土壌ＤＮＡ抽出−ＰＣＲ法による土壌中ダイズ黒根腐病菌の迅速検出法
【課題】土壌伝染性のダイズ黒根腐病菌を迅速に検出する。
【解決手段】圃場の表面から深さ5cmまでの土壌から土壌試料を採取し、通風乾燥機を用いて60℃で乾燥する。乾燥した土壌試料約0.5ｇから土壌ＤＮＡ抽出キットを用いて、全土壌ＤＮＡを抽出する。抽出した全土壌ＤＮＡをテンプレートとし、ダイズ黒根腐病菌のマーカー遺伝子（β-tubulin遺伝子）に特異的なプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅する。増幅産物をアガロースゲルで電気泳動して、泳動ゲルのＤＮＡバンドにより、ダイズ黒根腐病菌マーカー遺伝子を検出する。検出したＤＮＡバンドによりダイズ黒根腐病菌の存在を検出し、バンドの濃さから菌密度を半定量する。
【解決手段】圃場の表面から深さ5cmまでの土壌から土壌試料を採取し、通風乾燥機を用いて60℃で乾燥する。乾燥した土壌試料約0.5ｇから土壌ＤＮＡ抽出キットを用いて、全土壌ＤＮＡを抽出する。抽出した全土壌ＤＮＡをテンプレートとし、ダイズ黒根腐病菌のマーカー遺伝子（β-tubulin遺伝子）に特異的なプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅する。増幅産物をアガロースゲルで電気泳動して、泳動ゲルのＤＮＡバンドにより、ダイズ黒根腐病菌マーカー遺伝子を検出する。検出したＤＮＡバンドによりダイズ黒根腐病菌の存在を検出し、バンドの濃さから菌密度を半定量する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、土壌伝染性のダイズ黒根腐病菌を迅速に検出する技術であり、土壌から抽出した全ＤＮＡに含まれるダイズ黒根腐病菌マーカー遺伝子を特異的にＰＣＲ増幅させ、半定量的に検出する技術である。
【背景技術】
【０００２】
近年、日本各地でダイズ黒根腐病が多発している。この理由は明らかでないが、ダイズの連作により発生するケースが多い。ダイズ黒根腐病が発生すれば、ダイズの生育は強く阻害され、収量も大きく減少する。ダイズ黒根腐病に対する有効な対処技術は開発されておらず、ダイズ黒根腐病が多発すれば、ダイズ栽培を止めるしかない。ダイズ黒根腐病は土壌感染性であるため、ダイズを作付けする前に土壌中における病原菌の存在を知ることができれば、土壌消毒や作目変更等の対応が可能であるが、これまでダイズではそのような技術はなかった（特許文献１、特許文献２、特許文献３）。
【０００３】
【特許文献１】特開２００５−２６９９６６
【特許文献２】特開２００６−１５１８９８
【特許文献３】特開２００７−２０２５２９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
土壌試料からのダイズ黒根腐病菌の検出は難しく、定量的な解析は不可能であった。ダイズ黒根腐病菌の検出には、その土壌に生えている病徴を示すダイズ植物体試料から検出するしかなく、土壌試料を用いて迅速にダイズ黒根腐病菌を検出する必要があった。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
土壌試料から全ＤＮＡを抽出し、ダイズ黒根腐病菌に特異的なマーカー遺伝子をターゲットとするプライマーを用いてＰＣＲ増幅し、増幅産物をアガロースゲルで電気泳動して、ダイズ黒根腐病菌マーカー遺伝子を検出する。
【０００６】
（土壌ＤＮＡの抽出方法）
土壌試料を60℃で乾燥し、約0.5ｇ秤量する。土壌試料をＤＮＡ抽出キット（Soil DNA Isolation
Kit，MO Bio)を用いて、土壌中の全ＤＮＡを抽出する。
【０００７】
（土壌試料の採取方法）
一つの圃場から数点ずつ土壌試料を採取する。採取点数は、面積が一反（10アール）につき最低4地点から採取する。深さは表面から5ｃｍの間とし、約500ｇ採取する。採取した土壌試料は、解析に供するまで冷蔵保存する。
【０００８】
（土壌試料の前処理方法）
土壌試料（生土）を、60℃で24時間通風乾燥する。乾燥土壌試料を、乳鉢を用いて微粉砕する。
【０００９】
（土壌ＤＮＡの抽出方法）
乾燥土壌試料を、約0.5ｇ秤量する。土壌試料を土壌ＤＮＡ抽出キット（Soil DNA Isolation Kit，MO Bio)を用いて、土壌中の全ＤＮＡを抽出する。
【００１０】
（マーカー遺伝子を増幅するプライマーの作成）
土壌中のダイズ黒根腐病菌を検出するためには、ダイズ黒根腐病菌が持つ遺伝子のみをＰＣＲ増幅する必要がある。ダイズ黒根腐病菌が持つ遺伝子のうち、配列表に示すようにHistone H3、およびβ-tubulin遺伝子領域を増幅するプライマーセットを設計した。
なお、プライマーセット１は配列番号１および配列番号２の組合せ、プライマーセット２は配列番号２および配列番号３の組合せである。
【００１１】
（ＰＣＲ増幅と検出方法）
ダイズ黒根腐病菌2菌株に対して、Histone H3、およびβ-tubulin遺伝子領域に設計した合計3種のプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅を行った。その後、ＰＣＲ増幅産物を、アガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色した。染色した泳動ゲルを、トランスイルミネーターで紫外線照射し、バンドを検出した。
【発明の効果】
【００１２】
従来のダイズ黒根腐病菌検出方法では、時間や手間もかかり、ダイズ栽培前の検出は不可能であった。本方法を用いることにより土壌中のダイズ黒根腐病菌を短時間で検出できるだけでなく、腐病菌の半定量も可能になるため、ダイズ栽培前にダイズ黒根腐病が発生する可能性を判断できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】3種のプライマーセットによるダイズ黒根腐病菌の検出
【図２】プライマーセット1（β-tubulin）の検出限界
【発明を実施するための形態】
【００１４】
ダイズを作付けする予定の土壌を、あらかじめ採取する。本検出法を用いて土壌中のダイズ黒根腐病菌の存在・菌密度を調査し、ダイズ黒根腐病発生の危険性の情報を得ることで、土壌消毒や作目変更などの対策をとる。
【実施例】
【００１５】
（プライマーの検証）
いずれの菌株においても、安定して遺伝子の増幅が認められたプライマーセットは、β-tubulin領域に設計した2種のプライマーセット１とプライマーセット２のみであった。そこで図１に示す３種のうち、これらのプライマーセットについての検出限界を検討した結果、図２に示すようにプライマーセット1（β-tubulin）では、DNA濃度が反応液あたり5pg/μlまで検出可能であった。加えて、本プライマーセット１は、茎疫病菌、白絹病菌、菌核病菌では遺伝子の増幅が認められなかったことから、本プライマーセット１の特異性が実証された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、土壌伝染性のダイズ黒根腐病菌を迅速に検出する技術であり、土壌から抽出した全ＤＮＡに含まれるダイズ黒根腐病菌マーカー遺伝子を特異的にＰＣＲ増幅させ、半定量的に検出する技術である。
【背景技術】
【０００２】
近年、日本各地でダイズ黒根腐病が多発している。この理由は明らかでないが、ダイズの連作により発生するケースが多い。ダイズ黒根腐病が発生すれば、ダイズの生育は強く阻害され、収量も大きく減少する。ダイズ黒根腐病に対する有効な対処技術は開発されておらず、ダイズ黒根腐病が多発すれば、ダイズ栽培を止めるしかない。ダイズ黒根腐病は土壌感染性であるため、ダイズを作付けする前に土壌中における病原菌の存在を知ることができれば、土壌消毒や作目変更等の対応が可能であるが、これまでダイズではそのような技術はなかった（特許文献１、特許文献２、特許文献３）。
【０００３】
【特許文献１】特開２００５−２６９９６６
【特許文献２】特開２００６−１５１８９８
【特許文献３】特開２００７−２０２５２９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
土壌試料からのダイズ黒根腐病菌の検出は難しく、定量的な解析は不可能であった。ダイズ黒根腐病菌の検出には、その土壌に生えている病徴を示すダイズ植物体試料から検出するしかなく、土壌試料を用いて迅速にダイズ黒根腐病菌を検出する必要があった。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
土壌試料から全ＤＮＡを抽出し、ダイズ黒根腐病菌に特異的なマーカー遺伝子をターゲットとするプライマーを用いてＰＣＲ増幅し、増幅産物をアガロースゲルで電気泳動して、ダイズ黒根腐病菌マーカー遺伝子を検出する。
【０００６】
（土壌ＤＮＡの抽出方法）
土壌試料を60℃で乾燥し、約0.5ｇ秤量する。土壌試料をＤＮＡ抽出キット（Soil DNA Isolation
Kit，MO Bio)を用いて、土壌中の全ＤＮＡを抽出する。
【０００７】
（土壌試料の採取方法）
一つの圃場から数点ずつ土壌試料を採取する。採取点数は、面積が一反（10アール）につき最低4地点から採取する。深さは表面から5ｃｍの間とし、約500ｇ採取する。採取した土壌試料は、解析に供するまで冷蔵保存する。
【０００８】
（土壌試料の前処理方法）
土壌試料（生土）を、60℃で24時間通風乾燥する。乾燥土壌試料を、乳鉢を用いて微粉砕する。
【０００９】
（土壌ＤＮＡの抽出方法）
乾燥土壌試料を、約0.5ｇ秤量する。土壌試料を土壌ＤＮＡ抽出キット（Soil DNA Isolation Kit，MO Bio)を用いて、土壌中の全ＤＮＡを抽出する。
【００１０】
（マーカー遺伝子を増幅するプライマーの作成）
土壌中のダイズ黒根腐病菌を検出するためには、ダイズ黒根腐病菌が持つ遺伝子のみをＰＣＲ増幅する必要がある。ダイズ黒根腐病菌が持つ遺伝子のうち、配列表に示すようにHistone H3、およびβ-tubulin遺伝子領域を増幅するプライマーセットを設計した。
なお、プライマーセット１は配列番号１および配列番号２の組合せ、プライマーセット２は配列番号２および配列番号３の組合せである。
【００１１】
（ＰＣＲ増幅と検出方法）
ダイズ黒根腐病菌2菌株に対して、Histone H3、およびβ-tubulin遺伝子領域に設計した合計3種のプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅を行った。その後、ＰＣＲ増幅産物を、アガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色した。染色した泳動ゲルを、トランスイルミネーターで紫外線照射し、バンドを検出した。
【発明の効果】
【００１２】
従来のダイズ黒根腐病菌検出方法では、時間や手間もかかり、ダイズ栽培前の検出は不可能であった。本方法を用いることにより土壌中のダイズ黒根腐病菌を短時間で検出できるだけでなく、腐病菌の半定量も可能になるため、ダイズ栽培前にダイズ黒根腐病が発生する可能性を判断できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】3種のプライマーセットによるダイズ黒根腐病菌の検出
【図２】プライマーセット1（β-tubulin）の検出限界
【発明を実施するための形態】
【００１４】
ダイズを作付けする予定の土壌を、あらかじめ採取する。本検出法を用いて土壌中のダイズ黒根腐病菌の存在・菌密度を調査し、ダイズ黒根腐病発生の危険性の情報を得ることで、土壌消毒や作目変更などの対策をとる。
【実施例】
【００１５】
（プライマーの検証）
いずれの菌株においても、安定して遺伝子の増幅が認められたプライマーセットは、β-tubulin領域に設計した2種のプライマーセット１とプライマーセット２のみであった。そこで図１に示す３種のうち、これらのプライマーセットについての検出限界を検討した結果、図２に示すようにプライマーセット1（β-tubulin）では、DNA濃度が反応液あたり5pg/μlまで検出可能であった。加えて、本プライマーセット１は、茎疫病菌、白絹病菌、菌核病菌では遺伝子の増幅が認められなかったことから、本プライマーセット１の特異性が実証された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
土壌ＤＮＡを抽出し、ダイズ黒根腐病菌のマーカー遺伝子（β-tubulin）のみを特異的にＰＣＲ増幅させ、土壌中におけるダイズ黒根腐病菌を迅速検出する方法。
【請求項２】
請求項１に記載のダイズ黒根腐病菌のマーカー遺伝子（β-tubulin）のみを増幅する、配列表に示す配列番号１と配列番号２からなるプライマーセット。
【請求項１】
土壌ＤＮＡを抽出し、ダイズ黒根腐病菌のマーカー遺伝子（β-tubulin）のみを特異的にＰＣＲ増幅させ、土壌中におけるダイズ黒根腐病菌を迅速検出する方法。
【請求項２】
請求項１に記載のダイズ黒根腐病菌のマーカー遺伝子（β-tubulin）のみを増幅する、配列表に示す配列番号１と配列番号２からなるプライマーセット。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１２−１４７６９９（Ｐ２０１２−１４７６９９Ａ）
【公開日】平成２４年８月９日（２０１２．８．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−７５２７（Ｐ２０１１−７５２７）
【出願日】平成２３年１月１８日（２０１１．１．１８）
【出願人】（３０６０２４１４８）公立大学法人秋田県立大学 (74)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年８月９日（２０１２．８．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１月１８日（２０１１．１．１８）
【出願人】（３０６０２４１４８）公立大学法人秋田県立大学 (74)
【Ｆターム（参考）】
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