増幅ターゲッティングによるモルホリノイメージングおよび治療
本発明は、病的状態にある哺乳動物において診断薬または治療薬を標的部位にターゲッティングするためのキットおよび方法を提供する。該キットは、個別容器に入った、（Ａ）標的部位の主要な標的特異的な結合部位、または標的部位により生成される物質もしくは標的部位と関連する物質と選択的に結合するターゲッティング部分と、モルホリノオリゴマーとを含んでなる第一の複合体、（Ｂ）所望により、クリアリング剤、（Ｃ）ポリマーと結合した相補的モルホリノオリゴマーの複数のコピーと診断薬または治療薬とを含んでなる第二の複合体、および（Ｄ）モルホリノオリゴマーと放射性同位元素とを含んでなる第三の複合体を含んでなる。前記方法は、哺乳動物に（Ａ）、所望により（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）を投与することを含む。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物において診断薬または治療薬を標的部位にターゲッティングするためのキット、ならびにポリマーと結合した一本鎖モルホリノオリゴマー相補対の複数のコピーを用いて病的状態を診断または治療するための方法に関する。
【発明の背景】
【０００２】
薬物標的研究の目的は、治療薬を標的とされる腫瘍部位に直接送達し、これらの部位においてより効果的な投薬を可能にし、それによって、非腫瘍関連副作用を低減して、それら治療薬の有効性を向上させることである。もう１つの目的は、標的部位での治療薬の完全な集積を実現し、それによって、標的／非標的比を高めることである。
【０００３】
選択的に局在させるためにターゲッティング部分と結合した診断薬または治療薬を含んでなる異なるターゲッティングベクターは以前から知られている。ターゲッティングベクターの例としては、抗体または抗体フラグメント、細胞特異的または組織特異的ペプチド、ホルモンおよび他の受容体結合分子のようなターゲッティング部分の診断薬または治療薬との複合体が挙げられる。例えば、罹患細胞および正常細胞と関連し、病原微生物とも関連する異なる決定因子に対する抗体が病態または病変の検出および治療に使用されている。これらの方法では、例えば、それらの全ての開示内容が引用することにより本明細書の一部とされる、Hansen et al., 米国特許第３，９２７，１９３号ならびにGoldenberg、米国特許第４，３３１，６４７号、同第４，３４８，３７６号、同第４，３６１，５４４号、同第４，４６８，４５７号、同第４，４４４，７４４号、同第４，４６０，４５９号、同第４，４６０，５６１号、同第４，６２４，８４６号および同第４，８１８，７０９号に記載のように、ターゲッティング抗体を好適な検出薬または治療薬と直接結合する。
【０００４】
直接ターゲッティング法において遭遇する問題の１つは、標的部位と実際に結合するのは比較的ごく一部の複合体であって、複合体の大部分が循環に留まり、標的化した複合体の機能を何らかの形で抑制していることである。他の問題としては、診断薬を投与した場合の高バックグラウンドおよび低解像度、ならびに治療薬を長時間循環する標的化部分と結合した場合の骨髄毒性または全身性副作用が挙げられる。
【０００５】
プレターゲッティング法は、検出薬または治療薬の標的：バックグラウンド比を高めることを目的に開発された。プレターゲッティングおよびビオチン／アビジンアプローチの例は、例えば、それらの全てが全開示内容が引用することにより本明細書の一部とされる、Goodwin et al., 米国特許第４，８６３，７１３号；Goodwin et al., J. Nucl. Med. 29: 226 (1988)；Hnatowich et al., J. Nucl. Med. 28: 1294 (1987)；0ehr et al., J. Nucl. Med. 29: 728 (1988)；Klibanov et al., J. Nucl. Med. 29: 1951 (1988)；Sinitsyn et al., J. Nucl. Med. 30: 66 (1989)；Kalofonos et al., J. Nucl. Med. 31 : 1791 (1990)；Schechter et al., Int. J. Cancer. 48: 167 (1991)；Paganelli et al., Cancer Res. 51: 5960 (1991)；Paganelli et al., Nucl. Med. Commun. 12: 211 (1991)；Stickney et al., Cancer Res. 51: 6650 (1991)；およびYuan et al., Cancer Res. 51: 3119 (1991)に記載されている。
【０００６】
プレターゲッティング法では、標的とする部位と結合する第一のターゲッティング部分と、続いて投与される第二の標的化種の結合に利用可能な結合部位とを含んでなる第一の標的化種（診断薬または治療薬と結合していない）がin vivo標的部位に向けられる。第一の標的化種が一度十分に集積したら、診断薬または治療薬と、第一の標的化種の利用可能な結合部位を認識する第二のターゲッティング部分とを含んでなる第二の標的化種を投与する。
【０００７】
プレターゲッティング方法論の実例が細胞傷害性放射性抗体を腫瘍に投与するためのビオチン−（ストレプト）アビジン系の使用である。第一の工程では、腫瘍関連抗原に対して向けられたモノクローナル抗体をアビジン（またはビオチン）と結合し、それを抗体により認識される腫瘍を有する患者に投与する。第二の工程では、その結合されたビオチン（またはアビジン）を介して、治療薬が腫瘍をプレターゲッティングした抗体−アビジン（または−ビオチン）複合体に取り込まれる。
【０００８】
しかしながら、プレターゲッティング時のビオチン−アビジンまたは（ストレプト）アビジン系の適用において問題が生じている。まず第一に、適切に構築されない限り、放射性標識ビオチンは血漿ビオチニダーゼ分解に付される。さらに、抗体と結合する場合には、ストレプト／アビジンおよびアビジンにより患者において抗ストレプト／アビジン抗体が生じる可能性がある。最後に、in vivoプレターゲッティング時の内因性ビオチンの潜在的影響によりビオチンの飽和を理由にビオチン結合発現の消失が起こる可能性がある。例えば、ヌードマウス異種移殖片に局在するあるストレプト／アビジン結合抗体がビオチン飽和状態になったときにこれが起こる。Rusckowski et al., Cancer 80: 2699-705 (1997)。ビオチン化モノクローナル抗体、アビジン、続いて、放射性標識ビオチンの投与を行う３段階戦略はこれらの欠点をある程度緩和するものであるが、この手法は画像法としては手間がかかると考えられており、さらに、この手法では免疫原性の問題が解決されない。
【０００９】
認識されているプレターゲッティング法のもう１つの例が、（ストレプト）アビジンとビオチンの代わりに放射性標識ハプテンと二重特異性抗体を使用する二重特異性抗体−ハプテン認識系の利用である。Barbet, J. et al. Cancer Biother. Radiopharm. 14: 153-166 (1999)；Karacay, H. et al., Bioconj. Chem. 11: 842-854 (2000)；Gautherot, E. et al., J Nucl. Med. 41: 480-487 (2000)；Lubic, S. P. et al., J. Nucl. Med. 42: 670-678 (2001)；Gestin, J. F. et al., J. Nucl. Med. 42: 146-153 (2001)。ハプテンは配位錯体であることが多く、例えば、インジウム−ＤＴＰＡがある。二重特異性抗体は、２種類の抗体または抗体フラグメントが独立した決定因子、ハプテンと癌胎児性抗原のような腫瘍マーカーと結合する産物である。このアプローチでは、二重特異性抗体を作製する必要性に加え、親和性が低いことが障害となっている。そのハプテン、特に一価のものに対する抗体の親和性は、ビオチンに対する（ストレプト）アビジンの親和性よりも桁違いに低い。数学モデリングでは、抗体とそのハプテンとの高親和性がプレターゲッティングを成功させる重要な決定因子であるということが示されている。Zhu, H. et al., J. Nucl Med. 39: 65-76 (1998)。
【００１０】
プレターゲッティング用のビオチン−アビジンおよび二重特異性抗体−ハプテン系に代わるものとして、ペプチド核酸（ＰＮＡ）のような一本鎖オリゴマーが使用されてきた。一本鎖オリゴマーはin vivoハイブリダイゼーションによりそれらの相補的一本鎖オリゴマーと特異的に結合する。ターゲッティング部分と結合した一本鎖ＰＮＡを最初に患者に投与し、続いて、診断薬で放射性標識化した一本鎖相補的ＰＮＡを投与する。この方法論の一例が、Rusckowski et al., Cancer 80: 2699-705 (1997)に記載されている。クリアリング剤の投与による２段階法に任意の中間工程を加えることもある。クリアリング剤の目的は、標的部位で結合していない循環する第一の複合体を除去することである。これについては、Griffiths et al.により、引用することにより本明細書の一部とされる米国特許第５，９５８，４０８号に開示されている。
【００１１】
ヌクレアーゼの安定性を向上させ、タンパク質結合親和性を低下させるには、通常、放射性ヌクレオチドと結合するこれらの一本鎖オリゴマーの主鎖への化学修飾が必要である。９９ｍＴｃでの標識を可能にする３つの異なる化学修飾がある１８マーのホスホロチオエートＤＮＡに及ぼす影響については、マウスにてin vitroおよびin vivoで比較されている。Zhang, Y. M. et al., Eur. J. Nucl. Med. 27: 1700-1707 (2000)。ハイブリダイゼーションでの結合速度定数が標識化法と無関係であることは判明しているが、培養下の細胞内蓄積と正常マウスにおける放射性標識の薬物動態学的挙動はいずれも、標識化法により強く影響を受けた。
【００１２】
オリゴマーのこれらのin vivo特性は、それらの鎖長および／または塩基配列の変化により影響を受けるかもしれない。考え得るところでは、鎖長および塩基配列の影響を理解すれば、それによって、オリゴマーの薬物動態を有効に修飾し得ると思われる。この可能性にもかかわらず（化学修飾の場合のように）、これらのさらなるに影響については、これまでほとんど全く未調査の状態であった。この原因は、１つには、適用によりこれらのパラメーターに課された制約にあるかもしれない。例えば、アンチセンス化学療法は、通常、短い単鎖オリゴマーをそのｍＲＮＡ標的のものと相補的な塩基配列とハイブリダイズすることにより効力を発揮すると思われる。Hnatowich, D. J., J. Nucl. Med. 40: 693-703 (1999)。このように、塩基配列と、ある程度、鎖長も所望のハイブリダイゼーションを提供するものに制限される。それにもかかわらず、注目を集めた塩基の組合せがある。一例がホスホジエステルまたはホスホロチオエートＤＮＡにおいて存在するＧカルテット（すなわち、１列に並んだ４つのグアニン塩基）である。Shafter, R. H. et al., Biopoly (Nucleic Acid Sci.) 56: 209-227 (2001)。少なくとも、これらの化学形態のＤＮＡの場合では、グアニン塩基のスタッキングにより特定の三次元４重構造を有するオリゴヌクレオチドが提供される。この構造が種々の生体内プロセスにとって重要な種々の配列特異的効果に関与することは明らかである。同文献。もう１つの例がシトシン塩基の直後にグアニンが続くＣｐＧモチーフであり、これは免疫賦活性を有することが分かっている。Zhao, Q. et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7: 495-502 (1997)。これらの配列が薬物動態に与える影響が少しでもあるとしたら、その影響はまだ確立されていない。
【００１３】
種々の他の公開報告では、オリゴマー鎖長および配列のin vitroでの影響に関してまとめられている。グアニン塩基とチミジン塩基で完全に構成されたホスホジエステルＤＮＡの一細胞系統における細胞毒性作用には少なくとも２０塩基の鎖長を必要とすることが分かった。また、その細胞毒性作用はアデニンまたはシトシンをいずれかの末端に導入することによって消失した。Morassutti, C. et al., Nucleosides & Nucleotides 18: 1711-1716 (1999)。ＰＮＡが細胞において転写および遺伝子発現を開始する効率は、鎖長１６〜１８塩基の場合に最適であることが分かった。Wang, G. et al., J. Mol. Biol. 313: 933-940 (2001)。ラット肝臓ホモジネートをex vivoにて使用して、鎖長および塩基配列の異なる一連のホスホロチオエートＤＮＡの代謝を調査した。Crooke, R. M. et al., J. Pharm. Exp.Therapeutics 292: 140-149 (2000)。最初に、全てのオリゴマーを３’エキソヌクレアーゼにより分解すると、鎖長が長くなるとともに代謝速度が上昇した。ピリミジンを多く含有するオリゴヌクレオチドがより不安定であるということから、ヌクレアーゼ代謝の速度と程度もまた塩基配列に関係していた。この特定調査は立体異性の影響も研究したという点で異例であった。あるジアステレオ異性体の代謝速度は他のものよりも迅速であり、それらの混合物の場合にはその間の速度で消化されることが判明した。最後に、最近の報告で、ＲＮＡにおけるホスホジエステル結合の反応性に及ぼす塩基配列の影響が記載されている。Kaukinen, U. et al., Nucl. Acids Res. 30: 468-474 (2002)。
【００１４】
本発明者らは、ホスホロジアミデートモルホリノ（ＭＯＲＦ）腫瘍イメージングおよび治療のようなオリゴマーの使用をこれまでに開示してきた。このような使用は、順に、２００１年３月３０日出願の米国仮出願番号６０／２７９，８０９および２００１年１２月２１日出願の同６０／３４１，７９４の優先権を主張する、２００２年４月１日出願の係属中の米国特許出願番号１０／１１２，０９４の係属中の一部継続出願に開示されている。これらの出願の明細書、特許請求の範囲および図面をはじめとする全開示内容は、それらの全開示内容が引用することにより本明細書の一部とされる。
【００１５】
天然ホスホジエステルＤＮＡは、非結合性酸素が硫黄原子で置換されているという点でホスホロチオエートとは異なっている。ＰＮＡの場合、ＤＮＡのリン酸主鎖が、窒素含有塩基がメチレンカルボニル基を介して結合される（２−アミノエチル）グリシンポリペプチド結合に置き換わり、その一方で、ＭＯＲＦのホスホジエステル主鎖がホスホロジアミデート基で置換されており、リボース糖がモルホリノ環に置き換わっている。ＤＮＡと同様に、ＭＯＲＦおよびＰＮＡは一般に市販されているが、ＤＮＡとは違って、それらはいずれも非荷電性であり、（ホスホジエステルＤＮＡとは違って）ヌクレアーゼに対して安定であり、（ホスホジチオエートとは違って）非キラルである。
【００１６】
増幅は、多段階プレターゲッティングプロセスであり、このプロセスはオリゴマーの複数のコピーと結合したポリマーの中間使用を通じて、ターゲッティングを大幅に向上させる可能性を有している。従って、腫瘍における放射活性の蓄積を大幅に増大させ、同時に、腫瘍／正常組織比を高める改善されたキットまたは方法が必要である。これにはまず、最後に抗体と結合させるＭＯＲＦポリマーを調製する必要がある。このような方法においては、抗体の著しい変性の回避だけはしたい。
【００１７】
増幅ターゲッティングに代わる１つの方法が（ストレプ）アビジン／ビオチン、二重特異性抗体またはオリゴマー対のいずれかを用いたプレターゲッティングである。最近、特に、二重特異性抗体(Karacay, H. et al., Bioconjug. Chem. 13: 1054-1070, 2002)およびオリゴマー(Liu, G. et al., J. Nucl. Med. 43: 384-391, 2002)を利用して有望な結果が報告されている。しかしながら、プレターゲッティングには多価ポリマーが関与しないため、増幅は（特定のストレプトアビジン／ビオチンプロトコールの場合最大４倍以外に）起こりえない(Kassis, A. I. et al., J. Nucl. Med. 37: 343-352, 1996)。
【００１８】
ホウ素中性子捕捉用のホウ素のような低分子量種(Novick, S. et al.,.Nucl. Met. Biol. 29: 159-67, 2002)または種々の用途に向けた金属キレート剤(Torchilin, V. P. et al, Hybridoma 6: 229-40, 1987)の複数のコピーと直接結合した抗腫瘍抗体についての数多くの報告がなされている。明白な不利益として、特に、比較的高分子量のＭＯＲＦの複数のコピーを結合することを目的とする場合には、結合した結果として抗体が変性する危険性がある。例えば、１分子あたり５０個のＭＯＲＦを保持するためには、ＩｇＧ抗体の分子量が約１５０ＫＤａから最小６００ＫＤａに上がるはずである。これらの条件下で免疫活性を保持することは不可能であろう。さらに、増幅ターゲッティングは、低分子量であることから、複数のＭＯＲＦとの結合を受け入れることができない抗腫瘍および抗組織ペプチドのような抗体以外の組織特異的な薬剤を用いても有効である。
【００１９】
ホスホジエステルの使用もホスホロモノチオエートの使用も、増幅ターゲッティングおよび他の放射性医薬品の適用に理想的とはいえない。前者はin vivoにてヌクレアーゼに対してあまりにも不安定であり、後者は血清および組織タンパク質に対してあまりにも高い親和性を示す(Hnatowich, D. J. et al., J. Pharmacol. Exp.Ther. 276: 326-334, 1996)。本発明者らは、その後、ＰＮＡが安定であり、最低タンパク質結合親和性を有することを示した(Mardirossian, G.et al., J. Nucl. Med. 38: 907-913, 1997)。それに応じ、本発明者らの第一の増幅ターゲッティング研究ではＰＮＡを使用した(Wang, Y. et al., Bioconjug. Chem. 12: 807-816, 2001)。しかしながら、選択塩基配列を有するＰＮＡの水溶解度が低いことから問題に遭遇した。結合に関する問題から、ＰＮＡ研究では抗腫瘍抗体を使用しなかった(Wang, Y. et al., 2001、上記)。場合により、水溶性がより高いことから、アミン誘導体化ＭＯＲＦを抗腫瘍抗体ＭＮ１４およびキレート化剤ＭＡＧ３の両方と結合させ、９９ｍＴｃでの放射性標識化に成功した。放射性標識およびＭＯＲＦは、タンパク質に対してほとんど親和性を示さず、in vitroおよびin vivoにて「安定」であることが判明し、それらは標識したＰＮＡと同様に、迅速なハイブリダイゼーションが可能である(Mang'era, K. et al., Eur. J. Nucl. Med. 28: 1682-1689, 2001)。
【００２０】
増幅ターゲッティングは、ＭＯＲＦ−抗体と放射性標識ＭＯＲＦ（プレターゲッティングの場合にはｃＭＯＲＦ）の両方を使用するプレターゲッティング（本明細書に記載）といくつかの類似点を共有しているが、ポリマーを中間使用する点で異なっている。増幅ターゲッティングはプレターゲッティングよりも明らかに複雑であるが、シグナル増幅の可能性がある。
【００２１】
増幅ターゲッティングの１つの重要な態様がin situ接近可能性である。腫瘍にて高放射能レベルを実現するためには、腫瘍における抗体のＭＯＲＦを多量体ｃＭＯＲＦに接近しやすくし、そして、腫瘍におけるポリマーのｃＭＯＲＦを放射性標識ＭＯＲＦに接近しやすくする必要がある。もう１つの重要な態様は、肝臓、脾臓、腎臓および他の正常な器官内での多量体ｃＭＯＲＦの蓄積によって起こる。これらの正常器官におけるバックグラウンド放射線レベルを低減するためには、多量体ｃＭＯＲＦの発現を迅速に放射性標識ＭＯＲＦに接近できない状態にすべきである。
【００２２】
ストレプト／アビジン−ビオチンおよび二重特異性抗体−ハプテン系に優るいくつかの利点にもかかわらず、プレターゲッティングにおいてこれらのオリゴマーを使用する場合にはいくつかの制限がある。これらの制限としては、特異性が乏しいこと、水溶液に不溶性である可能性があること、およびコストが高いことが挙げられる。
【００２３】
哺乳動物において標的部位に治療薬または診断薬を送達するためのin vivo ターゲッティングに用いる、より特異的で、手ごろで安価であり、標的への高い取り込みと正常組織内への低い取り込みを提供する、改善されたキットおよび方法が依然として必要とされている。また、癌細胞とは結合していない過剰の同位体標識オリゴマーが体内、とりわけ、腎臓から迅速に排除されるという改善されたプレターゲッティングキットおよび方法を提供する必要もある。
【発明の概要】
【００２４】
従って、本発明の１つの目的は、哺乳動物において診断薬または治療薬を増幅ターゲッティングするのに有用なキットおよび方法であって、比較的安価な出発原料から調製することが可能であり、さらに、従来のキットおよび方法ならびに他の公知のキットおよび方法よりも腎臓での取り込みおよび保持量が少なく、毒性が低く、特異性、安定性、予測可能なターゲッティングに優れ、かつ／または所望の抗原−抗体効果の高いキットおよび方法を提供することである。本発明のもう１つの目的は、ＭＯＲＦの複数のコピーを抗体と直接結合させ、そうすることによって、哺乳動物への第二の投与を回避することである。
【００２５】
もう１つの目的は、ストレプト／アビジン−ビオチン、ペプチド核酸および他のオリゴマーの代わりに、多価モルホリノオリゴマー（ＭＯＲＦ、下記に定義する）を使用する増幅ターゲッティングによる腫瘍局在／イメージングに有用な方法であって、放射性標識したターゲッティング部分を標的内の主たる標的特異的な結合部位に高度に蓄積させ、そうすることによって、腫瘍における放射活性の蓄積を大幅に増大させ、同時に、腫瘍／正常組織比を高めるという代替法を提供することである。
【００２６】
これらおよび他の目的は、本発明の１つの実施態様によれば、哺乳動物において診断薬または治療薬をターゲッティングするためのキットであって、
（Ａ）標的部位の主要な標的特異的な結合部位、または標的部位により生成される物質もしくは標的部位と関連する物質と選択的に結合するターゲッティング部分と、モルホリノオリゴマーとを含んでなる第一の複合体、
（Ｂ）所望により、クリアリング剤、
（Ｃ）ポリマーと結合した相補的モルホリノオリゴマーの複数のコピーと診断薬または治療薬とを含んでなる第二の複合体、および
（Ｄ）モルホリノオリゴマーと放射性標識とを含んでなる第三の複合体
を含んでなるキットの提供により実現する。
【００２７】
工程（ａ）のターゲッティング部分は、好ましくは、抗体、特に、ヒト化抗体またはヒト化抗体の抗原結合フラグメントを含んでなる。このようなヒト化抗体の１つが抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ）抗体である。ターゲッティング部分は、タンパク質、小ペプチド、ポリペプチド、酵素、ホルモン、ステロイド、サイトカイン、神経伝達物質、オリゴマー、ビタミンおよび受容体結合分子からなる群から選択される。
【００２８】
工程（ｃ）のポリマーとしては、限定されるものではないが、ポリ−リジン（ＰＬ）、ポリエチルビニルエーテルマレイン酸（ＰＡ）デキストラン、デンドリマーおよびＮ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）が挙げられる。
【００２９】
本発明のもう１つの態様によれば、モルホリノオリゴマーとその相補的モルホリノオリゴマーの長さが少なくとも約６塩基〜約１００塩基である、上記のようなキットが提供される。加えて、モルホリノオリゴマーおよびその相補的モルホリノオリゴマーは１５マー、１８マーまたは２５マーであってもよい。標的部分が１５マー、１８マーまたは２５マーモルホリノオリゴマーと結合する。
【００３０】
好ましい実施態様では、クリアリング剤は、抗イディオタイプ抗体または抗原結合抗体フラグメントである。
【００３１】
もう１つの好ましい実施態様では、治療薬は、抗体、抗体フラグメント、薬物、毒素、ヌクレアーゼ、ホルモン、免疫調節物質、キレート化剤、ホウ素化合物、光活性物質または色素および放射性核種からなる群から選択される。
【００３２】
さらにもう１つの好ましい実施態様では、診断薬は、放射性核種、色素、造影剤、蛍光化合物または分子および磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）に有用な増強剤からなる群から選択される。
【００３３】
本発明によれば、哺乳動物において診断薬または治療薬を標的部位に送達するためのターゲッティング方法であって、
（ａ）前記哺乳動物に、標的部位の主要な標的特異的な結合部位、または標的部位により生成される物質もしくは標的部位と関連する物質と選択的に結合するターゲッティング部分と、モルホリノオリゴマーとを含んでなる第一の複合体を投与すること、
（ｂ）所望により、前記哺乳動物にクリアリング剤を投与し、前記クリアリング剤によって局在していない第一の複合体を循環から排除すること、および
（ｃ）前記哺乳動物に、相補的モルホリノオリゴマーの複数のコピーと結合したポリマーと、診断薬または治療薬とを含んでなる第二の複合体を投与すること（この際、前記相補的モルホリノオリゴマー−ポリマー複合体が第一の複合体のそのモルホリノオリゴマー相補体と結合することによって、診断薬または治療薬を標的部位にターゲッティングする）、および、
（ｄ）前記哺乳動物に、モルホリノオリゴマーと放射性標識とを含んでなる第三の複合体を投与すること
を含んでなる方法が提供される。
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明および添付の特許請求の範囲から明らかになる。
【発明の具体的説明】
【００３４】
特に断りのない限り、単数形で示される用語は１以上のものを意味する。
【００３５】
本発明は、哺乳動物（好ましくは、ヒト）において診断薬または治療薬をin vivoターゲッティングするのに有用なキットおよび方法であって、
（Ａ）標的部位の主要な標的特異的な結合部位、または標的部位により生成される物質もしくは標的部位と関連する物質と選択的に結合するターゲッティング部分と、モルホリノオリゴマーとを含んでなる第一の複合体、
（Ｂ）所望により、クリアリング剤、
（Ｃ）ポリマーと結合した相補的モルホリノオリゴマーの複数のコピーと、診断薬または治療薬とを含んでなる第二の複合体、および
（Ｄ）モルホリノオリゴマーと放射性標識とを含んでなる第三の複合体
を含んでなるキットおよび方法を提供する。
【００３６】
ターゲッティング部分は、例えば、抗体または抗原結合抗体フラグメントであってよい。特異性が高いことからモノクローナル抗体（Ｍａｂ）が好ましい。これらは免疫原性抗原調製物での哺乳動物の免疫化、免疫リンパまたは脾臓細胞と不死化骨髄腫細胞系との融合および特定のハイブリドーマクローンの単離からなる従来の手順と考えられている方法により容易に調製される。主として、抗体の抗原特異性が本発明におけるそれらの有用性に影響を及ぼすことから、種間融合および遺伝子工学による超可変領域の操作のようなより斬新なモノクローナル抗体調製方法もまた意図される。当然のことではあるが、モノクローナル、例えば、ヒトモノクローナル、種間モノクローナル、キメラ（例えば、ヒト／マウス）モノクローナル、遺伝子組換え抗体などを製造するための最新の技術を使用することもできる。
【００３７】
本発明において有用な抗体フラグメントとしては、ハイブリッドフラグメントを含むＦ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖなどが挙げられる。好ましいフラグメントはＦａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）２である。同様に、免疫グロブリンの、抗原と結合する超可変領域を保有し、かつ、Ｆａｂ’フラグメント以下の大きさを有するいかなるサブフラグメントも有用である。これには、単鎖または複数鎖を問わず、抗原結合部位を組み入れているか、そうでなければin vivoにて天然免疫グロブリンフラグメントと実質的に同じようにターゲッティングビヒクルとして機能する遺伝子操作した抗体およびタンパク質または組換え型抗体およびタンパク質が含まれる。このような単鎖結合分子については、引用することにより本明細書の一部とされる、米国特許第４，９４６，７７８号に開示されている。
【００３８】
Ｆａｂ’フラグメントは、便宜には、還元条件下での無傷免疫グロブリンのペプシン消化によるか、または完全免疫グロブリンの慎重なパパイン消化によって生じるＦ（ａｂ’）２フラグメントの切断によって作製し得るＦ（ａｂ’）２フラグメントの還元切断により作製してもよい。また、遺伝子工学によってそのフラグメントを作製してもよい。
【００３９】
さらに、少なくとも６０％の癌細胞により生成されるか、またはその癌細胞と関連するマーカー物質に対する特異的な免疫反応性を有する抗体および３５％未満の他の抗原または非標的物質に対する交差反応性を有する抗体も好ましい。腫瘍により生成されるか、またはは腫瘍と関連する抗原と結合させることにより腫瘍部位に特異的にターゲッティングモノクローナル抗体が特に好ましい。
【００４０】
腫瘍抗原に対する抗体については公知である。例えば、腫瘍により生成されるか、あるいは腫瘍と関連するマーカーと特異的に結合する抗体および抗体フラグメントは、とりわけ、それらの全ての開示内容が引用することにより本明細書の一部とされる、Hansen et al., 米国特許第３，９２７，１９３号ならびにGoldenbergの米国特許第４，３３１，６４７号、同第４，３４８，３７６号、同第４，３６１，５４４号、同第４，４６８，４５７号、同第４，４４４，７４４号、同第４，８１８，７０９号および同第４，６２４，８４６号に開示されている。特に、抗原、例えば、胃腸腫瘍、肺腫瘍、乳房腫瘍、前立腺腫瘍、卵巣腫瘍、精巣腫瘍、脳腫瘍もしくはリンパ腺腫瘍、肉腫または黒色腫に対する抗体を使用することが有利である。
【００４１】
本発明のターゲッティング部分の他の標的としては、限定されるものではないが、Ｂ細胞抗原、Ｔ細胞抗原、形質細胞抗原、ＨＬＡ−ＤＲ系統抗原、ＣＥＡ、ＮＣＡ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３およびＭＵＣ４抗原、ＥＧＰ−１抗原、ＥＧＰ−２抗原、胎盤アルカリ性ホスファターゼ抗原、ＩＬ−６、ＶＥＧＦ、テネイシン、ＣＤ３３、ＣＤ７４、ＰＳＭＡ、ＰＳＡ、ＰＡＰ、自己免疫疾患、感染／炎症および感染症と関連する抗原が挙げられる。標的がＢ細胞もしくはＴ細胞リンパ腫と関連するか、または自己免疫疾患と関連するＢ細胞もしくはＴ細胞と関連する標的抗原である場合もある。標的がＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ４０、ＣＤ７４、ＣＥＡ、ＮＣＡ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２、ＩＬ−１５および悪性疾患によって発現されるＨＬＡ−ＤＲからなる群から選択される抗原である場合もある。標的は、例えば、特定の悪性疾患に関するＥＧＰ−２、ＥＧＰ−１、ＣＤ２２、ＣＥＡまたはＭＵＣ１である。
【００４２】
標的は、細菌、ウイルス、真菌、寄生生物または他の微生物によって発現される可能性がある。
【００４３】
また、標的は、感染部位にて増大する、活性化された顆粒球のような宿主細胞によって発現される可能性もある（例えば、ＣＤ１５、ＣＤ３３、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６６ｃ（ＮＣＡ）およびＣＤ６６ｅ他）。
【００４４】
本発明の方法において有用な抗体および抗原結合抗体フラグメントは、当技術分野で公知の種々の化学的結合方法により結合対のメンバーと結合させてもよい。これらの方法の多くは、それらの全ての開示内容が引用することにより本明細書の一部とされる、上記の米国特許および特許出願に開示されている。Childs et al., J. Nuc. Med. 26: 293 (1985)も参照のこと。
【００４５】
本発明において有用な１つのモノクローナル抗体が、ＣＥＡに対して第一世代型ＮＰ−４よりも１０倍高い親和性を有する第二世代ＣＥＡ−抗体であるＭＮ−１４である。Hansen et al., Cancer 71: 3478-85, (1993)。ＭＮ−１４はゆっくりと取り込まれ、これによりターゲッティングアプローチに好適なものとなる。これはキメラ化され、ヒト化されている。Leung et al., 米国特許第５，８７４，５４０号。
【００４６】
本発明において好適な他の抗体または抗体フラグメントは、悪性疾患にターゲッティングする場合には、例えば、ＲＳ１１、１７−１Ａ、ＲＳ７、ＬＬ１、ＬＬ２、ＭＮ−３、ＭＮ−１４もしくはＰＡＭ４またはそのヒト化型であってもよいし、あるいは、ＲＳ１１、１７−１Ａ、ＲＳ７、ＬＬ１、ＬＬ２、ＭＮ−３、ＭＮ−１４もしくはＰＡＭ４またはそのヒト化型から誘導したものであってもよい。好適な顆粒球抗体はLeukoScan（登録商標）で使用されるＭＮ３である。
【００４７】
本発明において有用な他のターゲッティング部分が、標的部位により生成されるか、あるいは標的部位と関連するマーカー物質と優先的に結合する、タンパク質、小ペプチド、ポリペプチド、酵素、ホルモン、ステロイド、サイトカイン、神経伝達物質、オリゴマー、ビタミンおよび受容体結合分子からなる群から選択される非抗体種であってもよい。
【００４８】
モルホリノオリゴマー（本明細書では「モルホリノ」または「ＭＯＲＦ」）は選択されたＲＮＡ配列と結合し、不活性化する。これらのオリゴマーは、六員のモルホリン環に連結された、その各々が４種の遺伝子塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、ＴまたはＵ）のうちの１つを含有する４つの異なるモルホリノサブユニットで構成されている。１５〜２５マーの場合、非イオン性ホスホロジアミデートサブユニット間結合によってこれらのサブユニットが特定の順序で結びつき、モルホリノオリゴマーが生じる。これらはＤＮＡ、ＲＮＡおよびイオン結合により結びついた五員のリボースまたはデオキシリボース主鎖部分を有するそれらの類似体よりも優れたアンチセンス特性を提供し得る。モルホリノに関するSummertonの研究については、それらの開示内容が引用することにより本明細書の一部とされる、米国特許第５，１４２，０４７号および同第５，１８５，４４４号に開示されている。モルホリノは、Gene Tools, LLC,. Corvallis, Oregonより市販されている。
【００４９】
それらは標的へと容易に送達されるため、モルホリノは遺伝学研究および薬剤標的実証プログラム向けの効果的なツールである。それらはヌクレアーゼに完全に耐性である。よりリジッドなＭＯＲＦ主鎖は、二本鎖形成時に、ペプチド主鎖または一般的な糖骨格に比べて優れた接近性を提供し得る。ＰＮＡと比べると、モルホリノはより安価であり、水溶液溶解度はより高く、それによれば予測可能なターゲッティングにより優れ、ＲＮＡ結合親和性の効果がより高い。
【００５０】
本発明においては、ターゲッティング抗体と結合したモルホリノオリゴマー（本明細書ではＭＯＲＦ）は、診断薬または治療薬と結合した相補的ＭＯＲＦ（本明細書ではｃＭＯＲＦ）とin vivoにてハイブリダイズされる。好ましい実施態様では、ＭＯＲＦおよびその相補的モルホリノ（ｃＭＯＲＦ）の長さは６塩基〜約１００塩基であり、例えば、ＭＯＲＦ１５およびｃＭＯＲＦ１５（１５マー）、ＭＯＲＦ１８およびｃＭＯＲＦ１８（１８マー）またはＭＯＲＦ２５およびｃＭＯＲＦ２５（２５マー）である。
【００５１】
本発明で使用するＭＯＲＦとしては、１５マー（５’相当ＴＧＴ−ＡＣＧ−ＴＣＡ−ＣＡＡ−ＣＴＡ−リンカー−アミン（本明細書ではＭＯＲＦ１５）とＴＡＧ−ＴＴＧ−ＴＧＡ−ＣＧＴ−ＡＣＡ−リンカー−アミン（本明細書では相補的ＭＯＲＦ１５またはｃＭＯＲＦ１５））、１８マー（５’相当ＣＧＧ−ＴＧＴ−ＡＣＧ−ＴＣＡ−ＣＡＡ−ＣＴＡ−リンカー−アミン（本明細書ではＭＯＲＦ１８）とＴＡＧ−ＴＴＧ−ＴＧＡ−ＣＧＴ−ＡＣＡ−ＣＣＣ−リンカー−アミン（本明細書では相補的ＭＯＲＦ１８またはｃＭＯＲＦ１８））および２５マー（５’相当Ｔ−ＧＧＴ−ＧＧＴ−ＧＧＧ−ＴＧＴ−ＡＣＧ−ＴＣＡ−ＣＡＡ−ＣＴＡ−リンカー−アミン（本明細書ではＭＯＲＦ２５）とＴＡＧ−ＴＴＧ−ＴＧＡ−ＣＧＴ−ＡＣＡ−ＣＣＣ−ＡＣＣ−ＡＣＣ−Ａ−リンカー−アミン（本明細書では相補的ＭＯＲＦ２５またはｃＭＯＲＦ２５））が挙げられる。
【００５２】
本発明で使用するモルホリノオリゴ構造(Summerton and Weller, Antisense Nucl. Acid Drug Dev. 7: 187-95, 1997)を以下に示す：
【化１】
【００５３】
本発明に従って、当技術分野で公知のクリアリング剤を使用してもよい。例えば、第一の複合体がアビジンまたはストレプトアビジンを含んでなる場合には、クリアリング剤としてビオチンを使用することができる。また、第一の複合体がビオチンを含んでなる場合には、クリアリング剤としてアビジンまたはストレプトアビジンを使用することができる。
【００５４】
好ましい実施態様では、クリアリング剤が、抗体、抗原結合抗体フラグメントまたは非抗体標的化部分であるターゲッティング部分の結合部位と結合する抗体である。より好ましい方法では、米国出願番号０８／４８６，１６６に記載のように、クリアリング剤は、第一の工程で使用する複合体のモノクローナル抗体に対する抗イディオタイプであるモノクローナル抗体である。もう１つの好ましい実施態様では、クリアリング剤をガラクトースのような炭水化物の複数の残基で置換し、そうすることによって、クリアリング剤が肝臓にあるアシアロ糖タンパク質受容体により循環から迅速に排除されるようにしている。
【００５５】
標的化種の生理溶液は、有利には、定量、例えば、単位用量約１．０〜５００ｍｇ標的化種／バイアルにて滅菌バイアルに入れられる。このバイアルは栓をし、密閉し、低温保存されるか、または凍結乾燥させ、栓をし、密閉し、保存される。
【００５６】
これらの処方物の変形および改変は当業者ならば、哺乳動物または治療計画それぞれの要求、ならびに、放射性同位元素を供給する形態または放射性同位元素の入手可能な形態のバリエーションに応じて容易に理解できる。
【００５７】
投与経路としては、静脈内、動脈内、胸膜腔内、腹腔内、くも膜下腔内、皮下投与または灌流による投与が挙げられる。
【００５８】
腫瘍または心血管病変（血塊、塞栓、梗塞など）、感染症、炎症性疾患および自己免疫疾患のような他の病変の体内検出または治療に有用な方法については、それらの開示内容が引用することにより本明細書の一部とされる、米国特許第４，７８２，８４０号、第４，９３２，４１２号および第５，７１６，５９５号に開示されている。これらの参考文献に開示されている方法を補強するために本発明の方法を使用してもよい。また、本発明は術中探針、内視鏡および腹腔鏡を併用して実施してもよいし、正常な器官をイメージングするための方法により実施してもよい。本発明の方法を当業者には明らかな他の方法で使用することもできる。
【００５９】
治療薬の例としては、抗体、抗体フラグメント、薬物、毒素、ヌクレアーゼ、ホルモン、免疫調節物質、キレート化剤、ホウ素化合物、光活性物質または色素および放射性核種が挙げられる。
【００６０】
さらに好ましい実施態様では、ｃＭＯＲＦを二官能性キレート化剤と結合させ、その後、そのキレート化剤を同位元素で放射性標識する。厳しい状況に耐えることのできないタンパク質、ポリペプチドまたはオリゴヌクレオチドでは、それらとの結合の前に、まず、キレート化剤を放射性標識化する（結合前標識）。キレート化剤の例としては、ヒドラジノニコチンアミド（ＨＹＮＩＣ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、１，４，７，１０−テトラアザ−シクロドデカンＮ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）およびメルカプトアセチルグリシルグリ−シルグリシン（ＭＡＧ３）が挙げられる。本発明で使用する好ましい二官能性キレート化剤は、アセチル−Ｓ−保護メルカプトアセチルトリグリシン（ＮＨＳ−ＭＡＧ３）のＮ−ヒドロキシスクシンイミジル誘導体である。ＮＨＳ−ＭＡＧ３は、Winnard, P. et al., Nucl. Med. Biol. 24: 425-32 (1997)の方法に従って合成される。一本鎖モルホリノオリゴマーのＮＨＳ−ＭＡＧ３との結合は、Mardirossian, G. et al., J. Nucl. Med. 38: 907-13 (1997)に記載のように実施した。
【００６１】
増幅ターゲッティングの１つの重要な態様がin situ接近可能性である。腫瘍にて高放射能レベルを実現するためには、腫瘍における抗体のＭＯＲＦを多量体ｃＭＯＲＦに接近しやすくし、そして、腫瘍におけるポリマーのｃＭＯＲＦを放射性標識ＭＯＲＦに接近しやすくする必要がある。もう１つの重要な態様は、肝臓、脾臓、腎臓および他の正常な器官内での多量体ｃＭＯＲＦの蓄積によって起こる。これらの正常器官におけるバックグラウンド放射線レベルを低減するためには、多量体ｃＭＯＲＦの発現を迅速に放射性標識ＭＯＲＦに接近できない状態にすべきである。
【００６２】
本発明のポリマーは、以下の特性を有するべきものである：（１）無毒であること；（２）適当な分子量を有し、市販されていること；（３）ｃＭＯＲＦとの結合が実現可能であること；（４）必要数のｃＭＯＲＦが結合しているポリマーを通じて接近可能であること；（５）結合したポリマーが十分な水溶性を有し、血中濃度が適度に持続するその薬物動態が有利であること；（６）ポリマーの抗体とのハイブリダイゼーションによって腫瘍への取込みを促進しないこと；および（７）正常組織においてｃＭＯＲＦ発現が消失するように、ポリマーがこれらの正常組織で代謝し、腫瘍においてポリマーが効果的に拡散すること。好ましくは、ポリマーは、上記特性全てを有するポリ−リジン（ＰＬ）およびポリエチルビニルエーテルマレイン酸（ＰＡ）である。他の好ましいポリマーとしては、限定されるものではないが、デキストラン、デンドリマーおよびＮ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）が挙げられる。これらのポリマー各々が以下に示した有用な分子量を有する種類のものとして商業的に入手可能であり、各々水溶性を有し、各々ｃＭＯＲＦと容易に結合することからそれらを選択した。さらに、ＰＬおよびＰＡの両方を使用することに成功した。デンドリマーは非線形ポリマーを評価する機会を提供する。デキストランは５０年以上にわたって、血漿量の増加に、末梢血流の促進に、そして、抗血栓薬として実際の臨床に用いられてきた(Thoren, 1981; Mehvar, 2000)。また、特に、増幅に関連して投与される低用量でのＰＬおよびデンドリマーの安全性は証明されている(Malik, 2000)。
【００６３】
【表１】
【００６４】
本発明者らがこれまでのＰＮＡ研究で使用したポリマーは、最初の分子量が８０ＫＤａであり、１分子当たり約９００個のカルボキシル基を有するポリメチルビニルエーテルマレイン酸（ＰＡ）であった(Wang, Y. et al., Bioconjug. Chem. 12: 807-816, 2001)。各分子を平均８０個のＰＮＡ（各々が１９メンバーポリエーテルポリアミドリンカーを有する）で修飾した。ＰＮＡの水溶解度に制限があるため、ポリマーが平均２００個のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基とも結合される場合を除き、ＰＡポリマーは好ましくない薬物動態（すなわち、肝臓濃度が高く、血中濃度が低い）を示した。結果として、ＰＥＧにより、７０％を上回るものに関して最終的なポリマーの分子量が１．４ＭＤａまで増加した。分子量がこの程度まで増加することにより、腫瘍への拡散および浸透が制限されることが予想される。そうとはいえ、ＰＮＡ研究の最も有望な態様は接近可能性であった。溶液中の放射性標識ｃＰＮＡにはＰＡにおけるＰＮＡの７５％が接近可能であり、（ビーズに）固定化されている場合でさえ、ＰＡにおけるＰＮＡの３５〜５８％がなお接近可能であった(Wang et al., 2001、上記)。
【００６５】
ＰＮＡに対し、ＭＯＲＦを使用するとポリマーの合成が簡易化され、より広範な種類のポリマーの選択が提供された。並行した調査では、必要なカルボキシル基を提供するために完全にスクシニル化した、最初の分子量の異なる３種類のポリリジン（ＰＬ）を合成し、試験した（非公開の所見）。さらに、これまでにＰＮＡとともに使用したものと類似したＰＡの最終分子量が、１分子当たりの接近可能なオリゴマーの数がほんの少し少ない場合の１．４ＭＤａに対し、約０．４ＭＤａであるようにＰＥＧを含まないＰＡも調べた。正常マウスの生体内分布では、ＰＮＡに対し、ほとんど同じ条件下でＭＯＲＦと結合させた場合、ＰＡの肝臓濃度は約半分であり、血中濃度は４倍であることから、ＰＮＡより優れたＭＯＲＦの利点が示された。これらの結果は、さらに、試験した他の３種類のポリマーよりも血中濃度が高く、肝臓濃度か低い３０ＫＤａのＰＬがin vivo研究に適していることも示唆した。こういうわけで、本明細書にて記載するin vivo研究では３０ＫＤａのＰＬポリマーを使用した。しかしながら、このポリマーは１分子当たり１２〜１５個のｃＭＯＲＦしか有していなかった。これに対し、in vitro研究用に選択したより大きな１００ＫＤａのＰＬポリマーは１分子当たり３５〜４０個のｃＭＯＲＦを有していた。
【００６６】
組織培養による腫瘍細胞蓄積試験は、動物試験を実施するよりもずっと簡単であり、クリアランスによる濃度の低減を受けない。そのため、このような試験が増幅戦略の有用な予備試験となり得る。それでもなお、組織培養試験は表１にて示されるように、腫瘍動物試験と同様に非特異的蓄積が伴うため、対照を使用する必要がある。組織培養での非特異的細胞蓄積をなくすことにより、プレターゲッティングに比べて６倍の特異的蓄積の増大が実現した。
【００６７】
動物試験は、明らかに、組織培養試験に比べて、より現実的でより厳しい増幅ターゲッティング試験を提供する。最初の２つの動物試験は、腫瘍内の抗体およびポリマーを定量する目的で設計した。二重放射能標識を使用することにより、この調査条件下では、約２日間で腫瘍内の抗体ＭＯＲＦの約２５％が多量体ｃＭＯＲＦにより標的化され、３時間後に腫瘍内のこれらの多量体ｃＭＯＲＦの１２％が放射性標識ＭＯＲＦにより標的化されることが予測できた。この研究室によるＰＮＡに関するこれまでの研究では抗腫瘍抗体を使用しなかったため、２５％の値とは比べものにならない。しかしながら、腫瘍における多量体オリゴマーの１２％の接近可能性は、これまでに判明した３５〜６０％の接近可能性よりも低い(Wang, Y. et al., 2001、上記)。この違いに関しては考えられる理由が多くあり、それらの理由としては、異なるポリマー主鎖の使用（すなわち、ＰＡ対ＰＬ）、大きさの異なるポリマーの使用（最初のＭｒ ８０ＫＤａ対３０ＫＤａ）、異なるオリゴマーの使用（すなわち、ＰＮＡ対ＭＯＲＦ）、異なるリンカーの使用（すなわち、１９メンバーポリエーテルポリアミド対９メンバースクシニル化ピペリジン）、異なる腫瘍モデルの使用（すなわち、ＡＣＨＮ対ＬＳ１７４Ｔ）およびポリマーの投与と放射性標識の投与間に要する時間を変えたこと（すなわち、３時間対１８時間）が挙げられる。最も有力な理由は異なる局在化機構を利用したことであろう。ＰＮＡポリマーは非特異的拡散により腫瘍に局在化し、そのため、間質液中におそらく遊離していたであろうが、ＭＯＲＦポリマーはおそらく腫瘍細胞表面にあるその抗体標的に固定されていたであろう。溶液中の両ポリマーの接近可能性がｃＭＯＲＦポリマーでは５０％に対し、ｃＰＮＡポリマーでは７０％である(Wang, Y. et al., 2001、上記)ということでほぼ一致していることからもこの可能性は支持される。
【００６８】
全ての動物試験で、試験動物と対照動物間で統計的に有意に高い値を一貫して示す唯一の組織が腫瘍であった。血液は試験動物で有意に高い場合が多いが、これはＭＯＲＦ−９９ｍＴｃ投与時に循環中（および組織中）に残留している抗体およびポリマーがハイブリダイズし、放射性標識ＭＯＲＦを保持しているものと考えられる。クリアリング剤の使用が有用であろう(Lubic, S. P. et al., J. Nucl. Med. 42: 670-678, 2001)。
【００６９】
最後に、増幅ターゲッティング概念実証は、in vivoにて存在する蓄積に対する障害やクリアランスとターゲッティングとの競合にもかかわらず、腫瘍内のＭＮ１４におけるＭＯＲＦをｃＭＯＲＦポリマーにより、そして、腫瘍内のポリマーにおけるｃＭＯＲＦを放射性標識ＭＯＲＦにより効果的にターゲッティングすることが可能であるということにより明示された。腫瘍における放射能蓄積はプレターゲッティングに比べて倍以上（すなわち、増幅倍率２．１）であった。さらに、（抗体における）ＭＯＲＦ発現および（ポリマーにおける）ｃＭＯＲＦ発現は肝臓、脾臓および腎臓のような正常な器官では急速に消失したが、腫瘍では消失せず、標的／非標的比が高まった。抗体を、平均してたった０．２個のＭＯＲＦと、１分子当たり１５個のｃＭＯＲＦしか有していない、おそらくあまり理想的ではないポリマーであるものと結合したにもかかわらず、これらの結果が得られた。さらに、クリアリング剤は使用しなかった。
【００７０】
治療薬として有用な、β線放射により実質的に崩壊する放射性核種としては、限定されるものではないが、Ｐ−３２、Ｐ−３３、Ｓｃ−４７、Ｆｅ−５９、Ｃｕ−６４、Ｃｕ−６７、Ｓｅ−７５、Ａｓ−７７、Ｓｒ−８９、Ｙ−９０、Ｍｏ−９９、Ｒｈ−１０５、Ｐｄ−１０９，Ａｇ−１１１、Ｉ−１２５、Ｉ−１３１、Ｐｒ−１４２、Ｐｒ−１４３、Ｐｍ−１４９、Ｓｍ−１５３，Ｔｂ−１６１、Ｈｏ−１６６、Ｅｒ−１６９、Ｌｕ−１７７、Ｒｅ−１８６、Ｒｅ−１８８、Ｒｅ−１８９、Ｉｒ−１９４、Ａｕ−１９８、Ａｕ−１９９、Ｐｂ−２１１、Ｐｂ−２１２およびＢｉ−２１３が挙げられる。有用なβ線放射核種の最大崩壊エネルギーは、好ましくは、２０〜５，０００ｋｅＶであり、より好ましくは、１００〜４，０００ｋｅＶであり、最も好ましくは、５００〜２，５００ｋｅＶである。
【００７１】
治療薬として有用な、オージェ放射粒子により実質的に崩壊する放射性核種としては、限定されるものではないが、Ｃｏ−５８、Ｇａ−６７、Ｂｒ−８０ｍ、Ｔｃ−９９ｍ、Ｒｈ−１０３ｍ、Ｐｔ−１０９、Ｉｎ−１１１、Ｓｂ−１１９、Ｉ−１２５、Ｈｏ−１６１、Ｏｓ−１８９ｍおよびＩｒ−１９２が挙げられる。これらの放射性核種の最大崩壊エネルギーは、好ましくは、１，０００ｋｅＶ未満であり、より好ましくは、１００ｋｅＶ未満であり、最も好ましくは、７０ｋｅＶ未満である。
【００７２】
治療薬として有用な、α粒子を生じることにより実質的に崩壊する放射性核種としては、限定されるものではないが、Ｄｙ−１５２、Ａｔ−２１１、Ｂｉ−２１２、Ｒａ−２２３、Ｒｎ−２１９、Ｐｏ−２１５、Ｂｉ−２１１、Ａｃ−２２５、Ｆｒ−２２１、Ａｔ−２１７、Ｂｉ−２１３およびＦｍ−２５５が挙げられる。有用なα線放射核種の崩壊エネルギーは、好ましくは、２，０００〜９，０００ｋｅＶであり、より好ましくは、３，０００〜８，０００ｋｅＶであり、最も好ましくは、４，０００〜７，０００ｋｅＶである。
【００７３】
光線力学療法の一部として有用な、錯体としての金属としては、限定されるものではないが、亜鉛、アルミニウム、ガリウム、ルテチウムおよびパラジウムが挙げられる。
【００７４】
中性子捕捉法に基づく治療法に有用な放射性核種としては、限定されるものではないが、Ｂ−１０、Ｇｄ−１５５７およびＵ−２３５が挙げられる。
【００７５】
有用な診断薬としては、限定されるものではないが、放射性核種、色素（例えば、ビオチン−ストレプトアビジン複合体の使用）、造影剤、蛍光化合物または分子および磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）に用いる増強剤（例えば、常磁性イオン）が挙げられる。米国特許第６，３３１，１７５号では、ＭＲＩ法およびＭＲＩ増強剤と結合した抗体の調製について記載されており、これはその全開示内容が引用することにより本明細書の一部とされる。好ましくは、診断薬が放射性核種、磁気共鳴画像法で用いる増強剤および蛍光化合物からなる群から選択される。
【００７６】
陽電子放射型断層撮影法で用いる診断薬として有用な放射性核種としては、限定されるものではないが、Ｆ−１８、Ｍｎ−５１、Ｍｎ−５２ｍ、Ｆｅ−５２、Ｃｏ−５５、Ｃｕ−６２、Ｃｕ−６４、Ｇａ−６８、Ａｓ−７２、Ｂｒ−７５、Ｂｒ−７６、Ｒｂ−８２ｍ、Ｓｒ−８３、Ｙ−８６、Ｚｒ−８９、Ｔｃ−９４ｍ、Ｉｎ−１１０、Ｉ−１２０およびＩ−１２４が挙げられる。有用な陽電子放出核種の全崩壊エネルギーは、好ましくは、２，０００ｋｅＶ未満であり、より好ましくは、１，０００ｋｅＶ未満であり、最も好ましくは、７００ｋｅＶ未満である。
【００７７】
磁気共鳴画像法を利用する場合の診断薬に有用な金属としては、限定されるものではないが、カドリニウム、マンガン、鉄、クロム、銅、コバルト、ニッケル、ジスプロシウム、レニウム、ユーロピウム、テルビウム、ホルミウムおよびネオジムが挙げられる。
【００７８】
γ線検出を利用する場合の診断薬として有用な放射性核種としては、限定されるものではないが、Ｃｒ−５１、Ｃｏ−５７、Ｃｏ−５８、Ｆｅ−５９、Ｃｕ−６７、Ｇａ−６７、Ｓｅ−７５、Ｒｕ−９７、Ｔｃ−９９ｍ、Ｉｎ−１１１、Ｉｎ−１１４ｍ、Ｉ−１２３、Ｉ−１２５、Ｉ−１３１、Ｙｂ−１６９、Ｈｇ−１９７およびＴＩ−２０１が挙げられる。有用なγ線放射核種の崩壊エネルギーは、好ましくは、２０〜２０００ｋｅＶであり、より好ましくは、６０〜６００ｋｅＶであり、最も好ましくは、１００〜３００ｋｅＶである。
【００７９】
以下、本発明の実施態様を、本発明の態様を詳細に示す実施例により説明する。これらの実施例は、本発明の特定の要素を例示するものであり、その範囲を制限するものではない。
【実施例】
【００８０】
材料および方法
９メンバースクシニル化ピペリジンリンカーを介して３’−アミンを有する２５マーＭＯＲＦおよびｃＭＯＲＦを購入した(Gene Tools, Corvallis, OR)。これらはこれまでに本発明者らが使用したものと同じものであった(Liu, G. et al., Quart. J. Nucl. Med. 46: 233-43, 2002)。高親和性ネズミ抗ＣＥＡ抗体（ＭＮ１４，ＩｇＧ１サブタイプ、Ｍｒ １６０ＫＤａ）は、Immunomedics(Morris Plains, NJ)から入手した。平均Ｍｒ約３０ＫＤａおよび１００ＫＤａを有する、均一にスクシニル化されたポリ−リジンをSigma-Aldrich, St Louis, MOから購入した。塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）は、Pierce Company, Rockford, IL製のものであった。
【００８１】
Winnard, P. et al., Nucl. Med. Biol. 24: 425-32 (1997)の方法に従って二官能性キレート化剤、アセチル−Ｓ−保護メルカプトアセチル−トリグリシン（ＮＨＳ−ＭＡＧ３）のＮ−ヒドロキシスクシンイミジル誘導体を合成した。元素分析、陽子ＮＭＲおよび質量分析によりこの構造を確認した。０．２２５Ｍ水酸化ナトリウム０．９７ｍｌに、トリグリシン５０ｍｇ（２６４μｍｏｌ）および新たに調製した５０ｍＭエチレントリアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）二ナトリウム１０μｌを添加した。この溶液を０．２μｍフィルターに通してアミン含有粒子を除去した。ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ；モレキュラーシーブスで乾燥させた）３４０μｌ中Ｓ−アセチルチオグリコール酸Ｎ−ヒドロスクシンイミドエステル（ＳＡＴＡ）９０ｍｇ（３９０μｍｏｌ）の溶液を調製し、その溶液をトリグリシン攪拌溶液に滴下した。室温にて１５分間攪拌した後、６Ｍ塩酸３７．６μｌを添加して、非水溶液の見かけのｐＨ８．９から見かけのｐＨ約２．７（ガラス電極−ｐＨメーターで測定）に調整した。最初のｐＨ約８．９は、トリグリシンのアミンを脱プロトン化するがＳＡＴＡのアセチル基が加水分解する強塩基性ｐＨ値には達しないように選択した（ｐＫ７．９; Fasman, G. D. [ed.] 1976, CRC Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, Third Edition, Vol. I, p 321, CRC Press, Boca Raton, FL）。アセチル基の加水分解を最小限に抑えるためにできるだけ早くｐＨを下げた。
【００８２】
乾燥ＤＭＦ３．６ｍｌ中ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）６０ｍｇ（２９０μｍｏｌ）の溶液をトリグリシン／ＳＡＴＡ攪拌溶液に迅速に添加した（見かけのｐＨ約５．０）。ジシクロヘキシル尿素が沈殿し始めたため、この溶液は２分で混濁状態となった。この反応物を暗室で室温にて２〜４時間攪拌した後、さらに１時間−２０℃に冷却し、完全沈降を促した。４℃、２５００ｇにて１５分間遠心分離した後、清澄な上清を除去した。
【００８３】
ＤＭＦ溶液中には水が存在するため、この形態のＮＨＳ−ＭＡＧ３調製物の使用は調製の２４時間以内とした。長期保存する場合には、ＮＨＳ−ＭＡＧ３水／ＤＭＦ溶液をロータリーフラッシュエバポレーター(Rotavapur-R, Buchi, Switzerland)により１５〜３０分でほとんど蒸発乾固させた後、凍結乾燥機(Virtis, Gardenier, NY)により１時間内に凍結乾燥させた。ＮＨＳ−ＭＡＧ３は、このように乾燥させた後、デシケーターに入れて室温にて無期限に保存することができる。複合体形成用に乾燥粉末にしたＮＨＳ−ＭＡＧ３を使用する場合、任意値５０重量％をその純度と見なした。
【００８４】
サイズ排除（ＳＥ）ＨＰＬＣ分析をSuperdex ペプチドカラム（最適分離範囲１×１０２〜７×１０３Ｄａ、Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）により、溶離剤として０．１０ｍｏｌ／Ｌリン酸バッファー、ｐＨ ７．０を流速０．６ｍＬ／分にて用いて実施した。２６０ｎｍでのインラインＵＶ吸光度および放射能検出器を利用して、ピーク画分を特定し、定量した。放射能の回収率を通常通り測定した。
【００８５】
試薬用ＤＴＰＡ環状無水物およびカルボニルジイミダゾールは、Sigma-Aldrich(St Louis, MO)製のものであり、そのまま使用した。Ｐ４樹脂（バイオゲル Ｐ４ゲル、培地）は、Bio-Rad Laboratories, Hercules, CAから購入した。セファデックスＧ１００樹脂は、Pharmacia Biotech Uppsala, Swedenから入手した。９９ｍＴｃ−過テクネチウム酸塩は、９９Ｍｏ−９９ｍＴｃジェネレーター(Bristol-Myers Squibb Medical Imaging, Billerica, MA)から溶出した。１１１Ｉｎは、塩化物として購入した(PerkinElmer Life Science Inc., Boston, MA)。他の全ての化学薬品は試薬用のものであり、さらなる精製は行わずに使用した。
【００８６】
ＭＮ１４−ＭＯＲＦ、ＭＮ１４−ＤＴＰＡ、ＭＯＲＦ−ＭＡＧ３、ＭＯＲＦ−ＤＴＰＡの調製と放射性標識化
ＭＮ１４のＭＯＲＦとの複合体形成は、Liu et al.によってこれまでに記載されている(J. Nucl. Med. 43: 384-391, 2002)ように、ＥＤＣを用いてアミン誘導体化ＭＯＲＦを天然抗体と反応させ、その後、セファデックスＧ−１００により、０．０５Ｍリン酸バッファー、ｐＨ７．２を用いて精製を行うことにより実施した。ＭＯＲＦ結合抗体は、ＨＰＬＣにより、２６５ｎｍおよび２８０ｎｍでの示差的ＵＶ法を利用して、濃度と１抗体分子当たりの平均ＭＯＲＦ数（１分子当たりの基）について特徴づけた(Liu et al., Quart. J. Nucl. Med. 46: 233-43, 2002)。ＭＮ１４−ＤＴＰＡおよびＭＯＲＦ−ＤＴＰＡは、記載されている(Liu et al., Nucl. Med. Comm., in press, 2003)ように、ＤＴＰＡ環状無水物を用いて調製した。複合体化したＤＴＰＡと遊離ＤＴＰＡの両方に対し、１１１Ｉｎの接近可能性が同じであるとし、精製前に混合物を１１１Ｉｎで標識することにより１ＭＮ１４当たりの平均ＤＴＰＡ基数を測定した。ＭＯＲＦ−ＭＡＧ３−９９ｍＴｃは、これまでに記載されている(Liu et al., Quart. J. Nucl. Med. 46: 233-43, 2002)ように、調製し、分析した。放射性標識化は、まず、９９ｍＴｃ過テクネチウム酸塩ジェネレーター溶出物を、ＭＯＲＦ−ＭＡＧ３またはｃＭＯＲＦ−ＭＡＧ３（０．１μｇ／μｌを上回る濃度）（５〜１０μｌ）、０．２５Ｍ酢酸アンモニウムバッファー、ｐＨ５．２（２５μＬ）、ｐＨ ９．２酒石酸塩溶液（５０μｇ酒石酸ナトリウム二水和物／μｌ）（１０μｌ）、および塩化スズ溶液（１０ｍＭ ＨＣｌ １μｌ中塩化スズ二水和物１μｇおよびアスコルビン酸ナトリウム１μｇ）（４μｌ）の溶液に添加し、その後、その溶液を沸騰水中で約２０分間加熱することにより実施した。生成物をＰ４カラムにより、溶離剤として０．０５Ｍリン酸バッファー、ｐＨ７．２を用いて精製した。ＭＯＲＦ−１１１Ｉｎは、ＭＯＲＦ−ＤＴＰＡを１１１Ｉｎとともに室温にて１時間インキュベートすることにより調製し、その後、ＭＯＲＦ−９９ｍＴｃに関して以上で記載しているように精製を行った。標識ＭＯＲＦおよび標識ｃＭＯＲＦの両方をサイズ排除ＨＰＬＣにより通常通り分析したところ、ＵＶおよび放射能検出の両方により本質的に同じクロマトグラフが得られることが分かった。
【００８７】
ＰＬ−ｃＭＯＲＦの調製と放射性標識化
最初のＭｒ３０ＫＤａ（動物試験）または１００ＫＤａ（組織培養試験）を有する、均一にスクシニル化されたポリリジンポリマー（ＰＬ）１０ミリグラムを非プロトン性溶媒Ｎ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）１．０ｍｌに溶解し、これに１，１’−カルボニルジイミダゾール２０．４ｍｇおよびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）３．０μｌを添加した。この混合物を室温にて２時間インキュベートした。ＮＭＰ中２．０ｍｇ／ｍｌ ｃＭＯＲＦ溶液５００μｌに、計画した量の活性化ＰＬ混合物と等モルのＤＩＥＡを添加すると、ｃＭＯＲＦ対ＰＬのモル比１００：１に達した。この溶液を室温にて一晩インキュベートした。
【００８８】
精製に先立ち、１アリコートの溶液をサイズ排除ＨＰＬＣにより、２６５ｎｍでのＵＶ検出を利用して分析し、各ＰＬ分子と結合した平均ｃＭＯＲＦ基数を推測した。２６５ｎｍではＰＬは感知できるほど吸収しないため、遊離状態にある結合していないｃＭＯＲＦとＰＬと結合したｃＭＯＲＦのピーク面積を比較した。１分子当たりの平均基数を推測する別法として、トレーサー濃度の放射性標識ＭＯＲＦを別の１アリコートのＰＬ−ｃＭＯＲＦ溶液にも添加し、遊離状態にある結合していないｃＭＯＲＦとハイブリダイズされたＭＯＲＦ−９９ｍＴｃの放射能をＰＬと結合したｃＭＯＲＦとハイブリダイズされたものの放射能と比較した。次いで、ＰＬ−ｃＭＯＲＦ複合体を、１ｃｍ×３０ｃｍセファデックスＧ１００カラムでのオープンカラムゲル濾過クロマトグラフィーにより、溶離剤として水を用いて精製した。回収した画分中のｃＭＯＲＦに関するＰＬ−ｃＭＯＲＦの濃度は、製造業者により提供されるｃＭＯＲＦのモル吸光度を利用して、ＵＶ吸光度により推測した。
【００８９】
ＰＬ−ｃＭＯＲＦは、各ポリマーにおける平均してわずか約１個のｃＭＯＲＦがＭＯＲＦとハイブリダイズされるように、微量のＭＯＲＦ−９９ｍＴｃまたはＭＯＲＦ−１１１Ｉｎとともに室温にて３０分間インキュベートすることにより放射性標識化した。品質保証は、放射能回収率が通常通りモニタリングされるサイズ排除ＨＰＬＣクロマトグラフィーに基づき、通常通り実施した。
【００９０】
ＵＶ ＨＰＬＣクロマトグラムと標準曲線の傾き（８）を利用して、この調査で使用した２つのＭＮ１４−ＭＯＲＦ調製物に関する１ＭＮ１４分子あたりの平均ＭＯＲＦを、０．０９（組織培養試験）および０．２０（動物試験）と算出した。ＭＮ１４−ＭＯＲＦのＨＰＬＣラジオクロマトグラムは、新たに調製し、精製した際には突出した１つのピークを示したが、保存した際には遊離型ＭＯＲＦピークの形跡を示した。この調査では新たに調製した合成抗体だけを使用した。精製前にＭＮ１４−ＤＴＰＡに付けた１１１Ｉｎ標識のＨＰＬＣラジオクロマトグラフを利用して、平均０．７個のＤＴＰＡ基が各ＭＮ１４抗体と結合したと算定した。
【００９１】
この調査で使用した９９ｍＴｃ標識化手法は、通常のＨＰＬＣ分析では全ての分析において回収率が９０％を上回ることから示されるように、常に、精製後の放射化学的純度が９０％を上回る標識ＭＯＲＦを提供する手法であった。放射性標識ｃＭＯＲＦが、抗体もしくはポリマーと結合しているか、または磁性ビーズ上に固定化されているＭＯＲＦとハイブリダイズ可能であることが通常通り示された(Liu, G. et al., J. Nucl. Med. 43: 384-391, 2002; Mang'era, K. et al., Eur. J. Nucl. Med., 28: 1682-1689, 2001)。
【００９２】
ＵＶ吸光度を利用したサイズ排除ＨＰＬＣ分析により、および微量ＭＯＲＦ−９９ｍＴｃの添加前後の、結合したが未精製のＰＬ−ｃＭＯＲＦポリマーのサイズ排除ＨＰＬＣ分析により、３０ＫＤａ ＰＬポリマーは１分子当たり平均１２〜１５個のｃＭＯＲＦ基と結合しており、一方、１００ＫＤａ ＰＬポリマーは１分子当たり平均３５〜４０個の基と結合していると推測した。１分子当たりの基を測定する２通りの方法では、８０〜９０％の一致を示した。最終的な分子量を、各々、１３０〜１６０ＫＤａおよび４００〜４４０ＫＤａと推測した。精製した両ポリマーのＨＰＬＣ分析では、単一ピークを示し、その回収率は９０％を上回った。
【００９３】
組織培養試験
ＬＳ１７４Ｔ細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１００ｍｇ／ｍｌのペニシリン−ストレプトマイシン(Gibco BRL Products, Gaithersburg, MD)を添加した、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１．５ｍｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、０．１ｍＭ非必須アミノ酸および１．０ｍＭピルビン酸ナトリウムを含有する最少必須培地(ＭＥＭ、Gibco BRL Products, Gaithersburg, MD)で増殖させた。細胞を通常、Ｔ７５フラスコ(Falcon, Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ)内にて加湿５％二酸化炭素雰囲気中、単層として維持した。取り込み試験では、細胞を８０〜９０％集密状態で、Ｔ７５フラスコ内にて０．０５％トリプシン／０．０２％ＥＤＴＡを用いてトリプシン化した後、１０％ＦＢＳを含有するＭＥＭで所望の密度、通常、０．１ｍｌ中１〜２×１０６細胞まで懸濁した。抗体に暴露した細胞を０．２ｍｌダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ、Gibco BRL Products, Gaithersburg, MD)中ＭＮ１４−ｃＭＯＲＦ ２０μｇとともに培養し、４℃にて１時間後、細胞懸濁液を２０００ｒｐｍにて４分間遠心分離し、細胞を各回ＰＢＳ ０．５ｍｌで３回洗浄した（抗体内在化の可能性を最小限に抑えるために培養は４℃にて行った）。ポリマーを与えた細胞を１００ＫＤａ ＰＬ−ｃＭＯＲＦ １０μｇとともに４℃にて１時間培養し、上記のように遠心分離し、３回洗浄した。全ての細胞にＭＯＲＦ−９９ｍＴｃ ０．６０μｇまたはｃＭＯＲＦ−９９ｍＴｃ ０．２７μｇを与えた。室温にて３０分間培養した後、細胞を上記のように遠心分離し、３回洗浄し、細胞ペレットを放射性標識培養液標準に対し、ＮａＩ（Ｔｌ）ウェルカウンターで計数した。
【００９４】
表１では、組織培養試験に関する５群を記載している。増幅群に属する細胞には抗体、１００ＫＤａ ＰＬポリマーおよび放射性標識ＭＯＲＦを与えた。残る４群は対照とした。プレターゲッティング対照群に属する細胞には抗体および放射性標識ｃＭＯＲＦだけを与え、ポリマー単独の対照群に属する細胞にはポリマーおよび放射性標識ＭＯＲＦだけを与え、９９ｍＴｃ単独の対照群ＩおよびIIに属する細胞には各々、標識ｃＭＯＲＦおよびＭＯＲＦだけを与えた。表内の最後の２列は細胞内に蓄積した（ｃ）ＭＯＲＦの平均添加放射能率およびモルを示している。
【００９５】
【表２】
【００９６】
９９ｍＴｃ単独の対照群ＩおよびIIの結果では、標識（ｃ）ＭＯＲＦが細胞内に非特異的に蓄積することが示されているため、プレターゲッティング群の値から０．０３０ピコモルを差し引き、ポリマー単独群および増幅群の値からは０．０５２ピコモルを差し引いた。さらに、ポリマー単独群の結果では、ポリマーも細胞内に非特異的に蓄積することが示されているため、増幅群における蓄積は、さらに１．１８ピコモル低いものであった。その結果、０．４１ピコモルというこの値をプレターゲッティングの０．０６７ピコモルと比較して増幅倍率６を得た。
【００９７】
動物試験
マサチューセッツ医科大学（University of Massachusetts Medical School）（ＵＭＭＳ）動物実験委員会(Institutional Animal Care and Use Committee)の承認を得て、全ての動物試験を実施した。ヌードマウス(NIH Swiss、Taconic Farms, Germantown, NY, ３０〜４０ｇ)各々に１０６ＬＳ１７４Ｔ結腸腫瘍細胞を含有する懸濁液０．１ｍｌを左大腿部に皮下注射した。腫瘍の大きさが１．５ｃｍ以下である１４日後に動物を使用した。
【００９８】
ＭＮ１４−ＭＯＲＦ抗体および３０ＫＤａ ＰＬポリマーの最適用量を推算するため、腫瘍動物に１分子当たり平均０．２個のＭＯＲＦと結合したＭＮ１４（最初の推定として）６０μｇおよび約２．０μＣｉの１１１Ｉｎで放射性標識したＭＮ１４−ＤＴＰＡ３μｇを投与し、２日後、２４〜７６μｇ／動物の３用量にて９９ｍＴｃ標識ポリマーを投与した。これらの結果に基づいて、その後の動物試験には２５μｇ用量のＭＮ１４−ＭＯＲＦおよび１５μｇ用量のポリマーを選択した。
【００９９】
増幅に関する動物試験に先立ち、抗体およびポリマー用量が腫瘍蓄積に及ぼす影響を確立した。腫瘍動物に１１１Ｉｎ標識ＭＯＲＦ抗体（最初の推定として）６０μｇを投与し、２日後、、２４〜７６μｇ／動物の３用量にて９９ｍＴｃ標識３０ＫＤａ ＰＬポリマーを投与した。各対照動物には、ポリマー２４μｇを与えたが抗体は与えなかった。９９ｍＴｃ生体内分布結果を表２に示しているが、その結果は用量が低下するとポリマーの腫瘍蓄積が増加することを示している。１１１Ｉｎ結果（示していない）から、抗体６０μｇの腫瘍内蓄積が、ＭＮ１４−ＭＯＲＦ ２４μｇに関して以下に示したもの（表２）と統計的に同じであることがわかる。よって、増幅に関する全ての動物試験では、ポリマー１５μｇをＭＮ１４−ＭＯＲＦ２５μｇとともに使用した。この表およびその後の表における統計的有意性は、マイクロソフト社製エクセルによる両側分布および対応のある場合のスチューデントのｔ検定により決定したものである。統計的に有意な値（すなわち、ｐ＜０．０５）には下線を施している。
【０１００】
【表３】
【０１０１】
最初の研究では、ＭＮ１４−ＭＯＲＦ ２５μｇをＭＮ１４−１１１Ｉｎ ３μｇ（２．０μＣｉ）と混合し、ヌードマウスにそれらを同時に与えた。約３０時間後、それらの動物には、ポリマーの１２〜１５個のｃＭＯＲＦのうち平均約１個だけ占有するＭＯＲＦ−９９ｍＴｃとのハイブリダイゼーションにより標識した３０ＫＤａ ＰＬ−ｃＭＯＲＦポリマー１５μｇ（２５０μＣｉ）を与えた。対照動物には抗体および／またはポリマーを与えなかった。ポリマーの投与後１８時間の時点に麻酔下、心臓穿刺により動物を犠牲にした。自動ガンマカウンター(Cobra II, Packard Instrument Company, Downers Grove, IL)により１１１Ｉｎおよび９９ｍＴｃを同時計数するため、器官および血液を採取した。全てのカウントを物理的崩壊および９９ｍＴｃウィンドウにおける１１１Ｉｎ活性のわずかな寄与に対して補正した。結果を１グラムあたりの注入量に対する割合として示している。
【０１０２】
増幅に関する第一の動物試験は、腫瘍内の抗体ＭＯＲＦが多量体ｃＭＯＲＦによって標的化される程度を評価する目的で計画されたものである。従って、ＬＳ１７４Ｔ腫瘍を移植したヌードマウスには放射性標識抗体（すなわち、ＭＮ１４−ＭＯＲＦ、ＭＮ１４−１１１Ｉｎと一緒に）を与えた。２日後、それらの動物にはＭＯＲＦ−９９ｍＴｃとのハイブリダイゼーションにより標識したＰＬ−ｃＭＯＲＦポリマーを与えた。ポリマーの投与後１８時間の時点に動物を犠牲にした。対照動物には抗体を与えなかったが、１８時間前に標識ポリマーのみを与えた。
【０１０３】
【表４】
【０１０４】
表３の生体内分布結果より、１１１Ｉｎ値を用いて腫瘍１ｇ当たりの抗体ＭＯＲＦ数を算出し、一方、対照動物の値を引いた試験動物の腫瘍の９９ｍＴｃ値を用いて抗体により特異的に局在化した腫瘍１ｇ当たりの多量体ｃＭＯＲＦ数を算出することができる。これらの計算から、この試験の条件下では、多量体ｃＭＯＲＦにより腫瘍内の抗体ＭＯＲＦの２５％が標的化されたということが分かる。この計算は、１つのポリマー分子が１つ以下の抗体分子と結合するということを前提としたものである。この仮定が間違っており、ポリマーが腫瘍にある抗体と架橋しているとすれば、上記の値は２５％よりも大きくなるであろう。ポリマーは腫瘍の複数の抗体分子と架橋することが可能である一方で、別の研究により、遊離状態にある（すなわち、ポリマーと結合していないために一価の）標識ｃＭＯＲＦによる腫瘍の抗体ＭＯＲＦとのハイブリダイゼーションが５０％にすぎないことが判明した（１０）。多量体ｃＭＯＲＦは遊離状態にあるｃＭＯＲＦよりも効果的に抗体ＭＯＲＦをターゲッティングするとは考えにくいため、架橋については、可能性は少ないが、仮にそれが起こったら、おそらく２つ以下の抗体分子と架橋することになると判断される。
【０１０５】
これまでのプレターゲッティング調査に関連して、この研究室は、ＬＳ１７４Ｔ腫瘍動物での同様の９９ｍＴｃおよび１１１Ｉｎ二重標識研究について報告しており、放射性標識ｃＭＯＲＦ（１０）に対する接近可能性を、腫瘍、肝臓および脾臓内にＭＮ１４−ＭＯＲＦが存在する時間の関数として推定した。これらの結果は、抗体投与の２４時間後に放射性標識ｃＭＯＲＦによる肝臓および脾臓内ＭＯＲＦへの接近が約６％未満に制限されることを示した。明らかに、抗体がこれらの器官に局在化すると、ＭＮ１４のＭＯＲＦは急速に大部分が「姿を消す」。幸いにも、これは接近可能性がずっと５０％を超えている腫瘍には当てはまらなかった。
【０１０６】
第二の研究では、ターゲッティングを同様に実施し、ＭＮ１４−ＭＯＲＦ(ここでは非標識のもの)２５μｇをＬＳ１７４Ｔ腫瘍マウスに投与し、その３０時間後にＰＬ−ｃＭＯＲＦポリマー（ここで、微量［３μＣｉ］ＭＯＲＦ−１１１Ｉｎにより放射性標識した）１５μｇを投与した。動物には、ポリマーの投与後４１時間の時点にＭＯＲＦ−９９ｍＴｃ １．５μｇ（約３００μＣｉ）を与え、３時間後にその動物を犠牲にした。標識ＭＯＲＦ用量は、適度に低いが十分な放射能を有し得るように選択した。対照に関しては、一動物セットにおいて抗体を排除し、別の動物セットでは抗体とポリマーの両方を排除した。
【０１０７】
増幅に関する第二の動物試験は、腫瘍内の多量体ｃＭＯＲＦが放射性標識ＭＯＲＦよって標的化される程度を評価する目的で設計した。従って、ＬＳ１７４Ｔ腫瘍を移植したヌードマウスに、まず、非標識抗体２５μｇを与え、３０時間後に、微量１１１Ｉｎ−ＭＯＲＦとのハイブリダイゼーションにより標識した３０ＫＤａ ＰＬ−ｃＭＯＲＦポリマー１５μｇを与えた。４１時間後、動物にＭＯＲＦ−９９ｍＴｃ １．５μｇを与え、３時間後（すなわち、抗体投与の７４時間後、１１１Ｉｎ−ポリマー投与の４４時間後）にその動物を犠牲にした。標識ＭＯＲＦ用量は、適度に低いがイメージングに十分な放射能を有し得るように選択した。対照に関しては、一動物セット（対照Ｉ）において抗体を排除し、別の動物セット（対照ＩＩ）では抗体とポリマーの両方を排除した。動物を犠牲にする前にイメージングした。生体内分布結果を表４に示している。
【０１０８】
【表５】
【０１０９】
腫瘍の９９ｍＴｃ値が抗体を含まない投与（群［１］対群［２］）に対して有意に高いことから、増幅ターゲッティングの特異性が示される。１１１Ｉｎ値より腫瘍１ｇ当たりの多量体ｃＭＯＲＦ数を算出し、一方、抗体を与えていない動物（群［２］）の値を引いた抗体を与えた試験動物（群［１］）の腫瘍の９９ｍＴｃ値を用いてＭＯＲＦ−９９ｍＴｃにより腫瘍内の多量体ｃＭＯＲＦの１２％が標的化されたと推算することができる。
【０１１０】
１１１Ｉｎおよび９９ｍＴｃの結果を用いて、ＰＬ−ｃＭＯＲＦポリマー投与の４４時間後に放射性標識ＭＯＲＦにより標的化された肝臓、脾臓および腎臓内の多量体ｃＭＯＲＦが１％未満であったと推算することもできる。肝臓および脾臓に運ばれた抗体のＭＯＲＦが急速に放射性標識ｃＭＯＲＦ（１０）から「姿を消す」ことが分かったと同時に、これらの最新の研究結果から多量体ｃＭＯＲＦも急速に放射性標識ＭＯＲＦから「姿を消す」ことが示される。幸いにも、この発現の消失現象も腫瘍においてはそれほど明らかではない。腫瘍においては、４０時間を越えても多量体ｃＭＯＲＦの１２％が標的化された。血液の値についても上記の計算を利用することができ、標識ＭＯＲＦにより循環中多量体ｃＭＯＲＦの約３０％が標的化されたことが示される。
【０１１１】
正常組織のポリマーが急速に失われることは、ポリマーを与えた場合と与えていない場合のＭＯＲＦ−９９ｍＴｃ値の表において比較することによっても分かる（群［２］対群［３］）。脾臓および血液を除き、それらの差に有意性はない。よって、またもや、ポリマーによってこれらの組織に運ばれたｃＭＯＲＦ発現が４１時間内に消失し、放射性標識ＭＯＲＦから効果的に姿を消すことがその証拠となる。抗体でのＭＯＲＦ発現およびポリマーでのｃＭＯＲＦ発現については、その結果として正常組織における放射能レベルが低下する。幸いにも、いずれの場合においても、この期間、腫瘍における接近可能性が顕著に維持された。
【０１１２】
第三の動物試験は、増幅を評価する目的で特別設計された。ヌードマウスに、まず、非標識抗体２５μｇを与え、３０時間後に、非標識の３０ＫＤａ ＰＬ−ｃＭＯＲＦポリマー１５μｇをマウスに投与した。ポリマーの投与後２１時間または４３時間の時点でのＭＯＲＦ−９９ｍＴｃ １．５μｇの投与の３時間後、動物を犠牲にした。対照動物には抗体を与えなかったか、または抗体もポリマーも与えなかった。さらなる対照（プレターゲッティング）として、動物にはポリマーを与えなかったが、ＭＮ１４−ＭＯＲＦ抗体、続いて、５１時間後にｃＭＯＲＦ−９９ｍＴｃを与えた。シリンジで慎重に膀胱から尿を吸引した後、動物をElscint APEX 409 M ラージビューガンマカメラ(Hackensack, NJ)でイメージングした。イメージング後、上記のように、動物を犠牲にし、解剖した。統計的有意性は、マイクロソフト社製エクセルによる両側分布および対応のある場合のスチューデントのｔ検定より決定した。
【０１１３】
第三の動物試験は、増幅を評価する目的で特別に計画したものである。従って、ＬＳ１７４Ｔ腫瘍を移植したヌードマウスに、まず、非標識抗体２５μｇを与え、３０時間後に、非標識の３０ＫＤａ ＰＬ−ｃＭＯＲＦポリマー１５μｇを与えた。次いで、動物に、ポリマー投与後２１時間（表５）または４３時間（表６）の時点にＭＯＲＦ−９９ｍＴｃ １５μｇを与え、３時間後、その動物を犠牲にした。対照動物には抗体を与えなかった（群［２］）か、または抗体もポリマーも与えなかった（群［３］）。さらなる対照（プレターゲッティング）として、動物にはポリマーを与えなかったが、ＭＮ１４−ＭＯＲＦ抗体、続いて、５１時間後にｃＭＯＲＦ−９９ｍＴｃを与えた（表５）。動物を犠牲にする前にイメージングした。
【０１１４】
【表６】
【０１１５】
【表７】
【０１１６】
ＭＯＲＦ−９９ｍＴｃとｃＭＯＲＦ−９９ｍＴｃのin vivo挙動が十分に類似しているとすれば、上記研究におけるプレターゲッティングに関するin vivo増幅倍率を推測することができる。従って、増幅研究群におけるＭＯＲＦ−９９ｍＴｃの腫瘍内絶対蓄積（０．６５％〜０．２４％）×１．５μｇは６．１５ｎｇであり、これに対し、プレターゲッティングによるｃＭＯＲＦ−９９ｍＴｃの蓄積（２．０３％〜０．１８％）×０．１５μｇは２．７８ｎｇである。この割合からプレターゲッティングに対する増幅倍率２．１が提供される。
【０１１７】
要するに、これらの結果は、in vivo 増幅ターゲッティングは実現可能であり、そしてそれが実現したということを証明するものである。これらの研究の条件下では、ＭＮ１４抗体を介して腫瘍に局在化したＭＯＲＦの約２５％が接近可能であり、それがＰＬ ｃＭＯＲＦポリマーにより標的化される。さらに、このように腫瘍に局在化したｃＭＯＲＦの約１２％が首尾よく、放射性標識ＭＯＲＦにより標的化される。各研究における腫瘍蓄積が対照より一貫して統計的に高いという点から増幅の概念実証は明らかである。標的における絶対蓄積に関し、同じく重要となるのが標的／正常組織比である。３種類の増幅研究各々に関する、各組織についてのこれらの比を算出することで、増幅ターゲッティングが、３５の評価のうち３３の評価にて、ポリマー単独の対照や放射性標識ｃＭＯＲＦ単独の対照よりも高い腫瘍／非標的比を提供することが示される。
【０１１８】
動物イメージング
図１は、各々が右大腿部にＬＳ１７４Ｔ腫瘍を有する２匹のヌードマウスの同時に得た全身画像である。両方の動物にＭＯＲＦ−９９ｍＴｃを与え（イメージングの３時間前）、その両方の動物にｃＭＯＲＦ−ポリマーを与えた（イメージングの４３時間前）。左の試験（増幅）動物のみＭＮ１４−ＭＯＲＦ抗体を与えた（イメージングの７３時間前）。
【０１１９】
図２は、各々が右大腿部にＬＳ１７４Ｔ腫瘍を有する３匹のヌードマウスの、図１と同じ条件下で同時に得た全身画像である。従って、左の動物にＭＯＲＦ−９９ｍＴｃのみを与え（イメージングの３時間前）、中央の動物にＭＯＲＦ−９９ｍＴｃとｃＭＯＲＦ−ポリマーを与え（イメージングの２１時間前）、また、右の試験動物（増幅）にＭＯＲＦ−９９ｍＴｃ、ｃＭＯＲＦ−ポリマーおよびＭＮ１４−ＭＯＲＦを与えた（イメージングの５１時間前）。抗体とポリマーの両方を与えた試験動物でのみ画像に腫瘍が示されている。
【０１２０】
本発明の産物、組成物、方法および工程に対して種々の修飾および変形を施し得ることは、当業者には明らかである。従って、このような修飾および変形が添付の請求項およびそれらの等価物の範囲にあるならば、本発明はそれらを包含するものとする。以上で引用した全ての公開物の開示内容は、各々が個々に引用することにより本明細書の一部とされるのと同じ程度で、それらの全開示内容が引用することにより明らかに本明細書の一部とされる。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】７３時間前にＭＯＲＦ−ＭＮ１４を与えたＬＳ１７４Ｔ腫瘍マウスへの９９ｍＴｃ−ＭＯＲＦ投与の３時間後およびＰＡ３０ＫＤａ−ｃＭＯＲＦ投与の４３時間後のそれらの動物の全身画像を同時に得た。左が試験動物、右がポリマーを与えたが抗体を与えなかった動物である。
【図２】５１時間前にＭＯＲＦ−ＭＮ１４を与えたＬＳ１７４Ｔ腫瘍マウスへの９９ｍＴｃ−ＭＯＲＦ投与の３時間後およびＰＡ３０ＫＤａ−ｃＭＯＲＦ投与の２１時間後のそれらの動物の全身画像を同時に得た。右が試験動物、中央がポリマーを与えたが抗体を与えなかった動物、そして左がポリマーも抗体も与えていない動物である。
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物において診断薬または治療薬を標的部位にターゲッティングするためのキット、ならびにポリマーと結合した一本鎖モルホリノオリゴマー相補対の複数のコピーを用いて病的状態を診断または治療するための方法に関する。
【発明の背景】
【０００２】
薬物標的研究の目的は、治療薬を標的とされる腫瘍部位に直接送達し、これらの部位においてより効果的な投薬を可能にし、それによって、非腫瘍関連副作用を低減して、それら治療薬の有効性を向上させることである。もう１つの目的は、標的部位での治療薬の完全な集積を実現し、それによって、標的／非標的比を高めることである。
【０００３】
選択的に局在させるためにターゲッティング部分と結合した診断薬または治療薬を含んでなる異なるターゲッティングベクターは以前から知られている。ターゲッティングベクターの例としては、抗体または抗体フラグメント、細胞特異的または組織特異的ペプチド、ホルモンおよび他の受容体結合分子のようなターゲッティング部分の診断薬または治療薬との複合体が挙げられる。例えば、罹患細胞および正常細胞と関連し、病原微生物とも関連する異なる決定因子に対する抗体が病態または病変の検出および治療に使用されている。これらの方法では、例えば、それらの全ての開示内容が引用することにより本明細書の一部とされる、Hansen et al., 米国特許第３，９２７，１９３号ならびにGoldenberg、米国特許第４，３３１，６４７号、同第４，３４８，３７６号、同第４，３６１，５４４号、同第４，４６８，４５７号、同第４，４４４，７４４号、同第４，４６０，４５９号、同第４，４６０，５６１号、同第４，６２４，８４６号および同第４，８１８，７０９号に記載のように、ターゲッティング抗体を好適な検出薬または治療薬と直接結合する。
【０００４】
直接ターゲッティング法において遭遇する問題の１つは、標的部位と実際に結合するのは比較的ごく一部の複合体であって、複合体の大部分が循環に留まり、標的化した複合体の機能を何らかの形で抑制していることである。他の問題としては、診断薬を投与した場合の高バックグラウンドおよび低解像度、ならびに治療薬を長時間循環する標的化部分と結合した場合の骨髄毒性または全身性副作用が挙げられる。
【０００５】
プレターゲッティング法は、検出薬または治療薬の標的：バックグラウンド比を高めることを目的に開発された。プレターゲッティングおよびビオチン／アビジンアプローチの例は、例えば、それらの全てが全開示内容が引用することにより本明細書の一部とされる、Goodwin et al., 米国特許第４，８６３，７１３号；Goodwin et al., J. Nucl. Med. 29: 226 (1988)；Hnatowich et al., J. Nucl. Med. 28: 1294 (1987)；0ehr et al., J. Nucl. Med. 29: 728 (1988)；Klibanov et al., J. Nucl. Med. 29: 1951 (1988)；Sinitsyn et al., J. Nucl. Med. 30: 66 (1989)；Kalofonos et al., J. Nucl. Med. 31 : 1791 (1990)；Schechter et al., Int. J. Cancer. 48: 167 (1991)；Paganelli et al., Cancer Res. 51: 5960 (1991)；Paganelli et al., Nucl. Med. Commun. 12: 211 (1991)；Stickney et al., Cancer Res. 51: 6650 (1991)；およびYuan et al., Cancer Res. 51: 3119 (1991)に記載されている。
【０００６】
プレターゲッティング法では、標的とする部位と結合する第一のターゲッティング部分と、続いて投与される第二の標的化種の結合に利用可能な結合部位とを含んでなる第一の標的化種（診断薬または治療薬と結合していない）がin vivo標的部位に向けられる。第一の標的化種が一度十分に集積したら、診断薬または治療薬と、第一の標的化種の利用可能な結合部位を認識する第二のターゲッティング部分とを含んでなる第二の標的化種を投与する。
【０００７】
プレターゲッティング方法論の実例が細胞傷害性放射性抗体を腫瘍に投与するためのビオチン−（ストレプト）アビジン系の使用である。第一の工程では、腫瘍関連抗原に対して向けられたモノクローナル抗体をアビジン（またはビオチン）と結合し、それを抗体により認識される腫瘍を有する患者に投与する。第二の工程では、その結合されたビオチン（またはアビジン）を介して、治療薬が腫瘍をプレターゲッティングした抗体−アビジン（または−ビオチン）複合体に取り込まれる。
【０００８】
しかしながら、プレターゲッティング時のビオチン−アビジンまたは（ストレプト）アビジン系の適用において問題が生じている。まず第一に、適切に構築されない限り、放射性標識ビオチンは血漿ビオチニダーゼ分解に付される。さらに、抗体と結合する場合には、ストレプト／アビジンおよびアビジンにより患者において抗ストレプト／アビジン抗体が生じる可能性がある。最後に、in vivoプレターゲッティング時の内因性ビオチンの潜在的影響によりビオチンの飽和を理由にビオチン結合発現の消失が起こる可能性がある。例えば、ヌードマウス異種移殖片に局在するあるストレプト／アビジン結合抗体がビオチン飽和状態になったときにこれが起こる。Rusckowski et al., Cancer 80: 2699-705 (1997)。ビオチン化モノクローナル抗体、アビジン、続いて、放射性標識ビオチンの投与を行う３段階戦略はこれらの欠点をある程度緩和するものであるが、この手法は画像法としては手間がかかると考えられており、さらに、この手法では免疫原性の問題が解決されない。
【０００９】
認識されているプレターゲッティング法のもう１つの例が、（ストレプト）アビジンとビオチンの代わりに放射性標識ハプテンと二重特異性抗体を使用する二重特異性抗体−ハプテン認識系の利用である。Barbet, J. et al. Cancer Biother. Radiopharm. 14: 153-166 (1999)；Karacay, H. et al., Bioconj. Chem. 11: 842-854 (2000)；Gautherot, E. et al., J Nucl. Med. 41: 480-487 (2000)；Lubic, S. P. et al., J. Nucl. Med. 42: 670-678 (2001)；Gestin, J. F. et al., J. Nucl. Med. 42: 146-153 (2001)。ハプテンは配位錯体であることが多く、例えば、インジウム−ＤＴＰＡがある。二重特異性抗体は、２種類の抗体または抗体フラグメントが独立した決定因子、ハプテンと癌胎児性抗原のような腫瘍マーカーと結合する産物である。このアプローチでは、二重特異性抗体を作製する必要性に加え、親和性が低いことが障害となっている。そのハプテン、特に一価のものに対する抗体の親和性は、ビオチンに対する（ストレプト）アビジンの親和性よりも桁違いに低い。数学モデリングでは、抗体とそのハプテンとの高親和性がプレターゲッティングを成功させる重要な決定因子であるということが示されている。Zhu, H. et al., J. Nucl Med. 39: 65-76 (1998)。
【００１０】
プレターゲッティング用のビオチン−アビジンおよび二重特異性抗体−ハプテン系に代わるものとして、ペプチド核酸（ＰＮＡ）のような一本鎖オリゴマーが使用されてきた。一本鎖オリゴマーはin vivoハイブリダイゼーションによりそれらの相補的一本鎖オリゴマーと特異的に結合する。ターゲッティング部分と結合した一本鎖ＰＮＡを最初に患者に投与し、続いて、診断薬で放射性標識化した一本鎖相補的ＰＮＡを投与する。この方法論の一例が、Rusckowski et al., Cancer 80: 2699-705 (1997)に記載されている。クリアリング剤の投与による２段階法に任意の中間工程を加えることもある。クリアリング剤の目的は、標的部位で結合していない循環する第一の複合体を除去することである。これについては、Griffiths et al.により、引用することにより本明細書の一部とされる米国特許第５，９５８，４０８号に開示されている。
【００１１】
ヌクレアーゼの安定性を向上させ、タンパク質結合親和性を低下させるには、通常、放射性ヌクレオチドと結合するこれらの一本鎖オリゴマーの主鎖への化学修飾が必要である。９９ｍＴｃでの標識を可能にする３つの異なる化学修飾がある１８マーのホスホロチオエートＤＮＡに及ぼす影響については、マウスにてin vitroおよびin vivoで比較されている。Zhang, Y. M. et al., Eur. J. Nucl. Med. 27: 1700-1707 (2000)。ハイブリダイゼーションでの結合速度定数が標識化法と無関係であることは判明しているが、培養下の細胞内蓄積と正常マウスにおける放射性標識の薬物動態学的挙動はいずれも、標識化法により強く影響を受けた。
【００１２】
オリゴマーのこれらのin vivo特性は、それらの鎖長および／または塩基配列の変化により影響を受けるかもしれない。考え得るところでは、鎖長および塩基配列の影響を理解すれば、それによって、オリゴマーの薬物動態を有効に修飾し得ると思われる。この可能性にもかかわらず（化学修飾の場合のように）、これらのさらなるに影響については、これまでほとんど全く未調査の状態であった。この原因は、１つには、適用によりこれらのパラメーターに課された制約にあるかもしれない。例えば、アンチセンス化学療法は、通常、短い単鎖オリゴマーをそのｍＲＮＡ標的のものと相補的な塩基配列とハイブリダイズすることにより効力を発揮すると思われる。Hnatowich, D. J., J. Nucl. Med. 40: 693-703 (1999)。このように、塩基配列と、ある程度、鎖長も所望のハイブリダイゼーションを提供するものに制限される。それにもかかわらず、注目を集めた塩基の組合せがある。一例がホスホジエステルまたはホスホロチオエートＤＮＡにおいて存在するＧカルテット（すなわち、１列に並んだ４つのグアニン塩基）である。Shafter, R. H. et al., Biopoly (Nucleic Acid Sci.) 56: 209-227 (2001)。少なくとも、これらの化学形態のＤＮＡの場合では、グアニン塩基のスタッキングにより特定の三次元４重構造を有するオリゴヌクレオチドが提供される。この構造が種々の生体内プロセスにとって重要な種々の配列特異的効果に関与することは明らかである。同文献。もう１つの例がシトシン塩基の直後にグアニンが続くＣｐＧモチーフであり、これは免疫賦活性を有することが分かっている。Zhao, Q. et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7: 495-502 (1997)。これらの配列が薬物動態に与える影響が少しでもあるとしたら、その影響はまだ確立されていない。
【００１３】
種々の他の公開報告では、オリゴマー鎖長および配列のin vitroでの影響に関してまとめられている。グアニン塩基とチミジン塩基で完全に構成されたホスホジエステルＤＮＡの一細胞系統における細胞毒性作用には少なくとも２０塩基の鎖長を必要とすることが分かった。また、その細胞毒性作用はアデニンまたはシトシンをいずれかの末端に導入することによって消失した。Morassutti, C. et al., Nucleosides & Nucleotides 18: 1711-1716 (1999)。ＰＮＡが細胞において転写および遺伝子発現を開始する効率は、鎖長１６〜１８塩基の場合に最適であることが分かった。Wang, G. et al., J. Mol. Biol. 313: 933-940 (2001)。ラット肝臓ホモジネートをex vivoにて使用して、鎖長および塩基配列の異なる一連のホスホロチオエートＤＮＡの代謝を調査した。Crooke, R. M. et al., J. Pharm. Exp.Therapeutics 292: 140-149 (2000)。最初に、全てのオリゴマーを３’エキソヌクレアーゼにより分解すると、鎖長が長くなるとともに代謝速度が上昇した。ピリミジンを多く含有するオリゴヌクレオチドがより不安定であるということから、ヌクレアーゼ代謝の速度と程度もまた塩基配列に関係していた。この特定調査は立体異性の影響も研究したという点で異例であった。あるジアステレオ異性体の代謝速度は他のものよりも迅速であり、それらの混合物の場合にはその間の速度で消化されることが判明した。最後に、最近の報告で、ＲＮＡにおけるホスホジエステル結合の反応性に及ぼす塩基配列の影響が記載されている。Kaukinen, U. et al., Nucl. Acids Res. 30: 468-474 (2002)。
【００１４】
本発明者らは、ホスホロジアミデートモルホリノ（ＭＯＲＦ）腫瘍イメージングおよび治療のようなオリゴマーの使用をこれまでに開示してきた。このような使用は、順に、２００１年３月３０日出願の米国仮出願番号６０／２７９，８０９および２００１年１２月２１日出願の同６０／３４１，７９４の優先権を主張する、２００２年４月１日出願の係属中の米国特許出願番号１０／１１２，０９４の係属中の一部継続出願に開示されている。これらの出願の明細書、特許請求の範囲および図面をはじめとする全開示内容は、それらの全開示内容が引用することにより本明細書の一部とされる。
【００１５】
天然ホスホジエステルＤＮＡは、非結合性酸素が硫黄原子で置換されているという点でホスホロチオエートとは異なっている。ＰＮＡの場合、ＤＮＡのリン酸主鎖が、窒素含有塩基がメチレンカルボニル基を介して結合される（２−アミノエチル）グリシンポリペプチド結合に置き換わり、その一方で、ＭＯＲＦのホスホジエステル主鎖がホスホロジアミデート基で置換されており、リボース糖がモルホリノ環に置き換わっている。ＤＮＡと同様に、ＭＯＲＦおよびＰＮＡは一般に市販されているが、ＤＮＡとは違って、それらはいずれも非荷電性であり、（ホスホジエステルＤＮＡとは違って）ヌクレアーゼに対して安定であり、（ホスホジチオエートとは違って）非キラルである。
【００１６】
増幅は、多段階プレターゲッティングプロセスであり、このプロセスはオリゴマーの複数のコピーと結合したポリマーの中間使用を通じて、ターゲッティングを大幅に向上させる可能性を有している。従って、腫瘍における放射活性の蓄積を大幅に増大させ、同時に、腫瘍／正常組織比を高める改善されたキットまたは方法が必要である。これにはまず、最後に抗体と結合させるＭＯＲＦポリマーを調製する必要がある。このような方法においては、抗体の著しい変性の回避だけはしたい。
【００１７】
増幅ターゲッティングに代わる１つの方法が（ストレプ）アビジン／ビオチン、二重特異性抗体またはオリゴマー対のいずれかを用いたプレターゲッティングである。最近、特に、二重特異性抗体(Karacay, H. et al., Bioconjug. Chem. 13: 1054-1070, 2002)およびオリゴマー(Liu, G. et al., J. Nucl. Med. 43: 384-391, 2002)を利用して有望な結果が報告されている。しかしながら、プレターゲッティングには多価ポリマーが関与しないため、増幅は（特定のストレプトアビジン／ビオチンプロトコールの場合最大４倍以外に）起こりえない(Kassis, A. I. et al., J. Nucl. Med. 37: 343-352, 1996)。
【００１８】
ホウ素中性子捕捉用のホウ素のような低分子量種(Novick, S. et al.,.Nucl. Met. Biol. 29: 159-67, 2002)または種々の用途に向けた金属キレート剤(Torchilin, V. P. et al, Hybridoma 6: 229-40, 1987)の複数のコピーと直接結合した抗腫瘍抗体についての数多くの報告がなされている。明白な不利益として、特に、比較的高分子量のＭＯＲＦの複数のコピーを結合することを目的とする場合には、結合した結果として抗体が変性する危険性がある。例えば、１分子あたり５０個のＭＯＲＦを保持するためには、ＩｇＧ抗体の分子量が約１５０ＫＤａから最小６００ＫＤａに上がるはずである。これらの条件下で免疫活性を保持することは不可能であろう。さらに、増幅ターゲッティングは、低分子量であることから、複数のＭＯＲＦとの結合を受け入れることができない抗腫瘍および抗組織ペプチドのような抗体以外の組織特異的な薬剤を用いても有効である。
【００１９】
ホスホジエステルの使用もホスホロモノチオエートの使用も、増幅ターゲッティングおよび他の放射性医薬品の適用に理想的とはいえない。前者はin vivoにてヌクレアーゼに対してあまりにも不安定であり、後者は血清および組織タンパク質に対してあまりにも高い親和性を示す(Hnatowich, D. J. et al., J. Pharmacol. Exp.Ther. 276: 326-334, 1996)。本発明者らは、その後、ＰＮＡが安定であり、最低タンパク質結合親和性を有することを示した(Mardirossian, G.et al., J. Nucl. Med. 38: 907-913, 1997)。それに応じ、本発明者らの第一の増幅ターゲッティング研究ではＰＮＡを使用した(Wang, Y. et al., Bioconjug. Chem. 12: 807-816, 2001)。しかしながら、選択塩基配列を有するＰＮＡの水溶解度が低いことから問題に遭遇した。結合に関する問題から、ＰＮＡ研究では抗腫瘍抗体を使用しなかった(Wang, Y. et al., 2001、上記)。場合により、水溶性がより高いことから、アミン誘導体化ＭＯＲＦを抗腫瘍抗体ＭＮ１４およびキレート化剤ＭＡＧ３の両方と結合させ、９９ｍＴｃでの放射性標識化に成功した。放射性標識およびＭＯＲＦは、タンパク質に対してほとんど親和性を示さず、in vitroおよびin vivoにて「安定」であることが判明し、それらは標識したＰＮＡと同様に、迅速なハイブリダイゼーションが可能である(Mang'era, K. et al., Eur. J. Nucl. Med. 28: 1682-1689, 2001)。
【００２０】
増幅ターゲッティングは、ＭＯＲＦ−抗体と放射性標識ＭＯＲＦ（プレターゲッティングの場合にはｃＭＯＲＦ）の両方を使用するプレターゲッティング（本明細書に記載）といくつかの類似点を共有しているが、ポリマーを中間使用する点で異なっている。増幅ターゲッティングはプレターゲッティングよりも明らかに複雑であるが、シグナル増幅の可能性がある。
【００２１】
増幅ターゲッティングの１つの重要な態様がin situ接近可能性である。腫瘍にて高放射能レベルを実現するためには、腫瘍における抗体のＭＯＲＦを多量体ｃＭＯＲＦに接近しやすくし、そして、腫瘍におけるポリマーのｃＭＯＲＦを放射性標識ＭＯＲＦに接近しやすくする必要がある。もう１つの重要な態様は、肝臓、脾臓、腎臓および他の正常な器官内での多量体ｃＭＯＲＦの蓄積によって起こる。これらの正常器官におけるバックグラウンド放射線レベルを低減するためには、多量体ｃＭＯＲＦの発現を迅速に放射性標識ＭＯＲＦに接近できない状態にすべきである。
【００２２】
ストレプト／アビジン−ビオチンおよび二重特異性抗体−ハプテン系に優るいくつかの利点にもかかわらず、プレターゲッティングにおいてこれらのオリゴマーを使用する場合にはいくつかの制限がある。これらの制限としては、特異性が乏しいこと、水溶液に不溶性である可能性があること、およびコストが高いことが挙げられる。
【００２３】
哺乳動物において標的部位に治療薬または診断薬を送達するためのin vivo ターゲッティングに用いる、より特異的で、手ごろで安価であり、標的への高い取り込みと正常組織内への低い取り込みを提供する、改善されたキットおよび方法が依然として必要とされている。また、癌細胞とは結合していない過剰の同位体標識オリゴマーが体内、とりわけ、腎臓から迅速に排除されるという改善されたプレターゲッティングキットおよび方法を提供する必要もある。
【発明の概要】
【００２４】
従って、本発明の１つの目的は、哺乳動物において診断薬または治療薬を増幅ターゲッティングするのに有用なキットおよび方法であって、比較的安価な出発原料から調製することが可能であり、さらに、従来のキットおよび方法ならびに他の公知のキットおよび方法よりも腎臓での取り込みおよび保持量が少なく、毒性が低く、特異性、安定性、予測可能なターゲッティングに優れ、かつ／または所望の抗原−抗体効果の高いキットおよび方法を提供することである。本発明のもう１つの目的は、ＭＯＲＦの複数のコピーを抗体と直接結合させ、そうすることによって、哺乳動物への第二の投与を回避することである。
【００２５】
もう１つの目的は、ストレプト／アビジン−ビオチン、ペプチド核酸および他のオリゴマーの代わりに、多価モルホリノオリゴマー（ＭＯＲＦ、下記に定義する）を使用する増幅ターゲッティングによる腫瘍局在／イメージングに有用な方法であって、放射性標識したターゲッティング部分を標的内の主たる標的特異的な結合部位に高度に蓄積させ、そうすることによって、腫瘍における放射活性の蓄積を大幅に増大させ、同時に、腫瘍／正常組織比を高めるという代替法を提供することである。
【００２６】
これらおよび他の目的は、本発明の１つの実施態様によれば、哺乳動物において診断薬または治療薬をターゲッティングするためのキットであって、
（Ａ）標的部位の主要な標的特異的な結合部位、または標的部位により生成される物質もしくは標的部位と関連する物質と選択的に結合するターゲッティング部分と、モルホリノオリゴマーとを含んでなる第一の複合体、
（Ｂ）所望により、クリアリング剤、
（Ｃ）ポリマーと結合した相補的モルホリノオリゴマーの複数のコピーと診断薬または治療薬とを含んでなる第二の複合体、および
（Ｄ）モルホリノオリゴマーと放射性標識とを含んでなる第三の複合体
を含んでなるキットの提供により実現する。
【００２７】
工程（ａ）のターゲッティング部分は、好ましくは、抗体、特に、ヒト化抗体またはヒト化抗体の抗原結合フラグメントを含んでなる。このようなヒト化抗体の１つが抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ）抗体である。ターゲッティング部分は、タンパク質、小ペプチド、ポリペプチド、酵素、ホルモン、ステロイド、サイトカイン、神経伝達物質、オリゴマー、ビタミンおよび受容体結合分子からなる群から選択される。
【００２８】
工程（ｃ）のポリマーとしては、限定されるものではないが、ポリ−リジン（ＰＬ）、ポリエチルビニルエーテルマレイン酸（ＰＡ）デキストラン、デンドリマーおよびＮ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）が挙げられる。
【００２９】
本発明のもう１つの態様によれば、モルホリノオリゴマーとその相補的モルホリノオリゴマーの長さが少なくとも約６塩基〜約１００塩基である、上記のようなキットが提供される。加えて、モルホリノオリゴマーおよびその相補的モルホリノオリゴマーは１５マー、１８マーまたは２５マーであってもよい。標的部分が１５マー、１８マーまたは２５マーモルホリノオリゴマーと結合する。
【００３０】
好ましい実施態様では、クリアリング剤は、抗イディオタイプ抗体または抗原結合抗体フラグメントである。
【００３１】
もう１つの好ましい実施態様では、治療薬は、抗体、抗体フラグメント、薬物、毒素、ヌクレアーゼ、ホルモン、免疫調節物質、キレート化剤、ホウ素化合物、光活性物質または色素および放射性核種からなる群から選択される。
【００３２】
さらにもう１つの好ましい実施態様では、診断薬は、放射性核種、色素、造影剤、蛍光化合物または分子および磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）に有用な増強剤からなる群から選択される。
【００３３】
本発明によれば、哺乳動物において診断薬または治療薬を標的部位に送達するためのターゲッティング方法であって、
（ａ）前記哺乳動物に、標的部位の主要な標的特異的な結合部位、または標的部位により生成される物質もしくは標的部位と関連する物質と選択的に結合するターゲッティング部分と、モルホリノオリゴマーとを含んでなる第一の複合体を投与すること、
（ｂ）所望により、前記哺乳動物にクリアリング剤を投与し、前記クリアリング剤によって局在していない第一の複合体を循環から排除すること、および
（ｃ）前記哺乳動物に、相補的モルホリノオリゴマーの複数のコピーと結合したポリマーと、診断薬または治療薬とを含んでなる第二の複合体を投与すること（この際、前記相補的モルホリノオリゴマー−ポリマー複合体が第一の複合体のそのモルホリノオリゴマー相補体と結合することによって、診断薬または治療薬を標的部位にターゲッティングする）、および、
（ｄ）前記哺乳動物に、モルホリノオリゴマーと放射性標識とを含んでなる第三の複合体を投与すること
を含んでなる方法が提供される。
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明および添付の特許請求の範囲から明らかになる。
【発明の具体的説明】
【００３４】
特に断りのない限り、単数形で示される用語は１以上のものを意味する。
【００３５】
本発明は、哺乳動物（好ましくは、ヒト）において診断薬または治療薬をin vivoターゲッティングするのに有用なキットおよび方法であって、
（Ａ）標的部位の主要な標的特異的な結合部位、または標的部位により生成される物質もしくは標的部位と関連する物質と選択的に結合するターゲッティング部分と、モルホリノオリゴマーとを含んでなる第一の複合体、
（Ｂ）所望により、クリアリング剤、
（Ｃ）ポリマーと結合した相補的モルホリノオリゴマーの複数のコピーと、診断薬または治療薬とを含んでなる第二の複合体、および
（Ｄ）モルホリノオリゴマーと放射性標識とを含んでなる第三の複合体
を含んでなるキットおよび方法を提供する。
【００３６】
ターゲッティング部分は、例えば、抗体または抗原結合抗体フラグメントであってよい。特異性が高いことからモノクローナル抗体（Ｍａｂ）が好ましい。これらは免疫原性抗原調製物での哺乳動物の免疫化、免疫リンパまたは脾臓細胞と不死化骨髄腫細胞系との融合および特定のハイブリドーマクローンの単離からなる従来の手順と考えられている方法により容易に調製される。主として、抗体の抗原特異性が本発明におけるそれらの有用性に影響を及ぼすことから、種間融合および遺伝子工学による超可変領域の操作のようなより斬新なモノクローナル抗体調製方法もまた意図される。当然のことではあるが、モノクローナル、例えば、ヒトモノクローナル、種間モノクローナル、キメラ（例えば、ヒト／マウス）モノクローナル、遺伝子組換え抗体などを製造するための最新の技術を使用することもできる。
【００３７】
本発明において有用な抗体フラグメントとしては、ハイブリッドフラグメントを含むＦ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖなどが挙げられる。好ましいフラグメントはＦａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）２である。同様に、免疫グロブリンの、抗原と結合する超可変領域を保有し、かつ、Ｆａｂ’フラグメント以下の大きさを有するいかなるサブフラグメントも有用である。これには、単鎖または複数鎖を問わず、抗原結合部位を組み入れているか、そうでなければin vivoにて天然免疫グロブリンフラグメントと実質的に同じようにターゲッティングビヒクルとして機能する遺伝子操作した抗体およびタンパク質または組換え型抗体およびタンパク質が含まれる。このような単鎖結合分子については、引用することにより本明細書の一部とされる、米国特許第４，９４６，７７８号に開示されている。
【００３８】
Ｆａｂ’フラグメントは、便宜には、還元条件下での無傷免疫グロブリンのペプシン消化によるか、または完全免疫グロブリンの慎重なパパイン消化によって生じるＦ（ａｂ’）２フラグメントの切断によって作製し得るＦ（ａｂ’）２フラグメントの還元切断により作製してもよい。また、遺伝子工学によってそのフラグメントを作製してもよい。
【００３９】
さらに、少なくとも６０％の癌細胞により生成されるか、またはその癌細胞と関連するマーカー物質に対する特異的な免疫反応性を有する抗体および３５％未満の他の抗原または非標的物質に対する交差反応性を有する抗体も好ましい。腫瘍により生成されるか、またはは腫瘍と関連する抗原と結合させることにより腫瘍部位に特異的にターゲッティングモノクローナル抗体が特に好ましい。
【００４０】
腫瘍抗原に対する抗体については公知である。例えば、腫瘍により生成されるか、あるいは腫瘍と関連するマーカーと特異的に結合する抗体および抗体フラグメントは、とりわけ、それらの全ての開示内容が引用することにより本明細書の一部とされる、Hansen et al., 米国特許第３，９２７，１９３号ならびにGoldenbergの米国特許第４，３３１，６４７号、同第４，３４８，３７６号、同第４，３６１，５４４号、同第４，４６８，４５７号、同第４，４４４，７４４号、同第４，８１８，７０９号および同第４，６２４，８４６号に開示されている。特に、抗原、例えば、胃腸腫瘍、肺腫瘍、乳房腫瘍、前立腺腫瘍、卵巣腫瘍、精巣腫瘍、脳腫瘍もしくはリンパ腺腫瘍、肉腫または黒色腫に対する抗体を使用することが有利である。
【００４１】
本発明のターゲッティング部分の他の標的としては、限定されるものではないが、Ｂ細胞抗原、Ｔ細胞抗原、形質細胞抗原、ＨＬＡ−ＤＲ系統抗原、ＣＥＡ、ＮＣＡ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３およびＭＵＣ４抗原、ＥＧＰ−１抗原、ＥＧＰ−２抗原、胎盤アルカリ性ホスファターゼ抗原、ＩＬ−６、ＶＥＧＦ、テネイシン、ＣＤ３３、ＣＤ７４、ＰＳＭＡ、ＰＳＡ、ＰＡＰ、自己免疫疾患、感染／炎症および感染症と関連する抗原が挙げられる。標的がＢ細胞もしくはＴ細胞リンパ腫と関連するか、または自己免疫疾患と関連するＢ細胞もしくはＴ細胞と関連する標的抗原である場合もある。標的がＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ４０、ＣＤ７４、ＣＥＡ、ＮＣＡ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２、ＩＬ−１５および悪性疾患によって発現されるＨＬＡ−ＤＲからなる群から選択される抗原である場合もある。標的は、例えば、特定の悪性疾患に関するＥＧＰ−２、ＥＧＰ−１、ＣＤ２２、ＣＥＡまたはＭＵＣ１である。
【００４２】
標的は、細菌、ウイルス、真菌、寄生生物または他の微生物によって発現される可能性がある。
【００４３】
また、標的は、感染部位にて増大する、活性化された顆粒球のような宿主細胞によって発現される可能性もある（例えば、ＣＤ１５、ＣＤ３３、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６６ｃ（ＮＣＡ）およびＣＤ６６ｅ他）。
【００４４】
本発明の方法において有用な抗体および抗原結合抗体フラグメントは、当技術分野で公知の種々の化学的結合方法により結合対のメンバーと結合させてもよい。これらの方法の多くは、それらの全ての開示内容が引用することにより本明細書の一部とされる、上記の米国特許および特許出願に開示されている。Childs et al., J. Nuc. Med. 26: 293 (1985)も参照のこと。
【００４５】
本発明において有用な１つのモノクローナル抗体が、ＣＥＡに対して第一世代型ＮＰ−４よりも１０倍高い親和性を有する第二世代ＣＥＡ−抗体であるＭＮ−１４である。Hansen et al., Cancer 71: 3478-85, (1993)。ＭＮ−１４はゆっくりと取り込まれ、これによりターゲッティングアプローチに好適なものとなる。これはキメラ化され、ヒト化されている。Leung et al., 米国特許第５，８７４，５４０号。
【００４６】
本発明において好適な他の抗体または抗体フラグメントは、悪性疾患にターゲッティングする場合には、例えば、ＲＳ１１、１７−１Ａ、ＲＳ７、ＬＬ１、ＬＬ２、ＭＮ−３、ＭＮ−１４もしくはＰＡＭ４またはそのヒト化型であってもよいし、あるいは、ＲＳ１１、１７−１Ａ、ＲＳ７、ＬＬ１、ＬＬ２、ＭＮ−３、ＭＮ−１４もしくはＰＡＭ４またはそのヒト化型から誘導したものであってもよい。好適な顆粒球抗体はLeukoScan（登録商標）で使用されるＭＮ３である。
【００４７】
本発明において有用な他のターゲッティング部分が、標的部位により生成されるか、あるいは標的部位と関連するマーカー物質と優先的に結合する、タンパク質、小ペプチド、ポリペプチド、酵素、ホルモン、ステロイド、サイトカイン、神経伝達物質、オリゴマー、ビタミンおよび受容体結合分子からなる群から選択される非抗体種であってもよい。
【００４８】
モルホリノオリゴマー（本明細書では「モルホリノ」または「ＭＯＲＦ」）は選択されたＲＮＡ配列と結合し、不活性化する。これらのオリゴマーは、六員のモルホリン環に連結された、その各々が４種の遺伝子塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、ＴまたはＵ）のうちの１つを含有する４つの異なるモルホリノサブユニットで構成されている。１５〜２５マーの場合、非イオン性ホスホロジアミデートサブユニット間結合によってこれらのサブユニットが特定の順序で結びつき、モルホリノオリゴマーが生じる。これらはＤＮＡ、ＲＮＡおよびイオン結合により結びついた五員のリボースまたはデオキシリボース主鎖部分を有するそれらの類似体よりも優れたアンチセンス特性を提供し得る。モルホリノに関するSummertonの研究については、それらの開示内容が引用することにより本明細書の一部とされる、米国特許第５，１４２，０４７号および同第５，１８５，４４４号に開示されている。モルホリノは、Gene Tools, LLC,. Corvallis, Oregonより市販されている。
【００４９】
それらは標的へと容易に送達されるため、モルホリノは遺伝学研究および薬剤標的実証プログラム向けの効果的なツールである。それらはヌクレアーゼに完全に耐性である。よりリジッドなＭＯＲＦ主鎖は、二本鎖形成時に、ペプチド主鎖または一般的な糖骨格に比べて優れた接近性を提供し得る。ＰＮＡと比べると、モルホリノはより安価であり、水溶液溶解度はより高く、それによれば予測可能なターゲッティングにより優れ、ＲＮＡ結合親和性の効果がより高い。
【００５０】
本発明においては、ターゲッティング抗体と結合したモルホリノオリゴマー（本明細書ではＭＯＲＦ）は、診断薬または治療薬と結合した相補的ＭＯＲＦ（本明細書ではｃＭＯＲＦ）とin vivoにてハイブリダイズされる。好ましい実施態様では、ＭＯＲＦおよびその相補的モルホリノ（ｃＭＯＲＦ）の長さは６塩基〜約１００塩基であり、例えば、ＭＯＲＦ１５およびｃＭＯＲＦ１５（１５マー）、ＭＯＲＦ１８およびｃＭＯＲＦ１８（１８マー）またはＭＯＲＦ２５およびｃＭＯＲＦ２５（２５マー）である。
【００５１】
本発明で使用するＭＯＲＦとしては、１５マー（５’相当ＴＧＴ−ＡＣＧ−ＴＣＡ−ＣＡＡ−ＣＴＡ−リンカー−アミン（本明細書ではＭＯＲＦ１５）とＴＡＧ−ＴＴＧ−ＴＧＡ−ＣＧＴ−ＡＣＡ−リンカー−アミン（本明細書では相補的ＭＯＲＦ１５またはｃＭＯＲＦ１５））、１８マー（５’相当ＣＧＧ−ＴＧＴ−ＡＣＧ−ＴＣＡ−ＣＡＡ−ＣＴＡ−リンカー−アミン（本明細書ではＭＯＲＦ１８）とＴＡＧ−ＴＴＧ−ＴＧＡ−ＣＧＴ−ＡＣＡ−ＣＣＣ−リンカー−アミン（本明細書では相補的ＭＯＲＦ１８またはｃＭＯＲＦ１８））および２５マー（５’相当Ｔ−ＧＧＴ−ＧＧＴ−ＧＧＧ−ＴＧＴ−ＡＣＧ−ＴＣＡ−ＣＡＡ−ＣＴＡ−リンカー−アミン（本明細書ではＭＯＲＦ２５）とＴＡＧ−ＴＴＧ−ＴＧＡ−ＣＧＴ−ＡＣＡ−ＣＣＣ−ＡＣＣ−ＡＣＣ−Ａ−リンカー−アミン（本明細書では相補的ＭＯＲＦ２５またはｃＭＯＲＦ２５））が挙げられる。
【００５２】
本発明で使用するモルホリノオリゴ構造(Summerton and Weller, Antisense Nucl. Acid Drug Dev. 7: 187-95, 1997)を以下に示す：
【化１】
【００５３】
本発明に従って、当技術分野で公知のクリアリング剤を使用してもよい。例えば、第一の複合体がアビジンまたはストレプトアビジンを含んでなる場合には、クリアリング剤としてビオチンを使用することができる。また、第一の複合体がビオチンを含んでなる場合には、クリアリング剤としてアビジンまたはストレプトアビジンを使用することができる。
【００５４】
好ましい実施態様では、クリアリング剤が、抗体、抗原結合抗体フラグメントまたは非抗体標的化部分であるターゲッティング部分の結合部位と結合する抗体である。より好ましい方法では、米国出願番号０８／４８６，１６６に記載のように、クリアリング剤は、第一の工程で使用する複合体のモノクローナル抗体に対する抗イディオタイプであるモノクローナル抗体である。もう１つの好ましい実施態様では、クリアリング剤をガラクトースのような炭水化物の複数の残基で置換し、そうすることによって、クリアリング剤が肝臓にあるアシアロ糖タンパク質受容体により循環から迅速に排除されるようにしている。
【００５５】
標的化種の生理溶液は、有利には、定量、例えば、単位用量約１．０〜５００ｍｇ標的化種／バイアルにて滅菌バイアルに入れられる。このバイアルは栓をし、密閉し、低温保存されるか、または凍結乾燥させ、栓をし、密閉し、保存される。
【００５６】
これらの処方物の変形および改変は当業者ならば、哺乳動物または治療計画それぞれの要求、ならびに、放射性同位元素を供給する形態または放射性同位元素の入手可能な形態のバリエーションに応じて容易に理解できる。
【００５７】
投与経路としては、静脈内、動脈内、胸膜腔内、腹腔内、くも膜下腔内、皮下投与または灌流による投与が挙げられる。
【００５８】
腫瘍または心血管病変（血塊、塞栓、梗塞など）、感染症、炎症性疾患および自己免疫疾患のような他の病変の体内検出または治療に有用な方法については、それらの開示内容が引用することにより本明細書の一部とされる、米国特許第４，７８２，８４０号、第４，９３２，４１２号および第５，７１６，５９５号に開示されている。これらの参考文献に開示されている方法を補強するために本発明の方法を使用してもよい。また、本発明は術中探針、内視鏡および腹腔鏡を併用して実施してもよいし、正常な器官をイメージングするための方法により実施してもよい。本発明の方法を当業者には明らかな他の方法で使用することもできる。
【００５９】
治療薬の例としては、抗体、抗体フラグメント、薬物、毒素、ヌクレアーゼ、ホルモン、免疫調節物質、キレート化剤、ホウ素化合物、光活性物質または色素および放射性核種が挙げられる。
【００６０】
さらに好ましい実施態様では、ｃＭＯＲＦを二官能性キレート化剤と結合させ、その後、そのキレート化剤を同位元素で放射性標識する。厳しい状況に耐えることのできないタンパク質、ポリペプチドまたはオリゴヌクレオチドでは、それらとの結合の前に、まず、キレート化剤を放射性標識化する（結合前標識）。キレート化剤の例としては、ヒドラジノニコチンアミド（ＨＹＮＩＣ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、１，４，７，１０−テトラアザ−シクロドデカンＮ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）およびメルカプトアセチルグリシルグリ−シルグリシン（ＭＡＧ３）が挙げられる。本発明で使用する好ましい二官能性キレート化剤は、アセチル−Ｓ−保護メルカプトアセチルトリグリシン（ＮＨＳ−ＭＡＧ３）のＮ−ヒドロキシスクシンイミジル誘導体である。ＮＨＳ−ＭＡＧ３は、Winnard, P. et al., Nucl. Med. Biol. 24: 425-32 (1997)の方法に従って合成される。一本鎖モルホリノオリゴマーのＮＨＳ−ＭＡＧ３との結合は、Mardirossian, G. et al., J. Nucl. Med. 38: 907-13 (1997)に記載のように実施した。
【００６１】
増幅ターゲッティングの１つの重要な態様がin situ接近可能性である。腫瘍にて高放射能レベルを実現するためには、腫瘍における抗体のＭＯＲＦを多量体ｃＭＯＲＦに接近しやすくし、そして、腫瘍におけるポリマーのｃＭＯＲＦを放射性標識ＭＯＲＦに接近しやすくする必要がある。もう１つの重要な態様は、肝臓、脾臓、腎臓および他の正常な器官内での多量体ｃＭＯＲＦの蓄積によって起こる。これらの正常器官におけるバックグラウンド放射線レベルを低減するためには、多量体ｃＭＯＲＦの発現を迅速に放射性標識ＭＯＲＦに接近できない状態にすべきである。
【００６２】
本発明のポリマーは、以下の特性を有するべきものである：（１）無毒であること；（２）適当な分子量を有し、市販されていること；（３）ｃＭＯＲＦとの結合が実現可能であること；（４）必要数のｃＭＯＲＦが結合しているポリマーを通じて接近可能であること；（５）結合したポリマーが十分な水溶性を有し、血中濃度が適度に持続するその薬物動態が有利であること；（６）ポリマーの抗体とのハイブリダイゼーションによって腫瘍への取込みを促進しないこと；および（７）正常組織においてｃＭＯＲＦ発現が消失するように、ポリマーがこれらの正常組織で代謝し、腫瘍においてポリマーが効果的に拡散すること。好ましくは、ポリマーは、上記特性全てを有するポリ−リジン（ＰＬ）およびポリエチルビニルエーテルマレイン酸（ＰＡ）である。他の好ましいポリマーとしては、限定されるものではないが、デキストラン、デンドリマーおよびＮ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）が挙げられる。これらのポリマー各々が以下に示した有用な分子量を有する種類のものとして商業的に入手可能であり、各々水溶性を有し、各々ｃＭＯＲＦと容易に結合することからそれらを選択した。さらに、ＰＬおよびＰＡの両方を使用することに成功した。デンドリマーは非線形ポリマーを評価する機会を提供する。デキストランは５０年以上にわたって、血漿量の増加に、末梢血流の促進に、そして、抗血栓薬として実際の臨床に用いられてきた(Thoren, 1981; Mehvar, 2000)。また、特に、増幅に関連して投与される低用量でのＰＬおよびデンドリマーの安全性は証明されている(Malik, 2000)。
【００６３】
【表１】
【００６４】
本発明者らがこれまでのＰＮＡ研究で使用したポリマーは、最初の分子量が８０ＫＤａであり、１分子当たり約９００個のカルボキシル基を有するポリメチルビニルエーテルマレイン酸（ＰＡ）であった(Wang, Y. et al., Bioconjug. Chem. 12: 807-816, 2001)。各分子を平均８０個のＰＮＡ（各々が１９メンバーポリエーテルポリアミドリンカーを有する）で修飾した。ＰＮＡの水溶解度に制限があるため、ポリマーが平均２００個のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基とも結合される場合を除き、ＰＡポリマーは好ましくない薬物動態（すなわち、肝臓濃度が高く、血中濃度が低い）を示した。結果として、ＰＥＧにより、７０％を上回るものに関して最終的なポリマーの分子量が１．４ＭＤａまで増加した。分子量がこの程度まで増加することにより、腫瘍への拡散および浸透が制限されることが予想される。そうとはいえ、ＰＮＡ研究の最も有望な態様は接近可能性であった。溶液中の放射性標識ｃＰＮＡにはＰＡにおけるＰＮＡの７５％が接近可能であり、（ビーズに）固定化されている場合でさえ、ＰＡにおけるＰＮＡの３５〜５８％がなお接近可能であった(Wang et al., 2001、上記)。
【００６５】
ＰＮＡに対し、ＭＯＲＦを使用するとポリマーの合成が簡易化され、より広範な種類のポリマーの選択が提供された。並行した調査では、必要なカルボキシル基を提供するために完全にスクシニル化した、最初の分子量の異なる３種類のポリリジン（ＰＬ）を合成し、試験した（非公開の所見）。さらに、これまでにＰＮＡとともに使用したものと類似したＰＡの最終分子量が、１分子当たりの接近可能なオリゴマーの数がほんの少し少ない場合の１．４ＭＤａに対し、約０．４ＭＤａであるようにＰＥＧを含まないＰＡも調べた。正常マウスの生体内分布では、ＰＮＡに対し、ほとんど同じ条件下でＭＯＲＦと結合させた場合、ＰＡの肝臓濃度は約半分であり、血中濃度は４倍であることから、ＰＮＡより優れたＭＯＲＦの利点が示された。これらの結果は、さらに、試験した他の３種類のポリマーよりも血中濃度が高く、肝臓濃度か低い３０ＫＤａのＰＬがin vivo研究に適していることも示唆した。こういうわけで、本明細書にて記載するin vivo研究では３０ＫＤａのＰＬポリマーを使用した。しかしながら、このポリマーは１分子当たり１２〜１５個のｃＭＯＲＦしか有していなかった。これに対し、in vitro研究用に選択したより大きな１００ＫＤａのＰＬポリマーは１分子当たり３５〜４０個のｃＭＯＲＦを有していた。
【００６６】
組織培養による腫瘍細胞蓄積試験は、動物試験を実施するよりもずっと簡単であり、クリアランスによる濃度の低減を受けない。そのため、このような試験が増幅戦略の有用な予備試験となり得る。それでもなお、組織培養試験は表１にて示されるように、腫瘍動物試験と同様に非特異的蓄積が伴うため、対照を使用する必要がある。組織培養での非特異的細胞蓄積をなくすことにより、プレターゲッティングに比べて６倍の特異的蓄積の増大が実現した。
【００６７】
動物試験は、明らかに、組織培養試験に比べて、より現実的でより厳しい増幅ターゲッティング試験を提供する。最初の２つの動物試験は、腫瘍内の抗体およびポリマーを定量する目的で設計した。二重放射能標識を使用することにより、この調査条件下では、約２日間で腫瘍内の抗体ＭＯＲＦの約２５％が多量体ｃＭＯＲＦにより標的化され、３時間後に腫瘍内のこれらの多量体ｃＭＯＲＦの１２％が放射性標識ＭＯＲＦにより標的化されることが予測できた。この研究室によるＰＮＡに関するこれまでの研究では抗腫瘍抗体を使用しなかったため、２５％の値とは比べものにならない。しかしながら、腫瘍における多量体オリゴマーの１２％の接近可能性は、これまでに判明した３５〜６０％の接近可能性よりも低い(Wang, Y. et al., 2001、上記)。この違いに関しては考えられる理由が多くあり、それらの理由としては、異なるポリマー主鎖の使用（すなわち、ＰＡ対ＰＬ）、大きさの異なるポリマーの使用（最初のＭｒ ８０ＫＤａ対３０ＫＤａ）、異なるオリゴマーの使用（すなわち、ＰＮＡ対ＭＯＲＦ）、異なるリンカーの使用（すなわち、１９メンバーポリエーテルポリアミド対９メンバースクシニル化ピペリジン）、異なる腫瘍モデルの使用（すなわち、ＡＣＨＮ対ＬＳ１７４Ｔ）およびポリマーの投与と放射性標識の投与間に要する時間を変えたこと（すなわち、３時間対１８時間）が挙げられる。最も有力な理由は異なる局在化機構を利用したことであろう。ＰＮＡポリマーは非特異的拡散により腫瘍に局在化し、そのため、間質液中におそらく遊離していたであろうが、ＭＯＲＦポリマーはおそらく腫瘍細胞表面にあるその抗体標的に固定されていたであろう。溶液中の両ポリマーの接近可能性がｃＭＯＲＦポリマーでは５０％に対し、ｃＰＮＡポリマーでは７０％である(Wang, Y. et al., 2001、上記)ということでほぼ一致していることからもこの可能性は支持される。
【００６８】
全ての動物試験で、試験動物と対照動物間で統計的に有意に高い値を一貫して示す唯一の組織が腫瘍であった。血液は試験動物で有意に高い場合が多いが、これはＭＯＲＦ−９９ｍＴｃ投与時に循環中（および組織中）に残留している抗体およびポリマーがハイブリダイズし、放射性標識ＭＯＲＦを保持しているものと考えられる。クリアリング剤の使用が有用であろう(Lubic, S. P. et al., J. Nucl. Med. 42: 670-678, 2001)。
【００６９】
最後に、増幅ターゲッティング概念実証は、in vivoにて存在する蓄積に対する障害やクリアランスとターゲッティングとの競合にもかかわらず、腫瘍内のＭＮ１４におけるＭＯＲＦをｃＭＯＲＦポリマーにより、そして、腫瘍内のポリマーにおけるｃＭＯＲＦを放射性標識ＭＯＲＦにより効果的にターゲッティングすることが可能であるということにより明示された。腫瘍における放射能蓄積はプレターゲッティングに比べて倍以上（すなわち、増幅倍率２．１）であった。さらに、（抗体における）ＭＯＲＦ発現および（ポリマーにおける）ｃＭＯＲＦ発現は肝臓、脾臓および腎臓のような正常な器官では急速に消失したが、腫瘍では消失せず、標的／非標的比が高まった。抗体を、平均してたった０．２個のＭＯＲＦと、１分子当たり１５個のｃＭＯＲＦしか有していない、おそらくあまり理想的ではないポリマーであるものと結合したにもかかわらず、これらの結果が得られた。さらに、クリアリング剤は使用しなかった。
【００７０】
治療薬として有用な、β線放射により実質的に崩壊する放射性核種としては、限定されるものではないが、Ｐ−３２、Ｐ−３３、Ｓｃ−４７、Ｆｅ−５９、Ｃｕ−６４、Ｃｕ−６７、Ｓｅ−７５、Ａｓ−７７、Ｓｒ−８９、Ｙ−９０、Ｍｏ−９９、Ｒｈ−１０５、Ｐｄ−１０９，Ａｇ−１１１、Ｉ−１２５、Ｉ−１３１、Ｐｒ−１４２、Ｐｒ−１４３、Ｐｍ−１４９、Ｓｍ−１５３，Ｔｂ−１６１、Ｈｏ−１６６、Ｅｒ−１６９、Ｌｕ−１７７、Ｒｅ−１８６、Ｒｅ−１８８、Ｒｅ−１８９、Ｉｒ−１９４、Ａｕ−１９８、Ａｕ−１９９、Ｐｂ−２１１、Ｐｂ−２１２およびＢｉ−２１３が挙げられる。有用なβ線放射核種の最大崩壊エネルギーは、好ましくは、２０〜５，０００ｋｅＶであり、より好ましくは、１００〜４，０００ｋｅＶであり、最も好ましくは、５００〜２，５００ｋｅＶである。
【００７１】
治療薬として有用な、オージェ放射粒子により実質的に崩壊する放射性核種としては、限定されるものではないが、Ｃｏ−５８、Ｇａ−６７、Ｂｒ−８０ｍ、Ｔｃ−９９ｍ、Ｒｈ−１０３ｍ、Ｐｔ−１０９、Ｉｎ−１１１、Ｓｂ−１１９、Ｉ−１２５、Ｈｏ−１６１、Ｏｓ−１８９ｍおよびＩｒ−１９２が挙げられる。これらの放射性核種の最大崩壊エネルギーは、好ましくは、１，０００ｋｅＶ未満であり、より好ましくは、１００ｋｅＶ未満であり、最も好ましくは、７０ｋｅＶ未満である。
【００７２】
治療薬として有用な、α粒子を生じることにより実質的に崩壊する放射性核種としては、限定されるものではないが、Ｄｙ−１５２、Ａｔ−２１１、Ｂｉ−２１２、Ｒａ−２２３、Ｒｎ−２１９、Ｐｏ−２１５、Ｂｉ−２１１、Ａｃ−２２５、Ｆｒ−２２１、Ａｔ−２１７、Ｂｉ−２１３およびＦｍ−２５５が挙げられる。有用なα線放射核種の崩壊エネルギーは、好ましくは、２，０００〜９，０００ｋｅＶであり、より好ましくは、３，０００〜８，０００ｋｅＶであり、最も好ましくは、４，０００〜７，０００ｋｅＶである。
【００７３】
光線力学療法の一部として有用な、錯体としての金属としては、限定されるものではないが、亜鉛、アルミニウム、ガリウム、ルテチウムおよびパラジウムが挙げられる。
【００７４】
中性子捕捉法に基づく治療法に有用な放射性核種としては、限定されるものではないが、Ｂ−１０、Ｇｄ−１５５７およびＵ−２３５が挙げられる。
【００７５】
有用な診断薬としては、限定されるものではないが、放射性核種、色素（例えば、ビオチン−ストレプトアビジン複合体の使用）、造影剤、蛍光化合物または分子および磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）に用いる増強剤（例えば、常磁性イオン）が挙げられる。米国特許第６，３３１，１７５号では、ＭＲＩ法およびＭＲＩ増強剤と結合した抗体の調製について記載されており、これはその全開示内容が引用することにより本明細書の一部とされる。好ましくは、診断薬が放射性核種、磁気共鳴画像法で用いる増強剤および蛍光化合物からなる群から選択される。
【００７６】
陽電子放射型断層撮影法で用いる診断薬として有用な放射性核種としては、限定されるものではないが、Ｆ−１８、Ｍｎ−５１、Ｍｎ−５２ｍ、Ｆｅ−５２、Ｃｏ−５５、Ｃｕ−６２、Ｃｕ−６４、Ｇａ−６８、Ａｓ−７２、Ｂｒ−７５、Ｂｒ−７６、Ｒｂ−８２ｍ、Ｓｒ−８３、Ｙ−８６、Ｚｒ−８９、Ｔｃ−９４ｍ、Ｉｎ−１１０、Ｉ−１２０およびＩ−１２４が挙げられる。有用な陽電子放出核種の全崩壊エネルギーは、好ましくは、２，０００ｋｅＶ未満であり、より好ましくは、１，０００ｋｅＶ未満であり、最も好ましくは、７００ｋｅＶ未満である。
【００７７】
磁気共鳴画像法を利用する場合の診断薬に有用な金属としては、限定されるものではないが、カドリニウム、マンガン、鉄、クロム、銅、コバルト、ニッケル、ジスプロシウム、レニウム、ユーロピウム、テルビウム、ホルミウムおよびネオジムが挙げられる。
【００７８】
γ線検出を利用する場合の診断薬として有用な放射性核種としては、限定されるものではないが、Ｃｒ−５１、Ｃｏ−５７、Ｃｏ−５８、Ｆｅ−５９、Ｃｕ−６７、Ｇａ−６７、Ｓｅ−７５、Ｒｕ−９７、Ｔｃ−９９ｍ、Ｉｎ−１１１、Ｉｎ−１１４ｍ、Ｉ−１２３、Ｉ−１２５、Ｉ−１３１、Ｙｂ−１６９、Ｈｇ−１９７およびＴＩ−２０１が挙げられる。有用なγ線放射核種の崩壊エネルギーは、好ましくは、２０〜２０００ｋｅＶであり、より好ましくは、６０〜６００ｋｅＶであり、最も好ましくは、１００〜３００ｋｅＶである。
【００７９】
以下、本発明の実施態様を、本発明の態様を詳細に示す実施例により説明する。これらの実施例は、本発明の特定の要素を例示するものであり、その範囲を制限するものではない。
【実施例】
【００８０】
材料および方法
９メンバースクシニル化ピペリジンリンカーを介して３’−アミンを有する２５マーＭＯＲＦおよびｃＭＯＲＦを購入した(Gene Tools, Corvallis, OR)。これらはこれまでに本発明者らが使用したものと同じものであった(Liu, G. et al., Quart. J. Nucl. Med. 46: 233-43, 2002)。高親和性ネズミ抗ＣＥＡ抗体（ＭＮ１４，ＩｇＧ１サブタイプ、Ｍｒ １６０ＫＤａ）は、Immunomedics(Morris Plains, NJ)から入手した。平均Ｍｒ約３０ＫＤａおよび１００ＫＤａを有する、均一にスクシニル化されたポリ−リジンをSigma-Aldrich, St Louis, MOから購入した。塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）は、Pierce Company, Rockford, IL製のものであった。
【００８１】
Winnard, P. et al., Nucl. Med. Biol. 24: 425-32 (1997)の方法に従って二官能性キレート化剤、アセチル−Ｓ−保護メルカプトアセチル−トリグリシン（ＮＨＳ−ＭＡＧ３）のＮ−ヒドロキシスクシンイミジル誘導体を合成した。元素分析、陽子ＮＭＲおよび質量分析によりこの構造を確認した。０．２２５Ｍ水酸化ナトリウム０．９７ｍｌに、トリグリシン５０ｍｇ（２６４μｍｏｌ）および新たに調製した５０ｍＭエチレントリアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）二ナトリウム１０μｌを添加した。この溶液を０．２μｍフィルターに通してアミン含有粒子を除去した。ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ；モレキュラーシーブスで乾燥させた）３４０μｌ中Ｓ−アセチルチオグリコール酸Ｎ−ヒドロスクシンイミドエステル（ＳＡＴＡ）９０ｍｇ（３９０μｍｏｌ）の溶液を調製し、その溶液をトリグリシン攪拌溶液に滴下した。室温にて１５分間攪拌した後、６Ｍ塩酸３７．６μｌを添加して、非水溶液の見かけのｐＨ８．９から見かけのｐＨ約２．７（ガラス電極−ｐＨメーターで測定）に調整した。最初のｐＨ約８．９は、トリグリシンのアミンを脱プロトン化するがＳＡＴＡのアセチル基が加水分解する強塩基性ｐＨ値には達しないように選択した（ｐＫ７．９; Fasman, G. D. [ed.] 1976, CRC Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, Third Edition, Vol. I, p 321, CRC Press, Boca Raton, FL）。アセチル基の加水分解を最小限に抑えるためにできるだけ早くｐＨを下げた。
【００８２】
乾燥ＤＭＦ３．６ｍｌ中ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）６０ｍｇ（２９０μｍｏｌ）の溶液をトリグリシン／ＳＡＴＡ攪拌溶液に迅速に添加した（見かけのｐＨ約５．０）。ジシクロヘキシル尿素が沈殿し始めたため、この溶液は２分で混濁状態となった。この反応物を暗室で室温にて２〜４時間攪拌した後、さらに１時間−２０℃に冷却し、完全沈降を促した。４℃、２５００ｇにて１５分間遠心分離した後、清澄な上清を除去した。
【００８３】
ＤＭＦ溶液中には水が存在するため、この形態のＮＨＳ−ＭＡＧ３調製物の使用は調製の２４時間以内とした。長期保存する場合には、ＮＨＳ−ＭＡＧ３水／ＤＭＦ溶液をロータリーフラッシュエバポレーター(Rotavapur-R, Buchi, Switzerland)により１５〜３０分でほとんど蒸発乾固させた後、凍結乾燥機(Virtis, Gardenier, NY)により１時間内に凍結乾燥させた。ＮＨＳ−ＭＡＧ３は、このように乾燥させた後、デシケーターに入れて室温にて無期限に保存することができる。複合体形成用に乾燥粉末にしたＮＨＳ−ＭＡＧ３を使用する場合、任意値５０重量％をその純度と見なした。
【００８４】
サイズ排除（ＳＥ）ＨＰＬＣ分析をSuperdex ペプチドカラム（最適分離範囲１×１０２〜７×１０３Ｄａ、Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）により、溶離剤として０．１０ｍｏｌ／Ｌリン酸バッファー、ｐＨ ７．０を流速０．６ｍＬ／分にて用いて実施した。２６０ｎｍでのインラインＵＶ吸光度および放射能検出器を利用して、ピーク画分を特定し、定量した。放射能の回収率を通常通り測定した。
【００８５】
試薬用ＤＴＰＡ環状無水物およびカルボニルジイミダゾールは、Sigma-Aldrich(St Louis, MO)製のものであり、そのまま使用した。Ｐ４樹脂（バイオゲル Ｐ４ゲル、培地）は、Bio-Rad Laboratories, Hercules, CAから購入した。セファデックスＧ１００樹脂は、Pharmacia Biotech Uppsala, Swedenから入手した。９９ｍＴｃ−過テクネチウム酸塩は、９９Ｍｏ−９９ｍＴｃジェネレーター(Bristol-Myers Squibb Medical Imaging, Billerica, MA)から溶出した。１１１Ｉｎは、塩化物として購入した(PerkinElmer Life Science Inc., Boston, MA)。他の全ての化学薬品は試薬用のものであり、さらなる精製は行わずに使用した。
【００８６】
ＭＮ１４−ＭＯＲＦ、ＭＮ１４−ＤＴＰＡ、ＭＯＲＦ−ＭＡＧ３、ＭＯＲＦ−ＤＴＰＡの調製と放射性標識化
ＭＮ１４のＭＯＲＦとの複合体形成は、Liu et al.によってこれまでに記載されている(J. Nucl. Med. 43: 384-391, 2002)ように、ＥＤＣを用いてアミン誘導体化ＭＯＲＦを天然抗体と反応させ、その後、セファデックスＧ−１００により、０．０５Ｍリン酸バッファー、ｐＨ７．２を用いて精製を行うことにより実施した。ＭＯＲＦ結合抗体は、ＨＰＬＣにより、２６５ｎｍおよび２８０ｎｍでの示差的ＵＶ法を利用して、濃度と１抗体分子当たりの平均ＭＯＲＦ数（１分子当たりの基）について特徴づけた(Liu et al., Quart. J. Nucl. Med. 46: 233-43, 2002)。ＭＮ１４−ＤＴＰＡおよびＭＯＲＦ−ＤＴＰＡは、記載されている(Liu et al., Nucl. Med. Comm., in press, 2003)ように、ＤＴＰＡ環状無水物を用いて調製した。複合体化したＤＴＰＡと遊離ＤＴＰＡの両方に対し、１１１Ｉｎの接近可能性が同じであるとし、精製前に混合物を１１１Ｉｎで標識することにより１ＭＮ１４当たりの平均ＤＴＰＡ基数を測定した。ＭＯＲＦ−ＭＡＧ３−９９ｍＴｃは、これまでに記載されている(Liu et al., Quart. J. Nucl. Med. 46: 233-43, 2002)ように、調製し、分析した。放射性標識化は、まず、９９ｍＴｃ過テクネチウム酸塩ジェネレーター溶出物を、ＭＯＲＦ−ＭＡＧ３またはｃＭＯＲＦ−ＭＡＧ３（０．１μｇ／μｌを上回る濃度）（５〜１０μｌ）、０．２５Ｍ酢酸アンモニウムバッファー、ｐＨ５．２（２５μＬ）、ｐＨ ９．２酒石酸塩溶液（５０μｇ酒石酸ナトリウム二水和物／μｌ）（１０μｌ）、および塩化スズ溶液（１０ｍＭ ＨＣｌ １μｌ中塩化スズ二水和物１μｇおよびアスコルビン酸ナトリウム１μｇ）（４μｌ）の溶液に添加し、その後、その溶液を沸騰水中で約２０分間加熱することにより実施した。生成物をＰ４カラムにより、溶離剤として０．０５Ｍリン酸バッファー、ｐＨ７．２を用いて精製した。ＭＯＲＦ−１１１Ｉｎは、ＭＯＲＦ−ＤＴＰＡを１１１Ｉｎとともに室温にて１時間インキュベートすることにより調製し、その後、ＭＯＲＦ−９９ｍＴｃに関して以上で記載しているように精製を行った。標識ＭＯＲＦおよび標識ｃＭＯＲＦの両方をサイズ排除ＨＰＬＣにより通常通り分析したところ、ＵＶおよび放射能検出の両方により本質的に同じクロマトグラフが得られることが分かった。
【００８７】
ＰＬ−ｃＭＯＲＦの調製と放射性標識化
最初のＭｒ３０ＫＤａ（動物試験）または１００ＫＤａ（組織培養試験）を有する、均一にスクシニル化されたポリリジンポリマー（ＰＬ）１０ミリグラムを非プロトン性溶媒Ｎ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）１．０ｍｌに溶解し、これに１，１’−カルボニルジイミダゾール２０．４ｍｇおよびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）３．０μｌを添加した。この混合物を室温にて２時間インキュベートした。ＮＭＰ中２．０ｍｇ／ｍｌ ｃＭＯＲＦ溶液５００μｌに、計画した量の活性化ＰＬ混合物と等モルのＤＩＥＡを添加すると、ｃＭＯＲＦ対ＰＬのモル比１００：１に達した。この溶液を室温にて一晩インキュベートした。
【００８８】
精製に先立ち、１アリコートの溶液をサイズ排除ＨＰＬＣにより、２６５ｎｍでのＵＶ検出を利用して分析し、各ＰＬ分子と結合した平均ｃＭＯＲＦ基数を推測した。２６５ｎｍではＰＬは感知できるほど吸収しないため、遊離状態にある結合していないｃＭＯＲＦとＰＬと結合したｃＭＯＲＦのピーク面積を比較した。１分子当たりの平均基数を推測する別法として、トレーサー濃度の放射性標識ＭＯＲＦを別の１アリコートのＰＬ−ｃＭＯＲＦ溶液にも添加し、遊離状態にある結合していないｃＭＯＲＦとハイブリダイズされたＭＯＲＦ−９９ｍＴｃの放射能をＰＬと結合したｃＭＯＲＦとハイブリダイズされたものの放射能と比較した。次いで、ＰＬ−ｃＭＯＲＦ複合体を、１ｃｍ×３０ｃｍセファデックスＧ１００カラムでのオープンカラムゲル濾過クロマトグラフィーにより、溶離剤として水を用いて精製した。回収した画分中のｃＭＯＲＦに関するＰＬ−ｃＭＯＲＦの濃度は、製造業者により提供されるｃＭＯＲＦのモル吸光度を利用して、ＵＶ吸光度により推測した。
【００８９】
ＰＬ−ｃＭＯＲＦは、各ポリマーにおける平均してわずか約１個のｃＭＯＲＦがＭＯＲＦとハイブリダイズされるように、微量のＭＯＲＦ−９９ｍＴｃまたはＭＯＲＦ−１１１Ｉｎとともに室温にて３０分間インキュベートすることにより放射性標識化した。品質保証は、放射能回収率が通常通りモニタリングされるサイズ排除ＨＰＬＣクロマトグラフィーに基づき、通常通り実施した。
【００９０】
ＵＶ ＨＰＬＣクロマトグラムと標準曲線の傾き（８）を利用して、この調査で使用した２つのＭＮ１４−ＭＯＲＦ調製物に関する１ＭＮ１４分子あたりの平均ＭＯＲＦを、０．０９（組織培養試験）および０．２０（動物試験）と算出した。ＭＮ１４−ＭＯＲＦのＨＰＬＣラジオクロマトグラムは、新たに調製し、精製した際には突出した１つのピークを示したが、保存した際には遊離型ＭＯＲＦピークの形跡を示した。この調査では新たに調製した合成抗体だけを使用した。精製前にＭＮ１４−ＤＴＰＡに付けた１１１Ｉｎ標識のＨＰＬＣラジオクロマトグラフを利用して、平均０．７個のＤＴＰＡ基が各ＭＮ１４抗体と結合したと算定した。
【００９１】
この調査で使用した９９ｍＴｃ標識化手法は、通常のＨＰＬＣ分析では全ての分析において回収率が９０％を上回ることから示されるように、常に、精製後の放射化学的純度が９０％を上回る標識ＭＯＲＦを提供する手法であった。放射性標識ｃＭＯＲＦが、抗体もしくはポリマーと結合しているか、または磁性ビーズ上に固定化されているＭＯＲＦとハイブリダイズ可能であることが通常通り示された(Liu, G. et al., J. Nucl. Med. 43: 384-391, 2002; Mang'era, K. et al., Eur. J. Nucl. Med., 28: 1682-1689, 2001)。
【００９２】
ＵＶ吸光度を利用したサイズ排除ＨＰＬＣ分析により、および微量ＭＯＲＦ−９９ｍＴｃの添加前後の、結合したが未精製のＰＬ−ｃＭＯＲＦポリマーのサイズ排除ＨＰＬＣ分析により、３０ＫＤａ ＰＬポリマーは１分子当たり平均１２〜１５個のｃＭＯＲＦ基と結合しており、一方、１００ＫＤａ ＰＬポリマーは１分子当たり平均３５〜４０個の基と結合していると推測した。１分子当たりの基を測定する２通りの方法では、８０〜９０％の一致を示した。最終的な分子量を、各々、１３０〜１６０ＫＤａおよび４００〜４４０ＫＤａと推測した。精製した両ポリマーのＨＰＬＣ分析では、単一ピークを示し、その回収率は９０％を上回った。
【００９３】
組織培養試験
ＬＳ１７４Ｔ細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１００ｍｇ／ｍｌのペニシリン−ストレプトマイシン(Gibco BRL Products, Gaithersburg, MD)を添加した、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１．５ｍｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、０．１ｍＭ非必須アミノ酸および１．０ｍＭピルビン酸ナトリウムを含有する最少必須培地(ＭＥＭ、Gibco BRL Products, Gaithersburg, MD)で増殖させた。細胞を通常、Ｔ７５フラスコ(Falcon, Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ)内にて加湿５％二酸化炭素雰囲気中、単層として維持した。取り込み試験では、細胞を８０〜９０％集密状態で、Ｔ７５フラスコ内にて０．０５％トリプシン／０．０２％ＥＤＴＡを用いてトリプシン化した後、１０％ＦＢＳを含有するＭＥＭで所望の密度、通常、０．１ｍｌ中１〜２×１０６細胞まで懸濁した。抗体に暴露した細胞を０．２ｍｌダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ、Gibco BRL Products, Gaithersburg, MD)中ＭＮ１４−ｃＭＯＲＦ ２０μｇとともに培養し、４℃にて１時間後、細胞懸濁液を２０００ｒｐｍにて４分間遠心分離し、細胞を各回ＰＢＳ ０．５ｍｌで３回洗浄した（抗体内在化の可能性を最小限に抑えるために培養は４℃にて行った）。ポリマーを与えた細胞を１００ＫＤａ ＰＬ−ｃＭＯＲＦ １０μｇとともに４℃にて１時間培養し、上記のように遠心分離し、３回洗浄した。全ての細胞にＭＯＲＦ−９９ｍＴｃ ０．６０μｇまたはｃＭＯＲＦ−９９ｍＴｃ ０．２７μｇを与えた。室温にて３０分間培養した後、細胞を上記のように遠心分離し、３回洗浄し、細胞ペレットを放射性標識培養液標準に対し、ＮａＩ（Ｔｌ）ウェルカウンターで計数した。
【００９４】
表１では、組織培養試験に関する５群を記載している。増幅群に属する細胞には抗体、１００ＫＤａ ＰＬポリマーおよび放射性標識ＭＯＲＦを与えた。残る４群は対照とした。プレターゲッティング対照群に属する細胞には抗体および放射性標識ｃＭＯＲＦだけを与え、ポリマー単独の対照群に属する細胞にはポリマーおよび放射性標識ＭＯＲＦだけを与え、９９ｍＴｃ単独の対照群ＩおよびIIに属する細胞には各々、標識ｃＭＯＲＦおよびＭＯＲＦだけを与えた。表内の最後の２列は細胞内に蓄積した（ｃ）ＭＯＲＦの平均添加放射能率およびモルを示している。
【００９５】
【表２】
【００９６】
９９ｍＴｃ単独の対照群ＩおよびIIの結果では、標識（ｃ）ＭＯＲＦが細胞内に非特異的に蓄積することが示されているため、プレターゲッティング群の値から０．０３０ピコモルを差し引き、ポリマー単独群および増幅群の値からは０．０５２ピコモルを差し引いた。さらに、ポリマー単独群の結果では、ポリマーも細胞内に非特異的に蓄積することが示されているため、増幅群における蓄積は、さらに１．１８ピコモル低いものであった。その結果、０．４１ピコモルというこの値をプレターゲッティングの０．０６７ピコモルと比較して増幅倍率６を得た。
【００９７】
動物試験
マサチューセッツ医科大学（University of Massachusetts Medical School）（ＵＭＭＳ）動物実験委員会(Institutional Animal Care and Use Committee)の承認を得て、全ての動物試験を実施した。ヌードマウス(NIH Swiss、Taconic Farms, Germantown, NY, ３０〜４０ｇ)各々に１０６ＬＳ１７４Ｔ結腸腫瘍細胞を含有する懸濁液０．１ｍｌを左大腿部に皮下注射した。腫瘍の大きさが１．５ｃｍ以下である１４日後に動物を使用した。
【００９８】
ＭＮ１４−ＭＯＲＦ抗体および３０ＫＤａ ＰＬポリマーの最適用量を推算するため、腫瘍動物に１分子当たり平均０．２個のＭＯＲＦと結合したＭＮ１４（最初の推定として）６０μｇおよび約２．０μＣｉの１１１Ｉｎで放射性標識したＭＮ１４−ＤＴＰＡ３μｇを投与し、２日後、２４〜７６μｇ／動物の３用量にて９９ｍＴｃ標識ポリマーを投与した。これらの結果に基づいて、その後の動物試験には２５μｇ用量のＭＮ１４−ＭＯＲＦおよび１５μｇ用量のポリマーを選択した。
【００９９】
増幅に関する動物試験に先立ち、抗体およびポリマー用量が腫瘍蓄積に及ぼす影響を確立した。腫瘍動物に１１１Ｉｎ標識ＭＯＲＦ抗体（最初の推定として）６０μｇを投与し、２日後、、２４〜７６μｇ／動物の３用量にて９９ｍＴｃ標識３０ＫＤａ ＰＬポリマーを投与した。各対照動物には、ポリマー２４μｇを与えたが抗体は与えなかった。９９ｍＴｃ生体内分布結果を表２に示しているが、その結果は用量が低下するとポリマーの腫瘍蓄積が増加することを示している。１１１Ｉｎ結果（示していない）から、抗体６０μｇの腫瘍内蓄積が、ＭＮ１４−ＭＯＲＦ ２４μｇに関して以下に示したもの（表２）と統計的に同じであることがわかる。よって、増幅に関する全ての動物試験では、ポリマー１５μｇをＭＮ１４−ＭＯＲＦ２５μｇとともに使用した。この表およびその後の表における統計的有意性は、マイクロソフト社製エクセルによる両側分布および対応のある場合のスチューデントのｔ検定により決定したものである。統計的に有意な値（すなわち、ｐ＜０．０５）には下線を施している。
【０１００】
【表３】
【０１０１】
最初の研究では、ＭＮ１４−ＭＯＲＦ ２５μｇをＭＮ１４−１１１Ｉｎ ３μｇ（２．０μＣｉ）と混合し、ヌードマウスにそれらを同時に与えた。約３０時間後、それらの動物には、ポリマーの１２〜１５個のｃＭＯＲＦのうち平均約１個だけ占有するＭＯＲＦ−９９ｍＴｃとのハイブリダイゼーションにより標識した３０ＫＤａ ＰＬ−ｃＭＯＲＦポリマー１５μｇ（２５０μＣｉ）を与えた。対照動物には抗体および／またはポリマーを与えなかった。ポリマーの投与後１８時間の時点に麻酔下、心臓穿刺により動物を犠牲にした。自動ガンマカウンター(Cobra II, Packard Instrument Company, Downers Grove, IL)により１１１Ｉｎおよび９９ｍＴｃを同時計数するため、器官および血液を採取した。全てのカウントを物理的崩壊および９９ｍＴｃウィンドウにおける１１１Ｉｎ活性のわずかな寄与に対して補正した。結果を１グラムあたりの注入量に対する割合として示している。
【０１０２】
増幅に関する第一の動物試験は、腫瘍内の抗体ＭＯＲＦが多量体ｃＭＯＲＦによって標的化される程度を評価する目的で計画されたものである。従って、ＬＳ１７４Ｔ腫瘍を移植したヌードマウスには放射性標識抗体（すなわち、ＭＮ１４−ＭＯＲＦ、ＭＮ１４−１１１Ｉｎと一緒に）を与えた。２日後、それらの動物にはＭＯＲＦ−９９ｍＴｃとのハイブリダイゼーションにより標識したＰＬ−ｃＭＯＲＦポリマーを与えた。ポリマーの投与後１８時間の時点に動物を犠牲にした。対照動物には抗体を与えなかったが、１８時間前に標識ポリマーのみを与えた。
【０１０３】
【表４】
【０１０４】
表３の生体内分布結果より、１１１Ｉｎ値を用いて腫瘍１ｇ当たりの抗体ＭＯＲＦ数を算出し、一方、対照動物の値を引いた試験動物の腫瘍の９９ｍＴｃ値を用いて抗体により特異的に局在化した腫瘍１ｇ当たりの多量体ｃＭＯＲＦ数を算出することができる。これらの計算から、この試験の条件下では、多量体ｃＭＯＲＦにより腫瘍内の抗体ＭＯＲＦの２５％が標的化されたということが分かる。この計算は、１つのポリマー分子が１つ以下の抗体分子と結合するということを前提としたものである。この仮定が間違っており、ポリマーが腫瘍にある抗体と架橋しているとすれば、上記の値は２５％よりも大きくなるであろう。ポリマーは腫瘍の複数の抗体分子と架橋することが可能である一方で、別の研究により、遊離状態にある（すなわち、ポリマーと結合していないために一価の）標識ｃＭＯＲＦによる腫瘍の抗体ＭＯＲＦとのハイブリダイゼーションが５０％にすぎないことが判明した（１０）。多量体ｃＭＯＲＦは遊離状態にあるｃＭＯＲＦよりも効果的に抗体ＭＯＲＦをターゲッティングするとは考えにくいため、架橋については、可能性は少ないが、仮にそれが起こったら、おそらく２つ以下の抗体分子と架橋することになると判断される。
【０１０５】
これまでのプレターゲッティング調査に関連して、この研究室は、ＬＳ１７４Ｔ腫瘍動物での同様の９９ｍＴｃおよび１１１Ｉｎ二重標識研究について報告しており、放射性標識ｃＭＯＲＦ（１０）に対する接近可能性を、腫瘍、肝臓および脾臓内にＭＮ１４−ＭＯＲＦが存在する時間の関数として推定した。これらの結果は、抗体投与の２４時間後に放射性標識ｃＭＯＲＦによる肝臓および脾臓内ＭＯＲＦへの接近が約６％未満に制限されることを示した。明らかに、抗体がこれらの器官に局在化すると、ＭＮ１４のＭＯＲＦは急速に大部分が「姿を消す」。幸いにも、これは接近可能性がずっと５０％を超えている腫瘍には当てはまらなかった。
【０１０６】
第二の研究では、ターゲッティングを同様に実施し、ＭＮ１４−ＭＯＲＦ(ここでは非標識のもの)２５μｇをＬＳ１７４Ｔ腫瘍マウスに投与し、その３０時間後にＰＬ−ｃＭＯＲＦポリマー（ここで、微量［３μＣｉ］ＭＯＲＦ−１１１Ｉｎにより放射性標識した）１５μｇを投与した。動物には、ポリマーの投与後４１時間の時点にＭＯＲＦ−９９ｍＴｃ １．５μｇ（約３００μＣｉ）を与え、３時間後にその動物を犠牲にした。標識ＭＯＲＦ用量は、適度に低いが十分な放射能を有し得るように選択した。対照に関しては、一動物セットにおいて抗体を排除し、別の動物セットでは抗体とポリマーの両方を排除した。
【０１０７】
増幅に関する第二の動物試験は、腫瘍内の多量体ｃＭＯＲＦが放射性標識ＭＯＲＦよって標的化される程度を評価する目的で設計した。従って、ＬＳ１７４Ｔ腫瘍を移植したヌードマウスに、まず、非標識抗体２５μｇを与え、３０時間後に、微量１１１Ｉｎ−ＭＯＲＦとのハイブリダイゼーションにより標識した３０ＫＤａ ＰＬ−ｃＭＯＲＦポリマー１５μｇを与えた。４１時間後、動物にＭＯＲＦ−９９ｍＴｃ １．５μｇを与え、３時間後（すなわち、抗体投与の７４時間後、１１１Ｉｎ−ポリマー投与の４４時間後）にその動物を犠牲にした。標識ＭＯＲＦ用量は、適度に低いがイメージングに十分な放射能を有し得るように選択した。対照に関しては、一動物セット（対照Ｉ）において抗体を排除し、別の動物セット（対照ＩＩ）では抗体とポリマーの両方を排除した。動物を犠牲にする前にイメージングした。生体内分布結果を表４に示している。
【０１０８】
【表５】
【０１０９】
腫瘍の９９ｍＴｃ値が抗体を含まない投与（群［１］対群［２］）に対して有意に高いことから、増幅ターゲッティングの特異性が示される。１１１Ｉｎ値より腫瘍１ｇ当たりの多量体ｃＭＯＲＦ数を算出し、一方、抗体を与えていない動物（群［２］）の値を引いた抗体を与えた試験動物（群［１］）の腫瘍の９９ｍＴｃ値を用いてＭＯＲＦ−９９ｍＴｃにより腫瘍内の多量体ｃＭＯＲＦの１２％が標的化されたと推算することができる。
【０１１０】
１１１Ｉｎおよび９９ｍＴｃの結果を用いて、ＰＬ−ｃＭＯＲＦポリマー投与の４４時間後に放射性標識ＭＯＲＦにより標的化された肝臓、脾臓および腎臓内の多量体ｃＭＯＲＦが１％未満であったと推算することもできる。肝臓および脾臓に運ばれた抗体のＭＯＲＦが急速に放射性標識ｃＭＯＲＦ（１０）から「姿を消す」ことが分かったと同時に、これらの最新の研究結果から多量体ｃＭＯＲＦも急速に放射性標識ＭＯＲＦから「姿を消す」ことが示される。幸いにも、この発現の消失現象も腫瘍においてはそれほど明らかではない。腫瘍においては、４０時間を越えても多量体ｃＭＯＲＦの１２％が標的化された。血液の値についても上記の計算を利用することができ、標識ＭＯＲＦにより循環中多量体ｃＭＯＲＦの約３０％が標的化されたことが示される。
【０１１１】
正常組織のポリマーが急速に失われることは、ポリマーを与えた場合と与えていない場合のＭＯＲＦ−９９ｍＴｃ値の表において比較することによっても分かる（群［２］対群［３］）。脾臓および血液を除き、それらの差に有意性はない。よって、またもや、ポリマーによってこれらの組織に運ばれたｃＭＯＲＦ発現が４１時間内に消失し、放射性標識ＭＯＲＦから効果的に姿を消すことがその証拠となる。抗体でのＭＯＲＦ発現およびポリマーでのｃＭＯＲＦ発現については、その結果として正常組織における放射能レベルが低下する。幸いにも、いずれの場合においても、この期間、腫瘍における接近可能性が顕著に維持された。
【０１１２】
第三の動物試験は、増幅を評価する目的で特別設計された。ヌードマウスに、まず、非標識抗体２５μｇを与え、３０時間後に、非標識の３０ＫＤａ ＰＬ−ｃＭＯＲＦポリマー１５μｇをマウスに投与した。ポリマーの投与後２１時間または４３時間の時点でのＭＯＲＦ−９９ｍＴｃ １．５μｇの投与の３時間後、動物を犠牲にした。対照動物には抗体を与えなかったか、または抗体もポリマーも与えなかった。さらなる対照（プレターゲッティング）として、動物にはポリマーを与えなかったが、ＭＮ１４−ＭＯＲＦ抗体、続いて、５１時間後にｃＭＯＲＦ−９９ｍＴｃを与えた。シリンジで慎重に膀胱から尿を吸引した後、動物をElscint APEX 409 M ラージビューガンマカメラ(Hackensack, NJ)でイメージングした。イメージング後、上記のように、動物を犠牲にし、解剖した。統計的有意性は、マイクロソフト社製エクセルによる両側分布および対応のある場合のスチューデントのｔ検定より決定した。
【０１１３】
第三の動物試験は、増幅を評価する目的で特別に計画したものである。従って、ＬＳ１７４Ｔ腫瘍を移植したヌードマウスに、まず、非標識抗体２５μｇを与え、３０時間後に、非標識の３０ＫＤａ ＰＬ−ｃＭＯＲＦポリマー１５μｇを与えた。次いで、動物に、ポリマー投与後２１時間（表５）または４３時間（表６）の時点にＭＯＲＦ−９９ｍＴｃ １５μｇを与え、３時間後、その動物を犠牲にした。対照動物には抗体を与えなかった（群［２］）か、または抗体もポリマーも与えなかった（群［３］）。さらなる対照（プレターゲッティング）として、動物にはポリマーを与えなかったが、ＭＮ１４−ＭＯＲＦ抗体、続いて、５１時間後にｃＭＯＲＦ−９９ｍＴｃを与えた（表５）。動物を犠牲にする前にイメージングした。
【０１１４】
【表６】
【０１１５】
【表７】
【０１１６】
ＭＯＲＦ−９９ｍＴｃとｃＭＯＲＦ−９９ｍＴｃのin vivo挙動が十分に類似しているとすれば、上記研究におけるプレターゲッティングに関するin vivo増幅倍率を推測することができる。従って、増幅研究群におけるＭＯＲＦ−９９ｍＴｃの腫瘍内絶対蓄積（０．６５％〜０．２４％）×１．５μｇは６．１５ｎｇであり、これに対し、プレターゲッティングによるｃＭＯＲＦ−９９ｍＴｃの蓄積（２．０３％〜０．１８％）×０．１５μｇは２．７８ｎｇである。この割合からプレターゲッティングに対する増幅倍率２．１が提供される。
【０１１７】
要するに、これらの結果は、in vivo 増幅ターゲッティングは実現可能であり、そしてそれが実現したということを証明するものである。これらの研究の条件下では、ＭＮ１４抗体を介して腫瘍に局在化したＭＯＲＦの約２５％が接近可能であり、それがＰＬ ｃＭＯＲＦポリマーにより標的化される。さらに、このように腫瘍に局在化したｃＭＯＲＦの約１２％が首尾よく、放射性標識ＭＯＲＦにより標的化される。各研究における腫瘍蓄積が対照より一貫して統計的に高いという点から増幅の概念実証は明らかである。標的における絶対蓄積に関し、同じく重要となるのが標的／正常組織比である。３種類の増幅研究各々に関する、各組織についてのこれらの比を算出することで、増幅ターゲッティングが、３５の評価のうち３３の評価にて、ポリマー単独の対照や放射性標識ｃＭＯＲＦ単独の対照よりも高い腫瘍／非標的比を提供することが示される。
【０１１８】
動物イメージング
図１は、各々が右大腿部にＬＳ１７４Ｔ腫瘍を有する２匹のヌードマウスの同時に得た全身画像である。両方の動物にＭＯＲＦ−９９ｍＴｃを与え（イメージングの３時間前）、その両方の動物にｃＭＯＲＦ−ポリマーを与えた（イメージングの４３時間前）。左の試験（増幅）動物のみＭＮ１４−ＭＯＲＦ抗体を与えた（イメージングの７３時間前）。
【０１１９】
図２は、各々が右大腿部にＬＳ１７４Ｔ腫瘍を有する３匹のヌードマウスの、図１と同じ条件下で同時に得た全身画像である。従って、左の動物にＭＯＲＦ−９９ｍＴｃのみを与え（イメージングの３時間前）、中央の動物にＭＯＲＦ−９９ｍＴｃとｃＭＯＲＦ−ポリマーを与え（イメージングの２１時間前）、また、右の試験動物（増幅）にＭＯＲＦ−９９ｍＴｃ、ｃＭＯＲＦ−ポリマーおよびＭＮ１４−ＭＯＲＦを与えた（イメージングの５１時間前）。抗体とポリマーの両方を与えた試験動物でのみ画像に腫瘍が示されている。
【０１２０】
本発明の産物、組成物、方法および工程に対して種々の修飾および変形を施し得ることは、当業者には明らかである。従って、このような修飾および変形が添付の請求項およびそれらの等価物の範囲にあるならば、本発明はそれらを包含するものとする。以上で引用した全ての公開物の開示内容は、各々が個々に引用することにより本明細書の一部とされるのと同じ程度で、それらの全開示内容が引用することにより明らかに本明細書の一部とされる。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】７３時間前にＭＯＲＦ−ＭＮ１４を与えたＬＳ１７４Ｔ腫瘍マウスへの９９ｍＴｃ−ＭＯＲＦ投与の３時間後およびＰＡ３０ＫＤａ−ｃＭＯＲＦ投与の４３時間後のそれらの動物の全身画像を同時に得た。左が試験動物、右がポリマーを与えたが抗体を与えなかった動物である。
【図２】５１時間前にＭＯＲＦ−ＭＮ１４を与えたＬＳ１７４Ｔ腫瘍マウスへの９９ｍＴｃ−ＭＯＲＦ投与の３時間後およびＰＡ３０ＫＤａ−ｃＭＯＲＦ投与の２１時間後のそれらの動物の全身画像を同時に得た。右が試験動物、中央がポリマーを与えたが抗体を与えなかった動物、そして左がポリマーも抗体も与えていない動物である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体において診断薬または治療薬を標的部位に送達する方法であって、
（ａ）前記被験体に、標的部位の主要な標的特異的な結合部位、または標的部位により生成される物質、もしくは標的部位と関連する物質と選択的に結合するターゲッティング部分と、第一のモルホリノオリゴマーとを含んでなる第一の複合体を投与すること、
（ｂ）前記被験体に、前記第一のモルホリノオリゴマーに相補的な第二のモルホリノオリゴマーの複数のコピーと結合したポリマーを含んでなる第二の複合体を投与すること、および
（ｃ）前記哺乳動物に、前記第二のモルホリノオリゴマーと相補的な第三のモルホリノオリゴマーと、診断薬または治療薬とを含んでなる第三の複合体を投与すること
を含む、方法。
【請求項２】
前記第一のモルホリノオリゴマーと前記第三のモルホリノオリゴマーとが同じものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ａ）の後の時点で、前記哺乳動物にクリアリング剤を投与し、前記クリアリング剤により、局在していない第一の複合体を循環から排除することをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ターゲッティング部分が抗体または抗体フラグメントである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記抗体または抗体フラグメントがヒト抗体もしくは抗体フラグメントまたはヒト化抗体もしくは抗体フラグメントである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ターゲッティング部分がタンパク質、小ペプチド、ポリペプチド、酵素、ホルモン、ステロイド、サイトカイン、神経伝達物質、オリゴマー、ビタミンおよび受容体結合分子からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記抗体または抗体フラグメントがＣＥＡ、Ｂ細胞抗原、Ｔ細胞抗原、形質細胞抗原、ＨＬＡ−ＤＲ系統抗原、ＮＣＡ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３およびＭＵＣ４抗原、ＥＧＰ−１抗原、ＥＧＰ−２抗原、胎盤アルカリ性ホスファターゼ抗原、ＩＬ−６、ＶＥＧＦ、テネイシン、ＣＤ３３、ＣＤ７４、ＰＳＭＡ、ＰＳＡ、ＰＡＰ、自己免疫疾患、感染／炎症および感染症と関連する抗原、Ｂ細胞もしくはＴ細胞リンパ腫と関連するか、または自己免疫疾患と関連するＢ細胞もしくはＴ細胞と関連する抗原、悪性疾患によって発現されるＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ４０、ＣＤ７４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＩＬ−１５およびＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１５、ＣＤ３３、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｂならびにＣＤ６６ｅからなる群から選択される標的と結合する、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリマーがポリ−リジン（ＰＬ）、ポリエチルビニルエーテルマレイン酸（ＰＡ）デキストラン、デンドリマーおよびＮ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記モルホリノオリゴマーが各々、少なくとも約６塩基〜約１００塩基の長さを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記第一のオリゴマーが約１５〜約２５塩基の長さを有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記第二のオリゴマーが約１５〜約２５塩基の長さを有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記第三のオリゴマーが約１５〜約２５塩基の長さを有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記クリアリング剤が抗イディオタイプ抗体または抗原と結合する抗体フラグメントを含んでなる、請求項３に記載の方法。
【請求項１４】
前記第三の複合体が抗体、抗体フラグメント、薬物、毒素、ヌクレアーゼ、ホルモン、免疫調節物質、キレート化剤、ホウ素化合物、光活性物質または色素および放射性核種からなる群から選択される治療薬を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記第三の複合体が放射性核種、色素、造影剤、蛍光化合物または分子および磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）に有用な増強剤からなる群から選択される診断薬を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記第二の複合体が前記第二のモルホリノオリゴマーの少なくとも５コピー、少なくとも１０コピー、少なくとも２５コピーまたは少なくとも５０コピーを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記第二の複合体が前記第二のモルホリノオリゴマーの約２５〜５０コピーを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
被験体において診断薬または治療薬のターゲッティングのためのキットであって、
（ａ）標的部位の主要な標的特異的な結合部位、または標的部位により生成される物質もしくは標的部位と関連する物質と選択的に結合するターゲッティング部分と、第一のモルホリノオリゴマーとを含んでなる第一の複合体、
（ｂ）前記第一のモルホリノオリゴマーに相補的な第二のモルホリノオリゴマーの複数のコピーと結合したポリマーを含んでなる第二の複合体、および
（ｃ）前記第二のモルホリノオリゴマーと相補的な第三のモルホリノオリゴマーと、放射性標識とを含んでなる第三の複合体
を含んでなる、キット。
【請求項１９】
前記第一のモルホリノオリゴマーと前記第三のモルホリノオリゴマーとが同じものである、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
クリアリング剤をさらに含んでなる、請求項１８に記載のキット。
【請求項２１】
前記ターゲッティング部分が抗体または抗体フラグメントである請求項１８に記載のキット。
【請求項２２】
前記抗体または抗体フラグメントがヒト抗体もしくは抗体フラグメントまたはヒト化抗体もしくは抗体フラグメントである、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
前記ターゲッティング部分がタンパク質、小ペプチド、ポリペプチド、酵素、ホルモン、ステロイド、サイトカイン、神経伝達物質、オリゴマー、ビタミンおよび受容体結合分子からなる群から選択される、請求項１８に記載のキット。
【請求項２４】
前記抗体または抗体フラグメントがヒト癌胎児性抗原と結合する、請求項２２に記載のキット。
【請求項２５】
前記ポリマーがポリ−リジン（ＰＬ）、ポリエチルビニルエーテルマレイン酸（ＰＡ）デキストラン、デンドリマーおよびＮ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）からなる群から選択される、請求項１８に記載のキット。
【請求項２６】
前記モルホリノオリゴマーが各々、少なくとも約６塩基〜約１００塩基の長さを有する、請求項１８に記載のキット。
【請求項２７】
前記第一のオリゴマーが約１５〜約２５塩基の長さを有する、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
前記第二のオリゴマーが約１５〜約２５塩基の長さを有する、請求項２６に記載のキット。
【請求項２９】
前記第三のオリゴマーが約１５〜約２５塩基の長さを有する、請求項２６に記載のキット。
【請求項３０】
前記クリアリング剤が抗イディオタイプ抗体または抗原と結合する抗体フラグメントを含んでなる、請求項２０に記載のキット。
【請求項３１】
前記第三の複合体が抗体、抗体フラグメント、薬物、毒素、ヌクレアーゼ、ホルモン、免疫調節物質、キレート化剤、ホウ素化合物、光活性物質または色素および放射性核種からなる群から選択される治療薬を含んでなる、請求項１８に記載のキット。
【請求項３２】
前記第三の複合体が放射性核種、色素、造影剤、蛍光化合物または分子および磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）に有用な増強剤からなる群から選択される診断薬を含んでなる、請求項１８に記載のキット。
【請求項３３】
前記第二の複合体が前記第二のモルホリノオリゴマーの少なくとも５コピー、少なくとも１０コピー、少なくとも２５コピーまたは少なくとも５０コピーを含んでなる、請求項１８に記載のキット。
【請求項３４】
前記第二の複合体が前記第二のモルホリノオリゴマーの約２５〜５０コピーを含んでなる、請求項１８に記載のキット。
【請求項１】
被験体において診断薬または治療薬を標的部位に送達する方法であって、
（ａ）前記被験体に、標的部位の主要な標的特異的な結合部位、または標的部位により生成される物質、もしくは標的部位と関連する物質と選択的に結合するターゲッティング部分と、第一のモルホリノオリゴマーとを含んでなる第一の複合体を投与すること、
（ｂ）前記被験体に、前記第一のモルホリノオリゴマーに相補的な第二のモルホリノオリゴマーの複数のコピーと結合したポリマーを含んでなる第二の複合体を投与すること、および
（ｃ）前記哺乳動物に、前記第二のモルホリノオリゴマーと相補的な第三のモルホリノオリゴマーと、診断薬または治療薬とを含んでなる第三の複合体を投与すること
を含む、方法。
【請求項２】
前記第一のモルホリノオリゴマーと前記第三のモルホリノオリゴマーとが同じものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ａ）の後の時点で、前記哺乳動物にクリアリング剤を投与し、前記クリアリング剤により、局在していない第一の複合体を循環から排除することをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ターゲッティング部分が抗体または抗体フラグメントである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記抗体または抗体フラグメントがヒト抗体もしくは抗体フラグメントまたはヒト化抗体もしくは抗体フラグメントである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ターゲッティング部分がタンパク質、小ペプチド、ポリペプチド、酵素、ホルモン、ステロイド、サイトカイン、神経伝達物質、オリゴマー、ビタミンおよび受容体結合分子からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記抗体または抗体フラグメントがＣＥＡ、Ｂ細胞抗原、Ｔ細胞抗原、形質細胞抗原、ＨＬＡ−ＤＲ系統抗原、ＮＣＡ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３およびＭＵＣ４抗原、ＥＧＰ−１抗原、ＥＧＰ−２抗原、胎盤アルカリ性ホスファターゼ抗原、ＩＬ−６、ＶＥＧＦ、テネイシン、ＣＤ３３、ＣＤ７４、ＰＳＭＡ、ＰＳＡ、ＰＡＰ、自己免疫疾患、感染／炎症および感染症と関連する抗原、Ｂ細胞もしくはＴ細胞リンパ腫と関連するか、または自己免疫疾患と関連するＢ細胞もしくはＴ細胞と関連する抗原、悪性疾患によって発現されるＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ４０、ＣＤ７４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＩＬ−１５およびＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１５、ＣＤ３３、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｂならびにＣＤ６６ｅからなる群から選択される標的と結合する、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリマーがポリ−リジン（ＰＬ）、ポリエチルビニルエーテルマレイン酸（ＰＡ）デキストラン、デンドリマーおよびＮ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記モルホリノオリゴマーが各々、少なくとも約６塩基〜約１００塩基の長さを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記第一のオリゴマーが約１５〜約２５塩基の長さを有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記第二のオリゴマーが約１５〜約２５塩基の長さを有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記第三のオリゴマーが約１５〜約２５塩基の長さを有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記クリアリング剤が抗イディオタイプ抗体または抗原と結合する抗体フラグメントを含んでなる、請求項３に記載の方法。
【請求項１４】
前記第三の複合体が抗体、抗体フラグメント、薬物、毒素、ヌクレアーゼ、ホルモン、免疫調節物質、キレート化剤、ホウ素化合物、光活性物質または色素および放射性核種からなる群から選択される治療薬を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記第三の複合体が放射性核種、色素、造影剤、蛍光化合物または分子および磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）に有用な増強剤からなる群から選択される診断薬を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記第二の複合体が前記第二のモルホリノオリゴマーの少なくとも５コピー、少なくとも１０コピー、少なくとも２５コピーまたは少なくとも５０コピーを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記第二の複合体が前記第二のモルホリノオリゴマーの約２５〜５０コピーを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
被験体において診断薬または治療薬のターゲッティングのためのキットであって、
（ａ）標的部位の主要な標的特異的な結合部位、または標的部位により生成される物質もしくは標的部位と関連する物質と選択的に結合するターゲッティング部分と、第一のモルホリノオリゴマーとを含んでなる第一の複合体、
（ｂ）前記第一のモルホリノオリゴマーに相補的な第二のモルホリノオリゴマーの複数のコピーと結合したポリマーを含んでなる第二の複合体、および
（ｃ）前記第二のモルホリノオリゴマーと相補的な第三のモルホリノオリゴマーと、放射性標識とを含んでなる第三の複合体
を含んでなる、キット。
【請求項１９】
前記第一のモルホリノオリゴマーと前記第三のモルホリノオリゴマーとが同じものである、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
クリアリング剤をさらに含んでなる、請求項１８に記載のキット。
【請求項２１】
前記ターゲッティング部分が抗体または抗体フラグメントである請求項１８に記載のキット。
【請求項２２】
前記抗体または抗体フラグメントがヒト抗体もしくは抗体フラグメントまたはヒト化抗体もしくは抗体フラグメントである、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
前記ターゲッティング部分がタンパク質、小ペプチド、ポリペプチド、酵素、ホルモン、ステロイド、サイトカイン、神経伝達物質、オリゴマー、ビタミンおよび受容体結合分子からなる群から選択される、請求項１８に記載のキット。
【請求項２４】
前記抗体または抗体フラグメントがヒト癌胎児性抗原と結合する、請求項２２に記載のキット。
【請求項２５】
前記ポリマーがポリ−リジン（ＰＬ）、ポリエチルビニルエーテルマレイン酸（ＰＡ）デキストラン、デンドリマーおよびＮ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）からなる群から選択される、請求項１８に記載のキット。
【請求項２６】
前記モルホリノオリゴマーが各々、少なくとも約６塩基〜約１００塩基の長さを有する、請求項１８に記載のキット。
【請求項２７】
前記第一のオリゴマーが約１５〜約２５塩基の長さを有する、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
前記第二のオリゴマーが約１５〜約２５塩基の長さを有する、請求項２６に記載のキット。
【請求項２９】
前記第三のオリゴマーが約１５〜約２５塩基の長さを有する、請求項２６に記載のキット。
【請求項３０】
前記クリアリング剤が抗イディオタイプ抗体または抗原と結合する抗体フラグメントを含んでなる、請求項２０に記載のキット。
【請求項３１】
前記第三の複合体が抗体、抗体フラグメント、薬物、毒素、ヌクレアーゼ、ホルモン、免疫調節物質、キレート化剤、ホウ素化合物、光活性物質または色素および放射性核種からなる群から選択される治療薬を含んでなる、請求項１８に記載のキット。
【請求項３２】
前記第三の複合体が放射性核種、色素、造影剤、蛍光化合物または分子および磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）に有用な増強剤からなる群から選択される診断薬を含んでなる、請求項１８に記載のキット。
【請求項３３】
前記第二の複合体が前記第二のモルホリノオリゴマーの少なくとも５コピー、少なくとも１０コピー、少なくとも２５コピーまたは少なくとも５０コピーを含んでなる、請求項１８に記載のキット。
【請求項３４】
前記第二の複合体が前記第二のモルホリノオリゴマーの約２５〜５０コピーを含んでなる、請求項１８に記載のキット。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２００６−５２３７０６（Ｐ２００６−５２３７０６Ａ）
【公表日】平成１８年１０月１９日（２００６．１０．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１００３７（Ｐ２００６−５１００３７）
【出願日】平成１６年４月１５日（２００４．４．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１５１７
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９１５２５
【国際公開日】平成１６年１０月２８日（２００４．１０．２８）
【出願人】（５０４１４９９７１）イミューノメディクス、インコーポレイテッド (48)
【氏名又は名称原語表記】ＩＭＭＵＮＯＭＥＤＩＣＳ， ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年１０月１９日（２００６．１０．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年４月１５日（２００４．４．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１５１７
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９１５２５
【国際公開日】平成１６年１０月２８日（２００４．１０．２８）
【出願人】（５０４１４９９７１）イミューノメディクス、インコーポレイテッド (48)
【氏名又は名称原語表記】ＩＭＭＵＮＯＭＥＤＩＣＳ， ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
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