培養培地にプロスタグランジン又はプロスタグランジン類似物を補足することによってインビトロ胚発生を高めるための方法及び組成
哺乳動物胚のインビトロ発生を高める方法が開示されており、胚の完全孵化（すなわち、透明帯から胚の遊離）を促進するのに有効な量において、培養培地にプロスタグランジン、すなわちプロスタグランジン類似物を補足することを有する。培養培地の補足は、好ましくは１又はそれ以上、以下の胚の発生時期の間に行われる、すなわち（ａ）ゲノムが活性化されて受精卵が桑実胚に発生するとき及び（ｂ）胚の桑実胚から初期胚盤胞への発生の間である。インビトロ受精胚のインビボ着床の可能性及び生児出生の可能性が、その結果高められ、生存に適した妊娠の確立が容易にされる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府の支援による研究または開発に関する記載
本発明は、全体的に又は部分的にＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｈｉｌｄ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（ＮＩＣＨＤ）、契約番号ＨＤ０１２７７、から財政的支援を受けて行われるものである。したがって、米国政府が本発明について所定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
発明の分野
本発明は、一般に哺乳動物胚のインビトロ培養のため、及び適した宿主哺乳動物の子宮に培養された胚の着床後における妊娠の達成を高めるための組成及び方法に関する。
【０００３】
従来技術の説明
卵管内の環境は、精子の受精の可能性を高め、分裂する胚の発生を促進する。卵管上皮細胞と共培養された胚は、発生、孵化及び着床を向上させたことが示された[Ｘｕ、２００１年；Ｘｕ、２０００年]。プロスタサイクリン（ＰＧＩ２）は、もともと血液及び血管（ｖａｓｃｕｌａｒ）のホメオスタシスを維持する点に関与すると考えられている。しかしながら、遺伝子ノックアウトマウスにおける最近の観察結果から示唆されることは、プロスタサイクリンが他の生理的機能を有し得ることである。子宮内膜由来ＰＧＩ２の重要性が、シクロオキシゲナーゼ(ＣＯＸ)−２ノックアウトマウスにおいて行われた観察によって強調される[Ｌｉｍ、１９９７年]。ＣＯＸ−２ノックアウトマウスの子宮内膜は、正常には脱落しなかった。結果として、移入された野生型胚（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ｅｍｂｒｙｏ）は、ＣＯＸ−２の欠損した雌マウスには着床できなかった。前述の異常性は、母方に外部からＰＧＩ２類似物の投与によってある程度矯正されることができた[Ｌｉｍ、１９９９年]。
【０００４】
着床前胚の発生における卵管由来ＰＧＩ２の役割が明らかでない理由は、ＰＧＩ２レセプタ(ＩＰ)ノックアウトマウスの一腹の産子数が野生型の産子数と比較されていないからである[Ｍｕｒａｔａ、１９９７年]。しかしながら、ヘテロ接合体ＩＰノックアウトマウスとの交配から生まれる子の遺伝子型の分布がメンデルの法則に従っていなかった。すなわち、ホモ接合体ＩＰノックアウト遺伝子型を有する雄及び雌の子の普及率は、それぞれ３７％及び２０％であり、予想されるよりも低かった[Ｍｕｒａｔａ、１９９７年]。
【０００５】
【特許文献１】米国特許第６１００２４９号公報
【特許文献２】米国特許第５０９６８２２号公報
【発明の開示】
【０００６】
発明の簡単な概要
最近、我々は、ヒト卵管がたくさんのプロスタサイクリン（ＰＧＩ２）及びＰＧＥ２を合成すること発見した[Ｈｕａｎｇ、２００２年]。遺伝子ノックアウトの研究は、子宮内膜由来ＰＧＩ２が子宮内膜の脱落に必須であることを示唆するが、着床前胚の発生におけるＰＧＩ２の効果は報告されていなかった。着床前胚の最適な発生にはＰＧＩ２を必要とするという仮説を用いて、マウス胚におけるＰＧＩ２の効果が、完全孵化率を基にして検査された。ＰＧＩ２レセプタ(ＩＰ)の発現は、ウエスタンブロット解析及び免疫組織化学によって評価された。ＰＧＩ２の胚への結合は、ラジオリガンド結合検定法によって確認された。我々の結果は、マウス胚の孵化はアイロプロスト(Ｉｌｏｐｒｏｓｔ）（ＥＤ５０６．７ｎＭ）、すなわち安定化したＰＧＩ２合成類似物の補足によって高められることを明らかにしている。８細胞から桑実胚に至る間、又は桑実胚から初期胚盤胞に至る間に、アイロプロストへの暴露が、孵化を促進させるのに重要であった。ＰＧＩ２に対するこの時期特有の反応が、ＩＰの発生時期特有の発現と同時に起こった。さらなる研究は、高められる胚の孵化を着床及び生児出生の増加と関連づけるために実施され、すなわちアイロプロストを補足された培地中で培養されたマウス胚が、妊娠キャリアに移入された。妊娠嚢及び生存する子の数がコントロール胚のその数と比較された。報告によれば、培養培地の添加物が胎児の体重を増加させるため[ＤｅＢａｕｍ、２００２年；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、１９９５年；Ｓｉｎｃｌａｉｒ、１９９９年]、子及び胎盤の重量も比較された。我々の結果は、アイロプロストを補足された培養培地中で胚を培養することは、子及び胎盤の重量に影響を与えることなく、マウス胚の着床及び生児出生を高めることを示している。
【０００７】
したがって、本発明のある実施例においては、培養培地にプロスタグランジン、例えばＰＧＩ２又はＰＧＥ２又はその類似物を補足することを含む胚のインビトロ発生を高める方法が提供されている。ある実施例において、プロスタグランジンはＰＧＩ２又はＰＧＥ２であり、またある実施例では、プロスタグランジン類似物はアイロプロスト又はＰＧＥ１である。ある実施例では、方法は、培養培地に胚の完全孵化を促進するのに十分量のプロスタグランジン又は類似物を添加することを含む。好ましくは、「完全孵化」は、胚が透明帯（ｚｏｎａ ｐｅｌｌｕｃｉｄａ）から離れることを有する。方法のある実施例において、培養培地の補足は、ゲノムが活性化されて受精卵が桑実胚へ発生する期間である、胚の初期発生時期の間に行われる。胚がヒトである実施例において、初期発生は４乃至８細胞状態で開始する。方法のある実施例において、培養培地の補足は、胚の桑実胚から初期胚盤胞への発生の間に行われる。ある実施例では、胚の初期発生から桑実胚期への発生と、胚の桑実胚から初期胚盤胞への発生の間との両方の間において行われる。方法のある実施例において、胚がマウス起源にある場合、補足する段階は、その２細胞発生の時期に胚を採取後２４乃至４２時間の間に、培養中の胚をプロスタグランジン又は類似物に暴露することを含む。胚がマウスである方法のある実施例では、桑実胚から初期胚盤胞の間に補足する段階は、その２細胞発生の時期に胚を採取後４２乃至７２時間の間に、胚を一度にプロスタグランジン又はプロスタグランジン類似物に暴露することを有する。
【０００８】
また、本発明のある実施例にしたがって提供されることは、インビトロ受精胚のインビボ着床の可能性を増加させる方法である。「着床の可能性」とは、子宮に着床する胚の能力である。この方法は、胚のインビトロ発生を高めるために、上述の実施例の一つを実行することを含むことにより、培養中の胚の完全な孵化が達せられる、すなわち、別のＩＶＦ方法に比べて孵化が高められる。この方法のある実施例にしたがって、完全に又は殆ど孵化された胚が、それから宿主哺乳動物の子宮に導入されて、胚の高められた着床が達せられる。ある実施例では、インビトロで胚の完全孵化は、生存に適した妊娠の確立と相関する。
【０００９】
本発明のある実施例において、インビトロで受精された哺乳動物胚の生児出生の可能性を増加させる方法が提供されている。「生児出生の可能性」とは、生児出生を生じる胚の能力である。上述されるように、この方法はプロスタグランジン又はその類似物を有するインビトロ培養によって、胚のインビトロ発生を高めることを有することにより、高められる孵化の可能性、すなわち培養中の胚の完全孵化が達せられる。好ましい実施例において、このような処理は、胚が培養から取り出されてインビボ環境にある後にさえも、完全孵化のための高められる可能性を与えている。この性質は「高められる孵化の可能性」として説明される。孵化される胚、すなわち高められる孵化の可能性を有する胚が、宿主哺乳動物の子宮に移入されて、胚が着床するようになりインビボで成長することにより、生児出生を生じる胚の能力が、孵化の高まりを有せず着床された胚の能力と比較して高められている。
【００１０】
本発明のさらにもう一つの実施例においては、インビトロで受精された哺乳動物胚の一群における生児出生率を増加させる方法が、上述の方法に従って胚のインビトロ発生を高めることを有することを提供されていることにより、孵化の高まり、すなわち好ましくは培養中の胚の完全孵化が達せられる。方法は、宿主哺乳動物に胚を導入、又は移入すること、及びそれから胚をインビボで成長できるようにすることを含んでおり、高められる孵化を有する胚の群からの生児出生率は、最初に完全に孵化されていない、すなわち孵化の高まりを受けていない状態で、宿主子宮へ移入される胚の群からの生児出生率よりも非常に高い。
【００１１】
なおもさらに、本発明のある実施例に従って提供されていることは、哺乳動物胚のインビトロ発生のための改良された細胞培養培地であり、その改良点は、孵化を高め、また好ましくはインビトロで胚の完全孵化を促進するのに有効な補足量のプロスタグランジン又はその類似物を含むことである。ある実施例において、培地は、ある量のプロスタグランジン又はその類似物を含んでおり、それはインビトロ培養から取り出されて宿主哺乳動物の子宮に移入された後に、胚の完全な孵化の可能性を高めるために有効である。これら及びその他の実施例、本発明の特徴及び利点は、以下の説明及び図を参照することによって明白になるであろう。
【００１２】
好ましい実施例の詳細な説明
本開示は、精子及び胚に対するＰＧＩ２並びにＰＧＥ２の効果の研究及びそれに続く研究の過程で明らかになった。我々の最近の結果は、ヒト[Ｈｕａｎｇ、２００２年]及びマウス[Ｈｕａｎｇ、２００４年]卵管上皮細胞が、ＰＧＩ２の合成、すなわちＣＯＸ-１又はＣＯＸ-２及びＰＧＩ２合成酵素に必須の酵素を発現することを示している。たくさんのＰＧＩ２又はＰＧＥ２は、１４Ｃ−アラキドン酸がヒト[Ｈｕａｎｇ、２００２年]又はマウス卵管[Ｈｕａｎｇ、２００４年]から調製されたミクロソームとインキュベーションされたときに産生された。本研究はまた、精子が卵と受精するために卵管末端に移動し、胚発生の最初の７２時間は卵管で起こるという事実を考慮した。
【００１３】
本研究の一部分として、胚に対するＰＧＩ２の影響が、ＰＧＩ２類似物を伴って培養されたマウス胚の完全な孵化を観察することによって評価された。そのメカニズムをさらに解明するために、ＩＰの発現及び放射ラベルされたアイロプロストによる胚の結合がまた検討された。
【００１４】
材料及び方法
試薬の出所及び制度上の承認。
別のものであると記載しない限り、試薬はシグマ社(Ｓｉｇｍａ Ｃｏ．）（アメリカリ合衆国、ミズーリ、セント．ルイス）(Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から購入されたものである。ヒトのサンプルの使用は、ヒューマンサブジェクツの保護のための委員会（ｔｈｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｓｕｂｊｅｃｔｓ）(Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄと同等）によって承認された。実験動物の取扱い及び研究プロトコルは動物福祉委員会によって認定された。
【００１５】
マウス胚の採取及び培養。
マウスは、水及び餌へのアクセスが自由で、制御された温度、湿度、及び光周期(１２時間明暗周期)条件の下に保った。３週齢のＣ５７Ｂ１／６雌マウスはハーラン（Ｈａｒｌａｎ）（アメリカ合衆国、インジアナ、インジアナポリス）（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ、ＵＳＡ）から購入された。８週齢のＣ３Ｈ雄マウスは最初にハーランから購入され、後にジャクソンラボラトリー（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（アメリカ合衆国、メイン、バーハーバー）（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ ＭＥ、ＵＳＡ）から購入された。雌マウスの過剰排卵は、妊娠雌馬血清ゴナドトロピン（５単位）、及び続く４６時間後にヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ、５単位）の腹腔内投与によって行われた。ｈＣＧを受けた後、それぞれの雌マウスが一匹の繁殖力のある雄マウスとつがいにされた。４８時間後、２細胞胚は卵管から２５ｍＭへペス（ＨＥＰＥＳ）及び１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（アービン サイエンテイフィツク）（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補足されたα-ＭＥＭ培地に採取された。
【００１６】
胚(群当り１７-２０個)は、各ウエルに６００μＬの培地を含む４ウエルデイッシュ（アメリカ合衆国、イリノイス、ネイパービルのナルジ ヌンク インターナショナル ネイパー）（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｎａｐｅｒ、Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ、ＩＬ、ＵＳＡ）において、３７℃で５％ＣＯ２の下に培養された。ＨＴＦ及びα-ＭＥＭ培地は、９６時間連続して用いられて分裂胚の変化する栄養要件を満たした[Ｇａｒｄｎｅｒ、１９９８年]。ＨＴＦ培養液（セイジ バイオフアーマ）（ＳＡＧＥ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ）は最初の４８時間用い、イーグルの塩類（Ｅａｒｌｅ'ｓ ｓａｌｔｓ）及び２ｍＭグルタミンを有するα-ＭＥＭ培地（アービン サイエンテイフィツク）（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）は２番目の４８時間の間用いた。実験胚は、水中のアイロプロストを受け、コントロール胚は等量の水を受けた。予備実験では、胚の９５％以上がＫＳＯＭ培地(アメリカ合衆国、ニュージャージー、フィリップスバーグのスペシャリテイ−メデイア、セル アンド モレキュラー テクノロジーズ、インク．（Ｓｐｅｃｉａｌｉｔｙ Ｍｅｄｉａ、Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ． Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ ＮＪ，ＵＳＡ））で培養した胚と同様に、９６時間までに胚盤胞になることを示した。９６時間培養後、各胚は透明帯(ｚｏｎａ ｐｅｌｌｕｃｉｄａ）の有無に対して調べられた。透明帯が完全に無い胚は、完全に孵化したものとして計測された。完全孵化率は、完全に孵化された胚の数を胚の総数で割って求められた。胚の完全孵化を、胚盤胞形成又は胚孵化の代わりに指標として選択したが、この理由は、後者の２マーカーが生存に適した妊娠の確立[Ｌａｎｅ、１９９７年]と相関しないからである。
【００１７】
ウエスタンブロット解析（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）。
推定されるマウスＩＰのアミノ酸配列(４１７ａ．ａ、Ｇｅｎｅｂａｎｋ＿ＢＡＡ０５１４４）及びヒトＩＰのアミノ酸配列(３８６ａ．ａ、Ｇｅｎｅｂａｎｋ＿ＢＡＡ０６１１０）は相同性が高い[Ｋａｔｓｕｙａｍａ、１９９４年]。予備的な検討では、アフィニテイー精製ポリクローナルペプチド抗体(テキサス大学健康科学センターのケーヘルアン博士（Ｄｒ．Ｋｅ−Ｈｅ Ｒｕａｎ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ）から提供)は、マウスＩＰと交差反応することを確認した。ウエスタンブロット解析は以前に説明したように行われた[Ｈｕａｎｇ、２００２年]。簡潔には、６０個のマウス胚盤胞由来の全細胞溶解物が、１０％アクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって分離され、ニトロセルロース膜（アメリカ合衆国、ニューハンプシャーのシュレイチャ− アンド シュエル、インク．）（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｉｎｃ．、ＮＨ、ＵＳＡ）に転写された。免疫反応タンパクが、抗体とのインキュベーション及び増強された化学発光（アメリカ合衆国、ニュージャージー、ピスカタウエイのアマ−シャム バイオサイエンス）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）による視覚化によって検出され、またＳＴＯＲＭ８６０レーザースキャナ（アマ−シャム バイオサイエンス）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使って検出された。ヒト血小板ミクロソームは、陽性のコントロールとして用いられた。抗体の特異性は、前吸収抗体を用いる平行実験で確かめられた。
【００１８】
免疫組織化学、蛍光顕微鏡及び共焦点顕微鏡解析。
マウス胚が４℃で３０分間、４％パラホルムアルデヒド中に固定された。リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄後、胚は０．０５％のＴｗｅｅｎー２０、５％の粉末ミルク及び０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００含有トリス緩衝化生理食塩水(ｐＨ７．４)において、室温で２０分間ブロックされた。胚は、２時間ブロッキング緩衝液中でＩＰ抗体(５ｎｇ／ｍｌ）とインキュベーションされ、それから３７℃で３０分間、アレクザ（Ａｌｅｘａ）４８８(２.５μｇ／ｍｌ、アメリカ合衆国、アラバマのモレキュラー プローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、ＡＬ、ＵＳＡ））と結合したヤギ抗-ラビットＩｇＧとインキュベーションされた。細胞核は、室温で２０分間、１０μｇ／ｍｌプロピデウム イオダイド（ｐｒｏｐｄｉｕｍ ｉｏｄｉｏｄｅ）によって対比染色された。胚は、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ-Ｇ（登録商標）（アメリカ合衆国、アラバマ、バーミングハムのサザン バイオテクノロジー アソシエイツ インク.）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｉｎｃ．、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ、ＵＳＡ）に埋め込まれた。蛍光顕微鏡解析のために、胚盤胞は封入剤中に置かれてカバースリップが被せられた。共焦点顕微鏡解析のために、およそ５０μｍのスペーサが、スライドとカバースリップとの間に置かれて胚の３次元形態を保持した。陰性のコントロールには、胚が１０ｎｇ／ｍｌの非免疫ラビットＩｇＧとインキュベーションされた（すなわち、一次抗体濃度の２倍の濃度）。
【００１９】
蛍光顕微鏡解析は、適切なフィルタを備えたツアイス アキシオプラン２（ＺｅｉｓｓＡｘｉｏＰｌａｎ ２）顕微鏡を用いて行われた。画像は、ＣＣＤカメラを用いて捕らえられ、アキシオビジョン プログラム（Ｖｅｓｉｏｎ ３．０．６）によって処理された。共焦点顕微鏡解析は、オリンパス ＢＸ-５０顕微鏡に付属されたバイオラッド ラジアンス ２０００（ＢｉｏＲａｄ Ｒａｄｉａｎｃｅ ２０００）共焦点システム（アメリカ合衆国、カルフオル二ア、ハーカルスのバイオラッド ラボラトリーズ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使って行われた。その画像は、イメージ プロ プラス プログラム（Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ＋ ｐｒｏｇｒａｍ）（アメリカ合衆国、カルフオル二ア、カールスバッドのメデイア−サイバーネテイックス）（Ｍｅｄｉａ−Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使って処理された。
【００２０】
全胚ラジオリガンド結合測定。
３Ｈ−アイロプロストの胚盤胞への結合の解析は、わずかに変更修正して以前に説明された [Ａｒｂａｂ、２００２年] ように行われた。２３２個が孵化されて孵化する胚盤胞は、結合緩衝液(１０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４中に１０ｍＭＭｎＣｌ２）中で３回洗浄されてから、非標識アイロプロスト（５μＭ）を有する又は有しない１００μｌの結合緩衝液に移された。反応は、３Ｈ−アイロプロスト（２００ｎＭ、特異活性１１．０Ｃｉ／ｍｍｏｌ、アマ−シャム バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を含む結合緩衝液を加えて、室温で６０分間インキュベーションすることによって開始された。その反応は、氷冷洗浄緩衝液(１０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４中に０．０１％ＢＳＡ）に胚盤胞を移すことによって終了された。緩衝液及び胚盤胞は、ガラスフアイバーフィルタ（Ｗｈａｔｍａｎ ＧＦ／Ｃ２．４ｃｍ）を通してろ過され、フィルタは、２ｍｌの洗浄緩衝液で３回洗浄された。フィルタがオーブン中で乾燥されてから、放射活性が５ｍｌのシンチレーション液で計測されるシンチレーションによって測定された。
【００２１】
統計解析
スチュ-デントのｔ検定又はダネット（Ｄｕｎｎｅｔ）検定に従った一元配置分散分析が適所に用いられた。ｐ値＜０．０５は統計的に有意とみなされた。量反応曲線の作図及びＥＤ５０値(１．０に設定されるヒル勾配を有して）の計算には、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅ（アメリカ合衆国、カルフオル二ア、サンデイゴのグラフパッド プリズム ソフトウエア インク．）（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を備えた。
【００２２】
胚移入
マウス胚が採取されて上述のように培養され、その後に本発明者によって公表された[Ｈｕａｎｇら、２００３年]。簡潔には、２細胞胚（Ｃ３Ｂ６Ｆ１）が、ｈＣＧ投与後４２時間、過剰排卵された３週齢のＣ５７Ｂｌ／６雌マウスから採取された。胚(群当り１４個)は、６００μｌのＨＴＦ培地（アメリカ合衆国、ニュージャージー、ベッドミンスターのセイジ バイオフアーマ）（ＳＡＧＥ Ｂｉｏｐｈａｍａ、Ｂｅｄｍｉｎｓｔｅｒ、ＮＪ、ＵＳＡ）を各々含む４ウエルデイッシュ（アメリカ合衆国、イリノイス、ネイパービルのナルジ ヌンク インターナショナル ネイパー）（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ、ＩＬ、ＵＳＡ）において、３７℃で５％ＣＯ２の下に培養された。実験胚は、水中のアイロプロスト（１μＭ、アメリカ合衆国、ミシガン、アン アーバーのケイメン ケミカル（Ｃａｙｍｅｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ、ＵＳＡ））を、またコントロール胚は等量の水を受けた。どちらの場合も水量は培養液の０．１％に満たなかった。
【００２３】
胚ドナー（ｄｏｎｏｒ）がｈＣＧを受けた翌日に、膣スメアが妊娠可能性キャリア(８週齢のＣ３Ｂ６Ｆ１雌マウス)から得られて、発情周期の時期を決定した。発情期のマウスは、精管切除されたＩＣＲ雄（ハーレン）（Ｈａｒｌａｎ）とつがいにされて翌朝膣栓を調べられた。栓を有する発情期のマウスは０．５日偽妊娠であると指定された。
【００２４】
胚移入は、解剖顕微鏡(オリンパスＳＺ−ＰＴ）の下に、２．５日偽妊娠において行われた。外科的麻酔は、ケタミン（ｋｅｔａｍｉｎｅ）（２００ｍｇ／Ｋｇ）及びキシラジン（ｘｙｌａｚｉｎｅ）（１０ｍｇ／Ｋｇ）（合衆国テキサス州のバーンズ ベトサプライ インク（Ｂｕｒｎｓ ＶｅｔＳｕｐｐｌｙ Ｉｎｃ．ＴＸ、ＵＳＡ）からの両麻酔薬）の腹腔内投与によって得られた。各子宮角は、２ｃｍの側面切り口からアクセスされた。近位卵管は一対のピンセットで保持されたまま、開口部が３０ゲージの皮下針によって、腸間膜の子宮角の遠位端に作り出された。開口部は、１３５μｍの内径を有するトランスフアーピペット（アメリカ合衆国、ニュージャージーのミッドアトランテイックダイアゴノステイックス、インク．）（ＭｉｄＡｔｉａｎｔｉｃ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｃ．、ＮＪ、ＵＳＡ）を入らせることができる。０．８μｌの移入用培地(２５ｍｌ ＨＥＰＥＳ及び１％ＢＳＡを加えたα-ＭＥＭ）中の７個の胚までが、各々の子宮角に移入された。それぞれ移入後、ピペットの内容物が、残留した胚を同定するために、立体写真顕微鏡下で調べられた。側面切り口は、９ｍｍの金属クリップ（アメリカ合衆国、ニュージャージーのクレイ アダムス、パルシッパニー）（Ｃｌａｙ Ａｄａｍｓ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）で閉じられた。一方の子宮角から他方の子宮角への胚の移動によるコントロール胚及び実験胚の混合を避けるために（ドイツのボン大学のアンドレス ツインマー博士との個人情報（Ｄｒ．Ａｎｄｒｅａｓ Ｚｉｍｍｅｒ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｂｏｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ））、それぞれの妊娠キャリアは、コントロール胚又は実験胚のいずれかを受けた。一定の移入技術を維持するために、胚移入は同じプロトコルに従って、一人の人によって行われる、その人は、判別されている胚が受ける処理には左右されなかった。両群が、研究の過程で（６ヶ月間）得られる経験と等しく利益を得たことを確実にするために、胚は４つのブロックでの処理（コントロール又はアイロプロスト処理）に割り当てられた。
【００２５】
着床率の決定
胚移入後７２時間目に、着床は、多少変更修正して以前に説明された方法に基いて決定された[Ｐａｒｉａら、１９９３年]。簡潔には、安楽死前３分間、０．１ｍｌのシカゴブルー（１％）が、妊娠マウスの尾静脈から投与された。そのマウスを殺した後、子宮角が取り出された。子宮角を取り囲む別々のブルーバンド(アスタリスクで示される)が計測された(図６Ａ)。これらのバンドの存在は、着床部位への血管補給の増加を反映している。それから子宮角が開かれ、妊娠嚢が計測された(図６Ｂ)。着床率は、移入された胚当りの妊娠嚢の数として表現された。
【００２６】
生児出生率と子及び胎盤の重量の決定
予備的な検討は、一腹の大きさが小さいときには、妊娠キャリアが子を共食いするこを示した。子を正確に計測し、体重を量るために、我々は、胚移入後１４日目に妊娠キャリアを殺した(妊娠期間の１６．５日目、すなわち自然に誕生する２日前)。殺した後、生きている子の数を計測し、個々の子及び胎盤の重量が決定された。全ての子が全体の異常を調べられた。空の妊娠嚢の数がまた、着床率の決定のために計測された。生児出生率は、移入される胚当りの生存する子の数として表現され、着床率は、移入される胚当りの生存する子を有し又は有しない嚢の数として表現された。
【００２７】
統計解析
フィッシャーの直接確率検定が、比率を比較するために用いられ、スチュ-ダントのｔ検定が体重の比較のために用いられた。ｐ値＜０．０５は統計的に有意であると認められた。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｉｎｓｔａｔ（登録商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅ（アメリカ合衆国、カルフオル二ア、サンデイゴのグラフパッド プリズム ソフトウエア インク．）（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）が、統計解析に用いられた。
【００２８】
結果
ＰＧＩ２はマウス胚の完全孵化を高めた。
マウス胚の完全孵化が、濃度に依存するかたちでアイロプロストによって高められた。その効果は０．１μＭ又はそれ以上の濃度（図１） で統計的に有意であった。完全な胚の孵化の最大増加は、１μＭで起こっており、実験胚の８１±７％(平均値±標準偏差、ｎ＝３)が完全に孵化した。対照的に、コントロール胚の４９±１４％(平均値±標準偏差、ｎ＝５)のみが完全に孵化した。量反応曲線からのＥＤ５０値は６．７ｎＭ（図１）であった。飽和濃度依存反応及び６．７ｎＭのＥＤ５０値は、アイロプロストの効果がレセプタによって仲介されたことを示唆している。
【００２９】
高められる孵化への重要なＰＧＩ２暴露の継続時間及び胚の発生時期。
胚が子宮に入る前にいくつかの発生時期を経るので、我々は、アイロプロストに対する発生時期特有の反応を研究した。我々の結果は、９６時間培養の間のある期間が、その他の期間よりもより重要であったことを示している。最初の２４時間の培養中（この期間の間に、たいていの２細胞の胚は８細胞の胚に発生した）にアイロプロストへの暴露は、孵化を高めなかった（図２）。一方、採取後０−７２時間又は２４−７２時間の間にアイロプロストへの暴露は、０−９６時間暴露を行ったものと同じ比率の完全孵化を生じた（図２）。
【００３０】
アイロプロストの十分な効果を確保するアイロプロストへの暴露の２つの重要な期間は、採取後２４乃至４２時間と、４２乃至７２時間との間にあり、これらはそれぞれ８細胞から桑実胚までと、桑実胚から初期胚盤胞までとの形質転換に対応している(図２の下部の表)。我々のデータは、胚をＰＧＩ２に短時間暴露することは、胚が卵管を離れた後でさえも完全孵化のための高められる可能性を与えることを示している。
【００３１】
マウス胚はＩＰを発現する。
マウス胚の発生時期特有の発現を調査するために、我々は発生の異なる時期において胚盤胞のウエスタンブロット解析及び胚の免疫組織化学解析を行った。ウエスタンブロット解析は期待される分子量のタンパクが、ＩＰに対するアフィニテイ精製抗体によって検出できることを示した（図３）。蛍光顕微鏡は、ＩＰ染色が桑実胚及び胚盤胞には存在する（図４Ａ−Ｅ）が、未受精卵又は１細胞、２細胞及び８細胞胚(図示せず）には存在しないことを示した。桑実胚及び胚盤胞のＩＰ染色は、同じ細かい網状模様を共有していた。共焦点顕微鏡画像は、ＩＰが栄養外胚葉で好ましく発現されたことを示唆している。したがって、マウス胚によるＩＰの時期特有発現が、アイロプロストに対する反応と一致した。
【００３２】
放射ラベルしたアイロプロストはマウス胚に結合する。
アイロプロストによる胚の完全な孵化の濃度依存性の高まりは、その効果がレセプタ仲介であることを示唆した。我々は、ラジオリガンド結合測定を行って、アイロプロストによるマウス胚の結合をさらに確認した。我々は、０．１μＭレベルのリガンドで結合するアイロプロストの量を計ることを選択し、ここで増大された孵化が最初に観察され、およそ３．０４ｆｍｏｌの３Ｈ−アイロプロストが１１６胚盤胞に特異的に結合することを見出した（図５）。
【００３３】
議論
我々のデータは、ＰＧＩ２が胚の完全孵化を高めることを最初に示している。これは、ヒト卵管由来の上皮細胞とマウス胚の共培養が、胚細胞数を増加させ、アポトーシスを減少させて、胚の孵化を発生させるという以前の報告と一致している[Ｐｉｅｋｏｓ、１９９５年；Ｘｕ、２０００年；Ｘｕ、２００１年]。それ故、卵管由来ＰＧＩ２及び子宮内膜細胞由来ＰＧＩ２は、同様のパラ分泌方法でこれらの効果を与えている。前者は胚の孵化を促進させ、後者は血小板凝集を妨げる。濃度依存性反応は、レセプタ仲介の事象と一致しており、ＥＤ５０値６．７ｎＭは報告されているＫｄ、すなわちヒト血小板から可溶化されたＩＰ（８ｎＭ）の値と同様であった[Ｔｓａｉ、１９８９年]。
【００３４】
アイロプロストに対する胚の反応は、発生時期特有であり、ＩＰの発現と一致した（図２）。反応性についてのこれらの重要な期間は、受精卵が桑実胚へと発生する期間である、卵管におけるマウス胚の一時滞在と一致した。関連した発生時期が、ヒト及びマウス胚のゲノムの活性化とも一致しており、ゲノムの活性化は、４細胞期及び８細胞期の間と、２細胞期後とにそれぞれ起こる[Ｔｅｓａｒｉｋ、１９８６年；Ｔｅｓａｒｉｋ、１９８８年；Ｂｒａｕｄｅ、１９８８年]。
【００３５】
ＩＰがどのようにその効果を発揮するのかという特定の理論に限定されることを望むものではないが、初期発生の間、卵管由来ＰＧＩ２又はＰＧＥ２に暴露された胚が、子宮に達する際に、高められる孵化の可能性を維持することが提案される。したがって、卵管由来ＰＧＩ２を通じて、胚が卵管中にある間に、着床のために胚自体が積極的に準備している。胚の観点からすれば、卵管由来ＰＧＩ２は、子宮内膜細胞由来ＰＧＩ２に相補的であり、受容力を確保するために子宮内膜の脱落を仲介する[Ｌｉｍ、１９９９年]。
【００３６】
特定の理論に限定されることを望むものではないが、ＰＧＩ２及びＰＧＥ２によって仲介される高められた孵化は、胚細胞の数の増加によってもよいことが提案される。様々なメカニズムが、インビトロ及びインビボのマウス胚の孵化に関与している。インビトロの孵化は、胚盤胞の拡張に関与して、透明帯破裂の前に全体的な透明帯の間伐が引き起こるが、インビボの孵化は、子宮の又は栄養外胚葉の分解物質による全体的な透明帯の溶解に関与する[Ｍｏｎｔａｇ、２０００年]。したがって、インビトロで孵化を達するためには十分な量の胚細胞の数が要求される。この点において、われわれの結果は、卵管の上皮細胞と共培養された胚は、より多くの細胞を有し細胞死をより少なくしたという発見と一致しており、孵化を向上させた[Ｙｅｕｎｇ、１９９２年；Ｘｕ、２０００年]。その上、ＰＧＩ２は、栄養外胚葉でトリプシン様プロテアーゼの生産を増加させて透明帯（ｚｏｎａ）を溶解することができる[Ｓａｗａｄａ、１９９０年；Ｐａｒｏｎａ、１９８６年]。
【００３７】
ＩＶＦ胚(胚当り１０−２０％)の低着床の可能性[ＣＤＣ、２００１年]は、一つには次善の培養条件に起因すると考えられる[Ｄｅ Ｖｏｓ、２０００年]。培養液は、インビトロの胚発生を改良するために変更されてきた[Ｇａｒｄｎｅｒ、１９９８年]。我々のデータを基に、培地にＰＧＩ２及び／又はＰＧＥ２類似物、例えばアイロプロスト、ＰＧＥ１のような物質を補足することで、発生する胚に改良した培養環境を与え、着床の可能性を増加させることができる。
【００３８】
要するに、ＰＧＩ２は、培養されたマウス胚の完全孵化を高めた。マウス胚によるＩＰの時期特異発現は、ＰＧＩ２に対する反応と一致した。結局、我々の予備的なデータを基に、ＰＧＥ２もまた、培養されたマウス胚の完全孵化を高めた。
【００３９】
さらなる検討において、我々は、培養培地にＰＧＩ２を補足することが、着床の可能性及びマウス胚の生児出生の可能性を高めることを明らかにした。これらの結果は、ＰＧＩ２は、培養中のマウス胚の完全孵化を高めるという我々の最初の観察を裏付けており [Ｈｕａｎｇ、２００３年]、また、卵管由来ＰＧＩ２が生理的機能を果たすという我々の仮説も裏付けている[Ｈｕａｎｇ、２００２年]。
【００４０】
表１は、ＰＧＩ２がマウス胚の着床の可能性を高めることを示す。８４個のコントロール胚及び８１個のアイロプロスト処理胚が、１２匹の妊娠キャリアに移入された。７２時間後、よりたくさんの妊娠嚢が、コントロール群よりもアイロプロスト処理群に見出された（７６％対４２％、相対的危険度１．８４、９５％信頼区間１．３８−２．４３、ｐ値＜０．０００１)。移入時においては、胚の発生時期は同等であった。
【００４１】
表２は、ＰＧＩ２アイロプロストが、マウス胚の生児出生の可能性を高めることを示す。４０６個のコントロール胚及び４１５個のアイロプロスト処理胚が、それぞれ３０及び３１匹の妊娠キャリアに移入された。コントロール及び実験群の生児出生率は、それぞれ２８％及び３６％であった（ｐ値＝０．００１７、相対危険度１．２８、９５％信頼区間：１．０４４−１．５６０)。子及び胎盤の重量が比較された。したがって、ＰＧＩ２は、子又は胎盤のどちらの重量にも影響を与えることなく、マウス胚の生児出生の可能性を増加させた。その上、全体の異常は指摘されなかった。
【００４２】
上述したように、およそ７０％の実験胚及びコントロール胚が、移入時には桑実胚期にあった（表1)が、移入された実験胚はよりたくさんの妊娠嚢を生じた。これらの結果は、８細胞期と桑実胚期の間にＰＧＩ２に暴露することは、マウス胚の完全な孵化を高めるには十分であるという我々の以前の観察を確認するものである[Ｈｕａｎｇ、２００３年]。それらはまた、胚栄養因子として作用する卵管由来ＰＧＩ２と一致しており、この理由は、受精されたマウス卵が、卵管の内部で桑実胚に発生するためである[Ｓｎｅｌｌ、１９６６年]。
【００４３】
上述した現象は、ＰＧＩ２が、結果的に高められる孵化、着床、及び生児出生の増加となる一連の出来事を開始することを示している。この点において、ＰＧＩ２は血小板活性化因子（ＰＡＦ）によく似ており、それはＰＡＦに短時間暴露するとマウス[Ｏ’Ｎｅｉｌｌ、１９９８年]及びヒト胚[Ｏ’Ｎｅｉｌｌ、１９８９年]の着床を増加させた。ＰＧＩ２によって開始される分子細胞学的事象は、孵化にとっては重要であるに違いない。それらは、胚細胞数の増加[Ｍｏｎｔａｇ、２０００年]、栄養外胚葉でトリプシン様プロテアーゼの産生の増加[Ｓａｗａｄａ、１９９０年；Ｐｅｒｏｎａ、１９８６年]、栄養外胚葉の高められるナトリウム−カリウム−ＡＴＰアーゼ（Ｎａ＋−Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ）システムによる高められた胞胚腔の拡張[Ｂｉｇｇｅｒｓ、１９８８年]、又はいまだメカニズムに見出されていないことを含んでいる。
【００４４】
コントロール胚の着床率が、移入後７２時間又は１４日目それぞれを調べたときには同等であった(４２％及び４６％)。一方、移入後１４日目に調べられた実験胚の着床率(５９％)は、移入後７２時間目に調べられた着床率(７６％)よりもかなり小さかった(ｐ＝０．０３８)。よりたくさんの嚢が、着床の位置に群がることによって、実験群に完全に再び吸収されたことはもっともらしい事である。代わって、アイロプロストは、さもなければ着床してなかったいくつかの胚を「救済」し、これら「救済された」胚の一部のみが生存する子へ発生した。この検討と、[Ｈｕａｎｇ、２００２年]及びマウス[Ｈｕａｎｇ、２００４年]卵管でのたくさんのＰＧＩ２生産との結果は、ＰＧＩ２が、卵管で分泌される胚栄養因子の一つであることを示唆し、したがってＰＧＩ２類似物を有する胚の培養培地に補足することは、ＩＶＦの効果を改良することを予期させる。
【００４５】
ＩＶＦ培養培地に胚発生又は着床を高める物質を補足することは、たいていの実験室及び非常に注意を払う培地製造業者によって採用されてきた。この懸念事項には、生殖毒物学、奇形形成、及び場合によってはこのような操作の後生的な影響を含んでいる。ヒト血清を補足された培地中で培養された羊胚由来の子羊は、より重みがあり妊娠期間がより長かった[Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、１９９５年；Ｈｏｌｍ、１９９６年；Ｓｉｎｃｌａｉｒ、１９９９年]。過剰増殖及び新形成を含む先天性異常症、すなわちベックイス−ワインダーマン（Ｂｅｃｋｗｉｔｈ−Ｗｅｉｎｄｅｒｍａｎｎ）症候群は生殖介助術と関係があった。[ＤｅＢａｕｎ、２００２年；Ｍａｈｅｒ、２００３年]。
【００４６】
胚及び胎児発生に示したアイロプロスト[Ｂａｔｔｅｎｆｅｌｄ、１９９５年]に関する生殖毒物学の検討は、胚及び胎児発生でウサギ及びサルでは影響されないが、指の変形がラットで観察されることを示した。指の異常は、アイロプロストの先天的奇形形成というよりも、影響を受けた構造から低酸素症を招く子宮胎盤流量の減少によるものらしく、この理由は、アイロプロストは血管拡張剤であり検討された動物が、妊娠期間を通してアイロプロストを受容したからである。ヒドラジン及びジヒドロピリジン類のような異なった化学構造を有する血管拡張剤を用いる場合、同じような問題が引き起こされるであろう。最近の研究では、アイロプロストへの暴露が、着床前の期間の間に行われた。２４６匹の生存する子において調べると、指の変形又はその他の異常性はなく、２群間の子及び胎盤の重量は同様であった。全てこれらのことを除いて、ＩＶＦ培地にＰＧＩ２類似物を補足することは、実験的プロトコルとみなされるべきである。
【００４７】
これらの実例の検討において、我々は、ＰＧＩ２が胎児又は胎盤のいずれの重量にも影響を与えることなく、マウス胚の着床及び生児出生の可能性を高めること、すなわちプロスタサイクリンは、胎盤又は新生児の重量を増加させないことを明らかにした。これは、着床及び生児出生の高まりとは別の利点であり、プロスタサイクリンが、着床及び生児出生を高める他の代理母とは異なることを示している。着床及び生児出生を高める以前に報告された代理母はまた、新生児の重量を増加させて、ヒト体外受精（ＩＶＦ）についてこれらの代理母の使用を不適としている。さらに、プロスタサイクリンは、インビボのマウスモデルでは、胎盤及び新生児の重量に影響を与えなかったため、ヒトＩＶＦ胚に利用できると考えられている。
【００４８】
マウス胚についての前述のインビボ研究で得られた結果は、それらの胚が子宮に移入される前に、プロスタグランジン又はプロスタグランジン類似物を用いてインビトロで同様に処理される場合に、ヒトを含めその他の哺乳動物胚において得られるであろう同様な好ましいインビボの結果を示し、又は予測させるものであるとみなされる。本ヒトＩＶＦは、患者の子宮への８細胞期又は胚盤胞期の胚の移入を含んでいる。この点において、ヒトＩＶＦは、妊娠マウスに対するコントロール、すなわちプロスタサイクリン類似物処理胚への移入を含む我々の実験の計画と同様である。我々のデータは、妊娠キャリアに移入された際に、８細胞期と桑実胚期との間にプロスタサイクリン類似物に暴露された実験胚が、コントロール胚よりも着床及び生児出生率が非常にに高いことを示した（表１及び２、それぞれに示されるように）。
【表１】
【表２】
【００４９】
さらに苦心なく、当業者はここまでの説明を用いて、その最大限に本発明を利用できることを確信する。前述の実施例は、例証として解釈されるべきであり、開示の残部をいかように規制するものではない。本発明の好ましい実施例を示され説明したけれども、その変更が、本発明の趣旨及び教示から逸脱することなく当業者によりなされるであろう。ここに説明される実施例は、単なる例示であり限定を意図するものではない。ここに開示された本発明の多くの変形及び変更が、可能であり本発明の範囲のものである。発明の背景における参照例、特にこの出願の優先日後の公開日を有する如何なる参照例の如何なる説明も、本発明に対して従来技術であると認めているものではない。ここに引用した全ての特許、特許出願及び公開の開示は、それらがここでの記載を補う模範的、手法的、その他の詳細を与える限りにおいて、ここに援用される。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】プロスタサイクリン（ＰＧＩ２）及びマウス胚の完全孵化を示したグラフである。２細胞マウス胚が、ＰＧＩ２類似物（アイロプロスト、１ｎＭから１０μＭの範囲）で培養された。完全孵化率は９６時間後に決定された。３乃至５の個別の実験（各々１７−２０胚）の結果は、平均±標準偏差として表現される。ＥＤ５０値はおよそ６．７ｎＭである。
【図２】完全孵化の増大及びプロスタサイクリン（ＰＧＩ２）暴露の継続時間（胚発生の時期を基にアイロプロスト暴露）を示す棒グラフである。２細胞マウス胚が０．１μＭアイロプロスト、すなわちＰＧＩ２類似物の存在下で示された期間（２細胞胚の採取後の時間として表現される）培養された。完全孵化率は平均±標準偏差として表現される。胚がアイロプロストに暴露されている間の発生時期が表に記載されている。２期間がアイロプロストの最大限の効果に重要であるようである、すなわち２４乃至４２時間及び４２乃至７２時間であり、それぞれ８細胞胚から桑実胚期及び桑実胚期から初期胚盤胞への発生に対応する。いずれの期間の間にアイロプロストに暴露しても、高められる孵化を確実にした。個別の観察の数（１８−２０胚についてのそれぞれ）は、コントロールで１２胚、４２−７２時間では３胚、その他は４胚であった。コントロール胚の完全孵化率は、図１の孵化率とは異なっており、おそらく雌マウスの個体が変更されたからであろう。
【図３】マウス胚のプロスタサイクリンレセプタ（ＩＰ）の発現を示すウエスタンブロットである。６０匹のマウス桑実胚（レーン１）から抽出した全細胞溶解物及びヒト血小板のミクロソーム（陽性コントロール、レーン２）のウエスタンブロット解析は、ヒトＩＰに対する抗体との免疫反応を示した。マウスＩＰの移動度は、ヒトＩＰの移動度よりも少なく、予想される分子量のそれぞれ〜５０ｋＤａ及び〜４６ｋＤａと一致した。
【図４Ａ−Ｇ】桑実胚及び胚盤胞におけるプロスタサイクリンレセプタ（ＩＰ）の発現を示す顕微鏡写真である。２個の桑実胚の位相差（図４Ａ）及びＩＰ染色（図４Ｂ）像が示される。透明帯は矢印で示される。図４Ｃは、胚盤胞における核のプロピジウムイオダイド染色を示す。図４Ｄにおいて、胚盤胞のＩＰ及びプロピジウムイオダイドが重ね合わせられる。図４Ｅは胚盤胞のＩＰ染色が網状模様を示すことを示す。ＩＰ染色の集合塊が栄養外胚葉のみに見られ、内部細胞塊には染色の増進を示さなかった。図４Ｆは桑実胚内の内部細胞塊（ＩＣＭ）の配置を示すスケッチである。図４Ｇは胚盤胞の共焦点顕微鏡画像であり、栄養外胚葉のみがＩＰ抗体によって染色されることを示す。断面の平面図はパネルＦ中のラインによって示される。陰性のコントロール、受精卵又はその他の発生時期にある胚（図示せず）にはＩＰ染色はなかった。図中の棒はおよそ２０μｍである。
【図５】無傷のマウス胚に結合するアイロプロストを示す棒グラフである。１１６個のマウス胚盤胞が、５μＭの非標識アイロプロストの存在又は不在下で、０．１μＭ３Ｈ−アイロプロスト、すなわちＰＧＩ２類似物とインキュベーションした。結合した３Ｈ−アイロプロスト及び遊離の３Ｈ−アイロプロストは膜ろ過によって分離された。
【図６Ａ−Ｂ】妊娠マウスの子宮内の妊娠嚢を示す。着床は、着床部位の血管の増加によって決定され、妊娠嚢の存在によって確認された。胚移入後７２時間、妊娠マウスは尾静脈から１％シカゴブルー（Ｃｈｉｃａｇｏ Ｂｌｕｅ）が与えられて３分後に安楽死させられた。図６Ａは胚を受け入れた子宮角を取り巻く個々のブルーバンド（アスタリスクによって示される）を示す。図６Ｂでは、各ブルーバンドは妊娠嚢に対応しており、開放される子宮角ではピンクカラーの組織として現れた。ブルーバンド又は妊娠嚢のどれにも、胚を受け入れない子宮角には見つからなかった（矢印によって印を付けられる）。
【技術分野】
【０００１】
連邦政府の支援による研究または開発に関する記載
本発明は、全体的に又は部分的にＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｈｉｌｄ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（ＮＩＣＨＤ）、契約番号ＨＤ０１２７７、から財政的支援を受けて行われるものである。したがって、米国政府が本発明について所定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
発明の分野
本発明は、一般に哺乳動物胚のインビトロ培養のため、及び適した宿主哺乳動物の子宮に培養された胚の着床後における妊娠の達成を高めるための組成及び方法に関する。
【０００３】
従来技術の説明
卵管内の環境は、精子の受精の可能性を高め、分裂する胚の発生を促進する。卵管上皮細胞と共培養された胚は、発生、孵化及び着床を向上させたことが示された[Ｘｕ、２００１年；Ｘｕ、２０００年]。プロスタサイクリン（ＰＧＩ２）は、もともと血液及び血管（ｖａｓｃｕｌａｒ）のホメオスタシスを維持する点に関与すると考えられている。しかしながら、遺伝子ノックアウトマウスにおける最近の観察結果から示唆されることは、プロスタサイクリンが他の生理的機能を有し得ることである。子宮内膜由来ＰＧＩ２の重要性が、シクロオキシゲナーゼ(ＣＯＸ)−２ノックアウトマウスにおいて行われた観察によって強調される[Ｌｉｍ、１９９７年]。ＣＯＸ−２ノックアウトマウスの子宮内膜は、正常には脱落しなかった。結果として、移入された野生型胚（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ｅｍｂｒｙｏ）は、ＣＯＸ−２の欠損した雌マウスには着床できなかった。前述の異常性は、母方に外部からＰＧＩ２類似物の投与によってある程度矯正されることができた[Ｌｉｍ、１９９９年]。
【０００４】
着床前胚の発生における卵管由来ＰＧＩ２の役割が明らかでない理由は、ＰＧＩ２レセプタ(ＩＰ)ノックアウトマウスの一腹の産子数が野生型の産子数と比較されていないからである[Ｍｕｒａｔａ、１９９７年]。しかしながら、ヘテロ接合体ＩＰノックアウトマウスとの交配から生まれる子の遺伝子型の分布がメンデルの法則に従っていなかった。すなわち、ホモ接合体ＩＰノックアウト遺伝子型を有する雄及び雌の子の普及率は、それぞれ３７％及び２０％であり、予想されるよりも低かった[Ｍｕｒａｔａ、１９９７年]。
【０００５】
【特許文献１】米国特許第６１００２４９号公報
【特許文献２】米国特許第５０９６８２２号公報
【発明の開示】
【０００６】
発明の簡単な概要
最近、我々は、ヒト卵管がたくさんのプロスタサイクリン（ＰＧＩ２）及びＰＧＥ２を合成すること発見した[Ｈｕａｎｇ、２００２年]。遺伝子ノックアウトの研究は、子宮内膜由来ＰＧＩ２が子宮内膜の脱落に必須であることを示唆するが、着床前胚の発生におけるＰＧＩ２の効果は報告されていなかった。着床前胚の最適な発生にはＰＧＩ２を必要とするという仮説を用いて、マウス胚におけるＰＧＩ２の効果が、完全孵化率を基にして検査された。ＰＧＩ２レセプタ(ＩＰ)の発現は、ウエスタンブロット解析及び免疫組織化学によって評価された。ＰＧＩ２の胚への結合は、ラジオリガンド結合検定法によって確認された。我々の結果は、マウス胚の孵化はアイロプロスト(Ｉｌｏｐｒｏｓｔ）（ＥＤ５０６．７ｎＭ）、すなわち安定化したＰＧＩ２合成類似物の補足によって高められることを明らかにしている。８細胞から桑実胚に至る間、又は桑実胚から初期胚盤胞に至る間に、アイロプロストへの暴露が、孵化を促進させるのに重要であった。ＰＧＩ２に対するこの時期特有の反応が、ＩＰの発生時期特有の発現と同時に起こった。さらなる研究は、高められる胚の孵化を着床及び生児出生の増加と関連づけるために実施され、すなわちアイロプロストを補足された培地中で培養されたマウス胚が、妊娠キャリアに移入された。妊娠嚢及び生存する子の数がコントロール胚のその数と比較された。報告によれば、培養培地の添加物が胎児の体重を増加させるため[ＤｅＢａｕｍ、２００２年；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、１９９５年；Ｓｉｎｃｌａｉｒ、１９９９年]、子及び胎盤の重量も比較された。我々の結果は、アイロプロストを補足された培養培地中で胚を培養することは、子及び胎盤の重量に影響を与えることなく、マウス胚の着床及び生児出生を高めることを示している。
【０００７】
したがって、本発明のある実施例においては、培養培地にプロスタグランジン、例えばＰＧＩ２又はＰＧＥ２又はその類似物を補足することを含む胚のインビトロ発生を高める方法が提供されている。ある実施例において、プロスタグランジンはＰＧＩ２又はＰＧＥ２であり、またある実施例では、プロスタグランジン類似物はアイロプロスト又はＰＧＥ１である。ある実施例では、方法は、培養培地に胚の完全孵化を促進するのに十分量のプロスタグランジン又は類似物を添加することを含む。好ましくは、「完全孵化」は、胚が透明帯（ｚｏｎａ ｐｅｌｌｕｃｉｄａ）から離れることを有する。方法のある実施例において、培養培地の補足は、ゲノムが活性化されて受精卵が桑実胚へ発生する期間である、胚の初期発生時期の間に行われる。胚がヒトである実施例において、初期発生は４乃至８細胞状態で開始する。方法のある実施例において、培養培地の補足は、胚の桑実胚から初期胚盤胞への発生の間に行われる。ある実施例では、胚の初期発生から桑実胚期への発生と、胚の桑実胚から初期胚盤胞への発生の間との両方の間において行われる。方法のある実施例において、胚がマウス起源にある場合、補足する段階は、その２細胞発生の時期に胚を採取後２４乃至４２時間の間に、培養中の胚をプロスタグランジン又は類似物に暴露することを含む。胚がマウスである方法のある実施例では、桑実胚から初期胚盤胞の間に補足する段階は、その２細胞発生の時期に胚を採取後４２乃至７２時間の間に、胚を一度にプロスタグランジン又はプロスタグランジン類似物に暴露することを有する。
【０００８】
また、本発明のある実施例にしたがって提供されることは、インビトロ受精胚のインビボ着床の可能性を増加させる方法である。「着床の可能性」とは、子宮に着床する胚の能力である。この方法は、胚のインビトロ発生を高めるために、上述の実施例の一つを実行することを含むことにより、培養中の胚の完全な孵化が達せられる、すなわち、別のＩＶＦ方法に比べて孵化が高められる。この方法のある実施例にしたがって、完全に又は殆ど孵化された胚が、それから宿主哺乳動物の子宮に導入されて、胚の高められた着床が達せられる。ある実施例では、インビトロで胚の完全孵化は、生存に適した妊娠の確立と相関する。
【０００９】
本発明のある実施例において、インビトロで受精された哺乳動物胚の生児出生の可能性を増加させる方法が提供されている。「生児出生の可能性」とは、生児出生を生じる胚の能力である。上述されるように、この方法はプロスタグランジン又はその類似物を有するインビトロ培養によって、胚のインビトロ発生を高めることを有することにより、高められる孵化の可能性、すなわち培養中の胚の完全孵化が達せられる。好ましい実施例において、このような処理は、胚が培養から取り出されてインビボ環境にある後にさえも、完全孵化のための高められる可能性を与えている。この性質は「高められる孵化の可能性」として説明される。孵化される胚、すなわち高められる孵化の可能性を有する胚が、宿主哺乳動物の子宮に移入されて、胚が着床するようになりインビボで成長することにより、生児出生を生じる胚の能力が、孵化の高まりを有せず着床された胚の能力と比較して高められている。
【００１０】
本発明のさらにもう一つの実施例においては、インビトロで受精された哺乳動物胚の一群における生児出生率を増加させる方法が、上述の方法に従って胚のインビトロ発生を高めることを有することを提供されていることにより、孵化の高まり、すなわち好ましくは培養中の胚の完全孵化が達せられる。方法は、宿主哺乳動物に胚を導入、又は移入すること、及びそれから胚をインビボで成長できるようにすることを含んでおり、高められる孵化を有する胚の群からの生児出生率は、最初に完全に孵化されていない、すなわち孵化の高まりを受けていない状態で、宿主子宮へ移入される胚の群からの生児出生率よりも非常に高い。
【００１１】
なおもさらに、本発明のある実施例に従って提供されていることは、哺乳動物胚のインビトロ発生のための改良された細胞培養培地であり、その改良点は、孵化を高め、また好ましくはインビトロで胚の完全孵化を促進するのに有効な補足量のプロスタグランジン又はその類似物を含むことである。ある実施例において、培地は、ある量のプロスタグランジン又はその類似物を含んでおり、それはインビトロ培養から取り出されて宿主哺乳動物の子宮に移入された後に、胚の完全な孵化の可能性を高めるために有効である。これら及びその他の実施例、本発明の特徴及び利点は、以下の説明及び図を参照することによって明白になるであろう。
【００１２】
好ましい実施例の詳細な説明
本開示は、精子及び胚に対するＰＧＩ２並びにＰＧＥ２の効果の研究及びそれに続く研究の過程で明らかになった。我々の最近の結果は、ヒト[Ｈｕａｎｇ、２００２年]及びマウス[Ｈｕａｎｇ、２００４年]卵管上皮細胞が、ＰＧＩ２の合成、すなわちＣＯＸ-１又はＣＯＸ-２及びＰＧＩ２合成酵素に必須の酵素を発現することを示している。たくさんのＰＧＩ２又はＰＧＥ２は、１４Ｃ−アラキドン酸がヒト[Ｈｕａｎｇ、２００２年]又はマウス卵管[Ｈｕａｎｇ、２００４年]から調製されたミクロソームとインキュベーションされたときに産生された。本研究はまた、精子が卵と受精するために卵管末端に移動し、胚発生の最初の７２時間は卵管で起こるという事実を考慮した。
【００１３】
本研究の一部分として、胚に対するＰＧＩ２の影響が、ＰＧＩ２類似物を伴って培養されたマウス胚の完全な孵化を観察することによって評価された。そのメカニズムをさらに解明するために、ＩＰの発現及び放射ラベルされたアイロプロストによる胚の結合がまた検討された。
【００１４】
材料及び方法
試薬の出所及び制度上の承認。
別のものであると記載しない限り、試薬はシグマ社(Ｓｉｇｍａ Ｃｏ．）（アメリカリ合衆国、ミズーリ、セント．ルイス）(Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から購入されたものである。ヒトのサンプルの使用は、ヒューマンサブジェクツの保護のための委員会（ｔｈｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｓｕｂｊｅｃｔｓ）(Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄと同等）によって承認された。実験動物の取扱い及び研究プロトコルは動物福祉委員会によって認定された。
【００１５】
マウス胚の採取及び培養。
マウスは、水及び餌へのアクセスが自由で、制御された温度、湿度、及び光周期(１２時間明暗周期)条件の下に保った。３週齢のＣ５７Ｂ１／６雌マウスはハーラン（Ｈａｒｌａｎ）（アメリカ合衆国、インジアナ、インジアナポリス）（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ、ＵＳＡ）から購入された。８週齢のＣ３Ｈ雄マウスは最初にハーランから購入され、後にジャクソンラボラトリー（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（アメリカ合衆国、メイン、バーハーバー）（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ ＭＥ、ＵＳＡ）から購入された。雌マウスの過剰排卵は、妊娠雌馬血清ゴナドトロピン（５単位）、及び続く４６時間後にヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ、５単位）の腹腔内投与によって行われた。ｈＣＧを受けた後、それぞれの雌マウスが一匹の繁殖力のある雄マウスとつがいにされた。４８時間後、２細胞胚は卵管から２５ｍＭへペス（ＨＥＰＥＳ）及び１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（アービン サイエンテイフィツク）（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補足されたα-ＭＥＭ培地に採取された。
【００１６】
胚(群当り１７-２０個)は、各ウエルに６００μＬの培地を含む４ウエルデイッシュ（アメリカ合衆国、イリノイス、ネイパービルのナルジ ヌンク インターナショナル ネイパー）（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｎａｐｅｒ、Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ、ＩＬ、ＵＳＡ）において、３７℃で５％ＣＯ２の下に培養された。ＨＴＦ及びα-ＭＥＭ培地は、９６時間連続して用いられて分裂胚の変化する栄養要件を満たした[Ｇａｒｄｎｅｒ、１９９８年]。ＨＴＦ培養液（セイジ バイオフアーマ）（ＳＡＧＥ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ）は最初の４８時間用い、イーグルの塩類（Ｅａｒｌｅ'ｓ ｓａｌｔｓ）及び２ｍＭグルタミンを有するα-ＭＥＭ培地（アービン サイエンテイフィツク）（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）は２番目の４８時間の間用いた。実験胚は、水中のアイロプロストを受け、コントロール胚は等量の水を受けた。予備実験では、胚の９５％以上がＫＳＯＭ培地(アメリカ合衆国、ニュージャージー、フィリップスバーグのスペシャリテイ−メデイア、セル アンド モレキュラー テクノロジーズ、インク．（Ｓｐｅｃｉａｌｉｔｙ Ｍｅｄｉａ、Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ． Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ ＮＪ，ＵＳＡ））で培養した胚と同様に、９６時間までに胚盤胞になることを示した。９６時間培養後、各胚は透明帯(ｚｏｎａ ｐｅｌｌｕｃｉｄａ）の有無に対して調べられた。透明帯が完全に無い胚は、完全に孵化したものとして計測された。完全孵化率は、完全に孵化された胚の数を胚の総数で割って求められた。胚の完全孵化を、胚盤胞形成又は胚孵化の代わりに指標として選択したが、この理由は、後者の２マーカーが生存に適した妊娠の確立[Ｌａｎｅ、１９９７年]と相関しないからである。
【００１７】
ウエスタンブロット解析（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）。
推定されるマウスＩＰのアミノ酸配列(４１７ａ．ａ、Ｇｅｎｅｂａｎｋ＿ＢＡＡ０５１４４）及びヒトＩＰのアミノ酸配列(３８６ａ．ａ、Ｇｅｎｅｂａｎｋ＿ＢＡＡ０６１１０）は相同性が高い[Ｋａｔｓｕｙａｍａ、１９９４年]。予備的な検討では、アフィニテイー精製ポリクローナルペプチド抗体(テキサス大学健康科学センターのケーヘルアン博士（Ｄｒ．Ｋｅ−Ｈｅ Ｒｕａｎ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ）から提供)は、マウスＩＰと交差反応することを確認した。ウエスタンブロット解析は以前に説明したように行われた[Ｈｕａｎｇ、２００２年]。簡潔には、６０個のマウス胚盤胞由来の全細胞溶解物が、１０％アクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって分離され、ニトロセルロース膜（アメリカ合衆国、ニューハンプシャーのシュレイチャ− アンド シュエル、インク．）（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｉｎｃ．、ＮＨ、ＵＳＡ）に転写された。免疫反応タンパクが、抗体とのインキュベーション及び増強された化学発光（アメリカ合衆国、ニュージャージー、ピスカタウエイのアマ−シャム バイオサイエンス）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）による視覚化によって検出され、またＳＴＯＲＭ８６０レーザースキャナ（アマ−シャム バイオサイエンス）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使って検出された。ヒト血小板ミクロソームは、陽性のコントロールとして用いられた。抗体の特異性は、前吸収抗体を用いる平行実験で確かめられた。
【００１８】
免疫組織化学、蛍光顕微鏡及び共焦点顕微鏡解析。
マウス胚が４℃で３０分間、４％パラホルムアルデヒド中に固定された。リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄後、胚は０．０５％のＴｗｅｅｎー２０、５％の粉末ミルク及び０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００含有トリス緩衝化生理食塩水(ｐＨ７．４)において、室温で２０分間ブロックされた。胚は、２時間ブロッキング緩衝液中でＩＰ抗体(５ｎｇ／ｍｌ）とインキュベーションされ、それから３７℃で３０分間、アレクザ（Ａｌｅｘａ）４８８(２.５μｇ／ｍｌ、アメリカ合衆国、アラバマのモレキュラー プローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、ＡＬ、ＵＳＡ））と結合したヤギ抗-ラビットＩｇＧとインキュベーションされた。細胞核は、室温で２０分間、１０μｇ／ｍｌプロピデウム イオダイド（ｐｒｏｐｄｉｕｍ ｉｏｄｉｏｄｅ）によって対比染色された。胚は、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ-Ｇ（登録商標）（アメリカ合衆国、アラバマ、バーミングハムのサザン バイオテクノロジー アソシエイツ インク.）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｉｎｃ．、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ、ＵＳＡ）に埋め込まれた。蛍光顕微鏡解析のために、胚盤胞は封入剤中に置かれてカバースリップが被せられた。共焦点顕微鏡解析のために、およそ５０μｍのスペーサが、スライドとカバースリップとの間に置かれて胚の３次元形態を保持した。陰性のコントロールには、胚が１０ｎｇ／ｍｌの非免疫ラビットＩｇＧとインキュベーションされた（すなわち、一次抗体濃度の２倍の濃度）。
【００１９】
蛍光顕微鏡解析は、適切なフィルタを備えたツアイス アキシオプラン２（ＺｅｉｓｓＡｘｉｏＰｌａｎ ２）顕微鏡を用いて行われた。画像は、ＣＣＤカメラを用いて捕らえられ、アキシオビジョン プログラム（Ｖｅｓｉｏｎ ３．０．６）によって処理された。共焦点顕微鏡解析は、オリンパス ＢＸ-５０顕微鏡に付属されたバイオラッド ラジアンス ２０００（ＢｉｏＲａｄ Ｒａｄｉａｎｃｅ ２０００）共焦点システム（アメリカ合衆国、カルフオル二ア、ハーカルスのバイオラッド ラボラトリーズ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使って行われた。その画像は、イメージ プロ プラス プログラム（Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ＋ ｐｒｏｇｒａｍ）（アメリカ合衆国、カルフオル二ア、カールスバッドのメデイア−サイバーネテイックス）（Ｍｅｄｉａ−Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使って処理された。
【００２０】
全胚ラジオリガンド結合測定。
３Ｈ−アイロプロストの胚盤胞への結合の解析は、わずかに変更修正して以前に説明された [Ａｒｂａｂ、２００２年] ように行われた。２３２個が孵化されて孵化する胚盤胞は、結合緩衝液(１０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４中に１０ｍＭＭｎＣｌ２）中で３回洗浄されてから、非標識アイロプロスト（５μＭ）を有する又は有しない１００μｌの結合緩衝液に移された。反応は、３Ｈ−アイロプロスト（２００ｎＭ、特異活性１１．０Ｃｉ／ｍｍｏｌ、アマ−シャム バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を含む結合緩衝液を加えて、室温で６０分間インキュベーションすることによって開始された。その反応は、氷冷洗浄緩衝液(１０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４中に０．０１％ＢＳＡ）に胚盤胞を移すことによって終了された。緩衝液及び胚盤胞は、ガラスフアイバーフィルタ（Ｗｈａｔｍａｎ ＧＦ／Ｃ２．４ｃｍ）を通してろ過され、フィルタは、２ｍｌの洗浄緩衝液で３回洗浄された。フィルタがオーブン中で乾燥されてから、放射活性が５ｍｌのシンチレーション液で計測されるシンチレーションによって測定された。
【００２１】
統計解析
スチュ-デントのｔ検定又はダネット（Ｄｕｎｎｅｔ）検定に従った一元配置分散分析が適所に用いられた。ｐ値＜０．０５は統計的に有意とみなされた。量反応曲線の作図及びＥＤ５０値(１．０に設定されるヒル勾配を有して）の計算には、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅ（アメリカ合衆国、カルフオル二ア、サンデイゴのグラフパッド プリズム ソフトウエア インク．）（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を備えた。
【００２２】
胚移入
マウス胚が採取されて上述のように培養され、その後に本発明者によって公表された[Ｈｕａｎｇら、２００３年]。簡潔には、２細胞胚（Ｃ３Ｂ６Ｆ１）が、ｈＣＧ投与後４２時間、過剰排卵された３週齢のＣ５７Ｂｌ／６雌マウスから採取された。胚(群当り１４個)は、６００μｌのＨＴＦ培地（アメリカ合衆国、ニュージャージー、ベッドミンスターのセイジ バイオフアーマ）（ＳＡＧＥ Ｂｉｏｐｈａｍａ、Ｂｅｄｍｉｎｓｔｅｒ、ＮＪ、ＵＳＡ）を各々含む４ウエルデイッシュ（アメリカ合衆国、イリノイス、ネイパービルのナルジ ヌンク インターナショナル ネイパー）（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ、ＩＬ、ＵＳＡ）において、３７℃で５％ＣＯ２の下に培養された。実験胚は、水中のアイロプロスト（１μＭ、アメリカ合衆国、ミシガン、アン アーバーのケイメン ケミカル（Ｃａｙｍｅｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ、ＵＳＡ））を、またコントロール胚は等量の水を受けた。どちらの場合も水量は培養液の０．１％に満たなかった。
【００２３】
胚ドナー（ｄｏｎｏｒ）がｈＣＧを受けた翌日に、膣スメアが妊娠可能性キャリア(８週齢のＣ３Ｂ６Ｆ１雌マウス)から得られて、発情周期の時期を決定した。発情期のマウスは、精管切除されたＩＣＲ雄（ハーレン）（Ｈａｒｌａｎ）とつがいにされて翌朝膣栓を調べられた。栓を有する発情期のマウスは０．５日偽妊娠であると指定された。
【００２４】
胚移入は、解剖顕微鏡(オリンパスＳＺ−ＰＴ）の下に、２．５日偽妊娠において行われた。外科的麻酔は、ケタミン（ｋｅｔａｍｉｎｅ）（２００ｍｇ／Ｋｇ）及びキシラジン（ｘｙｌａｚｉｎｅ）（１０ｍｇ／Ｋｇ）（合衆国テキサス州のバーンズ ベトサプライ インク（Ｂｕｒｎｓ ＶｅｔＳｕｐｐｌｙ Ｉｎｃ．ＴＸ、ＵＳＡ）からの両麻酔薬）の腹腔内投与によって得られた。各子宮角は、２ｃｍの側面切り口からアクセスされた。近位卵管は一対のピンセットで保持されたまま、開口部が３０ゲージの皮下針によって、腸間膜の子宮角の遠位端に作り出された。開口部は、１３５μｍの内径を有するトランスフアーピペット（アメリカ合衆国、ニュージャージーのミッドアトランテイックダイアゴノステイックス、インク．）（ＭｉｄＡｔｉａｎｔｉｃ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｃ．、ＮＪ、ＵＳＡ）を入らせることができる。０．８μｌの移入用培地(２５ｍｌ ＨＥＰＥＳ及び１％ＢＳＡを加えたα-ＭＥＭ）中の７個の胚までが、各々の子宮角に移入された。それぞれ移入後、ピペットの内容物が、残留した胚を同定するために、立体写真顕微鏡下で調べられた。側面切り口は、９ｍｍの金属クリップ（アメリカ合衆国、ニュージャージーのクレイ アダムス、パルシッパニー）（Ｃｌａｙ Ａｄａｍｓ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）で閉じられた。一方の子宮角から他方の子宮角への胚の移動によるコントロール胚及び実験胚の混合を避けるために（ドイツのボン大学のアンドレス ツインマー博士との個人情報（Ｄｒ．Ａｎｄｒｅａｓ Ｚｉｍｍｅｒ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｂｏｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ））、それぞれの妊娠キャリアは、コントロール胚又は実験胚のいずれかを受けた。一定の移入技術を維持するために、胚移入は同じプロトコルに従って、一人の人によって行われる、その人は、判別されている胚が受ける処理には左右されなかった。両群が、研究の過程で（６ヶ月間）得られる経験と等しく利益を得たことを確実にするために、胚は４つのブロックでの処理（コントロール又はアイロプロスト処理）に割り当てられた。
【００２５】
着床率の決定
胚移入後７２時間目に、着床は、多少変更修正して以前に説明された方法に基いて決定された[Ｐａｒｉａら、１９９３年]。簡潔には、安楽死前３分間、０．１ｍｌのシカゴブルー（１％）が、妊娠マウスの尾静脈から投与された。そのマウスを殺した後、子宮角が取り出された。子宮角を取り囲む別々のブルーバンド(アスタリスクで示される)が計測された(図６Ａ)。これらのバンドの存在は、着床部位への血管補給の増加を反映している。それから子宮角が開かれ、妊娠嚢が計測された(図６Ｂ)。着床率は、移入された胚当りの妊娠嚢の数として表現された。
【００２６】
生児出生率と子及び胎盤の重量の決定
予備的な検討は、一腹の大きさが小さいときには、妊娠キャリアが子を共食いするこを示した。子を正確に計測し、体重を量るために、我々は、胚移入後１４日目に妊娠キャリアを殺した(妊娠期間の１６．５日目、すなわち自然に誕生する２日前)。殺した後、生きている子の数を計測し、個々の子及び胎盤の重量が決定された。全ての子が全体の異常を調べられた。空の妊娠嚢の数がまた、着床率の決定のために計測された。生児出生率は、移入される胚当りの生存する子の数として表現され、着床率は、移入される胚当りの生存する子を有し又は有しない嚢の数として表現された。
【００２７】
統計解析
フィッシャーの直接確率検定が、比率を比較するために用いられ、スチュ-ダントのｔ検定が体重の比較のために用いられた。ｐ値＜０．０５は統計的に有意であると認められた。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｉｎｓｔａｔ（登録商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅ（アメリカ合衆国、カルフオル二ア、サンデイゴのグラフパッド プリズム ソフトウエア インク．）（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）が、統計解析に用いられた。
【００２８】
結果
ＰＧＩ２はマウス胚の完全孵化を高めた。
マウス胚の完全孵化が、濃度に依存するかたちでアイロプロストによって高められた。その効果は０．１μＭ又はそれ以上の濃度（図１） で統計的に有意であった。完全な胚の孵化の最大増加は、１μＭで起こっており、実験胚の８１±７％(平均値±標準偏差、ｎ＝３)が完全に孵化した。対照的に、コントロール胚の４９±１４％(平均値±標準偏差、ｎ＝５)のみが完全に孵化した。量反応曲線からのＥＤ５０値は６．７ｎＭ（図１）であった。飽和濃度依存反応及び６．７ｎＭのＥＤ５０値は、アイロプロストの効果がレセプタによって仲介されたことを示唆している。
【００２９】
高められる孵化への重要なＰＧＩ２暴露の継続時間及び胚の発生時期。
胚が子宮に入る前にいくつかの発生時期を経るので、我々は、アイロプロストに対する発生時期特有の反応を研究した。我々の結果は、９６時間培養の間のある期間が、その他の期間よりもより重要であったことを示している。最初の２４時間の培養中（この期間の間に、たいていの２細胞の胚は８細胞の胚に発生した）にアイロプロストへの暴露は、孵化を高めなかった（図２）。一方、採取後０−７２時間又は２４−７２時間の間にアイロプロストへの暴露は、０−９６時間暴露を行ったものと同じ比率の完全孵化を生じた（図２）。
【００３０】
アイロプロストの十分な効果を確保するアイロプロストへの暴露の２つの重要な期間は、採取後２４乃至４２時間と、４２乃至７２時間との間にあり、これらはそれぞれ８細胞から桑実胚までと、桑実胚から初期胚盤胞までとの形質転換に対応している(図２の下部の表)。我々のデータは、胚をＰＧＩ２に短時間暴露することは、胚が卵管を離れた後でさえも完全孵化のための高められる可能性を与えることを示している。
【００３１】
マウス胚はＩＰを発現する。
マウス胚の発生時期特有の発現を調査するために、我々は発生の異なる時期において胚盤胞のウエスタンブロット解析及び胚の免疫組織化学解析を行った。ウエスタンブロット解析は期待される分子量のタンパクが、ＩＰに対するアフィニテイ精製抗体によって検出できることを示した（図３）。蛍光顕微鏡は、ＩＰ染色が桑実胚及び胚盤胞には存在する（図４Ａ−Ｅ）が、未受精卵又は１細胞、２細胞及び８細胞胚(図示せず）には存在しないことを示した。桑実胚及び胚盤胞のＩＰ染色は、同じ細かい網状模様を共有していた。共焦点顕微鏡画像は、ＩＰが栄養外胚葉で好ましく発現されたことを示唆している。したがって、マウス胚によるＩＰの時期特有発現が、アイロプロストに対する反応と一致した。
【００３２】
放射ラベルしたアイロプロストはマウス胚に結合する。
アイロプロストによる胚の完全な孵化の濃度依存性の高まりは、その効果がレセプタ仲介であることを示唆した。我々は、ラジオリガンド結合測定を行って、アイロプロストによるマウス胚の結合をさらに確認した。我々は、０．１μＭレベルのリガンドで結合するアイロプロストの量を計ることを選択し、ここで増大された孵化が最初に観察され、およそ３．０４ｆｍｏｌの３Ｈ−アイロプロストが１１６胚盤胞に特異的に結合することを見出した（図５）。
【００３３】
議論
我々のデータは、ＰＧＩ２が胚の完全孵化を高めることを最初に示している。これは、ヒト卵管由来の上皮細胞とマウス胚の共培養が、胚細胞数を増加させ、アポトーシスを減少させて、胚の孵化を発生させるという以前の報告と一致している[Ｐｉｅｋｏｓ、１９９５年；Ｘｕ、２０００年；Ｘｕ、２００１年]。それ故、卵管由来ＰＧＩ２及び子宮内膜細胞由来ＰＧＩ２は、同様のパラ分泌方法でこれらの効果を与えている。前者は胚の孵化を促進させ、後者は血小板凝集を妨げる。濃度依存性反応は、レセプタ仲介の事象と一致しており、ＥＤ５０値６．７ｎＭは報告されているＫｄ、すなわちヒト血小板から可溶化されたＩＰ（８ｎＭ）の値と同様であった[Ｔｓａｉ、１９８９年]。
【００３４】
アイロプロストに対する胚の反応は、発生時期特有であり、ＩＰの発現と一致した（図２）。反応性についてのこれらの重要な期間は、受精卵が桑実胚へと発生する期間である、卵管におけるマウス胚の一時滞在と一致した。関連した発生時期が、ヒト及びマウス胚のゲノムの活性化とも一致しており、ゲノムの活性化は、４細胞期及び８細胞期の間と、２細胞期後とにそれぞれ起こる[Ｔｅｓａｒｉｋ、１９８６年；Ｔｅｓａｒｉｋ、１９８８年；Ｂｒａｕｄｅ、１９８８年]。
【００３５】
ＩＰがどのようにその効果を発揮するのかという特定の理論に限定されることを望むものではないが、初期発生の間、卵管由来ＰＧＩ２又はＰＧＥ２に暴露された胚が、子宮に達する際に、高められる孵化の可能性を維持することが提案される。したがって、卵管由来ＰＧＩ２を通じて、胚が卵管中にある間に、着床のために胚自体が積極的に準備している。胚の観点からすれば、卵管由来ＰＧＩ２は、子宮内膜細胞由来ＰＧＩ２に相補的であり、受容力を確保するために子宮内膜の脱落を仲介する[Ｌｉｍ、１９９９年]。
【００３６】
特定の理論に限定されることを望むものではないが、ＰＧＩ２及びＰＧＥ２によって仲介される高められた孵化は、胚細胞の数の増加によってもよいことが提案される。様々なメカニズムが、インビトロ及びインビボのマウス胚の孵化に関与している。インビトロの孵化は、胚盤胞の拡張に関与して、透明帯破裂の前に全体的な透明帯の間伐が引き起こるが、インビボの孵化は、子宮の又は栄養外胚葉の分解物質による全体的な透明帯の溶解に関与する[Ｍｏｎｔａｇ、２０００年]。したがって、インビトロで孵化を達するためには十分な量の胚細胞の数が要求される。この点において、われわれの結果は、卵管の上皮細胞と共培養された胚は、より多くの細胞を有し細胞死をより少なくしたという発見と一致しており、孵化を向上させた[Ｙｅｕｎｇ、１９９２年；Ｘｕ、２０００年]。その上、ＰＧＩ２は、栄養外胚葉でトリプシン様プロテアーゼの生産を増加させて透明帯（ｚｏｎａ）を溶解することができる[Ｓａｗａｄａ、１９９０年；Ｐａｒｏｎａ、１９８６年]。
【００３７】
ＩＶＦ胚(胚当り１０−２０％)の低着床の可能性[ＣＤＣ、２００１年]は、一つには次善の培養条件に起因すると考えられる[Ｄｅ Ｖｏｓ、２０００年]。培養液は、インビトロの胚発生を改良するために変更されてきた[Ｇａｒｄｎｅｒ、１９９８年]。我々のデータを基に、培地にＰＧＩ２及び／又はＰＧＥ２類似物、例えばアイロプロスト、ＰＧＥ１のような物質を補足することで、発生する胚に改良した培養環境を与え、着床の可能性を増加させることができる。
【００３８】
要するに、ＰＧＩ２は、培養されたマウス胚の完全孵化を高めた。マウス胚によるＩＰの時期特異発現は、ＰＧＩ２に対する反応と一致した。結局、我々の予備的なデータを基に、ＰＧＥ２もまた、培養されたマウス胚の完全孵化を高めた。
【００３９】
さらなる検討において、我々は、培養培地にＰＧＩ２を補足することが、着床の可能性及びマウス胚の生児出生の可能性を高めることを明らかにした。これらの結果は、ＰＧＩ２は、培養中のマウス胚の完全孵化を高めるという我々の最初の観察を裏付けており [Ｈｕａｎｇ、２００３年]、また、卵管由来ＰＧＩ２が生理的機能を果たすという我々の仮説も裏付けている[Ｈｕａｎｇ、２００２年]。
【００４０】
表１は、ＰＧＩ２がマウス胚の着床の可能性を高めることを示す。８４個のコントロール胚及び８１個のアイロプロスト処理胚が、１２匹の妊娠キャリアに移入された。７２時間後、よりたくさんの妊娠嚢が、コントロール群よりもアイロプロスト処理群に見出された（７６％対４２％、相対的危険度１．８４、９５％信頼区間１．３８−２．４３、ｐ値＜０．０００１)。移入時においては、胚の発生時期は同等であった。
【００４１】
表２は、ＰＧＩ２アイロプロストが、マウス胚の生児出生の可能性を高めることを示す。４０６個のコントロール胚及び４１５個のアイロプロスト処理胚が、それぞれ３０及び３１匹の妊娠キャリアに移入された。コントロール及び実験群の生児出生率は、それぞれ２８％及び３６％であった（ｐ値＝０．００１７、相対危険度１．２８、９５％信頼区間：１．０４４−１．５６０)。子及び胎盤の重量が比較された。したがって、ＰＧＩ２は、子又は胎盤のどちらの重量にも影響を与えることなく、マウス胚の生児出生の可能性を増加させた。その上、全体の異常は指摘されなかった。
【００４２】
上述したように、およそ７０％の実験胚及びコントロール胚が、移入時には桑実胚期にあった（表1)が、移入された実験胚はよりたくさんの妊娠嚢を生じた。これらの結果は、８細胞期と桑実胚期の間にＰＧＩ２に暴露することは、マウス胚の完全な孵化を高めるには十分であるという我々の以前の観察を確認するものである[Ｈｕａｎｇ、２００３年]。それらはまた、胚栄養因子として作用する卵管由来ＰＧＩ２と一致しており、この理由は、受精されたマウス卵が、卵管の内部で桑実胚に発生するためである[Ｓｎｅｌｌ、１９６６年]。
【００４３】
上述した現象は、ＰＧＩ２が、結果的に高められる孵化、着床、及び生児出生の増加となる一連の出来事を開始することを示している。この点において、ＰＧＩ２は血小板活性化因子（ＰＡＦ）によく似ており、それはＰＡＦに短時間暴露するとマウス[Ｏ’Ｎｅｉｌｌ、１９９８年]及びヒト胚[Ｏ’Ｎｅｉｌｌ、１９８９年]の着床を増加させた。ＰＧＩ２によって開始される分子細胞学的事象は、孵化にとっては重要であるに違いない。それらは、胚細胞数の増加[Ｍｏｎｔａｇ、２０００年]、栄養外胚葉でトリプシン様プロテアーゼの産生の増加[Ｓａｗａｄａ、１９９０年；Ｐｅｒｏｎａ、１９８６年]、栄養外胚葉の高められるナトリウム−カリウム−ＡＴＰアーゼ（Ｎａ＋−Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ）システムによる高められた胞胚腔の拡張[Ｂｉｇｇｅｒｓ、１９８８年]、又はいまだメカニズムに見出されていないことを含んでいる。
【００４４】
コントロール胚の着床率が、移入後７２時間又は１４日目それぞれを調べたときには同等であった(４２％及び４６％)。一方、移入後１４日目に調べられた実験胚の着床率(５９％)は、移入後７２時間目に調べられた着床率(７６％)よりもかなり小さかった(ｐ＝０．０３８)。よりたくさんの嚢が、着床の位置に群がることによって、実験群に完全に再び吸収されたことはもっともらしい事である。代わって、アイロプロストは、さもなければ着床してなかったいくつかの胚を「救済」し、これら「救済された」胚の一部のみが生存する子へ発生した。この検討と、[Ｈｕａｎｇ、２００２年]及びマウス[Ｈｕａｎｇ、２００４年]卵管でのたくさんのＰＧＩ２生産との結果は、ＰＧＩ２が、卵管で分泌される胚栄養因子の一つであることを示唆し、したがってＰＧＩ２類似物を有する胚の培養培地に補足することは、ＩＶＦの効果を改良することを予期させる。
【００４５】
ＩＶＦ培養培地に胚発生又は着床を高める物質を補足することは、たいていの実験室及び非常に注意を払う培地製造業者によって採用されてきた。この懸念事項には、生殖毒物学、奇形形成、及び場合によってはこのような操作の後生的な影響を含んでいる。ヒト血清を補足された培地中で培養された羊胚由来の子羊は、より重みがあり妊娠期間がより長かった[Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、１９９５年；Ｈｏｌｍ、１９９６年；Ｓｉｎｃｌａｉｒ、１９９９年]。過剰増殖及び新形成を含む先天性異常症、すなわちベックイス−ワインダーマン（Ｂｅｃｋｗｉｔｈ−Ｗｅｉｎｄｅｒｍａｎｎ）症候群は生殖介助術と関係があった。[ＤｅＢａｕｎ、２００２年；Ｍａｈｅｒ、２００３年]。
【００４６】
胚及び胎児発生に示したアイロプロスト[Ｂａｔｔｅｎｆｅｌｄ、１９９５年]に関する生殖毒物学の検討は、胚及び胎児発生でウサギ及びサルでは影響されないが、指の変形がラットで観察されることを示した。指の異常は、アイロプロストの先天的奇形形成というよりも、影響を受けた構造から低酸素症を招く子宮胎盤流量の減少によるものらしく、この理由は、アイロプロストは血管拡張剤であり検討された動物が、妊娠期間を通してアイロプロストを受容したからである。ヒドラジン及びジヒドロピリジン類のような異なった化学構造を有する血管拡張剤を用いる場合、同じような問題が引き起こされるであろう。最近の研究では、アイロプロストへの暴露が、着床前の期間の間に行われた。２４６匹の生存する子において調べると、指の変形又はその他の異常性はなく、２群間の子及び胎盤の重量は同様であった。全てこれらのことを除いて、ＩＶＦ培地にＰＧＩ２類似物を補足することは、実験的プロトコルとみなされるべきである。
【００４７】
これらの実例の検討において、我々は、ＰＧＩ２が胎児又は胎盤のいずれの重量にも影響を与えることなく、マウス胚の着床及び生児出生の可能性を高めること、すなわちプロスタサイクリンは、胎盤又は新生児の重量を増加させないことを明らかにした。これは、着床及び生児出生の高まりとは別の利点であり、プロスタサイクリンが、着床及び生児出生を高める他の代理母とは異なることを示している。着床及び生児出生を高める以前に報告された代理母はまた、新生児の重量を増加させて、ヒト体外受精（ＩＶＦ）についてこれらの代理母の使用を不適としている。さらに、プロスタサイクリンは、インビボのマウスモデルでは、胎盤及び新生児の重量に影響を与えなかったため、ヒトＩＶＦ胚に利用できると考えられている。
【００４８】
マウス胚についての前述のインビボ研究で得られた結果は、それらの胚が子宮に移入される前に、プロスタグランジン又はプロスタグランジン類似物を用いてインビトロで同様に処理される場合に、ヒトを含めその他の哺乳動物胚において得られるであろう同様な好ましいインビボの結果を示し、又は予測させるものであるとみなされる。本ヒトＩＶＦは、患者の子宮への８細胞期又は胚盤胞期の胚の移入を含んでいる。この点において、ヒトＩＶＦは、妊娠マウスに対するコントロール、すなわちプロスタサイクリン類似物処理胚への移入を含む我々の実験の計画と同様である。我々のデータは、妊娠キャリアに移入された際に、８細胞期と桑実胚期との間にプロスタサイクリン類似物に暴露された実験胚が、コントロール胚よりも着床及び生児出生率が非常にに高いことを示した（表１及び２、それぞれに示されるように）。
【表１】
【表２】
【００４９】
さらに苦心なく、当業者はここまでの説明を用いて、その最大限に本発明を利用できることを確信する。前述の実施例は、例証として解釈されるべきであり、開示の残部をいかように規制するものではない。本発明の好ましい実施例を示され説明したけれども、その変更が、本発明の趣旨及び教示から逸脱することなく当業者によりなされるであろう。ここに説明される実施例は、単なる例示であり限定を意図するものではない。ここに開示された本発明の多くの変形及び変更が、可能であり本発明の範囲のものである。発明の背景における参照例、特にこの出願の優先日後の公開日を有する如何なる参照例の如何なる説明も、本発明に対して従来技術であると認めているものではない。ここに引用した全ての特許、特許出願及び公開の開示は、それらがここでの記載を補う模範的、手法的、その他の詳細を与える限りにおいて、ここに援用される。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】プロスタサイクリン（ＰＧＩ２）及びマウス胚の完全孵化を示したグラフである。２細胞マウス胚が、ＰＧＩ２類似物（アイロプロスト、１ｎＭから１０μＭの範囲）で培養された。完全孵化率は９６時間後に決定された。３乃至５の個別の実験（各々１７−２０胚）の結果は、平均±標準偏差として表現される。ＥＤ５０値はおよそ６．７ｎＭである。
【図２】完全孵化の増大及びプロスタサイクリン（ＰＧＩ２）暴露の継続時間（胚発生の時期を基にアイロプロスト暴露）を示す棒グラフである。２細胞マウス胚が０．１μＭアイロプロスト、すなわちＰＧＩ２類似物の存在下で示された期間（２細胞胚の採取後の時間として表現される）培養された。完全孵化率は平均±標準偏差として表現される。胚がアイロプロストに暴露されている間の発生時期が表に記載されている。２期間がアイロプロストの最大限の効果に重要であるようである、すなわち２４乃至４２時間及び４２乃至７２時間であり、それぞれ８細胞胚から桑実胚期及び桑実胚期から初期胚盤胞への発生に対応する。いずれの期間の間にアイロプロストに暴露しても、高められる孵化を確実にした。個別の観察の数（１８−２０胚についてのそれぞれ）は、コントロールで１２胚、４２−７２時間では３胚、その他は４胚であった。コントロール胚の完全孵化率は、図１の孵化率とは異なっており、おそらく雌マウスの個体が変更されたからであろう。
【図３】マウス胚のプロスタサイクリンレセプタ（ＩＰ）の発現を示すウエスタンブロットである。６０匹のマウス桑実胚（レーン１）から抽出した全細胞溶解物及びヒト血小板のミクロソーム（陽性コントロール、レーン２）のウエスタンブロット解析は、ヒトＩＰに対する抗体との免疫反応を示した。マウスＩＰの移動度は、ヒトＩＰの移動度よりも少なく、予想される分子量のそれぞれ〜５０ｋＤａ及び〜４６ｋＤａと一致した。
【図４Ａ−Ｇ】桑実胚及び胚盤胞におけるプロスタサイクリンレセプタ（ＩＰ）の発現を示す顕微鏡写真である。２個の桑実胚の位相差（図４Ａ）及びＩＰ染色（図４Ｂ）像が示される。透明帯は矢印で示される。図４Ｃは、胚盤胞における核のプロピジウムイオダイド染色を示す。図４Ｄにおいて、胚盤胞のＩＰ及びプロピジウムイオダイドが重ね合わせられる。図４Ｅは胚盤胞のＩＰ染色が網状模様を示すことを示す。ＩＰ染色の集合塊が栄養外胚葉のみに見られ、内部細胞塊には染色の増進を示さなかった。図４Ｆは桑実胚内の内部細胞塊（ＩＣＭ）の配置を示すスケッチである。図４Ｇは胚盤胞の共焦点顕微鏡画像であり、栄養外胚葉のみがＩＰ抗体によって染色されることを示す。断面の平面図はパネルＦ中のラインによって示される。陰性のコントロール、受精卵又はその他の発生時期にある胚（図示せず）にはＩＰ染色はなかった。図中の棒はおよそ２０μｍである。
【図５】無傷のマウス胚に結合するアイロプロストを示す棒グラフである。１１６個のマウス胚盤胞が、５μＭの非標識アイロプロストの存在又は不在下で、０．１μＭ３Ｈ−アイロプロスト、すなわちＰＧＩ２類似物とインキュベーションした。結合した３Ｈ−アイロプロスト及び遊離の３Ｈ−アイロプロストは膜ろ過によって分離された。
【図６Ａ−Ｂ】妊娠マウスの子宮内の妊娠嚢を示す。着床は、着床部位の血管の増加によって決定され、妊娠嚢の存在によって確認された。胚移入後７２時間、妊娠マウスは尾静脈から１％シカゴブルー（Ｃｈｉｃａｇｏ Ｂｌｕｅ）が与えられて３分後に安楽死させられた。図６Ａは胚を受け入れた子宮角を取り巻く個々のブルーバンド（アスタリスクによって示される）を示す。図６Ｂでは、各ブルーバンドは妊娠嚢に対応しており、開放される子宮角ではピンクカラーの組織として現れた。ブルーバンド又は妊娠嚢のどれにも、胚を受け入れない子宮角には見つからなかった（矢印によって印を付けられる）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物胚のインビトロ発生を高める方法であって、胚の完全孵化を促進するのに有効な量において、培養培地にプロスタグランジン又はその類似物を補足することを有する、方法。
【請求項２】
前記プロスタグランジンはプロスタサイクリン（ＰＧＩ２）又はプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プロスタグランジン類似物はアイロプロスト又はプロスタグランジンＥ１（ＰＧＥ１）である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
培養培地の前記補足は、ゲノムが活性化されて受精卵が桑実胚に発生する期間である胚の初期発生の間に行われる請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記胚はヒトであり、前記初期発生は４乃至８細胞期で開始する請求項１に記載の方法。
【請求項６】
培養培地の前記補足は、胚の桑実胚から初期胚盤胞への発生の間に行われる請求項１に記載の方法。
【請求項７】
培養培地の前記補足は、胚の初期発生から桑実胚期への発生と、胚の桑実胚から初期胚盤胞への発生の間との両方の間において行われる請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記胚はマウスであり、前記補足することは、培養中の胚を、その胚の２細胞発生期に胚の採取後２４乃至４２時間の間に、プロスタグランジン又は類似物に暴露することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記胚はマウスであり、前記補足は、胚を、その胚の２細胞発生期に胚の採取後２４乃至７２時間の間に、前記プロスタグランジン又はその類似物に暴露することを有する請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
インビトロ受精胚のインビボ着床の可能性を増大させる方法であって、請求項１に記載の方法に従って胚のインビトロ発生を高めることにより、胚の孵化の可能性が高められてインビボ着床の可能性が増大させられることを有する、方法。
【請求項１１】
前記胚を完全に孵化させることを有しており、完全孵化は前記胚を透明帯から離すことを有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記胚を宿主哺乳動物の子宮へ着床すること及び前記完全孵化を、生存に適した妊娠の確立と相関させることを有する請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
インビトロで受精された哺乳動物胚の生児出生の可能性を増加させる方法であって、
請求項１に記載の方法に従って胚のインビトロ発生を高めることにより、高められる孵化、すなわち胚の高められる孵化の可能性が達せられること、
孵化の可能性が高められた胚を宿主哺乳動物の子宮に導入すること、及び
導入された胚を前記子宮内に着床できるようにすること、
とを有し、胚の宿主の子宮内に着床される能力は、このような高まりは有せず同様の宿主の子宮内へ導入される胚の能力と比較して高められる方法。
【請求項１４】
インビトロで受精された哺乳動物胚の一群における生児出生率を増加させる方法であって、
請求項１に記載の方法に従って前記胚のインビトロ発生を高めることにより、高められる孵化、すなわち胚の高められる孵化の可能性が達せられること、
高められる孵化の可能性を有する胚を宿主哺乳動物に着床させること、及び
着床された胚をインビボで成長できるようにして、高められる孵化を有する胚、すなわち孵化の可能性が高められた胚からの生児出生率が、このような高まりを有せず着床された胚からの生児出生率よりも非常に高くなるようにすること、
とを有する方法。
【請求項１５】
哺乳動物胚のインビトロ初期発生のための改良された細胞培養培地であって、その改良点は、インビトロで前記胚の完全孵化を促進するのに有効な補足量のプロスタグランジン又はその類似物を有する、改良された細胞培養培地。
【請求項１６】
プロスタグランジン又はその類似物の前記量は、インビトロ培養から取り出されて宿主哺乳動物の子宮に移入した後の、前記胚の完全孵化の可能性を高めるのに有効である、請求項１５に記載の培地。
【請求項１】
哺乳動物胚のインビトロ発生を高める方法であって、胚の完全孵化を促進するのに有効な量において、培養培地にプロスタグランジン又はその類似物を補足することを有する、方法。
【請求項２】
前記プロスタグランジンはプロスタサイクリン（ＰＧＩ２）又はプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プロスタグランジン類似物はアイロプロスト又はプロスタグランジンＥ１（ＰＧＥ１）である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
培養培地の前記補足は、ゲノムが活性化されて受精卵が桑実胚に発生する期間である胚の初期発生の間に行われる請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記胚はヒトであり、前記初期発生は４乃至８細胞期で開始する請求項１に記載の方法。
【請求項６】
培養培地の前記補足は、胚の桑実胚から初期胚盤胞への発生の間に行われる請求項１に記載の方法。
【請求項７】
培養培地の前記補足は、胚の初期発生から桑実胚期への発生と、胚の桑実胚から初期胚盤胞への発生の間との両方の間において行われる請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記胚はマウスであり、前記補足することは、培養中の胚を、その胚の２細胞発生期に胚の採取後２４乃至４２時間の間に、プロスタグランジン又は類似物に暴露することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記胚はマウスであり、前記補足は、胚を、その胚の２細胞発生期に胚の採取後２４乃至７２時間の間に、前記プロスタグランジン又はその類似物に暴露することを有する請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
インビトロ受精胚のインビボ着床の可能性を増大させる方法であって、請求項１に記載の方法に従って胚のインビトロ発生を高めることにより、胚の孵化の可能性が高められてインビボ着床の可能性が増大させられることを有する、方法。
【請求項１１】
前記胚を完全に孵化させることを有しており、完全孵化は前記胚を透明帯から離すことを有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記胚を宿主哺乳動物の子宮へ着床すること及び前記完全孵化を、生存に適した妊娠の確立と相関させることを有する請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
インビトロで受精された哺乳動物胚の生児出生の可能性を増加させる方法であって、
請求項１に記載の方法に従って胚のインビトロ発生を高めることにより、高められる孵化、すなわち胚の高められる孵化の可能性が達せられること、
孵化の可能性が高められた胚を宿主哺乳動物の子宮に導入すること、及び
導入された胚を前記子宮内に着床できるようにすること、
とを有し、胚の宿主の子宮内に着床される能力は、このような高まりは有せず同様の宿主の子宮内へ導入される胚の能力と比較して高められる方法。
【請求項１４】
インビトロで受精された哺乳動物胚の一群における生児出生率を増加させる方法であって、
請求項１に記載の方法に従って前記胚のインビトロ発生を高めることにより、高められる孵化、すなわち胚の高められる孵化の可能性が達せられること、
高められる孵化の可能性を有する胚を宿主哺乳動物に着床させること、及び
着床された胚をインビボで成長できるようにして、高められる孵化を有する胚、すなわち孵化の可能性が高められた胚からの生児出生率が、このような高まりを有せず着床された胚からの生児出生率よりも非常に高くなるようにすること、
とを有する方法。
【請求項１５】
哺乳動物胚のインビトロ初期発生のための改良された細胞培養培地であって、その改良点は、インビトロで前記胚の完全孵化を促進するのに有効な補足量のプロスタグランジン又はその類似物を有する、改良された細胞培養培地。
【請求項１６】
プロスタグランジン又はその類似物の前記量は、インビトロ培養から取り出されて宿主哺乳動物の子宮に移入した後の、前記胚の完全孵化の可能性を高めるのに有効である、請求項１５に記載の培地。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図４Ｆ】
【図４Ｇ】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図４Ｆ】
【図４Ｇ】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【公表番号】特表２００７−５０４８０７（Ｐ２００７−５０４８０７Ａ）
【公表日】平成１９年３月８日（２００７．３．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５２５５２６（Ｐ２００６−５２５５２６）
【出願日】平成１６年９月８日（２００４．９．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２９１６７
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０２６３２４
【国際公開日】平成１７年３月２４日（２００５．３．２４）
【出願人】（５０５０７３０９３）ボード オブ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティー オブ テキサス システム (5)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年３月８日（２００７．３．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年９月８日（２００４．９．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２９１６７
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０２６３２４
【国際公開日】平成１７年３月２４日（２００５．３．２４）
【出願人】（５０５０７３０９３）ボード オブ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティー オブ テキサス システム (5)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]