈降物中で結合させる。沈降物の半分を９６ウェルプレート上の３つのウェルの上方に同等に分布させ、血清無含有培地中で細胞を２４時間維持する。最後の５時間に、細胞を選択した化合物と一緒にインキュベートする。次いで細胞を溶解させ、ＬｕｃｌｉｔｅＴＭキット（Ｐａｃｋａｒｄ社製、カタログ番号６０１６９１１）ならびに「Ｔｒｉｌｕｘ １４５０ Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ」液体シンチレーションおよびルミネセンスカウンター（Ｗａｌｌａｃ社製）を製造業者の指示書にしたがって用いてルシフェラーゼ活性についてアッセイする。データは、ＧｒａｐｈＰａｄ ＰｒｉｓｍＴＭ２．０ａ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．社製）を用いて分析できる。
【０１４４】
細胞内イノシトール１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）蓄積アッセイ（Ｇｑ関連受容体）：
第１日に、受容体（内因性および／または非内因性）を含む細胞は２４ウェルプレート上で、通常は１ウェルに付き１×１０５細胞でプレートに蒔かれ得る（しかしこの数は最適化できる）。第２日に、細胞は１ウェルに付き５０μＬの血清無含有ＤＭＥＭ中の０．２５μｇのＤＮＡおよび１ウェルに付き５０μＬの血清無含有ＤＭＥＭ中の２μＬリポフェクトアミンを最初に混合することによってトランスフェクトすることができる。溶液を穏やかに混合し、室温で１５〜３０分間にわたりインキュベートする。細胞は０．５ｍＬのＰＢＳを用いて洗浄し、４００μＬの血清無含有培地をトランスフェクション培地と混合し、細胞に添加する。細胞を次に３７℃／５％ ＣＯ２で３〜４時間インキュベートし、トランスフェクション培地を除去し、１ｍＬ／ウェルの標準増殖培地と取り替える。
【０１４５】
第３日に、この細胞を３Ｈ−ミオ−イノシトールを用いて標識する。手短には、培地を除去し、０．５ｍＬのＰＢＳを用いて細胞を洗浄する。１ウェルに付き０．５ｍＬのイノシトール無含有／血清無含有培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）とともに１ウェルに付き０．２５μＣｉの３Ｈ−ミオ−イノシトールを添加し、細胞を３７℃／５％ＣＯ２で１６〜１８時間にわたりインキュベートする。第４日に、０．５ｍＬのＰＢＳを用いて細胞を洗浄し、１０μＭパルジリン、１０ｍＭ塩化リチウムを含むイノシトール無含有／血清無含有培地を含有する０．４５ｍＬのアッセイ培地、または０．４ｍＬのアッセイ培地および最終濃度が１０μＭになるような５０μＬの１０×ケタンセリン（ｋｅｔ）を添加する。この細胞を次に３７℃で３０分間インキュベートする。０．５ｍＬのＰＢＳを用いて細胞を洗浄し、１ウェルに付き２００μＬの新鮮／氷冷停止液（１Ｍ ＫＯＨ；１８ｍＭ ホウ酸ナトリウム溶液；３．８ｍＭ ＥＤＴＡ）を添加する。この溶液を氷上で５〜１０分間または細胞が溶解するまで維持し、次に２００μＬの新鮮／氷冷中和溶液（７．５％ＨＣｌ）によって中和する。
【０１４６】
この溶解液を１．５ｍＬのエッペンドルフチューブ内へ移し、チューブ１本に付き１ｍＬのクロロホルム／メタノール（１：２）を添加する。この溶液を１５秒間ボルテックスミキサーにかけ、上層をＢｉｏｒａｄ ＡＧ１−Ｘ８ＴＭアニオン交換樹脂（１００〜２００メッシュ）へ適用する。最初に、１：１．２５（Ｗ／Ｖ）で水を用いて樹脂を洗浄し、０．９ｍＬの上層をカラムへ入れる。１０ｍＬの５ｍＭミオ−イノシトールおよび１０ｍＬの５ｍＭホウ酸ナトリウム／６０ｍＭギ酸ナトリウムを用いてカラムを洗浄する。２ｍＬの０．１Ｍギ酸／１Ｍギ酸アンモニウムを含む１０ｍＬのシンチレーションカクテルを含有するシンチレーションバイアル内へイノシトールＴｒｉｓリン酸塩を溶出させる。このカラムは１０ｍＬの０．１Ｍギ酸／３Ｍギ酸アンモニウムを用いて洗浄する工程によって再生され、ｄｄＨ２Ｏを用いて２回すすぎ洗いし、４℃の水中へ保管される。
【０１４７】
細胞内カルシウム濃度を測定するための蛍光測定イメージングプレートリーダー（ＦＬＩＰＲ）アッセイ：
各クローン系から安定性にトランスフェクトした標的受容体（実験的）およびｐＣＭＶ（ネガティブコントロール）細胞を、翌日アッセイするために、完全培養培地（１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウムを含むＤＭＥＭ）を含むポリ−Ｄ−リジン前処理９６ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製、番号３５６６４０）内へ１ウェルにつき５．５×１０４細胞で播種する。Ｆｌｕｏ４−ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社製、番号Ｆ１４２０２）インキュベーションバッファーストック液を調製するために、１ｍｇ Ｆｌｕｏ４−ＡＭを４６７μＬのＤＭＳＯおよび４６７μＬのＰｌｕｏｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社製、番号Ｐ３０００）中へ溶解させて、−２０℃で１カ月間にわたり保管できる１ｍＭストック溶液を入手する。Ｆｌｕｏ４−ＡＭは、蛍光カルシウム指示染料である。
【０１４８】
候補化合物は、洗浄バッファー（１×ＨＢＳＳ／２．５ｍＭ プロベニシド（Ｐｒｏｂｅｎｉｃｉｄ）／２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４））中で調製される。
【０１４９】
アッセイ時に、培地をウェルから取り除き、この細胞に１００μＬの４μＭ Ｆｌｕｏ４−ＡＭ／２．５ｍＭ プロベニシド（Ｓｉｇｍａ社製、番号Ｐ８７６１）／２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／完全培地（ｐＨ７．４）を添加する。３７℃／５％ ＣＯ２でのインキュベーションを６０分間にわたり進行させる。
【０１５０】
１時間のインキュベーション後、Ｆｌｕｏ４−ＡＭインキュベーションバッファーを取り除き、１００μＬの洗浄バッファーを用いて細胞を２回洗浄する。各ウェル内に１００μＬの洗浄バッファーを放置する。プレートを６０分間にわたり３７℃／５％ＣＯ２に設定したインキュベーターに戻す。
【０１５１】
ＦＬＩＰＲ（蛍光測定イメージングプレートリーダー；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ社製）を、３０秒毎に５０μＬの候補化合物を添加し、その後の１５０秒間について候補化合物によって引き起こされる細胞内カルシウム濃度（［Ｃａ２＋］）の一過性変化を記録するようにプログラミングする。ＦＬＩＰＲソフトウエアを用いてアゴニスト活性を決定するために全蛍光変化数を使用する。機器のソフトウエアは、ゼロで同等の初期読み取り値を得るように蛍光読み取り値を標準化する。
【０１５２】
一部の実施形態では、標的受容体を含む細胞は、無差別Ｇα１５／１６またはキメラＧｑ／Ｇｉαユニットをさらに含んでいる。
【０１５３】
上記は安定性にトランスフェクトした細胞を用いてアゴニスト活性についてのＦＬＩＰＲアッセイを提供するが、当業者であればアンタゴニスト活性を特性解析するために本アッセイを容易に改変できるであろう。前記当業者は、あるいはまた一過性トランスフェクト細胞も使用できることを容易に理解するであろう。
【０１５４】
上記の試験結果および考察から、本発明が嗅覚ＧＰＣＲを産生するための重要な新規手段を提供することが明らかである。詳細には、本発明は嗅覚ＧＰＣＲ調節因子を見いだすための化学物質ライブラリーをスクリーニングするためのシステムを提供する。したがって、本方法およびシステムは、研究、食品および芳香剤の改良を含む様々な用途、およびその他の用途において利用される。したがって、本発明は当技術分野にとって有意な貢献を意味する。
【０１５５】
【表１−１】
【０１５６】
【表１−２】
【０１５７】
【表１−３】
【０１５８】
【表１−４】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【図１】
【公開番号】特開２０１１−１３９７０９（Ｐ２０１１−１３９７０９Ａ）
【公開日】平成２３年７月２１日（２０１１．７．２１）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１１−４３２９０（Ｐ２０１１−４３２９０）
【出願日】平成２３年２月２８日（２０１１．２．２８）
【分割の表示】特願２００６−５４１３２２（Ｐ２００６−５４１３２２）の分割
【原出願日】平成１６年１１月１５日（２００４．１１．１５）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＥＦＬＯＮ
【出願人】（５００４７８０９７）アリーナ ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド (97)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年７月２１日（２０１１．７．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−４３２９０（Ｐ２０１１−４３２９０）
【出願日】平成２３年２月２８日（２０１１．２．２８）
【分割の表示】特願２００６−５４１３２２（Ｐ２００６−５４１３２２）の分割
【原出願日】平成１６年１１月１５日（２００４．１１．１５）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＥＦＬＯＮ
【出願人】（５００４７８０９７）アリーナ ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド (97)
【Ｆターム（参考）】
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