サイトカインおよびそのレセプター結合アンタゴニスト、特に非グリコシル化インターフェロン−β、のポリマー結合体の合成のために、方法が提供される。これらの結合体は、通常高い生物学的効力を保持する。本発明の方法に従うポリマー結合体の調製物は、レセプター−リガンド相互作用の立体的阻害を減少または回避する。この減少または回避は、通常、サイトカインならびにそのアゴニスト性アナログおよびアンタゴニスト性アナログのレセプター結合領域に対する、ポリマーの付加によって生じる。本発明はまた、このような方法によって生成された結合体および組成物を提供する。本発明の結合体は、サイトカインのレセプター結合ドメインを避けることを目的としない伝統的なポリマーカップリング法によって生成されたものと比較して、高レベルの生物学的効力を保持する。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
非グリコシル化インターフェロン−βの生物学的効力を増加するための方法であって、一種以上の合成水溶性ポリマーを該インターフェロン−βのアミノ末端アミノ酸に選択的に結合する工程を包含し、ここで、該アミノ末端アミノ酸が、該インターフェロン−βのレセプター結合ドメインから離れて位置する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記生物学的効力が、インターフェロン−βに対して応答する細胞−培養物アッセイにおいて測定される、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、前記一種以上のポリマーが、一種以上のポリアルキレングリコール、一種以上のポリアルキレンオキシド、一種以上のポリビニルアルコール、一種以上のポリカルボキシレート、一種以上のポリ（ビニルピロリドン）、一種以上のポリ（オキシエチレン−オキシメチレン）、一種以上のポリ（アミノ酸）、一種以上のポリアクリロイルモルホリン、一種以上のアミドと一種以上のアルキレンオキシドとの一種以上のコポリマー、一種以上のデキストラン、ならびに一種以上のヒアルロン酸からなる群より選択される、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、前記インターフェロン−βが、配列番号１に特定されるインターフェロン−β−１ｂのアミノ酸配列を有する、方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、前記インターフェロン−βが、実質的に配列番号１のアミノ酸配列を有する、方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、前記ポリマーが、前記アミノ末端アミノ酸のαアミノ酸基に共有結合される、方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、前記ポリマーの前記αアミノ基への共有結合が、第２級アミン連結を介する、方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、前記ポリマーが、前記アミノ末端アミノ酸の化学的に反応性の側鎖基に結合される、方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、前記反応性の側鎖が、インターフェロン−βのアミノ末端セリン残基の選択的酸化的切断によって導入されるアルデヒド基である、方法。
【請求項１０】
請求項３に記載の方法であって、前記ポリマーがポリアルキレングリコールである、方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、前記ポリアルキレングリコールが、ポリ（エチレングリコール）、モノ−メトキシポリ（エチレングリコール）およびモノヒドロキシ−ポリ（エチレングリコール）からなる群より選択される、方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、前記ポリアルキレングリコールが、モノメトキシポリ（エチレングリコール）である、方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載の方法であって、前記ポリアルキレングリコールが、モノヒドロキシポリ（エチレングリコール）である、方法。
【請求項１４】
請求項１０に記載の方法であって、前記ポリアルキレングリコールが、約１ｋＤａと約１００ｋＤａとの間（両端を含む）の分子量を有する、方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、前記ポリアルキレングリコールが、約８ｋＤａと約１４ｋＤａとの間（両端を含む）の分子量を有する、方法。
【請求項１６】
請求項１４に記載の方法であって、前記ポリアルキレングリコールが、約１０ｋＤａと約３０ｋＤａとの間（両端を含む）の分子量を有する、方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、前記ポリアルキレングリコールが、約１８ｋＤａと約２２ｋＤａとの間（両端を含む）の分子量を有する、方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法であって、前記ポリアルキレングリコールが、約２０ｋＤａの分子量を有する、方法。
【請求項１９】
請求項１４に記載の方法であって、前記ポリアルキレングリコールが、約３０ｋＤａの分子量を有する、方法。
【請求項２０】
請求項１に記載の方法であって、前記アミノ末端アミノ酸における前記ポリマーの前記インターフェロン−βへの結合が、該インターフェロン−βのグリコシル化または過剰グリコシル化の有利な効果を模倣する、方法。
【請求項２１】
請求項１に記載の方法によって作製された、結合体。
【請求項２２】
一種以上の請求項２１に記載の結合体と一種以上の薬学的に受容可能な賦形剤またはキャリアとを含む、薬学的組成物。
【請求項２３】
結合体であって、そのアミノ末端アミノ酸において一種以上の合成水溶性ポリマーに共有結合されたインターフェロン−βを含み、該インターフェロン−βの生物学的効力が、このように結合されなかった同じインターフェロン−βと比較して、増加している、結合体。
【請求項２４】
結合体であって、そのアミノ末端アミノ酸において一種以上の合成水溶性ポリマーに共有結合されたインターフェロン−βを含み、該インターフェロン−βの生物学的効力が、一種以上の同じ合成水溶性ポリマーが溶媒にアクセス可能なリジン残基にランダムに結合されている同じインターフェロン−βと比較して、増加している、結合体。
【請求項２５】
請求項２３または請求項２４に記載の結合体であって、該結合体の生物学的効力が、インターフェロン−βに応答する細胞−培養物アッセイにおいて測定される、結合体。
【請求項２６】
請求項２３または請求項２４に記載の結合体であって、前記インターフェロン−βが、配列番号１に特定されるインターフェロン−β−１ｂのアミノ酸配列を有する、結合体。
【請求項２７】
請求項２６に記載の結合体であって、前記インターフェロン−β−１ｂの生物学的効力が、配列番号２に特定されるアミノ酸配列を有しかつアスパラギン残基８０においてグリコシル化されているインターフェロン−β−１ａの効力近くまで増加する、結合体。
【請求項２８】
請求項２５に記載の結合体であって、前記インターフェロン−β反応性細胞−培養物アッセイが、抗増殖アッセイ、抗ウイルスアッセイ、シグナル伝達アッセイおよび遺伝子活性化アッセイからなる群より選択される、結合体。
【請求項２９】
請求項２３または請求項２４に記載の結合体であって、前記一種以上のポリマーが、一種以上のポリアルキレングリコール、一種以上のポリアルキレンオキシド、一種以上のポリビニルアルコール、一種以上のポリカルボキシレート、一種以上のポリ（ビニルピロリドン）、一種以上のポリ（オキシエチレン−オキシメチレン）、一種以上のポリ（アミノ酸）、一種以上のポリアクリロイルモルホリン、一種以上のアミドと一種以上のアルキレンオキシドとの一種以上のコポリマー、一種以上のデキストラン、ならびに一種以上のヒアルロン酸からなる群より選択される、結合体。
【請求項３０】
請求項２３または請求項２４に記載の結合体であって、前記ポリマーが、前記インターフェロン−βのアミノ末端アミノ酸のαアミノ基に共有結合されている、結合体。
【請求項３１】
請求項３０に記載の結合体であって、前記ポリマーの前記αアミノ基への共有結合が、第２級アミン連結を介する、結合体。
【請求項３２】
請求項２３または請求項２４に記載の結合体であって、前記ポリマーが、前記アミノ末端アミノ酸の化学的に反応性の側鎖基に結合されている、結合体。
【請求項３３】
請求項３２に記載の結合体であって、前記反応性の側鎖が、インターフェロン−βのアミノ末端セリン残基の選択的酸化的切断によって導入されるアルデヒド基である、結合体。
【請求項３４】
請求項２３または請求項２４に記載の結合体であって、前記水溶性ポリマーが、ポリアルキレングリコールである、結合体。
【請求項３５】
請求項３４に記載の結合体であって、前記ポリアルキレングリコールが、ポリ（エチレングリコール）、モノ−メトキシポリ（エチレングリコール）およびモノヒドロキシポリ（エチレングリコール）からなる群より選択される、結合体。
【請求項３６】
請求項３５に記載の結合体であって、前記ポリアルキレングリコールが、モノメトキシポリ（エチレングリコール）である、結合体。
【請求項３７】
請求項３５に記載の結合体であって、前記ポリアルキレングリコールが、モノヒドロキシポリ（エチレングリコール）である、結合体。
【請求項３８】
請求項３４に記載の結合体であって、前記ポリアルキレングリコールが、約１ｋＤａと約１００ｋＤａとの間（両端を含む）の分子量を有する、結合体。
【請求項３９】
請求項３８に記載の結合体であって、前記ポリアルキレングリコールが、約８ｋＤａと約１４ｋＤａとの間（両端を含む）の分子量を有する、結合体。
【請求項４０】
請求項３８に記載の結合体であって、前記ポリアルキレングリコールが、約１０ｋＤａと約３０ｋＤａとの間（両端を含む）の分子量を有する、結合体。
【請求項４１】
請求項４０に記載の結合体であって、前記ポリアルキレングリコールが、約１８ｋＤａと約２２ｋＤａとの間（両端を含む）の分子量を有する、結合体。
【請求項４２】
請求項４１に記載の結合体であって、前記ポリアルキレングリコールが、約２０ｋＤａの分子量を有する、結合体。
【請求項４３】
請求項３８に記載の結合体であって、前記ポリアルキレングリコールが、約３０ｋＤａの分子量を有する、結合体。
【請求項４４】
請求項２３または請求項２４に記載の結合体であって、前記アミノ末端アミノ酸における、前記インターフェロン−βへの前記ポリマーの結合が、該インターフェロン−βのグリコシル化または過剰グリコシル化の有利な効果を模倣する、結合体。
【請求項４５】
請求項２１、２３および２４のいずれか一項に記載の結合体と薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤とを含む、薬学的組成物。
【請求項４６】
請求項２１に記載の結合体を含む、キット。
【請求項４７】
請求項２３または請求項２４に記載の結合体を含む、キット。
【請求項４８】
請求項２２に記載の薬学的組成物を含む、キット。
【請求項４９】
請求項４５に記載の薬学的組成物を含む、キット。
【請求項５０】
インターフェロン−β応答性の身体的障害に罹患しているかまたは該身体的障害の素因がある動物において、該身体的障害を予防するか、診断するか、または処置する方法であって、該動物に、有効量の請求項２１、２３および２５のいずれか一項に記載の結合体を投与する工程を包含する、方法。
【請求項５１】
インターフェロン−β応答性身体障害に罹患しているかまたは罹患する素因のある動物において、該身体障害を予防、診断、または処置するための方法であって、該動物に、有効量の、請求項２２または請求項４５に記載の薬学的組成物を投与する工程を包含する、方法。
【請求項５２】
前記動物が、哺乳動物である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記動物が、哺乳動物である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記哺乳動物が、ヒトである、請求項５２または５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記インターフェロン−β応答性身体障害が、癌、感染性疾患、神経変性障害、自己免疫障害、および遺伝的障害からなる群より選択される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５６】
前記癌が、乳癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、肺癌、白血病、リンパ腫、結腸癌、消化管の癌、膵臓癌、膀胱癌、腎臓癌、骨の癌、神経の癌、頭頸部の癌、皮膚癌、癌腫、肉腫、腺腫、および骨髄腫からなる群より選択される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記インターフェロン−β応答性感染性疾患が、ウイルス性肝炎、心向性のウイルスによって引き起こされる疾患、およびＨＩＶ／ＡＩＤＳからなる群より選択される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記インターフェロン−β応答性神経変性障害が、多発性硬化症である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
前記多発性硬化症が、再発−寛解型多発性硬化症、一次性進行型多発性硬化症、および二次性進行型多発性硬化症からなる群より選択される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記インターフェロン−β応答性身体障害が、癌、感染性疾患、神経変性障害、自己免疫障害、および遺伝的障害からなる群より選択される、請求項５１に記載の方法。
【請求項６１】
前記癌が、乳癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、肺癌、白血病、リンパ腫、結腸癌、消化管の癌、膵臓癌、膀胱癌、腎臓癌、骨の癌、神経の癌、頭頸部の癌、皮膚癌、癌腫、肉腫、腺腫、および骨髄腫からなる群より選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記インターフェロン−β応答性感染性疾患が、ウイルス性肝炎、心向性のウイルスによって引き起こされる疾患、およびＨＩＶ／ＡＩＤＳからなる群より選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
前記インターフェロン−β応答性神経変性障害が、多発性硬化症である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
前記多発性硬化症が、再発−寛解型多発性硬化症、一次性進行型多発性硬化症、および二次性進行型多発性硬化症からなる群より選択される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
還元的アルキル化によって合成されるポリマー−タンパク質結合体において、Ｎ−末端セリン残基またはＮ−末端スレオニン残基を有するタンパク質のアミノ末端に付加されるポリマーの量を決定するための方法であって、該方法は、以下：
ａ）該結合体と十分な量の酸化剤とを、該ポリマーを該セリン残基または該スレオニン残基から切断するのに十分な時間、反応させる工程；および
ｂ）調製物における未結合タンパク質部分の増加を測定する工程、
を包含する、方法。
【請求項６６】
前記タンパク質が、サイトカインである、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記サイトカインが、インターフェロン−βである、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記サイトカインが、巨核球成長因子および巨核球発達因子である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
前記酸化剤が、メタペルヨーデートナトリウム、メタペルヨーデートカリウム、メタペルヨーデートリチウム、ペルヨーデートカルシウム、ペルヨーデートバリウム、および過ヨウ素酸からなる群より選択されるペルヨーデートを含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項７０】
前記測定する工程が、サイズ排除クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、超遠心分離法、限外濾過、光散乱および質量分析計からなる群より選択される一以上の方法によって行われる、請求項６５に記載の方法。
【請求項７１】
生物活性タンパク質の機能的に必須なアミノ酸残基を酸化することなく、該生物活性タンパク質のＮ−末端セリン残基またはＮ−末端スレオニン残基を選択的に酸化的切断するための方法であって、該方法は、以下：
ａ）該生物活性タンパク質の溶液の水素イオン濃度を、約７と約８との間のｐＨに調整する工程；
ｂ）該生物活性タンパク質と、生物活性タンパク質１モル当たり約０．５モル〜約５モルのペルヨーデート溶液とを混合する工程；および
ｃ）該混合物を、少なくとも１時間、約２℃と約４０℃との間の温度でインキュベートする、工程、
を包含する、方法。
【請求項７２】
前記生物活性タンパク質が、インターフェロン−βである、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記インターフェロン−βが、配列番号１で特定されたアミノ酸配列を有するインターフェロン−β−１ｂである、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
インターフェロン−β−１ｂの調製物の生物学的効力を上昇させるための方法であって、一以上の阻害性成分を、該インターフェロン−β−１ｂ調製物から除去する工程を包含する、方法。
【請求項７５】
前記一以上の阻害性成分が、サイズ排除クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよびアフィニティークロマトグラフィーからなる群より選択される一以上のクロマトグラフィー法によって、前記インターフェロン−β−１ｂの調製物から除去される、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記インターフェロン−β−１ｂの調製物の前記生物学的効力が、インターフェロン−βに反応する細胞培養アッセイにおいて測定される、請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
前記インターフェロン−β応答性細胞培養アッセイが、抗増殖性アッセイ、抗ウイルスアッセイ、シグナル伝達アッセイ、および遺伝子活性化アッセイからなる群より選択される、請求項７６に記載の方法。

【図１ａ】

【図１ｂ】

【図１ｃ】

【図１ｄ】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【公表番号】特表２００６−５２０３２３（Ｐ２００６−５２０３２３Ａ）
【公表日】平成１８年９月７日（２００６．９．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０８６１３（Ｐ２００５−５０８６１３）
【出願日】平成１５年１２月２３日（２００３．１２．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０４１１６０
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０６０２９９
【国際公開日】平成１６年７月２２日（２００４．７．２２）
【出願人】（５０１０５２８２３）マウンテン　ビュー　ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド (9)
【Ｆターム（参考）】