固形腫瘍の治療に貢献するための方法、組成物及び製品
【課題】固形のがん性腫瘍の治療に貢献するための方法、組成物及び製品を提供する。該方法、組成物及び製品は、ヒトを含む哺乳動物の固形腫瘍への化学療法薬の送達を増強するためにエンドセリンＢ（ＥＴＢ）受容体アゴニストを利用できる。
【解決手段】固形腫瘍の治療に貢献する方法を含み、該方法は、その必要ある哺乳動物にＥＴＢ受容体アゴニストと化学療法薬を静脈内投与することを含む。前記ＥＴＢ受容体アゴニストは固形腫瘍への血液供給を選択的に増大することによって固形腫瘍への化学療法薬の送達を増大する。
【解決手段】固形腫瘍の治療に貢献する方法を含み、該方法は、その必要ある哺乳動物にＥＴＢ受容体アゴニストと化学療法薬を静脈内投与することを含む。前記ＥＴＢ受容体アゴニストは固形腫瘍への血液供給を選択的に増大することによって固形腫瘍への化学療法薬の送達を増大する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エンドセリンアゴニストと化学療法薬の投与を通じて哺乳動物における乳房腫瘍のような固形腫瘍の治療に貢献するための方法、組成物及び製品に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳がんの発生率はこの１０年間実質的に増加し、米国における４０〜４９歳の女性の死
因の単独首位となっている。乳がんを含む固形腫瘍の成功的治療は、腫瘍細胞の分子生物学の理解が進み、可能性ある多数の治療薬を利用できるようになったにもかかわらず、医学的目標を未だ満たしていない。
【０００３】
がん治療における一つの問題は、可能性ある多様な化学療法薬の有効量が、これらの薬剤の正常組織に及ぼす非選択的高毒性の作用のために制限されていることである。その結果、多くの患者は治療の利益を得ることなく化学療法の副作用に苦しむことになる。例えば、化学療法薬のパクリタキセルは、細胞増殖を阻害し、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する。しかしながら、パクリタキセルの臨床的有用性は、過敏、好中球減少及び末梢神経障害といったその用量制限毒性によって妨害されている。従って、より特異的で低毒性のがん療法の開発が求められている。
【０００４】
化学療法薬を腫瘍に標的化送達できれば、化学療法薬の利益を増強しつつ全身毒性は最小限化するという利益をもたらすはずである。そのような標的化送達は、化学療法薬の必要量を低減し、ひいてはこれらの薬剤の許容しがたい有害作用を潜在的に削減するのにも役立つと思われる。化学療法薬の標的化送達を達成するための一つの可能な方法は、腫瘍の血管系に特有の特徴を利用することである。
【０００５】
大きさ数ミリメートル以上の腫瘍は一定の栄養補給を必要とするので、それら自身の血管床及び血流を発達させる。Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，４６：４６７ （１９８６）。これらの発達中の血管からの常時栄養補給がなければ、腫瘍は低酸素状態になり、その後死滅する。既存の血管から新規血管系を動員することを“血管新生”と呼ぶ。
【０００６】
血管新生の間、腫瘍の血管は正常の血管系とは実質的に異なる発達をし、異なる性質を有する。単層の上皮細胞がまず急造される腫瘍血管である。これらの新規形成された腫瘍血管は平滑筋層又は神経分布を持たない。腫瘍は、あらゆる自己調節機能を備えた成熟血管も取り込む。Ｍａｔｔｓｓｏｎら，Ｔｕｍｏｒ Ｂｌｏｏｄ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ｐｇ．１２９（１９７９）；Ｒｅｉｎｈｏｌｄ，Ｔｕｍｏｒ Ｂｌｏｏｄ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ｐｇ．１１５（１９７９）；Ｗａｒｒｅｎ，Ｔｕｍｏｒ Ｂｌｏｏｄ
Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ｐｇ．２６（１９７９）。
血管緊張（血管が拡張又は収縮する程度）は、Ｈ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋、ｐＯ２、ｐＣＯ２及び一酸化窒素（ＮＯ）を含む多くの内因性因子、並びにエンドセリン（ＥＴ−１）のようなその他の調節物質によって支配されている。Ｌｕｓｃｈｅｒら，Ｔｈｅ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ：ｍｏｄｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ｐｇ．６１（１９９０）。ＥＴ−１は血管緊張の調節に著しく寄与しており（Ｙａｎａｇｉｓａｗａら，Ｎａｔｕｒｅ，
３３２：４１１（１９８８））、研究者らは乳がんを含む固形腫瘍にＥＴ−１及びＥＴＢ受容体の発現が増加していることを示している。Ａｌａｎｅｎら，Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，３６：１６１（２０００）；Ｎｅｌｓｏｎら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，５６：６６３（１９９６）；Ｋａｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２１６：５１４（１９９５）；Ｐａｇｏｔｔｏら，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，９６：２０１７（１９９５）；Ｙａｍａｓｈｉｔａら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，５２：４０４６（１９９２）；Ｙａｍａｓｈｉｔａら，Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ Ｃｈｅｍ Ｐａｔｈｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，７４：３６３（１９９１）。さらに、ＥＴＢ受容体の刺激は、腫瘍血管の血管拡張を通じて腫瘍への血液供給の増大を起こす。本発明は、この事実を利用することによってＥＴＢ受容体アゴニストを用いて腫瘍への血流を選択的に増やし、化学療法薬の標的化送達を増強する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，４６：４６７ （１９８６）
【非特許文献２】Ｍａｔｔｓｓｏｎら，Ｔｕｍｏｒ Ｂｌｏｏｄ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ｐｇ．１２９（１９７９）
【非特許文献３】Ｒｅｉｎｈｏｌｄ，Ｔｕｍｏｒ Ｂｌｏｏｄ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ｐｇ．１１５（１９７９）
【非特許文献４】Ｗａｒｒｅｎ，Ｔｕｍｏｒ Ｂｌｏｏｄ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ｐｇ．２６（１９７９）
【非特許文献５】Ｌｕｓｃｈｅｒら，Ｔｈｅ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ：ｍｏｄｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ｐｇ．６１（１９９０）
【非特許文献６】Ｙａｎａｇｉｓａｗａら，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：４１１（１９８８）
【非特許文献７】Ａｌａｎｅｎら，Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，３６：１６１（２０００）
【非特許文献８】Ｎｅｌｓｏｎら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，５６：６６３（１９９６）
【非特許文献９】Ｋａｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２１６：５１４（１９９５）
【非特許文献１０】Ｐａｇｏｔｔｏら，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，９６：２０１７（１９９５）
【非特許文献１１】Ｙａｍａｓｈｉｔａら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，５２：４０４６（１９９２）
【非特許文献１２】Ｙａｍａｓｈｉｔａら，Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ Ｃｈｅｍ Ｐａｔｈｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，７４：３６３（１９９１）
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、固形腫瘍の治療に貢献するために、その必要ある個人へのエンドセリンアゴニストと化学療法薬の投与に向けられている。特に、腫瘍は、ＥＴＢ受容体（結合されると血管拡張を起こす）の数の増加を含む独特の血管系を有している。ＥＴＢ受容体は血管拡張因子なので、化学療法薬と組み合わせたＥＴＢ受容体アゴニストは、乳がんに見られるような固形腫瘍の治療に有用である。ＥＴＢ受容体アゴニストは化学療法薬をより効果的に腫瘍に送達できるので、治療の増強をもたらす。
【０００９】
具体的には、本発明の一態様は、固形腫瘍の治療に貢献する方法を含み、該方法は、その必要ある哺乳動物にＥＴＢアゴニストと化学療法薬を静脈内投与することを含む。前記ＥＴＢアゴニストは固形腫瘍への血液供給を選択的に増大することによって固形腫瘍への化学療法薬の送達を増大する。
【００１０】
本発明の方法の別の態様において、化学療法薬の薬物動態はＥＴＢ受容体アゴニストによって影響されない。
本発明の方法の別の態様において、ＥＴＢ受容体アゴニストは化学療法薬の効能を増強する。
【００１１】
本発明の方法の別の態様において、ＥＴＢアゴニストは、ＥＴ−１、ＥＴ−２、ＥＴ−３、ＢＱ３０２０、ＩＲＬ１６２０（Ｎ−ｓｕｃ−［Ｇｌｕ９，Ａｌａ１１，１５］ＥＴ−１（８−２１））、サラホトキシン５６ｃ、［Ａｌａ１，３，１１，１５］ＥＴ−１、及びそれらの混合物からなる群から選ばれる。本発明の方法の別の態様において、ＥＴＢアゴニストはＩＲＬ１６２０である。
【００１２】
本発明の方法の別の態様において、化学療法薬は、アドリアマイシン、カンプトテシン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、アルファインターフェロン、ベータインターフェロン、ガンマインターフェロン、インターロイキン２、イリノテカン、ドセタキセル、パクリタキセル、トポテカン、及びそれらの混合物からなる群から選ばれる。本発明の方法の別の態様において化学療法薬はパクリタキセルである。
【００１３】
本発明の方法の別の態様において、固形腫瘍は、卵巣腫瘍、結腸腫瘍、カポジ肉腫、乳房腫瘍、黒色腫、前立腺腫瘍、髄膜腫、肝腫瘍、及び乳房葉状腫瘍からなる群から選ばれる。本発明の方法の別の態様において、固形腫瘍は乳房腫瘍である。
【００１４】
本発明の方法の別の態様において、ＥＴＢアゴニストと化学療法薬は、ＥＴＢアゴニストと化学療法薬を単一組成物として投与する；ＥＴＢアゴニストと化学療法薬を別の組成物として投与する；ＥＴＢアゴニストと化学療法薬を順に投与し、ＥＴＢアゴニストを化学療法薬より先に投与する；そしてＥＴＢアゴニストと化学療法薬を順に投与し、化学療
法薬をＥＴＢアゴニストより先に投与する；からなる群から選ばれる戦略に従って投与される。
【００１５】
本発明の方法の別の態様において、哺乳動物はヒトである。
本発明は製品も含む。一態様において、製品は、（ａ）ＥＴＢアゴニストを含む包装組成物；及び（ｂ）哺乳動物における固形腫瘍の治療に貢献するためのＥＴＢアゴニストの静脈内投与についての取扱説明を提供する添付文書；及び（ｃ）（ａ）ＥＴＢアゴニストと（ｂ）添付文書のための容器を含む。
【００１６】
本発明の製品の別の態様において、製品は、（ｄ）化学療法薬をさらに含み、取扱説明はＥＴＢアゴニストと化学療法薬の投与について規定し、容器（ｃ）は（ａ）ＥＴＢアゴニスト、（ｂ）添付文書及び（ｄ）化学療法薬のためのものである。
【００１７】
本発明の製品の別の態様において、取扱説明に従った場合、ＥＴＢアゴニストは固形腫瘍への血液供給を選択的に増大し、ひいては固形腫瘍への化学療法薬の送達が増大する。
本発明の製品の別の態様において、化学療法薬の薬物動態はＥＴＢ受容体アゴニストによって影響されない。
【００１８】
本発明の製品の別の態様において、ＥＴＢ受容体アゴニストは化学療法薬の効能を増強する。
本発明の製品の別の態様において、ＥＴＢアゴニストは、ＥＴ−１、ＥＴ−２、ＥＴ−３、ＢＱ３０２０、ＩＲＬ１６２０（Ｎ−ｓｕｃ−［Ｇｌｕ９，Ａｌａ１１，１５］ＥＴ−１（８−２１））、サラホトキシン５６ｃ、［Ａｌａ１，３，１１，１５］ＥＴ−１、及びそれらの混合物からなる群から選ばれる。本発明の製品の別の態様においてＥＴＢアゴニストはＩＲＬ１６２０である。
本発明の製品の別の態様において、化学療法薬は、アドリアマイシン、カンプトテシン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、アルファインターフェロン、ベータインターフェロン、ガンマインターフェロン、インターロイキン２、イリノテカン、ドセタキセル、パクリタキセル、トポテカン、及びそれらの混合物からなる群から選ばれる。本発明の製品の別の態様において化学療法薬はパクリタキセルである。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】パクリタキセルが誘導する腫瘍潅流における変化に及ぼすＩＲＬ１６２０の影響を示す図である。
【図２】図２Ａは、無がんラット及び乳房腫瘍ラットの全身血行動態に及ぼすＥＴ−１の影響を示す図である。図２Ｂは、無がんラット及び乳房腫瘍ラットの全身血行動態に及ぼすＥＴ−１の影響を示す図である。図２Ｃは、無がんラット及び乳房腫瘍ラットの全身血行動態に及ぼすＥＴ−１の影響を示す図である。図２Ｄは、無がんラット及び乳房腫瘍ラットの全身血行動態に及ぼすＥＴ−１の影響を示す図である。図２Ｅは、無がんラット及び乳房腫瘍ラットの全身血行動態に及ぼすＥＴ−１の影響を示す図である。
【図３】図３Ａは、無がんラット及び乳房腫瘍ラットの乳房組織における血流と局所血管抵抗に及ぼすＥＴ−１の影響を示す図である。図３Ｂは、無がんラット及び乳房腫瘍ラットの乳房組織における血流と局所血管抵抗に及ぼすＥＴ−１の影響を示す図である。
【図４】図４Ａは、無がんラット及び乳房腫瘍ラットの乳房組織における潅流、移動血球の濃度（ＣＭＢＣ）、及び血球速度に及ぼすＥＴ−１の影響を示す図である。図４Ｂは、無がんラット及び乳房腫瘍ラットの乳房組織における潅流、移動血球の濃度（ＣＭＢＣ）、及び血球速度に及ぼすＥＴ−１の影響を示す図である。図４Ｃは、無がんラット及び乳房腫瘍ラットの乳房組織における潅流、移動血球の濃度（ＣＭＢＣ）、及び血球速度に及ぼすＥＴ−１の影響を示す図である。
【図５】図５Ａは、ＥＴ−１が誘導する無がんラット及び乳房腫瘍ラットの乳房組織における血液潅流、ＣＭＢＣ、及び血球速度の変化に及ぼすＢＱ７８８の影響を示す図である。図５Ｂは、ＥＴ−１が誘導する無がんラット及び乳房腫瘍ラットの乳房組織における血液潅流、ＣＭＢＣ、及び血球速度の変化に及ぼすＢＱ７８８の影響を示す図である。図５Ｃは、ＥＴ−１が誘導する無がんラット及び乳房腫瘍ラットの乳房組織における血液潅流、ＣＭＢＣ、及び血球速度の変化に及ぼすＢＱ７８８の影響を示す図である。
【図６】乳房腫瘍ラットの腫瘍及び他の主要器官におけるパクリタキセル蓄積に及ぼすＩＲＬ１６２０の影響を示す図である。
【図７】ＨＰＬＣで測定した正常及び腫瘍ラットにおけるパクリタキセルの血漿中薬物動態分析に及ぼすビヒクル又はＩＲＬ１６２０の影響を示す図である。
【図８】液体シンチレーション計数で測定した［３Ｈ］パクリタキセルの血漿中薬物動態に及ぼすビヒクル又はＩＲＬ１６２０の影響を示す図である。
【図９】液体シンチレーション計数で測定した［３Ｈ］パクリタキセルの血漿中薬物動態に及ぼすビヒクル又はＩＲＬ１６２０の影響を示す図である。
【図１０】図１０Ａは、レーザードップラー流量計で測定した乳房腫瘍潅流に及ぼすＩＲＬ１６２０の影響を示す図である。図１０Ｂは、レーザードップラー流量計で測定した乳房腫瘍潅流に及ぼすＩＲＬ１６２０の影響を示す図である。
【図１１】乳房腫瘍ラットの腫瘍及び主要器官における［３Ｈ］パクリタキセル濃度に及ぼすＩＲＬ１６２０投与の時間依存性効果を示す図である。
【図１２】処置開始時と比較した乳房腫瘍ラットの体重における相違率を示す図である。
【図１３】乳房腫瘍ラットの腫瘍体積に及ぼすＩＲＬ１６２０投与の影響を示す図である。そして
【図１４】腫瘍の進行、停滞及び退行に及ぼすＩＲＬ１６２０投与の影響を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
詳細な説明
１．定義
本明細書中で使用される一部の用語は以下のように説明される。
“治療”又は“〜の治療に貢献する”という用語は、固形腫瘍の予防、進行又は成長の遅延、縮小、又は排除を含む。従って、これらの用語は、必要に応じて、医学療法的及び／又は予防的投与の両方を含む。
【００２１】
“容器”という用語は、医薬品の保管、輸送、投薬、及び／又は取扱に適切な任意の入れ物（レセプタクル）及び閉包（クロージャー）を意味する。
“添付文書”という用語は、医薬品に添付された情報を意味し、該情報は、製品の投与法の説明と共に、医師、薬剤師、及び患者が製品の使用に関して詳細な情報を得た上での決断を可能にするのに必要な安全性及び効能データを提供する。包装品の添付文書は一般に医薬品の“ラベル”とみなされている。添付文書は紙面又はＣＤロムなど（これらに限定されない）の多くの形態を取ることができる。
【００２２】
“プロドラッグ”という用語は、インビボで例えば加水分解によって本発明に有用な化合物に迅速に変換する化合物を意味する。プロドラッグに関する詳細な解説は、Ｈｉｇｕｃｈｉら，Ｐｒｏｄｒｕｇｓ ａｓ Ｎｏｖｅｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，
Ｖｏｌ．１４，ｏｆ ｔｈｅ Ａ．Ｃ．Ｓ．Ｄ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ，ａｎｄ ｉｎ Ｒｏｃｈｅ（ｅｄ．），Ｂｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，１９８７に提供されている。
【００２３】
ほとんどの化学療法薬はがん細胞を破壊するために標的化される細胞毒性を有しているが、その過程で体の正常の生理系にもかなりの損傷を与える。従って、化学療法薬を固形腫瘍に選択的に送達するのは大きな利点があり、がん治療におけるこれらの悪影響を回避するのに役立つ。
【００２４】
腫瘍血管の血管構造は正常血管のそれと異なる。Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ ＆ Ｊａｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，４０７：２４９（２０００）。従って、腫瘍の血管反応性も正常組織のそれと異なる。例えば、一酸化窒素供与体、ニコチンアミド及びブラジキニンアゴニストの投与は腫瘍への血流を変調する。Ｊｏｒｄａｎら，Ｉｎｔ Ｊ Ｒａｄｉａｔ Ｏｎｃｏｌ Ｂｉｏｌ Ｐｈｙｓ，４８：５６５（２０００）；Ｆｕｋｕｍｕｒａら，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ，１５０：７１３（１９９７）；Ｈｉｒｓｔら，Ｂｒ Ｊ Ｒａｄｉｏｌ，６７：７９５（１９９４）。
【００２５】
エンドセリンは血流を変調する血管作用物質で、正常乳房組織と比べて乳がん組織中に高濃度に存在する（具体的には、エンドセリンは正常乳房組織中に約０．１２ｐｇ／ｍｇであるのに対して乳がん組織中には約１２ｐｇ／ｍｇの量で存在しうる）。Ｋｏｊｉｍａら，Ｓｕｒｇ Ｏｎｃｏｌ，４（６）：３０９（１９９５）；Ｋｕｒｂｅｌら，Ｍｅｄ Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ，５２（４）：３２９（１９９９）；Ｐａｔｅｌら，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，１２６（２）：１４３（１９９７）；Ｙａｍａｓｈｉｔａら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，５２（１４）：４０４６（１９９２）；Ｙａｍａｓｈｉｔａら，Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ Ｃｈｅｍ Ｐａｔｈｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，７４（３）：３６３（１９９１）。エンドセリンは２１個のアミノ酸を有する環状ペプチドのファミリーで、哺乳動物ではＥＴ−１、ＥＴ−２及びＥＴ−３の３個のアイソフォームを含む。Ｉｎｏｕｅら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６：２８６３（１９８９）；Ｙａｎａｇｉｓａｗａら，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：４１１（１９８８）。エンドセリンは、二つの異なる細胞表面受容体ＥＴＡ及びＥＴＢに結合することによって作用する。ＥＴＢ受容体は３個のペプチドアイソタイプと同じ親和性で結合する。これに対し、ＥＴＡ受容体は、他のアイソフォームよりもＥＴ−１に高親和性で結合する。どちらの受容体もＧタンパク質共役型受容体系に属し、増殖因子、血管作用性ポリペプチド、神経伝達物質及びホルモンなどの様々な刺激からの生物学的応答を媒介する。Ｍａｓａｋｉ，Ｊ
Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，３５：Ｓ３（２０００）；Ｇｕｌａｔｉ，Ｐｒｅｆａｃｅ．Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ，４０：１２９（２０００）；Ｇｕｌａｔｉら，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２７３：Ｈ８２７（１９９７）；Ｌｅｖｉｎ，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，３３３：３５６（１９９５）。本発明の焦点であるＥＴＢ受容体は、内皮細胞（ＥＣ）及び血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）の両方に存在し、正常乳房組織と比較した場合に乳がん組織（ヒトの浸潤性乳がん組織中でも腺管及び小葉乳がん組織中でも）で増加している。Ｗｕｌｆｉｎｇら，Ｏｎｃｏｌ Ｒｅｐ，１１：７９１（２００４）；Ｗｕｌｆｉｎｇら，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，９：４１２５（２００３）；Ａｌａｎｅｎら，Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，３６（２）：１６１（２０００）。エンドセリンはＥＴＢ受容体に作用して血管拡張を起こし、乳房腫瘍組織への血流を増大する。ＥＣ上に多く見られるＥＴＢ受容体は、プロスタサイクリン及び一酸化窒素のような因子の放出によって血管拡張を起こす。ｄｅ Ｎｕｃｃｉら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，８５：９７９７（１９８８）。ＥＴ−１はＥＴＢ受容体を刺激することによって腫瘍への血流増加を起こすので、ＥＴＢ受容体アゴニストを使
えば腫瘍への血液供給を選択的に増加させることができる。こうして化学療法薬の標的化送達とその結果の効能が増大する。
【００２６】
ＥＴＢ受容体は、例えば、卵巣がん、筋線維芽細胞、カポジ肉腫と腫瘍内血管、乳がん及び黒色腫（これらに限定されない）中に示されている。Ｂａｇｎａｔｏら，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ，１５８：８４１（２００１）；Ａｌａｎｅｎら，Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，３６（２）：１６１（２０００）；Ｂａｇｎａｔｏら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，５９：７２０（１９９９）；Ｋｉｋｕｃｈｉら，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍ，２１９：７３４（１９９６）。従って、化学療法薬と組み合わせたＥＴＢ受容体アゴニストの投与は、卵巣がん、結腸がん、カポジ肉腫、乳がん、及び黒色腫（これらに限定されない）を含む固形腫瘍の治療に貢献するのに使用できる。
【００２７】
本発明に従って有用なＥＴＢアゴニストは、ＥＴ−１、ＥＴ−２、ＥＴ−３、ＢＱ３０２０、ＩＲＬ１６２０（Ｎ−ｓｕｃ−［Ｇｌｕ９，Ａｌａ１１，１５］ＥＴ−１（８−２１））、サラホトキシン５６ｃ、［Ａｌａ１，３，１１，１５］ＥＴ−１、及びそれらの混合物などであるが、これらに限定されない。［Ａｌａ１，３，１１，１５］ＥＴ−１はＥＴ−１の線形類似体で、Ｃｙｓ残基がＡｌａで置換されることによってジスルフィドブリッジが除去されている。Ｓａｅｋｉら，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，１７９：２８６（１９９１）。ＢＱ３０２０及びＩＲＬ１６２０は、ＥＴ−１の切断（トランケート）線形合成類似体で、最も広く使用されている選択的合成アゴニストである。ＩＲＬ１６２０は線形ＥＴ−類似体で、その構造はＥＴ−１のカルボキシ末端を基にしており、ＥＴＢ受容体に対して１２０，０００倍の選択性を有する。Ｏｋａｄａ ＆ Ｎｉｓｈｉｋｉｂｅ，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｄｒｕｇ Ｒｅｖ，２０：５３（２００２）；Ｄｏｕｇｌａｓら， Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，１１４：１５２９（１９９５）。ＩＲＬ１６２０は高選択的及び強力なＥＴＢアゴニストで、ＥＴＢ２サブタイプよりもＥＴＢ１受容体サブタイプに対する選択性の証拠が報告されている。Ｂｒｏｏｋｓら，Ｊ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２６ Ｓｕｐｐｌ ３：Ｓ３２２（１９９５）。
【００２８】
本発明に従って有用な化学療法薬は、例えば、アルキル化薬、代謝拮抗物質、ホルモン及びそのアンタゴニスト、放射性同位体、抗体、並びに天然産物、そしてそれらの混合物などであるが、これらに限定されない。例えば、ＥＴＢアゴニストは、ドキソルビシン及びその他のアントラサイクリン類似体のような抗生物質、シクロホスファミド（これに限定されない）のようなナイトロジェンマスタード、５−フルオロウラシル（これに限定されない）のようなピリミジン類似体、シスプラチン、ヒドロキシウレア、並びにその天然及び合成誘導体などと共に投与することができる。別の例として、腫瘍がゴナドトロピン依存性及びゴナドトロピン非依存性細胞を含む乳腺腺がんのような混合腫瘍の場合、ＥＴＢアゴニストはロイプロリド又はゴセレリン（ＬＨ−ＲＨの合成ペプチド類似体）（これらに限定されない）と組み合わせて投与できる。本発明と共に使用できる追加の非制限的化学療法薬の例は、アドリアマイシン、カンプトテシン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、インターフェロン（アルファ、ベータ及び／又はガンマ）、インターロイキン２、イリノテカン、ドセタキセル、パクリタキセル、トポテカン、並びにそれらの治療上有効な類似体及び誘導体などである。
【００２９】
本発明の一態様において、エンドセリンアゴニストは化学療法薬と組み合わせて固形腫瘍の治療に貢献するために使用される。本方法において、エンドセリンアゴニスト、とりわけＥＴＢアゴニストは、ＥＴＢ受容体に富む腫瘍への血流を増大する。従って、ＥＴＢアゴニストは、化学療法薬のためにより選択的な標的を提供し、薬剤の化学療法的効果を改良する。
【００３０】
エンドセリンアゴニストはＥＴＢ受容体を刺激して腫瘍血管を拡張し、それによって腫瘍への血流とその結果の化学療法薬の送達の増加をもたらすことは理論化されているが、ここではそれに頼らない。エンドセリンアゴニストによって起こる腫瘍の血液潅流の増加は組織の酸素化も増大させる。酸素化の改良は化学療法薬の治療作用を増強できる。エンドセリンは分裂誘発性も有しうる。エンドセリンの分裂促進作用は、一緒に投与された場合、化学療法薬の作用を増大するのにも役立ちうる。エンドセリンアゴニストの分裂促進作用は、化学療法薬の分裂細胞への取込みを改良することによって化学療法薬の作用を高めることができる。従って化学療法薬の効能が高まる。
【００３１】
がんの治療において化学療法は手術の補助として指示されることが多い。補助療法としての化学療法の目標は、原発腫瘍がコントロールされている場合の再発リスクの削減及び無病生存率の増大である。化学療法はがんの補助治療として、該疾患が転移性の場合に利用されることが多い。従って、ＥＴＢアゴニストは、固形腫瘍の治療において手術の前又は後に化学療法と組み合わせると特に有用である。
【実施例】
【００３２】
実施例１．乳房腫瘍潅流に及ぼすＩＲＬ１６２０とパクリタキセルの影響
方法
正常及び乳房腫瘍ラットにおけるＥＴ−１の全身血行動態及び局所循環効果を調べるために以下の試験を実施した。
【００３３】
一つの広く研究されている乳房腫瘍モデルは、化学誘導されたラット乳がん発生モデルである。ｖａｎ Ｚｗｉｅｔｅｎ，Ｔｈｅ ｒａｔ ａｓ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｍａｒｔｉｎｕｓ Ｎｉｊｈｏｆｆ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ｐｇ．２０６（１９８４）；Ｄａｏら，Ｊ
Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ，７１：２０１（１９８３）；Ｒｕｓｓｏら，Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ，６１：１４３９（１９７８）．Ｈｕｇｇｉｎｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１３７（１９６２）；Ｈｕｇｇｉｎｓら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，４５：１２９４（１９５９）。ラットに化学誘導された乳房腫瘍発生はヒトのがんを最も良く近似するモデルである。Ｒｕｓｓｏら，Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ，６２：２４４（１９９０）。組織構造に関してラットの乳腺はヒト女性のそれに似ている。それは乳腺管及び乳腺胞を覆う上皮と、この器官の骨格となる結合組織である間質によって形成されている。これら二つのコンパートメントは胎児発育期及び成熟期を通して連続的に相互作用している。従って、この自発性実験モデルが、ヒトがんを最もよく近似するので本試験のモデルとして選ばれた。同上。
【００３４】
化学誘導されたラットの乳がん発生は典型的には、７，１２−ジメチルベンゼン（ａ）アントラセン（ＤＭＢＡ）又はＮ−メチルニトロソウレア（ＭＮＵ）の投与によって達成される。Ｒｏｇｅｒｓら，Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｍａｍｍａｒｙ ｇｌａｎｄ ｔｕｍｏｒｓ ｉｎ ｒａｔｓ：ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ｄｉｅｔａｒｙ ｆａｔ．Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ２５５（１９９６）。ＤＭＢＡ又はＭＮＵによって誘導された腫瘍は異なる形態学的特徴を有している。特に、ＭＮＵによって誘導された腫瘍は乳房により限局し転移しにくい。Ｍａｃｅｊｏｖａら，Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｇｕｌ，３５：５３（２００１）。従って、ＭＮＵがラットに乳房腫瘍を特異的に誘導するための化学薬剤として選ばれることが多い。これらの乳房腫瘍は、線維腺腫及び乳頭腫で良性のことも、悪性のこともある。ｖａｎ Ｚｗｉｅｔｅｎ，Ｔｈｅ ｒａｔ ａｓ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｍａｒｔｉｎｕｓ Ｎｉｊｈｏｆｆ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ｐｇ．２０６（１９８４）。ラットは６対の乳腺を有し、１対は頸部、２対は胸部、１対は腹部、そして２対は鼠径部にある。同上；Ａｓｔｗｏｏｄら，Ａｍ Ｊ Ａｎａｔ，６１（１９３７）。ＭＮＵで処置したバージンラットは腹部よりも胸部に多く
の腫瘍を発生する。Ｒｕｓｓｏら，Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ，５７：１１２（１９８７）。
【００３５】
方法
１８０〜２００グラム（ｇ）の雌のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（Ｈａｒｌａｎ Ｃｏ．，ウィスコンシン州マジソン）を使用した。温度管理室（２３±１℃）、湿度（５０±１０％）、人工光（０６：００〜１８：００）下で全動物を一つのケージに３匹ずつ収容した。動物には餌と水を自由に与えた。実験は動物を少なくとも４日間環境に慣らした後で実施した。
【００３６】
Ｎ−メチルニトロソウレア（ＭＮＵ）はＡｓｈ Ｓｔｅｖｅｎｓ Ｉｎｃ．（ミシガン州デトロイト）から購入した。ＩＲＬ１６２０とエンドセリン−１（ＥＴ−１）はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｉｎｃ．（カリフォルニア州サニーベール）から入手した。ＥＴ−１を０．１％アルブミンに溶解した。
【００３７】
ＭＮＵ（５０ｍｇ／ｋｇ）又は生理食塩水（１ｍｌ／ｋｇ）を雌のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットに腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。腫瘍が直径２〜４ｃｍに達した後、血流実験を実施した。
【００３８】
ラットをウレタン（１．５ｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ミズーリ州セントルイス）で麻酔し、薬物投与のため左大腿静脈にカニューレを挿入した（ＰＥ ５０管、Ｃｌａｙ Ａｄａｍｓ，ニュージャージー州パーシパニー）。
【００３９】
動物を以下の群に分けた。
（ｉ）正常ラットに生理食塩水注射、１５分後にパクリタキセル（３ｍｇ／ｋｇ）（Ｎ＝４）；
（ii）正常ラットにＩＲＬ１６２０（３ｎｍｏｌ／ｋｇ）注射、１５分後にパクリタキセル（３ｍｇ／ｋｇ）（Ｎ＝４）；
（iii）腫瘍ラットに生理食塩水注射、１５分後にパクリタキセル（３ｍｇ／ｋｇ）（
Ｎ＝４）；及び
（iv）腫瘍ラットにＩＲＬ１６２０（３ｎｍｏｌ／ｋｇ）注射、１５分後にパクリタキセル（３ｍｇ／ｋｇ）（Ｎ＝４）。
【００４０】
ラットの乳腺への血液潅流はレーザードップラー流量計を用いて測定した。Ｓｏｎｇら，Ｉｎｔ Ｊ Ｒａｄｉａｔ Ｏｎｃｏｌ Ｂｉｏｌ Ｐｈｙｓ，１８：９０３（１９９０）；Ｓｏｎｇら，Ｉｎｔ Ｊ Ｒａｄｉａｔ Ｏｎｃｏｌ Ｂｉｏｌ Ｐｈｙｓ，１７：１０４１（１９８９）参照。この過程で動物の乳頭周辺を剃毛し、乳腺周辺の皮膚を切開した。標準モデルの光ファイバープローブを乳腺動脈に固定し、Ｐｅｒｉｆｌｕｘ ＰＦ２ｂ ４０００レーザードップラー流量計（Ｐｅｒｉｍｅｄ ＫＢ，スウェーデン、ストックホルム）に接続した。時定数を１．５秒にセットし、帯域幅を４ＫＨｚにセットした。データは分散分析（ＡＮＯＶＡ）、次いでダンカン検定を用いて分析した。ｐ＜０．０５の水準を有意とみなした。
【００４１】
結果
正常ラットの乳房組織への血流に、生理食塩水又はＩＲＬ１６２０及びパクリタキセルの投与後、変化は観察されなかった。腫瘍組織中の血流はＩＲＬ１６２０注射後（３６．３％、ｐ＜０．０５）及びパクリタキセル投与後（５１．９％、ｐ＜０．０−５）、ベースラインとの間に有意の差が観察された（図１参照）。
【００４２】
実施例２．正常及び腫瘍ラットの全身血行動態及び乳房組織への血流に及ぼすＥＴ−１注入の影響
方法
ＭＮＵ及び生理食塩水処置は腹腔内注射として試験の３ヶ月前に実施した。ラットは処置の４週間後から定期的に触診し始めた。腫瘍の直径が４〜８ｍｍに達したら実験を開始した。
【００４３】
ラットをウレタン（１．５ｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ミズーリ州セントルイス）で麻酔した。すべての術域を剃毛し、アルコール消毒綿で清拭した。薬物投与のため左大腿静脈にカニューレを挿入した（ＰＥ ５０管、Ｃｌａｙ Ａｄａｍｓ，ニュージャージー州パーシパニー）。左大腿動脈にもカニューレを挿入し（ＰＥ ５０管）、回収ポンプ（Ｍｏｄｅｌ ２２，Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ，マサチューセッツ州サウスナティック）を用いて微小球試験の参照血液サンプルの回収に使用した。右大腿動脈にカニューレを挿入し（ＰＥ ５０管）、Ｇｒａｓｓ Ｐ７Ｄ ポリグラフ（Ｇｒａｓｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．，マサチューセッツ州クインシー，ＵＳＡ）上で血圧を記録するため、７ＰＩ前置増幅器を通してＧｏｕｌｄ Ｐ２３ ＩＤ圧力トランスデューサに接続した。心拍数（ＨＲ）は血圧信号で始動する７Ｐ４Ｂ Ｇｒａｓｓタコグラフ（Ｇｒａｓｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．，マサチューセッツ州クインシー）を通じて記録した。右頸動脈を露出し、ＰＥ ５０管を総頸動脈から左心室に導入した。左心室内にカニューレがあるかどうかは、Ｓｔａｔｈａｍ Ｐ２３ ＤＣ圧力トランスデューサ（Ｇｒａｓｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．，マサチューセッツ州クインシー）を用いてＧｒａｓｓポリグラフ上に血圧を記録することによって確認した。カニューレが左心室に到達している場合、拡張期血圧はゼロに降下する。血中ｐＯ２、ｐＣＯ２、及びｐＨを一定に維持するため、そして血圧及びＨＲに対する呼吸の影響を回避するため、動物は齧歯類用人工呼吸器（Ｍｏｄｅｌ ６８３，Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ Ｉｎｃ．，マサチューセッツ州サウスナティック）に接続された気管内カニューレの挿入によって定速人工呼吸の状態にした。
【００４４】
ラットを最初に２群に分け、それぞれ以下の処置の一つを受けさせた。
（ｉ）生理食塩水で処置されたラットに３０分間ＥＴ−１（５０ｎｇ／ｋｇ／分）注入（Ｎ＝６）；及び
（ii）ＭＮＵ（５０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）で処置されたラットに３０分間ＥＴ−１（５０ｎｇ／ｋｇ／分）注入（Ｎ＝６）。
【００４５】
次に、ＥＴ−１注入によって誘導される、正常ラット及び乳房腫瘍ラットの全身血行動態及び乳房組織への血流における変化に対するＥＴＢ受容体の役割を評価するために以下の群について試験した。
【００４６】
（ｉ）生理食塩水処置ラットに、ＢＱ７８８（（Ｎ−シス２，６−ジメチルピペリジノカルボニル−Ｌ−ガンマ−メチル−ロイシル−Ｄ−１−メトキシカルボニルトリプトファニル−Ｄ−Ｎｌｅ）；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｉｎｃ．（カリフォルニア州サニーベール）から入手、生理食塩水に０．５ｐｍｏｌ／ｋｇで溶解））を２０分間注入、次いでＥＴ−１（５０ｎｇ／ｋｇ／分）を３０分間注入（Ｎ＝５）；
（ii）ＭＮＵ（５０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）処置ラットに、ＢＱ７８８（０．５ｐｍｏｌ／ｋｇ）を２０分間注入、次いでＥＴ−１（５０ｎｇ／ｋｇ／分）を３０分間注入（Ｎ＝５）。
【００４７】
全身血行動態と局所循環パラメータは、ベースライン、ＥＴ−１（５０ｎｇ／ｋｇ／分）注入開始後３０、６０、及び１２０分の時点で測定した。ＥＴ−１の注入は３０分間行われるので、３０分のデータはＥＴ−１の効果を示し、６０及び１２０分のデータはＥＴ−１効果の持続時間を示す。
【００４８】
全身血行動態と局所血液循環は文献に記載の手順を用いて測定した。Ｇｕｌａｔｉら，Ｊ Ｌａｂ Ｃｌｉｎ Ｍｅｄ，１２６：５５９（１９９５）；Ｇｕｌａｔｉら，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．，５５：８２７（１９９４）；Ｓｈａｒｍａら，Ａｒｔｉｆ Ｃｅｌｌｓ Ｂｌｏｏｄ Ｓｕｂｓｔｉｔ Ｉｍｍｏｂｉｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２２：５９３（１９９４）参照。各測定で、４６Ｓｃ（スカンジウム）、１１３Ｓｎ（スズ）、１４１Ｃｅ（セリウム）、又は９５Ｎｂ（ニオブ）で標識した約１００，０００個の微小球（直径１５±１μｍ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，マサチューセッツ州ボストン，ＵＳＡ）の０．２ｍｌ生理食塩水中完全混合懸濁液を左心室に注射し、１５秒間かけて０．３ｍｌの生理食塩水で洗い流した。血流を計算するために、動脈血を右大腿動脈から０．５ｍｌ／分の速度で回収した。血液の回収は、微小球注射の約５〜１０秒前に開始し、９０秒間実施した。実験終了時、ペントバルビタールナトリウムを過剰投与して動物を犠死させた。全組織及び器官を切離し、重量測定し、バイアルに入れた。標準、血液サンプル、及び組織サンプル中の放射能を、同位体エネルギーを区別するプリセットウィンドウ付きＰａｃｋａｒｄ Ｍｉｎａｘｉ Ａｕｔｏ−Ｇａｍｍａ ５０００シリーズのガンマカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｃｏ．，イリノイ州ダウナーズグローブ）でカウントした。下記のパラメータを計算した。（１）心拍出量（ＣＯ）（（注射した放射能×動脈血の回収速度）／採取した動脈血中の放射能）、（２）１回拍出量（ＳＶ）（ＣＯ／ＨＲ）、（３）全末梢血管抵抗（ＴＰＲ）（平均動脈圧（ＭＡＰ）／ＣＯ）、（４）局所血流量（（組織中の放射能×動脈血の回収速度）／採取した動脈血中の放射能）、及び（５）局所血管抵抗（ＭＡＰ／局所血流量）。データは文献に記載のコンピュータプログラムを用いて計算した。Ｓａｘｅｎａら，Ｃｏｍｐｕｔ Ｐｒｏｇｒａｍｓ Ｂｉｏｍｅｄ，１２：６３（１９８０）。
【００４９】
ラットの乳腺への血液潅流はレーザードップラー流量計を用いて測定した。Ｓｏｎｇら，Ｉｎｔ Ｊ Ｒａｄｉａｔ Ｏｎｃｏｌ Ｂｉｏｌ Ｐｈｙｓ，１８：９０３（１９９０）；Ｓｏｎｇら，Ｉｎｔ Ｊ Ｒａｄｉａｔ Ｏｎｃｏｌ Ｂｉｏｌ Ｐｈｙｓ，１７：１０４１（１９８９）参照。動物の乳頭周辺を剃毛した。乳腺周辺の皮膚を幅約６ｃｍ及び長さ約４ｃｍの断片(lambeau)として切離した。標準モデルの光ファイバープローブ
を断片表面に当て、両面接着テープで組織に固定した。断片を金属ホルダーに入れ、動きを防止するためにテープで貼り付けた後、Ｐｅｒｉｆｌｕｘ ＰＦ２ｂ ４０００レーザードップラー流量計（Ｐｅｒｉｍｅｄ ＫＢ，スウェーデン、ストックホルム）に接続した。時定数を１．５秒にセットし、帯域幅を４ＫＨｚにセットした。データは分散分析、次いでダンカン検定を用いて分析した。ｐ＜０．０５の水準を有意とみなした。
【００５０】
結果
正常（生理食塩水処置）ラットにおけるベースラインの全身血行動態のパラメータは、ＭＡＰ：１１１．１±４．８ｍｍＨｇ；ＣＯ：２６８．６±１７．６ｍｌ／分；ＳＶ：０．８７±０．０６ｍｌ；ＴＰＲ：４１９．６±．２４．３７ｍｍＨｇ．分／ｍｌ；及びＨＲ：３１２．５±２０．２拍／分。正常ラットでは、ＭＡＰの有意の増加がＥＴ−１注入後３０分時点（１４．５％；ｐ＜０．０５）、及び減少が１２０分時点（１７．８％；ｐ＜０．０５）で観察された。ＴＰＲは１２０分時点で増加した（４９．２％；ｐ＜０．０５）。ＣＯはＥＴ−１注入後６０及び１２０分時点で減少した（それぞれ２２．９％及び４２．５％；ｐ＜０．０５）。ＳＶは６０及び１２０分時点で減少した（それぞれ２０．９％及び３６％；ｐ＜０．０５）。ＨＲには有意の変化は観察されなかった（図２Ａ〜２Ｅ）。
【００５１】
腫瘍（ＭＮＵ処置）ラットにおけるベースラインの全身血行動態のパラメータは正常ラットのそれと類似していた。腫瘍ラットでは、ＭＡＰの有意の増加がＥＴ−１注入後３０分時点（１９．１％；ｐ＜０．０５）及び６０分時点（１５．３％；ｐ＜０．０５）で観
察された。ＴＲＦはＥＴ−１の投与後３０分時点（７３．９％；ｐ＜０．０５）、６０分時点（３９．７％；ｐ＜０．０５）、及び１２０分時点（７１．４％；ｐ＜０．０５）で増加した。ＣＯは３０、６０及び１２０分時点で減少した（それぞれ２９．４％、１６．７％及び３６．１％；ｐ＜０．０５）。ＳＶは３０、６０及び１２０分時点で有意に減少した（それぞれ３１．１％、１７．９％及び３２．１％；ｐ＜０．０５）。ＨＲには変化は観察されなかった（図２Ａ〜２Ｅ）。
【００５２】
ＥＴ−１投与後、正常の生理食塩水処置ラットの乳房組織への血流に変化は観察されなかった。正常ラットの乳房組織では、６０分時点で血管抵抗に有意の減少（１８．６１％；ｐ＜０．０５）が観察された。これはＥＴ−１注入後３０分のことである（図３Ａ〜３Ｂ）。
【００５３】
腫瘍（ＭＮＵ処置）ラット及び正常（生理食塩水処置）ラットの乳房組織における血流及び局所血管抵抗の間に有意の差が観察された。正常ラットと比べた場合に腫瘍ラットの乳房組織への血流に有意の増加（１５３％；ｐ＜０．０５）がＥＴ−１投与後６０分時点で観察された。腫瘍ラットの血管抵抗は、正常ラットと比べて、ベースライン（１０２％；ｐ＜０．０５）及びＥＴ−１投与後６０分時点（１４７％；ｐ＜０．０５）で有意に異なっていた（図３Ａ〜３Ｂ）。
【００５４】
図４Ａ〜４Ｃは、腫瘍及び正常ラットの乳房組織における潅流、移動血球の濃度（ＣＭＢＣ）、及び赤血球（ＲＢＣ）の速度の変化を示す。ＥＴ−１投与後正常ラットの乳房組織中の血液潅流は変化しなかった。ＥＴ−１投与後３０分時点における腫瘍ラットの乳房組織中の潅流は、正常ラットと比べて有意に増加した（１７６％；ｐ＜０．０５）。腫瘍ラットにおけるこの潅流の増加はＥＴ−１投与後６０及び１２０分時点でベースラインに戻った。
【００５５】
腫瘍ラットのＣＭＢＣは、ＥＴ−１投与後６０分時点で正常ラットと比べて有意に増加した（５４％；ｐ＜０．０５）。ＣＭＢＣはＥＴ−１投与後１２０分時点でベースラインに戻った。ＲＢＣの速度はＥＴ−１投与後３０分時点で正常ラットと比べて有意に増加した（２５２％；ｐ＜０．０５）。ＥＴ−１投与２時間（１２０分）後に腫瘍ラットのＲＢＣの速度はベースラインに戻った（図４Ａ〜４Ｃ）。
【００５６】
図５Ａ〜５Ｃは、それぞれ腫瘍及び正常ラットの血液潅流、ＣＭＢＣ、及びＲＢＣの速度における、ＥＴ−１が誘導する変化に及ぼすＢＱ７８８の影響を示す。正常ラットの乳房組織中の血液潅流はＢＱ７８８投与又はＥＴ−１注入後も有意に変化しなかった。しかしながら、腫瘍ラットの乳房腫瘍組織中の潅流は、ＢＱ７８８前処置ラットでＥＴ−１注入後３０分時点（２５．２５．±．５．７％；ｐ＜０．０５）及び６０分時点（２５．１７．±．５．７％；ｐ＜０．０５）で有意に減少した。ＢＱ７８８による前処置は、腫瘍ラットでＥＴ−１によって誘導される潅流の増加を減弱した。ＢＱ７８８前処置ラットではＥＴ−１投与後、腫瘍ラットと正常ラットの乳房組織中の潅流の間に差は観察されなかった。
【００５７】
腫瘍ラットのベースラインＣＭＢＣは正常ラットの乳房組織のベースラインＣＭＢＣより有意に高かった（４２．２％；ｐ＜０．０５）。しかしながらＢＱ７８８注入後は腫瘍及び正常ラットのＣＭＢＣ間に差は観察されなかった。さらにこの２群間にはＲＢＣの速度の差も観察されなかった（図５Ａ〜５Ｃ）。
【００５８】
上記試験は、生理食塩水処置及びＭＮＵ処置腫瘍ラットの全身血行動態及び乳房組織への血流に及ぼすＥＴ−１の影響を示している。ＥＴ−１はＶＥＧＦの産生を促進することによって血管新生を刺激することが知られている。ＥＴ−１は多くのがん組織で増加して
いることが研究によって示されている。例えば、乳がん（Ｙａｍａｓｈｉｔａら，Ｒｅｓ
Ｃｏｍｍｕｎ Ｃｈｅｍ Ｐａｔｈｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，７４：３６３（１９９１））、乳房葉状腫瘍（Ｙａｍａｓｈｉｔａら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，５２：４０４６（１９９２））、前立腺がん（Ｎｅｌｓｏｎら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，５６：６６３（１９９６））、肝がん（Ｋａｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２１６：５１４（１９９５））、及び一部の髄膜腫（Ｐａｇｏｔｔｏら，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，９６：２０１７（１９９５））などのがん組織である。上記試験は、乳房腫瘍でＥＴ−１が誘導する血管応答の変化を示している。これらの試験で使用された方法は、全身血行動態及び局所血液循環を調べるためのよく確立された放射性微小球技術であった。Ｇｕｌａｔｉら，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２７３：Ｈ８２７（１９９７）；Ｇｕｌａｔｉら，Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ，２４：１３７（１９９６）；Ｇｕｌａｔｉら，Ｊ Ｌａｂ Ｃｌｉｎ Ｍｅｄ，１２６：５５９（１９９５）；Ｇｕｌａｔｉら，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ，５５：８２７（１９９４）。
【００５９】
腫瘍ラットの乳房腫瘍組織へのベースライン血流は正常動物の血流より高かった。これは以前の研究で観察され、腫瘍における新規血管の動員によるものであると理論化されている（それに頼らない）。Ｖａｕｐｅｌ，Ｂｌｏｏｄ ｆｌｏｗ，ｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ，ｔｉｓｓｕｅ ｐＨ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ，ａｎｄ ｂｉｏｅｎｅｒｇｅｔｉｃ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒｓ．Ｅｒｎｓｔ Ｓｃｈｅｒｉｎｇ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｌｅｃｔｕｒｅ ２３，Ｂｅｒｌｉｎ（１９９４）。ＥＴ−１投与後の乳房腫瘍への血流は、正常ラットの乳房組織で観察されるものと比べて有意に増加した。乳房腫瘍への血液潅流の増加を示すレーザードップラー流量測定から、ＥＴ−１投与後乳房腫瘍組織で観察された血流増加が確認された。血液潅流の増加は、ＲＢＣの速度又はＣＭＢＣのいずれか、又はその両方の増加によるものであると理論化されている（それに頼らない）。ＥＴ−１注入の終了時、ＲＢＣの速度の増加が観察されたが、ＣＭＢＣの増加はＥＴ−１注入の３０分後に観察された。
【００６０】
さらに、ＥＴ−１に応答して観察された血流の増加は、ＥＴＢが媒介する血管拡張によるものであると理論化されている（それに頼らない）。研究によれば、ＥＴ−１及びＥＴＢ受容体の発現は乳がん組織で増大していることが示されている。Ａｌａｎｅｎら，Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，３６：１６１（２０００）；Ｙａｍａｓｈｉｔａら，Ｒｅｓ
Ｃｏｍｍｕｎ Ｃｈｅｍ Ｐａｔｈｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，７４：３６３（１９９１）。本発明よれば、ＢＱ７８８の投与はＥＴ−１が誘導する腫瘍組織への血流の増加を阻止することがわかった。ＢＱ７８８（すなわち、Ｎ−シス−２，６−ジメチルピペリジノカルボニル−Ｌ−ガンマ−メチル−ロイシル−Ｄ−１−メトキシカルボニルトリプトファニル−Ｄ−Ｎｌｅ）は、特異的なＥＴＢ受容体アンタゴニストである。ＢＱ７８８はＥＴＢ受容体への結合を１．２ｎＭのＩＣ５０値で阻害する。
【００６１】
ＢＱ７８８は、乳房腫瘍でＥＴ−１が誘導する血管拡張におけるＥＴＢ受容体の役割を決定するのに使用された。この結果から、ＥＴ−１が誘導する血管拡張応答はＥＴＢ受容体を通して媒介されることが示唆される。ＥＴＢ受容体の発現は、平滑筋細胞よりも内皮細胞で高く、様々な増殖因子及びサイトカインによって調節されている。Ｓｍｉｔｈら，Ｊ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，３１：Ｓ１５８（１９９８）。正常乳房組織はＥＴＡ受容体よりもＥＴＢ受容体を高濃度に有しており（Ａｌａｎｅｎら，Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，３６：１６１（２０００））、乳がん時にはＥＴＢ受容体が過剰発現して腫瘍組織への血流維持に貢献していると理論化されている（それに頼らない）。
【００６２】
まとめると、記載した実験は、ＥＴ−１の注入は乳房腫瘍組織における血流の増加と血管抵抗の減少を起こし、そしてこの血流の増加はＥＴＢ受容体アンタゴニストによって阻
止できることを示している。
【００６３】
実施例３．腫瘍の血液潅流及び化学療法薬送達に及ぼすＩＲＬ１６２０の影響
前の実験で、乳房腫瘍ラットへのＥＴ−１投与は、ＥＴＢ受容体の刺激によって腫瘍組織への血流を選択的に増大することが示された。この実施例で記載する実験は、ＥＴＢ受容体アゴニストのＩＲＬ１６２０が乳房腫瘍及び黒色腫の潅流に及ぼす影響と腫瘍及びその他の主要器官におけるパクリタキセル蓄積に及ぼす影響を調べるために実施する。
【００６４】
方法
Ｎ−メチルニトロソウレア（ＭＮＵ；５０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）によってバージン雌Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（４８日齢）に乳房腫瘍を誘導する。腫瘍体積が３００〜５００ｍｍ３のラットを前述のようにウレタンで麻酔し（１．５ｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）、生理食塩水（０．３ｍｌ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）又はＩＲＬ１６２０（３ｎｍｏｌ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）で処置した。腫瘍の潅流は前述のようにＰｅｒｉｆｌｕｘ ＰＦ２ｂ ４０００レーザードップラー流量計を用いて１０時間測定する。第二の試験で、ヌードマウスに１００万個のヒト黒色腫細胞（ＵＩＳＯ−ＭＥＬ−２）を皮下接種する。腫瘍体積が３００〜５００ｍｍ３のマウスを前述のように生理食塩水又はＩＲＬ１６２０で処置し、潅流を前述のように３時間測定する。実験は、高められた潅流が腫瘍組織におけるパクリタキセルの蓄積を増加するかどうかを調べるためにも実施する。［３Ｈ］−パクリタキセル（１０μＣｉ／マウス）を黒色腫マウスに、ＩＲＬ１６２０又は生理食塩水の１５分後に投与する。動物は［３Ｈ］−パクリタキセル投与３時間後に犠死させる。腫瘍及び主要器官を切離、秤量、そして組織溶解剤に溶解し、放射能を当業者に周知の技術によって測定する。具体的には、血漿サンプル中の［３Ｈ］−パクリタキセルの濃度をＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ液体シンチレーションカウンター（モデルＬＳ ６５００）を用いて測定する。血漿は解凍して２０ｍＬの液体シンチレーションカクテルと混合する。サンプルをカウントする。カウントは次式を用いて“ｄｐｍ”の単位から“ｆｍｏｌ／ｍＬ”に換算する。
【００６５】
ｆｍｏｌ／ｍＬ＝ｄｐｍ値×崩壊因子×２．２×１０−１２／１０−１２×サンプル体積ｍＬ
【００６６】
結果
ＩＲＬ１６２０は、乳房腫瘍ラット及び黒色腫マウスの腫瘍潅流を有意に増加する。ＩＲＬ１６２０の投与は、乳房腫瘍及び黒色腫動物の腫瘍潅流にそれぞれ１５０％及び３１８％の増加をもたらす。ＩＲＬ１６２０で処置したマウスでは生理食塩水処置マウスと比べて腫瘍中のパクリタキセル濃度に７３０％の増加が見られる。しかしながら、ＩＲＬ１６２０は他の主要器官中のパクリタキセル濃度を有意に増大しない。結果を図６に示す。
【００６７】
実施例４．パクリタキセルの薬物動態に及ぼすＩＲＬ１６２０の影響
体内の血流動態の変更は治療薬の薬物動態に著しく影響を及ぼすことができる。パクリタキセルは複雑な薬物動態性を持つことが知られている。例えば、Ｓｐａｒｒｅｂｏｏｍら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５６：２１１２（１９９６ａ）；Ｇｉａｎｎｉら，Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ ８７：１１６９（１９９５ｂ）；Ｓｏｎｎｉｃｈｓｅｎ
＆ Ｒｅｌｌｉｎｇ，Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ ２７：２５６（１９９４）；Ｈｕｉｚｉｎｇら，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ １１：２１２７（１９９３）；Ｂｒｏｗｎら，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ９： １２６１（１９９１）；Ｌｏｎｇｎｅｃｋｅｒら，Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ Ｒｅｐ ７１：５３（１９８７）；Ｗｉｅｍｉｋら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ４７：２４８６（１９８７ｂ）参照。そこで、パクリタキセルの血漿中薬物動態に及ぼすＩＲＬ１６２０の影響を理解することが重要となる。従って、本試験は、選択的ＥＴＢ受容体アゴニストのＩＲＬ１６２０が乳房腫瘍ラットでパクリタ
キセルの薬物動態を変更するかどうかを調べるために実施した。
【００６８】
方法
ＩＲＬ１６２０はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州セントルイス）から購入した。パクリタキセル（６ ｍｇ／ｍＬ溶液）はＢｅｎ Ｖｅｎｕｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．（オハイオ州ベッドフォード）から購入した。ケタミン及びキシラジンはＰｈｏｅｎｉｘ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．（ミズーリ州セントジョーゼフ）から購入した。［３Ｈ］−パクリタキセル（ｌｍＣｉ，６．４Ｃｉ／ｍｍｏｌ，比活性）はＭｏｒａｖｅｋ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｏｒａｖｅｋ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，カリフォルニア州）から購入した。ウレタンはＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ミズーリ州セントルイス）から購入した。
【００６９】
バージン雌Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（Ｈａｒｌａｎ Ｃｏ．，ウィスコンシン州マジソン）、４８日齢（１２０〜１４０ｇ）をこの試験に使用した。到着後、管理された温度（２３±１℃）、湿度（５０±１０％）及び人工光（０６：００〜１８：００）の部屋で全ラットを一つのケージに３匹ずつ収容した。ラットには餌と水を自由に与えた。実験はラットを少なくとも４日間環境に慣らした上でのみ実施した。
【００７０】
Ｎ−メチル−ｎ−ニトロソウレア（ＭＮＵ）を５０ｍｇ／ｋｇの用量でｉ．ｐ．投与し、週２回ラットを触診した。腫瘍が７５〜１００ｍｍ３に達したら薬物動態試験を実施した。
【００７１】
ＨＰＬＣ−ＵＶ試験．ウレタン（１．５ｍｇ／ｋｇ）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ミズーリ州セントルイス）の１回ｉ．ｐ．注射でラットを麻酔した。右大腿部を剃毛し、外科用消毒薬及びアルコールで清拭した。右大腿動脈及び静脈を露出し、無菌ＰＥ−５０管を挿入した。頸部を剃毛し、外科用消毒薬及びアルコールで清拭した。頸部付近を正中切開し、気管挿管して齧歯類用人工呼吸器（Ｍｏｄｅｌ ６８３，Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ Ｉｎｃ．，マサチューセッツ州サウスナティック）につないだ。全手術とも無菌状態で実施した。感染防止のためにネオスポリン抗生物質クリーム（Ｐｆｉｚｅｒ，ニュージャージー州モリスプレーンズ）を傷に塗布した。薬物投与の前に４５分間の回復時間を与えた。
【００７２】
正常及び腫瘍ラットを使用した。ＩＲＬ１６２０（３ｎｍｏｌ／ｋｇ）又はビヒクル（生理食塩水、３ｍＬ／ｋｇ）投与１５分後にパクリタキセルをｉ．ｖ．投与した（３ｍｇ／ｋｇ）。ＩＲＬ１６２０投与前に採血してベースライン値を得た。ラットから０．５ｍＬの血液をヘパリン処理シリンジに、ベースライン、パクリタキセル投与後５、３０分、そして２、６、及び１０時間の時点で採取した。サンプルを遠心分離し、血漿を回収して分析まで−８０℃で保存した。
【００７３】
血漿サンプルをＨＰＬＣシステムを用いてパクリタキセルについて分析した。手短に述べると、血漿を解凍し、５０μＬの内部標準Ｎ−シクロヘキシルベンズアミド（低標準曲線３ｍＭ、高標準曲線３０ｍＭ）及び３ｍＬのエチルエーテル（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，イリノイ州シカゴ）と１３×１００のガラス培養管で混合した。混合物を往復式振盪器を用いて５分間振盪し、次いで３，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した。得られた上清を１３×１００のホウケイ酸ガラス培養管に移し、窒素流下、加熱水浴（３７℃）中で蒸発させた。残渣を２００μＬの移動相Ａ（５０％脱イオン水、５０％アセトニトリル）で再構成した（もどした）。再構成材料の１００μＬ分（低標準曲線、ＩＶ投与後に回収したサンプル）を４ｍｍ ＮｏｖａＰａｋ １５０×３．９ｍｍ Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，マサチューセッツ州ミルフォード）に注入した。その手前には４ｍｍ ＮｏｖａＰａｋ ２０×３．９ｍｍ Ｃ１８プレカラムが
ある。装置は、２２７ｎｍにセットしたＷａｔｅｒｓ ２４８７吸光度検出器に接続したＷａｔｅｒｓ ２６９５セパレーションモジュールを用いた。１００％の移動相Ａを流速１ｍＬ／分で送液して直線勾配（リニアグラジエント）を開始した。次いで移動相Ａを１０〜１１分に７０％に下げ、移動相Ａを１１〜１６分の間７０％に維持してカラムからゆっくり溶出する物質を次の注入の前に除去した。その後、移動相Ａを１６〜１７分に１００％に上げ、１００％移動相Ａを３分間維持して、合計の運転時間を２０分とした。パクリタキセルの血漿中濃度は、パクリタキセルピーク面積のＮ−シクロヘキシルベンズアミドピーク面積に対する比率から、線形最小二乗回帰を用い、１／×で重み付けして計算した。変動係数によって測定した日内及び日間変動は＜１０％であった。正常及び腫瘍ラットの血漿中濃度のプロファイルを比較した。
【００７４】
液体シンチレーション計数試験．ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）とキシラジン（２ｍｇ／ｋｇ）の併用１回ｉ．ｐ．注射でラットを麻酔した。頸部を剃毛し、外科用消毒薬及びアルコールで清拭した。右頸動脈を露出し、無菌ＰＥ−５０管を挿入した。頸部付近を正中切開し、血液採取のため左頸動脈にＰＥ５０管を挿入した。カテーテルは皮下に潜らせて頸部の基部で体外に出し、その後切開部分を外科用ステープルで閉じた。Ｂｕｅｈｌｅｒら，Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ ３７：１２４（２００４）。開いている管は釣り糸で栓をした。全手術とも無菌状態で実施した。感染防止のためにネオスポリン抗生物質クリーム（Ｐｆｉｚｅｒ，ニュージャージー州モリスプレーンズ）を傷に塗布した。薬物投与の前に４５分間の回復時間を与えた。
【００７５】
ＩＲＬ１６２０を腫瘍動物に３ｎｍｏｌ／ｋｇの用量でｉ．ｖ．投与した。［３Ｈ］−パクリタキセル（１６０μＣｉ／ｋｇ）を非標識パクリタキセルと混合した。パクリタキセルは、ビヒクル又はＩＲＬ１６２０の投与１５分後にｉ．ｖ．投与した。
【００７６】
ビヒクル又はＩＲＬ１６２０投与前に血漿を採取してベースライン値を得た。約０．２ｍＬの血液をラットからヘパリン処理シリンジに、ベースライン、１、５、１５、３０分、１、２、４、６、８、１２及び２４時間の時点で採取した。サンプルを遠心分離し、血漿を分離して分析まで−８０℃で保存した。
【００７７】
血漿サンプル中の［３Ｈ］−パクリタキセルの濃度をＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ液体シンチレーションカウンター（モデルＬＳ ６５００）を用いて測定した。手短に言うと、血漿を解凍して２０ｍＬの液体シンチレーションカクテルと混合した。サンプルをカウントし、カウントは次式を用いて“ｄｐｍ”の単位から“ｆｍｏｌ／ｍＬ”に換算した。
【００７８】
ｆｍｏｌ／ｍＬ＝ｄｐｍ値×崩壊因子×２．２×１０−１２／１０−１２×サンプル体積ｍＬ
ｆｍｏｌ／ｍＬへの換算後、全パクリタキセルの薬物動態を、［３Ｈ］−パクリタキセルの非標識パクリタキセルに対する比率を用いて計算した。血漿中パクリタキセルの薬物動態の見積は、ノンコンパートメント及びコンパートメント解析の両方を用いて決定した（ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ Ｐｒｏ ４．ｌ（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐ，カリフォルニア州マウンテンビュー）で実行）。
【００７９】
ノンコンパートメント解析では、曲線下面積（ＡＵＣ０−∞）を、最終測定可能濃度（Ｃｌａｓｔ）まで台形法を用い、Ｃｌａｓｔを対数直線の血漿中濃度vs時間曲線の終末部分の傾き（λ）（負の数）で割ることによって無限大まで外挿して推定した。以下のパラメータも算出した。平均滞留時間（ＭＲＴｉｖ）は全身クリアランスの逆数として計算し、全身クリアランス（ＣＬ）はＡＵＣ０−∞に対する用量の比率として計算し、見かけの容積分布はＣＬ及びλの比率として計算した。血漿中半減期は０．６９３（２の自然対数
）とＭＲＴｉｖの積として計算した。
【００８０】
コンパートメント解析では、一連の非線形コンパートメントモデルを血漿中濃度vs時間曲線データに当てはめた。具体的には、１コンパートメント、２コンパートメント及び３コンパートメントモデルを比較した。統一及び予測データに基づく重み付けを試験した。最終のモデル選択は、診断的プロット（観測値vs予測値及び残差プロット）、Ａｋａｉｋｅ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ（ＡＩＣ）及びＳｃｈｗａｒｔｚ Ｃｒｉｔｅｒｉａ（ＳＣ）に基づいた。低いＡＩＣ及びＳＣ基準を有するモデルを最終モデルとみなした。
【００８１】
データは、ＨＰＬＣ−ＵＶについては一元ＡＮＯＶＡに続いてダンカン検定によって、液体シンチレーション試験についてはｔ検定によって分析した。ｐ＜０．０５を有意とみなした。これらの薬理反応試験で測定された主な結果は、血漿中のパクリタキセル濃度の違いであった。
【００８２】
結果
パクリタキセルの薬物動態プロファイルは、正常及び腫瘍ラットともＩＲＬ１６２０の投与に影響されなかった（図７及び８）。血漿中薬物動態プロファイルのＨＰＬＣ分析は、より広範な放射性パクリタキセルの動態のプロファイルと類似している。図８は、ビヒクル処置及びＩＲＬ１６２０処置腫瘍ラットにおけるパクリタキセルの放射能の薬物動態プロファイルを描いている。薬物動態プロファイルはノンコンパートメント及びコンパートメント法によって解析した。
【００８３】
ノンコンパートメント解析では、ビヒクル＋パクリタキセル群について計算されたＡＵＣは９４３３．５３±１４６５．００ｎｇ＊ｈ／ｍＬで、ＩＲＬ１６２０処置腫瘍ラットのそれと類似していた（ｐ＞０．０５）。消失半減期は０．１４ ±０．０８時間と計算
された。用量／ＡＵＣとして計算されたクリアランスは０．５６ ±０．０７Ｌ／ｈ／ｋ
ｇと推定された。クリアランス／Ｋｅｌとして計算された分布容積は１０．１１ ±４．
１７Ｌ／ｋｇであることがわかった。概して、以下の表からもわかるように、ＩＲＬ１６２０はパクリタキセルの薬物動態プロファイルに影響を与えていなかった。
【００８４】
【表１】
【００８５】
パクリタキセルの血漿中濃度は血漿サンプルのｄｐｍカウントから計算された。３コンパートメントモデルがパクリタキセルの薬物動態を最もよく説明していた。図９は、ビヒクル処置及びＩＲＬ１６２０処置ラット両方の観測vs予測される薬物動態のプロットを描いている。ビヒクル処置ラットにおけるパクリタキセルのＡＵＣは９．４２±３．１８μｇ−ｈ／ｍＬであった。定常状態の分布容積（Ｖｓｓ）は１０．３１±４．５４Ｌ／Ｋｇであった。クリアランスは０．６９±０．１７Ｌ／ｈ／Ｋｇと推定された。α ｔ1/2、
β ｔ1/2、γ ｔ1/2は、それぞれ０．０３±０．０１ｈ、１．０±０．３２ｈ、及び２５．８７＋１７．８１ｈであった。平均滞留時間は２７．９２±１９．８４ｈであった。以下の表からわかるように、ＩＲＬ１６２０処置群で推定されたこれらのパラメータはビヒクル処置群のものと顕著な違いはなかった。
【００８６】
【表２】
【００８７】
この試験では３コンパートメントモデルがパクリタキセルの血漿中薬物動態を最もよく説明していた。このモデルは、器官における血液潅流が高くても、中程度でも又は低くても、パクリタキセルは様々な器官に分布することを示唆している。ＩＲＬ１６２０の投与でパクリタキセルの分布は変化しなかった。３コンパートメントモデルによって得られた血漿中薬物動態のパラメータは、ビヒクル及びＩＲＬ１６２０処置群について同程度のクリアランス、分布及び吸収の容積、分布及び消失半減期を示した。しかしながら、ＩＲＬ１６２０は腫瘍の血液潅流及び腫瘍のパクリタキセル濃度を増大する。Ｒａｉら，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔｓ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ（２００４）；Ｒａｉ ＆ Ｇｕｌａｔｉ，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，５１：２１（２００３）。従って、ＩＲＬ１６２０は、パクリタキセルの薬物動態プロファイルを著しく変えることなく腫瘍の潅流を選択的に増大する。
【００８８】
ＩＲＬ１６２０を使用してもパクリタキセルの薬物動態に影響はなかった。薬物動態は化合物の安全性の代理とみなせることが多い。従って、これらの結果は、パクリタキセルの安全性がＩＲＬ１６２０の投与によって変化しないことも示唆している。結果として、ＩＲＬ１６２０はパクリタキセルの効能を改良し、その重篤な毒性を最小限にするための適当な用量漸増を可能にするために使用できるはずである。これらの結果は、正常ラットにおけるパクリタキセルの薬物動態プロファイルが腫瘍ラットと類似していることを示しており、パクリタキセルの動態は腫瘍モデル系によって変化しないことを示している。
【００８９】
実施例５．ＩＲＬ１６２０の用量反応効果、主要器官及び腫瘍組織における［３Ｈ］パクリタキセルの生体内分布に及ぼすＩＲＬ１６２０の影響、及び腫瘍状態に対するパクリタキセルの効能に及ぼすＩＲＬ１６２０の影響
本実施例に記載の実験は、（ａ）ＥＴＢ受容体アゴニストＩＲＬ１６２０が正常及び腫瘍ラットの乳房潅流に及ぼす用量反応効果、（ｂ）主要器官及び腫瘍組織における［３Ｈ］パクリタキセルの生体内分布に及ぼすＩＲＬ１６２０の影響、及び（３）ＭＮＵ誘導性乳房腫瘍ラットにおける腫瘍状態に対するパクリタキセルの効能に及ぼすＩＲＬ１６２０の影響を調べるために設計された。
【００９０】
方法
ＩＲＬ１６２０はＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（ミズーリ州セントルイス）から入手した。［３Ｈ］−パクリタキセルはＭｏｒａｖｅｋ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（カリフォルニア州ブレア）から購入した。パクリタキセル（６ ｍｇ／ｍｌ溶液）はＢｅｎ Ｖｅｎｕｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．（オハイオ州ベッドフォード）から購入した。ケタミン及びキシラジンはＰｈｏｅｎｉｘ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．（ミズーリ州セントジョーゼフ）から購入した。組織溶解剤（ＴＳ−２）はＲＰＩ Ｃｏｒｐ．（イリノイ州シカゴ）から購入した。
【００９１】
バージン雌Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（Ｈａｒｌａｎ Ｃｏｍｐａｎｙ，ウィスコンシン州マジソン）を４０日齢で購入し、２３±１℃に温度管理された部屋で２匹ずつケージに入れ、１２時間明／１２時間暗のスケジュール下で維持した。ラットには水と標準の齧歯類用餌を自由に与えた。４８日齢で各動物にＮ−メチルニトロソウレア（ＭＮＵ，Ａｓｈ Ｓｔｅｖｅｎｓ，ミシガン州デトロイト）を５０ｍｇ／ｋｇの用量で１回注射した。ＭＮＵは３％酢酸に溶解し、そして０．９％ＮａＣｌ中に希釈し（最終濃度１２．５ｍｇ／ｍｌ）、これを調製３０分以内にｉ．ｐ．注射によって投与した。この処置によってほぼ１００％の発生率で乳房腺がんが発がん処置約１００日後に誘発される。Ｍｅｈｔａ Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，３６：１２７５（２０００）。腫瘍の外観と位置は手による乳腺の触診でモニターし、腫瘍表面はデジタルキャリパーで測定した。腫瘍体積５００〜８００ｍｍ３のラットを選んで試験した。
【００９２】
潅流試験．ラットの乳房組織及び腫瘍への潅流は、前述のようにＰｅｒｉｆｌｕｘ ＰＦ２ｂ ４０００レーザードップラー流量計（Ｐｅｒｉｍｅｄ，スウェーデン、ストックホルム）を用いて測定した。手短に言うと、ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）とキシラジン（２ｍｇ／ｋｇ）を併用１回ｉ．ｐ．注射してラットを麻酔した。乳頭付近を剃毛し、体温の変動を最小限にするために加熱パッド（３７℃）に動物を置いた。乳腺周囲の皮膚を幅約６ｍｍ、長さ約４ｍｍ切開した。標準モデルの光ファイバープローブ（ＭＰ３ フロープローブ，Ｍｏｏｒｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，英国、デボン）を露出組織の表面に当てた。それをＰｅｒｉｆｌｕｘ ＰＦ２ｂ ４０００レーザードップラー流量計に接続した。時定数を１．５秒にセットし、帯域幅を４ＫＨｚにセットした。この方法はレーザー光線（フラックス）におけるドップラーシフトを測定する。これは赤血球の数及び速度によって決まり、所定体積の組織内の全血流に比例する。フラックス値はＰｏｌｙｖｉｅｗソフトウェアを用いて獲得した。１５分間の安定な記録のベースラインを得てから生理食塩水又はＩＲＬ１６２０を投与した。動物には１、３又は９ｎｍｏｌ／ｋｇのＩＲＬ１６２０を投与し、潅流を３時間記録した。各用量は少なくとも４匹の動物に投与した。
【００９３】
生体内分布試験．ラットをケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）とキシラジン（２ｍｇ／ｋｇ）の併用１回ｉ．ｐ．注射で麻酔した。ラットの体重、腫瘍位置及び腫瘍体積を記録した。動物を無作為にグループ分けし、生理食塩水又はＩＲＬ１６２０（３ｎｍｏｌ／ｋｇ）を尾静脈から最終体積０．２ｍｌ投与した。各群のラットに［３Ｈ］パクリタキセル（５０：５０のＣｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬとエタノール中４０μＣｉ／ラット）を、ＩＲＬ１６２０の投与後１５、１２０及び２４０分時点で最終体積１．０ｍｌ投与した。各時点で６匹のラットを試験したので、合計３６匹のラットを使用した。動物は［３Ｈ］パクリタキセル投与３時間後に犠死させた。腫瘍組織、腎臓、肝臓、肺及び脾臓中の［３Ｈ］パクリタキセル濃度を測定した。腫瘍及び器官は小片にスライスした。約５００ｍｇの組織又は腫瘍を組織溶解剤（６ｍｌ）入りの別のバイアルに入れ、５０℃の水浴中でインキュベートした。組織又は腫瘍が溶解したら水浴からバイアルを取り出し、１．２ｍｌの１０％
氷酢酸を加えた。バイアルの中身を３個のバイアルに等分し、１５ｍｌの液体シンチレーションカクテル（Ｓａｆｅｔｙ Ｓｏｌｖｅ，ＲＰＩ Ｃｏｒｐ，イリノイ州シカゴ）を各バイアルに加え、平衡化のために一晩維持した。液体シンチレーションカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，ＬＳ ６５００）を用いて管の放射能をカウントした。
【００９４】
効能試験．腫瘍ラットを無作為に７つの群に分けた（１２ラット／群）。Ｉ群−生理食塩水；II群−ＩＲＬ１６２０（３ｎｍｏｌ／ｋｇ）；III群−Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ
：エタノール；IV群−ビヒクル（生理食塩水）＋パクリタキセル（１ｍｇ／ｋｇ）；Ｖ群−ビヒクル（生理食塩水）＋パクリタキセル（５ｍｇ／ｋｇ）；VI群−ＩＲＬ１６２０（３ｎｍｏｌ／ｋｇ）＋パクリタキセル（１ｍｇ／ｋｇ）；及びVII群−ＩＲＬ１６２０（
３ｎｍｏｌ／ｋｇ）＋パクリタキセル（５ｍｇ／ｋｇ）。投与スケジュールは３日に１回、計５回であった。体重、腫瘍の大きさ及び位置は３日目ごとに最終投与後計３０日間モニターした。評価には以下のカテゴリーを使用した。進行：処置の開始と比べて腫瘍が面積で４０％を超えて成長している；停滞：処置の過程を通して腫瘍がその初期面積から４０％を超えて変動しなかった；部分退行：腫瘍がその初期面積から４０％を超えて退行した；完全寛解：腫瘍がもはや触診及び測定できない場合。処置中及び３０日間の観察期間中、腫瘍の多重度（新規腫瘍の出現）も記録した。動物は最後（５回目）の投与３０日後に犠死させた。データは分散分析、次いでダンカン検定を用いて分析した。ｐ＜０．０５の水準を有意とみなした。
【００９５】
結果
ＩＲＬ１６２０の乳房潅流における用量反応．腫瘍潅流に及ぼすＩＲＬ１６２０投与の影響は一過性で用量依存性であることがわかった（図１０Ａ）。腫瘍潅流におけるベースラインからの最大増加２４４．０％（ｐ＜０．００１）は３ｎｍｏｌ／ｋｇのＩＲＬ１６２０投与１５分後に観察された。潅流の増加は、ベースライン並びに生理食塩水処置ラットと比べて１５、３０及び６０分時点で有意であることがわかった（図１０Ｂ）。１及び９ｎｍｏｌ／ｋｇのＩＲＬ１６２０の投与は、ベースライン潅流及び生理食塩水処置ラットと比べて乳房腫瘍潅流に微増しかもたらしていない。潅流の最大増加（６０．９及び６３．３％）は、それぞれ１及び９ｎｍｏｌ／ｋｇのＩＲＬ１６２０後９０及び３０分時点で記録された。しかしながら、９ｎｍｏｌ／ｋｇのＩＲＬ１６２０で処置された動物における潅流の増加は、生理食塩水処置ラットと比べて１５、３０及び６０分時点で有意であることがわかった（図１０Ａ）。腫瘍ラットへの生理食塩水の投与はベースラインと比べて血液潅流に何ら有意の変化を起こさなかった（図１０Ａ）。生理食塩水、１、３又は９ｎｍｏｌ／ｋｇのＩＲＬ１６２０の投与は正常雌ラットでは乳房潅流に何ら有意の変化を起こさなかった（データ示さず）。
【００９６】
生体内分布試験．腫瘍中の［３Ｈ］パクリタキセルの濃度は、生理食塩水処置ラットと比べてＩＲＬ１６２０（３ｎｍｏｌ／ｋｇ）処置ラットで有意に増加した。最大効果は、パクリタキセルをＩＲＬ１６２０の１５分後に投与された動物群に認められた。腫瘍中のパクリタキセル濃度に２７７．１、１５１．９及び３４．７％の増加が、パクリタキセルをＩＲＬ１６２０投与のそれぞれ１５、１２０及び２４０分後に投与した場合に観察された（図１１）。ＩＲＬ１６２０を投与しても、肝臓、肺、腎臓及び脾臓におけるパクリタキセルの蓄積は対照動物と比べて変化ないことがわかった（図１１）。
【００９７】
効能試験：体重．ベースライン（処置開始前）から最終投与後３０日までの体重の相違率を図１２に示す。生理食塩水処置対照ラットで実験終了時にモニタした体重の増加率は、ベースラインの体重と比べて７．２±１．７％であった（図１２）。ビヒクル＋パクリタキセル（１ｍｇ／ｋｇ）、ビヒクル＋パクリタキセル（５ｍｇ／ｋｇ）、ＩＲＬ１６２０＋パクリタキセル１ｍｇ／ｋｇ及びＩＲＬ１６２０＋パクリタキセル５ｍｇ／ｋｇで処置した動物群では体重にそれぞれ５．１±３．６、９．４±２．４、１４．３±３．１及び１３．１±１．８％の増加があった（図１２）。Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ：エタノール及びＩＲＬ１６２０を投与した動物の体重の、ベースラインと比較した増加率は＜１０％であることがわかった（データ示さず）。
【００９８】
効能試験：腫瘍体積．処置開始時には様々な群の腫瘍サイズは同程度で互いに有意の差はなかった（図１３）。対照ラットの腫瘍体積は迅速かつ変動する速度で増加した。腫瘍成長における大きな変動性は、自発性成長腫瘍のランダム成長パターンによるものであろう。３０日間の観察期間終了時、対照腫瘍は２６９３．４±７９０．９ｍｍ３の腫瘍体積を有していた。ＩＲＬ１６２０処置ラットも同様の発達パターンを有し、最終腫瘍体積は２５６０．５±８４４．４ｍｍ３であった。Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ：エタノール処置も同様の成長パターンで、最終腫瘍体積は２３３８±１３２９ｍｍ３となった。このように、ＩＲＬ１６２０及びｃｒｅｍｏｐｈｏｒ Ｅｌ：エタノールは、ＭＮＵ誘導乳房腫瘍の成長に顕著な影響は及ぼさなかった。対照ラットと比較した場合、ビヒクル＋パクリタキセル１ ｍｇ／ｋｇ処置ラットはわずかに低減された腫瘍サイズの成長を示したが（１９６０．８±６１１．９ｍｍ３）、ビヒクル＋パクリタキセル５ｍｇ／ｋｇ群ではそれがより顕著であった（１６８２．７±４９７．３ｍｍ３）。ＩＲＬ１６２０＋パクリタキセル１ｍｇ／ｋｇ処置ラットは削減された腫瘍サイズを示した（１７０７．２±６２１．１ｍｍ３）。しかしながら、最低平均腫瘍サイズ（７３０．１±２１９．４ｍｍ３）はＩＲＬ１６２０＋パクリタキセル５ｍｇ／ｋｇで処置された動物群で観察された（図１３）。ＩＲＬ１６２０に続きパクリタキセル５ｍｇ／ｋｇを３日目ごとに計５回投与することは、生理食塩水＋パクリタキセル（５ｍｇ／ｋｇ）投与ラットと比べて有意に（ｐ＜０．０５）腫瘍体積を削減した（図１３）。腫瘍体積は、ＩＲＬ１６２０又はｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ：エタノールのいずれかで処置されたラットと比べてもＩＲＬ１６２０＋パクリタキセル５ｍｇ／ｋｇ群で低いことがわかった（データ示さず）。
【００９９】
効能試験：腫瘍の多重度．全処置群の動物とも３０日間の観察期間終了時までに追加の腫瘍を発症していた。生理食塩水、ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ：エタノール及びＩＲＬ１６２０で処置した動物では、追加の腫瘍出現にそれぞれ５８．４、５７．１及び６０．８％の増加がみられた。ビヒクル＋パクリタキセル１及び５ｍｇ／ｋｇを投与した動物では新規腫瘍の発生はそれぞれ７８．３％及び４１％であることがわかった。しかしながら、ＩＲＬ１６２０＋パクリタキセル１及び５ｍｇ／ｋｇでは、追加の腫瘍のパーセントはそれぞれ６９．２及び４４．８％であることがわかった。
【０１００】
効能試験：腫瘍の進行．進行、停滞、退行又は消失した腫瘍のパーセントは前述のように計算した。生理食塩水処置群では７３．５％の腫瘍が初期腫瘍サイズの４０％を超えて進行した。ＩＲＬ１６２０（８２．７％）及びｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ：エタノール（８０．４％）処置群も初期腫瘍サイズの４０％を超える同様の腫瘍進行パーセントを示した。腫瘍の進行が低パーセントだったのは、ビヒクル＋パクリタキセル（５ｍｇ／ｋｇ）群（７１．４％）、ビヒクル＋パクリタキセル（１ｍｇ／ｋｇ）群（６１．１％）及びＩＲＬ１６２０＋パクリタキセル（１ｍｇ／ｋｇ）群（６９％）であった。しかし最低のパーセント（４０％）はＩＲＬ１６２０＋パクリタキセル（５ｍｇ／ｋｇ）群で見られた（図１４）。
【０１０１】
効能試験：腫瘍の停滞．生理食塩水処置ラットの１６．９％の腫瘍は停滞していた。すなわち３０日間の終了時点までに４０％の範囲を超えて成長しなかった。ＩＲＬ１６２０（１３．７％）、ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ：エタノール（１５．２％）、ビヒクル＋パクリタキセル（１ｍｇ／ｋｇ）（２２．２％）及びビヒクル ＋パクリタキセル（５ｍｇ／ｋｇ）（１９．５％）処置ラットは停滞状態の腫瘍のパーセントは低かった。ＩＲＬ１６２０＋パクリタキセル（１ｍｇ／ｋｇ）（２３．８％）処置ラット及びＩＲＬ１６２０＋パクリタキセル（５ｍｇ／ｋｇ）処置ラットは停滞状態の腫瘍のパーセントが大きかった（２６．６％）（図１４）。
【０１０２】
効能試験：腫瘍の退行．パクリタキセル５ｍｇ／ｋｇ処置の前にＩＲＬ１６２０を投与すると、対照動物と比べて腫瘍の進行が有意に低下した。生理食塩水処置ラットは初期の腫瘍体積から９．２％の腫瘍が退行を示した。Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ：エタノール（４．３％）、ＩＲＬ１６２０（３．４％）及びビヒクル ＋パクリタキセル（５ｍｇ／ｋｇ）（９．５％）処置ラットは、サイズの退行した腫瘍のパーセントに対照群との有意の差はなかった。５回目の投与終了時点で、腫瘍は、ＩＲＬ１６２０＋パクリタキセル５ｍｇ／ｋｇ処置ラット及びビヒクル＋パクリタキセル５ｍｇ／ｋｇ処置ラットで対照ラットと比べてそれぞれ７６．１±１０．５及び４５．９±１１．５％退行していた。ＩＲＬ１６２０＋パクリタキセル５ｍｇ／ｋｇ及びビヒクル＋パクリタキセル５ｍｇ／ｋｇで処置された群の動物に８０．２±６．９％（ｐ＜０．０５）及び３３．８±１９．４％の退行があった（図１４）。ＩＲＬ１６２０＋パクリタキセル１ｍｇ／ｋｇ及びビヒクル＋パクリタキセル（１ｍｇ／ｋｇ）群における腫瘍退行率は、それぞれ４７．１±１５．４及び３７．７±１６．２％であることがわかった。ＩＲＬ１６２０の１５分後のパクリタキセル（５ｍｇ／ｋｇ）投与は、生理食塩水の１５分後のパクリタキセル（５ｍｇ／ｋｇ）投与と比べて有意に大きい腫瘍退行をもたらした。ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ Ｅｌ：エタノールとＩＲＬ１６２０処置群は、どの時点でも対照ラットと比べて腫瘍の退行に有意の差はなかった（データ示さず）。
【０１０３】
効能試験：腫瘍の寛解．腫瘍が完全に消失する完全寛解は２つの群でしか観察されなかった。ＩＲＬ１６２０＋パクリタキセル（１ｍｇ／ｋｇ）（２．３％）及びＩＲＬ１６２０＋パクリタキセル（５ｍｇ／ｋｇ）（１５％）処置ラットである（図１４）。
本試験で得られた結果は、３ｎｍｏｌ／ｋｇ用量のＩＲＬ１６２０の投与は、ベースライン及びビヒクル処置ラットと比べて腫瘍潅流に有意の増加をもたらすことを示している。１、３及び９ｎｍｏｌ／ｋｇのＩＲＬ１６２０も腫瘍潅流を増大するが、３ｎｍｏｌ／ｋｇの用量のＩＲＬ１６２０が最大効果をもたらした。高用量（９ｎｍｏｌ／ｋｇ）は血管収縮に関与するＥＴＢ受容体を刺激することも可能である。Ｂｒｏｏｋｓら，Ｊ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２６ Ｓｕｐｐｌ ３：Ｓ３２２（１９９５）。
【０１０４】
従って、高用量でのＥＴＢ受容体刺激による血管収縮と混合した血管拡張は、削減された血管拡張効果をもたらす。低用量（１ｎｍｏｌ／ｋｇ）だと最大の血管拡張をもたらすのに不十分なのであろう。従って、次の試験には３ｎｍｏｌ／ｋｇ用量のＩＲＬ１６２０を選択した。
【０１０５】
腫瘍組織中のパクリタキセル濃度に及ぼすＩＲＬ１６２０の効果は時間依存性であることがわかった。［３Ｈ］パクリタキセルをＩＲＬ１６２０投与の１５分、２時間及び４時間後に投与した場合、ビヒクル処置ラットと比べて、腫瘍中の［３Ｈ］パクリタキセル濃度にそれぞれ２７７．１、１５１．９及び３４．７％の差があった。ＩＲＬ１６２０の投与は、肝臓、肺、腎臓及び脾臓中のパクリタキセル蓄積に有意の増加をもたらさないことが研究から示された。効能試験の結果は、ＩＲＬ１６２０の投与は、パクリタキセルが誘導する腫瘍体積の削減を、パクリタキセルを投与された生理食塩水処置ラットと比べて有意に増大したことを示している。５ｍｇ／ｋｇの用量のパクリタキセルで見られた治療利益の増強は最終投与の３０日後まで維持された。これは、腫瘍体積にぶり返しがなく、パクリタキセルの効能増強におけるＩＲＬ１６２０の効果が試験終了まで不変であったことを意味する。しかしながら、生理食塩水処置後のパクリタキセル（１及び５ｍｇ／ｋｇ）は腫瘍成長にそのような有意の変化をもたらさなかった。さらに、腫瘍の多重度は、ＩＲＬ１６２０の後パクリタキセル５ｍｇ／ｋｇで処置されたラットの群で減少した。従って、パクリタキセル５ｍｇ／ｋｇの前にＩＲＬ１６２０を投与することは、パクリタキセルの効能に著しい効果を有する。これは、腫瘍負荷の減少、腫瘍退行のパーセント、影響を
受けない体重及び多重度によって示される。さらに、ＩＲＬ１６２０の後パクリタキセル１及び５ｍｇ／ｋｇで処置した動物群では、他のすべての群と比べて、それぞれ２．３及び１５％の初期腫瘍完全寛解があった。
【０１０６】
この実施例で述べた実験は、ＥＴＢ受容体アゴニストであるＩＲＬ１６２０が腫瘍の血流を有意に増大しうることを明らかに示している。ＩＲＬ１６２０の投与は腫瘍血流の増大を起こしたが、対照の健常組織における潅流は変化させなかった。腫瘍潅流の増加は３時間持続した。潅流が増大している期間中に［３Ｈ］パクリタキセルを投与すると、他の器官ではなく腫瘍組織だけで［３Ｈ］パクリタキセルの濃度が有意に増加した。さらに、本実施例で述べた実験の結果は、ＩＲＬ１６２０の投与はパクリタキセルの抗腫瘍効果を刺激するという証拠を提供している。パクリタキセル５ｍｇ／ｋｇを３日目ごとに計５回処置されたラットの腫瘍体積は、対照ラットと比べて６０．０％の削減があった。しかしながら、ＩＲＬ１６２０投与１５分後のパクリタキセル投与は、最終パクリタキセル投与の１ヶ月後に記録した場合、対照ラットと比べて腫瘍体積を２６８．９％まで削減した。ＩＲＬ１６２０投与ラットでは、パクリタキセルだけの処置ラットと比べて、腫瘍体積に１３０．４％の削減があった。腫瘍潅流の増大は、腫瘍成長を促進する栄養素の供給を増大しうる可能性もある。我々の結果は、生理食塩水処置ラットと比べてＩＲＬ１６２０処置ラットの腫瘍体積及び腫瘍多重度に有意の増加はなかったことを示しており、ＩＲＬ１６２０単独では腫瘍体積及び多重度に何の影響も生じなかったことを示唆している。結論として、ＩＲＬ１６２０は腫瘍選択的血管拡張薬として使用でき、化学療法の効能を選択的に増大するために使用できる。本試験は、この治療戦略を採用することによって、腫瘍組織中に何倍も高い薬物濃度が達成できることを明らかに実証している。最後に、ＥＴＡ受容体アンタゴニストも腫瘍血流の改良のために提唱されており（Ｓｏｎｖｅａｕｘら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，６４：３２０９（２００４））、本発明に従って腫瘍への抗がん剤の送達を増強するのに使用できる。
【０１０７】
活性成分を含有する医薬組成物は、ヒト又は他の哺乳動物への投与に適している。典型的には、医薬組成物は無菌性であり、投与された場合に有害反応を起こすような毒性、発がん性、又は変異原性化合物を含有しない。医薬組成物の投与は、固形腫瘍成長の開始の前、中又は後に実施できる。
【０１０８】
本発明の方法は、前述の活性成分を用いて、又はその生理学的に許容しうる塩、誘導体、プロドラッグ又は溶媒和物として達成できる。活性成分は、そのままの化合物として、又はいずれかもしくは両方の実体を含有する医薬組成物として投与できる。
【０１０９】
医薬組成物は、活性成分がそれらの意図する目的を達成するために有効な量で投与されるようなものを含む。更に詳しくは、“治療上有効量”とは、固形腫瘍の発生を防止、その除去、その進行を遅延、又はそのサイズを削減するのに有効な量を意味する。治療上有効な量の決定は、特に本明細書中に提供されている詳細な開示に照らせば、十分当業者の能力の範囲内である。
【０１１０】
“治療上有効な用量”とは、所望の効果を達成する活性成分の量のことである。そのような活性成分の毒性及び治療効能は、細胞培養又は実験動物における標準の製薬手順によって決定できる。例えばＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）及びＥＤ５０（集団の５０％に治療上有効な用量）を決定する。毒性及び治療効果間の用量比は治療指数であり、ＬＤ５０とＥＤ５０間の比率として表される。高い治療指数が好適である。得られたデータはヒトに使用するための用量範囲を設計するのに使用できる。活性成分の用量は、ＥＤ５０を含み毒性が殆どないし全くない循環濃度の範囲内にあるのが好ましい。用量は、この範囲内で、使用される剤形、及び利用される投与経路に応じて変動しうる。
【０１１１】
正確な処方及び用量は、患者の状態を考慮して医師が決定する。投与量及び間隔は、治療又は予防効果を維持するに足る活性成分の濃度を提供するために個別に調整できる。
投与される医薬組成物の量は、治療される患者、患者の体重、疾患の重症度、投与様式、及び処方医の判断に依存しうる。
【０１１２】
活性成分は、単独で、又は意図する投与経路及び標準の製薬学的実施基準に関して選ばれる製薬学的担体と混合して投与できる。そこで、本発明に従って使用される医薬組成物は、活性成分を薬学的に使用できる製剤に加工するのを容易にする賦形剤及び補助剤を含む一つ又は複数の生理学的に許容しうる担体を用いて、従来様式で製剤化できる。
【０１１３】
治療上有効量の活性成分が投与される場合、組成物は、発熱物質を除去された、非経口的に許容しうる水溶液の形態であってよい。ｐＨ、等張性、安定性などを十分顧慮したそのような非経口的に許容しうる溶液の調製は当該技術分野における技能の範囲内である。静脈内注射のための好適な組成物は、典型的には等張性ビヒクルを含有するが、この特徴は必要とされない。
【０１１４】
獣医学的使用の場合、活性成分は、通常の獣医学的実施基準に従って適切に許容されうる製剤として投与される。獣医は、特定の動物に最も適当な投与計画を容易に決定することができる。
【０１１５】
本発明の範囲及び精神から離れることなく態様の様々な適応及び変更を行い、そして使用することができる。本発明は本明細書中で具体的に記載した以外にも実施することができる。上記記載は説明を目的としたもので制限を意図していない。本発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ決定される。
【０１１６】
本明細書中で使用してきた用語及び表現は、制限ではなく説明のための用語として使用されている。そのような用語及び表現の使用にあたって、示し説明した特徴の等価物又はその一部を除外する意図はない。特許請求された本発明の範囲内で多様な変形が可能であることは認識されている。さらに、本発明のいずれかの態様のいずれか一つ又は複数の特徴は、本発明の範囲を離れることなく本発明のいずれかその他の態様のいずれか一つ又は複数の特徴と組み合わせることができる。
【０１１７】
特に明記されない限り、本明細書及び特許請求の範囲で使用されている、分子量、反応条件などのような成分、性質の量を表すすべての数字は、すべての例で“約”という用語によって変更されると理解されるべきである。従って、反対に指示されない限り、以下の明細書及び添付の特許請求の範囲に示されている数値パラメータは、本発明によって得ようと求めている所望の性質に応じて変動しうる概数である。最低限でも、そして特許請求の範囲に等価の教義の適用を制限しようとしてではなく、それぞれの数値パラメータは少なくとも、報告された有効数字の数の点から、及び通常の丸め技術を適用することによって解釈されるべきである。本発明の広い範囲を示す数値範囲及びパラメータは概数であるにもかかわらず、特定の実施例に示された数値はできるだけ正確に報告されている。しかしながら、いずれの数値も、各試験測定法に見られる標準偏差に必然的に由来するある誤差を本質的に内包している。
【０１１８】
本発明を説明する文脈（特に以下の特許請求の範囲の文脈）で使用されている“一つの（ａ、ａｎ）”及び“その（ｔｈｅ）”という用語並びに類似の指示は、本明細書中で特に明記されない限り又は文脈によって明らかにそれに反しない限り、単数及び複数の両方をカバーすると解釈されるべきである。本明細書中で値の範囲を挙げることは、その範囲に入るそれぞれの別の数字を個別に言及することの省略法として代用しているに過ぎない。本明細書中で特に明記されない限り、それぞれの個別の数値は、本明細書中であたかも
個別に挙げられたかの如く、本明細書中に組み込まれる。本明細書中に記載のすべての方法は、本明細書中で別途記載のない限り又は文脈によって明らかにそれに反しない限り、任意の適切な順序で実施できる。本明細書中に提供されているいずれか及びすべての例、又は例示言語（例えば“〜のような”）の使用は、単に本発明をより良く照らし出すためのものであって、別に特許請求されている本発明の範囲を制限するためのものではない。本明細書中のどの言語も、本発明の実施に不可欠の何らかの非請求要素を指していると解釈されるべきでない。
【０１１９】
本明細書中に開示されている本発明の代替の要素又は態様のグループ分けは制限と解釈されるべきでない。各グループのメンバーは、個別に又は該グループの他のメンバー又は本明細書中に見出される他の要素との何らかの組合せで言及及び特許請求されうる。グループの一つ又は複数のメンバーは、便宜上及び／又は特許性のためにグループに包含されるか、又はグループから削除されうることは予想される。何らかのそのような包含又は削除が発生する場合、明細書はここでは変更されたグループを含有するとみなされ、従って添付の特許請求の範囲で使用されているすべてのマーカッシュグループの記載を満たしている。
【０１２０】
本発明を実施するために発明者らが知る最良の様式を含む本発明の好適な態様が本明細書中に記載されている。当然のことながら、それらの好適な態様の変形は、上記記載を読めば当業者には明白であろう。発明者らは専門家がそのような変形を必要に応じて使用することを期待し、また発明者らは本発明が本明細書中に明記した以外に実施されることを意図している。従って、本発明は、適用法によって許されているように、添付の特許請求の範囲に掲げられている主題のすべての変形及び等価物を含む。さらに、そのすべての可能な変形における上記要素の何らかの組合せも、本明細書中に別途記載がない限り又は文脈によって明らかにそれに反しない限り、本発明に包含される。
【０１２１】
さらに、本明細書全体を通じて特許及び刊行物を多数参照してきた。上で引用した参考文献及び刊行物のそれぞれは、引用によってそれらの全文を個々に本明細書に援用する。
最後に、本明細書中に開示した本発明の態様は、本発明の原理を説明するためのものであると理解されるべきである。使用できる他の変形も本発明の範囲に含まれる。従って、例えば（制限ではない）、本発明の代替の構成も本明細書中の教示に従って利用できる。従って、本発明は、提示及び記載された通りのものに正確に限定されることはない。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エンドセリンアゴニストと化学療法薬の投与を通じて哺乳動物における乳房腫瘍のような固形腫瘍の治療に貢献するための方法、組成物及び製品に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳がんの発生率はこの１０年間実質的に増加し、米国における４０〜４９歳の女性の死
因の単独首位となっている。乳がんを含む固形腫瘍の成功的治療は、腫瘍細胞の分子生物学の理解が進み、可能性ある多数の治療薬を利用できるようになったにもかかわらず、医学的目標を未だ満たしていない。
【０００３】
がん治療における一つの問題は、可能性ある多様な化学療法薬の有効量が、これらの薬剤の正常組織に及ぼす非選択的高毒性の作用のために制限されていることである。その結果、多くの患者は治療の利益を得ることなく化学療法の副作用に苦しむことになる。例えば、化学療法薬のパクリタキセルは、細胞増殖を阻害し、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する。しかしながら、パクリタキセルの臨床的有用性は、過敏、好中球減少及び末梢神経障害といったその用量制限毒性によって妨害されている。従って、より特異的で低毒性のがん療法の開発が求められている。
【０００４】
化学療法薬を腫瘍に標的化送達できれば、化学療法薬の利益を増強しつつ全身毒性は最小限化するという利益をもたらすはずである。そのような標的化送達は、化学療法薬の必要量を低減し、ひいてはこれらの薬剤の許容しがたい有害作用を潜在的に削減するのにも役立つと思われる。化学療法薬の標的化送達を達成するための一つの可能な方法は、腫瘍の血管系に特有の特徴を利用することである。
【０００５】
大きさ数ミリメートル以上の腫瘍は一定の栄養補給を必要とするので、それら自身の血管床及び血流を発達させる。Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，４６：４６７ （１９８６）。これらの発達中の血管からの常時栄養補給がなければ、腫瘍は低酸素状態になり、その後死滅する。既存の血管から新規血管系を動員することを“血管新生”と呼ぶ。
【０００６】
血管新生の間、腫瘍の血管は正常の血管系とは実質的に異なる発達をし、異なる性質を有する。単層の上皮細胞がまず急造される腫瘍血管である。これらの新規形成された腫瘍血管は平滑筋層又は神経分布を持たない。腫瘍は、あらゆる自己調節機能を備えた成熟血管も取り込む。Ｍａｔｔｓｓｏｎら，Ｔｕｍｏｒ Ｂｌｏｏｄ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ｐｇ．１２９（１９７９）；Ｒｅｉｎｈｏｌｄ，Ｔｕｍｏｒ Ｂｌｏｏｄ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ｐｇ．１１５（１９７９）；Ｗａｒｒｅｎ，Ｔｕｍｏｒ Ｂｌｏｏｄ
Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ｐｇ．２６（１９７９）。
血管緊張（血管が拡張又は収縮する程度）は、Ｈ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋、ｐＯ２、ｐＣＯ２及び一酸化窒素（ＮＯ）を含む多くの内因性因子、並びにエンドセリン（ＥＴ−１）のようなその他の調節物質によって支配されている。Ｌｕｓｃｈｅｒら，Ｔｈｅ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ：ｍｏｄｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ｐｇ．６１（１９９０）。ＥＴ−１は血管緊張の調節に著しく寄与しており（Ｙａｎａｇｉｓａｗａら，Ｎａｔｕｒｅ，
３３２：４１１（１９８８））、研究者らは乳がんを含む固形腫瘍にＥＴ−１及びＥＴＢ受容体の発現が増加していることを示している。Ａｌａｎｅｎら，Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，３６：１６１（２０００）；Ｎｅｌｓｏｎら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，５６：６６３（１９９６）；Ｋａｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２１６：５１４（１９９５）；Ｐａｇｏｔｔｏら，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，９６：２０１７（１９９５）；Ｙａｍａｓｈｉｔａら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，５２：４０４６（１９９２）；Ｙａｍａｓｈｉｔａら，Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ Ｃｈｅｍ Ｐａｔｈｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，７４：３６３（１９９１）。さらに、ＥＴＢ受容体の刺激は、腫瘍血管の血管拡張を通じて腫瘍への血液供給の増大を起こす。本発明は、この事実を利用することによってＥＴＢ受容体アゴニストを用いて腫瘍への血流を選択的に増やし、化学療法薬の標的化送達を増強する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，４６：４６７ （１９８６）
【非特許文献２】Ｍａｔｔｓｓｏｎら，Ｔｕｍｏｒ Ｂｌｏｏｄ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ｐｇ．１２９（１９７９）
【非特許文献３】Ｒｅｉｎｈｏｌｄ，Ｔｕｍｏｒ Ｂｌｏｏｄ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ｐｇ．１１５（１９７９）
【非特許文献４】Ｗａｒｒｅｎ，Ｔｕｍｏｒ Ｂｌｏｏｄ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ｐｇ．２６（１９７９）
【非特許文献５】Ｌｕｓｃｈｅｒら，Ｔｈｅ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ：ｍｏｄｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ｐｇ．６１（１９９０）
【非特許文献６】Ｙａｎａｇｉｓａｗａら，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：４１１（１９８８）
【非特許文献７】Ａｌａｎｅｎら，Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，３６：１６１（２０００）
【非特許文献８】Ｎｅｌｓｏｎら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，５６：６６３（１９９６）
【非特許文献９】Ｋａｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２１６：５１４（１９９５）
【非特許文献１０】Ｐａｇｏｔｔｏら，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，９６：２０１７（１９９５）
【非特許文献１１】Ｙａｍａｓｈｉｔａら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，５２：４０４６（１９９２）
【非特許文献１２】Ｙａｍａｓｈｉｔａら，Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ Ｃｈｅｍ Ｐａｔｈｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，７４：３６３（１９９１）
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、固形腫瘍の治療に貢献するために、その必要ある個人へのエンドセリンアゴニストと化学療法薬の投与に向けられている。特に、腫瘍は、ＥＴＢ受容体（結合されると血管拡張を起こす）の数の増加を含む独特の血管系を有している。ＥＴＢ受容体は血管拡張因子なので、化学療法薬と組み合わせたＥＴＢ受容体アゴニストは、乳がんに見られるような固形腫瘍の治療に有用である。ＥＴＢ受容体アゴニストは化学療法薬をより効果的に腫瘍に送達できるので、治療の増強をもたらす。
【０００９】
具体的には、本発明の一態様は、固形腫瘍の治療に貢献する方法を含み、該方法は、その必要ある哺乳動物にＥＴＢアゴニストと化学療法薬を静脈内投与することを含む。前記ＥＴＢアゴニストは固形腫瘍への血液供給を選択的に増大することによって固形腫瘍への化学療法薬の送達を増大する。
【００１０】
本発明の方法の別の態様において、化学療法薬の薬物動態はＥＴＢ受容体アゴニストによって影響されない。
本発明の方法の別の態様において、ＥＴＢ受容体アゴニストは化学療法薬の効能を増強する。
【００１１】
本発明の方法の別の態様において、ＥＴＢアゴニストは、ＥＴ−１、ＥＴ−２、ＥＴ−３、ＢＱ３０２０、ＩＲＬ１６２０（Ｎ−ｓｕｃ−［Ｇｌｕ９，Ａｌａ１１，１５］ＥＴ−１（８−２１））、サラホトキシン５６ｃ、［Ａｌａ１，３，１１，１５］ＥＴ−１、及びそれらの混合物からなる群から選ばれる。本発明の方法の別の態様において、ＥＴＢアゴニストはＩＲＬ１６２０である。
【００１２】
本発明の方法の別の態様において、化学療法薬は、アドリアマイシン、カンプトテシン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、アルファインターフェロン、ベータインターフェロン、ガンマインターフェロン、インターロイキン２、イリノテカン、ドセタキセル、パクリタキセル、トポテカン、及びそれらの混合物からなる群から選ばれる。本発明の方法の別の態様において化学療法薬はパクリタキセルである。
【００１３】
本発明の方法の別の態様において、固形腫瘍は、卵巣腫瘍、結腸腫瘍、カポジ肉腫、乳房腫瘍、黒色腫、前立腺腫瘍、髄膜腫、肝腫瘍、及び乳房葉状腫瘍からなる群から選ばれる。本発明の方法の別の態様において、固形腫瘍は乳房腫瘍である。
【００１４】
本発明の方法の別の態様において、ＥＴＢアゴニストと化学療法薬は、ＥＴＢアゴニストと化学療法薬を単一組成物として投与する；ＥＴＢアゴニストと化学療法薬を別の組成物として投与する；ＥＴＢアゴニストと化学療法薬を順に投与し、ＥＴＢアゴニストを化学療法薬より先に投与する；そしてＥＴＢアゴニストと化学療法薬を順に投与し、化学療
法薬をＥＴＢアゴニストより先に投与する；からなる群から選ばれる戦略に従って投与される。
【００１５】
本発明の方法の別の態様において、哺乳動物はヒトである。
本発明は製品も含む。一態様において、製品は、（ａ）ＥＴＢアゴニストを含む包装組成物；及び（ｂ）哺乳動物における固形腫瘍の治療に貢献するためのＥＴＢアゴニストの静脈内投与についての取扱説明を提供する添付文書；及び（ｃ）（ａ）ＥＴＢアゴニストと（ｂ）添付文書のための容器を含む。
【００１６】
本発明の製品の別の態様において、製品は、（ｄ）化学療法薬をさらに含み、取扱説明はＥＴＢアゴニストと化学療法薬の投与について規定し、容器（ｃ）は（ａ）ＥＴＢアゴニスト、（ｂ）添付文書及び（ｄ）化学療法薬のためのものである。
【００１７】
本発明の製品の別の態様において、取扱説明に従った場合、ＥＴＢアゴニストは固形腫瘍への血液供給を選択的に増大し、ひいては固形腫瘍への化学療法薬の送達が増大する。
本発明の製品の別の態様において、化学療法薬の薬物動態はＥＴＢ受容体アゴニストによって影響されない。
【００１８】
本発明の製品の別の態様において、ＥＴＢ受容体アゴニストは化学療法薬の効能を増強する。
本発明の製品の別の態様において、ＥＴＢアゴニストは、ＥＴ−１、ＥＴ−２、ＥＴ−３、ＢＱ３０２０、ＩＲＬ１６２０（Ｎ−ｓｕｃ−［Ｇｌｕ９，Ａｌａ１１，１５］ＥＴ−１（８−２１））、サラホトキシン５６ｃ、［Ａｌａ１，３，１１，１５］ＥＴ−１、及びそれらの混合物からなる群から選ばれる。本発明の製品の別の態様においてＥＴＢアゴニストはＩＲＬ１６２０である。
本発明の製品の別の態様において、化学療法薬は、アドリアマイシン、カンプトテシン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、アルファインターフェロン、ベータインターフェロン、ガンマインターフェロン、インターロイキン２、イリノテカン、ドセタキセル、パクリタキセル、トポテカン、及びそれらの混合物からなる群から選ばれる。本発明の製品の別の態様において化学療法薬はパクリタキセルである。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】パクリタキセルが誘導する腫瘍潅流における変化に及ぼすＩＲＬ１６２０の影響を示す図である。
【図２】図２Ａは、無がんラット及び乳房腫瘍ラットの全身血行動態に及ぼすＥＴ−１の影響を示す図である。図２Ｂは、無がんラット及び乳房腫瘍ラットの全身血行動態に及ぼすＥＴ−１の影響を示す図である。図２Ｃは、無がんラット及び乳房腫瘍ラットの全身血行動態に及ぼすＥＴ−１の影響を示す図である。図２Ｄは、無がんラット及び乳房腫瘍ラットの全身血行動態に及ぼすＥＴ−１の影響を示す図である。図２Ｅは、無がんラット及び乳房腫瘍ラットの全身血行動態に及ぼすＥＴ−１の影響を示す図である。
【図３】図３Ａは、無がんラット及び乳房腫瘍ラットの乳房組織における血流と局所血管抵抗に及ぼすＥＴ−１の影響を示す図である。図３Ｂは、無がんラット及び乳房腫瘍ラットの乳房組織における血流と局所血管抵抗に及ぼすＥＴ−１の影響を示す図である。
【図４】図４Ａは、無がんラット及び乳房腫瘍ラットの乳房組織における潅流、移動血球の濃度（ＣＭＢＣ）、及び血球速度に及ぼすＥＴ−１の影響を示す図である。図４Ｂは、無がんラット及び乳房腫瘍ラットの乳房組織における潅流、移動血球の濃度（ＣＭＢＣ）、及び血球速度に及ぼすＥＴ−１の影響を示す図である。図４Ｃは、無がんラット及び乳房腫瘍ラットの乳房組織における潅流、移動血球の濃度（ＣＭＢＣ）、及び血球速度に及ぼすＥＴ−１の影響を示す図である。
【図５】図５Ａは、ＥＴ−１が誘導する無がんラット及び乳房腫瘍ラットの乳房組織における血液潅流、ＣＭＢＣ、及び血球速度の変化に及ぼすＢＱ７８８の影響を示す図である。図５Ｂは、ＥＴ−１が誘導する無がんラット及び乳房腫瘍ラットの乳房組織における血液潅流、ＣＭＢＣ、及び血球速度の変化に及ぼすＢＱ７８８の影響を示す図である。図５Ｃは、ＥＴ−１が誘導する無がんラット及び乳房腫瘍ラットの乳房組織における血液潅流、ＣＭＢＣ、及び血球速度の変化に及ぼすＢＱ７８８の影響を示す図である。
【図６】乳房腫瘍ラットの腫瘍及び他の主要器官におけるパクリタキセル蓄積に及ぼすＩＲＬ１６２０の影響を示す図である。
【図７】ＨＰＬＣで測定した正常及び腫瘍ラットにおけるパクリタキセルの血漿中薬物動態分析に及ぼすビヒクル又はＩＲＬ１６２０の影響を示す図である。
【図８】液体シンチレーション計数で測定した［３Ｈ］パクリタキセルの血漿中薬物動態に及ぼすビヒクル又はＩＲＬ１６２０の影響を示す図である。
【図９】液体シンチレーション計数で測定した［３Ｈ］パクリタキセルの血漿中薬物動態に及ぼすビヒクル又はＩＲＬ１６２０の影響を示す図である。
【図１０】図１０Ａは、レーザードップラー流量計で測定した乳房腫瘍潅流に及ぼすＩＲＬ１６２０の影響を示す図である。図１０Ｂは、レーザードップラー流量計で測定した乳房腫瘍潅流に及ぼすＩＲＬ１６２０の影響を示す図である。
【図１１】乳房腫瘍ラットの腫瘍及び主要器官における［３Ｈ］パクリタキセル濃度に及ぼすＩＲＬ１６２０投与の時間依存性効果を示す図である。
【図１２】処置開始時と比較した乳房腫瘍ラットの体重における相違率を示す図である。
【図１３】乳房腫瘍ラットの腫瘍体積に及ぼすＩＲＬ１６２０投与の影響を示す図である。そして
【図１４】腫瘍の進行、停滞及び退行に及ぼすＩＲＬ１６２０投与の影響を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
詳細な説明
１．定義
本明細書中で使用される一部の用語は以下のように説明される。
“治療”又は“〜の治療に貢献する”という用語は、固形腫瘍の予防、進行又は成長の遅延、縮小、又は排除を含む。従って、これらの用語は、必要に応じて、医学療法的及び／又は予防的投与の両方を含む。
【００２１】
“容器”という用語は、医薬品の保管、輸送、投薬、及び／又は取扱に適切な任意の入れ物（レセプタクル）及び閉包（クロージャー）を意味する。
“添付文書”という用語は、医薬品に添付された情報を意味し、該情報は、製品の投与法の説明と共に、医師、薬剤師、及び患者が製品の使用に関して詳細な情報を得た上での決断を可能にするのに必要な安全性及び効能データを提供する。包装品の添付文書は一般に医薬品の“ラベル”とみなされている。添付文書は紙面又はＣＤロムなど（これらに限定されない）の多くの形態を取ることができる。
【００２２】
“プロドラッグ”という用語は、インビボで例えば加水分解によって本発明に有用な化合物に迅速に変換する化合物を意味する。プロドラッグに関する詳細な解説は、Ｈｉｇｕｃｈｉら，Ｐｒｏｄｒｕｇｓ ａｓ Ｎｏｖｅｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，
Ｖｏｌ．１４，ｏｆ ｔｈｅ Ａ．Ｃ．Ｓ．Ｄ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ，ａｎｄ ｉｎ Ｒｏｃｈｅ（ｅｄ．），Ｂｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，１９８７に提供されている。
【００２３】
ほとんどの化学療法薬はがん細胞を破壊するために標的化される細胞毒性を有しているが、その過程で体の正常の生理系にもかなりの損傷を与える。従って、化学療法薬を固形腫瘍に選択的に送達するのは大きな利点があり、がん治療におけるこれらの悪影響を回避するのに役立つ。
【００２４】
腫瘍血管の血管構造は正常血管のそれと異なる。Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ ＆ Ｊａｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，４０７：２４９（２０００）。従って、腫瘍の血管反応性も正常組織のそれと異なる。例えば、一酸化窒素供与体、ニコチンアミド及びブラジキニンアゴニストの投与は腫瘍への血流を変調する。Ｊｏｒｄａｎら，Ｉｎｔ Ｊ Ｒａｄｉａｔ Ｏｎｃｏｌ Ｂｉｏｌ Ｐｈｙｓ，４８：５６５（２０００）；Ｆｕｋｕｍｕｒａら，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ，１５０：７１３（１９９７）；Ｈｉｒｓｔら，Ｂｒ Ｊ Ｒａｄｉｏｌ，６７：７９５（１９９４）。
【００２５】
エンドセリンは血流を変調する血管作用物質で、正常乳房組織と比べて乳がん組織中に高濃度に存在する（具体的には、エンドセリンは正常乳房組織中に約０．１２ｐｇ／ｍｇであるのに対して乳がん組織中には約１２ｐｇ／ｍｇの量で存在しうる）。Ｋｏｊｉｍａら，Ｓｕｒｇ Ｏｎｃｏｌ，４（６）：３０９（１９９５）；Ｋｕｒｂｅｌら，Ｍｅｄ Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ，５２（４）：３２９（１９９９）；Ｐａｔｅｌら，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，１２６（２）：１４３（１９９７）；Ｙａｍａｓｈｉｔａら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，５２（１４）：４０４６（１９９２）；Ｙａｍａｓｈｉｔａら，Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ Ｃｈｅｍ Ｐａｔｈｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，７４（３）：３６３（１９９１）。エンドセリンは２１個のアミノ酸を有する環状ペプチドのファミリーで、哺乳動物ではＥＴ−１、ＥＴ−２及びＥＴ−３の３個のアイソフォームを含む。Ｉｎｏｕｅら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６：２８６３（１９８９）；Ｙａｎａｇｉｓａｗａら，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：４１１（１９８８）。エンドセリンは、二つの異なる細胞表面受容体ＥＴＡ及びＥＴＢに結合することによって作用する。ＥＴＢ受容体は３個のペプチドアイソタイプと同じ親和性で結合する。これに対し、ＥＴＡ受容体は、他のアイソフォームよりもＥＴ−１に高親和性で結合する。どちらの受容体もＧタンパク質共役型受容体系に属し、増殖因子、血管作用性ポリペプチド、神経伝達物質及びホルモンなどの様々な刺激からの生物学的応答を媒介する。Ｍａｓａｋｉ，Ｊ
Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，３５：Ｓ３（２０００）；Ｇｕｌａｔｉ，Ｐｒｅｆａｃｅ．Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ，４０：１２９（２０００）；Ｇｕｌａｔｉら，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２７３：Ｈ８２７（１９９７）；Ｌｅｖｉｎ，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，３３３：３５６（１９９５）。本発明の焦点であるＥＴＢ受容体は、内皮細胞（ＥＣ）及び血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）の両方に存在し、正常乳房組織と比較した場合に乳がん組織（ヒトの浸潤性乳がん組織中でも腺管及び小葉乳がん組織中でも）で増加している。Ｗｕｌｆｉｎｇら，Ｏｎｃｏｌ Ｒｅｐ，１１：７９１（２００４）；Ｗｕｌｆｉｎｇら，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，９：４１２５（２００３）；Ａｌａｎｅｎら，Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，３６（２）：１６１（２０００）。エンドセリンはＥＴＢ受容体に作用して血管拡張を起こし、乳房腫瘍組織への血流を増大する。ＥＣ上に多く見られるＥＴＢ受容体は、プロスタサイクリン及び一酸化窒素のような因子の放出によって血管拡張を起こす。ｄｅ Ｎｕｃｃｉら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，８５：９７９７（１９８８）。ＥＴ−１はＥＴＢ受容体を刺激することによって腫瘍への血流増加を起こすので、ＥＴＢ受容体アゴニストを使
えば腫瘍への血液供給を選択的に増加させることができる。こうして化学療法薬の標的化送達とその結果の効能が増大する。
【００２６】
ＥＴＢ受容体は、例えば、卵巣がん、筋線維芽細胞、カポジ肉腫と腫瘍内血管、乳がん及び黒色腫（これらに限定されない）中に示されている。Ｂａｇｎａｔｏら，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ，１５８：８４１（２００１）；Ａｌａｎｅｎら，Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，３６（２）：１６１（２０００）；Ｂａｇｎａｔｏら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，５９：７２０（１９９９）；Ｋｉｋｕｃｈｉら，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍ，２１９：７３４（１９９６）。従って、化学療法薬と組み合わせたＥＴＢ受容体アゴニストの投与は、卵巣がん、結腸がん、カポジ肉腫、乳がん、及び黒色腫（これらに限定されない）を含む固形腫瘍の治療に貢献するのに使用できる。
【００２７】
本発明に従って有用なＥＴＢアゴニストは、ＥＴ−１、ＥＴ−２、ＥＴ−３、ＢＱ３０２０、ＩＲＬ１６２０（Ｎ−ｓｕｃ−［Ｇｌｕ９，Ａｌａ１１，１５］ＥＴ−１（８−２１））、サラホトキシン５６ｃ、［Ａｌａ１，３，１１，１５］ＥＴ−１、及びそれらの混合物などであるが、これらに限定されない。［Ａｌａ１，３，１１，１５］ＥＴ−１はＥＴ−１の線形類似体で、Ｃｙｓ残基がＡｌａで置換されることによってジスルフィドブリッジが除去されている。Ｓａｅｋｉら，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，１７９：２８６（１９９１）。ＢＱ３０２０及びＩＲＬ１６２０は、ＥＴ−１の切断（トランケート）線形合成類似体で、最も広く使用されている選択的合成アゴニストである。ＩＲＬ１６２０は線形ＥＴ−類似体で、その構造はＥＴ−１のカルボキシ末端を基にしており、ＥＴＢ受容体に対して１２０，０００倍の選択性を有する。Ｏｋａｄａ ＆ Ｎｉｓｈｉｋｉｂｅ，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｄｒｕｇ Ｒｅｖ，２０：５３（２００２）；Ｄｏｕｇｌａｓら， Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，１１４：１５２９（１９９５）。ＩＲＬ１６２０は高選択的及び強力なＥＴＢアゴニストで、ＥＴＢ２サブタイプよりもＥＴＢ１受容体サブタイプに対する選択性の証拠が報告されている。Ｂｒｏｏｋｓら，Ｊ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２６ Ｓｕｐｐｌ ３：Ｓ３２２（１９９５）。
【００２８】
本発明に従って有用な化学療法薬は、例えば、アルキル化薬、代謝拮抗物質、ホルモン及びそのアンタゴニスト、放射性同位体、抗体、並びに天然産物、そしてそれらの混合物などであるが、これらに限定されない。例えば、ＥＴＢアゴニストは、ドキソルビシン及びその他のアントラサイクリン類似体のような抗生物質、シクロホスファミド（これに限定されない）のようなナイトロジェンマスタード、５−フルオロウラシル（これに限定されない）のようなピリミジン類似体、シスプラチン、ヒドロキシウレア、並びにその天然及び合成誘導体などと共に投与することができる。別の例として、腫瘍がゴナドトロピン依存性及びゴナドトロピン非依存性細胞を含む乳腺腺がんのような混合腫瘍の場合、ＥＴＢアゴニストはロイプロリド又はゴセレリン（ＬＨ−ＲＨの合成ペプチド類似体）（これらに限定されない）と組み合わせて投与できる。本発明と共に使用できる追加の非制限的化学療法薬の例は、アドリアマイシン、カンプトテシン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、インターフェロン（アルファ、ベータ及び／又はガンマ）、インターロイキン２、イリノテカン、ドセタキセル、パクリタキセル、トポテカン、並びにそれらの治療上有効な類似体及び誘導体などである。
【００２９】
本発明の一態様において、エンドセリンアゴニストは化学療法薬と組み合わせて固形腫瘍の治療に貢献するために使用される。本方法において、エンドセリンアゴニスト、とりわけＥＴＢアゴニストは、ＥＴＢ受容体に富む腫瘍への血流を増大する。従って、ＥＴＢアゴニストは、化学療法薬のためにより選択的な標的を提供し、薬剤の化学療法的効果を改良する。
【００３０】
エンドセリンアゴニストはＥＴＢ受容体を刺激して腫瘍血管を拡張し、それによって腫瘍への血流とその結果の化学療法薬の送達の増加をもたらすことは理論化されているが、ここではそれに頼らない。エンドセリンアゴニストによって起こる腫瘍の血液潅流の増加は組織の酸素化も増大させる。酸素化の改良は化学療法薬の治療作用を増強できる。エンドセリンは分裂誘発性も有しうる。エンドセリンの分裂促進作用は、一緒に投与された場合、化学療法薬の作用を増大するのにも役立ちうる。エンドセリンアゴニストの分裂促進作用は、化学療法薬の分裂細胞への取込みを改良することによって化学療法薬の作用を高めることができる。従って化学療法薬の効能が高まる。
【００３１】
がんの治療において化学療法は手術の補助として指示されることが多い。補助療法としての化学療法の目標は、原発腫瘍がコントロールされている場合の再発リスクの削減及び無病生存率の増大である。化学療法はがんの補助治療として、該疾患が転移性の場合に利用されることが多い。従って、ＥＴＢアゴニストは、固形腫瘍の治療において手術の前又は後に化学療法と組み合わせると特に有用である。
【実施例】
【００３２】
実施例１．乳房腫瘍潅流に及ぼすＩＲＬ１６２０とパクリタキセルの影響
方法
正常及び乳房腫瘍ラットにおけるＥＴ−１の全身血行動態及び局所循環効果を調べるために以下の試験を実施した。
【００３３】
一つの広く研究されている乳房腫瘍モデルは、化学誘導されたラット乳がん発生モデルである。ｖａｎ Ｚｗｉｅｔｅｎ，Ｔｈｅ ｒａｔ ａｓ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｍａｒｔｉｎｕｓ Ｎｉｊｈｏｆｆ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ｐｇ．２０６（１９８４）；Ｄａｏら，Ｊ
Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ，７１：２０１（１９８３）；Ｒｕｓｓｏら，Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ，６１：１４３９（１９７８）．Ｈｕｇｇｉｎｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１３７（１９６２）；Ｈｕｇｇｉｎｓら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，４５：１２９４（１９５９）。ラットに化学誘導された乳房腫瘍発生はヒトのがんを最も良く近似するモデルである。Ｒｕｓｓｏら，Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ，６２：２４４（１９９０）。組織構造に関してラットの乳腺はヒト女性のそれに似ている。それは乳腺管及び乳腺胞を覆う上皮と、この器官の骨格となる結合組織である間質によって形成されている。これら二つのコンパートメントは胎児発育期及び成熟期を通して連続的に相互作用している。従って、この自発性実験モデルが、ヒトがんを最もよく近似するので本試験のモデルとして選ばれた。同上。
【００３４】
化学誘導されたラットの乳がん発生は典型的には、７，１２−ジメチルベンゼン（ａ）アントラセン（ＤＭＢＡ）又はＮ−メチルニトロソウレア（ＭＮＵ）の投与によって達成される。Ｒｏｇｅｒｓら，Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｍａｍｍａｒｙ ｇｌａｎｄ ｔｕｍｏｒｓ ｉｎ ｒａｔｓ：ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ｄｉｅｔａｒｙ ｆａｔ．Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ２５５（１９９６）。ＤＭＢＡ又はＭＮＵによって誘導された腫瘍は異なる形態学的特徴を有している。特に、ＭＮＵによって誘導された腫瘍は乳房により限局し転移しにくい。Ｍａｃｅｊｏｖａら，Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｇｕｌ，３５：５３（２００１）。従って、ＭＮＵがラットに乳房腫瘍を特異的に誘導するための化学薬剤として選ばれることが多い。これらの乳房腫瘍は、線維腺腫及び乳頭腫で良性のことも、悪性のこともある。ｖａｎ Ｚｗｉｅｔｅｎ，Ｔｈｅ ｒａｔ ａｓ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｍａｒｔｉｎｕｓ Ｎｉｊｈｏｆｆ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ｐｇ．２０６（１９８４）。ラットは６対の乳腺を有し、１対は頸部、２対は胸部、１対は腹部、そして２対は鼠径部にある。同上；Ａｓｔｗｏｏｄら，Ａｍ Ｊ Ａｎａｔ，６１（１９３７）。ＭＮＵで処置したバージンラットは腹部よりも胸部に多く
の腫瘍を発生する。Ｒｕｓｓｏら，Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ，５７：１１２（１９８７）。
【００３５】
方法
１８０〜２００グラム（ｇ）の雌のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（Ｈａｒｌａｎ Ｃｏ．，ウィスコンシン州マジソン）を使用した。温度管理室（２３±１℃）、湿度（５０±１０％）、人工光（０６：００〜１８：００）下で全動物を一つのケージに３匹ずつ収容した。動物には餌と水を自由に与えた。実験は動物を少なくとも４日間環境に慣らした後で実施した。
【００３６】
Ｎ−メチルニトロソウレア（ＭＮＵ）はＡｓｈ Ｓｔｅｖｅｎｓ Ｉｎｃ．（ミシガン州デトロイト）から購入した。ＩＲＬ１６２０とエンドセリン−１（ＥＴ−１）はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｉｎｃ．（カリフォルニア州サニーベール）から入手した。ＥＴ−１を０．１％アルブミンに溶解した。
【００３７】
ＭＮＵ（５０ｍｇ／ｋｇ）又は生理食塩水（１ｍｌ／ｋｇ）を雌のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットに腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。腫瘍が直径２〜４ｃｍに達した後、血流実験を実施した。
【００３８】
ラットをウレタン（１．５ｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ミズーリ州セントルイス）で麻酔し、薬物投与のため左大腿静脈にカニューレを挿入した（ＰＥ ５０管、Ｃｌａｙ Ａｄａｍｓ，ニュージャージー州パーシパニー）。
【００３９】
動物を以下の群に分けた。
（ｉ）正常ラットに生理食塩水注射、１５分後にパクリタキセル（３ｍｇ／ｋｇ）（Ｎ＝４）；
（ii）正常ラットにＩＲＬ１６２０（３ｎｍｏｌ／ｋｇ）注射、１５分後にパクリタキセル（３ｍｇ／ｋｇ）（Ｎ＝４）；
（iii）腫瘍ラットに生理食塩水注射、１５分後にパクリタキセル（３ｍｇ／ｋｇ）（
Ｎ＝４）；及び
（iv）腫瘍ラットにＩＲＬ１６２０（３ｎｍｏｌ／ｋｇ）注射、１５分後にパクリタキセル（３ｍｇ／ｋｇ）（Ｎ＝４）。
【００４０】
ラットの乳腺への血液潅流はレーザードップラー流量計を用いて測定した。Ｓｏｎｇら，Ｉｎｔ Ｊ Ｒａｄｉａｔ Ｏｎｃｏｌ Ｂｉｏｌ Ｐｈｙｓ，１８：９０３（１９９０）；Ｓｏｎｇら，Ｉｎｔ Ｊ Ｒａｄｉａｔ Ｏｎｃｏｌ Ｂｉｏｌ Ｐｈｙｓ，１７：１０４１（１９８９）参照。この過程で動物の乳頭周辺を剃毛し、乳腺周辺の皮膚を切開した。標準モデルの光ファイバープローブを乳腺動脈に固定し、Ｐｅｒｉｆｌｕｘ ＰＦ２ｂ ４０００レーザードップラー流量計（Ｐｅｒｉｍｅｄ ＫＢ，スウェーデン、ストックホルム）に接続した。時定数を１．５秒にセットし、帯域幅を４ＫＨｚにセットした。データは分散分析（ＡＮＯＶＡ）、次いでダンカン検定を用いて分析した。ｐ＜０．０５の水準を有意とみなした。
【００４１】
結果
正常ラットの乳房組織への血流に、生理食塩水又はＩＲＬ１６２０及びパクリタキセルの投与後、変化は観察されなかった。腫瘍組織中の血流はＩＲＬ１６２０注射後（３６．３％、ｐ＜０．０５）及びパクリタキセル投与後（５１．９％、ｐ＜０．０−５）、ベースラインとの間に有意の差が観察された（図１参照）。
【００４２】
実施例２．正常及び腫瘍ラットの全身血行動態及び乳房組織への血流に及ぼすＥＴ−１注入の影響
方法
ＭＮＵ及び生理食塩水処置は腹腔内注射として試験の３ヶ月前に実施した。ラットは処置の４週間後から定期的に触診し始めた。腫瘍の直径が４〜８ｍｍに達したら実験を開始した。
【００４３】
ラットをウレタン（１．５ｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ミズーリ州セントルイス）で麻酔した。すべての術域を剃毛し、アルコール消毒綿で清拭した。薬物投与のため左大腿静脈にカニューレを挿入した（ＰＥ ５０管、Ｃｌａｙ Ａｄａｍｓ，ニュージャージー州パーシパニー）。左大腿動脈にもカニューレを挿入し（ＰＥ ５０管）、回収ポンプ（Ｍｏｄｅｌ ２２，Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ，マサチューセッツ州サウスナティック）を用いて微小球試験の参照血液サンプルの回収に使用した。右大腿動脈にカニューレを挿入し（ＰＥ ５０管）、Ｇｒａｓｓ Ｐ７Ｄ ポリグラフ（Ｇｒａｓｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．，マサチューセッツ州クインシー，ＵＳＡ）上で血圧を記録するため、７ＰＩ前置増幅器を通してＧｏｕｌｄ Ｐ２３ ＩＤ圧力トランスデューサに接続した。心拍数（ＨＲ）は血圧信号で始動する７Ｐ４Ｂ Ｇｒａｓｓタコグラフ（Ｇｒａｓｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．，マサチューセッツ州クインシー）を通じて記録した。右頸動脈を露出し、ＰＥ ５０管を総頸動脈から左心室に導入した。左心室内にカニューレがあるかどうかは、Ｓｔａｔｈａｍ Ｐ２３ ＤＣ圧力トランスデューサ（Ｇｒａｓｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．，マサチューセッツ州クインシー）を用いてＧｒａｓｓポリグラフ上に血圧を記録することによって確認した。カニューレが左心室に到達している場合、拡張期血圧はゼロに降下する。血中ｐＯ２、ｐＣＯ２、及びｐＨを一定に維持するため、そして血圧及びＨＲに対する呼吸の影響を回避するため、動物は齧歯類用人工呼吸器（Ｍｏｄｅｌ ６８３，Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ Ｉｎｃ．，マサチューセッツ州サウスナティック）に接続された気管内カニューレの挿入によって定速人工呼吸の状態にした。
【００４４】
ラットを最初に２群に分け、それぞれ以下の処置の一つを受けさせた。
（ｉ）生理食塩水で処置されたラットに３０分間ＥＴ−１（５０ｎｇ／ｋｇ／分）注入（Ｎ＝６）；及び
（ii）ＭＮＵ（５０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）で処置されたラットに３０分間ＥＴ−１（５０ｎｇ／ｋｇ／分）注入（Ｎ＝６）。
【００４５】
次に、ＥＴ−１注入によって誘導される、正常ラット及び乳房腫瘍ラットの全身血行動態及び乳房組織への血流における変化に対するＥＴＢ受容体の役割を評価するために以下の群について試験した。
【００４６】
（ｉ）生理食塩水処置ラットに、ＢＱ７８８（（Ｎ−シス２，６−ジメチルピペリジノカルボニル−Ｌ−ガンマ−メチル−ロイシル−Ｄ−１−メトキシカルボニルトリプトファニル−Ｄ−Ｎｌｅ）；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｉｎｃ．（カリフォルニア州サニーベール）から入手、生理食塩水に０．５ｐｍｏｌ／ｋｇで溶解））を２０分間注入、次いでＥＴ−１（５０ｎｇ／ｋｇ／分）を３０分間注入（Ｎ＝５）；
（ii）ＭＮＵ（５０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）処置ラットに、ＢＱ７８８（０．５ｐｍｏｌ／ｋｇ）を２０分間注入、次いでＥＴ−１（５０ｎｇ／ｋｇ／分）を３０分間注入（Ｎ＝５）。
【００４７】
全身血行動態と局所循環パラメータは、ベースライン、ＥＴ−１（５０ｎｇ／ｋｇ／分）注入開始後３０、６０、及び１２０分の時点で測定した。ＥＴ−１の注入は３０分間行われるので、３０分のデータはＥＴ−１の効果を示し、６０及び１２０分のデータはＥＴ−１効果の持続時間を示す。
【００４８】
全身血行動態と局所血液循環は文献に記載の手順を用いて測定した。Ｇｕｌａｔｉら，Ｊ Ｌａｂ Ｃｌｉｎ Ｍｅｄ，１２６：５５９（１９９５）；Ｇｕｌａｔｉら，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．，５５：８２７（１９９４）；Ｓｈａｒｍａら，Ａｒｔｉｆ Ｃｅｌｌｓ Ｂｌｏｏｄ Ｓｕｂｓｔｉｔ Ｉｍｍｏｂｉｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２２：５９３（１９９４）参照。各測定で、４６Ｓｃ（スカンジウム）、１１３Ｓｎ（スズ）、１４１Ｃｅ（セリウム）、又は９５Ｎｂ（ニオブ）で標識した約１００，０００個の微小球（直径１５±１μｍ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，マサチューセッツ州ボストン，ＵＳＡ）の０．２ｍｌ生理食塩水中完全混合懸濁液を左心室に注射し、１５秒間かけて０．３ｍｌの生理食塩水で洗い流した。血流を計算するために、動脈血を右大腿動脈から０．５ｍｌ／分の速度で回収した。血液の回収は、微小球注射の約５〜１０秒前に開始し、９０秒間実施した。実験終了時、ペントバルビタールナトリウムを過剰投与して動物を犠死させた。全組織及び器官を切離し、重量測定し、バイアルに入れた。標準、血液サンプル、及び組織サンプル中の放射能を、同位体エネルギーを区別するプリセットウィンドウ付きＰａｃｋａｒｄ Ｍｉｎａｘｉ Ａｕｔｏ−Ｇａｍｍａ ５０００シリーズのガンマカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｃｏ．，イリノイ州ダウナーズグローブ）でカウントした。下記のパラメータを計算した。（１）心拍出量（ＣＯ）（（注射した放射能×動脈血の回収速度）／採取した動脈血中の放射能）、（２）１回拍出量（ＳＶ）（ＣＯ／ＨＲ）、（３）全末梢血管抵抗（ＴＰＲ）（平均動脈圧（ＭＡＰ）／ＣＯ）、（４）局所血流量（（組織中の放射能×動脈血の回収速度）／採取した動脈血中の放射能）、及び（５）局所血管抵抗（ＭＡＰ／局所血流量）。データは文献に記載のコンピュータプログラムを用いて計算した。Ｓａｘｅｎａら，Ｃｏｍｐｕｔ Ｐｒｏｇｒａｍｓ Ｂｉｏｍｅｄ，１２：６３（１９８０）。
【００４９】
ラットの乳腺への血液潅流はレーザードップラー流量計を用いて測定した。Ｓｏｎｇら，Ｉｎｔ Ｊ Ｒａｄｉａｔ Ｏｎｃｏｌ Ｂｉｏｌ Ｐｈｙｓ，１８：９０３（１９９０）；Ｓｏｎｇら，Ｉｎｔ Ｊ Ｒａｄｉａｔ Ｏｎｃｏｌ Ｂｉｏｌ Ｐｈｙｓ，１７：１０４１（１９８９）参照。動物の乳頭周辺を剃毛した。乳腺周辺の皮膚を幅約６ｃｍ及び長さ約４ｃｍの断片(lambeau)として切離した。標準モデルの光ファイバープローブ
を断片表面に当て、両面接着テープで組織に固定した。断片を金属ホルダーに入れ、動きを防止するためにテープで貼り付けた後、Ｐｅｒｉｆｌｕｘ ＰＦ２ｂ ４０００レーザードップラー流量計（Ｐｅｒｉｍｅｄ ＫＢ，スウェーデン、ストックホルム）に接続した。時定数を１．５秒にセットし、帯域幅を４ＫＨｚにセットした。データは分散分析、次いでダンカン検定を用いて分析した。ｐ＜０．０５の水準を有意とみなした。
【００５０】
結果
正常（生理食塩水処置）ラットにおけるベースラインの全身血行動態のパラメータは、ＭＡＰ：１１１．１±４．８ｍｍＨｇ；ＣＯ：２６８．６±１７．６ｍｌ／分；ＳＶ：０．８７±０．０６ｍｌ；ＴＰＲ：４１９．６±．２４．３７ｍｍＨｇ．分／ｍｌ；及びＨＲ：３１２．５±２０．２拍／分。正常ラットでは、ＭＡＰの有意の増加がＥＴ−１注入後３０分時点（１４．５％；ｐ＜０．０５）、及び減少が１２０分時点（１７．８％；ｐ＜０．０５）で観察された。ＴＰＲは１２０分時点で増加した（４９．２％；ｐ＜０．０５）。ＣＯはＥＴ−１注入後６０及び１２０分時点で減少した（それぞれ２２．９％及び４２．５％；ｐ＜０．０５）。ＳＶは６０及び１２０分時点で減少した（それぞれ２０．９％及び３６％；ｐ＜０．０５）。ＨＲには有意の変化は観察されなかった（図２Ａ〜２Ｅ）。
【００５１】
腫瘍（ＭＮＵ処置）ラットにおけるベースラインの全身血行動態のパラメータは正常ラットのそれと類似していた。腫瘍ラットでは、ＭＡＰの有意の増加がＥＴ−１注入後３０分時点（１９．１％；ｐ＜０．０５）及び６０分時点（１５．３％；ｐ＜０．０５）で観
察された。ＴＲＦはＥＴ−１の投与後３０分時点（７３．９％；ｐ＜０．０５）、６０分時点（３９．７％；ｐ＜０．０５）、及び１２０分時点（７１．４％；ｐ＜０．０５）で増加した。ＣＯは３０、６０及び１２０分時点で減少した（それぞれ２９．４％、１６．７％及び３６．１％；ｐ＜０．０５）。ＳＶは３０、６０及び１２０分時点で有意に減少した（それぞれ３１．１％、１７．９％及び３２．１％；ｐ＜０．０５）。ＨＲには変化は観察されなかった（図２Ａ〜２Ｅ）。
【００５２】
ＥＴ−１投与後、正常の生理食塩水処置ラットの乳房組織への血流に変化は観察されなかった。正常ラットの乳房組織では、６０分時点で血管抵抗に有意の減少（１８．６１％；ｐ＜０．０５）が観察された。これはＥＴ−１注入後３０分のことである（図３Ａ〜３Ｂ）。
【００５３】
腫瘍（ＭＮＵ処置）ラット及び正常（生理食塩水処置）ラットの乳房組織における血流及び局所血管抵抗の間に有意の差が観察された。正常ラットと比べた場合に腫瘍ラットの乳房組織への血流に有意の増加（１５３％；ｐ＜０．０５）がＥＴ−１投与後６０分時点で観察された。腫瘍ラットの血管抵抗は、正常ラットと比べて、ベースライン（１０２％；ｐ＜０．０５）及びＥＴ−１投与後６０分時点（１４７％；ｐ＜０．０５）で有意に異なっていた（図３Ａ〜３Ｂ）。
【００５４】
図４Ａ〜４Ｃは、腫瘍及び正常ラットの乳房組織における潅流、移動血球の濃度（ＣＭＢＣ）、及び赤血球（ＲＢＣ）の速度の変化を示す。ＥＴ−１投与後正常ラットの乳房組織中の血液潅流は変化しなかった。ＥＴ−１投与後３０分時点における腫瘍ラットの乳房組織中の潅流は、正常ラットと比べて有意に増加した（１７６％；ｐ＜０．０５）。腫瘍ラットにおけるこの潅流の増加はＥＴ−１投与後６０及び１２０分時点でベースラインに戻った。
【００５５】
腫瘍ラットのＣＭＢＣは、ＥＴ−１投与後６０分時点で正常ラットと比べて有意に増加した（５４％；ｐ＜０．０５）。ＣＭＢＣはＥＴ−１投与後１２０分時点でベースラインに戻った。ＲＢＣの速度はＥＴ−１投与後３０分時点で正常ラットと比べて有意に増加した（２５２％；ｐ＜０．０５）。ＥＴ−１投与２時間（１２０分）後に腫瘍ラットのＲＢＣの速度はベースラインに戻った（図４Ａ〜４Ｃ）。
【００５６】
図５Ａ〜５Ｃは、それぞれ腫瘍及び正常ラットの血液潅流、ＣＭＢＣ、及びＲＢＣの速度における、ＥＴ−１が誘導する変化に及ぼすＢＱ７８８の影響を示す。正常ラットの乳房組織中の血液潅流はＢＱ７８８投与又はＥＴ−１注入後も有意に変化しなかった。しかしながら、腫瘍ラットの乳房腫瘍組織中の潅流は、ＢＱ７８８前処置ラットでＥＴ−１注入後３０分時点（２５．２５．±．５．７％；ｐ＜０．０５）及び６０分時点（２５．１７．±．５．７％；ｐ＜０．０５）で有意に減少した。ＢＱ７８８による前処置は、腫瘍ラットでＥＴ−１によって誘導される潅流の増加を減弱した。ＢＱ７８８前処置ラットではＥＴ−１投与後、腫瘍ラットと正常ラットの乳房組織中の潅流の間に差は観察されなかった。
【００５７】
腫瘍ラットのベースラインＣＭＢＣは正常ラットの乳房組織のベースラインＣＭＢＣより有意に高かった（４２．２％；ｐ＜０．０５）。しかしながらＢＱ７８８注入後は腫瘍及び正常ラットのＣＭＢＣ間に差は観察されなかった。さらにこの２群間にはＲＢＣの速度の差も観察されなかった（図５Ａ〜５Ｃ）。
【００５８】
上記試験は、生理食塩水処置及びＭＮＵ処置腫瘍ラットの全身血行動態及び乳房組織への血流に及ぼすＥＴ−１の影響を示している。ＥＴ−１はＶＥＧＦの産生を促進することによって血管新生を刺激することが知られている。ＥＴ−１は多くのがん組織で増加して
いることが研究によって示されている。例えば、乳がん（Ｙａｍａｓｈｉｔａら，Ｒｅｓ
Ｃｏｍｍｕｎ Ｃｈｅｍ Ｐａｔｈｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，７４：３６３（１９９１））、乳房葉状腫瘍（Ｙａｍａｓｈｉｔａら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，５２：４０４６（１９９２））、前立腺がん（Ｎｅｌｓｏｎら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，５６：６６３（１９９６））、肝がん（Ｋａｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２１６：５１４（１９９５））、及び一部の髄膜腫（Ｐａｇｏｔｔｏら，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，９６：２０１７（１９９５））などのがん組織である。上記試験は、乳房腫瘍でＥＴ−１が誘導する血管応答の変化を示している。これらの試験で使用された方法は、全身血行動態及び局所血液循環を調べるためのよく確立された放射性微小球技術であった。Ｇｕｌａｔｉら，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２７３：Ｈ８２７（１９９７）；Ｇｕｌａｔｉら，Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ，２４：１３７（１９９６）；Ｇｕｌａｔｉら，Ｊ Ｌａｂ Ｃｌｉｎ Ｍｅｄ，１２６：５５９（１９９５）；Ｇｕｌａｔｉら，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ，５５：８２７（１９９４）。
【００５９】
腫瘍ラットの乳房腫瘍組織へのベースライン血流は正常動物の血流より高かった。これは以前の研究で観察され、腫瘍における新規血管の動員によるものであると理論化されている（それに頼らない）。Ｖａｕｐｅｌ，Ｂｌｏｏｄ ｆｌｏｗ，ｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ，ｔｉｓｓｕｅ ｐＨ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ，ａｎｄ ｂｉｏｅｎｅｒｇｅｔｉｃ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒｓ．Ｅｒｎｓｔ Ｓｃｈｅｒｉｎｇ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｌｅｃｔｕｒｅ ２３，Ｂｅｒｌｉｎ（１９９４）。ＥＴ−１投与後の乳房腫瘍への血流は、正常ラットの乳房組織で観察されるものと比べて有意に増加した。乳房腫瘍への血液潅流の増加を示すレーザードップラー流量測定から、ＥＴ−１投与後乳房腫瘍組織で観察された血流増加が確認された。血液潅流の増加は、ＲＢＣの速度又はＣＭＢＣのいずれか、又はその両方の増加によるものであると理論化されている（それに頼らない）。ＥＴ−１注入の終了時、ＲＢＣの速度の増加が観察されたが、ＣＭＢＣの増加はＥＴ−１注入の３０分後に観察された。
【００６０】
さらに、ＥＴ−１に応答して観察された血流の増加は、ＥＴＢが媒介する血管拡張によるものであると理論化されている（それに頼らない）。研究によれば、ＥＴ−１及びＥＴＢ受容体の発現は乳がん組織で増大していることが示されている。Ａｌａｎｅｎら，Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，３６：１６１（２０００）；Ｙａｍａｓｈｉｔａら，Ｒｅｓ
Ｃｏｍｍｕｎ Ｃｈｅｍ Ｐａｔｈｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，７４：３６３（１９９１）。本発明よれば、ＢＱ７８８の投与はＥＴ−１が誘導する腫瘍組織への血流の増加を阻止することがわかった。ＢＱ７８８（すなわち、Ｎ−シス−２，６−ジメチルピペリジノカルボニル−Ｌ−ガンマ−メチル−ロイシル−Ｄ−１−メトキシカルボニルトリプトファニル−Ｄ−Ｎｌｅ）は、特異的なＥＴＢ受容体アンタゴニストである。ＢＱ７８８はＥＴＢ受容体への結合を１．２ｎＭのＩＣ５０値で阻害する。
【００６１】
ＢＱ７８８は、乳房腫瘍でＥＴ−１が誘導する血管拡張におけるＥＴＢ受容体の役割を決定するのに使用された。この結果から、ＥＴ−１が誘導する血管拡張応答はＥＴＢ受容体を通して媒介されることが示唆される。ＥＴＢ受容体の発現は、平滑筋細胞よりも内皮細胞で高く、様々な増殖因子及びサイトカインによって調節されている。Ｓｍｉｔｈら，Ｊ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，３１：Ｓ１５８（１９９８）。正常乳房組織はＥＴＡ受容体よりもＥＴＢ受容体を高濃度に有しており（Ａｌａｎｅｎら，Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，３６：１６１（２０００））、乳がん時にはＥＴＢ受容体が過剰発現して腫瘍組織への血流維持に貢献していると理論化されている（それに頼らない）。
【００６２】
まとめると、記載した実験は、ＥＴ−１の注入は乳房腫瘍組織における血流の増加と血管抵抗の減少を起こし、そしてこの血流の増加はＥＴＢ受容体アンタゴニストによって阻
止できることを示している。
【００６３】
実施例３．腫瘍の血液潅流及び化学療法薬送達に及ぼすＩＲＬ１６２０の影響
前の実験で、乳房腫瘍ラットへのＥＴ−１投与は、ＥＴＢ受容体の刺激によって腫瘍組織への血流を選択的に増大することが示された。この実施例で記載する実験は、ＥＴＢ受容体アゴニストのＩＲＬ１６２０が乳房腫瘍及び黒色腫の潅流に及ぼす影響と腫瘍及びその他の主要器官におけるパクリタキセル蓄積に及ぼす影響を調べるために実施する。
【００６４】
方法
Ｎ−メチルニトロソウレア（ＭＮＵ；５０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）によってバージン雌Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（４８日齢）に乳房腫瘍を誘導する。腫瘍体積が３００〜５００ｍｍ３のラットを前述のようにウレタンで麻酔し（１．５ｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）、生理食塩水（０．３ｍｌ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）又はＩＲＬ１６２０（３ｎｍｏｌ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）で処置した。腫瘍の潅流は前述のようにＰｅｒｉｆｌｕｘ ＰＦ２ｂ ４０００レーザードップラー流量計を用いて１０時間測定する。第二の試験で、ヌードマウスに１００万個のヒト黒色腫細胞（ＵＩＳＯ−ＭＥＬ−２）を皮下接種する。腫瘍体積が３００〜５００ｍｍ３のマウスを前述のように生理食塩水又はＩＲＬ１６２０で処置し、潅流を前述のように３時間測定する。実験は、高められた潅流が腫瘍組織におけるパクリタキセルの蓄積を増加するかどうかを調べるためにも実施する。［３Ｈ］−パクリタキセル（１０μＣｉ／マウス）を黒色腫マウスに、ＩＲＬ１６２０又は生理食塩水の１５分後に投与する。動物は［３Ｈ］−パクリタキセル投与３時間後に犠死させる。腫瘍及び主要器官を切離、秤量、そして組織溶解剤に溶解し、放射能を当業者に周知の技術によって測定する。具体的には、血漿サンプル中の［３Ｈ］−パクリタキセルの濃度をＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ液体シンチレーションカウンター（モデルＬＳ ６５００）を用いて測定する。血漿は解凍して２０ｍＬの液体シンチレーションカクテルと混合する。サンプルをカウントする。カウントは次式を用いて“ｄｐｍ”の単位から“ｆｍｏｌ／ｍＬ”に換算する。
【００６５】
ｆｍｏｌ／ｍＬ＝ｄｐｍ値×崩壊因子×２．２×１０−１２／１０−１２×サンプル体積ｍＬ
【００６６】
結果
ＩＲＬ１６２０は、乳房腫瘍ラット及び黒色腫マウスの腫瘍潅流を有意に増加する。ＩＲＬ１６２０の投与は、乳房腫瘍及び黒色腫動物の腫瘍潅流にそれぞれ１５０％及び３１８％の増加をもたらす。ＩＲＬ１６２０で処置したマウスでは生理食塩水処置マウスと比べて腫瘍中のパクリタキセル濃度に７３０％の増加が見られる。しかしながら、ＩＲＬ１６２０は他の主要器官中のパクリタキセル濃度を有意に増大しない。結果を図６に示す。
【００６７】
実施例４．パクリタキセルの薬物動態に及ぼすＩＲＬ１６２０の影響
体内の血流動態の変更は治療薬の薬物動態に著しく影響を及ぼすことができる。パクリタキセルは複雑な薬物動態性を持つことが知られている。例えば、Ｓｐａｒｒｅｂｏｏｍら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５６：２１１２（１９９６ａ）；Ｇｉａｎｎｉら，Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ ８７：１１６９（１９９５ｂ）；Ｓｏｎｎｉｃｈｓｅｎ
＆ Ｒｅｌｌｉｎｇ，Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ ２７：２５６（１９９４）；Ｈｕｉｚｉｎｇら，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ １１：２１２７（１９９３）；Ｂｒｏｗｎら，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ９： １２６１（１９９１）；Ｌｏｎｇｎｅｃｋｅｒら，Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ Ｒｅｐ ７１：５３（１９８７）；Ｗｉｅｍｉｋら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ４７：２４８６（１９８７ｂ）参照。そこで、パクリタキセルの血漿中薬物動態に及ぼすＩＲＬ１６２０の影響を理解することが重要となる。従って、本試験は、選択的ＥＴＢ受容体アゴニストのＩＲＬ１６２０が乳房腫瘍ラットでパクリタ
キセルの薬物動態を変更するかどうかを調べるために実施した。
【００６８】
方法
ＩＲＬ１６２０はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州セントルイス）から購入した。パクリタキセル（６ ｍｇ／ｍＬ溶液）はＢｅｎ Ｖｅｎｕｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．（オハイオ州ベッドフォード）から購入した。ケタミン及びキシラジンはＰｈｏｅｎｉｘ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．（ミズーリ州セントジョーゼフ）から購入した。［３Ｈ］−パクリタキセル（ｌｍＣｉ，６．４Ｃｉ／ｍｍｏｌ，比活性）はＭｏｒａｖｅｋ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｏｒａｖｅｋ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，カリフォルニア州）から購入した。ウレタンはＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ミズーリ州セントルイス）から購入した。
【００６９】
バージン雌Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（Ｈａｒｌａｎ Ｃｏ．，ウィスコンシン州マジソン）、４８日齢（１２０〜１４０ｇ）をこの試験に使用した。到着後、管理された温度（２３±１℃）、湿度（５０±１０％）及び人工光（０６：００〜１８：００）の部屋で全ラットを一つのケージに３匹ずつ収容した。ラットには餌と水を自由に与えた。実験はラットを少なくとも４日間環境に慣らした上でのみ実施した。
【００７０】
Ｎ−メチル−ｎ−ニトロソウレア（ＭＮＵ）を５０ｍｇ／ｋｇの用量でｉ．ｐ．投与し、週２回ラットを触診した。腫瘍が７５〜１００ｍｍ３に達したら薬物動態試験を実施した。
【００７１】
ＨＰＬＣ−ＵＶ試験．ウレタン（１．５ｍｇ／ｋｇ）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ミズーリ州セントルイス）の１回ｉ．ｐ．注射でラットを麻酔した。右大腿部を剃毛し、外科用消毒薬及びアルコールで清拭した。右大腿動脈及び静脈を露出し、無菌ＰＥ−５０管を挿入した。頸部を剃毛し、外科用消毒薬及びアルコールで清拭した。頸部付近を正中切開し、気管挿管して齧歯類用人工呼吸器（Ｍｏｄｅｌ ６８３，Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ Ｉｎｃ．，マサチューセッツ州サウスナティック）につないだ。全手術とも無菌状態で実施した。感染防止のためにネオスポリン抗生物質クリーム（Ｐｆｉｚｅｒ，ニュージャージー州モリスプレーンズ）を傷に塗布した。薬物投与の前に４５分間の回復時間を与えた。
【００７２】
正常及び腫瘍ラットを使用した。ＩＲＬ１６２０（３ｎｍｏｌ／ｋｇ）又はビヒクル（生理食塩水、３ｍＬ／ｋｇ）投与１５分後にパクリタキセルをｉ．ｖ．投与した（３ｍｇ／ｋｇ）。ＩＲＬ１６２０投与前に採血してベースライン値を得た。ラットから０．５ｍＬの血液をヘパリン処理シリンジに、ベースライン、パクリタキセル投与後５、３０分、そして２、６、及び１０時間の時点で採取した。サンプルを遠心分離し、血漿を回収して分析まで−８０℃で保存した。
【００７３】
血漿サンプルをＨＰＬＣシステムを用いてパクリタキセルについて分析した。手短に述べると、血漿を解凍し、５０μＬの内部標準Ｎ−シクロヘキシルベンズアミド（低標準曲線３ｍＭ、高標準曲線３０ｍＭ）及び３ｍＬのエチルエーテル（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，イリノイ州シカゴ）と１３×１００のガラス培養管で混合した。混合物を往復式振盪器を用いて５分間振盪し、次いで３，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した。得られた上清を１３×１００のホウケイ酸ガラス培養管に移し、窒素流下、加熱水浴（３７℃）中で蒸発させた。残渣を２００μＬの移動相Ａ（５０％脱イオン水、５０％アセトニトリル）で再構成した（もどした）。再構成材料の１００μＬ分（低標準曲線、ＩＶ投与後に回収したサンプル）を４ｍｍ ＮｏｖａＰａｋ １５０×３．９ｍｍ Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，マサチューセッツ州ミルフォード）に注入した。その手前には４ｍｍ ＮｏｖａＰａｋ ２０×３．９ｍｍ Ｃ１８プレカラムが
ある。装置は、２２７ｎｍにセットしたＷａｔｅｒｓ ２４８７吸光度検出器に接続したＷａｔｅｒｓ ２６９５セパレーションモジュールを用いた。１００％の移動相Ａを流速１ｍＬ／分で送液して直線勾配（リニアグラジエント）を開始した。次いで移動相Ａを１０〜１１分に７０％に下げ、移動相Ａを１１〜１６分の間７０％に維持してカラムからゆっくり溶出する物質を次の注入の前に除去した。その後、移動相Ａを１６〜１７分に１００％に上げ、１００％移動相Ａを３分間維持して、合計の運転時間を２０分とした。パクリタキセルの血漿中濃度は、パクリタキセルピーク面積のＮ−シクロヘキシルベンズアミドピーク面積に対する比率から、線形最小二乗回帰を用い、１／×で重み付けして計算した。変動係数によって測定した日内及び日間変動は＜１０％であった。正常及び腫瘍ラットの血漿中濃度のプロファイルを比較した。
【００７４】
液体シンチレーション計数試験．ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）とキシラジン（２ｍｇ／ｋｇ）の併用１回ｉ．ｐ．注射でラットを麻酔した。頸部を剃毛し、外科用消毒薬及びアルコールで清拭した。右頸動脈を露出し、無菌ＰＥ−５０管を挿入した。頸部付近を正中切開し、血液採取のため左頸動脈にＰＥ５０管を挿入した。カテーテルは皮下に潜らせて頸部の基部で体外に出し、その後切開部分を外科用ステープルで閉じた。Ｂｕｅｈｌｅｒら，Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ ３７：１２４（２００４）。開いている管は釣り糸で栓をした。全手術とも無菌状態で実施した。感染防止のためにネオスポリン抗生物質クリーム（Ｐｆｉｚｅｒ，ニュージャージー州モリスプレーンズ）を傷に塗布した。薬物投与の前に４５分間の回復時間を与えた。
【００７５】
ＩＲＬ１６２０を腫瘍動物に３ｎｍｏｌ／ｋｇの用量でｉ．ｖ．投与した。［３Ｈ］−パクリタキセル（１６０μＣｉ／ｋｇ）を非標識パクリタキセルと混合した。パクリタキセルは、ビヒクル又はＩＲＬ１６２０の投与１５分後にｉ．ｖ．投与した。
【００７６】
ビヒクル又はＩＲＬ１６２０投与前に血漿を採取してベースライン値を得た。約０．２ｍＬの血液をラットからヘパリン処理シリンジに、ベースライン、１、５、１５、３０分、１、２、４、６、８、１２及び２４時間の時点で採取した。サンプルを遠心分離し、血漿を分離して分析まで−８０℃で保存した。
【００７７】
血漿サンプル中の［３Ｈ］−パクリタキセルの濃度をＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ液体シンチレーションカウンター（モデルＬＳ ６５００）を用いて測定した。手短に言うと、血漿を解凍して２０ｍＬの液体シンチレーションカクテルと混合した。サンプルをカウントし、カウントは次式を用いて“ｄｐｍ”の単位から“ｆｍｏｌ／ｍＬ”に換算した。
【００７８】
ｆｍｏｌ／ｍＬ＝ｄｐｍ値×崩壊因子×２．２×１０−１２／１０−１２×サンプル体積ｍＬ
ｆｍｏｌ／ｍＬへの換算後、全パクリタキセルの薬物動態を、［３Ｈ］−パクリタキセルの非標識パクリタキセルに対する比率を用いて計算した。血漿中パクリタキセルの薬物動態の見積は、ノンコンパートメント及びコンパートメント解析の両方を用いて決定した（ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ Ｐｒｏ ４．ｌ（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐ，カリフォルニア州マウンテンビュー）で実行）。
【００７９】
ノンコンパートメント解析では、曲線下面積（ＡＵＣ０−∞）を、最終測定可能濃度（Ｃｌａｓｔ）まで台形法を用い、Ｃｌａｓｔを対数直線の血漿中濃度vs時間曲線の終末部分の傾き（λ）（負の数）で割ることによって無限大まで外挿して推定した。以下のパラメータも算出した。平均滞留時間（ＭＲＴｉｖ）は全身クリアランスの逆数として計算し、全身クリアランス（ＣＬ）はＡＵＣ０−∞に対する用量の比率として計算し、見かけの容積分布はＣＬ及びλの比率として計算した。血漿中半減期は０．６９３（２の自然対数
）とＭＲＴｉｖの積として計算した。
【００８０】
コンパートメント解析では、一連の非線形コンパートメントモデルを血漿中濃度vs時間曲線データに当てはめた。具体的には、１コンパートメント、２コンパートメント及び３コンパートメントモデルを比較した。統一及び予測データに基づく重み付けを試験した。最終のモデル選択は、診断的プロット（観測値vs予測値及び残差プロット）、Ａｋａｉｋｅ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ（ＡＩＣ）及びＳｃｈｗａｒｔｚ Ｃｒｉｔｅｒｉａ（ＳＣ）に基づいた。低いＡＩＣ及びＳＣ基準を有するモデルを最終モデルとみなした。
【００８１】
データは、ＨＰＬＣ−ＵＶについては一元ＡＮＯＶＡに続いてダンカン検定によって、液体シンチレーション試験についてはｔ検定によって分析した。ｐ＜０．０５を有意とみなした。これらの薬理反応試験で測定された主な結果は、血漿中のパクリタキセル濃度の違いであった。
【００８２】
結果
パクリタキセルの薬物動態プロファイルは、正常及び腫瘍ラットともＩＲＬ１６２０の投与に影響されなかった（図７及び８）。血漿中薬物動態プロファイルのＨＰＬＣ分析は、より広範な放射性パクリタキセルの動態のプロファイルと類似している。図８は、ビヒクル処置及びＩＲＬ１６２０処置腫瘍ラットにおけるパクリタキセルの放射能の薬物動態プロファイルを描いている。薬物動態プロファイルはノンコンパートメント及びコンパートメント法によって解析した。
【００８３】
ノンコンパートメント解析では、ビヒクル＋パクリタキセル群について計算されたＡＵＣは９４３３．５３±１４６５．００ｎｇ＊ｈ／ｍＬで、ＩＲＬ１６２０処置腫瘍ラットのそれと類似していた（ｐ＞０．０５）。消失半減期は０．１４ ±０．０８時間と計算
された。用量／ＡＵＣとして計算されたクリアランスは０．５６ ±０．０７Ｌ／ｈ／ｋ
ｇと推定された。クリアランス／Ｋｅｌとして計算された分布容積は１０．１１ ±４．
１７Ｌ／ｋｇであることがわかった。概して、以下の表からもわかるように、ＩＲＬ１６２０はパクリタキセルの薬物動態プロファイルに影響を与えていなかった。
【００８４】
【表１】
【００８５】
パクリタキセルの血漿中濃度は血漿サンプルのｄｐｍカウントから計算された。３コンパートメントモデルがパクリタキセルの薬物動態を最もよく説明していた。図９は、ビヒクル処置及びＩＲＬ１６２０処置ラット両方の観測vs予測される薬物動態のプロットを描いている。ビヒクル処置ラットにおけるパクリタキセルのＡＵＣは９．４２±３．１８μｇ−ｈ／ｍＬであった。定常状態の分布容積（Ｖｓｓ）は１０．３１±４．５４Ｌ／Ｋｇであった。クリアランスは０．６９±０．１７Ｌ／ｈ／Ｋｇと推定された。α ｔ1/2、
β ｔ1/2、γ ｔ1/2は、それぞれ０．０３±０．０１ｈ、１．０±０．３２ｈ、及び２５．８７＋１７．８１ｈであった。平均滞留時間は２７．９２±１９．８４ｈであった。以下の表からわかるように、ＩＲＬ１６２０処置群で推定されたこれらのパラメータはビヒクル処置群のものと顕著な違いはなかった。
【００８６】
【表２】
【００８７】
この試験では３コンパートメントモデルがパクリタキセルの血漿中薬物動態を最もよく説明していた。このモデルは、器官における血液潅流が高くても、中程度でも又は低くても、パクリタキセルは様々な器官に分布することを示唆している。ＩＲＬ１６２０の投与でパクリタキセルの分布は変化しなかった。３コンパートメントモデルによって得られた血漿中薬物動態のパラメータは、ビヒクル及びＩＲＬ１６２０処置群について同程度のクリアランス、分布及び吸収の容積、分布及び消失半減期を示した。しかしながら、ＩＲＬ１６２０は腫瘍の血液潅流及び腫瘍のパクリタキセル濃度を増大する。Ｒａｉら，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔｓ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ（２００４）；Ｒａｉ ＆ Ｇｕｌａｔｉ，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，５１：２１（２００３）。従って、ＩＲＬ１６２０は、パクリタキセルの薬物動態プロファイルを著しく変えることなく腫瘍の潅流を選択的に増大する。
【００８８】
ＩＲＬ１６２０を使用してもパクリタキセルの薬物動態に影響はなかった。薬物動態は化合物の安全性の代理とみなせることが多い。従って、これらの結果は、パクリタキセルの安全性がＩＲＬ１６２０の投与によって変化しないことも示唆している。結果として、ＩＲＬ１６２０はパクリタキセルの効能を改良し、その重篤な毒性を最小限にするための適当な用量漸増を可能にするために使用できるはずである。これらの結果は、正常ラットにおけるパクリタキセルの薬物動態プロファイルが腫瘍ラットと類似していることを示しており、パクリタキセルの動態は腫瘍モデル系によって変化しないことを示している。
【００８９】
実施例５．ＩＲＬ１６２０の用量反応効果、主要器官及び腫瘍組織における［３Ｈ］パクリタキセルの生体内分布に及ぼすＩＲＬ１６２０の影響、及び腫瘍状態に対するパクリタキセルの効能に及ぼすＩＲＬ１６２０の影響
本実施例に記載の実験は、（ａ）ＥＴＢ受容体アゴニストＩＲＬ１６２０が正常及び腫瘍ラットの乳房潅流に及ぼす用量反応効果、（ｂ）主要器官及び腫瘍組織における［３Ｈ］パクリタキセルの生体内分布に及ぼすＩＲＬ１６２０の影響、及び（３）ＭＮＵ誘導性乳房腫瘍ラットにおける腫瘍状態に対するパクリタキセルの効能に及ぼすＩＲＬ１６２０の影響を調べるために設計された。
【００９０】
方法
ＩＲＬ１６２０はＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（ミズーリ州セントルイス）から入手した。［３Ｈ］−パクリタキセルはＭｏｒａｖｅｋ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（カリフォルニア州ブレア）から購入した。パクリタキセル（６ ｍｇ／ｍｌ溶液）はＢｅｎ Ｖｅｎｕｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．（オハイオ州ベッドフォード）から購入した。ケタミン及びキシラジンはＰｈｏｅｎｉｘ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．（ミズーリ州セントジョーゼフ）から購入した。組織溶解剤（ＴＳ−２）はＲＰＩ Ｃｏｒｐ．（イリノイ州シカゴ）から購入した。
【００９１】
バージン雌Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（Ｈａｒｌａｎ Ｃｏｍｐａｎｙ，ウィスコンシン州マジソン）を４０日齢で購入し、２３±１℃に温度管理された部屋で２匹ずつケージに入れ、１２時間明／１２時間暗のスケジュール下で維持した。ラットには水と標準の齧歯類用餌を自由に与えた。４８日齢で各動物にＮ−メチルニトロソウレア（ＭＮＵ，Ａｓｈ Ｓｔｅｖｅｎｓ，ミシガン州デトロイト）を５０ｍｇ／ｋｇの用量で１回注射した。ＭＮＵは３％酢酸に溶解し、そして０．９％ＮａＣｌ中に希釈し（最終濃度１２．５ｍｇ／ｍｌ）、これを調製３０分以内にｉ．ｐ．注射によって投与した。この処置によってほぼ１００％の発生率で乳房腺がんが発がん処置約１００日後に誘発される。Ｍｅｈｔａ Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，３６：１２７５（２０００）。腫瘍の外観と位置は手による乳腺の触診でモニターし、腫瘍表面はデジタルキャリパーで測定した。腫瘍体積５００〜８００ｍｍ３のラットを選んで試験した。
【００９２】
潅流試験．ラットの乳房組織及び腫瘍への潅流は、前述のようにＰｅｒｉｆｌｕｘ ＰＦ２ｂ ４０００レーザードップラー流量計（Ｐｅｒｉｍｅｄ，スウェーデン、ストックホルム）を用いて測定した。手短に言うと、ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）とキシラジン（２ｍｇ／ｋｇ）を併用１回ｉ．ｐ．注射してラットを麻酔した。乳頭付近を剃毛し、体温の変動を最小限にするために加熱パッド（３７℃）に動物を置いた。乳腺周囲の皮膚を幅約６ｍｍ、長さ約４ｍｍ切開した。標準モデルの光ファイバープローブ（ＭＰ３ フロープローブ，Ｍｏｏｒｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，英国、デボン）を露出組織の表面に当てた。それをＰｅｒｉｆｌｕｘ ＰＦ２ｂ ４０００レーザードップラー流量計に接続した。時定数を１．５秒にセットし、帯域幅を４ＫＨｚにセットした。この方法はレーザー光線（フラックス）におけるドップラーシフトを測定する。これは赤血球の数及び速度によって決まり、所定体積の組織内の全血流に比例する。フラックス値はＰｏｌｙｖｉｅｗソフトウェアを用いて獲得した。１５分間の安定な記録のベースラインを得てから生理食塩水又はＩＲＬ１６２０を投与した。動物には１、３又は９ｎｍｏｌ／ｋｇのＩＲＬ１６２０を投与し、潅流を３時間記録した。各用量は少なくとも４匹の動物に投与した。
【００９３】
生体内分布試験．ラットをケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）とキシラジン（２ｍｇ／ｋｇ）の併用１回ｉ．ｐ．注射で麻酔した。ラットの体重、腫瘍位置及び腫瘍体積を記録した。動物を無作為にグループ分けし、生理食塩水又はＩＲＬ１６２０（３ｎｍｏｌ／ｋｇ）を尾静脈から最終体積０．２ｍｌ投与した。各群のラットに［３Ｈ］パクリタキセル（５０：５０のＣｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬとエタノール中４０μＣｉ／ラット）を、ＩＲＬ１６２０の投与後１５、１２０及び２４０分時点で最終体積１．０ｍｌ投与した。各時点で６匹のラットを試験したので、合計３６匹のラットを使用した。動物は［３Ｈ］パクリタキセル投与３時間後に犠死させた。腫瘍組織、腎臓、肝臓、肺及び脾臓中の［３Ｈ］パクリタキセル濃度を測定した。腫瘍及び器官は小片にスライスした。約５００ｍｇの組織又は腫瘍を組織溶解剤（６ｍｌ）入りの別のバイアルに入れ、５０℃の水浴中でインキュベートした。組織又は腫瘍が溶解したら水浴からバイアルを取り出し、１．２ｍｌの１０％
氷酢酸を加えた。バイアルの中身を３個のバイアルに等分し、１５ｍｌの液体シンチレーションカクテル（Ｓａｆｅｔｙ Ｓｏｌｖｅ，ＲＰＩ Ｃｏｒｐ，イリノイ州シカゴ）を各バイアルに加え、平衡化のために一晩維持した。液体シンチレーションカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，ＬＳ ６５００）を用いて管の放射能をカウントした。
【００９４】
効能試験．腫瘍ラットを無作為に７つの群に分けた（１２ラット／群）。Ｉ群−生理食塩水；II群−ＩＲＬ１６２０（３ｎｍｏｌ／ｋｇ）；III群−Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ
：エタノール；IV群−ビヒクル（生理食塩水）＋パクリタキセル（１ｍｇ／ｋｇ）；Ｖ群−ビヒクル（生理食塩水）＋パクリタキセル（５ｍｇ／ｋｇ）；VI群−ＩＲＬ１６２０（３ｎｍｏｌ／ｋｇ）＋パクリタキセル（１ｍｇ／ｋｇ）；及びVII群−ＩＲＬ１６２０（
３ｎｍｏｌ／ｋｇ）＋パクリタキセル（５ｍｇ／ｋｇ）。投与スケジュールは３日に１回、計５回であった。体重、腫瘍の大きさ及び位置は３日目ごとに最終投与後計３０日間モニターした。評価には以下のカテゴリーを使用した。進行：処置の開始と比べて腫瘍が面積で４０％を超えて成長している；停滞：処置の過程を通して腫瘍がその初期面積から４０％を超えて変動しなかった；部分退行：腫瘍がその初期面積から４０％を超えて退行した；完全寛解：腫瘍がもはや触診及び測定できない場合。処置中及び３０日間の観察期間中、腫瘍の多重度（新規腫瘍の出現）も記録した。動物は最後（５回目）の投与３０日後に犠死させた。データは分散分析、次いでダンカン検定を用いて分析した。ｐ＜０．０５の水準を有意とみなした。
【００９５】
結果
ＩＲＬ１６２０の乳房潅流における用量反応．腫瘍潅流に及ぼすＩＲＬ１６２０投与の影響は一過性で用量依存性であることがわかった（図１０Ａ）。腫瘍潅流におけるベースラインからの最大増加２４４．０％（ｐ＜０．００１）は３ｎｍｏｌ／ｋｇのＩＲＬ１６２０投与１５分後に観察された。潅流の増加は、ベースライン並びに生理食塩水処置ラットと比べて１５、３０及び６０分時点で有意であることがわかった（図１０Ｂ）。１及び９ｎｍｏｌ／ｋｇのＩＲＬ１６２０の投与は、ベースライン潅流及び生理食塩水処置ラットと比べて乳房腫瘍潅流に微増しかもたらしていない。潅流の最大増加（６０．９及び６３．３％）は、それぞれ１及び９ｎｍｏｌ／ｋｇのＩＲＬ１６２０後９０及び３０分時点で記録された。しかしながら、９ｎｍｏｌ／ｋｇのＩＲＬ１６２０で処置された動物における潅流の増加は、生理食塩水処置ラットと比べて１５、３０及び６０分時点で有意であることがわかった（図１０Ａ）。腫瘍ラットへの生理食塩水の投与はベースラインと比べて血液潅流に何ら有意の変化を起こさなかった（図１０Ａ）。生理食塩水、１、３又は９ｎｍｏｌ／ｋｇのＩＲＬ１６２０の投与は正常雌ラットでは乳房潅流に何ら有意の変化を起こさなかった（データ示さず）。
【００９６】
生体内分布試験．腫瘍中の［３Ｈ］パクリタキセルの濃度は、生理食塩水処置ラットと比べてＩＲＬ１６２０（３ｎｍｏｌ／ｋｇ）処置ラットで有意に増加した。最大効果は、パクリタキセルをＩＲＬ１６２０の１５分後に投与された動物群に認められた。腫瘍中のパクリタキセル濃度に２７７．１、１５１．９及び３４．７％の増加が、パクリタキセルをＩＲＬ１６２０投与のそれぞれ１５、１２０及び２４０分後に投与した場合に観察された（図１１）。ＩＲＬ１６２０を投与しても、肝臓、肺、腎臓及び脾臓におけるパクリタキセルの蓄積は対照動物と比べて変化ないことがわかった（図１１）。
【００９７】
効能試験：体重．ベースライン（処置開始前）から最終投与後３０日までの体重の相違率を図１２に示す。生理食塩水処置対照ラットで実験終了時にモニタした体重の増加率は、ベースラインの体重と比べて７．２±１．７％であった（図１２）。ビヒクル＋パクリタキセル（１ｍｇ／ｋｇ）、ビヒクル＋パクリタキセル（５ｍｇ／ｋｇ）、ＩＲＬ１６２０＋パクリタキセル１ｍｇ／ｋｇ及びＩＲＬ１６２０＋パクリタキセル５ｍｇ／ｋｇで処置した動物群では体重にそれぞれ５．１±３．６、９．４±２．４、１４．３±３．１及び１３．１±１．８％の増加があった（図１２）。Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ：エタノール及びＩＲＬ１６２０を投与した動物の体重の、ベースラインと比較した増加率は＜１０％であることがわかった（データ示さず）。
【００９８】
効能試験：腫瘍体積．処置開始時には様々な群の腫瘍サイズは同程度で互いに有意の差はなかった（図１３）。対照ラットの腫瘍体積は迅速かつ変動する速度で増加した。腫瘍成長における大きな変動性は、自発性成長腫瘍のランダム成長パターンによるものであろう。３０日間の観察期間終了時、対照腫瘍は２６９３．４±７９０．９ｍｍ３の腫瘍体積を有していた。ＩＲＬ１６２０処置ラットも同様の発達パターンを有し、最終腫瘍体積は２５６０．５±８４４．４ｍｍ３であった。Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ：エタノール処置も同様の成長パターンで、最終腫瘍体積は２３３８±１３２９ｍｍ３となった。このように、ＩＲＬ１６２０及びｃｒｅｍｏｐｈｏｒ Ｅｌ：エタノールは、ＭＮＵ誘導乳房腫瘍の成長に顕著な影響は及ぼさなかった。対照ラットと比較した場合、ビヒクル＋パクリタキセル１ ｍｇ／ｋｇ処置ラットはわずかに低減された腫瘍サイズの成長を示したが（１９６０．８±６１１．９ｍｍ３）、ビヒクル＋パクリタキセル５ｍｇ／ｋｇ群ではそれがより顕著であった（１６８２．７±４９７．３ｍｍ３）。ＩＲＬ１６２０＋パクリタキセル１ｍｇ／ｋｇ処置ラットは削減された腫瘍サイズを示した（１７０７．２±６２１．１ｍｍ３）。しかしながら、最低平均腫瘍サイズ（７３０．１±２１９．４ｍｍ３）はＩＲＬ１６２０＋パクリタキセル５ｍｇ／ｋｇで処置された動物群で観察された（図１３）。ＩＲＬ１６２０に続きパクリタキセル５ｍｇ／ｋｇを３日目ごとに計５回投与することは、生理食塩水＋パクリタキセル（５ｍｇ／ｋｇ）投与ラットと比べて有意に（ｐ＜０．０５）腫瘍体積を削減した（図１３）。腫瘍体積は、ＩＲＬ１６２０又はｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ：エタノールのいずれかで処置されたラットと比べてもＩＲＬ１６２０＋パクリタキセル５ｍｇ／ｋｇ群で低いことがわかった（データ示さず）。
【００９９】
効能試験：腫瘍の多重度．全処置群の動物とも３０日間の観察期間終了時までに追加の腫瘍を発症していた。生理食塩水、ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ：エタノール及びＩＲＬ１６２０で処置した動物では、追加の腫瘍出現にそれぞれ５８．４、５７．１及び６０．８％の増加がみられた。ビヒクル＋パクリタキセル１及び５ｍｇ／ｋｇを投与した動物では新規腫瘍の発生はそれぞれ７８．３％及び４１％であることがわかった。しかしながら、ＩＲＬ１６２０＋パクリタキセル１及び５ｍｇ／ｋｇでは、追加の腫瘍のパーセントはそれぞれ６９．２及び４４．８％であることがわかった。
【０１００】
効能試験：腫瘍の進行．進行、停滞、退行又は消失した腫瘍のパーセントは前述のように計算した。生理食塩水処置群では７３．５％の腫瘍が初期腫瘍サイズの４０％を超えて進行した。ＩＲＬ１６２０（８２．７％）及びｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ：エタノール（８０．４％）処置群も初期腫瘍サイズの４０％を超える同様の腫瘍進行パーセントを示した。腫瘍の進行が低パーセントだったのは、ビヒクル＋パクリタキセル（５ｍｇ／ｋｇ）群（７１．４％）、ビヒクル＋パクリタキセル（１ｍｇ／ｋｇ）群（６１．１％）及びＩＲＬ１６２０＋パクリタキセル（１ｍｇ／ｋｇ）群（６９％）であった。しかし最低のパーセント（４０％）はＩＲＬ１６２０＋パクリタキセル（５ｍｇ／ｋｇ）群で見られた（図１４）。
【０１０１】
効能試験：腫瘍の停滞．生理食塩水処置ラットの１６．９％の腫瘍は停滞していた。すなわち３０日間の終了時点までに４０％の範囲を超えて成長しなかった。ＩＲＬ１６２０（１３．７％）、ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ：エタノール（１５．２％）、ビヒクル＋パクリタキセル（１ｍｇ／ｋｇ）（２２．２％）及びビヒクル ＋パクリタキセル（５ｍｇ／ｋｇ）（１９．５％）処置ラットは停滞状態の腫瘍のパーセントは低かった。ＩＲＬ１６２０＋パクリタキセル（１ｍｇ／ｋｇ）（２３．８％）処置ラット及びＩＲＬ１６２０＋パクリタキセル（５ｍｇ／ｋｇ）処置ラットは停滞状態の腫瘍のパーセントが大きかった（２６．６％）（図１４）。
【０１０２】
効能試験：腫瘍の退行．パクリタキセル５ｍｇ／ｋｇ処置の前にＩＲＬ１６２０を投与すると、対照動物と比べて腫瘍の進行が有意に低下した。生理食塩水処置ラットは初期の腫瘍体積から９．２％の腫瘍が退行を示した。Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ：エタノール（４．３％）、ＩＲＬ１６２０（３．４％）及びビヒクル ＋パクリタキセル（５ｍｇ／ｋｇ）（９．５％）処置ラットは、サイズの退行した腫瘍のパーセントに対照群との有意の差はなかった。５回目の投与終了時点で、腫瘍は、ＩＲＬ１６２０＋パクリタキセル５ｍｇ／ｋｇ処置ラット及びビヒクル＋パクリタキセル５ｍｇ／ｋｇ処置ラットで対照ラットと比べてそれぞれ７６．１±１０．５及び４５．９±１１．５％退行していた。ＩＲＬ１６２０＋パクリタキセル５ｍｇ／ｋｇ及びビヒクル＋パクリタキセル５ｍｇ／ｋｇで処置された群の動物に８０．２±６．９％（ｐ＜０．０５）及び３３．８±１９．４％の退行があった（図１４）。ＩＲＬ１６２０＋パクリタキセル１ｍｇ／ｋｇ及びビヒクル＋パクリタキセル（１ｍｇ／ｋｇ）群における腫瘍退行率は、それぞれ４７．１±１５．４及び３７．７±１６．２％であることがわかった。ＩＲＬ１６２０の１５分後のパクリタキセル（５ｍｇ／ｋｇ）投与は、生理食塩水の１５分後のパクリタキセル（５ｍｇ／ｋｇ）投与と比べて有意に大きい腫瘍退行をもたらした。ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ Ｅｌ：エタノールとＩＲＬ１６２０処置群は、どの時点でも対照ラットと比べて腫瘍の退行に有意の差はなかった（データ示さず）。
【０１０３】
効能試験：腫瘍の寛解．腫瘍が完全に消失する完全寛解は２つの群でしか観察されなかった。ＩＲＬ１６２０＋パクリタキセル（１ｍｇ／ｋｇ）（２．３％）及びＩＲＬ１６２０＋パクリタキセル（５ｍｇ／ｋｇ）（１５％）処置ラットである（図１４）。
本試験で得られた結果は、３ｎｍｏｌ／ｋｇ用量のＩＲＬ１６２０の投与は、ベースライン及びビヒクル処置ラットと比べて腫瘍潅流に有意の増加をもたらすことを示している。１、３及び９ｎｍｏｌ／ｋｇのＩＲＬ１６２０も腫瘍潅流を増大するが、３ｎｍｏｌ／ｋｇの用量のＩＲＬ１６２０が最大効果をもたらした。高用量（９ｎｍｏｌ／ｋｇ）は血管収縮に関与するＥＴＢ受容体を刺激することも可能である。Ｂｒｏｏｋｓら，Ｊ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２６ Ｓｕｐｐｌ ３：Ｓ３２２（１９９５）。
【０１０４】
従って、高用量でのＥＴＢ受容体刺激による血管収縮と混合した血管拡張は、削減された血管拡張効果をもたらす。低用量（１ｎｍｏｌ／ｋｇ）だと最大の血管拡張をもたらすのに不十分なのであろう。従って、次の試験には３ｎｍｏｌ／ｋｇ用量のＩＲＬ１６２０を選択した。
【０１０５】
腫瘍組織中のパクリタキセル濃度に及ぼすＩＲＬ１６２０の効果は時間依存性であることがわかった。［３Ｈ］パクリタキセルをＩＲＬ１６２０投与の１５分、２時間及び４時間後に投与した場合、ビヒクル処置ラットと比べて、腫瘍中の［３Ｈ］パクリタキセル濃度にそれぞれ２７７．１、１５１．９及び３４．７％の差があった。ＩＲＬ１６２０の投与は、肝臓、肺、腎臓及び脾臓中のパクリタキセル蓄積に有意の増加をもたらさないことが研究から示された。効能試験の結果は、ＩＲＬ１６２０の投与は、パクリタキセルが誘導する腫瘍体積の削減を、パクリタキセルを投与された生理食塩水処置ラットと比べて有意に増大したことを示している。５ｍｇ／ｋｇの用量のパクリタキセルで見られた治療利益の増強は最終投与の３０日後まで維持された。これは、腫瘍体積にぶり返しがなく、パクリタキセルの効能増強におけるＩＲＬ１６２０の効果が試験終了まで不変であったことを意味する。しかしながら、生理食塩水処置後のパクリタキセル（１及び５ｍｇ／ｋｇ）は腫瘍成長にそのような有意の変化をもたらさなかった。さらに、腫瘍の多重度は、ＩＲＬ１６２０の後パクリタキセル５ｍｇ／ｋｇで処置されたラットの群で減少した。従って、パクリタキセル５ｍｇ／ｋｇの前にＩＲＬ１６２０を投与することは、パクリタキセルの効能に著しい効果を有する。これは、腫瘍負荷の減少、腫瘍退行のパーセント、影響を
受けない体重及び多重度によって示される。さらに、ＩＲＬ１６２０の後パクリタキセル１及び５ｍｇ／ｋｇで処置した動物群では、他のすべての群と比べて、それぞれ２．３及び１５％の初期腫瘍完全寛解があった。
【０１０６】
この実施例で述べた実験は、ＥＴＢ受容体アゴニストであるＩＲＬ１６２０が腫瘍の血流を有意に増大しうることを明らかに示している。ＩＲＬ１６２０の投与は腫瘍血流の増大を起こしたが、対照の健常組織における潅流は変化させなかった。腫瘍潅流の増加は３時間持続した。潅流が増大している期間中に［３Ｈ］パクリタキセルを投与すると、他の器官ではなく腫瘍組織だけで［３Ｈ］パクリタキセルの濃度が有意に増加した。さらに、本実施例で述べた実験の結果は、ＩＲＬ１６２０の投与はパクリタキセルの抗腫瘍効果を刺激するという証拠を提供している。パクリタキセル５ｍｇ／ｋｇを３日目ごとに計５回処置されたラットの腫瘍体積は、対照ラットと比べて６０．０％の削減があった。しかしながら、ＩＲＬ１６２０投与１５分後のパクリタキセル投与は、最終パクリタキセル投与の１ヶ月後に記録した場合、対照ラットと比べて腫瘍体積を２６８．９％まで削減した。ＩＲＬ１６２０投与ラットでは、パクリタキセルだけの処置ラットと比べて、腫瘍体積に１３０．４％の削減があった。腫瘍潅流の増大は、腫瘍成長を促進する栄養素の供給を増大しうる可能性もある。我々の結果は、生理食塩水処置ラットと比べてＩＲＬ１６２０処置ラットの腫瘍体積及び腫瘍多重度に有意の増加はなかったことを示しており、ＩＲＬ１６２０単独では腫瘍体積及び多重度に何の影響も生じなかったことを示唆している。結論として、ＩＲＬ１６２０は腫瘍選択的血管拡張薬として使用でき、化学療法の効能を選択的に増大するために使用できる。本試験は、この治療戦略を採用することによって、腫瘍組織中に何倍も高い薬物濃度が達成できることを明らかに実証している。最後に、ＥＴＡ受容体アンタゴニストも腫瘍血流の改良のために提唱されており（Ｓｏｎｖｅａｕｘら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，６４：３２０９（２００４））、本発明に従って腫瘍への抗がん剤の送達を増強するのに使用できる。
【０１０７】
活性成分を含有する医薬組成物は、ヒト又は他の哺乳動物への投与に適している。典型的には、医薬組成物は無菌性であり、投与された場合に有害反応を起こすような毒性、発がん性、又は変異原性化合物を含有しない。医薬組成物の投与は、固形腫瘍成長の開始の前、中又は後に実施できる。
【０１０８】
本発明の方法は、前述の活性成分を用いて、又はその生理学的に許容しうる塩、誘導体、プロドラッグ又は溶媒和物として達成できる。活性成分は、そのままの化合物として、又はいずれかもしくは両方の実体を含有する医薬組成物として投与できる。
【０１０９】
医薬組成物は、活性成分がそれらの意図する目的を達成するために有効な量で投与されるようなものを含む。更に詳しくは、“治療上有効量”とは、固形腫瘍の発生を防止、その除去、その進行を遅延、又はそのサイズを削減するのに有効な量を意味する。治療上有効な量の決定は、特に本明細書中に提供されている詳細な開示に照らせば、十分当業者の能力の範囲内である。
【０１１０】
“治療上有効な用量”とは、所望の効果を達成する活性成分の量のことである。そのような活性成分の毒性及び治療効能は、細胞培養又は実験動物における標準の製薬手順によって決定できる。例えばＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）及びＥＤ５０（集団の５０％に治療上有効な用量）を決定する。毒性及び治療効果間の用量比は治療指数であり、ＬＤ５０とＥＤ５０間の比率として表される。高い治療指数が好適である。得られたデータはヒトに使用するための用量範囲を設計するのに使用できる。活性成分の用量は、ＥＤ５０を含み毒性が殆どないし全くない循環濃度の範囲内にあるのが好ましい。用量は、この範囲内で、使用される剤形、及び利用される投与経路に応じて変動しうる。
【０１１１】
正確な処方及び用量は、患者の状態を考慮して医師が決定する。投与量及び間隔は、治療又は予防効果を維持するに足る活性成分の濃度を提供するために個別に調整できる。
投与される医薬組成物の量は、治療される患者、患者の体重、疾患の重症度、投与様式、及び処方医の判断に依存しうる。
【０１１２】
活性成分は、単独で、又は意図する投与経路及び標準の製薬学的実施基準に関して選ばれる製薬学的担体と混合して投与できる。そこで、本発明に従って使用される医薬組成物は、活性成分を薬学的に使用できる製剤に加工するのを容易にする賦形剤及び補助剤を含む一つ又は複数の生理学的に許容しうる担体を用いて、従来様式で製剤化できる。
【０１１３】
治療上有効量の活性成分が投与される場合、組成物は、発熱物質を除去された、非経口的に許容しうる水溶液の形態であってよい。ｐＨ、等張性、安定性などを十分顧慮したそのような非経口的に許容しうる溶液の調製は当該技術分野における技能の範囲内である。静脈内注射のための好適な組成物は、典型的には等張性ビヒクルを含有するが、この特徴は必要とされない。
【０１１４】
獣医学的使用の場合、活性成分は、通常の獣医学的実施基準に従って適切に許容されうる製剤として投与される。獣医は、特定の動物に最も適当な投与計画を容易に決定することができる。
【０１１５】
本発明の範囲及び精神から離れることなく態様の様々な適応及び変更を行い、そして使用することができる。本発明は本明細書中で具体的に記載した以外にも実施することができる。上記記載は説明を目的としたもので制限を意図していない。本発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ決定される。
【０１１６】
本明細書中で使用してきた用語及び表現は、制限ではなく説明のための用語として使用されている。そのような用語及び表現の使用にあたって、示し説明した特徴の等価物又はその一部を除外する意図はない。特許請求された本発明の範囲内で多様な変形が可能であることは認識されている。さらに、本発明のいずれかの態様のいずれか一つ又は複数の特徴は、本発明の範囲を離れることなく本発明のいずれかその他の態様のいずれか一つ又は複数の特徴と組み合わせることができる。
【０１１７】
特に明記されない限り、本明細書及び特許請求の範囲で使用されている、分子量、反応条件などのような成分、性質の量を表すすべての数字は、すべての例で“約”という用語によって変更されると理解されるべきである。従って、反対に指示されない限り、以下の明細書及び添付の特許請求の範囲に示されている数値パラメータは、本発明によって得ようと求めている所望の性質に応じて変動しうる概数である。最低限でも、そして特許請求の範囲に等価の教義の適用を制限しようとしてではなく、それぞれの数値パラメータは少なくとも、報告された有効数字の数の点から、及び通常の丸め技術を適用することによって解釈されるべきである。本発明の広い範囲を示す数値範囲及びパラメータは概数であるにもかかわらず、特定の実施例に示された数値はできるだけ正確に報告されている。しかしながら、いずれの数値も、各試験測定法に見られる標準偏差に必然的に由来するある誤差を本質的に内包している。
【０１１８】
本発明を説明する文脈（特に以下の特許請求の範囲の文脈）で使用されている“一つの（ａ、ａｎ）”及び“その（ｔｈｅ）”という用語並びに類似の指示は、本明細書中で特に明記されない限り又は文脈によって明らかにそれに反しない限り、単数及び複数の両方をカバーすると解釈されるべきである。本明細書中で値の範囲を挙げることは、その範囲に入るそれぞれの別の数字を個別に言及することの省略法として代用しているに過ぎない。本明細書中で特に明記されない限り、それぞれの個別の数値は、本明細書中であたかも
個別に挙げられたかの如く、本明細書中に組み込まれる。本明細書中に記載のすべての方法は、本明細書中で別途記載のない限り又は文脈によって明らかにそれに反しない限り、任意の適切な順序で実施できる。本明細書中に提供されているいずれか及びすべての例、又は例示言語（例えば“〜のような”）の使用は、単に本発明をより良く照らし出すためのものであって、別に特許請求されている本発明の範囲を制限するためのものではない。本明細書中のどの言語も、本発明の実施に不可欠の何らかの非請求要素を指していると解釈されるべきでない。
【０１１９】
本明細書中に開示されている本発明の代替の要素又は態様のグループ分けは制限と解釈されるべきでない。各グループのメンバーは、個別に又は該グループの他のメンバー又は本明細書中に見出される他の要素との何らかの組合せで言及及び特許請求されうる。グループの一つ又は複数のメンバーは、便宜上及び／又は特許性のためにグループに包含されるか、又はグループから削除されうることは予想される。何らかのそのような包含又は削除が発生する場合、明細書はここでは変更されたグループを含有するとみなされ、従って添付の特許請求の範囲で使用されているすべてのマーカッシュグループの記載を満たしている。
【０１２０】
本発明を実施するために発明者らが知る最良の様式を含む本発明の好適な態様が本明細書中に記載されている。当然のことながら、それらの好適な態様の変形は、上記記載を読めば当業者には明白であろう。発明者らは専門家がそのような変形を必要に応じて使用することを期待し、また発明者らは本発明が本明細書中に明記した以外に実施されることを意図している。従って、本発明は、適用法によって許されているように、添付の特許請求の範囲に掲げられている主題のすべての変形及び等価物を含む。さらに、そのすべての可能な変形における上記要素の何らかの組合せも、本明細書中に別途記載がない限り又は文脈によって明らかにそれに反しない限り、本発明に包含される。
【０１２１】
さらに、本明細書全体を通じて特許及び刊行物を多数参照してきた。上で引用した参考文献及び刊行物のそれぞれは、引用によってそれらの全文を個々に本明細書に援用する。
最後に、本明細書中に開示した本発明の態様は、本発明の原理を説明するためのものであると理解されるべきである。使用できる他の変形も本発明の範囲に含まれる。従って、例えば（制限ではない）、本発明の代替の構成も本明細書中の教示に従って利用できる。従って、本発明は、提示及び記載された通りのものに正確に限定されることはない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳房腫瘍の治療のための医薬の製造におけるＥＴＢ受容体アゴニストを含む組成物の使用であって、当該医薬は化学療法薬と共に使用されるものであり、前記ＥＴＢ受容体アゴニストはＩＲＬ１６２０であり、前記組成物は前記治療の必要ある哺乳動物に静脈内投与されるものであり、前記ＥＴＢ受容体アゴニストは前記乳房腫瘍への血液供給を選択的に増大し、ひいては前記乳房腫瘍への前記化学療法薬の送達を増大させ、そして前記ＥＴＢ受容体アゴニストは前記化学療法薬の効果を増強する、前記使用。
【請求項２】
前記化学療法薬の薬物動態が前記ＥＴＢ受容体アゴニストによって影響されない、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記化学療法薬が、アドリアマイシン、カンプトテシン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、アルファインターフェロン、ベータインターフェロン、ガンマインターフェロン、インターロイキン２、イリノテカン、ドセタキセル、パクリタキセル、トポテカン、又はそれらの混合物である、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記化学療法薬がパクリタキセルである、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記ＥＴＢ受容体アゴニストと前記化学療法薬が、
前記ＥＴＢ受容体アゴニストと前記化学療法薬を単一組成物として投与する；
前記ＥＴＢ受容体アゴニストと前記化学療法薬を別の組成物として投与する；
前記ＥＴＢ受容体アゴニストと前記化学療法薬を順に投与し、前記ＥＴＢ受容体アゴニストを前記化学療法薬より先に投与する；又は
前記ＥＴＢ受容体アゴニストと前記化学療法薬を順に投与し、前記化学療法薬を前記ＥＴＢ受容体アゴニストより先に投与する；
ことにより投与される、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
治療の必要のある哺乳動物における乳房腫瘍の治療のための、治療上有効な量のＥＴＢ受容体アゴニスト及び治療上有効な量の化学療法薬の使用であって、前記ＥＴＢ受容体アゴニストがＩＲＬ１６２０である、前記使用。
【請求項７】
前記化学療法薬が、アドリアマイシン、カンプトテシン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、アルファインターフェロン、ベータインターフェロン、ガンマインターフェロン、インターロイキン２、イリノテカン、ドセタキセル、パクリタキセル、トポテカン、又はそれらの混合物である、請求項１に記載の使用。
【請求項８】
前記化学療法薬がパクリタキセルである、請求項１に記載の使用。
【請求項９】
前記ＥＴＢ受容体アゴニストと前記化学療法薬が同時に投与される、請求項１に記載の使用。
【請求項１０】
前記ＥＴＢ受容体アゴニストと前記化学療法薬が単一組成物として投与される、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記ＥＴＢ受容体アゴニストと前記化学療法薬が別の組成物として投与される、請求項９に記載の使用。
【請求項１２】
前記ＥＴＢ受容体アゴニストと前記化学療法薬が順に投与される、請求項１に記載の使用。
【請求項１３】
前記ＥＴＢ受容体アゴニストが前記化学療法薬より先に投与される、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
（ａ）ＩＲＬ１６２０であるＥＴＢ受容体アゴニストを含む包装組成物；
（ｂ）哺乳動物における乳房腫瘍の治療に貢献するための（ａ）の静脈内投与についての取扱説明を提供する添付文書であって、取扱説明に従った場合、前記ＥＴＢ受容体アゴニストは前記乳房腫瘍への血液供給を選択的に増大し、ひいては前記乳房腫瘍への化学療法薬の送達を増大し、そして前記ＥＴＢ受容体アゴニストは前記化学療法薬の効果を増強する、前記添付文書；及び
（ｃ）（ａ）と（ｂ）のための容器
を含む製品。
【請求項１５】
前記製品が、（ｄ）化学療法薬をさらに含み、前記取扱説明が（ａ）と（ｄ）の投与について規定し、前記容器（ｃ）が（ａ）、（ｂ）及び（ｄ）のためのものであって、取扱説明に従った場合、前記ＥＴＢ受容体アゴニストは前記乳房腫瘍への血液供給を選択的に増大し、ひいては前記乳房腫瘍への前記化学療法薬の送達を増大し、そして前記ＥＴＢ受容体アゴニストは前記化学療法薬の効果を増強する、請求項１４に記載の製品。
【請求項１６】
前記化学療法薬が、アドリアマイシン、カンプトテシン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、アルファインターフェロン、ベータインターフェロン、ガンマインターフェロン、インターロイキン２、イリノテカン、ドセタキセル、パクリタキセル、トポテカン、又はそれらの混合物である、請求項１５に記載の製品。
【請求項１７】
前記化学療法薬がパクリタキセルである、請求項１４に記載の製品。
【請求項１８】
（ａ）ＩＲＬ１６２０であるＥＴＢ受容体アゴニストを含む包装組成物；
（ｂ）哺乳動物における乳房腫瘍を治療するために化学療法薬と共に（ａ）を投与する取扱説明を提供する添付文書；及び
（ｃ）（ａ）と（ｂ）のための容器
を含む乳房腫瘍を治療することができる製品。
【請求項１９】
（ａ）ＩＲＬ１６２０であるＥＴＢ受容体アゴニストを含む包装組成物；
（ｂ）化学療法薬を含む包装組成物；
（ｃ）哺乳動物における乳房腫瘍を治療するために化学療法薬と共に（ａ）及び（ｂ）を同時に若しくは連続的に投与する取扱説明を提供する添付文書；及び
（ｄ）（ａ），（ｂ）と（ｃ）のための容器
を含む乳房腫瘍を治療することができる製品。
【請求項２０】
（ａ）ＩＲＬ１６２０であるＥＴＢ受容体アゴニスト及び化学療法薬を含む包装組成物；
（ｂ）哺乳動物における乳房腫瘍を治療するために化学療法薬と共に（ａ）を投与する取扱説明を提供する添付文書；及び
（ｃ）（ａ）と（ｂ）のための容器
を含む乳房腫瘍を治療することができる製品。
【請求項２１】
前記化学療法薬が、アドリアマイシン、カンプトテシン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、アルファインターフェロン、ベータインターフェロン、ガンマインターフェロン、インターロイキン２、イリノテカン、ドセタキセル、パクリタキセル、トポテカン、又はそれらの混合物である、請求項１８、１９又は２０に記載の製品。
【請求項２２】
前記化学療法薬がパクリタキセルである、請求項１８、１９又は２０に記載の製品。
【請求項２３】
ＥＴＢ受容体アゴニストを含む乳房腫瘍の治療のための医薬組成物であって、当該組成物は化学療法薬と共に使用されるものであり、前記ＥＴＢ受容体アゴニストはＩＲＬ１６２０であり、前記組成物は前記治療の必要ある哺乳動物に静脈内投与されるものであり、前記ＥＴＢ受容体アゴニストは前記乳房腫瘍への血液供給を選択的に増大し、ひいては前記乳房腫瘍への前記化学療法薬の送達を増大させ、そして前記ＥＴＢ受容体アゴニストは前記化学療法薬の効果を増強する、前記医薬組成物。
【請求項２４】
前記化学療法薬の薬物動態が前記ＥＴＢ受容体アゴニストによって影響されない、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記化学療法薬が、アドリアマイシン、カンプトテシン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、アルファインターフェロン、ベータインターフェロン、ガンマインターフェロン、インターロイキン２、イリノテカン、ドセタキセル、パクリタキセル、トポテカン、又はそれらの混合物である、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記化学療法薬がパクリタキセルである、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項１】
乳房腫瘍の治療のための医薬の製造におけるＥＴＢ受容体アゴニストを含む組成物の使用であって、当該医薬は化学療法薬と共に使用されるものであり、前記ＥＴＢ受容体アゴニストはＩＲＬ１６２０であり、前記組成物は前記治療の必要ある哺乳動物に静脈内投与されるものであり、前記ＥＴＢ受容体アゴニストは前記乳房腫瘍への血液供給を選択的に増大し、ひいては前記乳房腫瘍への前記化学療法薬の送達を増大させ、そして前記ＥＴＢ受容体アゴニストは前記化学療法薬の効果を増強する、前記使用。
【請求項２】
前記化学療法薬の薬物動態が前記ＥＴＢ受容体アゴニストによって影響されない、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記化学療法薬が、アドリアマイシン、カンプトテシン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、アルファインターフェロン、ベータインターフェロン、ガンマインターフェロン、インターロイキン２、イリノテカン、ドセタキセル、パクリタキセル、トポテカン、又はそれらの混合物である、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記化学療法薬がパクリタキセルである、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記ＥＴＢ受容体アゴニストと前記化学療法薬が、
前記ＥＴＢ受容体アゴニストと前記化学療法薬を単一組成物として投与する；
前記ＥＴＢ受容体アゴニストと前記化学療法薬を別の組成物として投与する；
前記ＥＴＢ受容体アゴニストと前記化学療法薬を順に投与し、前記ＥＴＢ受容体アゴニストを前記化学療法薬より先に投与する；又は
前記ＥＴＢ受容体アゴニストと前記化学療法薬を順に投与し、前記化学療法薬を前記ＥＴＢ受容体アゴニストより先に投与する；
ことにより投与される、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
治療の必要のある哺乳動物における乳房腫瘍の治療のための、治療上有効な量のＥＴＢ受容体アゴニスト及び治療上有効な量の化学療法薬の使用であって、前記ＥＴＢ受容体アゴニストがＩＲＬ１６２０である、前記使用。
【請求項７】
前記化学療法薬が、アドリアマイシン、カンプトテシン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、アルファインターフェロン、ベータインターフェロン、ガンマインターフェロン、インターロイキン２、イリノテカン、ドセタキセル、パクリタキセル、トポテカン、又はそれらの混合物である、請求項１に記載の使用。
【請求項８】
前記化学療法薬がパクリタキセルである、請求項１に記載の使用。
【請求項９】
前記ＥＴＢ受容体アゴニストと前記化学療法薬が同時に投与される、請求項１に記載の使用。
【請求項１０】
前記ＥＴＢ受容体アゴニストと前記化学療法薬が単一組成物として投与される、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記ＥＴＢ受容体アゴニストと前記化学療法薬が別の組成物として投与される、請求項９に記載の使用。
【請求項１２】
前記ＥＴＢ受容体アゴニストと前記化学療法薬が順に投与される、請求項１に記載の使用。
【請求項１３】
前記ＥＴＢ受容体アゴニストが前記化学療法薬より先に投与される、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
（ａ）ＩＲＬ１６２０であるＥＴＢ受容体アゴニストを含む包装組成物；
（ｂ）哺乳動物における乳房腫瘍の治療に貢献するための（ａ）の静脈内投与についての取扱説明を提供する添付文書であって、取扱説明に従った場合、前記ＥＴＢ受容体アゴニストは前記乳房腫瘍への血液供給を選択的に増大し、ひいては前記乳房腫瘍への化学療法薬の送達を増大し、そして前記ＥＴＢ受容体アゴニストは前記化学療法薬の効果を増強する、前記添付文書；及び
（ｃ）（ａ）と（ｂ）のための容器
を含む製品。
【請求項１５】
前記製品が、（ｄ）化学療法薬をさらに含み、前記取扱説明が（ａ）と（ｄ）の投与について規定し、前記容器（ｃ）が（ａ）、（ｂ）及び（ｄ）のためのものであって、取扱説明に従った場合、前記ＥＴＢ受容体アゴニストは前記乳房腫瘍への血液供給を選択的に増大し、ひいては前記乳房腫瘍への前記化学療法薬の送達を増大し、そして前記ＥＴＢ受容体アゴニストは前記化学療法薬の効果を増強する、請求項１４に記載の製品。
【請求項１６】
前記化学療法薬が、アドリアマイシン、カンプトテシン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、アルファインターフェロン、ベータインターフェロン、ガンマインターフェロン、インターロイキン２、イリノテカン、ドセタキセル、パクリタキセル、トポテカン、又はそれらの混合物である、請求項１５に記載の製品。
【請求項１７】
前記化学療法薬がパクリタキセルである、請求項１４に記載の製品。
【請求項１８】
（ａ）ＩＲＬ１６２０であるＥＴＢ受容体アゴニストを含む包装組成物；
（ｂ）哺乳動物における乳房腫瘍を治療するために化学療法薬と共に（ａ）を投与する取扱説明を提供する添付文書；及び
（ｃ）（ａ）と（ｂ）のための容器
を含む乳房腫瘍を治療することができる製品。
【請求項１９】
（ａ）ＩＲＬ１６２０であるＥＴＢ受容体アゴニストを含む包装組成物；
（ｂ）化学療法薬を含む包装組成物；
（ｃ）哺乳動物における乳房腫瘍を治療するために化学療法薬と共に（ａ）及び（ｂ）を同時に若しくは連続的に投与する取扱説明を提供する添付文書；及び
（ｄ）（ａ），（ｂ）と（ｃ）のための容器
を含む乳房腫瘍を治療することができる製品。
【請求項２０】
（ａ）ＩＲＬ１６２０であるＥＴＢ受容体アゴニスト及び化学療法薬を含む包装組成物；
（ｂ）哺乳動物における乳房腫瘍を治療するために化学療法薬と共に（ａ）を投与する取扱説明を提供する添付文書；及び
（ｃ）（ａ）と（ｂ）のための容器
を含む乳房腫瘍を治療することができる製品。
【請求項２１】
前記化学療法薬が、アドリアマイシン、カンプトテシン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、アルファインターフェロン、ベータインターフェロン、ガンマインターフェロン、インターロイキン２、イリノテカン、ドセタキセル、パクリタキセル、トポテカン、又はそれらの混合物である、請求項１８、１９又は２０に記載の製品。
【請求項２２】
前記化学療法薬がパクリタキセルである、請求項１８、１９又は２０に記載の製品。
【請求項２３】
ＥＴＢ受容体アゴニストを含む乳房腫瘍の治療のための医薬組成物であって、当該組成物は化学療法薬と共に使用されるものであり、前記ＥＴＢ受容体アゴニストはＩＲＬ１６２０であり、前記組成物は前記治療の必要ある哺乳動物に静脈内投与されるものであり、前記ＥＴＢ受容体アゴニストは前記乳房腫瘍への血液供給を選択的に増大し、ひいては前記乳房腫瘍への前記化学療法薬の送達を増大させ、そして前記ＥＴＢ受容体アゴニストは前記化学療法薬の効果を増強する、前記医薬組成物。
【請求項２４】
前記化学療法薬の薬物動態が前記ＥＴＢ受容体アゴニストによって影響されない、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記化学療法薬が、アドリアマイシン、カンプトテシン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、アルファインターフェロン、ベータインターフェロン、ガンマインターフェロン、インターロイキン２、イリノテカン、ドセタキセル、パクリタキセル、トポテカン、又はそれらの混合物である、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記化学療法薬がパクリタキセルである、請求項２５に記載の医薬組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公開番号】特開２０１２−２１４５１９（Ｐ２０１２−２１４５１９Ａ）
【公開日】平成２４年１１月８日（２０１２．１１．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１７９５９６（Ｐ２０１２−１７９５９６）
【出願日】平成２４年８月１３日（２０１２．８．１３）
【分割の表示】特願２００７−５５７１７６（Ｐ２００７−５５７１７６）の分割
【原出願日】平成１８年２月２２日（２００６．２．２２）
【出願人】（５０３０６３５９３）ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ イリノイ (12)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月８日（２０１２．１１．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年８月１３日（２０１２．８．１３）
【分割の表示】特願２００７−５５７１７６（Ｐ２００７−５５７１７６）の分割
【原出願日】平成１８年２月２２日（２００６．２．２２）
【出願人】（５０３０６３５９３）ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ イリノイ (12)
【Ｆターム（参考）】
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