変形性関節症疾患の治療又は予防のためのトール様受容体４拮抗物質の使用
トール様受容体４（ＴＬＲ４）拮抗物質を使用して変形性関節症疾患を治療又は予防する方法を開示する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トール様受容体４（ＴＬＲ４）拮抗物質の治療的及び予防的な使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
変形性関節症は、関節軟骨の変性、関節縁の過剰な骨の成長、及び関節（例えば膝、腰、肘）周囲の潤滑液を生成する関節滑膜における変化によって特徴づけられる関節の病気である。
【０００３】
変形性関節症は、ヘルスケアにおいて重大な問題となっている。変形性関節症は痛みと衰弱を伴う場合がある。進行した変形性関節症には、関節置換又は他のタイプの医療的介入のような外科手術がを必要となる場合がある。多くの場合、変形性関節症疾患は中年期に現れ始めるが、７０才頃までには両方の性別の成人の大半が変形性関節症と診断されることになる（ビアース（Beers）及びバーコウ（Berkow）編集（Eds）、メルクマニュアル（Merck Manual）第１７版、２００３年センテニアルエディション（Centennial Edition））。米国だけでも、毎年２０００万人以上の人が変形性関節症を患う（ゴールドリング（Godring）及びゴールドリング２１３Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．６２６（２００７））。
【０００４】
多くのケースで、変形性関節症の進行の原因の一部は、サイトカイン媒介性炎症のサイクル、軟骨の劣化、並びに軟骨を生成する軟骨細胞の死が関わる機構によるものと考えられている。その他のケースでは、機械的な傷害又は軟骨の生成又は維持の欠陥が変形性関節症を起こす原因となり得る。軟骨細胞は、軟骨の生成と維持をする細胞タイプであり、変形性関節症の発症に関与する細胞タイプだと考えられている。
【０００５】
トール様受容体４（ＴＬＲ４）は、ＭＤ２構成成分を結合するリポ多糖体（ＬＰＳ）のような外因性リガンドによって活性化される付属タンパク質ＭＤ２及びＣＤ１４と受容体複合体を形成する。また、ＴＬＲ４は、内因性リガンドによっても活性化される（ビスチン（Vistin）ら、１７５Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６４６５（２００５年））。活性化されたＴＬＲ４は、炎症性サイトカインを放出し始め、ＴＲＬ４活性は、グラム陰性細菌による炎症に対する免疫反応における役割りを果たすと考えられている（ビスチン（Vistin）ら、１７５Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６４６５（２００５））。
【０００６】
しかし、ＴＬＲ４は、他の生物学的経路においても重要な役割りを果たすことが可能である。例えば、ＴＬＲ４は変形性関節症の軟骨障害において高レベルで発現することが示されており、ＬＰＳによるＴＬＲ４の活性は軟骨細胞による軟骨劣化生成物の生成を増すことが示されている（Kim et al., 54 Arthritis Rheum. 2152（2006））。その後のトランスジェニックマウス（ハツカネズミ）での研究でＴＬＲ４遺伝子が不活性化されたことは、このＬＰＳ誘導による軟骨劣化生成物の放出がＴＬＲ４により媒介されることを示している（ボバクツ（Bobacz）ら、５６ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．１８８０（２００７））。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、変形性関節症におけるＴＬＲ４の役割りを理解し、この役割りを利用して、変形性関節症疾患を効果的に治療又は予防する拮抗物質のような薬剤及び療法を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一態様は、トール様受容体４（ＴＬＲ４）拮抗物質の治療有効量を、変形性関節症の治療に十分な時間にわたってそれを必要とする患者に投与することを含む、変形性関節症の治療法である。
【０００９】
本発明の別の態様は、トール様受容体（ＴＬＲ４）拮抗物質の治療有効量を、変形性関節症の予防に十分な時間にわたってそれを必要とする患者に投与することを含む、変形性関節症の予防法である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】変形性関節症でない人からの関節軟骨及び骨膜細胞に比べて、変形性関節症患者からの関節軟骨及び骨膜細胞では、ｈＴＬＲ４Ａ転写レベルが高いことを示す。
【図２】変形性関節症でない人からの関節軟骨及び骨膜細胞に比べて、変形性関節症患者からの関節軟骨ではＭＤ２転写レベルが高いが、骨膜細胞では高くないことを示す。
【図３】変形性関節症でない人からの関節軟骨及び骨膜細胞に比べて、変形性関節症患者からの関節軟骨及び骨膜細胞ではＣＤ１４転写レベルが高いことを示す。
【図４】野生型マウス（ハツカネズミ）からの、リポ多糖体（ＬＰＳ）、又はＴＬＲ４／ＭＤ２複合体を結合する拮抗物質ｍＡｂ（ＭＴＳ５１０）、又はＬＰＳ及びＭＴＳ５１０で処置した関節軟骨におけるＳ−ＧＡＧ合成を、野生型マウスからの未処置関節軟骨におけるＧＡＧ合成に対する百分率として示す。
【図５】ｍＴＬＲノックアウトマウス（ハツカネズミ）からの、ＬＰＳ、又はＴＬＲ４／ＭＤ２複合体を結合する拮抗物質ｍＡｂ（ＭＴＳ５１０）、又はＬＰＳ及びＭＴＳ５１０で処置した関節軟骨におけるＳ−ＧＡＧ合成を、ｍＴＬＲ４ノックアウトマウスからの未処置関節軟骨におけるＧＡＧ合成に対する百分率として示す。
【図６】野生型及びｍＴＬＲ４ノックアウトマウス（ハツカネズミ）からの、ＬＰＳ、又はＴＬＲ４／ＭＤ２複合体を結合する拮抗物質ｍＡｂ（ＭＴＳ５１０）、又はＬＰＳ及びＭＴＳ５１０で処置した関節軟骨におけるＴＮＦ−α分泌。
【図７】野生型及びｍＴＬＲ４ノックアウトマウス（ハツカネズミ）からの、ＬＰＳ、又はＴＬＲ４／ＭＤ２複合体を結合する拮抗物質ｍＡｂ（ＭＴＳ５１０）、又はＬＰＳ及びＭＴＳ５１０で処置した関節軟骨におけるＩＬ−１α分泌。
【図８】野生型及びｍＴＬＲ４ノックアウトマウス（ハツカネズミ）からの、ＬＰＳ、又はＴＬＲ４／ＭＤ２複合体を結合する拮抗物質ｍＡｂ（ＭＴＳ５１０）、又はＬＰＳ及びＭＴＳ５１０で処置した関節軟骨におけるＩＬ−１β分泌。
【図９】野生型及びｍＴＬＲ４ノックアウトマウス（ハツカネズミ）からの、ＬＰＳ、又はＴＬＲ４／ＭＤ２複合体を結合する拮抗物質ｍＡｂ（ＭＴＳ５１０）、又はＬＰＳ及びＭＴＳ５１０で処置した関節軟骨、におけるＧＭ−ＣＳＦ分泌。
【図１０】野生型及びｍＴＬＲ４ノックアウトマウス（ハツカネズミ）からの、ＬＰＳ、又はＴＬＲ４／ＭＤ２複合体を結合する拮抗物質ｍＡｂ（ＭＴＳ５１０）、又はＬＰＳ及びＭＴＳ５１０で処置した関節軟骨、におけるＲＡＮＴＥＳ分泌。
【図１１】野生型及びｍＴＬＲ４ノックアウトマウス（ハツカネズミ）からの、ＬＰＳ、又はＴＬＲ４／ＭＤ２複合体を結合する拮抗物質ｍＡｂ（ＭＴＳ５１０）、又はＬＰＳ及びＭＴＳ５１０で処置した関節軟骨、におけるＩＬ−１０分泌。
【図１２】野生型及びｍＴＬＲ４ノックアウトマウス（ハツカネズミ）からの、ＬＰＳ、又はＴＬＲ４／ＭＤ２複合体を結合する拮抗物質ｍＡｂ（ＭＴＳ５１０）、又はＬＰＳ及びＭＴＳ５１０で処置した関節軟骨、におけるＫＣ１２分泌。
【図１３】野生型及びｍＴＬＲ４ノックアウトマウス（ハツカネズミ）からの、ＬＰＳ、又はＴＬＲ４／ＭＤ２複合体を結合する拮抗物質ｍＡｂ（ＭＴＳ５１０）、又はＬＰＳ及びＭＴＳ５１０で処置した関節軟骨、におけるＭＣＰ１分泌。
【図１４】野生型及びｍＴＬＲ４ノックアウトマウス（ハツカネズミ）からの、ＬＰＳ、又はＴＬＲ４／ＭＤ２複合体を結合する拮抗物質ｍＡｂ（ＭＴＳ５１０）、又はＬＰＳ及びＭＴＳ５１０で処置した関節軟骨、におけるＩＬ−６分泌。
【図１５】野生型及びｍＴＬＲ４ノックアウトマウス（ハツカネズミ）からの、ＬＰＳ、又はＴＬＲ４／ＭＤ２複合体を結合する拮抗物質ｍＡｂ（ＭＴＳ５１０）、又はＬＰＳ及びＭＴＳ５１０で処置した関節軟骨、におけるＩＰ−１０分泌。
【図１６】野生型及びｍＴＬＲ４ノックアウトマウス（ハツカネズミ）からの、ＬＰＳ、又はＴＬＲ４／ＭＤ２複合体を結合する拮抗物質ｍＡｂ（ＭＴＳ５１０）、又はＬＰＳ及びＭＴＳ５１０で処置した関節軟骨におけるＧ−ＣＳＦ分泌。
【図１７】野生型及びｍＴＬＲ４ノックアウトマウス（ハツカネズミ）からの、ＬＰＳ、又はＴＬＲ４／ＭＤ２複合体を結合する拮抗物質ｍＡｂ（ＭＴＳ５１０）、又はＬＰＳ及びＭＴＳ５１０で処置した関節軟骨におけるＭＩＰ−１α分泌。
【図１８】ＬＰＳ、ＬＰＳ及びポリミキシンＢ、ＬＰＳ及びＴＬＲ４拮抗物質ＴＬＲ４−ＥＣＤ、ＴＬＲ４−ＥＣＤのみ、ＩＬ−１アルファ（ＩＬ−１α）、又はＴＮＦアルファ（ＴＮＦα）で処置したヒト軟骨細胞におけるＳ−ＧＡＧ合成を、未処置のヒト軟骨細胞におけるＧＡＧ合成の百分率として示す。
【図１９】ＬＰＳ、ＰＳ及びＴＬＲ４拮抗物質ＴＬＲ４−ＥＣＤ、ＴＬＲ４−ＥＣＤのみ、ＴＮＦアルファ（ＴＮＦα）、ＩＬ−１アルファ（ＩＬ−１α）、ＩＧＦ１（インスリン様成長因子１）、ＬＰＳ及びＩＧＦ１、ＩｇＧ１、又はＬＰＳ及びＩｇＧ１で処置した変形性関節症患者からのヒト軟骨細胞におけるＳ−ＧＡＧ合成を、未処置の変形性関節症患者からのヒト軟骨細胞におけるＧＡＧ合成の百分率として示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
特許及び特許出願を含み、それらには限定されない全ての刊行文献は、本明細書への参照により、完全に説明されているごとくに、本願に包含される。
【００１２】
本明細書で使用される用語「拮抗物質」とは、任意の機構によって、受容体のような別の分子の効果を部分的又は完全に阻害する分子を意味する。本明細書で使用される「ＴＬＲ４拮抗物質」又は「ＴＬＲ４と反応性の（である）」化合物とは、ＴＬＲ４の生物学的活性又はＴＬＲ４受容体の活性化を、直接又は間接に、実質的に無効にするか、削減するか、又は阻害することができる分子である。そのような拮抗物質は、例えば、小有機分子、ペプチド鎖、抗体、抗体フラグメント、ミメチボディ（MIMETIBODY）（商標）ペプチド鎖、又はポリヌクレオチドである場合がある。そのような拮抗物質は、例えば、ＴＬＲ４を含む機能的複合体の活性又は形成を阻止することによって（例えばＭＤ２ホモログ又はＣＤ１４ホモログの活性に支障をきたすことによって）、ＴＬＲ４の活性を阻害することができる。配列番号１２及び配列番号１４に示されるアミノ酸配列は、それぞれ、人類（ヒト）ＭＤ２及びハツカネズミＭＤ２のものである。
【００１３】
具体的なＴＬＲ４拮抗物質の例としては、Ｆｃドメインに融合されたｈＴＬＲ４Ａの細胞外ドメインを含むＴＬＲ４−ＥＣＤのような拮抗物質であるｍＡｂ ＭＴＳ５１０など（配列番号２）が挙げられる。ｍＡｂ ＭＴＳ５１０は、ハツカネズミのＴＬＲ４を結合するＩｇＧ２ａイソ型の単クローナルラット抗体であり、ＭＤ２との複合体ｍＴＬＲ４の結合がｇできる及びＴＬＲ４活性阻害することができる。ｍＡｂ ＭＴＳ５１０はクローン指定ＭＴＳ５１０によって生成されるものであり、凍結乾燥に好適であるｍＡｂ ＭＴＳ５１０は、インビボジェン（Invivo Gen）（カリフォルニア州サンディエゴ）又はイーバイオサイエンス社（eBioscience, Inc.）（カリフォルニア州サンディエゴ）から入手可能である。ＴＬＲ４−ＥＣＤタイプは、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むような構造であり、配列番号１０もまた、ＴＬＲ４活性を阻害することができ、ＴＬＲ４とのＭＤ２の相互作用を阻害することによって、ＬＰＳ結合ＭＤ２ペプチド鎖によるＴＬＲ４の活性化を防ぎ、ＴＬＲ４を拮抗すると考えられる。配列番号６及び配列番号１６に示すアミノ酸配列は、そのようなＴＬＲ４−ＥＣＤ構造の具体例である。
【００１４】
本発明の方法において有用なＴＬＲ４拮抗物質は、また、核酸分子である場合がある。そのような核酸分子は、ＴＬＲ４拮抗物質である短絡干渉ＲＮＡ又はアンチセンス分子のような核酸分子を干渉することができる。あるいは、二本鎖又は一本鎖のプラスミドＤＮＡベクトル、人工染色体若しくは直鎖核酸、あるいはＴＬＲ４拮抗物質（例えばペプチド鎖又はＲＮＡ）をエンコードする若しくはＴＬＲ４拮抗物質として機能する他のベクトルのようなポリヌクレオチド分子を、本発明の方法に使用して、ＴＬＲ４拮抗物質を患者に投与することができる。
【００１５】
本明細書で使用される用語「抗体」は広義に用いられ、多クローナル抗体と、ねずみ（murine）、ヒト、ヒト化及びキメラモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体と、抗体フラグメントを含む、免疫グロブリン又は抗体分子を含む。
【００１６】
概して、抗体は、特定の抗原との結合特異性を示すタンパク質又はポリペプチドである。損なわれていない抗体は、２つの全く同じ軽鎖と２つの全く同じ重鎖とから成るヘテロテトラメリック糖タンパク質である。典型的に、それぞれの軽鎖は１つの共有ジスルフィド結合によって重鎖と連結しており、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンイソ型の重鎖によって異なる。各重鎖及び軽鎖はまた、規則的間隔の鎖内ジスルフィド架橋を有する。それぞれの重鎖は一端に１つの可変領域（ＶH）を有し、多数の定常領域がそれに続く。それぞれの軽鎖は一端に可変領域（ＶL）を有し、もう一方の端に定常領域を有する。軽鎖の定常領域は重鎖の第１の定常領域と整列し、軽鎖の可変領域は重鎖の可変領域と整列する。任意の脊椎動物種の抗体軽鎖は、それらの定常領域のアミノ酸配列に基づき、カッパ（ｋ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの明確なタイプの１つに割り当てることができる。免疫グロブリンは、重鎖の定常領域アミノ酸配列に依存して、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭと呼ばれる５つの主要なクラスに割り当てられる。ＩｇＡ及びＩｇＧは、ＩｇＡ1、ＩｇＡ2、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、ＩｇＧ4というイソ型に更に細かく分類される。
【００１７】
「抗体フラグメント」という用語は、損なわれていない抗体の一部分を意味し、概して、損なわれていない抗体の抗原結合又は可変領域である。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖフラグメント、ジアボディ、単鎖抗体分子、及び少なくとも２つの損なわれていない抗体から形成された多特異的抗体が挙げられる。
【００１８】
本明細書で使用される用語「抗原」は、直接又は間接に抗体を生成する能力を有する任意の分子を意味する。「抗原」の定義内には、タンパク質エンコーディング核酸が含まれる。
【００１９】
「ＣＤＲ」は、抗体の相補的決定領域アミノ酸配列として定義され、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の高可変領域である。例として、カバト（Kabat）らの「免疫的関心対象タンパク質の配列（Sequences of Proteins of Immunological Interest）」第４版（米保健社会福祉省国立衛生研究所（１９８７年）を参照。３つの重鎖及び３つの軽鎖ＣＤＲ又はＣＤＲ領域が免疫グロブリンの可変部分にある。したがって、本明細書において「ＣＤＲ」は３つの重鎖ＣＤＲ全てを指すか、３つの軽鎖ＣＤＲか、又は適切な場合は両方の全ての重鎖及び軽鎖ＣＤＲを指す。
【００２０】
ＣＤＲは抗体が抗原又はエピトープと結合するための接触残基の大半を提供する。本発明で有用な関心対象のＣＤＲは、ドナー抗体可変重鎖・軽鎖配列に由来し、天然発生するＣＤＲの類似体を含み、これらの類似体はまた、これらが由来するドナー抗体と同じ抗原結合特異性及び／又は中和能力を共有又は保持する。
【００２１】
本明細書で使用される用語「ホモログ」とは、参照配列との配列同一性が７５％〜１００％であるタンパク質配列を意味する。例えば、成熟形態の人類ＭＤ−２タンパク質のホモログは、配列番号１２のアミノ酸残基１７〜１６０と７５％〜１００％の配列同一性を有するペプチド鎖を含む。２つのペプチド鎖間の同一性率（％）は、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ ｖ．９．０．０（インビトロジェン社（Invitrogen Corp）（カリフォルニア州カースルバッド）のＡｌｉｇｎＸモジュールの初期設定を使う対整合によって測定することができる。
【００２２】
本願で用いられる「〜と組み合わせて（in combination with）」という用語は、記述の対象である薬剤が、他の薬剤と共に、混合物中で一緒に、又は単独薬剤として同時に、又は単独薬剤として順次に任意の順序で、動物に投与されうることを意味する。
【００２３】
本明細書で使用される用語「炎症条件」は、サイトカイン、ケモカイン、又は炎症性細胞（例えば好中球、単核細胞、リンパ球）の活性によって部分的に媒介される細胞傷害に対する局所的応答を意味し、ほとんどの場合、疼痛、赤み、腫れ、組織機能の損失によって特徴づけられるものである。
【００２４】
本明細書で使用される用語「ミメチボディ（MIMETIBODY）（商標）ペプチド鎖」とは、一般式（Ｉ）：
（Ｖ１−Ｐｅｐ−Ｌｋ−Ｖ２−Ｈｇ−ＣH２−ＣH３）（ｔ）
（Ｉ）
を有するタンパク質であり、式中、Ｖ１は免疫グロブリン可変領域のＮ−末端部分、Ｐｅｐは細胞表面ＴＬＲ４に結合するポリペプチド、Ｌｋはポリペプチド又は化学的連鎖、Ｖ２は免疫グロブリンの可変領域のＣ−端末部分、Ｈｇは免疫グロブリンの可変ヒンジ領域の一部分、ＣH２は免疫グロブリン重鎖のＣH２定常領域、及びＣH３は免疫グロブリン重鎖のＣH３定常領域であり、ｔは独立する１から１０までの整数である。ミメチボディ（MIMETIBODY）（商標）ペプチド鎖は、その構造に存在する重鎖定常領域アミノ酸配列に依存して、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥのような異なるタイプの免疫グロブリン分子の特性及び機能を模倣することができる。一部のミメチボディ（MIMETIBODY）（商標）ペプチド鎖実施形態において、Ｖ１が欠如している場合がある。本発明において有用なミメチボディ（MIMETIBODY）（商標）ペプチド鎖拮抗物質は、細胞表面ＴＬＲ４との結合を介してＴＬＲ４生物活性に影響を与える。
【００２５】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体（又は抗体フラグメント）を意味する。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一の抗原決定因子を標的とする。この「モノクローナル」という修飾子は、抗体の実質的な均一性を示すものであって、任意の特定の方法による抗体の生成は要求しない。例えば、マウス（murine）ｍＡｂは、コーラー（Kohler）ら（Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５〜４９７（１９７５年））のハイブリドーマ法によって作製することができる。受容体抗体（通常、別の哺乳動物種、例えばヒト）由来の軽鎖及び重鎖定常領域と関連するドナー抗体（通常はマウス（murine）から）由来の軽鎖及び重鎖可変領域を含むキメラｍＡｂは、米国特許第４，８１６，５６７号に開示されている方法によって調整することができる。ヒトでないドナーの免疫グロブリン（通常、マウス（murine））に由来するＣＤＲを有するヒト化ｍＡｂ、及び結合親和力を保存するために変更されたフレームワーク支持残基を選択的に有する、１つ以上のヒト免疫グロブリンに由来する分子の残りの免疫グロブリン由来部分は、クイーン（Queen）ら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（米国）８６：１００２９〜１００３２（１９８９年））及びホジソン（Hodgson）ら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９：４２１（１９９１年））に開示されている技法によって得られる。
【００２６】
ヒト化に有用なヒトフレームワーク配列の例は、例えば、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ；ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ；ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ｐｈａｇｅ／ｈｄｂ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ＡＬＩＧＮＭＥＮＴＳ．ｐｈｐ；ｗｗｗ．ｋａｂａｔｄａｔａｂａｓｅ．ｃｏｍ／ｔｏｐ．ｈｔｍｌ；ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ／ｋａｂａｔ；ｗｗｗ．ｓｃｉｑｕｅｓｔ．ｃｏｍ；ｗｗｗ．ａｂｃａｍ．ｃｏｍ；ｗｗｗ．ａｎｔｉｂｏｄｙｒｅｓｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ／ｏｎｌｉｎｅｃｏｍｐ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｐｕｂｌｉｃ．ｉａｓｔａｔｅ．ｅｄｕ／〜ｐｅｄｒｏ／ｒｅｓｅａｒｃｈ＿ｔｏｏｌｓ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｗｈｆｒｅｅｍａｎ．ｃｏｍ／ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ／ＣＨ０５／ｋｕｂｙ０５．ｈｔｍ；ｗｗｗ．ｈｈｍｉ．ｏｒｇ／ｇｒａｎｔｓ／ｌｅｃｔｕｒｅｓ／１９９６／ｖｌａｂ；ｗｗｗ．ｐａｔｈ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／〜ｍｒｃ７／ｍｉｋｅｉｍａｇｅｓ．ｈｔｍｌ；ｍｃｂ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ＢｉｏＬｉｎｋｓ／Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙｌｉｎｋ．ｃｏｍ；ｐａｔｈｂｏｘ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／〜ｈｃｅｎｔｅｒ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ；ｗｗｗ．ｎａｌ．ｕｓｄａ．ｇｏｖ／ａｗｉｃ／ｐｕｂｓ／ａｎｔｉｂｏｄｙ；ｗｗｗ．ｍ．ｅｈｉｍｅ−ｕ．ａｃ．ｊｐ／〜ｙａｓｕｈｉｔｏ／Ｅｌｉｓａ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ．ｃｏｍ；ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒｒｅｓｅａｒｃｈｕｋ．ｏｒｇ；ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｃｈ．ｕｆｌ．ｅｄｕ；ｗｗｗ．ｉｓａｃ−ｎｅｔ．ｏｒｇ；ｂａｓｅｒｖ．ｕｃｉ．ｋｕｎ．ｎｌ／〜ｊｒａａｔｓ／ｌｉｎｋｓ１．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｒｅｃａｂ．ｕｎｉ−ｈｄ．ｄｅ／ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕ；ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ；ｗｗｗ．ｉｂｔ．ｕｎａｍ．ｍｘ／ｖｉｒ／Ｖ＿ｍｉｃｅ．ｈｔｍｌ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ；ａｎｔｉｂｏｄｙ．ｂａｔｈ．ａｃ．ｕｋ；ｗｗｗ．ｕｎｉｚｈ．ｃｈ；ｗｗｗ．ｃｒｙｓｔ．ｂｂｋ．ａｃ．ｕｋ／〜ｕｂｃｇ０７ｓ；ｗｗｗ．ｎｉｍｒ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋ／ＣＣ／ｃｃａｅｗｇ／ｃｃａｅｗｇ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｐａｔｈ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／〜ｍｒｃ７／ｈｕｍａｎｉｓａｔｉｏｎ／ＴＡＨＨＰ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｉｂｔ．ｕｎａｍ．ｍｘ／ｖｉｒ／ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｓｔａｔ＿ａｉｍ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｂｉｏｓｃｉ．ｍｉｓｓｏｕｒｉ．ｅｄｕ／ｓｍｉｔｈｇｐ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｊｅｒｉｎｉ．ｄｅ；及びカバト（Kabat）らによる「免疫学的関心対象のタンパク質の配列（Sequences of Proteins of Immunological Interest）」、米国衛生省（１９８７年）に開示されており、それぞれの全文はこの参照により本明細書に組み込まれる。
【００２７】
非ヒト配列を一切含まない完全なヒトｍＡｂは、例えばローンバーグ（Lonberg）ら（Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６〜８５９ １９９４年）、フィッシュワイルド（Fishwild）ら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１４：８４５〜８５１ １９９６年）及びメンデツ（Mendez）ら（Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６〜１５６ １９９７年）に参照された技法によってヒト免疫グロブリントランスジェニックマウスから調製することができる。ヒトｍＡｂは、また、ファージディスプレイライブラリを元に、例えばナピック（Knappik）ら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５７〜８６ ２０００年）及びクレブス（Krebs）ら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２５４：６７〜８４ ２００１年）に参照された技法によって調製及び最適化することができる。
【００２８】
本明細書で使用される「変形性関節症疾患」又は「変形性関節症」という用語は、関節軟骨の変性、関節縁での過剰な骨の成長、及び関節周囲の潤滑液を生成する、関節滑膜における変化によって特徴づけられる関節の病気を意味する。多くのケースで、変形性関節症の進行の原因の一部は、サイトカイン媒介性炎症のサイクル、軟骨の劣化、並びに軟骨を生成する軟骨細胞の死が関わる機構によるものと考えられている。その他のケースでは、機械的な傷害又は軟骨の生成又は維持の欠陥が変形性関節症を起こす原因となり得る。
【００２９】
「患者」という用語は、変形性関節症疾患の治療又は変形性関節症疾患の予防が適応される任意の属に属する動物を意味する。
【００３０】
「ペプチド鎖」という用語は、鎖を形成するためにペプチド結合によって結合された少なくとも２つのアミノ酸残基から成る分子を意味する。５０を越すアミノ酸から成る大きいペプチド鎖は、「ポリペプチド」又は「タンパク質」と呼ぶことができる。５０未満のアミノ酸から成る小さいペプチド鎖は、「ペプチド」と呼ぶことができる。
【００３１】
本発明の方法において、ＴＬＲ４拮抗物質の「治療有効量」とは、与えられた一患者において、変形関節症疾患の１つ以上の症状（例えば炎症性サイトカインレベル）の改善及び治療をもたらす応答を作り出す投与量を意味する。あるいは、本発明の方法において、ＴＬＲ４拮抗物質の「治療有効量」とは、特定の一患者において、例えば、変形性間接症にかかりやすい（例えば間接又は軟骨の機械的な傷害又は軟骨生成及び維持の欠陥による）一患者のような個人の変形関節症疾患の１つ以上の症状を予防する投与量を意味する。一患者に適切な治療有効量は、当業者に周知のルーチン臨床技術を用いて容易に決定することができる（例えば投与量応答プロット）。
【００３２】
「ＴＬＲ４」という用語は、配列番号２に示されるアミノ酸配列の残基２４〜６３１と、少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列から成るペプチド鎖か、そのようなペプチド鎖を含むペプチド鎖の複合体（例えばＭＤ２及びＣＤ１４）を意味する。配列番号２は、人類（ヒト）ＴＬＲ４イソ型Ａ前駆体（ｈＴＬＲ４Ａ）のアミノ酸配列を示す。２つのペプチド鎖間の同一性率（％）は、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ ｖ．９．０．０（インビトロジェン社（Invitrogen Corp）（カリフォルニア州カースルバッド））のＡｌｉｇｎＸモジュールの初期設定を使う対整合によって測定することができる。
【００３３】
本明細書で使用される「ＴＬＲ４生物活性」又は「ＴＬＲ４受容体活性化」という用語は、ＴＬＲ４又はＴＬＲ４含有複合体とのリガンド結合の結果として生ずる任意の活性を指す。
【００３４】
「細胞外領域」という用語は、配列番号２に示されるアミノ酸配列の残基２４〜６３１と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列から成るペプチド鎖を指す。
【００３５】
本発明の異なる態様と関係のある他のいくつかの配列が開示される。これらは、配列番号１、５、７、８、９、１１、１３、１５、１７に示される配列である。配列番号１は、人類ＴＬＲ４イソ型Ａ前駆体をエンコードするｃＤＮＡ配列を示す。配列番号５は、ＩｇＧ１抗体Ｆｃ領域とのカルボキシ端末で融合された人類ＴＬＲ４イソ型Ａの細胞外領域をエンコードするｃＤＮＡ配列示す。配列番号７は、ハツカネズミＴＬＲ４前駆体をエンコードするｃＤＮＡ配列を示す。配列番号８は、ハツカネズミＴＬＲ４前駆体のアミノ酸配列を示す。配列番号９は、ハツカネズミＴＬＲ４前駆体の細胞外領域をエンコードするｃＤＮＡ配列を示す。配列番号１１は、人類ＭＤ２前駆体をエンコードするｃＤＮＡ配列を示す。配列番号１３は、ハツカネズミＭＤ２前駆体をエンコードするｃＤＮＡ配列を示す。配列番号１５は、ＩｇＧ１抗体Ｆｃ領域とのカルボキシ端末で融合された人類ＴＬＲ４イソ型Ａの細胞外領域とのカルボキシ端末で順に融合されたＨＧＨ（ヒト成長ホルモン）シグナル配列をエンコードするｃＤＮＡ配列を示す。配列番号１７は、ＩｇＧ１抗体Ｆｃ領域とのカルボキシ端末で融合された人類ＴＬＲ４イソ型Ａの細胞外領域とのカルボキシ端末で順に融合されたＨＧＨ（ヒト成長ホルモン）シグナル配列をエンコードする発現ベクターの核酸配列を示す。
【００３６】
本発明の一態様は、トール様受容体４（ＴＬＲ４）拮抗物質の治療有効量を、変形性関節症の治療に十分な時間にわたってそれを必要とする患者に投与することを含む、変形性関節症の治療法である。
【００３７】
本発明の別の態様は、トール様受容体（ＴＬＲ４）拮抗物質の治療有効量を、変形性関節症の予防に十分な時間にわたってそれを必要とする患者に投与することを含む、変形性関節症の予防法である。
【００３８】
本発明の方法において有用なＴＬＲ４拮抗物質は、ＴＬＲ４受容体を結合し、ＴＬＲ４受容体媒介性シグナリングを阻害する特性を有することができる。そのような拮抗物質によってＴＬＲ４シグナリングを阻害することが可能な機構の例としては、キナーゼ活性、転写低減又は受容体拮抗作用の阻害が含まれる。その他の機構によってＴＬＲ４受容体媒介性シグナリングを阻害することができるその他の拮抗物質の使用もまた、本発明の方法において有用である。
【００３９】
本発明の方法を用いて、任意の属に属する動物患者を治療することができる。そのような動物の例としては、ヒト、マウス、鳥類、爬虫類、魚類が含まれる。特定の理論に束縛されることは望まないが、ＴＬＲ４拮抗物質の治療的便益は、炎症性疾患に関わる炎症性ケモカイン及びサイトカインの分泌をそのような拮抗物質が阻害する能力によるものと考えられる。
【００４０】
所与の炎症性疾患の治療に与えられた十分なＴＬＲ４拮抗物質の量は容易に決定することができる。本発明の方法において、ＴＬＲ４拮抗物質は単独で、又は少なくとも１つの他の分子との組み合わせとして、投与することができる。そのような付加的分子としては、他のＴＬＲ４拮抗物質分子か、又はＴＬＲ４受容体のシグナリングによって媒介されない治療的便益を有する分子が可能である。抗生物質、抗ウイルス、他の免疫賦活剤、他の抗炎症剤、ロイコトリエン拮抗薬、β２作用物質、及びムスカリン性受容体拮抗物質は、そのような付加的分子の例である。
【００４１】
本発明の拮抗物質を使用する治療のための投与の態様は、薬剤をホストに送達できるいずれの適切な経路であってもよい。タンパク質、抗体、抗体フラグメント、及びミメチボディ（MIMETIBODY）（商標）ペプチド鎖、並びにこれらの薬剤の医薬組成物は、非経口的投与、すなわち動脈内、皮下、筋肉内、経皮、静脈内又は経鼻腔による投与に特に有用である。
【００４２】
本発明の方法に有用な拮抗物質は、製薬上許容できる担体に含まれる有効成分としての拮抗物質の有効量を含有する医薬組成物として調製することができる。直ちに注入可能な、好ましくは生理的ｐＨに緩衝された、前記拮抗物質を含む水性けん濁液又は溶液が好適である。非経口的投与のための組成物は、通常、本発明の拮抗物質の溶液、又は、この溶液と好適には水性のキャリアである薬学的に受容可能なキャリアとの混合物よりなることができる。例えば、０．４％生理食塩水又は０．３％グリセリンなどの、種々の水性キャリアを援用することができる。これらの溶液は滅菌され、そして粒子状物質を含まない。これらの溶液は、従来の、よく知られた殺菌技術（例えば、ろ過）などにより殺菌される。これらの組成物は、ｐＨ調整剤及び緩衝剤など製薬上許容できるオージリアリ物質を、およその生理学的条件により必要に応じて含有できる。そのような薬学的製剤中の本発明の拮抗物質の濃度は、幅広く変化することができ、すなわち、重量百分率で約０．５％未満から通常は約１％又は少なくとも約１％から、１５又は２０％まで変化でき、主に選択された投与の態様に適合した液体の容積、粘度などに基づいて選択される。
【００４３】
したがって、本発明の方法に有用な筋肉内注射用の薬学的組成物は、１ｍＬの無菌緩衝水、及び約１ｎｇから約１００ｍｇの間の、例えば約５０ｎｇから約３０ｍｇの間の、又はより好ましくは約５ｍｇから約２５ｍｇの間のＴＬＲ４拮抗物質を含むように調製されることができる。同様に、静脈内注射用の本発明の薬学的組成物は、２５０ｍＬの無菌リンゲル溶液、及び約１ｍｇから約３０ｍｇの、又はより好ましくは、約５ｍｇから約２５ｍｇの本発明の拮抗物質を含むように調製されることができる。非経口投与可能な組成物を調製する実際の方法は周知であり、例えば、「レミントン製薬科学（Remington's Pharmaceutical Science）」第１５版マック出版（Mack Publishing Company）（ペンシルベニア州イーストン）に、より詳細に記載されている。ｍＡｂ（例えばＭＴＳ５１０）又はＴＬＲ４−ＥＣＤのようなＴＬＲ４拮抗物質の投与量は、動物体重１ｋｇ当たり約０．０１ｍｇ〜動物体重１ｋｇ当たり５ｍｇが可能である。
【００４４】
本発明の方法に有用なＴＬＲ４拮抗物質は、製剤中に含まれるとき、一回用量の形態で存在することができる。適切な治療に有効な量又は投与量は、当業者であれば直ちに決定することができる。決定された投与量は、必要ならば、治療期間中、医師により適切として選ばれた適切な時間的間隔をおいて、反復投与することができる。
【００４５】
本発明の方法に有用なペプチド鎖ＴＬＲ４拮抗物質は、保管のために凍結乾燥し、使用前に好適な担体にて再構成することができる。この技術は従来の免疫グロブリン及びタンパクの調製において有効であることが示されており、周知の凍結乾燥と再構成の技術を援用することができる。
【００４６】
本発明の方法のいくつかの実施形態において、ＴＬＲ４拮抗物質は、ＴＬＲ４と反応性の単離抗体である。抗体は、例えば、与えられたＴＬＲ４ペプチド鎖（例えば、人類ＴＬＲ４イソ型Ａ）又はＴＬＲ４含有複合体と特異的に結合する抗体であるとき、ＴＬＲ４と反応性である。ＴＬＲ４と反応性の抗体のような拮抗物質の結合は、それがそのような結合を用いて第１のペプチド鎖（例えば、人類ＴＬＲ４イソ型Ａ）の存在を検知できるが、第２の相同のペプチド鎖（例えば、アルブミン）を検知できないとき、与えられたペプチド鎖に特異的な結合である。この特異的結合を用いて、２つのペプチド鎖を互いに区別することができる。特異的結合は、ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット、並びに当該技術分野で周知の他の技法のような従来の技法を用いて分析することができる。
【００４７】
抗体拮抗物質の例としては、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＧａ、ＩｇＭイソ型の抗体が挙げられる。加えて、そのような拮抗物質抗体を、グリコシル化、異性化、アグリコシレーションのようなプロセス、又はポリエチレングリコール部分の付加（ペジレーション（pegylation））及び脂質化など非天然に発生する共有結合修飾のようなプロセスによって、翻訳後に修飾することができる。そのような修飾は生体内でも生体外でも可能である。完全なヒト、ヒト化、及び親和力が成熟した抗体分子又は抗体フラグメント、並びにミメチボディ（MIMETIBODY）（商標）ペプチド鎖、融合タンパク質及びキメラタンパク質は、本発明の方法において有用である。
【００４８】
本発明の方法において有用な抗体拮抗物質は、ＴＬＲ４か、又はＫdが約１０-7、１０-8、１０-9、１０-10、１０-11又は１０-12ＭであるＴＬＲ４を含む複合体か、と特異的に結合することができる。ＴＬＲ４受容体、又はＴＬＲ４を含む複合体の与えられた分子の親和力は、任意の好適な方法を用いて実験的に決定することができる。そのような方法は、当業者に既知のバイアコア（Biacore）又はＫｉｎＥｘＡ計測、ＥＬＩＳＡ又は競合的結合分析を利用することができる。
【００４９】
与えられたＴＬＲ４ホモログと望ましい親和力で結合する抗体拮抗物質分子は、抗体親和力成熟及び他の、非抗体分子に好適な当該技術分野で認識されている技法を含む技法によって、タンパク質変異型又はフラグメントのライブラリから選択することができる。
【００５０】
本発明の方法のいくつかの実施形態において、ＴＬＲ４拮抗物質は、ＴＬＲ４と反応性でありかつモノクローナル抗体ＭＴＳ５１０の抗原結合能力を有する単離抗体である。ＴＬＲ４と反応性の単離抗体は、標準の競合的結合分析においてそのような単離抗体が与えられたＴＬＲ４分子と結合するためにｍＡｂ ＭＴＳ５１０と競合するとき、ｍＡｂ ＭＴＳ５１０の抗原結合能力を有する。そのような分析としては、例えば、競合的結合ＥＬＩＳＡ分析が挙げられる。当業者は、また、２つの抗体同士の抗原結合の競合を検出するために適切なその他の方法を認識するであろう。
【００５１】
本発明の方法に有用なＴＬＲ４拮抗物質抗体は、更に、ｍＡｂ ＭＴＳ５１０のラット重鎖アミノ酸配列及びラット軽鎖アミノ酸配列との同一性によって選択されたヒトフレームワーク領域を更に含むことができる。
【００５２】
本発明の方法のいくつかの実施形態において、ＴＬＲ４拮抗物質はＴＬＲ４の細胞外領域を含む。
【００５３】
本発明の方法のいくつかの実施形態において、ＴＬＲ４拮抗物質は、配列番号４に示されるヒトＴＬＲ４イソ型Ａ細胞外領域アミノ酸配列を含むペプチド鎖である。
【００５４】
本発明の方法のいくつかの実施形態において、ＴＬＲ４拮抗物質は、配列番号４に示されるマウスＴＬＲ４イソ型Ａ細胞外領域アミノ酸配列を含むペプチド鎖である。
【００５５】
ここで、以下の具体的かつ非限定的な実施例を参照して、本発明を説明する。
【実施例】
【００５６】
（実施例１）
ＴＬＲ４、ＭＤ２及びＣＤ１４転写レベルは、ヒト変形性関節症患者からの関節軟骨及び滑膜細胞において増加する。
【００５７】
人類ＴＬＲ４イソ型Ａ（ｈＴＬＲ４Ａ）及びＣＤ１４転写レベルは、変形性関節症でない人からの関節軟骨及び滑膜細胞に比べて、ヒト変形性関節症患者からの関節軟骨及び滑膜細胞において増加する（図１及び図３）。
【００５８】
ヒト変形性関節症患者及び変形性関節症患者でない人からの関節軟骨及び滑膜細胞から抽出したトータルＲＮＡのｈＴＬＲ４Ａ、ＭＤ２及びＣＤ１４転写レベルを実時間ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）によって測定した。トータルＲＮＡは、トリゾル（Trizol）（商標）（インビトロジェン社（Invitrogen Corp）（カリフォルニア州カールスバッド））を用いて試料から抽出し、ＲＮＥａｓｙミニキット（キアジェン社（Qiagen Inc）（カリフォルニア州バレンシア）を用いて単離した。次に、単離したＲＮＡを必要に応じてプールした。
【００５９】
ｃＤＮＡは、オムニスクリプト（Omniscript）（商標）（キアジェン社（Qiagen Inc）（カリフォルニア州バレンシア）を製造業者の指示に従って用いて調製した。タグマン（TaqMan）（商標）カスタム低密度アレイ（ＬＤＡ）カード（アプライドバイオシステムズ社（Applied Biosystems）（カリフォルニア州フォスターシティ）を用いて、１００ｎｇのｃＤＮＡを増幅した。プライマーエクスプレス（Primer Express）（商標）ソフトウェア（アプライドバイオシステムズ社（Applied Biosystems））を用いて、プローブとプライマーの組み合わせを設計した。次に、タグマン（TaqMan）（商標）ＲＴ−ＰＣＲ（アプライドバイオシステムズ社（Applied Biosystems））で、ＡＢＩプリズム（ABI PRISM）（商標）７０００ＨＴ計測（アプライドバイオシステムズ社（Applied Biosystems））を行った。
【００６０】
ＡＢＩプリズム（ABI PRISM）（商標）７０００ＨＴ計測及び関連ソフトウェアを用いて、ＰＣＲの初期指数増殖期におけるデータ収集及び転写量子化を実行した。１８ＳリボゾームＲＮＡの転写レベルに対して、個々の転写レベルを正規化した。データは、変形性関節症患者からの関節軟骨及び滑膜細胞におけるｍＲＮＡ転写レベルを、変形性関節症でない個体からのものと相対した平均フォールド変化として表した。データは、４ドナー（Ｎ＝４）からのＲＮＡ試料を代表する。
【００６１】
このデータは、変形性関節症でない個体からのものに比べて、変形性関節症患者からの関節軟骨及び滑膜細胞におけるｈＴＬＲ４Ａ及びＣＤ１４転写レベルが増加していることを示す（図１及び図３）。図２に図示されるように、ＭＤ２転写レベルは軟骨で増加している。ｈＴＬＲ４Ａ、ＭＤ２及びＣＤ１４は、ＬＰＳのようなリガンド及び他のシグナルによる活性に応答して、ＴＬＲ４シグナリングを媒介する複合体を形成する。更に、ＴＬＲ４活性化は、炎症性サイトカインの放出を増加することができる（下記実施例３を参照）。したがって、ここに示す結果は、ＴＬＲ４活性化及び付随する炎症反応が変形性関節症疾患の発症において重量な役割りを果たすことができることを示している。
【００６２】
（実施例２）
関節軟骨成分の合成のリポ多糖体（ＬＰＳ）媒介性の減少硫酸化グリコサミノグリカン（Ｓ−ＧＡＧ）はＴＬＲ４依存性であり、ＴＬＲ４拮抗物質ｍＡｂによって逆行させられる。
【００６３】
関節軟骨成分Ｓ−ＧＡＧの合成のリポ多糖体（ＬＰＳ）媒介性の減少は、ＴＬＲ４依存性であり、野生型マウスにおいて生ずるが、ＴＬＲ４ノックアウトマウスでは生じない。ＬＰＳは、ＴＬＲ４受容体及の作動物質リガンドであり、ＴＬＲ４が媒介するシグナリングを活性する。図４及び５に示されるように、野生型マウス関節軟骨外植片におけるＳ−ＧＡＧの合成はＬＰＳ処置によって減少するが、ＴＬＲ４ノックアウトマウスからの関節軟骨外植片のＬＰＳ処置は、対照と比べてＳ−ＧＡＧの合成を減少しない。重要なのは、ＬＰＳ及びＴＬＲ４／ＭＤ２複合体結合性拮抗物質ｍＡｂ（ＭＴＳ５１０）での野生型マウス関節軟骨外植片の処置が、ＬＰＳのみで処置した外植片に比べてＳ−ＧＡＧ合成の増加をもたらしたことである（図４）。
【００６４】
これらの実験では、生後５週の野生型マウス（ハツカネズミ）又はＴＬＲ４ノックアウトマウスの大腿骨頭から関節軟骨外植片を取り出した。ＴＬＲ４ノックアウトマウスは、遺伝子エンコーディングｍＴＬＲ４が不活性化されたマウスである。軟骨外植片は、標準的方法を用いて準備及び維持した。軟骨外植片を２００μＬの外植片培地にて３〜５日間培養したところで使用済み培地を取り除き、実験０日目に新鮮な培地と交換した。「対照」外植片は野生型（図４）又はＴＬＲ４ノックアウトマウスからの未処置外植片である（図５）。野生型（図４）又はＴＬＲ４ノックアウトマウス（図５）からの「ＬＰＳ」処置外植片をこの培地にて２日目から３日間、１０ｎｇ／ｍｌの濃度のＬＰＳで処置した。野生型（図４）又はＴＬＲ４ノックアウトマウス（図５）からの「抗ＴＬＲ４／ＭＤ２ ｍＡｂ」処置外植片は、この培地にて２０μｇ／ｍｌの濃度のＴＬＲ４／ＭＤ２複合体結合拮抗物質ｍＡｂ ＭＴＳ５１０（インビボジェン（Invivo Gen）又はイーバイオサイエンス（eBioscience, Inc.）（カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて０日目に処置を開始した。野生型（図４）又はＴＬＲ４ノックアウトマウス（図５）からの「ＬＰＳ＋抗ＴＬＲ４／ＭＤ２ ｍＡｂ」処置外植片は、２０μｇ／ｍｌの濃度でＴＬＲ４／ＭＤ２複合体結合拮抗物質ｍＡｂ ＭＴＳ５１０の培地にて０日目に開始し、２日目から３日間、この培地にて１０ｎｇ／ｍｌの濃度のＬＰＳで処置した。５日目に外植片を一晩35Ｓラベル付けし、Ｓ−ＧＡＧ（硫酸化グリコサミノグリカン）への35Ｓ組み込みを、ボバクツ（Bobacz）ら（５６ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｒｈｅｕｍ．１８８０（２００７年））が記述しているように測定した。
【００６５】
その結果（図４及び図５）は、ｍＡｂＭＴＳ５１０のようなＴＬＲ４受容体複合体活性拮抗物質が、変形性関節症のような疾患の軟骨劣化を治療及び予防できることを示している。図４及び図５のデータは、平均−／＋標準偏差（Ｎ＝４）として表されている。図３で、「**」＝Ｐ＜０．０５（対「対照」）であり、「****」＝Ｐ＜０．００１（対「ＬＰＳ」）である。
【００６６】
（実施例３）
関節軟骨からの、ＬＰＳ誘導による炎症性サイトカインの放出は、ＴＬＲ４活性に依存する。
【００６７】
関節軟骨からの、ＬＰＳ誘導による炎症性サイトカインＴＮＦ−α、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＧＭ−ＣＳＦ、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−１０、ＫＣ１２、ＭＣＰ１、ＩＬ−６、ＩＰ−１０、Ｇ−ＣＳＦ、ＭＩＰ−１αの放出は、ＴＬＲ４活性に依存する（図６、図７、図８、図９、図１０、図１１、図１２、図１３、図１４、図１５、図１６、図１７を参照）。ＴＬＲ４拮抗物質ｍＡｂによるＴＬＲ４活性の阻止、あるいはマウスのＴＬＲ４遺伝子のノックアウトによって、これらの炎症性サイトカインの放出を予防又は減少した（図６、図７、図８、図９、図１０、図１１、図１２、図１３、図１４、図１５、図１６、図１７を参照）。
【００６８】
これらの実験では、上記実施例２のように、野生型（「ＷＴ」）及びＴＬＲ４ノックアウト（「ＫＯ」）マウスからの関節軟骨外植片を準備し、ＬＰＳで処置した。「対照」外植片は、野生型又はＴＬＲ４ノックアウトマウスからの未処置外植片である。野生型又はＴＬＲ４ノックアウトマウスからの「ＬＰＳ」処置外植片をこの培地にて、２日目から開始して３日間、１０ｎｇ／ｍｌの濃度のＬＰＳで処置した。野生型又はＴＬＲ４ノックアウトマウスからの「ｍＡｂ」処置した外植片は、この培地にて２０μｇ／ｍｌの濃度のＴＬＲ４／ＭＤ２複合体結合拮抗物質ｍＡｂ ＭＴＳ５１０で０日目に処置を開始した。野生型又はＴＬＲ４ノックアウトマウスからの「ＬＰＳ＋ｍＡｂ」処置した外植片は、０日目に、２０μｇ／ｍｌの濃度のＴＬＲ４／ＭＤ２複合体結合拮抗物質ｍＡｂ ＭＴＳ５１０でこの培地にて開始し、２日目に１０ｎｇ／ｍｌの濃度のＬＰＳにして３日間処置した。次に、関節軟骨外植片細胞培養上清のサイトカインレベルを、ルミネックス（LUMINEX）（登録商標）計測（ルミネックス（LUMINEX）社（テキサス州オースティン））のＴＮＦ−α、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＧＭ−ＣＳＦ、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−１０、ＫＣ１２、ＭＣＰ１、ＩＬ−６、ＩＰ−１０、Ｇ−ＣＳＦ、及びＭＩＰ−１αに特異的なｍＡｂ共役ビードて適宜測定した。それぞれのサイトカインのルミネックス（LUMINEX）（登録商標）分析は、製造業者の指示に従って行った。
【００６９】
その結果（図６、図７、図８、図９、図１０、図１１、図１２、図１３、図１４、図１５、図１６、図１７を参照）は、ｍＡｂ ＭＴＳ５１０処置による又は減少するＴＬＲ４遺伝子発現によるような、ＴＬＲ４受容体複合体の活性の拮抗作用が、炎症性サイトカインの放出の予防又は減少によって、変形性関節症のような疾患による軟骨の劣化を治療及び予防できることを示している。図６、図７、図８、図９、図１０、図１１、図１２、図１３、図１４、図１５、図１６、図１７において、最初の４本の棒は野生型マウス関節軟骨外植片からのデータであり、残りの４本の棒はＴＬＲ４ノックアウトマウスの関節軟骨外植片からのデータを表す。図６、図７、図８、図９、図１０、図１１、図１２、図１３、図１４、図１５、図１６、図１７は、平均−／＋標準偏差（Ｎ＝４）として表されている。
【００７０】
（実施例４）
ヒト軟骨細胞の関節軟骨成分Ｓ−ＧＡＧの合成の、ＬＰＳ媒介による減少は、ＴＬＲ４拮抗物質ｈＴＬＲ４−ＥＣＤ処置によって逆行させられる。
【００７１】
ヒト軟骨細胞における関節軟骨成分Ｓ−ＧＡＧの合成のリポ多糖体（ＬＰＳ）媒介性の減少は、ＴＬＲ４拮抗物質ｈＴＬＲ４−ＥＣＤ処置によって逆行させられる（図１８）。図１８に示すように、アルギン酸培養におけるヒト軟骨細胞の関節軟骨成分のＳ−ＧＡＧの合成は、ＬＰＳ処置によって減少する。重要なことは、ｈＴＬＲ４−ＥＣＤのみ又はＬＰＳ及びｈＴＬＲ４−ＥＣＤでの処置では、ＬＰＳのみで処置した軟骨細胞に比べてＳ−ＧＡＧ合成の増加がもたらされたことである（図１８）。
【００７２】
これらの実験では、健康なボランティアからのヒト軟骨細胞のアルギン酸培養は、アーティキュラーエンジニアリング社（Articular Engineering, LLC）（イリノイ州ノースブルック）から供給されたものであり、供給元の指示に従って維持した。「対照」軟骨細胞は処置しなかった。「ＬＰＳ」処置軟骨細胞は、２日目からこの培地にて１μｇ／ｍｌの濃度で３日間、ＬＰＳで処置された。「ＬＰＳ＋ポリミキシンＢ」処置軟骨細胞は、ＴＬＲ４拮抗物質であるＬＰＳ類似体ポリミキシンＢで、２０μｇ／ｍｌの濃度で１時間処置された後、２日目から３日間、この培地にて１μｇ／ｍｌの濃度でＴＬＲ４受容体作動物質ＬＰＳで処置された。「ＬＰＳ＋ＴＬＲ４−ＥＣＤ」処置軟骨細胞は、５０μｇ／ｍｌの濃度の、ＴＬＲ４拮抗物質であるＴＬＲ４−ＥＣＤで０日目から処置された後、２日目から３日間、この培地にて１μｇ／ｍｌの濃度のＬＰＳで処置された。ＴＬＲ４−ＥＣＤはＴＬＲ４受容体拮抗物質であり、ｈＴＬＲ４Ａの細胞外領域及びＩｇＧ１イソ型抗体のＦｃ領域を含む。ＴＬＲ４−ＥＣＤは配列番号４に示されるアミノ酸配列を有し、配列番号３に示される核酸配列を有するｃＤＮＡによってエンコードされる。ここで使用したＴＬＲ４−ＥＣＤ製剤は、約２５％のＭＤ２を含有する。「ＴＬＲ４−ＥＣＤ」処置軟骨細胞は、０日目から５０μｇ／ｍｌの濃度のＴＬＲ４拮抗物質ＴＬＲ４−ＥＣＤでこの培地にて処置した。「ＩＬ−１α」処置軟骨細胞は、１０ｎｇ／ｍｌの濃度のＩＬ１−αでこの培地にて２日目から３日間処置した。「ＴＮＦ−α」処置軟骨細胞は、５０ｎｇ／ｍｌの濃度のＴＮＦ−αでこの培地にて２日目から３日間処置した。５日目に、アルギン酸ビード軟骨細胞細胞培養を35Ｓで一晩ラベル付けした後、Ｓ−ＧＡＧ（硫酸化グリコサミノグリカン）への35Ｓ組み入れを、ボバクツ（Bobacz）ら（５６ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ． Ｒｈｅｕｍ．１８８０（２００７年））が記述している方法で測定した。
【００７３】
その結果（図１８）は、ＴＬＲ４−ＥＣＤのようなＴＬＲ４受容体複合体活性拮抗物質が、変形性関節症のような疾患の軟骨劣化を治療及び予防できることを示している。図１８のデータは、Ｘ軸ディスクリプタの後の括弧内に示すそれぞれの処置群に含まれる培養数とともに、平均−／＋標準偏差として表されている。図１８で、「**」＝Ｐ＜０．０５（「対照」に対して）であり、「****」＝Ｐ＜０．００１（「ＬＰＳ」に対して）である。
【００７４】
（実施例５）
変形性関節症患者からのヒト軟骨細胞の関節軟骨成分Ｓ−ＧＡＧ合成のＬＰＳ媒介による減少は、ＴＬＲ４拮抗物質ｈＴＬＲ４−ＥＣＤ処置によって逆行させられる。
【００７５】
変形性関節症患者からの関節軟骨成分Ｓ−ＧＡＧの合成のリポ多糖体（ＬＰＳ）媒介性の減少は、ＴＬＲ４拮抗物質ｈＴＬＲ４−ＥＣＤ処置によって逆行させられる（図１９）。図１９に示すように、アルギン酸培養における、変形性関節症患者からのヒト軟骨細胞の関節軟骨成分のＳ−ＧＡＧの合成は、ＬＰＳ処置によって減少する。重要なことは、ｈＴＬＲ４−ＥＣＤのみ又はＬＰＳ及びｈＴＬＲ４−ＥＣＤでの処置では、ＬＰＳのみで処置した変形性関節症患者からの軟骨細胞に比べてＳ−ＧＡＧ合成の増加がもたらされたことである（図１９）。
【００７６】
これらの実験では、健康なボランティアからの変形性関節症患者からのヒト軟骨細胞のアルギン酸培養は、アーティキュラーエンジニアリング社（Articular Engineering, LLC）（イリノイ州ノースブルック）から供給されたものであり、供給元の指示に従って維持した。変形性関節症患者からのヒト軟骨細胞の「対照」、「ＬＰＳ」、「ＬＰＳ＋ＴＬＲ４−ＥＣＤ」、「ＴＬＲ４−ＥＣＤ」、「ＴＮＦアルファ（ＴＮＦα）」、「ＩＬ−１アルファ（ＩＬ−１α）」での処置については上記実施例４で説明した。「ＩＧＦ１」（インスリン様成長因子１）処置軟骨細胞は、１００ｎｇ／ｍｌの濃度のＩＧＦ１でこの培地にて２日目から３日間処置された。ＩＧＦ１は、ヒト軟骨細胞によるｓＧＡＧ合成を刺激するものとして既知であり、陽性対照として使用した。「ＬＰＳ＋ＩＧＦ１」処置軟骨細胞は、この培地にて１０ｎｇ／ｍｌの濃度のＩＧＦ１で処置を開始し、１μｇ／ｍｌの濃度のＬＰＳで、２日目から３日間この培地にて処置した。「ｌｇＧ１」処置軟骨細胞は、５０μｇ／ｍｌ濃度のｌｇＧ１ Ｆｃ領域でこの培地にて０日目から処置した。「ＬＰＳ＋ＩＧＦ１」処置軟骨細胞は、この培地にて５０μｇ／ｍｌの濃度のＩＧＦ１で０日目に処置を開始し、１μｇ／ｍｌの濃度のＬＰＳで、２日目から３日間この培地にて処置した。「ｌｇＧ１」はｌｇＧ１ Ｆｃ領域のみを含み、Ｆｃ領域を含む拮抗物質ＴＬＲ−４−ＥＣＤのＦｃ部分に対する負の対照として使用した。５日目に、アルギン酸ビード軟骨細胞細胞培養を35Ｓで一晩ラベル付けした後、Ｓ−ＧＡＧ（硫酸化グリコサミノグリカン）への35Ｓ組み入れを、ボバクツ（Bobacz）ら（５６ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｒｈｅｕｍ．１８８０（２００７年））が記述している方法で測定した。
【００７７】
その結果（図１９）は、ｍＡｂ ＭＴＳ５１０のようなＴＬＲ４受容体複合体が活性する拮抗物質が、変形性関節症患者における軟骨劣化を治療及び予防できることを示している。図１９のデータは、Ｘ軸ディスクリプタの後の括弧内に示すそれぞれの処置群に含まれる培養数とともに、平均−／＋標準偏差として表されている。図１９において、「**」＝Ｐ＜０．０５（「対照」に対して）、「***」＝Ｐ＜０．００１（「対照」に対して）、「****」＝Ｐ＜０．００１（「ＬＰＳ」に対して）、ＮＣ＝負対照である。
【００７８】
本発明はここに完全に記述され、添付の本発明の請求項の趣旨及び範囲を逸脱しない範囲での、本発明に対する多くの変更及び改良をなしうることは、当業者にとり明白である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トール様受容体４（ＴＬＲ４）拮抗物質の治療的及び予防的な使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
変形性関節症は、関節軟骨の変性、関節縁の過剰な骨の成長、及び関節（例えば膝、腰、肘）周囲の潤滑液を生成する関節滑膜における変化によって特徴づけられる関節の病気である。
【０００３】
変形性関節症は、ヘルスケアにおいて重大な問題となっている。変形性関節症は痛みと衰弱を伴う場合がある。進行した変形性関節症には、関節置換又は他のタイプの医療的介入のような外科手術がを必要となる場合がある。多くの場合、変形性関節症疾患は中年期に現れ始めるが、７０才頃までには両方の性別の成人の大半が変形性関節症と診断されることになる（ビアース（Beers）及びバーコウ（Berkow）編集（Eds）、メルクマニュアル（Merck Manual）第１７版、２００３年センテニアルエディション（Centennial Edition））。米国だけでも、毎年２０００万人以上の人が変形性関節症を患う（ゴールドリング（Godring）及びゴールドリング２１３Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．６２６（２００７））。
【０００４】
多くのケースで、変形性関節症の進行の原因の一部は、サイトカイン媒介性炎症のサイクル、軟骨の劣化、並びに軟骨を生成する軟骨細胞の死が関わる機構によるものと考えられている。その他のケースでは、機械的な傷害又は軟骨の生成又は維持の欠陥が変形性関節症を起こす原因となり得る。軟骨細胞は、軟骨の生成と維持をする細胞タイプであり、変形性関節症の発症に関与する細胞タイプだと考えられている。
【０００５】
トール様受容体４（ＴＬＲ４）は、ＭＤ２構成成分を結合するリポ多糖体（ＬＰＳ）のような外因性リガンドによって活性化される付属タンパク質ＭＤ２及びＣＤ１４と受容体複合体を形成する。また、ＴＬＲ４は、内因性リガンドによっても活性化される（ビスチン（Vistin）ら、１７５Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６４６５（２００５年））。活性化されたＴＬＲ４は、炎症性サイトカインを放出し始め、ＴＲＬ４活性は、グラム陰性細菌による炎症に対する免疫反応における役割りを果たすと考えられている（ビスチン（Vistin）ら、１７５Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６４６５（２００５））。
【０００６】
しかし、ＴＬＲ４は、他の生物学的経路においても重要な役割りを果たすことが可能である。例えば、ＴＬＲ４は変形性関節症の軟骨障害において高レベルで発現することが示されており、ＬＰＳによるＴＬＲ４の活性は軟骨細胞による軟骨劣化生成物の生成を増すことが示されている（Kim et al., 54 Arthritis Rheum. 2152（2006））。その後のトランスジェニックマウス（ハツカネズミ）での研究でＴＬＲ４遺伝子が不活性化されたことは、このＬＰＳ誘導による軟骨劣化生成物の放出がＴＬＲ４により媒介されることを示している（ボバクツ（Bobacz）ら、５６ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．１８８０（２００７））。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、変形性関節症におけるＴＬＲ４の役割りを理解し、この役割りを利用して、変形性関節症疾患を効果的に治療又は予防する拮抗物質のような薬剤及び療法を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一態様は、トール様受容体４（ＴＬＲ４）拮抗物質の治療有効量を、変形性関節症の治療に十分な時間にわたってそれを必要とする患者に投与することを含む、変形性関節症の治療法である。
【０００９】
本発明の別の態様は、トール様受容体（ＴＬＲ４）拮抗物質の治療有効量を、変形性関節症の予防に十分な時間にわたってそれを必要とする患者に投与することを含む、変形性関節症の予防法である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】変形性関節症でない人からの関節軟骨及び骨膜細胞に比べて、変形性関節症患者からの関節軟骨及び骨膜細胞では、ｈＴＬＲ４Ａ転写レベルが高いことを示す。
【図２】変形性関節症でない人からの関節軟骨及び骨膜細胞に比べて、変形性関節症患者からの関節軟骨ではＭＤ２転写レベルが高いが、骨膜細胞では高くないことを示す。
【図３】変形性関節症でない人からの関節軟骨及び骨膜細胞に比べて、変形性関節症患者からの関節軟骨及び骨膜細胞ではＣＤ１４転写レベルが高いことを示す。
【図４】野生型マウス（ハツカネズミ）からの、リポ多糖体（ＬＰＳ）、又はＴＬＲ４／ＭＤ２複合体を結合する拮抗物質ｍＡｂ（ＭＴＳ５１０）、又はＬＰＳ及びＭＴＳ５１０で処置した関節軟骨におけるＳ−ＧＡＧ合成を、野生型マウスからの未処置関節軟骨におけるＧＡＧ合成に対する百分率として示す。
【図５】ｍＴＬＲノックアウトマウス（ハツカネズミ）からの、ＬＰＳ、又はＴＬＲ４／ＭＤ２複合体を結合する拮抗物質ｍＡｂ（ＭＴＳ５１０）、又はＬＰＳ及びＭＴＳ５１０で処置した関節軟骨におけるＳ−ＧＡＧ合成を、ｍＴＬＲ４ノックアウトマウスからの未処置関節軟骨におけるＧＡＧ合成に対する百分率として示す。
【図６】野生型及びｍＴＬＲ４ノックアウトマウス（ハツカネズミ）からの、ＬＰＳ、又はＴＬＲ４／ＭＤ２複合体を結合する拮抗物質ｍＡｂ（ＭＴＳ５１０）、又はＬＰＳ及びＭＴＳ５１０で処置した関節軟骨におけるＴＮＦ−α分泌。
【図７】野生型及びｍＴＬＲ４ノックアウトマウス（ハツカネズミ）からの、ＬＰＳ、又はＴＬＲ４／ＭＤ２複合体を結合する拮抗物質ｍＡｂ（ＭＴＳ５１０）、又はＬＰＳ及びＭＴＳ５１０で処置した関節軟骨におけるＩＬ−１α分泌。
【図８】野生型及びｍＴＬＲ４ノックアウトマウス（ハツカネズミ）からの、ＬＰＳ、又はＴＬＲ４／ＭＤ２複合体を結合する拮抗物質ｍＡｂ（ＭＴＳ５１０）、又はＬＰＳ及びＭＴＳ５１０で処置した関節軟骨におけるＩＬ−１β分泌。
【図９】野生型及びｍＴＬＲ４ノックアウトマウス（ハツカネズミ）からの、ＬＰＳ、又はＴＬＲ４／ＭＤ２複合体を結合する拮抗物質ｍＡｂ（ＭＴＳ５１０）、又はＬＰＳ及びＭＴＳ５１０で処置した関節軟骨、におけるＧＭ−ＣＳＦ分泌。
【図１０】野生型及びｍＴＬＲ４ノックアウトマウス（ハツカネズミ）からの、ＬＰＳ、又はＴＬＲ４／ＭＤ２複合体を結合する拮抗物質ｍＡｂ（ＭＴＳ５１０）、又はＬＰＳ及びＭＴＳ５１０で処置した関節軟骨、におけるＲＡＮＴＥＳ分泌。
【図１１】野生型及びｍＴＬＲ４ノックアウトマウス（ハツカネズミ）からの、ＬＰＳ、又はＴＬＲ４／ＭＤ２複合体を結合する拮抗物質ｍＡｂ（ＭＴＳ５１０）、又はＬＰＳ及びＭＴＳ５１０で処置した関節軟骨、におけるＩＬ−１０分泌。
【図１２】野生型及びｍＴＬＲ４ノックアウトマウス（ハツカネズミ）からの、ＬＰＳ、又はＴＬＲ４／ＭＤ２複合体を結合する拮抗物質ｍＡｂ（ＭＴＳ５１０）、又はＬＰＳ及びＭＴＳ５１０で処置した関節軟骨、におけるＫＣ１２分泌。
【図１３】野生型及びｍＴＬＲ４ノックアウトマウス（ハツカネズミ）からの、ＬＰＳ、又はＴＬＲ４／ＭＤ２複合体を結合する拮抗物質ｍＡｂ（ＭＴＳ５１０）、又はＬＰＳ及びＭＴＳ５１０で処置した関節軟骨、におけるＭＣＰ１分泌。
【図１４】野生型及びｍＴＬＲ４ノックアウトマウス（ハツカネズミ）からの、ＬＰＳ、又はＴＬＲ４／ＭＤ２複合体を結合する拮抗物質ｍＡｂ（ＭＴＳ５１０）、又はＬＰＳ及びＭＴＳ５１０で処置した関節軟骨、におけるＩＬ−６分泌。
【図１５】野生型及びｍＴＬＲ４ノックアウトマウス（ハツカネズミ）からの、ＬＰＳ、又はＴＬＲ４／ＭＤ２複合体を結合する拮抗物質ｍＡｂ（ＭＴＳ５１０）、又はＬＰＳ及びＭＴＳ５１０で処置した関節軟骨、におけるＩＰ−１０分泌。
【図１６】野生型及びｍＴＬＲ４ノックアウトマウス（ハツカネズミ）からの、ＬＰＳ、又はＴＬＲ４／ＭＤ２複合体を結合する拮抗物質ｍＡｂ（ＭＴＳ５１０）、又はＬＰＳ及びＭＴＳ５１０で処置した関節軟骨におけるＧ−ＣＳＦ分泌。
【図１７】野生型及びｍＴＬＲ４ノックアウトマウス（ハツカネズミ）からの、ＬＰＳ、又はＴＬＲ４／ＭＤ２複合体を結合する拮抗物質ｍＡｂ（ＭＴＳ５１０）、又はＬＰＳ及びＭＴＳ５１０で処置した関節軟骨におけるＭＩＰ−１α分泌。
【図１８】ＬＰＳ、ＬＰＳ及びポリミキシンＢ、ＬＰＳ及びＴＬＲ４拮抗物質ＴＬＲ４−ＥＣＤ、ＴＬＲ４−ＥＣＤのみ、ＩＬ−１アルファ（ＩＬ−１α）、又はＴＮＦアルファ（ＴＮＦα）で処置したヒト軟骨細胞におけるＳ−ＧＡＧ合成を、未処置のヒト軟骨細胞におけるＧＡＧ合成の百分率として示す。
【図１９】ＬＰＳ、ＰＳ及びＴＬＲ４拮抗物質ＴＬＲ４−ＥＣＤ、ＴＬＲ４−ＥＣＤのみ、ＴＮＦアルファ（ＴＮＦα）、ＩＬ−１アルファ（ＩＬ−１α）、ＩＧＦ１（インスリン様成長因子１）、ＬＰＳ及びＩＧＦ１、ＩｇＧ１、又はＬＰＳ及びＩｇＧ１で処置した変形性関節症患者からのヒト軟骨細胞におけるＳ−ＧＡＧ合成を、未処置の変形性関節症患者からのヒト軟骨細胞におけるＧＡＧ合成の百分率として示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
特許及び特許出願を含み、それらには限定されない全ての刊行文献は、本明細書への参照により、完全に説明されているごとくに、本願に包含される。
【００１２】
本明細書で使用される用語「拮抗物質」とは、任意の機構によって、受容体のような別の分子の効果を部分的又は完全に阻害する分子を意味する。本明細書で使用される「ＴＬＲ４拮抗物質」又は「ＴＬＲ４と反応性の（である）」化合物とは、ＴＬＲ４の生物学的活性又はＴＬＲ４受容体の活性化を、直接又は間接に、実質的に無効にするか、削減するか、又は阻害することができる分子である。そのような拮抗物質は、例えば、小有機分子、ペプチド鎖、抗体、抗体フラグメント、ミメチボディ（MIMETIBODY）（商標）ペプチド鎖、又はポリヌクレオチドである場合がある。そのような拮抗物質は、例えば、ＴＬＲ４を含む機能的複合体の活性又は形成を阻止することによって（例えばＭＤ２ホモログ又はＣＤ１４ホモログの活性に支障をきたすことによって）、ＴＬＲ４の活性を阻害することができる。配列番号１２及び配列番号１４に示されるアミノ酸配列は、それぞれ、人類（ヒト）ＭＤ２及びハツカネズミＭＤ２のものである。
【００１３】
具体的なＴＬＲ４拮抗物質の例としては、Ｆｃドメインに融合されたｈＴＬＲ４Ａの細胞外ドメインを含むＴＬＲ４−ＥＣＤのような拮抗物質であるｍＡｂ ＭＴＳ５１０など（配列番号２）が挙げられる。ｍＡｂ ＭＴＳ５１０は、ハツカネズミのＴＬＲ４を結合するＩｇＧ２ａイソ型の単クローナルラット抗体であり、ＭＤ２との複合体ｍＴＬＲ４の結合がｇできる及びＴＬＲ４活性阻害することができる。ｍＡｂ ＭＴＳ５１０はクローン指定ＭＴＳ５１０によって生成されるものであり、凍結乾燥に好適であるｍＡｂ ＭＴＳ５１０は、インビボジェン（Invivo Gen）（カリフォルニア州サンディエゴ）又はイーバイオサイエンス社（eBioscience, Inc.）（カリフォルニア州サンディエゴ）から入手可能である。ＴＬＲ４−ＥＣＤタイプは、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むような構造であり、配列番号１０もまた、ＴＬＲ４活性を阻害することができ、ＴＬＲ４とのＭＤ２の相互作用を阻害することによって、ＬＰＳ結合ＭＤ２ペプチド鎖によるＴＬＲ４の活性化を防ぎ、ＴＬＲ４を拮抗すると考えられる。配列番号６及び配列番号１６に示すアミノ酸配列は、そのようなＴＬＲ４−ＥＣＤ構造の具体例である。
【００１４】
本発明の方法において有用なＴＬＲ４拮抗物質は、また、核酸分子である場合がある。そのような核酸分子は、ＴＬＲ４拮抗物質である短絡干渉ＲＮＡ又はアンチセンス分子のような核酸分子を干渉することができる。あるいは、二本鎖又は一本鎖のプラスミドＤＮＡベクトル、人工染色体若しくは直鎖核酸、あるいはＴＬＲ４拮抗物質（例えばペプチド鎖又はＲＮＡ）をエンコードする若しくはＴＬＲ４拮抗物質として機能する他のベクトルのようなポリヌクレオチド分子を、本発明の方法に使用して、ＴＬＲ４拮抗物質を患者に投与することができる。
【００１５】
本明細書で使用される用語「抗体」は広義に用いられ、多クローナル抗体と、ねずみ（murine）、ヒト、ヒト化及びキメラモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体と、抗体フラグメントを含む、免疫グロブリン又は抗体分子を含む。
【００１６】
概して、抗体は、特定の抗原との結合特異性を示すタンパク質又はポリペプチドである。損なわれていない抗体は、２つの全く同じ軽鎖と２つの全く同じ重鎖とから成るヘテロテトラメリック糖タンパク質である。典型的に、それぞれの軽鎖は１つの共有ジスルフィド結合によって重鎖と連結しており、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンイソ型の重鎖によって異なる。各重鎖及び軽鎖はまた、規則的間隔の鎖内ジスルフィド架橋を有する。それぞれの重鎖は一端に１つの可変領域（ＶH）を有し、多数の定常領域がそれに続く。それぞれの軽鎖は一端に可変領域（ＶL）を有し、もう一方の端に定常領域を有する。軽鎖の定常領域は重鎖の第１の定常領域と整列し、軽鎖の可変領域は重鎖の可変領域と整列する。任意の脊椎動物種の抗体軽鎖は、それらの定常領域のアミノ酸配列に基づき、カッパ（ｋ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの明確なタイプの１つに割り当てることができる。免疫グロブリンは、重鎖の定常領域アミノ酸配列に依存して、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭと呼ばれる５つの主要なクラスに割り当てられる。ＩｇＡ及びＩｇＧは、ＩｇＡ1、ＩｇＡ2、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、ＩｇＧ4というイソ型に更に細かく分類される。
【００１７】
「抗体フラグメント」という用語は、損なわれていない抗体の一部分を意味し、概して、損なわれていない抗体の抗原結合又は可変領域である。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖフラグメント、ジアボディ、単鎖抗体分子、及び少なくとも２つの損なわれていない抗体から形成された多特異的抗体が挙げられる。
【００１８】
本明細書で使用される用語「抗原」は、直接又は間接に抗体を生成する能力を有する任意の分子を意味する。「抗原」の定義内には、タンパク質エンコーディング核酸が含まれる。
【００１９】
「ＣＤＲ」は、抗体の相補的決定領域アミノ酸配列として定義され、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の高可変領域である。例として、カバト（Kabat）らの「免疫的関心対象タンパク質の配列（Sequences of Proteins of Immunological Interest）」第４版（米保健社会福祉省国立衛生研究所（１９８７年）を参照。３つの重鎖及び３つの軽鎖ＣＤＲ又はＣＤＲ領域が免疫グロブリンの可変部分にある。したがって、本明細書において「ＣＤＲ」は３つの重鎖ＣＤＲ全てを指すか、３つの軽鎖ＣＤＲか、又は適切な場合は両方の全ての重鎖及び軽鎖ＣＤＲを指す。
【００２０】
ＣＤＲは抗体が抗原又はエピトープと結合するための接触残基の大半を提供する。本発明で有用な関心対象のＣＤＲは、ドナー抗体可変重鎖・軽鎖配列に由来し、天然発生するＣＤＲの類似体を含み、これらの類似体はまた、これらが由来するドナー抗体と同じ抗原結合特異性及び／又は中和能力を共有又は保持する。
【００２１】
本明細書で使用される用語「ホモログ」とは、参照配列との配列同一性が７５％〜１００％であるタンパク質配列を意味する。例えば、成熟形態の人類ＭＤ−２タンパク質のホモログは、配列番号１２のアミノ酸残基１７〜１６０と７５％〜１００％の配列同一性を有するペプチド鎖を含む。２つのペプチド鎖間の同一性率（％）は、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ ｖ．９．０．０（インビトロジェン社（Invitrogen Corp）（カリフォルニア州カースルバッド）のＡｌｉｇｎＸモジュールの初期設定を使う対整合によって測定することができる。
【００２２】
本願で用いられる「〜と組み合わせて（in combination with）」という用語は、記述の対象である薬剤が、他の薬剤と共に、混合物中で一緒に、又は単独薬剤として同時に、又は単独薬剤として順次に任意の順序で、動物に投与されうることを意味する。
【００２３】
本明細書で使用される用語「炎症条件」は、サイトカイン、ケモカイン、又は炎症性細胞（例えば好中球、単核細胞、リンパ球）の活性によって部分的に媒介される細胞傷害に対する局所的応答を意味し、ほとんどの場合、疼痛、赤み、腫れ、組織機能の損失によって特徴づけられるものである。
【００２４】
本明細書で使用される用語「ミメチボディ（MIMETIBODY）（商標）ペプチド鎖」とは、一般式（Ｉ）：
（Ｖ１−Ｐｅｐ−Ｌｋ−Ｖ２−Ｈｇ−ＣH２−ＣH３）（ｔ）
（Ｉ）
を有するタンパク質であり、式中、Ｖ１は免疫グロブリン可変領域のＮ−末端部分、Ｐｅｐは細胞表面ＴＬＲ４に結合するポリペプチド、Ｌｋはポリペプチド又は化学的連鎖、Ｖ２は免疫グロブリンの可変領域のＣ−端末部分、Ｈｇは免疫グロブリンの可変ヒンジ領域の一部分、ＣH２は免疫グロブリン重鎖のＣH２定常領域、及びＣH３は免疫グロブリン重鎖のＣH３定常領域であり、ｔは独立する１から１０までの整数である。ミメチボディ（MIMETIBODY）（商標）ペプチド鎖は、その構造に存在する重鎖定常領域アミノ酸配列に依存して、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥのような異なるタイプの免疫グロブリン分子の特性及び機能を模倣することができる。一部のミメチボディ（MIMETIBODY）（商標）ペプチド鎖実施形態において、Ｖ１が欠如している場合がある。本発明において有用なミメチボディ（MIMETIBODY）（商標）ペプチド鎖拮抗物質は、細胞表面ＴＬＲ４との結合を介してＴＬＲ４生物活性に影響を与える。
【００２５】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体（又は抗体フラグメント）を意味する。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一の抗原決定因子を標的とする。この「モノクローナル」という修飾子は、抗体の実質的な均一性を示すものであって、任意の特定の方法による抗体の生成は要求しない。例えば、マウス（murine）ｍＡｂは、コーラー（Kohler）ら（Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５〜４９７（１９７５年））のハイブリドーマ法によって作製することができる。受容体抗体（通常、別の哺乳動物種、例えばヒト）由来の軽鎖及び重鎖定常領域と関連するドナー抗体（通常はマウス（murine）から）由来の軽鎖及び重鎖可変領域を含むキメラｍＡｂは、米国特許第４，８１６，５６７号に開示されている方法によって調整することができる。ヒトでないドナーの免疫グロブリン（通常、マウス（murine））に由来するＣＤＲを有するヒト化ｍＡｂ、及び結合親和力を保存するために変更されたフレームワーク支持残基を選択的に有する、１つ以上のヒト免疫グロブリンに由来する分子の残りの免疫グロブリン由来部分は、クイーン（Queen）ら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（米国）８６：１００２９〜１００３２（１９８９年））及びホジソン（Hodgson）ら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９：４２１（１９９１年））に開示されている技法によって得られる。
【００２６】
ヒト化に有用なヒトフレームワーク配列の例は、例えば、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ；ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ；ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ｐｈａｇｅ／ｈｄｂ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ＡＬＩＧＮＭＥＮＴＳ．ｐｈｐ；ｗｗｗ．ｋａｂａｔｄａｔａｂａｓｅ．ｃｏｍ／ｔｏｐ．ｈｔｍｌ；ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ／ｋａｂａｔ；ｗｗｗ．ｓｃｉｑｕｅｓｔ．ｃｏｍ；ｗｗｗ．ａｂｃａｍ．ｃｏｍ；ｗｗｗ．ａｎｔｉｂｏｄｙｒｅｓｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ／ｏｎｌｉｎｅｃｏｍｐ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｐｕｂｌｉｃ．ｉａｓｔａｔｅ．ｅｄｕ／〜ｐｅｄｒｏ／ｒｅｓｅａｒｃｈ＿ｔｏｏｌｓ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｗｈｆｒｅｅｍａｎ．ｃｏｍ／ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ／ＣＨ０５／ｋｕｂｙ０５．ｈｔｍ；ｗｗｗ．ｈｈｍｉ．ｏｒｇ／ｇｒａｎｔｓ／ｌｅｃｔｕｒｅｓ／１９９６／ｖｌａｂ；ｗｗｗ．ｐａｔｈ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／〜ｍｒｃ７／ｍｉｋｅｉｍａｇｅｓ．ｈｔｍｌ；ｍｃｂ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ＢｉｏＬｉｎｋｓ／Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙｌｉｎｋ．ｃｏｍ；ｐａｔｈｂｏｘ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／〜ｈｃｅｎｔｅｒ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ；ｗｗｗ．ｎａｌ．ｕｓｄａ．ｇｏｖ／ａｗｉｃ／ｐｕｂｓ／ａｎｔｉｂｏｄｙ；ｗｗｗ．ｍ．ｅｈｉｍｅ−ｕ．ａｃ．ｊｐ／〜ｙａｓｕｈｉｔｏ／Ｅｌｉｓａ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ．ｃｏｍ；ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒｒｅｓｅａｒｃｈｕｋ．ｏｒｇ；ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｃｈ．ｕｆｌ．ｅｄｕ；ｗｗｗ．ｉｓａｃ−ｎｅｔ．ｏｒｇ；ｂａｓｅｒｖ．ｕｃｉ．ｋｕｎ．ｎｌ／〜ｊｒａａｔｓ／ｌｉｎｋｓ１．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｒｅｃａｂ．ｕｎｉ−ｈｄ．ｄｅ／ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕ；ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ；ｗｗｗ．ｉｂｔ．ｕｎａｍ．ｍｘ／ｖｉｒ／Ｖ＿ｍｉｃｅ．ｈｔｍｌ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ；ａｎｔｉｂｏｄｙ．ｂａｔｈ．ａｃ．ｕｋ；ｗｗｗ．ｕｎｉｚｈ．ｃｈ；ｗｗｗ．ｃｒｙｓｔ．ｂｂｋ．ａｃ．ｕｋ／〜ｕｂｃｇ０７ｓ；ｗｗｗ．ｎｉｍｒ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋ／ＣＣ／ｃｃａｅｗｇ／ｃｃａｅｗｇ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｐａｔｈ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／〜ｍｒｃ７／ｈｕｍａｎｉｓａｔｉｏｎ／ＴＡＨＨＰ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｉｂｔ．ｕｎａｍ．ｍｘ／ｖｉｒ／ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｓｔａｔ＿ａｉｍ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｂｉｏｓｃｉ．ｍｉｓｓｏｕｒｉ．ｅｄｕ／ｓｍｉｔｈｇｐ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｊｅｒｉｎｉ．ｄｅ；及びカバト（Kabat）らによる「免疫学的関心対象のタンパク質の配列（Sequences of Proteins of Immunological Interest）」、米国衛生省（１９８７年）に開示されており、それぞれの全文はこの参照により本明細書に組み込まれる。
【００２７】
非ヒト配列を一切含まない完全なヒトｍＡｂは、例えばローンバーグ（Lonberg）ら（Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６〜８５９ １９９４年）、フィッシュワイルド（Fishwild）ら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１４：８４５〜８５１ １９９６年）及びメンデツ（Mendez）ら（Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６〜１５６ １９９７年）に参照された技法によってヒト免疫グロブリントランスジェニックマウスから調製することができる。ヒトｍＡｂは、また、ファージディスプレイライブラリを元に、例えばナピック（Knappik）ら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５７〜８６ ２０００年）及びクレブス（Krebs）ら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２５４：６７〜８４ ２００１年）に参照された技法によって調製及び最適化することができる。
【００２８】
本明細書で使用される「変形性関節症疾患」又は「変形性関節症」という用語は、関節軟骨の変性、関節縁での過剰な骨の成長、及び関節周囲の潤滑液を生成する、関節滑膜における変化によって特徴づけられる関節の病気を意味する。多くのケースで、変形性関節症の進行の原因の一部は、サイトカイン媒介性炎症のサイクル、軟骨の劣化、並びに軟骨を生成する軟骨細胞の死が関わる機構によるものと考えられている。その他のケースでは、機械的な傷害又は軟骨の生成又は維持の欠陥が変形性関節症を起こす原因となり得る。
【００２９】
「患者」という用語は、変形性関節症疾患の治療又は変形性関節症疾患の予防が適応される任意の属に属する動物を意味する。
【００３０】
「ペプチド鎖」という用語は、鎖を形成するためにペプチド結合によって結合された少なくとも２つのアミノ酸残基から成る分子を意味する。５０を越すアミノ酸から成る大きいペプチド鎖は、「ポリペプチド」又は「タンパク質」と呼ぶことができる。５０未満のアミノ酸から成る小さいペプチド鎖は、「ペプチド」と呼ぶことができる。
【００３１】
本発明の方法において、ＴＬＲ４拮抗物質の「治療有効量」とは、与えられた一患者において、変形関節症疾患の１つ以上の症状（例えば炎症性サイトカインレベル）の改善及び治療をもたらす応答を作り出す投与量を意味する。あるいは、本発明の方法において、ＴＬＲ４拮抗物質の「治療有効量」とは、特定の一患者において、例えば、変形性間接症にかかりやすい（例えば間接又は軟骨の機械的な傷害又は軟骨生成及び維持の欠陥による）一患者のような個人の変形関節症疾患の１つ以上の症状を予防する投与量を意味する。一患者に適切な治療有効量は、当業者に周知のルーチン臨床技術を用いて容易に決定することができる（例えば投与量応答プロット）。
【００３２】
「ＴＬＲ４」という用語は、配列番号２に示されるアミノ酸配列の残基２４〜６３１と、少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列から成るペプチド鎖か、そのようなペプチド鎖を含むペプチド鎖の複合体（例えばＭＤ２及びＣＤ１４）を意味する。配列番号２は、人類（ヒト）ＴＬＲ４イソ型Ａ前駆体（ｈＴＬＲ４Ａ）のアミノ酸配列を示す。２つのペプチド鎖間の同一性率（％）は、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ ｖ．９．０．０（インビトロジェン社（Invitrogen Corp）（カリフォルニア州カースルバッド））のＡｌｉｇｎＸモジュールの初期設定を使う対整合によって測定することができる。
【００３３】
本明細書で使用される「ＴＬＲ４生物活性」又は「ＴＬＲ４受容体活性化」という用語は、ＴＬＲ４又はＴＬＲ４含有複合体とのリガンド結合の結果として生ずる任意の活性を指す。
【００３４】
「細胞外領域」という用語は、配列番号２に示されるアミノ酸配列の残基２４〜６３１と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列から成るペプチド鎖を指す。
【００３５】
本発明の異なる態様と関係のある他のいくつかの配列が開示される。これらは、配列番号１、５、７、８、９、１１、１３、１５、１７に示される配列である。配列番号１は、人類ＴＬＲ４イソ型Ａ前駆体をエンコードするｃＤＮＡ配列を示す。配列番号５は、ＩｇＧ１抗体Ｆｃ領域とのカルボキシ端末で融合された人類ＴＬＲ４イソ型Ａの細胞外領域をエンコードするｃＤＮＡ配列示す。配列番号７は、ハツカネズミＴＬＲ４前駆体をエンコードするｃＤＮＡ配列を示す。配列番号８は、ハツカネズミＴＬＲ４前駆体のアミノ酸配列を示す。配列番号９は、ハツカネズミＴＬＲ４前駆体の細胞外領域をエンコードするｃＤＮＡ配列を示す。配列番号１１は、人類ＭＤ２前駆体をエンコードするｃＤＮＡ配列を示す。配列番号１３は、ハツカネズミＭＤ２前駆体をエンコードするｃＤＮＡ配列を示す。配列番号１５は、ＩｇＧ１抗体Ｆｃ領域とのカルボキシ端末で融合された人類ＴＬＲ４イソ型Ａの細胞外領域とのカルボキシ端末で順に融合されたＨＧＨ（ヒト成長ホルモン）シグナル配列をエンコードするｃＤＮＡ配列を示す。配列番号１７は、ＩｇＧ１抗体Ｆｃ領域とのカルボキシ端末で融合された人類ＴＬＲ４イソ型Ａの細胞外領域とのカルボキシ端末で順に融合されたＨＧＨ（ヒト成長ホルモン）シグナル配列をエンコードする発現ベクターの核酸配列を示す。
【００３６】
本発明の一態様は、トール様受容体４（ＴＬＲ４）拮抗物質の治療有効量を、変形性関節症の治療に十分な時間にわたってそれを必要とする患者に投与することを含む、変形性関節症の治療法である。
【００３７】
本発明の別の態様は、トール様受容体（ＴＬＲ４）拮抗物質の治療有効量を、変形性関節症の予防に十分な時間にわたってそれを必要とする患者に投与することを含む、変形性関節症の予防法である。
【００３８】
本発明の方法において有用なＴＬＲ４拮抗物質は、ＴＬＲ４受容体を結合し、ＴＬＲ４受容体媒介性シグナリングを阻害する特性を有することができる。そのような拮抗物質によってＴＬＲ４シグナリングを阻害することが可能な機構の例としては、キナーゼ活性、転写低減又は受容体拮抗作用の阻害が含まれる。その他の機構によってＴＬＲ４受容体媒介性シグナリングを阻害することができるその他の拮抗物質の使用もまた、本発明の方法において有用である。
【００３９】
本発明の方法を用いて、任意の属に属する動物患者を治療することができる。そのような動物の例としては、ヒト、マウス、鳥類、爬虫類、魚類が含まれる。特定の理論に束縛されることは望まないが、ＴＬＲ４拮抗物質の治療的便益は、炎症性疾患に関わる炎症性ケモカイン及びサイトカインの分泌をそのような拮抗物質が阻害する能力によるものと考えられる。
【００４０】
所与の炎症性疾患の治療に与えられた十分なＴＬＲ４拮抗物質の量は容易に決定することができる。本発明の方法において、ＴＬＲ４拮抗物質は単独で、又は少なくとも１つの他の分子との組み合わせとして、投与することができる。そのような付加的分子としては、他のＴＬＲ４拮抗物質分子か、又はＴＬＲ４受容体のシグナリングによって媒介されない治療的便益を有する分子が可能である。抗生物質、抗ウイルス、他の免疫賦活剤、他の抗炎症剤、ロイコトリエン拮抗薬、β２作用物質、及びムスカリン性受容体拮抗物質は、そのような付加的分子の例である。
【００４１】
本発明の拮抗物質を使用する治療のための投与の態様は、薬剤をホストに送達できるいずれの適切な経路であってもよい。タンパク質、抗体、抗体フラグメント、及びミメチボディ（MIMETIBODY）（商標）ペプチド鎖、並びにこれらの薬剤の医薬組成物は、非経口的投与、すなわち動脈内、皮下、筋肉内、経皮、静脈内又は経鼻腔による投与に特に有用である。
【００４２】
本発明の方法に有用な拮抗物質は、製薬上許容できる担体に含まれる有効成分としての拮抗物質の有効量を含有する医薬組成物として調製することができる。直ちに注入可能な、好ましくは生理的ｐＨに緩衝された、前記拮抗物質を含む水性けん濁液又は溶液が好適である。非経口的投与のための組成物は、通常、本発明の拮抗物質の溶液、又は、この溶液と好適には水性のキャリアである薬学的に受容可能なキャリアとの混合物よりなることができる。例えば、０．４％生理食塩水又は０．３％グリセリンなどの、種々の水性キャリアを援用することができる。これらの溶液は滅菌され、そして粒子状物質を含まない。これらの溶液は、従来の、よく知られた殺菌技術（例えば、ろ過）などにより殺菌される。これらの組成物は、ｐＨ調整剤及び緩衝剤など製薬上許容できるオージリアリ物質を、およその生理学的条件により必要に応じて含有できる。そのような薬学的製剤中の本発明の拮抗物質の濃度は、幅広く変化することができ、すなわち、重量百分率で約０．５％未満から通常は約１％又は少なくとも約１％から、１５又は２０％まで変化でき、主に選択された投与の態様に適合した液体の容積、粘度などに基づいて選択される。
【００４３】
したがって、本発明の方法に有用な筋肉内注射用の薬学的組成物は、１ｍＬの無菌緩衝水、及び約１ｎｇから約１００ｍｇの間の、例えば約５０ｎｇから約３０ｍｇの間の、又はより好ましくは約５ｍｇから約２５ｍｇの間のＴＬＲ４拮抗物質を含むように調製されることができる。同様に、静脈内注射用の本発明の薬学的組成物は、２５０ｍＬの無菌リンゲル溶液、及び約１ｍｇから約３０ｍｇの、又はより好ましくは、約５ｍｇから約２５ｍｇの本発明の拮抗物質を含むように調製されることができる。非経口投与可能な組成物を調製する実際の方法は周知であり、例えば、「レミントン製薬科学（Remington's Pharmaceutical Science）」第１５版マック出版（Mack Publishing Company）（ペンシルベニア州イーストン）に、より詳細に記載されている。ｍＡｂ（例えばＭＴＳ５１０）又はＴＬＲ４−ＥＣＤのようなＴＬＲ４拮抗物質の投与量は、動物体重１ｋｇ当たり約０．０１ｍｇ〜動物体重１ｋｇ当たり５ｍｇが可能である。
【００４４】
本発明の方法に有用なＴＬＲ４拮抗物質は、製剤中に含まれるとき、一回用量の形態で存在することができる。適切な治療に有効な量又は投与量は、当業者であれば直ちに決定することができる。決定された投与量は、必要ならば、治療期間中、医師により適切として選ばれた適切な時間的間隔をおいて、反復投与することができる。
【００４５】
本発明の方法に有用なペプチド鎖ＴＬＲ４拮抗物質は、保管のために凍結乾燥し、使用前に好適な担体にて再構成することができる。この技術は従来の免疫グロブリン及びタンパクの調製において有効であることが示されており、周知の凍結乾燥と再構成の技術を援用することができる。
【００４６】
本発明の方法のいくつかの実施形態において、ＴＬＲ４拮抗物質は、ＴＬＲ４と反応性の単離抗体である。抗体は、例えば、与えられたＴＬＲ４ペプチド鎖（例えば、人類ＴＬＲ４イソ型Ａ）又はＴＬＲ４含有複合体と特異的に結合する抗体であるとき、ＴＬＲ４と反応性である。ＴＬＲ４と反応性の抗体のような拮抗物質の結合は、それがそのような結合を用いて第１のペプチド鎖（例えば、人類ＴＬＲ４イソ型Ａ）の存在を検知できるが、第２の相同のペプチド鎖（例えば、アルブミン）を検知できないとき、与えられたペプチド鎖に特異的な結合である。この特異的結合を用いて、２つのペプチド鎖を互いに区別することができる。特異的結合は、ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット、並びに当該技術分野で周知の他の技法のような従来の技法を用いて分析することができる。
【００４７】
抗体拮抗物質の例としては、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＧａ、ＩｇＭイソ型の抗体が挙げられる。加えて、そのような拮抗物質抗体を、グリコシル化、異性化、アグリコシレーションのようなプロセス、又はポリエチレングリコール部分の付加（ペジレーション（pegylation））及び脂質化など非天然に発生する共有結合修飾のようなプロセスによって、翻訳後に修飾することができる。そのような修飾は生体内でも生体外でも可能である。完全なヒト、ヒト化、及び親和力が成熟した抗体分子又は抗体フラグメント、並びにミメチボディ（MIMETIBODY）（商標）ペプチド鎖、融合タンパク質及びキメラタンパク質は、本発明の方法において有用である。
【００４８】
本発明の方法において有用な抗体拮抗物質は、ＴＬＲ４か、又はＫdが約１０-7、１０-8、１０-9、１０-10、１０-11又は１０-12ＭであるＴＬＲ４を含む複合体か、と特異的に結合することができる。ＴＬＲ４受容体、又はＴＬＲ４を含む複合体の与えられた分子の親和力は、任意の好適な方法を用いて実験的に決定することができる。そのような方法は、当業者に既知のバイアコア（Biacore）又はＫｉｎＥｘＡ計測、ＥＬＩＳＡ又は競合的結合分析を利用することができる。
【００４９】
与えられたＴＬＲ４ホモログと望ましい親和力で結合する抗体拮抗物質分子は、抗体親和力成熟及び他の、非抗体分子に好適な当該技術分野で認識されている技法を含む技法によって、タンパク質変異型又はフラグメントのライブラリから選択することができる。
【００５０】
本発明の方法のいくつかの実施形態において、ＴＬＲ４拮抗物質は、ＴＬＲ４と反応性でありかつモノクローナル抗体ＭＴＳ５１０の抗原結合能力を有する単離抗体である。ＴＬＲ４と反応性の単離抗体は、標準の競合的結合分析においてそのような単離抗体が与えられたＴＬＲ４分子と結合するためにｍＡｂ ＭＴＳ５１０と競合するとき、ｍＡｂ ＭＴＳ５１０の抗原結合能力を有する。そのような分析としては、例えば、競合的結合ＥＬＩＳＡ分析が挙げられる。当業者は、また、２つの抗体同士の抗原結合の競合を検出するために適切なその他の方法を認識するであろう。
【００５１】
本発明の方法に有用なＴＬＲ４拮抗物質抗体は、更に、ｍＡｂ ＭＴＳ５１０のラット重鎖アミノ酸配列及びラット軽鎖アミノ酸配列との同一性によって選択されたヒトフレームワーク領域を更に含むことができる。
【００５２】
本発明の方法のいくつかの実施形態において、ＴＬＲ４拮抗物質はＴＬＲ４の細胞外領域を含む。
【００５３】
本発明の方法のいくつかの実施形態において、ＴＬＲ４拮抗物質は、配列番号４に示されるヒトＴＬＲ４イソ型Ａ細胞外領域アミノ酸配列を含むペプチド鎖である。
【００５４】
本発明の方法のいくつかの実施形態において、ＴＬＲ４拮抗物質は、配列番号４に示されるマウスＴＬＲ４イソ型Ａ細胞外領域アミノ酸配列を含むペプチド鎖である。
【００５５】
ここで、以下の具体的かつ非限定的な実施例を参照して、本発明を説明する。
【実施例】
【００５６】
（実施例１）
ＴＬＲ４、ＭＤ２及びＣＤ１４転写レベルは、ヒト変形性関節症患者からの関節軟骨及び滑膜細胞において増加する。
【００５７】
人類ＴＬＲ４イソ型Ａ（ｈＴＬＲ４Ａ）及びＣＤ１４転写レベルは、変形性関節症でない人からの関節軟骨及び滑膜細胞に比べて、ヒト変形性関節症患者からの関節軟骨及び滑膜細胞において増加する（図１及び図３）。
【００５８】
ヒト変形性関節症患者及び変形性関節症患者でない人からの関節軟骨及び滑膜細胞から抽出したトータルＲＮＡのｈＴＬＲ４Ａ、ＭＤ２及びＣＤ１４転写レベルを実時間ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）によって測定した。トータルＲＮＡは、トリゾル（Trizol）（商標）（インビトロジェン社（Invitrogen Corp）（カリフォルニア州カールスバッド））を用いて試料から抽出し、ＲＮＥａｓｙミニキット（キアジェン社（Qiagen Inc）（カリフォルニア州バレンシア）を用いて単離した。次に、単離したＲＮＡを必要に応じてプールした。
【００５９】
ｃＤＮＡは、オムニスクリプト（Omniscript）（商標）（キアジェン社（Qiagen Inc）（カリフォルニア州バレンシア）を製造業者の指示に従って用いて調製した。タグマン（TaqMan）（商標）カスタム低密度アレイ（ＬＤＡ）カード（アプライドバイオシステムズ社（Applied Biosystems）（カリフォルニア州フォスターシティ）を用いて、１００ｎｇのｃＤＮＡを増幅した。プライマーエクスプレス（Primer Express）（商標）ソフトウェア（アプライドバイオシステムズ社（Applied Biosystems））を用いて、プローブとプライマーの組み合わせを設計した。次に、タグマン（TaqMan）（商標）ＲＴ−ＰＣＲ（アプライドバイオシステムズ社（Applied Biosystems））で、ＡＢＩプリズム（ABI PRISM）（商標）７０００ＨＴ計測（アプライドバイオシステムズ社（Applied Biosystems））を行った。
【００６０】
ＡＢＩプリズム（ABI PRISM）（商標）７０００ＨＴ計測及び関連ソフトウェアを用いて、ＰＣＲの初期指数増殖期におけるデータ収集及び転写量子化を実行した。１８ＳリボゾームＲＮＡの転写レベルに対して、個々の転写レベルを正規化した。データは、変形性関節症患者からの関節軟骨及び滑膜細胞におけるｍＲＮＡ転写レベルを、変形性関節症でない個体からのものと相対した平均フォールド変化として表した。データは、４ドナー（Ｎ＝４）からのＲＮＡ試料を代表する。
【００６１】
このデータは、変形性関節症でない個体からのものに比べて、変形性関節症患者からの関節軟骨及び滑膜細胞におけるｈＴＬＲ４Ａ及びＣＤ１４転写レベルが増加していることを示す（図１及び図３）。図２に図示されるように、ＭＤ２転写レベルは軟骨で増加している。ｈＴＬＲ４Ａ、ＭＤ２及びＣＤ１４は、ＬＰＳのようなリガンド及び他のシグナルによる活性に応答して、ＴＬＲ４シグナリングを媒介する複合体を形成する。更に、ＴＬＲ４活性化は、炎症性サイトカインの放出を増加することができる（下記実施例３を参照）。したがって、ここに示す結果は、ＴＬＲ４活性化及び付随する炎症反応が変形性関節症疾患の発症において重量な役割りを果たすことができることを示している。
【００６２】
（実施例２）
関節軟骨成分の合成のリポ多糖体（ＬＰＳ）媒介性の減少硫酸化グリコサミノグリカン（Ｓ−ＧＡＧ）はＴＬＲ４依存性であり、ＴＬＲ４拮抗物質ｍＡｂによって逆行させられる。
【００６３】
関節軟骨成分Ｓ−ＧＡＧの合成のリポ多糖体（ＬＰＳ）媒介性の減少は、ＴＬＲ４依存性であり、野生型マウスにおいて生ずるが、ＴＬＲ４ノックアウトマウスでは生じない。ＬＰＳは、ＴＬＲ４受容体及の作動物質リガンドであり、ＴＬＲ４が媒介するシグナリングを活性する。図４及び５に示されるように、野生型マウス関節軟骨外植片におけるＳ−ＧＡＧの合成はＬＰＳ処置によって減少するが、ＴＬＲ４ノックアウトマウスからの関節軟骨外植片のＬＰＳ処置は、対照と比べてＳ−ＧＡＧの合成を減少しない。重要なのは、ＬＰＳ及びＴＬＲ４／ＭＤ２複合体結合性拮抗物質ｍＡｂ（ＭＴＳ５１０）での野生型マウス関節軟骨外植片の処置が、ＬＰＳのみで処置した外植片に比べてＳ−ＧＡＧ合成の増加をもたらしたことである（図４）。
【００６４】
これらの実験では、生後５週の野生型マウス（ハツカネズミ）又はＴＬＲ４ノックアウトマウスの大腿骨頭から関節軟骨外植片を取り出した。ＴＬＲ４ノックアウトマウスは、遺伝子エンコーディングｍＴＬＲ４が不活性化されたマウスである。軟骨外植片は、標準的方法を用いて準備及び維持した。軟骨外植片を２００μＬの外植片培地にて３〜５日間培養したところで使用済み培地を取り除き、実験０日目に新鮮な培地と交換した。「対照」外植片は野生型（図４）又はＴＬＲ４ノックアウトマウスからの未処置外植片である（図５）。野生型（図４）又はＴＬＲ４ノックアウトマウス（図５）からの「ＬＰＳ」処置外植片をこの培地にて２日目から３日間、１０ｎｇ／ｍｌの濃度のＬＰＳで処置した。野生型（図４）又はＴＬＲ４ノックアウトマウス（図５）からの「抗ＴＬＲ４／ＭＤ２ ｍＡｂ」処置外植片は、この培地にて２０μｇ／ｍｌの濃度のＴＬＲ４／ＭＤ２複合体結合拮抗物質ｍＡｂ ＭＴＳ５１０（インビボジェン（Invivo Gen）又はイーバイオサイエンス（eBioscience, Inc.）（カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて０日目に処置を開始した。野生型（図４）又はＴＬＲ４ノックアウトマウス（図５）からの「ＬＰＳ＋抗ＴＬＲ４／ＭＤ２ ｍＡｂ」処置外植片は、２０μｇ／ｍｌの濃度でＴＬＲ４／ＭＤ２複合体結合拮抗物質ｍＡｂ ＭＴＳ５１０の培地にて０日目に開始し、２日目から３日間、この培地にて１０ｎｇ／ｍｌの濃度のＬＰＳで処置した。５日目に外植片を一晩35Ｓラベル付けし、Ｓ−ＧＡＧ（硫酸化グリコサミノグリカン）への35Ｓ組み込みを、ボバクツ（Bobacz）ら（５６ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｒｈｅｕｍ．１８８０（２００７年））が記述しているように測定した。
【００６５】
その結果（図４及び図５）は、ｍＡｂＭＴＳ５１０のようなＴＬＲ４受容体複合体活性拮抗物質が、変形性関節症のような疾患の軟骨劣化を治療及び予防できることを示している。図４及び図５のデータは、平均−／＋標準偏差（Ｎ＝４）として表されている。図３で、「**」＝Ｐ＜０．０５（対「対照」）であり、「****」＝Ｐ＜０．００１（対「ＬＰＳ」）である。
【００６６】
（実施例３）
関節軟骨からの、ＬＰＳ誘導による炎症性サイトカインの放出は、ＴＬＲ４活性に依存する。
【００６７】
関節軟骨からの、ＬＰＳ誘導による炎症性サイトカインＴＮＦ−α、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＧＭ−ＣＳＦ、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−１０、ＫＣ１２、ＭＣＰ１、ＩＬ−６、ＩＰ−１０、Ｇ−ＣＳＦ、ＭＩＰ−１αの放出は、ＴＬＲ４活性に依存する（図６、図７、図８、図９、図１０、図１１、図１２、図１３、図１４、図１５、図１６、図１７を参照）。ＴＬＲ４拮抗物質ｍＡｂによるＴＬＲ４活性の阻止、あるいはマウスのＴＬＲ４遺伝子のノックアウトによって、これらの炎症性サイトカインの放出を予防又は減少した（図６、図７、図８、図９、図１０、図１１、図１２、図１３、図１４、図１５、図１６、図１７を参照）。
【００６８】
これらの実験では、上記実施例２のように、野生型（「ＷＴ」）及びＴＬＲ４ノックアウト（「ＫＯ」）マウスからの関節軟骨外植片を準備し、ＬＰＳで処置した。「対照」外植片は、野生型又はＴＬＲ４ノックアウトマウスからの未処置外植片である。野生型又はＴＬＲ４ノックアウトマウスからの「ＬＰＳ」処置外植片をこの培地にて、２日目から開始して３日間、１０ｎｇ／ｍｌの濃度のＬＰＳで処置した。野生型又はＴＬＲ４ノックアウトマウスからの「ｍＡｂ」処置した外植片は、この培地にて２０μｇ／ｍｌの濃度のＴＬＲ４／ＭＤ２複合体結合拮抗物質ｍＡｂ ＭＴＳ５１０で０日目に処置を開始した。野生型又はＴＬＲ４ノックアウトマウスからの「ＬＰＳ＋ｍＡｂ」処置した外植片は、０日目に、２０μｇ／ｍｌの濃度のＴＬＲ４／ＭＤ２複合体結合拮抗物質ｍＡｂ ＭＴＳ５１０でこの培地にて開始し、２日目に１０ｎｇ／ｍｌの濃度のＬＰＳにして３日間処置した。次に、関節軟骨外植片細胞培養上清のサイトカインレベルを、ルミネックス（LUMINEX）（登録商標）計測（ルミネックス（LUMINEX）社（テキサス州オースティン））のＴＮＦ−α、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＧＭ−ＣＳＦ、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−１０、ＫＣ１２、ＭＣＰ１、ＩＬ−６、ＩＰ−１０、Ｇ−ＣＳＦ、及びＭＩＰ−１αに特異的なｍＡｂ共役ビードて適宜測定した。それぞれのサイトカインのルミネックス（LUMINEX）（登録商標）分析は、製造業者の指示に従って行った。
【００６９】
その結果（図６、図７、図８、図９、図１０、図１１、図１２、図１３、図１４、図１５、図１６、図１７を参照）は、ｍＡｂ ＭＴＳ５１０処置による又は減少するＴＬＲ４遺伝子発現によるような、ＴＬＲ４受容体複合体の活性の拮抗作用が、炎症性サイトカインの放出の予防又は減少によって、変形性関節症のような疾患による軟骨の劣化を治療及び予防できることを示している。図６、図７、図８、図９、図１０、図１１、図１２、図１３、図１４、図１５、図１６、図１７において、最初の４本の棒は野生型マウス関節軟骨外植片からのデータであり、残りの４本の棒はＴＬＲ４ノックアウトマウスの関節軟骨外植片からのデータを表す。図６、図７、図８、図９、図１０、図１１、図１２、図１３、図１４、図１５、図１６、図１７は、平均−／＋標準偏差（Ｎ＝４）として表されている。
【００７０】
（実施例４）
ヒト軟骨細胞の関節軟骨成分Ｓ−ＧＡＧの合成の、ＬＰＳ媒介による減少は、ＴＬＲ４拮抗物質ｈＴＬＲ４−ＥＣＤ処置によって逆行させられる。
【００７１】
ヒト軟骨細胞における関節軟骨成分Ｓ−ＧＡＧの合成のリポ多糖体（ＬＰＳ）媒介性の減少は、ＴＬＲ４拮抗物質ｈＴＬＲ４−ＥＣＤ処置によって逆行させられる（図１８）。図１８に示すように、アルギン酸培養におけるヒト軟骨細胞の関節軟骨成分のＳ−ＧＡＧの合成は、ＬＰＳ処置によって減少する。重要なことは、ｈＴＬＲ４−ＥＣＤのみ又はＬＰＳ及びｈＴＬＲ４−ＥＣＤでの処置では、ＬＰＳのみで処置した軟骨細胞に比べてＳ−ＧＡＧ合成の増加がもたらされたことである（図１８）。
【００７２】
これらの実験では、健康なボランティアからのヒト軟骨細胞のアルギン酸培養は、アーティキュラーエンジニアリング社（Articular Engineering, LLC）（イリノイ州ノースブルック）から供給されたものであり、供給元の指示に従って維持した。「対照」軟骨細胞は処置しなかった。「ＬＰＳ」処置軟骨細胞は、２日目からこの培地にて１μｇ／ｍｌの濃度で３日間、ＬＰＳで処置された。「ＬＰＳ＋ポリミキシンＢ」処置軟骨細胞は、ＴＬＲ４拮抗物質であるＬＰＳ類似体ポリミキシンＢで、２０μｇ／ｍｌの濃度で１時間処置された後、２日目から３日間、この培地にて１μｇ／ｍｌの濃度でＴＬＲ４受容体作動物質ＬＰＳで処置された。「ＬＰＳ＋ＴＬＲ４−ＥＣＤ」処置軟骨細胞は、５０μｇ／ｍｌの濃度の、ＴＬＲ４拮抗物質であるＴＬＲ４−ＥＣＤで０日目から処置された後、２日目から３日間、この培地にて１μｇ／ｍｌの濃度のＬＰＳで処置された。ＴＬＲ４−ＥＣＤはＴＬＲ４受容体拮抗物質であり、ｈＴＬＲ４Ａの細胞外領域及びＩｇＧ１イソ型抗体のＦｃ領域を含む。ＴＬＲ４−ＥＣＤは配列番号４に示されるアミノ酸配列を有し、配列番号３に示される核酸配列を有するｃＤＮＡによってエンコードされる。ここで使用したＴＬＲ４−ＥＣＤ製剤は、約２５％のＭＤ２を含有する。「ＴＬＲ４−ＥＣＤ」処置軟骨細胞は、０日目から５０μｇ／ｍｌの濃度のＴＬＲ４拮抗物質ＴＬＲ４−ＥＣＤでこの培地にて処置した。「ＩＬ−１α」処置軟骨細胞は、１０ｎｇ／ｍｌの濃度のＩＬ１−αでこの培地にて２日目から３日間処置した。「ＴＮＦ−α」処置軟骨細胞は、５０ｎｇ／ｍｌの濃度のＴＮＦ−αでこの培地にて２日目から３日間処置した。５日目に、アルギン酸ビード軟骨細胞細胞培養を35Ｓで一晩ラベル付けした後、Ｓ−ＧＡＧ（硫酸化グリコサミノグリカン）への35Ｓ組み入れを、ボバクツ（Bobacz）ら（５６ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ． Ｒｈｅｕｍ．１８８０（２００７年））が記述している方法で測定した。
【００７３】
その結果（図１８）は、ＴＬＲ４−ＥＣＤのようなＴＬＲ４受容体複合体活性拮抗物質が、変形性関節症のような疾患の軟骨劣化を治療及び予防できることを示している。図１８のデータは、Ｘ軸ディスクリプタの後の括弧内に示すそれぞれの処置群に含まれる培養数とともに、平均−／＋標準偏差として表されている。図１８で、「**」＝Ｐ＜０．０５（「対照」に対して）であり、「****」＝Ｐ＜０．００１（「ＬＰＳ」に対して）である。
【００７４】
（実施例５）
変形性関節症患者からのヒト軟骨細胞の関節軟骨成分Ｓ−ＧＡＧ合成のＬＰＳ媒介による減少は、ＴＬＲ４拮抗物質ｈＴＬＲ４−ＥＣＤ処置によって逆行させられる。
【００７５】
変形性関節症患者からの関節軟骨成分Ｓ−ＧＡＧの合成のリポ多糖体（ＬＰＳ）媒介性の減少は、ＴＬＲ４拮抗物質ｈＴＬＲ４−ＥＣＤ処置によって逆行させられる（図１９）。図１９に示すように、アルギン酸培養における、変形性関節症患者からのヒト軟骨細胞の関節軟骨成分のＳ−ＧＡＧの合成は、ＬＰＳ処置によって減少する。重要なことは、ｈＴＬＲ４−ＥＣＤのみ又はＬＰＳ及びｈＴＬＲ４−ＥＣＤでの処置では、ＬＰＳのみで処置した変形性関節症患者からの軟骨細胞に比べてＳ−ＧＡＧ合成の増加がもたらされたことである（図１９）。
【００７６】
これらの実験では、健康なボランティアからの変形性関節症患者からのヒト軟骨細胞のアルギン酸培養は、アーティキュラーエンジニアリング社（Articular Engineering, LLC）（イリノイ州ノースブルック）から供給されたものであり、供給元の指示に従って維持した。変形性関節症患者からのヒト軟骨細胞の「対照」、「ＬＰＳ」、「ＬＰＳ＋ＴＬＲ４−ＥＣＤ」、「ＴＬＲ４−ＥＣＤ」、「ＴＮＦアルファ（ＴＮＦα）」、「ＩＬ−１アルファ（ＩＬ−１α）」での処置については上記実施例４で説明した。「ＩＧＦ１」（インスリン様成長因子１）処置軟骨細胞は、１００ｎｇ／ｍｌの濃度のＩＧＦ１でこの培地にて２日目から３日間処置された。ＩＧＦ１は、ヒト軟骨細胞によるｓＧＡＧ合成を刺激するものとして既知であり、陽性対照として使用した。「ＬＰＳ＋ＩＧＦ１」処置軟骨細胞は、この培地にて１０ｎｇ／ｍｌの濃度のＩＧＦ１で処置を開始し、１μｇ／ｍｌの濃度のＬＰＳで、２日目から３日間この培地にて処置した。「ｌｇＧ１」処置軟骨細胞は、５０μｇ／ｍｌ濃度のｌｇＧ１ Ｆｃ領域でこの培地にて０日目から処置した。「ＬＰＳ＋ＩＧＦ１」処置軟骨細胞は、この培地にて５０μｇ／ｍｌの濃度のＩＧＦ１で０日目に処置を開始し、１μｇ／ｍｌの濃度のＬＰＳで、２日目から３日間この培地にて処置した。「ｌｇＧ１」はｌｇＧ１ Ｆｃ領域のみを含み、Ｆｃ領域を含む拮抗物質ＴＬＲ−４−ＥＣＤのＦｃ部分に対する負の対照として使用した。５日目に、アルギン酸ビード軟骨細胞細胞培養を35Ｓで一晩ラベル付けした後、Ｓ−ＧＡＧ（硫酸化グリコサミノグリカン）への35Ｓ組み入れを、ボバクツ（Bobacz）ら（５６ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｒｈｅｕｍ．１８８０（２００７年））が記述している方法で測定した。
【００７７】
その結果（図１９）は、ｍＡｂ ＭＴＳ５１０のようなＴＬＲ４受容体複合体が活性する拮抗物質が、変形性関節症患者における軟骨劣化を治療及び予防できることを示している。図１９のデータは、Ｘ軸ディスクリプタの後の括弧内に示すそれぞれの処置群に含まれる培養数とともに、平均−／＋標準偏差として表されている。図１９において、「**」＝Ｐ＜０．０５（「対照」に対して）、「***」＝Ｐ＜０．００１（「対照」に対して）、「****」＝Ｐ＜０．００１（「ＬＰＳ」に対して）、ＮＣ＝負対照である。
【００７８】
本発明はここに完全に記述され、添付の本発明の請求項の趣旨及び範囲を逸脱しない範囲での、本発明に対する多くの変更及び改良をなしうることは、当業者にとり明白である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トール様受容体４（ＴＬＲ４）拮抗物質の治療有効量を、変形性関節症の治療に十分な時間にわたってそれを必要とする患者に投与することを含む、変形性関節症の治療法。
【請求項２】
前記ＴＬＲ４拮抗物質が、ＴＬＲ４と反応性の単離抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＴＬＲ４拮抗物質が、ＴＬＲ４と反応性でありかつモノクローナル抗体ＭＴＳ５１０の抗原結合能力を有する単離抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＴＬＲ４拮抗物質が、ＴＬＲ４の細胞外領域を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＴＬＲ４拮抗物質が、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むペプチド鎖である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＴＬＲ４拮抗物質が、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含むペプチド鎖である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
ＴＬＲ４拮抗物質の治療有効量を、変形性関節症の予防に十分な時間にわたってそれを必要とする患者に投与することを含む、変形性関節症の予防法。
【請求項８】
前記ＴＬＲ４拮抗物質が、ＴＬＲ４と反応性の単離抗体である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＴＬＲ４拮抗物質が、ＴＬＲ４と反応性でありかつモノクローナル抗体ＭＴＳ５１０の抗原結合能力を有する単離抗体である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＴＬＲ４拮抗物質が、ＴＬＲ４の細胞外領域を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＴＬＲ４拮抗物質が、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むペプチド鎖である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＴＬＲ４拮抗物質が、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含むペプチド鎖である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１】
トール様受容体４（ＴＬＲ４）拮抗物質の治療有効量を、変形性関節症の治療に十分な時間にわたってそれを必要とする患者に投与することを含む、変形性関節症の治療法。
【請求項２】
前記ＴＬＲ４拮抗物質が、ＴＬＲ４と反応性の単離抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＴＬＲ４拮抗物質が、ＴＬＲ４と反応性でありかつモノクローナル抗体ＭＴＳ５１０の抗原結合能力を有する単離抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＴＬＲ４拮抗物質が、ＴＬＲ４の細胞外領域を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＴＬＲ４拮抗物質が、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むペプチド鎖である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＴＬＲ４拮抗物質が、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含むペプチド鎖である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
ＴＬＲ４拮抗物質の治療有効量を、変形性関節症の予防に十分な時間にわたってそれを必要とする患者に投与することを含む、変形性関節症の予防法。
【請求項８】
前記ＴＬＲ４拮抗物質が、ＴＬＲ４と反応性の単離抗体である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＴＬＲ４拮抗物質が、ＴＬＲ４と反応性でありかつモノクローナル抗体ＭＴＳ５１０の抗原結合能力を有する単離抗体である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＴＬＲ４拮抗物質が、ＴＬＲ４の細胞外領域を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＴＬＲ４拮抗物質が、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むペプチド鎖である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＴＬＲ４拮抗物質が、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含むペプチド鎖である、請求項１０に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【公表番号】特表２０１１−５０２１７０（Ｐ２０１１−５０２１７０Ａ）
【公表日】平成２３年１月２０日（２０１１．１．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３２２８１（Ｐ２０１０−５３２２８１）
【出願日】平成２０年１０月３１日（２００８．１０．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８２００２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０５９１４３
【国際公開日】平成２１年５月７日（２００９．５．７）
【出願人】（５０９０８７７５９）セントコア・オーソ・バイオテツク・インコーポレーテツド (77)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１月２０日（２０１１．１．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月３１日（２００８．１０．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８２００２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０５９１４３
【国際公開日】平成２１年５月７日（２００９．５．７）
【出願人】（５０９０８７７５９）セントコア・オーソ・バイオテツク・インコーポレーテツド (77)
【Ｆターム（参考）】
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