器官または組織の損傷を検出する方法
本発明は、器官または組織の傷害の存在を検出、評価、および／または診断するための方法に関する。より具体的に述べると、本発明は、器官（例えば、肝臓）または組織（例えば、皮膚）の傷害を検出、評価、および／または診断するのに用いうる具体的な血清バイオマーカーを検出する方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、器官または組織の傷害を検出、評価、および／または診断するための方法に関する。より具体的に述べると、本発明は、器官または組織の薬物誘導性傷害を検出、評価、および／または診断するのに用いうる具体的な血清バイオマーカーを検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
製薬の分野では、薬物有害反応（ＡＤＲ）が主要な臨床的懸念であり、薬物開発における損耗の重大な原因である。
【０００３】
肝毒性は、薬物損耗の特に顕著な原因である（１、２）。肝臓において、薬物が化学的に反応性の代謝物へと代謝されることは、薬物性肝障害（ＤＩＬＩ）における重要な因子である（３、４）。しかし、薬物の生体内活性化の化学反応と毒性転帰とを連関付ける細胞内イベントについてはほとんど理解されていない。ＤＩＬＩをもたらす機構および経路をよりよく理解することにより、臨床管理が改善され、臨床で用いるのにより安全な薬剤のデザインについての情報が得られる。
【０００４】
加えて、多くの薬物はまた、皮膚（刺激、発疹など）、肺、腎臓、および心臓など、他の器官および組織に対しても毒性でありうる。重篤な症例では、この毒性により薬物損耗がもたらされる場合もあり、さらなる臨床管理が必要とされる場合もある。また、皮膚毒性、肺毒性、腎毒性、および心毒性をもたらす機構および経路をよりよく理解すれば、有益でもあるだろう。
【０００５】
薬物開発のペースを加速化させ、損耗を低減し、それ自体生物学的に有益なバイオマーカーの重要性は、製薬分野において一般に認識されつつある。アポトーシス、壊死、および炎症の選択的なバイオマーカーを容易に検出することができれば、肝臓、皮膚、肺、腎臓、または心臓の薬物誘導性傷害など、器官傷害の基礎原因を鑑別するのに極めて有益であろうし、将来的に、臨床的介入を支援するためのさらなる情報が得られ、より安全な薬物開発のための情報が得られることになる。
【発明の概要】
【０００６】
例えば、肝臓の傷害と関連するアラニンアミノトランスアミナーゼ（ＡＬＴ）など、器官傷害と関連するバイオマーカーがいくつか存在する。しかし、これらのバイオマーカーを検出しても、器官損傷の基礎的機構または経過についての情報は明らかとならない。
【０００７】
したがって、器官または組織の薬物誘導性傷害を検出および／または評価するための、簡略かつ簡便であり、また、器官または組織の損傷を早期に検出することを可能とするのに十分な程度に高感度でもある手法を提供することが、本発明の目的である。
【０００８】
器官または組織の薬物誘導性傷害の一因となる基礎的な機構および経路の評価を可能とする方法を提供することがさらなる目的である。
【０００９】
本発明は、アポトーシス、壊死、および炎症の具体的な血清バイオマーカーを、簡便かつ非侵襲的に検出する能力による。これらの血清バイオマーカーのすべてを併せて検出し、それらの検出を、具体的な器官または組織において生じる薬物誘導性毒性と相関させることができれば、傷害過程に関与する基礎的な機構および経路を評価することが可能となる。
【００１０】
薬物により引き起こされる器官および組織の損傷は、アポトーシス過程、壊死過程、および炎症過程のうちの１つ以上を伴いうる。どの基礎的過程が生じているか、ならびに各過程の相対的寄与を評価できれば、器官または組織に進行中の傷害の性質および病期をよりよく理解することが可能となる。それはまた、標的化された臨床的介入により、傷害または損傷が生じる程度を制限する機会も可能とする。さらに、ある期間にわたりこれらのバイオマーカーをモニタリングすることにより、器官または組織の傷害の経過をモニタリングすることができる。
【００１１】
また、このようにして器官または組織の損傷を検出および／または評価することができれば、潜在的な新規の治療剤の毒性についてスクリーニングするのにも極めて有用であろう。
【００１２】
したがって、本発明は、ヒト対象もしくは動物対象における薬物誘導性アポトーシス、薬物誘導性壊死、および／または薬物誘導性炎症を検出および評価する方法であって、前記対象から得られる血清試料を、
（ｉ）アポトーシスに特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉ）壊死に特異的な血清バイオマーカー；および
（ｉｉｉ）炎症に特異的な血清バイオマーカー
について調べるステップを含む方法を提供する。
【００１３】
本発明はまた、器官もしくは組織の薬物誘導性損傷を検出、評価、および／または診断する方法であって、
（ｉ）アポトーシスに特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉ）壊死に特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉｉ）炎症に特異的な血清バイオマーカー
の存在を判定するために血清試料を調べるステップと、
前記血清バイオマーカーのうちの１つ以上の存在を、器官または組織に特異的な損傷の指標と相関させるステップと
を含む方法も提供する。
【００１４】
さらなる態様では、本発明が、器官または組織と関連する、薬物誘導性アポトーシス、薬物誘導性壊死、および薬物誘導性炎症の存在を検出ならびに／または評価する方法であって、
（ｉ）アポトーシスに特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉ）壊死に特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉｉ）炎症に特異的な血清バイオマーカー
の存在を判定するために血清試料を調べるステップと、
前記血清バイオマーカーのうちの１つ以上の存在を、器官または組織に特異的な損傷の指標と相関させるステップと
を含む方法を提供する。
【００１５】
なお別の態様では、本発明が、ヒト対象もしくは動物対象への薬物の投与により引き起こされる器官または組織の損傷の発症機序をモニタリングする方法であって、
（ｉ）アポトーシスに特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉ）壊死に特異的な血清バイオマーカー；および
（ｉｉｉ）炎症に特異的な血清バイオマーカー
の存在を判定するために前記対象に由来する血清試料を調べるステップと、
前記血清バイオマーカーのうちの１つ以上の存在を、器官または組織に特異的な損傷の指標と相関させるステップと
を含む方法を提供する。
【００１６】
さらなる態様では、本発明が、器官または組織の薬物誘導性損傷を検出および／または評価するアッセイであって、
アポトーシスに特異的な血清バイオマーカーを検出する手段と；
壊死に特異的な血清バイオマーカーを検出する手段と；
炎症に特異的な血清バイオマーカーを検出する手段と
を含むアッセイを提供する。
【００１７】
さらなる態様では、本発明がまた、本明細書でさらに定義される、器官の損傷を検出、評価、および／または診断するためのキットも提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、アポトーシス、壊死、および／または炎症の血清バイオマーカーの存在を検出する能力による。これは、ヒト対象または動物対象から得られる血清試料を、
（ｉ）アポトーシスに特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉ）壊死に特異的な血清バイオマーカー；および
（ｉｉｉ）炎症に特異的な血清バイオマーカー
について調べることにより達成される。
【００１９】
本明細書で定義される本発明の方法を実施するのに必要とされる血清試料は、当技術分野で知られる従来の技法を用いて、ヒト対象または動物対象から得る。ヒト対象または動物対象は、器官または組織の損傷を有することが疑われる対象の場合もあり、器官または組織の損傷が生じつつあるかどうかを決定するためにモニタリングを必要とする対象の場合もある。
【００２０】
本発明の方法は、非侵襲的であることが適切である。「非侵襲的」とは、ヒト対象または動物対象から得られる血清試料に対して、ヒトまたは動物の体外でそれらの方法を実施することを意味する、すなわち、該方法は、ヒトまたは動物の身体に対して直接は実施されない。
【００２１】
＜血清バイオマーカー＞
（ｉ）ケラチン１８
ケラチンとは、細胞の構造および完全性の一因となる、上皮細胞により発現される中間線維タンパク質である。Ｆａｓ媒介性アポトーシスの早期には、ケラチン１８（Ｋ１８）内の重要なセリン残基がリン酸化する（１２）。カスパーゼ媒介型Ｋ１８切断もまた、アポトーシス時における細胞構造再編成の早期イベントである（１３）。カスパーゼ３、７、および９は、Ｃ末端のＤＡＬＤ／ＳモチーフにおいてＫ１８を切断することに関与し、カスパーゼ６は、リンカー領域Ｌ１〜２内のＶＥＶＤ／ＡモチーフにおいてＫ１８を切断することが示されている。壊死性細胞死時には、全長Ｋ１８が受動的に放出され、アポトーシス時には、生成された断片化されたＫ１８が血液中に放出されて、時間が経過するにつれて蓄積されうる（１４）。Ｋ１８のアポトーシス関連形態に対する抗体が作製され、ｉｎ ｖｉｖｏ状況および臨床状況において精査されている（１５、１６）。臨床モデルおよび動物モデルにおいて、患者における化学療法剤の薬力学的治療薬モニタリングを行うとき（１７）、ならびに、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）（１８）およびＣ型肝炎ウイルス感染（１９）などの肝障害時におけるアポトーシスを定量化するのに、血清中で定量化されるカスパーゼ切断型Ｋ１８および全長Ｋ１８が、それぞれ、アポトーシスマーカーおよび壊死マーカーとして用いられている。
【００２２】
全長Ｋ１８とは、全長Ｋ１８タンパク質および／またはカスパーゼ切断を受けていないＫ１８を意味する。
【００２３】
本発明の具体的な実施形態では、カスパーゼ切断型Ｋ１８を、薬物誘導性アポトーシスに特異的な血清バイオマーカーとして用いる。疑念を回避する目的で述べると、カスパーゼ切断型Ｋ１８とは、カスパーゼ酵素により切断されたＫ１８タンパク質を意味する。上記で示した通り、カスパーゼ酵素は、ＤＡＬＤ／ＳモチーフまたはＶＥＶＤ／ＡモチーフにおいてＫ１８を切断する。
【００２４】
さらなる実施形態では、壊死性細胞死において不動態で放出される全長Ｋ１８を、壊死の血清バイオマーカーとして用いる。疑念を回避する目的で述べると、全長Ｋ１８とは、カスパーゼ酵素により（ＤＡＬＤ／Ｓモチーフおよび／またはＶＥＶＤ／Ａモチーフにおいて）切断されていないＫ１８タンパク質を意味する。
【００２５】
ヒト、マウス、およびラットにおける全長Ｋ１８タンパク質の配列を、それぞれ、配列番号１、２、および３に示す。
【００２６】
全長Ｋ１８およびカスパーゼ切断型Ｋ１８は、当技術分野で知られる、任意の適切な技法により検出することができる。例えば、これらのバイオマーカーはいずれも、免疫ベースのアッセイ（ＵＳ６，２９２，８５０、ＵＳ６，７１６，９６８、およびＵＳ６，７０６，４８８において開示されているＥＬＩＳＡおよびイムノアッセイなど）、質量分析法（全長Ｋ１８断片と、カスパーゼ切断型Ｋ１８断片との質量差を検出しうる）、およびＨＰＬＣ法により検出することができる。
【００２７】
本発明のある実施形態では、カスパーゼ切断型Ｋ１８および全長Ｋ１８を、免疫ベースのアッセイ、とりわけ、ＥＬＩＳＡを用いて検出および定量化する。ＥＬＩＳＡは、タンパク質のバイオマーカーを検出するための、よく知られていて確立された技法である。
【００２８】
代替的な実施形態では、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析を用いて、カスパーゼ切断型Ｋ１８および／または全長Ｋ１８をいずれも簡便に検出および定量化することができる。
【００２９】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるカスパーゼ切断型Ｋ１８および全長Ｋ１８についての検出および解析を容易にするには、適切なプロテアーゼ酵素を用いて血清Ｋ１８を断片へと部分消化することが望ましい。
【００３０】
Ｋ１８タンパク質を部分消化することにより形成されるペプチド断片のうちの１つは、カスパーゼ切断モチーフのうちの１つにわたることが適切である。適切であればどのプロテアーゼ酵素でもこの目的で用いうるであろうし、当業者は、質量分析による検出に適する断片を生成させる適切な酵素、または酵素の混合物を選択することができる。
【００３１】
Ｋ１８を部分消化することにより生成される断片のうちの１つが、カスパーゼ切断モチーフのうちの１つにわたることは、これにより、カスパーゼ切断モチーフが切断されていない断片（すなわち、壊死において放出される全長Ｋ１８）、ならびにカスパーゼ切断を受けた対応する断片（すなわち、アポトーシスと関連する断片）を、質量分析により検出および差別化することが可能となるため、重要である。
【００３２】
具体的な実施形態では、形成されるペプチド断片は、カスパーゼ３、７、および９の切断部位（すなわち、ＤＡＬＤ／Ｓモチーフ）にわたる。
【００３３】
本発明の特定の実施形態では、Ｋ１８タンパク質を部分消化するのに用いられるプロテアーゼがトリプシンであり、これは、アミノ酸であるリシンまたはアルギニンのカルボキシル側においてペプチド結合を切断する。
【００３４】
血清Ｋ１８をトリプシンで部分消化することにより形成され、カスパーゼ３、７、および９の標的となるＤＡＬＤ／Ｓ切断モチーフにわたる全長Ｋ１８断片を、配列番号４（ヒト）、５（マウス）、および６（ラット）に示す。これらの断片は、質量分析により検出することができる。
【００３５】
カスパーゼ切断型Ｋ１８断片をトリプシンで消化すると、配列番号７（ヒト）、８（マウス）、および９（ラット）に示す断片が形成される。これらの断片は、質量分析により検出することができる。
【００３６】
市販されている合成Ｋ１８ペプチド断片は、被験種に由来する、Ｋ１８を含まない対照血清中に添加した場合に質量分析計で観察されるピーク強度を較正するための基準物質として用いることができる。これは、得られるピーク強度および曲線下面積を、合成ペプチド断片を用いて得られる較正強度と比較することにより、それぞれの血清Ｋ１８断片の量を定量化することを可能とする。
【００３７】
質量分析を用いることにより、これら２つのＫ１８バイオマーカーの存在を、血清試料中において容易に決定することが可能となる。さらに、単回のアッセイにおいてデータを発生させることができる。
【００３８】
（ｉｉ）ＨＭＧＢ−１（ｈｉｇｈ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｇｒｏｕｐ ｂｏｘ １）
近年の証拠は、免疫系の注意を死滅細胞へと促すのにＨＭＧＢ−１（ｈｉｇｈ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｇｒｏｕｐ ｂｏｘ ｐｒｏｔｅｉｎ １）が果たす重要な役割について示唆している（２０、２１）。ＨＭＧＢ−１は、炎症促進活性を有し、標的細胞におけるＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）および終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ）を標的とする、核結合タンパク質である（２２、２３）。ＨＭＧＢ−１は、活性化した自然免疫細胞に由来する別個のリシン残基から過剰アセチル化形態で放出され（２４）、壊死細胞から不動態の低アセチル化形態で放出されるが、アポトーシス細胞または二次的壊死細胞によっては放出されない（２１）と考えられている。抗ＨＭＧＢ−１抗体は、インビボにおけるＡＰＡＰによる肝毒性およびエンドトキシンによる致死性を随伴させる炎症応答を阻害する（２１、２５）。
【００３９】
本発明の具体的な実施形態では、ＨＭＧＢ−１の低アセチル化形態を、壊死に特異的な血清バイオマーカーとして検出する。
【００４０】
さらなる実施形態では、ＨＭＧＢ−１の過剰アセチル化形態が、炎症に特異的な血清バイオマーカーである。
【００４１】
それぞれ、壊死細胞および自然免疫細胞により放出される、ＨＭＧＢ−１の低アセチル化形態および過剰アセチル化形態のいずれもが、当技術分野で知られる任意の適切な技法により検出されうる。例えば、これらのバイオマーカーはいずれも、免疫ベースのアッセイ（米国第６，２９２，８５０号、米国第６，７１６，９６８号、および米国第６，７０６，４８８号において開示されているＥＬＩＳＡおよびイムノアッセイなど）、質量分析法（ＨＭＧＢ−１の低アセチル化形態と、過剰アセチル化形態との質量差を検出しうる）、ならびに、これらのＨＭＧＢ−１バイオマーカーの保持時間を決定しうるＨＰＬＣ法により検出することができる。
【００４２】
本発明のある実施形態では、ＨＭＧＢ−１の低アセチル化形態および／または過剰アセチル化形態を、免疫ベースのアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）により検出する。
【００４３】
代替的な実施形態では、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析を用いて、ＨＭＧＢ−１の低アセチル化形態および／または過剰アセチル化形態を検出および定量化することができる。さらに、単回のアッセイにおいてデータを発生させることができて簡便である。
【００４４】
ヒト、マウス、およびラットにおけるＨＭＧＢ−１配列を、それぞれ、配列番号１０、１１、および１２に示す。
【００４５】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる検出の場合、タンパク質をペプチド断片へと切断する酵素により血清ＨＭＧＢ−１を部分消化してから質量分析による検出を行うことが適切である。
【００４６】
ＨＭＧＢ−１の過剰アセチル化形態においてアセチル化するのは、ＨＭＧＢ−１タンパク質配列中に存在するリシン残基である。したがって、質量分析法を用いて、アセチル化していないペプチド断片（ＨＭＧＢ−１の低アセチル化形態と対応する）と、アセチル化したペプチド断片（過剰アセチル化形態と対応する）との質量差を検出することができる。
【００４７】
質量分析により検出されるＨＭＧＢ−１ペプチド断片は、少なくとも１つのリシン残基を含むことが適切である。検出されるペプチド断片は、２つ以上のリシン残基を含むことが好ましく、３つ以上のリシン残基を含むことがなおより好ましい。
【００４８】
具体的な実施形態では、ＨＭＧＢ−１を部分消化することにより形成されるペプチド断片が、ＨＭＧＢ−１タンパク質の核局在化領域に由来する１つ以上のリシン残基を含む。この領域内に存在するリシン残基は、図１Ｃに示されるリシン１７２、１７３、１７７、１８０、および１８２〜５である。
【００４９】
具体的な実施形態では、酵素であるＧＬｕＣを用いて、血清ＨＭＧＢ−１を部分消化する。ＧＬｕＣは、配列番号１３、１４、または１５に示される断片を生成させる。配列番号１３、１４、または１５に示される配列の非アセチル化形態と、リシン残基上にさらに５つのアセチル基を保有するアセチル化形態との差違は、質量分析により容易に検出することができる。
【００５０】
ＨＭＧＢ−１タンパク質はまた、酸化形態でも存在することが知られている。ＨＭＧＢ−１の酸化形態は、ＨＭＧＢ−１のサイトカインドメイン内のＣ１０６による酸化スルフヒドリル基からなる（図７Ａを参照されたい）。Ｃ１０６によるスルフヒドリル基の酸化は、酵素であるカスパーゼにより促進され、アポトーシス細胞におけるＨＭＧＢ−１の炎症特性を中和するのに重要な役割を果たす（３９）。したがって、ＨＭＧＢ−１の酸化形態が存在すれば、また、ＨＭＧＢ−１の炎症特性に抗する抑制応答も表示されうる。したがって、本発明のある実施形態では、本発明の方法が、血清試料を調べて、ＨＭＧＢ−１の酸化形態の存在を判定するステップをさらに含みうる。本明細書で説明されるＨＭＧＢ−１の低アセチル化形態および／または過剰アセチル化形態を検出するのに用いられる任意の技法により、ＨＭＧＢ−１の酸化形態を検出することができる。
【００５１】
＜アッセイの方法＞
本発明のある実施形態では、検出されるアポトーシスに特異的な血清バイオマーカーが、カスパーゼ切断型Ｋ１８である。
【００５２】
本発明のある実施形態では、検出される壊死に特異的な血清バイオマーカーが、全長Ｋ１８および／またはＨＭＧＢ−１の低アセチル化形態である。
【００５３】
本発明のある実施形態では、検出される壊死に特異的な血清バイオマーカーが、全長Ｋ１８である。
【００５４】
本発明のある実施形態では、検出される壊死に特異的な血清バイオマーカーが、ＨＭＧＢ−１の低アセチル化形態である。
【００５５】
本発明のある実施形態では、検出される壊死に特異的な血清バイオマーカーが、全長Ｋ１８およびＨＭＧＢ−１の低アセチル化形態である。
【００５６】
本発明のある実施形態では、検出される炎症に特異的な血清バイオマーカーが、ＨＭＧＢ−１の過剰アセチル化形態である。
【００５７】
本発明のさらなる実施形態では、血清試料を、ＨＭＧＢ−１の酸化形態の存在についてさらに調べる。
【００５８】
したがって、具体的な実施形態では、本発明の方法が、
（ｉ）カスパーゼ切断型Ｋ１８；
（ｉｉ）全長Ｋ１８および／またはＨＭＧＢ−１の低アセチル化形態；ならびに
（ｉｉｉ）ＨＭＧＢ−１の過剰アセチル化形態
の存在を判定するために血清試料を調べるステップを含む。
【００５９】
特定の実施形態では、本発明の方法が、血清試料を調べて、
（ｉ）カスパーゼ切断型Ｋ１８；
（ｉｉ）全長Ｋ１８；および
（ｉｉｉ）ＨＭＧＢ−１の過剰アセチル化形態
の存在を判定するステップを含む。
【００６０】
別の特定の実施形態では、本発明の方法が、
（ｉ）カスパーゼ切断型Ｋ１８；
（ｉｉ）ＨＭＧＢ−１の低アセチル化形態；および
（ｉｉｉ）ＨＭＧＢ−１の過剰アセチル化形態
の存在を判定するために血清試料を調べるステップを含む。
【００６１】
さらなる実施形態では、本発明の方法が、
（ｉ）カスパーゼ切断型Ｋ１８；
（ｉｉ）全長Ｋ１８およびＨＭＧＢ−１の低アセチル化形態；ならびに
（ｉｉｉ）ＨＭＧＢ−１の過剰アセチル化形態
の存在を判定するために血清試料を調べるステップを含む。
【００６２】
上述の実施形態すべてにおいて、ＨＭＧＢ−１の酸化形態の存在を検出するために血清試料をさらに調べることができる。
【００６３】
上述の通り、本発明のＫ１８バイオマーカーおよびＨＭＧＢ−１バイオマーカーは、当技術分野で知られる任意の適切な手段により検出することができる。例えば、これらのバイオマーカーはいずれも、免疫ベースのアッセイ（米国特許第６，２９２，８５０号、米国特許第６，７１６，９６８号、および米国特許第６，７０６，４８８号において開示されているＥＬＩＳＡおよびイムノアッセイなど）、質量分析法、およびＨＰＬＣ法により検出することができる。
【００６４】
本発明のある実施形態では、Ｋ１８バイオマーカーおよびＨＭＧＢ−１バイオマーカーを、免疫ベースのアッセイ、とりわけ、ＥＬＩＳＡ技法を用いて検出および定量化する。ＥＬＩＳＡアッセイは、タンパク質のバイオマーカーを検出するための、よく知られていて確立された技法である。
【００６５】
代替的な実施形態では、本発明のＫ１８バイオマーカーおよびＨＭＧＢ−１バイオマーカーを、質量分析、とりわけ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析により検出することができる。
【００６６】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる検出は、それにより、上記の血清バイオマーカーのすべて（すなわち、アポトーシスマーカー（カスパーゼ切断型Ｋ１８）、壊死マーカー（全長Ｋ１８および低アセチル化ＨＭＧＢ−１）、および炎症マーカー（過剰アセチル化ＨＭＧＢ−１））を単一の血液試料中で検出しうる、高感度で簡便な手段を提供する。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳはまた、Ｋ１８の２つの形態の比、ならびにＨＭＧＢ−１の２つの形態の比を平行的に決定することも可能とする。これは、発生するアポトーシス、壊死、および炎症の相対量を表示する。
【００６７】
本発明のある実施形態では、質量分析を用いて、カスパーゼ切断型Ｋ１８（アポトーシスに特異的な血清バイオマーカーとして）、全長Ｋ１８およびＨＭＧＢ−１の低アセチル化形態（壊死に特異的な血清バイオマーカーとして）、ならびにＨＭＧＢ−１の過剰アセチル化形態（炎症に特異的な血清バイオマーカーとして）の存在について血清試料を調べる。次いで、アポトーシス、壊死、および／または炎症の存在を、特定の器官または組織と相関させるため、これらのバイオマーカーのうちの１つ以上を、以下でさらに定義する、器官または組織に特異的な損傷の指標の存在と相関させることができる。
【００６８】
本発明のある実施形態では、宿主から得られた血清試料を、２つの個別の試料へと分割し、それらのうちの一方を用いてＨＭＧＢ−１を検出し、それらのうちの他方を用いてＫ１８を検出する。次いで、ＨＭＧＢ−１試料を、ＧＬｕＣなどのプロテアーゼ酵素で処理して、ＨＭＧＢ−１を部分消化して断片を形成し、次いで、それらの低アセチル化形態および過剰アセチル化形態を、上記で論じた質量分析により検出および差別化することができる。Ｋ１８試料もまた、トリプシンなどのプロテアーゼで処理して、血清Ｋ１８タンパク質を断片へと部分消化すると、上記で論じた質量分析により、カスパーゼ切断型形態および全長形態を検出および差別化することが可能となる。
【００６９】
代替的な実施形態では、方法が、
Ｋ１８タンパク質成分およびＨＭＧＢ−１タンパク質成分を血清試料から分離するステップと、
質量分析により検出しうる断片を形成するようにＫ１８タンパク質を部分消化するステップと、
質量分析により検出しうる断片を形成するようにＨＭＧＢ−１タンパク質を部分消化するステップと
を含む。
【００７０】
Ｋ１８タンパク質およびＨＭＧＢ−１タンパク質は、任意の適切なタンパク質分離法、例えば、免疫沈降、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動、ウェスタンブロット法、またはクロマトグラフィーを用いて他の血清成分から分離し、単離することができる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはウェスタンブロットを用いて、血清タンパク質を分離するのが適切である。適切な基準物質を用いて、タンパク質分離法により生成されるＫ１８およびＨＭＧＢ−１を同定することができる。
【００７１】
上記で論じた通り、任意の適切な酵素を用いて、タンパク質を部分消化することができる。
【００７２】
次いで、部分消化後、質量分析によりＫ１８およびＨＭＧＢ−１の断片を検出することができる。
【００７３】
ある実施形態では、本発明の方法が、器官または組織の損傷に特異的な指標についてアッセイするステップをさらに含むことが適切である。以下でさらに論じる通り、多くの場合には、これが、器官または組織に特異的な損傷バイオマーカーについてアッセイするステップを含む。
【００７４】
＜器官または組織に特異的な損傷の指標＞
本明細書では、「器官または組織に特異的な損傷の指標」への言及を、具体的な器官または組織と関連する傷害または損傷の臨床的指標を指すのに用いる。
【００７５】
例えば、肝臓の場合、「器官に特異的な損傷の指標」とは、肝毒性または肝機能について受容されている別の臨床測定値と関連する別のバイオマーカーでありうる。本発明のある実施形態では、肝臓に特異的な損傷の指標は、その存在が肝臓の傷害と関連する血清バイオマーカーである。アポトーシス、壊死、および／または炎症に特異的な血清バイオマーカーのうちの１つ以上と併せて、肝臓に特異的な傷害のバイオマーカーを検出することにより、検出された任意のアポトーシス、壊死、または炎症を、肝臓内で生じつつある傷害と相関させることが可能となる。肝臓の傷害と関連する肝臓に特異的なバイオマーカーの具体例には、ＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）、ＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）、ＡＰ（アルカリホスファターゼ）、ＧＬＤＨ（グルタミン酸デヒドロゲナーゼ）、およびＧＧＴ（ガンマ−グルタミルトランスペプチダーゼ）が含まれる。これらのバイオマーカーの存在について解析する方法はよく知られており、任意の適切な方法を、本発明の方法に従って用いることができる。
【００７６】
皮膚組織の場合、「組織に特異的な損傷の指標」は、臨床的な皮膚状態（発疹、腫脹、かゆみ）の存在でありうる。アポトーシス、壊死、および／または炎症のうちの１つ以上と併せて皮膚状態が存在すれば、検出された任意のアポトーシス、壊死、または炎症を、皮膚組織内で生じつつある傷害と相関させることが可能となる。
【００７７】
肺の場合、「器官に特異的な損傷の指標」には、サーファクタントプロテインＤ、サーファクタントプロテインＡ、またはシンデカン１のうちの１つ以上が含まれうる。これらのバイオマーカーの存在について解析する方法は当技術分野で知られており、本発明の方法に従い任意の適切な方法を用いることができる。
【００７８】
腎臓の場合、「器官に特異的な損傷の指標」には、ＫＩＭ−１、クラステリン、オステオポンチン、β２−マイクログロブリン、レチノール結合タンパク質、β−ＮＡＧ（Ｎ−アセチル−Ｂ−Ｄ−グルコサミダーゼ）、シスタチン−Ｃ、アルブミン、ＧＳＴα、リポカリン（ＮＧＡＬ）、またはＩＬ−１８のうちの１つ以上が含まれうる。これらのバイオマーカーの存在について解析する方法は当技術分野で知られており、本発明の方法に従い任意の適切な方法を用いることができる。
【００７９】
心血管系の場合、損傷の指標は、心臓トロポニンＴおよび／またはＩ（ｃＴｎＴ、ｃＴｎＩ）でありうる。これらのバイオマーカーの存在について解析する方法は当技術分野で知られており、本発明の方法に従い任意の適切な方法を用いることができる。
【００８０】
具体的な実施形態では、本発明の方法は、検出されたアポトーシス、壊死、または炎症を、１つ以上の特定の器官または組織内で生じつつある損傷と相関させうるように、異なる器官または組織と関連する、器官または組織の損傷に特異的な複数の指標の存在についてアッセイするステップをさらに含む。
【００８１】
＜適用＞
本発明の方法は、例えば、新規の薬物などの化学的作用物質を投与した後、ヒト対象または動物対象におけるアポトーシス、壊死、および／または炎症の発生をモニタリングするのに特に有用である。
【００８２】
したがって、一態様では、本発明が、ヒト対象または動物対象への薬物の投与により引き起こされる器官または組織の損傷の病態をモニタリングする方法であって、
（ｉ）本明細書で定義されるアポトーシスに特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉ）本明細書で定義される壊死に特異的な血清バイオマーカー；および
（ｉｉｉ）本明細書で定義される炎症に特異的な血清バイオマーカー
の存在を判定するために前記対象に由来する血清試料を調べるステップと、
前記血清バイオマーカーのうちの１つ以上の存在を、器官または組織に特異的な損傷の指標と相関させるステップと
を含む方法を提供する。
【００８３】
該方法は、血清バイオマーカーのレベルを、器官または組織の薬物誘導性損傷の重症度を示す所定のレベルと相関させるステップをさらに含むことが適切である。
【００８４】
該方法は、検出された血清バイオマーカーのレベルを、所定のレベルと比較するステップを含むことが適切である。該所定のレベルは、薬物の投与を開始する前に対象から得られるベースラインのレベルでありうる。
【００８５】
検出されたバイオマーカーのレベルが高いほど、生じつつある器官または組織の傷害の重症度が重度であることが典型的である。
【００８６】
該方法はまた、選択される期間にわたり対象から採取される血清試料を調べることにより、ある期間にわたりアポトーシス、壊死、および／または炎症の経過をモニタリングするのにも用いることができる。関与するバイオマーカーの存在を迅速に評価することができれば、研究者および／または医師に情報を迅速にフィードバックすることが可能となる。
【００８７】
本発明の方法は、肝臓、皮膚、腎臓、肺、もしくは心血管の傷害／毒性、またはこれらの組合せを検出、評価、および診断するのに特に有用である。
【００８８】
（ｉ）肝損傷の評価
具体的な実施形態では、本発明が、薬物誘導性肝損傷の存在を検出および／または評価する方法であって、
（ｉ）本明細書で定義されるアポトーシスに特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉ）本明細書で定義される壊死に特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉｉ）本明細書で定義される炎症に特異的な血清バイオマーカー
の存在を判定するために血清試料を調べるステップと、
前記血清バイオマーカーのうちの１つ以上の存在を、本明細書で定義される肝臓に特異的な損傷の指標と相関させるステップと
を含む方法を提供する。
【００８９】
さらなる実施形態では、本発明が、薬物誘導性肝損傷を診断する方法であって、
（ｉ）本明細書で定義されるアポトーシスに特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉ）本明細書で定義される壊死に特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉｉ）本明細書で定義される炎症に特異的な血清バイオマーカー
の存在を判定するために動物またはヒトから得られる血清試料を調べるステップと、
前記血清バイオマーカーのうちの１つ以上の存在を、本明細書で定義される肝臓に特異的な損傷の指標と相関させるステップと
を含む方法を提供する。
【００９０】
さらなる実施形態では、本発明が、肝臓における薬物誘導性アポトーシス、薬物誘導性壊死、および薬物誘導性炎症の存在を検出および／または評価する方法であって、
（ｉ）本明細書で定義されるアポトーシスに特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉ）本明細書で定義される壊死に特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉｉ）本明細書で定義される炎症に特異的な血清バイオマーカー
の存在を判定するために血清試料を調べるステップと、
前記血清バイオマーカーのうちの１つ以上の存在を、本明細書で定義される肝臓に特異的な損傷の指標と相関させるステップと
を含む方法を提供する。
【００９１】
肝臓に特異的な損傷の指標を検出するのに当技術分野で知られる任意の方法を用いることが適切である。例えば、肝臓に特異的な損傷の指標としてＡＬＴを検出する場合は、Ｃｕｍｍｉｎｇｓら（１７）において説明されている技法を用いてＡＬＴを測定することができる。
【００９２】
（ｉｉ）皮膚損傷の評価
具体的な実施形態では、本発明が、薬物誘導性皮膚損傷の存在を検出および／または評価する方法であって、
（ｉ）本明細書で定義されるアポトーシスに特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉ）本明細書で定義される壊死に特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉｉ）本明細書で定義される炎症に特異的な血清バイオマーカー
の存在を判定するために血清試料を調べるステップと、
前記血清バイオマーカーのうちの１つ以上の存在を、本明細書で定義される皮膚損傷の臨床的指標と相関させるステップと
を含む方法を提供する。
【００９３】
さらなる実施形態では、本発明が、皮膚における薬物誘導性アポトーシス、薬物誘導性壊死、および薬物誘導性炎症の存在を検出および／または評価する方法であって、
（ｉ）本明細書で定義されるアポトーシスに特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉ）本明細書で定義される壊死に特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉｉ）本明細書で定義される炎症に特異的な血清バイオマーカー
の存在を判定するために血清試料を調べるステップと、
前記血清バイオマーカーのうちの１つ以上の存在を、本明細書で定義される皮膚損傷の臨床的指標と相関させるステップと
を含む方法を提供する。
【００９４】
上記で定義された肝臓または肝臓損傷を検出、評価、および／または診断する方法は、アポトーシスに特異的な血清バイオマーカーとしてのカスパーゼ切断型Ｋ１８、壊死に特異的な血清バイオマーカーとしての全長Ｋ１８およびＨＭＧＢ−１の低アセチル化形態、ならびに炎症に特異的な血清バイオマーカーとしてのＨＭＧＢ−１の過剰アセチル化形態の検出を伴うことが適切である。これらのすべては、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより検出することが簡便でありうる。
【００９５】
皮膚損傷の臨床的指標は、臨床的な皮膚状態（発疹、腫脹、かゆみなど）であることが適切である。
【００９６】
（ｉｉｉ）肺損傷の評価
具体的な実施形態では、本発明が、薬物誘導性肺損傷の存在を検出および／または評価する方法であって、
（ｉ）本明細書で定義されるアポトーシスに特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉ）本明細書で定義される壊死に特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉｉ）本明細書で定義される炎症に特異的な血清バイオマーカー
の存在を判定するために血清試料を調べるステップと、
前記血清バイオマーカーのうちの１つ以上の存在を、本明細書で定義される肺に特異的な損傷の指標と相関させるステップと
を含む方法を提供する。
【００９７】
さらなる実施形態では、本発明が、薬物誘導性肺損傷を診断する方法であって、
（ｉ）本明細書で定義されるアポトーシスに特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉ）本明細書で定義される壊死に特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉｉ）本明細書で定義される炎症に特異的な血清バイオマーカー
の存在を判定するために動物またはヒトから得られる血清試料を調べるステップと、
前記血清バイオマーカーのうちの１つ以上の存在を、本明細書で定義される肺に特異的な損傷の指標と相関させるステップと
を含む方法を提供する。
【００９８】
さらなる実施形態では、本発明が、肺における薬物誘導性アポトーシス、薬物誘導性壊死、および薬物誘導性炎症の存在を検出および／または評価する方法であって、
（ｉ）本明細書で定義されるアポトーシスに特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉ）本明細書で定義される壊死に特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉｉ）本明細書で定義される炎症に特異的な血清バイオマーカー
の存在を判定するために血清試料を調べるステップと、
前記血清バイオマーカーのうちの１つ以上の存在を、本明細書で定義される肺に特異的な損傷の指標と相関させるステップと
を含む方法を提供する。
【００９９】
肺に特異的な損傷の指標を検出するのに当技術分野で知られる任意の方法を用いることが適切である。
【０１００】
（ｉｖ）腎損傷の評価
具体的な実施形態では、本発明が、薬物誘導性腎損傷の存在を検出および／または評価する方法であって、
（ｉ）本明細書で定義されるアポトーシスに特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉ）本明細書で定義される壊死に特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉｉ）本明細書で定義される炎症に特異的な血清バイオマーカー
の存在を判定するために血清試料を調べるステップと、
前記血清バイオマーカーのうちの１つ以上の存在を、本明細書で定義される腎臓に特異的な損傷の指標と相関させるステップと
を含む方法を提供する。
【０１０１】
さらなる実施形態では、本発明が、薬物誘導性肺損傷を診断する方法であって、
（ｉ）本明細書で定義されるアポトーシスに特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉ）本明細書で定義される壊死に特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉｉ）本明細書で定義される炎症に特異的な血清バイオマーカー
の存在を判定するために動物またはヒトから得られる血清試料を調べるステップと、
前記血清バイオマーカーのうちの１つ以上の存在を、本明細書で定義される腎臓に特異的な損傷の指標と相関させるステップと
を含む方法を提供する。
【０１０２】
さらなる実施形態では、本発明が、腎臓における薬物誘導性アポトーシス、薬物誘導性壊死、および薬物誘導性炎症の存在を検出および／または評価する方法であって、
（ｉ）本明細書で定義されるアポトーシスに特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉ）本明細書で定義される壊死に特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉｉ）本明細書で定義される炎症に特異的な血清バイオマーカー
の存在を判定するために血清試料を調べるステップと、
前記血清バイオマーカーのうちの１つ以上の存在を、本明細書で定義される腎臓に特異的な損傷の指標と相関させるステップと
を含む方法を提供する。
【０１０３】
腎臓に特異的な損傷の指標を検出するのに当技術分野で知られる任意の方法を用いることが適切である。
【０１０４】
（ｖ）心血管損傷の評価
具体的な実施形態では、本発明が、薬物誘導性心血管損傷の存在を検出および／または評価する方法であって、
（ｉ）本明細書で定義されるアポトーシスに特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉ）本明細書で定義される壊死に特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉｉ）本明細書で定義される炎症に特異的な血清バイオマーカー
の存在を判定するために血清試料を調べるステップと、
前記血清バイオマーカーのうちの１つ以上の存在を、本明細書で定義される心臓に特異的な損傷の指標と相関させるステップと
を含む方法を提供する。
【０１０５】
さらなる実施形態では、本発明が、薬物誘導性心血管損傷を診断する方法であって、
（ｉ）本明細書で定義されるアポトーシスに特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉ）本明細書で定義される壊死に特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉｉ）本明細書で定義される炎症に特異的な血清バイオマーカー
の存在を判定するために動物またはヒトから得られる血清試料を調べるステップと、
前記血清バイオマーカーのうちの１つ以上の存在を、本明細書で定義される心血管に特異的な損傷の指標と相関させるステップと
を含む方法を提供する。
【０１０６】
さらなる実施形態では、本発明が、心血管組織における薬物誘導性アポトーシス、薬物誘導性壊死、および薬物誘導性炎症の存在を検出および／または評価する方法であって、
（ｉ）本明細書で定義されるアポトーシスに特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉ）本明細書で定義される壊死に特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉｉ）本明細書で定義される炎症に特異的な血清バイオマーカー
の存在を判定するために血清試料を調べるステップと、
前記血清バイオマーカーのうちの１つ以上の存在を、本明細書で定義される心血管に特異的な損傷の指標と相関させるステップと
を含む方法を提供する。
【０１０７】
肺に特異的な損傷の指標を検出するのに当技術分野で知られる任意の方法を用いることが適切である。
【０１０８】
本発明はまた、器官または組織の傷害を検出および／または評価する際における、本明細書で定義されるバイオマーカーの使用も提供する。
【０１０９】
＜アッセイ／キット＞
本発明はまた、器官または組織の薬物誘導性損傷を検出および／または評価するアッセイであって、
本明細書で定義されるアポトーシスに特異的な血清バイオマーカーを検出する手段と；
本明細書で定義される壊死に特異的な血清バイオマーカーを検出する手段と；
本明細書で定義される炎症に特異的な血清バイオマーカーを検出する手段と
を含むアッセイも提供する。
【０１１０】
該アッセイは、器官または組織に特異的な１つ以上の傷害バイオマーカーを検出して、検出された任意のアポトーシス、壊死、または炎症を、１つ以上の具体的な器官および／または組織と相関させる手段をさらに含む。
【０１１１】
ある実施形態では、アッセイが、ＨＭＧＢ−１の酸化形態を検出する手段をさらに含む。
【０１１２】
アポトーシス、壊死、および／または炎症に特異的な血清バイオマーカーを検出する手段は、質量分析またはＥＬＩＳＡなどの免疫アッセイから選択されることが適切である。
【０１１３】
ある実施形態では、器官または組織に特異的な１または複数の傷害バイオマーカーを検出する手段が、ＥＬＩＳＡなどの免疫アッセイである。
【０１１４】
本発明はまた、器官または組織の薬物誘導性傷害を検出および／または評価するキットであって、
カスパーゼ切断型Ｋ１８を検出する試薬と、
全長Ｋ１８および／またはＨＭＧＢ−１の低アセチル化形態を検出する試薬と、
ＨＭＧＢ−１の過剰アセチル化形態を検出する試薬と
を含むキットも提供する。
【０１１５】
ある実施形態では、該キットが、ＨＭＧＢ−１の酸化形態の存在を検出する試薬をさらに含む。
【０１１６】
ある実施形態では、バイオマーカーがＥＬＩＳＡにより検出されることを可能とするのに必要な試薬が、該試薬である。このような試薬には、カスパーゼ切断型Ｋ１８、全長Ｋ１８および／またはＨＭＧＢ−１の低アセチル化形態、ならびにＨＭＧＢ−１の過剰アセチル化形態に特異的な抗体が含まれうる。
【０１１７】
代替的な実施形態では、キットは、質量分析によりバイオマーカーを検出するためのキットである。このようなキットは、
本明細書の前出で定義される、血清Ｋ１８を部分消化するための酵素と、
本明細書の前出で定義される、血清ＨＭＧＢ−１を部分消化するための酵素と、
どのようにして、本明細書で定義される方法のうちの１つに従い試料を調べ、アポトーシス、壊死、および／または炎症が生じつつあるかどうかを決定するかについて詳述する指示書と
を含む。
【０１１８】
本発明のキットは、器官に特異的な器官損傷の指標の存在を検出するための試薬をさらに含みうる。例として述べるなら、このような試薬には、本明細書で定義される、肝臓、腎臓、肺、および／または心臓の傷害バイオマーカーのうちのいずれかを検出するのに必要とされる任意の試薬が含まれうるであろう。例えば、キットを用いて肝損傷を検出するなら、肝臓に特異的なバイオマーカーはＡＬＴでありうるであろうし、この場合、キットは、製造元の指示書に従い用いられる、ＴｈｅｒｍｏＴｒａｃｅ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＡＬＴ Ｌｉｑｕｉｄ安定試薬をさらに含みうる。
【０１１９】
ある実施形態では、キットが、血清タンパク質の分離を可能とする試薬をさらに含む。このような試薬には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動またはウェスタンブロット法のための試薬が含まれうる。このような試薬には、ゲル上で泳動して、Ｋ１８バンドおよびＨＭＧＢ−１バンドの同定を可能とする任意の基準物質、ならびに／またはゲル自体を形成するのに必要とされる任意の試薬が含まれうる。代替的に、キットは、分離カラムを含みうる。
【０１２０】
キットは、血清試料を保持するための基質をさらに含むことが適切である。
【０１２１】
試料中におけるＫ−１８バイオマーカーおよびＨＭＧＢ−１バイオマーカーの存在を評価することにより、アポトーシス、壊死、および／または炎症の検出および評価を容易とする目的で、本発明のキットを、標準的な検査装置と共に用いることができる。質量分析器は、酵素的な部分消化により形成されるＫ１８およびＨＭＧＢ−１の断片を検出するのに不可欠な付加装置部分である。
【０１２２】
以下の図を参照しながら、以下で、本発明をさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】（Ａ）ＡＰＡＰ（５３０ｍｇ／ｋｇ；５時間）または０．９％生理食塩液を投与されたマウスの血清から免疫沈降（ＩＰ）により単離されたＨＭＧＢ１およびＫ１８の形態についての、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシーによる解析を示す図；（Ｂ）リシン残基１８０、１８２〜１８５においてアセチル化したマウスＨＭＧＢ１についてのＭＳ／ＭＳ解析を示す図；（Ｃ）ＡＰＡＰを投与されたマウスの血清中に存在する核局在化配列において、ＭＳ／ＭＳによりアセチル化残基が同定されたマウスＨＭＧＢ１内のリシンについての概略を示す図；（Ｄ）カスパーゼ切断モチーフが切断されていない、４７ｋＤａの全長Ｋ１８についてのＭＳ／ＭＳによる特徴づけを示す図；ならびに（Ｅ）４４ｋＤａの変異体および２１ｋＤａの変異体だけに存在する、カスパーゼ切断モチーフで切断された断片型Ｋ１８についてのＭＳ／ＭＳによる特徴づけを示す図である。図は、１群当たり６匹ずつの動物を表わす。
【図２】（Ａ）ＡＰＡＰ投与（５３０ｍｇ／ｋｇ）３時間後のＨ＆Ｅ染色したマウス肝臓切片を示す図（矢印は、アポトーシス形態を示す肝細胞を指示する。）；（Ｂ）マウス肝臓における切断型カスパーゼ３の免疫組織学的実証を示す図（矢印は、活性カスパーゼ３陽性細胞を示す肝細胞を指示する。）；（Ｃ）ＡＰＡＰ投与（５３０ｍｇ／ｋｇ）５時間後のＨ＆Ｅ染色したマウス肝臓切片を示す図（黒色矢印は、壊死肝細胞を指示する。）；（Ｄ）ＡＰＡＰ投与（５３０ｍｇ／ｋｇ）１５時間後のＨ＆Ｅ染色したマウス肝臓切片を示す図（黒色矢印は、有糸分裂形態を示す肝細胞を指示する。）；（Ｅ）ＡＰＡＰ投与（５３０ｍｇ／ｋｇ）２４時間後のＨ＆Ｅ染色したマウス肝臓切片を示す図（黒色矢印は、有糸分裂形態を示す肝細胞を指示する。以上すべての切片は、２０倍に拡大されている。）；ならびに（Ｆ）ＡＰＡＰ＋Ｚ−ＶＡＤ．ｆｍｋ処置５時間後のＨ＆Ｅ染色したマウス肝臓切片を示す図（１０倍に拡大されている）である。ＣＶ：中央静脈。図は、１群当たり６匹ずつの動物を表わす。
【図３】（Ａ）アガロースゲル解析により決定される、肝臓ＤＮＡラダリングについて、ＡＰＡＰ投与（５３０ｍｇ／ｋｇ、０〜２４時間）後の経時的評価を示す図；（Ｂ）ウェスタンブロットにより決定される、肝臓プロカスパーゼ３（ｐ３２）が活性断片（ｐ１７）へとプロセシングされることについて、ＡＰＡＰ投与（５３０ｍｇ／ｋｇ、０〜２４時間）後の経時的評価を示す図；（Ｃ）ＡＰＡＰ投与（５３０ｍｇ／ｋｇ）マウスの血清中に存在するカスパーゼ切断型Ｋ１８断片レベル（実線；ピコモル／ｍｌ）との、ＡＬＴ活性（点線；Ｕ／ｌ）の経時的な同時的相関を示す図；（Ｄ）全長Ｋ１８レベル（実線；ピコモル／ｍｌ）との、ＡＬＴ活性（点線；Ｕ／ｌ）の経時的な同時的相関を示す図；ならびに（Ｅ）全ＨＭＧＢ１レベル（実線；ｎｇ／ｍｌ）との、ＡＬＴ活性（点線；Ｕ／ｌ）の経時的な同時的相関を示す図である。図は、１群当たり６匹ずつの動物を表わす。データは、平均±標準偏差として与える。統計学的有意性は、「材料および方法」で規定する同じ時点に由来する媒体で処置した対照との関連で割り当てた。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、ならびに＊＊＊ｐ＜０．００５。
【図４】（Ａ）０〜２４時間後の、血清過剰アセチル化ＨＭＧＢ１（免疫細胞に由来する：点線）および血清低アセチル化ＨＭＧＢ１（壊死細胞により放出される：実線）の倍数増大を示す図；（Ｂ）ＡＰＡＰ投与（５３０ｍｇ／ｋｇ）後１０時間にわたる、個々のマウスにおける壊死マーカーとしての血清全長Ｋ１８に対する、アポトーシスマーカーとしての血清カスパーゼ切断型Ｋ１８の相関を示す図（必要に応じて相関係数を示す）；ならびに（Ｃ）マウスにおけるＡＰＡＰ肝毒性のバイオマーカーとしての血清Ｋ１８、血清断片型Ｋ１８、血清ＨＭＧＢ１、血清ＡＬＴの感度および（１−特異度）を示唆するＲＯＣ解析を示す図である。データは、１群当たり６匹ずつのマウスの平均±標準偏差として与える。統計学的有意性は、時点の合致する媒体を投与した対照との関連で割り当てた。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、ならびに＊＊＊ｐ＜０．００５。
【図５】（Ａ）個々の動物の細胞喪失度（組織学スコア）との、血清全長Ｋ１８レベル（ピコモル／ｍｌ）の相関を示す図；（Ｂ）個々の動物の細胞喪失度（組織学スコア）との、血清全ＨＭＧＢ１含量（ｎｇ／ｍｌ）の相関を示す図；（Ｃ）個々の動物のＡＰＡＰ投与（５３０ｍｇ／ｋｇ；５時間）後における、血清全長Ｋ１８レベルとの、血清ＡＬＴ活性（Ｕ／ｌ）の相関を示す図；および（Ｄ）個々の動物のＡＰＡＰ投与（５３０ｍｇ／ｋｇ；５時間）後における、血清全ＨＭＧＢ１含量との、血清ＡＬＴ活性（Ｕ／ｌ）の相関を示す図である。表示の相関係数が必要とされた。
【図６】（Ａ）ＡＰＡＰ（５３０ｍｇ／ｋｇ；５時間）誘導性肝臓ＤＮＡラダリングに対してＺ−ＶＡＤ．ｆｍｋが及ぼす効果を示す図；（Ｂ）ＡＰＡＰ誘導性プロカスパーゼ３プロセシングに対してＺ−ＶＡＤ．ｆｍｋが及ぼす効果を示す図；（Ｃ）ＡＰＡＰ誘導性血清カスパーゼ切断型Ｋ１８量（ピコモル／ｍｌ）に対してＺ−ＶＡＤ．ｆｍｋが及ぼす効果を示す図；（Ｄ）ＡＰＡＰ誘導性肝臓グルタチオン（ＧＳＨ）枯渇（ナノモル／ｍｇ）に対してＺ−ＶＡＤ．ｆｍｋが及ぼす効果を示す図；（Ｅ）ＡＰＡＰ誘導性全血清ＨＭＧＢ１含量（ｎｇ／ｍｌ）に対してＺ−ＶＡＤ．ｆｍｋが及ぼす効果を示す図；および（Ｆ）ＡＰＡＰ誘導性血清ＡＬＴ活性（Ｕ／ｌ）に対してＺ−ＶＡＤ．ｆｍｋが及ぼす効果を示す図である。これらは、同じマウス群内で同時に記録された。データは、１群当たり６匹ずつのマウスの平均±標準偏差として与える。統計学的有意性は、時点の合致する媒体を投与した対照との関連で割り当てた。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、ならびに＊＊＊ｐ＜０．００５。
【図７】アセトアミノフェン（ＡＰＡＰ）（５３０ｍｇ／ｋｇ；５時間）投与マウスの血清を用いた、システイン１０６におけるＨＭＧＢ−１酸化状態の特徴づけを示す図である。（Ａ）ＭＳ／ＭＳにより特徴づけられるマウスＨＭＧＢ−１のサイトカインドメインにおけるシステイン１０６の位置についての概略図である。（Ｂ）摂食ＡＰＡＰ投与（５３０ｍｇ／ｋｇ；５時間）マウスおよび絶食ＡＰＡＰ投与（５３０ｍｇ／ｋｇ；５時間）マウスの血清から、免疫沈降により単離された還元型ＨＭＧＢ−１および酸化型ＨＭＧＢ−１の非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離およびウェスタンブロット解析を示す図である。ＨＭＧＢ−１はまた、Ｚ−ＶＡＤ．ｆｍｋで前処置したＡＰＡＰ投与マウスからも単離した。（Ｃ）システイン１０６においてスルホン酸を含有する、摂食ＡＰＡＰ処置マウスに由来するマウス酸化型ＨＭＧＢ−１ペプチド９７〜１１２についてのＭＳ／ＭＳ解析を示す図である。（Ｄ）２４時間にわたりあらかじめ絶食させたＡＰＡＰ処置マウスに由来する、システイン１０６チオールを含有するマウス還元型ＨＭＧＢ−１ペプチド９７〜１１２についてのＭＳ／ＭＳ解析を示す図である。ＭＳ／ＭＳについての図、ならびにウェスタンブロットについての図は、１群当たり６匹ずつの動物を表わす。
【０１２４】
［表１］
ＡＰＡＰにより、雄ＣＤ−１マウス（５３０ｍｇ／ｋｇ）において、３〜２４時間後にわたり誘導される組織学的変化、アポトーシス性バイオマーカーの誘導（カスパーゼ３の活性化およびＤＮＡラダリング）、および血清バイオマーカーの増大についての概要を示す表である。免疫組織学（ＩＨ）については、＋が、肝臓切断型カスパーゼ３の発現度を示す。ＧＳＨ枯渇については、肝臓ＧＳＨ枯渇が対照動物と比較して著明であることを（＋）が示すか、または肝臓ＧＳＨ枯渇が著明でないことを（−）が示す。（＋）は、ウェスタンブロット（ＷＢ）によるＤＮＡラダリングまたはカスパーゼ３のプロセシングについての陽性検出を示す。血清バイオマーカー解析については、対照値を上回る著明な増大が見られることを（＋）が示すか、または対照値を上回る著明な増大が見られないことを（−）が示す。
【０１２５】
［実施例］
ここで、本発明を、以下の例示的な実施例との関連でより詳細に説明する。
【実施例１】
【０１２６】
＜アセトアミノフェン誘導性アポトーシスおよびアセトアミノフェン誘導性壊死のバイオマーカーとしてのケラチン１８およびＨＭＧＢ−１（ｈｉｇｈ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｇｒｏｕｐ ｂｏｘ−１）についての生体分析＞
潜在的に有益かつメカニズムに基づいたＤＩＬＩバイオマーカーを探索するには、げっ歯動物系におけるモデル肝毒素であり、かつ、重大な臨床的ＡＤＲであるアセトアミノフェン（ＡＰＡＰ）を用いることができる。シトクロムＰ４５０を媒介する反応性代謝物であるＮ−アセチル−ｐ−ベンゾ−キノンイミン（ＮＡＰＱＩ）の形成を介してＡＰＡＰ肝毒性を誘発し、その後、ＧＳＨ枯渇を要請する生化学的イベントについては、十分に定義されている（５）。壊死が細胞死の最終的で究極的な形態ではあるが、ＡＰＡＰ代謝が活性化された後の細胞内イベントにより肝細胞のアポトーシスがもたらされうることを、複数の報告が示唆している（６〜８）。しかし、ＡＰＡＰがアポトーシスを誘導する程度については、依然として異論の余地がある（９〜１１）。
【０１２７】
本探索の目的は、細胞死の血清バイオマーカーとしてのＨＭＧＢ１およびＫ１８を非侵襲的に解析することにより、ＡＰＡＰ誘導性肝毒性の動物モデルにおけるアポトーシスと壊死との間の力動性を規定することであった。自然免疫細胞または壊死細胞により放出される血清ＨＭＧＢ１の異なる分子形態を特徴づけて定量化するのには、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法を用いた。また、平行して、マウスにおけるＡＰＡＰ誘導性アポトーシス後のカスパーゼによるＫ１８の切断を確認し、血清中の断片Ｋ１８および全長Ｋ１８を定量化するのにもＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた。
【０１２８】
＜材料および方法＞
＜材料＞
ＨＭＧＢ１およびＫ１８に対する抗体（ウサギ抗ヒト抗体）は、Ａｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）から購入し、ウェスタンブロット解析用のカスパーゼ３に対する抗体（ウサギ抗カスパーゼ３抗体、８Ｇ１０）ならびに免疫組織学解析用のカスパーゼ３に対する抗体（ウサギ抗切断型カスパーゼ抗体、５Ａ１Ｅ）は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（Ｈｉｔｃｈｉｎ、ＵＫ）から購入した。免疫組織学用の二次抗体は、から購入し、ＨＭＧＢ１ ＥＬＩＳＡキットは、株式会社シノテスト（日本、東京）から、Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＡＬＴ液体試薬は、Ａｌｐｈａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｅａｓｔｌｅｉｇｈ、ＵＫ）から購入した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｄｙｅ Ｒｅａｇｅｎｔは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｔｄ（Ｈｅｍｅｌ Ｈｅｍｐｓｔｅａｄ、ＵＫ）から購入した。プロテオーム解析には、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸をＬａｓｅｒＢｉｏｌａｂｓ（Ｆｒａｎｃｅ）から、トリプシンをＰｒｏｍｅｇａ（ＵＫ）から、ＺｉｐＴｉｐｓをＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（ＵＫ）から購入した。すべての溶媒は、ＨＰＬＣグレードであり、Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｐｌｃ（Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ、ＵＫ）製であった。別段に言及しない限り、他のすべての化学物質、ペプチド基準物質、および材料は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｐｏｏｌｅ、ＵＫ）から購入した。
【０１２９】
＜動物の処理＞
食物および水を自由に摂取させた、雄ＣＤ−１マウスの個体（２５〜３５ｇ）６匹ずつによる群を、試験に組み入れた。ある時間経過にわたり、試験動物に、０．９％生理食塩液中のＡＰＡＰ（５３０ｍｇ／ｋｇ）の単回腹腔内注射を行い、処理の３、５、１０、１５、２０、または２４時間後に安楽死させた。対照動物には、必要に応じて、０．９％の生理食塩液、または０．９％の生理食塩液中の溶媒対照を施した。アポトーシスについての陰性対照として、ならびにアポトーシスについての血清バイオマーカーを検証するために、１つの群のマウスには、汎カスパーゼ阻害剤であるＺ−ＶＡＤ．ｆｍｋを施し（ＤＭＳＯ（ＡＰＡＰ投与の１５分前における、０．９％の生理食塩液中０．１ｍｌ／ｋｇのＤＭＳＯ）中１０ｍｇ／ｋｇの静脈内投与）、処理の５時間後に安楽死させた。血清中のＡＬＴ活性、ＨＭＧＢ１、およびＫ１８を決定したほか、ＤＮＡラダリング、カスパーゼ３についてのウェスタンブロット法、ＧＳＨ含量、ならびに免疫組織学を含めた組織学を、すべての動物に対して実施した。
【０１３０】
＜肝毒性の評価＞
ＣＯ２の吸入および頸椎脱臼により動物を安楽死させ、心臓穿刺により血液を採取した。血液試料を、一晩にわたり４℃で保存し、凝固させた。肝臓を摘出し、氷冷生理食塩液中ですすぎ、１０％の中性緩衝ホルマリン中で固定するか、または瞬間凍結させた。既に報告した（２８）通りに、血清アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）レベルを決定した。肝毒性の組織学的評価および免疫組織学検査を行うため、ホルマリンで固定した肝切片を、日常的な方法でパラフィンろう中に包埋した。３〜５μｍの切片を調製し、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色するか、または免疫組織学に用いた。Ｈ＆Ｅ染色切片を、任意の組織病理学的特色について検査し、アポトーシス性肝細胞および／または壊死性肝細胞を同定した。肝細胞喪失（おもに、小葉中心性喪失）の程度を、０〜５としてスコア評価した（ここで、０は、細胞喪失の証拠を示さず（未変化の肝臓）、５は、広範にわたる細胞喪失を示した）。スコア評価は、２人の共同研究者（ＤＪＡ、ＡＫ）により、盲検処理の上で個別に実施した。
【０１３１】
＜肝臓内グルタチオンレベルの決定＞
既に説明した（２９）通りに、肝臓内総グルタチオン（ＧＳＨ＋ＧＳＳＧ）レベルを決定した。
【０１３２】
＜カスパーゼ３についてのウェスタンブロット法、切断型カスパーゼ３の免疫組織学的裏付け、およびＤＮＡラダリング＞
カスパーゼ３についてのウェスタンブロット法は、瞬間凍結させた肝臓から調製したマウス肝臓細胞質ゾル画分に対して、既に説明した（３０）通りに実施した。製造元の指示書に従い、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ ＧｅｎｅＥｌｕｔｅキットを用いて、瞬間凍結させた肝臓からＤＮＡを単離した。１％アガロースゲル上において分離した後、臭化エチジウム染色によりＤＮＡラダリングを可視化した。切断型カスパーゼ３を免疫組織学的に裏付けるため、既に説明したプロトコール（３１）に基づき、ホルマリンで固定し、パラフィンで包埋した肝切片に対して、ペルオキシダーゼ抗ペルオキシダーゼ法を適用した。切断型カスパーゼ３陽性細胞（細胞質染色）の数を半定量評価した（−：陽性細胞なし；＋：陽性細胞が散見される；＋＋：中間数の陽性細胞が見られる；＋＋＋：多数の陽性細胞が見られる）。
【０１３３】
＜血清ＨＭＧＢ１および血清Ｋ１８の特徴づけおよび定量化＞
血清Ｋ１８および血清ＨＭＧＢ１の免疫沈降（ＩＰ）物（５μｇの抗体およびプロテインＧによる分離物）を、一晩にわたりＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。クーマシーブルー染色ゲルからタンパク質バンドを摘出し、５０％アセトニトリル／５０ｍＭ重炭酸アンモニウムと共にインキュベートすることにより脱染色した後、真空乾燥させた。４０ｎｇ／μＬの修飾トリプシン（Ｋ１８）または修飾ＧｌｕＣ中（ＨＭＧＢ１）を含有する５０ｍＭ重炭酸アンモニウム中でゲル小片を再水和させ、３７℃で１６時間にわたりインキュベートした。２回の交換を行いながら６０％アセトニトリル／１％トリフルオロ酢酸と共にインキュベートすることによりペプチドを抽出し、結果として得られる上清を再度乾燥させた。製造元の指示書に従い、Ｃ１８ ＺｉｐＴｉｐｓを用いて抽出物を脱塩し、５％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸中で復元した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析のため、自動式インライン型液体クロマトグラフ（ナノエレクトロスプレー線源ヘッド、ならびに内径１０μｍのＰｉｃｏＴｉｐ（Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ、ＵＳＡ）を介して統合された、ＬＣ−Ｐａｃｋｉｎｇｓ Ｓｙｓｔｅｍ、５ｍｍ Ｃ１８ナノプレカラム、ならびに７５μｍ×１５ｃｍのＣ１８ ＰｅｐＭａｐカラム（Ｄｉｏｎｅｘ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ））を介して、ＱＳＴＡＲ Ｐｕｌｓａｒ ｉハイブリッド型質量分析器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）へと試料を送入した。６０分間で５％アセトニトリル／０．０５％トリフルオロ酢酸（ｖ／ｖ）〜４８％アセトニトリル／０．０５％トリフルオロ酢酸（ｖ／ｖ）の勾配を、３００ｎＬ／分の流速で適用し、ＩＤＡ（ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ）（Ａｎａｌｙｓｔ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いる陽イオンモードで、ＭＳスペクトルおよびＭＳ／ＭＳスペクトルを自動的に取得した。信頼水準を８０％に設定し、生物学的修飾を許容したＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースの最新版と共にＰｒｏｔｅｉｎ Ｐｉｌｏｔ ２（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、データベース検索を実施した。合成ペプチド基準物質を対照血清中に添加して生成させた標準曲線を構築することにより、マウス血清全長Ｋ１８断片およびカスパーゼ依存型Ｋ１８断片の定量化を実施し、イムノアッセイ（１７）と比較した。カスパーゼ３、７、９切断部位にわたるように全長Ｋ１８基準ペプチド（ＬＬＥＤＧＥＤＦＳＬＮＤＡＬＤＳＳＮＳＭＱＴＶＱＫ）をデザインする一方、カスパーゼ切断部位で切断したＫ１８断片だけから短縮型ペプチド（ＬＬＥＤＧＥＤＦＳＬＮＤＡＬＤ）を誘導する（検出限界：３００フェムトモル／ｍｌ；変動係数＜１０％）。ＨＭＧＢ１ならびにその過剰アセチル化誘導体は、合成基準物質が利用できないので、スペクトルのペプチドピークをカウントすることにより定量化されたものであり、その結果、相対値としてだけ提示され、製造元の指示書に従いＥＬＩＳＡにより決定された総レベルと比較される（検出限界：０．１ｎｇ／ｍｌ；変動係数＜１０％）。
【０１３４】
＜統計学的解析＞
すべての結果（組織学的解析を除く）は、平均±標準偏差（ＳＤ）として表現する。比較される値は、シャピロ−ウィルク検定を用いる非正規分布について解析した。正規分布が適応である場合は、対応のないｔ検定を用いた。ノンパラメトリックデータについて、マン−ホイットニーのＵ検定を用いた。ＳｔａｔｓＤｉｒｅｃｔ統計ソフトウェアを用いてすべての計算を実施し、ｐ＜０．０５の場合に結果を有意であると考えた。
【０１３５】
＜結果＞
＜ＡＰＡＰ誘導性肝毒性時におけるＨＭＧＢ１およびＫ１８の循環分子形態の同定および特徴づけ＞
ＡＰＡＰ投与マウスの血清中には存在するが、対照マウスの血清中には存在しないＨＭＧＢ１についてＬＣ−ＭＳ／ＭＳで特徴づけたところ（図１Ａ）、低アセチル化ＨＭＧＢ１（壊死と共に放出される）および過剰アセチル化ＨＭＧＢ１（活性化免疫細胞から放出される）両方の混合物が明らかとなった。ＧＬｕＣで消化したＨＭＧＢ１およびＭＳ／ＭＳ解析により、ＨＭＧＢ１核局在化配列内に存在する、リシン残基１８０〜１８５を含有する１１３２．６Ｄａのペプチドを同定した。また、同じアミノ酸配列を含有するペプチドも存在したが、質量が２１０ａｍｕ大きかった。１３４２．６Ｄａへと質量が増大することは、アセチル基５個の付加に対応する。さらなるＭＳ／ＭＳ解析により、単球およびマクロファージによりそれが活性で放出される際の重要な機構であるアセチル化による修飾が、リシン残基１８０〜１８５において存在することが確認された（図１Ｂ〜Ｃ）。ＡＰＡＰ投与マウスの血清中で特徴づけられるアセチル化残基を伴う、概略的なＨＭＧＢ１リシンマップを図１Ｃに示す。
【０１３６】
ＡＰＡＰ投与マウスの血清中に存在するＫ１８を特徴づけた結果として、壊死細胞から放出された全長Ｋ１８（４７ｋＤａ）、ならびに４４ｋＤａおよび２１ｋＤａにおける２つのアポトーシス関連形態が同定された（図１Ａ）。これに対し、非処理マウスの血清中では、Ｋ１８の全長形態または断片化形態の放出についての証拠が見出されなかった（図１Ａ）。ＭＳ／ＭＳにより全長Ｋ１８を解析したところ、Ｋ１８のカスパーゼ依存型アポトーシス断片（４４ｋＤａおよび２１ｋＤａ）内には存在しない２７５６Ｄａのペプチドがもたらされた。解析により、このペプチドは、切断されていない予測カスパーゼ３、７、および９切断モチーフを有するペプチドであると特徴づけられた（図１Ｄ）。これに対し、トリプシンにより４４ｋＤａおよび２１ｋＤａのＫ１８断片を消化したところ、全長Ｋ１８を伴わない１６６５Ｄａの短縮型ペプチドがもたらされた。ＭＳ解析により、これは、ＤＡＬＤ／ＳＳモチーフで切断されるカスパーゼ部位が存在するためであることが明らかとなった（図１Ｅ）。
【０１３７】
＜Ｋ１８およびＨＭＧＢ１は、ＡＰＡＰ誘導性組織学変化についての高感度で有益な機構ベースのバイオマーカーを表わす＞
対照動物は、組織学的変化を示さなかった、すなわち、切断型カスパーゼ３についての免疫組織学を含めた組織学による肝細胞喪失の証拠は見られず（スコア０）、壊死またはアポトーシスについての証拠も見られなかった。処理の３時間後において、小葉中心性喪失が観察され（スコア１〜２）、おもに小葉中心性のアポトーシス細胞の形態を伴う多数の細胞が見られた（図２Ａ）。切断型カスパーゼ３の発現（図２Ｂ）により、ならびにＤＮＡラダリングおよびカスパーゼ３プロセシングのほか、血清Ｋ１８断片の増大（図３）により、アポトーシスが確認された。処理の５時間後に、動物は、多様な程度の細胞喪失を示した（スコア１〜３、平均２）。アポトーシス細胞数は減少したが、スコア１のアポトーシス細胞は一般に多数であり、壊死細胞も増大した（図２Ｃ）。ｉｎ ｓｉｔｕにおいてアポトーシス細胞が同定されない場合は、ＤＮＡラダリングおよび／またはカスパーゼ３プロセシング、ならびに血清Ｋ１８断片の増大もまた一般に観察されなかった。処理の１０時間後までに、細胞喪失スコアは１または２となり、アポトーシス細胞は、観察されたとしてもまれとなった。ＤＮＡラダリングまたはカスパーゼ３プロセシングの証拠は見られず、依然として血清Ｋ１８断片の増大が観察された。処理の１５時間後にも、血清Ｋ１８断片は依然として増大した。肝細胞喪失のスコアは０〜２（平均１または２）であり、帯域３（小葉中心帯域）では肝細胞置換の証拠が見られた（図２Ｄ）。処理の２０時間後には、肝細胞喪失の際立った証拠が見られないかまたはごくわずかな肝細胞喪失の証拠が見られた（スコア０または１）が、帯域３内の肝細胞は、不規則に配置されているように見えた。全肝臓のスコアが０となった、処理の２４時間後には、この不規則な配置も観察されなかった。処理の５時間後以降、有糸分裂形状により表わされる、肝細胞の有糸分裂が増大する証拠が見られた。処理の１５、２０、および２４時間後には、これらの証拠が特に多数であった（図２Ｄ〜Ｅ）。全時間が経過するにつれて、血清全長Ｋ１８の増大、ならびに血清ＡＬＴ活性の増大が観察される（図３Ｄ）一方、処理の１５時間後以降、血清ＨＭＧＢ１の増大は見られず（図３Ｅ）、ＧＳＨ枯渇が明白であるのは処理の３〜５時間後に限られた。処理後のどの時点でも著明な炎症細胞浸潤は観察されなかったが、５〜１５時間後において、一部の動物では、少数の好中球が小葉中心において見られた。結果を表１にまとめる。
【０１３８】
ＡＰＡＰの投与後、ＭＳ／ＭＳによりＨＭＧＢ１の各種の血清分子形態を解析したところ、投与の３時間後に壊死随伴形態が著明に増大し、これは５時間後にピークに達し、２０時間後までに対照レベルへと復帰したことが明らかとなった。これに対し、ＨＭＧＢ１の免疫細胞由来形態の血清レベルがわずかながら著明に上昇したが、これが検出されたのは、投与の５時間後に限られた。このレベルのこの形態は、時間が経過するにつれて増大し、１５時間後にピークに達し、２４時間後までに対照レベルへと復帰した（図４）。ＡＰＡＰ投与後において血清中に存在するカスパーゼ切断型Ｋ１８レベルに対する全長Ｋ１８レベルの相関により、時間が経過するにつれてアポトーシス性細胞死から壊死性細胞死への変化が生じていることが示される（図４Ｂ）。
【０１３９】
ＨＭＧＢ１およびＫ１８（全長Ｋ１８および断片化Ｋ１８）を、ＡＰＡＰによる肝毒性についての有益で機構ベースのバイオマーカーとして評価するため、ＲＯＣ（ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｏｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）解析を、従来の血清肝毒性指標（ＡＬＴ）と比較して行った。図４Ｃは、ＡＬＴ（０．８０）と比較した、血清断片化Ｋ１８（０．８４）、全長Ｋ１８（０．９０）、および全ＨＭＧＢ１（０．８７）についてのＲＯＣ曲線ならびに曲線下面積についての解析を示す。個々の動物の血清ＨＭＧＢ１レベルおよび血清Ｋ１８レベルを、組織学により決定される肝細胞喪失の程度（図５Ａ〜Ｂ）ならびにＡＬＴ活性のレベルと相関させることにより、ＨＭＧＢ１およびＫ１８が、これらの動物モデルにおけるＤＩＬＩのバイオマーカーとしてさらに検証される。血清全長１８および血清ＨＭＧＢ１の両方が増大することは、肝細胞喪失度が増大することと相関していた。ＡＰＡＰ投与後におけるＡＬＴ活性のレベルと相関させたとき、Ｋ１８およびＨＭＧＢ１のそれぞれについて得られる相関係数は、Ｒ２＝０．８３２およびＲ２＝０．７４６であった（図５Ｃ〜Ｄ）。
【０１４０】
＜カスパーゼを阻害するとＡＰＡＰ誘導性壊死が増大する＞
Ｋ１８の断片化がカスパーゼ依存性であることを確認するため、マウスに、カスパーゼ阻害剤であるＺ−ＶＡＤ．ｆｍｋと共にＡＰＡＰを共投与した。Ｚ−ＶＡＤ．ｆｍｋは、ＡＰＡＰを単独で投与したマウスと比較して、ＡＰＡＰ投与マウスにおけるアポトーシスマーカーの検出を完全に阻害した（図６Ａ〜Ｃ）。Ｚ−ＶＡＤ．ｆｍｋまたはＤＭＳＯ溶媒対照による前処理は、ＡＰＡＰ媒介性ＧＳＨ枯渇に対して効果を及ぼさなかった（図６Ｄ）。しかし、Ｚ−ＶＡＤ．ｆｍｋおよびＡＰＡＰを投与すると、ＡＰＡＰ単独の場合と比較して、血清ＡＬＴレベルおよび血清ＨＭＧＢ１レベルを結果として増大させた（図６Ｅ〜Ｆ）。ＡＰＡＰにより誘導される小葉中心性肝細胞喪失の組織学的スコアは一般に２〜３であり、したがって、ＡＰＡＰをＺ−ＶＡＤ．ｆｍｋと共投与すると、ＡＰＡＰ単独の場合と比較してスコアが上昇した（ｐ＜０．０５）（図２Ｆ）。切断型カスパーゼ３については、組織学および免疫組織学によるアポトーシス性肝細胞死の証拠が見られなかった（データは図示しない）。
【０１４１】
＜考察＞
この試験で、本発明者らは、ＤＩＬＩをもたらす機構をさらに理解するために、インビボにおいて、非侵襲的で生物学的に有益なバイオマーカーとしてのＨＭＧＢ１およびＫ１８の異なる分子形態についての質量分析評価を用いた。
【０１４２】
ＡＰＡＰは、動物モデルにおける「オフターゲット」の肝毒性をもたらす機構を探索し、潜在的に有用な肝毒性バイオマーカーを評価するための、臨床的に関与性で重要なツールを表わす。組織学的かつ生化学的な特徴づけの後、ＡＰＡＰ肝毒性の高感度なバイオマーカーであるＨＭＧＢ１およびＫ１８の各種の機構および細胞死モデル特異的な形態を、マウス血清中において同定および特徴づけすることができるであろうという仮説について調べた。
【０１４３】
質量分析は、広範な前臨床試験種にわたる絶対的かつ相対的な定量化法を開発するための、バイオマーカー分析物についての明確な同定および特徴づけをもたらす。これは、薬物の安全性解析、臨床研究、および基礎研究を支援する試験となる可能性を有する。本探索において、質量分析による、マウス血清中に存在するＫ１８の特徴づけを用いたところ、壊死により不活性状態で放出されることが知られる全長Ｋ１８、ならびにアポトーシス時において放出される断片型Ｋ１８のいずれもが、ＡＰＡＰ肝毒性時において放出されることが明らかとなった。ＭＳ／ＭＳ解析により、Ｋ１８の断片化形態（ＤＡＬＤ）では、カスパーゼ切断モチーフが時間依存的な形で切断および曝露されるが、Ｋ１８の全長形態（ＤＡＬＤＳＳ）ではそうならないことが示された。これにより、この動物モデルでは、ＡＰＡＰ肝毒性時において、カスパーゼ基質の切断が確かに生じることが示唆された。データは、プロカスパーゼのプロセシングおよびＤＮＡラダリングについての測定値と符合する。さらに、ＭＳ解析は、同じ試料内における、アポトーシスに関連するＫ１８形態ならびに壊死に関連するＫ１８形態の増大を同時に解析することも可能とした。個々の動物の全長Ｋ１８レベルおよびカスパーゼ切断型Ｋ１８レベルの相関は、組織学的経過を反映し、処置の２４時間後までの全時間にわたり観察される壊死性細胞死と並んで、処置後最初の数時間以内のアポトーシス性細胞死を裏付ける非侵襲的方法をもたらした。Ｋ１８の定量化は、どの時点においても、壊死が、細胞死の主要形態であることを示唆した。組織学的に述べると、早期の時点ではアポトーシス細胞を同定することができ、これは、アポトーシス形態を伴う細胞内における切断型カスパーゼ３の存在を免疫組織学的に実証することにより裏付けられた。しかし、壊死細胞が組織学的に同定されることはごくまれであり、これにより、肝細胞壊死が、極めて早期の段階にして既に細胞喪失をもたらす、極めて急速な過程であることが確認される。しかし、血清ＨＭＧＢ１、ＡＬＴ活性の増大、ならびに切断型カスパーゼ３についての免疫組織学を含めた組織学により示される通り、カスパーゼ活性を阻害することにより、肝臓の傷害の著明な増大、ならびに肝細胞アポトーシスの完全な消失が観察された。
【０１４４】
ＡＰＡＰ誘導性Ｋ１８切断は、カスパーゼ３、７、および９による切断から生成される大型の４４ｋＤａ断片と、生成される小型の断片だけでなく、カスパーゼ６のさらなる活性に依存する小型のＫ１８断片との両方を結果としてもたらした。４４ｋＤａの断片と２１ｋＤａの断片とを差別化しない現在のイムノアッセイからこの情報を導出することはできなかった。しかし、カスパーゼ６による切断だけに由来する２７ｋＤａの断片もまた予測することができたが、同定はできなかった（１６）。このＫ１８切断のパターンを明らかにする可能性のある説明は数多い。カスパーゼ６の関与がより低度であることを明らかにするのは、細胞死の外因的経路ではなく、内因的経路の活性化でありうる（３２、３３）。カスパーゼの完全な活性化からは、小型の断片が主要な形態であることが予測されるであろう。しかし、最適条件下では、カスパーゼ６部位が切断される前に、カスパーゼ３、７、および９の部位が切断されることが研究により示されている（１２）。カスパーゼ活性（３４）にはＡＴＰが必要とされ、ＡＰＡＰ肝毒性では肝臓ＡＴＰが枯渇するため、肝臓ＡＴＰの減少により、カスパーゼ６媒介性Ｋ１８切断、ならびに持続的なアポトーシスカスケードが阻害される可能性が存在し、これによるなら、大型のＫ１８断片と小型のＫ１８断片との両方の混合物が生成されることも説明可能であろう。
【０１４５】
ＭＳ／ＭＳ解析では、ＡＰＡＰ投与マウス血清中の壊死細胞から放出される低アセチル化ＨＭＧＢ１、ならびに活性化免疫細胞に由来する過剰アセチル化ＨＭＧＢ１の両方が同定された。この情報は、異なる分子形態を差別化しない現在のイムノアッセイからは導出することができなかった。さらに、ＭＳ／ＭＳ解析では、免疫細胞がＨＭＧＢ１を放出するのに極めて重要な配列として既に同定されている、核局在化配列内において重要なリシン残基１８０〜１８５のアセチル化も同定されている（２４）。ＡＰＡＰ肝毒性時において、壊死に由来する分子形態は、処置の３時間後から著明に増大し、１０時間後にピークに達し、次いで減少し、２０時間後にはもはや検出されなかった。感染の１５時間後には既に、肝細胞壊死の組織学的証拠がもはや見られず、肝細胞有糸分裂の再生および誘導の証拠が見られたことは興味深い。血清におけるＨＭＧＢ１の半減期が比較的短く、その増大後に減少することは、肝細胞の喪失および再生が、肝臓の傷害状態を反映するバイオマーカーとしてのＨＭＧＢ１の重要な特色を強調することを反映した。免疫細胞に由来するＨＭＧＢ１の形態は、５時間後以降、はるかに低レベルまでの増大ではあるが、実験終了時である２４時間後まで増大した。どの時点でも、肝臓内で著明な炎症細胞の浸潤が観察されることはなく、ＡＰＡＰ投与の５〜１５時間後、一部の動物の小葉中心において少数の好中球が見られただけであった。これは、ＡＰＡＰにより誘導される壊死性肝細胞死が免疫細胞の活性化をもたらすことを示し、機構ベースのＤＩＬＩバイオマーカーとしてのＨＭＧＢ１の使用をさらに裏付ける。しかし、ＤＩＬＩ時におけるＨＭＧＢ１の正確な役割、ならびにそれが活性化免疫細胞に由来するかどうかは、いまだ解明されていない（３５〜３８）。
【０１４６】
予測される通り、血清ＡＬＴ解析が肝損傷のより特異的なマーカーであるが、ＲＯＣ曲線の解析は、Ｋ１８およびＨＭＧＢ１が、ＡＬＴより高感度な肝毒性の指標であるという経時的評価を裏付けた。安全性バイオマーカーの潜在的な有用性を援用するには、相関についての用量および時点ほか、識別についての用量および時点も規定することが重要である。Ｋ１８およびＨＭＧＢ１が機構ベースのＡＰＡＰ肝毒性バイオマーカーであることは、組織学により決定される細胞喪失の増大との強い相関、ならびにＡＬＴ活性との相関によりさらに検証された。ＨＭＧＢ１およびＫ１８が示す器官特異性は、ＡＬＴ活性と同レベルではないが、このデータは、ＨＭＧＢ１およびＫ１８が、ＡＬＴ活性と並んで用いてＤＩＬＩ機構についての知識を増強しうる、肝細胞喪失についての高感度で有益な指標をもたらすという仮説を裏付ける。
【０１４７】
まとめると、本発明者らは、マウスモデルにおけるＡＰＡＰ肝毒性の発生と連関する機構ベースのバイオマーカーとして、Ｋ１８およびＨＭＧＢ１の分子形態を同定および解析するのに質量分析を用いた。このような機構ベースの血清バイオマーカーは、臨床系における研究、動物系における研究、およびインビトロ系における研究を架橋してヒトにおけるＤＩＬＩについての理解を増強し、これにより、それを予防するための戦略をもたらすのに用いることができる。
【実施例２】
【０１４８】
＜ＨＭＧＢ−１の酸化形態の検出＞
上述の通り、ＨＭＧＢ−１のサイトカインドメイン内におけるＣ１０６のスルフヒドリル基（図７Ａ）に対するカスパーゼ依存性酸化は、アポトーシス細胞内のＨＭＧＢ−１の炎症特性の中和において重要な機構である（３９）。
【０１４９】
本出願者らは、パラセタモール毒性（絶食動物における）に随伴する炎症反応の誘導が、これらもまたパラセタモールを施されたが毒性は観察されなかった対照動物（摂食動物）と比較して、酸化ＨＭＧＢ−１の欠如と関連することを見出した。
【０１５０】
毒性を示す、ＡＰＡＰを投与された絶食マウスに由来する血清についてのウェスタンブロット解析により、血清中に存在するＨＭＧＢ−１の唯一の分子形態は、還元形態であることが明らかとなった（図７Ｂ）。ＡＰＡＰを投与されたが毒性を示さなかった摂食マウス血清中のＨＭＧＢ−１の主要な形態は、免疫耐性の酸化形態であった（図７Ｂ）。還元型ＨＭＧＢ−１タンパク質内では、ＭＳ／ＭＳにより、Ｃ１０６を含有する１９４７．３Ｄａのペプチドが特徴づけられた。さらなるＭＳ／ＭＳ解析では、酸化型ＨＭＧＢ−１中だけに存在し、ＨＭＧＢ−１の還元形態中には存在しない、１９６３．３、１９７９．３、および１９９５．３Ｄａのペプチドが同定された。１６ａｍｕずつの漸増は、Ｃ１０６に酸素が付加されて、スルホン酸含有残基、スルフェン酸含有残基、およびスルフィン酸含有残基が生成されることに対応した（図７Ｃ〜Ｄ）。Ｃ１０６の酸化がカスパーゼに依存することは、ＡＰＡＰで処置した摂食マウスにおいて汎カスパーゼ阻害剤であるＺ−ＶＡＤ．ｆｍｋを用いることにより確認された。この処置により、これらのマウスにおいて検出され、毒性の増大と関連する、ＨＭＧＢ−１の還元型分子形態だけが結果としてもたらされた（図Ｂ）。
【０１５１】
ＨＭＧＢ１の免疫刺激特性は、Ｃ１０６のスルフィドリル基の酸化状態に依存して変化することが判明している。この基の酸化は、細胞内における翻訳後修飾であり、免疫耐性を促進するカスパーゼ誘導性過程であることが示されている（３９）。本出願者は、ウェスタンブロット法により、ＨＭＧＢ−１の酸化形態が、ＡＰＡＰを投与された摂食マウスの血液中における主要形態であり、カスパーゼの活性化に依存することを裏付けたが、これは、かつて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで観察されただけであった（３９）。
【０１５２】
【表１】
【０１５３】
［文献］
【表２Ａ】
【表２Ｂ】
【表２Ｃ】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、器官または組織の傷害を検出、評価、および／または診断するための方法に関する。より具体的に述べると、本発明は、器官または組織の薬物誘導性傷害を検出、評価、および／または診断するのに用いうる具体的な血清バイオマーカーを検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
製薬の分野では、薬物有害反応（ＡＤＲ）が主要な臨床的懸念であり、薬物開発における損耗の重大な原因である。
【０００３】
肝毒性は、薬物損耗の特に顕著な原因である（１、２）。肝臓において、薬物が化学的に反応性の代謝物へと代謝されることは、薬物性肝障害（ＤＩＬＩ）における重要な因子である（３、４）。しかし、薬物の生体内活性化の化学反応と毒性転帰とを連関付ける細胞内イベントについてはほとんど理解されていない。ＤＩＬＩをもたらす機構および経路をよりよく理解することにより、臨床管理が改善され、臨床で用いるのにより安全な薬剤のデザインについての情報が得られる。
【０００４】
加えて、多くの薬物はまた、皮膚（刺激、発疹など）、肺、腎臓、および心臓など、他の器官および組織に対しても毒性でありうる。重篤な症例では、この毒性により薬物損耗がもたらされる場合もあり、さらなる臨床管理が必要とされる場合もある。また、皮膚毒性、肺毒性、腎毒性、および心毒性をもたらす機構および経路をよりよく理解すれば、有益でもあるだろう。
【０００５】
薬物開発のペースを加速化させ、損耗を低減し、それ自体生物学的に有益なバイオマーカーの重要性は、製薬分野において一般に認識されつつある。アポトーシス、壊死、および炎症の選択的なバイオマーカーを容易に検出することができれば、肝臓、皮膚、肺、腎臓、または心臓の薬物誘導性傷害など、器官傷害の基礎原因を鑑別するのに極めて有益であろうし、将来的に、臨床的介入を支援するためのさらなる情報が得られ、より安全な薬物開発のための情報が得られることになる。
【発明の概要】
【０００６】
例えば、肝臓の傷害と関連するアラニンアミノトランスアミナーゼ（ＡＬＴ）など、器官傷害と関連するバイオマーカーがいくつか存在する。しかし、これらのバイオマーカーを検出しても、器官損傷の基礎的機構または経過についての情報は明らかとならない。
【０００７】
したがって、器官または組織の薬物誘導性傷害を検出および／または評価するための、簡略かつ簡便であり、また、器官または組織の損傷を早期に検出することを可能とするのに十分な程度に高感度でもある手法を提供することが、本発明の目的である。
【０００８】
器官または組織の薬物誘導性傷害の一因となる基礎的な機構および経路の評価を可能とする方法を提供することがさらなる目的である。
【０００９】
本発明は、アポトーシス、壊死、および炎症の具体的な血清バイオマーカーを、簡便かつ非侵襲的に検出する能力による。これらの血清バイオマーカーのすべてを併せて検出し、それらの検出を、具体的な器官または組織において生じる薬物誘導性毒性と相関させることができれば、傷害過程に関与する基礎的な機構および経路を評価することが可能となる。
【００１０】
薬物により引き起こされる器官および組織の損傷は、アポトーシス過程、壊死過程、および炎症過程のうちの１つ以上を伴いうる。どの基礎的過程が生じているか、ならびに各過程の相対的寄与を評価できれば、器官または組織に進行中の傷害の性質および病期をよりよく理解することが可能となる。それはまた、標的化された臨床的介入により、傷害または損傷が生じる程度を制限する機会も可能とする。さらに、ある期間にわたりこれらのバイオマーカーをモニタリングすることにより、器官または組織の傷害の経過をモニタリングすることができる。
【００１１】
また、このようにして器官または組織の損傷を検出および／または評価することができれば、潜在的な新規の治療剤の毒性についてスクリーニングするのにも極めて有用であろう。
【００１２】
したがって、本発明は、ヒト対象もしくは動物対象における薬物誘導性アポトーシス、薬物誘導性壊死、および／または薬物誘導性炎症を検出および評価する方法であって、前記対象から得られる血清試料を、
（ｉ）アポトーシスに特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉ）壊死に特異的な血清バイオマーカー；および
（ｉｉｉ）炎症に特異的な血清バイオマーカー
について調べるステップを含む方法を提供する。
【００１３】
本発明はまた、器官もしくは組織の薬物誘導性損傷を検出、評価、および／または診断する方法であって、
（ｉ）アポトーシスに特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉ）壊死に特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉｉ）炎症に特異的な血清バイオマーカー
の存在を判定するために血清試料を調べるステップと、
前記血清バイオマーカーのうちの１つ以上の存在を、器官または組織に特異的な損傷の指標と相関させるステップと
を含む方法も提供する。
【００１４】
さらなる態様では、本発明が、器官または組織と関連する、薬物誘導性アポトーシス、薬物誘導性壊死、および薬物誘導性炎症の存在を検出ならびに／または評価する方法であって、
（ｉ）アポトーシスに特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉ）壊死に特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉｉ）炎症に特異的な血清バイオマーカー
の存在を判定するために血清試料を調べるステップと、
前記血清バイオマーカーのうちの１つ以上の存在を、器官または組織に特異的な損傷の指標と相関させるステップと
を含む方法を提供する。
【００１５】
なお別の態様では、本発明が、ヒト対象もしくは動物対象への薬物の投与により引き起こされる器官または組織の損傷の発症機序をモニタリングする方法であって、
（ｉ）アポトーシスに特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉ）壊死に特異的な血清バイオマーカー；および
（ｉｉｉ）炎症に特異的な血清バイオマーカー
の存在を判定するために前記対象に由来する血清試料を調べるステップと、
前記血清バイオマーカーのうちの１つ以上の存在を、器官または組織に特異的な損傷の指標と相関させるステップと
を含む方法を提供する。
【００１６】
さらなる態様では、本発明が、器官または組織の薬物誘導性損傷を検出および／または評価するアッセイであって、
アポトーシスに特異的な血清バイオマーカーを検出する手段と；
壊死に特異的な血清バイオマーカーを検出する手段と；
炎症に特異的な血清バイオマーカーを検出する手段と
を含むアッセイを提供する。
【００１７】
さらなる態様では、本発明がまた、本明細書でさらに定義される、器官の損傷を検出、評価、および／または診断するためのキットも提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、アポトーシス、壊死、および／または炎症の血清バイオマーカーの存在を検出する能力による。これは、ヒト対象または動物対象から得られる血清試料を、
（ｉ）アポトーシスに特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉ）壊死に特異的な血清バイオマーカー；および
（ｉｉｉ）炎症に特異的な血清バイオマーカー
について調べることにより達成される。
【００１９】
本明細書で定義される本発明の方法を実施するのに必要とされる血清試料は、当技術分野で知られる従来の技法を用いて、ヒト対象または動物対象から得る。ヒト対象または動物対象は、器官または組織の損傷を有することが疑われる対象の場合もあり、器官または組織の損傷が生じつつあるかどうかを決定するためにモニタリングを必要とする対象の場合もある。
【００２０】
本発明の方法は、非侵襲的であることが適切である。「非侵襲的」とは、ヒト対象または動物対象から得られる血清試料に対して、ヒトまたは動物の体外でそれらの方法を実施することを意味する、すなわち、該方法は、ヒトまたは動物の身体に対して直接は実施されない。
【００２１】
＜血清バイオマーカー＞
（ｉ）ケラチン１８
ケラチンとは、細胞の構造および完全性の一因となる、上皮細胞により発現される中間線維タンパク質である。Ｆａｓ媒介性アポトーシスの早期には、ケラチン１８（Ｋ１８）内の重要なセリン残基がリン酸化する（１２）。カスパーゼ媒介型Ｋ１８切断もまた、アポトーシス時における細胞構造再編成の早期イベントである（１３）。カスパーゼ３、７、および９は、Ｃ末端のＤＡＬＤ／ＳモチーフにおいてＫ１８を切断することに関与し、カスパーゼ６は、リンカー領域Ｌ１〜２内のＶＥＶＤ／ＡモチーフにおいてＫ１８を切断することが示されている。壊死性細胞死時には、全長Ｋ１８が受動的に放出され、アポトーシス時には、生成された断片化されたＫ１８が血液中に放出されて、時間が経過するにつれて蓄積されうる（１４）。Ｋ１８のアポトーシス関連形態に対する抗体が作製され、ｉｎ ｖｉｖｏ状況および臨床状況において精査されている（１５、１６）。臨床モデルおよび動物モデルにおいて、患者における化学療法剤の薬力学的治療薬モニタリングを行うとき（１７）、ならびに、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）（１８）およびＣ型肝炎ウイルス感染（１９）などの肝障害時におけるアポトーシスを定量化するのに、血清中で定量化されるカスパーゼ切断型Ｋ１８および全長Ｋ１８が、それぞれ、アポトーシスマーカーおよび壊死マーカーとして用いられている。
【００２２】
全長Ｋ１８とは、全長Ｋ１８タンパク質および／またはカスパーゼ切断を受けていないＫ１８を意味する。
【００２３】
本発明の具体的な実施形態では、カスパーゼ切断型Ｋ１８を、薬物誘導性アポトーシスに特異的な血清バイオマーカーとして用いる。疑念を回避する目的で述べると、カスパーゼ切断型Ｋ１８とは、カスパーゼ酵素により切断されたＫ１８タンパク質を意味する。上記で示した通り、カスパーゼ酵素は、ＤＡＬＤ／ＳモチーフまたはＶＥＶＤ／ＡモチーフにおいてＫ１８を切断する。
【００２４】
さらなる実施形態では、壊死性細胞死において不動態で放出される全長Ｋ１８を、壊死の血清バイオマーカーとして用いる。疑念を回避する目的で述べると、全長Ｋ１８とは、カスパーゼ酵素により（ＤＡＬＤ／Ｓモチーフおよび／またはＶＥＶＤ／Ａモチーフにおいて）切断されていないＫ１８タンパク質を意味する。
【００２５】
ヒト、マウス、およびラットにおける全長Ｋ１８タンパク質の配列を、それぞれ、配列番号１、２、および３に示す。
【００２６】
全長Ｋ１８およびカスパーゼ切断型Ｋ１８は、当技術分野で知られる、任意の適切な技法により検出することができる。例えば、これらのバイオマーカーはいずれも、免疫ベースのアッセイ（ＵＳ６，２９２，８５０、ＵＳ６，７１６，９６８、およびＵＳ６，７０６，４８８において開示されているＥＬＩＳＡおよびイムノアッセイなど）、質量分析法（全長Ｋ１８断片と、カスパーゼ切断型Ｋ１８断片との質量差を検出しうる）、およびＨＰＬＣ法により検出することができる。
【００２７】
本発明のある実施形態では、カスパーゼ切断型Ｋ１８および全長Ｋ１８を、免疫ベースのアッセイ、とりわけ、ＥＬＩＳＡを用いて検出および定量化する。ＥＬＩＳＡは、タンパク質のバイオマーカーを検出するための、よく知られていて確立された技法である。
【００２８】
代替的な実施形態では、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析を用いて、カスパーゼ切断型Ｋ１８および／または全長Ｋ１８をいずれも簡便に検出および定量化することができる。
【００２９】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるカスパーゼ切断型Ｋ１８および全長Ｋ１８についての検出および解析を容易にするには、適切なプロテアーゼ酵素を用いて血清Ｋ１８を断片へと部分消化することが望ましい。
【００３０】
Ｋ１８タンパク質を部分消化することにより形成されるペプチド断片のうちの１つは、カスパーゼ切断モチーフのうちの１つにわたることが適切である。適切であればどのプロテアーゼ酵素でもこの目的で用いうるであろうし、当業者は、質量分析による検出に適する断片を生成させる適切な酵素、または酵素の混合物を選択することができる。
【００３１】
Ｋ１８を部分消化することにより生成される断片のうちの１つが、カスパーゼ切断モチーフのうちの１つにわたることは、これにより、カスパーゼ切断モチーフが切断されていない断片（すなわち、壊死において放出される全長Ｋ１８）、ならびにカスパーゼ切断を受けた対応する断片（すなわち、アポトーシスと関連する断片）を、質量分析により検出および差別化することが可能となるため、重要である。
【００３２】
具体的な実施形態では、形成されるペプチド断片は、カスパーゼ３、７、および９の切断部位（すなわち、ＤＡＬＤ／Ｓモチーフ）にわたる。
【００３３】
本発明の特定の実施形態では、Ｋ１８タンパク質を部分消化するのに用いられるプロテアーゼがトリプシンであり、これは、アミノ酸であるリシンまたはアルギニンのカルボキシル側においてペプチド結合を切断する。
【００３４】
血清Ｋ１８をトリプシンで部分消化することにより形成され、カスパーゼ３、７、および９の標的となるＤＡＬＤ／Ｓ切断モチーフにわたる全長Ｋ１８断片を、配列番号４（ヒト）、５（マウス）、および６（ラット）に示す。これらの断片は、質量分析により検出することができる。
【００３５】
カスパーゼ切断型Ｋ１８断片をトリプシンで消化すると、配列番号７（ヒト）、８（マウス）、および９（ラット）に示す断片が形成される。これらの断片は、質量分析により検出することができる。
【００３６】
市販されている合成Ｋ１８ペプチド断片は、被験種に由来する、Ｋ１８を含まない対照血清中に添加した場合に質量分析計で観察されるピーク強度を較正するための基準物質として用いることができる。これは、得られるピーク強度および曲線下面積を、合成ペプチド断片を用いて得られる較正強度と比較することにより、それぞれの血清Ｋ１８断片の量を定量化することを可能とする。
【００３７】
質量分析を用いることにより、これら２つのＫ１８バイオマーカーの存在を、血清試料中において容易に決定することが可能となる。さらに、単回のアッセイにおいてデータを発生させることができる。
【００３８】
（ｉｉ）ＨＭＧＢ−１（ｈｉｇｈ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｇｒｏｕｐ ｂｏｘ １）
近年の証拠は、免疫系の注意を死滅細胞へと促すのにＨＭＧＢ−１（ｈｉｇｈ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｇｒｏｕｐ ｂｏｘ ｐｒｏｔｅｉｎ １）が果たす重要な役割について示唆している（２０、２１）。ＨＭＧＢ−１は、炎症促進活性を有し、標的細胞におけるＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）および終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ）を標的とする、核結合タンパク質である（２２、２３）。ＨＭＧＢ−１は、活性化した自然免疫細胞に由来する別個のリシン残基から過剰アセチル化形態で放出され（２４）、壊死細胞から不動態の低アセチル化形態で放出されるが、アポトーシス細胞または二次的壊死細胞によっては放出されない（２１）と考えられている。抗ＨＭＧＢ−１抗体は、インビボにおけるＡＰＡＰによる肝毒性およびエンドトキシンによる致死性を随伴させる炎症応答を阻害する（２１、２５）。
【００３９】
本発明の具体的な実施形態では、ＨＭＧＢ−１の低アセチル化形態を、壊死に特異的な血清バイオマーカーとして検出する。
【００４０】
さらなる実施形態では、ＨＭＧＢ−１の過剰アセチル化形態が、炎症に特異的な血清バイオマーカーである。
【００４１】
それぞれ、壊死細胞および自然免疫細胞により放出される、ＨＭＧＢ−１の低アセチル化形態および過剰アセチル化形態のいずれもが、当技術分野で知られる任意の適切な技法により検出されうる。例えば、これらのバイオマーカーはいずれも、免疫ベースのアッセイ（米国第６，２９２，８５０号、米国第６，７１６，９６８号、および米国第６，７０６，４８８号において開示されているＥＬＩＳＡおよびイムノアッセイなど）、質量分析法（ＨＭＧＢ−１の低アセチル化形態と、過剰アセチル化形態との質量差を検出しうる）、ならびに、これらのＨＭＧＢ−１バイオマーカーの保持時間を決定しうるＨＰＬＣ法により検出することができる。
【００４２】
本発明のある実施形態では、ＨＭＧＢ−１の低アセチル化形態および／または過剰アセチル化形態を、免疫ベースのアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）により検出する。
【００４３】
代替的な実施形態では、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析を用いて、ＨＭＧＢ−１の低アセチル化形態および／または過剰アセチル化形態を検出および定量化することができる。さらに、単回のアッセイにおいてデータを発生させることができて簡便である。
【００４４】
ヒト、マウス、およびラットにおけるＨＭＧＢ−１配列を、それぞれ、配列番号１０、１１、および１２に示す。
【００４５】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる検出の場合、タンパク質をペプチド断片へと切断する酵素により血清ＨＭＧＢ−１を部分消化してから質量分析による検出を行うことが適切である。
【００４６】
ＨＭＧＢ−１の過剰アセチル化形態においてアセチル化するのは、ＨＭＧＢ−１タンパク質配列中に存在するリシン残基である。したがって、質量分析法を用いて、アセチル化していないペプチド断片（ＨＭＧＢ−１の低アセチル化形態と対応する）と、アセチル化したペプチド断片（過剰アセチル化形態と対応する）との質量差を検出することができる。
【００４７】
質量分析により検出されるＨＭＧＢ−１ペプチド断片は、少なくとも１つのリシン残基を含むことが適切である。検出されるペプチド断片は、２つ以上のリシン残基を含むことが好ましく、３つ以上のリシン残基を含むことがなおより好ましい。
【００４８】
具体的な実施形態では、ＨＭＧＢ−１を部分消化することにより形成されるペプチド断片が、ＨＭＧＢ−１タンパク質の核局在化領域に由来する１つ以上のリシン残基を含む。この領域内に存在するリシン残基は、図１Ｃに示されるリシン１７２、１７３、１７７、１８０、および１８２〜５である。
【００４９】
具体的な実施形態では、酵素であるＧＬｕＣを用いて、血清ＨＭＧＢ−１を部分消化する。ＧＬｕＣは、配列番号１３、１４、または１５に示される断片を生成させる。配列番号１３、１４、または１５に示される配列の非アセチル化形態と、リシン残基上にさらに５つのアセチル基を保有するアセチル化形態との差違は、質量分析により容易に検出することができる。
【００５０】
ＨＭＧＢ−１タンパク質はまた、酸化形態でも存在することが知られている。ＨＭＧＢ−１の酸化形態は、ＨＭＧＢ−１のサイトカインドメイン内のＣ１０６による酸化スルフヒドリル基からなる（図７Ａを参照されたい）。Ｃ１０６によるスルフヒドリル基の酸化は、酵素であるカスパーゼにより促進され、アポトーシス細胞におけるＨＭＧＢ−１の炎症特性を中和するのに重要な役割を果たす（３９）。したがって、ＨＭＧＢ−１の酸化形態が存在すれば、また、ＨＭＧＢ−１の炎症特性に抗する抑制応答も表示されうる。したがって、本発明のある実施形態では、本発明の方法が、血清試料を調べて、ＨＭＧＢ−１の酸化形態の存在を判定するステップをさらに含みうる。本明細書で説明されるＨＭＧＢ−１の低アセチル化形態および／または過剰アセチル化形態を検出するのに用いられる任意の技法により、ＨＭＧＢ−１の酸化形態を検出することができる。
【００５１】
＜アッセイの方法＞
本発明のある実施形態では、検出されるアポトーシスに特異的な血清バイオマーカーが、カスパーゼ切断型Ｋ１８である。
【００５２】
本発明のある実施形態では、検出される壊死に特異的な血清バイオマーカーが、全長Ｋ１８および／またはＨＭＧＢ−１の低アセチル化形態である。
【００５３】
本発明のある実施形態では、検出される壊死に特異的な血清バイオマーカーが、全長Ｋ１８である。
【００５４】
本発明のある実施形態では、検出される壊死に特異的な血清バイオマーカーが、ＨＭＧＢ−１の低アセチル化形態である。
【００５５】
本発明のある実施形態では、検出される壊死に特異的な血清バイオマーカーが、全長Ｋ１８およびＨＭＧＢ−１の低アセチル化形態である。
【００５６】
本発明のある実施形態では、検出される炎症に特異的な血清バイオマーカーが、ＨＭＧＢ−１の過剰アセチル化形態である。
【００５７】
本発明のさらなる実施形態では、血清試料を、ＨＭＧＢ−１の酸化形態の存在についてさらに調べる。
【００５８】
したがって、具体的な実施形態では、本発明の方法が、
（ｉ）カスパーゼ切断型Ｋ１８；
（ｉｉ）全長Ｋ１８および／またはＨＭＧＢ−１の低アセチル化形態；ならびに
（ｉｉｉ）ＨＭＧＢ−１の過剰アセチル化形態
の存在を判定するために血清試料を調べるステップを含む。
【００５９】
特定の実施形態では、本発明の方法が、血清試料を調べて、
（ｉ）カスパーゼ切断型Ｋ１８；
（ｉｉ）全長Ｋ１８；および
（ｉｉｉ）ＨＭＧＢ−１の過剰アセチル化形態
の存在を判定するステップを含む。
【００６０】
別の特定の実施形態では、本発明の方法が、
（ｉ）カスパーゼ切断型Ｋ１８；
（ｉｉ）ＨＭＧＢ−１の低アセチル化形態；および
（ｉｉｉ）ＨＭＧＢ−１の過剰アセチル化形態
の存在を判定するために血清試料を調べるステップを含む。
【００６１】
さらなる実施形態では、本発明の方法が、
（ｉ）カスパーゼ切断型Ｋ１８；
（ｉｉ）全長Ｋ１８およびＨＭＧＢ−１の低アセチル化形態；ならびに
（ｉｉｉ）ＨＭＧＢ−１の過剰アセチル化形態
の存在を判定するために血清試料を調べるステップを含む。
【００６２】
上述の実施形態すべてにおいて、ＨＭＧＢ−１の酸化形態の存在を検出するために血清試料をさらに調べることができる。
【００６３】
上述の通り、本発明のＫ１８バイオマーカーおよびＨＭＧＢ−１バイオマーカーは、当技術分野で知られる任意の適切な手段により検出することができる。例えば、これらのバイオマーカーはいずれも、免疫ベースのアッセイ（米国特許第６，２９２，８５０号、米国特許第６，７１６，９６８号、および米国特許第６，７０６，４８８号において開示されているＥＬＩＳＡおよびイムノアッセイなど）、質量分析法、およびＨＰＬＣ法により検出することができる。
【００６４】
本発明のある実施形態では、Ｋ１８バイオマーカーおよびＨＭＧＢ−１バイオマーカーを、免疫ベースのアッセイ、とりわけ、ＥＬＩＳＡ技法を用いて検出および定量化する。ＥＬＩＳＡアッセイは、タンパク質のバイオマーカーを検出するための、よく知られていて確立された技法である。
【００６５】
代替的な実施形態では、本発明のＫ１８バイオマーカーおよびＨＭＧＢ−１バイオマーカーを、質量分析、とりわけ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析により検出することができる。
【００６６】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる検出は、それにより、上記の血清バイオマーカーのすべて（すなわち、アポトーシスマーカー（カスパーゼ切断型Ｋ１８）、壊死マーカー（全長Ｋ１８および低アセチル化ＨＭＧＢ−１）、および炎症マーカー（過剰アセチル化ＨＭＧＢ−１））を単一の血液試料中で検出しうる、高感度で簡便な手段を提供する。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳはまた、Ｋ１８の２つの形態の比、ならびにＨＭＧＢ−１の２つの形態の比を平行的に決定することも可能とする。これは、発生するアポトーシス、壊死、および炎症の相対量を表示する。
【００６７】
本発明のある実施形態では、質量分析を用いて、カスパーゼ切断型Ｋ１８（アポトーシスに特異的な血清バイオマーカーとして）、全長Ｋ１８およびＨＭＧＢ−１の低アセチル化形態（壊死に特異的な血清バイオマーカーとして）、ならびにＨＭＧＢ−１の過剰アセチル化形態（炎症に特異的な血清バイオマーカーとして）の存在について血清試料を調べる。次いで、アポトーシス、壊死、および／または炎症の存在を、特定の器官または組織と相関させるため、これらのバイオマーカーのうちの１つ以上を、以下でさらに定義する、器官または組織に特異的な損傷の指標の存在と相関させることができる。
【００６８】
本発明のある実施形態では、宿主から得られた血清試料を、２つの個別の試料へと分割し、それらのうちの一方を用いてＨＭＧＢ−１を検出し、それらのうちの他方を用いてＫ１８を検出する。次いで、ＨＭＧＢ−１試料を、ＧＬｕＣなどのプロテアーゼ酵素で処理して、ＨＭＧＢ−１を部分消化して断片を形成し、次いで、それらの低アセチル化形態および過剰アセチル化形態を、上記で論じた質量分析により検出および差別化することができる。Ｋ１８試料もまた、トリプシンなどのプロテアーゼで処理して、血清Ｋ１８タンパク質を断片へと部分消化すると、上記で論じた質量分析により、カスパーゼ切断型形態および全長形態を検出および差別化することが可能となる。
【００６９】
代替的な実施形態では、方法が、
Ｋ１８タンパク質成分およびＨＭＧＢ−１タンパク質成分を血清試料から分離するステップと、
質量分析により検出しうる断片を形成するようにＫ１８タンパク質を部分消化するステップと、
質量分析により検出しうる断片を形成するようにＨＭＧＢ−１タンパク質を部分消化するステップと
を含む。
【００７０】
Ｋ１８タンパク質およびＨＭＧＢ−１タンパク質は、任意の適切なタンパク質分離法、例えば、免疫沈降、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動、ウェスタンブロット法、またはクロマトグラフィーを用いて他の血清成分から分離し、単離することができる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはウェスタンブロットを用いて、血清タンパク質を分離するのが適切である。適切な基準物質を用いて、タンパク質分離法により生成されるＫ１８およびＨＭＧＢ−１を同定することができる。
【００７１】
上記で論じた通り、任意の適切な酵素を用いて、タンパク質を部分消化することができる。
【００７２】
次いで、部分消化後、質量分析によりＫ１８およびＨＭＧＢ−１の断片を検出することができる。
【００７３】
ある実施形態では、本発明の方法が、器官または組織の損傷に特異的な指標についてアッセイするステップをさらに含むことが適切である。以下でさらに論じる通り、多くの場合には、これが、器官または組織に特異的な損傷バイオマーカーについてアッセイするステップを含む。
【００７４】
＜器官または組織に特異的な損傷の指標＞
本明細書では、「器官または組織に特異的な損傷の指標」への言及を、具体的な器官または組織と関連する傷害または損傷の臨床的指標を指すのに用いる。
【００７５】
例えば、肝臓の場合、「器官に特異的な損傷の指標」とは、肝毒性または肝機能について受容されている別の臨床測定値と関連する別のバイオマーカーでありうる。本発明のある実施形態では、肝臓に特異的な損傷の指標は、その存在が肝臓の傷害と関連する血清バイオマーカーである。アポトーシス、壊死、および／または炎症に特異的な血清バイオマーカーのうちの１つ以上と併せて、肝臓に特異的な傷害のバイオマーカーを検出することにより、検出された任意のアポトーシス、壊死、または炎症を、肝臓内で生じつつある傷害と相関させることが可能となる。肝臓の傷害と関連する肝臓に特異的なバイオマーカーの具体例には、ＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）、ＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）、ＡＰ（アルカリホスファターゼ）、ＧＬＤＨ（グルタミン酸デヒドロゲナーゼ）、およびＧＧＴ（ガンマ−グルタミルトランスペプチダーゼ）が含まれる。これらのバイオマーカーの存在について解析する方法はよく知られており、任意の適切な方法を、本発明の方法に従って用いることができる。
【００７６】
皮膚組織の場合、「組織に特異的な損傷の指標」は、臨床的な皮膚状態（発疹、腫脹、かゆみ）の存在でありうる。アポトーシス、壊死、および／または炎症のうちの１つ以上と併せて皮膚状態が存在すれば、検出された任意のアポトーシス、壊死、または炎症を、皮膚組織内で生じつつある傷害と相関させることが可能となる。
【００７７】
肺の場合、「器官に特異的な損傷の指標」には、サーファクタントプロテインＤ、サーファクタントプロテインＡ、またはシンデカン１のうちの１つ以上が含まれうる。これらのバイオマーカーの存在について解析する方法は当技術分野で知られており、本発明の方法に従い任意の適切な方法を用いることができる。
【００７８】
腎臓の場合、「器官に特異的な損傷の指標」には、ＫＩＭ−１、クラステリン、オステオポンチン、β２−マイクログロブリン、レチノール結合タンパク質、β−ＮＡＧ（Ｎ−アセチル−Ｂ−Ｄ−グルコサミダーゼ）、シスタチン−Ｃ、アルブミン、ＧＳＴα、リポカリン（ＮＧＡＬ）、またはＩＬ−１８のうちの１つ以上が含まれうる。これらのバイオマーカーの存在について解析する方法は当技術分野で知られており、本発明の方法に従い任意の適切な方法を用いることができる。
【００７９】
心血管系の場合、損傷の指標は、心臓トロポニンＴおよび／またはＩ（ｃＴｎＴ、ｃＴｎＩ）でありうる。これらのバイオマーカーの存在について解析する方法は当技術分野で知られており、本発明の方法に従い任意の適切な方法を用いることができる。
【００８０】
具体的な実施形態では、本発明の方法は、検出されたアポトーシス、壊死、または炎症を、１つ以上の特定の器官または組織内で生じつつある損傷と相関させうるように、異なる器官または組織と関連する、器官または組織の損傷に特異的な複数の指標の存在についてアッセイするステップをさらに含む。
【００８１】
＜適用＞
本発明の方法は、例えば、新規の薬物などの化学的作用物質を投与した後、ヒト対象または動物対象におけるアポトーシス、壊死、および／または炎症の発生をモニタリングするのに特に有用である。
【００８２】
したがって、一態様では、本発明が、ヒト対象または動物対象への薬物の投与により引き起こされる器官または組織の損傷の病態をモニタリングする方法であって、
（ｉ）本明細書で定義されるアポトーシスに特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉ）本明細書で定義される壊死に特異的な血清バイオマーカー；および
（ｉｉｉ）本明細書で定義される炎症に特異的な血清バイオマーカー
の存在を判定するために前記対象に由来する血清試料を調べるステップと、
前記血清バイオマーカーのうちの１つ以上の存在を、器官または組織に特異的な損傷の指標と相関させるステップと
を含む方法を提供する。
【００８３】
該方法は、血清バイオマーカーのレベルを、器官または組織の薬物誘導性損傷の重症度を示す所定のレベルと相関させるステップをさらに含むことが適切である。
【００８４】
該方法は、検出された血清バイオマーカーのレベルを、所定のレベルと比較するステップを含むことが適切である。該所定のレベルは、薬物の投与を開始する前に対象から得られるベースラインのレベルでありうる。
【００８５】
検出されたバイオマーカーのレベルが高いほど、生じつつある器官または組織の傷害の重症度が重度であることが典型的である。
【００８６】
該方法はまた、選択される期間にわたり対象から採取される血清試料を調べることにより、ある期間にわたりアポトーシス、壊死、および／または炎症の経過をモニタリングするのにも用いることができる。関与するバイオマーカーの存在を迅速に評価することができれば、研究者および／または医師に情報を迅速にフィードバックすることが可能となる。
【００８７】
本発明の方法は、肝臓、皮膚、腎臓、肺、もしくは心血管の傷害／毒性、またはこれらの組合せを検出、評価、および診断するのに特に有用である。
【００８８】
（ｉ）肝損傷の評価
具体的な実施形態では、本発明が、薬物誘導性肝損傷の存在を検出および／または評価する方法であって、
（ｉ）本明細書で定義されるアポトーシスに特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉ）本明細書で定義される壊死に特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉｉ）本明細書で定義される炎症に特異的な血清バイオマーカー
の存在を判定するために血清試料を調べるステップと、
前記血清バイオマーカーのうちの１つ以上の存在を、本明細書で定義される肝臓に特異的な損傷の指標と相関させるステップと
を含む方法を提供する。
【００８９】
さらなる実施形態では、本発明が、薬物誘導性肝損傷を診断する方法であって、
（ｉ）本明細書で定義されるアポトーシスに特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉ）本明細書で定義される壊死に特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉｉ）本明細書で定義される炎症に特異的な血清バイオマーカー
の存在を判定するために動物またはヒトから得られる血清試料を調べるステップと、
前記血清バイオマーカーのうちの１つ以上の存在を、本明細書で定義される肝臓に特異的な損傷の指標と相関させるステップと
を含む方法を提供する。
【００９０】
さらなる実施形態では、本発明が、肝臓における薬物誘導性アポトーシス、薬物誘導性壊死、および薬物誘導性炎症の存在を検出および／または評価する方法であって、
（ｉ）本明細書で定義されるアポトーシスに特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉ）本明細書で定義される壊死に特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉｉ）本明細書で定義される炎症に特異的な血清バイオマーカー
の存在を判定するために血清試料を調べるステップと、
前記血清バイオマーカーのうちの１つ以上の存在を、本明細書で定義される肝臓に特異的な損傷の指標と相関させるステップと
を含む方法を提供する。
【００９１】
肝臓に特異的な損傷の指標を検出するのに当技術分野で知られる任意の方法を用いることが適切である。例えば、肝臓に特異的な損傷の指標としてＡＬＴを検出する場合は、Ｃｕｍｍｉｎｇｓら（１７）において説明されている技法を用いてＡＬＴを測定することができる。
【００９２】
（ｉｉ）皮膚損傷の評価
具体的な実施形態では、本発明が、薬物誘導性皮膚損傷の存在を検出および／または評価する方法であって、
（ｉ）本明細書で定義されるアポトーシスに特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉ）本明細書で定義される壊死に特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉｉ）本明細書で定義される炎症に特異的な血清バイオマーカー
の存在を判定するために血清試料を調べるステップと、
前記血清バイオマーカーのうちの１つ以上の存在を、本明細書で定義される皮膚損傷の臨床的指標と相関させるステップと
を含む方法を提供する。
【００９３】
さらなる実施形態では、本発明が、皮膚における薬物誘導性アポトーシス、薬物誘導性壊死、および薬物誘導性炎症の存在を検出および／または評価する方法であって、
（ｉ）本明細書で定義されるアポトーシスに特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉ）本明細書で定義される壊死に特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉｉ）本明細書で定義される炎症に特異的な血清バイオマーカー
の存在を判定するために血清試料を調べるステップと、
前記血清バイオマーカーのうちの１つ以上の存在を、本明細書で定義される皮膚損傷の臨床的指標と相関させるステップと
を含む方法を提供する。
【００９４】
上記で定義された肝臓または肝臓損傷を検出、評価、および／または診断する方法は、アポトーシスに特異的な血清バイオマーカーとしてのカスパーゼ切断型Ｋ１８、壊死に特異的な血清バイオマーカーとしての全長Ｋ１８およびＨＭＧＢ−１の低アセチル化形態、ならびに炎症に特異的な血清バイオマーカーとしてのＨＭＧＢ−１の過剰アセチル化形態の検出を伴うことが適切である。これらのすべては、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより検出することが簡便でありうる。
【００９５】
皮膚損傷の臨床的指標は、臨床的な皮膚状態（発疹、腫脹、かゆみなど）であることが適切である。
【００９６】
（ｉｉｉ）肺損傷の評価
具体的な実施形態では、本発明が、薬物誘導性肺損傷の存在を検出および／または評価する方法であって、
（ｉ）本明細書で定義されるアポトーシスに特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉ）本明細書で定義される壊死に特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉｉ）本明細書で定義される炎症に特異的な血清バイオマーカー
の存在を判定するために血清試料を調べるステップと、
前記血清バイオマーカーのうちの１つ以上の存在を、本明細書で定義される肺に特異的な損傷の指標と相関させるステップと
を含む方法を提供する。
【００９７】
さらなる実施形態では、本発明が、薬物誘導性肺損傷を診断する方法であって、
（ｉ）本明細書で定義されるアポトーシスに特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉ）本明細書で定義される壊死に特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉｉ）本明細書で定義される炎症に特異的な血清バイオマーカー
の存在を判定するために動物またはヒトから得られる血清試料を調べるステップと、
前記血清バイオマーカーのうちの１つ以上の存在を、本明細書で定義される肺に特異的な損傷の指標と相関させるステップと
を含む方法を提供する。
【００９８】
さらなる実施形態では、本発明が、肺における薬物誘導性アポトーシス、薬物誘導性壊死、および薬物誘導性炎症の存在を検出および／または評価する方法であって、
（ｉ）本明細書で定義されるアポトーシスに特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉ）本明細書で定義される壊死に特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉｉ）本明細書で定義される炎症に特異的な血清バイオマーカー
の存在を判定するために血清試料を調べるステップと、
前記血清バイオマーカーのうちの１つ以上の存在を、本明細書で定義される肺に特異的な損傷の指標と相関させるステップと
を含む方法を提供する。
【００９９】
肺に特異的な損傷の指標を検出するのに当技術分野で知られる任意の方法を用いることが適切である。
【０１００】
（ｉｖ）腎損傷の評価
具体的な実施形態では、本発明が、薬物誘導性腎損傷の存在を検出および／または評価する方法であって、
（ｉ）本明細書で定義されるアポトーシスに特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉ）本明細書で定義される壊死に特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉｉ）本明細書で定義される炎症に特異的な血清バイオマーカー
の存在を判定するために血清試料を調べるステップと、
前記血清バイオマーカーのうちの１つ以上の存在を、本明細書で定義される腎臓に特異的な損傷の指標と相関させるステップと
を含む方法を提供する。
【０１０１】
さらなる実施形態では、本発明が、薬物誘導性肺損傷を診断する方法であって、
（ｉ）本明細書で定義されるアポトーシスに特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉ）本明細書で定義される壊死に特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉｉ）本明細書で定義される炎症に特異的な血清バイオマーカー
の存在を判定するために動物またはヒトから得られる血清試料を調べるステップと、
前記血清バイオマーカーのうちの１つ以上の存在を、本明細書で定義される腎臓に特異的な損傷の指標と相関させるステップと
を含む方法を提供する。
【０１０２】
さらなる実施形態では、本発明が、腎臓における薬物誘導性アポトーシス、薬物誘導性壊死、および薬物誘導性炎症の存在を検出および／または評価する方法であって、
（ｉ）本明細書で定義されるアポトーシスに特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉ）本明細書で定義される壊死に特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉｉ）本明細書で定義される炎症に特異的な血清バイオマーカー
の存在を判定するために血清試料を調べるステップと、
前記血清バイオマーカーのうちの１つ以上の存在を、本明細書で定義される腎臓に特異的な損傷の指標と相関させるステップと
を含む方法を提供する。
【０１０３】
腎臓に特異的な損傷の指標を検出するのに当技術分野で知られる任意の方法を用いることが適切である。
【０１０４】
（ｖ）心血管損傷の評価
具体的な実施形態では、本発明が、薬物誘導性心血管損傷の存在を検出および／または評価する方法であって、
（ｉ）本明細書で定義されるアポトーシスに特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉ）本明細書で定義される壊死に特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉｉ）本明細書で定義される炎症に特異的な血清バイオマーカー
の存在を判定するために血清試料を調べるステップと、
前記血清バイオマーカーのうちの１つ以上の存在を、本明細書で定義される心臓に特異的な損傷の指標と相関させるステップと
を含む方法を提供する。
【０１０５】
さらなる実施形態では、本発明が、薬物誘導性心血管損傷を診断する方法であって、
（ｉ）本明細書で定義されるアポトーシスに特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉ）本明細書で定義される壊死に特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉｉ）本明細書で定義される炎症に特異的な血清バイオマーカー
の存在を判定するために動物またはヒトから得られる血清試料を調べるステップと、
前記血清バイオマーカーのうちの１つ以上の存在を、本明細書で定義される心血管に特異的な損傷の指標と相関させるステップと
を含む方法を提供する。
【０１０６】
さらなる実施形態では、本発明が、心血管組織における薬物誘導性アポトーシス、薬物誘導性壊死、および薬物誘導性炎症の存在を検出および／または評価する方法であって、
（ｉ）本明細書で定義されるアポトーシスに特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉ）本明細書で定義される壊死に特異的な血清バイオマーカー；
（ｉｉｉ）本明細書で定義される炎症に特異的な血清バイオマーカー
の存在を判定するために血清試料を調べるステップと、
前記血清バイオマーカーのうちの１つ以上の存在を、本明細書で定義される心血管に特異的な損傷の指標と相関させるステップと
を含む方法を提供する。
【０１０７】
肺に特異的な損傷の指標を検出するのに当技術分野で知られる任意の方法を用いることが適切である。
【０１０８】
本発明はまた、器官または組織の傷害を検出および／または評価する際における、本明細書で定義されるバイオマーカーの使用も提供する。
【０１０９】
＜アッセイ／キット＞
本発明はまた、器官または組織の薬物誘導性損傷を検出および／または評価するアッセイであって、
本明細書で定義されるアポトーシスに特異的な血清バイオマーカーを検出する手段と；
本明細書で定義される壊死に特異的な血清バイオマーカーを検出する手段と；
本明細書で定義される炎症に特異的な血清バイオマーカーを検出する手段と
を含むアッセイも提供する。
【０１１０】
該アッセイは、器官または組織に特異的な１つ以上の傷害バイオマーカーを検出して、検出された任意のアポトーシス、壊死、または炎症を、１つ以上の具体的な器官および／または組織と相関させる手段をさらに含む。
【０１１１】
ある実施形態では、アッセイが、ＨＭＧＢ−１の酸化形態を検出する手段をさらに含む。
【０１１２】
アポトーシス、壊死、および／または炎症に特異的な血清バイオマーカーを検出する手段は、質量分析またはＥＬＩＳＡなどの免疫アッセイから選択されることが適切である。
【０１１３】
ある実施形態では、器官または組織に特異的な１または複数の傷害バイオマーカーを検出する手段が、ＥＬＩＳＡなどの免疫アッセイである。
【０１１４】
本発明はまた、器官または組織の薬物誘導性傷害を検出および／または評価するキットであって、
カスパーゼ切断型Ｋ１８を検出する試薬と、
全長Ｋ１８および／またはＨＭＧＢ−１の低アセチル化形態を検出する試薬と、
ＨＭＧＢ−１の過剰アセチル化形態を検出する試薬と
を含むキットも提供する。
【０１１５】
ある実施形態では、該キットが、ＨＭＧＢ−１の酸化形態の存在を検出する試薬をさらに含む。
【０１１６】
ある実施形態では、バイオマーカーがＥＬＩＳＡにより検出されることを可能とするのに必要な試薬が、該試薬である。このような試薬には、カスパーゼ切断型Ｋ１８、全長Ｋ１８および／またはＨＭＧＢ−１の低アセチル化形態、ならびにＨＭＧＢ−１の過剰アセチル化形態に特異的な抗体が含まれうる。
【０１１７】
代替的な実施形態では、キットは、質量分析によりバイオマーカーを検出するためのキットである。このようなキットは、
本明細書の前出で定義される、血清Ｋ１８を部分消化するための酵素と、
本明細書の前出で定義される、血清ＨＭＧＢ−１を部分消化するための酵素と、
どのようにして、本明細書で定義される方法のうちの１つに従い試料を調べ、アポトーシス、壊死、および／または炎症が生じつつあるかどうかを決定するかについて詳述する指示書と
を含む。
【０１１８】
本発明のキットは、器官に特異的な器官損傷の指標の存在を検出するための試薬をさらに含みうる。例として述べるなら、このような試薬には、本明細書で定義される、肝臓、腎臓、肺、および／または心臓の傷害バイオマーカーのうちのいずれかを検出するのに必要とされる任意の試薬が含まれうるであろう。例えば、キットを用いて肝損傷を検出するなら、肝臓に特異的なバイオマーカーはＡＬＴでありうるであろうし、この場合、キットは、製造元の指示書に従い用いられる、ＴｈｅｒｍｏＴｒａｃｅ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＡＬＴ Ｌｉｑｕｉｄ安定試薬をさらに含みうる。
【０１１９】
ある実施形態では、キットが、血清タンパク質の分離を可能とする試薬をさらに含む。このような試薬には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動またはウェスタンブロット法のための試薬が含まれうる。このような試薬には、ゲル上で泳動して、Ｋ１８バンドおよびＨＭＧＢ−１バンドの同定を可能とする任意の基準物質、ならびに／またはゲル自体を形成するのに必要とされる任意の試薬が含まれうる。代替的に、キットは、分離カラムを含みうる。
【０１２０】
キットは、血清試料を保持するための基質をさらに含むことが適切である。
【０１２１】
試料中におけるＫ−１８バイオマーカーおよびＨＭＧＢ−１バイオマーカーの存在を評価することにより、アポトーシス、壊死、および／または炎症の検出および評価を容易とする目的で、本発明のキットを、標準的な検査装置と共に用いることができる。質量分析器は、酵素的な部分消化により形成されるＫ１８およびＨＭＧＢ−１の断片を検出するのに不可欠な付加装置部分である。
【０１２２】
以下の図を参照しながら、以下で、本発明をさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】（Ａ）ＡＰＡＰ（５３０ｍｇ／ｋｇ；５時間）または０．９％生理食塩液を投与されたマウスの血清から免疫沈降（ＩＰ）により単離されたＨＭＧＢ１およびＫ１８の形態についての、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシーによる解析を示す図；（Ｂ）リシン残基１８０、１８２〜１８５においてアセチル化したマウスＨＭＧＢ１についてのＭＳ／ＭＳ解析を示す図；（Ｃ）ＡＰＡＰを投与されたマウスの血清中に存在する核局在化配列において、ＭＳ／ＭＳによりアセチル化残基が同定されたマウスＨＭＧＢ１内のリシンについての概略を示す図；（Ｄ）カスパーゼ切断モチーフが切断されていない、４７ｋＤａの全長Ｋ１８についてのＭＳ／ＭＳによる特徴づけを示す図；ならびに（Ｅ）４４ｋＤａの変異体および２１ｋＤａの変異体だけに存在する、カスパーゼ切断モチーフで切断された断片型Ｋ１８についてのＭＳ／ＭＳによる特徴づけを示す図である。図は、１群当たり６匹ずつの動物を表わす。
【図２】（Ａ）ＡＰＡＰ投与（５３０ｍｇ／ｋｇ）３時間後のＨ＆Ｅ染色したマウス肝臓切片を示す図（矢印は、アポトーシス形態を示す肝細胞を指示する。）；（Ｂ）マウス肝臓における切断型カスパーゼ３の免疫組織学的実証を示す図（矢印は、活性カスパーゼ３陽性細胞を示す肝細胞を指示する。）；（Ｃ）ＡＰＡＰ投与（５３０ｍｇ／ｋｇ）５時間後のＨ＆Ｅ染色したマウス肝臓切片を示す図（黒色矢印は、壊死肝細胞を指示する。）；（Ｄ）ＡＰＡＰ投与（５３０ｍｇ／ｋｇ）１５時間後のＨ＆Ｅ染色したマウス肝臓切片を示す図（黒色矢印は、有糸分裂形態を示す肝細胞を指示する。）；（Ｅ）ＡＰＡＰ投与（５３０ｍｇ／ｋｇ）２４時間後のＨ＆Ｅ染色したマウス肝臓切片を示す図（黒色矢印は、有糸分裂形態を示す肝細胞を指示する。以上すべての切片は、２０倍に拡大されている。）；ならびに（Ｆ）ＡＰＡＰ＋Ｚ−ＶＡＤ．ｆｍｋ処置５時間後のＨ＆Ｅ染色したマウス肝臓切片を示す図（１０倍に拡大されている）である。ＣＶ：中央静脈。図は、１群当たり６匹ずつの動物を表わす。
【図３】（Ａ）アガロースゲル解析により決定される、肝臓ＤＮＡラダリングについて、ＡＰＡＰ投与（５３０ｍｇ／ｋｇ、０〜２４時間）後の経時的評価を示す図；（Ｂ）ウェスタンブロットにより決定される、肝臓プロカスパーゼ３（ｐ３２）が活性断片（ｐ１７）へとプロセシングされることについて、ＡＰＡＰ投与（５３０ｍｇ／ｋｇ、０〜２４時間）後の経時的評価を示す図；（Ｃ）ＡＰＡＰ投与（５３０ｍｇ／ｋｇ）マウスの血清中に存在するカスパーゼ切断型Ｋ１８断片レベル（実線；ピコモル／ｍｌ）との、ＡＬＴ活性（点線；Ｕ／ｌ）の経時的な同時的相関を示す図；（Ｄ）全長Ｋ１８レベル（実線；ピコモル／ｍｌ）との、ＡＬＴ活性（点線；Ｕ／ｌ）の経時的な同時的相関を示す図；ならびに（Ｅ）全ＨＭＧＢ１レベル（実線；ｎｇ／ｍｌ）との、ＡＬＴ活性（点線；Ｕ／ｌ）の経時的な同時的相関を示す図である。図は、１群当たり６匹ずつの動物を表わす。データは、平均±標準偏差として与える。統計学的有意性は、「材料および方法」で規定する同じ時点に由来する媒体で処置した対照との関連で割り当てた。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、ならびに＊＊＊ｐ＜０．００５。
【図４】（Ａ）０〜２４時間後の、血清過剰アセチル化ＨＭＧＢ１（免疫細胞に由来する：点線）および血清低アセチル化ＨＭＧＢ１（壊死細胞により放出される：実線）の倍数増大を示す図；（Ｂ）ＡＰＡＰ投与（５３０ｍｇ／ｋｇ）後１０時間にわたる、個々のマウスにおける壊死マーカーとしての血清全長Ｋ１８に対する、アポトーシスマーカーとしての血清カスパーゼ切断型Ｋ１８の相関を示す図（必要に応じて相関係数を示す）；ならびに（Ｃ）マウスにおけるＡＰＡＰ肝毒性のバイオマーカーとしての血清Ｋ１８、血清断片型Ｋ１８、血清ＨＭＧＢ１、血清ＡＬＴの感度および（１−特異度）を示唆するＲＯＣ解析を示す図である。データは、１群当たり６匹ずつのマウスの平均±標準偏差として与える。統計学的有意性は、時点の合致する媒体を投与した対照との関連で割り当てた。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、ならびに＊＊＊ｐ＜０．００５。
【図５】（Ａ）個々の動物の細胞喪失度（組織学スコア）との、血清全長Ｋ１８レベル（ピコモル／ｍｌ）の相関を示す図；（Ｂ）個々の動物の細胞喪失度（組織学スコア）との、血清全ＨＭＧＢ１含量（ｎｇ／ｍｌ）の相関を示す図；（Ｃ）個々の動物のＡＰＡＰ投与（５３０ｍｇ／ｋｇ；５時間）後における、血清全長Ｋ１８レベルとの、血清ＡＬＴ活性（Ｕ／ｌ）の相関を示す図；および（Ｄ）個々の動物のＡＰＡＰ投与（５３０ｍｇ／ｋｇ；５時間）後における、血清全ＨＭＧＢ１含量との、血清ＡＬＴ活性（Ｕ／ｌ）の相関を示す図である。表示の相関係数が必要とされた。
【図６】（Ａ）ＡＰＡＰ（５３０ｍｇ／ｋｇ；５時間）誘導性肝臓ＤＮＡラダリングに対してＺ−ＶＡＤ．ｆｍｋが及ぼす効果を示す図；（Ｂ）ＡＰＡＰ誘導性プロカスパーゼ３プロセシングに対してＺ−ＶＡＤ．ｆｍｋが及ぼす効果を示す図；（Ｃ）ＡＰＡＰ誘導性血清カスパーゼ切断型Ｋ１８量（ピコモル／ｍｌ）に対してＺ−ＶＡＤ．ｆｍｋが及ぼす効果を示す図；（Ｄ）ＡＰＡＰ誘導性肝臓グルタチオン（ＧＳＨ）枯渇（ナノモル／ｍｇ）に対してＺ−ＶＡＤ．ｆｍｋが及ぼす効果を示す図；（Ｅ）ＡＰＡＰ誘導性全血清ＨＭＧＢ１含量（ｎｇ／ｍｌ）に対してＺ−ＶＡＤ．ｆｍｋが及ぼす効果を示す図；および（Ｆ）ＡＰＡＰ誘導性血清ＡＬＴ活性（Ｕ／ｌ）に対してＺ−ＶＡＤ．ｆｍｋが及ぼす効果を示す図である。これらは、同じマウス群内で同時に記録された。データは、１群当たり６匹ずつのマウスの平均±標準偏差として与える。統計学的有意性は、時点の合致する媒体を投与した対照との関連で割り当てた。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、ならびに＊＊＊ｐ＜０．００５。
【図７】アセトアミノフェン（ＡＰＡＰ）（５３０ｍｇ／ｋｇ；５時間）投与マウスの血清を用いた、システイン１０６におけるＨＭＧＢ−１酸化状態の特徴づけを示す図である。（Ａ）ＭＳ／ＭＳにより特徴づけられるマウスＨＭＧＢ−１のサイトカインドメインにおけるシステイン１０６の位置についての概略図である。（Ｂ）摂食ＡＰＡＰ投与（５３０ｍｇ／ｋｇ；５時間）マウスおよび絶食ＡＰＡＰ投与（５３０ｍｇ／ｋｇ；５時間）マウスの血清から、免疫沈降により単離された還元型ＨＭＧＢ−１および酸化型ＨＭＧＢ−１の非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離およびウェスタンブロット解析を示す図である。ＨＭＧＢ−１はまた、Ｚ−ＶＡＤ．ｆｍｋで前処置したＡＰＡＰ投与マウスからも単離した。（Ｃ）システイン１０６においてスルホン酸を含有する、摂食ＡＰＡＰ処置マウスに由来するマウス酸化型ＨＭＧＢ−１ペプチド９７〜１１２についてのＭＳ／ＭＳ解析を示す図である。（Ｄ）２４時間にわたりあらかじめ絶食させたＡＰＡＰ処置マウスに由来する、システイン１０６チオールを含有するマウス還元型ＨＭＧＢ−１ペプチド９７〜１１２についてのＭＳ／ＭＳ解析を示す図である。ＭＳ／ＭＳについての図、ならびにウェスタンブロットについての図は、１群当たり６匹ずつの動物を表わす。
【０１２４】
［表１］
ＡＰＡＰにより、雄ＣＤ−１マウス（５３０ｍｇ／ｋｇ）において、３〜２４時間後にわたり誘導される組織学的変化、アポトーシス性バイオマーカーの誘導（カスパーゼ３の活性化およびＤＮＡラダリング）、および血清バイオマーカーの増大についての概要を示す表である。免疫組織学（ＩＨ）については、＋が、肝臓切断型カスパーゼ３の発現度を示す。ＧＳＨ枯渇については、肝臓ＧＳＨ枯渇が対照動物と比較して著明であることを（＋）が示すか、または肝臓ＧＳＨ枯渇が著明でないことを（−）が示す。（＋）は、ウェスタンブロット（ＷＢ）によるＤＮＡラダリングまたはカスパーゼ３のプロセシングについての陽性検出を示す。血清バイオマーカー解析については、対照値を上回る著明な増大が見られることを（＋）が示すか、または対照値を上回る著明な増大が見られないことを（−）が示す。
【０１２５】
［実施例］
ここで、本発明を、以下の例示的な実施例との関連でより詳細に説明する。
【実施例１】
【０１２６】
＜アセトアミノフェン誘導性アポトーシスおよびアセトアミノフェン誘導性壊死のバイオマーカーとしてのケラチン１８およびＨＭＧＢ−１（ｈｉｇｈ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｇｒｏｕｐ ｂｏｘ−１）についての生体分析＞
潜在的に有益かつメカニズムに基づいたＤＩＬＩバイオマーカーを探索するには、げっ歯動物系におけるモデル肝毒素であり、かつ、重大な臨床的ＡＤＲであるアセトアミノフェン（ＡＰＡＰ）を用いることができる。シトクロムＰ４５０を媒介する反応性代謝物であるＮ−アセチル−ｐ−ベンゾ−キノンイミン（ＮＡＰＱＩ）の形成を介してＡＰＡＰ肝毒性を誘発し、その後、ＧＳＨ枯渇を要請する生化学的イベントについては、十分に定義されている（５）。壊死が細胞死の最終的で究極的な形態ではあるが、ＡＰＡＰ代謝が活性化された後の細胞内イベントにより肝細胞のアポトーシスがもたらされうることを、複数の報告が示唆している（６〜８）。しかし、ＡＰＡＰがアポトーシスを誘導する程度については、依然として異論の余地がある（９〜１１）。
【０１２７】
本探索の目的は、細胞死の血清バイオマーカーとしてのＨＭＧＢ１およびＫ１８を非侵襲的に解析することにより、ＡＰＡＰ誘導性肝毒性の動物モデルにおけるアポトーシスと壊死との間の力動性を規定することであった。自然免疫細胞または壊死細胞により放出される血清ＨＭＧＢ１の異なる分子形態を特徴づけて定量化するのには、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法を用いた。また、平行して、マウスにおけるＡＰＡＰ誘導性アポトーシス後のカスパーゼによるＫ１８の切断を確認し、血清中の断片Ｋ１８および全長Ｋ１８を定量化するのにもＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた。
【０１２８】
＜材料および方法＞
＜材料＞
ＨＭＧＢ１およびＫ１８に対する抗体（ウサギ抗ヒト抗体）は、Ａｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）から購入し、ウェスタンブロット解析用のカスパーゼ３に対する抗体（ウサギ抗カスパーゼ３抗体、８Ｇ１０）ならびに免疫組織学解析用のカスパーゼ３に対する抗体（ウサギ抗切断型カスパーゼ抗体、５Ａ１Ｅ）は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（Ｈｉｔｃｈｉｎ、ＵＫ）から購入した。免疫組織学用の二次抗体は、から購入し、ＨＭＧＢ１ ＥＬＩＳＡキットは、株式会社シノテスト（日本、東京）から、Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＡＬＴ液体試薬は、Ａｌｐｈａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｅａｓｔｌｅｉｇｈ、ＵＫ）から購入した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｄｙｅ Ｒｅａｇｅｎｔは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｔｄ（Ｈｅｍｅｌ Ｈｅｍｐｓｔｅａｄ、ＵＫ）から購入した。プロテオーム解析には、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸をＬａｓｅｒＢｉｏｌａｂｓ（Ｆｒａｎｃｅ）から、トリプシンをＰｒｏｍｅｇａ（ＵＫ）から、ＺｉｐＴｉｐｓをＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（ＵＫ）から購入した。すべての溶媒は、ＨＰＬＣグレードであり、Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｐｌｃ（Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ、ＵＫ）製であった。別段に言及しない限り、他のすべての化学物質、ペプチド基準物質、および材料は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｐｏｏｌｅ、ＵＫ）から購入した。
【０１２９】
＜動物の処理＞
食物および水を自由に摂取させた、雄ＣＤ−１マウスの個体（２５〜３５ｇ）６匹ずつによる群を、試験に組み入れた。ある時間経過にわたり、試験動物に、０．９％生理食塩液中のＡＰＡＰ（５３０ｍｇ／ｋｇ）の単回腹腔内注射を行い、処理の３、５、１０、１５、２０、または２４時間後に安楽死させた。対照動物には、必要に応じて、０．９％の生理食塩液、または０．９％の生理食塩液中の溶媒対照を施した。アポトーシスについての陰性対照として、ならびにアポトーシスについての血清バイオマーカーを検証するために、１つの群のマウスには、汎カスパーゼ阻害剤であるＺ−ＶＡＤ．ｆｍｋを施し（ＤＭＳＯ（ＡＰＡＰ投与の１５分前における、０．９％の生理食塩液中０．１ｍｌ／ｋｇのＤＭＳＯ）中１０ｍｇ／ｋｇの静脈内投与）、処理の５時間後に安楽死させた。血清中のＡＬＴ活性、ＨＭＧＢ１、およびＫ１８を決定したほか、ＤＮＡラダリング、カスパーゼ３についてのウェスタンブロット法、ＧＳＨ含量、ならびに免疫組織学を含めた組織学を、すべての動物に対して実施した。
【０１３０】
＜肝毒性の評価＞
ＣＯ２の吸入および頸椎脱臼により動物を安楽死させ、心臓穿刺により血液を採取した。血液試料を、一晩にわたり４℃で保存し、凝固させた。肝臓を摘出し、氷冷生理食塩液中ですすぎ、１０％の中性緩衝ホルマリン中で固定するか、または瞬間凍結させた。既に報告した（２８）通りに、血清アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）レベルを決定した。肝毒性の組織学的評価および免疫組織学検査を行うため、ホルマリンで固定した肝切片を、日常的な方法でパラフィンろう中に包埋した。３〜５μｍの切片を調製し、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色するか、または免疫組織学に用いた。Ｈ＆Ｅ染色切片を、任意の組織病理学的特色について検査し、アポトーシス性肝細胞および／または壊死性肝細胞を同定した。肝細胞喪失（おもに、小葉中心性喪失）の程度を、０〜５としてスコア評価した（ここで、０は、細胞喪失の証拠を示さず（未変化の肝臓）、５は、広範にわたる細胞喪失を示した）。スコア評価は、２人の共同研究者（ＤＪＡ、ＡＫ）により、盲検処理の上で個別に実施した。
【０１３１】
＜肝臓内グルタチオンレベルの決定＞
既に説明した（２９）通りに、肝臓内総グルタチオン（ＧＳＨ＋ＧＳＳＧ）レベルを決定した。
【０１３２】
＜カスパーゼ３についてのウェスタンブロット法、切断型カスパーゼ３の免疫組織学的裏付け、およびＤＮＡラダリング＞
カスパーゼ３についてのウェスタンブロット法は、瞬間凍結させた肝臓から調製したマウス肝臓細胞質ゾル画分に対して、既に説明した（３０）通りに実施した。製造元の指示書に従い、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ ＧｅｎｅＥｌｕｔｅキットを用いて、瞬間凍結させた肝臓からＤＮＡを単離した。１％アガロースゲル上において分離した後、臭化エチジウム染色によりＤＮＡラダリングを可視化した。切断型カスパーゼ３を免疫組織学的に裏付けるため、既に説明したプロトコール（３１）に基づき、ホルマリンで固定し、パラフィンで包埋した肝切片に対して、ペルオキシダーゼ抗ペルオキシダーゼ法を適用した。切断型カスパーゼ３陽性細胞（細胞質染色）の数を半定量評価した（−：陽性細胞なし；＋：陽性細胞が散見される；＋＋：中間数の陽性細胞が見られる；＋＋＋：多数の陽性細胞が見られる）。
【０１３３】
＜血清ＨＭＧＢ１および血清Ｋ１８の特徴づけおよび定量化＞
血清Ｋ１８および血清ＨＭＧＢ１の免疫沈降（ＩＰ）物（５μｇの抗体およびプロテインＧによる分離物）を、一晩にわたりＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。クーマシーブルー染色ゲルからタンパク質バンドを摘出し、５０％アセトニトリル／５０ｍＭ重炭酸アンモニウムと共にインキュベートすることにより脱染色した後、真空乾燥させた。４０ｎｇ／μＬの修飾トリプシン（Ｋ１８）または修飾ＧｌｕＣ中（ＨＭＧＢ１）を含有する５０ｍＭ重炭酸アンモニウム中でゲル小片を再水和させ、３７℃で１６時間にわたりインキュベートした。２回の交換を行いながら６０％アセトニトリル／１％トリフルオロ酢酸と共にインキュベートすることによりペプチドを抽出し、結果として得られる上清を再度乾燥させた。製造元の指示書に従い、Ｃ１８ ＺｉｐＴｉｐｓを用いて抽出物を脱塩し、５％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸中で復元した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析のため、自動式インライン型液体クロマトグラフ（ナノエレクトロスプレー線源ヘッド、ならびに内径１０μｍのＰｉｃｏＴｉｐ（Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ、ＵＳＡ）を介して統合された、ＬＣ−Ｐａｃｋｉｎｇｓ Ｓｙｓｔｅｍ、５ｍｍ Ｃ１８ナノプレカラム、ならびに７５μｍ×１５ｃｍのＣ１８ ＰｅｐＭａｐカラム（Ｄｉｏｎｅｘ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ））を介して、ＱＳＴＡＲ Ｐｕｌｓａｒ ｉハイブリッド型質量分析器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）へと試料を送入した。６０分間で５％アセトニトリル／０．０５％トリフルオロ酢酸（ｖ／ｖ）〜４８％アセトニトリル／０．０５％トリフルオロ酢酸（ｖ／ｖ）の勾配を、３００ｎＬ／分の流速で適用し、ＩＤＡ（ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ）（Ａｎａｌｙｓｔ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いる陽イオンモードで、ＭＳスペクトルおよびＭＳ／ＭＳスペクトルを自動的に取得した。信頼水準を８０％に設定し、生物学的修飾を許容したＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースの最新版と共にＰｒｏｔｅｉｎ Ｐｉｌｏｔ ２（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、データベース検索を実施した。合成ペプチド基準物質を対照血清中に添加して生成させた標準曲線を構築することにより、マウス血清全長Ｋ１８断片およびカスパーゼ依存型Ｋ１８断片の定量化を実施し、イムノアッセイ（１７）と比較した。カスパーゼ３、７、９切断部位にわたるように全長Ｋ１８基準ペプチド（ＬＬＥＤＧＥＤＦＳＬＮＤＡＬＤＳＳＮＳＭＱＴＶＱＫ）をデザインする一方、カスパーゼ切断部位で切断したＫ１８断片だけから短縮型ペプチド（ＬＬＥＤＧＥＤＦＳＬＮＤＡＬＤ）を誘導する（検出限界：３００フェムトモル／ｍｌ；変動係数＜１０％）。ＨＭＧＢ１ならびにその過剰アセチル化誘導体は、合成基準物質が利用できないので、スペクトルのペプチドピークをカウントすることにより定量化されたものであり、その結果、相対値としてだけ提示され、製造元の指示書に従いＥＬＩＳＡにより決定された総レベルと比較される（検出限界：０．１ｎｇ／ｍｌ；変動係数＜１０％）。
【０１３４】
＜統計学的解析＞
すべての結果（組織学的解析を除く）は、平均±標準偏差（ＳＤ）として表現する。比較される値は、シャピロ−ウィルク検定を用いる非正規分布について解析した。正規分布が適応である場合は、対応のないｔ検定を用いた。ノンパラメトリックデータについて、マン−ホイットニーのＵ検定を用いた。ＳｔａｔｓＤｉｒｅｃｔ統計ソフトウェアを用いてすべての計算を実施し、ｐ＜０．０５の場合に結果を有意であると考えた。
【０１３５】
＜結果＞
＜ＡＰＡＰ誘導性肝毒性時におけるＨＭＧＢ１およびＫ１８の循環分子形態の同定および特徴づけ＞
ＡＰＡＰ投与マウスの血清中には存在するが、対照マウスの血清中には存在しないＨＭＧＢ１についてＬＣ−ＭＳ／ＭＳで特徴づけたところ（図１Ａ）、低アセチル化ＨＭＧＢ１（壊死と共に放出される）および過剰アセチル化ＨＭＧＢ１（活性化免疫細胞から放出される）両方の混合物が明らかとなった。ＧＬｕＣで消化したＨＭＧＢ１およびＭＳ／ＭＳ解析により、ＨＭＧＢ１核局在化配列内に存在する、リシン残基１８０〜１８５を含有する１１３２．６Ｄａのペプチドを同定した。また、同じアミノ酸配列を含有するペプチドも存在したが、質量が２１０ａｍｕ大きかった。１３４２．６Ｄａへと質量が増大することは、アセチル基５個の付加に対応する。さらなるＭＳ／ＭＳ解析により、単球およびマクロファージによりそれが活性で放出される際の重要な機構であるアセチル化による修飾が、リシン残基１８０〜１８５において存在することが確認された（図１Ｂ〜Ｃ）。ＡＰＡＰ投与マウスの血清中で特徴づけられるアセチル化残基を伴う、概略的なＨＭＧＢ１リシンマップを図１Ｃに示す。
【０１３６】
ＡＰＡＰ投与マウスの血清中に存在するＫ１８を特徴づけた結果として、壊死細胞から放出された全長Ｋ１８（４７ｋＤａ）、ならびに４４ｋＤａおよび２１ｋＤａにおける２つのアポトーシス関連形態が同定された（図１Ａ）。これに対し、非処理マウスの血清中では、Ｋ１８の全長形態または断片化形態の放出についての証拠が見出されなかった（図１Ａ）。ＭＳ／ＭＳにより全長Ｋ１８を解析したところ、Ｋ１８のカスパーゼ依存型アポトーシス断片（４４ｋＤａおよび２１ｋＤａ）内には存在しない２７５６Ｄａのペプチドがもたらされた。解析により、このペプチドは、切断されていない予測カスパーゼ３、７、および９切断モチーフを有するペプチドであると特徴づけられた（図１Ｄ）。これに対し、トリプシンにより４４ｋＤａおよび２１ｋＤａのＫ１８断片を消化したところ、全長Ｋ１８を伴わない１６６５Ｄａの短縮型ペプチドがもたらされた。ＭＳ解析により、これは、ＤＡＬＤ／ＳＳモチーフで切断されるカスパーゼ部位が存在するためであることが明らかとなった（図１Ｅ）。
【０１３７】
＜Ｋ１８およびＨＭＧＢ１は、ＡＰＡＰ誘導性組織学変化についての高感度で有益な機構ベースのバイオマーカーを表わす＞
対照動物は、組織学的変化を示さなかった、すなわち、切断型カスパーゼ３についての免疫組織学を含めた組織学による肝細胞喪失の証拠は見られず（スコア０）、壊死またはアポトーシスについての証拠も見られなかった。処理の３時間後において、小葉中心性喪失が観察され（スコア１〜２）、おもに小葉中心性のアポトーシス細胞の形態を伴う多数の細胞が見られた（図２Ａ）。切断型カスパーゼ３の発現（図２Ｂ）により、ならびにＤＮＡラダリングおよびカスパーゼ３プロセシングのほか、血清Ｋ１８断片の増大（図３）により、アポトーシスが確認された。処理の５時間後に、動物は、多様な程度の細胞喪失を示した（スコア１〜３、平均２）。アポトーシス細胞数は減少したが、スコア１のアポトーシス細胞は一般に多数であり、壊死細胞も増大した（図２Ｃ）。ｉｎ ｓｉｔｕにおいてアポトーシス細胞が同定されない場合は、ＤＮＡラダリングおよび／またはカスパーゼ３プロセシング、ならびに血清Ｋ１８断片の増大もまた一般に観察されなかった。処理の１０時間後までに、細胞喪失スコアは１または２となり、アポトーシス細胞は、観察されたとしてもまれとなった。ＤＮＡラダリングまたはカスパーゼ３プロセシングの証拠は見られず、依然として血清Ｋ１８断片の増大が観察された。処理の１５時間後にも、血清Ｋ１８断片は依然として増大した。肝細胞喪失のスコアは０〜２（平均１または２）であり、帯域３（小葉中心帯域）では肝細胞置換の証拠が見られた（図２Ｄ）。処理の２０時間後には、肝細胞喪失の際立った証拠が見られないかまたはごくわずかな肝細胞喪失の証拠が見られた（スコア０または１）が、帯域３内の肝細胞は、不規則に配置されているように見えた。全肝臓のスコアが０となった、処理の２４時間後には、この不規則な配置も観察されなかった。処理の５時間後以降、有糸分裂形状により表わされる、肝細胞の有糸分裂が増大する証拠が見られた。処理の１５、２０、および２４時間後には、これらの証拠が特に多数であった（図２Ｄ〜Ｅ）。全時間が経過するにつれて、血清全長Ｋ１８の増大、ならびに血清ＡＬＴ活性の増大が観察される（図３Ｄ）一方、処理の１５時間後以降、血清ＨＭＧＢ１の増大は見られず（図３Ｅ）、ＧＳＨ枯渇が明白であるのは処理の３〜５時間後に限られた。処理後のどの時点でも著明な炎症細胞浸潤は観察されなかったが、５〜１５時間後において、一部の動物では、少数の好中球が小葉中心において見られた。結果を表１にまとめる。
【０１３８】
ＡＰＡＰの投与後、ＭＳ／ＭＳによりＨＭＧＢ１の各種の血清分子形態を解析したところ、投与の３時間後に壊死随伴形態が著明に増大し、これは５時間後にピークに達し、２０時間後までに対照レベルへと復帰したことが明らかとなった。これに対し、ＨＭＧＢ１の免疫細胞由来形態の血清レベルがわずかながら著明に上昇したが、これが検出されたのは、投与の５時間後に限られた。このレベルのこの形態は、時間が経過するにつれて増大し、１５時間後にピークに達し、２４時間後までに対照レベルへと復帰した（図４）。ＡＰＡＰ投与後において血清中に存在するカスパーゼ切断型Ｋ１８レベルに対する全長Ｋ１８レベルの相関により、時間が経過するにつれてアポトーシス性細胞死から壊死性細胞死への変化が生じていることが示される（図４Ｂ）。
【０１３９】
ＨＭＧＢ１およびＫ１８（全長Ｋ１８および断片化Ｋ１８）を、ＡＰＡＰによる肝毒性についての有益で機構ベースのバイオマーカーとして評価するため、ＲＯＣ（ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｏｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）解析を、従来の血清肝毒性指標（ＡＬＴ）と比較して行った。図４Ｃは、ＡＬＴ（０．８０）と比較した、血清断片化Ｋ１８（０．８４）、全長Ｋ１８（０．９０）、および全ＨＭＧＢ１（０．８７）についてのＲＯＣ曲線ならびに曲線下面積についての解析を示す。個々の動物の血清ＨＭＧＢ１レベルおよび血清Ｋ１８レベルを、組織学により決定される肝細胞喪失の程度（図５Ａ〜Ｂ）ならびにＡＬＴ活性のレベルと相関させることにより、ＨＭＧＢ１およびＫ１８が、これらの動物モデルにおけるＤＩＬＩのバイオマーカーとしてさらに検証される。血清全長１８および血清ＨＭＧＢ１の両方が増大することは、肝細胞喪失度が増大することと相関していた。ＡＰＡＰ投与後におけるＡＬＴ活性のレベルと相関させたとき、Ｋ１８およびＨＭＧＢ１のそれぞれについて得られる相関係数は、Ｒ２＝０．８３２およびＲ２＝０．７４６であった（図５Ｃ〜Ｄ）。
【０１４０】
＜カスパーゼを阻害するとＡＰＡＰ誘導性壊死が増大する＞
Ｋ１８の断片化がカスパーゼ依存性であることを確認するため、マウスに、カスパーゼ阻害剤であるＺ−ＶＡＤ．ｆｍｋと共にＡＰＡＰを共投与した。Ｚ−ＶＡＤ．ｆｍｋは、ＡＰＡＰを単独で投与したマウスと比較して、ＡＰＡＰ投与マウスにおけるアポトーシスマーカーの検出を完全に阻害した（図６Ａ〜Ｃ）。Ｚ−ＶＡＤ．ｆｍｋまたはＤＭＳＯ溶媒対照による前処理は、ＡＰＡＰ媒介性ＧＳＨ枯渇に対して効果を及ぼさなかった（図６Ｄ）。しかし、Ｚ−ＶＡＤ．ｆｍｋおよびＡＰＡＰを投与すると、ＡＰＡＰ単独の場合と比較して、血清ＡＬＴレベルおよび血清ＨＭＧＢ１レベルを結果として増大させた（図６Ｅ〜Ｆ）。ＡＰＡＰにより誘導される小葉中心性肝細胞喪失の組織学的スコアは一般に２〜３であり、したがって、ＡＰＡＰをＺ−ＶＡＤ．ｆｍｋと共投与すると、ＡＰＡＰ単独の場合と比較してスコアが上昇した（ｐ＜０．０５）（図２Ｆ）。切断型カスパーゼ３については、組織学および免疫組織学によるアポトーシス性肝細胞死の証拠が見られなかった（データは図示しない）。
【０１４１】
＜考察＞
この試験で、本発明者らは、ＤＩＬＩをもたらす機構をさらに理解するために、インビボにおいて、非侵襲的で生物学的に有益なバイオマーカーとしてのＨＭＧＢ１およびＫ１８の異なる分子形態についての質量分析評価を用いた。
【０１４２】
ＡＰＡＰは、動物モデルにおける「オフターゲット」の肝毒性をもたらす機構を探索し、潜在的に有用な肝毒性バイオマーカーを評価するための、臨床的に関与性で重要なツールを表わす。組織学的かつ生化学的な特徴づけの後、ＡＰＡＰ肝毒性の高感度なバイオマーカーであるＨＭＧＢ１およびＫ１８の各種の機構および細胞死モデル特異的な形態を、マウス血清中において同定および特徴づけすることができるであろうという仮説について調べた。
【０１４３】
質量分析は、広範な前臨床試験種にわたる絶対的かつ相対的な定量化法を開発するための、バイオマーカー分析物についての明確な同定および特徴づけをもたらす。これは、薬物の安全性解析、臨床研究、および基礎研究を支援する試験となる可能性を有する。本探索において、質量分析による、マウス血清中に存在するＫ１８の特徴づけを用いたところ、壊死により不活性状態で放出されることが知られる全長Ｋ１８、ならびにアポトーシス時において放出される断片型Ｋ１８のいずれもが、ＡＰＡＰ肝毒性時において放出されることが明らかとなった。ＭＳ／ＭＳ解析により、Ｋ１８の断片化形態（ＤＡＬＤ）では、カスパーゼ切断モチーフが時間依存的な形で切断および曝露されるが、Ｋ１８の全長形態（ＤＡＬＤＳＳ）ではそうならないことが示された。これにより、この動物モデルでは、ＡＰＡＰ肝毒性時において、カスパーゼ基質の切断が確かに生じることが示唆された。データは、プロカスパーゼのプロセシングおよびＤＮＡラダリングについての測定値と符合する。さらに、ＭＳ解析は、同じ試料内における、アポトーシスに関連するＫ１８形態ならびに壊死に関連するＫ１８形態の増大を同時に解析することも可能とした。個々の動物の全長Ｋ１８レベルおよびカスパーゼ切断型Ｋ１８レベルの相関は、組織学的経過を反映し、処置の２４時間後までの全時間にわたり観察される壊死性細胞死と並んで、処置後最初の数時間以内のアポトーシス性細胞死を裏付ける非侵襲的方法をもたらした。Ｋ１８の定量化は、どの時点においても、壊死が、細胞死の主要形態であることを示唆した。組織学的に述べると、早期の時点ではアポトーシス細胞を同定することができ、これは、アポトーシス形態を伴う細胞内における切断型カスパーゼ３の存在を免疫組織学的に実証することにより裏付けられた。しかし、壊死細胞が組織学的に同定されることはごくまれであり、これにより、肝細胞壊死が、極めて早期の段階にして既に細胞喪失をもたらす、極めて急速な過程であることが確認される。しかし、血清ＨＭＧＢ１、ＡＬＴ活性の増大、ならびに切断型カスパーゼ３についての免疫組織学を含めた組織学により示される通り、カスパーゼ活性を阻害することにより、肝臓の傷害の著明な増大、ならびに肝細胞アポトーシスの完全な消失が観察された。
【０１４４】
ＡＰＡＰ誘導性Ｋ１８切断は、カスパーゼ３、７、および９による切断から生成される大型の４４ｋＤａ断片と、生成される小型の断片だけでなく、カスパーゼ６のさらなる活性に依存する小型のＫ１８断片との両方を結果としてもたらした。４４ｋＤａの断片と２１ｋＤａの断片とを差別化しない現在のイムノアッセイからこの情報を導出することはできなかった。しかし、カスパーゼ６による切断だけに由来する２７ｋＤａの断片もまた予測することができたが、同定はできなかった（１６）。このＫ１８切断のパターンを明らかにする可能性のある説明は数多い。カスパーゼ６の関与がより低度であることを明らかにするのは、細胞死の外因的経路ではなく、内因的経路の活性化でありうる（３２、３３）。カスパーゼの完全な活性化からは、小型の断片が主要な形態であることが予測されるであろう。しかし、最適条件下では、カスパーゼ６部位が切断される前に、カスパーゼ３、７、および９の部位が切断されることが研究により示されている（１２）。カスパーゼ活性（３４）にはＡＴＰが必要とされ、ＡＰＡＰ肝毒性では肝臓ＡＴＰが枯渇するため、肝臓ＡＴＰの減少により、カスパーゼ６媒介性Ｋ１８切断、ならびに持続的なアポトーシスカスケードが阻害される可能性が存在し、これによるなら、大型のＫ１８断片と小型のＫ１８断片との両方の混合物が生成されることも説明可能であろう。
【０１４５】
ＭＳ／ＭＳ解析では、ＡＰＡＰ投与マウス血清中の壊死細胞から放出される低アセチル化ＨＭＧＢ１、ならびに活性化免疫細胞に由来する過剰アセチル化ＨＭＧＢ１の両方が同定された。この情報は、異なる分子形態を差別化しない現在のイムノアッセイからは導出することができなかった。さらに、ＭＳ／ＭＳ解析では、免疫細胞がＨＭＧＢ１を放出するのに極めて重要な配列として既に同定されている、核局在化配列内において重要なリシン残基１８０〜１８５のアセチル化も同定されている（２４）。ＡＰＡＰ肝毒性時において、壊死に由来する分子形態は、処置の３時間後から著明に増大し、１０時間後にピークに達し、次いで減少し、２０時間後にはもはや検出されなかった。感染の１５時間後には既に、肝細胞壊死の組織学的証拠がもはや見られず、肝細胞有糸分裂の再生および誘導の証拠が見られたことは興味深い。血清におけるＨＭＧＢ１の半減期が比較的短く、その増大後に減少することは、肝細胞の喪失および再生が、肝臓の傷害状態を反映するバイオマーカーとしてのＨＭＧＢ１の重要な特色を強調することを反映した。免疫細胞に由来するＨＭＧＢ１の形態は、５時間後以降、はるかに低レベルまでの増大ではあるが、実験終了時である２４時間後まで増大した。どの時点でも、肝臓内で著明な炎症細胞の浸潤が観察されることはなく、ＡＰＡＰ投与の５〜１５時間後、一部の動物の小葉中心において少数の好中球が見られただけであった。これは、ＡＰＡＰにより誘導される壊死性肝細胞死が免疫細胞の活性化をもたらすことを示し、機構ベースのＤＩＬＩバイオマーカーとしてのＨＭＧＢ１の使用をさらに裏付ける。しかし、ＤＩＬＩ時におけるＨＭＧＢ１の正確な役割、ならびにそれが活性化免疫細胞に由来するかどうかは、いまだ解明されていない（３５〜３８）。
【０１４６】
予測される通り、血清ＡＬＴ解析が肝損傷のより特異的なマーカーであるが、ＲＯＣ曲線の解析は、Ｋ１８およびＨＭＧＢ１が、ＡＬＴより高感度な肝毒性の指標であるという経時的評価を裏付けた。安全性バイオマーカーの潜在的な有用性を援用するには、相関についての用量および時点ほか、識別についての用量および時点も規定することが重要である。Ｋ１８およびＨＭＧＢ１が機構ベースのＡＰＡＰ肝毒性バイオマーカーであることは、組織学により決定される細胞喪失の増大との強い相関、ならびにＡＬＴ活性との相関によりさらに検証された。ＨＭＧＢ１およびＫ１８が示す器官特異性は、ＡＬＴ活性と同レベルではないが、このデータは、ＨＭＧＢ１およびＫ１８が、ＡＬＴ活性と並んで用いてＤＩＬＩ機構についての知識を増強しうる、肝細胞喪失についての高感度で有益な指標をもたらすという仮説を裏付ける。
【０１４７】
まとめると、本発明者らは、マウスモデルにおけるＡＰＡＰ肝毒性の発生と連関する機構ベースのバイオマーカーとして、Ｋ１８およびＨＭＧＢ１の分子形態を同定および解析するのに質量分析を用いた。このような機構ベースの血清バイオマーカーは、臨床系における研究、動物系における研究、およびインビトロ系における研究を架橋してヒトにおけるＤＩＬＩについての理解を増強し、これにより、それを予防するための戦略をもたらすのに用いることができる。
【実施例２】
【０１４８】
＜ＨＭＧＢ−１の酸化形態の検出＞
上述の通り、ＨＭＧＢ−１のサイトカインドメイン内におけるＣ１０６のスルフヒドリル基（図７Ａ）に対するカスパーゼ依存性酸化は、アポトーシス細胞内のＨＭＧＢ−１の炎症特性の中和において重要な機構である（３９）。
【０１４９】
本出願者らは、パラセタモール毒性（絶食動物における）に随伴する炎症反応の誘導が、これらもまたパラセタモールを施されたが毒性は観察されなかった対照動物（摂食動物）と比較して、酸化ＨＭＧＢ−１の欠如と関連することを見出した。
【０１５０】
毒性を示す、ＡＰＡＰを投与された絶食マウスに由来する血清についてのウェスタンブロット解析により、血清中に存在するＨＭＧＢ−１の唯一の分子形態は、還元形態であることが明らかとなった（図７Ｂ）。ＡＰＡＰを投与されたが毒性を示さなかった摂食マウス血清中のＨＭＧＢ−１の主要な形態は、免疫耐性の酸化形態であった（図７Ｂ）。還元型ＨＭＧＢ−１タンパク質内では、ＭＳ／ＭＳにより、Ｃ１０６を含有する１９４７．３Ｄａのペプチドが特徴づけられた。さらなるＭＳ／ＭＳ解析では、酸化型ＨＭＧＢ−１中だけに存在し、ＨＭＧＢ−１の還元形態中には存在しない、１９６３．３、１９７９．３、および１９９５．３Ｄａのペプチドが同定された。１６ａｍｕずつの漸増は、Ｃ１０６に酸素が付加されて、スルホン酸含有残基、スルフェン酸含有残基、およびスルフィン酸含有残基が生成されることに対応した（図７Ｃ〜Ｄ）。Ｃ１０６の酸化がカスパーゼに依存することは、ＡＰＡＰで処置した摂食マウスにおいて汎カスパーゼ阻害剤であるＺ−ＶＡＤ．ｆｍｋを用いることにより確認された。この処置により、これらのマウスにおいて検出され、毒性の増大と関連する、ＨＭＧＢ−１の還元型分子形態だけが結果としてもたらされた（図Ｂ）。
【０１５１】
ＨＭＧＢ１の免疫刺激特性は、Ｃ１０６のスルフィドリル基の酸化状態に依存して変化することが判明している。この基の酸化は、細胞内における翻訳後修飾であり、免疫耐性を促進するカスパーゼ誘導性過程であることが示されている（３９）。本出願者は、ウェスタンブロット法により、ＨＭＧＢ−１の酸化形態が、ＡＰＡＰを投与された摂食マウスの血液中における主要形態であり、カスパーゼの活性化に依存することを裏付けたが、これは、かつて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで観察されただけであった（３９）。
【０１５２】
【表１】
【０１５３】
［文献］
【表２Ａ】
【表２Ｂ】
【表２Ｃ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト対象または動物対象への薬物の投与に伴う器官または組織の損傷を検出および／または評価する方法であって、前記対象から得られる血清試料を、
（ｉ）アポトーシスに特異的な血清バイオマーカー、
（ｉｉ）壊死に特異的な血清バイオマーカー、および
（ｉｉｉ）炎症に特異的な血清バイオマーカー
について調べるステップと、
前記血清バイオマーカーのうちの１つ以上の存在を、器官または組織に特異的な損傷の指標と相関させるステップと
を含む方法。
【請求項２】
アポトーシスに特異的なバイオマーカーが、カスパーゼ切断型Ｋ１８である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
壊死に特異的なバイオマーカーが、全長Ｋ１８および／またはＨＭＧＢ−１の低アセチル化形態である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
炎症に特異的なバイオマーカーが、ＨＭＧＢ−１のアセチル化形態である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
血清試料を、
（ｉ）カスパーゼ切断型Ｋ１８、
（ｉｉ）全長Ｋ１８とＨＭＧＢ−１の低アセチル化形態、および
（ｉｉｉ）ＨＭＧＢ−１のアセチル化形態
の存在について調べる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
血清試料を、ＨＭＧＢ−１の酸化形態の存在について調べるステップをさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
血清バイオマーカーのレベルを、器官または組織の薬物誘導性損傷の重症度を示す所定のレベルと相関させるステップをさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記所定のレベルが、薬物の投与を開始する前に対象から得られるベースラインのレベルである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
アポトーシス、壊死、および炎症の前記バイオマーカーが、質量分析により検出される、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
血清Ｋ１８を、カスパーゼ切断モチーフにわたる断片を形成させるためにプロテアーゼ酵素により部分的に消化した後、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる検出を行い、それにより、切断されていないカスパーゼ切断モチーフを伴う断片が全長血清Ｋ１８に対応し、切断されたカスパーゼ切断モチーフを伴う断片がカスパーゼ切断型血清Ｋ１８に対応する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
血清Ｋ１８を、ＤＡＬＤ／Ｓモチーフにわたる全長血清Ｋ１８断片を形成させるためにトリプシンにより部分的に消化して、それにより、切断されていないＤＡＬＤ／Ｓモチーフを伴う断片が全長血清Ｋ１８に対応し、切断されたＤＡＬＤ／Ｓモチーフを伴う断片がカスパーゼ切断型血清Ｋ１８に対応する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
血清ＨＭＧＢ−１を、少なくとも１つのリシン残基を含むＨＭＧＢ−１断片を形成させるためにプロテアーゼ酵素により部分的に消化した後、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる検出を行い、それにより、リシン残基がアセチル化されていない断片が低アセチル化ＨＭＧＢ−１に対応し、リシン残基がアセチル化されている断片が過剰アセチル化ＨＭＧＢ−１に対応する、請求項９、１０、または１１に記載の方法。
【請求項１３】
血清ＨＭＧＢ−１を、５つのリシン残基を含む断片を形成させるためにＧＬｕＣにより部分的に消化して、それにより、リシン残基がアセチル化されていない断片が低アセチル化ＨＭＧＢ−１に対応し、リシン残基がアセチル化されている断片が過剰アセチル化ＨＭＧＢ−１に対応する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記バイオマーカーが、ＥＬＩＳＡなど、免疫ベースのアッセイにより検出される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
器官が、肝臓、肺、腎臓、または心血管系であり、器官に特異的な損傷の指標が、肝臓、肺、腎臓、または心血管の傷害バイオマーカーである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
肝臓の前記傷害バイオマーカーが、ＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）、ＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）、ＡＰ（アルカリホスファターゼ）、ＧＬＤＨ（グルタミン酸デヒドロゲナーゼ）、およびＧＧＴ（ガンマ−グルタミルトランスペプチダーゼ）から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記組織が皮膚であり、組織に特異的な損傷の指標が臨床的な皮膚状態の存在である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
器官または組織の薬物誘導性損傷を検出および／または評価するアッセイであって、
本明細書において定義されるアポトーシスに特異的な血清バイオマーカーを検出する手段と、
本明細書において定義される壊死に特異的な血清バイオマーカーを検出する手段と、
本明細書において定義される炎症に特異的な血清バイオマーカーを検出する手段と
を含むアッセイ。
【請求項１９】
器官または組織の薬物誘導性傷害を検出および／または評価するキットであって、
カスパーゼ切断型Ｋ１８を検出する試薬と、
全長Ｋ１８および／またはＨＭＧＢ−１の低アセチル化形態を検出する試薬と、
ＨＭＧＢ−１の過剰アセチル化形態を検出する試薬と
を含むキット。
【請求項２０】
ＨＭＧＢ−１の酸化形態の存在を検出する試薬をさらに含む、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
宿主において生じるアポトーシス、壊死、および／または炎症の存在を検出および評価するためのキットであって、
前出のように本明細書において定義される、血清Ｋ１８を部分消化するための酵素と、
前出のように本明細書において定義される、血清ＨＭＧＢ−１を部分消化するための酵素と、
どのようにして、本明細書で定義される方法のうちの１つに従い試料を調べ、アポトーシス、壊死、および／または炎症が生じつつあるかどうかを決定するかについて詳述する指示書と
を含むキット。
【請求項１】
ヒト対象または動物対象への薬物の投与に伴う器官または組織の損傷を検出および／または評価する方法であって、前記対象から得られる血清試料を、
（ｉ）アポトーシスに特異的な血清バイオマーカー、
（ｉｉ）壊死に特異的な血清バイオマーカー、および
（ｉｉｉ）炎症に特異的な血清バイオマーカー
について調べるステップと、
前記血清バイオマーカーのうちの１つ以上の存在を、器官または組織に特異的な損傷の指標と相関させるステップと
を含む方法。
【請求項２】
アポトーシスに特異的なバイオマーカーが、カスパーゼ切断型Ｋ１８である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
壊死に特異的なバイオマーカーが、全長Ｋ１８および／またはＨＭＧＢ−１の低アセチル化形態である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
炎症に特異的なバイオマーカーが、ＨＭＧＢ−１のアセチル化形態である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
血清試料を、
（ｉ）カスパーゼ切断型Ｋ１８、
（ｉｉ）全長Ｋ１８とＨＭＧＢ−１の低アセチル化形態、および
（ｉｉｉ）ＨＭＧＢ−１のアセチル化形態
の存在について調べる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
血清試料を、ＨＭＧＢ−１の酸化形態の存在について調べるステップをさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
血清バイオマーカーのレベルを、器官または組織の薬物誘導性損傷の重症度を示す所定のレベルと相関させるステップをさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記所定のレベルが、薬物の投与を開始する前に対象から得られるベースラインのレベルである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
アポトーシス、壊死、および炎症の前記バイオマーカーが、質量分析により検出される、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
血清Ｋ１８を、カスパーゼ切断モチーフにわたる断片を形成させるためにプロテアーゼ酵素により部分的に消化した後、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる検出を行い、それにより、切断されていないカスパーゼ切断モチーフを伴う断片が全長血清Ｋ１８に対応し、切断されたカスパーゼ切断モチーフを伴う断片がカスパーゼ切断型血清Ｋ１８に対応する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
血清Ｋ１８を、ＤＡＬＤ／Ｓモチーフにわたる全長血清Ｋ１８断片を形成させるためにトリプシンにより部分的に消化して、それにより、切断されていないＤＡＬＤ／Ｓモチーフを伴う断片が全長血清Ｋ１８に対応し、切断されたＤＡＬＤ／Ｓモチーフを伴う断片がカスパーゼ切断型血清Ｋ１８に対応する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
血清ＨＭＧＢ−１を、少なくとも１つのリシン残基を含むＨＭＧＢ−１断片を形成させるためにプロテアーゼ酵素により部分的に消化した後、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる検出を行い、それにより、リシン残基がアセチル化されていない断片が低アセチル化ＨＭＧＢ−１に対応し、リシン残基がアセチル化されている断片が過剰アセチル化ＨＭＧＢ−１に対応する、請求項９、１０、または１１に記載の方法。
【請求項１３】
血清ＨＭＧＢ−１を、５つのリシン残基を含む断片を形成させるためにＧＬｕＣにより部分的に消化して、それにより、リシン残基がアセチル化されていない断片が低アセチル化ＨＭＧＢ−１に対応し、リシン残基がアセチル化されている断片が過剰アセチル化ＨＭＧＢ−１に対応する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記バイオマーカーが、ＥＬＩＳＡなど、免疫ベースのアッセイにより検出される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
器官が、肝臓、肺、腎臓、または心血管系であり、器官に特異的な損傷の指標が、肝臓、肺、腎臓、または心血管の傷害バイオマーカーである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
肝臓の前記傷害バイオマーカーが、ＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）、ＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）、ＡＰ（アルカリホスファターゼ）、ＧＬＤＨ（グルタミン酸デヒドロゲナーゼ）、およびＧＧＴ（ガンマ−グルタミルトランスペプチダーゼ）から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記組織が皮膚であり、組織に特異的な損傷の指標が臨床的な皮膚状態の存在である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
器官または組織の薬物誘導性損傷を検出および／または評価するアッセイであって、
本明細書において定義されるアポトーシスに特異的な血清バイオマーカーを検出する手段と、
本明細書において定義される壊死に特異的な血清バイオマーカーを検出する手段と、
本明細書において定義される炎症に特異的な血清バイオマーカーを検出する手段と
を含むアッセイ。
【請求項１９】
器官または組織の薬物誘導性傷害を検出および／または評価するキットであって、
カスパーゼ切断型Ｋ１８を検出する試薬と、
全長Ｋ１８および／またはＨＭＧＢ−１の低アセチル化形態を検出する試薬と、
ＨＭＧＢ−１の過剰アセチル化形態を検出する試薬と
を含むキット。
【請求項２０】
ＨＭＧＢ−１の酸化形態の存在を検出する試薬をさらに含む、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
宿主において生じるアポトーシス、壊死、および／または炎症の存在を検出および評価するためのキットであって、
前出のように本明細書において定義される、血清Ｋ１８を部分消化するための酵素と、
前出のように本明細書において定義される、血清ＨＭＧＢ−１を部分消化するための酵素と、
どのようにして、本明細書で定義される方法のうちの１つに従い試料を調べ、アポトーシス、壊死、および／または炎症が生じつつあるかどうかを決定するかについて詳述する指示書と
を含むキット。
【図１】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２０１２−５３２３１０（Ｐ２０１２−５３２３１０Ａ）
【公表日】平成２４年１２月１３日（２０１２．１２．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１６８７１（Ｐ２０１２−５１６８７１）
【出願日】平成２２年７月５日（２０１０．７．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２０１０／０５１１０７
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／００１１９１
【国際公開日】平成２３年１月６日（２０１１．１．６）
【出願人】（５１１３１４６６９）ザ・ユニヴァーシティ・オヴ・リヴァプール (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１２月１３日（２０１２．１２．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月５日（２０１０．７．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２０１０／０５１１０７
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／００１１９１
【国際公開日】平成２３年１月６日（２０１１．１．６）
【出願人】（５１１３１４６６９）ザ・ユニヴァーシティ・オヴ・リヴァプール (1)
【Ｆターム（参考）】
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