塩素化アミノ酸を有するインスリン類似体
【解決手段】インスリン類似体は、塩化フェニルアラニンを導入するＢ鎖ポリペプチドを含む。該塩化フェニルアラニンは、Ｂ２４位に位置し得る。該塩化フェニルアラニンは、パラ−モノクロロ−フェニルアラニンであり得る。該類似体は、ヒトインスリンのような哺乳動物インスリン型であり得る。核酸は、係るインスリン類似体をコードする。該塩化インスリン類似体は、著しい活性を保持する。患者を治療する方法は、生理学的有効量の前記インスリン類似体或いはその生理学的に許容される塩を患者に投与することを含む。インスリンの塩素置換に基づく安定化は、細繊維形成を低下し得、それによって冷蔵を欠如する開発途上世界の地域における真性糖尿病の治療を向上し得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００９年１２月１１日付で出願した係属中の米国仮出願第６１/２８５、９５５号の利益を主張する。
【０００２】
政府援助研究又は開発に関連する供述
本発明は、助成金番号ＤＫ４０９４９およびＤＫ０７４１７６下に国立衛生研究所により授与された協力協定の基に政府の支援でなされた。米国政府は、本発明に一定の権利を有し得る。
【０００３】
本発明は、耐熱分解性ポリペプチドに関連する。特に、本発明は、熱的に安定したインスリン類似体に関連する。さらに特に、本発明は、前記インスリン類似体のアミノ酸中に塩素元素を導入することで化学的、熱的に安定化したインスリン類似体に関連する。塩素はハロゲンの一つに分類され、その原子半径、電気陰性度、部分電荷の立体電子分布、および分子中の隣接原子の立体電子特性に及ぼす伝達効果によって、タンパク質類の一般成分とは区別されるものである。
【背景技術】
【０００４】
治療薬とワクチンを含む、超安定タンパク質の改変（ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）は、電気や冷凍が安定して利用できない発展途上国世界の地域で広範な社会的利益をもたらし得る。熱劣化の影響を受けやすい治療用タンパク質の１例として、インスリンがあげられる。その化学的および物理的な劣化が投げ掛ける課題は、アフリカおよびアジアでさし迫った真性糖尿病の流行によって深刻になっている。インスリン類似体の化学的劣化速度は、その相対的安定性と逆相関しているので、超安定化製剤の設計は、係る課題地域でのインスリン補充療法の安全性と有効性を向上し得る。
【０００５】
有機小分子においてハロゲン置換が有用なことがあるのは、薬化学で知られている。フッ素官能基は、コレステロール生合成の阻害剤である、アトルバスタチン（ａｔｏｒｖａｓｔａｔｉｎ）（Ｌｉｐｉｔｏｒ（商標））、うつ病やその他の情動障害の治療に使用される、選択的セロトニン再導入阻害剤である、フルオキセチン塩酸塩（Ｆｌｕｏｘｅｔｉｎ（Ｐｒｏｚａｃ（商標））などのように広く処方されている小分子の有効性にとって重要である。フッ素の原子半径は、水素のと同様であるが、その大きな誘起効果は、これらの薬剤の立体電子的性質を変え、その結果生物学的活性を向上させるのである。類似した物理有機化学上の考慮は、塩素のような大きいハロゲン原子の導入に関連する。小分子モンテルカストナトリウム（ｍｏｎｔｅｌｕｋａｓｔ ｓｏｄｉｕｍ）（Ｓｉｎｇｕｌａｉｒ（商標））は、その医薬品の特性が塩素原子の共有結合の導入で強化されたロイコトリエン（ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅ）阻害剤である。さらに、インスリン類似体でのフッ素置換アミノ酸の使用は、２００９年７月３１日出願の国際特許出願ＰＣＴ/ＵＳ第２００９/５２４７７号に提供されている。
【０００６】
修飾アミノ酸中への塩素原子の部位特異的導入によるタンパク質の化学的、物理的、および生物学的特性の調節に就いては、フッ素原子の導入による上記効果に比して、あまりよく科学文献に特性が記述されていない。
【０００７】
芳香族側鎖は、隣接する芳香環だけでなく、正或いは負の静電ポテンシャルの他の発生源を含む、様々の弱い極性相互作用に関係し得る。例としては、ペプチド結合中の主鎖カルボニル基とアミド基が含まれる。
【０００８】
インスリンの投与は、永年真性糖尿病の治療として確立されている。インスリンは脊椎動物の代謝において中心的な役割を果たす小さな球状蛋白質である。インスリンは、２１残基を含有するＡ鎖および３０残基を含有するＢ鎖である、２つの鎖を含有する。当該ホルモンは、膵臓β細胞中にＺｎ２+で安定化された６量体として貯蔵されるが、血液中ではＺｎ２+不含単量体として機能する。インスリンは、接続領域（３５残基）が、Ａ鎖のＮ末端残基にＢ鎖のＣ末端残基（残基Ｂ３０）を結びつける単鎖前駆体である、プロインスリンの産出物である（図１Ａ）。プロインスリンの構造は、決定されていないが、様々な証拠は、それがインスリン様のコアと無秩序の連結ペプチド（図１Ｂ）から成ることを示している。３つの特定のジスルフィド結合（Ａ６−Ａ１１、Ａ７−Ｂ７、およびＡ２０−Ｂ１９、図１Ａおよび１Ｂ）の形成は、粗面小胞体（ＥＲ）でのインスリンの酸化的フォールディングと連携していると考えられている。プロインスリンは、ＥＲからゴルジ（Ｇｏｌｇｉ）体へ排出後直ぐに会合して、水溶性のＺｎ２+−配位６量体を形成する。内部タンパク質分解による消化およびインスリンへの変換は、未熟な分泌顆粒で起こり、次いで形態学的縮合が起こる。成熟した貯蔵顆粒内の亜鉛インスリン６量体の結晶配列は、電子顕微鏡（ＥＭ）により可視化されている。
【０００９】
生理学的貯蔵形態である、Ｚｎ２+配位インスリン６量体については、広範囲なＸ線結晶学的研究が行われてきた。インビトロで複数の結晶形態が記載され、Ｔ６、Ｔ３Ｒｆ３及びＲ６と命名された、３個の構造系統が定義されている。これらの６量体では、２個のＺｎイオンが６量体中心軸に沿って位置すると考えられ、各３個のヒスチジン（ＨｉｓＢ１０）が配位し、更なる低親和性Ｚｎ結合部位が、いくつかの結晶形態で観察されている。Ｔ−状態プロトマーは、溶液中のインスリン単量体の構造に似ている。Ｒ−状態プロトマーは、Ｂ鎖の二次構造にある変化を示し、中央のα−ヘリックスは、Ｂ１（Ｒ状態）或いはＢ３（擦り切れたＲｆ状態）にまで延長している。
【００１０】
インスリンは、血流中単量体として機能するが、それにもかかわらず、この単量体こそが最も細繊維維形成しやすく、化学的分解の大抵の形態であると考えられている。ＮＭＲで溶液中の特徴を求めた、インスリン単量体の構造は、図１Ｄに示されている。Ａ鎖は、Ｎ末端ヘリックス（残基Ａ１〜Ａ８）、非正規のターン（Ａ９〜Ａ１２）、第２α−ヘリックス（Ａ１２〜Ａ１８）、およびＣ末端延長（Ａ１９〜Ａ２１）から成る。Ｂ鎖は、Ｎ末端アーム（Ｂ１〜Ｂ６）、β−ターン（Ｂ７〜Ｂ１０）、中央α−ヘリックス（Ｂ９〜Ｂ１９）、β−ターン（Ｂ２０〜Ｂ２３）、β−ストランド（Ｂ２４〜Ｂ２８）、および柔軟なＣ−末端残基Ｂ２９〜Ｂ３０を含む。この二つの鎖は、３個のジスルフィド架橋（システイン、Ａ６〜Ａ１１、Ａ７〜Ｂ７、およびＡ２０〜Ｂ１９）によって安定化した、緻密な球状ドメインを形成するように纏まる（ｐａｃｋ）。
【００１１】
通常のインスリンの吸収は、亜鉛―インスリン６量体の動力学的寿命で限定されていて、毛細血管の内皮細胞ライニングを介して通過できる為にはより小さな２量体および単量体に分解しなければならない。Ｈｕｍａｌｏｇ（登録商標）及びＮｏｖｏｌｏｇ（登録商標）の設計の基にある本質的な考え方は、分解を加速することである。これは古典的な二量体形成面（Ｃ末端反平行β−シート）を不安定にすることで達成される。Ｈｕｍａｌｏｇ（登録商標）は、ＩＧＦ−Ｉの配列を模倣する反転である、ＰｒｏＢ２８→ＬｙｓおよびＬｙｓＢ２９→Ｐｒｏ置換を含んでいる。Ｎｏｖｏｌｏｇ（登録商標）はＰｒｏＢ２８→Ａｓｐ置換を含んでいる。該置換は二量体化を阻害するが、前記類似体は、フェノール或いはメタ−クレゾール安定化亜鉛６量体の会合能力がある。この会合は、前記類似体がバイアル中で細繊維形成しないように保護するが、皮下注射後、前記フェノール（或いはｍ−クレゾール）と亜鉛イオンとが拡散除去されるにつれて、前記６量体は、急速に解離する。これらの類似体の不安定性は、患者或いは医療提供者による希釈後にその有効期限が短くなる原因となる。インスリン類似体がＨｕｍａｌｏｇ（登録商標）の変異形２量体−関連β−シートを保持しつつ、インスリン単量体の本質的な安定性を強化するのは有用であろう。
【００１２】
貯蔵時に亜鉛インスリン６量体を使用することは、既知であり、バイアルやポンプの貯留タンク内での製剤の物理的劣化、化学的劣化を遅延させるための古典的な戦略を代表する。前記亜鉛インスリン６量体は毛細血管中に瞬時に通過するには大きすぎるため、皮下注射後のインスリンの吸収速度は、６量体がより小さい２量体および単量体単位に解離するのに必要な時間で限定される。したがって、インスリン類似体が（ａ）高いタンパク質濃度（バイル或いはポンプ内のように）で、６量体が十分会合出来、しかも（ｂ）前記２量体界面では十分不安定化し、加速化した分解を示し、その為当該皮下デポー（ｄｅｐｏｔ）から超高速で吸収が予期されるという両方の能力があれば有利であろう。これらの構造上の目標は、安定性（貯蔵時）と不安定性（注入後）との間の紙一重の所を行くことである。
【００１３】
インスリン中のアミノ酸置換が熱力学的安定性および生物学的活性に及ぼす影響について検討されてきた。安定性と活性の間には、一致した関係が見られていない。熱力学的安定性を向上させる置換のあるものは、インスリン受容体への結合も強化する一方、安定性を向上させる他の置換は、そのような結合を妨げるのである。ＴｈｒＡ８をいくつかの他のアミノ酸で置換する効果が、野生型ヒトインスリンで検討され、又、Ｂ鎖中の３個の無関係な置換（ＨｉｓＢ１０→Ａｓｐ、ＰｒｏＢ２８→Ｌｙｓ、およびＬｙｓＢ２９→Ｐｒｏ）を含む、改変インスリン単量体の場合について報告されている。置換の当該分野では、吸収の経時変化を加速或いは遅延させる例も知られている。係る置換（例えばＮｏｖａｌｏｇ（登録商標）におけるＡｓｐＢ２８およびＨｕｍａｌｏｇ（登録商標）などにおける[ＬｙｓＢ２８、ＰｒｏＢ２９]）は、より迅速な細繊維形成と、より低い物理的安定性とに関連し得るし、またしばしば関係がある。事実、ある研究に於いてＡｓｐＢ２８インスリンとＡｓｐＢ１０インスリンとを含む、ヒトインスリン類似体１０種のシリーズで、細繊維形成のし易さが試験された。１０種は全てが、ｐＨ７．４および３７℃で、ヒトインスリンより細繊維形成しやすいことが判った。この１０種の置換は、当インスリン分子の多様な部位にあって、古典的な熱力学的安定性の変化の幅広い違いと関連する可能性がある。一連の効果が観察されてきたが、活性と熱力学的安定性間には、相関関係が存在しない。
【００１４】
インスリンは化学合成も半合成も極めてし易い、小さな球状タンパク質であり、それで非標準的な側鎖の導入が容易になる。インスリンは３個のフェニルアラニン残基（Ｂ１、Ｂ２４、及びＢ２５位）と、Ｂ２６位に構造的に類似のチロシンとを含有する。ＰｈｅＢ２４の芳香環は、脊椎動物のインスリン及びインスリン様成長因子間に保存されていて、Ｂ鎖の超二次構造を安定させるよう、疎水性コア（ただし内部ではなく）に対して纏まって（ｐａｃｋ）いる。ＰｈｅＢ２４は、古典的な受容体結合表面に位置し、受容体結合時の立体構造（コンフォメーション）の変化を誘導すると提案されている。ＰｈｅＢ２５は、インスリン単量体の表面から突出している一方、ＴｙｒＢ２６は、前記コアの一端に於いて脂肪族側鎖（ＩｌｅＡ２、ＶａｌＡ３およびＶａｌＢ１２）付近に纏まって（ｐａｃｋ）いる。Ｂ２４に関連する立体構造の変化は、ＰｈｅＢ２５およびＴｙｒＢ２６がインスリン受容体の別個のドメインと接触出来るようにするものと提案する。
【００１５】
蛋白質細繊維形成の現在の理論は、細繊維形成のメカニズムが部分的に折り畳まれた中間体状態を介して進行し、次いで凝集し、アミロイド形成的核を形成すると仮定する。この理論では、天然状態を安定させるアミノ酸置換は、部分的に折り畳まれた中間状態を安定させ得るか、或いはさせ得ず、亦、天然状態と中間状態間の自由エネルギー障壁を増加（或いは減少）させ得るか、或いはさせ得ないことが可能である。したがって、現在の理論は、当該インスリン分子内の特定のアミノ酸置換が細繊維形成のリスクを増加或いは減少させる傾向が極めて予測不能であることを示している。
【００１６】
糖尿病治療用のインスリンおよびインスリン類似体の製造、貯蔵、及び使用における重大な問題である細繊維形成は、高温、低ｐＨ、攪拌、或いは尿素、グアニジン、エタノール共溶媒、或いは疎水性表面の存在下で促進される。現行の米国医薬品規制は、細繊維形成が１％或いはそれ以上のレベルで発生した場合、インスリンは破棄すべしと定めている。細繊維形成は、高温で促進されるので、糖尿病患者は、最適には、使用前には、インスリンを冷蔵しておかなければならない。インスリン或いはインスリン類似体は、インスリン又はインスリン類似体を少量定期的に患者の体内に注入する体外インスリン・ポンプを利用する糖尿病患者にとって特に問題となり得る。係る使用法では、前記インスリン又はインスリン類似体は、ポンプ装置内で冷蔵保存されていなく、インスリンの細繊維形成により、体内にインスリン或いはインスリン類似体注入用カテーテルの閉塞をもたらし得るので、予測不能な血糖値の変動を招き、危険な高血糖症さえ引き起こす可能性がある。少なくとも最近のある報告は、リスプロインスリン（野生型ヒトインスリンで残基Ｂ２８とＢ２９がこれらの位置を入れ替えた類似体、商品名Ｈｕｍａｌｏｇ（登録商標））が特に細繊維形成し易く、インスリンポンプ・カテーテルの閉塞を起こし得ることを示している。
【００１７】
インスリン細繊維形成は、インスリンが１〜３箇月間高濃度で、しかも体外ポンプのような常温ではなく生理学的温度（すなわち３７℃）でインプラント内に収納されている、植込み式（インプランタブル）インスリンポンプにおいては、さらにより大きな問題である。さらに、通常の運動によって引き起こされる攪拌も、またインスリンの細繊維形成を加速する傾向となるであろう。インスリン細繊維形成の可能性が増大するにもかかわらず、植込み型インスリンポンプは、係るシステムの可能性のある利点のために、まだ研究活動の題目となっている。これらの長所は、全身循環系を介して患者にインスリンを提供する皮下注射より密接に、インスリンの正常な生理学的送達を真似た門脈循環器系へのインスリンの腹腔内への送達を包含する。腹腔内送達は、注射部位が変われば吸収と分解が変わり得る皮下注射に比べて、より迅速で且つ着実にインスリンの吸収を提供する。植込み型ポンプを介するインスリンの投与は、また、患者にとってより便利になる可能性がある。例えば、貯留タンクへ界面活性剤を添加することなどで細繊維形成を防止するための努力は、いくらかの改善をもたらしたが、これまで、これらの改善は、厳密な監視下の臨床試験以外には、植え込みインスリンポンプを信頼して糖尿病患者に使用を認めるには不十分だと考えられている。
【００１８】
上述したように、発展途上国世界は、医薬及びワクチンの安全な保管、輸送、及び使用に関連する課題に直面している。この課題は、電気と冷蔵に着実にアクセスできない、アフリカ及びアジア地域での、温度に敏感なインスリン製剤の使用を悪化させるが、さらに該発展途上国世界の糖尿病の目下の流行によって、課題が深刻化する可能性が高い。インスリンは、２５℃を超える温度で、１０℃上昇毎に分解速度が１０倍増、或いはそれ以上を示すので、指針は、３０℃未満の温度での貯蔵、好ましくは冷蔵保存するよう求めている。より高温でインスリンは、化学的劣化（例えば、イソ−アスパラギン酸の形成、ジスルフィド結合の再配列、及び共有結合ポリマーの形成などの共有結合構造の変化）と物理的劣化（非天然凝集及び細繊維形成）との両方を受ける。
【００１９】
インスリンのアミノ酸置換は、蛋白質を安定化するが、インスリン受容体（ＩＲ）への結合及びインスリン様成長因子（ＩＧＦＲ）の相同受容体への交差（クロス）結合を増大するので、発癌リスクを付与すると記載されている。当分野で知られている例は、アスパラギン酸によるＨｉｓＢ１０の置換が挙げられる。ＡｓｐＢ１０インスリンは、安定性と薬物動態とに関して有利な薬学的特性を示すが、その増大した受容体−結合特性は、Ｓｐｒａｇuｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの腫瘍形成と関連していた。ＩＲ及びＩＧＦＲへの結合をヒトインスリンのそれに似たレベルまでに減らすのに、ＡｓｐＢ１０−インスリン或いは関連類似体に導入し得る、Ａ或いはＢ鎖に可能な置換が多くあるが、係る置換は、一般にインスリン（或いはインスリン類似体）の安定性を悪化し、その化学的および物理的劣化し易さを高める。受容体―結合親和性の"調整"を可能にし、同時に細繊維形成に対する安定性及び抵抗力を高める、インスリンおよびインスリン類似体の修飾方法を発見することは、望ましいであろう。係る応用法では、その受容体―結合特性において超活性な類似体の発癌可能性を相殺するように、ＩＲおよびＩＧＦＲへの結合を種々の程度に減らす一組の安定化の修飾が必要となるであろう。
【００２０】
したがって、貯蔵中安定であるが、同時に即効性のものを含めて、代替インスリン類似体の必要性がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２１】
したがって、本発明の一態様は、アミノ酸の塩素置換によって改善された安定性のような特性変化をもたらし、さらに、対応する非塩素系インスリン或いは類似体の生物学的活性の少なくとも一部を保持するインスリン類似体を提供することである。
【００２２】
さらに、或いは代替として、本発明の一態様は、速効性インスリンであるが従来の速効型インスリン類似体に勝る、改善した安定性を有するインスリン類似体を提供することである。
【００２３】
一般に、本発明は、塩素化アミノ酸を導入するＢ−鎖のポリペプチドを含むインスリン類似体を提供する。一実施形態では、該塩素化アミノ酸は、Ｂ２４位におけるフェニルアラニンである。特定の一実施態様において、前記塩素化フェニルアラニンは、パラ−モノクロロ−フェニルアラニンである。さらに、或いは代替物では、前記インスリン類似体は、ヒトインスリン類似体のような、哺乳動物のインスリン類似体であり得る。特定の一組の実施形態では、前記Ｂ鎖ポリペプチドは、配列ＩＤ番号４〜８からなる群から選択されるアミノ酸配列と、その３個或いはそれ以下の更なるアミノ酸置換を有するポリペプチドとを、含む。
【００２４】
また、Ｂ２４位でパラ−モノクロロ−フェニルアラニンのような塩素化フェニルアラニンを導入するＢ鎖ポリペプチドを含むインスリン類似体をコードする核酸も提供される。一例において、前記塩素化フェニルアラニンは、核酸配列ＴＡＧのような終止コドンによりコードされる。発現ベクターが係る核酸を含み得、宿主細胞が係る発現ベクターを含み得る。
【００２５】
本発明はまた、患者を治療する方法を提供する。該方法は、インスリン類似体或いはその生理学的に許容される塩の生理学的有効量を患者に投与することを含むが、該インスリン類似体或いはその生理学的に許容される塩は、塩素化アミノ酸を含む。一実施形態では、インスリンＢ鎖は、Ｂ２４位に塩素化フェニルアラニンを導入する。特定の一態様では、前記塩素化フェニルアラニンは、パラ−モノクロロ−フェニルアラニンである。さらに、或いは代替では、インスリン類似体は、例えば、ヒトインスリンの類似体のような哺乳動物のインスリン類似体を含み得る。さらに、前記Ｂ鎖ポリペプチドは、配列ＩＤ番号４〜８からなる群から選択されるアミノ酸配列と、その３個或いはそれ以下の更なるアミノ酸置換を有するポリペプチドとを、含み得る。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１Ａ】図１ＡはＡ−鎖及びＢ−鎖と、隣接する２塩基性切断部位（黒丸）で示される連結領域と、Ｃ−ペプチド（白丸）と、を含むヒトプロインスリン配列の概略図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、インスリン様部分と不規則連結ペプチド（破線）から成る、プロインスリンの構造モデルである。
【図１Ｃ】図１Ｃは、Ｂ鎖中の残基Ｂ２４の位置を示すヒトインスリン配列の概略図である。
【図１Ｄ】図１Ｄは、３つのジスルフィド架橋との関聯でＰｈｅＢ２４の芳香族残基を示すインスリン単量体のリボンモデルである。ＬｅｕＢ１５（黒）及びＰｈｅＢ２４（灰色）の隣接する側鎖が示されている。Ａ鎖とＢ鎖の鎖が示され、ジスルフィド架橋は、球及び棒として示されている。
【図１Ｅ】図１Ｅは、疎水性コアの端にあるポケット内のＰｈｅＢ２４側鎖を示すインスリンの空間充填モデルである。
【図２Ａ】図２Ａは、オルト−モノクロロ−フェニルアラニン（２Ｃｌ−Ｐｈｅ）の図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、メタ−モノクロロ−フェニルアラニン（３Ｃｌ−Ｐｈｅ）の図である。
【図２Ｃ】図２Ｃは、パラ−モノクロロ−フェニルアラニン（４Ｃｌ−Ｐｈｅ）の図である。
【図３Ａ】図３Ａは、単離インスリン受容体（アイソフォーム Ｂ）：ヒトインスリン（三角）、ＫＰ−インスリン（四角）、および４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリン（逆三角）を用いたインビトロ受容体―結合アッセイの結果を示すグラフである。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＩＧＦ−1Ｒ：ヒトインスリン（三角）、ＫＰ−インスリン（四角）、４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリン（逆三角）、および天然ＩＧＦ−I（円）を用いたインビトロ受容体―結合アッセイの結果を示すグラフである。
【図３Ｃ】図３Ｃは、単離インスリン受容体（アイソフォームＢ）：ヒトインスリン（実線）、ＫＰ−インスリン（破線）、４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリン（三角）、４Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリン（四角）を用いたインビトロ受容体−結合アッセイの結果を比較したグラフである。
【図３Ｄ】図３Ｄは、単離インスリン受容体（アイソフォームＢ）：ヒトインスリン（実線）、ＫＰ−インスリン（破線）、４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリン（三角）、４Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリン（四角）を用いたインビトロ受容体―結合アッセイの結果を比較したグラフである。
【図４】図４は、ＳＴＺ誘発糖尿病Ｌｅｗｉｓラットでの４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリン（逆三角）の皮下注射の経時血糖降下作用を、希釈液単独（丸）、ヒトインスリン（ｘ）、及ＫＰ−インスリン（四角）に対して相対的に示すグラフである。
【図５】図５Ａ〜Ｃは、インスリンコバルト溶液の平均トレース（記録図）を示すグラフであって、２ｍＭＥＤＴＡの添加前と後の４００〜７５０ｎｍの特徴的なスペクトル・プロファイルを示す。試料は、５０ｍＭトリス（ｐＨ７.４）、５０ｍＭフェノール、および０.２ｍＭ塩化コバルト（ＣｏＣｌ２）に溶解した。次いで、ＮａＳＣＮを最終濃度１ｍＭになるまで添加した。実線は、ＥＤＴＡ抽出前データを示す。破線は、ＥＤＴＡ抽出後のデータを示す。図Ａ：野生型インスリン；図Ｂ：ＫＰ−インスリン；図Ｃ；４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリン。 図５Ｄは、２ｍＭＥＤＴＡ添加後、５７４ｎｍ（２５℃およびｐＨ７.４）で測定した、６量体解離の動態を示すグラフである。データは、各試料のタイム・ゼロに正規化した：野生型（実線）、ＫＰ−インスリン（破線）、および４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリン（点線）。
【図６】図６は、平均濾過グルコース注入速度対体重ｋｇ当たり０.２単位用量でインスリンＫＰ−インスリン（リスプロインスリン）及び４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリン（４−Ｃｌ−リスプロインスリン）のインスリン投与後の時間とのプロットを示すグラフである。
【図７】図７は、豚の薬理試験２０組をまとめた棒グラフであって、５つの異なる投与量レベルで、ＫＰ−インスリンに比し、４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンが後期最大半量到達時間（１／２Ｔ−ｍａｘ ｌａｔｅ）の有意な改善を実証している。
【図８】図８は、豚の薬理試験１４組をまとめた棒グラフであって、３つの異なる投与量レベルで、ＫＰ−インスリンに比し、４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンが初期最大半量到達時間（１／２Ｔ−ｍａｘ ｅａｒｌｙ）の改善を示唆している。
【図９】図９は、曲線下面積（ＡＵＣ）で測定した、４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンのＫＰインスリンに対する相対的効力を比較した１０組の対応する薬物動態の研究要約であって、４−Ｃｌ−ＫＰの平均効力のわずかな減少は、統計的に有意でないことが判明した（ｐ＝０.２２）。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明は、アミノ酸の塩素置換によってより高い安定性を提供するインスリン類似体であって、対応する非塩素系インスリン或いはインスリン類似体の生物学的活性の少なくとも一部を保持する、当該類似体に関聯する。特に、本発明は、アミノ酸における塩素置換で、より高い安定性を提供するインスリン類似体であって、同時に対応する非塩素系インスリン或いはインスリン類似体の生物学的活性の少なくとも一部を保持する当該類似体を提供する。ある特定の態様において、本発明は、野生型フェニルアラニンのＢ位における置換としてパラ−モノクロロ−フェニルアラニン（４−Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４）残基を含むインスリン類似体を提供する。
【００２８】
しかし、本発明はヒトインスリンおよびその類似体に限定されない。これらの置換は非限定的例により、ブタ、ウシ、ウマ、及びイヌインスリンのような動物インスリンでも実施し得ることも想定される。
【００２９】
さらに、ヒトとインスリンと動物インスリン間の類似性と、過去において人間の糖尿病患者に使用した動物インスリンと、の観点から、インスリンの配列内に他の小規模な修飾、とくに"保存"とみなされる置換を導入し得ることも想定される。例えば、アミノ酸の更なる置換は、本発明から逸脱することなく、類似の側鎖を有するアミノ酸のグループ内で行い得る。これらは中性疎水性アミノ酸：アラニン（Ａｌａ或いはＡ）、バリン（Ｖａｌ或いはＶ）、ロイシン（Ｌｅｕ或いはＬ）、イソロイシン（ＩｌＥ或いはＩ）、プロリン（Ｐｒｏ或いはＰ）、トリプトファン（Ｔｒｐ或いはＷ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ或いはＦ）及びメチオニン（Ｍｅｔ或いはＭ）を含む。同様に、中性の極性アミノ酸は、グリシン（Ｇｌｙ或いはＧ）、セリン（Ｓｅｒ或いはＳ）、スレオニン（Ｔｈｒ或いはＴ）、チロシン（Ｔｙｒ或いはＹ）、システイン（Ｃｙｓ或いはＣ）、グルタミン（Ｇｌｕ或いはＱ）、およびアスパラギン（Ａｓｎ或いはＮ）のグループ内で互いに置換し得る。塩基性アミノ酸は、リジン（Ｌｙｓ或いはＫ）、アルギニン（ＡｒＧ或いはＲ）およびヒスチジン（Ｈｉｓ或いはＨ）を含むと考えられる。酸性アミノ酸は、アスパラギン酸（Ａｓｐ或いはＤ）とグルタミン酸（Ｇｌu或いはＥ）とがある。別途に記載があるか、或いは前後関係から明らかな場合でない限り、本明細書に記載のアミノ酸は、Ｌ−アミノ酸であると考えるべきである。一例では、本発明のインスリン類似体は、本発明の前記４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４置換以外の３個或いはそれ以下の保存的置換を含む。別の例では、本発明のインスリン類似体は、本発明の前記４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４置換以外の１個或いはそれ以下の保存的置換を含む。
【００３０】
本明細書および特許請求の範囲で使用されている場合、インスリンあるいはインスリン類似体中の様々なアミノ酸は、問題にしているアミノ酸残基を記載し、次いで当該アミノ酸の位置を、選択的には上付き文字で記載し得る。問題のアミノ酸の位置は、前記置換が位置するインスリンの前記Ａ鎖或いはＢ鎖を含む。したがって、ＰｈｅＢ２４は、インスリンのＢ鎖の第２４番目のアミノ酸にあるフェニルアラニンを表し、一方ＰｈｅＢ２５は、インスリンのＢ鎖の第２５番目のアミノ酸にあるフェニルアラニンを表す。塩素化アミノ酸は接頭辞「Ｃｌ−」で表し得る。したがって、塩素化フェニルアラニンは、「Ｃｌ−Ｐｈｅ」と省略し得る。フェニルアラニンの場合には、塩素置換基或いはフェニル側鎖上の置換基の位置をさらに前記塩素が結合する炭素の番号で表してもよい。したがって、オルト−モノクロロ−フェニルアラニンは、（図２Ｂに示すように）「２Ｃｌ−Ｐｈｅ」と省略され、メタ−モノクロロ−フェニルアラニンは（図２Ｃに示すように）３Ｃｌ−Ｐｈｅ」と省略され、パラ−モノクロロ−フェニルアラニンは４Ｃｌ−Ｐｈｅとｌ−Ｐｈｅと、省略される。
【００３１】
Ｂ２４にあるフェニルアラニンは、機能性インスリンにおける不変アミノ酸であって、芳香族側鎖を包含する。インスリンにおけるＰｈｅＢ２４の生物学的重要性は、臨床的変異（ＳｅｒＢ２４）がヒトの真性糖尿病を引き起こすことで示される。図１Ｄと図１Ｅに図示のように、亦、理論に束縛されることを望まないが、ＰｈｅＢ２４は、古典的な受容体結合表面で疎水性コアの端に纏まって（ｐａｃｋ）いると考えられている。このモデルは、結晶学的プロトマー（２−Ｚｎ分子１；プロテインデータバンク識別名４ＩＮＳ）に基づいている。ＰｈｅＢ２４は、Ｂ鎖（残基Ｂ２４〜Ｂ２８）のＣ末端β−ストランド内に位置し、中央のα−ヘリックス（残基Ｂ９〜Ｂ１９）に隣接している。芳香環の一面と一端は、ＬｅｕＢ１５とＣｙｓＢ１９により規定される浅いポケット内に位置する。他の面と他の端は溶剤に露出している（図１Ｅ）。このポケットは、部分的に主鎖カルボニル基とアミド基とで囲まれているので、複雑で且つ非対称的な静電気的環境を形成する。
【００３２】
本発明の前記置換は、現行の多くのインスリン類似体のいずれにでも実施し得ることが想定される。例えば、本明細書で提供される塩素化ＰｈｅＢ２４置換は、ヒトインスリンの他にリスプロ（ＫＰ）インスリン、インスリンアスパルト（Ａｓｐａｒｔ）、他の修飾インスリン或いはインスリン類似体、或いは、通常のインスリン、ＮＰＨインスリン、レンテインスリン或いはウルトラレンテインスリンのような様々な医薬製剤内で実施し得る。アスパルト（Ａｓｐａｒｔ）インスリンは、ＡｓｐＢ２８置換を含み、Ｎｏｖａｌｏｇ（登録商標）として販売され、一方リスプロインスリンは、ＬｙｓＢ２８とＰｒｏＢ２９置換とを含み、名称Ｈｕｍａｌｏｇ（登録商標）として知られ、また、その名称で販売されている。これらの類似体は、米国特許第５，１４９，７７７号及び第５，４７４，９７８号に記載されている。これらの類似体は、共に速効性インスリンとして知られている。
【００３３】
理論に束縛されることを望まないが、芳香環のパラ位にある前記塩素置換は二量体インターフェース（４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４）内に埋め込まれていると考えられ、また不利な塩素―芳香族静電双極子モーメントの配置を形成し、当該６量体内において、各二量体界面で対に並置することで、６量体の分解を促進するとも考えられている。これによって、Ｚｎ２＋イオンの存在下に前記インスリン類似体を形成しても、尚且速効性（食事時）インスリン類似体である能力を保持出来ると考えられている。
【００３４】
塩素化−Ｐｈｅ置換は、Ｂ２４におけるものを含めて、従来臨床的に使用されていないが、なお実験的に有用である、以下にもっと詳しく記載のＤＫＰインスリンのようなヒトインスリン類似体にも導入し得るし、或いはＢ鎖のＣ末端残基とＡ鎖のＮ末端残基との間の正常の３５個のアミノ酸連結領域の代わりにインスリンの前記Ａ鎖部分とＢ鎖部分の間に一つのジペプチドリンカー（Ａｌａ−Ｌｙｓ）を含む、プロインスリン類似体であるミニプロインスリンにも導入し得る（図１Ｂ参照）。ＤＫＰ−インスリン（或いはＡｓｐＢ１０を含む、或いはヒトインスリンのそれよりも高い受容体−結合親和性を示す他のインスリン類似体）においてＢ２４位での塩素化―Ｐｈｅの導入は、これらの受容体―結合親和性をヒトインスリンと同様或いはそれ以下までに低下できるので、潜在的に臨床的使用を可能にする。このようにして、インスリン類似体の、分裂促進的なＩＧＦＲへの交差結合も低下し得る。
【００３５】
ヒトプロインスリンのアミノ酸配列を、比較の目的のために、配列ＩＤ番号１として提供する。
配列ＩＤ番号１（プロインスリン）
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn
【００３６】
ヒトインスリンＡ鎖のアミノ酸配列を配列ＩＤ番号２として提供する。
配列ＩＤ番号２ （Ａ鎖）
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn
【００３７】
ヒトインスリンＢＡ鎖のアミノ酸配列を配列ＩＤ番号３として提供する。
配列ＩＤ番号３ （Ｂ鎖）
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr
【００３８】
他の置換のさらなる組合せも、本発明の範囲内である。本発明の置換を、従来既知のインスリン類似体の置換と組み合わせ得ることも想定される。例えば、塩素化Ｐｈｅ置換も導入し得るリスプロインスリン（Ｈｕｍａｌｏｇ（登録商標））のＬｙｓＢ２８、ＰｒｏＢ２９置換を含むヒトインスリンのＢ鎖の類似体のアミノ酸配列を、配列ＩＤ番号４として提供する。同様に、塩素化Ｐｈｅ置換も導入し得る、アスパートインスリンのＡｓｐＢ２８の置換を含むヒトインスリンのＢ鎖の類似体のアミノ酸配列を、配列ＩＤ番号５として提供する。
配列ＩＤ番号４
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Lys-Pro-Thr
配列ＩＤ番号５
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Asp-Lys-Thr
【００３９】
塩素化−ＰｈｅＢ２４置換はまた、残基Ａ４、Ａ８および／或いはＢ１でのＨｉｓ置換を含むヒトインスリンの類似体のような他のインスリン類似体置換との組み合わせにでも、導入し得るが、これは、もっと詳細に、同時係属中の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０７／００３２０号および米国特許出願第１２／１６０，１８７号に記載されている通りであって、その参照により本明細書に組み込まれる。例えば、４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４置換は、［ＨｉｓＡ４、ＨｉｓＡ８］および／或いはＨｉｓＢ１置換と共に、配列ＩＤ番号６で表されるアミノ酸配列を有するインスリン類似体或いはプロインスリン類似体中に存在し得る。
配列ＩＤ番号６
R1-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-R2-Thr-R3-R4-Thr-Xaa0-35-Gly-Ile-Val-R5-Gln-Cys-Cys-R6-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn;
【００４０】
ここで、Ｒ１はＨｉｓ或いはＰｈｅであり；Ｒ２はＴｙｒ或いはＰｈｅであり、Ｒ３はＰｒｏ、Ｌｙｓ或いはＡｓｐであり；Ｒ４はＬｙｓ或いはＰｒｏであり；Ｒ５はＨｉｓ或いはＧｌｕであり；Ｒ６はＨｉｓ或いはＴｈｒであり；Ｘａａ０〜３５は０〜３５個の任意のアミノ酸或いは該アミノ酸鎖中の切れ目（break）であり；
さらに、以下のアミノ酸置換の群から選択される、少なくとも１つの置換が存在する：
Ｒ１はＨｉｓである；
Ｒ６はＨｉｓである；
Ｒ５とＲ６とは共にＨｉｓである。
【００４１】
前記４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４置換は、同時係属中の米国特許出願番号第１２／１６０，１８７に開示のような単一鎖インスリン類似体にも導入することが可能であり、その開示は、この参照により本明細書に組み込まれる。
【００４２】
塩素化−ＰｈｅＢ２４置換は、インスリンＡ鎖中に置換を含むインスリン類似体にも導入し得ることが想定される。例えば、インスリン類似体は、さらに、Ａ８位に野生型のスレオニン（配列ＩＤ番号２参照）の代わりに、配列ＩＤ番号７に示すように、Ａ８位にリジン、ヒスチジン或いはアルギニン置換を含み得る。
配列ＩＤ番号７
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Xaa-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn
[Xaa = His, Arg,或いはLys]
【００４３】
上記したように、４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４置換は、ＡｓｐＢ１０（Ｄ）、ＬｙｓＢ２８（Ｋ）およびＰｒｏＢ２９（Ｐ）置換を含む、ＤＫＰ−インスリンと呼ぶ高活性の改変インスリン単量体中に導入し得る。前記Ｂ鎖の表面上のこれら３個の置換は、２量体および６量体形成を妨害すると考えられる。改変単量体の使用で、安定性アッセイに及ぼす自己会合の混乱効果を回避する。ＤＫＰ−インスリンの構造は、結晶学的プロトマーに密接に似ている。ＤＫＰインスリンのＢ鎖ポリペプチドの配列を、配列ＩＤ番号８として提供する。
配列ＩＤ番号８（ＤＫＰ Ｂ鎖配列）
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-Asp-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Lys-Pro-Thr
【００４４】
ＫＰ−インスリン類似体は、トリプシン−触媒による半合成により調製し、高速液体クロマトグラフィーにより精製し得る。（Ｍｉｒｍｉｒａ，Ｒ．Ｇ．およびＴａｇｅｒｒ，Ｈ．Ｓ．、１９８９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：６３４９〜６３５４）。このプロトコルは、（ｉ）残基（Ｎ）−ＧＦ＊ＦＹＴＫＰＴを表す合成オクタペプチド（修飾した残基（Ｆ＊）と「ＫＰ」置換（下線）とを含む；配列ＩＤ番号９）と、（ｉｉ）切断型類似体デスオクタペプチド［Ｂ２３〜Ｂ３０］−インスリン（ＤＯＩ：配列ＩＤ番号１５）とを用いる。オクタペプチドは、ＰｒｏＢ２８およびＬｙｓＢ２９（斜体）の相互交換により、野生型Ｂ２３〜Ｂ３０配列（ＧＦＦＹＴＰＫＴ；配列ＩＤ番号１０）とは異なるので、トリプシン処理中、リジンε−アミノ基の保護は、必要ない。要するに、このプロトコルでは、デスオクタペプチド（１５０ｍｇ）およびオクタペプチド（１５０ｍｇ）を、１０ｍＭ酢酸カルシウムおよび１ｍＭエチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）を含有するジメチルアセトアミド／１，４−ブタンジオール／０．２Ｍトリス酢酸（ｐＨ８）（３５：３５：３０、ｖ／ｖ、４ｍｌ）の混合物中に溶解する。ＤＯＩに対して５倍モル過剰のオクタペプチドで、トリプシンの逆反応(タンパク質分解方向）の防止を基質飽和によって確実にするのである。最終ｐＨを、０．１ｍｌのＮ−メチルモルホリンを用いて７．０に調整する。該溶液を１２℃まで冷却し、１．５ｍｇのトリプシンを加え、１２℃で２日間インキュベートする。追加の１．５ｍｇのトリプシンを、２４時間後に加える。反応物を、０．１％トリフルオロ酢酸を用いて酸性にし、分取逆相ＨＰＬＣ（Ｃ４）により精製する。生成物は、次いで、マトリクス支援レーザ脱着／イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ）を使用して確証し得る。固相合成の一般的なプロトコルは、記載されている通りである（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら、１９８２．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２１：５０２０〜５０３１）。９−フルオレン−９−イル−メトキシカルボニル（Ｆ−ｍｏｃ）保護フェニルアラニン類似体は、Ｃｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（イリノイ州 Ｗｏｏｄ Ｄａｌｅ）から入手し得る。
【００４５】
円二色性（ＣＤ）スペクトルは、Ａｖｉｖ分光旋光計を用いて４℃および２５℃で取得し得る（Ｗｅｉｓｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９：１５４２９〜１５４４０）。試料は、約２５μＭのＫＰ−インスリン或いは類似体を、５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．４）中に含有し得る。試料は、２５℃でのグアニジン−誘導による変性研究用に５μＭに希釈される。アンフォールディングの自由エネルギーを導き出すために、変性遷移を、非線形最小２乗法により、Ｓｏｓｎｉｃｋらの、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３１７：３９３〜４０９に記載されているように、２相モデルにフィットさせる。要するに、ｘは変性剤の濃度を示す、ＣＤデータθ（ｘ）を次式により、非線形最小２乗法プログラムによりフィットさせる。
【００４６】
【数１】
【００４７】
ここで、ｘはグアニジンの濃度であり、θＡおよびθＢは天然で、アンフォールドした状態におけるベースライン値である。ベースラインは、遷移前および遷移後の次の直線により近似する。
【００４８】
【数２】
【００４９】
相対活性は、特異的に結合した１２５Ｉ−ヒトインスリンの５０％を置き換えるのに要する野生型ヒトインスリンに対する類似体の割合として定義する。インスリン受容体（ＩＲ）を含むヒト胎盤膜調製物を、当該技術分野で既知のように使用する。膜断片（０．０２５ｍｇタンパク質／チューブ）を、１２５Ｉ標識インスリン（約３０，０００ｃｐｍ）と共に、選択した濃度の未標識類似体の存在下で１８時間、４℃で、最終容積０．２５ｍｌの０．０５Ｍトリス−ＨＣｌおよび０．２５％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン中、ｐＨ８でインキュベートした。インキュベーション後、混合物を１ｍｌの氷冷緩衝液で希釈し、４℃で５分間遠心分離する（１０，０００ｇ）。次いで、上清を吸引により除去し、膜ペレットを放射能について計測する。データを、非特異的結合（１μＭヒトインスリンの存在下で結合した膜に残存する放射能の量）に対して補正する。全てのアッセイにおいて、競合リガンド不在で結合したトレーサーのパーセンテージは、リガンド喪失による人為的結果（ａｒｔｉｆａｃｔｓ）を回避するため、１５％未満であった。インスリン類似体の３７℃でのインキュベーション間中の活性の変化を測定するための更なるインスリン受容体−結合アッセイは、マイクロタイター（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ）プレート抗体捕捉を用いて、当該技術分野で既知のように行い得る。マイクロタイターストリッププレート（Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｂ）を、４℃で１晩、ＡＵ５ ＩｇＧ（リン酸緩衝食塩水中４０μｇ／ｍｌを１００μｌ／ウェル）と共にインキュベートする。結合データは、二サイト（ｔｗｏ−ｓｉｔｅ）逐次モデルで分析し得る。ＩＧＦ Ｉ型受容体を用いた、対応するマイクロタイタープレート抗体アッセイを行い、この相同受容体への交差結合を評価し得る。
【００５０】
修飾された残基は、ＫＰ−インスリンの範囲内に導入された。提示した活性値は、ヒトインスリンとの相対的なホルモン−受容体の解離定数の比率に基づくものであり、ヒトインスリンの活性は、このように定義によって、１．０である。活性値の標準誤差は一般に２５％未満であった。２５℃におけるアンフォールディングの自由エネルギー（ΔＧu）は、２状態モデルに基づき、ゼロ変性剤濃度に外挿して見積もった。時間のずれは、亜鉛不含リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７.４）中、３７℃で穏やかに撹拌する際の蛋白質細繊維形成開始に必要な時間（日数）を示す。
【００５１】
本明細書で提供される塩素化−ＰｈｅＢ２４置換は、インスリン類似体、例えば、リスプロインスリン（つまり、置換ＬｙｓＢ２８及び置換ＰｒｏＢ２９も含むインスリン類似体（名称Ｈｕｍａｌｏｇ（登録商標）として販売））で実施できる。係るインスリン類似体は、塩素化−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンと呼ぶ。比較目的のために、フッ素置換も、本質的には、上述のように導入されたが、但し、パラフッ化フェニルアラニン置換は、リスプロインスリンのＢ２４位とＢ２６位に導入された。Ｂ２４位にパラフッ素フェニルアラニン置換を含む類似体は４Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンと呼ぶ。Ｂ２６位（チロシンを置換する）にパラフッ素化フェニルアラニン置換を含む類似体は４Ｆ−ＰｈｅＢ２６−ＫＰ−インスリンと呼ぶ。ＫＰ−インスリンおよびＤＫＰ−インスリンのそれぞれの類似体の名称を表や図で簡潔にする為、"インスリン"を除去してＫＰ及びＤＫＰと省略し得る。
【００５２】
Ｂ２４での塩素化フェニルアラニン置換には、残基（Ｎ）−ＧＦ＊ＦＹＴＫＰＴを表す合成オクタペプチド（塩素化フェニルアラニン残基を「Ｆ＊」として、「ＫＰ」置換を（下線）で表わした：配列ＩＤ番号９）及び切断した類似体デスオクタペプチド［Ｂ２３〜Ｂ３０］−インスリン（Ｂ１０位において野生型、配列ＩＤ番号１５）を用いた。Ｂ２６でのフッ素化フェニルアラニン置換には、残基（Ｎ）−ＧＦＦＦ＊ＴＫＰＴを表す合成オクタペプチド（再び、フッ素化フェニルアラニン残基を「Ｆ＊」として、「ＫＰ」置換を（下線）で表わした：配列ＩＤ番号１６）及び切断した類似体デスオクタペプチド［Ｂ２３〜Ｂ３０］−インスリン（配列ＩＤ番号１５）を用いた。
【００５３】
リスプロインスリン類似体のバックグラウンド中のＢ２４位或いはＢ２６位のハロゲン化フェニルアラニン置換で得られたデータを以下の表１に示す。
【００５４】
【表１】
【００５５】
細繊維形成アッセイ。４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンの物理的安定性は、ガラスバイアル中で穏やかに撹拌しながらｐＨ７.４、３７℃で亜鉛不含リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中でインキュベーションの間に三重反復して評価した。該試料は、タンパク質濃度６０μＭで曇り度の外観を１２日間観察し、毎日２回、チオフラビン−Ｔ（ＴｈＴ）蛍光分析用に一定分量を採取した。ＴｈＴ蛍光は、アミロイドが存在しない場合には僅少であるが、細繊維形成の発生時には著しく強まるので、このアッセイは、前記時間のずれを求める。ヒトインスリン、ＫＰ−インスリン、及び４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンの時間のずれは、それぞれ、５±１日、３±１日、および１３日以上である。したがって、４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンは、これらの条件下で、ＫＰ−インスリンよりも４倍以上細繊維形成に対して耐性があり、少なくともヒトインスリンの２倍以上耐性がある。特許性を理論に条件付けるのは望まないが、４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４インスリン類似体の細繊維形成抵抗の向上で、個々の試料の使用開始前でも後でも、概インスリン類似体の貯蔵期間を余り短縮することなく、当該インスリン類似体の即効性を高めるよう、亜鉛不含製剤で調剤が可能になると想定される。
【００５６】
熱力学的安定性。本発明者らは、４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンのアンフォールディングの自由エネルギーを、ＫＰ−インスリン及びＬｙｓＡ８−ＫＰ−インスリンに相対的に、亜鉛不含緩衝液中ｐＨ７.４および２５℃（１０ ｍＭリン酸カリウムおよび５０ｍＭＫＣｌ）で測定した。このアッセイは、ヘリックスに敏感な波長２２２ ｎｍでプローブし、グアニジン誘発性変性のＣＤによる検出を利用した。二状態モデルに基づく、アンフォールディングの自由エネルギーによる推定値を得るために、ΔＧｕの値を変性剤濃度ゼロに外挿した。置換ＴｈｒＡ８→Ｌｙｓは、熱力学的安定性を０.６±０.２Ｋｃａｌ／モル増加した一方、該４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４修飾は、安定性を０.４±０.２Ｋｃａｌ／モル減少させた。
【００５７】
４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリン−Ａ８Ｔと、界面活性剤−可溶化し、レクチン精製したインスリン受容体（アイソフォームＢ）との親和性は、ヒトインスリンのそれと類似している。単離インスリン受容体（アイソフォームＢ）：ヒトインスリン（三角）、ＫＰ−インスリン（四角）、４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリン（逆三角）を使用して、トレーサーとして１２５Ｉ標識ヒトインスリンを用いた競合置換アッセイを図３Ａに示す。３つの曲線はすべて密接に整列しており、類似した受容体−結合親和性を示す。４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンのインスリン受容体に対する親和性は、ＫＰ−ヒトインスリンのそれと区別できなかったが、それぞれ野生型インスリンの親和性よりもわずかに低かった。
【００５８】
図３Ｂは、インスリン様成長因子Ｉ受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）を使用し、トレーサーとして１２５Ｉで標識したＩＧＦ−Ｉを使用してプローブした競合置換によって調べた、対応するアッセイの結果を示す。天然ＩＧＦ−Ｉ（円）が追加されているが、記号は同一である。４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリン曲線の右側シフトは、ＩＧＦ−１Ｒへの交差結合の減少を示す。ＩＧＦ−１Ｒへの４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンの交差結合は、ＫＰ−インスリン或いは野生型インスリンのそれに対して約３倍相対的に減少している。
【００５９】
単離インスリン受容体（アイソフォームＢ）を用いた、ヒトインスリン（黒実線）、ＫＰ−インスリン（破線）、４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリン（三角）、４Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリン（四角）間の同様な比較は、図３Ｃに示す。４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリン、野生型ヒトインスリン、及びインスリンリスプロと相対的に、４Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリン曲線の右側シフトは、フェニルアラニン環の同一位置での異なるハロゲンの使用で、Ｂ２４位でのフェニルアラニンのパラ−クロロ置換に比較して減少した受容体−結合親和性を示している。対照的に、４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンのインスリン受容体結合親和性は、野生型ヒトインスリン及びリスプロ（ＫＰ）インスリンのそれと似ている。
【００６０】
単離インスリン受容体（アイソフォームＢ）を使用した、ヒトインスリン（実線）、ＫＰ−インスリン（破線）、４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２６−ＫＰ−インスリン（三角）、４Ｆ−ＰｈｅＢ２６−ＫＰ−インスリン（四角）間のさらなる比較は、図３Ｄに示す。４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２６−ＫＰ−インスリン及び４Ｆ−ＰｈｅＢ２６−ＫＰ−インスリンは、両方とも野生型インスリンとリスプロインスリンとに比べて、インスリン受容体結合親和性が低下した。上記のように、４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンは、受容体−結合親和性で類似した減少を示さない。
【００６１】
糖尿病ラットにおける４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンのインビボ効力は、ＫＰ−インスリンのそれと似ている。生物学的活性の特徴づけを行う為に、雄Ｌｅｗｉｓラット（体重約３００ｇ）をストレプトゾトシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ）で糖尿病状態にした。ヒトインスリン、ＫＰ−インスリン、４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンは、ＨＰＬＣにより精製、乾燥して粉末にし、インスリン希釈液（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ Ｃｏｒｐ）に溶解した。ＫＰ−インスリン或いは４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンを希釈液１００μｌ中２０μｇ或いは６.７μｇ、時間＝０で、ラットに皮下注射した。多い方の用量は、野生型インスリンの用量−応答曲線の定常（プラトー）になるが、一方少ない方の用量は、グルコース処理最高初速度の５０〜７０％に相当する。希釈剤単独の注入は、負の対照として行った。各グループ８匹のラットについて研究した。血液は時間０および継続間隔で最大１２０分まで、切り取った尾の先端から得た。血糖は、Ｈｙｐｏｇuａｒｄ Ａｄｖａｎｃｅ Ｍｉｃｒｏ−Ｄｒａｗメーターを用いて測定した。血糖濃度は、図４に示すように減少することが観察された。注入後最初の２４分間の血中グルコース濃度降下の初速度を比較すると、４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリン（−２２５±２９ ｍｇ/ｄｌ/時）、ＫＰ−インスリン（−２５６±３５ ｍｇ/ｄｌ/時）及びヒトインスリン（−２５５±３５ｍｇ/ｄｌ/時）で似ている。初期速度の違いは、いずれも統計的に有意ではない。しかし、次の６０分に亘る４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンの作用持続時間は、ヒトインスリン或いはＫＰ−インスリンの持続時間よりも短いと思われる。
【００６２】
４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンの天然受容体−結合親和性を考慮すれば、その効力がヒトインスリンのそれよりより低いことは異常なことであろう。確かに、野生型に比べた相対的な親和性が３０〜１００％台のインスリン類似体は、通常、インビボで天然物の効力を示す。しかし、形式的には、Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンの生物学的効力が、ヒトインスリン或いはＫＰ−インスリンの効力より（モル基準で）やや低いことはあり得る。もしそうであっても、我々は、如何なる係る降下も、臨床で使用の現行のインスリン製品のモル当たり活性閾値の範囲内になるであろうということに注目する（慣例により、国際単位（ＩＵ）は、それぞれ、糖降下程度を反映するように再定義され、その結果製品毎の単位当りミリグラム或いはナノモル数に違いが出ることになる）。留意すべきは、タンパク質不含希釈剤（図４の褐色破線）の対照注入での血糖濃度の緩やかな減少は、注入後の動物の昼間の空腹を示していることである。
【００６３】
インスリン６量体分解の薬物動態（ＥＤＴＡ封鎖アッセイと呼ぶ）用代替えマーカーは、亜鉛イオン（Ｚｎ２＋）ではなくコバルトイオン（Ｃｏ２＋）を使用して、６量体会合を仲介させるのである。Ｃｏ２＋６量体とＺｎ２＋６量体は、構造上似ているが、該コバルトイオンは、未充填ｄ−電子殻に起因する好都合な分光プローブを提供する。
【００６４】
アッセイの原理は次の通りである。Ｒ６のフェノール安定化Ｃｏ２＋インスリン６量体溶液は、四面体Ｃｏ２＋配位の為に青色であるが、分解後、該タンパク質溶液は、水或いはＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸：金属イオンの強力なキレート剤）による八面体Ｃｏ２＋の配位で、配位子場理論の結果として、可視波長での光学遷移が無くなるので、無色となる。該ＥＤＴＡ金属イオン封鎖アッセイは、次のように、これらの分光機能を利用する。時刻ｔ＝０に、モル過剰量のＥＤＴＡをＲ６インスリン６量体或いはインスリン類似体６量体溶液に添加する。ＥＤＴＡ自体は６量体に作用してそれから金属イオンを抜き取ることはないが、一時的な６量体分解の過程で解放されたＣｏ２＋はいずれもキレート剤によって補足され、再会合のために利用できなくなるのである。青色（Ｒ６固有のインスリン−結合Ｃｏ２＋の５７４ｎｍにおける正四面体ｄ−ｄ光学遷移）消失速度は、このように、６量体分解動態の光学的証拠を提供する。
【００６５】
４００〜７５０ｎｍの特徴的なスペクトルプロファイルを示す、インスリン・コバルト溶液の平均化トレースは、２ｍＭＥＤＴＡ（図５Ａ−Ｃ）の添加前と添加後測定した。試料を、５０ｍＭトリス（ｐＨ７.４）、５０ｍＭフェノール、および０.２ｍＭＣｏＣｌ２に溶解した。その後、ＮａＳＣＮを最終濃度１ｍＭまで追加した。５７４ｎｍ（２５℃およびｐＨ７.４）で追跡した、２ｍＭＥＤＴＡ添加後の６量体解離の速度式も示す。ＥＤＴＡ抽出前の類似体のスペクトルは実線として表示する。ＥＤＴＡ抽出後、該スペクトルは破線として表示する。野生型は、パネルＡに、ＫＰ−インスリンはパネルＢに、４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンはパネルＣに示す。データは各試料について時間ゼロに正規化した。
【００６６】
一方、ｔ＝０で６量体コバルト錯体のベースライン光吸収スペクトルは、野生型インスリン６量体、ＫＰインスリン６量体、及び４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰインスリン６量体（図５Ａ〜５Ｃ参照）間で類似している。これら各のｄ−ｄ電子遷移の類似した形状と大きさは、前記金属イオンが、野生型と変異型６量体で、類似したＲ６−固有の四面体配位部位にあることを示唆している。それは、４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンが金属イオン媒介会合に適格であり、それゆえ、亜鉛ベースの製剤に有用なことを意味するので、この結果は重要である。
【００６７】
２ｍＭＥＤＴＡ添加後、５７４ｎｍ（２５℃およびｐＨ７.４）で追跡した６量体解離の動力学は、野生型と変異型の６量体がＥＤＴＡ介在Ｃｏ２+封鎖速度に著しい違いを見せることを示す。予想通り、野生型６量体は、最高の動力学的安定性（図５Ｄの実線）を示し、次いでＫＰ−インスリン（図５Ｄの一点鎖線）および４−Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリン（図５Ｄの点線）が続く。それぞれの半減期は４８１秒（野生型）、３６３秒（ＫＰ−インスリン）、６６秒（４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリン）である。パラ−クロロ芳香族置換によって誘導される加速の程度は、リスプロインスリン（Ｈｕｍａｌｏｇ（商標））の「ＫＰスイッチ（切替）」関連の程度よりも大きい。皮下注射部位からの亜鉛イオンの拡散は、ＥＤＴＡ封鎖アッセイにおけるコバルトイオンのインビトロ封鎖に類似するので、これらの知見から、４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンが著しい吸収の加速を示すものと予測される。
【００６８】
野生型インスリン（Ｈｕｍｕｌｉｎ（商標）；ＥＬｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏ．）とＫＰ−インスリン（Ｈｕｍａｌｏｇ（商標）と、に比して、４−Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンの薬物動態（ＰＫ）、薬物動力学（ＰＤ）特性、及びその効力を青年期のヨークシャーファーム（Ｙｏｒｋｓｈｉｒｅ ｆａｒｍ）の豚（体重２５〜４５ｋｇ）で調べた。野生型とＫＰ−インスリンは、製造元（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏ．）から提供を受けたまま、Ｕ−１００強度で使用した。前記４−Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンは、野生型及びＫＰ−インスリン製品のそれと同様なタンパク質対亜鉛イオンの比率でＬｉｌｌｙ希釈液に調剤した；その強度は、Ｕ−８７であった。動物は、試験日にそれぞれＴｅｒａｚｏｌで麻酔導入し、次いで、Ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅで全身麻酔した。各動物に気管挿管し、酸素飽和度と終末呼気ＣＯ２とを連続的にモニターした。内因性の膵臓α−およびβ−細胞分泌をブロックする為に、クランプ調査開始前約３０分と、その後２時間毎に、酢酸オクトレオチド（ｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ）を豚に皮下注射（４４μｇ/ｋｇ）により投与した。静脈カテーテルを設置し、１０％ブドウ糖輸液でベースライン正常血糖値を確立してから、カテーテルを介してインスリンを静脈注射で投与した。末梢インスリン媒介による、グルコース取り込みを定量化する為に、可変流量でグルコース注入を行い、血中グルコース濃度を約８５ｍｇ/ｄｌに維持するようにした。グルコース注入速度がインスリン投与以前のベースラインに戻るまで、前記グルコース注入は、通常５〜８時間必要であった。グルコース濃度は１０分毎、Ｈｅｍｏｃuｅ２０１ポータブルグルコース分析器で測定した（機器の誤差：１.９％）。グルコース・クランプ法のコンピュータ化プロトコルは、Ｍａｔｔｈｅｗｓらの報告通りであった。インスリンアッセイのための血液試料２ｍｌも次のスケジュールに従って取得した：インスリン送達後０〜４０分：５分間隔；５０〜１４０分：１０分間隔；１６０分〜ＧＩＲがベースラインに戻るまで：２０分間隔。ＰＫ／ＰＤの分析のために、２０分間の移動平均カーブフィットとフィルタが適用された。ＰＤは、初期最大半量到達時間、後期最大半量到達時間、最大効果到達時間、およびベースライン上の曲線下のエリア（ＡＵＣ）として測定された。これらの分析のそれぞれについては、生データではなくて近似曲線を使用した。３頭の豚では、それぞれ３組の試験を行った。これらの試験の結果を図６〜９に提供する.
４−Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリン（図６では、４−Ｃｌ−リスプロインスリンと短縮）は、ＫＰ−インスリン或いは野生型インスリンよりも大幅に低下した、延長後期の"尾部"を示すことが見出された。インスリンの作用遮断が改善した事は、遅発型食後低血糖症に関して潜在的な臨床的有益性を示唆する。
【００６９】
図７は、豚での薬力学試験２０組を要約し、後期最大半量到達時間に於いて、ＫＰ−インスリンより、４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンが、０.０５Ｕ/ｋｇ、０.１Ｕ/ｋｇ、０.２Ｕ/ｋｇ、０.５Ｕ/ｋｇ、及び１Ｕ/ｋｇの５つの異なる投与量レベルで有意な改善を実証する。
【００７０】
図８は、豚での薬力学試験１４組を要約し、初期最大半量到達時間に於いて、ＫＰ−インスリンより、４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンが、０.０５Ｕ/ｋｇ、０.１Ｕ/ｋｇ、０.２Ｕ/ｋｇの３つの異なる投与量レベルで、改善を示唆する。
【００７１】
図９は、曲線下面積（ＡＵＣ）で測定した、４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンの相対的な効力をＫＰインスリンのそれと比較した、対応１０組の薬力学研究を要約し、その中で、４−Ｃｌ−ＫＰの平均効力のわずかな減少は、統計的に有意でないことが見出された（ｐ＝０.２２）。類似の製剤配合条件下（フェノール及びメタクレゾールで安定化した、亜鉛インスリン６量体或いは亜鉛インスリン類似体６量体）で、野生型インスリンとＫＰ−インスリン（リスプロ−インスリン）との関連で、４−Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンの薬物動態（ＰＫ）および薬力学（ＰＤ）の特性は、曲線下エリア（ＡＵＣ）法で測定した、４−Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンの効力が、野生型インスリン及びＫＰ−インスリンのものと類似していたことを示す。
【００７２】
患者を治療する方法は、当該患者に塩素化−ＰｈｅＢ２４置換インスリン類似体を投与することを含む。一例では、前記インスリン類似体は、４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰインスリンである。前記インスリン類似体は、選択的にＡ８位にヒスチジン、リジン或いはアルギニン置換を含み得る。別の例では、前記塩素置換インスリン類似体は、さらに、インスリン分子内の他の位置に、人体での前記類似体の作用速度を変更するように設計された１つ或いはそれ以上の置換を含む。なお別の例では、前記インスリン類似体は、外付け或いは植込み型インスリンポンプで投与される。同時係属中の米国特許出願番号１２／４１９１６９により完全に記載されている通り、本発明のインスリン類似体は、また、前記Ｂ鎖のＣ−末端およびＡ鎖のＮ末端のとの間のテザー（係留）のような、他の修飾を含み得る。
【００７３】
医薬組成物は、係るインスリン類似体を含み得、選択的に亜鉛を含み得る。亜鉛イオンは、インスリン類似体の６量体につき２．２〜３．０モル比のレベルで、当該組成物中に含め得る。当該製剤において、インスリン類似体濃度は、通常、約０．１〜約３ｍＭであって、インスリンポンプの貯槽では、３ｍＭ以下の濃度を使用し得る。食事時のインスリン類似体の修飾は、（ａ）Ｈｕｍｕｌｉｎ（登録商標）（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏ．）、Ｈｕｍａｌｏｇ（登録商標）（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏ．）、Ｎｏｖａｌｉｎ（登録商標）（Ｎｏｖｏ−Ｎｏｒｄｉｓｋ）及びＮｏｖａｌｏｇ（登録商標）（Ｎｏｖｏ−Ｎｏｒｄｉｓｋ）及びヒトでの使用が現在承認されている他の速効インスリン製剤の「通常の」製剤、（ｂ）上記および他のインスリン類似体の「ＮＰＨ」製剤、並びに（ｃ）係る製剤の混合物について記載のように調剤し得る。前述したように、その細繊維形成に対する抵抗の向上の為、４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４含有インスリン類似体は亜鉛の存在なしで調剤し、前記類似体の速効性を最大限にし得ると思われる。しかし、また、亜鉛の存在下でも、前記４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４含有インスリン類似体は、６量体から２量体および単量体に十分に速く解離するので、速効性インスリン類似体としても考慮されるべきと考えられる。
【００７４】
賦形剤は、グリセロール、グリシン、他の緩衝剤、及び塩、並びにフェノールおよびメタ−クレゾールなどの抗菌保存剤を含み得、後者の保存剤は、インスリン６量体の安定性を強化することが既知である。係る医薬組成物は、生理学的有効量の前記組成物を患者に投与することにより、真性糖尿病或いは他の病状を有する患者を治療するのに使用し得る。
【００７５】
少なくとも、Ｂ２４位に塩素化フェニルアラニンを有するインスリンのＢ鎖をコードする配列を含むインスリン類似体をコードするポリペプチドをコードする配列を含む核酸も想定される。これは、終止コドン（アンバーコドンＴＡＧのような）をＢ２４位に導入することで達成できるのであって、抑制（サプレッサー）ｔＲＮＡ（アンバーコドンを用いる場合はアンバーサプレッサー）及び以前に記載されたような（Ｆｕｒｔｅｒ、１９９８、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．７：４１９〜４２６；Ｘｉｅら、２００５、Ｍｅｔｈｏｄｓ．３６：２２７〜２３８）、前記終止コドンに応答してポリペプチド中に非標準的なアミノ酸を導入する対応ｔＲＮＡ合成酵素を併用して行う。特定の配列は、核酸配列が導入される種の好ましいコドン使用に依存し得る。該核酸は、野生型インスリンの他の修飾体もコードし得る。前記核酸配列は、該ポリペプチド或いは修飾されたプロインスリン類似体の他の位置に無関係の置換或いは伸長を含む、修飾されたＡ鎖或いはＢ鎖配列をコードし得る。該核酸は、発現ベクターの一部分であり得るし、また、このベクターは、大腸菌細胞系のような原核宿主細胞、或いはＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｃｉａｅ）或いはピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓ）株、或いは細胞系のような真核細胞系などの宿主細胞に挿入し得る。
【００７６】
例えば、酵母ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓ）および他の微生物中のＢ鎖ポリペプチドの発現に向けるように、合成遺伝子を合成し得ることが想定される。Ｂ２４位に終止コドンを用い、その位置に塩素化フェニルアラニンを導入する目的でのＢ鎖ポリペプチドのヌクレオチド配列は、次のいずれか或いはその変異型であり得る：
（ａ）ヒトコドン優先性を持つ：TTTGTGAACCAACACCTGTGCGGCTCACACCTGGTGGAAGCTCTCTACCTAGT
GTGCGGGGAACGAGGCTAGTTCTACACACCCAAGACC (配列ＩＤ番号１１)
（ｂ）ピチアコドン優先性を持つ
TTTGTTAACCAACATTTGTGTGGTTCTCATTTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTT
TGTGGTGAAAGAGGTTAGTTTTACACTCCAAAGACT (配列ＩＤ番号１２)
【００７７】
同様に、ヒトコドン優先性を有し、Ｂ２４位に終止コドンを用いてその位置に塩素化化フェニルアラニンを導入する目的の、全長プロインスリンｃＤＮＡは、配列番号１３の配列を有し得る。
TTTGTGAACC AACACCTGTG CGGCTCACAC CTGGTGGAAG CTCTCTACCT AGTGTGCGGG GAACGAGGCT AGTTCTACAC ACCCAAGACC CGCCGGGAGG CAGAGGACCT GCAGGTGGGG CAGGTGGAGC TGGGCGGCGG CCCTGGTGCA GGCAGCCTGC AGCCCTTGGC CCTGGAGGGG TCCCTGCAGA AGCGTGGCAT TGTGGAACAA TGCTGTACCA GCATCTGCTC CCTCTACCAG CTGGAGAACT ACTGCAACTA G (配列ＩＤ番号１３)
【００７８】
同様に、ヒトコドン優先性を有し、Ｂ２４位に終止コドンを用いてその位置に塩素化フェニルアラニンを導入する目的であり、Ｐ．パストリスに好ましいコドンを有する、全長プロインスリンｃＤＮＡは、配列ＩＤ番号１４の配列を有し得る。
TTTGTTAACC AACATTTGTG TGGTTCTCAT TTGGTTGAAG CTTTGTACTT GGTTTGTGGT GAAAGAGGTT AGTTTTACAC TCCAAAGACT AGAAGAGAAG CTGAAGATTT GCAAGTTGGT CAAGTTGAAT TGGGTGGTGG TCCAGGTGCT GGTTCTTTGC AACCATTGGC TTTGGAAGGT TCTTTGCAAA AGAGAGGTAT TGTTGAACAA TGTTGTACTT CTATTTGTTC TTTGTACCAA TTGGAAAACT ACTGTAACTA A （配列ＩＤ番号１４）
【００７９】
前述の開示に基づいて、塩素置換インスリン類似体が上述した目的を達成するのは、もう明らかのはずである。即ち、これらのインスリン類似体は、向上した熱力学的安定性、細繊維形成への耐性、および血糖値を低下させる効力を示す。塩素置換フェニルアラニンを含むインスリン類似体は、またインスリン様成長因子（ＩＧＦＲ）への交差反応性も低下させる。従って、如何なる明白な変形形態も特許請求に係わる発明の範囲内に含まれ、また、それ故に特定の構成要素の選択は、本明細書に開示、記載された本発明の精神から逸脱することなく決定できることを理解すべきである。
【００８０】
以下の文献は、本明細書に記載の試験およびアッセイ方法が当業者に理解されることを実証するために引用する。
【００８１】
Furter, R., 1998. Expansion of the genetic code: Site-directed p-fluoro-phenylalanine incorporation in Escherichia coli. Protein Sci. 7:419-426.
Matthews D.R., Hosker J.P. 1989. Unbiased and flexible iterative computer program to achieve glucose clamping. Diabetes Care. 12: 156-9.
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Wang, Z.X. 1995. An exact mathematical expression for describing competitive biding of two different ligands to a protein molecule FEBS Lett. 360: 111-114.
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Whittaker, J., and Whittaker, L. 2005. Characterization of the functional insulin binding epitopes of the full length insulin receptor. J. Biol. Chem. 280: 20932-20936.
Xie, J. and Schultz, P.G. 2005. An expanding genetic code. Methods. 36: 227-238.
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００９年１２月１１日付で出願した係属中の米国仮出願第６１/２８５、９５５号の利益を主張する。
【０００２】
政府援助研究又は開発に関連する供述
本発明は、助成金番号ＤＫ４０９４９およびＤＫ０７４１７６下に国立衛生研究所により授与された協力協定の基に政府の支援でなされた。米国政府は、本発明に一定の権利を有し得る。
【０００３】
本発明は、耐熱分解性ポリペプチドに関連する。特に、本発明は、熱的に安定したインスリン類似体に関連する。さらに特に、本発明は、前記インスリン類似体のアミノ酸中に塩素元素を導入することで化学的、熱的に安定化したインスリン類似体に関連する。塩素はハロゲンの一つに分類され、その原子半径、電気陰性度、部分電荷の立体電子分布、および分子中の隣接原子の立体電子特性に及ぼす伝達効果によって、タンパク質類の一般成分とは区別されるものである。
【背景技術】
【０００４】
治療薬とワクチンを含む、超安定タンパク質の改変（ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）は、電気や冷凍が安定して利用できない発展途上国世界の地域で広範な社会的利益をもたらし得る。熱劣化の影響を受けやすい治療用タンパク質の１例として、インスリンがあげられる。その化学的および物理的な劣化が投げ掛ける課題は、アフリカおよびアジアでさし迫った真性糖尿病の流行によって深刻になっている。インスリン類似体の化学的劣化速度は、その相対的安定性と逆相関しているので、超安定化製剤の設計は、係る課題地域でのインスリン補充療法の安全性と有効性を向上し得る。
【０００５】
有機小分子においてハロゲン置換が有用なことがあるのは、薬化学で知られている。フッ素官能基は、コレステロール生合成の阻害剤である、アトルバスタチン（ａｔｏｒｖａｓｔａｔｉｎ）（Ｌｉｐｉｔｏｒ（商標））、うつ病やその他の情動障害の治療に使用される、選択的セロトニン再導入阻害剤である、フルオキセチン塩酸塩（Ｆｌｕｏｘｅｔｉｎ（Ｐｒｏｚａｃ（商標））などのように広く処方されている小分子の有効性にとって重要である。フッ素の原子半径は、水素のと同様であるが、その大きな誘起効果は、これらの薬剤の立体電子的性質を変え、その結果生物学的活性を向上させるのである。類似した物理有機化学上の考慮は、塩素のような大きいハロゲン原子の導入に関連する。小分子モンテルカストナトリウム（ｍｏｎｔｅｌｕｋａｓｔ ｓｏｄｉｕｍ）（Ｓｉｎｇｕｌａｉｒ（商標））は、その医薬品の特性が塩素原子の共有結合の導入で強化されたロイコトリエン（ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅ）阻害剤である。さらに、インスリン類似体でのフッ素置換アミノ酸の使用は、２００９年７月３１日出願の国際特許出願ＰＣＴ/ＵＳ第２００９/５２４７７号に提供されている。
【０００６】
修飾アミノ酸中への塩素原子の部位特異的導入によるタンパク質の化学的、物理的、および生物学的特性の調節に就いては、フッ素原子の導入による上記効果に比して、あまりよく科学文献に特性が記述されていない。
【０００７】
芳香族側鎖は、隣接する芳香環だけでなく、正或いは負の静電ポテンシャルの他の発生源を含む、様々の弱い極性相互作用に関係し得る。例としては、ペプチド結合中の主鎖カルボニル基とアミド基が含まれる。
【０００８】
インスリンの投与は、永年真性糖尿病の治療として確立されている。インスリンは脊椎動物の代謝において中心的な役割を果たす小さな球状蛋白質である。インスリンは、２１残基を含有するＡ鎖および３０残基を含有するＢ鎖である、２つの鎖を含有する。当該ホルモンは、膵臓β細胞中にＺｎ２+で安定化された６量体として貯蔵されるが、血液中ではＺｎ２+不含単量体として機能する。インスリンは、接続領域（３５残基）が、Ａ鎖のＮ末端残基にＢ鎖のＣ末端残基（残基Ｂ３０）を結びつける単鎖前駆体である、プロインスリンの産出物である（図１Ａ）。プロインスリンの構造は、決定されていないが、様々な証拠は、それがインスリン様のコアと無秩序の連結ペプチド（図１Ｂ）から成ることを示している。３つの特定のジスルフィド結合（Ａ６−Ａ１１、Ａ７−Ｂ７、およびＡ２０−Ｂ１９、図１Ａおよび１Ｂ）の形成は、粗面小胞体（ＥＲ）でのインスリンの酸化的フォールディングと連携していると考えられている。プロインスリンは、ＥＲからゴルジ（Ｇｏｌｇｉ）体へ排出後直ぐに会合して、水溶性のＺｎ２+−配位６量体を形成する。内部タンパク質分解による消化およびインスリンへの変換は、未熟な分泌顆粒で起こり、次いで形態学的縮合が起こる。成熟した貯蔵顆粒内の亜鉛インスリン６量体の結晶配列は、電子顕微鏡（ＥＭ）により可視化されている。
【０００９】
生理学的貯蔵形態である、Ｚｎ２+配位インスリン６量体については、広範囲なＸ線結晶学的研究が行われてきた。インビトロで複数の結晶形態が記載され、Ｔ６、Ｔ３Ｒｆ３及びＲ６と命名された、３個の構造系統が定義されている。これらの６量体では、２個のＺｎイオンが６量体中心軸に沿って位置すると考えられ、各３個のヒスチジン（ＨｉｓＢ１０）が配位し、更なる低親和性Ｚｎ結合部位が、いくつかの結晶形態で観察されている。Ｔ−状態プロトマーは、溶液中のインスリン単量体の構造に似ている。Ｒ−状態プロトマーは、Ｂ鎖の二次構造にある変化を示し、中央のα−ヘリックスは、Ｂ１（Ｒ状態）或いはＢ３（擦り切れたＲｆ状態）にまで延長している。
【００１０】
インスリンは、血流中単量体として機能するが、それにもかかわらず、この単量体こそが最も細繊維維形成しやすく、化学的分解の大抵の形態であると考えられている。ＮＭＲで溶液中の特徴を求めた、インスリン単量体の構造は、図１Ｄに示されている。Ａ鎖は、Ｎ末端ヘリックス（残基Ａ１〜Ａ８）、非正規のターン（Ａ９〜Ａ１２）、第２α−ヘリックス（Ａ１２〜Ａ１８）、およびＣ末端延長（Ａ１９〜Ａ２１）から成る。Ｂ鎖は、Ｎ末端アーム（Ｂ１〜Ｂ６）、β−ターン（Ｂ７〜Ｂ１０）、中央α−ヘリックス（Ｂ９〜Ｂ１９）、β−ターン（Ｂ２０〜Ｂ２３）、β−ストランド（Ｂ２４〜Ｂ２８）、および柔軟なＣ−末端残基Ｂ２９〜Ｂ３０を含む。この二つの鎖は、３個のジスルフィド架橋（システイン、Ａ６〜Ａ１１、Ａ７〜Ｂ７、およびＡ２０〜Ｂ１９）によって安定化した、緻密な球状ドメインを形成するように纏まる（ｐａｃｋ）。
【００１１】
通常のインスリンの吸収は、亜鉛―インスリン６量体の動力学的寿命で限定されていて、毛細血管の内皮細胞ライニングを介して通過できる為にはより小さな２量体および単量体に分解しなければならない。Ｈｕｍａｌｏｇ（登録商標）及びＮｏｖｏｌｏｇ（登録商標）の設計の基にある本質的な考え方は、分解を加速することである。これは古典的な二量体形成面（Ｃ末端反平行β−シート）を不安定にすることで達成される。Ｈｕｍａｌｏｇ（登録商標）は、ＩＧＦ−Ｉの配列を模倣する反転である、ＰｒｏＢ２８→ＬｙｓおよびＬｙｓＢ２９→Ｐｒｏ置換を含んでいる。Ｎｏｖｏｌｏｇ（登録商標）はＰｒｏＢ２８→Ａｓｐ置換を含んでいる。該置換は二量体化を阻害するが、前記類似体は、フェノール或いはメタ−クレゾール安定化亜鉛６量体の会合能力がある。この会合は、前記類似体がバイアル中で細繊維形成しないように保護するが、皮下注射後、前記フェノール（或いはｍ−クレゾール）と亜鉛イオンとが拡散除去されるにつれて、前記６量体は、急速に解離する。これらの類似体の不安定性は、患者或いは医療提供者による希釈後にその有効期限が短くなる原因となる。インスリン類似体がＨｕｍａｌｏｇ（登録商標）の変異形２量体−関連β−シートを保持しつつ、インスリン単量体の本質的な安定性を強化するのは有用であろう。
【００１２】
貯蔵時に亜鉛インスリン６量体を使用することは、既知であり、バイアルやポンプの貯留タンク内での製剤の物理的劣化、化学的劣化を遅延させるための古典的な戦略を代表する。前記亜鉛インスリン６量体は毛細血管中に瞬時に通過するには大きすぎるため、皮下注射後のインスリンの吸収速度は、６量体がより小さい２量体および単量体単位に解離するのに必要な時間で限定される。したがって、インスリン類似体が（ａ）高いタンパク質濃度（バイル或いはポンプ内のように）で、６量体が十分会合出来、しかも（ｂ）前記２量体界面では十分不安定化し、加速化した分解を示し、その為当該皮下デポー（ｄｅｐｏｔ）から超高速で吸収が予期されるという両方の能力があれば有利であろう。これらの構造上の目標は、安定性（貯蔵時）と不安定性（注入後）との間の紙一重の所を行くことである。
【００１３】
インスリン中のアミノ酸置換が熱力学的安定性および生物学的活性に及ぼす影響について検討されてきた。安定性と活性の間には、一致した関係が見られていない。熱力学的安定性を向上させる置換のあるものは、インスリン受容体への結合も強化する一方、安定性を向上させる他の置換は、そのような結合を妨げるのである。ＴｈｒＡ８をいくつかの他のアミノ酸で置換する効果が、野生型ヒトインスリンで検討され、又、Ｂ鎖中の３個の無関係な置換（ＨｉｓＢ１０→Ａｓｐ、ＰｒｏＢ２８→Ｌｙｓ、およびＬｙｓＢ２９→Ｐｒｏ）を含む、改変インスリン単量体の場合について報告されている。置換の当該分野では、吸収の経時変化を加速或いは遅延させる例も知られている。係る置換（例えばＮｏｖａｌｏｇ（登録商標）におけるＡｓｐＢ２８およびＨｕｍａｌｏｇ（登録商標）などにおける[ＬｙｓＢ２８、ＰｒｏＢ２９]）は、より迅速な細繊維形成と、より低い物理的安定性とに関連し得るし、またしばしば関係がある。事実、ある研究に於いてＡｓｐＢ２８インスリンとＡｓｐＢ１０インスリンとを含む、ヒトインスリン類似体１０種のシリーズで、細繊維形成のし易さが試験された。１０種は全てが、ｐＨ７．４および３７℃で、ヒトインスリンより細繊維形成しやすいことが判った。この１０種の置換は、当インスリン分子の多様な部位にあって、古典的な熱力学的安定性の変化の幅広い違いと関連する可能性がある。一連の効果が観察されてきたが、活性と熱力学的安定性間には、相関関係が存在しない。
【００１４】
インスリンは化学合成も半合成も極めてし易い、小さな球状タンパク質であり、それで非標準的な側鎖の導入が容易になる。インスリンは３個のフェニルアラニン残基（Ｂ１、Ｂ２４、及びＢ２５位）と、Ｂ２６位に構造的に類似のチロシンとを含有する。ＰｈｅＢ２４の芳香環は、脊椎動物のインスリン及びインスリン様成長因子間に保存されていて、Ｂ鎖の超二次構造を安定させるよう、疎水性コア（ただし内部ではなく）に対して纏まって（ｐａｃｋ）いる。ＰｈｅＢ２４は、古典的な受容体結合表面に位置し、受容体結合時の立体構造（コンフォメーション）の変化を誘導すると提案されている。ＰｈｅＢ２５は、インスリン単量体の表面から突出している一方、ＴｙｒＢ２６は、前記コアの一端に於いて脂肪族側鎖（ＩｌｅＡ２、ＶａｌＡ３およびＶａｌＢ１２）付近に纏まって（ｐａｃｋ）いる。Ｂ２４に関連する立体構造の変化は、ＰｈｅＢ２５およびＴｙｒＢ２６がインスリン受容体の別個のドメインと接触出来るようにするものと提案する。
【００１５】
蛋白質細繊維形成の現在の理論は、細繊維形成のメカニズムが部分的に折り畳まれた中間体状態を介して進行し、次いで凝集し、アミロイド形成的核を形成すると仮定する。この理論では、天然状態を安定させるアミノ酸置換は、部分的に折り畳まれた中間状態を安定させ得るか、或いはさせ得ず、亦、天然状態と中間状態間の自由エネルギー障壁を増加（或いは減少）させ得るか、或いはさせ得ないことが可能である。したがって、現在の理論は、当該インスリン分子内の特定のアミノ酸置換が細繊維形成のリスクを増加或いは減少させる傾向が極めて予測不能であることを示している。
【００１６】
糖尿病治療用のインスリンおよびインスリン類似体の製造、貯蔵、及び使用における重大な問題である細繊維形成は、高温、低ｐＨ、攪拌、或いは尿素、グアニジン、エタノール共溶媒、或いは疎水性表面の存在下で促進される。現行の米国医薬品規制は、細繊維形成が１％或いはそれ以上のレベルで発生した場合、インスリンは破棄すべしと定めている。細繊維形成は、高温で促進されるので、糖尿病患者は、最適には、使用前には、インスリンを冷蔵しておかなければならない。インスリン或いはインスリン類似体は、インスリン又はインスリン類似体を少量定期的に患者の体内に注入する体外インスリン・ポンプを利用する糖尿病患者にとって特に問題となり得る。係る使用法では、前記インスリン又はインスリン類似体は、ポンプ装置内で冷蔵保存されていなく、インスリンの細繊維形成により、体内にインスリン或いはインスリン類似体注入用カテーテルの閉塞をもたらし得るので、予測不能な血糖値の変動を招き、危険な高血糖症さえ引き起こす可能性がある。少なくとも最近のある報告は、リスプロインスリン（野生型ヒトインスリンで残基Ｂ２８とＢ２９がこれらの位置を入れ替えた類似体、商品名Ｈｕｍａｌｏｇ（登録商標））が特に細繊維形成し易く、インスリンポンプ・カテーテルの閉塞を起こし得ることを示している。
【００１７】
インスリン細繊維形成は、インスリンが１〜３箇月間高濃度で、しかも体外ポンプのような常温ではなく生理学的温度（すなわち３７℃）でインプラント内に収納されている、植込み式（インプランタブル）インスリンポンプにおいては、さらにより大きな問題である。さらに、通常の運動によって引き起こされる攪拌も、またインスリンの細繊維形成を加速する傾向となるであろう。インスリン細繊維形成の可能性が増大するにもかかわらず、植込み型インスリンポンプは、係るシステムの可能性のある利点のために、まだ研究活動の題目となっている。これらの長所は、全身循環系を介して患者にインスリンを提供する皮下注射より密接に、インスリンの正常な生理学的送達を真似た門脈循環器系へのインスリンの腹腔内への送達を包含する。腹腔内送達は、注射部位が変われば吸収と分解が変わり得る皮下注射に比べて、より迅速で且つ着実にインスリンの吸収を提供する。植込み型ポンプを介するインスリンの投与は、また、患者にとってより便利になる可能性がある。例えば、貯留タンクへ界面活性剤を添加することなどで細繊維形成を防止するための努力は、いくらかの改善をもたらしたが、これまで、これらの改善は、厳密な監視下の臨床試験以外には、植え込みインスリンポンプを信頼して糖尿病患者に使用を認めるには不十分だと考えられている。
【００１８】
上述したように、発展途上国世界は、医薬及びワクチンの安全な保管、輸送、及び使用に関連する課題に直面している。この課題は、電気と冷蔵に着実にアクセスできない、アフリカ及びアジア地域での、温度に敏感なインスリン製剤の使用を悪化させるが、さらに該発展途上国世界の糖尿病の目下の流行によって、課題が深刻化する可能性が高い。インスリンは、２５℃を超える温度で、１０℃上昇毎に分解速度が１０倍増、或いはそれ以上を示すので、指針は、３０℃未満の温度での貯蔵、好ましくは冷蔵保存するよう求めている。より高温でインスリンは、化学的劣化（例えば、イソ−アスパラギン酸の形成、ジスルフィド結合の再配列、及び共有結合ポリマーの形成などの共有結合構造の変化）と物理的劣化（非天然凝集及び細繊維形成）との両方を受ける。
【００１９】
インスリンのアミノ酸置換は、蛋白質を安定化するが、インスリン受容体（ＩＲ）への結合及びインスリン様成長因子（ＩＧＦＲ）の相同受容体への交差（クロス）結合を増大するので、発癌リスクを付与すると記載されている。当分野で知られている例は、アスパラギン酸によるＨｉｓＢ１０の置換が挙げられる。ＡｓｐＢ１０インスリンは、安定性と薬物動態とに関して有利な薬学的特性を示すが、その増大した受容体−結合特性は、Ｓｐｒａｇuｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの腫瘍形成と関連していた。ＩＲ及びＩＧＦＲへの結合をヒトインスリンのそれに似たレベルまでに減らすのに、ＡｓｐＢ１０−インスリン或いは関連類似体に導入し得る、Ａ或いはＢ鎖に可能な置換が多くあるが、係る置換は、一般にインスリン（或いはインスリン類似体）の安定性を悪化し、その化学的および物理的劣化し易さを高める。受容体―結合親和性の"調整"を可能にし、同時に細繊維形成に対する安定性及び抵抗力を高める、インスリンおよびインスリン類似体の修飾方法を発見することは、望ましいであろう。係る応用法では、その受容体―結合特性において超活性な類似体の発癌可能性を相殺するように、ＩＲおよびＩＧＦＲへの結合を種々の程度に減らす一組の安定化の修飾が必要となるであろう。
【００２０】
したがって、貯蔵中安定であるが、同時に即効性のものを含めて、代替インスリン類似体の必要性がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２１】
したがって、本発明の一態様は、アミノ酸の塩素置換によって改善された安定性のような特性変化をもたらし、さらに、対応する非塩素系インスリン或いは類似体の生物学的活性の少なくとも一部を保持するインスリン類似体を提供することである。
【００２２】
さらに、或いは代替として、本発明の一態様は、速効性インスリンであるが従来の速効型インスリン類似体に勝る、改善した安定性を有するインスリン類似体を提供することである。
【００２３】
一般に、本発明は、塩素化アミノ酸を導入するＢ−鎖のポリペプチドを含むインスリン類似体を提供する。一実施形態では、該塩素化アミノ酸は、Ｂ２４位におけるフェニルアラニンである。特定の一実施態様において、前記塩素化フェニルアラニンは、パラ−モノクロロ−フェニルアラニンである。さらに、或いは代替物では、前記インスリン類似体は、ヒトインスリン類似体のような、哺乳動物のインスリン類似体であり得る。特定の一組の実施形態では、前記Ｂ鎖ポリペプチドは、配列ＩＤ番号４〜８からなる群から選択されるアミノ酸配列と、その３個或いはそれ以下の更なるアミノ酸置換を有するポリペプチドとを、含む。
【００２４】
また、Ｂ２４位でパラ−モノクロロ−フェニルアラニンのような塩素化フェニルアラニンを導入するＢ鎖ポリペプチドを含むインスリン類似体をコードする核酸も提供される。一例において、前記塩素化フェニルアラニンは、核酸配列ＴＡＧのような終止コドンによりコードされる。発現ベクターが係る核酸を含み得、宿主細胞が係る発現ベクターを含み得る。
【００２５】
本発明はまた、患者を治療する方法を提供する。該方法は、インスリン類似体或いはその生理学的に許容される塩の生理学的有効量を患者に投与することを含むが、該インスリン類似体或いはその生理学的に許容される塩は、塩素化アミノ酸を含む。一実施形態では、インスリンＢ鎖は、Ｂ２４位に塩素化フェニルアラニンを導入する。特定の一態様では、前記塩素化フェニルアラニンは、パラ−モノクロロ−フェニルアラニンである。さらに、或いは代替では、インスリン類似体は、例えば、ヒトインスリンの類似体のような哺乳動物のインスリン類似体を含み得る。さらに、前記Ｂ鎖ポリペプチドは、配列ＩＤ番号４〜８からなる群から選択されるアミノ酸配列と、その３個或いはそれ以下の更なるアミノ酸置換を有するポリペプチドとを、含み得る。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１Ａ】図１ＡはＡ−鎖及びＢ−鎖と、隣接する２塩基性切断部位（黒丸）で示される連結領域と、Ｃ−ペプチド（白丸）と、を含むヒトプロインスリン配列の概略図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、インスリン様部分と不規則連結ペプチド（破線）から成る、プロインスリンの構造モデルである。
【図１Ｃ】図１Ｃは、Ｂ鎖中の残基Ｂ２４の位置を示すヒトインスリン配列の概略図である。
【図１Ｄ】図１Ｄは、３つのジスルフィド架橋との関聯でＰｈｅＢ２４の芳香族残基を示すインスリン単量体のリボンモデルである。ＬｅｕＢ１５（黒）及びＰｈｅＢ２４（灰色）の隣接する側鎖が示されている。Ａ鎖とＢ鎖の鎖が示され、ジスルフィド架橋は、球及び棒として示されている。
【図１Ｅ】図１Ｅは、疎水性コアの端にあるポケット内のＰｈｅＢ２４側鎖を示すインスリンの空間充填モデルである。
【図２Ａ】図２Ａは、オルト−モノクロロ−フェニルアラニン（２Ｃｌ−Ｐｈｅ）の図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、メタ−モノクロロ−フェニルアラニン（３Ｃｌ−Ｐｈｅ）の図である。
【図２Ｃ】図２Ｃは、パラ−モノクロロ−フェニルアラニン（４Ｃｌ−Ｐｈｅ）の図である。
【図３Ａ】図３Ａは、単離インスリン受容体（アイソフォーム Ｂ）：ヒトインスリン（三角）、ＫＰ−インスリン（四角）、および４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリン（逆三角）を用いたインビトロ受容体―結合アッセイの結果を示すグラフである。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＩＧＦ−1Ｒ：ヒトインスリン（三角）、ＫＰ−インスリン（四角）、４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリン（逆三角）、および天然ＩＧＦ−I（円）を用いたインビトロ受容体―結合アッセイの結果を示すグラフである。
【図３Ｃ】図３Ｃは、単離インスリン受容体（アイソフォームＢ）：ヒトインスリン（実線）、ＫＰ−インスリン（破線）、４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリン（三角）、４Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリン（四角）を用いたインビトロ受容体−結合アッセイの結果を比較したグラフである。
【図３Ｄ】図３Ｄは、単離インスリン受容体（アイソフォームＢ）：ヒトインスリン（実線）、ＫＰ−インスリン（破線）、４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリン（三角）、４Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリン（四角）を用いたインビトロ受容体―結合アッセイの結果を比較したグラフである。
【図４】図４は、ＳＴＺ誘発糖尿病Ｌｅｗｉｓラットでの４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリン（逆三角）の皮下注射の経時血糖降下作用を、希釈液単独（丸）、ヒトインスリン（ｘ）、及ＫＰ−インスリン（四角）に対して相対的に示すグラフである。
【図５】図５Ａ〜Ｃは、インスリンコバルト溶液の平均トレース（記録図）を示すグラフであって、２ｍＭＥＤＴＡの添加前と後の４００〜７５０ｎｍの特徴的なスペクトル・プロファイルを示す。試料は、５０ｍＭトリス（ｐＨ７.４）、５０ｍＭフェノール、および０.２ｍＭ塩化コバルト（ＣｏＣｌ２）に溶解した。次いで、ＮａＳＣＮを最終濃度１ｍＭになるまで添加した。実線は、ＥＤＴＡ抽出前データを示す。破線は、ＥＤＴＡ抽出後のデータを示す。図Ａ：野生型インスリン；図Ｂ：ＫＰ−インスリン；図Ｃ；４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリン。 図５Ｄは、２ｍＭＥＤＴＡ添加後、５７４ｎｍ（２５℃およびｐＨ７.４）で測定した、６量体解離の動態を示すグラフである。データは、各試料のタイム・ゼロに正規化した：野生型（実線）、ＫＰ−インスリン（破線）、および４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリン（点線）。
【図６】図６は、平均濾過グルコース注入速度対体重ｋｇ当たり０.２単位用量でインスリンＫＰ−インスリン（リスプロインスリン）及び４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリン（４−Ｃｌ−リスプロインスリン）のインスリン投与後の時間とのプロットを示すグラフである。
【図７】図７は、豚の薬理試験２０組をまとめた棒グラフであって、５つの異なる投与量レベルで、ＫＰ−インスリンに比し、４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンが後期最大半量到達時間（１／２Ｔ−ｍａｘ ｌａｔｅ）の有意な改善を実証している。
【図８】図８は、豚の薬理試験１４組をまとめた棒グラフであって、３つの異なる投与量レベルで、ＫＰ−インスリンに比し、４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンが初期最大半量到達時間（１／２Ｔ−ｍａｘ ｅａｒｌｙ）の改善を示唆している。
【図９】図９は、曲線下面積（ＡＵＣ）で測定した、４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンのＫＰインスリンに対する相対的効力を比較した１０組の対応する薬物動態の研究要約であって、４−Ｃｌ−ＫＰの平均効力のわずかな減少は、統計的に有意でないことが判明した（ｐ＝０.２２）。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明は、アミノ酸の塩素置換によってより高い安定性を提供するインスリン類似体であって、対応する非塩素系インスリン或いはインスリン類似体の生物学的活性の少なくとも一部を保持する、当該類似体に関聯する。特に、本発明は、アミノ酸における塩素置換で、より高い安定性を提供するインスリン類似体であって、同時に対応する非塩素系インスリン或いはインスリン類似体の生物学的活性の少なくとも一部を保持する当該類似体を提供する。ある特定の態様において、本発明は、野生型フェニルアラニンのＢ位における置換としてパラ−モノクロロ−フェニルアラニン（４−Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４）残基を含むインスリン類似体を提供する。
【００２８】
しかし、本発明はヒトインスリンおよびその類似体に限定されない。これらの置換は非限定的例により、ブタ、ウシ、ウマ、及びイヌインスリンのような動物インスリンでも実施し得ることも想定される。
【００２９】
さらに、ヒトとインスリンと動物インスリン間の類似性と、過去において人間の糖尿病患者に使用した動物インスリンと、の観点から、インスリンの配列内に他の小規模な修飾、とくに"保存"とみなされる置換を導入し得ることも想定される。例えば、アミノ酸の更なる置換は、本発明から逸脱することなく、類似の側鎖を有するアミノ酸のグループ内で行い得る。これらは中性疎水性アミノ酸：アラニン（Ａｌａ或いはＡ）、バリン（Ｖａｌ或いはＶ）、ロイシン（Ｌｅｕ或いはＬ）、イソロイシン（ＩｌＥ或いはＩ）、プロリン（Ｐｒｏ或いはＰ）、トリプトファン（Ｔｒｐ或いはＷ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ或いはＦ）及びメチオニン（Ｍｅｔ或いはＭ）を含む。同様に、中性の極性アミノ酸は、グリシン（Ｇｌｙ或いはＧ）、セリン（Ｓｅｒ或いはＳ）、スレオニン（Ｔｈｒ或いはＴ）、チロシン（Ｔｙｒ或いはＹ）、システイン（Ｃｙｓ或いはＣ）、グルタミン（Ｇｌｕ或いはＱ）、およびアスパラギン（Ａｓｎ或いはＮ）のグループ内で互いに置換し得る。塩基性アミノ酸は、リジン（Ｌｙｓ或いはＫ）、アルギニン（ＡｒＧ或いはＲ）およびヒスチジン（Ｈｉｓ或いはＨ）を含むと考えられる。酸性アミノ酸は、アスパラギン酸（Ａｓｐ或いはＤ）とグルタミン酸（Ｇｌu或いはＥ）とがある。別途に記載があるか、或いは前後関係から明らかな場合でない限り、本明細書に記載のアミノ酸は、Ｌ−アミノ酸であると考えるべきである。一例では、本発明のインスリン類似体は、本発明の前記４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４置換以外の３個或いはそれ以下の保存的置換を含む。別の例では、本発明のインスリン類似体は、本発明の前記４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４置換以外の１個或いはそれ以下の保存的置換を含む。
【００３０】
本明細書および特許請求の範囲で使用されている場合、インスリンあるいはインスリン類似体中の様々なアミノ酸は、問題にしているアミノ酸残基を記載し、次いで当該アミノ酸の位置を、選択的には上付き文字で記載し得る。問題のアミノ酸の位置は、前記置換が位置するインスリンの前記Ａ鎖或いはＢ鎖を含む。したがって、ＰｈｅＢ２４は、インスリンのＢ鎖の第２４番目のアミノ酸にあるフェニルアラニンを表し、一方ＰｈｅＢ２５は、インスリンのＢ鎖の第２５番目のアミノ酸にあるフェニルアラニンを表す。塩素化アミノ酸は接頭辞「Ｃｌ−」で表し得る。したがって、塩素化フェニルアラニンは、「Ｃｌ−Ｐｈｅ」と省略し得る。フェニルアラニンの場合には、塩素置換基或いはフェニル側鎖上の置換基の位置をさらに前記塩素が結合する炭素の番号で表してもよい。したがって、オルト−モノクロロ−フェニルアラニンは、（図２Ｂに示すように）「２Ｃｌ−Ｐｈｅ」と省略され、メタ−モノクロロ−フェニルアラニンは（図２Ｃに示すように）３Ｃｌ−Ｐｈｅ」と省略され、パラ−モノクロロ−フェニルアラニンは４Ｃｌ−Ｐｈｅとｌ−Ｐｈｅと、省略される。
【００３１】
Ｂ２４にあるフェニルアラニンは、機能性インスリンにおける不変アミノ酸であって、芳香族側鎖を包含する。インスリンにおけるＰｈｅＢ２４の生物学的重要性は、臨床的変異（ＳｅｒＢ２４）がヒトの真性糖尿病を引き起こすことで示される。図１Ｄと図１Ｅに図示のように、亦、理論に束縛されることを望まないが、ＰｈｅＢ２４は、古典的な受容体結合表面で疎水性コアの端に纏まって（ｐａｃｋ）いると考えられている。このモデルは、結晶学的プロトマー（２−Ｚｎ分子１；プロテインデータバンク識別名４ＩＮＳ）に基づいている。ＰｈｅＢ２４は、Ｂ鎖（残基Ｂ２４〜Ｂ２８）のＣ末端β−ストランド内に位置し、中央のα−ヘリックス（残基Ｂ９〜Ｂ１９）に隣接している。芳香環の一面と一端は、ＬｅｕＢ１５とＣｙｓＢ１９により規定される浅いポケット内に位置する。他の面と他の端は溶剤に露出している（図１Ｅ）。このポケットは、部分的に主鎖カルボニル基とアミド基とで囲まれているので、複雑で且つ非対称的な静電気的環境を形成する。
【００３２】
本発明の前記置換は、現行の多くのインスリン類似体のいずれにでも実施し得ることが想定される。例えば、本明細書で提供される塩素化ＰｈｅＢ２４置換は、ヒトインスリンの他にリスプロ（ＫＰ）インスリン、インスリンアスパルト（Ａｓｐａｒｔ）、他の修飾インスリン或いはインスリン類似体、或いは、通常のインスリン、ＮＰＨインスリン、レンテインスリン或いはウルトラレンテインスリンのような様々な医薬製剤内で実施し得る。アスパルト（Ａｓｐａｒｔ）インスリンは、ＡｓｐＢ２８置換を含み、Ｎｏｖａｌｏｇ（登録商標）として販売され、一方リスプロインスリンは、ＬｙｓＢ２８とＰｒｏＢ２９置換とを含み、名称Ｈｕｍａｌｏｇ（登録商標）として知られ、また、その名称で販売されている。これらの類似体は、米国特許第５，１４９，７７７号及び第５，４７４，９７８号に記載されている。これらの類似体は、共に速効性インスリンとして知られている。
【００３３】
理論に束縛されることを望まないが、芳香環のパラ位にある前記塩素置換は二量体インターフェース（４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４）内に埋め込まれていると考えられ、また不利な塩素―芳香族静電双極子モーメントの配置を形成し、当該６量体内において、各二量体界面で対に並置することで、６量体の分解を促進するとも考えられている。これによって、Ｚｎ２＋イオンの存在下に前記インスリン類似体を形成しても、尚且速効性（食事時）インスリン類似体である能力を保持出来ると考えられている。
【００３４】
塩素化−Ｐｈｅ置換は、Ｂ２４におけるものを含めて、従来臨床的に使用されていないが、なお実験的に有用である、以下にもっと詳しく記載のＤＫＰインスリンのようなヒトインスリン類似体にも導入し得るし、或いはＢ鎖のＣ末端残基とＡ鎖のＮ末端残基との間の正常の３５個のアミノ酸連結領域の代わりにインスリンの前記Ａ鎖部分とＢ鎖部分の間に一つのジペプチドリンカー（Ａｌａ−Ｌｙｓ）を含む、プロインスリン類似体であるミニプロインスリンにも導入し得る（図１Ｂ参照）。ＤＫＰ−インスリン（或いはＡｓｐＢ１０を含む、或いはヒトインスリンのそれよりも高い受容体−結合親和性を示す他のインスリン類似体）においてＢ２４位での塩素化―Ｐｈｅの導入は、これらの受容体―結合親和性をヒトインスリンと同様或いはそれ以下までに低下できるので、潜在的に臨床的使用を可能にする。このようにして、インスリン類似体の、分裂促進的なＩＧＦＲへの交差結合も低下し得る。
【００３５】
ヒトプロインスリンのアミノ酸配列を、比較の目的のために、配列ＩＤ番号１として提供する。
配列ＩＤ番号１（プロインスリン）
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn
【００３６】
ヒトインスリンＡ鎖のアミノ酸配列を配列ＩＤ番号２として提供する。
配列ＩＤ番号２ （Ａ鎖）
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn
【００３７】
ヒトインスリンＢＡ鎖のアミノ酸配列を配列ＩＤ番号３として提供する。
配列ＩＤ番号３ （Ｂ鎖）
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr
【００３８】
他の置換のさらなる組合せも、本発明の範囲内である。本発明の置換を、従来既知のインスリン類似体の置換と組み合わせ得ることも想定される。例えば、塩素化Ｐｈｅ置換も導入し得るリスプロインスリン（Ｈｕｍａｌｏｇ（登録商標））のＬｙｓＢ２８、ＰｒｏＢ２９置換を含むヒトインスリンのＢ鎖の類似体のアミノ酸配列を、配列ＩＤ番号４として提供する。同様に、塩素化Ｐｈｅ置換も導入し得る、アスパートインスリンのＡｓｐＢ２８の置換を含むヒトインスリンのＢ鎖の類似体のアミノ酸配列を、配列ＩＤ番号５として提供する。
配列ＩＤ番号４
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Lys-Pro-Thr
配列ＩＤ番号５
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Asp-Lys-Thr
【００３９】
塩素化−ＰｈｅＢ２４置換はまた、残基Ａ４、Ａ８および／或いはＢ１でのＨｉｓ置換を含むヒトインスリンの類似体のような他のインスリン類似体置換との組み合わせにでも、導入し得るが、これは、もっと詳細に、同時係属中の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０７／００３２０号および米国特許出願第１２／１６０，１８７号に記載されている通りであって、その参照により本明細書に組み込まれる。例えば、４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４置換は、［ＨｉｓＡ４、ＨｉｓＡ８］および／或いはＨｉｓＢ１置換と共に、配列ＩＤ番号６で表されるアミノ酸配列を有するインスリン類似体或いはプロインスリン類似体中に存在し得る。
配列ＩＤ番号６
R1-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-R2-Thr-R3-R4-Thr-Xaa0-35-Gly-Ile-Val-R5-Gln-Cys-Cys-R6-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn;
【００４０】
ここで、Ｒ１はＨｉｓ或いはＰｈｅであり；Ｒ２はＴｙｒ或いはＰｈｅであり、Ｒ３はＰｒｏ、Ｌｙｓ或いはＡｓｐであり；Ｒ４はＬｙｓ或いはＰｒｏであり；Ｒ５はＨｉｓ或いはＧｌｕであり；Ｒ６はＨｉｓ或いはＴｈｒであり；Ｘａａ０〜３５は０〜３５個の任意のアミノ酸或いは該アミノ酸鎖中の切れ目（break）であり；
さらに、以下のアミノ酸置換の群から選択される、少なくとも１つの置換が存在する：
Ｒ１はＨｉｓである；
Ｒ６はＨｉｓである；
Ｒ５とＲ６とは共にＨｉｓである。
【００４１】
前記４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４置換は、同時係属中の米国特許出願番号第１２／１６０，１８７に開示のような単一鎖インスリン類似体にも導入することが可能であり、その開示は、この参照により本明細書に組み込まれる。
【００４２】
塩素化−ＰｈｅＢ２４置換は、インスリンＡ鎖中に置換を含むインスリン類似体にも導入し得ることが想定される。例えば、インスリン類似体は、さらに、Ａ８位に野生型のスレオニン（配列ＩＤ番号２参照）の代わりに、配列ＩＤ番号７に示すように、Ａ８位にリジン、ヒスチジン或いはアルギニン置換を含み得る。
配列ＩＤ番号７
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Xaa-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn
[Xaa = His, Arg,或いはLys]
【００４３】
上記したように、４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４置換は、ＡｓｐＢ１０（Ｄ）、ＬｙｓＢ２８（Ｋ）およびＰｒｏＢ２９（Ｐ）置換を含む、ＤＫＰ−インスリンと呼ぶ高活性の改変インスリン単量体中に導入し得る。前記Ｂ鎖の表面上のこれら３個の置換は、２量体および６量体形成を妨害すると考えられる。改変単量体の使用で、安定性アッセイに及ぼす自己会合の混乱効果を回避する。ＤＫＰ−インスリンの構造は、結晶学的プロトマーに密接に似ている。ＤＫＰインスリンのＢ鎖ポリペプチドの配列を、配列ＩＤ番号８として提供する。
配列ＩＤ番号８（ＤＫＰ Ｂ鎖配列）
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-Asp-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Lys-Pro-Thr
【００４４】
ＫＰ−インスリン類似体は、トリプシン−触媒による半合成により調製し、高速液体クロマトグラフィーにより精製し得る。（Ｍｉｒｍｉｒａ，Ｒ．Ｇ．およびＴａｇｅｒｒ，Ｈ．Ｓ．、１９８９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：６３４９〜６３５４）。このプロトコルは、（ｉ）残基（Ｎ）−ＧＦ＊ＦＹＴＫＰＴを表す合成オクタペプチド（修飾した残基（Ｆ＊）と「ＫＰ」置換（下線）とを含む；配列ＩＤ番号９）と、（ｉｉ）切断型類似体デスオクタペプチド［Ｂ２３〜Ｂ３０］−インスリン（ＤＯＩ：配列ＩＤ番号１５）とを用いる。オクタペプチドは、ＰｒｏＢ２８およびＬｙｓＢ２９（斜体）の相互交換により、野生型Ｂ２３〜Ｂ３０配列（ＧＦＦＹＴＰＫＴ；配列ＩＤ番号１０）とは異なるので、トリプシン処理中、リジンε−アミノ基の保護は、必要ない。要するに、このプロトコルでは、デスオクタペプチド（１５０ｍｇ）およびオクタペプチド（１５０ｍｇ）を、１０ｍＭ酢酸カルシウムおよび１ｍＭエチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）を含有するジメチルアセトアミド／１，４−ブタンジオール／０．２Ｍトリス酢酸（ｐＨ８）（３５：３５：３０、ｖ／ｖ、４ｍｌ）の混合物中に溶解する。ＤＯＩに対して５倍モル過剰のオクタペプチドで、トリプシンの逆反応(タンパク質分解方向）の防止を基質飽和によって確実にするのである。最終ｐＨを、０．１ｍｌのＮ−メチルモルホリンを用いて７．０に調整する。該溶液を１２℃まで冷却し、１．５ｍｇのトリプシンを加え、１２℃で２日間インキュベートする。追加の１．５ｍｇのトリプシンを、２４時間後に加える。反応物を、０．１％トリフルオロ酢酸を用いて酸性にし、分取逆相ＨＰＬＣ（Ｃ４）により精製する。生成物は、次いで、マトリクス支援レーザ脱着／イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ）を使用して確証し得る。固相合成の一般的なプロトコルは、記載されている通りである（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら、１９８２．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２１：５０２０〜５０３１）。９−フルオレン−９−イル−メトキシカルボニル（Ｆ−ｍｏｃ）保護フェニルアラニン類似体は、Ｃｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（イリノイ州 Ｗｏｏｄ Ｄａｌｅ）から入手し得る。
【００４５】
円二色性（ＣＤ）スペクトルは、Ａｖｉｖ分光旋光計を用いて４℃および２５℃で取得し得る（Ｗｅｉｓｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９：１５４２９〜１５４４０）。試料は、約２５μＭのＫＰ−インスリン或いは類似体を、５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．４）中に含有し得る。試料は、２５℃でのグアニジン−誘導による変性研究用に５μＭに希釈される。アンフォールディングの自由エネルギーを導き出すために、変性遷移を、非線形最小２乗法により、Ｓｏｓｎｉｃｋらの、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３１７：３９３〜４０９に記載されているように、２相モデルにフィットさせる。要するに、ｘは変性剤の濃度を示す、ＣＤデータθ（ｘ）を次式により、非線形最小２乗法プログラムによりフィットさせる。
【００４６】
【数１】
【００４７】
ここで、ｘはグアニジンの濃度であり、θＡおよびθＢは天然で、アンフォールドした状態におけるベースライン値である。ベースラインは、遷移前および遷移後の次の直線により近似する。
【００４８】
【数２】
【００４９】
相対活性は、特異的に結合した１２５Ｉ−ヒトインスリンの５０％を置き換えるのに要する野生型ヒトインスリンに対する類似体の割合として定義する。インスリン受容体（ＩＲ）を含むヒト胎盤膜調製物を、当該技術分野で既知のように使用する。膜断片（０．０２５ｍｇタンパク質／チューブ）を、１２５Ｉ標識インスリン（約３０，０００ｃｐｍ）と共に、選択した濃度の未標識類似体の存在下で１８時間、４℃で、最終容積０．２５ｍｌの０．０５Ｍトリス−ＨＣｌおよび０．２５％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン中、ｐＨ８でインキュベートした。インキュベーション後、混合物を１ｍｌの氷冷緩衝液で希釈し、４℃で５分間遠心分離する（１０，０００ｇ）。次いで、上清を吸引により除去し、膜ペレットを放射能について計測する。データを、非特異的結合（１μＭヒトインスリンの存在下で結合した膜に残存する放射能の量）に対して補正する。全てのアッセイにおいて、競合リガンド不在で結合したトレーサーのパーセンテージは、リガンド喪失による人為的結果（ａｒｔｉｆａｃｔｓ）を回避するため、１５％未満であった。インスリン類似体の３７℃でのインキュベーション間中の活性の変化を測定するための更なるインスリン受容体−結合アッセイは、マイクロタイター（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ）プレート抗体捕捉を用いて、当該技術分野で既知のように行い得る。マイクロタイターストリッププレート（Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｂ）を、４℃で１晩、ＡＵ５ ＩｇＧ（リン酸緩衝食塩水中４０μｇ／ｍｌを１００μｌ／ウェル）と共にインキュベートする。結合データは、二サイト（ｔｗｏ−ｓｉｔｅ）逐次モデルで分析し得る。ＩＧＦ Ｉ型受容体を用いた、対応するマイクロタイタープレート抗体アッセイを行い、この相同受容体への交差結合を評価し得る。
【００５０】
修飾された残基は、ＫＰ−インスリンの範囲内に導入された。提示した活性値は、ヒトインスリンとの相対的なホルモン−受容体の解離定数の比率に基づくものであり、ヒトインスリンの活性は、このように定義によって、１．０である。活性値の標準誤差は一般に２５％未満であった。２５℃におけるアンフォールディングの自由エネルギー（ΔＧu）は、２状態モデルに基づき、ゼロ変性剤濃度に外挿して見積もった。時間のずれは、亜鉛不含リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７.４）中、３７℃で穏やかに撹拌する際の蛋白質細繊維形成開始に必要な時間（日数）を示す。
【００５１】
本明細書で提供される塩素化−ＰｈｅＢ２４置換は、インスリン類似体、例えば、リスプロインスリン（つまり、置換ＬｙｓＢ２８及び置換ＰｒｏＢ２９も含むインスリン類似体（名称Ｈｕｍａｌｏｇ（登録商標）として販売））で実施できる。係るインスリン類似体は、塩素化−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンと呼ぶ。比較目的のために、フッ素置換も、本質的には、上述のように導入されたが、但し、パラフッ化フェニルアラニン置換は、リスプロインスリンのＢ２４位とＢ２６位に導入された。Ｂ２４位にパラフッ素フェニルアラニン置換を含む類似体は４Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンと呼ぶ。Ｂ２６位（チロシンを置換する）にパラフッ素化フェニルアラニン置換を含む類似体は４Ｆ−ＰｈｅＢ２６−ＫＰ−インスリンと呼ぶ。ＫＰ−インスリンおよびＤＫＰ−インスリンのそれぞれの類似体の名称を表や図で簡潔にする為、"インスリン"を除去してＫＰ及びＤＫＰと省略し得る。
【００５２】
Ｂ２４での塩素化フェニルアラニン置換には、残基（Ｎ）−ＧＦ＊ＦＹＴＫＰＴを表す合成オクタペプチド（塩素化フェニルアラニン残基を「Ｆ＊」として、「ＫＰ」置換を（下線）で表わした：配列ＩＤ番号９）及び切断した類似体デスオクタペプチド［Ｂ２３〜Ｂ３０］−インスリン（Ｂ１０位において野生型、配列ＩＤ番号１５）を用いた。Ｂ２６でのフッ素化フェニルアラニン置換には、残基（Ｎ）−ＧＦＦＦ＊ＴＫＰＴを表す合成オクタペプチド（再び、フッ素化フェニルアラニン残基を「Ｆ＊」として、「ＫＰ」置換を（下線）で表わした：配列ＩＤ番号１６）及び切断した類似体デスオクタペプチド［Ｂ２３〜Ｂ３０］−インスリン（配列ＩＤ番号１５）を用いた。
【００５３】
リスプロインスリン類似体のバックグラウンド中のＢ２４位或いはＢ２６位のハロゲン化フェニルアラニン置換で得られたデータを以下の表１に示す。
【００５４】
【表１】
【００５５】
細繊維形成アッセイ。４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンの物理的安定性は、ガラスバイアル中で穏やかに撹拌しながらｐＨ７.４、３７℃で亜鉛不含リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中でインキュベーションの間に三重反復して評価した。該試料は、タンパク質濃度６０μＭで曇り度の外観を１２日間観察し、毎日２回、チオフラビン−Ｔ（ＴｈＴ）蛍光分析用に一定分量を採取した。ＴｈＴ蛍光は、アミロイドが存在しない場合には僅少であるが、細繊維形成の発生時には著しく強まるので、このアッセイは、前記時間のずれを求める。ヒトインスリン、ＫＰ−インスリン、及び４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンの時間のずれは、それぞれ、５±１日、３±１日、および１３日以上である。したがって、４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンは、これらの条件下で、ＫＰ−インスリンよりも４倍以上細繊維形成に対して耐性があり、少なくともヒトインスリンの２倍以上耐性がある。特許性を理論に条件付けるのは望まないが、４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４インスリン類似体の細繊維形成抵抗の向上で、個々の試料の使用開始前でも後でも、概インスリン類似体の貯蔵期間を余り短縮することなく、当該インスリン類似体の即効性を高めるよう、亜鉛不含製剤で調剤が可能になると想定される。
【００５６】
熱力学的安定性。本発明者らは、４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンのアンフォールディングの自由エネルギーを、ＫＰ−インスリン及びＬｙｓＡ８−ＫＰ−インスリンに相対的に、亜鉛不含緩衝液中ｐＨ７.４および２５℃（１０ ｍＭリン酸カリウムおよび５０ｍＭＫＣｌ）で測定した。このアッセイは、ヘリックスに敏感な波長２２２ ｎｍでプローブし、グアニジン誘発性変性のＣＤによる検出を利用した。二状態モデルに基づく、アンフォールディングの自由エネルギーによる推定値を得るために、ΔＧｕの値を変性剤濃度ゼロに外挿した。置換ＴｈｒＡ８→Ｌｙｓは、熱力学的安定性を０.６±０.２Ｋｃａｌ／モル増加した一方、該４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４修飾は、安定性を０.４±０.２Ｋｃａｌ／モル減少させた。
【００５７】
４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリン−Ａ８Ｔと、界面活性剤−可溶化し、レクチン精製したインスリン受容体（アイソフォームＢ）との親和性は、ヒトインスリンのそれと類似している。単離インスリン受容体（アイソフォームＢ）：ヒトインスリン（三角）、ＫＰ−インスリン（四角）、４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリン（逆三角）を使用して、トレーサーとして１２５Ｉ標識ヒトインスリンを用いた競合置換アッセイを図３Ａに示す。３つの曲線はすべて密接に整列しており、類似した受容体−結合親和性を示す。４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンのインスリン受容体に対する親和性は、ＫＰ−ヒトインスリンのそれと区別できなかったが、それぞれ野生型インスリンの親和性よりもわずかに低かった。
【００５８】
図３Ｂは、インスリン様成長因子Ｉ受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）を使用し、トレーサーとして１２５Ｉで標識したＩＧＦ−Ｉを使用してプローブした競合置換によって調べた、対応するアッセイの結果を示す。天然ＩＧＦ−Ｉ（円）が追加されているが、記号は同一である。４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリン曲線の右側シフトは、ＩＧＦ−１Ｒへの交差結合の減少を示す。ＩＧＦ−１Ｒへの４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンの交差結合は、ＫＰ−インスリン或いは野生型インスリンのそれに対して約３倍相対的に減少している。
【００５９】
単離インスリン受容体（アイソフォームＢ）を用いた、ヒトインスリン（黒実線）、ＫＰ−インスリン（破線）、４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリン（三角）、４Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリン（四角）間の同様な比較は、図３Ｃに示す。４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリン、野生型ヒトインスリン、及びインスリンリスプロと相対的に、４Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリン曲線の右側シフトは、フェニルアラニン環の同一位置での異なるハロゲンの使用で、Ｂ２４位でのフェニルアラニンのパラ−クロロ置換に比較して減少した受容体−結合親和性を示している。対照的に、４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンのインスリン受容体結合親和性は、野生型ヒトインスリン及びリスプロ（ＫＰ）インスリンのそれと似ている。
【００６０】
単離インスリン受容体（アイソフォームＢ）を使用した、ヒトインスリン（実線）、ＫＰ−インスリン（破線）、４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２６−ＫＰ−インスリン（三角）、４Ｆ−ＰｈｅＢ２６−ＫＰ−インスリン（四角）間のさらなる比較は、図３Ｄに示す。４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２６−ＫＰ−インスリン及び４Ｆ−ＰｈｅＢ２６−ＫＰ−インスリンは、両方とも野生型インスリンとリスプロインスリンとに比べて、インスリン受容体結合親和性が低下した。上記のように、４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンは、受容体−結合親和性で類似した減少を示さない。
【００６１】
糖尿病ラットにおける４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンのインビボ効力は、ＫＰ−インスリンのそれと似ている。生物学的活性の特徴づけを行う為に、雄Ｌｅｗｉｓラット（体重約３００ｇ）をストレプトゾトシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ）で糖尿病状態にした。ヒトインスリン、ＫＰ−インスリン、４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンは、ＨＰＬＣにより精製、乾燥して粉末にし、インスリン希釈液（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ Ｃｏｒｐ）に溶解した。ＫＰ−インスリン或いは４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンを希釈液１００μｌ中２０μｇ或いは６.７μｇ、時間＝０で、ラットに皮下注射した。多い方の用量は、野生型インスリンの用量−応答曲線の定常（プラトー）になるが、一方少ない方の用量は、グルコース処理最高初速度の５０〜７０％に相当する。希釈剤単独の注入は、負の対照として行った。各グループ８匹のラットについて研究した。血液は時間０および継続間隔で最大１２０分まで、切り取った尾の先端から得た。血糖は、Ｈｙｐｏｇuａｒｄ Ａｄｖａｎｃｅ Ｍｉｃｒｏ−Ｄｒａｗメーターを用いて測定した。血糖濃度は、図４に示すように減少することが観察された。注入後最初の２４分間の血中グルコース濃度降下の初速度を比較すると、４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリン（−２２５±２９ ｍｇ/ｄｌ/時）、ＫＰ−インスリン（−２５６±３５ ｍｇ/ｄｌ/時）及びヒトインスリン（−２５５±３５ｍｇ/ｄｌ/時）で似ている。初期速度の違いは、いずれも統計的に有意ではない。しかし、次の６０分に亘る４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンの作用持続時間は、ヒトインスリン或いはＫＰ−インスリンの持続時間よりも短いと思われる。
【００６２】
４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンの天然受容体−結合親和性を考慮すれば、その効力がヒトインスリンのそれよりより低いことは異常なことであろう。確かに、野生型に比べた相対的な親和性が３０〜１００％台のインスリン類似体は、通常、インビボで天然物の効力を示す。しかし、形式的には、Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンの生物学的効力が、ヒトインスリン或いはＫＰ−インスリンの効力より（モル基準で）やや低いことはあり得る。もしそうであっても、我々は、如何なる係る降下も、臨床で使用の現行のインスリン製品のモル当たり活性閾値の範囲内になるであろうということに注目する（慣例により、国際単位（ＩＵ）は、それぞれ、糖降下程度を反映するように再定義され、その結果製品毎の単位当りミリグラム或いはナノモル数に違いが出ることになる）。留意すべきは、タンパク質不含希釈剤（図４の褐色破線）の対照注入での血糖濃度の緩やかな減少は、注入後の動物の昼間の空腹を示していることである。
【００６３】
インスリン６量体分解の薬物動態（ＥＤＴＡ封鎖アッセイと呼ぶ）用代替えマーカーは、亜鉛イオン（Ｚｎ２＋）ではなくコバルトイオン（Ｃｏ２＋）を使用して、６量体会合を仲介させるのである。Ｃｏ２＋６量体とＺｎ２＋６量体は、構造上似ているが、該コバルトイオンは、未充填ｄ−電子殻に起因する好都合な分光プローブを提供する。
【００６４】
アッセイの原理は次の通りである。Ｒ６のフェノール安定化Ｃｏ２＋インスリン６量体溶液は、四面体Ｃｏ２＋配位の為に青色であるが、分解後、該タンパク質溶液は、水或いはＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸：金属イオンの強力なキレート剤）による八面体Ｃｏ２＋の配位で、配位子場理論の結果として、可視波長での光学遷移が無くなるので、無色となる。該ＥＤＴＡ金属イオン封鎖アッセイは、次のように、これらの分光機能を利用する。時刻ｔ＝０に、モル過剰量のＥＤＴＡをＲ６インスリン６量体或いはインスリン類似体６量体溶液に添加する。ＥＤＴＡ自体は６量体に作用してそれから金属イオンを抜き取ることはないが、一時的な６量体分解の過程で解放されたＣｏ２＋はいずれもキレート剤によって補足され、再会合のために利用できなくなるのである。青色（Ｒ６固有のインスリン−結合Ｃｏ２＋の５７４ｎｍにおける正四面体ｄ−ｄ光学遷移）消失速度は、このように、６量体分解動態の光学的証拠を提供する。
【００６５】
４００〜７５０ｎｍの特徴的なスペクトルプロファイルを示す、インスリン・コバルト溶液の平均化トレースは、２ｍＭＥＤＴＡ（図５Ａ−Ｃ）の添加前と添加後測定した。試料を、５０ｍＭトリス（ｐＨ７.４）、５０ｍＭフェノール、および０.２ｍＭＣｏＣｌ２に溶解した。その後、ＮａＳＣＮを最終濃度１ｍＭまで追加した。５７４ｎｍ（２５℃およびｐＨ７.４）で追跡した、２ｍＭＥＤＴＡ添加後の６量体解離の速度式も示す。ＥＤＴＡ抽出前の類似体のスペクトルは実線として表示する。ＥＤＴＡ抽出後、該スペクトルは破線として表示する。野生型は、パネルＡに、ＫＰ−インスリンはパネルＢに、４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンはパネルＣに示す。データは各試料について時間ゼロに正規化した。
【００６６】
一方、ｔ＝０で６量体コバルト錯体のベースライン光吸収スペクトルは、野生型インスリン６量体、ＫＰインスリン６量体、及び４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰインスリン６量体（図５Ａ〜５Ｃ参照）間で類似している。これら各のｄ−ｄ電子遷移の類似した形状と大きさは、前記金属イオンが、野生型と変異型６量体で、類似したＲ６−固有の四面体配位部位にあることを示唆している。それは、４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンが金属イオン媒介会合に適格であり、それゆえ、亜鉛ベースの製剤に有用なことを意味するので、この結果は重要である。
【００６７】
２ｍＭＥＤＴＡ添加後、５７４ｎｍ（２５℃およびｐＨ７.４）で追跡した６量体解離の動力学は、野生型と変異型の６量体がＥＤＴＡ介在Ｃｏ２+封鎖速度に著しい違いを見せることを示す。予想通り、野生型６量体は、最高の動力学的安定性（図５Ｄの実線）を示し、次いでＫＰ−インスリン（図５Ｄの一点鎖線）および４−Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリン（図５Ｄの点線）が続く。それぞれの半減期は４８１秒（野生型）、３６３秒（ＫＰ−インスリン）、６６秒（４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリン）である。パラ−クロロ芳香族置換によって誘導される加速の程度は、リスプロインスリン（Ｈｕｍａｌｏｇ（商標））の「ＫＰスイッチ（切替）」関連の程度よりも大きい。皮下注射部位からの亜鉛イオンの拡散は、ＥＤＴＡ封鎖アッセイにおけるコバルトイオンのインビトロ封鎖に類似するので、これらの知見から、４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンが著しい吸収の加速を示すものと予測される。
【００６８】
野生型インスリン（Ｈｕｍｕｌｉｎ（商標）；ＥＬｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏ．）とＫＰ−インスリン（Ｈｕｍａｌｏｇ（商標）と、に比して、４−Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンの薬物動態（ＰＫ）、薬物動力学（ＰＤ）特性、及びその効力を青年期のヨークシャーファーム（Ｙｏｒｋｓｈｉｒｅ ｆａｒｍ）の豚（体重２５〜４５ｋｇ）で調べた。野生型とＫＰ−インスリンは、製造元（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏ．）から提供を受けたまま、Ｕ−１００強度で使用した。前記４−Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンは、野生型及びＫＰ−インスリン製品のそれと同様なタンパク質対亜鉛イオンの比率でＬｉｌｌｙ希釈液に調剤した；その強度は、Ｕ−８７であった。動物は、試験日にそれぞれＴｅｒａｚｏｌで麻酔導入し、次いで、Ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅで全身麻酔した。各動物に気管挿管し、酸素飽和度と終末呼気ＣＯ２とを連続的にモニターした。内因性の膵臓α−およびβ−細胞分泌をブロックする為に、クランプ調査開始前約３０分と、その後２時間毎に、酢酸オクトレオチド（ｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ）を豚に皮下注射（４４μｇ/ｋｇ）により投与した。静脈カテーテルを設置し、１０％ブドウ糖輸液でベースライン正常血糖値を確立してから、カテーテルを介してインスリンを静脈注射で投与した。末梢インスリン媒介による、グルコース取り込みを定量化する為に、可変流量でグルコース注入を行い、血中グルコース濃度を約８５ｍｇ/ｄｌに維持するようにした。グルコース注入速度がインスリン投与以前のベースラインに戻るまで、前記グルコース注入は、通常５〜８時間必要であった。グルコース濃度は１０分毎、Ｈｅｍｏｃuｅ２０１ポータブルグルコース分析器で測定した（機器の誤差：１.９％）。グルコース・クランプ法のコンピュータ化プロトコルは、Ｍａｔｔｈｅｗｓらの報告通りであった。インスリンアッセイのための血液試料２ｍｌも次のスケジュールに従って取得した：インスリン送達後０〜４０分：５分間隔；５０〜１４０分：１０分間隔；１６０分〜ＧＩＲがベースラインに戻るまで：２０分間隔。ＰＫ／ＰＤの分析のために、２０分間の移動平均カーブフィットとフィルタが適用された。ＰＤは、初期最大半量到達時間、後期最大半量到達時間、最大効果到達時間、およびベースライン上の曲線下のエリア（ＡＵＣ）として測定された。これらの分析のそれぞれについては、生データではなくて近似曲線を使用した。３頭の豚では、それぞれ３組の試験を行った。これらの試験の結果を図６〜９に提供する.
４−Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリン（図６では、４−Ｃｌ−リスプロインスリンと短縮）は、ＫＰ−インスリン或いは野生型インスリンよりも大幅に低下した、延長後期の"尾部"を示すことが見出された。インスリンの作用遮断が改善した事は、遅発型食後低血糖症に関して潜在的な臨床的有益性を示唆する。
【００６９】
図７は、豚での薬力学試験２０組を要約し、後期最大半量到達時間に於いて、ＫＰ−インスリンより、４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンが、０.０５Ｕ/ｋｇ、０.１Ｕ/ｋｇ、０.２Ｕ/ｋｇ、０.５Ｕ/ｋｇ、及び１Ｕ/ｋｇの５つの異なる投与量レベルで有意な改善を実証する。
【００７０】
図８は、豚での薬力学試験１４組を要約し、初期最大半量到達時間に於いて、ＫＰ−インスリンより、４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンが、０.０５Ｕ/ｋｇ、０.１Ｕ/ｋｇ、０.２Ｕ/ｋｇの３つの異なる投与量レベルで、改善を示唆する。
【００７１】
図９は、曲線下面積（ＡＵＣ）で測定した、４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンの相対的な効力をＫＰインスリンのそれと比較した、対応１０組の薬力学研究を要約し、その中で、４−Ｃｌ−ＫＰの平均効力のわずかな減少は、統計的に有意でないことが見出された（ｐ＝０.２２）。類似の製剤配合条件下（フェノール及びメタクレゾールで安定化した、亜鉛インスリン６量体或いは亜鉛インスリン類似体６量体）で、野生型インスリンとＫＰ−インスリン（リスプロ−インスリン）との関連で、４−Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンの薬物動態（ＰＫ）および薬力学（ＰＤ）の特性は、曲線下エリア（ＡＵＣ）法で測定した、４−Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンの効力が、野生型インスリン及びＫＰ−インスリンのものと類似していたことを示す。
【００７２】
患者を治療する方法は、当該患者に塩素化−ＰｈｅＢ２４置換インスリン類似体を投与することを含む。一例では、前記インスリン類似体は、４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰインスリンである。前記インスリン類似体は、選択的にＡ８位にヒスチジン、リジン或いはアルギニン置換を含み得る。別の例では、前記塩素置換インスリン類似体は、さらに、インスリン分子内の他の位置に、人体での前記類似体の作用速度を変更するように設計された１つ或いはそれ以上の置換を含む。なお別の例では、前記インスリン類似体は、外付け或いは植込み型インスリンポンプで投与される。同時係属中の米国特許出願番号１２／４１９１６９により完全に記載されている通り、本発明のインスリン類似体は、また、前記Ｂ鎖のＣ−末端およびＡ鎖のＮ末端のとの間のテザー（係留）のような、他の修飾を含み得る。
【００７３】
医薬組成物は、係るインスリン類似体を含み得、選択的に亜鉛を含み得る。亜鉛イオンは、インスリン類似体の６量体につき２．２〜３．０モル比のレベルで、当該組成物中に含め得る。当該製剤において、インスリン類似体濃度は、通常、約０．１〜約３ｍＭであって、インスリンポンプの貯槽では、３ｍＭ以下の濃度を使用し得る。食事時のインスリン類似体の修飾は、（ａ）Ｈｕｍｕｌｉｎ（登録商標）（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏ．）、Ｈｕｍａｌｏｇ（登録商標）（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏ．）、Ｎｏｖａｌｉｎ（登録商標）（Ｎｏｖｏ−Ｎｏｒｄｉｓｋ）及びＮｏｖａｌｏｇ（登録商標）（Ｎｏｖｏ−Ｎｏｒｄｉｓｋ）及びヒトでの使用が現在承認されている他の速効インスリン製剤の「通常の」製剤、（ｂ）上記および他のインスリン類似体の「ＮＰＨ」製剤、並びに（ｃ）係る製剤の混合物について記載のように調剤し得る。前述したように、その細繊維形成に対する抵抗の向上の為、４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４含有インスリン類似体は亜鉛の存在なしで調剤し、前記類似体の速効性を最大限にし得ると思われる。しかし、また、亜鉛の存在下でも、前記４Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４含有インスリン類似体は、６量体から２量体および単量体に十分に速く解離するので、速効性インスリン類似体としても考慮されるべきと考えられる。
【００７４】
賦形剤は、グリセロール、グリシン、他の緩衝剤、及び塩、並びにフェノールおよびメタ−クレゾールなどの抗菌保存剤を含み得、後者の保存剤は、インスリン６量体の安定性を強化することが既知である。係る医薬組成物は、生理学的有効量の前記組成物を患者に投与することにより、真性糖尿病或いは他の病状を有する患者を治療するのに使用し得る。
【００７５】
少なくとも、Ｂ２４位に塩素化フェニルアラニンを有するインスリンのＢ鎖をコードする配列を含むインスリン類似体をコードするポリペプチドをコードする配列を含む核酸も想定される。これは、終止コドン（アンバーコドンＴＡＧのような）をＢ２４位に導入することで達成できるのであって、抑制（サプレッサー）ｔＲＮＡ（アンバーコドンを用いる場合はアンバーサプレッサー）及び以前に記載されたような（Ｆｕｒｔｅｒ、１９９８、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．７：４１９〜４２６；Ｘｉｅら、２００５、Ｍｅｔｈｏｄｓ．３６：２２７〜２３８）、前記終止コドンに応答してポリペプチド中に非標準的なアミノ酸を導入する対応ｔＲＮＡ合成酵素を併用して行う。特定の配列は、核酸配列が導入される種の好ましいコドン使用に依存し得る。該核酸は、野生型インスリンの他の修飾体もコードし得る。前記核酸配列は、該ポリペプチド或いは修飾されたプロインスリン類似体の他の位置に無関係の置換或いは伸長を含む、修飾されたＡ鎖或いはＢ鎖配列をコードし得る。該核酸は、発現ベクターの一部分であり得るし、また、このベクターは、大腸菌細胞系のような原核宿主細胞、或いはＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｃｉａｅ）或いはピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓ）株、或いは細胞系のような真核細胞系などの宿主細胞に挿入し得る。
【００７６】
例えば、酵母ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓ）および他の微生物中のＢ鎖ポリペプチドの発現に向けるように、合成遺伝子を合成し得ることが想定される。Ｂ２４位に終止コドンを用い、その位置に塩素化フェニルアラニンを導入する目的でのＢ鎖ポリペプチドのヌクレオチド配列は、次のいずれか或いはその変異型であり得る：
（ａ）ヒトコドン優先性を持つ：TTTGTGAACCAACACCTGTGCGGCTCACACCTGGTGGAAGCTCTCTACCTAGT
GTGCGGGGAACGAGGCTAGTTCTACACACCCAAGACC (配列ＩＤ番号１１)
（ｂ）ピチアコドン優先性を持つ
TTTGTTAACCAACATTTGTGTGGTTCTCATTTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTT
TGTGGTGAAAGAGGTTAGTTTTACACTCCAAAGACT (配列ＩＤ番号１２)
【００７７】
同様に、ヒトコドン優先性を有し、Ｂ２４位に終止コドンを用いてその位置に塩素化化フェニルアラニンを導入する目的の、全長プロインスリンｃＤＮＡは、配列番号１３の配列を有し得る。
TTTGTGAACC AACACCTGTG CGGCTCACAC CTGGTGGAAG CTCTCTACCT AGTGTGCGGG GAACGAGGCT AGTTCTACAC ACCCAAGACC CGCCGGGAGG CAGAGGACCT GCAGGTGGGG CAGGTGGAGC TGGGCGGCGG CCCTGGTGCA GGCAGCCTGC AGCCCTTGGC CCTGGAGGGG TCCCTGCAGA AGCGTGGCAT TGTGGAACAA TGCTGTACCA GCATCTGCTC CCTCTACCAG CTGGAGAACT ACTGCAACTA G (配列ＩＤ番号１３)
【００７８】
同様に、ヒトコドン優先性を有し、Ｂ２４位に終止コドンを用いてその位置に塩素化フェニルアラニンを導入する目的であり、Ｐ．パストリスに好ましいコドンを有する、全長プロインスリンｃＤＮＡは、配列ＩＤ番号１４の配列を有し得る。
TTTGTTAACC AACATTTGTG TGGTTCTCAT TTGGTTGAAG CTTTGTACTT GGTTTGTGGT GAAAGAGGTT AGTTTTACAC TCCAAAGACT AGAAGAGAAG CTGAAGATTT GCAAGTTGGT CAAGTTGAAT TGGGTGGTGG TCCAGGTGCT GGTTCTTTGC AACCATTGGC TTTGGAAGGT TCTTTGCAAA AGAGAGGTAT TGTTGAACAA TGTTGTACTT CTATTTGTTC TTTGTACCAA TTGGAAAACT ACTGTAACTA A （配列ＩＤ番号１４）
【００７９】
前述の開示に基づいて、塩素置換インスリン類似体が上述した目的を達成するのは、もう明らかのはずである。即ち、これらのインスリン類似体は、向上した熱力学的安定性、細繊維形成への耐性、および血糖値を低下させる効力を示す。塩素置換フェニルアラニンを含むインスリン類似体は、またインスリン様成長因子（ＩＧＦＲ）への交差反応性も低下させる。従って、如何なる明白な変形形態も特許請求に係わる発明の範囲内に含まれ、また、それ故に特定の構成要素の選択は、本明細書に開示、記載された本発明の精神から逸脱することなく決定できることを理解すべきである。
【００８０】
以下の文献は、本明細書に記載の試験およびアッセイ方法が当業者に理解されることを実証するために引用する。
【００８１】
Furter, R., 1998. Expansion of the genetic code: Site-directed p-fluoro-phenylalanine incorporation in Escherichia coli. Protein Sci. 7:419-426.
Matthews D.R., Hosker J.P. 1989. Unbiased and flexible iterative computer program to achieve glucose clamping. Diabetes Care. 12: 156-9.
Merrifield, R.B., Vizioli, L.D., and Boman, H.G. 1982. Synthesis of the antibacterial peptide cecropin A (1-33). Biochemistry 21: 5020-5031.
Mirmira, R.G., and Tager, H.S. 1989. Role of the phenylalanine B24 side chain in directing insulin interaction with its receptor: Importance of main chain conformation. J. Biol. Chem. 264: 6349-6354. Sosnick, T.R., Fang, X., and Shelton, V.M. 2000. Application of circular dichroism to study RNA folding transitions. Methods Enzymol. 317: 393-409.
Wang, Z.X. 1995. An exact mathematical expression for describing competitive biding of two different ligands to a protein molecule FEBS Lett. 360: 111-114.
Weiss, M.A., Hua, Q.X., Jia, W., Chu, Y.C., Wang, R.Y., and Katsoyannis, P.G. 2000.
Hierarchiacal protein "un-design": insulin's intrachain disulfide bridge tethers a recognition α-helix. Biochemistry 39: 15429-15440.
Whittaker, J., and Whittaker, L. 2005. Characterization of the functional insulin binding epitopes of the full length insulin receptor. J. Biol. Chem. 280: 20932-20936.
Xie, J. and Schultz, P.G. 2005. An expanding genetic code. Methods. 36: 227-238.
【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩素化フェニルアラニンを導入するＢ鎖ポリペプチドを有するインスリン類似体。
【請求項２】
請求項１に記載のインスリン類似体において、前記塩素化フェニルアラニンは、Ｂ２４位に位置するものである、類似体。
【請求項３】
請求項２に記載のインスリン類似体において、前記塩素化フェニルアラニンは、パラ−モノクロロ−フェニルアラニンである、類似体。
【請求項４】
請求項１〜３の何れかに記載のインスリン類似体において、前記類似体は、哺乳動物のインスリン類似体である、類似体。
【請求項５】
請求項４に記載のインスリン類似体において、前記類似体は、ヒトインスリンの類似体である、類似体。
【請求項６】
請求項４に記載のインスリン類似体において、前記Ｂ鎖ポリペプチドは、配列ＩＤ番号４〜８からなる群から選択されるアミノ酸配列と、３個或いはそれ以下の追加のアミノ酸置換を有するポリペプチドとを有するものである、類似体。
【請求項７】
請求項４に記載のインスリン類似体をコードする核酸。
【請求項８】
請求項６に記載の核酸において、前記塩化フェニルアラニンは、終止コドンによりコードされているものである、核酸。
【請求項９】
請求項７に記載の核酸において、前記終止コドンは、核酸配列ＴＡＧである、核酸。
【請求項１０】
請求項７、８或いは９に記載の前記核酸配列を有する発現ベクター。
【請求項１１】
請求項１０記載の前記発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１２】
患者を治療する方法であって、生理学的有効量のインスリン類似体或いはその生理学的に許容される塩を前記患者に投与する工程を有し、前記インスリン類似体或いはその生理学的に許容される塩は、塩化フェニルアラニンを導入するＢ鎖ポリペプチドを含有するものである、方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法において、前記塩化フェニルアラニンは、Ｂ２４位に位置するものである、方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法において、前記塩化フェニルアラニンは、パラ−モノクロロ−フェニルアラニンである、方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法において、前記Ｂ鎖ポリペプチドは、配列番号４〜８からなる群から選択されるアミノ酸配列と、その３個或いはそれ以下の追加のアミノ酸置換を有するポリペプチドとを有するものである、方法。
【請求項１】
塩素化フェニルアラニンを導入するＢ鎖ポリペプチドを有するインスリン類似体。
【請求項２】
請求項１に記載のインスリン類似体において、前記塩素化フェニルアラニンは、Ｂ２４位に位置するものである、類似体。
【請求項３】
請求項２に記載のインスリン類似体において、前記塩素化フェニルアラニンは、パラ−モノクロロ−フェニルアラニンである、類似体。
【請求項４】
請求項１〜３の何れかに記載のインスリン類似体において、前記類似体は、哺乳動物のインスリン類似体である、類似体。
【請求項５】
請求項４に記載のインスリン類似体において、前記類似体は、ヒトインスリンの類似体である、類似体。
【請求項６】
請求項４に記載のインスリン類似体において、前記Ｂ鎖ポリペプチドは、配列ＩＤ番号４〜８からなる群から選択されるアミノ酸配列と、３個或いはそれ以下の追加のアミノ酸置換を有するポリペプチドとを有するものである、類似体。
【請求項７】
請求項４に記載のインスリン類似体をコードする核酸。
【請求項８】
請求項６に記載の核酸において、前記塩化フェニルアラニンは、終止コドンによりコードされているものである、核酸。
【請求項９】
請求項７に記載の核酸において、前記終止コドンは、核酸配列ＴＡＧである、核酸。
【請求項１０】
請求項７、８或いは９に記載の前記核酸配列を有する発現ベクター。
【請求項１１】
請求項１０記載の前記発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１２】
患者を治療する方法であって、生理学的有効量のインスリン類似体或いはその生理学的に許容される塩を前記患者に投与する工程を有し、前記インスリン類似体或いはその生理学的に許容される塩は、塩化フェニルアラニンを導入するＢ鎖ポリペプチドを含有するものである、方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法において、前記塩化フェニルアラニンは、Ｂ２４位に位置するものである、方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法において、前記塩化フェニルアラニンは、パラ−モノクロロ−フェニルアラニンである、方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法において、前記Ｂ鎖ポリペプチドは、配列番号４〜８からなる群から選択されるアミノ酸配列と、その３個或いはそれ以下の追加のアミノ酸置換を有するポリペプチドとを有するものである、方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２０１３−５１３３９１（Ｐ２０１３−５１３３９１Ａ）
【公表日】平成２５年４月２２日（２０１３．４．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４３３２９（Ｐ２０１２−５４３３２９）
【出願日】平成２２年１２月１３日（２０１０．１２．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０６００８５
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０７２２８８
【国際公開日】平成２３年６月１６日（２０１１．６．１６）
【出願人】（５００４２９３３２）ケース ウェスタン リザーブ ユニバーシティ (12)
【氏名又は名称原語表記】ＣＡＳＥ ＷＥＳＴＥＲＮ ＲＥＳＥＲＶＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年４月２２日（２０１３．４．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月１３日（２０１０．１２．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０６００８５
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０７２２８８
【国際公開日】平成２３年６月１６日（２０１１．６．１６）
【出願人】（５００４２９３３２）ケース ウェスタン リザーブ ユニバーシティ (12)
【氏名又は名称原語表記】ＣＡＳＥ ＷＥＳＴＥＲＮ ＲＥＳＥＲＶＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【Ｆターム（参考）】
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