固定化された標的と直接結合する小分子を検出するためにバイオセンサーを使用する方法
固定化された標的と直接結合する小分子を検出するためにバイオセンサーを使用する方法。本発明は、小分子の、標的分子との相互作用を検出する方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
優先権
本願は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、２００７年４月１９日に出願された米国特許第６０／９１２，７２５号の利益を主張する。
【０００２】
新薬の開発につながるようなタンパク質標的の高品質リード化合物の同定は複雑な作業である。新規であり最適化が可能なリードを作製することは、困難であり得る。最近、断片ベースのスクリーニングが、高品質のリードを作製する方法として検討された。約１００Ｄａ〜約３００Ｄａの分子量を有する化合物（すなわち「断片」）は、歴史的にリード作製のために使用されてきた約３００Ｄａ〜約６００Ｄａの分子量を有する化合物よりも良好なリードを提供し得ると思われる。断片は弱結合性分子であることが多いが、治療標的タンパク質と結合する低分子量の弱結合性分子のスクリーニングは、わずかに大きな分子量の、より堅く結合する化合物を提供するために化学的に組み合わせることができる小さい構成要素を決定するのに有用である。次いで、これらの分子は、標的タンパク質に対して治療効果を有し得る。低分子量化合物は有効な薬物の開発をもたらし得るが、弱結合性の、極めて低分子量の化合物の同定は、極端に時間がかかり、困難である。タンパク質または標的分子と結合する任意の大きさの化合物を発見する従前の方法は、化合物が、断片化合物によって通常得られない特定のエネルギーを用いて結合することを必要とする方法を含んでいた。タンパク質と結合する断片化合物を同定するための従前の同定方法は、相当な量のタンパク質を含み、労働集約的であり、高度な教育を受けた個人によって操作される高価な機器を必要とし、数種の小さな化合物をスクリーニングするのに何日も、または何週間もかかる。通常の方法は、多次元核磁気共鳴法（ＮＭＲ）、Ｘ線結晶学または等温滴定熱量測定法などの従来の生物物理学的技術を用いる。当技術分野では、少量の試験化合物を使用するハイスループット法で、約１００Ｄａ〜約３００Ｄａの断片ベースの化合物ライブラリーをスクリーニングする方法が必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
一実施形態では、本発明は、標的分子に対する小分子の親和性を調べる方法を提供する。この方法は、標的分子を、比色共鳴反射（ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｔ ｒｅｆｌｅｃｔａｎｃｅ）バイオセンサーの表面に固定化するステップと、第１のピーク波長値を調べるステップとを含んでなる。小分子を、３以上の異なる濃度で比色共鳴反射バイオセンサーの表面に加え、３以上の異なる濃度でピーク波長値を調べる。ピーク波長を比較し、標的分子に対する小分子の親和性を求める。小分子は、約３００Ｄａ未満であり得る。小分子の解離定数（Ｋｄ）を求めることができる。小分子の解離定数は、約２，０００〜約７５０μＭであり得る。小分子の濃度は、約０．５ｍＭ〜約０．０１ｍＭであり得る。
【０００４】
別の実施形態では、本発明は、小分子サンプルの順位親和性を調べる方法を提供する。この方法は、比色共鳴反射バイオセンサーの表面の第１のピーク波長値を検出するステップを含んでなる。既知分子量を有する標的分子を、比色共鳴反射バイオセンサーの表面に固定化し、第２のピーク波長値を調べる。第１および第２のピーク波長値を用いて、比色共鳴反射バイオセンサーに結合されている標的分子のモル量を求める。比色共鳴反射バイオセンサーに、特定の濃度の、既知分子量を有する小分子サンプルを加え、第３のピーク波長値を調べる。第２のピーク波長値と第３のピーク波長値間の相違が、比色共鳴反射バイオセンサー表面に結合されている小分子の量を提供する。第１のピーク波長値と第２のピーク波長値間の相違対第２のピーク波長値と第３のピーク波長値間の相違の比を用いて、小分子サンプルの順位親和性を求める。小分子サンプルは、約３００Ｄａ未満である小分子を含んでなり得る。小分子サンプル中の小分子の解離定数は、約２，０００〜約７５０μＭであり得る。小分子サンプル中の小分子の濃度は、約０．５ｍＭ〜約０．０１ｍＭであり得る。
【０００５】
本発明のさらに別の実施形態は、小分子が標的分子上の特定の部位と結合するかどうか、または標的結合について、標的分子上の標的部位の既知ブロッカーと競合するかどうかを調べる方法を提供する。この方法は、標的分子を、第１の比色共鳴反射バイオセンサーに固定化するステップを含んでなる。標的分子を、第２の比色共鳴反射バイオセンサーに固定化し、ここで、標的分子の標的部位は、標的部位の既知ブロッカーでブロックされる。小分子を、第１および第２両方の比色共鳴反射バイオセンサーに加え、第１および第２の比色共鳴反射バイオセンサーのピーク波長値を調べる。第１の比色共鳴反射バイオセンサーのピーク波長値が、第２の比色共鳴反射バイオセンサーのピーク波長値と比較してシフトされる場合は、小分子は、標的分子上の標的部位の既知ブロッカーと競合する、または標的分子上の特定の部位と結合する。小分子は約３００Ｄａ未満であり得る。小分子の解離定数は、約２，０００〜約７５０μＭであり得る。小分子の濃度は、約０．５ｍＭ〜約０．０１ｍＭであり得る。
【０００６】
本発明のさらに別の実施形態は、３００Ｄａ未満の小分子が、標的分子と結合するかどうかを調べる方法を提供する。この方法は、標的分子を、比色共鳴反射バイオセンサーの表面に固定化するステップと、第１のピーク波長値を調べるステップとを含んでなる。小分子を、比色共鳴反射バイオセンサーの表面に加え、第２のピーク波長値を調べる。第１および第２のピーク波長を比較し、第２のピーク波長値が、第１のピーク波長値と比較してシフトしている場合は、小分子は標的分子と結合する。小分子の解離定数（Ｋｄ）を求めることができる。小分子の解離定数は、約２，０００〜約７５０μＭであり得る。小分子の濃度は、約０．５ｍＭ〜約０．０１ｍＭであり得る。
【０００７】
したがって、本発明は、標的生体分子と結合する、断片として当技術分野に精通している人に公知の、極めて低分子量の化合物の測定を提供する。本発明は、相互作用を定性および定量するための通常の生化学試験の厳密性を提供し、ならびに、断片分子のその他の特性の測定を提供する。この方法は、かなりより経済的であり、測定にかなり少ない時間しか必要でなく、ＮＭＲ分光法、Ｘ線結晶学または熱量測定法などの従来の方法を使用する同様の測定に使用されると通常思われるものよりも、かなり少量の試薬しか必要でない。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】標的表面と弱く会合する小分子を高感度に検出するためのバイオセンサーの再現性を示す図である。
【図２】凝集性化合物およびＤＭＳＯミスマッチ化合物が、両方に等濃度で加えた場合に、標的表面（ｙ軸）と比較して、対照またはブロッキングされた表面（ｘ軸）で大きく異なるシグナルを提供することを示す図である。
【図３】本発明の方法を使用して滴定し、その他の生物物理学的方法によって得られた既知結合性化合物の妥当な親和性結合曲線を得ることができることを示す図である。
【図４】本発明の方法が、種々の結合部位と弱く会合する断片の結合の測定を可能にすることを実証する図である。
【図５】特異性決定のための結合の経時変化アッセイを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の一実施形態により、結合相互作用が極めて弱いものであっても、放射測定標識、比色分析標識または蛍光標識を組み込む必要なく、バイオセンサー、例えば、比色共鳴反射バイオセンサーを用いて、小分子（断片としても知られる）の標的分子との結合を直接検出することが可能となる。結合は、ＢＩＮＤ Ｓｃａｎｎｅｒ（商標）（すなわち、比色共鳴反射バイオセンサーシステム）などの高速、高分解能機器およびデータを定量化するための対応するアルゴリズムを用いてリアルタイムで検出できる。例えば、米国特許第６，９５１，７１５号および米国特許公開第２００４／０１５１６２６号参照のこと。この方法論、機器の使用およびコンピュータ分析を組み合わせることによって、小分子の標的分子との結合を結合が極めて弱い場合であっても、標識を含まない方法でリアルタイムで都合よくモニターできる。
【００１０】
バイオセンサー
本発明のバイオセンサーは、比色共鳴反射バイオセンサーであり得る。例えば、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、「Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｔ ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ ａｓ ａ ｄｉｒｅｃｔ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｓｓａｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」、Ｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ａｃｔｕａｔｏｒｓ Ｂ、第８１巻、３１６〜３２８頁、２００２年１月５日；米国特許公開第２００４／００９１３９７号参照のこと。比色共鳴バイオセンサーは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサーではない。ＳＰＲバイオセンサーは、銀、金、銅、アルミニウム、ナトリウムおよびインジウムなどの薄い金属層を有する。金属は、適した波長で光と共鳴できる伝導帯電子を有するはずである。光に曝露されるＳＰＲバイオセンサー表面は、純粋な金属でなければならない。酸化物、硫化物およびその他のフィルムは、ＳＰＲを妨害する。比色共鳴バイオセンサーは、金属層を有さず、むしろＴｉＯ2などの高屈折率物質の誘電体コーティングを有する。
【００１１】
回折格子ベースの導波路バイオセンサーは、例えば、米国特許第５，７３８，８２５号に記載されている。回折格子ベースの導波路バイオセンサーは、導波路フィルムおよび入射光照射野を導波路フィルムにインカップルして（ｉｎｃｏｕｐｌｅ）回折光照射野を生じる回折格子を含んでなる。導波路フィルムの有効屈折率の変化を検出する。回折格子ベースの導波路バイオセンサーなどの、波動が装置内の相当な距離を輸送されなくてはならない装置は、本発明の空間分解能を欠く。
【００１２】
比色共鳴反射バイオセンサーによって、蛍光タグ、比色分析標識または任意のその他の種類の検出タグもしくは検出標識を使用することなく、バイオセンサーの表面上で生化学的相互作用が測定されることが可能となる。バイオセンサー表面は、コリメート光および／または白色光を照射された場合に、狭帯域の波長のみを反射する（「共鳴格子効果」）よう設計される光学構造を含む。狭い波長帯は、波長「ピーク」として記載される。「ピーク波長値」（ＰＷＶ）は、生物学的物質などの物質がバイオセンサー表面に沈着されるか、または除去される際に変化する。読み出し機器を用いて、コリメート光および／または白色光でバイオセンサー表面上の個別の位置を照射し、反射光を集める。集められた光を、ＰＷＶの測定のために波長分光計に収集する。
【００１３】
底のないマイクロタイタープレートカートリッジの底に構造を結合すること（バイオセンサー面を上にして）によって、マイクロタイタープレートなどの標準的な使い捨て実験室品目にバイオセンサーを組み込むことができる。普通の実験室形式のカートリッジにバイオセンサーを組み込むことが、既存のマイクロタイタープレート操作装置、例えば、ミキサー、インキュベーターおよび液体分配装置との互換性にとって望ましい。比色共鳴反射バイオセンサーはまた、例えば、マイクロ流体装置、マクロ流体装置またはマイクロアレイ装置に組み込むことができる（例えば、米国特許第７，０３３，８１９号、同７，０３３，８２１号参照のこと）。比色共鳴反射バイオセンサーは、当技術分野で周知の方法論（例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｕｎ−Ｌｉｎ Ｇｕａｎ編、第２９４巻、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ参照のこと）とともに使用し、分子の、バイオセンサーの表面との共有結合または非共有結合をモニターすることができる。
【００１４】
比色共鳴反射バイオセンサーは、サブ波長構造表面（ＳＷＳ）を含んでなり、薄フィルムコーティングの効果を模倣し得る従来のものではない種類の回折格子素子である（Ｐｅｎｇ＆Ｍｏｒｒｉｓ、「Ｒｅｓｏｎａｎｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ｆｒｏｍ ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｇｒａｔｉｎｇｓ」、Ｊ．Ｏｐｔ．Ｓｏｃ．Ａｍ．Ａ、第１３巻、第５号、９９３頁、１９９６年５月；Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ，＆Ｗａｎｇ、「Ｎｅｗ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｆｏｒ ｏｐｔｉｃａｌ ｆｉｌｔｅｒｓ」、Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．、第６１巻、第９号、１０２２頁、１９９２年８月；Ｐｅｎｇ＆Ｍｏｒｒｉｓ、「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｏｎａｎｔ ａｎｏｍａｌｉｅｓ ｉｎ ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｇｒａｔｉｎｇｓ」、Ｏｐｔｉｃｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ、第２１巻、第８号、５４９頁、１９９６年４月）。ＳＷＳ構造は、回折格子周期が、入射光の波長に対して比較して小さく、その結果、反射されるおよび透過されるゼロ次数以外の回折次数が伝播されることが可能とならない、一次元、二次元または三次元格子を含む。横方向の導波モードの伝播は、支持されない。むしろ、導波モード共鳴効果は、任意の光子がバイオセンサー構造に入る点から約３ミクロンの高度に局在化された領域中で生じる。
【００１５】
比色共鳴反射バイオセンサーの反射光または透過光は、バイオセンサーの上面に、特異的に結合する物質、標的分子または小分子またはそれらの組み合わせなどの分子を加えることによって調節できる。加えられた分子は、構造を通る入射光照射の光路長を増大させ、したがって、最大反射率または透過率が生じる波長を改変する。
【００１６】
一実施形態では、比色共鳴反射バイオセンサーは、白色光および／またはコリメート光で照射された場合に、単一波長または狭帯域の波長を反射する（「共鳴格子効果」）よう設計される。質量がバイオセンサーの表面に沈着されると、反射される波長は、バイオセンサー上に示される光の光路の変化によってシフトする。
【００１７】
例えば、検出システムは、例えば、光ファイバープローブによって垂直入射でバイオセンサーの小さな点を照射する光源と、例えば、同様に垂直入射で第２の光ファイバープローブによって反射光を集める分光計とからなる。励起／検出システムとバイオセンサー表面間に物理的接触が生じないので、特定のカップリングプリズムは必要ではなく、バイオセンサーを、例えば、マイクロタイタープレートをはじめとする任意のよく用いられるアッセイプラットフォームに容易に適応させることができる。単一の分光計読み取りを、数ミリ秒で実施することができ、したがって、バイオセンサー表面上で並行して起こる多数の分子相互作用を迅速に測定し、反応動力学をリアルタイムでモニターすることが可能である。
【００１８】
層厚（すなわち、カバー層、生物学的物質、または光回折格子）を、上面でさらなる分子に対する共鳴波長感度を達成するよう選択する。回折格子周期は、所望の波長で共鳴を達成するよう選択する。
【００１９】
比色共鳴反射バイオセンサーは、例えば、高屈折率物質からなる光回折格子と、回折格子を支持する基板層と、場合により、基板層の反対側の回折格子の表面上に１種以上の特異的に結合する物質または固定されたリンカーとを含んでなる。高屈折率物質は、基板層よりも高い屈折率を有する。例えば、米国特許第７，０９４，５９５号；同７，０７０，９８７号を参照のこと。基板層は、ポリマー、プラスチック、ガラスまたはナノポーラス物質であり得る。米国特許公開第２００７／０００９３８０号参照のこと。所望により、カバー層は、回折格子表面をカバーする。光回折格子は、例えば、硫化亜鉛、二酸化チタン、酸化タンタル、窒化ケイ素および二酸化ケイ素からなるものであり得る高屈折率誘電体フィルムでコーティングされる。光学的特長を有する回折格子の断面プロフィールは、任意の周期的に反復する機能、例えば、「方形波」を含んでなり得る。光回折格子はまた、線（一次元）、四角形、円、楕円、三角形、台形、正弦波、卵形、矩形および六角形からなる群から選択される形の反復パターンを含んでなり得る。本発明の比色共鳴反射バイオセンサーはまた、例えば、高屈折率物質でコーティングされる、プラスチックまたはエポキシからなる光回折格子を含んでなり得る。
【００２０】
線形格子（すなわち、一次元格子）は、照射光偏光が回折格子周期に対して垂直方向である共鳴特徴を有する。比色共鳴反射バイオセンサーはまた、例えば、二次元格子、例えば、六角形アレイのホールまたは四角形を含んでなる。その他の形も同様に使用してもよい。線形格子は、六角形アレイ格子と同一のピッチ（すなわち、高および低屈折率の領域間の距離）、周期、層厚および物質特性を有する。しかし、光は、光学構造に共鳴的に結合されるよう格子線に対して垂直に偏光するはずである。したがって、その偏光軸が線形格子に対して垂直に配向した偏光フィルターは、照射源とバイオセンサー表面の間に挿入されなければならない。照射光源の小さな部分のみが正しく偏光されるので、六角形格子と比較して同等の量の共鳴反射光を集めるには長い組み込み時間が必要である。
【００２１】
光回折格子はまた、例えば、単一の固定された高さの高屈折率領域が低屈折率カバー層内に埋め込まれる「段階的」プロフィールを含んでなり得る。高および低屈折率の交互領域は、バイオセンサーの上面に対して平行な光学導波路を提供する。
【００２２】
本発明の比色共鳴反射バイオセンサーは、基板層の反対の光回折格子の表面にカバー層をさらに含んでなり得る。カバー層が存在する場合には、１種以上の特異的に結合する物質が、回折格子の反対のカバー層の表面上に固定化される。カバー層は、回折格子を含んでなる物質よりも低い屈折率を有する物質を含んでなることが好ましい。カバー層は、例えば、ガラス（例えば、スピンオンガラス（ＳＯＧ））、エポキシまたはプラスチックからなり得る。
【００２３】
例えば、バイオセンサーの屈折率必要条件を満たす種々のポリマーをカバー層に使用してよい。ＳＯＧは、その好都合な屈折率、操作の容易さおよび豊富なガラス表面活性化技術を用いて特異的に結合する物質で活性化される容易性のために使用してもよい。バイオセンサー表面の平坦性が特定のシステム設定にとって問題でない場合には、ＳｉＮ／ガラスの回折格子構造を、検知面として直接使用してもよく、その活性化は、ガラス表面上と同一の手段を用いて行ってもよい。
【００２４】
共鳴反射はまた、光回折格子上の平坦化カバー層を伴わずに得ることもできる。例えば、バイオセンサーは、高屈折率物質の構造化された薄いフィルム層でコーティングされた物質のみを含む場合もある。平坦化カバー層を使用することなく、周囲の媒体（例えば、空気または水）が格子を満たす。したがって、特異的に結合する物質が、上面上だけでなく特異的に結合する物質に曝露された光回折格子のすべての表面上のバイオセンサーに固定化される。
【００２５】
通常、本発明の比色共鳴反射バイオセンサーが、すべての偏光角の光を含む白色光および／またはコリメート光で照射される。バイオセンサー格子中の反復特徴に対する偏光角の方向が、共鳴波長を決定する。例えば、反復する線と空間のセットからなる「線形格子」（すなわち、一次元格子）バイオセンサーは、別個の共鳴反射を生じ得る２種の光学偏光を有する。線に対して垂直に偏光される光は、「ｓ偏光される」と呼ばれ、線に対して平行に偏光される光は、「ｐ偏光される」と呼ばれる。入射光のｓおよびｐ成分は両方とも、フィルター処理されていない照射ビーム中に同時に存在し、各々別個の共鳴シグナルを生じる。バイオセンサーは、通常、一方のみの偏光（ｓ偏光）の特性を最適化するよう設計することができ、最適化されない偏光は、偏光フィルターによって容易に除去される。
【００２６】
すべての偏光角が同一の共鳴反射スペクトルを生じるよう偏光依存を除去するために、同心円状のリングのセットからなる交互バイオセンサー構造を使用できる。この構造では、各同心円状のリングの内径と外径の間の差が、回折格子周期の約１／２に等しい。連続するリングは各々、前のリングの内径よりも約１回折格子周期大きい内径を有する。同心円状のリングパターンは、単一のセンサー位置、例えば、アレイスポットまたはマイクロタイタープレートウェルを覆うように伸びる。別個のマイクロアレイスポットまたはマイクロタイタープレートウェルの各々は、その中を中心とする別個の同心円状のリングパターンを有する。このような構造のすべての偏光方向は、同一の断面プロフィールを有する。同心円状のリング構造は、偏光無依存を保つために正確に中心に照射されなければならない。同心円状のリング構造の回折格子周期は、共鳴反射光の波長未満である。回折格子周期は、約０．０１ミクロン〜約１ミクロンである。回折格子深度は、約０．０１〜約１ミクロンである。
【００２７】
別の実施形態では、ホールまたはポストのアレイは、上記の同心円状の円構造を密接に接近させ、格子の任意の特定の位置上を中心とする照射ビームを必要としないよう配置される。このようなアレイパターンは、等角度で３方向から表面に入射する３つのレーザービームの光学干渉によって自動的に生じる。このパターンでは、ホール（またはポスト）は、密接に詰まっている六角形のアレイの角を中心とする。ホールまたはポストはまた、各六角形の中心に生じる。ホールまたはポストのこのような六角形の格子は、同一の断面プロフィールが「起こる」３つの偏光方向を有する。したがって、六角形の格子構造は、任意の偏光角の光を用いて同等な共鳴反射スペクトルを提供する。したがって、不要な反射シグナル成分を除去するための偏光フィルターは必要ではない。ホールまたはポストの周期は、約０．０１ミクロン〜約１ミクロンであり得、深度または高さは約０．０１ミクロン〜約１ミクロンであり得る。
【００２８】
検出システムは、光を比色共鳴反射バイオセンサーに向ける比色共鳴反射バイオセンサー光源と、バイオセンサーから反射された光を検出する検出器とを含んでなり得る。一実施形態では、決定された閾値を超える陽性結果のみが検出を引き起こすようフィルターを適用することによって読み出し機器を簡素化することが可能である。
【００２９】
本発明の比色共鳴反射バイオセンサー各個別の位置で共鳴波長のシフトを測定することによって、どの個別の位置が、例えば、そこに沈着された生物学的物質を有するかを調べることが可能である。シフトの程度を用いて、例えば、試験サンプル中の結合パートナーの量および１種以上の特異的に結合する物質と試験サンプルの結合パートナー間の化学親和性を決定することができる。
【００３０】
比色共鳴反射バイオセンサーは、２回照射してもよい。最初の測定によって、例えば、バイオセンサー上に標的分子のない、バイオセンサーの１以上の個別の位置の反射スペクトルを求める。２回目の測定によって、例えば、バイオセンサーに１種以上の分子が適用された後の反射スペクトル求める。これら２回の測定間のピーク波長の相違が、バイオセンサー上の分子の存在または量の測定値である。この照射方法は、ピーク共鳴波長のわずかな変動を有する領域をもたらし得るバイオセンサーの表面中の小さな不完全性について制御できる。この方法はまた、バイオセンサー上の分子の変動する濃度または密度について制御できる。
【００３１】
バイオセンサーの表面
１種以上の特異的に結合する物質または標的分子を、例えば、物理吸着によって、または化学結合によってバイオセンサー上に固定化できる。標的分子は、核酸、ペプチド、タンパク質溶液、ペプチド溶液、コンビナトリアルケミカルライブラリーに由来する化合物を含有する溶液、抗原、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ）断片、Ｆ（ａｂ’）2断片、Ｆｖ断片、小さい有機分子、ウイルス、ポ
リマーまたは生物学的サンプルなどの特異的に結合する物質によってバイオセンサー表面と特異的に結合し得、ここでは、標的分子はバイオセンサーの表面に固定化される。標的分子は、バイオセンサーに非共有結合によって付着される場合もあるし、共有結合によって付着される場合もある。
【００３２】
標的分子は、バイオセンサー表面上の１以上の個別の位置のアレイに配置してもよく、前記表面は、マルチウェルプレートの１以上のウェル内にあり、マルチウェルプレートまたはマイクロアレイの１以上の表面を含んでなる。標的分子のアレイは、表面が、各々、異なる標的分子を含むか、異なる量の標的分子を含む、１以上の個別の位置を含むように、マイクロウェルプレート内のバイオセンサー表面上に１以上の標的分子を含んでなる。例えば、アレイは、１、１０、１００、１，０００、１０，０００または１００，０００の、またはそれを超える個別の位置を含んでなり得る。したがって、マルチウェルプレートまたはマイクロアレイの各ウェルは、その中にマルチウェルプレートのその他のウェルとは別個の１以上の個別の位置のアレイを有し得、これによって、複数の異なるサンプルが１つのマルチウェルプレート上で処理されることが可能となる。任意の１つのウェル内のアレイまたは複数のアレイは、同一のマイクロタイタープレートの任意のその他のマイクロタイターウェル中に見られるアレイまたは複数のアレイと、同一である場合もあり、異なる場合もある。
【００３３】
標的分子をバイオセンサー表面に固定化することはまた、例えば、以下の官能性リンカーとの結合によって影響を受け得る：ニッケル基、アミン基、アルデヒド基、酸性基、アルカン基、アルケン基、アルキン基、芳香族基、アルコール基、エーテル基、ケトン基、エステル基、アミド基、アミノ酸基、ニトロ基、ニトリル基、炭水化物基、チオール基、有機リン酸基、脂質基、リン脂質基またはステロイド基。さらに、標的分子は、物理吸着、化学結合、電気化学結合、静電結合、疎水性結合または親水性結合および免疫捕捉法によってバイオセンサーの表面上に固定化され得る。
【００３４】
本発明の一実施形態では、バイオセンサーは、例えば、ニッケル基、アミン基、アルデヒド基、酸性基、アルカン基、アルケン基、アルキン基、芳香族基、アルコール基、エーテル基、ケトン基、エステル基、アミド基、アミノ酸基、ニトロ基、ニトリル基、炭水化物基、チオール基、有機リン酸基、脂質基、リン脂質基またはステロイド基などのリンカーでコーティングすることができる。例えば、アミン表面を用いて、いくつかの種類のリンカー分子を付着することができ、他方、アルデヒド表面を用いて、さらなるリンカーを含まずにタンパク質を直接結合することができる。ニッケル表面を用いて、組み込まれたヒスチジン（「ｈｉｓ」）タグを有する分子を結合することができる。ニッケルで活性化された表面を用いる「ｈｉｓタグをつけた」分子の検出は、当技術分野で周知である（Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６８、４９０、（１９９６年））。
【００３５】
リンカーおよび特異的に結合する物質は、各ウェルが、それに固定化された同一のリンカーおよび／または特異的に結合する物質を有するようにバイオセンサーの表面上に固定化できる。あるいは、各ウェルは、リンカーおよび／または特異的に結合する物質の種々の組み合わせを含み得る。
【００３６】
標的分子は、バイオセンサーの表面上に固定化されているリンカーまたは特異的に結合する物質と特異的に、または非特異的に結合し得る。あるいは、バイオセンサーの表面は、リンカーまたは特異的に結合する物質を有さない場合もあり、標的分子がバイオセンサー表面と非特異的に結合する場合もある。
【００３７】
バイオセンサー上への１種以上の特異的に結合する物質またはリンカーの固定化は、特異的に結合する物質またはリンカーがすすぎ手順によって洗浄除去されないように、また、試験サンプル中の標的分子とのその結合がバイオセンサー表面によって妨げられないように実施する。特異的に結合する物質の、例えば、種々の種類のマイクロアレイおよびバイオセンサーにおいて使用するためのガラス、プラスチックまたはナノポーラス物質との共有結合のために、いくつかの異なる種類の表面化学戦略が実施されてきた。１種以上の特異的に結合する物質を結合するための正しい官能基を含むようなバイオセンサーの表面調製は、バイオセンサー製造法の不可欠な部分である。
【００３８】
１種以上の特異的標的分子は、物理吸着によって（すなわち、化学リンカーを使用することなく）または化学結合によって（すなわち、化学リンカーを使用して）ならびに電気化学結合、静電結合、疎水性結合および親水性結合によってバイオセンサー表面に付着され得る。化学結合は、特異的に結合する物質のバイオセンサー表面上へのより強い付着を生じ、表面に結合された分子の規定の配向およびコンホメーションを規定し得る。
【００３９】
プラスチック、エポキシまたは高屈折率物質への特異的に結合する物質の固定化は、本質的には、ガラスへの固定化について記載されたように実施できる。しかし、酸性洗浄ステップは、特異的に結合する物質が固定化される材料にかかる処理が損傷を与えるような場合には、省略することができる。
【００４０】
バイオセンサーを使用する方法
本発明の一実施形態は、標的分子と結合する１種以上の「小分子」（すなわち、約３００Ｄａ未満である分子）を同定する方法を提供する。標的分子は、例えば、核酸分子、ポリペプチド、タンパク質、抗原、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ）断片、Ｆ（ａｂ’）2断片、Ｆｖ断片、小さい有機分子、小さ
い無機分子、細胞、ウイルス、細菌または生物学的サンプルであり得る。
【００４１】
小分子は、例えば、核酸分子、ポリペプチド、抗原、抗体断片、小さい有機分子または小さい無機分子であり得る。小分子は、約１、５、１０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５または３００Ｄａ未満であり得る。小分子は、約０．１〜約５００Ｄａ、約１〜約３００Ｄａ、約１〜約２００Ｄａ、約１〜約１００Ｄａ、約１〜約５０Ｄａ、約１〜約２５Ｄａまたは約０．１〜約５００Ｄａ間の任意の範囲であり得る。適当な検出感度を有する、プレートベースの標識を含まない方法論によって、標的分子上のどこかと結合する極めて小さい（約３００Ｄａ未満）化合物のライブラリー全体の迅速なスクリーニングが可能となる。小分子ライブラリーは、約５、１０、２５、５０、１００、５００、１，０００、５，０００、１０，０００種またはそれを超える異なる小分子を含んでなり得る。あるいは、小分子ライブラリーは、１種のみの小分子を含んでなり得る。
【００４２】
標的分子は、バイオセンサーの表面上の第１の位置に適用できる。第１の位置の比色共鳴反射光学第１ピーク波長値（ＰＷＶ）または屈折率を求める。小分子サンプル（例えば、小分子ライブラリー）を、第１の位置に適用する。標的分子および小分子サンプルは、必要に応じて一定期間インキュベートしてもよい。第１の位置の第２のＰＷＶまたは屈折率を求める。第１の値を算出し、ここで第１の値は、第１のＰＷＶと第２のＰＷＶ（または第１の屈折率と第２の屈折率）間の相違である。第２のＰＷＶ（または屈折率）が、第１のＰＷＶに比較してシフトしている場合には、小分子サンプルは標的分子と結合している。場合により、第１の値を対照試験と比較してもよい。対照試験は、標的分子をバイオセンサーの表面上の第２の位置に適用することを含んでなり得る。これらの標的分子は、標的分子の第１のセットを第１の位置に適用するのと同時に、またはその後に第２の位置に適用してよい。これらの標的分子は、第１の位置に適用される標的分子のセットと同じ種類の標的分子であってもよいし、異なる標的分子であってもよい。第２の位置の第３のＰＷＶ（または屈折率）を検出する。既知標的分子結合剤を第２の位置に適用する。標的分子は、必要に応じて一定期間インキュベートしてもよい。第２の位置の第４のＰＷＶ（または屈折率）を検出する。第２の値を求め、ここで、第２の値は、第２の位置の第３のＰＷＶ（または屈折率）と第４のＰＷＶ（屈折率）間の相違である。第１および第２の値が同一または同様である場合は、小分子サンプルは標的分子と結合する。第１および第２の値は、それらが互いに約１ｎｍ内にある場合に同一または同様である。標的分子を調べる標識を含まないバイオセンサー法は、標的分子にとって破壊的ではないので、標的分子を２回以上処理して経時的に相違を探してもよい。
【００４３】
バイオセンサーの表面上の第１の位置および第２の位置は、マイクロタイターウェル、マイクロタイタープレート、試験管、ペトリ皿、マイクロ流体装置チャネルおよびマイクロアレイからなる群から選択される容器の内側面であり得る。本発明のアッセイでは、小分子サンプルおよび試験分子は、検出標識を含んでなる必要はないが、必要に応じて標識を含んでなる場合もある。
【００４４】
１種以上の標的分子を、１つの位置、例えば、バイオセンサーの表面上のマイクロタイターウェルに適用してもよい。レセプタクルとは、一容器を指し、容器の収集物、例えば、マルチウェルプレートではない。位置の比色共鳴反射光学ピーク波長値（ＰＷＶ）（または屈折率）を検出する。１種以上の標的分子を一定期間（例えば、１秒、３０秒、１、２、５、１０、２０、３０、４５分、１、２、５、１０時間またはそれを超える時間）インキュベートしてもよい。インキュベーションに先立って、またはインキュベーション後に、またはインキュベーションの前とインキュベーションの後に、１種以上の標的分子に１種以上の小分子を適用してもよい。位置の比色共鳴反射光学ＰＷＶは、２回検出してよい。１種以上の小分子が標的分子と結合する場合には、光の反射波長は、結合がない状況と比較してシフトされる。第１のＰＷＶは、第２のＰＷＶと比較できる。ＰＷＶの変化は、結合を示し得る。いくつかの期間にわたってＰＷＶを調べ、比較することができる。結合はリアルタイムでモニターすることもできる（例えば、図５参照のこと）。
【００４５】
本発明の一実施形態では、標的分子と結合する小分子の量または濃度を調べることができる。例えば、図１参照のこと。
【００４６】
バイオセンサー位置での結合は、バイオセンサー表面のＰＷＶによって検出でき、またはより一般的には、顕微鏡、デジタルカメラ、従来のカメラまたはレンズに基づく光学もしくはエレクトロニクスに基づく電荷結合素子（ＣＣＤ）技術を利用する、拡大するか、拡大しないその他の可視化装置を用いてモニターできる。
【００４７】
ＰＷＶを調べるスキャナーのレンズの解像度は、約２〜約２００、約２〜約５０または約２〜約１５マイクロメートルピクセルサイズを有することが好ましい。本発明のアッセイは、約１、５、１０、１５、３０、４５または６０分未満で完了できる。すなわち、結合を時間的に効率よく調べることができる。
【００４８】
薬物の開発および設計では、標的分子上の標的部位と結合する第１の分子を、標的部位と結合する小分子と、または標的分子上の隣接する部位と連結することが有利であり得る。このようにして、標的部位と結合する第１の分子に特異性を加えることができる。例えば、多数の標的活性部位は、同様に課せられる標的分子にとってかなり似ている。しかし、標的分子は、独特である活性部位に隣接する部位を有する可能性が高い。隣接する分子の利点は、隣接される分子の一部分によって標的部位をブロックすることによって、およびより独特の隣接標的部位に対する隣接される分子の結合部分の特異性によって得られる。したがって、特異的標的部位の外側の標的分子と結合する小分子を同定することが有利であり得る。さらに、本発明は、複数の、連続的な相互作用を調べることができる静止系を提供するので、これを用いて、複数の小分子付着（同一標的分子内の異なる部位を含めた異なる部位での）事象を調べることができる。
【００４９】
標的分子は、例えば、標的部位で標的分子と結合する（共有結合によってまたは非共有結合によってのいずれか）分子（「ブロッカー分子」）で「ブロッッキング」され得る。標的部位は、例えば、ブロッキングされると、標的分子を不活化するか、または活性化する部位であり得る。次いで、ブロッキングされた、およびブロッキングされていない標的分子センサー表面を、小分子ライブラリーを用いて探索し、ライブラリーから、標的分子のブロッキングされていない部位で標的分子と結合する小分子を見出すことができる。本発明の方法はまた、同一の結合部位で、またはその付近で標的と相互作用している／結合している分子を競合アッセイによって決定することを可能にする。
【００５０】
本発明の方法はまた、滴定アッセイによる結合力および親和性測定値または平衡結合定数の決定を可能にする。結合力とは、複数の結合相互作用の組み合わせた力である。そのようなものとして、結合力は、結合の合計というよりも結合親和性の組み合わせた相乗的な力である。親和性とは、単一の結合の力を意味する。親和性測定値として、それだけには限らないが、平衡結合定数、解離定数、結合の速度および解離の速度が挙げられる。解離定数（Ｋｄ）は、小分子と標的分子間の親和性であり、したがって、小分子が特定の標的分子とどの程度堅く結合しているかを表す。親和性は、例えば、小分子および標的分子２者間の共有結合相互作用および非共有結合分子間相互作用、例えば、水素結合、静電相互作用、疎水性力およびファンデルワールス力によって影響され得る。本発明の方法は、その他の方法を用いては検出可能ではない、小分子と標的分子間の極めて弱い結合を検出し得る。例えば、小分子と標的分子間の結合は、約２，０００、１，５００、１，０００、７５０、５００、２５０、１００、５０、２５、１０、５、１μＭを超えるＫｄで、またはそれ以上で検出され得る。小分子と標的分子間の結合は、約２，０００〜約０．００１μＭ；約２，０００〜約０．０１μＭ；約２，０００〜約１，０００μＭ；約２，０００〜約１，５００μＭ；約２，０００〜約７５０μＭ約１，５００〜約０．０１μＭ；約１，０００〜約０．０１μＭ；約７５０〜約０．０１μＭ；約５００〜約０．０１μＭ；約２５０〜約０．０１μＭまたは約２，０００〜約０．００１μＭ間の任意の範囲のＫｄで検出され得る。
【００５１】
一実施形態では、本発明の方法を用いて、標的分子に対する小分子の親和性を調べることができる。標的分子は、比色共鳴反射バイオセンサーの表面に固定化できる。第１のピーク波長値を調べる。例えば、３、５、１０、１２、１５、２４または３６またはそれを超える（または２から１，０００の間の任意の範囲）種々の濃度で比色共鳴反射バイオセンサーの表面に小分子を加えることができる。実質的に、滴定曲線が作製される。種々の濃度の各々について、ピーク波長値を検出する。ピーク波長を比較して、標的分子に対する小分子の親和性を求める。一実施形態では、標的分子または小分子の分子量または両方がわかっている。
【００５２】
本発明の別の実施形態は、小分子の順位親和性値を調べる方法を提供する。比色共鳴反射バイオセンサーの表面の第１のピーク波長値を調べる。既知分子量を有する標的分子を、比色共鳴反射バイオセンサーの表面に固定化する。第２のピーク波長値を調べる。第１と第２のピーク波長値間の相違を用いて、比色共鳴反射バイオセンサーに結合している標的分子のモル量を求める。特定の濃度の、既知分子量を有する小分子を、比色共鳴反射バイオセンサーに加える。特定の分子量は必要ではない。例えば、およその分子量値を使用してもよい。例えば、３０，０００Ｄａ標的に対する３００〜６００分子量の範囲の小分子ライブラリーは、４５０Ｄａ結合を用いて近似させることができ、標的に対するレシオメトリックな３００〜６００の間の変動は無視できる。第３のピーク波長値を調べる。第２のピーク波長値と第３のピーク波長値間の相違は、比色共鳴反射バイオセンサー表面と結合している小分子の量を提供する。第２のピーク波長値と第３のピーク波長値間の相違対第１のピーク波長値と第２のピーク波長値間の相違の比を用いて小分子の順位親和性を求める。
【００５３】
本発明はまた、小分子が標的分子上の特定の部位と結合するかどうか、または標的結合について標的分子上の標的部位の既知ブロッカーと競合するかどうかを調べる方法を提供する。標的分子は、第１の比色共鳴反射バイオセンサーに固定化できる。また、標的分子を、第２の比色共鳴反射バイオセンサーに固定化し、これでは、標的分子の標的部位は、標的部位の既知ブロッカーでブロッキングされる。小分子を第１および第２の比色共鳴反射バイオセンサー両方に加え、第１および第２の比色共鳴反射バイオセンサーのピーク波長値を調べる。第１の比色共鳴反射バイオセンサーのピーク波長値が、第２の比色共鳴反射バイオセンサーのピーク波長値と比較してシフトしている場合には、小分子は、標的分子上の標的部位の既知ブロッカーと競合するか、標的分子上の特定の部位と結合する。
【００５４】
本発明はまた、固定化された標的分子対添加された小分子の化学量論的比を求めることができる。さらに、本発明を用いて化学量論を超える相互作用を測定し、小分子の相互作用の特異性または「粘性」を調べることができる。一般に、薬物設計では、化学量論を超える小分子または「粘性」の小分子、すなわち、標的分子上の２以上の結合部位と結合する小分子を避けることが望ましいが、これは、それらが特定の標的に対する特異性を欠き、最終的に望ましくない毒性につながる傾向があるからである。一実施例では、センサーに固定化される標的分子の量を経時的に定量化する。例えば、０．１分〜１時間（または間の任意の範囲）にＰＷＶをとる。２、５、１０、２０、３０、５０、１００、２００またはそれより多い（または間の任意の範囲）時点をとってもよい。本発明の一形態が、約２ｎｇ／ｍｍ2のＰＷＶシフトを提供するという事実を用いることによって、および固定化された標識の分子量の値を有することによって、センサー上に固定化される標的のモル数を算出することができる（２ｎｇ／ｍｍ2×ｍｍ2でのセンサー読み取り領域の大きさ×１モル／標的の分子量）。この値を用い、以下の方程式を使用して、標的と結合する小分子の対応する量を算出する：標的固定化ＰＷＶシフト×（リガンドの分子量／標的の分子量）。本発明を用い、上記のＰＷＶシフト値を得ることによって、この数は、化学量論を超える結合を示す。値が２〜５倍の倍数である場合は、この値は、標的との実際の結合である可能性が高い。値がこれを超える倍数である場合は、これは、凝集性化合物を示す可能性がある。例えば、図５参照のこと。
【００５５】
一般に、分子と標的分子間の解離定数を求める場合には、予想されるＫｄより約１０倍高い、標的分子と結合するべき分子の濃度を有することが望ましい。しかし、高感度の生物学的系を用いて使用するであろうものなどの、少ない量の非水性溶媒における分子の固有の溶解度のために、このような高濃度で小分子をスクリーニングすることは困難であり得る。本発明は、低濃度の小分子で（例えば、約２ｍＭ、約１ｍＭ、約０．５ｍＭ、約０．２５ｍＭまたは約２ｍＭ〜約０．５ｍＭ、約２ｍＭ〜約０．２５ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約０．０ＩｍＭまたは２ｍＭから０．０１ｍＭ間の任意の範囲）、小分子および標的分子の親和性を調べる方法を提供する。Ｋｄを下回る小分子の濃度で、ほとんどのアッセイの結合シグナルは、たとえ検出可能であったとしても大幅に小さくなる。結合シグナルは、Ｋｄと等しい濃度点での最大の１／２である点へ濃度が高まるにつれて上がる。本発明は、最大シグナルの予測を可能にするので（上記参照のこと）、結合シグナルを示し始める任意の低濃度の小分子は、予測されるプラトーへつながる傾斜した線を開始する。当業者ならば、小分子の標的に対する親和性を前記の傾斜および前記の最大シグナルから確認できることは認識されよう。
【００５６】
また、本発明の方法を用い、阻害型アッセイにおいて既知結合パートナーを置換することによって生物活性の低下を調べることができる。既知結合パートナーおよび１種以上の小分子の両方を、標的部位がブロックされているか、ブロッキングされていないバイオセンサー表面に加える。対照アッセイは、ブロッキングされたおよびブロッキングされていない表面に１種以上の小分子のみ、既知結合パートナーのみを加えることまたは分子を加えないことを含む。
【００５７】
本発明の方法はまた、ブロッキングされている（標的分子への既知結合剤で）およびブロッキングされていない標的分子の試験間に生じ得る変動を同定し、補正できる。例えば、標的分子でコーティングされたバイオセンサー表面に既知強力結合分子を加える場合には、表面に小分子のライブラリー（ＤＭＳＯバッファーまたは塩バッファー中）を加え、次いで、シグナルを検出すればよい。シグナルは結合を表し得る。あるいは、シグナルは、塩バッファーまたはＤＭＳＯバッファーによる偽シグナルを表す場合もある。例えば、小分子ライブラリー溶液中のＤＭＳＯは、２５％以上もの高いシグナルの変動を引き起こし得る。本発明の一実施形態は、標的部位がブロッキングされた、およびブロッキングされていないバイオセンサー表面でのＤＭＳＯの滴定による「ミスマッチ」補正を提供する。標的部位がブロッキングされた表面とは、バイオセンサー表面に標的分子が固定化されている表面であり、バイオセンサー表面に、分子の標的部位と結合することがわかっている分子（すなわち、「ブロッカー分子」）を加える。ブロッキングされていない表面とは、バイオセンサー表面に標的分子が固定化されていない表面である。ブロッキングされた、およびブロッキングされていない表面に、１以上の種類の小分子を加える。ブロッキングされたバイオセンサー表面で陰性ＰＷＶシフトが観察される場合には、ＤＭＳＯまたは塩バッファーが変動を引き起こしている。ブロッキングされた表面とブロッキングされていない表面の両方で陽性シフトが見られる場合には、小分子は、既知結合分子以外の部位で標的と結合している。ブロッキングされていない表面で陽性シフトが見られ、ブロッキングされた表面ではより少ない陽性シフトが見られる場合には、既知結合分子および小分子は、同一標的部位と結合している。例えば、図４参照のこと。ＤＭＳＯまたは塩バッファーによって引き起こされる変動を補正するために、参照または対照表面で測定されるＰＷＶにおける陰性シフトを、標的表面の結合シグナルに加えてもよい。
【００５８】
本発明の方法が検出できる相互作用の種類の例が表１に示されている。
【００５９】
【表１】
【００６０】
本明細書中のいずれかに言及される、すべての特許、特許出願およびその他の化学的または技術的文書は、参照によりその全文が組み込まれる。本明細書に例示的に記載される本発明は、本明細書に具体的に開示されていない、任意の要素または複数の要素、制限または複数の制限の不在下で適切に実施できる。したがって、例えば、本明細書における各場合において、用語「含んでなる」、「本質的にからなる」および「からなる」のいずれも、その通常の意味を保持しながら、他の２つの用語のいずれかで置き換えることができる。使用されている用語および表現は、説明の用語として用いられ、制限の用語ではなく、このような用語および表現の使用において、示され、記載される特徴またはその一部の任意の等価物を排除する意図はないが、特許請求される本発明の範囲内で種々の改変が可能であるということは認識される。したがって、本発明は実施形態によって具体的に開示されるが、本明細書に開示される概念の任意の特徴、改変および変化は、当業者によって用いることができるということ、およびこのような改変および変化は、この記述および添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲内であると考えられることは理解されなければならない。さらに、本発明の特徴または態様が、マーカッシュグループまたは代替のその他のグループ分けの用語で記載されている場合には、当業者ならば、それによって本発明もまた、マーカッシュグループまたはその他のグループの任意の個々のメンバーまたはメンバーの下位グループの用語で記載されるということは認識されよう。
【実施例】
【００６１】
標的分子、ＡＴＰアーゼドメインを有するプロテインＸ（２６ｋＤａ）を、比色共鳴反射バイオセンサーに固定化した。このバイオセンサーに、＜３００Ｄａのライブラリーメンバーの平均分子量を有する化合物ライブラリーを加えた。ライブラリー構成要素の、バイオセンサーとの直接結合を検出した。化合物ライブラリーの結合データはまた、ＮＭＲおよびＸ線結晶学を含めた生物物理学的方法からも得た。
【００６２】
２％ＤＭＳＯバッファー中の約５００種の分子をスクリーニングした。読み取り時間は１０分未満であった。リガンドスクリーニング濃度は、２５０μＭおよび１ｍＭであった。結果を以下に示した：１：１化学量論での２００Ｄａリガンドのダイナミックレンジ、全結合６０ｐｍ、Ｓ／Ｎ＝１２；陽性および陰性対照の適切な同定；検出／滴定される親和性の範囲１ｎＭ〜約１ｍＭ；および低スループット生物物理学的方法を用いた強力なヒット相関。
【００６３】
以下の化合物を同定した（図２および３参照のこと）：
・断片Ａ：（Ｍｒ＝２６５Ｄａ、Ｋｄ約０．０１μＭ）
・断片Ｂ：（Ｍｒ＝２６３Ｄａ、Ｋｄ約１μＭ）
・断片Ｃ：（Ｍｒ＝２４９Ｄａ、Ｋｄ約１μＭ）
・断片Ｄ：（Ｍｒ＝１６８Ｄａ、Ｋｄ約１００μＭ）
・断片Ｅ：（Ｍｒ＝２１５Ｄａ、Ｋｄ約１０μＭ）
・断片Ｆ：（Ｍｒ＝２６５Ｄａ、Ｋｄ約０．１μＭ）
・断片Ｇ：（Ｍｒ＝２８３Ｄａ、Ｋｄ約０．００１μＭ）
【００６４】
図１は、センサーの表面上に固定化されたプロテインＸと弱く会合する小分子を高感度検出するためのバイオセンサーの再現性を示す。小分子は、１ｍＭまたは０．２５ｍＭの濃度でセンサープレートの表面に加えた。結果は、高度に再現性のある、定量的な結果を実証する。アッセイは、標準９６および３８４ウェルプレートで実施した。
【００６５】
図２は、凝集性化合物およびＤＭＳＯミスマッチ化合物が、両方に等濃度で加えられた場合に、標的表面（ｙ軸）と比較して対照またはブロッキングされた表面（ｘ軸）で大きく異なるシグナルを提供することを示す。図は丸く囲まれた領域で、アッセイのロバスト性の統計的評価を得るために用いた陽性対照（既知結合）化合物を強調する。このアッセイによって、凝集性分子による偽陽性（斜線の四角形の外側のもの）が同定された。このアッセイによって、その他の生物物理学的アッセイ：核磁気共鳴法、Ｘ線結晶学および等温滴定熱量測定法によって決定された結合性化合物が強い相関で確認された。図２は、５つの９６ウェルセンサープレートのうちの１つに由来する代表的なデータを示す。
【００６６】
図３「標準」グラフは、本発明の方法を使用して滴定し、その他の生物物理学的方法によって得られた既知結合性化合物の妥当な親和性結合曲線を得ることができることを示す。「ＢＩＮＤ（登録商標）ヒット」グラフは、本発明の方法によって「発見された」化合物を、滴定曲線を実施し、これを親和性の順位付けのために平衡結合定数に合わせることによる本発明の方法によるさらなる生化学的特性決定によって結合性化合物と確認できることを示す。したがって、本発明の方法を用いて、各結合性化合物がどの程度堅く標的分子と結合するかを調べること、化学量論を調べること、および例えば、競合アッセイを用いて個々の結合部位を調べることができる。
【００６７】
図４は、本発明の方法が、種々の結合部位と弱く会合する断片の結合の測定を可能にすることを実証する。ゼロより大きく、標的表面および同様にブロッキングされた標的表面で試験された場合の概算と等しいシグナルを与える化合物は、標的に対して特異性を有さず、標的上の単一部位と実際に結合している可能性が低い。強調された、円で囲んだ領域中の化合物は、ブロッキングされた標的表面上で示しているよりも、標的上で大幅に大きなシグナルを示しており、したがって、特異的に、ＰＷＶシフトシグナルによって提供されるモル計算から決定される適切な比で結合していると決定される。
【００６８】
図５は、特異性決定のための結合の経時変化アッセイを示す。遅い結合ほど、特に、ＰＷＶシフトが１：１化学量論を上回る場合に、低い特異性を表し得る。化合物ウェルＦ１１およびウェルＦ４は、「粘性」または化学量論を上回る化合物を表す。正常な１：１結合は、混合時間内に生じる安定なプラトーシグナルを実証する（化合物ウェルＧ７）。
【背景技術】
【０００１】
優先権
本願は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、２００７年４月１９日に出願された米国特許第６０／９１２，７２５号の利益を主張する。
【０００２】
新薬の開発につながるようなタンパク質標的の高品質リード化合物の同定は複雑な作業である。新規であり最適化が可能なリードを作製することは、困難であり得る。最近、断片ベースのスクリーニングが、高品質のリードを作製する方法として検討された。約１００Ｄａ〜約３００Ｄａの分子量を有する化合物（すなわち「断片」）は、歴史的にリード作製のために使用されてきた約３００Ｄａ〜約６００Ｄａの分子量を有する化合物よりも良好なリードを提供し得ると思われる。断片は弱結合性分子であることが多いが、治療標的タンパク質と結合する低分子量の弱結合性分子のスクリーニングは、わずかに大きな分子量の、より堅く結合する化合物を提供するために化学的に組み合わせることができる小さい構成要素を決定するのに有用である。次いで、これらの分子は、標的タンパク質に対して治療効果を有し得る。低分子量化合物は有効な薬物の開発をもたらし得るが、弱結合性の、極めて低分子量の化合物の同定は、極端に時間がかかり、困難である。タンパク質または標的分子と結合する任意の大きさの化合物を発見する従前の方法は、化合物が、断片化合物によって通常得られない特定のエネルギーを用いて結合することを必要とする方法を含んでいた。タンパク質と結合する断片化合物を同定するための従前の同定方法は、相当な量のタンパク質を含み、労働集約的であり、高度な教育を受けた個人によって操作される高価な機器を必要とし、数種の小さな化合物をスクリーニングするのに何日も、または何週間もかかる。通常の方法は、多次元核磁気共鳴法（ＮＭＲ）、Ｘ線結晶学または等温滴定熱量測定法などの従来の生物物理学的技術を用いる。当技術分野では、少量の試験化合物を使用するハイスループット法で、約１００Ｄａ〜約３００Ｄａの断片ベースの化合物ライブラリーをスクリーニングする方法が必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
一実施形態では、本発明は、標的分子に対する小分子の親和性を調べる方法を提供する。この方法は、標的分子を、比色共鳴反射（ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｔ ｒｅｆｌｅｃｔａｎｃｅ）バイオセンサーの表面に固定化するステップと、第１のピーク波長値を調べるステップとを含んでなる。小分子を、３以上の異なる濃度で比色共鳴反射バイオセンサーの表面に加え、３以上の異なる濃度でピーク波長値を調べる。ピーク波長を比較し、標的分子に対する小分子の親和性を求める。小分子は、約３００Ｄａ未満であり得る。小分子の解離定数（Ｋｄ）を求めることができる。小分子の解離定数は、約２，０００〜約７５０μＭであり得る。小分子の濃度は、約０．５ｍＭ〜約０．０１ｍＭであり得る。
【０００４】
別の実施形態では、本発明は、小分子サンプルの順位親和性を調べる方法を提供する。この方法は、比色共鳴反射バイオセンサーの表面の第１のピーク波長値を検出するステップを含んでなる。既知分子量を有する標的分子を、比色共鳴反射バイオセンサーの表面に固定化し、第２のピーク波長値を調べる。第１および第２のピーク波長値を用いて、比色共鳴反射バイオセンサーに結合されている標的分子のモル量を求める。比色共鳴反射バイオセンサーに、特定の濃度の、既知分子量を有する小分子サンプルを加え、第３のピーク波長値を調べる。第２のピーク波長値と第３のピーク波長値間の相違が、比色共鳴反射バイオセンサー表面に結合されている小分子の量を提供する。第１のピーク波長値と第２のピーク波長値間の相違対第２のピーク波長値と第３のピーク波長値間の相違の比を用いて、小分子サンプルの順位親和性を求める。小分子サンプルは、約３００Ｄａ未満である小分子を含んでなり得る。小分子サンプル中の小分子の解離定数は、約２，０００〜約７５０μＭであり得る。小分子サンプル中の小分子の濃度は、約０．５ｍＭ〜約０．０１ｍＭであり得る。
【０００５】
本発明のさらに別の実施形態は、小分子が標的分子上の特定の部位と結合するかどうか、または標的結合について、標的分子上の標的部位の既知ブロッカーと競合するかどうかを調べる方法を提供する。この方法は、標的分子を、第１の比色共鳴反射バイオセンサーに固定化するステップを含んでなる。標的分子を、第２の比色共鳴反射バイオセンサーに固定化し、ここで、標的分子の標的部位は、標的部位の既知ブロッカーでブロックされる。小分子を、第１および第２両方の比色共鳴反射バイオセンサーに加え、第１および第２の比色共鳴反射バイオセンサーのピーク波長値を調べる。第１の比色共鳴反射バイオセンサーのピーク波長値が、第２の比色共鳴反射バイオセンサーのピーク波長値と比較してシフトされる場合は、小分子は、標的分子上の標的部位の既知ブロッカーと競合する、または標的分子上の特定の部位と結合する。小分子は約３００Ｄａ未満であり得る。小分子の解離定数は、約２，０００〜約７５０μＭであり得る。小分子の濃度は、約０．５ｍＭ〜約０．０１ｍＭであり得る。
【０００６】
本発明のさらに別の実施形態は、３００Ｄａ未満の小分子が、標的分子と結合するかどうかを調べる方法を提供する。この方法は、標的分子を、比色共鳴反射バイオセンサーの表面に固定化するステップと、第１のピーク波長値を調べるステップとを含んでなる。小分子を、比色共鳴反射バイオセンサーの表面に加え、第２のピーク波長値を調べる。第１および第２のピーク波長を比較し、第２のピーク波長値が、第１のピーク波長値と比較してシフトしている場合は、小分子は標的分子と結合する。小分子の解離定数（Ｋｄ）を求めることができる。小分子の解離定数は、約２，０００〜約７５０μＭであり得る。小分子の濃度は、約０．５ｍＭ〜約０．０１ｍＭであり得る。
【０００７】
したがって、本発明は、標的生体分子と結合する、断片として当技術分野に精通している人に公知の、極めて低分子量の化合物の測定を提供する。本発明は、相互作用を定性および定量するための通常の生化学試験の厳密性を提供し、ならびに、断片分子のその他の特性の測定を提供する。この方法は、かなりより経済的であり、測定にかなり少ない時間しか必要でなく、ＮＭＲ分光法、Ｘ線結晶学または熱量測定法などの従来の方法を使用する同様の測定に使用されると通常思われるものよりも、かなり少量の試薬しか必要でない。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】標的表面と弱く会合する小分子を高感度に検出するためのバイオセンサーの再現性を示す図である。
【図２】凝集性化合物およびＤＭＳＯミスマッチ化合物が、両方に等濃度で加えた場合に、標的表面（ｙ軸）と比較して、対照またはブロッキングされた表面（ｘ軸）で大きく異なるシグナルを提供することを示す図である。
【図３】本発明の方法を使用して滴定し、その他の生物物理学的方法によって得られた既知結合性化合物の妥当な親和性結合曲線を得ることができることを示す図である。
【図４】本発明の方法が、種々の結合部位と弱く会合する断片の結合の測定を可能にすることを実証する図である。
【図５】特異性決定のための結合の経時変化アッセイを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の一実施形態により、結合相互作用が極めて弱いものであっても、放射測定標識、比色分析標識または蛍光標識を組み込む必要なく、バイオセンサー、例えば、比色共鳴反射バイオセンサーを用いて、小分子（断片としても知られる）の標的分子との結合を直接検出することが可能となる。結合は、ＢＩＮＤ Ｓｃａｎｎｅｒ（商標）（すなわち、比色共鳴反射バイオセンサーシステム）などの高速、高分解能機器およびデータを定量化するための対応するアルゴリズムを用いてリアルタイムで検出できる。例えば、米国特許第６，９５１，７１５号および米国特許公開第２００４／０１５１６２６号参照のこと。この方法論、機器の使用およびコンピュータ分析を組み合わせることによって、小分子の標的分子との結合を結合が極めて弱い場合であっても、標識を含まない方法でリアルタイムで都合よくモニターできる。
【００１０】
バイオセンサー
本発明のバイオセンサーは、比色共鳴反射バイオセンサーであり得る。例えば、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、「Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｔ ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ ａｓ ａ ｄｉｒｅｃｔ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｓｓａｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」、Ｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ａｃｔｕａｔｏｒｓ Ｂ、第８１巻、３１６〜３２８頁、２００２年１月５日；米国特許公開第２００４／００９１３９７号参照のこと。比色共鳴バイオセンサーは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサーではない。ＳＰＲバイオセンサーは、銀、金、銅、アルミニウム、ナトリウムおよびインジウムなどの薄い金属層を有する。金属は、適した波長で光と共鳴できる伝導帯電子を有するはずである。光に曝露されるＳＰＲバイオセンサー表面は、純粋な金属でなければならない。酸化物、硫化物およびその他のフィルムは、ＳＰＲを妨害する。比色共鳴バイオセンサーは、金属層を有さず、むしろＴｉＯ2などの高屈折率物質の誘電体コーティングを有する。
【００１１】
回折格子ベースの導波路バイオセンサーは、例えば、米国特許第５，７３８，８２５号に記載されている。回折格子ベースの導波路バイオセンサーは、導波路フィルムおよび入射光照射野を導波路フィルムにインカップルして（ｉｎｃｏｕｐｌｅ）回折光照射野を生じる回折格子を含んでなる。導波路フィルムの有効屈折率の変化を検出する。回折格子ベースの導波路バイオセンサーなどの、波動が装置内の相当な距離を輸送されなくてはならない装置は、本発明の空間分解能を欠く。
【００１２】
比色共鳴反射バイオセンサーによって、蛍光タグ、比色分析標識または任意のその他の種類の検出タグもしくは検出標識を使用することなく、バイオセンサーの表面上で生化学的相互作用が測定されることが可能となる。バイオセンサー表面は、コリメート光および／または白色光を照射された場合に、狭帯域の波長のみを反射する（「共鳴格子効果」）よう設計される光学構造を含む。狭い波長帯は、波長「ピーク」として記載される。「ピーク波長値」（ＰＷＶ）は、生物学的物質などの物質がバイオセンサー表面に沈着されるか、または除去される際に変化する。読み出し機器を用いて、コリメート光および／または白色光でバイオセンサー表面上の個別の位置を照射し、反射光を集める。集められた光を、ＰＷＶの測定のために波長分光計に収集する。
【００１３】
底のないマイクロタイタープレートカートリッジの底に構造を結合すること（バイオセンサー面を上にして）によって、マイクロタイタープレートなどの標準的な使い捨て実験室品目にバイオセンサーを組み込むことができる。普通の実験室形式のカートリッジにバイオセンサーを組み込むことが、既存のマイクロタイタープレート操作装置、例えば、ミキサー、インキュベーターおよび液体分配装置との互換性にとって望ましい。比色共鳴反射バイオセンサーはまた、例えば、マイクロ流体装置、マクロ流体装置またはマイクロアレイ装置に組み込むことができる（例えば、米国特許第７，０３３，８１９号、同７，０３３，８２１号参照のこと）。比色共鳴反射バイオセンサーは、当技術分野で周知の方法論（例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｕｎ−Ｌｉｎ Ｇｕａｎ編、第２９４巻、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ参照のこと）とともに使用し、分子の、バイオセンサーの表面との共有結合または非共有結合をモニターすることができる。
【００１４】
比色共鳴反射バイオセンサーは、サブ波長構造表面（ＳＷＳ）を含んでなり、薄フィルムコーティングの効果を模倣し得る従来のものではない種類の回折格子素子である（Ｐｅｎｇ＆Ｍｏｒｒｉｓ、「Ｒｅｓｏｎａｎｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ｆｒｏｍ ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｇｒａｔｉｎｇｓ」、Ｊ．Ｏｐｔ．Ｓｏｃ．Ａｍ．Ａ、第１３巻、第５号、９９３頁、１９９６年５月；Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ，＆Ｗａｎｇ、「Ｎｅｗ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｆｏｒ ｏｐｔｉｃａｌ ｆｉｌｔｅｒｓ」、Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．、第６１巻、第９号、１０２２頁、１９９２年８月；Ｐｅｎｇ＆Ｍｏｒｒｉｓ、「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｏｎａｎｔ ａｎｏｍａｌｉｅｓ ｉｎ ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｇｒａｔｉｎｇｓ」、Ｏｐｔｉｃｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ、第２１巻、第８号、５４９頁、１９９６年４月）。ＳＷＳ構造は、回折格子周期が、入射光の波長に対して比較して小さく、その結果、反射されるおよび透過されるゼロ次数以外の回折次数が伝播されることが可能とならない、一次元、二次元または三次元格子を含む。横方向の導波モードの伝播は、支持されない。むしろ、導波モード共鳴効果は、任意の光子がバイオセンサー構造に入る点から約３ミクロンの高度に局在化された領域中で生じる。
【００１５】
比色共鳴反射バイオセンサーの反射光または透過光は、バイオセンサーの上面に、特異的に結合する物質、標的分子または小分子またはそれらの組み合わせなどの分子を加えることによって調節できる。加えられた分子は、構造を通る入射光照射の光路長を増大させ、したがって、最大反射率または透過率が生じる波長を改変する。
【００１６】
一実施形態では、比色共鳴反射バイオセンサーは、白色光および／またはコリメート光で照射された場合に、単一波長または狭帯域の波長を反射する（「共鳴格子効果」）よう設計される。質量がバイオセンサーの表面に沈着されると、反射される波長は、バイオセンサー上に示される光の光路の変化によってシフトする。
【００１７】
例えば、検出システムは、例えば、光ファイバープローブによって垂直入射でバイオセンサーの小さな点を照射する光源と、例えば、同様に垂直入射で第２の光ファイバープローブによって反射光を集める分光計とからなる。励起／検出システムとバイオセンサー表面間に物理的接触が生じないので、特定のカップリングプリズムは必要ではなく、バイオセンサーを、例えば、マイクロタイタープレートをはじめとする任意のよく用いられるアッセイプラットフォームに容易に適応させることができる。単一の分光計読み取りを、数ミリ秒で実施することができ、したがって、バイオセンサー表面上で並行して起こる多数の分子相互作用を迅速に測定し、反応動力学をリアルタイムでモニターすることが可能である。
【００１８】
層厚（すなわち、カバー層、生物学的物質、または光回折格子）を、上面でさらなる分子に対する共鳴波長感度を達成するよう選択する。回折格子周期は、所望の波長で共鳴を達成するよう選択する。
【００１９】
比色共鳴反射バイオセンサーは、例えば、高屈折率物質からなる光回折格子と、回折格子を支持する基板層と、場合により、基板層の反対側の回折格子の表面上に１種以上の特異的に結合する物質または固定されたリンカーとを含んでなる。高屈折率物質は、基板層よりも高い屈折率を有する。例えば、米国特許第７，０９４，５９５号；同７，０７０，９８７号を参照のこと。基板層は、ポリマー、プラスチック、ガラスまたはナノポーラス物質であり得る。米国特許公開第２００７／０００９３８０号参照のこと。所望により、カバー層は、回折格子表面をカバーする。光回折格子は、例えば、硫化亜鉛、二酸化チタン、酸化タンタル、窒化ケイ素および二酸化ケイ素からなるものであり得る高屈折率誘電体フィルムでコーティングされる。光学的特長を有する回折格子の断面プロフィールは、任意の周期的に反復する機能、例えば、「方形波」を含んでなり得る。光回折格子はまた、線（一次元）、四角形、円、楕円、三角形、台形、正弦波、卵形、矩形および六角形からなる群から選択される形の反復パターンを含んでなり得る。本発明の比色共鳴反射バイオセンサーはまた、例えば、高屈折率物質でコーティングされる、プラスチックまたはエポキシからなる光回折格子を含んでなり得る。
【００２０】
線形格子（すなわち、一次元格子）は、照射光偏光が回折格子周期に対して垂直方向である共鳴特徴を有する。比色共鳴反射バイオセンサーはまた、例えば、二次元格子、例えば、六角形アレイのホールまたは四角形を含んでなる。その他の形も同様に使用してもよい。線形格子は、六角形アレイ格子と同一のピッチ（すなわち、高および低屈折率の領域間の距離）、周期、層厚および物質特性を有する。しかし、光は、光学構造に共鳴的に結合されるよう格子線に対して垂直に偏光するはずである。したがって、その偏光軸が線形格子に対して垂直に配向した偏光フィルターは、照射源とバイオセンサー表面の間に挿入されなければならない。照射光源の小さな部分のみが正しく偏光されるので、六角形格子と比較して同等の量の共鳴反射光を集めるには長い組み込み時間が必要である。
【００２１】
光回折格子はまた、例えば、単一の固定された高さの高屈折率領域が低屈折率カバー層内に埋め込まれる「段階的」プロフィールを含んでなり得る。高および低屈折率の交互領域は、バイオセンサーの上面に対して平行な光学導波路を提供する。
【００２２】
本発明の比色共鳴反射バイオセンサーは、基板層の反対の光回折格子の表面にカバー層をさらに含んでなり得る。カバー層が存在する場合には、１種以上の特異的に結合する物質が、回折格子の反対のカバー層の表面上に固定化される。カバー層は、回折格子を含んでなる物質よりも低い屈折率を有する物質を含んでなることが好ましい。カバー層は、例えば、ガラス（例えば、スピンオンガラス（ＳＯＧ））、エポキシまたはプラスチックからなり得る。
【００２３】
例えば、バイオセンサーの屈折率必要条件を満たす種々のポリマーをカバー層に使用してよい。ＳＯＧは、その好都合な屈折率、操作の容易さおよび豊富なガラス表面活性化技術を用いて特異的に結合する物質で活性化される容易性のために使用してもよい。バイオセンサー表面の平坦性が特定のシステム設定にとって問題でない場合には、ＳｉＮ／ガラスの回折格子構造を、検知面として直接使用してもよく、その活性化は、ガラス表面上と同一の手段を用いて行ってもよい。
【００２４】
共鳴反射はまた、光回折格子上の平坦化カバー層を伴わずに得ることもできる。例えば、バイオセンサーは、高屈折率物質の構造化された薄いフィルム層でコーティングされた物質のみを含む場合もある。平坦化カバー層を使用することなく、周囲の媒体（例えば、空気または水）が格子を満たす。したがって、特異的に結合する物質が、上面上だけでなく特異的に結合する物質に曝露された光回折格子のすべての表面上のバイオセンサーに固定化される。
【００２５】
通常、本発明の比色共鳴反射バイオセンサーが、すべての偏光角の光を含む白色光および／またはコリメート光で照射される。バイオセンサー格子中の反復特徴に対する偏光角の方向が、共鳴波長を決定する。例えば、反復する線と空間のセットからなる「線形格子」（すなわち、一次元格子）バイオセンサーは、別個の共鳴反射を生じ得る２種の光学偏光を有する。線に対して垂直に偏光される光は、「ｓ偏光される」と呼ばれ、線に対して平行に偏光される光は、「ｐ偏光される」と呼ばれる。入射光のｓおよびｐ成分は両方とも、フィルター処理されていない照射ビーム中に同時に存在し、各々別個の共鳴シグナルを生じる。バイオセンサーは、通常、一方のみの偏光（ｓ偏光）の特性を最適化するよう設計することができ、最適化されない偏光は、偏光フィルターによって容易に除去される。
【００２６】
すべての偏光角が同一の共鳴反射スペクトルを生じるよう偏光依存を除去するために、同心円状のリングのセットからなる交互バイオセンサー構造を使用できる。この構造では、各同心円状のリングの内径と外径の間の差が、回折格子周期の約１／２に等しい。連続するリングは各々、前のリングの内径よりも約１回折格子周期大きい内径を有する。同心円状のリングパターンは、単一のセンサー位置、例えば、アレイスポットまたはマイクロタイタープレートウェルを覆うように伸びる。別個のマイクロアレイスポットまたはマイクロタイタープレートウェルの各々は、その中を中心とする別個の同心円状のリングパターンを有する。このような構造のすべての偏光方向は、同一の断面プロフィールを有する。同心円状のリング構造は、偏光無依存を保つために正確に中心に照射されなければならない。同心円状のリング構造の回折格子周期は、共鳴反射光の波長未満である。回折格子周期は、約０．０１ミクロン〜約１ミクロンである。回折格子深度は、約０．０１〜約１ミクロンである。
【００２７】
別の実施形態では、ホールまたはポストのアレイは、上記の同心円状の円構造を密接に接近させ、格子の任意の特定の位置上を中心とする照射ビームを必要としないよう配置される。このようなアレイパターンは、等角度で３方向から表面に入射する３つのレーザービームの光学干渉によって自動的に生じる。このパターンでは、ホール（またはポスト）は、密接に詰まっている六角形のアレイの角を中心とする。ホールまたはポストはまた、各六角形の中心に生じる。ホールまたはポストのこのような六角形の格子は、同一の断面プロフィールが「起こる」３つの偏光方向を有する。したがって、六角形の格子構造は、任意の偏光角の光を用いて同等な共鳴反射スペクトルを提供する。したがって、不要な反射シグナル成分を除去するための偏光フィルターは必要ではない。ホールまたはポストの周期は、約０．０１ミクロン〜約１ミクロンであり得、深度または高さは約０．０１ミクロン〜約１ミクロンであり得る。
【００２８】
検出システムは、光を比色共鳴反射バイオセンサーに向ける比色共鳴反射バイオセンサー光源と、バイオセンサーから反射された光を検出する検出器とを含んでなり得る。一実施形態では、決定された閾値を超える陽性結果のみが検出を引き起こすようフィルターを適用することによって読み出し機器を簡素化することが可能である。
【００２９】
本発明の比色共鳴反射バイオセンサー各個別の位置で共鳴波長のシフトを測定することによって、どの個別の位置が、例えば、そこに沈着された生物学的物質を有するかを調べることが可能である。シフトの程度を用いて、例えば、試験サンプル中の結合パートナーの量および１種以上の特異的に結合する物質と試験サンプルの結合パートナー間の化学親和性を決定することができる。
【００３０】
比色共鳴反射バイオセンサーは、２回照射してもよい。最初の測定によって、例えば、バイオセンサー上に標的分子のない、バイオセンサーの１以上の個別の位置の反射スペクトルを求める。２回目の測定によって、例えば、バイオセンサーに１種以上の分子が適用された後の反射スペクトル求める。これら２回の測定間のピーク波長の相違が、バイオセンサー上の分子の存在または量の測定値である。この照射方法は、ピーク共鳴波長のわずかな変動を有する領域をもたらし得るバイオセンサーの表面中の小さな不完全性について制御できる。この方法はまた、バイオセンサー上の分子の変動する濃度または密度について制御できる。
【００３１】
バイオセンサーの表面
１種以上の特異的に結合する物質または標的分子を、例えば、物理吸着によって、または化学結合によってバイオセンサー上に固定化できる。標的分子は、核酸、ペプチド、タンパク質溶液、ペプチド溶液、コンビナトリアルケミカルライブラリーに由来する化合物を含有する溶液、抗原、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ）断片、Ｆ（ａｂ’）2断片、Ｆｖ断片、小さい有機分子、ウイルス、ポ
リマーまたは生物学的サンプルなどの特異的に結合する物質によってバイオセンサー表面と特異的に結合し得、ここでは、標的分子はバイオセンサーの表面に固定化される。標的分子は、バイオセンサーに非共有結合によって付着される場合もあるし、共有結合によって付着される場合もある。
【００３２】
標的分子は、バイオセンサー表面上の１以上の個別の位置のアレイに配置してもよく、前記表面は、マルチウェルプレートの１以上のウェル内にあり、マルチウェルプレートまたはマイクロアレイの１以上の表面を含んでなる。標的分子のアレイは、表面が、各々、異なる標的分子を含むか、異なる量の標的分子を含む、１以上の個別の位置を含むように、マイクロウェルプレート内のバイオセンサー表面上に１以上の標的分子を含んでなる。例えば、アレイは、１、１０、１００、１，０００、１０，０００または１００，０００の、またはそれを超える個別の位置を含んでなり得る。したがって、マルチウェルプレートまたはマイクロアレイの各ウェルは、その中にマルチウェルプレートのその他のウェルとは別個の１以上の個別の位置のアレイを有し得、これによって、複数の異なるサンプルが１つのマルチウェルプレート上で処理されることが可能となる。任意の１つのウェル内のアレイまたは複数のアレイは、同一のマイクロタイタープレートの任意のその他のマイクロタイターウェル中に見られるアレイまたは複数のアレイと、同一である場合もあり、異なる場合もある。
【００３３】
標的分子をバイオセンサー表面に固定化することはまた、例えば、以下の官能性リンカーとの結合によって影響を受け得る：ニッケル基、アミン基、アルデヒド基、酸性基、アルカン基、アルケン基、アルキン基、芳香族基、アルコール基、エーテル基、ケトン基、エステル基、アミド基、アミノ酸基、ニトロ基、ニトリル基、炭水化物基、チオール基、有機リン酸基、脂質基、リン脂質基またはステロイド基。さらに、標的分子は、物理吸着、化学結合、電気化学結合、静電結合、疎水性結合または親水性結合および免疫捕捉法によってバイオセンサーの表面上に固定化され得る。
【００３４】
本発明の一実施形態では、バイオセンサーは、例えば、ニッケル基、アミン基、アルデヒド基、酸性基、アルカン基、アルケン基、アルキン基、芳香族基、アルコール基、エーテル基、ケトン基、エステル基、アミド基、アミノ酸基、ニトロ基、ニトリル基、炭水化物基、チオール基、有機リン酸基、脂質基、リン脂質基またはステロイド基などのリンカーでコーティングすることができる。例えば、アミン表面を用いて、いくつかの種類のリンカー分子を付着することができ、他方、アルデヒド表面を用いて、さらなるリンカーを含まずにタンパク質を直接結合することができる。ニッケル表面を用いて、組み込まれたヒスチジン（「ｈｉｓ」）タグを有する分子を結合することができる。ニッケルで活性化された表面を用いる「ｈｉｓタグをつけた」分子の検出は、当技術分野で周知である（Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６８、４９０、（１９９６年））。
【００３５】
リンカーおよび特異的に結合する物質は、各ウェルが、それに固定化された同一のリンカーおよび／または特異的に結合する物質を有するようにバイオセンサーの表面上に固定化できる。あるいは、各ウェルは、リンカーおよび／または特異的に結合する物質の種々の組み合わせを含み得る。
【００３６】
標的分子は、バイオセンサーの表面上に固定化されているリンカーまたは特異的に結合する物質と特異的に、または非特異的に結合し得る。あるいは、バイオセンサーの表面は、リンカーまたは特異的に結合する物質を有さない場合もあり、標的分子がバイオセンサー表面と非特異的に結合する場合もある。
【００３７】
バイオセンサー上への１種以上の特異的に結合する物質またはリンカーの固定化は、特異的に結合する物質またはリンカーがすすぎ手順によって洗浄除去されないように、また、試験サンプル中の標的分子とのその結合がバイオセンサー表面によって妨げられないように実施する。特異的に結合する物質の、例えば、種々の種類のマイクロアレイおよびバイオセンサーにおいて使用するためのガラス、プラスチックまたはナノポーラス物質との共有結合のために、いくつかの異なる種類の表面化学戦略が実施されてきた。１種以上の特異的に結合する物質を結合するための正しい官能基を含むようなバイオセンサーの表面調製は、バイオセンサー製造法の不可欠な部分である。
【００３８】
１種以上の特異的標的分子は、物理吸着によって（すなわち、化学リンカーを使用することなく）または化学結合によって（すなわち、化学リンカーを使用して）ならびに電気化学結合、静電結合、疎水性結合および親水性結合によってバイオセンサー表面に付着され得る。化学結合は、特異的に結合する物質のバイオセンサー表面上へのより強い付着を生じ、表面に結合された分子の規定の配向およびコンホメーションを規定し得る。
【００３９】
プラスチック、エポキシまたは高屈折率物質への特異的に結合する物質の固定化は、本質的には、ガラスへの固定化について記載されたように実施できる。しかし、酸性洗浄ステップは、特異的に結合する物質が固定化される材料にかかる処理が損傷を与えるような場合には、省略することができる。
【００４０】
バイオセンサーを使用する方法
本発明の一実施形態は、標的分子と結合する１種以上の「小分子」（すなわち、約３００Ｄａ未満である分子）を同定する方法を提供する。標的分子は、例えば、核酸分子、ポリペプチド、タンパク質、抗原、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ）断片、Ｆ（ａｂ’）2断片、Ｆｖ断片、小さい有機分子、小さ
い無機分子、細胞、ウイルス、細菌または生物学的サンプルであり得る。
【００４１】
小分子は、例えば、核酸分子、ポリペプチド、抗原、抗体断片、小さい有機分子または小さい無機分子であり得る。小分子は、約１、５、１０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５または３００Ｄａ未満であり得る。小分子は、約０．１〜約５００Ｄａ、約１〜約３００Ｄａ、約１〜約２００Ｄａ、約１〜約１００Ｄａ、約１〜約５０Ｄａ、約１〜約２５Ｄａまたは約０．１〜約５００Ｄａ間の任意の範囲であり得る。適当な検出感度を有する、プレートベースの標識を含まない方法論によって、標的分子上のどこかと結合する極めて小さい（約３００Ｄａ未満）化合物のライブラリー全体の迅速なスクリーニングが可能となる。小分子ライブラリーは、約５、１０、２５、５０、１００、５００、１，０００、５，０００、１０，０００種またはそれを超える異なる小分子を含んでなり得る。あるいは、小分子ライブラリーは、１種のみの小分子を含んでなり得る。
【００４２】
標的分子は、バイオセンサーの表面上の第１の位置に適用できる。第１の位置の比色共鳴反射光学第１ピーク波長値（ＰＷＶ）または屈折率を求める。小分子サンプル（例えば、小分子ライブラリー）を、第１の位置に適用する。標的分子および小分子サンプルは、必要に応じて一定期間インキュベートしてもよい。第１の位置の第２のＰＷＶまたは屈折率を求める。第１の値を算出し、ここで第１の値は、第１のＰＷＶと第２のＰＷＶ（または第１の屈折率と第２の屈折率）間の相違である。第２のＰＷＶ（または屈折率）が、第１のＰＷＶに比較してシフトしている場合には、小分子サンプルは標的分子と結合している。場合により、第１の値を対照試験と比較してもよい。対照試験は、標的分子をバイオセンサーの表面上の第２の位置に適用することを含んでなり得る。これらの標的分子は、標的分子の第１のセットを第１の位置に適用するのと同時に、またはその後に第２の位置に適用してよい。これらの標的分子は、第１の位置に適用される標的分子のセットと同じ種類の標的分子であってもよいし、異なる標的分子であってもよい。第２の位置の第３のＰＷＶ（または屈折率）を検出する。既知標的分子結合剤を第２の位置に適用する。標的分子は、必要に応じて一定期間インキュベートしてもよい。第２の位置の第４のＰＷＶ（または屈折率）を検出する。第２の値を求め、ここで、第２の値は、第２の位置の第３のＰＷＶ（または屈折率）と第４のＰＷＶ（屈折率）間の相違である。第１および第２の値が同一または同様である場合は、小分子サンプルは標的分子と結合する。第１および第２の値は、それらが互いに約１ｎｍ内にある場合に同一または同様である。標的分子を調べる標識を含まないバイオセンサー法は、標的分子にとって破壊的ではないので、標的分子を２回以上処理して経時的に相違を探してもよい。
【００４３】
バイオセンサーの表面上の第１の位置および第２の位置は、マイクロタイターウェル、マイクロタイタープレート、試験管、ペトリ皿、マイクロ流体装置チャネルおよびマイクロアレイからなる群から選択される容器の内側面であり得る。本発明のアッセイでは、小分子サンプルおよび試験分子は、検出標識を含んでなる必要はないが、必要に応じて標識を含んでなる場合もある。
【００４４】
１種以上の標的分子を、１つの位置、例えば、バイオセンサーの表面上のマイクロタイターウェルに適用してもよい。レセプタクルとは、一容器を指し、容器の収集物、例えば、マルチウェルプレートではない。位置の比色共鳴反射光学ピーク波長値（ＰＷＶ）（または屈折率）を検出する。１種以上の標的分子を一定期間（例えば、１秒、３０秒、１、２、５、１０、２０、３０、４５分、１、２、５、１０時間またはそれを超える時間）インキュベートしてもよい。インキュベーションに先立って、またはインキュベーション後に、またはインキュベーションの前とインキュベーションの後に、１種以上の標的分子に１種以上の小分子を適用してもよい。位置の比色共鳴反射光学ＰＷＶは、２回検出してよい。１種以上の小分子が標的分子と結合する場合には、光の反射波長は、結合がない状況と比較してシフトされる。第１のＰＷＶは、第２のＰＷＶと比較できる。ＰＷＶの変化は、結合を示し得る。いくつかの期間にわたってＰＷＶを調べ、比較することができる。結合はリアルタイムでモニターすることもできる（例えば、図５参照のこと）。
【００４５】
本発明の一実施形態では、標的分子と結合する小分子の量または濃度を調べることができる。例えば、図１参照のこと。
【００４６】
バイオセンサー位置での結合は、バイオセンサー表面のＰＷＶによって検出でき、またはより一般的には、顕微鏡、デジタルカメラ、従来のカメラまたはレンズに基づく光学もしくはエレクトロニクスに基づく電荷結合素子（ＣＣＤ）技術を利用する、拡大するか、拡大しないその他の可視化装置を用いてモニターできる。
【００４７】
ＰＷＶを調べるスキャナーのレンズの解像度は、約２〜約２００、約２〜約５０または約２〜約１５マイクロメートルピクセルサイズを有することが好ましい。本発明のアッセイは、約１、５、１０、１５、３０、４５または６０分未満で完了できる。すなわち、結合を時間的に効率よく調べることができる。
【００４８】
薬物の開発および設計では、標的分子上の標的部位と結合する第１の分子を、標的部位と結合する小分子と、または標的分子上の隣接する部位と連結することが有利であり得る。このようにして、標的部位と結合する第１の分子に特異性を加えることができる。例えば、多数の標的活性部位は、同様に課せられる標的分子にとってかなり似ている。しかし、標的分子は、独特である活性部位に隣接する部位を有する可能性が高い。隣接する分子の利点は、隣接される分子の一部分によって標的部位をブロックすることによって、およびより独特の隣接標的部位に対する隣接される分子の結合部分の特異性によって得られる。したがって、特異的標的部位の外側の標的分子と結合する小分子を同定することが有利であり得る。さらに、本発明は、複数の、連続的な相互作用を調べることができる静止系を提供するので、これを用いて、複数の小分子付着（同一標的分子内の異なる部位を含めた異なる部位での）事象を調べることができる。
【００４９】
標的分子は、例えば、標的部位で標的分子と結合する（共有結合によってまたは非共有結合によってのいずれか）分子（「ブロッカー分子」）で「ブロッッキング」され得る。標的部位は、例えば、ブロッキングされると、標的分子を不活化するか、または活性化する部位であり得る。次いで、ブロッキングされた、およびブロッキングされていない標的分子センサー表面を、小分子ライブラリーを用いて探索し、ライブラリーから、標的分子のブロッキングされていない部位で標的分子と結合する小分子を見出すことができる。本発明の方法はまた、同一の結合部位で、またはその付近で標的と相互作用している／結合している分子を競合アッセイによって決定することを可能にする。
【００５０】
本発明の方法はまた、滴定アッセイによる結合力および親和性測定値または平衡結合定数の決定を可能にする。結合力とは、複数の結合相互作用の組み合わせた力である。そのようなものとして、結合力は、結合の合計というよりも結合親和性の組み合わせた相乗的な力である。親和性とは、単一の結合の力を意味する。親和性測定値として、それだけには限らないが、平衡結合定数、解離定数、結合の速度および解離の速度が挙げられる。解離定数（Ｋｄ）は、小分子と標的分子間の親和性であり、したがって、小分子が特定の標的分子とどの程度堅く結合しているかを表す。親和性は、例えば、小分子および標的分子２者間の共有結合相互作用および非共有結合分子間相互作用、例えば、水素結合、静電相互作用、疎水性力およびファンデルワールス力によって影響され得る。本発明の方法は、その他の方法を用いては検出可能ではない、小分子と標的分子間の極めて弱い結合を検出し得る。例えば、小分子と標的分子間の結合は、約２，０００、１，５００、１，０００、７５０、５００、２５０、１００、５０、２５、１０、５、１μＭを超えるＫｄで、またはそれ以上で検出され得る。小分子と標的分子間の結合は、約２，０００〜約０．００１μＭ；約２，０００〜約０．０１μＭ；約２，０００〜約１，０００μＭ；約２，０００〜約１，５００μＭ；約２，０００〜約７５０μＭ約１，５００〜約０．０１μＭ；約１，０００〜約０．０１μＭ；約７５０〜約０．０１μＭ；約５００〜約０．０１μＭ；約２５０〜約０．０１μＭまたは約２，０００〜約０．００１μＭ間の任意の範囲のＫｄで検出され得る。
【００５１】
一実施形態では、本発明の方法を用いて、標的分子に対する小分子の親和性を調べることができる。標的分子は、比色共鳴反射バイオセンサーの表面に固定化できる。第１のピーク波長値を調べる。例えば、３、５、１０、１２、１５、２４または３６またはそれを超える（または２から１，０００の間の任意の範囲）種々の濃度で比色共鳴反射バイオセンサーの表面に小分子を加えることができる。実質的に、滴定曲線が作製される。種々の濃度の各々について、ピーク波長値を検出する。ピーク波長を比較して、標的分子に対する小分子の親和性を求める。一実施形態では、標的分子または小分子の分子量または両方がわかっている。
【００５２】
本発明の別の実施形態は、小分子の順位親和性値を調べる方法を提供する。比色共鳴反射バイオセンサーの表面の第１のピーク波長値を調べる。既知分子量を有する標的分子を、比色共鳴反射バイオセンサーの表面に固定化する。第２のピーク波長値を調べる。第１と第２のピーク波長値間の相違を用いて、比色共鳴反射バイオセンサーに結合している標的分子のモル量を求める。特定の濃度の、既知分子量を有する小分子を、比色共鳴反射バイオセンサーに加える。特定の分子量は必要ではない。例えば、およその分子量値を使用してもよい。例えば、３０，０００Ｄａ標的に対する３００〜６００分子量の範囲の小分子ライブラリーは、４５０Ｄａ結合を用いて近似させることができ、標的に対するレシオメトリックな３００〜６００の間の変動は無視できる。第３のピーク波長値を調べる。第２のピーク波長値と第３のピーク波長値間の相違は、比色共鳴反射バイオセンサー表面と結合している小分子の量を提供する。第２のピーク波長値と第３のピーク波長値間の相違対第１のピーク波長値と第２のピーク波長値間の相違の比を用いて小分子の順位親和性を求める。
【００５３】
本発明はまた、小分子が標的分子上の特定の部位と結合するかどうか、または標的結合について標的分子上の標的部位の既知ブロッカーと競合するかどうかを調べる方法を提供する。標的分子は、第１の比色共鳴反射バイオセンサーに固定化できる。また、標的分子を、第２の比色共鳴反射バイオセンサーに固定化し、これでは、標的分子の標的部位は、標的部位の既知ブロッカーでブロッキングされる。小分子を第１および第２の比色共鳴反射バイオセンサー両方に加え、第１および第２の比色共鳴反射バイオセンサーのピーク波長値を調べる。第１の比色共鳴反射バイオセンサーのピーク波長値が、第２の比色共鳴反射バイオセンサーのピーク波長値と比較してシフトしている場合には、小分子は、標的分子上の標的部位の既知ブロッカーと競合するか、標的分子上の特定の部位と結合する。
【００５４】
本発明はまた、固定化された標的分子対添加された小分子の化学量論的比を求めることができる。さらに、本発明を用いて化学量論を超える相互作用を測定し、小分子の相互作用の特異性または「粘性」を調べることができる。一般に、薬物設計では、化学量論を超える小分子または「粘性」の小分子、すなわち、標的分子上の２以上の結合部位と結合する小分子を避けることが望ましいが、これは、それらが特定の標的に対する特異性を欠き、最終的に望ましくない毒性につながる傾向があるからである。一実施例では、センサーに固定化される標的分子の量を経時的に定量化する。例えば、０．１分〜１時間（または間の任意の範囲）にＰＷＶをとる。２、５、１０、２０、３０、５０、１００、２００またはそれより多い（または間の任意の範囲）時点をとってもよい。本発明の一形態が、約２ｎｇ／ｍｍ2のＰＷＶシフトを提供するという事実を用いることによって、および固定化された標識の分子量の値を有することによって、センサー上に固定化される標的のモル数を算出することができる（２ｎｇ／ｍｍ2×ｍｍ2でのセンサー読み取り領域の大きさ×１モル／標的の分子量）。この値を用い、以下の方程式を使用して、標的と結合する小分子の対応する量を算出する：標的固定化ＰＷＶシフト×（リガンドの分子量／標的の分子量）。本発明を用い、上記のＰＷＶシフト値を得ることによって、この数は、化学量論を超える結合を示す。値が２〜５倍の倍数である場合は、この値は、標的との実際の結合である可能性が高い。値がこれを超える倍数である場合は、これは、凝集性化合物を示す可能性がある。例えば、図５参照のこと。
【００５５】
一般に、分子と標的分子間の解離定数を求める場合には、予想されるＫｄより約１０倍高い、標的分子と結合するべき分子の濃度を有することが望ましい。しかし、高感度の生物学的系を用いて使用するであろうものなどの、少ない量の非水性溶媒における分子の固有の溶解度のために、このような高濃度で小分子をスクリーニングすることは困難であり得る。本発明は、低濃度の小分子で（例えば、約２ｍＭ、約１ｍＭ、約０．５ｍＭ、約０．２５ｍＭまたは約２ｍＭ〜約０．５ｍＭ、約２ｍＭ〜約０．２５ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約０．０ＩｍＭまたは２ｍＭから０．０１ｍＭ間の任意の範囲）、小分子および標的分子の親和性を調べる方法を提供する。Ｋｄを下回る小分子の濃度で、ほとんどのアッセイの結合シグナルは、たとえ検出可能であったとしても大幅に小さくなる。結合シグナルは、Ｋｄと等しい濃度点での最大の１／２である点へ濃度が高まるにつれて上がる。本発明は、最大シグナルの予測を可能にするので（上記参照のこと）、結合シグナルを示し始める任意の低濃度の小分子は、予測されるプラトーへつながる傾斜した線を開始する。当業者ならば、小分子の標的に対する親和性を前記の傾斜および前記の最大シグナルから確認できることは認識されよう。
【００５６】
また、本発明の方法を用い、阻害型アッセイにおいて既知結合パートナーを置換することによって生物活性の低下を調べることができる。既知結合パートナーおよび１種以上の小分子の両方を、標的部位がブロックされているか、ブロッキングされていないバイオセンサー表面に加える。対照アッセイは、ブロッキングされたおよびブロッキングされていない表面に１種以上の小分子のみ、既知結合パートナーのみを加えることまたは分子を加えないことを含む。
【００５７】
本発明の方法はまた、ブロッキングされている（標的分子への既知結合剤で）およびブロッキングされていない標的分子の試験間に生じ得る変動を同定し、補正できる。例えば、標的分子でコーティングされたバイオセンサー表面に既知強力結合分子を加える場合には、表面に小分子のライブラリー（ＤＭＳＯバッファーまたは塩バッファー中）を加え、次いで、シグナルを検出すればよい。シグナルは結合を表し得る。あるいは、シグナルは、塩バッファーまたはＤＭＳＯバッファーによる偽シグナルを表す場合もある。例えば、小分子ライブラリー溶液中のＤＭＳＯは、２５％以上もの高いシグナルの変動を引き起こし得る。本発明の一実施形態は、標的部位がブロッキングされた、およびブロッキングされていないバイオセンサー表面でのＤＭＳＯの滴定による「ミスマッチ」補正を提供する。標的部位がブロッキングされた表面とは、バイオセンサー表面に標的分子が固定化されている表面であり、バイオセンサー表面に、分子の標的部位と結合することがわかっている分子（すなわち、「ブロッカー分子」）を加える。ブロッキングされていない表面とは、バイオセンサー表面に標的分子が固定化されていない表面である。ブロッキングされた、およびブロッキングされていない表面に、１以上の種類の小分子を加える。ブロッキングされたバイオセンサー表面で陰性ＰＷＶシフトが観察される場合には、ＤＭＳＯまたは塩バッファーが変動を引き起こしている。ブロッキングされた表面とブロッキングされていない表面の両方で陽性シフトが見られる場合には、小分子は、既知結合分子以外の部位で標的と結合している。ブロッキングされていない表面で陽性シフトが見られ、ブロッキングされた表面ではより少ない陽性シフトが見られる場合には、既知結合分子および小分子は、同一標的部位と結合している。例えば、図４参照のこと。ＤＭＳＯまたは塩バッファーによって引き起こされる変動を補正するために、参照または対照表面で測定されるＰＷＶにおける陰性シフトを、標的表面の結合シグナルに加えてもよい。
【００５８】
本発明の方法が検出できる相互作用の種類の例が表１に示されている。
【００５９】
【表１】
【００６０】
本明細書中のいずれかに言及される、すべての特許、特許出願およびその他の化学的または技術的文書は、参照によりその全文が組み込まれる。本明細書に例示的に記載される本発明は、本明細書に具体的に開示されていない、任意の要素または複数の要素、制限または複数の制限の不在下で適切に実施できる。したがって、例えば、本明細書における各場合において、用語「含んでなる」、「本質的にからなる」および「からなる」のいずれも、その通常の意味を保持しながら、他の２つの用語のいずれかで置き換えることができる。使用されている用語および表現は、説明の用語として用いられ、制限の用語ではなく、このような用語および表現の使用において、示され、記載される特徴またはその一部の任意の等価物を排除する意図はないが、特許請求される本発明の範囲内で種々の改変が可能であるということは認識される。したがって、本発明は実施形態によって具体的に開示されるが、本明細書に開示される概念の任意の特徴、改変および変化は、当業者によって用いることができるということ、およびこのような改変および変化は、この記述および添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲内であると考えられることは理解されなければならない。さらに、本発明の特徴または態様が、マーカッシュグループまたは代替のその他のグループ分けの用語で記載されている場合には、当業者ならば、それによって本発明もまた、マーカッシュグループまたはその他のグループの任意の個々のメンバーまたはメンバーの下位グループの用語で記載されるということは認識されよう。
【実施例】
【００６１】
標的分子、ＡＴＰアーゼドメインを有するプロテインＸ（２６ｋＤａ）を、比色共鳴反射バイオセンサーに固定化した。このバイオセンサーに、＜３００Ｄａのライブラリーメンバーの平均分子量を有する化合物ライブラリーを加えた。ライブラリー構成要素の、バイオセンサーとの直接結合を検出した。化合物ライブラリーの結合データはまた、ＮＭＲおよびＸ線結晶学を含めた生物物理学的方法からも得た。
【００６２】
２％ＤＭＳＯバッファー中の約５００種の分子をスクリーニングした。読み取り時間は１０分未満であった。リガンドスクリーニング濃度は、２５０μＭおよび１ｍＭであった。結果を以下に示した：１：１化学量論での２００Ｄａリガンドのダイナミックレンジ、全結合６０ｐｍ、Ｓ／Ｎ＝１２；陽性および陰性対照の適切な同定；検出／滴定される親和性の範囲１ｎＭ〜約１ｍＭ；および低スループット生物物理学的方法を用いた強力なヒット相関。
【００６３】
以下の化合物を同定した（図２および３参照のこと）：
・断片Ａ：（Ｍｒ＝２６５Ｄａ、Ｋｄ約０．０１μＭ）
・断片Ｂ：（Ｍｒ＝２６３Ｄａ、Ｋｄ約１μＭ）
・断片Ｃ：（Ｍｒ＝２４９Ｄａ、Ｋｄ約１μＭ）
・断片Ｄ：（Ｍｒ＝１６８Ｄａ、Ｋｄ約１００μＭ）
・断片Ｅ：（Ｍｒ＝２１５Ｄａ、Ｋｄ約１０μＭ）
・断片Ｆ：（Ｍｒ＝２６５Ｄａ、Ｋｄ約０．１μＭ）
・断片Ｇ：（Ｍｒ＝２８３Ｄａ、Ｋｄ約０．００１μＭ）
【００６４】
図１は、センサーの表面上に固定化されたプロテインＸと弱く会合する小分子を高感度検出するためのバイオセンサーの再現性を示す。小分子は、１ｍＭまたは０．２５ｍＭの濃度でセンサープレートの表面に加えた。結果は、高度に再現性のある、定量的な結果を実証する。アッセイは、標準９６および３８４ウェルプレートで実施した。
【００６５】
図２は、凝集性化合物およびＤＭＳＯミスマッチ化合物が、両方に等濃度で加えられた場合に、標的表面（ｙ軸）と比較して対照またはブロッキングされた表面（ｘ軸）で大きく異なるシグナルを提供することを示す。図は丸く囲まれた領域で、アッセイのロバスト性の統計的評価を得るために用いた陽性対照（既知結合）化合物を強調する。このアッセイによって、凝集性分子による偽陽性（斜線の四角形の外側のもの）が同定された。このアッセイによって、その他の生物物理学的アッセイ：核磁気共鳴法、Ｘ線結晶学および等温滴定熱量測定法によって決定された結合性化合物が強い相関で確認された。図２は、５つの９６ウェルセンサープレートのうちの１つに由来する代表的なデータを示す。
【００６６】
図３「標準」グラフは、本発明の方法を使用して滴定し、その他の生物物理学的方法によって得られた既知結合性化合物の妥当な親和性結合曲線を得ることができることを示す。「ＢＩＮＤ（登録商標）ヒット」グラフは、本発明の方法によって「発見された」化合物を、滴定曲線を実施し、これを親和性の順位付けのために平衡結合定数に合わせることによる本発明の方法によるさらなる生化学的特性決定によって結合性化合物と確認できることを示す。したがって、本発明の方法を用いて、各結合性化合物がどの程度堅く標的分子と結合するかを調べること、化学量論を調べること、および例えば、競合アッセイを用いて個々の結合部位を調べることができる。
【００６７】
図４は、本発明の方法が、種々の結合部位と弱く会合する断片の結合の測定を可能にすることを実証する。ゼロより大きく、標的表面および同様にブロッキングされた標的表面で試験された場合の概算と等しいシグナルを与える化合物は、標的に対して特異性を有さず、標的上の単一部位と実際に結合している可能性が低い。強調された、円で囲んだ領域中の化合物は、ブロッキングされた標的表面上で示しているよりも、標的上で大幅に大きなシグナルを示しており、したがって、特異的に、ＰＷＶシフトシグナルによって提供されるモル計算から決定される適切な比で結合していると決定される。
【００６８】
図５は、特異性決定のための結合の経時変化アッセイを示す。遅い結合ほど、特に、ＰＷＶシフトが１：１化学量論を上回る場合に、低い特異性を表し得る。化合物ウェルＦ１１およびウェルＦ４は、「粘性」または化学量論を上回る化合物を表す。正常な１：１結合は、混合時間内に生じる安定なプラトーシグナルを実証する（化合物ウェルＧ７）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的分子に対する小分子の親和性を調べる方法であって、
（ａ）標的分子を、比色共鳴反射バイオセンサーの表面に固定化するステップおよび第１のピーク波長値を調べるステップと；
（ｂ）小分子を、３以上の異なる濃度で比色共鳴反射バイオセンサーの表面に加えるステップと、３以上の異なる濃度のピーク波長値を調べるステップと；
ピーク波長を比較して、標的分子に対する小分子の親和性を決定するステップと
を含んでなる方法。
【請求項２】
小分子が、約３００Ｄａ未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
小分子の解離定数（Ｋｄ）を求める、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
小分子の解離定数が、約２，０００〜約７５０μＭである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
小分子の濃度が、約０．５ｍＭ〜約０．０１ｍＭである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
小分子サンプルの順位親和性を調べる方法であって、
（ａ）比色共鳴反射バイオセンサーの表面の第１のピーク波長値を検出するステップと；
（ｂ）既知分子量を有する標的分子を、比色共鳴反射バイオセンサーの表面に固定化するステップと、第２のピーク波長値を調べるステップと；
（ｃ）第１および第２のピーク波長値を用いて、比色共鳴反射バイオセンサーと結合している標的分子のモル量を求めるステップと；
（ｄ）比色共鳴反射バイオセンサーに、特定の濃度の、既知分子量の小分子サンプルを加えるステップと、第３のピーク波長値を調べ、ここで、第２のピーク波長値と第３のピーク波長値間の相違が比色共鳴反射バイオセンサー表面に結合している小分子の量を提供するステップと；
（ｅ） 第１のピーク波長値と第２のピーク波長値間の相違対第２のピーク波長値と第３のピーク波長値間の相違の比を用いて小分子サンプルの順位親和性を調べるステップと
を含んでなる方法。
【請求項７】
小分子サンプルが、約３００Ｄａ未満である小分子を含んでなる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
小分子サンプル中の小分子の解離定数が、約２，０００〜約７５０μＭである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
小分子サンプル中の小分子の濃度が、約０．５ｍＭ〜約０．０１ｍＭである、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
小分子が標的分子上の特定の部位と結合するかどうか、または標的結合について標的分子上の標的部位の既知ブロッカーと競合するかどうかを調べる方法であって、
（ａ）標的分子を、第１の比色共鳴反射バイオセンサーに固定化するステップと；
（ｂ）標的分子を、第２の比色共鳴反射バイオセンサーに固定化し、ここで、標的分子の標的部位が、標的部位の既知ブロッカーでブロッキングされるステップと；
（ｃ）第１および第２の比色共鳴反射バイオセンサーの両方に小分子を加えるステップ、および第１および第２の比色共鳴反射バイオセンサーの＋＋＋ピーク波長値を調べるステップと
を含んでなり、
ここで、第１の比色共鳴反射バイオセンサーのピーク波長値が、第２の比色共鳴反射バイオセンサーのピーク波長値と比較してシフトしている場合には、小分子が、標的分子上の標的部位の既知ブロッカーと競合するか、または標的分子上の特定の部位と結合する方法。
【請求項１１】
小分子が約３００Ｄａ未満である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
小分子の解離定数が、約２，０００〜約７５０μＭである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
小分子の濃度が、約０．５ｍＭ〜約０．０１ｍＭである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
３００Ｄａ未満の小分子が標的分子と結合するかどうかを調べる方法であって、
（ａ）標的分子を、比色共鳴反射バイオセンサーの表面に固定化するステップおよび第１のピーク波長値を調べるステップと；
（ｂ）比色共鳴反射バイオセンサーの表面に小分子を加えるステップおよび第２のピーク波長値を調べるステップと；
第１および第２のピーク波長を比較するステップと
を含んでなり、第２のピーク波長値が、第１のピーク波長値と比較してシフトしている場合、小分子は標的分子と結合する方法。
【請求項１５】
小分子の解離定数（Ｋｄ）を求める、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
小分子の解離定数が、約２，０００〜約７５０μＭである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
小分子の濃度が、約０．５ｍＭ〜約０．０ １ｍＭである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１】
標的分子に対する小分子の親和性を調べる方法であって、
（ａ）標的分子を、比色共鳴反射バイオセンサーの表面に固定化するステップおよび第１のピーク波長値を調べるステップと；
（ｂ）小分子を、３以上の異なる濃度で比色共鳴反射バイオセンサーの表面に加えるステップと、３以上の異なる濃度のピーク波長値を調べるステップと；
ピーク波長を比較して、標的分子に対する小分子の親和性を決定するステップと
を含んでなる方法。
【請求項２】
小分子が、約３００Ｄａ未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
小分子の解離定数（Ｋｄ）を求める、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
小分子の解離定数が、約２，０００〜約７５０μＭである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
小分子の濃度が、約０．５ｍＭ〜約０．０１ｍＭである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
小分子サンプルの順位親和性を調べる方法であって、
（ａ）比色共鳴反射バイオセンサーの表面の第１のピーク波長値を検出するステップと；
（ｂ）既知分子量を有する標的分子を、比色共鳴反射バイオセンサーの表面に固定化するステップと、第２のピーク波長値を調べるステップと；
（ｃ）第１および第２のピーク波長値を用いて、比色共鳴反射バイオセンサーと結合している標的分子のモル量を求めるステップと；
（ｄ）比色共鳴反射バイオセンサーに、特定の濃度の、既知分子量の小分子サンプルを加えるステップと、第３のピーク波長値を調べ、ここで、第２のピーク波長値と第３のピーク波長値間の相違が比色共鳴反射バイオセンサー表面に結合している小分子の量を提供するステップと；
（ｅ） 第１のピーク波長値と第２のピーク波長値間の相違対第２のピーク波長値と第３のピーク波長値間の相違の比を用いて小分子サンプルの順位親和性を調べるステップと
を含んでなる方法。
【請求項７】
小分子サンプルが、約３００Ｄａ未満である小分子を含んでなる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
小分子サンプル中の小分子の解離定数が、約２，０００〜約７５０μＭである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
小分子サンプル中の小分子の濃度が、約０．５ｍＭ〜約０．０１ｍＭである、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
小分子が標的分子上の特定の部位と結合するかどうか、または標的結合について標的分子上の標的部位の既知ブロッカーと競合するかどうかを調べる方法であって、
（ａ）標的分子を、第１の比色共鳴反射バイオセンサーに固定化するステップと；
（ｂ）標的分子を、第２の比色共鳴反射バイオセンサーに固定化し、ここで、標的分子の標的部位が、標的部位の既知ブロッカーでブロッキングされるステップと；
（ｃ）第１および第２の比色共鳴反射バイオセンサーの両方に小分子を加えるステップ、および第１および第２の比色共鳴反射バイオセンサーの＋＋＋ピーク波長値を調べるステップと
を含んでなり、
ここで、第１の比色共鳴反射バイオセンサーのピーク波長値が、第２の比色共鳴反射バイオセンサーのピーク波長値と比較してシフトしている場合には、小分子が、標的分子上の標的部位の既知ブロッカーと競合するか、または標的分子上の特定の部位と結合する方法。
【請求項１１】
小分子が約３００Ｄａ未満である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
小分子の解離定数が、約２，０００〜約７５０μＭである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
小分子の濃度が、約０．５ｍＭ〜約０．０１ｍＭである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
３００Ｄａ未満の小分子が標的分子と結合するかどうかを調べる方法であって、
（ａ）標的分子を、比色共鳴反射バイオセンサーの表面に固定化するステップおよび第１のピーク波長値を調べるステップと；
（ｂ）比色共鳴反射バイオセンサーの表面に小分子を加えるステップおよび第２のピーク波長値を調べるステップと；
第１および第２のピーク波長を比較するステップと
を含んでなり、第２のピーク波長値が、第１のピーク波長値と比較してシフトしている場合、小分子は標的分子と結合する方法。
【請求項１５】
小分子の解離定数（Ｋｄ）を求める、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
小分子の解離定数が、約２，０００〜約７５０μＭである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
小分子の濃度が、約０．５ｍＭ〜約０．０ １ｍＭである、請求項１４に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２０１０−５２５３３４（Ｐ２０１０−５２５３３４Ａ）
【公表日】平成２２年７月２２日（２０１０．７．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５０４３０５（Ｐ２０１０−５０４３０５）
【出願日】平成２０年４月１９日（２００８．４．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６０９５１
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１３１３１４
【国際公開日】平成２０年１０月３０日（２００８．１０．３０）
【出願人】（５０３１５９２１０）エス アール ユー バイオシステムズ，インコーポレイテッド (24)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年７月２２日（２０１０．７．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年４月１９日（２００８．４．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６０９５１
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１３１３１４
【国際公開日】平成２０年１０月３０日（２００８．１０．３０）
【出願人】（５０３１５９２１０）エス アール ユー バイオシステムズ，インコーポレイテッド (24)
【Ｆターム（参考）】
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