説明

増大した活性および細胞膜親和性を有する修飾抗ウイルス性ペプチド

国際公開第95/07929号、国際公開第98/29443号および国際公開第03/95479号から知られるものを含めた所定の抗ウイルス性多分枝ペプチド構築物の活性および細胞膜親和性は、そのペプチドのC末端に、(a)4から10個までの炭素原子と、0から2個までの炭素−炭素二重結合を有するω−アミノ脂肪酸か、または(b)ペプチド性細胞膜貫通剤のいずれかであるターミネーターを結合させることによって改善されうる。改善は、とても目立っているので、いくつかの場合には、分枝の数は、しばしば単独分枝まで減少され得て、および/またはその分枝は縮められうる。好ましいω−アミノ脂肪酸は、γ−アミノ酪酸、δ−アミノ吉草酸およびε−アミノカプロン酸である。ペプチド性細胞膜貫通剤は、好ましくは、TAT由来のペプチド、ペネトラチン(登録商標)またはKパムである。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、細胞膜相互作用および/または細胞膜貫通が可能な構造の当初の抗ウイルス性分子に対する電子対を共有する接ぎ木(グラフト)により、抗ウイルス性活性、特に抗−HIV活性が増大した化合物に関する。
【背景技術】
【0002】
多分枝ペプチド構築物(Multiple branch peptide constructions;MBPC)は、小型ペプチドが結合したコア・マトリックスを包含する。コア・マトリックスは、自然状態において枝分かれした樹枝状重合体であり、その分枝は各々同一である方が好ましい。他のコア分子も可能であるが、好ましいコア分子は、リシンである。コア・マトリックスは、しばしばMBPCの「根」と呼ばれる中央のリシン残基から構築され得る。その中央のリシン残基には二つのリシン残基が結合しており、これらのリシン残基はそれぞれ、そのカルボキシル基を通じて、中央のリシン残基の異なるアミノ基にそれぞれ結合される。その結果、4つのアミノ基を有する分子が提供され、その分子は、4つのペプチドを有するMBPCに用いられるコア・マトリックスになりうる。あるいは、さらに4つのリシン残基を、そのカルボキシ残基を通じて上述の4つの異なるアミノ基にそれぞれ結合することによって、8つの分枝を有する分枝を有する分枝を提供することができる。この分子は、8つのペプチドを有するMBPCに用いられるコア・マトリックスとして役割を果たしうるか、あるいは、上記手段で8個のリシン残基を受け取って、16個のペプチドを有するMBPCに用いられるコア・マトリックスを形成しうる。ペプチドのC末端は、コア・マトリックスの各分枝に共有結合してMBPCを形成しうる。これらのペプチドは、好ましくは同じペプチドであるが、互いに異なっていてもよい。得られる分子は、表面にペプチドのクラスターを有し、内側にコア・マトリックスを有している。内側のコア・マトリックスは提示されていないので抗原性を示さない。
【0003】
所望により、ペプチドとコア・マトリックスとの間に、スペーサーを入れてもよい。第一リシン残基のカルボキシル基は、そのままにしておくか、アミド化するか、またはβ−アラニン(β−アミノプロピオン酸)等の遮断化合物にカップリングさせてもよい。ペプチドは、D−またはL−アミノ酸残基を含んでいてもよい。D−アミノ酸類は、ペプチダーゼによって切断されにくいので、生体内でより長時間存在することができる。一方、L−アミノ酸類はより優れた活性を示す。さらに、ペプチド類似体、即ちペプチドの炭素骨格を用いるが、ペプチド結合−CONH−を省いた合成構築物を、ペプチドの代わりに用いることができる。したがって、本願において、ペプチドは、ペプチド類似体を含むものと解すべきである。ペプチド類似体は、ペプチダーゼに対して一層耐性があり、生体内でより長期間存在しうると考えられる。ペプチドの長さが長すぎる場合には、MBPCは抗原性になる。したがって、各ペプチドにおいては、アミノ酸残基が10個以下であることが好ましく、9個以下であることがより好ましい。
【0004】
HIV感染の治療において用いられるMBPCは、ジェイ エム サバティエ(J−M.Sabatier)らが国際公開第95/07929号に初めて記述した。そこに記述されたMBPCは、0〜4個のアミノ酸残基が先行し、2〜4個のアミノ酸残基が続いた配列GPGR(HIVの表面エンベロープ糖タンパク質gp120のV3ループ由来)を含有するペプチドを有している。アミノ酸配列IGPGRとIXXGPGR(ここでXは、アミノ酸残基である)は、排除される。これらのMBPCのうち最も好ましいものは、ペプチドGPGRAFが8個結合したリシン残基のコアを有するものである。そのMBPCは、(GPGRAF)8−K4−K2−K−βA−OHで表され、そのOH末端は、β−アラニンのカルボキシル基を示す。そのカルボキシル基を修飾して、カルボキサミド末端を形成することもできる。この化合物は、ここではSPC3と称する。
【0005】
国際公開第98/29443号において、ジェイ エム サバティエ(J−M.Sabatier)らは、HIV感染の治療に有効でありうる別のMBPCを記述した。これらは、HIVエンベロープの膜貫通糖タンパク質gp41由来のペプチドを利用している。そのペプチドは、0〜4個のアミノ酸残基が先行し、2〜4個のアミノ酸残基が後に続く配列RQGYを含有する。これらのMBPCの中で最も好ましいものは、ペプチドRQGYSPLが8個結合したリシン残基のコアを有する。そのMBPCは、(RQGYSPL)8−K4−K2−K−βA−OHで表され、そのOH末端は、β−アラニンのカルボキシル基を示す。そのカルボキシル基を修飾して、カルボキサミド末端を形成することもできる。この化合物は、過去に、SPC RLと、およびRL41と称されていたが、ここではRLとして称する。
【0006】
国際公開第98/29443号以降、MBPC(RQGYSPL)2−K−βA(以降、RL二量体という)は効果があるが、MBPC(RQGYSP)2−K−βAは、効果が低いことが立証された。このことから、MBPCのペプチド分枝においては、6アミノ酸という下限値が確認された考えられた。しかし、ケイ マブロウ(K.Mabrouk)らは、国際公開第03/095479号において、いくつかのより短いペプチド、特に(RQGYS)2−K−βA−OH(以降、RSという。しかし過去には、短RLとも称されていた)及び(RQGY)8−K4−K2−K−βA−OHが利用できることを示した。
【0007】
SPC3およびRLは両方とも、8つの分枝を有し、八量体であるとされている。RSは、2つの分枝を有し、二量体であるされている。モノマー、即ち、線状のペプチドGPGRAF、RQGYSPL、及びRQGYSは、いずれもなんら活性を示さなかった。
【0008】
SPC3及びRLのような抗HIV剤は、細胞膜レセプターと直接相互作用することを通じて、レトロウイルスの感染の融合段階を遮断することが示された。エンフュヴィルタイドおよびT−1249(トリメリス・インク(Trimeris Inc))のような他の融合阻害剤は、ウイルスエンベロープの糖タンパク質と直接的に相互作用する。後者の活性は、このような糖たんぱく質の構造に依存するため、ウイルス株に依存する。結局のところ、ウイルスの糖たんぱく質を直接的に阻害する分子は、耐性株を選出するという結果に至るだろう。これに対し、細胞膜レセプターを遮断できる分子は、全ての株が同様に阻害されるので、当然ウイルスの選出という結果には至らないであろう。
【0009】
細胞レセプター遮断型のHIV阻害剤は、このようなレセプター(例えば、CxCR4またはCCR5)の表面だけでなく、上述のレセプターの細胞膜内構成要素にも、さらには細胞膜直下の領域や事象にさえ相互作用する可能性がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
例えば、水溶性に優れたペプチドであるSPC3は、インビトロで、末梢血リンパ球(PBL)及びマクロファージだけでなく、C8166培養細胞においても抗HIV活性を示す。ビー ド ルージュ(B de Rouge)は、国際公開第99/34777号において、SPC3とある特定のリポソームとを結びつけたときに、おそらく細胞膜との相互作用がよくなるため、この活性が、5〜50倍に増大することを示した。しかしながら、SPC3は、56個のアミノ酸残基からなる重合化ペプチドである。それのリポソームとの結合は困難であり、そして収率は完全ではないため、技術的なリスクだけでなく、コストの増大を引起す。したがって、SPC3のような分子の有効性を改善する他の手法が求められていた。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明は、配列GPGおよびRQGYの内の1つを含む水溶性の抗ウイルス性ペプチドと、そのペプチドのC末端に結合したターミネーターとを含有しており、該ターミネーターは、(a)4〜10個の炭素原子と0〜2個の炭素−炭素間の二重結合とを有するω−アミノ脂肪酸又は(b)ペプチド性細胞膜貫通剤のいずれかである化合物を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【0012】
上記抗ウイルス性ペプチドは、リシン・コア・マトリックスを有するMBPCであってもよい。このような場合には、ターミネーターは、根のリシン残基に結合される。上述のMBPC、すなわち、GPGRAFの8個の分枝を有するSPC3、RQGYSPLの8個の分枝を有するRL、およびRQGYSの2個の分枝を有するRSが使用されうる。しかしながら、抗ウイルス性ペプチドのC末端に対するターミネーターの結合によって奏される改善は非常に大きいので、SPC3およびRLは、2個の分枝(それぞれ、SPC3二量体およびRL二量体)に、または1個の分枝(それぞれ、SPC3単量体およびRL単量体)にさえ減少されうる。その一方で、RSも、1個の分枝(RS単量体)に減少されうる。さらなる研究によれば、SPC3単量体(GPGRAF)は、GRGRA、GPGRまたはGPCに縮められうることが示された。これらは、非常に小型の分子であるため、作るのがいっそう容易でそして安く、そしてその理由のため好まれる。
【0013】
ω−アミノ脂肪酸は、飽和されていることが好ましい。炭素数が10個より長い鎖は、その効果がほとんど得られないので不必要であり、そしてより長鎖は、脂質度が高すぎる可能性がある。好ましい長さは、炭素数4〜8個、そしてさらに好ましくは、炭素数4〜6個である。最も好ましいω−アミノ脂肪酸は、γ−アミノ酪酸、δ−アミノ吉草酸およびε−アミノカプロン酸である。
【0014】
他のペプチドも適切でありうるが、ペプチド性細胞膜貫通剤は、適切にはTAT−由来のペプチド、ペネトラチン(登録商標)またはKパムである。
【実施例】
【0015】
(実験)
我々は、最初に、コア・リシン残基上に、長さを4から8個の炭素まで増大した飽和脂肪酸鎖のグラフトを有するSPC3八量体、およびリシン残基上に3個の異なるペプチド鎖、即ちTAT由来のペプチド、ペネトラチンおよびKパム・ペプチド(全て膜貫通および架橋を増強すると報告されている)を有するSPC3八量体を合成した。我々は、NL4−3HIV株に感染したC8166細胞について、その後同じ株に感染したPBLについて、上記分子をテストした。結果を表1および2に示す。
【0016】
陽性の結果が観察されると、費用抑制の観点で、水溶性ペプチド上の膜親和性鎖のグラフトが、その効力(SPC3、RLおよびそれらの誘導体は、小型ペプチドの重合体、しばしば八量体である;単量体は、不活性であることが示された)を失うことなくそれらのサイズを減少させうるかどうかを試験するための更なる試みがなされた。この目的を達成するために、我々は、好ましいグラフト化配列をつけて、SPC3、RLおよびRSの配列の単量体および二量体を合成し、そしてそれらを、C8166、PBLおよびPBMCについて試験した。結果は、表3〜5に示す。
【0017】
我々は、GPGRAF、特にGRGRA、GPGRおよびGPGであるSPC3単量体に関連する短ペプチドも合成し、そしてδ−アミノ吉草酸ターミネーターがついたこれらを試験した。これらを、HIV−1 NL4−3に対するC8166細胞(結果は、表6および7に示される)について、そしてHIV−1 NDKに対するC8166細胞(結果は、表8で示される)について、8日ごとに、2回試験した。
【0018】
行われた実験は今までのところインビトロであるが、本発明でなされた改良は、インビボのリンパ系で、化合物のより優れた有用性につながるであろうことが予想される。
【0019】
(試験方法)
(細胞およびウイルス)
HIV−1 NL4−3単離物(アダチ(Adachi)他、1986年;バーレ・シノウシ(Barre−Sinoussi)他、1983年)および高細胞変性のザイールのHIV−1 NDK単離物(エルロッド(Ellrodt)他、1984年)を、許容性CEM細胞(ナラ(Nara)他、1987年)で増殖させた。未感染CEMおよびC8166(サラフディン(Salahuddin)他、1983年)は、ウルトラグルタミン(カンブレックス(cambrex)、ベルビエ(Vervier)、ベルギー国)、ペニシリン(100U/ml)、ストレプトマイシン(100μg/ml)、および10%熱不活化ウシ胎仔血清(カムブレックス(cambrex))を含むRPMI1640(R10)中で維持した。
【0020】
HIV−1陰性のドナーから得られた末梢血リンパ球を、先に記述されるとおりに培養し、ウルトラグルタミン、IL2(20μg/ml)、ペニシリン(100U/ml)、ストレプトマイシン(100μg/ml)、および10%加熱不活化ウシ胎仔血清を添加したRPMI1640中で維持した。細胞を、フィトヘマグルチニン(20U/ml PHA P、ジフコ(P,DIFCO)、ミズーリー州デトロイト)が添加された培養液中で3日間刺激した。
【0021】
(C8166細胞のHIV−1感染)
3×10/100μLのC8166細胞のサンプルを、96穴マイクロタイタープレート内で、種々の濃度のペプチドを含有する培養液中で前(予備)培養した。37℃で1時間処理後、HIV−1の希釈ウイルス溶液100μlを添加した。細胞を、37℃で1時間、ml当たり1000TCID50という感染の多重度でウイルスにさらした。その細胞を、3回洗浄し、37℃で、24穴プレート内でR10培養液中にて3×105/μlで培養した。C8166培養液は、感染後4日目に交換した。その処理は、ウイルス吸収の前も、ウイルス吸収の間も、そして感染の後も永続した。C8166細胞についてのアッセイは、少なくとも2回、そして二重で行われた。毒性の評価を、毎日の細胞計数およびトリパンブルー排除アッセイによって行った。HIV−1でのC8166T細胞の感染を、ウイルス誘導細胞変性効果(シンシチウム形成)によって、そして、培養上清中における、細胞不含のp24ウイルスタンパク質の定量によって評価した。培養上清中のHIV−1のp24gag濃度の測定は、ELISA(アライアンス(ALLIANCE(登録商標)、HIV−1p24キット、パーキン・エルマー(Perkin Elmer)、ライフサイエンシズ、米国(life sciences, USA))によって行った。
【0022】
(ヒト末梢血リンパ球(PBL)の感染)
10/100μLのPBL細胞のサンプルを、96穴マイクロタイタープレート内で、種々の濃度のペプチドを含有する培養液中で前(予備)培養した。37℃で1時間処理後、HIV−1の希釈ウイルス溶液100μlを添加した。細胞を、37℃で、1時間、ml当たり1000TCID50という感染の多重度でウイルスにさらした。その細胞を、3回洗浄し、そして、37℃、5%CO2で、24穴プレート内で、ペプチドを含んだ培養液中にて1106/mlで培養した。その処理は、ウイルス吸収の前も、ウイルス吸収の間も、そして感染の後も永続した。PBL培養液は、常にペプチドの存在下で、3週間の間3−4日毎に交換した。細胞計数およびトリパンブルー排除アッセイによって、細胞生存性を評価した。先述のとおり、培養上清中のウイルス産出を、p24ELISA試験によって定量した。実験は全て、盲検試験で行われた。試験は、二重で行われた。
【0023】
(結果)

【0024】

【0025】

【0026】

【0027】

【0028】
試験に用いられた全ての類似物(アナログ)は全て、SPC3と比較して増大した活性(5〜150倍の間)を示した。

類似の結果が、PBLで得られた:


最も優れた作用物質は、S5およびS6、即ちそれぞれSPC3−(δ−アミノ吉草酸)およびSPC3−(γ−アミノ酪酸)であり、最大10μMまでの投与量で、0.1から0.01μMのIC50で、そして細胞に毒性なしであった。
【0029】

【0030】
上の表は、ペプチドRLとSPC3の単量体への吉草酸のグラフトが、C8166細胞に対するそれらの活性を増大させることを示す。SPC3の場合には、活性は、当初の重合化ペプチドのものより大きくなった。
【0031】

【0032】
結果は、当初のペプチドの単量体または二量体が、その八量体のものに匹敵する活性を有することを示す。正常なSPC3が2μm、SPC3吉草酸が0.5μMであるのに対して、SPC3単量体吉草酸は、0.1μMのIC100を示す。これは、SPC3が、56個のアミノ酸残基を含むのに対して、単量体は、わずか6個のみを含有するので重要である。
【0033】

【0034】

【0035】

【0036】

【0037】

【0038】

【0039】

【0040】

【0041】

【0042】

【0043】


【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列GPGおよびRQGYの内の1つを含む水溶性抗ウイルス性ペプチドと、そのペプチドのC末端に結合したターミネーターとを含有しており、該ターミネーターは、(a)4〜10個の炭素原子と0〜2個の炭素−炭素間の二重結合とを有するω−アミノ脂肪酸又は(b)ペプチド性細胞膜貫通剤のいずれかである化合物。
【請求項2】
上記ペプチドは、多分枝ペプチド構築物(MBPC)であり、その各分枝は、ペプチド配列GPGを含有し、そしてそのコアは、リシン残基から形成され、そして上記ターミネーターは、その基礎となるリシン残基に結合されている請求項1に記載の化合物。
【請求項3】
上記MBPCの各分枝は、ペプチドGPGRAFである請求項2に記載の化合物。
【請求項4】
上記ペプチドは、上記多分枝ペプチド構築物(MBPC)であり、その各分枝は、ペプチド配列RQGYを含有し、そしてそのコアは、リシン残基から形成され、そして上記ターミネーターは、その基礎となるリシン残基に結合されている請求項1に記載の化合物。
【請求項5】
上記MBPCの各分枝は、ペプチドRQGYSPLである請求項4に記載の化合物。
【請求項6】
上記MBPCの各分枝は、ペプチドRQGYSである請求項4に記載の化合物。
【請求項7】
上記MBPCは、2つの分枝を有する請求項3、請求項5または請求項6に記載の化合物。
【請求項8】
上記MBPCは、8つの分枝を有する請求項3、請求項5または請求項6に記載の化合物。
【請求項9】
上記ペプチドは、GPG、GPGR、GPGRAまたはGPGRAFである請求項1に記載の化合物。
【請求項10】
上記ペプチドは、RQGYSまたはRQGYSPLである請求項1に記載の化合物。
【請求項11】
上記ターミネーターは、4〜8個の炭素原子を有するω−アミノ飽和脂肪酸である前述のいずれかの請求項に記載の化合物。
【請求項12】
上記ターミネーターは、4〜6個の炭素原子を有するω−アミノ飽和脂肪酸である前述のいずれかの請求項に記載の化合物。
【請求項13】
上記ターミネーターは、γ−アミノ酪酸、δ−アミノ吉草酸またはε−アミノカプロン酸である前述のいずれかの請求項に記載の化合物。
【請求項14】
上記ターミネーターは、TAT−由来ペプチド、ペネトラチン(登録商標)またはKパムである請求項1〜10のいずれか1項に記載の化合物。

【公表番号】特表2007−531705(P2007−531705A)
【公表日】平成19年11月8日(2007.11.8)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2006−529908(P2006−529908)
【出願日】平成16年5月20日(2004.5.20)
【国際出願番号】PCT/EP2004/005563
【国際公開番号】WO2004/104031
【国際公開日】平成16年12月2日(2004.12.2)
【出願人】(505428916)セルペップ ソシエテ アノニム (3)
【氏名又は名称原語表記】CELLPEP S. A.
【住所又は居所原語表記】16,Rue de la Banque, F−75002 Paris (FR)
【Fターム(参考)】