増加した生物学的活性を有する短縮型ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）
【課題】成熟、完全長ヒトＫＧＦと比較して生物活性における増加を示す、成熟、完全長ヒトＫＧＦのフラグメントを提供すること。
【解決手段】単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは成熟、完全長ヒトＫＧＦのフラグメントであり、ここで該ポリペプチドは、Ｂａｌｂ／ＭＫ生物活性アッセイにより測定される場合に、成熟、完全長ヒトＫＧＦと比較して生物活性における増加を示し、そして上皮細胞増殖を特異的に刺激し、そして該生物活性における増加は、生物活性における少なくとも約２倍の増加である、単離されたポリペプチド。
【解決手段】単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは成熟、完全長ヒトＫＧＦのフラグメントであり、ここで該ポリペプチドは、Ｂａｌｂ／ＭＫ生物活性アッセイにより測定される場合に、成熟、完全長ヒトＫＧＦと比較して生物活性における増加を示し、そして上皮細胞増殖を特異的に刺激し、そして該生物活性における増加は、生物活性における少なくとも約２倍の増加である、単離されたポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般にケラチノサイト増殖因子（「ＫＧＦ」）に関する。さらに特定的に、本発明は、昆虫細胞系で発現する組換え完全長ＫＧＦと比較して、生物学的活性の増加および細胞毒の減少を有する短縮型ＫＧＦフラグメントおよびそのアナログに関する。このＫＧＦフラグメントは、本明細書中ではＫＧＦｄｅｓ１−２３と命名され、成熟完全長ＫＧＦのＮ末端の最初の２３アミノ酸残基を欠損し、このＮ末端は、Ｆｉｎｃｈ，Ｐ．Ｗ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５：７５２−７５５（１９８９）に示され、そしてＫＧＦにその上皮細胞特異性を与えると既に考えられているように、Ｎ末端からのアミノ酸残基１４〜１６にグリコシル化部位を含む。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ＫＧＦは、線維芽細胞成長因子（「ＦＧＦ」）のファミリーに属し、塩基性ＦＧＦ（「ｂＦＧＦ」）として示されるものの始原型である。このため、ＫＧＦはまた、ＦＧＦ−６として公知である。他のＦＧＦのように、ＫＧＦはヘパリン結合タンパク質であるが、他のＦＧＦと異なり、それは独特な標的細胞特異性を有する。特に、ＦＧＦは、一般に、一次または二次中胚葉由来および神経外胚葉由来の種々の細胞型の増殖および分化を刺激し得る。ＫＧＦは、Ｆｉｎｃｈ，Ｐ．Ｗ．ら（上記引用文中）で考察されるように、上皮細胞増殖を刺激し得るその能力において他のＦＧＦと同様であるが、内皮細胞または線維芽細胞の増殖を刺激し得ないその能力において他のＦＧＦと同様でない。
【０００３】
酸性線維芽細胞成長因子（「ａＦＧＦ」）および塩基性線維芽細胞成長因子（「ｂＦＧＦ」）を含むＦＧＦは、Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚら、Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．２５：３０７−３１４（１９９１）、およびＢａｓｉｌｉｃｏら、Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．５９：１１５−１６５（１９９２）で考察されるように、ヘパリン結合特性を有し、そして腹部および背部の中胚葉の初期胞胚での分化および増殖を誘導する能力を有することが公知である。ＦＧＦに対する細胞の応答は、Ｈｏｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：６６５−６６８（１９９１）で考察されるように、細胞表面レセプター（「ＦＧＦＲ」）へのその結合を通じて介在される。このレセプターには、３つの相関型がある。高親和性のＦＧＦＲは、Ｌｅｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５：５７−６０（１９８９）；Ｄｉｏｎｎｅら、ＥＭＢＯ ９：２６８５−２６９２（１９９０）；Ｍｉｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：７２−７５（１９９１）；Ｍｉｋｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：２４６−２５０（１９９２）；およびＤｅｌｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２１２２５−２１２２９（１９９２）で考察されたように、チロシンキナーゼであり、そしてｆｌｇレセプター（「ＦＧＦＲ−１」）、ｂｅｋレセプター（「ＦＧＦＲ−２」）、およびＫ Ｓａｍレセプター（「ＦＧＦＲ−３」）を含む。
【０００４】
ＦＧＦＲ−１およびＦＧＦＲ−２の両者は、中胚葉および神経外胚葉組織で広範囲に発現され、そして両者は、同じ親和性でａＦＧＦおよびｂＦＧＦを結合し得る。ＦＧＦＲ−３は、上皮細胞に特異的であるＫＧＦレセプターである。それは、ＦＧＦＲ−２のもう一つの転写物である。Ｍｉｋｉら（上記引用文中）およびＤｅｌｌら（上記引用文中）で考察されたように、ａＦＧＦおよびｂＦＧＦの両方について高い親和性を示し、そしてＫＧＦについて全く親和性を示さないＦＧＦＲ−２とは対照的に、ＦＧＦＲ−３は、ＫＧＦおよびａＦＧＦをｂＦＧＦより約２０〜１０００倍高い親和性で結合する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上皮細胞に対するＫＧＦの厳密に制限される活性プロフィールが、例えば、多くのタイプの創傷治癒のための適用ならびに乾癬および基底細胞癌のような表皮の過剰増殖疾患の処置で所望される。現在では、ＫＧＦを除いて、高適性マイトジェン因子はこれらの適用のためには存在しない。従って、ＫＧＦが、その効力を増加しそしてその細胞毒を減少するように改変されれば、治療用適用のために望ましい。
【０００６】
最近、Ｒｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２９８４−２９８８（１９９３年２月）により、ＫＧＦ１６３がＴ７原核生物発現系で発現される場合、マイトジェン活性を所有する組換えＫＧＦ（「ｒＫＧＦ」）ポリペプチドが得られ得ることが見出された。ｒＫＧＦ分子が、成熟ＫＧＦ１６３ポリペプチドのＮ末端からそれぞれ３、８、２７、３８、および４８アミノ酸残基の欠失により短縮される場合、生じる分子の生物学的活性は変化した。それぞれ、３および８アミノ酸残基の欠失により、生じる分子のマイトジェン活性は、完全長のｒＫＧＦ（「ｒＫＧＦ１６３」）と比べて影響し得なかった。しかし、２７アミノ酸残基の欠失は、１０〜２０倍減少したマイトジェン活性を生じた。３８および４８アミノ酸残基の欠失は、それぞれマイトジェン活性およびヘパリン結合能を完全に失うようになる。従って、Ｒｏｎらは、ｒＫＧＦ１６３分子と比べて増加した細胞分裂活性を有するいかなる短縮型ＫＧＦフラグメントをも生産し得なかった。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明の目的の１つは、成熟完全長ＫＧＦ、ＫＧＦ１６３のアミノ酸配列の一部分を含み、そして完全長組換えＫＧＦ、ｒＫＧＦ１６３と比較して少なくとも２倍のマイトジェン活性の増加を有するＫＧＦフラグメントを提供することである。特別な目的は、ｒＫＧＦ１６３の最初の２３個のＮ末端アミノ酸残基Ｃ−Ｎ−Ｄ−Ｍ−Ｔ−Ｐ−Ｅ−Ｑ−Ｍ−Ａ−Ｔ−Ｎ−Ｖ−Ｎ−Ｃ−Ｓ−Ｓ−Ｐ−Ｅ−Ｒ−Ｈ−Ｔ−Ｒ−を含む配列を欠失しているＫＧＦフラグメントを提供することである。
【０００８】
本発明の１つの他の目的は、ｒＫＧＦ１６３と比較して減少した細胞毒を有するＫＧＦフラグメントを提供することである。さらに他の目的は、上記のＫＧＦフラグメントおよび毒性分子を含む結合体を提供することである。毒性分子は、リシンＡ、ジフテリアトキシン、およびサポニン（ｓａｐｏｒｉｎ）のうち少なくとも１つであり得る。
【０００９】
本発明の他の１つの目的は、上記のようなＫＧＦフラグメント、および薬学的に受容可能なキャリア（例えば、ヒト皮膚への局所適用に適するもの）を含む治療用組成物を提供することである。
【００１０】
本発明のさらに他の１つの目的は、上記のＫＧＦフラグメントをコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ分子を提供することである。
【００１１】
本発明の他の１つの目的は、上記のＫＧＦフラグメントをコードするＤＮＡ分子、およびＤＮＡ分子の発現のための調節配列を含む発現ベクターを提供することである。例えば、発現ベクターは、バキュロウイルスであり得る。
【００１２】
本発明の他の１つの目的は、上記の発現ベクターで形質転換した宿主細胞を提供することである。例えば、宿主細胞は、細菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、または昆虫細胞であり得る。
【００１３】
本発明の他の１つの目的は、上記のような形質転換宿主細胞を培養し、そして培養物からＫＧＦフラグメントを単離することにより、ＫＧＦフラグメントを生産する方法を提供することである。
【００１４】
本発明のさらに他の１つの目的は、上皮細胞成長が所望される領域にＫＧＦフラグメントを適用することにより上皮細胞成長を刺激し、そして細胞を培養し得る方法を提供することである。
【００１５】
本発明のさらに他の１つの目的は、処置されるべき創傷の領域に上記の治療組成物を適用して損傷を治癒させることによる、損傷治癒方法を提供することである。
【００１６】
本発明のさらに他の１つの目的は、治療すべき領域に上記の結合体を適用することにより表皮の過剰増殖疾患を処置する方法を提供することである。
【００１７】
従って、本発明は以下を提供する。
【００１８】
１．成熟、完全長ケラチノサイト増殖因子のアミノ酸配列の一部分を含有するケラチノサイト増殖因子フラグメントであって、該一部分が、成熟、組換え、完全長ケラチノサイト増殖因子と比較して少なくとも２倍増加したマイトジェン活性を有し、そして成熟、完全長ケラチノサイト増殖因子の最初の２３個のＮ末端アミノ酸残基を含有する配列を欠く、ケラチノサイト増殖因子フラグメント。
【００１９】
２．前記フラグメントが、成熟、組換え、完全長ケラチノサイト増殖因子と比較して７倍増加したマイトジェン活性を有する、項目１に記載のケラチノサイト増殖因子フラグメント。
【００２０】
３．前記フラグメントが、成熟、組換え、完全長ケラチノサイト増殖因子と比較して１０倍増加したマイトジェン活性を有する、項目１に記載のケラチノサイト増殖因子フラグメント。
【００２１】
４．前記フラグメントが、成熟、組換え、完全長ケラチノサイト増殖因子と比較して細胞毒性の減少を示す、項目１に記載のケラチノサイト増殖因子フラグメント。
【００２２】
５．（ａ）成熟、完全長ケラチノサイト増殖因子のアミノ酸配列の一部分を含有するケラチノサイト増殖因子フラグメントであって、該一部分が、成熟、組換え、完全長ケラチノサイト増殖因子と比較して少なくとも２倍増加したマイトジェン活性を有し、そして成熟、完全長ケラチノサイト増殖因子の最初の２３個のＮ末端アミノ酸残基を含有する配列を欠く、ケラチノサイト増殖因子フラグメント、および
（ｂ）毒性分子
を含有する結合体。
【００２３】
６．前記毒性分子が、リシンＡ、ジフテリアトキシンおよびサポニンからなる群から選択れる、項目５に記載の結合体。
【００２４】
７．前記フラグメントが、成熟、組換え、完全長ケラチノサイト増殖因子と比較して７倍増加したマイトジェン活性を有する、項目５に記載の結合体。
【００２５】
８．前記フラグメントが、成熟、組換え、完全長ケラチノサイト増殖因子と比較して１０倍増加したマイトジェン活性を有する、項目５に記載の結合体。
【００２６】
９．（ａ）成熟、完全長ケラチノサイト増殖因子のアミノ酸配列の一部分を含有するケラチノサイト増殖因子フラグメントであって、該一部分が、成熟、組換え、完全長ケラチノサイト増殖因子と比較して少なくとも２倍増加したマイトジェン活性を有するが、成熟、完全長ケラチノサイト増殖因子の最初の２３個のＮ末端アミノ酸残基を含有する配列を欠く、ケラチノサイト増殖因子フラグメント、および
（ｂ）薬剤的に許容し得るキャリアー
を含有する治療組成物。
【００２７】
１０．項目１に記載のケラチノサイト増殖因子フラグメントをコードするヌクレオチド配列を含有する、ＤＮＡ分子。
【００２８】
１１．項目２に記載のケラチノサイト増殖因子フラグメントをコードするヌクレオチド配列を含有する、ＤＮＡ分子。
【００２９】
１２．項目３に記載のケラチノサイト増殖因子フラグメントをコードするヌクレオチド配列を含有する、ＤＮＡ分子。
【００３０】
１３．項目１０に記載のＤＮＡ分子および該ＤＮＡ分子の発現のための調節配列を含有する発現ベクター。
【００３１】
１４．前記ベクターがバキュロウイルスである項目１３に記載の発現ベクター。
【００３２】
１５．項目１３に記載の発現ベクターによって形質転換された宿主細胞。
【００３３】
１６．前記細胞が、細菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞および昆虫細胞からなる群から選択される、項目１５に記載の宿主細胞。
【００３４】
１７．項目１５に記載の宿主細胞を培養する工程、および該培養物からケラチノサイト増殖因子フラグメントを単離する工程を包含する、ケラチノサイト増殖因子フラグメントを生産する方法。
【００３５】
１８．項目９に記載の治療組成物を、処置しようとする損傷領域に適用し、そして損傷を治癒し得ることを包含する、損傷治癒の方法。
【００３６】
１９．項目５に記載の結合体を、処置しようとする領域に適用することを包含する、表皮の過増殖疾患の処置方法。
【００３７】
２０．前記疾患が、乾癬および基底細胞癌からなる群から選択される疾患である、項目２０に記載の処置方法。
【００３８】
本発明のさらなる目的、特徴、および利益は、当業者に明らかであり、そしてここに列挙する必要はない。本発明は、当業者に明らかであり、そしてフラグメント、結合体、治療組成物、ベクター、宿主、および使用方法の性質および活性を実質上変化しない上記の変形および改変を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
（好ましい実施態様の詳細な説明）
本明細書中でＫＧＦフラグメントまたはＫＧＦｄｅｓ１−２３と称される、ｒＫＧＦ１６３の最初の２３個のＮ末端アミノ酸残基にわたる欠失を有する短縮型非グリコシル化ＫＧＦが、ｒＫＧＦ１６３と比べて上皮細胞上でより大きな生物学的活性および細胞毒の減少を有することを驚くべきことに発見した。一般に、本発明のＫＧＦフラグメントは、上皮細胞の増殖の刺激に対してＫＧＦ１６３の特異性を保持する。
【００４０】
従って、本発明の好ましい実施態様は、天然分子がインビボで生産される場合に、通常それに付随する不純物をともなわない新規な短縮型非グリコシル化ＫＧＦフラグメント、ＫＧＦｄｅｓ１−２３である。このフラグメントは、単一なピークとしてＮａ Ｄｏｄ ＳＯ４／ＰＡＧＥでその移動度に基づき約１８ｋＤａの見かけ上の分子量を有する。Ｂａｌｂ／Ｍｋ細胞上での精製ＫＧＦｄｅｓ１−２３の比活性は、ＰＣＴ特許出願第ＷＯ９０／０８７７１号に記載のように、約２．５×１０７ユニット／ミリグラム（ＥＤ５０４０ｐｇ／ｍｌ）であり、細胞増殖アッセイで比較する場合、ｒＫＧＦ１６３タンパク質の比活性、またはａＦＧＦの比活性より約７〜１０倍大きく、そしてｒＫＧＦ１６３を化学的に規定した培地中でＢａｌｂ／Ｍｋ細胞でＤＮＡ合成の開始を試験することによりバイオアッセイする場合より１００倍大きい。
【００４１】
本発明の他の好ましい実施態様では、ＫＧＦｄｅｓ１−２３は、組換えＤＮＡ技術により、特に大量生産販売のために生産される。さらに好ましい実施態様では、本発明によるＫＧＦｄｅｓ１−２３またはそのアナログをそれぞれ含む組換えＤＮＡ分子および発現ベクターは、当該分野で周知の方法を用いて、標準遺伝子発現技術により実施される。
【００４２】
さらなる実施態様では、ＫＧＦｄｅｓ１−２３をコードするＤＮＡを含むＤＮＡまたはベクターは、細菌、哺乳動物、酵母、または昆虫細胞発現系で発現され得る。好ましい実施態様では、細菌または酵母細胞の発現系は、ＫＧＦｄｅｓ１−２３フラグメントの生産にとって理想である。他の好ましい実施態様では、ＤＮＡまたはベクターは、昆虫細胞発現系で発現される。
【００４３】
本発明のＫＧＦフラグメントは、レセプター認識部位の同定、およびペプチドアゴニストまたはアンタゴニストの設計に使用され得る。さらに、ケラチノサイトに対するＫＧＦの独特な特異性である、血管内皮細胞または線維芽細胞の増殖を誘導し得ない能力および細胞毒の欠損を考慮して、本発明の他の実施態様では、ＫＧＦｄｅｓ１−２３は、好ましくは、特に、皮膚の上皮再形成の促進を所望する場合、創傷治癒適用のために使用される。好ましい実施態様では、ＫＧＦ ｄｅｓ１−２３は、角膜の上皮修復で使用される。ＫＧＦｄｅｓ１−２３の他の適用は、胃腸管内に見られる表皮細胞に対するその特異性に基づいて想定され得る。
【００４４】
皮膚修復について、上皮成長因子（「ＥＧＦ」）、血小板由来の成長因子（「ＰＤＧＦ」）、および他のＦＧＦのような他の成長因子以外の本明細書におけるＫＧＦフラグメントの選択は、当業者の技術範囲内である。例えば、他の成長因子は、ケラチノサイト増殖を直接的または間接的のいずれかで刺激するのに加えて、線維増殖および脈管形成を誘導する。皮膚修復では、このような特別な活性は瘢痕形成のような所望でない副作用を生成し得る。創傷または手術のいずれかを含む角膜修復では、これらの他の因子の使用は、角膜内に血管侵入を誘導し、所望でない角膜不透明または浮腫を生じる。他方では、ＫＧＦは、ケラチノサイトにとって独特な特異性を有し、そして血管内皮細胞または線維芽細胞の増殖を誘導せず、そして従って、これらの特定の創傷治癒適用のために選択した薬剤である。
【００４５】
さらに、本発明のＫＧＦフラグメントは、ＫＧＦフラグメント／毒素結合体の形態で本発明の他の実施態様で用いられ得る。このような結合体は、上皮から基底層のケラチノサイトの過剰増殖を生じる乾癬のような疾患における疾患のプロセスを減衰させ得るか、または停止し得る。この結合体は、血管内皮細胞および線維芽細胞のような、これらの組織に存在する他の２つの主要な細胞型に影響を及ぼさない。
【００４６】
本発明の他の実施態様では、ＫＧＦフラグメント／毒素結合体は、腫瘍細胞増殖、例えば、基底細胞癌を根絶するために用いられ得る。
【００４７】
本発明の実施は、他に指示がなければ、当該分野の技術範囲内にある分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来の技法を使用する。このような技法は文献で十分に説明されている。例えば以下を参照のこと：
【００４８】
【表１Ａ】
【００４９】
【表１Ｂ】
アミノ酸の標準略語は、本明細書中の図１およびその他で用いられる。本明細書中に引用した全ての刊行物、特許、および特許出願は参考として援用される。説明のために、本明細書で用いる用語を下記により特定的に定義する。
【００５０】
（定義）
本明細書で用いる用語「ケラチノサイト増殖因子」または「ＫＧＦ」は、構造的に異なるタンパク質である線維芽細胞成長因子、ＦＧＦのファミリーに属するポリペプチドを意味し、このタンパク質は、それらが関連するファミリーの遺伝子にコードされていることを示唆する配列相同性の変化程度を呈示する。ＫＧＦは、本明細書の他の所に記載された特性を有し、例えば、ＦＧＦＲ−３に結合し、そして上皮細胞、特にケラチノサイトの成長を刺激し得る。完全長ＫＧＦは、１６３アミノ酸残基からなる。
【００５１】
本明細書で用いる本発明のＫＧＦフラグメントは、成熟完全長ＫＧＦのアミノ酸配列の一部分からなるポリペプチドである。本明細書で用いるＫＧＦフラグメントのアナログは、ＫＧＦフラグメントの特性に実質的に影響しないＫＧＦフラグメントの主要ではない挿入、欠失、または置換を含む。例えば、保存的アミノ酸置換が予測される。このような置換は、例えば、アミノ酸の側鎖に関連するアミノ酸ファミリー内で起こる。アミノ酸のファミリーは、（１）酸性：アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性：リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性：アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）非荷電極性：グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシンを含む。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、時折芳香族アミノ酸のファミリーとして共同に分類される。特に、ポリペプチドの活性部位の外側領域でロイシンをイソロイシンまたはバリンで、またはアスパラギン酸をグルタミン酸で、またはトレオニンをセリンで置換する孤立置換、もしくはアミノ酸を構造的な関連アミノ酸で置換する同様の保存的置換からなる保存的アミノ酸置換は、ポリペプチドの特性に大きな影響を有さないことが、一般に認められている。
【００５２】
ＫＧＦフラグメントの特性は、（ｉ）成熟完全長天然ＫＧＦ分子と比較して、上皮細胞増殖の刺激を、２〜１０倍、好ましくは２倍、最も好ましくは７〜１０倍増加するようなその生物学的活性、および（ｉｉ）ＦＧＦＲ−３に結合するその能力を含む。
【００５３】
本明細書で用いる用語「組換えポリヌクレオチド」は、半合成、または合成起源、もしくはｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ（「ｇＤＮＡ」）にコードされたポリヌクレオチドを意味し、それは、（１）天然で会合するポリヌクレオチドの全てまたは一部分と会合しない、（２）天然で連結するポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドに連結する、あるいは（３）天然に存在しない。
【００５４】
「レプリコン」は、任意の遺伝要素、例えば、プラスミド、染色体、ウイルス、コスミドなどであり、それは、細胞内でポリヌクレオチド複製の自律単位として挙動する；すなわち、それは、それ自身の制御下で複製し得る。レプリコンは、例えば、選択マーカーを含み得る。
【００５５】
「組換えベクター」は、他のポリヌクレオチドセグメントが付加されるレプリコンであり、付加したポリヌクレオチドセグメントの複製および／または発現をもたらす。
【００５６】
「調節配列」は、ポリヌクレオチド配列が作動可能に連結されるコーディング配列の発現の調節に必要なポリヌクレオチド配列を意味する。このような調節配列の性質は、コーディング配列が発現されるべき宿主細胞に依存して異なる。原核生物では、このような調節配列は、例えば、一般にプロモーター、リボソーム結合部位、および／または転写終結配列を含む。真核生物では、一般にこのような調節配列は、プロモーターおよび／または転写終結配列を含む。用語「調節配列」はまた、その存在が有益な付加成分、例えば、発現されるべきポリペプチドの分泌をコードする分泌リーダー配列を含み得る。
【００５７】
「作動可能に連結された」は、成分が、意図した様式で機能し得るような関係で連結している並置を意味する。例えば、調節配列は、コーディング配列の発現が、調節配列に適合した条件下で達成されるように、それが接続される場合、コーディング配列に「作動可能に連結されて」いる。
【００５８】
「コーディング配列」は、適切な調節配列の制御下に置かれた場合、ポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチド配列である。コーディング配列の境界は、一般にその５’末端の翻訳開始コドンおよびその３’末端の翻訳終止コドンにより決定される。コーディング配列は、例えば、ｃＤＮＡ、および組換えポリヌクレオチド配列を含み得る。
【００５９】
「ＰＣＲ」は、Ｓａｉｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ ３２４：１６３（１９８６）；およびＳｃｈａｒｆら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３：１０７６−１０７８（１９８６）；米国特許第４，６８３，１９５号；および米国特許第４，６８３，２０２号に記載するポリメラーゼ連鎖反応の技術を意味する。
【００６０】
本明細書で用いる用語「ポリペプチド」は、アミノ酸のポリマーを意味し、そして生成物の特定の長さを意味しない。従って、ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質は、この用語内に包含される。この用語はまた、ポリペプチドの翻訳修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などを包含する。定義内に包含されるものは、置換した結合を有するポリペプチド、および当該分野で公知のその他の改変で、天然に存在するおよび天然に存在しない両方のポリペプチドである。
【００６１】
本明細書で用いる「ターミネーター」は、コーディング配列の終止コドンの３’または下流に位置するポリアデニル化および転写終結配列のような調節配列である。
【００６２】
「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞培養物」、および他のこのような用語は、例えば、微生物、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を意味し、これは、組換えベクターまたは他の転移ＤＮＡを導入するためのレシピエントとして用いられ得るかまたは用いられており、そして形質転換された細胞の子孫を含む。このような子孫は、形態もしくはゲノムＤＮＡまたは全ＤＮＡの相補性が元の親と必ずしも同一ではなく、そして天然、偶発的、または意図的な変異によって生成され得る。哺乳動物宿主細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣（「ＣＨＯ」）およびサル腎臓（「ＣＯＳ」）細胞を含む。
【００６３】
本細書で用いる用語「微生物」は、細菌および真菌のような原核生物および真核生物の微生物種を含み、後者は、酵母および糸状菌を含む。
【００６４】
本明細書で用いる「形質転換」は、宿主細胞への外因性ポリヌクレオチドの転移を意味し、転移に用いた方法、例えば、感染、直接取り込み、形質導入、Ｆ因子交配、マイクロインジェクション、またはエレクトロポレーションにかかわらない。外因性ポリヌクレオチドは、非組み込みベクター、例えば、プラスミドとして維持され得、またはあるいは、宿主ゲノムに組み込まれ得る。
【００６５】
ポリペプチドまたはヌクレオチド配列に関する「精製」および「単離」は、示す分子が、同じ種または型の他の生物学的高分子が実質的にない状態で存在することを意味する。本明細書で用いる用語「精製」は、同じ型の生物学的高分子が少なくとも７５重量％；好ましくは少なくとも８５重量％、さらに好ましくは少なくとも９５重量％、最も好ましくは９８重量％存在することを意味するが、水、緩衝液、および他の小分子、特に、１０００未満の分子量を有する分子もまた存在し得る。
【００６６】
「薬学的に受容可能なキャリア」は、抗体、熱などの生成のような所望しない副作用をそれ自身誘導しないヒトへの投与のために、当業者により用いられる任意のキャリアを意味する。適切なキャリアは、典型的には大きく、ゆっくりと代謝される高分子（それはタンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸コポリマー、または非活性ウイルス粒子であり得る）である。他のキャリアは、当業者に周知である。好ましくは、キャリアは、チログロブリンを含む。
【００６７】
治療用組成物は、典型的には、薬学的に受容可能なキャリア、例えば、水、生理食塩水、グリセロール、エタノールなどを含有し得る。さらに、補助剤、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝化剤などが、このような組成物中に存在し得る。
【００６８】
本明細書で用いる「治療有効量」は、所望の結果の生成に効果的な量を意味する。この量は、処置されるべき個体の健康および身体状態、抗体を合成する個々の免疫系の能力、所望の防御程度、製剤、処置する医師の病状の評価、および他の関連因子に依存し得る。この量は、一般検査により決定され得る相対的に広い領域に入り得ることが予期される。
【００６９】
ＫＧＦが昆虫細胞Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（「ＳＦ９」）で、ＫＧＦ１６３をコードするｃＤＮＡを含む組換えバキュロウイルスＡｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａの感染により発現される場合、それらは、ＫＧＦ１６３に加えて、単一なグリコシル化部位を含むＫＧＦ１６３Ｎ末端ドメインの最初の２３アミノ酸残基を欠失するＫＧＦフラグメントを生産する。短縮型の非グリコシル化ＫＧＦフラグメントＫＧＦｄｅｓ１−２３またはＫＧＦ１４０は、ＫＧＦ１６３として同定された天然の長形態に較べて、標的細胞に対して７〜１０倍増加した能力を有する。 ＫＧＦｄｅｓ１−２３の標的細胞特異性は、変化しない。さらに、高濃度のＫＧＦフラグメントでは、ケラチノサイトについての毒性効果は、ＫＧＦ１６３について観察されたのに較べて全く観察されない。これらの観察は、ＰＣＴ出願第ＷＯ９０／０８７７１号で既に提唱されたことに反して、ＫＧＦの標的細胞特異性が、そのＮ末端ドメインの残基にないことを示唆する。さらに、本発明は、ＫＧＦのＮ末端短縮型バージョンが、実際に、治療用適用のためのさらに高い生物学的活性および細胞毒の減少を有する改良ＫＧＦバージョンを表すことを示す。
【００７０】
大量のＫＧＦフラグメントは、組換えＤＮＡ技術により生産され得、組換えＤＮＡ技術は、天然供給源からＫＧＦを単離して精製し、そしてそのＮ末端から最初の２３アミノ酸残基を切除するもう一方のプロセスより好ましい。組換え技術により生産されるＫＧＦが、細胞中に通常存在する混入分子の非存在下で、ＫＧＦが単離されることを可能にする。実際に、いかなる微量のヒトタンパク質混入物質も完全に含まないＫＧＦ組成物は、例えば、細菌細胞、酵母細胞、および昆虫細胞で容易に生産され得る。組換えＤＮＡ技術の使用により、部位特異的変異誘発により生産され得る変異型のような、天然で見られないＫＧＦフラグメントもまた、生産され得る。
【００７１】
所望の宿主でのＫＧＦフラグメントの発現を可能にする任意のプロモーターが、本発明で用いられ得る。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉでは、ｌａｃオペロンの調節プロモーター配列が用いられ得る。他の例は、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ（「ＡＤＨ」）プロモーターであり、それは、ＡＤＨプロモーターの活性を調節する上流アクチベーター配列（「ＵＡＳ」）を有する。さらに、特定のウイルスエンハンサーもまた、本明細書で用いられ得る。このようなエンハンサーは、哺乳動物細胞において増幅するだけでなく、発現を調節する。これらのエンハンサーは、Ｓａｓｓｏｎｅ−ＣｏｒｓｉおよびＢｏｒｅｌｌｉ Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．２：２１５（１９８６）；Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２３６：１２３７（１９８７）に記載のように、哺乳動物のプロモーター配列に組み込まれ、この哺乳動物プロモーター配列は、ホルモンまたは酵素基質のような誘導物質の存在下でのみ活性化し得る。本発明で用いられ得るプロモーターはまた、バキュロウイルスポリヘドロンハイブリッドプロモーターおよびｐ１０プロモーターを含む。
【００７２】
本発明で用いられ得る終結配列の例は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ α因子ターミネーターおよびバキュロウイルスターミネーターである。さらに、特定の宿主細胞で作動可能なウイルスターミネーターもまた、用いられ得る。例えば、ＳＶ４０ターミネーターは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で機能する。
【００７３】
短縮型タンパク質を設計する場合、いくつかのＫＧＦが、本発明の実施において好ましい。１つは、非グリコシル化ＫＧＦであり、例えば、天然ＫＧＦの最初の２３アミノ酸を切除している非グリコシル化ＫＧＦである。好ましい短縮型ＫＧＦをコードするｃＤＮＡを図１に示す。ＫＧＦフラグメントの他の種は、存在するか、または一般的な方法により作製され得る。示された配列において、短縮型タンパク質のための開裂部位が、矢印（ａ）で示される場所に生じ得、約１８，０００Ｄａの分子量を有するタンパク質を生じる。図１の配列データーおよび短縮型ＫＧＦの示された特徴を利用して、短縮型ＫＧＦをコードする他のＤＮＡ配列を得ることは、当該分野の技術範囲内にある。例えば、構造遺伝子は、正しいアミノ酸を保持しながら個々のヌクレオチドを変えること、または生物学的活性を損失せずにアミノ酸を改変するようにヌクレオチドを変えることにより操作され得る。ヌクレオチドは、例えば、インビトロでの変異誘発およびプライマー修復を含む公知の技術により置換、挿入、または欠失され得る。構造遺伝子は、その生物学的活性を保持しながら、その３’末端および／またはその５’末端で短縮され得る。
【００７４】
ＫＧＦフラグメントコーディング配列は、ＫＧＦフラグメントをコードするＤＮＡ配列を合成すること、もしくは所望の配列の生産のために存在しているまたは天然のＫＧＦコーディング配列を変化することにより構築され得る。天然ＫＧＦコーディング配列またはポリペプチドは、天然に生じる。天然ＫＧＦのアミノ酸配列を［図１］に示す。合成ＫＧＦフラグメントは、Ｕｒｄｅａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：７４６１（１９８３）で示唆されるように、ＫＧＦの公知のアミノ酸配列に基づき、選択した宿主細胞に好ましいコドンを用いて作製され得る。あるいは、所望のＫＧＦフラグメントコーディング配列は、［図１］に示す核酸配列に基づくプローブを用いて核酸ライブラリーからクローニングされ得る。核酸配列ライブラリーの生産およびプローブ化（ｐｒｏｂｉｎｇ）のための技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８０）に記載されている。他の組換え技術、例えば、部位特異的変異誘発、ＰＣＲ、酵素的切断および連結もまた、ＫＧＦフラグメントのコーディング配列のアナログおよび誘導体を構築するため用いられ得る。天然ＫＧＦポリペプチドコーディング配列は、他のクラスのＫＧＦポリペプチドを作製するために容易に改変され得る。
【００７５】
例として、ＫＧＦフラグメントのアナログは、ＫＧＦフラグメントの活性を損なわない保存的アミノ酸置換により作製される。本発明は、さらにムテイン（ｍｕｔｅｉｎ）と呼ばれるＫＧＦフラグメントのアナログのサブセットを意図しており、ムテインでは、ＫＧＦフラグメントのジスルフィド結合に関与しないシステインが通常は、セリンに置換されている。これらのムテインは、非改変ＫＧＦフラグメントより広い温度領域にわたり安定である。本明細書中のムテインはまた、天然ＫＧＦフラグメントと比較してアミノ酸欠失を含み得る。ムテインは、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも５０％、および最も好ましくは少なくとも８０％の天然ＫＧＦフラグメントの活性を保持し得る。ムテインのコーディング配列は、天然ＫＧＦフラグメントのコーディング配列のインビトロでの変異誘発により構築され得る。
【００７６】
フラグメントは、アミノおよび／またはカルボキシル末端アミノ酸欠失により天然ＫＧＦ分子と異なる。ＫＧＦフラグメントが、Ｎ末端グリコシル化部位を含まず、そして天然ＫＧＦ分子の少なくとも２０％のＫＧＦ活性を保持するなら、短縮されたアミノ酸の数は重大でない。このようなフラグメントのコーディング配列は、天然ＫＧＦコーディング配列またはその変異体由来の所望でないヌクレオチドを開裂することにより容易に構築され得る。
【００７７】
本発明の範囲内の発現ベクターは、宿主細胞で作動可能であり、そしてＫＧＦフラグメントまたはアナログのコーディング配列に作動可能に連結されるプロモーターを含む。発現ベクターは、分泌のためのシグナル配列、ターミネーター、選択マーカー、複製起点、および宿主細胞配列と同種（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）の配列を任意に含み得る。これらの追加的な要素は、発現を最適化するために含まれ得る。
【００７８】
機能的な非天然プロモーターもまた用いられ得、例えば、異なるプロモーターの共通配列に基づいた合成プロモーターであり得る。また、効果的なプロモーターは、異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）の発現開始領域と連結した調節領域を含むハイブリッドプロモーターであり得る。ハイブリッドプロモーターの例は、Ｅ．ｃｏｌｉ ｔａｃ転写活性領域に連結したＥ．ｃｏｌｉ ｌａｃオペレーター；本明細書に参考として援用される米国特許第４，８７６，１９７号および第４，８８０，７３４号に記載のような、酵母グリセルアルデヒド−３−ホスフェート−デヒドロゲナーゼ（「ＧＡＰＤＨ」）に連結した酵母アルコールデヒドロゲナーゼ（「ＡＤＨ」）調節配列；およびシミアンウイルスＳＶ４０プロモーターに連結したサイトメガロウイルス（「ＣＭＶ」）エンハンサーである。
【００７９】
本発明のＫＧＦフラグメントまたはアナログのコーディング配列はまた、読み取り枠でシグナル配列に結合され得る。シグナル配列は、典型的には、疎水性アミノ酸からなる分泌のためのアミノ酸配列をコードしＫＧＦフラグメントまたはアナログを細胞膜に導く。好ましい実施態様では、プロセッシング部位は、シグナル配列とＫＧＦフラグメントとの間に位置し、インビボまたはインビトロのいずれかでシグナル配列およびＫＧＦフラグメントの間を開裂し得る。適切なシグナル配列は、分泌される内因性宿主細胞タンパク質に対する遺伝子由来であり、例えば、ヨーロッパ特許第１２８７３号および日本特許第６２，０９６，０８６号に記載の酵母インベルターゼ、米国特許第４，５８８，６８４号に記載のＡ因子遺伝子、およびＥＰ６００５７に記載のようなインターフェロンシグナル配列である。
【００８０】
酵母での発現のために本発明で用いる好ましいクラスの分泌リーダーは、短縮型酵母α因子リーダー配列であり、それは、「プレ」シグナル配列の少なくとも一部分および「プロ」領域を含む。本明細書に参考として援用される米国特許第４，５４６，０８３号および第４，８７０，００８号、ならびにヨーロッパ特許第ＥＰ３２４２７４号に記載のように、本明細書中で使用され得るα因子リーダー配列は、約８３アミノ酸残基を有する完全長プレ−プロα因子リーダー、および典型的には、約２５〜約５０アミノ酸残基を含む短縮型α因子リーダーであり得る。本明細書で用いられ得るα因子リーダーフラグメントを使用する付加的なリーダーは、第二の酵母α因子由来のプロ領域ではなく、第一の酵母シグナル配列のプレ配列で作られるハイブリッドα因子リーダーを含む。（例えば、ＰＣＴ
ＷＯ８９／０２４６３を参照のこと。）
（ｆ．発現システム）
ＫＧＦフラグメントおよびそのアナログは、当業者に十分に理解されるように、ＫＧＦフラグメントまたはアナログをコードするＤＮＡ配列がベクターに適切な読み取り枠および方向で作動可能に連結される場合、組換え技術により発現され得る。ＫＧＦフラグメントを含む遺伝子構築物を作成する場合、好ましい出発材料は、ＫＧＦフラグメントをコードしているｃＤＮＡである。ＫＧＦフラグメントはまた、所望する場合、開裂され得るハイブリッドタンパク質として生産され得るが、典型的には、短縮型ＫＧＦ遺伝子は、プロモーターより下流に挿入され得、そして後ろにターミネーター配列が続き得る。一般に、短縮型ＫＧＦおよび短縮型ＫＧＦポリペプチド誘導体の生産収量を改善する宿主細胞特異的配列が用いられ得、そして適切な制御配列、例えば、エンハンサー配列、ポリアデニル化配列、およびリボソーム結合部位が発現ベクターに付加され得る。一旦、適切なコーディング配列が単離されること、それは、種々の異なる発現系；例えば、哺乳動物細胞、バキュロウイルス、細菌、および酵母で使用され、発現され得る。これらは、以下に考察される。
【００８１】
（ｉ．哺乳動物系）
哺乳動物発現系は、当該分野で公知である。哺乳動物プロモーターは、哺乳動物ＲＮＡポリメラーゼを結合し、そしてコーディング配列（例えば、構造遺伝子）のｍＲＮＡへの下流（３‘）転写を開始し得る任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは転写開始領域、それは、通常コーディング配列の５’末端に隣接する位置にあり、および転写開始部位の２５〜３０塩基対（ｂｐ）上流に位置するＴＡＴＡボックスを有し得る。 ＴＡＴＡボックスは、ＲＮＡ合成を正しい部位で始めるために、ＲＮＡポリメラーゼＩＩに指示すると考えられている。動物細胞のプロモーターはまた、上流のプロモーター要素（典型的には、ＴＡＴＡボックスの１００〜２００ｂｐ上流内に位置する）を含み得る。上流のプロモーター要素は、転写が開始される速度を決定しどちらかの方向に作用し得る［Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）「哺乳動物細胞におけるクローン化遺伝子の発現。」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版］。
【００８２】
哺乳動物のウイルス遺伝子は、しばしば高発現され、そして広い宿主領域を有する；従って、哺乳動物ウイルス遺伝子をコードしている配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。この例として、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳ガンウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ）、および単純ヘルペスウイルスプロモーターが含まれる。さらに、非ウイルス遺伝子、例えば、ネズミメタロチオネイン遺伝子由来の配列はまた、有用なプロモーター配列を提供する。発現は、構成的か、調節的（誘導性）のいずれかであり得、プロモーターがホルモン応答細胞におけるグルココルチコイドで誘導され得ることに依存する。
【００８３】
上記のプロモーター要素と結合したエンハンサー要素（エンハンサー）の存在は、典型的には、発現レベルを増加する。エンハンサーは、同種または異種プロモーターと連結されるとき、正常なＲＮＡ開始部位で合成を開始する場合に１０００倍まで転写を刺激し得る調節ＤＮＡ配列である。エンハンサーはまた、それらが転写開始部位から上流または下流に、正常または逆の向きで、もしくはプロモーターから１０００ヌクレオチオド以上の距離に位置する場合、活性である［Ｍａｎｉａｔｉｓら、（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：１２３７；Ａｌｂｅｒｔｓら、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ，第２版］。ウイルス由来のエンハンサー要素は特に有用である。なぜなら、それらは、典型的には、より広い宿主領域を有するからである。この例として、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー［Ｄｉｊｋｅｍａら、（１９８５）ＥＭＢＯ Ｊ．４：７６１］およびラウス肉腫ウイルスの長末端反復（ＬＴＲ）由来［Ｇｏｒｍａｎら、（１９８２ｂ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７９：６７７７］、およびヒトサイトメガロウイルス［Ｂｏｓｈａｒｔら、（１９８５）Ｃｅｌｌ ４１：５２１］由来のエンハンサー／プロモーターが含まれる。さらに、いくつかのエンハンサーは調節可能であり、そしてホルモンまたは金属イオンのような誘導物質の存在下でのみ活性になる［Ｓａｓｓｏｎｅ−ＣｏｒｓｉおよびＢｏｒｅｌｌｉ（１９８６）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．２：２１５；Ｍａｎｉａｔｉｓら、（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：１２３７］。
【００８４】
ＤＮＡ分子は、哺乳動物細胞において細胞内発現され得る。プロモーター配列は、ＤＮＡ分子と直接連結し得、その場合、組換えタンパク質のＮ末端の最初のアミノ酸は常にメチオニンであり、メチオニンは、ＡＴＧ開始コドンによりコードされている。所望であれば、Ｎ末端は、インビトロで臭化シアンとともにインキュベートすることでタンパク質から開裂され得る。
【００８５】
あるいは、外来タンパク質はまた、哺乳動物細胞において外来タンパク質の分泌を提供するリーダー配列フラグメントからなる融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子を作成することにより、細胞から成長培地へ分泌され得る。好ましくは、リーダーフラグメントと、インビボまたはインビトロのいずれかで開裂され得る外来遺伝子との間にコードされるプロセッシング部位がある。リーダー配列フラグメントは、典型的には、細胞からのタンパク質の分泌を指向する疎水性アミノ酸からなるシグナルペプチドをコードする。アデノウイルス三部分（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダーは、哺乳動物細胞において外来タンパク質の分泌を提供するリーダー配列の１例である。
【００８６】
典型的には、哺乳動物細胞により認識される転写終結およびポリアデニル化配列は、３’から翻訳終止コドンに位置する調節領域であり、そしてそれ故プロモーター要素とともにコーディング配列に隣接する。成熟ｍＲＮＡの３’末端は、部位特異的な転写後の開裂およびポリアデニル化により形成される［Ｂｉｒｎｓｔｉｅｌら、（１９８５）Ｃｅｌｌ
４１：３４９；ＰｒｏｕｄｆｏｏｔおよびＷｈｉｔｅｌａｗ（１９８８）「真核生物ＲＮＡの終結および３’末端プロセッシング」、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｐｌｉｃｉｎｇ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＤ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ（１９８９）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１４：１０５］。これらの配列は、ＤＮＡにコードされるポリペプチドに翻訳され得るｍＲＮＡの転写を指向する。転写ターミネーター／ポリアデニル化シグナルの例は、ＳＶ４０由来のそれらを含む［Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）「培養哺乳動物細胞におけるクローニングされた遺伝子の発現」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ。
【００８７】
いくつかの遺伝子は、イントロン（介在配列とも言う）が存在する場合、さらに効果的に発現され得る。しかし、いくつかのｃＤＮＡは、スプライシングシグナル（スプライス供与体および受容体部位ともいう）を欠いたベクターから効率的に発現された［ＧｏｔｈｉｎｇおよびＳａｍｂｒｏｏｋ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９３：６２０を参照のこと］。イントロンは、スプライス供与体および受容体部位を含む、コーディング配列内に介在する非コーディング配列である。それらは、一次転写物のポリアデニル化後「スプライシング」と呼ばれるプロセスにより取り除かれる［Ｎｅｖｉｎｓ（１９８３）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５２：４４１；Ｇｒｅｅｎ（１９８６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２０：６７１；Ｐａｄｇｅｔｔら、（１９８６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５５：１１１９；ＫｒａｉｎｅｒおよびＭａｎｉａｔｉｓ（１９８８）「ＲＮＡスプライシング」、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｐｌｉｃｉｎｇ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＤ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ編）。
【００８８】
典型的には、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、および転写終結配列を含む上記の構成成分は、一緒に発現構築物中に置かれる。エンハンサー、機能的なスプライス供与体および受容体部位を有するイントロン、ならびにリーダー配列はまた、所望する場合、発現構築物中に含まれる。発現構築物は、哺乳動物細胞または細菌のような宿主において安定に維持し得る染色体外要素（例えば、プラスミド）のようなレプリコン中にしばしば維持される。哺乳動物の複製系は、動物ウイルス由来の系を含み、それは、複製にトランスに作用する因子を必要とする。 例えば、ＳＶ４０［Ｇｌｕｚｍａｎ（１９８１）Ｃｅｌｌ ２３：１７５］のようなパポーバウイルスまたはポリオーマウイルスの複製系を含むプラスミドは、適切なウイルスＴ抗原の存在下できわめて高いコピー数に複製する。哺乳動物のレプリコンの別の例は、ウシパピローマウイルスおよびエプスタインバーウイルス由来のレプリコンを含む。さらに、レプリコンは、２つの複製系を有し得、従って、例えば、発現のために哺乳動物細胞で、およびクローニングおよび増幅のために原核生物宿主で維持され得る。このような哺乳動物−細菌シャトルベクターの例は、ｐＭＴ２［Ｋａｕｆｍａｎら、（１９８９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：９４６およびｐＨＥＢＯ［Ｓｈｉｍｉｚｕら、（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：１０７４］を含む。
【００８９】
用いた形質転換手順は、形質転換されるべき宿主に依存する。異種ポリヌクレオチドを哺乳動物細胞へ導入するための方法は、当該分野で公知であり、そしてデキストラン仲介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈澱、ポリブレン仲介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム内へのポリヌクレオチドのカプセル化、および核へのＤＮＡの直接マイクロインジェクションを含む。
【００９０】
発現のための宿主として利用できる哺乳動物細胞株は当該分野で公知であり、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、および多くのその他の細胞株を含むがこれに限定されない、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｔｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株を含む。
【００９１】
（ｉｉ．バキュロウイルス系）
ＫＧＦをコードしているポリヌクレオチドは、安定な発現ベクター、例えば昆虫細胞発現ベクター中に挿入され得、そしてベクター内で制御要素に作動可能に連結され得る。ベクターの構築は、当該分野で公知の技術を使用して行われる。特に、本発明の目的のため、バキュロウイルス発現ベクターが、Ｋｉｔｔｓら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４：８１０−８１７（１９９３）に実質的に従って構築される。
【００９２】
簡単に説明すると、バキュロウイルスゲノムの一部（本明細書中では、「バキュロウイルス配列」と呼ばれている）に相同性があり、そしてそれと相同的組換えを行い得るポリヌクレオチド配列を含むトランスファーベクターに、ＫＧＦ１６３をコードしている配列を挿入することによって、 ＫＧＦ発現カセットを最初に構築する。バキュロウイルス配列は、以下により詳しく記載されているように、必須のポリヌクレオチド配列を少なくとも含む。ＫＧＦコーディング配列は、バキュロウイルス配列が両端に位置するようにトランスファーベクターに挿入される。
【００９３】
ＫＧＦコーディング配列を含むトランスファーベクターを、機能的なウイルスの生産に必要な必須のポリヌクレオチド配列を欠いている野生型バキュロウイルスの変異体とともに宿主昆虫細胞中にトランスフェクトする。この点に関して、変異体のバキュロウイルスがＫＧＦ発現カセットと組換わるときトランスフェクションに際し機能的なウイルスが宿主細胞中で産生され得る。
【００９４】
従って、この様式で産生される機能的なバキュロウイルスは、ＫＧＦ発現カセットを組み込み、そして組換えＫＧＦおよび組換えＫＧＦｄｅｓ１−２３を産生するために、新たな宿主細胞のトランスフェクションに適切である。あるいは、このプロセスは、ＫＧＦ１６３コーディング配列の代わりにＫＧＦｄｅｓ１−２３コーディング配列を用いて実施され得る。
【００９５】
一般に、発現系の構成成分は、バキュロウイルスゲノムのフラグメント、および異種遺伝子または発現されるべき遺伝子の挿入に便利な制限部位の両方を含むトランスファーベクター（通常は細菌プラスミド）を含む機能的なバキュロウイルス；トランスファーベクター中のバキュロウイルス特異的フラグメントに相同な配列を有する野生型バキュロウイルス（これは、バキュロウイルスゲノムに異種遺伝子の相同組換えを可能にする）；および適切な昆虫宿主細胞および成長培地を含む。
【００９６】
短縮型ＫＧＦ ＤＮＡ配列をトランスファーベクターに挿入後、ベクターおよび野生型ウイルスゲノムを、ベクターおよびウイルスゲノムが組換えられ得る昆虫宿主細胞にトランスフェクトする。パッケージ化された組換えウイルスを発現し、そして組換えプラークを同定し、そして精製する。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系の材料および方法は、前記のＩｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡからキット形態（「ＭａｘＢａｃ」キット）で市販されている。これらの技術は、一般に、当業者に公知であり、そしてＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ，Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５（１９８７）（本明細書では以後、「ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ」と称する）に十分に記載され、そして参考として援用されている。
【００９７】
短縮型ＫＧＦ ＤＮＡ配列をバキュロウイルスゲノムに挿入する前に、プロモーター、リーダー（所望の場合）、目的のコーディング配列、および転写終結配列を含む上記の構成成分を、代表的には、中間導入配置構築物（トランスファーベクター）にアセンブルする。この構築物は、単一の遺伝子および作動可能に連結した調節要素；それぞれが作動可能に連結したそれ自身の調節要素のセットを有する複数の遺伝子；または調節要素の同じセットにより調節されているは複数の遺伝子を含み得る。中間導入配置構築物を、しばしば細菌のような宿主で安定に維持し得る染色体外要素（例えば、プラスミド）のようなレプリコン中に維持し得る。レプリコンは複製系を有し、従ってクローニングおよび増幅のために適切な宿主中で、それは維持され得る。
【００９８】
現在では、ＡｃＮＰＶに外来遺伝子を導入するために最も一般的に用られるトランスファーベクターはｐＡｃ３７３である。当業者に公知である多くの他のベクターもまた設計された。これらは、例えば、ｐＶＬ９８５（これは、ポリヘドリン開始コドンをＡＴＧからＡＴＴに改変し、そしてＡＴＴから３２塩基対下流にＢａｍＨＩクローニング部位を導入する；ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８９）１７：１３を参照のこと）を含む。
【００９９】
プラスミドはまた、通常ポリヘドリンポリアデニル化シグナル（Ｍｉｌｌｅｒら（１９８８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４２：１７７）、ならびにＥ．ｃｏｌｉにおける選択および増殖のための原核生物のアンピシリン耐性（ａｍｐ）遺伝子および複製起点を含む。
【０１００】
バキュロウイルストランスファーベクターは、通常バキュロウイルスプロモーターを含む。バキュロウイルスプロモーターは、バキュロウイルスＲＮＡポリメラーゼを結合し得、そしてコーディング配列（例えば、構造遺伝子）のｍＲＮＡへの下流（５’から３’）転写を開始し得る任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常、コーディング配列の５’末端に隣接して位置する転写開始領域を有する。この転写開始領域は、典型的には、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。バキュロウイルストランスファーベクターはまた、エンハンサーと呼ばれる第二ドメインを有し得、存在する場合は、通常構造遺伝子から遠位にある。発現は、調節され得るか、または構成的であり得る。
【０１０１】
構造遺伝子は、ウイルス感染サイクルの後期に盛んに転写され、特異的に有用なプロモーター配列を提供する。この例として、ウイルスポリヘドリンタンパク質をコードする遺伝子、Ｆｒｉｅｓｅｎら、（１９８６）「バキュロウイルス遺伝子発現の調節」、Ｔｈｅ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ（Ｗａｌｔｅｒ Ｄｏｅｒｆｌｅｒ編）；ＥＰＯ公開番号第１２７，８３９号および第１５５，４７６号；およびｐ１０タンパク質をコードする遺伝子、Ｖｌａｋら、（１９８８），Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：７６５由来の配列が含まれる。
【０１０２】
適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、分泌される昆虫タンパク質または分泌されるバキュロウイルスタンパク質、例えば、バキュロウイルスポリヘドリン遺伝子（Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら、（１９８８）Ｇｅｎｅ，７３：４０９）に由来する遺伝子であり得る。あるいは、哺乳動物細胞の翻訳後の修飾（例えば、シグナルペプチド開裂、タンパク質分解開裂、およびリン酸化）のためのシグナルが、昆虫細胞により認識されるようであり、そして分泌および核蓄積に必要なシグナルもまた、無脊椎動物細胞および脊椎動物細胞の間で保存され得るようであるので、昆虫起源でないリーダー、例えば、ヒトα−インターフェロン、Ｍａｅｄａら、（１９８５）、Ｎａｔｕｒｅ ３１５：５９２；ヒトガストリン放出ペプチド、Ｌｅｂａｃｑ−Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎら、（１９８８）、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３１２９；ヒトＩＬ−２、Ｓｍｉｔｈら、（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：８４０４；マウスＩＬ−３、（Ｍｉｙａｊｉｍａら、（１９８７）Ｇｅｎｅ ５８：２７３；およびヒトグルコセレブロシダーゼ、Ｍａｒｔｉｎら、（１９８８）ＤＮＡ，７：９９をコードする遺伝子由来のリーダーもまた、昆虫で分泌を提供するために使用され得る。
【０１０３】
組換えポリペプチドまたはポリタンパク質は、細胞内で発現され得、もしくは、適切な調節配列で発現される場合分泌され得る。非融合の外来タンパク質の良好な細胞内発現は、通常、 ＡＴＧ開始シグナルに先行する適切な翻訳開始シグナルを含む短いリーダー配列を理想的には有する異種遺伝子を必要とする。所望であれば、Ｎ末端のメチオニンを、臭化シアンとのインビトロでのインキュベーションにより、成熟タンパク質から開裂し得る。
【０１０４】
あるいは、天然では分泌されない組換えポリタンパク質またはタンパク質は、昆虫での外来タンパク質の分泌を提供するリーダー配列フラグメントからなる融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子を作製することにより昆虫細胞から分泌され得る。リーダー配列フラグメントは、典型的には、タンパク質の小胞体中への移動を指向する疎水性アミノ酸からなるシグナルペプチドをコードする。
【０１０５】
短縮型のＫＧＦ ＤＮＡ配列および／または発現産物前駆体をコードしている遺伝子の挿入後、昆虫細胞宿主は、トランスファーベクターの異種ＤＮＡおよび野生型バキュロウイルスのゲノムＤＮＡを用いて同時形質転換され、それは、通常、同時トランスフェクションによる。構築物のプロモーターおよび転写終結配列は、典型的には、２〜５ｋｂセクションのバキュロウイルスゲノムを含む。異種ＤＮＡをバキュロウイルスの所望の部位に導入する方法は、当該分野で公知である。（ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ 上記；Ｊｕら、（１９８７）；Ｓｍｉｔｈら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８３）３：２１５６；ならびにＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ（１９８９）参照のこと）。例えば、ポリヘドリン遺伝子のような遺伝子に、相同な二重交差組換えにより挿入され得る；また所望のバキュロウイルス遺伝子中に設計された制限酵素部位にも挿入し得る。Ｍｉｌｌｅｒら、（１９８９），Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ ４：９１。ＤＮＡ配列が、ポリヘドリン遺伝子の代わりに発現ベクターにクローニングされる場合、その５’および３’の両方にポリヘドリン特異的配列が隣接し、そしてポリヘドリンプロモーターの下流に位置する。
【０１０６】
新たに形成されたバキュロウイルス発現ベクターは、次いで感染性組換えバキュロウイルスにパッケージ化される。同種の組換えが、低頻度で起こる（約１％と約５％との間）；従って、同時トランスフェクション後に産生された多くのウイルスは、なお野生型のままである。それゆえ、組換えウイルスを同定するための方法が必要である。発現系の利点は、組換えウイルスを区別できるようにする視覚化スクリーニングである。ポリヘドリンタンパク質は、天然ウイルスにより産生され、ウイルス感染後、後期に感染細胞の核に非常に高レベルで産生される。蓄積したポリヘドリンタンパク質はまた、包埋粒子を含む封入体を形成する。これらの封入体は、サイズが１５μｍまでであり、高度に屈折性であり、光学顕微鏡下で容易に視覚化される明るく光った外観を与える。組換えウイルスに感染した細胞は、封入体を欠いている。野生型ウイルスから組換えウイルスを区別するために、トランスフェクション上清を当業者に公知の技術により単層の昆虫細胞上にプラーク化する。すなわち、プラークは、光学顕微鏡下で封入体の存在（野生型ウイルスを示す）または不在（組換えウイルスを示す）についてスクリーニングされる。「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」第２巻（Ａｕｓｕｂｅｌら編）、１６．８（増刊１９９０年１０月）；ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、前述；Ｍｉｌｌｅｒら（１９８９）。
【０１０７】
組換えバキュロウイルス発現ベクターが、いくつかの昆虫細胞に感染させるために開発された。例えば、組換えバキュロウイルスは、とりわけ以下について開発された：
【０１０８】
【表２】
細胞および細胞培養培地は、バキュロウイルス／発現系におる異種ポリペプチドの指向および融合発現の両方について市販されている；細胞培養技術は、当業者に一般に公知である。例えば、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、前述を参照のこと。
【０１０９】
次いで、改変された昆虫細胞は、適切な栄養培地で成長し得、この培地は、改変された昆虫宿主に存在するプラスミドを安定的に維持し得る。発現産物の遺伝子が、誘導し得る制御下にある場合、宿主は高濃度になるまで成長され得、そして発現を誘導する。あるいは、発現が構成的である場合、産物は連続的に培地中に発現され得、そして栄養培地は連続的に循環されねばならず、その間目的の産物を取り出し、そして枯渇した栄養を増強する。この産物をクロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなど）；電気泳動；密度勾配遠心分離；溶媒抽出などのような技術により精製され得る。適切には、必要に応じて、培地に同時に分泌されるか、または昆虫細胞の溶解から生じる任意の昆虫タンパク質を実質的に除去するように、宿主の残骸（例えば、タンパク質、脂質、および多糖）を少なくとも実質的に含まない産物を提供するように、産物をさらに精製する。
【０１１０】
短縮型ＫＧＦ発現を得るために、形質転換体由来の組換え宿主細胞を、配列をコードする組換え短縮型ＫＧＦの発現を可能にする条件下でインキュベートし得る。これらの条件は、選択される宿主細胞に依存して変化し得る。しかし、条件は、当該分野で公知の事項に基づき、当業者に容易に確認され得る。
【０１１１】
（ｉｉｉ．細菌系）
細菌発現技術は当該分野で公知である。細菌プロモーターは、細菌ＲＮＡポリメラーゼを結合し得、そしてコーディング配列（例えば、構造遺伝子）のｍＲＮＡへの下流（３”）転写を開始し得る任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常コーディング配列の５’末端に隣接して位置する転写開始領域を有する。この転写開始領域は、典型的には、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。細菌プロモーターはまた、オペレーターと呼ばれる第二ドメインを有し得、それは、ＲＮＡ合成が開始する隣接したＲＮＡポリメラーゼ結合部位とオーバーラップし得る。遺伝子リプレッサータンパク質がオペレーターに結合し得、そしてそれによって特異的な遺伝子の転写を阻害し得るので、オペレーターは、ネガティブに調節された（誘導可能な）転写を可能にする。構成的な発現は、オペレーターのようなネガティブな調節要素の非存在下で生じ得る。さらに、ポジティブな調節は、遺伝子活性化タンパク質結合配列により達成され得、それが存在する場合は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合配列に隣接する（５’側）。遺伝子活性化タンパク質の例は、カタボライトアクチベータータンパク質（ＣＡＰ）であり、それは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてｌａｃオペロンの転写開始を助ける［Ｒａｉｂａｕｄら、（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１８：１７３］。従って、調節された発現は、ポジティブまたはネガティブのいずれか、それにより転写促進または減少のいずれであり得る。
【０１１２】
代謝経路酵素をコードしている配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。この例としては、糖代謝酵素、例えば、ガラクトース、ラクトース（ｌａｃ）［Ｃｈａｎｇら、（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ １９８：１０５６］、およびマルトース由来のプロモーター配列を含む。別の例は、トリプトファン（ｔｒｐ）のような生合成酵素由来のプロモーター配列を含む［Ｇｏｅｄｄｅｌら、（１９８０）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８：４０５７；Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎら、（１９８１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９：７３１；米国特許第４，７３８，９２１号；ＥＰＯ公開第０３６７７６号および第１２１７７５号］。ｇ−ラオタマーゼ（ｇ−ｌａｏｔａｍａｓｅ）（ｂｌａ）プロモーター系［Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ（１９８１）「インターフェロンおよび他の間違いのクローニング。」Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ３（Ｉ．Ｇｒｅｓｓｅｒ編）］、バクテリオファージラムダＰＬ［Ｓｈｉｍａｔａｋｅら、（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１２８］およびＴ５［米国特許第４，６８９，４０６号］プロモーター系はまた、有用なプロモーター配列を提供する。
【０１１３】
さらに、天然にない合成プロモーターがまた、細菌プロモーターとして機能する。例えば、ある細菌またはバクテリオファージプロモーターの転写アクチベーター配列は、他の細菌またはバクテリオファージプロモーターのオペロン配列と結合され得、合成ハイブリッドプロモーターを作製する［米国特許第４，５５１，４３３］。例えば、ｔａｃ−ｌａｃプロモーターは、ｔｒｐプロモーターおよびｌａｃリプレッサーにより調節されるｌａｃオペロン配列の両方を含むハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃプロモーターである［Ａｍａｎｎら、（１９８３）Ｇｅｎｅ ２５：１６７；ｄｅ Ｂｏｅｒら、（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０：２１］。さらに、細菌プロモーターは、細菌ＲＮＡポリメラーゼを結合しそして転写を開始する能力を有する非細菌起源の天然に存在するプロモーターを含み得る。非細菌起源の天然に存在するプロモーターはまた、原核生物でいくつかの遺伝子の高レベルの発現を行うために、適合するＲＮＡポリメラーゼと結合され得る。バクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ／プロモーター系は、結合プロモーター系の例である［Ｓｔｕｄｉｅｒら、（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３；Ｔａｂｏｒら、（１９８５）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：１０７４］。さらに、ハイブリッドプロモーターはまた、バクテリオファージプロモーターおよびＥ．ｃｏｌｉオペロン領域（ＥＰＯ公開第２６７８５１号）を含み得る。
【０１１４】
機能するプロモーター配列に加えて、効率的なリボソーム結合部位はまた、原核生物における外来遺伝子の発現に有用である。Ｅ．ｃｏｌｉでは、リボソーム結合部位は、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列と呼ばれ、そして開始コドン（ＡＴＧ）および開始コドンの３〜１１ヌクレオチド上流に位置する長さが３〜９のヌクレオチドの配列を含む［Ｓｈｉｎｅら、（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５４：３４］。ＳＤ配列は、ＳＤ配列とＥ．ｃｏｌｉ １６Ｓ ｒＲＮＡの３’末端との間の塩基の対合により、ｍＲＮＡのリボソームへの結合を促進すると考えられている［Ｓｔｅｉｔｚら、（１９７９）「メッセンジャーＲＮＡにおける遺伝子シグナルおよびヌクレオチド配列」Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｒ．Ｆ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｒ編）］。弱いリボソーム結合部位を有する真核生物遺伝子および原核生物遺伝子を発現するためには［Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）「Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおけるクローニングされた遺伝子の発現」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ＤＮＡ分子は細胞内に発現され得る。プロモーター配列はまた、ＤＮＡ分子と直接結合し得、この場合、Ｎ末端の最初のアミノ酸は常にメチオニンであり得、メチオニンはＡＴＧ開始コドンによりコードされる。所望する場合、Ｎ末端のメチオニンは、臭化シアンとともにインビトロでインキュベーションすること、もしくは細菌メチオニンＮ末端ペプチダーゼとともにインビボまたはインビトロのいずれかでインキュベーションすることによりタンパク質から開裂され得る（ＥＰＯ公開第２１９２３７号）。
【０１１５】
融合タンパク質は、直接発現の代替物を提供する。典型的には、内因性細菌タンパク質のＮ末端部分または他の安定なタンパク質をコードするＤＮＡ配列を、異種コーディング配列の５’末端に融合する。発現の際に、この構築物は、２つのアミノ酸配列の融合を提供する。例えば、バクテリオファージラムダ細胞遺伝子が外来遺伝子の５’末端に連結され得、そしてバクテリア中で発現され得る。生じた融合タンパク質は、好ましくはプロセッシング酵素（Ｘａ因子）が外来遺伝子からバクテリオファージタンパク質を開裂するための部位を保持している［Ｎａｇａｉら、（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３０９：８１０］。融合タンパク質はまた、ｌａｃＺ［Ｊｉａら、（１９８７）Ｇｅｎｅ ６０：１９７］；ｔｒｐＥ［Ａｌｌｅｎら、（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：９３；Ｍａｋｏｆｆら、（１９８９）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３５：１１］およびＣｈｅｙ［ＥＰＯ公開第３２４ ６４７号］遺伝子由来の配列を用いて作成され得る。２つのアミノ酸配列の結合部分でのＤＮＡ配列は、開裂可能部位をコードし得るかまたはコードし得ない。他の例は、ユビキチン融合タンパク質である。このような融合タンパク質は、好ましくは、外来タンパク質からユビキチンを開裂するために、プロセッシング酵素（例えばユビキチン特異性プロセッシングプロテアーゼ）のための部位を保有しているユビキチン領域を用いて作成される。この方法により、天然の外来タンパク質を単離し得る［Ｍｉｌｌｅｒら、（１９８９）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：６９８］。
【０１１６】
あるいは、外来タンパク質はまた、細菌中で外来タンパク質の分泌を提供するシグナルペプチド配列のフラグメントからなる融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子を作成することにより細胞から分泌され得る［米国特許第４，３３６，３３６号］。このシグナル配列フラグメントは、典型的には細胞からタンパク質の分泌を指向する疎水性アミノ酸からなるシグナルペプチドをコードする。上記タンパク質は、成長培地中（グラム陽性細菌）、または細胞の内膜と外膜との間に存在する周辺腔（ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ｓｐａｃｅ）中（グラム陰性バクテリア）のいずれかに分泌される。 好ましくは、シグナルタンパク質フラグメントと外来遺伝子の間にコードされる、インビボ、またはインビトロで開裂され得るプロセッシング部位が存在する。
【０１１７】
適当なシグナル配列をコードするＤＮＡは、分泌される細菌タンパク質の遺伝子から由来し得る。例えばＥ．ｃｏｌ外膜タンパク遺伝子（ｏｍｐＡ）［Ｍａｓｕｉら、（１９８３）：Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；Ｇｈｒａｙｅｂら、（１９８４）ＥＭＢＯＪ．３：２４３７］およびＥ．ｃｏｌｉアルカリホスファターゼシグナル配列（ｐｈｏＡ）［Ｏｋａら、（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：７２１２］。別の例として、種々のＢａｃｉｌｕｓ株由来のα−アミラーゼ遺伝子のシグナル配列を用いて、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓから異種タンパク質を分泌し得る［Ｐａｌｖａら、（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：５５８２；ＥＰＯ公開 第２４４０４２号］。
【０１１８】
典型的には、細菌により認識される転写終結配列は、翻訳終止コドンの３’側に位置する調節領域であり、従って、プロモーターとともにコーディング配列に隣接する。これらの配列は、ＤＮＡによりコードされたポリペプチドに翻訳され得るｍＲＮＡの転写を指向する。転写終結配列は、転写の終結を助けるステムループ構造を形成し得る約５０ヌクレオチドのＤＮＡ配列を頻繁に含む。この例として、Ｅ．ｃｏｌｉのｔｒｐ遺伝子および他の生合成遺伝子のような、強力なプロモーターを有する遺伝子由来の転写終結配列が含まれる。
【０１１９】
典型的には、プロモーター、シグナル配列（所望であれば）、目的のコーディング配列、および転写終結配列を含む上記の構成成分は、発現構築物中に共に置かれる。発現構築物は、レプリコン、例えば、細菌のような宿主で安定的に維持され得る染色体外要素（例えば、プラスミド）にしばしば維持され得る。レプリコンは、複製系を有し、従って、発現のために、またはクローニングおよび増幅のいずれかのための原核生物宿主で維持され得る。さらに、レプリコンは、高コピー数または低コピー数のいずれかのプラスミドであり得る。高コピー数のプラスミドは、一般に、約５から約２００、そして典型的には、約１０から約１５０のコピー数の範囲を有する。高コピー数のプラスミドを含む宿主は、好ましくは、少なくとも約１０、およびさらに好ましくは少なくとも約２０のプラスミドを含む。高コピー数または低コピー数のベクターのいずれかを、宿主に対するベクターおよび外来タンパク質の影響に依存して選択し得る。
【０１２０】
あるいは、発現構築物は、組み込みベクターとともに細菌ゲノムに組み込まれ得る。組み込みベクターは、典型的には、ベクターの組み込みを可能にする、細菌染色体に相同な少なくとも１つの配列を含む。組み込みは、ベクター中の相同ＤＮＡと細菌染色体との間の組換えから生ずるようである。例えば、種々のＢａｃｉｌｌｕｓ株由来のＤＮＡを用いて構築された組み込みベクターは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ染色体に組み込まれる（ＥＰＯ公開第１２７３２８号）。組み込みベクターはまた、バクテリオファージまたはトランスポゾン配列を含み得る。
【０１２１】
典型的には、染色体外および組み込み発現構築物は、選択マーカーを含み得、形質転換された細菌株の選択を可能にする。選択マーカーは、細菌宿主で発現され得、そしてアンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン（ネオマイシン）、およびテトラサイクリンのような薬剤に対して細菌を耐性にする遺伝子を含み得る［Ｄａｖｉｓら、（１９７８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３２：４６９］。選択マーカーはまた、生合成遺伝子、例えば、ヒスチジン、トリプトファン、およびロイシン生合成経路の遺伝子を含み得る。
【０１２２】
あるいは、いくつかの上記の構成成分は、形質転換ベクターに一緒に置かれ得る。形質転換ベクターは、典型的には、上記のように、レプリコン中に維持されるか、または組み込みベクターに発展されるかのいずれかである選択マーカーを含む。
【０１２３】
発現および形質転換ベクター、染色体外レプリコンまたは組み込みベクターのいずれかは、多くの細菌への形質転換のために開発されている。例えば、発現ベクターは、特に以下の細菌のために開発されている：
【０１２４】
【表３】
細菌宿主へ外因性ＤＮＡを導入する方法は、当該分野で周知であり、そして典型的には、ＣａＣｌ２または他の試薬（例えば、２価のカチオンおよびＤＭＳＯ）のいずれかで処理した細菌の形質転換を含む。ＤＮＡはまた、エレクトロポレーションにより細菌細胞に導入され得る。形質転換手順は、通常、形質転換されるべき細菌種で変わる。以下の例を参照のこと、
【０１２５】
【表４】
（ｉｖ．酵母発現）
酵母発現系がまた当業者に公知である。酵母プロモーターは、酵母ＲＮＡポリメラーゼを結合し得、かつｍＲＮＡにコーディング配列（例えば、構造遺伝子）の下流（３’）転写を開始し得る任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常コーディング配列の５’末端に近接して位置する転写開始領域を有する。この転写開始領域は、典型的には、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位（「ＴＡＴＡ Ｂｏｘ」）および転写開始部位を含む。酵母プロモーターはまた、上流アクチベーター配列と呼ばれる第２ドメインを有し、存在する場合、それは、通常、構造遺伝子の遠方にある。ＵＡＳは、調節（誘導可能）発現を可能にする。構成的な発現はＵＡＳの非存在下で起こる。調節発現は、ポジティブまたはネガティブのいずれかであり得、それによって転写の促進または減少のいずれかであり得る。
【０１２６】
酵母は、活性な代謝経路を有する発酵生物であり、それゆえ代謝経路中の酵素をコードしている配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。この例としては、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）（ＥＰＯ公開第２８４０４４号）、エノラーゼ、グルコキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰまたはＧＡＰＤＨ）、ヘキソキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、およびピルビン酸キナーゼ（ＰｙＫ）（ＥＰＯ公開第３２９２０３号）が含まれる。酸性ホスファターゼをコードしている酵母ＰＨＯ５遺伝子はまた、有用なプロモーター配列を提供する［Ｍｙａｎｏｈａｒａら、（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：１］。
【０１２７】
さらに、天然には存在しない合成プロモーターがまた酵母プロモーターとして機能する。例えば、一つの酵母プロモーターのＵＳＡ配列が、他の酵母プロモーターの転写活性領域と結合され得、合成ハイブリッドプロモーターを生成する。このようなハイブリッドプロモーターの例は、ＧＡＰ転写活性化領域に連結したＡＤＨ調節配列を含む（米国特許第４，８７６，１９７号および米国特許第４，８８０，７３４号）。ハイブリッドプロモーターの他の例は、ＧＡＰまたはＰｙＫのような解糖系酵素遺伝子の転写活性化領域と組合せた、ＡＤＨ２、ＧＡＬ４、ＧＡＬ１０、またはＰＨＯ５遺伝子のいずれかの調節配列からなるプロモーターを含む（ＥＰＯ公開第１６４５５６号）。さらに、酵母プロモーターは、酵母ＲＮＡポリメラーゼに結合し、そして転写を開始する能力を有する非酵母起源の天然に存在するプロモーターを含み得る。このようなプロモーターの例は、特に以下を含む
【０１２８】
【表５】
ＤＮＡ分子は酵母細胞内で発現され得る。プロモーター配列は、ＤＮＡ分子と直接連結され得、この場合、組換えタンパク質のＮ末端の最初のアミノ酸は、常に、ＡＴＧ開始コドンによりコードされるメチオニンである。所望する場合、Ｎ末端のメチオニンを、インビトロで臭化シアンとともにインキュベートすることにより、このタンパク質から開裂し得る。
【０１２９】
融合タンパク質は、酵母発現系、ならびに哺乳動物、バキュロウイルス、および細菌発現系において代替物を提供する。典型的には、内因性酵母タンパク質または他の安定なタンパク質のＮ末端部分をコードしているＤＮＡ配列を、異種コーディング配列の５’末端に融合する。発現に際して、この構築物は、２つのアミノ酸配列の融合を提供し得る。例えば、酵母またはヒトスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）遺伝子は、外来遺伝子の５’末端で結合され得、そして酵母で発現され得た。２つのアミノ酸配列の結合部のＤＮＡ配列は、開裂可能部位をコードし得るか、またはコードし得ない。例えば、ＥＰＯ公開第１９６０５６号を参照のこと。他の例は、ユビキチン融合タンパク質である。このような融合タンパク質は、好ましくは、プロセッシング酵素（例えば、ユビキチン特異的プロセッシングプロテアーゼ）が、外来タンパク質からユビキチンを開裂するための部位を保持するユビキチン領域を用いて作成される。従って、この方法により、天然の外来タンパク質を単離し得る（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ８８／０２４０６６号参照）。
【０１３０】
あるいは、外来タンパク質はまた、酵母で外来遺伝子の分泌を提供するリーダー配列フラグメントを含む融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子を作成することにより細胞から成長培地中に分泌され得る。好ましくは、インビボまたはインビトロのいずれかで開裂され得る、リーダーフラグメントと外来遺伝子との間にコードされるプロセッシング部位がある。リーダー配列フラグメントは、典型的には、細胞からタンパク質の分泌を指向する疎水性アミノ酸を含むシグナルペプチドをコードする。
【０１３１】
適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、酵母インベルターゼ遺伝子（ＥＰＯ公開第０１２８７３号；日本公開第６２，０９６，０８６号）およびＡ因子遺伝子（米国特許第４，５８８，６８４号）のような分泌酵母タンパク質の遺伝子由来であり得る。あるいは、酵母における分泌もまた提供する非酵母起源のリーダー（例えば、インターフェロンリーダー）が存在する（ＥＰＯ公開第０６００５７号）。
【０１３２】
好ましいクラスの分泌リーダーは、酵母α因子遺伝子のフラグメントを使用しており、それは、「プレ」シグナル配列、および「プロ」領域の両方を含む。使用され得るα因子フラグメントのタイプは、完全長のプレ−プロα因子リーダー（約８３アミノ酸残基）および短縮型α因子リーダー（典型的には、約２５から約５０アミノ酸残基）（米国特許第４，５４６，０８３号および米国特許第４，８７０，００８号；ＥＰＯ公開第３２４２７４号）を含む。分泌を提供するα因子リーダーフラグメントを使用する別のリーダーは、第１の酵母のプレ配列を用いるが、第２の酵母α因子由来のプロ領域を用いて作成されるハイブリッドα因子リーダーを含む。例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ８９／０２４６３号参照のこと。
【０１３３】
典型的には、酵母により認識される転写終結配列は、翻訳終止コドンの３’に位置する調節領域であり、そしてそれ故プロモーターとともにコーディング配列に隣接する。これらの配列は、ＤＮＡによりコードされるポリペプチドに翻訳され得るｍＲＮＡの転写を指向する。転写ターミネーター配列および他の酵母認識終結配列の例は、解糖系酵素についてコードする終結配列である。
【０１３４】
典型的には、プロモーター、リーダー（所望する場合）、目的のコーディング配列、および転写終結配列を含む上記の構成成分は、発現構築物中に一緒に置かれる。発現構築物は、しばしば、レプリコン、例えば、酵母または細菌のような宿主で安定的に維持され得る染色体外要素（例えば、プラスミド）で維持される。レプリコンは、２つの複製系を有し、従って、例えば、発現するための酵母およびクローニングおよび増幅するための原核生物宿主で維持され得る。このような酵母−細菌シャトルベクターの例は、ＹＥｐ２４［Ｂｏｔｓｔｅｉｎら、（１９７９）Ｇｅｎｅ ８：１７−２４］；ｐＣｌ／ｌ［Ｂｒａｋｅら、（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８１：４６４２−４６４６］；およびＹＲｐ１７［Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら、（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５８：１５７］を含む。さらに、レプリコンは、高コピー数または低コピー数のいずれかのプラスミドであり得る。高コピー数のプラスミドは、一般に約５から約２００、および典型的には、約１０から約１５０のコピー数の範囲を有する。高コピー数のプラスミドを含む宿主は、好ましくは、少なくとも約１０、およびさらに好ましくは少なくとも約２０を有する。高コピー数または低コピー数のベクターは、ベクターの影響および宿主での外来タンパク質に依存して選択され得る。例えば、Ｂｒａｋｅら、同上を参照のこと。
【０１３５】
あるいは、発現構築物は、組み込みベクターによって酵母ゲノムに組み込まれ得る。組み込みベクターは、典型的には、ベクターを組み込み得る酵母染色体に相同な少なくとも１つの配列を含み、そして好ましくは、発現構築物に隣接する２つの相同な配列を含む。組み込みは、ベクターおよび酵母染色体における相同なＤＮＡの間での組換えにより生じるようである［Ｏｒｒ−Ｗｅａｖｅｒら、（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：２２８−２４５］。組み込みベクターは、ベクターに包埋するための適切な相同配列を選択することにより酵母の特異的な遺伝子座に指向され得る。 Ｏｒｒ−Ｗｅａｖｅｒら、同上を参照のこと。１またはそれ以上の発現構築物は、生産される組換えタンパク質のレベルができるだけ高くなるように組み込まれる［Ｒｉｎｅら、（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８０：６７５０］。ベクターに含まれる染色体配列は、完全なベクターの組み込みを生じるベクターの単一セグメントとして、または発現構築物のみからなる安定的な組み込みを生じ得る、染色体の近接したセグメントに相同で、かつベクターで発現構築物の両端に位置する２つのセグメントとしてのいずれかで存在し得る。
【０１３６】
典型的には、染色体外および組み込み発現構築物は、選択マーカーを含み得、形質転換された酵母株の選択を可能にする。選択マーカーは、酵母宿主で発現され得る生合成遺伝子、例えば、ＡＤＥ２、ＨＩＳ４、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、およびＡＬＧ７、ならびにＧ４１８耐性遺伝子（ツニカマイシンおよびＧ４１８に対する耐性をそれぞれ酵母細胞に供与する）。さらに、適切な選択マーカーはまた、金属のような毒性化合物の存在下で成長する能力を有する酵母を提供し得る。例えば、ＣＵＰ１の存在は、銅イオンの存在下で酵母を成長させ得る［Ｂｕｔｔら、（１９８７）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５１：３５１］。
【０１３７】
あるいは、いくつかの上記化合物は、形質転換ベクターに一緒に置かれ得る。形質転換ベクターは、典型的には、上記のように、レプリコンで維持されるか、または組み込みベクターへと展開されるかのいずれかである選択マーカーを含む。
【０１３８】
発現および形質転換ベクター、染色体外レプリコンまたは組み込みベクターのいずれかは、多くの酵母に形質転換するために発達した。例えば、発現ベクターは、上記のように以下の酵母のために発達した：
【０１３９】
【表６】
酵母宿主に外因性ＤＮＡを導入する方法は、当該分野で周知であり、そして典型的には、スフェロプラストまたはアルカリカチオンで処理したそのままの酵母細胞のいずれかの形質転換を含む。形質転換手順は、通常形質転換されるべき酵母種とともに変化する。以下の例を参照のこと、
【０１４０】
【表７Ａ】
【０１４１】
【表７Ｂ】
本発明において、選択マーカー、複製起点、および相同宿主細胞の配列が発現ベクターに含まれる。選択マーカーは、潜在的に発現ベクターを含む宿主細胞をスクリーニングするために使用し得る。このようなマーカーは、宿主細胞を、アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、ネオマイシンおよびテトラサイクリンのような薬剤に対して耐性にするマーカーを含む。また、マーカーは、宿主細胞の成長に必要なヒスチジン、トリプトファンおよびロイシン経路における生合成遺伝子のような生合成遺伝子を含む。従って、ｌｅｕ（−）宿主細胞を、発現ベクターによる形質転換におけるレシピエントとして使用し、そして例えばロイシンが培地に存在しない場合、ｌｅｕ（＋）遺伝子を伴うプラスミドを有する細胞のみが生存する。
【０１４２】
本発明において、複製起点は発現ベクターに取り込まれ、宿主細胞内で自己複製される。このような複製起点は、細胞内に適切なタンパク質の存在下で、発現ベクターが高いコピー数で再生産され得る複製起点、例えば酵母において有効な２μ配列および自己複製配列；およびＣＯＳ−７細胞において有効なウイルスＴ−抗原の複製起点を含む。
【０１４３】
本発明の目的のために、発現ベクターは、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、または細胞内で自律性を保持し得る。宿主ゲノムへの組み込みのために、本明細書の発現ベクターは、宿主細胞ゲノム内の配列に相同のポリヌクレオチド配列を含み得る。この相同配列は、発現ベクターに連結される必要はない。例えば、発現ベクターは、付随していないジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を介してＣＨＯゲノムに組み込み得る。酵母においては、相同配列は発現カセットに隣接することが好ましい。本発明に特に有用な相同酵母ゲノム配列は、ＰＣＴ ＷＯ９０／０１８００に開示された配列およびＧｅｎｂａｎｋ検索番号Ｊ０１３３１に記載のＨＩＳ４遺伝子配列である。
【０１４４】
発現ベクターのプロモーター、ターミネーターおよび他の随意エレメントの選択も、選択した宿主細胞に依存し、このことは当業者に既知である。本発明は、選択した宿主細胞には依存しない。簡便性および所望のタンパク質発現のレベルから、至適宿主細胞が指定される。発現のための種々の宿主は当該分野において既知であり、そしてＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）より入手可能である。
【０１４５】
例えば、ＫＧＦフラグメントまたはアナログを発現するための本明細書に適切な細菌宿主として、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓが挙げられる。以下の属由来の酵母宿主を利用し得る：Ｃａｎｄｉｄａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、ＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓおよびＹａｒｒｏｗｉａ。本明細書において宿主として使用され得る不死化哺乳動物細胞として、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（「ＢＨＫ」）細胞、サル腎臓細胞（「ＣＯＳ」）およびヒト肝細胞癌細胞、例えばＨｅｐ Ｇ２が挙げられる。また多くの昆虫細胞
宿主もＫＧＦフラグメントまたはアナログの発現に適切であって、ＰＣＴ ＷＯ ８９／０４６６９９；Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５６：１５３（１９８５）；Ｗｒｉｇｈｔ Ｎａｔｕｒｅ ３２１：７１８（１９８６）；Ｓｍｉｔｈら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６（１９８３）；および全般的にはＦｒａｓｅｒら、ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２５：２２５（１９８９）に記載の通り、Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒおよびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａが挙げられる。
【０１４６】
ＫＧＦフラグメントまたはアナログを含む発現ベクターは、宿主細胞に挿入される。発現ベクターを宿主細胞に挿入するためには、当該分野で既知の任意の形質転換技術を用い得る。例えば、細菌宿主の形質転換のために、典型的にまずＣａＣｌ２または他の試薬（２価カチオンおよびＤＭＳＯなど）のいずれかで細菌を処理し、そして外来性ＤＮＡを処理した細菌細胞に導入する。ＤＮＡは、エレクトロポレーションまたはウイルス感染によっても細菌細胞に導入し得る。本明細書で使用し得る細菌宿主に対する形質転換手順として、Ｍａｓｓｏｎら ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．６０：２７３（１９８９）；Ｐａｌｖａら Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：５５８２（１９８２）；欧州特許公開第０３６，２５９号および同第０６３，９５３号；ＰＣＴ ＷＯ ８４／０４５４１、Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、Ｍｉｌｌｅｒら Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：８５６（１９８８）；Ｗａｎｇら Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：９４９（１９９０）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、Ｃｏｈｅｎら Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６９：２１１０（１９７３）；Ｄｏｗｅｒら Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：６１２７（１９８８）；Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｈ．Ｗ．ＢｏｙｅｒおよびＳ．Ｎｉｃｏｓｉａ編）（１９７８）；Ｍａｎｄｅｌら Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５３：１５９（１９７０）のＫｕｓｈｎｅｒ「ＣｏｌＥ１由来プラスミドによるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ形質転換の改良法（Ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｗｉｔｈ ＣｏｌＥ１−ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｉｎ；Ｔａｋｅｔｏ Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ９４９：３１８（１９８８）；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ，Ｃｈａｓｓｙら ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．４４：１７３（１９８７）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ；Ｆｉｅｄｌｅｒら Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ １７０：３８（１９８８）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ；Ａｕｇｕｓｔｉｎら、 ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．６６：２０３（１９９０）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ，Ｂａｒａｎｙら Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４４：６９８（１９８０）；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｊ．ＦｅｒｒｅｔｔｉおよびＲ．Ｃｕｒｔｉｓｓ ＩＩＩ編）（１９８７）のＨａｒｌａｎｄｅｒ「エレクトロポレーションによるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓの形質転換（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）」；Ｐｅｒｒｙら Ｉｎｆｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．３２：１２９５（１９８１）；Ｐｏｗｅｌｌら Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５（１９８８）；Ｓｏｍｋｕｔｉら Ｐｒｏｃ．４ｔｈ Ｅｖｒ．Ｃｏｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １：４１２（１９８７）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ。
【０１４７】
酵母宿主に対する形質転換法は当該分野で周知であり、典型的にアルカリカチオンで処理したスフェロプラストまたはそのままの酵母細胞のいずれかの形質転換を含む。酵母宿主は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９４巻、１９９１、「酵母の遺伝学および分子生物学へのガイド（Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」に記載のエレクトロポレーションによ
っても形質転換し得る。本発明に対して、適用する形質転換手順は、形質転換しようとする酵母種により変化し、Ｋｕｒｔｚら Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：１４２（１９８６）；Ｋｕｎｚｅら Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１（１９８５）；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｇｌｅｅｓｏｎら Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３２：３４５９（１９８６）；Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐら Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０２：３０２（１９８６）；Ｈａｎｓｅｎｕｌａ；Ｄａｓら Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５８：１１６５（１９８４）；Ｄｅ Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４：１１６５（１９８３）；Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇら Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｇｙ ８：１３５（１９９０）；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ；Ｃｒｅｇｇら Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３３７６（１９８５）；Ｋｕｎｚｅら Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１（１９８５）；米国特許第４，８３７，１４８号および第４，９２９，５５５号；Ｐｉｃｈｉａ；Ｈｉｎｎｅｎら Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５；１９２９（１９７８）；Ｉｔｏら Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３（１９８３）Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ；ＢｅａｃｈおよびＮｕｒｓｅ
Ｎａｔｕｒｅ ３００：７０６（１９８１）；Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ；Ｄａｖｉｄｏｗら Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３９（１９８５）；Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎら Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：４９（１９８５）；Ｙａｒｒｏｗｉａ。
【０１４８】
異種ポリヌクレオチドを哺乳動物細胞に導入する方法は、当該分野において既知であり、そして例えばウイルス感染、デキストラン介在トランスフェクション、カルシウムリン酸沈殿、ポリブレン介在トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ポリヌクレオチドのリポソーム内のカプセル化（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ）、およびＤＮＡの核内へのダイレクトマイクロインジェクションが挙げられる。
【０１４９】
Ｓｍｉｔｈら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６（１９８３）；およびＬｕｃｋｌｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７：３１（１９８９）に記載の通り、発現ベクターを形成するためにバキュロウイルス属のウイルス内に異種ＤＮＡを導入する方法、および昆虫宿主細胞の形質転換の方法も当該分野において既知である。例えば、相同二重交差組換えにより、ＫＧＦフラグメントＤＮＡを多角体遺伝子に挿入し得る。Ｍｉｌｌｅｒら、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ ４：９１（１９８９）に記載の通り、所望のバキュロウイルス遺伝子中に設計された制限酵素部位にも挿入し得る。ＫＧＦフラグメントのＤＮＡ配列を、発現ベクター内の多角体遺伝子と換えてクローン化した場合、多角体特異配列の両５’および３’に隣接し、そして多角体プロモーターの下流に位置する。
【０１５０】
本発明の実施態様において、新たに形成されたバキュロウイルス発現ベクターは、次いで感染組換えバキュロウイルス内にパッケージされ得る。バキュロウイルス発現系においては、およそ１％からおよそ５％の間の低い頻度で相同組換えが起こる。従って、通常、トランスフェクション後に生産された大多数のウイルスは、まだ野生型のウイルスである。しかし、組換えウイルスは、既知の方法によって同定し得る。例えば、天然のウイルスは、ウイルス感染の後期の間、感染細胞の核内において、かなり高いレベルで多角体タンパク質を生産する。蓄積した多角体タンパク質は、埋包されたウイルス粒子も含む閉塞体を形成する。これらの閉塞体は、１５μｍまでのサイズで、屈折性が高いことから明るい光沢の外観で、光学顕微鏡下で容易に可視化される。組換えウイルスが感染した細胞は閉塞体を欠く。組換えウイルスおよび野生型ウイルスはプレートティングすることによって識別され得、トランスフェクション上清またはその希釈液は標準的技術によって昆虫細胞の単層上に存在する。次に「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」第２巻（Ａｕｓｕｂｅｌら編）の１６．８（補遺１０，１９９０）に記載の通り、閉塞体の存在（野生型ウイルスを示す）または非存在（組換えウイルスを示す）について、光学顕微鏡下でプラークをスクリーニングし得る。
【０１５１】
本明細書において形質転換された宿主細胞が所望のＫＧＦフラグメントを発現しているかどうかを調べるために、当該分野で既知のイムノアッセイおよび活性アッセイを利用し得る。例えば、細胞膜からＫＧＦフラグメントを分離することなく、形質転換された宿主細胞上で免疫蛍光アッセイを実施し得る。本アッセイにおいて、宿主細胞をまず、顕微鏡用スライドまたはマイクロタイターウエルのような固体支持体上に固定する。次に固定化した宿主細胞を抗ＫＧＦ抗体に暴する。好ましくはアッセイの感度を上昇させるために、固定化した細胞を、抗ＫＧＦ抗体に結合する標識された２次抗体に暴する。例えば、２次抗体は蛍光性のマーカーで標識し得る。ＫＧＦフラグメントを発現する宿主細胞を蛍光的に標識し、顕微鏡下で可視化し得る。
【実施例】
【０１５２】
（実施例１）
図１に示す通り、ｃＤＮＡをｐＡｃＣ１３Ｐｓｔ／Ｎｏｔ １発現ベクターにクローニングすることによって、ヒトＫＧＦ ｃＤＮＡをバキュロウイルス発現系に挿入した。Ｍｕｎｅｍｉｔｓｕら Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：５９７７−５９８２（１９９０）に記載の通り、このプラスミドはｐＡｃＣ１２に由来した。
【０１５３】
Ｆｉｎｃｈら Ｓｃｉｅｎｃｅ ２：７５２−７５５（１９８９）に記載の通り、入手可能なＫＧＦのＮ末端アミノ酸配列に基づく欠失した１８ｋｄ ＫＧＦについてＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。Ｌｕｃｋｏｗら Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９（１９８９）およびＱｕｉｌｌｉａｍら Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：２９０１０２９０８（１９９０）に記載の通り、ｐＶＬ９４１伝達ベクターの誘導体であるｐＡｃＣ１３発現ベクターへのサブクローニングを容易に行うために、隣接する制限部位（ＰｓｔＩおよびＮｏｔＩ）をプライマーに組み込ませた。この発現ベクターは、ｐＡｃＣ１３のＰｓｔＩ／ＮｏｔＩポリリンカー部位にＫＧＦをコードするフラグメントを挿入することによって構築された。ＫＧＦ ｃＤＮＡはＫＧＦのプロセシングされた成熟体をコードし、これは１６３個のアミノ酸残基からなり、１４〜１６番目の残基に潜在的なＮグリコシル化部位を伴った。
【０１５４】
（コンディション培地の調製）
Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９昆虫細胞）に、ＫＧＦ１−１６３に対するｃＤＮＡを含むバキュロウイルスのＡｕｔｏｇｒａｐｈａ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａを感染させた。希釈後、細胞を血清補充物、抗生物質、または殺菌剤非存在下のＥｘｃｅｌｌ−４００内で４８〜７２時間培養した。培養液を集め、そして１０，０００×ｇで３０分間遠心分離して浮遊細胞およびその他の細胞破砕物を除いた。次にコンディション培地を、０．８μフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濾過し、そしてこの培地の約５リットルを、３−ｋＤａの分子量カットオフ値を有するｆｉｌｔｒｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ ｓｙｓｔｅｍ（Ｏｍｅｇａ ｍｅｍｂｒａｎｅ）を用いて２００ｍｌに濃縮した。
【０１５５】
濃縮後、トランスフェクトしたＳｆ９細胞由来のコンディション培地を、１０，０００×ｇで２０分間の遠心分離によって集め、そして連続ヘパリンセファロース（「ＨＳ」）アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。本発明の一つの実施態様においては、約１リットルのＳｆ９細胞コンディション培地を、３−ｋＤａのカットオフ値を有するＯｍｅｇａ ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｆｉｌｔｒｏｎ）を用いて限外濾過し、２００ｍｌの限外濾過濃縮液を生産した。
【０１５６】
（ＨＳＡＣおよびＭｏｎｏ Ｓ陽イオン交換クロマトグラフィー）
上清をｐＨ７．２に調整した。３０ｍｌの試料を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．３、 １５０ｍＭ ＮａＣｌで平衡化したヘパリンセファロース樹脂に添加した。樹脂を、平衡化緩衝液で、吸光度がベースラインに戻るまで大量に洗浄し、そして次に０．
４５Ｍから１Ｍおよび２Ｍの上昇ＮａＣｌ濃度で段階的に溶出させた。細胞増殖アッセイに用いたフラクションからアリコートを分離し、そして最も高い生物活性を有する１Ｍ ＮａＣｌのフラクションをプールした。プールしたフラクションを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．２ で５倍に希釈し（最終塩濃度０．２Ｍ ＮａＣｌ）、そして同試料をＳｕｐｅｒ ｌｏｏｐで、ＦＰＬＣシステムに連結されたＭｏｎｏ Ｓカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に供した。直線勾配（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．３、０．２Ｍ ＮａＣｌ〜１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．３、１Ｍ ＮａＣｌ）により溶出を行った。分画後、アリコートを生物活性について試験し、活性フラクションをプールした。
【０１５７】
濃縮液をｐＨ７．３に調整し、そして約３０ｍｌのベット容量を含むＨＳカラムに添加した。カラムを、約２時間４℃で展開させた。カラムを、ｐＨ７．３で１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌおよび０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む１５０ｍｌの平衡化緩衝液で洗浄した。保持されたタンパク質を０．４５Ｍ ＮａＣｌおよび１Ｍ ＮａＣｌで溶出した。溶出中のカラムの流速を、約９０ｍｌ／時 に調整し、そして３ｍｌのサイズのフラクションを集めた。
【０１５８】
ＨＳアフィニティークロマトグラフィー工程の生物活性を有する１Ｍ ＮａＣｌフラクションをプールし、そして１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．３で５倍希釈し、そしてＭｏｎｏ Ｓ ＨＲ ５／５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に添加した。保持されたタンパク質を、０．２Ｍ ＮａＣｌから１Ｍ ＮａＣｌ勾配を用いて溶出した。活性フラクションのバイオアッセイを、Ｂａｌｂ−Ｍｋ細胞株を用いて測定した。Ｍｏｎｏ Ｓ 陽イオン交換クロマトグラフィーにより単離された生物活性タンパク質フラクションのＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を実施した。フラクション３７−３９およびフラクション４１−４２をプールし、そして１０μｌのアリコートをＳＤＳおよび１０ｍＭ ＤＴＴに添加した。これらの試料を加熱して変性させ、そして１２％のポリアクリルアミドゲル中で電気泳動を行い、続いて銀染色した。試料が還元状態中において展開された場合でも、または非還元状態中において展開された場合でも、同様の泳動パターンが観察された。２５Ｋｄはフラクション３７−３９に含まれるタンパク質の見かけの分子量で、そして１８ｋｄはフラクション４１−４２に含まれるタンパク質の見かけの分子量であった。
【０１５９】
ＨＳ生物活性フラクションのクロマトグラムは、フラクション３１〜４７にかけてのＢａｌｂ／Ｍｋ生物活性のプロフィールを示すが、これから、２種類の分子種の存在が明らかであり、一つは０．５５Ｍ ＮａＣｌで溶出し、そして他方は０．６Ｍ ＮａＣｌで溶出する。
【０１６０】
（ＫＧＦ活性の測定）
得られたフラクション中のＫＧＦ活性の存在を、ＢＡＬＢ／Ｃ−Ｍｋ細胞の成長を促進するフラクションの能力により評価した。この点に関して、任意のフラクションの１０μｌアリコートを１ｍｌのリン酸緩衝生理食塩液（「ＰＢＳ」）中０．２％ゼラチンに希釈し、そして１０μｌの希釈フラクションを、各々２２ｍｍウエルを含む１２−ウエルクラスタープレートに５×１０３細胞／ウエルで接種されたＢＡＬＢ／Ｃ−Ｍｋ細胞の成長刺激活性について試験した。全てのＫＧＦ活性がカラム内に保持されることが見出され、そして１Ｍ ＮａＣｌで溶出された。
【０１６１】
ＨＳカラムから１Ｍ ＮａＣｌで溶出されたＫＧＦの生物活性フラクションをさらに、陽イオン交換ＦＰＬＣカラムクロマトグラフィーによって精製した。これらのフラクションをプールし、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．３で５倍に希釈し、そしてＰｈａｒｍａｃｉａ製のＭｏｎｏ Ｓ ＨＲ ５／５カラムに直接添加した。
【０１６２】
Ｍｏｎｏ Ｓ ＨＲ ５／５カラムに保持されたタンパク質を、０．２Ｍ ＮａＣｌから１Ｍ ＮａＣｌの勾配で溶出させた。溶出したフラクションの生物活性を、ＢＡＬＢ／Ｃ−Ｍｋ細胞を用いて、上記の通りアッセイした。図３は、フラクション３１〜４７にわたる活性プロフィールを示す。
【０１６３】
マイトジェンアッセイにおいて、Ｂｏｈｌｅｎら ＥＭＢＯ ４：１９５１−１９５６（１９８５）、およびＧｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚら Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ １２７：１２１−１３６（１９８６）、およびＢｅｌｌｏｓｔａら Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２１：７０５−７１３（１９９３）に記載の通り、ウエル当たり１０４個のＡＢＡＥ細胞および５×１０３個のＡＣＥ細胞を、１０％仔牛血清および抗生物質を補充した１ｍｌのＤＭＥＭ中に密度５×１０３細胞／ウエルで、１２ウエルクラスタープレートに接種した。６時間のインキュベーション後、３重検体のウエルのセットをトリプシン処理し、そしてプレーティング効率を測定するために細胞をカウントした。次に適切な希釈の各試料の１０μｌアリコートを、０日目、２日目および４日目に３重検体としてシャーレ内のウエルに添加した。培養５日目後、プレートをトリプシン処理し、そしてコールターカウンター（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ）により細胞密度を測定した。
【０１６４】
０日目および１日おきに、表示した濃度で、ＫＧＦまたは塩基性ＦＧＦを添加した。培養５日後に、細胞をトリプシン処理し、そしてコールターカウンターを用いて最終的な細胞密度を測定した。
【０１６５】
（電気泳動（ＮａＤｏｄＳＯ４／ＰＡＧＥ））
Ｌａｅｍｍｌｉら Ｎａｔｕｒｅ ２２７：６８０−６８５（１９７０）に記載の手順に従い、ＮａＤｏｄＳＯ４によりポリアクリルアミドゲルを調製した。１０ｍＭ ＤＴＴ存在下で３分間試料を煮沸し、そして１２％ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動した。ゲルを固定し、そしてＢｉｏＲａｄの試薬およびプロトコールを用い、Ｍｅｒｒｉｌら Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１１：１４３７−１４３８に考察されている通りに銀染色を行った。適切な分子量マーカーは、Ｂｉｏｒａｄ製である。
【０１６６】
（細胞増殖アッセイ）
カラムフラクションおよび精製試料のマイトジェン活性を、標的細胞としてＢａｌｂ／Ｍｋ細胞を用いることによって測定した。ストック培養物を生育し、そしてＧｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚら Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１４２：３２５−３３３に記載の通り、１０％ＦＣＳ、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン、０．２５μｇ／ｍｌファンギゾン（ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ）、および１０ｎｇ／ｍｌ ａＦＧＦを補充した低カルシウム改変イーグル培地中に維持した。マイトジェンアッセイ用の細胞を、Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚらに記載の通り、１０％ＦＣＳを補充した１ｍｌの低カルシウムＭＥＭ中に５×１０３〜１×１０４細胞／ウエルの密度で１２ウエルクラスタープレートに接種した。培養５日後に、 Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚらに記載の通り、試料の添加および最終細胞密度の測定を行った。
【０１６７】
最終精製物質のマイトジェン活性を、Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚら Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７３：４１２０−４１２４（１９７６）に記載の通り、成獣ウシ動脈内皮細胞（「ＡＢＡＥ」）および副腎皮質由来毛細血管内皮細胞（「ＡＣＥ細胞」）上で試験した。ストック培養物を、１０％ＣＳ、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを補充したＤＭＥＭ存在下で維持し、そして０．２５μｇ／ｍｌのファンギゾンを、週１回、１：１０の分割比でゼラチン化組織培養シャーレ上を通過させた。
【０１６８】
当該分野で周知の標準的な方法論を用いて、以下の通り、ＫＧＦｄｃｓ１−２３のＮＨ２末端から１位〜２０位の明白なアミノ酸配列を確定した：
Ｓ１ Ｙ Ｄ Ｍ５ Ｅ Ｇ Ｇ Ｄ Ｉ Ｒ Ｖ Ｒ Ｒ Ｌ Ｆ Ｘ Ｒ Ｔ Ｑ
本発明はまた、ＫＧＦｄｃｓ１−２３をコードするＤＮＡセグメント、およびＦＧＦファミリーの他のメンバーに対してＫＧＦ１６３の非保存性ＮＨ２末端特性を欠くＫＧＦ由来のより短い他の形状を含む。
【０１６９】
（タンパク質マイクロシークエンシング）
ＫＧＦ１６３およびＫＧＦｄｃｓ１−２３の２つの名目上１００ｐｍｏｌの試料を、エドマン分解、および二フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｓｐｉｎ）への遠心吸着後のＡＡ分析により分析した。試料をＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４７７Ａ 気相タンパク質シークエネーターに添加した。標準的なソフトウエアおよびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ供給の化学試薬を用いて、２０回のエドマン分解を行い、そして自動化オンラインＨＰＬＣカラム（モデル１２０Ａ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によりＰＴＨアミノ酸の同定を行った。
【図面の簡単な説明】
【０１７０】
【図１】図１は、Ｎ末端で開始し、そして１６３アミノ酸残基およびアミノ酸残基１４−１６に単一のＮ結合グリコシル化シグナルを含む成熟完全長ヒトＫＧＦポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図２】図２は、１６３アミノ酸配列のＫＧＦが挿入されているｐＡｃＣ１３発現ベクターを示す。
【図３】図３は、ヘパリンセファロース（「ＨＳ」）カラムで１Ｍ ＮａＣｌを用いて溶出した後の培地で調整されたＳＦ９細胞由来の本発明のＫＧＦフラグメントのさらなる精製を示す。ＨＳカラム由来の生活性画分をプールし、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．３で５倍に希釈し、そしてＭｏｎｏ Ｓ ＨＲ５／５陽イオン交換ＦＰＬＣにかけた。
【図４】図４は、Ｂａｌｂ／Ｍｋ細胞株の細胞上で、長形態のＫＧＦ（すなわち、ｒＫＧＦ１６３）および短形態のＫＧＦ（すなわちＫＧＦｄｅｓ１−２３）対ａＦＧＦの生物学的活性を比較する。
【図５】図５は、大きな血管（Ａ：ＡＢＡＥ細胞）または毛細血管（Ｂ：ＡＣＥ細胞）由来の血管内皮細胞上で、長形態のＫＧＦ（すなわち、ｒＫＧＦ１６３）および短形態のＫＧＦ（すなわちＫＧＦｄｅｓ１−２３）対ｂＦＧＦの生物学的活性を比較する。
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般にケラチノサイト増殖因子（「ＫＧＦ」）に関する。さらに特定的に、本発明は、昆虫細胞系で発現する組換え完全長ＫＧＦと比較して、生物学的活性の増加および細胞毒の減少を有する短縮型ＫＧＦフラグメントおよびそのアナログに関する。このＫＧＦフラグメントは、本明細書中ではＫＧＦｄｅｓ１−２３と命名され、成熟完全長ＫＧＦのＮ末端の最初の２３アミノ酸残基を欠損し、このＮ末端は、Ｆｉｎｃｈ，Ｐ．Ｗ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５：７５２−７５５（１９８９）に示され、そしてＫＧＦにその上皮細胞特異性を与えると既に考えられているように、Ｎ末端からのアミノ酸残基１４〜１６にグリコシル化部位を含む。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ＫＧＦは、線維芽細胞成長因子（「ＦＧＦ」）のファミリーに属し、塩基性ＦＧＦ（「ｂＦＧＦ」）として示されるものの始原型である。このため、ＫＧＦはまた、ＦＧＦ−６として公知である。他のＦＧＦのように、ＫＧＦはヘパリン結合タンパク質であるが、他のＦＧＦと異なり、それは独特な標的細胞特異性を有する。特に、ＦＧＦは、一般に、一次または二次中胚葉由来および神経外胚葉由来の種々の細胞型の増殖および分化を刺激し得る。ＫＧＦは、Ｆｉｎｃｈ，Ｐ．Ｗ．ら（上記引用文中）で考察されるように、上皮細胞増殖を刺激し得るその能力において他のＦＧＦと同様であるが、内皮細胞または線維芽細胞の増殖を刺激し得ないその能力において他のＦＧＦと同様でない。
【０００３】
酸性線維芽細胞成長因子（「ａＦＧＦ」）および塩基性線維芽細胞成長因子（「ｂＦＧＦ」）を含むＦＧＦは、Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚら、Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．２５：３０７−３１４（１９９１）、およびＢａｓｉｌｉｃｏら、Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．５９：１１５−１６５（１９９２）で考察されるように、ヘパリン結合特性を有し、そして腹部および背部の中胚葉の初期胞胚での分化および増殖を誘導する能力を有することが公知である。ＦＧＦに対する細胞の応答は、Ｈｏｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：６６５−６６８（１９９１）で考察されるように、細胞表面レセプター（「ＦＧＦＲ」）へのその結合を通じて介在される。このレセプターには、３つの相関型がある。高親和性のＦＧＦＲは、Ｌｅｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５：５７−６０（１９８９）；Ｄｉｏｎｎｅら、ＥＭＢＯ ９：２６８５−２６９２（１９９０）；Ｍｉｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：７２−７５（１９９１）；Ｍｉｋｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：２４６−２５０（１９９２）；およびＤｅｌｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２１２２５−２１２２９（１９９２）で考察されたように、チロシンキナーゼであり、そしてｆｌｇレセプター（「ＦＧＦＲ−１」）、ｂｅｋレセプター（「ＦＧＦＲ−２」）、およびＫ Ｓａｍレセプター（「ＦＧＦＲ−３」）を含む。
【０００４】
ＦＧＦＲ−１およびＦＧＦＲ−２の両者は、中胚葉および神経外胚葉組織で広範囲に発現され、そして両者は、同じ親和性でａＦＧＦおよびｂＦＧＦを結合し得る。ＦＧＦＲ−３は、上皮細胞に特異的であるＫＧＦレセプターである。それは、ＦＧＦＲ−２のもう一つの転写物である。Ｍｉｋｉら（上記引用文中）およびＤｅｌｌら（上記引用文中）で考察されたように、ａＦＧＦおよびｂＦＧＦの両方について高い親和性を示し、そしてＫＧＦについて全く親和性を示さないＦＧＦＲ−２とは対照的に、ＦＧＦＲ−３は、ＫＧＦおよびａＦＧＦをｂＦＧＦより約２０〜１０００倍高い親和性で結合する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上皮細胞に対するＫＧＦの厳密に制限される活性プロフィールが、例えば、多くのタイプの創傷治癒のための適用ならびに乾癬および基底細胞癌のような表皮の過剰増殖疾患の処置で所望される。現在では、ＫＧＦを除いて、高適性マイトジェン因子はこれらの適用のためには存在しない。従って、ＫＧＦが、その効力を増加しそしてその細胞毒を減少するように改変されれば、治療用適用のために望ましい。
【０００６】
最近、Ｒｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２９８４−２９８８（１９９３年２月）により、ＫＧＦ１６３がＴ７原核生物発現系で発現される場合、マイトジェン活性を所有する組換えＫＧＦ（「ｒＫＧＦ」）ポリペプチドが得られ得ることが見出された。ｒＫＧＦ分子が、成熟ＫＧＦ１６３ポリペプチドのＮ末端からそれぞれ３、８、２７、３８、および４８アミノ酸残基の欠失により短縮される場合、生じる分子の生物学的活性は変化した。それぞれ、３および８アミノ酸残基の欠失により、生じる分子のマイトジェン活性は、完全長のｒＫＧＦ（「ｒＫＧＦ１６３」）と比べて影響し得なかった。しかし、２７アミノ酸残基の欠失は、１０〜２０倍減少したマイトジェン活性を生じた。３８および４８アミノ酸残基の欠失は、それぞれマイトジェン活性およびヘパリン結合能を完全に失うようになる。従って、Ｒｏｎらは、ｒＫＧＦ１６３分子と比べて増加した細胞分裂活性を有するいかなる短縮型ＫＧＦフラグメントをも生産し得なかった。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明の目的の１つは、成熟完全長ＫＧＦ、ＫＧＦ１６３のアミノ酸配列の一部分を含み、そして完全長組換えＫＧＦ、ｒＫＧＦ１６３と比較して少なくとも２倍のマイトジェン活性の増加を有するＫＧＦフラグメントを提供することである。特別な目的は、ｒＫＧＦ１６３の最初の２３個のＮ末端アミノ酸残基Ｃ−Ｎ−Ｄ−Ｍ−Ｔ−Ｐ−Ｅ−Ｑ−Ｍ−Ａ−Ｔ−Ｎ−Ｖ−Ｎ−Ｃ−Ｓ−Ｓ−Ｐ−Ｅ−Ｒ−Ｈ−Ｔ−Ｒ−を含む配列を欠失しているＫＧＦフラグメントを提供することである。
【０００８】
本発明の１つの他の目的は、ｒＫＧＦ１６３と比較して減少した細胞毒を有するＫＧＦフラグメントを提供することである。さらに他の目的は、上記のＫＧＦフラグメントおよび毒性分子を含む結合体を提供することである。毒性分子は、リシンＡ、ジフテリアトキシン、およびサポニン（ｓａｐｏｒｉｎ）のうち少なくとも１つであり得る。
【０００９】
本発明の他の１つの目的は、上記のようなＫＧＦフラグメント、および薬学的に受容可能なキャリア（例えば、ヒト皮膚への局所適用に適するもの）を含む治療用組成物を提供することである。
【００１０】
本発明のさらに他の１つの目的は、上記のＫＧＦフラグメントをコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ分子を提供することである。
【００１１】
本発明の他の１つの目的は、上記のＫＧＦフラグメントをコードするＤＮＡ分子、およびＤＮＡ分子の発現のための調節配列を含む発現ベクターを提供することである。例えば、発現ベクターは、バキュロウイルスであり得る。
【００１２】
本発明の他の１つの目的は、上記の発現ベクターで形質転換した宿主細胞を提供することである。例えば、宿主細胞は、細菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、または昆虫細胞であり得る。
【００１３】
本発明の他の１つの目的は、上記のような形質転換宿主細胞を培養し、そして培養物からＫＧＦフラグメントを単離することにより、ＫＧＦフラグメントを生産する方法を提供することである。
【００１４】
本発明のさらに他の１つの目的は、上皮細胞成長が所望される領域にＫＧＦフラグメントを適用することにより上皮細胞成長を刺激し、そして細胞を培養し得る方法を提供することである。
【００１５】
本発明のさらに他の１つの目的は、処置されるべき創傷の領域に上記の治療組成物を適用して損傷を治癒させることによる、損傷治癒方法を提供することである。
【００１６】
本発明のさらに他の１つの目的は、治療すべき領域に上記の結合体を適用することにより表皮の過剰増殖疾患を処置する方法を提供することである。
【００１７】
従って、本発明は以下を提供する。
【００１８】
１．成熟、完全長ケラチノサイト増殖因子のアミノ酸配列の一部分を含有するケラチノサイト増殖因子フラグメントであって、該一部分が、成熟、組換え、完全長ケラチノサイト増殖因子と比較して少なくとも２倍増加したマイトジェン活性を有し、そして成熟、完全長ケラチノサイト増殖因子の最初の２３個のＮ末端アミノ酸残基を含有する配列を欠く、ケラチノサイト増殖因子フラグメント。
【００１９】
２．前記フラグメントが、成熟、組換え、完全長ケラチノサイト増殖因子と比較して７倍増加したマイトジェン活性を有する、項目１に記載のケラチノサイト増殖因子フラグメント。
【００２０】
３．前記フラグメントが、成熟、組換え、完全長ケラチノサイト増殖因子と比較して１０倍増加したマイトジェン活性を有する、項目１に記載のケラチノサイト増殖因子フラグメント。
【００２１】
４．前記フラグメントが、成熟、組換え、完全長ケラチノサイト増殖因子と比較して細胞毒性の減少を示す、項目１に記載のケラチノサイト増殖因子フラグメント。
【００２２】
５．（ａ）成熟、完全長ケラチノサイト増殖因子のアミノ酸配列の一部分を含有するケラチノサイト増殖因子フラグメントであって、該一部分が、成熟、組換え、完全長ケラチノサイト増殖因子と比較して少なくとも２倍増加したマイトジェン活性を有し、そして成熟、完全長ケラチノサイト増殖因子の最初の２３個のＮ末端アミノ酸残基を含有する配列を欠く、ケラチノサイト増殖因子フラグメント、および
（ｂ）毒性分子
を含有する結合体。
【００２３】
６．前記毒性分子が、リシンＡ、ジフテリアトキシンおよびサポニンからなる群から選択れる、項目５に記載の結合体。
【００２４】
７．前記フラグメントが、成熟、組換え、完全長ケラチノサイト増殖因子と比較して７倍増加したマイトジェン活性を有する、項目５に記載の結合体。
【００２５】
８．前記フラグメントが、成熟、組換え、完全長ケラチノサイト増殖因子と比較して１０倍増加したマイトジェン活性を有する、項目５に記載の結合体。
【００２６】
９．（ａ）成熟、完全長ケラチノサイト増殖因子のアミノ酸配列の一部分を含有するケラチノサイト増殖因子フラグメントであって、該一部分が、成熟、組換え、完全長ケラチノサイト増殖因子と比較して少なくとも２倍増加したマイトジェン活性を有するが、成熟、完全長ケラチノサイト増殖因子の最初の２３個のＮ末端アミノ酸残基を含有する配列を欠く、ケラチノサイト増殖因子フラグメント、および
（ｂ）薬剤的に許容し得るキャリアー
を含有する治療組成物。
【００２７】
１０．項目１に記載のケラチノサイト増殖因子フラグメントをコードするヌクレオチド配列を含有する、ＤＮＡ分子。
【００２８】
１１．項目２に記載のケラチノサイト増殖因子フラグメントをコードするヌクレオチド配列を含有する、ＤＮＡ分子。
【００２９】
１２．項目３に記載のケラチノサイト増殖因子フラグメントをコードするヌクレオチド配列を含有する、ＤＮＡ分子。
【００３０】
１３．項目１０に記載のＤＮＡ分子および該ＤＮＡ分子の発現のための調節配列を含有する発現ベクター。
【００３１】
１４．前記ベクターがバキュロウイルスである項目１３に記載の発現ベクター。
【００３２】
１５．項目１３に記載の発現ベクターによって形質転換された宿主細胞。
【００３３】
１６．前記細胞が、細菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞および昆虫細胞からなる群から選択される、項目１５に記載の宿主細胞。
【００３４】
１７．項目１５に記載の宿主細胞を培養する工程、および該培養物からケラチノサイト増殖因子フラグメントを単離する工程を包含する、ケラチノサイト増殖因子フラグメントを生産する方法。
【００３５】
１８．項目９に記載の治療組成物を、処置しようとする損傷領域に適用し、そして損傷を治癒し得ることを包含する、損傷治癒の方法。
【００３６】
１９．項目５に記載の結合体を、処置しようとする領域に適用することを包含する、表皮の過増殖疾患の処置方法。
【００３７】
２０．前記疾患が、乾癬および基底細胞癌からなる群から選択される疾患である、項目２０に記載の処置方法。
【００３８】
本発明のさらなる目的、特徴、および利益は、当業者に明らかであり、そしてここに列挙する必要はない。本発明は、当業者に明らかであり、そしてフラグメント、結合体、治療組成物、ベクター、宿主、および使用方法の性質および活性を実質上変化しない上記の変形および改変を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
（好ましい実施態様の詳細な説明）
本明細書中でＫＧＦフラグメントまたはＫＧＦｄｅｓ１−２３と称される、ｒＫＧＦ１６３の最初の２３個のＮ末端アミノ酸残基にわたる欠失を有する短縮型非グリコシル化ＫＧＦが、ｒＫＧＦ１６３と比べて上皮細胞上でより大きな生物学的活性および細胞毒の減少を有することを驚くべきことに発見した。一般に、本発明のＫＧＦフラグメントは、上皮細胞の増殖の刺激に対してＫＧＦ１６３の特異性を保持する。
【００４０】
従って、本発明の好ましい実施態様は、天然分子がインビボで生産される場合に、通常それに付随する不純物をともなわない新規な短縮型非グリコシル化ＫＧＦフラグメント、ＫＧＦｄｅｓ１−２３である。このフラグメントは、単一なピークとしてＮａ Ｄｏｄ ＳＯ４／ＰＡＧＥでその移動度に基づき約１８ｋＤａの見かけ上の分子量を有する。Ｂａｌｂ／Ｍｋ細胞上での精製ＫＧＦｄｅｓ１−２３の比活性は、ＰＣＴ特許出願第ＷＯ９０／０８７７１号に記載のように、約２．５×１０７ユニット／ミリグラム（ＥＤ５０４０ｐｇ／ｍｌ）であり、細胞増殖アッセイで比較する場合、ｒＫＧＦ１６３タンパク質の比活性、またはａＦＧＦの比活性より約７〜１０倍大きく、そしてｒＫＧＦ１６３を化学的に規定した培地中でＢａｌｂ／Ｍｋ細胞でＤＮＡ合成の開始を試験することによりバイオアッセイする場合より１００倍大きい。
【００４１】
本発明の他の好ましい実施態様では、ＫＧＦｄｅｓ１−２３は、組換えＤＮＡ技術により、特に大量生産販売のために生産される。さらに好ましい実施態様では、本発明によるＫＧＦｄｅｓ１−２３またはそのアナログをそれぞれ含む組換えＤＮＡ分子および発現ベクターは、当該分野で周知の方法を用いて、標準遺伝子発現技術により実施される。
【００４２】
さらなる実施態様では、ＫＧＦｄｅｓ１−２３をコードするＤＮＡを含むＤＮＡまたはベクターは、細菌、哺乳動物、酵母、または昆虫細胞発現系で発現され得る。好ましい実施態様では、細菌または酵母細胞の発現系は、ＫＧＦｄｅｓ１−２３フラグメントの生産にとって理想である。他の好ましい実施態様では、ＤＮＡまたはベクターは、昆虫細胞発現系で発現される。
【００４３】
本発明のＫＧＦフラグメントは、レセプター認識部位の同定、およびペプチドアゴニストまたはアンタゴニストの設計に使用され得る。さらに、ケラチノサイトに対するＫＧＦの独特な特異性である、血管内皮細胞または線維芽細胞の増殖を誘導し得ない能力および細胞毒の欠損を考慮して、本発明の他の実施態様では、ＫＧＦｄｅｓ１−２３は、好ましくは、特に、皮膚の上皮再形成の促進を所望する場合、創傷治癒適用のために使用される。好ましい実施態様では、ＫＧＦ ｄｅｓ１−２３は、角膜の上皮修復で使用される。ＫＧＦｄｅｓ１−２３の他の適用は、胃腸管内に見られる表皮細胞に対するその特異性に基づいて想定され得る。
【００４４】
皮膚修復について、上皮成長因子（「ＥＧＦ」）、血小板由来の成長因子（「ＰＤＧＦ」）、および他のＦＧＦのような他の成長因子以外の本明細書におけるＫＧＦフラグメントの選択は、当業者の技術範囲内である。例えば、他の成長因子は、ケラチノサイト増殖を直接的または間接的のいずれかで刺激するのに加えて、線維増殖および脈管形成を誘導する。皮膚修復では、このような特別な活性は瘢痕形成のような所望でない副作用を生成し得る。創傷または手術のいずれかを含む角膜修復では、これらの他の因子の使用は、角膜内に血管侵入を誘導し、所望でない角膜不透明または浮腫を生じる。他方では、ＫＧＦは、ケラチノサイトにとって独特な特異性を有し、そして血管内皮細胞または線維芽細胞の増殖を誘導せず、そして従って、これらの特定の創傷治癒適用のために選択した薬剤である。
【００４５】
さらに、本発明のＫＧＦフラグメントは、ＫＧＦフラグメント／毒素結合体の形態で本発明の他の実施態様で用いられ得る。このような結合体は、上皮から基底層のケラチノサイトの過剰増殖を生じる乾癬のような疾患における疾患のプロセスを減衰させ得るか、または停止し得る。この結合体は、血管内皮細胞および線維芽細胞のような、これらの組織に存在する他の２つの主要な細胞型に影響を及ぼさない。
【００４６】
本発明の他の実施態様では、ＫＧＦフラグメント／毒素結合体は、腫瘍細胞増殖、例えば、基底細胞癌を根絶するために用いられ得る。
【００４７】
本発明の実施は、他に指示がなければ、当該分野の技術範囲内にある分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来の技法を使用する。このような技法は文献で十分に説明されている。例えば以下を参照のこと：
【００４８】
【表１Ａ】
【００４９】
【表１Ｂ】
アミノ酸の標準略語は、本明細書中の図１およびその他で用いられる。本明細書中に引用した全ての刊行物、特許、および特許出願は参考として援用される。説明のために、本明細書で用いる用語を下記により特定的に定義する。
【００５０】
（定義）
本明細書で用いる用語「ケラチノサイト増殖因子」または「ＫＧＦ」は、構造的に異なるタンパク質である線維芽細胞成長因子、ＦＧＦのファミリーに属するポリペプチドを意味し、このタンパク質は、それらが関連するファミリーの遺伝子にコードされていることを示唆する配列相同性の変化程度を呈示する。ＫＧＦは、本明細書の他の所に記載された特性を有し、例えば、ＦＧＦＲ−３に結合し、そして上皮細胞、特にケラチノサイトの成長を刺激し得る。完全長ＫＧＦは、１６３アミノ酸残基からなる。
【００５１】
本明細書で用いる本発明のＫＧＦフラグメントは、成熟完全長ＫＧＦのアミノ酸配列の一部分からなるポリペプチドである。本明細書で用いるＫＧＦフラグメントのアナログは、ＫＧＦフラグメントの特性に実質的に影響しないＫＧＦフラグメントの主要ではない挿入、欠失、または置換を含む。例えば、保存的アミノ酸置換が予測される。このような置換は、例えば、アミノ酸の側鎖に関連するアミノ酸ファミリー内で起こる。アミノ酸のファミリーは、（１）酸性：アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性：リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性：アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）非荷電極性：グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシンを含む。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、時折芳香族アミノ酸のファミリーとして共同に分類される。特に、ポリペプチドの活性部位の外側領域でロイシンをイソロイシンまたはバリンで、またはアスパラギン酸をグルタミン酸で、またはトレオニンをセリンで置換する孤立置換、もしくはアミノ酸を構造的な関連アミノ酸で置換する同様の保存的置換からなる保存的アミノ酸置換は、ポリペプチドの特性に大きな影響を有さないことが、一般に認められている。
【００５２】
ＫＧＦフラグメントの特性は、（ｉ）成熟完全長天然ＫＧＦ分子と比較して、上皮細胞増殖の刺激を、２〜１０倍、好ましくは２倍、最も好ましくは７〜１０倍増加するようなその生物学的活性、および（ｉｉ）ＦＧＦＲ−３に結合するその能力を含む。
【００５３】
本明細書で用いる用語「組換えポリヌクレオチド」は、半合成、または合成起源、もしくはｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ（「ｇＤＮＡ」）にコードされたポリヌクレオチドを意味し、それは、（１）天然で会合するポリヌクレオチドの全てまたは一部分と会合しない、（２）天然で連結するポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドに連結する、あるいは（３）天然に存在しない。
【００５４】
「レプリコン」は、任意の遺伝要素、例えば、プラスミド、染色体、ウイルス、コスミドなどであり、それは、細胞内でポリヌクレオチド複製の自律単位として挙動する；すなわち、それは、それ自身の制御下で複製し得る。レプリコンは、例えば、選択マーカーを含み得る。
【００５５】
「組換えベクター」は、他のポリヌクレオチドセグメントが付加されるレプリコンであり、付加したポリヌクレオチドセグメントの複製および／または発現をもたらす。
【００５６】
「調節配列」は、ポリヌクレオチド配列が作動可能に連結されるコーディング配列の発現の調節に必要なポリヌクレオチド配列を意味する。このような調節配列の性質は、コーディング配列が発現されるべき宿主細胞に依存して異なる。原核生物では、このような調節配列は、例えば、一般にプロモーター、リボソーム結合部位、および／または転写終結配列を含む。真核生物では、一般にこのような調節配列は、プロモーターおよび／または転写終結配列を含む。用語「調節配列」はまた、その存在が有益な付加成分、例えば、発現されるべきポリペプチドの分泌をコードする分泌リーダー配列を含み得る。
【００５７】
「作動可能に連結された」は、成分が、意図した様式で機能し得るような関係で連結している並置を意味する。例えば、調節配列は、コーディング配列の発現が、調節配列に適合した条件下で達成されるように、それが接続される場合、コーディング配列に「作動可能に連結されて」いる。
【００５８】
「コーディング配列」は、適切な調節配列の制御下に置かれた場合、ポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチド配列である。コーディング配列の境界は、一般にその５’末端の翻訳開始コドンおよびその３’末端の翻訳終止コドンにより決定される。コーディング配列は、例えば、ｃＤＮＡ、および組換えポリヌクレオチド配列を含み得る。
【００５９】
「ＰＣＲ」は、Ｓａｉｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ ３２４：１６３（１９８６）；およびＳｃｈａｒｆら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３：１０７６−１０７８（１９８６）；米国特許第４，６８３，１９５号；および米国特許第４，６８３，２０２号に記載するポリメラーゼ連鎖反応の技術を意味する。
【００６０】
本明細書で用いる用語「ポリペプチド」は、アミノ酸のポリマーを意味し、そして生成物の特定の長さを意味しない。従って、ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質は、この用語内に包含される。この用語はまた、ポリペプチドの翻訳修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などを包含する。定義内に包含されるものは、置換した結合を有するポリペプチド、および当該分野で公知のその他の改変で、天然に存在するおよび天然に存在しない両方のポリペプチドである。
【００６１】
本明細書で用いる「ターミネーター」は、コーディング配列の終止コドンの３’または下流に位置するポリアデニル化および転写終結配列のような調節配列である。
【００６２】
「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞培養物」、および他のこのような用語は、例えば、微生物、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を意味し、これは、組換えベクターまたは他の転移ＤＮＡを導入するためのレシピエントとして用いられ得るかまたは用いられており、そして形質転換された細胞の子孫を含む。このような子孫は、形態もしくはゲノムＤＮＡまたは全ＤＮＡの相補性が元の親と必ずしも同一ではなく、そして天然、偶発的、または意図的な変異によって生成され得る。哺乳動物宿主細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣（「ＣＨＯ」）およびサル腎臓（「ＣＯＳ」）細胞を含む。
【００６３】
本細書で用いる用語「微生物」は、細菌および真菌のような原核生物および真核生物の微生物種を含み、後者は、酵母および糸状菌を含む。
【００６４】
本明細書で用いる「形質転換」は、宿主細胞への外因性ポリヌクレオチドの転移を意味し、転移に用いた方法、例えば、感染、直接取り込み、形質導入、Ｆ因子交配、マイクロインジェクション、またはエレクトロポレーションにかかわらない。外因性ポリヌクレオチドは、非組み込みベクター、例えば、プラスミドとして維持され得、またはあるいは、宿主ゲノムに組み込まれ得る。
【００６５】
ポリペプチドまたはヌクレオチド配列に関する「精製」および「単離」は、示す分子が、同じ種または型の他の生物学的高分子が実質的にない状態で存在することを意味する。本明細書で用いる用語「精製」は、同じ型の生物学的高分子が少なくとも７５重量％；好ましくは少なくとも８５重量％、さらに好ましくは少なくとも９５重量％、最も好ましくは９８重量％存在することを意味するが、水、緩衝液、および他の小分子、特に、１０００未満の分子量を有する分子もまた存在し得る。
【００６６】
「薬学的に受容可能なキャリア」は、抗体、熱などの生成のような所望しない副作用をそれ自身誘導しないヒトへの投与のために、当業者により用いられる任意のキャリアを意味する。適切なキャリアは、典型的には大きく、ゆっくりと代謝される高分子（それはタンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸コポリマー、または非活性ウイルス粒子であり得る）である。他のキャリアは、当業者に周知である。好ましくは、キャリアは、チログロブリンを含む。
【００６７】
治療用組成物は、典型的には、薬学的に受容可能なキャリア、例えば、水、生理食塩水、グリセロール、エタノールなどを含有し得る。さらに、補助剤、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝化剤などが、このような組成物中に存在し得る。
【００６８】
本明細書で用いる「治療有効量」は、所望の結果の生成に効果的な量を意味する。この量は、処置されるべき個体の健康および身体状態、抗体を合成する個々の免疫系の能力、所望の防御程度、製剤、処置する医師の病状の評価、および他の関連因子に依存し得る。この量は、一般検査により決定され得る相対的に広い領域に入り得ることが予期される。
【００６９】
ＫＧＦが昆虫細胞Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（「ＳＦ９」）で、ＫＧＦ１６３をコードするｃＤＮＡを含む組換えバキュロウイルスＡｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａの感染により発現される場合、それらは、ＫＧＦ１６３に加えて、単一なグリコシル化部位を含むＫＧＦ１６３Ｎ末端ドメインの最初の２３アミノ酸残基を欠失するＫＧＦフラグメントを生産する。短縮型の非グリコシル化ＫＧＦフラグメントＫＧＦｄｅｓ１−２３またはＫＧＦ１４０は、ＫＧＦ１６３として同定された天然の長形態に較べて、標的細胞に対して７〜１０倍増加した能力を有する。 ＫＧＦｄｅｓ１−２３の標的細胞特異性は、変化しない。さらに、高濃度のＫＧＦフラグメントでは、ケラチノサイトについての毒性効果は、ＫＧＦ１６３について観察されたのに較べて全く観察されない。これらの観察は、ＰＣＴ出願第ＷＯ９０／０８７７１号で既に提唱されたことに反して、ＫＧＦの標的細胞特異性が、そのＮ末端ドメインの残基にないことを示唆する。さらに、本発明は、ＫＧＦのＮ末端短縮型バージョンが、実際に、治療用適用のためのさらに高い生物学的活性および細胞毒の減少を有する改良ＫＧＦバージョンを表すことを示す。
【００７０】
大量のＫＧＦフラグメントは、組換えＤＮＡ技術により生産され得、組換えＤＮＡ技術は、天然供給源からＫＧＦを単離して精製し、そしてそのＮ末端から最初の２３アミノ酸残基を切除するもう一方のプロセスより好ましい。組換え技術により生産されるＫＧＦが、細胞中に通常存在する混入分子の非存在下で、ＫＧＦが単離されることを可能にする。実際に、いかなる微量のヒトタンパク質混入物質も完全に含まないＫＧＦ組成物は、例えば、細菌細胞、酵母細胞、および昆虫細胞で容易に生産され得る。組換えＤＮＡ技術の使用により、部位特異的変異誘発により生産され得る変異型のような、天然で見られないＫＧＦフラグメントもまた、生産され得る。
【００７１】
所望の宿主でのＫＧＦフラグメントの発現を可能にする任意のプロモーターが、本発明で用いられ得る。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉでは、ｌａｃオペロンの調節プロモーター配列が用いられ得る。他の例は、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ（「ＡＤＨ」）プロモーターであり、それは、ＡＤＨプロモーターの活性を調節する上流アクチベーター配列（「ＵＡＳ」）を有する。さらに、特定のウイルスエンハンサーもまた、本明細書で用いられ得る。このようなエンハンサーは、哺乳動物細胞において増幅するだけでなく、発現を調節する。これらのエンハンサーは、Ｓａｓｓｏｎｅ−ＣｏｒｓｉおよびＢｏｒｅｌｌｉ Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．２：２１５（１９８６）；Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２３６：１２３７（１９８７）に記載のように、哺乳動物のプロモーター配列に組み込まれ、この哺乳動物プロモーター配列は、ホルモンまたは酵素基質のような誘導物質の存在下でのみ活性化し得る。本発明で用いられ得るプロモーターはまた、バキュロウイルスポリヘドロンハイブリッドプロモーターおよびｐ１０プロモーターを含む。
【００７２】
本発明で用いられ得る終結配列の例は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ α因子ターミネーターおよびバキュロウイルスターミネーターである。さらに、特定の宿主細胞で作動可能なウイルスターミネーターもまた、用いられ得る。例えば、ＳＶ４０ターミネーターは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で機能する。
【００７３】
短縮型タンパク質を設計する場合、いくつかのＫＧＦが、本発明の実施において好ましい。１つは、非グリコシル化ＫＧＦであり、例えば、天然ＫＧＦの最初の２３アミノ酸を切除している非グリコシル化ＫＧＦである。好ましい短縮型ＫＧＦをコードするｃＤＮＡを図１に示す。ＫＧＦフラグメントの他の種は、存在するか、または一般的な方法により作製され得る。示された配列において、短縮型タンパク質のための開裂部位が、矢印（ａ）で示される場所に生じ得、約１８，０００Ｄａの分子量を有するタンパク質を生じる。図１の配列データーおよび短縮型ＫＧＦの示された特徴を利用して、短縮型ＫＧＦをコードする他のＤＮＡ配列を得ることは、当該分野の技術範囲内にある。例えば、構造遺伝子は、正しいアミノ酸を保持しながら個々のヌクレオチドを変えること、または生物学的活性を損失せずにアミノ酸を改変するようにヌクレオチドを変えることにより操作され得る。ヌクレオチドは、例えば、インビトロでの変異誘発およびプライマー修復を含む公知の技術により置換、挿入、または欠失され得る。構造遺伝子は、その生物学的活性を保持しながら、その３’末端および／またはその５’末端で短縮され得る。
【００７４】
ＫＧＦフラグメントコーディング配列は、ＫＧＦフラグメントをコードするＤＮＡ配列を合成すること、もしくは所望の配列の生産のために存在しているまたは天然のＫＧＦコーディング配列を変化することにより構築され得る。天然ＫＧＦコーディング配列またはポリペプチドは、天然に生じる。天然ＫＧＦのアミノ酸配列を［図１］に示す。合成ＫＧＦフラグメントは、Ｕｒｄｅａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：７４６１（１９８３）で示唆されるように、ＫＧＦの公知のアミノ酸配列に基づき、選択した宿主細胞に好ましいコドンを用いて作製され得る。あるいは、所望のＫＧＦフラグメントコーディング配列は、［図１］に示す核酸配列に基づくプローブを用いて核酸ライブラリーからクローニングされ得る。核酸配列ライブラリーの生産およびプローブ化（ｐｒｏｂｉｎｇ）のための技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８０）に記載されている。他の組換え技術、例えば、部位特異的変異誘発、ＰＣＲ、酵素的切断および連結もまた、ＫＧＦフラグメントのコーディング配列のアナログおよび誘導体を構築するため用いられ得る。天然ＫＧＦポリペプチドコーディング配列は、他のクラスのＫＧＦポリペプチドを作製するために容易に改変され得る。
【００７５】
例として、ＫＧＦフラグメントのアナログは、ＫＧＦフラグメントの活性を損なわない保存的アミノ酸置換により作製される。本発明は、さらにムテイン（ｍｕｔｅｉｎ）と呼ばれるＫＧＦフラグメントのアナログのサブセットを意図しており、ムテインでは、ＫＧＦフラグメントのジスルフィド結合に関与しないシステインが通常は、セリンに置換されている。これらのムテインは、非改変ＫＧＦフラグメントより広い温度領域にわたり安定である。本明細書中のムテインはまた、天然ＫＧＦフラグメントと比較してアミノ酸欠失を含み得る。ムテインは、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも５０％、および最も好ましくは少なくとも８０％の天然ＫＧＦフラグメントの活性を保持し得る。ムテインのコーディング配列は、天然ＫＧＦフラグメントのコーディング配列のインビトロでの変異誘発により構築され得る。
【００７６】
フラグメントは、アミノおよび／またはカルボキシル末端アミノ酸欠失により天然ＫＧＦ分子と異なる。ＫＧＦフラグメントが、Ｎ末端グリコシル化部位を含まず、そして天然ＫＧＦ分子の少なくとも２０％のＫＧＦ活性を保持するなら、短縮されたアミノ酸の数は重大でない。このようなフラグメントのコーディング配列は、天然ＫＧＦコーディング配列またはその変異体由来の所望でないヌクレオチドを開裂することにより容易に構築され得る。
【００７７】
本発明の範囲内の発現ベクターは、宿主細胞で作動可能であり、そしてＫＧＦフラグメントまたはアナログのコーディング配列に作動可能に連結されるプロモーターを含む。発現ベクターは、分泌のためのシグナル配列、ターミネーター、選択マーカー、複製起点、および宿主細胞配列と同種（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）の配列を任意に含み得る。これらの追加的な要素は、発現を最適化するために含まれ得る。
【００７８】
機能的な非天然プロモーターもまた用いられ得、例えば、異なるプロモーターの共通配列に基づいた合成プロモーターであり得る。また、効果的なプロモーターは、異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）の発現開始領域と連結した調節領域を含むハイブリッドプロモーターであり得る。ハイブリッドプロモーターの例は、Ｅ．ｃｏｌｉ ｔａｃ転写活性領域に連結したＥ．ｃｏｌｉ ｌａｃオペレーター；本明細書に参考として援用される米国特許第４，８７６，１９７号および第４，８８０，７３４号に記載のような、酵母グリセルアルデヒド−３−ホスフェート−デヒドロゲナーゼ（「ＧＡＰＤＨ」）に連結した酵母アルコールデヒドロゲナーゼ（「ＡＤＨ」）調節配列；およびシミアンウイルスＳＶ４０プロモーターに連結したサイトメガロウイルス（「ＣＭＶ」）エンハンサーである。
【００７９】
本発明のＫＧＦフラグメントまたはアナログのコーディング配列はまた、読み取り枠でシグナル配列に結合され得る。シグナル配列は、典型的には、疎水性アミノ酸からなる分泌のためのアミノ酸配列をコードしＫＧＦフラグメントまたはアナログを細胞膜に導く。好ましい実施態様では、プロセッシング部位は、シグナル配列とＫＧＦフラグメントとの間に位置し、インビボまたはインビトロのいずれかでシグナル配列およびＫＧＦフラグメントの間を開裂し得る。適切なシグナル配列は、分泌される内因性宿主細胞タンパク質に対する遺伝子由来であり、例えば、ヨーロッパ特許第１２８７３号および日本特許第６２，０９６，０８６号に記載の酵母インベルターゼ、米国特許第４，５８８，６８４号に記載のＡ因子遺伝子、およびＥＰ６００５７に記載のようなインターフェロンシグナル配列である。
【００８０】
酵母での発現のために本発明で用いる好ましいクラスの分泌リーダーは、短縮型酵母α因子リーダー配列であり、それは、「プレ」シグナル配列の少なくとも一部分および「プロ」領域を含む。本明細書に参考として援用される米国特許第４，５４６，０８３号および第４，８７０，００８号、ならびにヨーロッパ特許第ＥＰ３２４２７４号に記載のように、本明細書中で使用され得るα因子リーダー配列は、約８３アミノ酸残基を有する完全長プレ−プロα因子リーダー、および典型的には、約２５〜約５０アミノ酸残基を含む短縮型α因子リーダーであり得る。本明細書で用いられ得るα因子リーダーフラグメントを使用する付加的なリーダーは、第二の酵母α因子由来のプロ領域ではなく、第一の酵母シグナル配列のプレ配列で作られるハイブリッドα因子リーダーを含む。（例えば、ＰＣＴ
ＷＯ８９／０２４６３を参照のこと。）
（ｆ．発現システム）
ＫＧＦフラグメントおよびそのアナログは、当業者に十分に理解されるように、ＫＧＦフラグメントまたはアナログをコードするＤＮＡ配列がベクターに適切な読み取り枠および方向で作動可能に連結される場合、組換え技術により発現され得る。ＫＧＦフラグメントを含む遺伝子構築物を作成する場合、好ましい出発材料は、ＫＧＦフラグメントをコードしているｃＤＮＡである。ＫＧＦフラグメントはまた、所望する場合、開裂され得るハイブリッドタンパク質として生産され得るが、典型的には、短縮型ＫＧＦ遺伝子は、プロモーターより下流に挿入され得、そして後ろにターミネーター配列が続き得る。一般に、短縮型ＫＧＦおよび短縮型ＫＧＦポリペプチド誘導体の生産収量を改善する宿主細胞特異的配列が用いられ得、そして適切な制御配列、例えば、エンハンサー配列、ポリアデニル化配列、およびリボソーム結合部位が発現ベクターに付加され得る。一旦、適切なコーディング配列が単離されること、それは、種々の異なる発現系；例えば、哺乳動物細胞、バキュロウイルス、細菌、および酵母で使用され、発現され得る。これらは、以下に考察される。
【００８１】
（ｉ．哺乳動物系）
哺乳動物発現系は、当該分野で公知である。哺乳動物プロモーターは、哺乳動物ＲＮＡポリメラーゼを結合し、そしてコーディング配列（例えば、構造遺伝子）のｍＲＮＡへの下流（３‘）転写を開始し得る任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは転写開始領域、それは、通常コーディング配列の５’末端に隣接する位置にあり、および転写開始部位の２５〜３０塩基対（ｂｐ）上流に位置するＴＡＴＡボックスを有し得る。 ＴＡＴＡボックスは、ＲＮＡ合成を正しい部位で始めるために、ＲＮＡポリメラーゼＩＩに指示すると考えられている。動物細胞のプロモーターはまた、上流のプロモーター要素（典型的には、ＴＡＴＡボックスの１００〜２００ｂｐ上流内に位置する）を含み得る。上流のプロモーター要素は、転写が開始される速度を決定しどちらかの方向に作用し得る［Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）「哺乳動物細胞におけるクローン化遺伝子の発現。」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版］。
【００８２】
哺乳動物のウイルス遺伝子は、しばしば高発現され、そして広い宿主領域を有する；従って、哺乳動物ウイルス遺伝子をコードしている配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。この例として、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳ガンウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ）、および単純ヘルペスウイルスプロモーターが含まれる。さらに、非ウイルス遺伝子、例えば、ネズミメタロチオネイン遺伝子由来の配列はまた、有用なプロモーター配列を提供する。発現は、構成的か、調節的（誘導性）のいずれかであり得、プロモーターがホルモン応答細胞におけるグルココルチコイドで誘導され得ることに依存する。
【００８３】
上記のプロモーター要素と結合したエンハンサー要素（エンハンサー）の存在は、典型的には、発現レベルを増加する。エンハンサーは、同種または異種プロモーターと連結されるとき、正常なＲＮＡ開始部位で合成を開始する場合に１０００倍まで転写を刺激し得る調節ＤＮＡ配列である。エンハンサーはまた、それらが転写開始部位から上流または下流に、正常または逆の向きで、もしくはプロモーターから１０００ヌクレオチオド以上の距離に位置する場合、活性である［Ｍａｎｉａｔｉｓら、（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：１２３７；Ａｌｂｅｒｔｓら、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ，第２版］。ウイルス由来のエンハンサー要素は特に有用である。なぜなら、それらは、典型的には、より広い宿主領域を有するからである。この例として、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー［Ｄｉｊｋｅｍａら、（１９８５）ＥＭＢＯ Ｊ．４：７６１］およびラウス肉腫ウイルスの長末端反復（ＬＴＲ）由来［Ｇｏｒｍａｎら、（１９８２ｂ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７９：６７７７］、およびヒトサイトメガロウイルス［Ｂｏｓｈａｒｔら、（１９８５）Ｃｅｌｌ ４１：５２１］由来のエンハンサー／プロモーターが含まれる。さらに、いくつかのエンハンサーは調節可能であり、そしてホルモンまたは金属イオンのような誘導物質の存在下でのみ活性になる［Ｓａｓｓｏｎｅ−ＣｏｒｓｉおよびＢｏｒｅｌｌｉ（１９８６）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．２：２１５；Ｍａｎｉａｔｉｓら、（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：１２３７］。
【００８４】
ＤＮＡ分子は、哺乳動物細胞において細胞内発現され得る。プロモーター配列は、ＤＮＡ分子と直接連結し得、その場合、組換えタンパク質のＮ末端の最初のアミノ酸は常にメチオニンであり、メチオニンは、ＡＴＧ開始コドンによりコードされている。所望であれば、Ｎ末端は、インビトロで臭化シアンとともにインキュベートすることでタンパク質から開裂され得る。
【００８５】
あるいは、外来タンパク質はまた、哺乳動物細胞において外来タンパク質の分泌を提供するリーダー配列フラグメントからなる融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子を作成することにより、細胞から成長培地へ分泌され得る。好ましくは、リーダーフラグメントと、インビボまたはインビトロのいずれかで開裂され得る外来遺伝子との間にコードされるプロセッシング部位がある。リーダー配列フラグメントは、典型的には、細胞からのタンパク質の分泌を指向する疎水性アミノ酸からなるシグナルペプチドをコードする。アデノウイルス三部分（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダーは、哺乳動物細胞において外来タンパク質の分泌を提供するリーダー配列の１例である。
【００８６】
典型的には、哺乳動物細胞により認識される転写終結およびポリアデニル化配列は、３’から翻訳終止コドンに位置する調節領域であり、そしてそれ故プロモーター要素とともにコーディング配列に隣接する。成熟ｍＲＮＡの３’末端は、部位特異的な転写後の開裂およびポリアデニル化により形成される［Ｂｉｒｎｓｔｉｅｌら、（１９８５）Ｃｅｌｌ
４１：３４９；ＰｒｏｕｄｆｏｏｔおよびＷｈｉｔｅｌａｗ（１９８８）「真核生物ＲＮＡの終結および３’末端プロセッシング」、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｐｌｉｃｉｎｇ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＤ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ（１９８９）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１４：１０５］。これらの配列は、ＤＮＡにコードされるポリペプチドに翻訳され得るｍＲＮＡの転写を指向する。転写ターミネーター／ポリアデニル化シグナルの例は、ＳＶ４０由来のそれらを含む［Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）「培養哺乳動物細胞におけるクローニングされた遺伝子の発現」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ。
【００８７】
いくつかの遺伝子は、イントロン（介在配列とも言う）が存在する場合、さらに効果的に発現され得る。しかし、いくつかのｃＤＮＡは、スプライシングシグナル（スプライス供与体および受容体部位ともいう）を欠いたベクターから効率的に発現された［ＧｏｔｈｉｎｇおよびＳａｍｂｒｏｏｋ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９３：６２０を参照のこと］。イントロンは、スプライス供与体および受容体部位を含む、コーディング配列内に介在する非コーディング配列である。それらは、一次転写物のポリアデニル化後「スプライシング」と呼ばれるプロセスにより取り除かれる［Ｎｅｖｉｎｓ（１９８３）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５２：４４１；Ｇｒｅｅｎ（１９８６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２０：６７１；Ｐａｄｇｅｔｔら、（１９８６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５５：１１１９；ＫｒａｉｎｅｒおよびＭａｎｉａｔｉｓ（１９８８）「ＲＮＡスプライシング」、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｐｌｉｃｉｎｇ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＤ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ編）。
【００８８】
典型的には、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、および転写終結配列を含む上記の構成成分は、一緒に発現構築物中に置かれる。エンハンサー、機能的なスプライス供与体および受容体部位を有するイントロン、ならびにリーダー配列はまた、所望する場合、発現構築物中に含まれる。発現構築物は、哺乳動物細胞または細菌のような宿主において安定に維持し得る染色体外要素（例えば、プラスミド）のようなレプリコン中にしばしば維持される。哺乳動物の複製系は、動物ウイルス由来の系を含み、それは、複製にトランスに作用する因子を必要とする。 例えば、ＳＶ４０［Ｇｌｕｚｍａｎ（１９８１）Ｃｅｌｌ ２３：１７５］のようなパポーバウイルスまたはポリオーマウイルスの複製系を含むプラスミドは、適切なウイルスＴ抗原の存在下できわめて高いコピー数に複製する。哺乳動物のレプリコンの別の例は、ウシパピローマウイルスおよびエプスタインバーウイルス由来のレプリコンを含む。さらに、レプリコンは、２つの複製系を有し得、従って、例えば、発現のために哺乳動物細胞で、およびクローニングおよび増幅のために原核生物宿主で維持され得る。このような哺乳動物−細菌シャトルベクターの例は、ｐＭＴ２［Ｋａｕｆｍａｎら、（１９８９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：９４６およびｐＨＥＢＯ［Ｓｈｉｍｉｚｕら、（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：１０７４］を含む。
【００８９】
用いた形質転換手順は、形質転換されるべき宿主に依存する。異種ポリヌクレオチドを哺乳動物細胞へ導入するための方法は、当該分野で公知であり、そしてデキストラン仲介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈澱、ポリブレン仲介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム内へのポリヌクレオチドのカプセル化、および核へのＤＮＡの直接マイクロインジェクションを含む。
【００９０】
発現のための宿主として利用できる哺乳動物細胞株は当該分野で公知であり、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、および多くのその他の細胞株を含むがこれに限定されない、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｔｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株を含む。
【００９１】
（ｉｉ．バキュロウイルス系）
ＫＧＦをコードしているポリヌクレオチドは、安定な発現ベクター、例えば昆虫細胞発現ベクター中に挿入され得、そしてベクター内で制御要素に作動可能に連結され得る。ベクターの構築は、当該分野で公知の技術を使用して行われる。特に、本発明の目的のため、バキュロウイルス発現ベクターが、Ｋｉｔｔｓら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４：８１０−８１７（１９９３）に実質的に従って構築される。
【００９２】
簡単に説明すると、バキュロウイルスゲノムの一部（本明細書中では、「バキュロウイルス配列」と呼ばれている）に相同性があり、そしてそれと相同的組換えを行い得るポリヌクレオチド配列を含むトランスファーベクターに、ＫＧＦ１６３をコードしている配列を挿入することによって、 ＫＧＦ発現カセットを最初に構築する。バキュロウイルス配列は、以下により詳しく記載されているように、必須のポリヌクレオチド配列を少なくとも含む。ＫＧＦコーディング配列は、バキュロウイルス配列が両端に位置するようにトランスファーベクターに挿入される。
【００９３】
ＫＧＦコーディング配列を含むトランスファーベクターを、機能的なウイルスの生産に必要な必須のポリヌクレオチド配列を欠いている野生型バキュロウイルスの変異体とともに宿主昆虫細胞中にトランスフェクトする。この点に関して、変異体のバキュロウイルスがＫＧＦ発現カセットと組換わるときトランスフェクションに際し機能的なウイルスが宿主細胞中で産生され得る。
【００９４】
従って、この様式で産生される機能的なバキュロウイルスは、ＫＧＦ発現カセットを組み込み、そして組換えＫＧＦおよび組換えＫＧＦｄｅｓ１−２３を産生するために、新たな宿主細胞のトランスフェクションに適切である。あるいは、このプロセスは、ＫＧＦ１６３コーディング配列の代わりにＫＧＦｄｅｓ１−２３コーディング配列を用いて実施され得る。
【００９５】
一般に、発現系の構成成分は、バキュロウイルスゲノムのフラグメント、および異種遺伝子または発現されるべき遺伝子の挿入に便利な制限部位の両方を含むトランスファーベクター（通常は細菌プラスミド）を含む機能的なバキュロウイルス；トランスファーベクター中のバキュロウイルス特異的フラグメントに相同な配列を有する野生型バキュロウイルス（これは、バキュロウイルスゲノムに異種遺伝子の相同組換えを可能にする）；および適切な昆虫宿主細胞および成長培地を含む。
【００９６】
短縮型ＫＧＦ ＤＮＡ配列をトランスファーベクターに挿入後、ベクターおよび野生型ウイルスゲノムを、ベクターおよびウイルスゲノムが組換えられ得る昆虫宿主細胞にトランスフェクトする。パッケージ化された組換えウイルスを発現し、そして組換えプラークを同定し、そして精製する。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系の材料および方法は、前記のＩｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡからキット形態（「ＭａｘＢａｃ」キット）で市販されている。これらの技術は、一般に、当業者に公知であり、そしてＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ，Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５（１９８７）（本明細書では以後、「ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ」と称する）に十分に記載され、そして参考として援用されている。
【００９７】
短縮型ＫＧＦ ＤＮＡ配列をバキュロウイルスゲノムに挿入する前に、プロモーター、リーダー（所望の場合）、目的のコーディング配列、および転写終結配列を含む上記の構成成分を、代表的には、中間導入配置構築物（トランスファーベクター）にアセンブルする。この構築物は、単一の遺伝子および作動可能に連結した調節要素；それぞれが作動可能に連結したそれ自身の調節要素のセットを有する複数の遺伝子；または調節要素の同じセットにより調節されているは複数の遺伝子を含み得る。中間導入配置構築物を、しばしば細菌のような宿主で安定に維持し得る染色体外要素（例えば、プラスミド）のようなレプリコン中に維持し得る。レプリコンは複製系を有し、従ってクローニングおよび増幅のために適切な宿主中で、それは維持され得る。
【００９８】
現在では、ＡｃＮＰＶに外来遺伝子を導入するために最も一般的に用られるトランスファーベクターはｐＡｃ３７３である。当業者に公知である多くの他のベクターもまた設計された。これらは、例えば、ｐＶＬ９８５（これは、ポリヘドリン開始コドンをＡＴＧからＡＴＴに改変し、そしてＡＴＴから３２塩基対下流にＢａｍＨＩクローニング部位を導入する；ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８９）１７：１３を参照のこと）を含む。
【００９９】
プラスミドはまた、通常ポリヘドリンポリアデニル化シグナル（Ｍｉｌｌｅｒら（１９８８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４２：１７７）、ならびにＥ．ｃｏｌｉにおける選択および増殖のための原核生物のアンピシリン耐性（ａｍｐ）遺伝子および複製起点を含む。
【０１００】
バキュロウイルストランスファーベクターは、通常バキュロウイルスプロモーターを含む。バキュロウイルスプロモーターは、バキュロウイルスＲＮＡポリメラーゼを結合し得、そしてコーディング配列（例えば、構造遺伝子）のｍＲＮＡへの下流（５’から３’）転写を開始し得る任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常、コーディング配列の５’末端に隣接して位置する転写開始領域を有する。この転写開始領域は、典型的には、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。バキュロウイルストランスファーベクターはまた、エンハンサーと呼ばれる第二ドメインを有し得、存在する場合は、通常構造遺伝子から遠位にある。発現は、調節され得るか、または構成的であり得る。
【０１０１】
構造遺伝子は、ウイルス感染サイクルの後期に盛んに転写され、特異的に有用なプロモーター配列を提供する。この例として、ウイルスポリヘドリンタンパク質をコードする遺伝子、Ｆｒｉｅｓｅｎら、（１９８６）「バキュロウイルス遺伝子発現の調節」、Ｔｈｅ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ（Ｗａｌｔｅｒ Ｄｏｅｒｆｌｅｒ編）；ＥＰＯ公開番号第１２７，８３９号および第１５５，４７６号；およびｐ１０タンパク質をコードする遺伝子、Ｖｌａｋら、（１９８８），Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：７６５由来の配列が含まれる。
【０１０２】
適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、分泌される昆虫タンパク質または分泌されるバキュロウイルスタンパク質、例えば、バキュロウイルスポリヘドリン遺伝子（Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら、（１９８８）Ｇｅｎｅ，７３：４０９）に由来する遺伝子であり得る。あるいは、哺乳動物細胞の翻訳後の修飾（例えば、シグナルペプチド開裂、タンパク質分解開裂、およびリン酸化）のためのシグナルが、昆虫細胞により認識されるようであり、そして分泌および核蓄積に必要なシグナルもまた、無脊椎動物細胞および脊椎動物細胞の間で保存され得るようであるので、昆虫起源でないリーダー、例えば、ヒトα−インターフェロン、Ｍａｅｄａら、（１９８５）、Ｎａｔｕｒｅ ３１５：５９２；ヒトガストリン放出ペプチド、Ｌｅｂａｃｑ−Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎら、（１９８８）、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３１２９；ヒトＩＬ−２、Ｓｍｉｔｈら、（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：８４０４；マウスＩＬ−３、（Ｍｉｙａｊｉｍａら、（１９８７）Ｇｅｎｅ ５８：２７３；およびヒトグルコセレブロシダーゼ、Ｍａｒｔｉｎら、（１９８８）ＤＮＡ，７：９９をコードする遺伝子由来のリーダーもまた、昆虫で分泌を提供するために使用され得る。
【０１０３】
組換えポリペプチドまたはポリタンパク質は、細胞内で発現され得、もしくは、適切な調節配列で発現される場合分泌され得る。非融合の外来タンパク質の良好な細胞内発現は、通常、 ＡＴＧ開始シグナルに先行する適切な翻訳開始シグナルを含む短いリーダー配列を理想的には有する異種遺伝子を必要とする。所望であれば、Ｎ末端のメチオニンを、臭化シアンとのインビトロでのインキュベーションにより、成熟タンパク質から開裂し得る。
【０１０４】
あるいは、天然では分泌されない組換えポリタンパク質またはタンパク質は、昆虫での外来タンパク質の分泌を提供するリーダー配列フラグメントからなる融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子を作製することにより昆虫細胞から分泌され得る。リーダー配列フラグメントは、典型的には、タンパク質の小胞体中への移動を指向する疎水性アミノ酸からなるシグナルペプチドをコードする。
【０１０５】
短縮型のＫＧＦ ＤＮＡ配列および／または発現産物前駆体をコードしている遺伝子の挿入後、昆虫細胞宿主は、トランスファーベクターの異種ＤＮＡおよび野生型バキュロウイルスのゲノムＤＮＡを用いて同時形質転換され、それは、通常、同時トランスフェクションによる。構築物のプロモーターおよび転写終結配列は、典型的には、２〜５ｋｂセクションのバキュロウイルスゲノムを含む。異種ＤＮＡをバキュロウイルスの所望の部位に導入する方法は、当該分野で公知である。（ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ 上記；Ｊｕら、（１９８７）；Ｓｍｉｔｈら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８３）３：２１５６；ならびにＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ（１９８９）参照のこと）。例えば、ポリヘドリン遺伝子のような遺伝子に、相同な二重交差組換えにより挿入され得る；また所望のバキュロウイルス遺伝子中に設計された制限酵素部位にも挿入し得る。Ｍｉｌｌｅｒら、（１９８９），Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ ４：９１。ＤＮＡ配列が、ポリヘドリン遺伝子の代わりに発現ベクターにクローニングされる場合、その５’および３’の両方にポリヘドリン特異的配列が隣接し、そしてポリヘドリンプロモーターの下流に位置する。
【０１０６】
新たに形成されたバキュロウイルス発現ベクターは、次いで感染性組換えバキュロウイルスにパッケージ化される。同種の組換えが、低頻度で起こる（約１％と約５％との間）；従って、同時トランスフェクション後に産生された多くのウイルスは、なお野生型のままである。それゆえ、組換えウイルスを同定するための方法が必要である。発現系の利点は、組換えウイルスを区別できるようにする視覚化スクリーニングである。ポリヘドリンタンパク質は、天然ウイルスにより産生され、ウイルス感染後、後期に感染細胞の核に非常に高レベルで産生される。蓄積したポリヘドリンタンパク質はまた、包埋粒子を含む封入体を形成する。これらの封入体は、サイズが１５μｍまでであり、高度に屈折性であり、光学顕微鏡下で容易に視覚化される明るく光った外観を与える。組換えウイルスに感染した細胞は、封入体を欠いている。野生型ウイルスから組換えウイルスを区別するために、トランスフェクション上清を当業者に公知の技術により単層の昆虫細胞上にプラーク化する。すなわち、プラークは、光学顕微鏡下で封入体の存在（野生型ウイルスを示す）または不在（組換えウイルスを示す）についてスクリーニングされる。「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」第２巻（Ａｕｓｕｂｅｌら編）、１６．８（増刊１９９０年１０月）；ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、前述；Ｍｉｌｌｅｒら（１９８９）。
【０１０７】
組換えバキュロウイルス発現ベクターが、いくつかの昆虫細胞に感染させるために開発された。例えば、組換えバキュロウイルスは、とりわけ以下について開発された：
【０１０８】
【表２】
細胞および細胞培養培地は、バキュロウイルス／発現系におる異種ポリペプチドの指向および融合発現の両方について市販されている；細胞培養技術は、当業者に一般に公知である。例えば、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、前述を参照のこと。
【０１０９】
次いで、改変された昆虫細胞は、適切な栄養培地で成長し得、この培地は、改変された昆虫宿主に存在するプラスミドを安定的に維持し得る。発現産物の遺伝子が、誘導し得る制御下にある場合、宿主は高濃度になるまで成長され得、そして発現を誘導する。あるいは、発現が構成的である場合、産物は連続的に培地中に発現され得、そして栄養培地は連続的に循環されねばならず、その間目的の産物を取り出し、そして枯渇した栄養を増強する。この産物をクロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなど）；電気泳動；密度勾配遠心分離；溶媒抽出などのような技術により精製され得る。適切には、必要に応じて、培地に同時に分泌されるか、または昆虫細胞の溶解から生じる任意の昆虫タンパク質を実質的に除去するように、宿主の残骸（例えば、タンパク質、脂質、および多糖）を少なくとも実質的に含まない産物を提供するように、産物をさらに精製する。
【０１１０】
短縮型ＫＧＦ発現を得るために、形質転換体由来の組換え宿主細胞を、配列をコードする組換え短縮型ＫＧＦの発現を可能にする条件下でインキュベートし得る。これらの条件は、選択される宿主細胞に依存して変化し得る。しかし、条件は、当該分野で公知の事項に基づき、当業者に容易に確認され得る。
【０１１１】
（ｉｉｉ．細菌系）
細菌発現技術は当該分野で公知である。細菌プロモーターは、細菌ＲＮＡポリメラーゼを結合し得、そしてコーディング配列（例えば、構造遺伝子）のｍＲＮＡへの下流（３”）転写を開始し得る任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常コーディング配列の５’末端に隣接して位置する転写開始領域を有する。この転写開始領域は、典型的には、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。細菌プロモーターはまた、オペレーターと呼ばれる第二ドメインを有し得、それは、ＲＮＡ合成が開始する隣接したＲＮＡポリメラーゼ結合部位とオーバーラップし得る。遺伝子リプレッサータンパク質がオペレーターに結合し得、そしてそれによって特異的な遺伝子の転写を阻害し得るので、オペレーターは、ネガティブに調節された（誘導可能な）転写を可能にする。構成的な発現は、オペレーターのようなネガティブな調節要素の非存在下で生じ得る。さらに、ポジティブな調節は、遺伝子活性化タンパク質結合配列により達成され得、それが存在する場合は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合配列に隣接する（５’側）。遺伝子活性化タンパク質の例は、カタボライトアクチベータータンパク質（ＣＡＰ）であり、それは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてｌａｃオペロンの転写開始を助ける［Ｒａｉｂａｕｄら、（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１８：１７３］。従って、調節された発現は、ポジティブまたはネガティブのいずれか、それにより転写促進または減少のいずれであり得る。
【０１１２】
代謝経路酵素をコードしている配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。この例としては、糖代謝酵素、例えば、ガラクトース、ラクトース（ｌａｃ）［Ｃｈａｎｇら、（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ １９８：１０５６］、およびマルトース由来のプロモーター配列を含む。別の例は、トリプトファン（ｔｒｐ）のような生合成酵素由来のプロモーター配列を含む［Ｇｏｅｄｄｅｌら、（１９８０）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８：４０５７；Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎら、（１９８１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９：７３１；米国特許第４，７３８，９２１号；ＥＰＯ公開第０３６７７６号および第１２１７７５号］。ｇ−ラオタマーゼ（ｇ−ｌａｏｔａｍａｓｅ）（ｂｌａ）プロモーター系［Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ（１９８１）「インターフェロンおよび他の間違いのクローニング。」Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ３（Ｉ．Ｇｒｅｓｓｅｒ編）］、バクテリオファージラムダＰＬ［Ｓｈｉｍａｔａｋｅら、（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１２８］およびＴ５［米国特許第４，６８９，４０６号］プロモーター系はまた、有用なプロモーター配列を提供する。
【０１１３】
さらに、天然にない合成プロモーターがまた、細菌プロモーターとして機能する。例えば、ある細菌またはバクテリオファージプロモーターの転写アクチベーター配列は、他の細菌またはバクテリオファージプロモーターのオペロン配列と結合され得、合成ハイブリッドプロモーターを作製する［米国特許第４，５５１，４３３］。例えば、ｔａｃ−ｌａｃプロモーターは、ｔｒｐプロモーターおよびｌａｃリプレッサーにより調節されるｌａｃオペロン配列の両方を含むハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃプロモーターである［Ａｍａｎｎら、（１９８３）Ｇｅｎｅ ２５：１６７；ｄｅ Ｂｏｅｒら、（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０：２１］。さらに、細菌プロモーターは、細菌ＲＮＡポリメラーゼを結合しそして転写を開始する能力を有する非細菌起源の天然に存在するプロモーターを含み得る。非細菌起源の天然に存在するプロモーターはまた、原核生物でいくつかの遺伝子の高レベルの発現を行うために、適合するＲＮＡポリメラーゼと結合され得る。バクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ／プロモーター系は、結合プロモーター系の例である［Ｓｔｕｄｉｅｒら、（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３；Ｔａｂｏｒら、（１９８５）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：１０７４］。さらに、ハイブリッドプロモーターはまた、バクテリオファージプロモーターおよびＥ．ｃｏｌｉオペロン領域（ＥＰＯ公開第２６７８５１号）を含み得る。
【０１１４】
機能するプロモーター配列に加えて、効率的なリボソーム結合部位はまた、原核生物における外来遺伝子の発現に有用である。Ｅ．ｃｏｌｉでは、リボソーム結合部位は、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列と呼ばれ、そして開始コドン（ＡＴＧ）および開始コドンの３〜１１ヌクレオチド上流に位置する長さが３〜９のヌクレオチドの配列を含む［Ｓｈｉｎｅら、（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５４：３４］。ＳＤ配列は、ＳＤ配列とＥ．ｃｏｌｉ １６Ｓ ｒＲＮＡの３’末端との間の塩基の対合により、ｍＲＮＡのリボソームへの結合を促進すると考えられている［Ｓｔｅｉｔｚら、（１９７９）「メッセンジャーＲＮＡにおける遺伝子シグナルおよびヌクレオチド配列」Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｒ．Ｆ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｒ編）］。弱いリボソーム結合部位を有する真核生物遺伝子および原核生物遺伝子を発現するためには［Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）「Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおけるクローニングされた遺伝子の発現」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ＤＮＡ分子は細胞内に発現され得る。プロモーター配列はまた、ＤＮＡ分子と直接結合し得、この場合、Ｎ末端の最初のアミノ酸は常にメチオニンであり得、メチオニンはＡＴＧ開始コドンによりコードされる。所望する場合、Ｎ末端のメチオニンは、臭化シアンとともにインビトロでインキュベーションすること、もしくは細菌メチオニンＮ末端ペプチダーゼとともにインビボまたはインビトロのいずれかでインキュベーションすることによりタンパク質から開裂され得る（ＥＰＯ公開第２１９２３７号）。
【０１１５】
融合タンパク質は、直接発現の代替物を提供する。典型的には、内因性細菌タンパク質のＮ末端部分または他の安定なタンパク質をコードするＤＮＡ配列を、異種コーディング配列の５’末端に融合する。発現の際に、この構築物は、２つのアミノ酸配列の融合を提供する。例えば、バクテリオファージラムダ細胞遺伝子が外来遺伝子の５’末端に連結され得、そしてバクテリア中で発現され得る。生じた融合タンパク質は、好ましくはプロセッシング酵素（Ｘａ因子）が外来遺伝子からバクテリオファージタンパク質を開裂するための部位を保持している［Ｎａｇａｉら、（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３０９：８１０］。融合タンパク質はまた、ｌａｃＺ［Ｊｉａら、（１９８７）Ｇｅｎｅ ６０：１９７］；ｔｒｐＥ［Ａｌｌｅｎら、（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：９３；Ｍａｋｏｆｆら、（１９８９）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３５：１１］およびＣｈｅｙ［ＥＰＯ公開第３２４ ６４７号］遺伝子由来の配列を用いて作成され得る。２つのアミノ酸配列の結合部分でのＤＮＡ配列は、開裂可能部位をコードし得るかまたはコードし得ない。他の例は、ユビキチン融合タンパク質である。このような融合タンパク質は、好ましくは、外来タンパク質からユビキチンを開裂するために、プロセッシング酵素（例えばユビキチン特異性プロセッシングプロテアーゼ）のための部位を保有しているユビキチン領域を用いて作成される。この方法により、天然の外来タンパク質を単離し得る［Ｍｉｌｌｅｒら、（１９８９）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：６９８］。
【０１１６】
あるいは、外来タンパク質はまた、細菌中で外来タンパク質の分泌を提供するシグナルペプチド配列のフラグメントからなる融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子を作成することにより細胞から分泌され得る［米国特許第４，３３６，３３６号］。このシグナル配列フラグメントは、典型的には細胞からタンパク質の分泌を指向する疎水性アミノ酸からなるシグナルペプチドをコードする。上記タンパク質は、成長培地中（グラム陽性細菌）、または細胞の内膜と外膜との間に存在する周辺腔（ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ｓｐａｃｅ）中（グラム陰性バクテリア）のいずれかに分泌される。 好ましくは、シグナルタンパク質フラグメントと外来遺伝子の間にコードされる、インビボ、またはインビトロで開裂され得るプロセッシング部位が存在する。
【０１１７】
適当なシグナル配列をコードするＤＮＡは、分泌される細菌タンパク質の遺伝子から由来し得る。例えばＥ．ｃｏｌ外膜タンパク遺伝子（ｏｍｐＡ）［Ｍａｓｕｉら、（１９８３）：Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；Ｇｈｒａｙｅｂら、（１９８４）ＥＭＢＯＪ．３：２４３７］およびＥ．ｃｏｌｉアルカリホスファターゼシグナル配列（ｐｈｏＡ）［Ｏｋａら、（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：７２１２］。別の例として、種々のＢａｃｉｌｕｓ株由来のα−アミラーゼ遺伝子のシグナル配列を用いて、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓから異種タンパク質を分泌し得る［Ｐａｌｖａら、（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：５５８２；ＥＰＯ公開 第２４４０４２号］。
【０１１８】
典型的には、細菌により認識される転写終結配列は、翻訳終止コドンの３’側に位置する調節領域であり、従って、プロモーターとともにコーディング配列に隣接する。これらの配列は、ＤＮＡによりコードされたポリペプチドに翻訳され得るｍＲＮＡの転写を指向する。転写終結配列は、転写の終結を助けるステムループ構造を形成し得る約５０ヌクレオチドのＤＮＡ配列を頻繁に含む。この例として、Ｅ．ｃｏｌｉのｔｒｐ遺伝子および他の生合成遺伝子のような、強力なプロモーターを有する遺伝子由来の転写終結配列が含まれる。
【０１１９】
典型的には、プロモーター、シグナル配列（所望であれば）、目的のコーディング配列、および転写終結配列を含む上記の構成成分は、発現構築物中に共に置かれる。発現構築物は、レプリコン、例えば、細菌のような宿主で安定的に維持され得る染色体外要素（例えば、プラスミド）にしばしば維持され得る。レプリコンは、複製系を有し、従って、発現のために、またはクローニングおよび増幅のいずれかのための原核生物宿主で維持され得る。さらに、レプリコンは、高コピー数または低コピー数のいずれかのプラスミドであり得る。高コピー数のプラスミドは、一般に、約５から約２００、そして典型的には、約１０から約１５０のコピー数の範囲を有する。高コピー数のプラスミドを含む宿主は、好ましくは、少なくとも約１０、およびさらに好ましくは少なくとも約２０のプラスミドを含む。高コピー数または低コピー数のベクターのいずれかを、宿主に対するベクターおよび外来タンパク質の影響に依存して選択し得る。
【０１２０】
あるいは、発現構築物は、組み込みベクターとともに細菌ゲノムに組み込まれ得る。組み込みベクターは、典型的には、ベクターの組み込みを可能にする、細菌染色体に相同な少なくとも１つの配列を含む。組み込みは、ベクター中の相同ＤＮＡと細菌染色体との間の組換えから生ずるようである。例えば、種々のＢａｃｉｌｌｕｓ株由来のＤＮＡを用いて構築された組み込みベクターは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ染色体に組み込まれる（ＥＰＯ公開第１２７３２８号）。組み込みベクターはまた、バクテリオファージまたはトランスポゾン配列を含み得る。
【０１２１】
典型的には、染色体外および組み込み発現構築物は、選択マーカーを含み得、形質転換された細菌株の選択を可能にする。選択マーカーは、細菌宿主で発現され得、そしてアンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン（ネオマイシン）、およびテトラサイクリンのような薬剤に対して細菌を耐性にする遺伝子を含み得る［Ｄａｖｉｓら、（１９７８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３２：４６９］。選択マーカーはまた、生合成遺伝子、例えば、ヒスチジン、トリプトファン、およびロイシン生合成経路の遺伝子を含み得る。
【０１２２】
あるいは、いくつかの上記の構成成分は、形質転換ベクターに一緒に置かれ得る。形質転換ベクターは、典型的には、上記のように、レプリコン中に維持されるか、または組み込みベクターに発展されるかのいずれかである選択マーカーを含む。
【０１２３】
発現および形質転換ベクター、染色体外レプリコンまたは組み込みベクターのいずれかは、多くの細菌への形質転換のために開発されている。例えば、発現ベクターは、特に以下の細菌のために開発されている：
【０１２４】
【表３】
細菌宿主へ外因性ＤＮＡを導入する方法は、当該分野で周知であり、そして典型的には、ＣａＣｌ２または他の試薬（例えば、２価のカチオンおよびＤＭＳＯ）のいずれかで処理した細菌の形質転換を含む。ＤＮＡはまた、エレクトロポレーションにより細菌細胞に導入され得る。形質転換手順は、通常、形質転換されるべき細菌種で変わる。以下の例を参照のこと、
【０１２５】
【表４】
（ｉｖ．酵母発現）
酵母発現系がまた当業者に公知である。酵母プロモーターは、酵母ＲＮＡポリメラーゼを結合し得、かつｍＲＮＡにコーディング配列（例えば、構造遺伝子）の下流（３’）転写を開始し得る任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常コーディング配列の５’末端に近接して位置する転写開始領域を有する。この転写開始領域は、典型的には、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位（「ＴＡＴＡ Ｂｏｘ」）および転写開始部位を含む。酵母プロモーターはまた、上流アクチベーター配列と呼ばれる第２ドメインを有し、存在する場合、それは、通常、構造遺伝子の遠方にある。ＵＡＳは、調節（誘導可能）発現を可能にする。構成的な発現はＵＡＳの非存在下で起こる。調節発現は、ポジティブまたはネガティブのいずれかであり得、それによって転写の促進または減少のいずれかであり得る。
【０１２６】
酵母は、活性な代謝経路を有する発酵生物であり、それゆえ代謝経路中の酵素をコードしている配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。この例としては、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）（ＥＰＯ公開第２８４０４４号）、エノラーゼ、グルコキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰまたはＧＡＰＤＨ）、ヘキソキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、およびピルビン酸キナーゼ（ＰｙＫ）（ＥＰＯ公開第３２９２０３号）が含まれる。酸性ホスファターゼをコードしている酵母ＰＨＯ５遺伝子はまた、有用なプロモーター配列を提供する［Ｍｙａｎｏｈａｒａら、（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：１］。
【０１２７】
さらに、天然には存在しない合成プロモーターがまた酵母プロモーターとして機能する。例えば、一つの酵母プロモーターのＵＳＡ配列が、他の酵母プロモーターの転写活性領域と結合され得、合成ハイブリッドプロモーターを生成する。このようなハイブリッドプロモーターの例は、ＧＡＰ転写活性化領域に連結したＡＤＨ調節配列を含む（米国特許第４，８７６，１９７号および米国特許第４，８８０，７３４号）。ハイブリッドプロモーターの他の例は、ＧＡＰまたはＰｙＫのような解糖系酵素遺伝子の転写活性化領域と組合せた、ＡＤＨ２、ＧＡＬ４、ＧＡＬ１０、またはＰＨＯ５遺伝子のいずれかの調節配列からなるプロモーターを含む（ＥＰＯ公開第１６４５５６号）。さらに、酵母プロモーターは、酵母ＲＮＡポリメラーゼに結合し、そして転写を開始する能力を有する非酵母起源の天然に存在するプロモーターを含み得る。このようなプロモーターの例は、特に以下を含む
【０１２８】
【表５】
ＤＮＡ分子は酵母細胞内で発現され得る。プロモーター配列は、ＤＮＡ分子と直接連結され得、この場合、組換えタンパク質のＮ末端の最初のアミノ酸は、常に、ＡＴＧ開始コドンによりコードされるメチオニンである。所望する場合、Ｎ末端のメチオニンを、インビトロで臭化シアンとともにインキュベートすることにより、このタンパク質から開裂し得る。
【０１２９】
融合タンパク質は、酵母発現系、ならびに哺乳動物、バキュロウイルス、および細菌発現系において代替物を提供する。典型的には、内因性酵母タンパク質または他の安定なタンパク質のＮ末端部分をコードしているＤＮＡ配列を、異種コーディング配列の５’末端に融合する。発現に際して、この構築物は、２つのアミノ酸配列の融合を提供し得る。例えば、酵母またはヒトスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）遺伝子は、外来遺伝子の５’末端で結合され得、そして酵母で発現され得た。２つのアミノ酸配列の結合部のＤＮＡ配列は、開裂可能部位をコードし得るか、またはコードし得ない。例えば、ＥＰＯ公開第１９６０５６号を参照のこと。他の例は、ユビキチン融合タンパク質である。このような融合タンパク質は、好ましくは、プロセッシング酵素（例えば、ユビキチン特異的プロセッシングプロテアーゼ）が、外来タンパク質からユビキチンを開裂するための部位を保持するユビキチン領域を用いて作成される。従って、この方法により、天然の外来タンパク質を単離し得る（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ８８／０２４０６６号参照）。
【０１３０】
あるいは、外来タンパク質はまた、酵母で外来遺伝子の分泌を提供するリーダー配列フラグメントを含む融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子を作成することにより細胞から成長培地中に分泌され得る。好ましくは、インビボまたはインビトロのいずれかで開裂され得る、リーダーフラグメントと外来遺伝子との間にコードされるプロセッシング部位がある。リーダー配列フラグメントは、典型的には、細胞からタンパク質の分泌を指向する疎水性アミノ酸を含むシグナルペプチドをコードする。
【０１３１】
適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、酵母インベルターゼ遺伝子（ＥＰＯ公開第０１２８７３号；日本公開第６２，０９６，０８６号）およびＡ因子遺伝子（米国特許第４，５８８，６８４号）のような分泌酵母タンパク質の遺伝子由来であり得る。あるいは、酵母における分泌もまた提供する非酵母起源のリーダー（例えば、インターフェロンリーダー）が存在する（ＥＰＯ公開第０６００５７号）。
【０１３２】
好ましいクラスの分泌リーダーは、酵母α因子遺伝子のフラグメントを使用しており、それは、「プレ」シグナル配列、および「プロ」領域の両方を含む。使用され得るα因子フラグメントのタイプは、完全長のプレ−プロα因子リーダー（約８３アミノ酸残基）および短縮型α因子リーダー（典型的には、約２５から約５０アミノ酸残基）（米国特許第４，５４６，０８３号および米国特許第４，８７０，００８号；ＥＰＯ公開第３２４２７４号）を含む。分泌を提供するα因子リーダーフラグメントを使用する別のリーダーは、第１の酵母のプレ配列を用いるが、第２の酵母α因子由来のプロ領域を用いて作成されるハイブリッドα因子リーダーを含む。例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ８９／０２４６３号参照のこと。
【０１３３】
典型的には、酵母により認識される転写終結配列は、翻訳終止コドンの３’に位置する調節領域であり、そしてそれ故プロモーターとともにコーディング配列に隣接する。これらの配列は、ＤＮＡによりコードされるポリペプチドに翻訳され得るｍＲＮＡの転写を指向する。転写ターミネーター配列および他の酵母認識終結配列の例は、解糖系酵素についてコードする終結配列である。
【０１３４】
典型的には、プロモーター、リーダー（所望する場合）、目的のコーディング配列、および転写終結配列を含む上記の構成成分は、発現構築物中に一緒に置かれる。発現構築物は、しばしば、レプリコン、例えば、酵母または細菌のような宿主で安定的に維持され得る染色体外要素（例えば、プラスミド）で維持される。レプリコンは、２つの複製系を有し、従って、例えば、発現するための酵母およびクローニングおよび増幅するための原核生物宿主で維持され得る。このような酵母−細菌シャトルベクターの例は、ＹＥｐ２４［Ｂｏｔｓｔｅｉｎら、（１９７９）Ｇｅｎｅ ８：１７−２４］；ｐＣｌ／ｌ［Ｂｒａｋｅら、（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８１：４６４２−４６４６］；およびＹＲｐ１７［Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら、（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５８：１５７］を含む。さらに、レプリコンは、高コピー数または低コピー数のいずれかのプラスミドであり得る。高コピー数のプラスミドは、一般に約５から約２００、および典型的には、約１０から約１５０のコピー数の範囲を有する。高コピー数のプラスミドを含む宿主は、好ましくは、少なくとも約１０、およびさらに好ましくは少なくとも約２０を有する。高コピー数または低コピー数のベクターは、ベクターの影響および宿主での外来タンパク質に依存して選択され得る。例えば、Ｂｒａｋｅら、同上を参照のこと。
【０１３５】
あるいは、発現構築物は、組み込みベクターによって酵母ゲノムに組み込まれ得る。組み込みベクターは、典型的には、ベクターを組み込み得る酵母染色体に相同な少なくとも１つの配列を含み、そして好ましくは、発現構築物に隣接する２つの相同な配列を含む。組み込みは、ベクターおよび酵母染色体における相同なＤＮＡの間での組換えにより生じるようである［Ｏｒｒ−Ｗｅａｖｅｒら、（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：２２８−２４５］。組み込みベクターは、ベクターに包埋するための適切な相同配列を選択することにより酵母の特異的な遺伝子座に指向され得る。 Ｏｒｒ−Ｗｅａｖｅｒら、同上を参照のこと。１またはそれ以上の発現構築物は、生産される組換えタンパク質のレベルができるだけ高くなるように組み込まれる［Ｒｉｎｅら、（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８０：６７５０］。ベクターに含まれる染色体配列は、完全なベクターの組み込みを生じるベクターの単一セグメントとして、または発現構築物のみからなる安定的な組み込みを生じ得る、染色体の近接したセグメントに相同で、かつベクターで発現構築物の両端に位置する２つのセグメントとしてのいずれかで存在し得る。
【０１３６】
典型的には、染色体外および組み込み発現構築物は、選択マーカーを含み得、形質転換された酵母株の選択を可能にする。選択マーカーは、酵母宿主で発現され得る生合成遺伝子、例えば、ＡＤＥ２、ＨＩＳ４、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、およびＡＬＧ７、ならびにＧ４１８耐性遺伝子（ツニカマイシンおよびＧ４１８に対する耐性をそれぞれ酵母細胞に供与する）。さらに、適切な選択マーカーはまた、金属のような毒性化合物の存在下で成長する能力を有する酵母を提供し得る。例えば、ＣＵＰ１の存在は、銅イオンの存在下で酵母を成長させ得る［Ｂｕｔｔら、（１９８７）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５１：３５１］。
【０１３７】
あるいは、いくつかの上記化合物は、形質転換ベクターに一緒に置かれ得る。形質転換ベクターは、典型的には、上記のように、レプリコンで維持されるか、または組み込みベクターへと展開されるかのいずれかである選択マーカーを含む。
【０１３８】
発現および形質転換ベクター、染色体外レプリコンまたは組み込みベクターのいずれかは、多くの酵母に形質転換するために発達した。例えば、発現ベクターは、上記のように以下の酵母のために発達した：
【０１３９】
【表６】
酵母宿主に外因性ＤＮＡを導入する方法は、当該分野で周知であり、そして典型的には、スフェロプラストまたはアルカリカチオンで処理したそのままの酵母細胞のいずれかの形質転換を含む。形質転換手順は、通常形質転換されるべき酵母種とともに変化する。以下の例を参照のこと、
【０１４０】
【表７Ａ】
【０１４１】
【表７Ｂ】
本発明において、選択マーカー、複製起点、および相同宿主細胞の配列が発現ベクターに含まれる。選択マーカーは、潜在的に発現ベクターを含む宿主細胞をスクリーニングするために使用し得る。このようなマーカーは、宿主細胞を、アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、ネオマイシンおよびテトラサイクリンのような薬剤に対して耐性にするマーカーを含む。また、マーカーは、宿主細胞の成長に必要なヒスチジン、トリプトファンおよびロイシン経路における生合成遺伝子のような生合成遺伝子を含む。従って、ｌｅｕ（−）宿主細胞を、発現ベクターによる形質転換におけるレシピエントとして使用し、そして例えばロイシンが培地に存在しない場合、ｌｅｕ（＋）遺伝子を伴うプラスミドを有する細胞のみが生存する。
【０１４２】
本発明において、複製起点は発現ベクターに取り込まれ、宿主細胞内で自己複製される。このような複製起点は、細胞内に適切なタンパク質の存在下で、発現ベクターが高いコピー数で再生産され得る複製起点、例えば酵母において有効な２μ配列および自己複製配列；およびＣＯＳ−７細胞において有効なウイルスＴ−抗原の複製起点を含む。
【０１４３】
本発明の目的のために、発現ベクターは、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、または細胞内で自律性を保持し得る。宿主ゲノムへの組み込みのために、本明細書の発現ベクターは、宿主細胞ゲノム内の配列に相同のポリヌクレオチド配列を含み得る。この相同配列は、発現ベクターに連結される必要はない。例えば、発現ベクターは、付随していないジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を介してＣＨＯゲノムに組み込み得る。酵母においては、相同配列は発現カセットに隣接することが好ましい。本発明に特に有用な相同酵母ゲノム配列は、ＰＣＴ ＷＯ９０／０１８００に開示された配列およびＧｅｎｂａｎｋ検索番号Ｊ０１３３１に記載のＨＩＳ４遺伝子配列である。
【０１４４】
発現ベクターのプロモーター、ターミネーターおよび他の随意エレメントの選択も、選択した宿主細胞に依存し、このことは当業者に既知である。本発明は、選択した宿主細胞には依存しない。簡便性および所望のタンパク質発現のレベルから、至適宿主細胞が指定される。発現のための種々の宿主は当該分野において既知であり、そしてＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）より入手可能である。
【０１４５】
例えば、ＫＧＦフラグメントまたはアナログを発現するための本明細書に適切な細菌宿主として、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓが挙げられる。以下の属由来の酵母宿主を利用し得る：Ｃａｎｄｉｄａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、ＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓおよびＹａｒｒｏｗｉａ。本明細書において宿主として使用され得る不死化哺乳動物細胞として、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（「ＢＨＫ」）細胞、サル腎臓細胞（「ＣＯＳ」）およびヒト肝細胞癌細胞、例えばＨｅｐ Ｇ２が挙げられる。また多くの昆虫細胞
宿主もＫＧＦフラグメントまたはアナログの発現に適切であって、ＰＣＴ ＷＯ ８９／０４６６９９；Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５６：１５３（１９８５）；Ｗｒｉｇｈｔ Ｎａｔｕｒｅ ３２１：７１８（１９８６）；Ｓｍｉｔｈら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６（１９８３）；および全般的にはＦｒａｓｅｒら、ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２５：２２５（１９８９）に記載の通り、Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒおよびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａが挙げられる。
【０１４６】
ＫＧＦフラグメントまたはアナログを含む発現ベクターは、宿主細胞に挿入される。発現ベクターを宿主細胞に挿入するためには、当該分野で既知の任意の形質転換技術を用い得る。例えば、細菌宿主の形質転換のために、典型的にまずＣａＣｌ２または他の試薬（２価カチオンおよびＤＭＳＯなど）のいずれかで細菌を処理し、そして外来性ＤＮＡを処理した細菌細胞に導入する。ＤＮＡは、エレクトロポレーションまたはウイルス感染によっても細菌細胞に導入し得る。本明細書で使用し得る細菌宿主に対する形質転換手順として、Ｍａｓｓｏｎら ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．６０：２７３（１９８９）；Ｐａｌｖａら Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：５５８２（１９８２）；欧州特許公開第０３６，２５９号および同第０６３，９５３号；ＰＣＴ ＷＯ ８４／０４５４１、Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、Ｍｉｌｌｅｒら Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：８５６（１９８８）；Ｗａｎｇら Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：９４９（１９９０）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、Ｃｏｈｅｎら Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６９：２１１０（１９７３）；Ｄｏｗｅｒら Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：６１２７（１９８８）；Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｈ．Ｗ．ＢｏｙｅｒおよびＳ．Ｎｉｃｏｓｉａ編）（１９７８）；Ｍａｎｄｅｌら Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５３：１５９（１９７０）のＫｕｓｈｎｅｒ「ＣｏｌＥ１由来プラスミドによるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ形質転換の改良法（Ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｗｉｔｈ ＣｏｌＥ１−ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｉｎ；Ｔａｋｅｔｏ Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ９４９：３１８（１９８８）；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ，Ｃｈａｓｓｙら ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．４４：１７３（１９８７）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ；Ｆｉｅｄｌｅｒら Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ １７０：３８（１９８８）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ；Ａｕｇｕｓｔｉｎら、 ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．６６：２０３（１９９０）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ，Ｂａｒａｎｙら Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４４：６９８（１９８０）；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｊ．ＦｅｒｒｅｔｔｉおよびＲ．Ｃｕｒｔｉｓｓ ＩＩＩ編）（１９８７）のＨａｒｌａｎｄｅｒ「エレクトロポレーションによるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓの形質転換（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）」；Ｐｅｒｒｙら Ｉｎｆｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．３２：１２９５（１９８１）；Ｐｏｗｅｌｌら Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５（１９８８）；Ｓｏｍｋｕｔｉら Ｐｒｏｃ．４ｔｈ Ｅｖｒ．Ｃｏｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １：４１２（１９８７）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ。
【０１４７】
酵母宿主に対する形質転換法は当該分野で周知であり、典型的にアルカリカチオンで処理したスフェロプラストまたはそのままの酵母細胞のいずれかの形質転換を含む。酵母宿主は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９４巻、１９９１、「酵母の遺伝学および分子生物学へのガイド（Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」に記載のエレクトロポレーションによ
っても形質転換し得る。本発明に対して、適用する形質転換手順は、形質転換しようとする酵母種により変化し、Ｋｕｒｔｚら Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：１４２（１９８６）；Ｋｕｎｚｅら Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１（１９８５）；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｇｌｅｅｓｏｎら Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３２：３４５９（１９８６）；Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐら Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０２：３０２（１９８６）；Ｈａｎｓｅｎｕｌａ；Ｄａｓら Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５８：１１６５（１９８４）；Ｄｅ Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４：１１６５（１９８３）；Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇら Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｇｙ ８：１３５（１９９０）；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ；Ｃｒｅｇｇら Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３３７６（１９８５）；Ｋｕｎｚｅら Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１（１９８５）；米国特許第４，８３７，１４８号および第４，９２９，５５５号；Ｐｉｃｈｉａ；Ｈｉｎｎｅｎら Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５；１９２９（１９７８）；Ｉｔｏら Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３（１９８３）Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ；ＢｅａｃｈおよびＮｕｒｓｅ
Ｎａｔｕｒｅ ３００：７０６（１９８１）；Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ；Ｄａｖｉｄｏｗら Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３９（１９８５）；Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎら Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：４９（１９８５）；Ｙａｒｒｏｗｉａ。
【０１４８】
異種ポリヌクレオチドを哺乳動物細胞に導入する方法は、当該分野において既知であり、そして例えばウイルス感染、デキストラン介在トランスフェクション、カルシウムリン酸沈殿、ポリブレン介在トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ポリヌクレオチドのリポソーム内のカプセル化（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ）、およびＤＮＡの核内へのダイレクトマイクロインジェクションが挙げられる。
【０１４９】
Ｓｍｉｔｈら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６（１９８３）；およびＬｕｃｋｌｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７：３１（１９８９）に記載の通り、発現ベクターを形成するためにバキュロウイルス属のウイルス内に異種ＤＮＡを導入する方法、および昆虫宿主細胞の形質転換の方法も当該分野において既知である。例えば、相同二重交差組換えにより、ＫＧＦフラグメントＤＮＡを多角体遺伝子に挿入し得る。Ｍｉｌｌｅｒら、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ ４：９１（１９８９）に記載の通り、所望のバキュロウイルス遺伝子中に設計された制限酵素部位にも挿入し得る。ＫＧＦフラグメントのＤＮＡ配列を、発現ベクター内の多角体遺伝子と換えてクローン化した場合、多角体特異配列の両５’および３’に隣接し、そして多角体プロモーターの下流に位置する。
【０１５０】
本発明の実施態様において、新たに形成されたバキュロウイルス発現ベクターは、次いで感染組換えバキュロウイルス内にパッケージされ得る。バキュロウイルス発現系においては、およそ１％からおよそ５％の間の低い頻度で相同組換えが起こる。従って、通常、トランスフェクション後に生産された大多数のウイルスは、まだ野生型のウイルスである。しかし、組換えウイルスは、既知の方法によって同定し得る。例えば、天然のウイルスは、ウイルス感染の後期の間、感染細胞の核内において、かなり高いレベルで多角体タンパク質を生産する。蓄積した多角体タンパク質は、埋包されたウイルス粒子も含む閉塞体を形成する。これらの閉塞体は、１５μｍまでのサイズで、屈折性が高いことから明るい光沢の外観で、光学顕微鏡下で容易に可視化される。組換えウイルスが感染した細胞は閉塞体を欠く。組換えウイルスおよび野生型ウイルスはプレートティングすることによって識別され得、トランスフェクション上清またはその希釈液は標準的技術によって昆虫細胞の単層上に存在する。次に「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」第２巻（Ａｕｓｕｂｅｌら編）の１６．８（補遺１０，１９９０）に記載の通り、閉塞体の存在（野生型ウイルスを示す）または非存在（組換えウイルスを示す）について、光学顕微鏡下でプラークをスクリーニングし得る。
【０１５１】
本明細書において形質転換された宿主細胞が所望のＫＧＦフラグメントを発現しているかどうかを調べるために、当該分野で既知のイムノアッセイおよび活性アッセイを利用し得る。例えば、細胞膜からＫＧＦフラグメントを分離することなく、形質転換された宿主細胞上で免疫蛍光アッセイを実施し得る。本アッセイにおいて、宿主細胞をまず、顕微鏡用スライドまたはマイクロタイターウエルのような固体支持体上に固定する。次に固定化した宿主細胞を抗ＫＧＦ抗体に暴する。好ましくはアッセイの感度を上昇させるために、固定化した細胞を、抗ＫＧＦ抗体に結合する標識された２次抗体に暴する。例えば、２次抗体は蛍光性のマーカーで標識し得る。ＫＧＦフラグメントを発現する宿主細胞を蛍光的に標識し、顕微鏡下で可視化し得る。
【実施例】
【０１５２】
（実施例１）
図１に示す通り、ｃＤＮＡをｐＡｃＣ１３Ｐｓｔ／Ｎｏｔ １発現ベクターにクローニングすることによって、ヒトＫＧＦ ｃＤＮＡをバキュロウイルス発現系に挿入した。Ｍｕｎｅｍｉｔｓｕら Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：５９７７−５９８２（１９９０）に記載の通り、このプラスミドはｐＡｃＣ１２に由来した。
【０１５３】
Ｆｉｎｃｈら Ｓｃｉｅｎｃｅ ２：７５２−７５５（１９８９）に記載の通り、入手可能なＫＧＦのＮ末端アミノ酸配列に基づく欠失した１８ｋｄ ＫＧＦについてＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。Ｌｕｃｋｏｗら Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９（１９８９）およびＱｕｉｌｌｉａｍら Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：２９０１０２９０８（１９９０）に記載の通り、ｐＶＬ９４１伝達ベクターの誘導体であるｐＡｃＣ１３発現ベクターへのサブクローニングを容易に行うために、隣接する制限部位（ＰｓｔＩおよびＮｏｔＩ）をプライマーに組み込ませた。この発現ベクターは、ｐＡｃＣ１３のＰｓｔＩ／ＮｏｔＩポリリンカー部位にＫＧＦをコードするフラグメントを挿入することによって構築された。ＫＧＦ ｃＤＮＡはＫＧＦのプロセシングされた成熟体をコードし、これは１６３個のアミノ酸残基からなり、１４〜１６番目の残基に潜在的なＮグリコシル化部位を伴った。
【０１５４】
（コンディション培地の調製）
Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９昆虫細胞）に、ＫＧＦ１−１６３に対するｃＤＮＡを含むバキュロウイルスのＡｕｔｏｇｒａｐｈａ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａを感染させた。希釈後、細胞を血清補充物、抗生物質、または殺菌剤非存在下のＥｘｃｅｌｌ−４００内で４８〜７２時間培養した。培養液を集め、そして１０，０００×ｇで３０分間遠心分離して浮遊細胞およびその他の細胞破砕物を除いた。次にコンディション培地を、０．８μフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濾過し、そしてこの培地の約５リットルを、３−ｋＤａの分子量カットオフ値を有するｆｉｌｔｒｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ ｓｙｓｔｅｍ（Ｏｍｅｇａ ｍｅｍｂｒａｎｅ）を用いて２００ｍｌに濃縮した。
【０１５５】
濃縮後、トランスフェクトしたＳｆ９細胞由来のコンディション培地を、１０，０００×ｇで２０分間の遠心分離によって集め、そして連続ヘパリンセファロース（「ＨＳ」）アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。本発明の一つの実施態様においては、約１リットルのＳｆ９細胞コンディション培地を、３−ｋＤａのカットオフ値を有するＯｍｅｇａ ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｆｉｌｔｒｏｎ）を用いて限外濾過し、２００ｍｌの限外濾過濃縮液を生産した。
【０１５６】
（ＨＳＡＣおよびＭｏｎｏ Ｓ陽イオン交換クロマトグラフィー）
上清をｐＨ７．２に調整した。３０ｍｌの試料を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．３、 １５０ｍＭ ＮａＣｌで平衡化したヘパリンセファロース樹脂に添加した。樹脂を、平衡化緩衝液で、吸光度がベースラインに戻るまで大量に洗浄し、そして次に０．
４５Ｍから１Ｍおよび２Ｍの上昇ＮａＣｌ濃度で段階的に溶出させた。細胞増殖アッセイに用いたフラクションからアリコートを分離し、そして最も高い生物活性を有する１Ｍ ＮａＣｌのフラクションをプールした。プールしたフラクションを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．２ で５倍に希釈し（最終塩濃度０．２Ｍ ＮａＣｌ）、そして同試料をＳｕｐｅｒ ｌｏｏｐで、ＦＰＬＣシステムに連結されたＭｏｎｏ Ｓカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に供した。直線勾配（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．３、０．２Ｍ ＮａＣｌ〜１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．３、１Ｍ ＮａＣｌ）により溶出を行った。分画後、アリコートを生物活性について試験し、活性フラクションをプールした。
【０１５７】
濃縮液をｐＨ７．３に調整し、そして約３０ｍｌのベット容量を含むＨＳカラムに添加した。カラムを、約２時間４℃で展開させた。カラムを、ｐＨ７．３で１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌおよび０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む１５０ｍｌの平衡化緩衝液で洗浄した。保持されたタンパク質を０．４５Ｍ ＮａＣｌおよび１Ｍ ＮａＣｌで溶出した。溶出中のカラムの流速を、約９０ｍｌ／時 に調整し、そして３ｍｌのサイズのフラクションを集めた。
【０１５８】
ＨＳアフィニティークロマトグラフィー工程の生物活性を有する１Ｍ ＮａＣｌフラクションをプールし、そして１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．３で５倍希釈し、そしてＭｏｎｏ Ｓ ＨＲ ５／５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に添加した。保持されたタンパク質を、０．２Ｍ ＮａＣｌから１Ｍ ＮａＣｌ勾配を用いて溶出した。活性フラクションのバイオアッセイを、Ｂａｌｂ−Ｍｋ細胞株を用いて測定した。Ｍｏｎｏ Ｓ 陽イオン交換クロマトグラフィーにより単離された生物活性タンパク質フラクションのＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を実施した。フラクション３７−３９およびフラクション４１−４２をプールし、そして１０μｌのアリコートをＳＤＳおよび１０ｍＭ ＤＴＴに添加した。これらの試料を加熱して変性させ、そして１２％のポリアクリルアミドゲル中で電気泳動を行い、続いて銀染色した。試料が還元状態中において展開された場合でも、または非還元状態中において展開された場合でも、同様の泳動パターンが観察された。２５Ｋｄはフラクション３７−３９に含まれるタンパク質の見かけの分子量で、そして１８ｋｄはフラクション４１−４２に含まれるタンパク質の見かけの分子量であった。
【０１５９】
ＨＳ生物活性フラクションのクロマトグラムは、フラクション３１〜４７にかけてのＢａｌｂ／Ｍｋ生物活性のプロフィールを示すが、これから、２種類の分子種の存在が明らかであり、一つは０．５５Ｍ ＮａＣｌで溶出し、そして他方は０．６Ｍ ＮａＣｌで溶出する。
【０１６０】
（ＫＧＦ活性の測定）
得られたフラクション中のＫＧＦ活性の存在を、ＢＡＬＢ／Ｃ−Ｍｋ細胞の成長を促進するフラクションの能力により評価した。この点に関して、任意のフラクションの１０μｌアリコートを１ｍｌのリン酸緩衝生理食塩液（「ＰＢＳ」）中０．２％ゼラチンに希釈し、そして１０μｌの希釈フラクションを、各々２２ｍｍウエルを含む１２−ウエルクラスタープレートに５×１０３細胞／ウエルで接種されたＢＡＬＢ／Ｃ−Ｍｋ細胞の成長刺激活性について試験した。全てのＫＧＦ活性がカラム内に保持されることが見出され、そして１Ｍ ＮａＣｌで溶出された。
【０１６１】
ＨＳカラムから１Ｍ ＮａＣｌで溶出されたＫＧＦの生物活性フラクションをさらに、陽イオン交換ＦＰＬＣカラムクロマトグラフィーによって精製した。これらのフラクションをプールし、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．３で５倍に希釈し、そしてＰｈａｒｍａｃｉａ製のＭｏｎｏ Ｓ ＨＲ ５／５カラムに直接添加した。
【０１６２】
Ｍｏｎｏ Ｓ ＨＲ ５／５カラムに保持されたタンパク質を、０．２Ｍ ＮａＣｌから１Ｍ ＮａＣｌの勾配で溶出させた。溶出したフラクションの生物活性を、ＢＡＬＢ／Ｃ−Ｍｋ細胞を用いて、上記の通りアッセイした。図３は、フラクション３１〜４７にわたる活性プロフィールを示す。
【０１６３】
マイトジェンアッセイにおいて、Ｂｏｈｌｅｎら ＥＭＢＯ ４：１９５１−１９５６（１９８５）、およびＧｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚら Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ １２７：１２１−１３６（１９８６）、およびＢｅｌｌｏｓｔａら Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２１：７０５−７１３（１９９３）に記載の通り、ウエル当たり１０４個のＡＢＡＥ細胞および５×１０３個のＡＣＥ細胞を、１０％仔牛血清および抗生物質を補充した１ｍｌのＤＭＥＭ中に密度５×１０３細胞／ウエルで、１２ウエルクラスタープレートに接種した。６時間のインキュベーション後、３重検体のウエルのセットをトリプシン処理し、そしてプレーティング効率を測定するために細胞をカウントした。次に適切な希釈の各試料の１０μｌアリコートを、０日目、２日目および４日目に３重検体としてシャーレ内のウエルに添加した。培養５日目後、プレートをトリプシン処理し、そしてコールターカウンター（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ）により細胞密度を測定した。
【０１６４】
０日目および１日おきに、表示した濃度で、ＫＧＦまたは塩基性ＦＧＦを添加した。培養５日後に、細胞をトリプシン処理し、そしてコールターカウンターを用いて最終的な細胞密度を測定した。
【０１６５】
（電気泳動（ＮａＤｏｄＳＯ４／ＰＡＧＥ））
Ｌａｅｍｍｌｉら Ｎａｔｕｒｅ ２２７：６８０−６８５（１９７０）に記載の手順に従い、ＮａＤｏｄＳＯ４によりポリアクリルアミドゲルを調製した。１０ｍＭ ＤＴＴ存在下で３分間試料を煮沸し、そして１２％ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動した。ゲルを固定し、そしてＢｉｏＲａｄの試薬およびプロトコールを用い、Ｍｅｒｒｉｌら Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１１：１４３７−１４３８に考察されている通りに銀染色を行った。適切な分子量マーカーは、Ｂｉｏｒａｄ製である。
【０１６６】
（細胞増殖アッセイ）
カラムフラクションおよび精製試料のマイトジェン活性を、標的細胞としてＢａｌｂ／Ｍｋ細胞を用いることによって測定した。ストック培養物を生育し、そしてＧｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚら Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１４２：３２５−３３３に記載の通り、１０％ＦＣＳ、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン、０．２５μｇ／ｍｌファンギゾン（ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ）、および１０ｎｇ／ｍｌ ａＦＧＦを補充した低カルシウム改変イーグル培地中に維持した。マイトジェンアッセイ用の細胞を、Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚらに記載の通り、１０％ＦＣＳを補充した１ｍｌの低カルシウムＭＥＭ中に５×１０３〜１×１０４細胞／ウエルの密度で１２ウエルクラスタープレートに接種した。培養５日後に、 Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚらに記載の通り、試料の添加および最終細胞密度の測定を行った。
【０１６７】
最終精製物質のマイトジェン活性を、Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚら Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７３：４１２０−４１２４（１９７６）に記載の通り、成獣ウシ動脈内皮細胞（「ＡＢＡＥ」）および副腎皮質由来毛細血管内皮細胞（「ＡＣＥ細胞」）上で試験した。ストック培養物を、１０％ＣＳ、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを補充したＤＭＥＭ存在下で維持し、そして０．２５μｇ／ｍｌのファンギゾンを、週１回、１：１０の分割比でゼラチン化組織培養シャーレ上を通過させた。
【０１６８】
当該分野で周知の標準的な方法論を用いて、以下の通り、ＫＧＦｄｃｓ１−２３のＮＨ２末端から１位〜２０位の明白なアミノ酸配列を確定した：
Ｓ１ Ｙ Ｄ Ｍ５ Ｅ Ｇ Ｇ Ｄ Ｉ Ｒ Ｖ Ｒ Ｒ Ｌ Ｆ Ｘ Ｒ Ｔ Ｑ
本発明はまた、ＫＧＦｄｃｓ１−２３をコードするＤＮＡセグメント、およびＦＧＦファミリーの他のメンバーに対してＫＧＦ１６３の非保存性ＮＨ２末端特性を欠くＫＧＦ由来のより短い他の形状を含む。
【０１６９】
（タンパク質マイクロシークエンシング）
ＫＧＦ１６３およびＫＧＦｄｃｓ１−２３の２つの名目上１００ｐｍｏｌの試料を、エドマン分解、および二フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｓｐｉｎ）への遠心吸着後のＡＡ分析により分析した。試料をＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４７７Ａ 気相タンパク質シークエネーターに添加した。標準的なソフトウエアおよびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ供給の化学試薬を用いて、２０回のエドマン分解を行い、そして自動化オンラインＨＰＬＣカラム（モデル１２０Ａ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によりＰＴＨアミノ酸の同定を行った。
【図面の簡単な説明】
【０１７０】
【図１】図１は、Ｎ末端で開始し、そして１６３アミノ酸残基およびアミノ酸残基１４−１６に単一のＮ結合グリコシル化シグナルを含む成熟完全長ヒトＫＧＦポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図２】図２は、１６３アミノ酸配列のＫＧＦが挿入されているｐＡｃＣ１３発現ベクターを示す。
【図３】図３は、ヘパリンセファロース（「ＨＳ」）カラムで１Ｍ ＮａＣｌを用いて溶出した後の培地で調整されたＳＦ９細胞由来の本発明のＫＧＦフラグメントのさらなる精製を示す。ＨＳカラム由来の生活性画分をプールし、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．３で５倍に希釈し、そしてＭｏｎｏ Ｓ ＨＲ５／５陽イオン交換ＦＰＬＣにかけた。
【図４】図４は、Ｂａｌｂ／Ｍｋ細胞株の細胞上で、長形態のＫＧＦ（すなわち、ｒＫＧＦ１６３）および短形態のＫＧＦ（すなわちＫＧＦｄｅｓ１−２３）対ａＦＧＦの生物学的活性を比較する。
【図５】図５は、大きな血管（Ａ：ＡＢＡＥ細胞）または毛細血管（Ｂ：ＡＣＥ細胞）由来の血管内皮細胞上で、長形態のＫＧＦ（すなわち、ｒＫＧＦ１６３）および短形態のＫＧＦ（すなわちＫＧＦｄｅｓ１−２３）対ｂＦＧＦの生物学的活性を比較する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式：
【化１】
の配列のアミノ酸２４−１６３の連続するアミノ酸配列からなるポリペプチドと、薬学的に受容可能な賦形剤とを含む、組成物。
【請求項２】
請求項１に記載されたポリペプチドのＮ末端においてメチオニンを有するポリペプチドを含む、組成物。
【請求項３】
以下の式：
【化２】
の配列のアミノ酸２４−１６３の連続するアミノ酸配列からなるポリペプチド、またはそのＮ末端にメチオニンを有する化１の配列のアミノ酸２４−１６３の連続するアミノ酸配列からなるポリペプチドを用いる工程を包含する、上皮細胞の増殖を刺激するための医薬の製造方法。
【請求項４】
以下の式：
【化３】
の配列のアミノ酸２４−１６３の連続するアミノ酸配列からなるポリペプチド、またはそのＮ末端にメチオニンを有する化１の配列のアミノ酸２４−１６３の連続するアミノ酸配列からなるポリペプチドを用いる工程を包含する、創傷治癒のための医薬の製造方法。
【請求項１】
以下の式：
【化１】
の配列のアミノ酸２４−１６３の連続するアミノ酸配列からなるポリペプチドと、薬学的に受容可能な賦形剤とを含む、組成物。
【請求項２】
請求項１に記載されたポリペプチドのＮ末端においてメチオニンを有するポリペプチドを含む、組成物。
【請求項３】
以下の式：
【化２】
の配列のアミノ酸２４−１６３の連続するアミノ酸配列からなるポリペプチド、またはそのＮ末端にメチオニンを有する化１の配列のアミノ酸２４−１６３の連続するアミノ酸配列からなるポリペプチドを用いる工程を包含する、上皮細胞の増殖を刺激するための医薬の製造方法。
【請求項４】
以下の式：
【化３】
の配列のアミノ酸２４−１６３の連続するアミノ酸配列からなるポリペプチド、またはそのＮ末端にメチオニンを有する化１の配列のアミノ酸２４−１６３の連続するアミノ酸配列からなるポリペプチドを用いる工程を包含する、創傷治癒のための医薬の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００９−６２３９６（Ｐ２００９−６２３９６Ａ）
【公開日】平成２１年３月２６日（２００９．３．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３０１６３０（Ｐ２００８−３０１６３０）
【出願日】平成２０年１１月２６日（２００８．１１．２６）
【分割の表示】特願２００５−３３３４３８（Ｐ２００５−３３３４３８）の分割
【原出願日】平成６年４月２８日（１９９４．４．２８）
【出願人】（５９１０７６８１１）ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド (265)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年３月２６日（２００９．３．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１１月２６日（２００８．１１．２６）
【分割の表示】特願２００５−３３３４３８（Ｐ２００５−３３３４３８）の分割
【原出願日】平成６年４月２８日（１９９４．４．２８）
【出願人】（５９１０７６８１１）ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド (265)
【Ｆターム（参考）】
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