変性多糖の製造方法
【課題】一部を化学修飾した変性多糖の製造方法を提供することを目的とする。
【解決手段】化学修飾された多糖（Ａ）及び下記リボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ｂ）を多糖合成酵素（Ｃ）の存在下で反応させる変性多糖の製造方法。
リボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ｂ）：トリオース（ｂ−１）、テトロース（ｂ−２）、ペントース（ｂ−３）、ヘキソース（ｂ−４）、ヘプトース（ｂ−５）及びその他の単糖（ｂ−６）からなる群より選ばれる少なくとも１種の単糖（ｂ）が有する少なくとも１つのヒドロキシル基の水素原子が置換された糖ヌクレオチド。
【解決手段】化学修飾された多糖（Ａ）及び下記リボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ｂ）を多糖合成酵素（Ｃ）の存在下で反応させる変性多糖の製造方法。
リボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ｂ）：トリオース（ｂ−１）、テトロース（ｂ−２）、ペントース（ｂ−３）、ヘキソース（ｂ−４）、ヘプトース（ｂ−５）及びその他の単糖（ｂ−６）からなる群より選ばれる少なくとも１種の単糖（ｂ）が有する少なくとも１つのヒドロキシル基の水素原子が置換された糖ヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は変性多糖の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多糖のなかでもヒアルロン酸は、牛の眼球、鶏冠、動物の緩衝組織、胎盤、癌細胞及び皮膚などの生体組織に多量に含まれているもので、グルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンとがβ１，３結合とβ１，４結合で交互に結合した直鎖状の多糖であり、分子量が１０5〜１０6Ｄａの高分子量のグルコサミノグリカンである。ヒアルロン酸は、粘度が高く、高い保湿効果を有し、物理的摩擦に対する潤滑効果及び細菌などの侵入に対する保護効果が優れているという性質を持つ。
ヒアルロン酸はこれらの性質を持つので、化粧品添加剤、関節炎治療剤、創傷被覆剤、眼科手術用手術補助剤及び外科手術後の癒着阻止剤などの医薬品として広範囲に使用されている。
【０００３】
ヒアルロン酸は、特に保湿性が優れることから、化粧品添加剤として多用されている。しかし、汗などによって皮膚表面から流れ去ってしまう問題がある。
また、ヒアルロン酸分子中のヒドロキシル基及び／又はカルボキシル基に、カルボン酸及び／又はアルコール等を反応させてエステル化する等により、ヒアルロン酸を化学修飾したヒアルロン酸誘導体の製造方法が知られている（特許文献１）。しかしながら、ヒアルロン酸にエステル化反応等の化学修飾を行うと、分子全体が化学修飾されてしまうため、ヒアルロン酸の親水性が極端に低下する問題がある。また、ヒアルロン酸の保湿性等の優れた性質が失われてしまう問題もある。そこで、ヒアルロン酸を含む多糖において、分子全体でなく、分子の一部を化学修飾した変性多糖の製造方法の開発が望まれている。
【０００４】
【特許文献１】特開平０６−２９８８０４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、一部を化学修飾した変性多糖の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記の目的を達成するべく検討を行った結果、本発明に到達した。
すなわち本発明は、化学修飾された多糖（Ａ）及び下記リボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ｂ）を多糖合成酵素（Ｃ）の存在下で反応させる変性多糖の製造方法である。
リボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ｂ）：トリオース（ｂ−１）、テトロース（ｂ−２）、ペントース（ｂ−３）、ヘキソース（ｂ−４）、ヘプトース（ｂ−５）及び下記単糖（ｂ−６）からなる群より選ばれる少なくとも１種の単糖（ｂ）が有する少なくとも１つのヒドロキシル基の水素原子が下記化学式（１）〜（５）のいずれか１つの官能基で置換された糖ヌクレオチド。
【化１】
【化２】
【化３】
【化４】
【化５】
単糖（ｂ−６）：（ｂ−１）、（ｂ−２）、（ｂ−３）、（ｂ−４）及び（ｂ−５）からなる群より選ばれる単糖において、この単糖が有する水素原子、ヒドロキシル基及びヒドロキシメチル基からなる群より選ばれる少なくとも１種が下記置換基（Ｄ）で置換された単糖。
置換基（Ｄ）：カルボキシル基、アミノ基、Ｎ−アセチルアミノ基、スルホ基、メチルエステル基、Ｎ−グリコリル基、メチル基、１，２，３−トリヒドロキシプロピル基、リン酸基及び２−カルボキシ−２−ヒドロキシエチル基からなる群より選ばれる少なくとも１種の置換基。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の変性多糖の製造方法は、一部を化学修飾した新規な変性多糖を製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明の変性多糖の製造方法は、化学修飾された多糖（Ａ）及びリボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ｂ）を多糖合成酵素（Ｃ）の存在下で反応させるものである。
【０００９】
化学修飾された多糖（Ａ）としては、多糖に化学反応によって他の化合物を化学結合させたものが含まれる。
多糖は、後述する単糖（ｂ−１）〜（ｂ−６）が複数連なったものであり、具体的には、ヒアルロン酸、デンプン、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、セルロース、キチン、キトサン、アガロース、カラギーナン、ヘパリン、ペクチン、キシログルカン及びキサンタンガム等が含まれる。
（Ａ）として具体的には、下記化合物（Ｅ）と多糖とを反応させた反応生成物等が挙げられる。
化合物（Ｅ）：ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、スルホ基及びリン酸基からなる群より選ばれる少なくとも１種を有する化合物と反応する官能基（ｅ）を有する化合物。
化合物（Ｅ）としては、官能基（ｅ）として、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、スルホ基、ホスホン酸基及びリン酸基からなる群より選ばれる少なくとも１種を有する化合物（Ｅ１）が含まれる。
【００１０】
（Ｅ１）としては、下記（Ｅ１１）〜（Ｅ１５）が含まれる。
（Ｅ１１）：ヒドロキシル基を有する化合物
（Ｅ１２）：カルボキシル基を有する化合物
（Ｅ１３）：アミノ基を有する化合物
（Ｅ１４）：スルホ基を有する化合物
（Ｅ１５）：ホスホン酸基又はリン酸基を有する化合物
（Ｅ１６）：ヒドロキシル基及びカルボキシル基を有する化合物
【００１１】
（Ｅ１１）としては、炭素数１〜１００の１価のアルコール（Ｅ１１１）及び炭素数２〜１００の２価以上のアルコール（Ｅ１１２）が含まれる。
（Ｅ１１１）としては、１価の脂肪族アルコール（Ｅ１１１−１）、１価の芳香脂肪族アルコール（Ｅ１１１−２）、１価の脂肪族アルコールのアルキレンオキサイド付加物（Ｅ１１１−３）、１価のアルキルフェノールのアルキレンオキサイド付加物（Ｅ１１１−４）、１価のモノアルキル又は１価のジアルキルアミンのアルキレンオキサイド付加物（Ｅ１１１−５）が含まれる。
【００１２】
（Ｅ１１１−１）としては、炭素数１〜３０の脂肪族モノオールが含まれ、具体的には、炭素数１〜５の低級アルコール（メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール等）、炭素数６〜３０の高級アルコール（ヘキシルアルコール、オクチルアルコール、デカノール、ウンデカノール、ドデカノール、トリデカノール、テトラデカノール、ペンタデシルアルコール、ヘキサデシルアルコール、ヘプタデカノール、オクタデカノール、オレイルアルコール、ノナデカノール、エイコサノール、セリルアルコール、ミリシルアルコール等）及びそれぞれの分岐鎖アルコール等が挙げられる。これらのうち２種以上を組み合わせてもよい。
【００１３】
（Ｅ１１１−２）としては、炭素数７〜３０の芳香脂肪族モノオールが含まれ、具体的には、ベンジルアルコール等が挙げられる。
【００１４】
（Ｅ１１１−３）としては、上記（Ｅ１１１−１）のアルキレンオキサイド（以下ＡＯと略記する）付加物（重合度＝１〜１００）が含まれる。ＡＯとしては、炭素数２〜１０のものが含まれ、具体的には、エチレンオキサイド（以下、ＥＯと略記する）、１，２−プロピレンオキサイド（以下、ＰＯと略記する）、ブチレンオキサイド及びスチレンオキサイド等が挙げられる。ＡＯとしてはこれら２種以上を併用してもよい。（Ｅ１１１−３）として、具体的には、オレイルアルコールＥＯＰＯ付加物等が挙げられる。
【００１５】
（Ｅ１１１−４）としては、炭素数７〜３０のアルキルフェノールのＡＯ付加物（重合度＝１〜１００）が含まれる。炭素数７〜３０のアルキルフェノールとして、具体的には、ノニルフェノール及びオクチルフェノール等が挙げられる。ＡＯとしては、炭素数２〜１０のものが含まれ、ＥＯ、ＰＯ、ブチレンオキサイド及びスチレンオキサイド等が挙げられる。ＡＯとしてはこれら２種以上を併用してもよい。（Ｅ１１１−４）として、具体的には、ノニルフェノールのＥＯ付加物及びオクチルフェノールのＥＯ付加物等が挙げられる。
【００１６】
（Ｅ１１１−５）としては、炭素数１〜３０のモノアルキル又はジアルキルアミンのＡＯ付加物（重合度＝１〜１００）が含まれる。ＡＯとしては、炭素数２〜１０のものが含まれ、ＥＯ、ＰＯ、ブチレンオキサイド及びスチレンオキサイド等が挙げられる。ＡＯとしてはこれら２種以上を併用してもよい。具体的には、ヘキサデシルアミンＥＯＰＯ付加物、ラウリルアミンＥＯ付加物及びステアリルアミンＥＯＰＯ付加物等が挙げられる。
【００１７】
（Ｅ１１２）として、具体的には、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３及び１，４−ブタンジオール、１，６−ヘキサンジオール、１，１０−デカンジオール、ジエチレングリコール、ネオペンチルグリコール、シクロヘキサンジオール、シクロヘキサンジメタノール、１，４−ビス（ヒドロキシメチル）シクロヘキサン及び１，４−ビス（ヒドロキシエチル）ベンゼン等の２価アルコール；グリセリン及びトリメチロールプロパン等の３価アルコール；ペンタエリスリトール、ソルビトール、マンニトール、ソルビタン、ジグリセリン、ジペンタエリスリトール等、ショ糖、グルコース、マンノース、フルクトース、メチルグルコシド及びその誘導体等の４〜８価のアルコ―ル；フェノール、フロログルシン、クレゾール、ピロガロ―ル、カテコール、ヒドロキノン、ビスフェノ―ルＡ、ビスフェノールＦ、ビスフェノールＳ、１−ヒドロキシナフタレン、１，３，６，８−テトラヒドロキシナフタレン、アントロール、１，４，５，８−テトラヒドロキシアントラセン及び１−ヒドロキシピレン等のフェノ―ル；ポリブタジエンポリオール；ひまし油系ポリオール等が挙げられる。
上記（Ｅ１１）のうち、化学修飾し易さの観点から、（Ｅ１１１）が好ましい。
【００１８】
カルボキシル基を有する化合物（Ｅ１２）としては、炭素数１〜１００の１価のカルボン酸（Ｅ１２１）及び炭素数１〜１００の２価以上のカルボン酸（Ｅ１２２）が含まれる。
（Ｅ１２１）としては、１価の脂肪族カルボン酸（Ｅ１２１−１）、１価の芳香族カルボン酸（Ｅ１２１−２）及び１価の芳香脂肪族カルボン酸（Ｅ１２１−３）が含まれる。
【００１９】
（Ｅ１２１−１）としては、炭素数１〜１００の脂肪族モノカルボン酸が挙げられ、具体的には、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、ブチル酸、バレリアン酸、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、クロトン酸、イソクロトン酸、ソルビン酸、オブツシル酸及びカプロレイン酸等が挙げられる。
【００２０】
（Ｅ１２１−２）としては、炭素数７〜１００の芳香族モノカルボン酸が挙げられ、具体的には、安息香酸、メチル安息香酸、プロピル安息香酸、ヘキシル安息香酸及びドデシル安息香酸等が挙げられる。
【００２１】
（Ｅ１２１−３）としては、炭素数８〜１００の芳香脂肪族モノカルボン酸が挙げられ、具体的には、フェニル酢酸、フェニルプロピオン酸及びフェニルデカン酸等が挙げられる。
【００２２】
２価以上のカルボン酸（Ｅ１２２）としては、炭素数４〜１００のアルカンジカルボン酸（コハク酸、アジピン酸、セバシン酸、アゼライン酸、ドデカンジカルボン酸、オクタデカンジカルボン酸及びデシルコハク酸等）；炭素数６〜１００の脂環式ジカルボン酸［ダイマー酸（２量化リノール酸）等］；炭素数４〜１００のアルケンジカルボン酸（ドデセニルコハク酸、ペンタデセニルコハク酸及びオクタデセニルコハク酸等のアルケニルコハク酸、マレイン酸、フマール酸及びシトラコン酸等）；炭素数８〜１００の芳香族多価カルボン酸（フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸、２，２’-ビベンジルジカルボン酸、トリメリット酸、ヘミリット酸、トリメシン酸、ピロメリット酸及びナフタレン−１，４ジカルボン酸、ナフタレン−２，３，６トリカルボン酸、ジフェン酸、２，３−アントラセンジカルボン酸、２，３，６−アントラセントリカルボン酸及びピレンジカルボン酸等の炭素数８〜１８の芳香族ポリカルボン酸等）等が挙げられる。
上記の（Ｅ１２）のうち、化学修飾し易さの観点から、（Ｅ１２１）が好ましい。
【００２３】
アミノ基を有する化合物（Ｅ１３）としては、炭素数１〜１００のアミン（Ｅ１３１）が含まれる。
（Ｅ１３１）としては、１価の脂肪族アミン（Ｅ１３１−１）、２価以上の脂肪族アミン（Ｅ１３１−２）、脂環式アミン（Ｅ１３１−３）、芳香族アミン（Ｅ１３１−４）及び複素環式アミン（Ｅ１３１−５）が含まれる。
【００２４】
（Ｅ１３１−１）として、具体的には、炭素数１〜１００のモノアルキルアミン（メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン及びブチルアミン等）；炭素数１〜１００のジアルキルアミン（ジメチルアミン、ジエチルアミン、ジプロピルアミン、プロピルメチルアミン及びプロピルエチルアミン等）；炭素数１〜１００のトリアルキルアミン（トリメチルアミン、エチルジメチルアミン、ジエチルメチルアミン、トリエチルアミン、トリｎ−プロピルアミン及びトリｎ−ブチルアミン等）等が挙げられる。
【００２５】
（Ｅ１３１−２）としては、炭素数１〜１００のものが含まれ、具体的には、１，２‐ジアミノエタン、１，２‐プロパンジアミン、１，３−プロパンジアミン、１，４−ブタンジアミン、１，６−ジアミノヘキサン、１，２−ビス(２-アミノエトキシ)エタン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ペンタエチレンヘキサミン、イミノビスプロピルアミン及びビス（ヘキサメチレン）トリアミン等が挙げられる。
【００２６】
（Ｅ１３１−３）としては、炭素数３〜１００のものが含まれ、具体的には、イソホロンジアミン及び１，２‐シクロヘキサンジアミン等が挙げられる。
【００２７】
（Ｅ１３１−４）としては、炭素数６〜１００のものが含まれ、具体的には、アニリン、１，３−フェニレンジアミン、２，４‐トリレンジアミン、１，３‐キシリレンジアミン、１，５−ナフタレンジアミン及び２，３−アントラセンジアミン等が挙げられる。
【００２８】
（Ｅ１３１−５）としては、炭素数３〜１００のものが含まれ、具体的には、ピペラジン、Ｎ−アミノエチルピペラジン及び１，４−ジアミノエチルピペラジン等が挙げられる。
上記（Ｅ１３）のうち、化学修飾し易さの観点から、（Ｅ１３１−１）が好ましい。
【００２９】
（Ｅ１４）としては、スルホ基を１個有する炭素数１〜１００の化合物（Ｅ１４１）及びスルホ基を２個以上有する炭素数１〜１００の化合物（Ｅ１４２）が含まれる。
（Ｅ１４１）としては、炭素数１〜１００の脂肪族モノスルホン酸（メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、プロパンスルホン酸、ブタンスルホン酸、ヘキサンスルホン酸、デカンスルホン酸、ウンデカンスルホン酸及びドデカンスルホン酸等）；炭素数６〜３０芳香族モノスルホン酸（ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ｏ−トルエンスルホン酸、ｍ−トルエンスルホン酸、４−ドデシルベンゼンスルホン酸、４−オクチルベンゼンスルホン酸及びナフタレンスルホン酸等）；炭素数１〜２０のパーフルオロアルカンスルホン酸（トリフルオロメタンスルホン酸等）等が挙げられる。
【００３０】
（Ｅ１４２）としては、炭素数１〜１００の脂肪族ポリスルホン酸（メチオン酸、１，１−エタンジスルホン酸、１，２−エタンジスルホン酸、１，１−プロパンジスルホン酸、１，３−プロパンジスルホン酸及びポリビニルスルホン酸等）；炭素数６〜１００の芳香族ポリスルホン酸（ｍ−ベンゼンジスルホン酸、１，４−ナフタレンスルホン酸、１，５−ナフタレンジスルホン酸、１，６−ナフタレンジスルホン酸、２，６−ナフタレンジスルホン酸、２，７−ナフタレンジスルホン酸及びスルホン化ポリスチレン等）；ビス（フルオロスルホニル）イミド；炭素数２〜１０のビス（パーフルオロアルカンスルホニル）イミド［ビス（トリフルオロメタンスルホニル）イミド、ビス（ペンタフルオロエタンスルホニル）イミド、ビス（ノナフルオロブタンスルホニル）イミド、ペンタフルオロエタンスルホニルトリフルオロメタンスルホニルイミド、トリフルオロメタンスルホニルヘプタフルオロプロパンスルホニルイミド、ノナフルオロブタンスルホニルトリフルオロメタンスルホニルイミド等］等が挙げられる。
上記（Ｅ１４）のうち、化学修飾し易さの観点から、（Ｅ１４１）が好ましい。
【００３１】
（Ｅ１５）としては、リン酸、ピロリン酸、トリリン酸、ポリリン酸、炭素数１〜１００のホスホン酸（メチルホスホン酸ジメチル、エチルホスホン酸ジエチル、メチルホスホン酸ジプロピル、メチルホスホン酸トリブチル、ブチルホスホン酸ジブチル、フェニルホスホン酸ジフェニル、フェニルホスホン酸ジクレジル、フェニルホスホン酸ジキシリル、フェニルホスホン酸フェニルクレジル等）及び炭素数１〜１００のリン酸基（リン酸トリメチル、リン酸トリエチル、リン酸トリプロピル、リン酸トリイソプロピル、リン酸トリブチル、リン酸トリイソブチル、リン酸トリフェニル、リン酸トリクレジル、リン酸トリキシリル、リン酸ジフェニルクレジル、リン酸メチルジフェニル、リン酸フェニルジエチル等）等が挙げられる。
【００３２】
（Ｅ１６）としては、炭素数２〜１００のヒドロキシカルボン酸が含まれ、具体的には、脂肪族ヒドロキシカルボン酸（グリコール酸、乳酸、２−ヒドロキシ酪酸、６−ヒドロキシヘキサン酸、２，８−ジヒドロキシカプリル酸、１０−ヒドロキシカプリン酸、１２−ヒドロキシラウリン酸、１６−ヒドロキシパルミチン酸、１８−ヒドロキシオレイン酸、２２−ヒドロキシベヘニン酸、りんご酸及びクエン酸等）；芳香族ヒドロキシカルボン酸（サリチル酸、ｍ−ヒドロキシ安息香酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、４−ヒドロキシフタル酸、５−ヒドロキシトリメリット酸及び３−ヒドロキシピロメリット酸等）等が挙げられる。
【００３３】
上記（Ｅ）のうち、原料の入手のしやすさ及び得られる変性多糖の物性の観点から、（Ｅ１１）、（Ｅ１２）及び（Ｅ１６）が好ましく、さらに好ましくは１価の脂肪族アルコール（Ｅ１１１−１）及び炭素数１〜１００の１価のカルボン酸（Ｅ１２１）であり、特に好ましくはメタノール及び酢酸からなる群より選ばれる少なくとも１種である。
また、化学修飾された多糖（Ａ）として、（Ａ）を製造し易い及び得られる変性多糖の物性の観点から、多糖が有するヒドロキシル基及び／又はカルボキシル基がエステル化された多糖であることが好ましく、さらに好ましくは多糖が有するヒドロキシル基及び／又はカルボキシル基がアセチル化された多糖であり、次にさらに好ましくは多糖が有するヒドロキシル基及び／又はカルボキシル基がアセチル化されたヒアルロン酸である。
【００３４】
化学修飾された多糖（Ａ）中には、変性多糖を大量に得る観点から、（Ａ）１分子の糖鎖を構成する末端の単糖のうち、少なくとも２つの末端の単糖が化学修飾されていない多糖分子を含むことが好ましい。（Ａ）分子が、末端の単糖が修飾された多糖分子である場合、多糖合成酵素（Ｃ）が伸長反応を行う効率が悪くなる。したがって、（Ａ）中に少なくとも２つの末端の単糖が化学修飾されていない多糖分子を含むことが好ましい。
（Ａ）分子の糖鎖を構成する末端の単糖が化学修飾されていない多糖（Ａ）を作成する方法としては、化学修飾された多糖（Ａ）を合成する際に、後述する置換率が１未満となるように合成する方法等が挙げられる。具体的には、化学修飾させる前の多糖が有する官能基｛ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、スルホ基及びリン酸基｝のうち、ヒドロキシル基と反応しうる（Ｅ）の量を、ヒドロキシル基のモル数よりも少なくすること等が挙げられる。
【００３５】
化学修飾された多糖（Ａ）が、多糖が有するカルボキシル基を化合物（Ｅ）で修飾したものである場合、（Ｅ１１）で修飾する方法としては、従来のカルボキシル基を有する化合物とヒドロキシル基を有する化合物からエステル化合物を作成する方法が使用でき、（Ｅ１３）で修飾する方法としては、従来のカルボキシル基を有する化合物とアミノ基を有する化合物からアミド化合物を作成する方法が使用できる。
また、（Ａ）が多糖が有するヒドロキシル基を化合物（Ｅ）で修飾したものである場合、（Ｅ１２）で修飾する方法としては、従来のヒドロキシル基を有する化合物とカルボキシル基を有する化合物からエステル化合物を作成する方法が使用でき、（Ｅ１４）で修飾する方法としては、従来のヒドロキシル基を有する化合物とスルホ基を有する化合物からスルホン酸エステル化合物を作成する方法が使用でき、（Ｅ１５）で修飾する方法としては、従来のヒドロキシル基を有するかご物とホスホン酸基又はリン酸基を有する化合物からリン酸エステル化合物を作成する方法が使用できる。
また、化学修飾した多糖を合成する従来の方法｛特開平０９−１１０９０１号、特開平０９−１２４７０１号及び特開平１１−０１２３０４号等｝を用いることができる。
【００３６】
化学修飾された多糖（Ａ）は、多糖が有するヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、スルホ基及びリン酸基からなる群より選ばれるするなくとも１種を少なくとも１つが修飾されていればよい。
【００３７】
また、化学修飾された多糖（Ａ）が（Ｅ）により修飾されている割合（置換率）は、変性多糖の物性を変化させる（適度に疎水性を付与する等）観点から、０．００１〜１が好ましく、さらに好ましくは０．１〜１である。また、効率よく変性多糖を得る観点から、置換率は１未満であることが好ましく、さらに好ましくは０．９以下であり、次にさらに好ましくは０．８以下である。
置換率は、下記式によって求められる。
置換率＝Ｍ２／Ｍ１
Ｍ１：化学修飾する前の多糖中の、化合物（Ｅ）が反応し得る官能基｛ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、スルホ基及びリン酸基｝のモル数
Ｍ２：多糖に付加した化合物（Ｅ）のモル数
上記（Ａ）の置換率は、ＮＭＲによって測定することができる。例えば、化合物（Ｅ）が酢酸であり、ヒアルロン酸を化学修飾し、（Ａ）がアセチル化ヒアルロン酸である場合、アセチル化ヒアルロン酸のＮＭＲを測定し、積分値から、下記式によって求める。
置換率＝（アセチル基のピーク積分値／３）／｛（ヒドロキシル基のピーク積分値）＋（アセチル基のピーク積分値／３）｝
【００３８】
化学修飾された多糖（Ａ）の液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法により測定される重量平均分子量は、改変多糖の製造のしやすさの観点から、５００〜１０，０００，０００が好ましい。
【００３９】
本発明において、リボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ｂ）は、トリオース（ｂ−１）、テトロース（ｂ−２）、ペントース（ｂ−３）、ヘキソース（ｂ−４）、ヘプトース（ｂ−５）及び下記単糖（ｂ−６）からなる群より選ばれる少なくとも１種の単糖（ｂ）が有する少なくとも１つのヒドロキシル基の水素原子が下記化学式（１）〜（５）のいずれか１つの官能基で置換された糖ヌクレオチドである。
【化１】
【化２】
【化３】
【化４】
【化５】
単糖（ｂ−６）：（ｂ−１）、（ｂ−２）、（ｂ−３）、（ｂ−４）及び（ｂ−５）からなる群より選ばれる単糖において、この単糖が有する水素原子、ヒドロキシル基及びヒドロキシメチル基からなる群より選ばれる少なくとも１種が下記置換基（Ｄ）で置換された単糖。
置換基（Ｄ）：カルボキシル基、アミノ基、Ｎ−アセチルアミノ基、スルホ基、メチルエステル基、Ｎ−グリコリル基、メチル基、１，２，３−トリヒドロキシプロピル基、リン酸基及び２−カルボキシ−２−ヒドロキシエチル基からなる群より選ばれる少なくとも１種の置換基。
単糖（ｂ）には、光学異性体及び立体異性体が含まれる。
【００４０】
トリオース（ｂ−１）は、炭素数３の単糖であり、具体的には、ジヒドロキシアセトン及びグリセルアルデヒド等が挙げられる。
テトロース（ｂ−２）は、炭素数４の単糖であり、具体的には、エリトロース、トレオース及びエリトルロース等が挙げられる。
ペントース（ｂ−３）は、炭素数５の単糖であり、具体的には、アラビノース、キシロース、リボース、キシルロース、リブロース及びデオキシリボース等が挙げられる。
ヘキソース（ｂ−４）は、炭素数６の単糖であり、具体的には、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ソルボース、タガトース、フコース、フクロース及びラムノース等が挙げられる。
ヘプトース（ｂ−５）は、炭素数７の単糖であり、具体的には、セドヘプツロース等が挙げられる。
【００４１】
置換基（Ｄ）で置換された単糖（ｂ−６）には、上記単糖（ｂ−１）〜（ｂ−５）の分子中の水素原子（−Ｈ）、ヒドロキシル基（−ＯＨ）及びヒドロキシメチル基（−ＣＨ2ＯＨ）のうち少なくとも１つが、カルボキシル基、アミノ基、Ｎ−アセチルアミノ基、スルホ基、メチルエステル基、Ｎ−グリコリル基、メチル基、１，２，３−トリヒドロキシプロピル基、リン酸基及び２−カルボキシ−２−ヒドロキシエチル基からなる群より選ばれる少なくとも１種の置換基で置換された下記（ｂ−６−１）〜（ｂ−６−１０）及び下記（ｂ−６−１１）が含まれる。
（ｂ−６−１）：カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）で置換された単糖
（ｂ−６−２）：アミノ基（−ＮＨ2）で置換された単糖
（ｂ−６−３）：Ｎ−アセチルアミノ基（−ＮＨＣＯＣＨ3）で置換された単糖
（ｂ−６−４）：スルホ基（−ＯＳＯ3Ｈ）で置換された単糖
（ｂ−６−５）：メチルエステル基（−ＣＯＯＣＨ3）で置換された単糖
（ｂ−６−６）：Ｎ−グリコリル基（−ＮＨＣＯＣＨ2ＯＨ）で置換された単糖
（ｂ−６−７）：メチル基で置換された単糖
（ｂ−６−８）：１，２，３−トリヒドロキシプロピル基（−ＣＨＯＨＣＨＯＨＣＨ2ＯＨ）で置換された単糖
（ｂ−６−９）：リン酸基（−ＯＰＯ3Ｈ2）で置換された単糖
（ｂ−６−１０）：２−カルボキシ−２−ヒドロキシエチル基（−ＣＨ2ＣＨＯＨＣＯＯＨ）で置換された単糖
（ｂ−６−１１）：（ｂ−１）〜（ｂ−５）の分子中の水素原子、ヒドロキシル基及びヒドロキシメチル基のうち少なくとも２つが２種以上の置換基（Ｄ）で置換された単糖
【００４２】
（ｂ−６−１）として、具体的には、グルクロン酸、イズロン酸、マンヌロン酸及びガラクツロン酸等のウロン酸等が挙げられる。
（ｂ−６−２）として、具体的には、グルコサミン、ガラクトサミン及びマンノサミン等のアミノ糖等が挙げられる。
（ｂ−６−３）として、具体的には、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルマンノサミン及びＮ−アセチルガラクトサミン等が挙げられる。
（ｂ−６−４）として、具体的には、ガラクトース−３−硫酸等が挙げられる。
（ｂ−６−５）として、具体的には、グルコースメチルエステル及び（ｂ−６−１）中のカルボン酸をメチルエステル化したもの等が挙げられる。
（ｂ−６−１１）として、具体的には、Ｎ−アセチルムラミン酸、ムラミン酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−４−硫酸、イズロン酸−２−硫酸、グルクロン酸−２−硫酸、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−硫酸、シアル酸、ノイラミン酸、Ｎ−グライコリルノイラミン酸及びＮ−アセチルノイラミン酸等が挙げられる。
【００４３】
（ｂ−６）が、置換基（Ｄ）としてアニオン基であるカルボキシル基、リン酸基、２−カルボキシ−２−ヒドロキシエチル基及びスルホ基からなる群より選ばれる少なくとも１種を有する場合、アニオン基のプロトンがアルカリ金属（Ｌｉ、Ｎａ及びＫ等）カチオン及び／又はアルカリ土類金属（Ｃａ等）カチオンで置換されていてもいい。
【００４４】
リボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ｂ）は、上記単糖（ｂ−１）〜（ｂ−６）の有する少なくとも１つのヒドロキシル基の水素原子が、上記化学式（１）〜（５）で置換された糖ヌクレオチド（Ｂ−１）〜（Ｂ−６）である。
（Ｂ−３）として、具体的には、ウリジン２リン酸−キシロース等が挙げられる。
（Ｂ−４）として、具体的には、シチジン２リン酸−グルコース、グアノシン２リン酸−マンノース、グアノシン２リン酸−フコース、アデノシン２リン酸−グルコース、ウリジン２リン酸−グルコース、ウリジン２リン酸−ガラクトース及びウリジン２リン酸−マンノース等が挙げられる。
（Ｂ−６）として、具体的には、ウリジン２リン酸−グルクロン酸、ウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン、ウリジン２リン酸−ウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルガラクトサミン及びウリジン２リン酸−イズロン酸等が挙げられる。
【００４５】
本発明の製造方法において、（Ｂ）は１種を使用してもよく、２種以上を使用してもいい。また、１種の（Ｂ）を使用して、１種の単糖が複数連なった変性多糖を製造してもよく、２種の（Ｂ）を使用して、２種の単糖がランダム又は交互に連なった変性多糖を製造してもよく、３種以上の（Ｂ）を使用して、３種以上の単糖がランダム又は規則的に連なった変性多糖を製造してもいい。また、２種以上の（Ａ）、２種以上の（Ｂ）及び２種以上の（Ｃ）を使用して、複数種類の変性多糖を製造してもいい。
【００４６】
多糖合成酵素（Ｃ）は、上記（Ｂ）から多糖を合成する活性を有する酵素である。本発明の製造方法においては、（Ａ）及び（Ｂ）を（Ｃ）の存在下で反応させることで、（Ｂ）が（Ａ）に糖を転移する反応を（Ｃ）が触媒し、（Ａ）に糖を結合させ、変性多糖を製造することができる。また、本発明の製造方法により得られる変性多糖は、化学修飾された多糖（Ａ）に化学修飾されていない糖が複数結合する（例えば、（Ａ）分子が直鎖であれば、２つの末端に化学修飾されていない多糖セグメントが結合し、化学修飾されていない多糖セグメント−化学修飾された多糖セグメント−化学修飾されていない多糖セグメントが結合した変性多糖となる）ため、分子の一部分が化学修飾された多糖となる。
多糖合成酵素（Ｃ）には、化学修飾された多糖（Ａ）の化学修飾される前の糖鎖がヒアルロン酸であるヒアルロン酸合成酵素（Ｃ−１）、コンドロイチンであるコンドロイチン合成酵素（Ｃ−２）、キサンタンであるキサンタン合成酵素（Ｃ−３）、セルロースであるセルロース合成酵素（Ｃ−４）、デンプンであるデンプン合成酵素（Ｃ−５）及びヘパリンであるヘパリン合成酵素（Ｃ−６）が含まれる。また、（Ｃ）には、（Ｃ−１）〜（Ｃ−６）以外にも、上記（Ｂ）から糖を転移させて多糖を合成する活性を有する酵素が含まれる。
【００４７】
ヒアルロン酸合成酵素（Ｃ−１）とは、リボヌクレオシド２リン酸−グルクロン酸及びリボヌクレオシド２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンを糖供与体として、グルクロン酸がβ１，３結合でＮ−アセチルグルコサミンに結合した二糖単位の、β１，４結合による繰り返し構造を有する糖を合成する酵素である。
（Ｃ−１）としては、従来のヒアルロン酸合成酵素を使用でき、ヒアルロン酸合成活性を有するものであれば特に限定されない。具体的には、非特許文献（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００７，Ｖｏｌ．２８２，Ｎｏ．５１，Ｐ３６７７７−３６７８１）に記載されているクラスＩ及びクラスＩＩのヒアルロン酸合成酵素等が挙げられる。クラスＩ及びクラスＩＩは、酵素のアミノ酸配列の相同性によって分類されたものである。クラスＩのヒアルロン酸合成酵素として、具体的には、ストレプトコッカスピロジェネシス由来、ストレプトコッカスエクイシミリス由来及び藻類ウイルス由来のヒアルロン酸合成酵素等が挙げられる。また、クラスＩＩのヒアルロン酸合成酵素として、具体的には、パスツレラ・ムルトシダ由来のヒアルロン酸合成酵素等が挙げられる。
【００４８】
本発明の製造方法において、（Ｃ）として（Ｃ−１）を用いてヒアルロン酸を製造する場合、単位酵素あたりの変性多糖の生産量の観点から、用いる（Ｂ）としては、リボヌクレオシド２リン酸−グルクロン酸及びリボヌクレオシド２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンが好ましく、さらに好ましくはウリジン２リン酸−グルクロン酸及びウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンである。
また、単位酵素あたりの変性多糖の生産量の観点から、用いる（Ａ）としては、ヒアルロン酸が化学修飾された多糖であることが好ましい。
【００４９】
コンドロイチン合成酵素（Ｃ−２）とは、リボヌクレオシド２リン酸−グルクロン酸及びリボヌクレオシド２リン酸−Ｎ−アセチルガラクトサミンを糖供与体として、グルクロン酸がβ１，３結合でＮ−アセチルガラクトサミンに結合した二糖単位の、β１，４結合による繰り返し構造を有する糖を合成する酵素である。
（Ｃ−２）としては、従来のコンドロイチン合成酵素を使用でき、コンドロイチン合成活性を有するものであれば特に限定されない。具体的には、ストレプトコッカスエクイシミリス由来のコンドロイチン合成酵素及びパスツレラムルトシダ由来のコンドロイチン合成酵素等が挙げられる。
【００５０】
本発明の製造方法において、（Ｃ）として（Ｃ−２）を用いてコンドロイチンを製造する場合、用いる（Ｂ）としては、単位酵素あたりの変性多糖の生産量の観点から、リボヌクレオシド２リン酸−グルクロン酸及びリボヌクレオシド２リン酸−Ｎ−アセチルガラクトサミンが好ましく、さらに好ましくはウリジン２リン酸−グルクロン酸及びウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルガラクトサミンである。
また、単位酵素あたりの変性多糖の生産量の観点から、用いる（Ａ）としては、コンドロイチンが化学修飾された多糖であることが好ましい。
【００５１】
キサンタン合成酵素（Ｃ−３）とは、リボヌクレオシド２リン酸−グルコース、リボヌクレオシド２リン酸−マンノース及びリボヌクレオシド２リン酸−グルクロン酸を糖供与体としてキサンタンを合成する酵素である。
（Ｃ−３）としては、従来のキサンタン合成酵素を使用でき、キサンタン合成活性を有するものであれば特に限定されない。具体的には、キサンタン・カムペストリスから得られるキサンタン合成酵素等が挙げられる。
【００５２】
本発明の製造方法において、（Ｃ）として（Ｃ−３）を用いてキサンタンを製造する場合、単位酵素あたりの変性多糖の生産量の観点から、用いる（Ｂ）としては、リボヌクレオシド２リン酸−グルコース、リボヌクレオシド２リン酸−マンノース及びリボヌクレオシド２リン酸−グルクロン酸が好ましく、さらに好ましくはウリジン２リン酸−グルコース、グアノシン２リン酸−マンノース及びウリジン２リン酸−グルクロン酸である。
また、単位酵素あたりの変性多糖の生産量の観点から、用いる（Ａ）としては、キサンタンが化学修飾された多糖であることが好ましい。
【００５３】
セルロース合成酵素（Ｃ−４）とは、リボヌクレオシド２リン酸グルコースを糖供与体としてβ１，４−結合を形成する酵素である。
（Ｃ−４）としては、従来のセルロース合成酵素を使用でき、セルロース合成活性を有するものであれば特に限定されない。具体的には、酢酸菌由来のセルロース合成酵素等が挙げられる。
【００５４】
本発明の製造方法において、（Ｃ）として（Ｃ−４）を用いてセルロースを製造する場合、単位酵素あたりの変性多糖の生産量の観点から、用いる（Ｂ）としては、リボヌクレオシド２リン酸−β−グルコースが好ましく、さらに好ましくはウリジン２リン酸−β−グルコースである。
また、単位酵素あたりの変性多糖の生産量の観点から、用いる（Ａ）としては、セルロースが化学修飾された多糖であることが好ましい。
【００５５】
デンプン合成酵素（Ｃ−５）は、リボヌクレオシド２リン酸−α−グルコースを糖供与体としてα１，６−結合を形成する酵素である。
（Ｃ−５）としては、従来のデンプン合成酵素を使用でき、デンプン合成活性を有するものであれば特に限定されない。具体的には、トウモロコシ由来のデンプン合成酵素等が挙げられる。
【００５６】
本発明の製造方法において、（Ｃ）として（Ｃ−５）を用いてデンプンを製造する場合は、単位酵素あたりの変性多糖の生産量の観点から、用いる（Ｂ）としては、リボヌクレオシド２リン酸−α−グルコースが好ましく、さらに好ましくはウリジン２リン酸−α−グルコースである。
また、単位酵素あたりの変性多糖の生産量の観点から、用いる（Ａ）としては、デンプンが化学修飾された多糖であることが好ましい。
【００５７】
ヘパリン合成酵素（Ｃ−６）とは、リボヌクレオシド２リン酸−グルクロン酸（β−Ｄ−）又はリボヌクレオシド２リン酸イズロン酸（α−Ｌ−）とリボヌクレオシド２リン酸−グルコサミン（Ｄ−グルコサミン）を糖供与体として１，４−結合を形成する酵素である。
（Ｃ−６）としては、従来のヘパリン合成酵素を使用でき、ヘパリン合成活性を有するものであれば特に限定されない。具体的には、ヒト由来のヘパリン合成酵素等が挙げられる。
【００５８】
本発明の製造方法において、（Ｃ）として（Ｃ−６）を用いてヘパリンを製造する場合、単位酵素あたりの変性多糖の生産量の観点から、用いる（Ｂ）としては、リボヌクレオシド２リン酸−グルクロン酸又はリボヌクレオシド２リン酸−イズロン酸とリボヌクレオシド２リン酸−グルコサミンとであることが好ましく、さらに好ましくはウリジン２リン酸−グルクロン酸又はウリジン２リン酸−イズロン酸とウリジン２リン酸−グルコサミンとであることである。
また、単位酵素あたりの変性多糖の生産量の観点から、用いる（Ａ）としては、ヘパリンが化学修飾された多糖であることが好ましい。
【００５９】
上記（Ａ）及び糖ヌクレオチド（Ｂ）及び上記多糖合成酵素（Ｃ）は、製造する変性多糖に応じて適宜選択する。
【００６０】
本発明の製造方法において、反応溶液中のリボヌクレオシド２リン酸の濃度は、多糖合成酵素（Ｃ）の下記阻害濃度ＩＣ50の１００倍未満である。
阻害濃度ＩＣ50：リボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ｂ）を多糖合成酵素（Ｃ）の存在下で反応させる際の（Ｃ）の濃度において、基質としてリボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ｂ）を用いて、阻害剤としてリボヌクレオシド２リン酸を用いて求めた、（Ｃ）の酵素活性が半減するときのリボヌクレオシド２リン酸の濃度。
阻害濃度ＩＣ50は、（Ｂ）を（Ｃ）の存在下で反応させる工程の開始時から終了時までのいずれかの時点での、（Ｃ）を反応させる際と同じ（Ｃ）の濃度、温度及びｐＨの条件下で、下記測定を行うことにより求められる。
＜阻害濃度ＩＣ50の測定方法＞
一定量の多糖合成酵素（Ｃ）、リボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ｂ）、リボヌクレオシド２リン酸、ｐＨ調整剤（Ｋ）及び水を含む一定の温度及びｐＨに調製した酵素反応溶液（Ｉ）を作成する。
酵素反応溶液（Ｉ）の温度は、製造工程中で（Ｃ）を（Ｂ）に作用させる工程の開始時から終了時までのいずれかの時点での温度と同じの温度に調整する。
酵素反応溶液（Ｉ）のｐＨは、製造工程中で（Ｃ）を（Ｂ）に作用させる工程の開始時から終了時までのいずれかの時点でのｐＨと同じのｐＨに調整する。
酵素反応溶液（Ｉ）中の（Ｃ）のモル濃度は、（Ｃ）を（Ｂ）に作用させる工程の開始時から終了時までのいずれかの時点での濃度と同じ濃度に調整する。
酵素反応溶液（Ｉ）中のリボヌクレオシド２リン酸の含有量（モル濃度）は、リボヌクレオシド２リン酸が０Ｍの酵素反応溶液（Ｉ）、及びリボヌクレオシド２リン酸の濃度が０Ｍから多糖合成酵素（Ｃ）の活性が０になる（多糖の生成が観測できなくなる）リボヌクレオシド２リン酸の濃度との間で、リボヌクレオシド２リン酸の濃度が異なる４種類以上の酵素反応溶液（Ｉ）、合計５種類以上の酵素反応溶液（Ｉ）を作成する。また、類似の多糖合成酵素に対するリボヌクレオシド２リン酸の阻害定数Ｋｉが分かっている場合は、リボヌクレオシド２リン酸の濃度が０Ｍのもの、類似の多糖合成酵素のＫｉ未満で０Ｍより大きい濃度範囲で２種類以上、Ｋｉ以上及びＫｉの１０倍以下の濃度範囲で２種類以上、合計５種類以上作成すればいい。
酵素反応溶液（Ｉ）中のリボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ｂ）の含有量は、経時的なピーク面積変化を観測できる濃度を１点選べばよい。測定に使用する（Ｃ）と類似の多糖合成酵素のミカエリス定数Ｋｍが分かっている場合は、Ｋｍ以上及びＫｍの５倍以下の濃度範囲の間で選べばよい。
酵素反応溶液（Ｉ）に用いるｐＨ調整剤（Ｋ）は、扱いやすさ及び酵素の安定性の観点から、リン酸塩、ホウ酸塩、ＨＥＰＥＳバッファー及びＭＥＳバッファー等のＧｏｏｄバッファーが好ましい。酵素反応溶液（Ｉ）中の（Ｋ）の含有量（モル濃度）は、１００〜５００ｍＭである。
作成した酵素反応溶液（Ｉ）について、（Ｉ）を作成直後及び一定時間（例えば５分）ごとに溶液の一部（例えば１００μＬ）を取り出し、取り出したものを１００℃で1分間熱処理し、酵素反応を停止する。液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと略記する）を用いて、取り出した反応溶液中の変性多糖の量を定量する。酵素反応溶液（Ｉ）を作成直後のピーク面積をＰ0、ｈ時間後のピーク面積をＰhとし、ピーク面積の変化ΔＰ（＝Ｐh−Ｐ0）と変性多糖のピーク面積に対する検量線を用いて酵素反応初速度ｖ（Ｍ／ｓ）を算出する。
さらに、リボヌクレオシド２リン酸の濃度が異なる酵素反応溶液（Ｉ）を用いて同様に測定し、酵素反応初速度ｖを算出する。
阻害濃度ＩＣ50は、横軸に（ｘ軸）に酵素反応溶液（Ｉ）中のそれぞれのリボヌクレオシド２リン酸の濃度、縦軸（ｙ軸）にリボヌクレオシド２リン酸の濃度が０の時の酵素反応初速度ｖを１００（％）としたときの相対活性をプロットする。プロットを直線でつなぎ、ｙ＝５０（％）となるときのリボヌクレオシド２リン酸の濃度を阻害剤濃度ＩＣ50とする。
【００６１】
本発明において、反応溶液中のリボヌクレオシド２リン酸の濃度は、変性多糖を効率よく製造する観点から、阻害濃度ＩＣ50の１００倍未満が好ましく、さらに好ましくは１０倍以下である。
また、複数種類の（Ｃ）を用いる場合は、全ての（Ｃ）の阻害濃度ＩＣ50を測定し、少なくとも１つの（Ｃ）の阻害濃度ＩＣ50について上記範囲であることが好ましい。
また、（Ａ）と（Ｂ）とを（Ｃ）の存在下で反応させる工程において、リボヌクレオシド２リン酸の濃度が上記範囲である時間は、（Ａ）と（Ｂ）とを（Ｃ）の存在下で反応させる時間中の１０〜１００％の時間であるが、反応効率の観点から、３０〜１００％の時間であることが好ましく、さらに好ましくは５０〜１００％の時間であり、特に好ましくは８０〜１００％の時間であり、最も好ましくは９０〜１００％の時間である。
（Ａ）と（Ｂ）とを（Ｃ）の存在下で反応させる際、リボヌクレオシド２リン酸が副生成物として生成する。（Ｃ）の活性は、リボヌクレオシド２リン酸により阻害されやすいため、（Ａ）と（Ｂ）とを（Ｃ）の存在下で反応させる工程において、リボヌクレオシド２リン酸の濃度は上記範囲であることが好ましい。
【００６２】
本発明の製造方法において、リボヌクレオシド２リン酸の濃度を上記範囲にする方法としては、下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の方法等が挙げられる。
（ｉ）リボヌクレオシド２リン酸変換酵素（Ｇ）を用いてリボヌクレオシド２リン酸を後述する化合物（Ｈ）に変換する方法
（ｉｉ）シリカゲル担体等を用いて反応溶液中のリボヌクレオシド２リン酸を吸着させる方法
（ｉｉｉ）化学反応によりリボヌクレオシド２リン酸を他の化合物に変換する方法
【００６３】
（ｉｉ）の方法においては、シリカゲル担体以外にも、活性炭及びゼオライトなど、リボヌクレオシド２リン酸を吸着できるものであれば制限なく利用できる。
（ｉｉｉ）の方法においては、リボヌクレオシド２リン酸を他の化合物に変換することができる化学反応であれば、一般的に知られている化学反応を制限無く用いることができる。
【００６４】
本発明において、リボヌクレオシド２リン酸の濃度を上記範囲にする方法としては、反応の基質特異性が高く、基質（リボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ｂ））が分解されるなどの問題が少ないという観点から、（ｉ）の方法が好ましい。
【００６５】
（ｉ）のリボヌクレオシド２リン酸変換酵素（Ｇ）を用いてリボヌクレオシド２リン酸を化合物（Ｈ）に変換する方法とは、具体的には下記方法が含まれる。
リボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ｂ）に多糖合成酵素（Ｃ）を作用させて変性多糖を製造する方法において、リボヌクレオシド２リン酸を下記化合物（Ｈ）に変換する活性を有するリボヌクレオシド２リン酸変換酵素（Ｇ）の存在下で（Ｃ）を作用させる変性多糖の製造方法。
化合物（Ｈ）：プリン塩基又はピリミジン塩基（Ｈ−1）、リボヌクレオシド（Ｈ−２）、リボヌクレオシド１リン酸（Ｈ−３）、リボヌクレオシド３リン酸（Ｈ−４）、ポリリボヌクレオチド（Ｈ−５）、デオキシリボヌクレオシド２リン酸（Ｈ−６）及びリボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ｈ−７）からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物。
【００６６】
（Ｈ−１）には、プリン塩基（アデニン及びグアニン等）並びにピリミジン塩基（チミン、シトシン及びウラシル等）等が含まれる。
（Ｈ−２）は、（Ｈ−１）の塩基と単糖が結合した化合物であり、具体的には、ウリジン、アデノシン、リボチミジン、シチジン及びグアノシン等が挙げられる。
（Ｈ−３）は、（Ｈ−２）のモノリン酸エステル化物であり、具体的には、ウリジル酸（ウリジン５’−リン酸）、アデノシン１リン酸（アデノシン５’−リン酸）、リボチミジル酸（リボチミジン５’−リン酸）、シチジン１リン酸（シチジン５’−リン酸）及びグアノシン１リン酸（グアノシン５’−リン酸）等が挙げられる。
（Ｈ−４）は、（Ｈ−２）のトリリン酸エステル化物であり、具体的には、ウリジン３リン酸（ウリジン５’−三リン酸）、アデノシン３リン酸（アデノシン５’−三リン酸）、リボチミジン−３リン酸（リボチミジン５’−三リン酸）、シチジン３リン酸（シチジン５’−三リン酸）及びグアノシン３リン酸（グアノシン５’−三リン酸）等が挙げられる。
（Ｈ−５）は、（Ｈ−３）がホスホジエステル結合で重合したポリマーであり、具体的には、ポリウリジル酸、ポリアデニル酸、ポリチミジル酸、ポリシチジル酸及びポリグアニル酸等が挙げられる。
（Ｈ−６）は、リボヌクレオシド２リン酸分子中のリボースが２−デオキシリボースとなったものであり、具体的には、デオキシウリジン２リン酸、デオキシアデノシン２リン酸、デオキシグアノシン２リン酸、デオキシシチジン２リン酸及びチミジン２リン酸等が挙げられる。
（Ｈ−７）には、上記リボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ｂ）が含まれる。
【００６７】
リボヌクレオシド２リン酸変換酵素（Ｇ）には、下記（Ｇ１）〜（Ｇ７）が含まれる。
（Ｇ１）リボヌクレオシド２リン酸をプリン塩基又はピリミジン塩基に変換する活性を有する酵素
（Ｇ２）リボヌクレオシド２リン酸をリボヌクレオシドに変換する活性を有する酵素
（Ｇ３）リボヌクレオシド２リン酸をリボヌクレオシド１リン酸に変換する活性を有する酵素
（Ｇ４）リボヌクレオシド２リン酸をリボヌクレオシド３リン酸に変換する活性を有する酵素
（Ｇ５）リボヌクレオシド２リン酸をポリリボヌクレオチドに変換する活性を有する酵素
（Ｇ６）リボヌクレオシド２リン酸をデオキシリボヌクレオシド２リン酸に変換する活性を有する酵素
（Ｇ７）リボヌクレオシド２リン酸をリボヌクレオシド２リン酸−単糖に変換する活性を有する酵素
【００６８】
（Ｇ２）は、リボヌクレオチド中の糖とリン酸との間のリン酸エステル結合を加水分解して、ヌクレオシドとリン酸にする反応を触媒する酵素である。（Ｇ２）として、具体的には、アピラーゼ及びアピラーゼ等が挙げられる。
【００６９】
（Ｇ３）は、リボヌクレオシド２リン酸等のリン酸ジエステルを加水分解してリン酸モノエステルとする反応を触媒する酵素である。（Ｇ３）として、具体的には、アデノシン２リン酸（ＡＤＰ）特異的ホスホフルクトキナーゼ及びヌクレオチダーゼ等が挙げられる。
【００７０】
（Ｇ４）は、リン酸基を有する化合物から、リボヌクレオシド２リン酸にリン酸基を転移させてリボヌクレオシド３リン酸とする反応を触媒する酵素である。
（Ｇ４）として、具体的には、ヌクレオシド２リン酸キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、アルギニンキナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、カルバミン酸キナーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ及びホスホクレアチンキナーゼ等が含まれる。
また、（Ｇ４）には、ウリジン３リン酸合成酵素（Ｇ４−１）が含まれる。（Ｇ４−１）は、作用するリボヌクレオシド２リン酸がウリジン２リン酸であり、ウリジン３リン酸を合成する反応を触媒する酵素である。
【００７１】
ヌクレオシド２リン酸キナーゼは、ヌクレオシド３リン酸からヌクレオシド２リン酸にリン酸基を転移する酵素である。ヌクレオシド２リン酸キナーゼとして、具体的には、生物由来のもの｛動物由来のもの（例えば、ヒト由来、ウシ由来及びラット由来のもの等）、植物由来のもの（例えば、シロイヌナズナ由来及びコメ由来のもの等）及び微生物由来のもの（例えば、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属由来、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属由来、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属由来及びサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属由来のもの等）等｝、生物由来のものを化学修飾したもの（例えば、カルボジイミド化合物、無水コハク酸、ヨード酢酸及びイミダゾール化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種を作用させて化学修飾したもの等）及び生物由来のものを遺伝子的に修飾したもの｛例えば、Ｓｍｉｔｈらの方法（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９８，Ｖｏｌ．２５３，Ｎｏ．１８，Ｐ６５５１−６５６０）を用いて遺伝子を改変して得たもの等｝等が挙げられる。
【００７２】
ポリリン酸キナーゼは、リボヌクレオシド２リン酸とポリリン酸とから、リボヌクレオシド３リン酸と、重合度の１つ少ないポリリン酸とを生成する活性を有する酵素である。ポリリン酸キナーゼとして、具体的には、生物由来のもの｛植物由来のもの（例えば、タバコ由来のもの等）及び微生物由来のもの（エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属由来、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属由来、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属由来及びサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属由来のもの等）等｝、生物由来のものを化学修飾したもの（例えば、カルボジイミド化合物、無水コハク酸、ヨード酢酸及びイミダゾール化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種を作用させて化学修飾したもの等）並びに生物由来のものを遺伝子的に修飾したもの｛例えば、Ｓｍｉｔｈらの方法（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９８，Ｖｏｌ．２５３，Ｎｏ．１８，Ｐ６５５１−６５６０）を用いて遺伝子を改変して得たもの等｝等が挙げられる。
【００７３】
アルギニンキナーゼは、リボヌクレオシド２リン酸とω−ホスホノ−Ｌ−アルギニンからリボヌクレオシド３リン酸とＬ−アルギニンを生成する活性を有する酵素である。アルギニンキナーゼとして、具体的には、生物由来のもの｛動物由来のもの（例えば、ショウジョウバエ由来、エビ由来及びノミ由来のもの等）、植物由来のもの（例えば、ケヤリ由来のもの等）及び微生物由来のもの（例えば、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属由来のもの等）等｝、生物由来のものを化学修飾したもの（例えば、カルボジイミド化合物、無水コハク酸、ヨード酢酸及びイミダゾール化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種を作用させて化学修飾したもの等）並びに生物由来のものを遺伝子的に修飾したもの｛例えば、Ｓｍｉｔｈらの方法（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９８，Ｖｏｌ．２５３，Ｎｏ．１８，Ｐ６５５１−６５６０）を用いて遺伝子を改変して得たもの等｝等が挙げられる。
【００７４】
ピルビン酸キナーゼは、リボヌクレオシド２リン酸とホスホエノールピルビン酸からリボヌクレオシド３リン酸とピルビン酸を生成する活性を有する酵素である。ピルビン酸キナーゼとして、具体的には、生物由来のもの｛動物由来のもの（例えば、ヒト由来、ウシ由来及びラット由来のもの等）、植物由来のもの（例えば、シロイヌナズナ由来及びトウゴマ由来のもの等）及び微生物由来のもの（例えば、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属由来及びサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属由来のもの等）等｝、生物由来のものを化学修飾したもの（例えば、カルボジイミド化合物、無水コハク酸、ヨード酢酸及びイミダゾール化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種を作用させて化学修飾したもの等）並びに生物由来のものを遺伝子的に修飾したもの｛例えば、Ｓｍｉｔｈらの方法（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９８，Ｖｏｌ．２５３，Ｎｏ．１８，Ｐ６５５１−６５６０）を用いて遺伝子を改変して得たもの等｝等が挙げられる。
【００７５】
カルバミン酸キナーゼは、カルバモイルリン酸とリボヌクレオシド２リン酸からリボヌクレオシド３リン酸、二酸化炭素、及びアンモニアを生成する活性を有する酵素である。カルバミン酸キナーゼとして、具体的には、生物由来のもの｛動物由来のもの（例えば、ラット由来のもの等）及び微生物由来のもの（例えば、ピロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属由来、及びラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属由来のもの等）等｝、生物由来のものを化学修飾したもの（例えば、カルボジイミド化合物、無水コハク酸、ヨード酢酸及びイミダゾール化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種を作用させて化学修飾したもの等）並びに生物由来のものを遺伝子的に修飾したもの｛例えば、Ｓｍｉｔｈらの方法（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９８，Ｖｏｌ．２５３，Ｎｏ．１８，Ｐ６５５１−６５６０）を用いて遺伝子を改変して得たもの等｝等が挙げられる。
【００７６】
ホスホグリセリン酸キナーゼは、３−ホスホグリセロールリン酸とリボヌクレオシド２リン酸からリボヌクレオシド３リン酸及び３−ホスホグリセリン酸を生成する活性を有する酵素である。ホスホグリセリン酸キナーゼとして、具体的には、生物由来のもの｛動物由来のもの（例えば、ラット由来のもの等）及び微生物由来のもの（例えば、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属由来のもの等）等｝、生物由来のものを化学修飾したもの（例えば、カルボジイミド化合物、無水コハク酸、ヨード酢酸及びイミダゾール化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種を作用させて化学修飾したもの等）並びに生物由来のものを遺伝子的に修飾したもの｛例えば、Ｓｍｉｔｈらの方法（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９８，Ｖｏｌ．２５３，Ｎｏ．１８，Ｐ６５５１−６５６０）を用いて遺伝子を改変して得たもの等｝等が挙げられる。
【００７７】
ホスホクレアチンキナーゼは、ホスホクレアチンとリボヌクレオシド２リン酸からリボヌクレオシド３リン酸及びクレアチンを生成する活性を有する酵素である。ホスホクレアチンキナーゼとして、具体的には、生物由来のもの｛動物由来のもの（例えば、ラット由来のもの等）等｝、生物由来のものを化学修飾したもの（例えば、カルボジイミド化合物、無水コハク酸、ヨード酢酸及びイミダゾール化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種を作用させて化学修飾したもの等）並びに生物由来のものを遺伝子的に修飾したもの｛例えば、Ｓｍｉｔｈらの方法（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９８，Ｖｏｌ．２５３，Ｎｏ．１８，Ｐ６５５１−６５６０）を用いて遺伝子を改変して得たもの等｝等が挙げられる。
【００７８】
（Ｇ４）は、１種を使用してもよく、２種以上を使用してもいい。
（Ｇ４）のうち、リボヌクレオシド３リン酸合成活性の高さの観点から、アルギニンキナーゼ、ヌクレオシド２リン酸キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ及びカルバミン酸キナーゼが好ましい。
【００７９】
（Ｇ４）を作用させる際、必要により、リボヌクレオシド２リン酸にリン酸基を与えるリン酸基含有化合物（Ｆ）を用いてもいい。（Ｆ）はリン酸基を有する化合物である。（Ｆ）としては、（Ｇ４）の基質特異性の観点から、リボヌクレオシド２リン酸にリン酸基を供与し得る化合物が好ましい。（Ｆ）としては、例えば、トリアミノホスフィンオキシド、リン酸化したアミノ酸（例えばω−ホスホノ−Ｌ−アルギニン等）、ポリリン酸、ホスホエノールピルビン酸及びその塩（例えば、リチウム塩、ナトリウム塩及びカリウム塩等）、カルバモイルリン酸、３−ホスホグリセロールリン酸、ホスホクレアチン並びにヌクレオシド３リン酸（例えばグアノシン３リン酸及びアデノシン３リン酸等）等が挙げられる。
リン酸基含有化合物（Ｆ）を用いる場合、（Ｇ４）と（Ｆ）との組み合わせとしては、ヌクレオシド２リン酸キナーゼとヌクレオシド３リン酸との組み合わせ、ポリリン酸キナーゼとポリリン酸との組み合わせ、アルギニンキナーゼとω−ホスホノ−Ｌ−アルギニンとの組み合わせ、ピルビン酸キナーゼとホスホエノールピルビン酸及びその塩との組み合わせ、カルバミン酸キナーゼとカルバモイルリン酸との組み合わせ、ホスホグリセリン酸キナーゼと３−ホスホグリセロールリン酸との組み合わせ、ホスホグリセリン酸キナーゼと３−ホスホグリセロールリン酸との組み合わせ並びにホスホクレアチンキナーゼとホスホクレアチンとの組み合わせが好ましい。
【００８０】
（Ｇ５）は、リボヌクレオシド２リン酸等のリボヌクレオシド２リン酸をリボヌクレオシド１リン酸の共重合物（ポリリボヌクレオチド等）及び無機リン酸とする反応を触媒する酵素である。（Ｇ５）として、具体的には、ポリリボヌクレオチドヌクレオチジルトランスフェラーゼ等が挙げられる。
【００８１】
（Ｇ６）は、リボヌクレオシド２リン酸等のリボヌクレオチドを還元してデオキシリボヌクレオチド（デオキシウリジン２リン酸等）とする反応を触媒する酵素である。（Ｇ６）として、具体的には、リボヌクレオシドジホスホリダクターゼ等が挙げられる。
【００８２】
リボヌクレオシド２リン酸変換酵素（Ｇ）として（Ｇ６）を用いる場合、還元剤（ｇ６）を用いる必要がある。（ｇ６）としては、電子伝達タンパク質を用いることができ、例えば、還元型チオレドキシン等が挙げられる。
【００８３】
（Ｇ７）は、リボヌクレオシド２リン酸等のリボヌクレオシド２リン酸と糖又は糖リン酸とから糖核酸（リボヌクレオシド２リン酸−単糖）を合成する反応を触媒する酵素である。（Ｇ７）として、具体的には、スクロースシンターゼ及びＮ−アシルニューラミネートシチジリルトランスフェラーゼ等が挙げられる。
【００８４】
リボヌクレオシド２リン酸変換酵素（Ｇ）として（Ｇ７）を用いる場合、糖核酸の原料（ｇ７）として、糖（ｇ７−１）又は糖リン酸（ｇ７−２）を用いる必要がある。
（ｇ７−１）には、単糖、二糖及びオリゴ糖等が含まれ、具体的には、スクロース等が挙げられる。
（ｇ７−２）は、単糖の有するヒドロキシル基のうち１つに１つのリン酸が結合した化合物であり、例えば、グルクロン酸１リン酸（１−ホスホ−α−Ｄ−グルクロン酸等）、Ｎ−アセチルグルコサミン１リン酸（Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン−１−ホスファート等）等が挙げられる。
（Ｇ７）により合成されるリボヌクレオシド２リン酸−単糖は、本発明の製造方法の原料である（Ｂ）と同じでもよく、（Ｂ）と異なってもいい。糖（ｇ７−１）又は糖リン酸（ｇ７−２）として、本発明の製造方法の原料であるリボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ｂ）と同じ単糖（ｂ）のヒドロキシル基に、１つのリン酸が結合した化合物である場合は、（Ｂ）が合成される。
【００８５】
上記リボヌクレオシド２リン酸変換酵素（Ｇ）のうち、変性多糖を効率よく製造する観点及び工業化しやすいという観点から、（Ｇ２）、（Ｇ３）、（Ｇ４）、（Ｇ５）及び（Ｇ７）が好ましく、さらに好ましくは（Ｇ４）及び（Ｇ７）である。
（Ｇ）は、１種を使用してもよく、２種以上を併用してもいい。
【００８６】
本発明の変性多糖の製造方法は、化学修飾された多糖（Ａ）を用いる以外は、従来のリボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ｂ）に多糖合成酵素（Ｃ）を作用させる多糖の製造方法と同様でいい。例えば、下記工程（１）〜（３）により製造する方法が含まれる。
（１）所定量の化学修飾された多糖（Ａ）、リボヌクレオシド２リン鎖−単糖（Ｂ）、緩衝液（Ｉ）及び多糖合成酵素（Ｃ）を混合して反応溶液（Ｌ）とし、所定の温度、所定のｐＨに調整する。必要により、リボヌクレオシド２リン酸変換酵素（Ｇ）を加えてもいい。また、本工程では、必要により攪拌してもいい。
上記工程においては、化学修飾された多糖（Ａ）、リボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ｂ）及び緩衝液（Ｉ）を混合し、温度及びｐＨを調整した後、多糖合成酵素（Ｃ）を添加してもいい。さらに、（Ｃ）は、そのまま添加してもよく、緩衝液（Ｉ）で希釈してから添加してもいい。
また、反応溶液（Ｌ）中にはリボヌクレオシド２リン酸変換酵素（Ｇ）を含んでもいい。使用する（Ｇ）が（Ｇ−４）である場合は、（ｇ−４）を含んでもいい。使用する（Ｇ）が（Ｇ−６）である場合は、（ｇ−６）を含む。使用する（Ｇ）が（Ｇ−７）である場合は、（ｇ−７）を含む。
さらに、反応溶液（Ｌ）中には、脂質（Ｍ）、糖類（Ｎ）及びオリゴ糖（Ｏ）を含んでもいい。
（２）反応溶液（Ｌ）の温度を調整しながら、所定の時間、化学修飾された多糖（Ａ）及びリボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ｂ）を多糖合成酵素（Ｃ）の存在下で反応させる。本工程では、必要により攪拌してもいい。
（３）生成した変性多糖を精製する。変性多糖の精製方法としては、適量のアルコール（炭素数１〜１０のアルコール）などの溶剤を加えて沈殿させる方法や膜（具体的には、セラミック膜等）を用いて溶液交換をする方法等が挙げられる。
【００８７】
反応溶液（Ｌ）中の化学修飾された多糖（Ａ）の含有量（重量％）は、変性多糖を効率よく製造する観点及び多糖合成酵素（Ｃ）を効率よく作用させる観点から、０．０００００１〜１重量％が好ましい。
反応溶液（Ｌ）中のリボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ｂ）の含有量（モル濃度）は、変性多糖を効率よく製造する観点及び多糖合成酵素（Ｃ）を効率よく作用させる観点から、０．１ｍＭ〜２Ｍが好ましい。
反応溶液（Ｌ）中の多糖合成酵素（Ｃ）の含有量（ユニット／Ｌ）は、変性多糖を効率よく製造する観点及び多糖合成酵素（Ｃ）を効率よく作用させる観点から、０．１〜１０，０００，０００ユニット／Ｌが好ましい。
１ユニットとは、１分間に１μｍｏｌのリボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ｂ）からヒアルロン酸を合成する活性を１ユニットと定義する。
【００８８】
緩衝液（Ｉ）としては、緩衝作用を有するバッファー等を含有した水が含まれる。緩衝作用を有するバッファー等としては、従来のｐＨ調整剤が使用でき、ホウ酸バッファー、リン酸バッファー、酢酸バッファー、Ｔｒｉｓバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、硫酸、塩酸、クエン酸、乳酸、ピルビン酸、蟻酸、塩化ナトリウム、塩化カリウム、モノエタノールアミン及びジエタノールアミン等が挙げられる。
【００８９】
反応溶液（Ｌ）の温度は、（Ｃ）及び（Ｇ）の安定性並びに反応速度の観点から０〜１００℃が好ましい。
【００９０】
反応溶液（Ｌ）のｐＨは、反応の至適条件の観点から、ｐＨ３〜１２が好ましい。
【００９１】
上記工程（１）及び（２）において、上記化学修飾された多糖（Ａ）、リボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ｂ）及び多糖合成酵素（Ｃ）以外に、変性多糖を効率よく製造する観点から、リボヌクレオシド２リン酸変換酵素（Ｇ）を用いてもいい。また、（Ｇ）として（Ｇ−４）を用いる場合は（ｇ−４）を用いてもよく、（Ｇ）として（Ｇ−６）を用いる場合は（ｇ−６）を用いる必要があり、（Ｇ）として（Ｇ−７）を用いる場合は（ｇ−７）を用いる必要がある。
リボヌクレオシド２リン酸変換酵素（Ｇ）を用いる場合、反応溶液（Ｌ）中の（Ｇ）の含有量（ユニット／Ｌ）は、変性多糖を効率よく製造する観点及び多糖合成酵素（Ｃ）を効率よく作用させる観点から、０．１〜１，０００，０００ユニット／Ｌが好ましい。
１ユニットとは、１分間に１μｍｏｌのリボヌクレオシド２リン酸を化合物（Ｈ）に変換する活性を１ユニットと定義する。
【００９２】
反応溶液（Ｌ）中の（ｇ−４）、（ｇ−６）又は（ｇ−７）の含有量（モル濃度）は、変性多糖を効率よく製造する観点及び多糖合成酵素（Ｃ）を効率よく作用させる観点から、０．０１ｎＭ〜１０Ｍが好ましい。
【００９３】
また、上記以外に、酵素の安定化及び酵素の活性化の観点から、脂質（Ｍ）、糖類（Ｎ）及びオリゴ糖（Ｏ）を用いてもよい。
脂質（Ｍ）としては、例えば、カルディオピン及びオレイン酸等が挙げられる。
糖類（Ｎ）としては、例えば、グリセリン等が挙げられる。
オリゴ糖（Ｏ）としては、例えば、オリゴヒアルロン酸等が挙げられる。
【００９４】
反応溶液（Ｌ）中の脂質（Ｍ）の含有量（重量％）は、酵素の安定化及び酵素の活性化の観点から、０〜１重量％が好ましい。
反応溶液（Ｌ）中の糖類（Ｎ）の含有量（重量％）は、酵素の安定化及び酵素の活性化の観点から、０〜３０重量％が好ましい。
反応溶液（Ｌ）中のオリゴ糖（Ｏ）の含有量（重量％）は、酵素の安定化及び酵素の活性化の観点から、０〜１重量％が好ましい。
【００９５】
工程（２）において、多糖合成酵素（Ｃ）を作用させる時間は、多糖合成酵素（Ｃ）の活性、反応溶液（Ｌ）の温度、多糖合成酵素（Ｃ）、リボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ｂ）の量比等によって異なる。反応溶液（Ｌ）の温度を、多糖合成酵素（Ｃ）の活性が高く、反応速度が速い温度に調整すれば、反応時間を短くすることができる。また、反応溶液（Ｌ）中のリボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ｂ）に対する多糖合成酵素（Ｃ）の量が多いほど、反応は早くなり、反応時間は短くなる。
【００９６】
本発明の製造方法によれば、化学修飾された多糖（Ａ）を多糖合成酵素（Ｃ）が基質として利用できれば、変性多糖を製造することができる。また、（Ａ）の基質としての利用性は、化学修飾された多糖（Ａ）の置換率が適度であり、化学修飾された多糖（Ａ）分子の末端の単糖が化学修飾されていない多糖分子を多く含んでいる方が高く、変性多糖を大量に得ることができる。
【００９７】
本発明の変性多糖の製造方法によれば、一部を化学修飾した新規な変性多糖を得ることができる。また、多糖がヒアルロン酸である場合、本発明の製造方法により得られた変性ヒアルロン酸は、ヒアルロン酸の優れた性質を保持しつつ、化学修飾されたヒアルロン酸の置換率、化学修飾する化合物（Ｅ）の種類等を変化させることにより、ヒアルロン酸の物性を調整することができる。ヒアルロン酸以外の多糖においても、多糖の有する優れた性質を保持しつつ、化学修飾された多糖（Ａ）の置換率等を変化させることにより、物性を調整することができる。
したがって、本発明の製造方法により得られる変性多糖は、化粧品、医薬部外品、関節炎治療剤、創傷被覆剤、眼科手術用手術補助剤及び外科手術後の癒着阻止剤などの医薬品、医療機器として広範囲に使用できる。
【実施例】
【００９８】
以下、実施例及び比較例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。以下、特に定めない限り、％は重量％、部は重量部を示す。
【００９９】
＜製造例１＞
パスツレラ・ムルトシダ由来の配列番号１のヒアルロン酸合成酵素にＦＬＡＧタグを融合したアミノ酸配列をコードする遺伝子をｐＫＫ２２３−３に組み込んだプラスミドを大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉＳＵＲＥに形質転換して、培養し、発現誘導した後、遠心分離機（６０００×ｇ、１５分間）を用いて大腸菌を回収した。回収した大腸菌を、緩衝液Ａ｛１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭドデシルマルトシド、５ｍＭオレイン酸｝に再懸濁して、超音波破砕（１３０Ｗ、１０分）を行った。その後、抗ＦＬＡＧ抗体カラムで精製を行い、多糖合成酵素（Ｃ）であるヒアルロン酸合成酵素（Ｃ−１）の水溶液を得た。
【０１００】
＜製造例２＞
ソラマメ由来の配列番号２のスクロースシンターゼにＦＬＡＧタグを融合したアミノ酸配列をコードする遺伝子をｐＥＴ２２ｂに組み込んだプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した後、培養し、発現誘導した後、遠心分離機（６０００×ｇ、１５分間）を用いて大腸菌を回収した。緩衝液Ｂ｛１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化マグネシウム｝に再懸濁して、超音波破砕（１３０Ｗ、１０分）を行った。その後、抗ＦＬＡＧ抗体カラムで精製を行い、リボヌクレオシド２リン酸変換酵素（Ｇ）であるスクロースシンターゼの水溶液を得た。
【０１０１】
＜ヒアルロン酸合成酵素（Ｃ−１）水溶液の比活性測定＞
水溶液Ｓ｛１ｍＭ ウリジン２リン酸−グルクロン酸（14Ｃでラベルした放射性同位体を含むウリジン２リン酸−グルクロン酸、放射能３００ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）、１ｍＭ ウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭドデシルマルトシド、５ｍＭオレイン酸｝１ｍＬに、１Ｍ スクロースを１０μＬ、製造例２で得たスクロースシンターゼ水溶液を１０μＬ及び製造例１で得たヒアルロン酸合成酵素（Ｃ−１）水溶液を１０μＬ加えて、反応溶液（Ｘ−１）とし、３０℃で１時間反応を行った。ろ紙を用いたペーパークロマトグラフィー法で未反応の基質とヒアルロン酸を分離した後、原点部を切り出し、液体シンチレーションカクテルに浸漬させた後、液体シンチレーションカウンターを用いて放射性同位体を測定し、14Ｃでラベルしたグルクロン酸の取り込み量からヒアルロン酸の合成量を算出した。その結果、ヒアルロン酸の合成量は１００μｇであった。したがって、製造例１で得られたヒアルロン酸合成酵素（Ｃ−１）の水溶液の比活性は０．４ユニット／ｍＬであった。
【０１０２】
＜スクロースシンターゼ水溶液の比活性測定＞
水溶液Ｒ｛１００ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭの塩化マグネシウム、１ｍＭのウリジン２リン酸を含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）｝１ｍＬに、１Ｍのスクロース水溶液を１０μＬ及びスクロースシンターゼ水溶液を１０μＬ加えて反応溶液（１）としたものを３つ作成し、それぞれ３０℃で５分、１０分、１５分反応を行った。反応生成物（ウリジン２リン酸−グルコース）の量は、ＴＬＣ（Ｓｉｄｍａ社、ＰＥＩ−Ｃｅｌｌｕｒｏｓｅプレート）で展開して（展開溶媒：１ＭのＬｉＣｌ、１Ｍのギ酸を含む水溶液）、ＵＶライト（２６０ｎｍ）で検出して求めた。反応生成量と反応時間との関係から、スクロースシンターゼ水溶液の比活性を計算したところ、０．３ユニット／ｍＬであった。
【０１０３】
＜ヒアルロン酸合成酵素（Ｃ−１）の阻害剤濃度ＩＣ50の測定＞
１．５ｍＬ容量のチューブ中で９４０μＬの水溶液１［５ｍＭの塩化マグネシウムと０．０５ｍＭのウリジン２リン酸ナトリウムを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５、２５℃）］に、製造例１で得たヒアルロン酸合成酵素（Ｃ−１）水溶液を１０μＬ溶解し、恒温水槽を用いてチューブを４０℃で２０分静置した。ここに、４０℃に温調した基質溶液１［ウリジン２リン酸−グルクロン酸ナトリウム塩及びウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンを緩衝液Ｂ｛５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５、２５℃）｝に溶解してそれぞれ２０ｍＭの濃度にしたもの］を５０μＬ添加し、酵素反応溶液（Ｉ−１）とした。（Ｉ−１）を作成直後及び５分おきに１００μＬずつ取り出し、取り出した溶液は、１００℃で２分間加熱して酵素反応を停止した。酵素反応を停止した溶液について、遠心分離器（４℃、１２，０００×ｇ、１０分）を用いて遠心し、不純物を沈殿させた。上清８０μＬを下記条件でＨＰＬＣにより分析し、ヒアルロン酸のピーク面積を記録した。
＜ＨＰＬＣの測定条件＞
装置：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣシステム
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ ＯＨｐａｋ ＳＢ−８０６Ｍ ＨＱ
移動相：０．１Ｍ ＮａＣＯ3
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
検出器：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＲＩＤ検出器
温度：４０℃
水溶液１において、ウリジン２リン酸ナトリウムの濃度が異なる溶液｛０ｍＭ（水溶液２）、０．１５ｍＭ（水溶液３）、０．５ｍＭ（水溶液４）、１ｍＭ（水溶液５）及び３ｍＭ（水溶液６）｝を作成した。水溶液１に代えて水溶液２〜６を用いる以外は同様にして酵素反応溶液（Ｉ−２）〜（Ｉ−６）を作成した。酵素反応溶液（Ｉ−２）〜（Ｉ−６）についても、酵素反応溶液（Ｉ−１）の場合と同様にして、ヒアルロン酸のピーク面積を記録した。
ヒアルロン酸ナトリウム（フナコシ社製、「ヒアロース」、分子質量：１７５ｋＤａ）を緩衝液Ｂに溶解し、それぞれ０．００１μｇ／ｍＬ、０．０１μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ及び５μｇ／ｍＬの濃度にしたものを作成し、ヒアルロン酸標準溶液（１）〜（４）とした。（１）〜（４）を、ＨＰＬＣにより分析し、ヒアルロン酸のピーク面積をそれぞれ記録した。横軸（ｘ軸）にそれぞれのヒアルロン酸濃度（μｇ）、縦軸（ｙ軸）にそれぞれのピーク面積Ｐをプロットし、直線の傾き「ｋ」を算出した。
（Ｉ−１）〜（Ｉ−６）を作成直後のウリジン３リン酸のピーク面積をＰ0、「ｍ」分後のピーク面積をＰhとし、それぞれピーク面積の変化ΔＰ（ΔＰ＝Ｐh−Ｐ0）と上記直線の傾きを用いて下記数式（１）からそれぞれの酵素反応初速度ｖ（μｇ／ｓ）を算出した。
ｖ＝ΔＰ／（ｋ×ｍ×６０）（１）
酵素反応溶液（Ｉ−２）を用いて測定した酵素反応初速度ｖを１００％とし、酵素反応溶液（Ｉ−１）及び（Ｉ−３）〜（Ｉ−６）を用いて測定した酵素反応初速度の相対値（％）を算出した。算出した相対値を用いて、横軸（ｘ軸）にそれぞれのウリジン２リン酸濃度［Ｓ］、縦軸（ｙ軸）に酵素反応溶液（Ｉ−１）〜（Ｉ−６）での酵素反応初速度ｖの相対値をプロットした。プロットの近似曲線と直線ｙ＝５０（％）との交点でのウリジン２リン酸の濃度が阻害濃度ＩＣ50であり、阻害濃度ＩＣ50は０．８ｍＭであった。
【０１０４】
＜実施例１＞
水溶液Ｘ｛０．００１％のアセチル化ヒアルロン酸（資生堂；重量平均分子量約１０万、酢酸による置換率０．１５、化学修飾された多糖（Ａ−１））、１ｍＭ ウリジン２リン酸−グルクロン酸、１ｍＭ ウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化マグネシウム｝１ｍＬに、製造例１で得たヒアルロン酸合成酵素（Ｃ−１）の水溶液を１０μＬ加えて、反応溶液（Ｌ−１）とし、３０℃で１時間反応を行った。限外ろ過膜｛Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、アミコンウルトラ−１５（分画分子量１０万）｝を用いて未反応の基質と変性多糖である変性ヒアルロン酸とを精製した。変性ヒアルロン酸を１００ｍｇ得た。
（Ａ−１）及び得られた変性ヒアルロン酸について、液体クロマトグラフィーで分析した結果、分子量５０万以上のピークは、（Ａ−１）が＜１％、得られた変性ヒアルロン酸が８０％であった。
また、得られた変性ヒアルロン酸について、液体クロマトグラフィーを用いて分子量５０万以上のものを分取し、液体クロマトグラフィー分取後の変性ヒアルロン酸（Ｖ−１）を得た。（Ｖ−１）をＮＭＲを用いて解析した結果、置換率は０．０２５であり、（Ａ−１）の置換率０．１５よりも低かった。
その後、液体クロマトグラフィーで分取後の変性ヒアルロン酸（Ｖ−１）をヒアルロニダーゼ（β−Ｎ−アセチルグルコサミナーゼ（生化学工業製）とβ−グルクロニダーゼ（シグマ社製）の混合物）を用いて分解し、さらに液体クロマトグラフィーで分子量１０００〜１０万のフラクションを分取し、ＮＭＲで解析した結果、分解後の変性ヒアルロン酸の置換率は０．１５５であった。
したがって、液体クロマトグラフィー分取後の変性ヒアルロン酸（Ｖ−１）は、（Ａ−１）に化学修飾されていないヒアルロン酸セグメント（グルクロン酸及びＮ−アセチルグルコサミン）が結合した、一部分が化学修飾された変性多糖である変性ヒアルロン酸を含んでいることがわかった。
【０１０５】
＜実施例２＞
実施例１において、水溶液Ｘ中のアセチル化ヒアルロン酸を、置換率が「約０．１５」のものに代えて「約１」のアセチル化ヒアルロン酸（Ａ−２）（資生堂；重量平均分子量約１０万）を使用する以外は同様にして実施した。変性ヒアルロン酸を３ｍｇ得た。
（Ａ−２）及び得られた変性ヒアルロン酸について、液体クロマトグラフィーで解析を行った結果、分子量５０万以上のピークは（Ａ−２）＜１％、得られた変性ヒアルロン酸が１０％であった。
得られた変性ヒアルロン酸について、液体クロマトグラフィーを用いて分子量５０万以上のものを分取し、液体クロマトグラフィー分取後の変性ヒアルロン酸（Ｖ−２）を得た。（Ｖ−２）をＮＭＲを用いて解析した結果、置換率は０．５であり、（Ａ−２）の置換率１よりも低かった。
その後、液体クロマトグラフィー分取後の変性ヒアルロン酸（Ｖ−２）をヒアルロニダーゼ（β−Ｎ−アセチルグルコサミナーゼ（生化学工業製）とβ−グルクロニダーゼ（シグマ社製）の混合物）を用いて分解した後、液体クロマトグラフィーで分子量１０００〜１０万のフラクションを分取し、ＮＭＲで解析した結果、分解後の変性ヒアルロン酸の置換率は０．９であった。
したがって、液体クロマトグラフィー分取後の変性ヒアルロン酸（Ｖ−２）は、（Ａ−２）に化学修飾されていないヒアルロン酸セグメント（グルクロン酸及びＮ−アセチルグルコサミン）が結合した、一部分が化学修飾された変性ヒアルロン酸を含んでいることがわかった。
【０１０６】
＜実施例３＞
実施例１において、水溶液Ｘ中に９０ｍＭのウリジン２リン酸を含む以外は同様にして実施した。変性ヒアルロン酸を１５ｍｇ得た。
得られた変性ヒアルロン酸について、液体クロマトグラフィーで解析を行った結果、分子量５０万以上のピークは５％であった。
得られた変性ヒアルロン酸について、液体クロマトグラフィーを用いて分子量５０万以上のものを分取し、液体クロマトグラフィー分取後の変性ヒアルロン酸（Ｖ−３）を得た。（Ｖ−３）をＮＭＲを用いて解析した結果、置換率は０．０７であり、（Ａ−１）の置換率０．１５よりも低かった。
その後、液体クロマトグラフィー分取後の変性ヒアルロン酸（Ｖ−３）をヒアルロニダーゼ（β−Ｎ−アセチルグルコサミナーゼ（生化学工業製）とβ−グルクロニダーゼ（シグマ社製）の混合物）を用いて分解した後、液体クロマトグラフィーで分子量１０００〜１０万のフラクションを分取し、ＮＭＲで解析した結果、分解後の変性ヒアルロン酸の置換率は０．１４であった。
したがって、液体クロマトグラフィー分取後の変性ヒアルロン酸（Ｖ−３）は、（Ａ−１）に化学修飾されていないヒアルロン酸セグメント（グルクロン酸及びＮ−アセチルグルコサミン）が結合した、一部分が化学修飾された変性ヒアルロン酸を含んでいることがわかった。
【０１０７】
＜実施例４＞
実施例１において、水溶液Ｘ中のアセチル化ヒアルロン酸を、置換率が「約０．１５」のものに代えて「約０．８」のアセチル化ヒアルロン酸（Ａ−３）（資生堂；重量平均分子量約１０万）を使用する以外は同様にして実施した。変性ヒアルロン酸を５０ｍｇ得た。
（Ａ−３）及び得られた変性ヒアルロン酸について、液体クロマトグラフィーで解析を行った結果、分子量５０万以上のピークは（Ａ−３）＜１％、得られた変性ヒアルロン酸が３０％であった。
得られた変性ヒアルロン酸について、液体クロマトグラフィーを用いて分子量５０万以上のものを分取し、液体クロマトグラフィー分取後の変性ヒアルロン酸（Ｖ−４）を得た。（Ｖ−４）をＮＭＲを用いて解析した結果、置換率は０．０５であり、置換率が原料として用いたアセチル化ヒアルロン酸の置換率である０．８よりも低かった。
その後、液体クロマトグラフィー分取後の変性ヒアルロン酸（Ｖ−４）をヒアルロニダーゼ（β−Ｎ−アセチルグルコサミナーゼ（生化学工業製）とβ−グルクロニダーゼ（シグマ社製）の混合物）を用いて分解した後、液体クロマトグラフィーで分子量１０００〜１０万のフラクションを分取し、ＮＭＲで解析した結果、分解後の変性ヒアルロン酸の置換率は０．７５であった。
したがって、液体クロマトグラフィー分取後の変性ヒアルロン酸（Ｖ−４）は、（Ａ−３）に化学修飾されていないヒアルロン酸セグメント（グルクロン酸及びＮ−アセチルグルコサミン）が結合した、一部分が化学修飾された変性ヒアルロン酸を含んでいることがわかった。
【０１０８】
＜実施例５＞
実施例１において、水溶液Ｘ中にさらに「スクロース（和光純薬社製）を溶液中の濃度が１００ｍＭとなるように加え、製造例２で得たスクロースシンターゼの水溶液を１μＬ加える」以外は同様にして実施した。変性ヒアルロン酸を２００ｍｇ得た。
得られた変性ヒアルロン酸について、液体クロマトグラフィーで分析した結果、分子量５０万以上のピークは、８０％であった。
また、得られた変性ヒアルロン酸について、液体クロマトグラフィーを用いて分子量５０万以上のものを分取し、液体クロマトグラフィー分取後の変性ヒアルロン酸（Ｖ−５）を得た。（Ｖ−５）をＮＭＲを用いて解析した結果、置換率は０．０２５であり、（Ａ−１）の置換率０．１５よりも低かった。
その後、液体クロマトグラフィーで分取後の変性ヒアルロン酸（Ｖ−５）をヒアルロニダーゼ（β−Ｎ−アセチルグルコサミナーゼ（生化学工業製）とβ−グルクロニダーゼ（シグマ社製）の混合物）を用いて分解し、さらに液体クロマトグラフィーで分子量１０００〜１０万のフラクションを分取し、ＮＭＲで解析した結果、分解後の変性ヒアルロン酸の置換率は０．１５であった。
したがって、液体クロマトグラフィー分取後のヒアルロン酸誘導体（Ｖ−５）は、（Ａ−１）に化学修飾されていないヒアルロン酸セグメント（グルクロン酸及びＮ−アセチルグルコサミン）が結合した、一部分が化学修飾された変性多糖である変性ヒアルロン酸を含んでいることがわかった。
【０１０９】
実施例１〜５の結果から、得られた変性ヒアルロン酸は原料のアセチルヒアルロン酸よりも分子量が大きく、原料と比較して置換率が低かった。また、実施例１〜５で得られた変性ヒアルロン酸はヒアルロニダーゼにより分解され、原料の置換率と同程度になった。したがって、実施例１〜５で得た変性ヒアルロン酸は、アセチルヒアルロン酸セグメントにヒアルロン酸セグメントが結合した一部分がアセチル化された変性ヒアルロン酸であることが分かる。
したがって、本発明の変性多糖の製造方法によれば、一部を化学修飾した変性多糖を製造することができることがわかる。
また、置換率１とほぼ全てのヒドロキシル基がアセチル化されている実施例２と置換率が０．１５の実施例１及び置換率が０．８の実施例４とを比較した場合、置換率が０．１５又は０．８である実施例１及び４の方が、変性多糖をより大量に得ることができた。
また、リボヌクレオシド２リン酸であるウリジン２リン酸を阻害濃度ＩＣ50の１１３倍含む溶液を用いた実施例３とウリジン２リン酸を加えていない実施例１とを比較した場合、ウリジン２リン酸を加えていない実施例１の方が、変性多糖をより大量に得ることができた。また、リボヌクレオシド２リン酸変換酵素（Ｇ）を用いた実施例５は、用いていない実施例１と比較して、さらに変性多糖を大量に得ることができた。
【０１１０】
＜ヒアルロン酸誘導体の汗による流れやすさ試験＞
実施例１〜５で液体クロマトグラフィー分取により得られた変性ヒアルロン酸（Ｖ−１）〜（Ｖ−５）を、限外ろ過膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製アミコンウルトラ−１５（分画分子量１０万））で濃縮して０．１％の変性ヒアルロン酸水溶液（Ｙ−１）〜（Ｙ−５）にした。５００μＬの（Ｙ−１）〜（Ｙ−５）をそれぞれ被験者の右手に塗布して３０分放置した後、サウナで１０分過ごした。水で簡単に汗を流した後、布で変性ヒアルロン酸塗布部位を拭き取った。その後、布から変性ヒアルロン酸を抽出し、液体クロマトグラフィーにより変性ヒアルロン酸量を定量した。同様の試験を変性ヒアルロン酸水溶液（Ｙ−１）〜（Ｙ−５）についてそれぞれ１０人に行ったところ、布に付着していた（汗で流れずに残った）変性ヒアルロン酸の量は（Ｖ−１）〜（Ｖ−５）全て０．３±０．１ｍｇであった。
【０１１１】
＜ヒアルロン酸の汗による流れやすさ試験＞
アセチル化ヒアルロン酸に代えて、ヒアルロン酸（重量平均分子量１０万）を用いる以外は実施例１と同様にして、ヒアルロン酸を作成した。
作成したヒアルロン酸について、液体クロマトグラフィーで分子量１００万付近を分取し、液体クロマトグラフィー分取後のヒアルロン酸（Ｖ’−１）を得た。さらに限外ろ過膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製アミコンウルトラ−１５（分画分子量１００，０００））で濃縮して、０．１％のヒアルロン酸溶液（Ｙ’−１）にした。５００μＬの（Ｙ’−１）を被験者の左手に塗布して３０分放置した後、サウナで１０分過ごした。水で簡単に汗を流した後、布でヒアルロン酸塗布部位を拭き取った。その後、布からヒアルロン酸を抽出して液体クロマトグラフィーによりヒアルロン酸量を定量した。同様の試験を１０人に行ったところ、布に付着していた（汗で流れずに残った）ヒアルロン酸の量は＜０．１ｍｇであった。
【０１１２】
変性ヒアルロン酸及びヒアルロン酸の汗による流れやすさ試験の結果から、化学修飾セグメントを有さないヒアルロン酸と比較して、本発明の製造方法により得られた変性ヒアルロン酸は、汗で流されにくいことがわかる。
したがって、本発明の製造方法によれば、機能性の高い変性多糖を得ることができることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【０１１３】
本発明の変性多糖の製造方法によれば、一部を化学修飾した変性多糖を製造できる。また、本発明の製造方法により得られた変性多糖は、化粧品のみならず医薬部外品、医薬品及び医療機器にも用いることができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は変性多糖の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多糖のなかでもヒアルロン酸は、牛の眼球、鶏冠、動物の緩衝組織、胎盤、癌細胞及び皮膚などの生体組織に多量に含まれているもので、グルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンとがβ１，３結合とβ１，４結合で交互に結合した直鎖状の多糖であり、分子量が１０5〜１０6Ｄａの高分子量のグルコサミノグリカンである。ヒアルロン酸は、粘度が高く、高い保湿効果を有し、物理的摩擦に対する潤滑効果及び細菌などの侵入に対する保護効果が優れているという性質を持つ。
ヒアルロン酸はこれらの性質を持つので、化粧品添加剤、関節炎治療剤、創傷被覆剤、眼科手術用手術補助剤及び外科手術後の癒着阻止剤などの医薬品として広範囲に使用されている。
【０００３】
ヒアルロン酸は、特に保湿性が優れることから、化粧品添加剤として多用されている。しかし、汗などによって皮膚表面から流れ去ってしまう問題がある。
また、ヒアルロン酸分子中のヒドロキシル基及び／又はカルボキシル基に、カルボン酸及び／又はアルコール等を反応させてエステル化する等により、ヒアルロン酸を化学修飾したヒアルロン酸誘導体の製造方法が知られている（特許文献１）。しかしながら、ヒアルロン酸にエステル化反応等の化学修飾を行うと、分子全体が化学修飾されてしまうため、ヒアルロン酸の親水性が極端に低下する問題がある。また、ヒアルロン酸の保湿性等の優れた性質が失われてしまう問題もある。そこで、ヒアルロン酸を含む多糖において、分子全体でなく、分子の一部を化学修飾した変性多糖の製造方法の開発が望まれている。
【０００４】
【特許文献１】特開平０６−２９８８０４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、一部を化学修飾した変性多糖の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記の目的を達成するべく検討を行った結果、本発明に到達した。
すなわち本発明は、化学修飾された多糖（Ａ）及び下記リボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ｂ）を多糖合成酵素（Ｃ）の存在下で反応させる変性多糖の製造方法である。
リボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ｂ）：トリオース（ｂ−１）、テトロース（ｂ−２）、ペントース（ｂ−３）、ヘキソース（ｂ−４）、ヘプトース（ｂ−５）及び下記単糖（ｂ−６）からなる群より選ばれる少なくとも１種の単糖（ｂ）が有する少なくとも１つのヒドロキシル基の水素原子が下記化学式（１）〜（５）のいずれか１つの官能基で置換された糖ヌクレオチド。
【化１】
【化２】
【化３】
【化４】
【化５】
単糖（ｂ−６）：（ｂ−１）、（ｂ−２）、（ｂ−３）、（ｂ−４）及び（ｂ−５）からなる群より選ばれる単糖において、この単糖が有する水素原子、ヒドロキシル基及びヒドロキシメチル基からなる群より選ばれる少なくとも１種が下記置換基（Ｄ）で置換された単糖。
置換基（Ｄ）：カルボキシル基、アミノ基、Ｎ−アセチルアミノ基、スルホ基、メチルエステル基、Ｎ−グリコリル基、メチル基、１，２，３−トリヒドロキシプロピル基、リン酸基及び２−カルボキシ−２−ヒドロキシエチル基からなる群より選ばれる少なくとも１種の置換基。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の変性多糖の製造方法は、一部を化学修飾した新規な変性多糖を製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明の変性多糖の製造方法は、化学修飾された多糖（Ａ）及びリボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ｂ）を多糖合成酵素（Ｃ）の存在下で反応させるものである。
【０００９】
化学修飾された多糖（Ａ）としては、多糖に化学反応によって他の化合物を化学結合させたものが含まれる。
多糖は、後述する単糖（ｂ−１）〜（ｂ−６）が複数連なったものであり、具体的には、ヒアルロン酸、デンプン、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、セルロース、キチン、キトサン、アガロース、カラギーナン、ヘパリン、ペクチン、キシログルカン及びキサンタンガム等が含まれる。
（Ａ）として具体的には、下記化合物（Ｅ）と多糖とを反応させた反応生成物等が挙げられる。
化合物（Ｅ）：ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、スルホ基及びリン酸基からなる群より選ばれる少なくとも１種を有する化合物と反応する官能基（ｅ）を有する化合物。
化合物（Ｅ）としては、官能基（ｅ）として、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、スルホ基、ホスホン酸基及びリン酸基からなる群より選ばれる少なくとも１種を有する化合物（Ｅ１）が含まれる。
【００１０】
（Ｅ１）としては、下記（Ｅ１１）〜（Ｅ１５）が含まれる。
（Ｅ１１）：ヒドロキシル基を有する化合物
（Ｅ１２）：カルボキシル基を有する化合物
（Ｅ１３）：アミノ基を有する化合物
（Ｅ１４）：スルホ基を有する化合物
（Ｅ１５）：ホスホン酸基又はリン酸基を有する化合物
（Ｅ１６）：ヒドロキシル基及びカルボキシル基を有する化合物
【００１１】
（Ｅ１１）としては、炭素数１〜１００の１価のアルコール（Ｅ１１１）及び炭素数２〜１００の２価以上のアルコール（Ｅ１１２）が含まれる。
（Ｅ１１１）としては、１価の脂肪族アルコール（Ｅ１１１−１）、１価の芳香脂肪族アルコール（Ｅ１１１−２）、１価の脂肪族アルコールのアルキレンオキサイド付加物（Ｅ１１１−３）、１価のアルキルフェノールのアルキレンオキサイド付加物（Ｅ１１１−４）、１価のモノアルキル又は１価のジアルキルアミンのアルキレンオキサイド付加物（Ｅ１１１−５）が含まれる。
【００１２】
（Ｅ１１１−１）としては、炭素数１〜３０の脂肪族モノオールが含まれ、具体的には、炭素数１〜５の低級アルコール（メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール等）、炭素数６〜３０の高級アルコール（ヘキシルアルコール、オクチルアルコール、デカノール、ウンデカノール、ドデカノール、トリデカノール、テトラデカノール、ペンタデシルアルコール、ヘキサデシルアルコール、ヘプタデカノール、オクタデカノール、オレイルアルコール、ノナデカノール、エイコサノール、セリルアルコール、ミリシルアルコール等）及びそれぞれの分岐鎖アルコール等が挙げられる。これらのうち２種以上を組み合わせてもよい。
【００１３】
（Ｅ１１１−２）としては、炭素数７〜３０の芳香脂肪族モノオールが含まれ、具体的には、ベンジルアルコール等が挙げられる。
【００１４】
（Ｅ１１１−３）としては、上記（Ｅ１１１−１）のアルキレンオキサイド（以下ＡＯと略記する）付加物（重合度＝１〜１００）が含まれる。ＡＯとしては、炭素数２〜１０のものが含まれ、具体的には、エチレンオキサイド（以下、ＥＯと略記する）、１，２−プロピレンオキサイド（以下、ＰＯと略記する）、ブチレンオキサイド及びスチレンオキサイド等が挙げられる。ＡＯとしてはこれら２種以上を併用してもよい。（Ｅ１１１−３）として、具体的には、オレイルアルコールＥＯＰＯ付加物等が挙げられる。
【００１５】
（Ｅ１１１−４）としては、炭素数７〜３０のアルキルフェノールのＡＯ付加物（重合度＝１〜１００）が含まれる。炭素数７〜３０のアルキルフェノールとして、具体的には、ノニルフェノール及びオクチルフェノール等が挙げられる。ＡＯとしては、炭素数２〜１０のものが含まれ、ＥＯ、ＰＯ、ブチレンオキサイド及びスチレンオキサイド等が挙げられる。ＡＯとしてはこれら２種以上を併用してもよい。（Ｅ１１１−４）として、具体的には、ノニルフェノールのＥＯ付加物及びオクチルフェノールのＥＯ付加物等が挙げられる。
【００１６】
（Ｅ１１１−５）としては、炭素数１〜３０のモノアルキル又はジアルキルアミンのＡＯ付加物（重合度＝１〜１００）が含まれる。ＡＯとしては、炭素数２〜１０のものが含まれ、ＥＯ、ＰＯ、ブチレンオキサイド及びスチレンオキサイド等が挙げられる。ＡＯとしてはこれら２種以上を併用してもよい。具体的には、ヘキサデシルアミンＥＯＰＯ付加物、ラウリルアミンＥＯ付加物及びステアリルアミンＥＯＰＯ付加物等が挙げられる。
【００１７】
（Ｅ１１２）として、具体的には、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３及び１，４−ブタンジオール、１，６−ヘキサンジオール、１，１０−デカンジオール、ジエチレングリコール、ネオペンチルグリコール、シクロヘキサンジオール、シクロヘキサンジメタノール、１，４−ビス（ヒドロキシメチル）シクロヘキサン及び１，４−ビス（ヒドロキシエチル）ベンゼン等の２価アルコール；グリセリン及びトリメチロールプロパン等の３価アルコール；ペンタエリスリトール、ソルビトール、マンニトール、ソルビタン、ジグリセリン、ジペンタエリスリトール等、ショ糖、グルコース、マンノース、フルクトース、メチルグルコシド及びその誘導体等の４〜８価のアルコ―ル；フェノール、フロログルシン、クレゾール、ピロガロ―ル、カテコール、ヒドロキノン、ビスフェノ―ルＡ、ビスフェノールＦ、ビスフェノールＳ、１−ヒドロキシナフタレン、１，３，６，８−テトラヒドロキシナフタレン、アントロール、１，４，５，８−テトラヒドロキシアントラセン及び１−ヒドロキシピレン等のフェノ―ル；ポリブタジエンポリオール；ひまし油系ポリオール等が挙げられる。
上記（Ｅ１１）のうち、化学修飾し易さの観点から、（Ｅ１１１）が好ましい。
【００１８】
カルボキシル基を有する化合物（Ｅ１２）としては、炭素数１〜１００の１価のカルボン酸（Ｅ１２１）及び炭素数１〜１００の２価以上のカルボン酸（Ｅ１２２）が含まれる。
（Ｅ１２１）としては、１価の脂肪族カルボン酸（Ｅ１２１−１）、１価の芳香族カルボン酸（Ｅ１２１−２）及び１価の芳香脂肪族カルボン酸（Ｅ１２１−３）が含まれる。
【００１９】
（Ｅ１２１−１）としては、炭素数１〜１００の脂肪族モノカルボン酸が挙げられ、具体的には、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、ブチル酸、バレリアン酸、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、クロトン酸、イソクロトン酸、ソルビン酸、オブツシル酸及びカプロレイン酸等が挙げられる。
【００２０】
（Ｅ１２１−２）としては、炭素数７〜１００の芳香族モノカルボン酸が挙げられ、具体的には、安息香酸、メチル安息香酸、プロピル安息香酸、ヘキシル安息香酸及びドデシル安息香酸等が挙げられる。
【００２１】
（Ｅ１２１−３）としては、炭素数８〜１００の芳香脂肪族モノカルボン酸が挙げられ、具体的には、フェニル酢酸、フェニルプロピオン酸及びフェニルデカン酸等が挙げられる。
【００２２】
２価以上のカルボン酸（Ｅ１２２）としては、炭素数４〜１００のアルカンジカルボン酸（コハク酸、アジピン酸、セバシン酸、アゼライン酸、ドデカンジカルボン酸、オクタデカンジカルボン酸及びデシルコハク酸等）；炭素数６〜１００の脂環式ジカルボン酸［ダイマー酸（２量化リノール酸）等］；炭素数４〜１００のアルケンジカルボン酸（ドデセニルコハク酸、ペンタデセニルコハク酸及びオクタデセニルコハク酸等のアルケニルコハク酸、マレイン酸、フマール酸及びシトラコン酸等）；炭素数８〜１００の芳香族多価カルボン酸（フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸、２，２’-ビベンジルジカルボン酸、トリメリット酸、ヘミリット酸、トリメシン酸、ピロメリット酸及びナフタレン−１，４ジカルボン酸、ナフタレン−２，３，６トリカルボン酸、ジフェン酸、２，３−アントラセンジカルボン酸、２，３，６−アントラセントリカルボン酸及びピレンジカルボン酸等の炭素数８〜１８の芳香族ポリカルボン酸等）等が挙げられる。
上記の（Ｅ１２）のうち、化学修飾し易さの観点から、（Ｅ１２１）が好ましい。
【００２３】
アミノ基を有する化合物（Ｅ１３）としては、炭素数１〜１００のアミン（Ｅ１３１）が含まれる。
（Ｅ１３１）としては、１価の脂肪族アミン（Ｅ１３１−１）、２価以上の脂肪族アミン（Ｅ１３１−２）、脂環式アミン（Ｅ１３１−３）、芳香族アミン（Ｅ１３１−４）及び複素環式アミン（Ｅ１３１−５）が含まれる。
【００２４】
（Ｅ１３１−１）として、具体的には、炭素数１〜１００のモノアルキルアミン（メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン及びブチルアミン等）；炭素数１〜１００のジアルキルアミン（ジメチルアミン、ジエチルアミン、ジプロピルアミン、プロピルメチルアミン及びプロピルエチルアミン等）；炭素数１〜１００のトリアルキルアミン（トリメチルアミン、エチルジメチルアミン、ジエチルメチルアミン、トリエチルアミン、トリｎ−プロピルアミン及びトリｎ−ブチルアミン等）等が挙げられる。
【００２５】
（Ｅ１３１−２）としては、炭素数１〜１００のものが含まれ、具体的には、１，２‐ジアミノエタン、１，２‐プロパンジアミン、１，３−プロパンジアミン、１，４−ブタンジアミン、１，６−ジアミノヘキサン、１，２−ビス(２-アミノエトキシ)エタン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ペンタエチレンヘキサミン、イミノビスプロピルアミン及びビス（ヘキサメチレン）トリアミン等が挙げられる。
【００２６】
（Ｅ１３１−３）としては、炭素数３〜１００のものが含まれ、具体的には、イソホロンジアミン及び１，２‐シクロヘキサンジアミン等が挙げられる。
【００２７】
（Ｅ１３１−４）としては、炭素数６〜１００のものが含まれ、具体的には、アニリン、１，３−フェニレンジアミン、２，４‐トリレンジアミン、１，３‐キシリレンジアミン、１，５−ナフタレンジアミン及び２，３−アントラセンジアミン等が挙げられる。
【００２８】
（Ｅ１３１−５）としては、炭素数３〜１００のものが含まれ、具体的には、ピペラジン、Ｎ−アミノエチルピペラジン及び１，４−ジアミノエチルピペラジン等が挙げられる。
上記（Ｅ１３）のうち、化学修飾し易さの観点から、（Ｅ１３１−１）が好ましい。
【００２９】
（Ｅ１４）としては、スルホ基を１個有する炭素数１〜１００の化合物（Ｅ１４１）及びスルホ基を２個以上有する炭素数１〜１００の化合物（Ｅ１４２）が含まれる。
（Ｅ１４１）としては、炭素数１〜１００の脂肪族モノスルホン酸（メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、プロパンスルホン酸、ブタンスルホン酸、ヘキサンスルホン酸、デカンスルホン酸、ウンデカンスルホン酸及びドデカンスルホン酸等）；炭素数６〜３０芳香族モノスルホン酸（ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ｏ−トルエンスルホン酸、ｍ−トルエンスルホン酸、４−ドデシルベンゼンスルホン酸、４−オクチルベンゼンスルホン酸及びナフタレンスルホン酸等）；炭素数１〜２０のパーフルオロアルカンスルホン酸（トリフルオロメタンスルホン酸等）等が挙げられる。
【００３０】
（Ｅ１４２）としては、炭素数１〜１００の脂肪族ポリスルホン酸（メチオン酸、１，１−エタンジスルホン酸、１，２−エタンジスルホン酸、１，１−プロパンジスルホン酸、１，３−プロパンジスルホン酸及びポリビニルスルホン酸等）；炭素数６〜１００の芳香族ポリスルホン酸（ｍ−ベンゼンジスルホン酸、１，４−ナフタレンスルホン酸、１，５−ナフタレンジスルホン酸、１，６−ナフタレンジスルホン酸、２，６−ナフタレンジスルホン酸、２，７−ナフタレンジスルホン酸及びスルホン化ポリスチレン等）；ビス（フルオロスルホニル）イミド；炭素数２〜１０のビス（パーフルオロアルカンスルホニル）イミド［ビス（トリフルオロメタンスルホニル）イミド、ビス（ペンタフルオロエタンスルホニル）イミド、ビス（ノナフルオロブタンスルホニル）イミド、ペンタフルオロエタンスルホニルトリフルオロメタンスルホニルイミド、トリフルオロメタンスルホニルヘプタフルオロプロパンスルホニルイミド、ノナフルオロブタンスルホニルトリフルオロメタンスルホニルイミド等］等が挙げられる。
上記（Ｅ１４）のうち、化学修飾し易さの観点から、（Ｅ１４１）が好ましい。
【００３１】
（Ｅ１５）としては、リン酸、ピロリン酸、トリリン酸、ポリリン酸、炭素数１〜１００のホスホン酸（メチルホスホン酸ジメチル、エチルホスホン酸ジエチル、メチルホスホン酸ジプロピル、メチルホスホン酸トリブチル、ブチルホスホン酸ジブチル、フェニルホスホン酸ジフェニル、フェニルホスホン酸ジクレジル、フェニルホスホン酸ジキシリル、フェニルホスホン酸フェニルクレジル等）及び炭素数１〜１００のリン酸基（リン酸トリメチル、リン酸トリエチル、リン酸トリプロピル、リン酸トリイソプロピル、リン酸トリブチル、リン酸トリイソブチル、リン酸トリフェニル、リン酸トリクレジル、リン酸トリキシリル、リン酸ジフェニルクレジル、リン酸メチルジフェニル、リン酸フェニルジエチル等）等が挙げられる。
【００３２】
（Ｅ１６）としては、炭素数２〜１００のヒドロキシカルボン酸が含まれ、具体的には、脂肪族ヒドロキシカルボン酸（グリコール酸、乳酸、２−ヒドロキシ酪酸、６−ヒドロキシヘキサン酸、２，８−ジヒドロキシカプリル酸、１０−ヒドロキシカプリン酸、１２−ヒドロキシラウリン酸、１６−ヒドロキシパルミチン酸、１８−ヒドロキシオレイン酸、２２−ヒドロキシベヘニン酸、りんご酸及びクエン酸等）；芳香族ヒドロキシカルボン酸（サリチル酸、ｍ−ヒドロキシ安息香酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、４−ヒドロキシフタル酸、５−ヒドロキシトリメリット酸及び３−ヒドロキシピロメリット酸等）等が挙げられる。
【００３３】
上記（Ｅ）のうち、原料の入手のしやすさ及び得られる変性多糖の物性の観点から、（Ｅ１１）、（Ｅ１２）及び（Ｅ１６）が好ましく、さらに好ましくは１価の脂肪族アルコール（Ｅ１１１−１）及び炭素数１〜１００の１価のカルボン酸（Ｅ１２１）であり、特に好ましくはメタノール及び酢酸からなる群より選ばれる少なくとも１種である。
また、化学修飾された多糖（Ａ）として、（Ａ）を製造し易い及び得られる変性多糖の物性の観点から、多糖が有するヒドロキシル基及び／又はカルボキシル基がエステル化された多糖であることが好ましく、さらに好ましくは多糖が有するヒドロキシル基及び／又はカルボキシル基がアセチル化された多糖であり、次にさらに好ましくは多糖が有するヒドロキシル基及び／又はカルボキシル基がアセチル化されたヒアルロン酸である。
【００３４】
化学修飾された多糖（Ａ）中には、変性多糖を大量に得る観点から、（Ａ）１分子の糖鎖を構成する末端の単糖のうち、少なくとも２つの末端の単糖が化学修飾されていない多糖分子を含むことが好ましい。（Ａ）分子が、末端の単糖が修飾された多糖分子である場合、多糖合成酵素（Ｃ）が伸長反応を行う効率が悪くなる。したがって、（Ａ）中に少なくとも２つの末端の単糖が化学修飾されていない多糖分子を含むことが好ましい。
（Ａ）分子の糖鎖を構成する末端の単糖が化学修飾されていない多糖（Ａ）を作成する方法としては、化学修飾された多糖（Ａ）を合成する際に、後述する置換率が１未満となるように合成する方法等が挙げられる。具体的には、化学修飾させる前の多糖が有する官能基｛ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、スルホ基及びリン酸基｝のうち、ヒドロキシル基と反応しうる（Ｅ）の量を、ヒドロキシル基のモル数よりも少なくすること等が挙げられる。
【００３５】
化学修飾された多糖（Ａ）が、多糖が有するカルボキシル基を化合物（Ｅ）で修飾したものである場合、（Ｅ１１）で修飾する方法としては、従来のカルボキシル基を有する化合物とヒドロキシル基を有する化合物からエステル化合物を作成する方法が使用でき、（Ｅ１３）で修飾する方法としては、従来のカルボキシル基を有する化合物とアミノ基を有する化合物からアミド化合物を作成する方法が使用できる。
また、（Ａ）が多糖が有するヒドロキシル基を化合物（Ｅ）で修飾したものである場合、（Ｅ１２）で修飾する方法としては、従来のヒドロキシル基を有する化合物とカルボキシル基を有する化合物からエステル化合物を作成する方法が使用でき、（Ｅ１４）で修飾する方法としては、従来のヒドロキシル基を有する化合物とスルホ基を有する化合物からスルホン酸エステル化合物を作成する方法が使用でき、（Ｅ１５）で修飾する方法としては、従来のヒドロキシル基を有するかご物とホスホン酸基又はリン酸基を有する化合物からリン酸エステル化合物を作成する方法が使用できる。
また、化学修飾した多糖を合成する従来の方法｛特開平０９−１１０９０１号、特開平０９−１２４７０１号及び特開平１１−０１２３０４号等｝を用いることができる。
【００３６】
化学修飾された多糖（Ａ）は、多糖が有するヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、スルホ基及びリン酸基からなる群より選ばれるするなくとも１種を少なくとも１つが修飾されていればよい。
【００３７】
また、化学修飾された多糖（Ａ）が（Ｅ）により修飾されている割合（置換率）は、変性多糖の物性を変化させる（適度に疎水性を付与する等）観点から、０．００１〜１が好ましく、さらに好ましくは０．１〜１である。また、効率よく変性多糖を得る観点から、置換率は１未満であることが好ましく、さらに好ましくは０．９以下であり、次にさらに好ましくは０．８以下である。
置換率は、下記式によって求められる。
置換率＝Ｍ２／Ｍ１
Ｍ１：化学修飾する前の多糖中の、化合物（Ｅ）が反応し得る官能基｛ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、スルホ基及びリン酸基｝のモル数
Ｍ２：多糖に付加した化合物（Ｅ）のモル数
上記（Ａ）の置換率は、ＮＭＲによって測定することができる。例えば、化合物（Ｅ）が酢酸であり、ヒアルロン酸を化学修飾し、（Ａ）がアセチル化ヒアルロン酸である場合、アセチル化ヒアルロン酸のＮＭＲを測定し、積分値から、下記式によって求める。
置換率＝（アセチル基のピーク積分値／３）／｛（ヒドロキシル基のピーク積分値）＋（アセチル基のピーク積分値／３）｝
【００３８】
化学修飾された多糖（Ａ）の液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法により測定される重量平均分子量は、改変多糖の製造のしやすさの観点から、５００〜１０，０００，０００が好ましい。
【００３９】
本発明において、リボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ｂ）は、トリオース（ｂ−１）、テトロース（ｂ−２）、ペントース（ｂ−３）、ヘキソース（ｂ−４）、ヘプトース（ｂ−５）及び下記単糖（ｂ−６）からなる群より選ばれる少なくとも１種の単糖（ｂ）が有する少なくとも１つのヒドロキシル基の水素原子が下記化学式（１）〜（５）のいずれか１つの官能基で置換された糖ヌクレオチドである。
【化１】
【化２】
【化３】
【化４】
【化５】
単糖（ｂ−６）：（ｂ−１）、（ｂ−２）、（ｂ−３）、（ｂ−４）及び（ｂ−５）からなる群より選ばれる単糖において、この単糖が有する水素原子、ヒドロキシル基及びヒドロキシメチル基からなる群より選ばれる少なくとも１種が下記置換基（Ｄ）で置換された単糖。
置換基（Ｄ）：カルボキシル基、アミノ基、Ｎ−アセチルアミノ基、スルホ基、メチルエステル基、Ｎ−グリコリル基、メチル基、１，２，３−トリヒドロキシプロピル基、リン酸基及び２−カルボキシ−２−ヒドロキシエチル基からなる群より選ばれる少なくとも１種の置換基。
単糖（ｂ）には、光学異性体及び立体異性体が含まれる。
【００４０】
トリオース（ｂ−１）は、炭素数３の単糖であり、具体的には、ジヒドロキシアセトン及びグリセルアルデヒド等が挙げられる。
テトロース（ｂ−２）は、炭素数４の単糖であり、具体的には、エリトロース、トレオース及びエリトルロース等が挙げられる。
ペントース（ｂ−３）は、炭素数５の単糖であり、具体的には、アラビノース、キシロース、リボース、キシルロース、リブロース及びデオキシリボース等が挙げられる。
ヘキソース（ｂ−４）は、炭素数６の単糖であり、具体的には、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ソルボース、タガトース、フコース、フクロース及びラムノース等が挙げられる。
ヘプトース（ｂ−５）は、炭素数７の単糖であり、具体的には、セドヘプツロース等が挙げられる。
【００４１】
置換基（Ｄ）で置換された単糖（ｂ−６）には、上記単糖（ｂ−１）〜（ｂ−５）の分子中の水素原子（−Ｈ）、ヒドロキシル基（−ＯＨ）及びヒドロキシメチル基（−ＣＨ2ＯＨ）のうち少なくとも１つが、カルボキシル基、アミノ基、Ｎ−アセチルアミノ基、スルホ基、メチルエステル基、Ｎ−グリコリル基、メチル基、１，２，３−トリヒドロキシプロピル基、リン酸基及び２−カルボキシ−２−ヒドロキシエチル基からなる群より選ばれる少なくとも１種の置換基で置換された下記（ｂ−６−１）〜（ｂ−６−１０）及び下記（ｂ−６−１１）が含まれる。
（ｂ−６−１）：カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）で置換された単糖
（ｂ−６−２）：アミノ基（−ＮＨ2）で置換された単糖
（ｂ−６−３）：Ｎ−アセチルアミノ基（−ＮＨＣＯＣＨ3）で置換された単糖
（ｂ−６−４）：スルホ基（−ＯＳＯ3Ｈ）で置換された単糖
（ｂ−６−５）：メチルエステル基（−ＣＯＯＣＨ3）で置換された単糖
（ｂ−６−６）：Ｎ−グリコリル基（−ＮＨＣＯＣＨ2ＯＨ）で置換された単糖
（ｂ−６−７）：メチル基で置換された単糖
（ｂ−６−８）：１，２，３−トリヒドロキシプロピル基（−ＣＨＯＨＣＨＯＨＣＨ2ＯＨ）で置換された単糖
（ｂ−６−９）：リン酸基（−ＯＰＯ3Ｈ2）で置換された単糖
（ｂ−６−１０）：２−カルボキシ−２−ヒドロキシエチル基（−ＣＨ2ＣＨＯＨＣＯＯＨ）で置換された単糖
（ｂ−６−１１）：（ｂ−１）〜（ｂ−５）の分子中の水素原子、ヒドロキシル基及びヒドロキシメチル基のうち少なくとも２つが２種以上の置換基（Ｄ）で置換された単糖
【００４２】
（ｂ−６−１）として、具体的には、グルクロン酸、イズロン酸、マンヌロン酸及びガラクツロン酸等のウロン酸等が挙げられる。
（ｂ−６−２）として、具体的には、グルコサミン、ガラクトサミン及びマンノサミン等のアミノ糖等が挙げられる。
（ｂ−６−３）として、具体的には、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルマンノサミン及びＮ−アセチルガラクトサミン等が挙げられる。
（ｂ−６−４）として、具体的には、ガラクトース−３−硫酸等が挙げられる。
（ｂ−６−５）として、具体的には、グルコースメチルエステル及び（ｂ−６−１）中のカルボン酸をメチルエステル化したもの等が挙げられる。
（ｂ−６−１１）として、具体的には、Ｎ−アセチルムラミン酸、ムラミン酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−４−硫酸、イズロン酸−２−硫酸、グルクロン酸−２−硫酸、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−硫酸、シアル酸、ノイラミン酸、Ｎ−グライコリルノイラミン酸及びＮ−アセチルノイラミン酸等が挙げられる。
【００４３】
（ｂ−６）が、置換基（Ｄ）としてアニオン基であるカルボキシル基、リン酸基、２−カルボキシ−２−ヒドロキシエチル基及びスルホ基からなる群より選ばれる少なくとも１種を有する場合、アニオン基のプロトンがアルカリ金属（Ｌｉ、Ｎａ及びＫ等）カチオン及び／又はアルカリ土類金属（Ｃａ等）カチオンで置換されていてもいい。
【００４４】
リボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ｂ）は、上記単糖（ｂ−１）〜（ｂ−６）の有する少なくとも１つのヒドロキシル基の水素原子が、上記化学式（１）〜（５）で置換された糖ヌクレオチド（Ｂ−１）〜（Ｂ−６）である。
（Ｂ−３）として、具体的には、ウリジン２リン酸−キシロース等が挙げられる。
（Ｂ−４）として、具体的には、シチジン２リン酸−グルコース、グアノシン２リン酸−マンノース、グアノシン２リン酸−フコース、アデノシン２リン酸−グルコース、ウリジン２リン酸−グルコース、ウリジン２リン酸−ガラクトース及びウリジン２リン酸−マンノース等が挙げられる。
（Ｂ−６）として、具体的には、ウリジン２リン酸−グルクロン酸、ウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン、ウリジン２リン酸−ウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルガラクトサミン及びウリジン２リン酸−イズロン酸等が挙げられる。
【００４５】
本発明の製造方法において、（Ｂ）は１種を使用してもよく、２種以上を使用してもいい。また、１種の（Ｂ）を使用して、１種の単糖が複数連なった変性多糖を製造してもよく、２種の（Ｂ）を使用して、２種の単糖がランダム又は交互に連なった変性多糖を製造してもよく、３種以上の（Ｂ）を使用して、３種以上の単糖がランダム又は規則的に連なった変性多糖を製造してもいい。また、２種以上の（Ａ）、２種以上の（Ｂ）及び２種以上の（Ｃ）を使用して、複数種類の変性多糖を製造してもいい。
【００４６】
多糖合成酵素（Ｃ）は、上記（Ｂ）から多糖を合成する活性を有する酵素である。本発明の製造方法においては、（Ａ）及び（Ｂ）を（Ｃ）の存在下で反応させることで、（Ｂ）が（Ａ）に糖を転移する反応を（Ｃ）が触媒し、（Ａ）に糖を結合させ、変性多糖を製造することができる。また、本発明の製造方法により得られる変性多糖は、化学修飾された多糖（Ａ）に化学修飾されていない糖が複数結合する（例えば、（Ａ）分子が直鎖であれば、２つの末端に化学修飾されていない多糖セグメントが結合し、化学修飾されていない多糖セグメント−化学修飾された多糖セグメント−化学修飾されていない多糖セグメントが結合した変性多糖となる）ため、分子の一部分が化学修飾された多糖となる。
多糖合成酵素（Ｃ）には、化学修飾された多糖（Ａ）の化学修飾される前の糖鎖がヒアルロン酸であるヒアルロン酸合成酵素（Ｃ−１）、コンドロイチンであるコンドロイチン合成酵素（Ｃ−２）、キサンタンであるキサンタン合成酵素（Ｃ−３）、セルロースであるセルロース合成酵素（Ｃ−４）、デンプンであるデンプン合成酵素（Ｃ−５）及びヘパリンであるヘパリン合成酵素（Ｃ−６）が含まれる。また、（Ｃ）には、（Ｃ−１）〜（Ｃ−６）以外にも、上記（Ｂ）から糖を転移させて多糖を合成する活性を有する酵素が含まれる。
【００４７】
ヒアルロン酸合成酵素（Ｃ−１）とは、リボヌクレオシド２リン酸−グルクロン酸及びリボヌクレオシド２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンを糖供与体として、グルクロン酸がβ１，３結合でＮ−アセチルグルコサミンに結合した二糖単位の、β１，４結合による繰り返し構造を有する糖を合成する酵素である。
（Ｃ−１）としては、従来のヒアルロン酸合成酵素を使用でき、ヒアルロン酸合成活性を有するものであれば特に限定されない。具体的には、非特許文献（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００７，Ｖｏｌ．２８２，Ｎｏ．５１，Ｐ３６７７７−３６７８１）に記載されているクラスＩ及びクラスＩＩのヒアルロン酸合成酵素等が挙げられる。クラスＩ及びクラスＩＩは、酵素のアミノ酸配列の相同性によって分類されたものである。クラスＩのヒアルロン酸合成酵素として、具体的には、ストレプトコッカスピロジェネシス由来、ストレプトコッカスエクイシミリス由来及び藻類ウイルス由来のヒアルロン酸合成酵素等が挙げられる。また、クラスＩＩのヒアルロン酸合成酵素として、具体的には、パスツレラ・ムルトシダ由来のヒアルロン酸合成酵素等が挙げられる。
【００４８】
本発明の製造方法において、（Ｃ）として（Ｃ−１）を用いてヒアルロン酸を製造する場合、単位酵素あたりの変性多糖の生産量の観点から、用いる（Ｂ）としては、リボヌクレオシド２リン酸−グルクロン酸及びリボヌクレオシド２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンが好ましく、さらに好ましくはウリジン２リン酸−グルクロン酸及びウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンである。
また、単位酵素あたりの変性多糖の生産量の観点から、用いる（Ａ）としては、ヒアルロン酸が化学修飾された多糖であることが好ましい。
【００４９】
コンドロイチン合成酵素（Ｃ−２）とは、リボヌクレオシド２リン酸−グルクロン酸及びリボヌクレオシド２リン酸−Ｎ−アセチルガラクトサミンを糖供与体として、グルクロン酸がβ１，３結合でＮ−アセチルガラクトサミンに結合した二糖単位の、β１，４結合による繰り返し構造を有する糖を合成する酵素である。
（Ｃ−２）としては、従来のコンドロイチン合成酵素を使用でき、コンドロイチン合成活性を有するものであれば特に限定されない。具体的には、ストレプトコッカスエクイシミリス由来のコンドロイチン合成酵素及びパスツレラムルトシダ由来のコンドロイチン合成酵素等が挙げられる。
【００５０】
本発明の製造方法において、（Ｃ）として（Ｃ−２）を用いてコンドロイチンを製造する場合、用いる（Ｂ）としては、単位酵素あたりの変性多糖の生産量の観点から、リボヌクレオシド２リン酸−グルクロン酸及びリボヌクレオシド２リン酸−Ｎ−アセチルガラクトサミンが好ましく、さらに好ましくはウリジン２リン酸−グルクロン酸及びウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルガラクトサミンである。
また、単位酵素あたりの変性多糖の生産量の観点から、用いる（Ａ）としては、コンドロイチンが化学修飾された多糖であることが好ましい。
【００５１】
キサンタン合成酵素（Ｃ−３）とは、リボヌクレオシド２リン酸−グルコース、リボヌクレオシド２リン酸−マンノース及びリボヌクレオシド２リン酸−グルクロン酸を糖供与体としてキサンタンを合成する酵素である。
（Ｃ−３）としては、従来のキサンタン合成酵素を使用でき、キサンタン合成活性を有するものであれば特に限定されない。具体的には、キサンタン・カムペストリスから得られるキサンタン合成酵素等が挙げられる。
【００５２】
本発明の製造方法において、（Ｃ）として（Ｃ−３）を用いてキサンタンを製造する場合、単位酵素あたりの変性多糖の生産量の観点から、用いる（Ｂ）としては、リボヌクレオシド２リン酸−グルコース、リボヌクレオシド２リン酸−マンノース及びリボヌクレオシド２リン酸−グルクロン酸が好ましく、さらに好ましくはウリジン２リン酸−グルコース、グアノシン２リン酸−マンノース及びウリジン２リン酸−グルクロン酸である。
また、単位酵素あたりの変性多糖の生産量の観点から、用いる（Ａ）としては、キサンタンが化学修飾された多糖であることが好ましい。
【００５３】
セルロース合成酵素（Ｃ−４）とは、リボヌクレオシド２リン酸グルコースを糖供与体としてβ１，４−結合を形成する酵素である。
（Ｃ−４）としては、従来のセルロース合成酵素を使用でき、セルロース合成活性を有するものであれば特に限定されない。具体的には、酢酸菌由来のセルロース合成酵素等が挙げられる。
【００５４】
本発明の製造方法において、（Ｃ）として（Ｃ−４）を用いてセルロースを製造する場合、単位酵素あたりの変性多糖の生産量の観点から、用いる（Ｂ）としては、リボヌクレオシド２リン酸−β−グルコースが好ましく、さらに好ましくはウリジン２リン酸−β−グルコースである。
また、単位酵素あたりの変性多糖の生産量の観点から、用いる（Ａ）としては、セルロースが化学修飾された多糖であることが好ましい。
【００５５】
デンプン合成酵素（Ｃ−５）は、リボヌクレオシド２リン酸−α−グルコースを糖供与体としてα１，６−結合を形成する酵素である。
（Ｃ−５）としては、従来のデンプン合成酵素を使用でき、デンプン合成活性を有するものであれば特に限定されない。具体的には、トウモロコシ由来のデンプン合成酵素等が挙げられる。
【００５６】
本発明の製造方法において、（Ｃ）として（Ｃ−５）を用いてデンプンを製造する場合は、単位酵素あたりの変性多糖の生産量の観点から、用いる（Ｂ）としては、リボヌクレオシド２リン酸−α−グルコースが好ましく、さらに好ましくはウリジン２リン酸−α−グルコースである。
また、単位酵素あたりの変性多糖の生産量の観点から、用いる（Ａ）としては、デンプンが化学修飾された多糖であることが好ましい。
【００５７】
ヘパリン合成酵素（Ｃ−６）とは、リボヌクレオシド２リン酸−グルクロン酸（β−Ｄ−）又はリボヌクレオシド２リン酸イズロン酸（α−Ｌ−）とリボヌクレオシド２リン酸−グルコサミン（Ｄ−グルコサミン）を糖供与体として１，４−結合を形成する酵素である。
（Ｃ−６）としては、従来のヘパリン合成酵素を使用でき、ヘパリン合成活性を有するものであれば特に限定されない。具体的には、ヒト由来のヘパリン合成酵素等が挙げられる。
【００５８】
本発明の製造方法において、（Ｃ）として（Ｃ−６）を用いてヘパリンを製造する場合、単位酵素あたりの変性多糖の生産量の観点から、用いる（Ｂ）としては、リボヌクレオシド２リン酸−グルクロン酸又はリボヌクレオシド２リン酸−イズロン酸とリボヌクレオシド２リン酸−グルコサミンとであることが好ましく、さらに好ましくはウリジン２リン酸−グルクロン酸又はウリジン２リン酸−イズロン酸とウリジン２リン酸−グルコサミンとであることである。
また、単位酵素あたりの変性多糖の生産量の観点から、用いる（Ａ）としては、ヘパリンが化学修飾された多糖であることが好ましい。
【００５９】
上記（Ａ）及び糖ヌクレオチド（Ｂ）及び上記多糖合成酵素（Ｃ）は、製造する変性多糖に応じて適宜選択する。
【００６０】
本発明の製造方法において、反応溶液中のリボヌクレオシド２リン酸の濃度は、多糖合成酵素（Ｃ）の下記阻害濃度ＩＣ50の１００倍未満である。
阻害濃度ＩＣ50：リボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ｂ）を多糖合成酵素（Ｃ）の存在下で反応させる際の（Ｃ）の濃度において、基質としてリボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ｂ）を用いて、阻害剤としてリボヌクレオシド２リン酸を用いて求めた、（Ｃ）の酵素活性が半減するときのリボヌクレオシド２リン酸の濃度。
阻害濃度ＩＣ50は、（Ｂ）を（Ｃ）の存在下で反応させる工程の開始時から終了時までのいずれかの時点での、（Ｃ）を反応させる際と同じ（Ｃ）の濃度、温度及びｐＨの条件下で、下記測定を行うことにより求められる。
＜阻害濃度ＩＣ50の測定方法＞
一定量の多糖合成酵素（Ｃ）、リボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ｂ）、リボヌクレオシド２リン酸、ｐＨ調整剤（Ｋ）及び水を含む一定の温度及びｐＨに調製した酵素反応溶液（Ｉ）を作成する。
酵素反応溶液（Ｉ）の温度は、製造工程中で（Ｃ）を（Ｂ）に作用させる工程の開始時から終了時までのいずれかの時点での温度と同じの温度に調整する。
酵素反応溶液（Ｉ）のｐＨは、製造工程中で（Ｃ）を（Ｂ）に作用させる工程の開始時から終了時までのいずれかの時点でのｐＨと同じのｐＨに調整する。
酵素反応溶液（Ｉ）中の（Ｃ）のモル濃度は、（Ｃ）を（Ｂ）に作用させる工程の開始時から終了時までのいずれかの時点での濃度と同じ濃度に調整する。
酵素反応溶液（Ｉ）中のリボヌクレオシド２リン酸の含有量（モル濃度）は、リボヌクレオシド２リン酸が０Ｍの酵素反応溶液（Ｉ）、及びリボヌクレオシド２リン酸の濃度が０Ｍから多糖合成酵素（Ｃ）の活性が０になる（多糖の生成が観測できなくなる）リボヌクレオシド２リン酸の濃度との間で、リボヌクレオシド２リン酸の濃度が異なる４種類以上の酵素反応溶液（Ｉ）、合計５種類以上の酵素反応溶液（Ｉ）を作成する。また、類似の多糖合成酵素に対するリボヌクレオシド２リン酸の阻害定数Ｋｉが分かっている場合は、リボヌクレオシド２リン酸の濃度が０Ｍのもの、類似の多糖合成酵素のＫｉ未満で０Ｍより大きい濃度範囲で２種類以上、Ｋｉ以上及びＫｉの１０倍以下の濃度範囲で２種類以上、合計５種類以上作成すればいい。
酵素反応溶液（Ｉ）中のリボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ｂ）の含有量は、経時的なピーク面積変化を観測できる濃度を１点選べばよい。測定に使用する（Ｃ）と類似の多糖合成酵素のミカエリス定数Ｋｍが分かっている場合は、Ｋｍ以上及びＫｍの５倍以下の濃度範囲の間で選べばよい。
酵素反応溶液（Ｉ）に用いるｐＨ調整剤（Ｋ）は、扱いやすさ及び酵素の安定性の観点から、リン酸塩、ホウ酸塩、ＨＥＰＥＳバッファー及びＭＥＳバッファー等のＧｏｏｄバッファーが好ましい。酵素反応溶液（Ｉ）中の（Ｋ）の含有量（モル濃度）は、１００〜５００ｍＭである。
作成した酵素反応溶液（Ｉ）について、（Ｉ）を作成直後及び一定時間（例えば５分）ごとに溶液の一部（例えば１００μＬ）を取り出し、取り出したものを１００℃で1分間熱処理し、酵素反応を停止する。液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと略記する）を用いて、取り出した反応溶液中の変性多糖の量を定量する。酵素反応溶液（Ｉ）を作成直後のピーク面積をＰ0、ｈ時間後のピーク面積をＰhとし、ピーク面積の変化ΔＰ（＝Ｐh−Ｐ0）と変性多糖のピーク面積に対する検量線を用いて酵素反応初速度ｖ（Ｍ／ｓ）を算出する。
さらに、リボヌクレオシド２リン酸の濃度が異なる酵素反応溶液（Ｉ）を用いて同様に測定し、酵素反応初速度ｖを算出する。
阻害濃度ＩＣ50は、横軸に（ｘ軸）に酵素反応溶液（Ｉ）中のそれぞれのリボヌクレオシド２リン酸の濃度、縦軸（ｙ軸）にリボヌクレオシド２リン酸の濃度が０の時の酵素反応初速度ｖを１００（％）としたときの相対活性をプロットする。プロットを直線でつなぎ、ｙ＝５０（％）となるときのリボヌクレオシド２リン酸の濃度を阻害剤濃度ＩＣ50とする。
【００６１】
本発明において、反応溶液中のリボヌクレオシド２リン酸の濃度は、変性多糖を効率よく製造する観点から、阻害濃度ＩＣ50の１００倍未満が好ましく、さらに好ましくは１０倍以下である。
また、複数種類の（Ｃ）を用いる場合は、全ての（Ｃ）の阻害濃度ＩＣ50を測定し、少なくとも１つの（Ｃ）の阻害濃度ＩＣ50について上記範囲であることが好ましい。
また、（Ａ）と（Ｂ）とを（Ｃ）の存在下で反応させる工程において、リボヌクレオシド２リン酸の濃度が上記範囲である時間は、（Ａ）と（Ｂ）とを（Ｃ）の存在下で反応させる時間中の１０〜１００％の時間であるが、反応効率の観点から、３０〜１００％の時間であることが好ましく、さらに好ましくは５０〜１００％の時間であり、特に好ましくは８０〜１００％の時間であり、最も好ましくは９０〜１００％の時間である。
（Ａ）と（Ｂ）とを（Ｃ）の存在下で反応させる際、リボヌクレオシド２リン酸が副生成物として生成する。（Ｃ）の活性は、リボヌクレオシド２リン酸により阻害されやすいため、（Ａ）と（Ｂ）とを（Ｃ）の存在下で反応させる工程において、リボヌクレオシド２リン酸の濃度は上記範囲であることが好ましい。
【００６２】
本発明の製造方法において、リボヌクレオシド２リン酸の濃度を上記範囲にする方法としては、下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の方法等が挙げられる。
（ｉ）リボヌクレオシド２リン酸変換酵素（Ｇ）を用いてリボヌクレオシド２リン酸を後述する化合物（Ｈ）に変換する方法
（ｉｉ）シリカゲル担体等を用いて反応溶液中のリボヌクレオシド２リン酸を吸着させる方法
（ｉｉｉ）化学反応によりリボヌクレオシド２リン酸を他の化合物に変換する方法
【００６３】
（ｉｉ）の方法においては、シリカゲル担体以外にも、活性炭及びゼオライトなど、リボヌクレオシド２リン酸を吸着できるものであれば制限なく利用できる。
（ｉｉｉ）の方法においては、リボヌクレオシド２リン酸を他の化合物に変換することができる化学反応であれば、一般的に知られている化学反応を制限無く用いることができる。
【００６４】
本発明において、リボヌクレオシド２リン酸の濃度を上記範囲にする方法としては、反応の基質特異性が高く、基質（リボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ｂ））が分解されるなどの問題が少ないという観点から、（ｉ）の方法が好ましい。
【００６５】
（ｉ）のリボヌクレオシド２リン酸変換酵素（Ｇ）を用いてリボヌクレオシド２リン酸を化合物（Ｈ）に変換する方法とは、具体的には下記方法が含まれる。
リボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ｂ）に多糖合成酵素（Ｃ）を作用させて変性多糖を製造する方法において、リボヌクレオシド２リン酸を下記化合物（Ｈ）に変換する活性を有するリボヌクレオシド２リン酸変換酵素（Ｇ）の存在下で（Ｃ）を作用させる変性多糖の製造方法。
化合物（Ｈ）：プリン塩基又はピリミジン塩基（Ｈ−1）、リボヌクレオシド（Ｈ−２）、リボヌクレオシド１リン酸（Ｈ−３）、リボヌクレオシド３リン酸（Ｈ−４）、ポリリボヌクレオチド（Ｈ−５）、デオキシリボヌクレオシド２リン酸（Ｈ−６）及びリボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ｈ−７）からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物。
【００６６】
（Ｈ−１）には、プリン塩基（アデニン及びグアニン等）並びにピリミジン塩基（チミン、シトシン及びウラシル等）等が含まれる。
（Ｈ−２）は、（Ｈ−１）の塩基と単糖が結合した化合物であり、具体的には、ウリジン、アデノシン、リボチミジン、シチジン及びグアノシン等が挙げられる。
（Ｈ−３）は、（Ｈ−２）のモノリン酸エステル化物であり、具体的には、ウリジル酸（ウリジン５’−リン酸）、アデノシン１リン酸（アデノシン５’−リン酸）、リボチミジル酸（リボチミジン５’−リン酸）、シチジン１リン酸（シチジン５’−リン酸）及びグアノシン１リン酸（グアノシン５’−リン酸）等が挙げられる。
（Ｈ−４）は、（Ｈ−２）のトリリン酸エステル化物であり、具体的には、ウリジン３リン酸（ウリジン５’−三リン酸）、アデノシン３リン酸（アデノシン５’−三リン酸）、リボチミジン−３リン酸（リボチミジン５’−三リン酸）、シチジン３リン酸（シチジン５’−三リン酸）及びグアノシン３リン酸（グアノシン５’−三リン酸）等が挙げられる。
（Ｈ−５）は、（Ｈ−３）がホスホジエステル結合で重合したポリマーであり、具体的には、ポリウリジル酸、ポリアデニル酸、ポリチミジル酸、ポリシチジル酸及びポリグアニル酸等が挙げられる。
（Ｈ−６）は、リボヌクレオシド２リン酸分子中のリボースが２−デオキシリボースとなったものであり、具体的には、デオキシウリジン２リン酸、デオキシアデノシン２リン酸、デオキシグアノシン２リン酸、デオキシシチジン２リン酸及びチミジン２リン酸等が挙げられる。
（Ｈ−７）には、上記リボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ｂ）が含まれる。
【００６７】
リボヌクレオシド２リン酸変換酵素（Ｇ）には、下記（Ｇ１）〜（Ｇ７）が含まれる。
（Ｇ１）リボヌクレオシド２リン酸をプリン塩基又はピリミジン塩基に変換する活性を有する酵素
（Ｇ２）リボヌクレオシド２リン酸をリボヌクレオシドに変換する活性を有する酵素
（Ｇ３）リボヌクレオシド２リン酸をリボヌクレオシド１リン酸に変換する活性を有する酵素
（Ｇ４）リボヌクレオシド２リン酸をリボヌクレオシド３リン酸に変換する活性を有する酵素
（Ｇ５）リボヌクレオシド２リン酸をポリリボヌクレオチドに変換する活性を有する酵素
（Ｇ６）リボヌクレオシド２リン酸をデオキシリボヌクレオシド２リン酸に変換する活性を有する酵素
（Ｇ７）リボヌクレオシド２リン酸をリボヌクレオシド２リン酸−単糖に変換する活性を有する酵素
【００６８】
（Ｇ２）は、リボヌクレオチド中の糖とリン酸との間のリン酸エステル結合を加水分解して、ヌクレオシドとリン酸にする反応を触媒する酵素である。（Ｇ２）として、具体的には、アピラーゼ及びアピラーゼ等が挙げられる。
【００６９】
（Ｇ３）は、リボヌクレオシド２リン酸等のリン酸ジエステルを加水分解してリン酸モノエステルとする反応を触媒する酵素である。（Ｇ３）として、具体的には、アデノシン２リン酸（ＡＤＰ）特異的ホスホフルクトキナーゼ及びヌクレオチダーゼ等が挙げられる。
【００７０】
（Ｇ４）は、リン酸基を有する化合物から、リボヌクレオシド２リン酸にリン酸基を転移させてリボヌクレオシド３リン酸とする反応を触媒する酵素である。
（Ｇ４）として、具体的には、ヌクレオシド２リン酸キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、アルギニンキナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、カルバミン酸キナーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ及びホスホクレアチンキナーゼ等が含まれる。
また、（Ｇ４）には、ウリジン３リン酸合成酵素（Ｇ４−１）が含まれる。（Ｇ４−１）は、作用するリボヌクレオシド２リン酸がウリジン２リン酸であり、ウリジン３リン酸を合成する反応を触媒する酵素である。
【００７１】
ヌクレオシド２リン酸キナーゼは、ヌクレオシド３リン酸からヌクレオシド２リン酸にリン酸基を転移する酵素である。ヌクレオシド２リン酸キナーゼとして、具体的には、生物由来のもの｛動物由来のもの（例えば、ヒト由来、ウシ由来及びラット由来のもの等）、植物由来のもの（例えば、シロイヌナズナ由来及びコメ由来のもの等）及び微生物由来のもの（例えば、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属由来、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属由来、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属由来及びサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属由来のもの等）等｝、生物由来のものを化学修飾したもの（例えば、カルボジイミド化合物、無水コハク酸、ヨード酢酸及びイミダゾール化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種を作用させて化学修飾したもの等）及び生物由来のものを遺伝子的に修飾したもの｛例えば、Ｓｍｉｔｈらの方法（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９８，Ｖｏｌ．２５３，Ｎｏ．１８，Ｐ６５５１−６５６０）を用いて遺伝子を改変して得たもの等｝等が挙げられる。
【００７２】
ポリリン酸キナーゼは、リボヌクレオシド２リン酸とポリリン酸とから、リボヌクレオシド３リン酸と、重合度の１つ少ないポリリン酸とを生成する活性を有する酵素である。ポリリン酸キナーゼとして、具体的には、生物由来のもの｛植物由来のもの（例えば、タバコ由来のもの等）及び微生物由来のもの（エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属由来、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属由来、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属由来及びサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属由来のもの等）等｝、生物由来のものを化学修飾したもの（例えば、カルボジイミド化合物、無水コハク酸、ヨード酢酸及びイミダゾール化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種を作用させて化学修飾したもの等）並びに生物由来のものを遺伝子的に修飾したもの｛例えば、Ｓｍｉｔｈらの方法（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９８，Ｖｏｌ．２５３，Ｎｏ．１８，Ｐ６５５１−６５６０）を用いて遺伝子を改変して得たもの等｝等が挙げられる。
【００７３】
アルギニンキナーゼは、リボヌクレオシド２リン酸とω−ホスホノ−Ｌ−アルギニンからリボヌクレオシド３リン酸とＬ−アルギニンを生成する活性を有する酵素である。アルギニンキナーゼとして、具体的には、生物由来のもの｛動物由来のもの（例えば、ショウジョウバエ由来、エビ由来及びノミ由来のもの等）、植物由来のもの（例えば、ケヤリ由来のもの等）及び微生物由来のもの（例えば、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属由来のもの等）等｝、生物由来のものを化学修飾したもの（例えば、カルボジイミド化合物、無水コハク酸、ヨード酢酸及びイミダゾール化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種を作用させて化学修飾したもの等）並びに生物由来のものを遺伝子的に修飾したもの｛例えば、Ｓｍｉｔｈらの方法（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９８，Ｖｏｌ．２５３，Ｎｏ．１８，Ｐ６５５１−６５６０）を用いて遺伝子を改変して得たもの等｝等が挙げられる。
【００７４】
ピルビン酸キナーゼは、リボヌクレオシド２リン酸とホスホエノールピルビン酸からリボヌクレオシド３リン酸とピルビン酸を生成する活性を有する酵素である。ピルビン酸キナーゼとして、具体的には、生物由来のもの｛動物由来のもの（例えば、ヒト由来、ウシ由来及びラット由来のもの等）、植物由来のもの（例えば、シロイヌナズナ由来及びトウゴマ由来のもの等）及び微生物由来のもの（例えば、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属由来及びサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属由来のもの等）等｝、生物由来のものを化学修飾したもの（例えば、カルボジイミド化合物、無水コハク酸、ヨード酢酸及びイミダゾール化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種を作用させて化学修飾したもの等）並びに生物由来のものを遺伝子的に修飾したもの｛例えば、Ｓｍｉｔｈらの方法（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９８，Ｖｏｌ．２５３，Ｎｏ．１８，Ｐ６５５１−６５６０）を用いて遺伝子を改変して得たもの等｝等が挙げられる。
【００７５】
カルバミン酸キナーゼは、カルバモイルリン酸とリボヌクレオシド２リン酸からリボヌクレオシド３リン酸、二酸化炭素、及びアンモニアを生成する活性を有する酵素である。カルバミン酸キナーゼとして、具体的には、生物由来のもの｛動物由来のもの（例えば、ラット由来のもの等）及び微生物由来のもの（例えば、ピロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属由来、及びラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属由来のもの等）等｝、生物由来のものを化学修飾したもの（例えば、カルボジイミド化合物、無水コハク酸、ヨード酢酸及びイミダゾール化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種を作用させて化学修飾したもの等）並びに生物由来のものを遺伝子的に修飾したもの｛例えば、Ｓｍｉｔｈらの方法（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９８，Ｖｏｌ．２５３，Ｎｏ．１８，Ｐ６５５１−６５６０）を用いて遺伝子を改変して得たもの等｝等が挙げられる。
【００７６】
ホスホグリセリン酸キナーゼは、３−ホスホグリセロールリン酸とリボヌクレオシド２リン酸からリボヌクレオシド３リン酸及び３−ホスホグリセリン酸を生成する活性を有する酵素である。ホスホグリセリン酸キナーゼとして、具体的には、生物由来のもの｛動物由来のもの（例えば、ラット由来のもの等）及び微生物由来のもの（例えば、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属由来のもの等）等｝、生物由来のものを化学修飾したもの（例えば、カルボジイミド化合物、無水コハク酸、ヨード酢酸及びイミダゾール化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種を作用させて化学修飾したもの等）並びに生物由来のものを遺伝子的に修飾したもの｛例えば、Ｓｍｉｔｈらの方法（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９８，Ｖｏｌ．２５３，Ｎｏ．１８，Ｐ６５５１−６５６０）を用いて遺伝子を改変して得たもの等｝等が挙げられる。
【００７７】
ホスホクレアチンキナーゼは、ホスホクレアチンとリボヌクレオシド２リン酸からリボヌクレオシド３リン酸及びクレアチンを生成する活性を有する酵素である。ホスホクレアチンキナーゼとして、具体的には、生物由来のもの｛動物由来のもの（例えば、ラット由来のもの等）等｝、生物由来のものを化学修飾したもの（例えば、カルボジイミド化合物、無水コハク酸、ヨード酢酸及びイミダゾール化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種を作用させて化学修飾したもの等）並びに生物由来のものを遺伝子的に修飾したもの｛例えば、Ｓｍｉｔｈらの方法（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９８，Ｖｏｌ．２５３，Ｎｏ．１８，Ｐ６５５１−６５６０）を用いて遺伝子を改変して得たもの等｝等が挙げられる。
【００７８】
（Ｇ４）は、１種を使用してもよく、２種以上を使用してもいい。
（Ｇ４）のうち、リボヌクレオシド３リン酸合成活性の高さの観点から、アルギニンキナーゼ、ヌクレオシド２リン酸キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ及びカルバミン酸キナーゼが好ましい。
【００７９】
（Ｇ４）を作用させる際、必要により、リボヌクレオシド２リン酸にリン酸基を与えるリン酸基含有化合物（Ｆ）を用いてもいい。（Ｆ）はリン酸基を有する化合物である。（Ｆ）としては、（Ｇ４）の基質特異性の観点から、リボヌクレオシド２リン酸にリン酸基を供与し得る化合物が好ましい。（Ｆ）としては、例えば、トリアミノホスフィンオキシド、リン酸化したアミノ酸（例えばω−ホスホノ−Ｌ−アルギニン等）、ポリリン酸、ホスホエノールピルビン酸及びその塩（例えば、リチウム塩、ナトリウム塩及びカリウム塩等）、カルバモイルリン酸、３−ホスホグリセロールリン酸、ホスホクレアチン並びにヌクレオシド３リン酸（例えばグアノシン３リン酸及びアデノシン３リン酸等）等が挙げられる。
リン酸基含有化合物（Ｆ）を用いる場合、（Ｇ４）と（Ｆ）との組み合わせとしては、ヌクレオシド２リン酸キナーゼとヌクレオシド３リン酸との組み合わせ、ポリリン酸キナーゼとポリリン酸との組み合わせ、アルギニンキナーゼとω−ホスホノ−Ｌ−アルギニンとの組み合わせ、ピルビン酸キナーゼとホスホエノールピルビン酸及びその塩との組み合わせ、カルバミン酸キナーゼとカルバモイルリン酸との組み合わせ、ホスホグリセリン酸キナーゼと３−ホスホグリセロールリン酸との組み合わせ、ホスホグリセリン酸キナーゼと３−ホスホグリセロールリン酸との組み合わせ並びにホスホクレアチンキナーゼとホスホクレアチンとの組み合わせが好ましい。
【００８０】
（Ｇ５）は、リボヌクレオシド２リン酸等のリボヌクレオシド２リン酸をリボヌクレオシド１リン酸の共重合物（ポリリボヌクレオチド等）及び無機リン酸とする反応を触媒する酵素である。（Ｇ５）として、具体的には、ポリリボヌクレオチドヌクレオチジルトランスフェラーゼ等が挙げられる。
【００８１】
（Ｇ６）は、リボヌクレオシド２リン酸等のリボヌクレオチドを還元してデオキシリボヌクレオチド（デオキシウリジン２リン酸等）とする反応を触媒する酵素である。（Ｇ６）として、具体的には、リボヌクレオシドジホスホリダクターゼ等が挙げられる。
【００８２】
リボヌクレオシド２リン酸変換酵素（Ｇ）として（Ｇ６）を用いる場合、還元剤（ｇ６）を用いる必要がある。（ｇ６）としては、電子伝達タンパク質を用いることができ、例えば、還元型チオレドキシン等が挙げられる。
【００８３】
（Ｇ７）は、リボヌクレオシド２リン酸等のリボヌクレオシド２リン酸と糖又は糖リン酸とから糖核酸（リボヌクレオシド２リン酸−単糖）を合成する反応を触媒する酵素である。（Ｇ７）として、具体的には、スクロースシンターゼ及びＮ−アシルニューラミネートシチジリルトランスフェラーゼ等が挙げられる。
【００８４】
リボヌクレオシド２リン酸変換酵素（Ｇ）として（Ｇ７）を用いる場合、糖核酸の原料（ｇ７）として、糖（ｇ７−１）又は糖リン酸（ｇ７−２）を用いる必要がある。
（ｇ７−１）には、単糖、二糖及びオリゴ糖等が含まれ、具体的には、スクロース等が挙げられる。
（ｇ７−２）は、単糖の有するヒドロキシル基のうち１つに１つのリン酸が結合した化合物であり、例えば、グルクロン酸１リン酸（１−ホスホ−α−Ｄ−グルクロン酸等）、Ｎ−アセチルグルコサミン１リン酸（Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン−１−ホスファート等）等が挙げられる。
（Ｇ７）により合成されるリボヌクレオシド２リン酸−単糖は、本発明の製造方法の原料である（Ｂ）と同じでもよく、（Ｂ）と異なってもいい。糖（ｇ７−１）又は糖リン酸（ｇ７−２）として、本発明の製造方法の原料であるリボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ｂ）と同じ単糖（ｂ）のヒドロキシル基に、１つのリン酸が結合した化合物である場合は、（Ｂ）が合成される。
【００８５】
上記リボヌクレオシド２リン酸変換酵素（Ｇ）のうち、変性多糖を効率よく製造する観点及び工業化しやすいという観点から、（Ｇ２）、（Ｇ３）、（Ｇ４）、（Ｇ５）及び（Ｇ７）が好ましく、さらに好ましくは（Ｇ４）及び（Ｇ７）である。
（Ｇ）は、１種を使用してもよく、２種以上を併用してもいい。
【００８６】
本発明の変性多糖の製造方法は、化学修飾された多糖（Ａ）を用いる以外は、従来のリボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ｂ）に多糖合成酵素（Ｃ）を作用させる多糖の製造方法と同様でいい。例えば、下記工程（１）〜（３）により製造する方法が含まれる。
（１）所定量の化学修飾された多糖（Ａ）、リボヌクレオシド２リン鎖−単糖（Ｂ）、緩衝液（Ｉ）及び多糖合成酵素（Ｃ）を混合して反応溶液（Ｌ）とし、所定の温度、所定のｐＨに調整する。必要により、リボヌクレオシド２リン酸変換酵素（Ｇ）を加えてもいい。また、本工程では、必要により攪拌してもいい。
上記工程においては、化学修飾された多糖（Ａ）、リボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ｂ）及び緩衝液（Ｉ）を混合し、温度及びｐＨを調整した後、多糖合成酵素（Ｃ）を添加してもいい。さらに、（Ｃ）は、そのまま添加してもよく、緩衝液（Ｉ）で希釈してから添加してもいい。
また、反応溶液（Ｌ）中にはリボヌクレオシド２リン酸変換酵素（Ｇ）を含んでもいい。使用する（Ｇ）が（Ｇ−４）である場合は、（ｇ−４）を含んでもいい。使用する（Ｇ）が（Ｇ−６）である場合は、（ｇ−６）を含む。使用する（Ｇ）が（Ｇ−７）である場合は、（ｇ−７）を含む。
さらに、反応溶液（Ｌ）中には、脂質（Ｍ）、糖類（Ｎ）及びオリゴ糖（Ｏ）を含んでもいい。
（２）反応溶液（Ｌ）の温度を調整しながら、所定の時間、化学修飾された多糖（Ａ）及びリボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ｂ）を多糖合成酵素（Ｃ）の存在下で反応させる。本工程では、必要により攪拌してもいい。
（３）生成した変性多糖を精製する。変性多糖の精製方法としては、適量のアルコール（炭素数１〜１０のアルコール）などの溶剤を加えて沈殿させる方法や膜（具体的には、セラミック膜等）を用いて溶液交換をする方法等が挙げられる。
【００８７】
反応溶液（Ｌ）中の化学修飾された多糖（Ａ）の含有量（重量％）は、変性多糖を効率よく製造する観点及び多糖合成酵素（Ｃ）を効率よく作用させる観点から、０．０００００１〜１重量％が好ましい。
反応溶液（Ｌ）中のリボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ｂ）の含有量（モル濃度）は、変性多糖を効率よく製造する観点及び多糖合成酵素（Ｃ）を効率よく作用させる観点から、０．１ｍＭ〜２Ｍが好ましい。
反応溶液（Ｌ）中の多糖合成酵素（Ｃ）の含有量（ユニット／Ｌ）は、変性多糖を効率よく製造する観点及び多糖合成酵素（Ｃ）を効率よく作用させる観点から、０．１〜１０，０００，０００ユニット／Ｌが好ましい。
１ユニットとは、１分間に１μｍｏｌのリボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ｂ）からヒアルロン酸を合成する活性を１ユニットと定義する。
【００８８】
緩衝液（Ｉ）としては、緩衝作用を有するバッファー等を含有した水が含まれる。緩衝作用を有するバッファー等としては、従来のｐＨ調整剤が使用でき、ホウ酸バッファー、リン酸バッファー、酢酸バッファー、Ｔｒｉｓバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、硫酸、塩酸、クエン酸、乳酸、ピルビン酸、蟻酸、塩化ナトリウム、塩化カリウム、モノエタノールアミン及びジエタノールアミン等が挙げられる。
【００８９】
反応溶液（Ｌ）の温度は、（Ｃ）及び（Ｇ）の安定性並びに反応速度の観点から０〜１００℃が好ましい。
【００９０】
反応溶液（Ｌ）のｐＨは、反応の至適条件の観点から、ｐＨ３〜１２が好ましい。
【００９１】
上記工程（１）及び（２）において、上記化学修飾された多糖（Ａ）、リボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ｂ）及び多糖合成酵素（Ｃ）以外に、変性多糖を効率よく製造する観点から、リボヌクレオシド２リン酸変換酵素（Ｇ）を用いてもいい。また、（Ｇ）として（Ｇ−４）を用いる場合は（ｇ−４）を用いてもよく、（Ｇ）として（Ｇ−６）を用いる場合は（ｇ−６）を用いる必要があり、（Ｇ）として（Ｇ−７）を用いる場合は（ｇ−７）を用いる必要がある。
リボヌクレオシド２リン酸変換酵素（Ｇ）を用いる場合、反応溶液（Ｌ）中の（Ｇ）の含有量（ユニット／Ｌ）は、変性多糖を効率よく製造する観点及び多糖合成酵素（Ｃ）を効率よく作用させる観点から、０．１〜１，０００，０００ユニット／Ｌが好ましい。
１ユニットとは、１分間に１μｍｏｌのリボヌクレオシド２リン酸を化合物（Ｈ）に変換する活性を１ユニットと定義する。
【００９２】
反応溶液（Ｌ）中の（ｇ−４）、（ｇ−６）又は（ｇ−７）の含有量（モル濃度）は、変性多糖を効率よく製造する観点及び多糖合成酵素（Ｃ）を効率よく作用させる観点から、０．０１ｎＭ〜１０Ｍが好ましい。
【００９３】
また、上記以外に、酵素の安定化及び酵素の活性化の観点から、脂質（Ｍ）、糖類（Ｎ）及びオリゴ糖（Ｏ）を用いてもよい。
脂質（Ｍ）としては、例えば、カルディオピン及びオレイン酸等が挙げられる。
糖類（Ｎ）としては、例えば、グリセリン等が挙げられる。
オリゴ糖（Ｏ）としては、例えば、オリゴヒアルロン酸等が挙げられる。
【００９４】
反応溶液（Ｌ）中の脂質（Ｍ）の含有量（重量％）は、酵素の安定化及び酵素の活性化の観点から、０〜１重量％が好ましい。
反応溶液（Ｌ）中の糖類（Ｎ）の含有量（重量％）は、酵素の安定化及び酵素の活性化の観点から、０〜３０重量％が好ましい。
反応溶液（Ｌ）中のオリゴ糖（Ｏ）の含有量（重量％）は、酵素の安定化及び酵素の活性化の観点から、０〜１重量％が好ましい。
【００９５】
工程（２）において、多糖合成酵素（Ｃ）を作用させる時間は、多糖合成酵素（Ｃ）の活性、反応溶液（Ｌ）の温度、多糖合成酵素（Ｃ）、リボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ｂ）の量比等によって異なる。反応溶液（Ｌ）の温度を、多糖合成酵素（Ｃ）の活性が高く、反応速度が速い温度に調整すれば、反応時間を短くすることができる。また、反応溶液（Ｌ）中のリボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ｂ）に対する多糖合成酵素（Ｃ）の量が多いほど、反応は早くなり、反応時間は短くなる。
【００９６】
本発明の製造方法によれば、化学修飾された多糖（Ａ）を多糖合成酵素（Ｃ）が基質として利用できれば、変性多糖を製造することができる。また、（Ａ）の基質としての利用性は、化学修飾された多糖（Ａ）の置換率が適度であり、化学修飾された多糖（Ａ）分子の末端の単糖が化学修飾されていない多糖分子を多く含んでいる方が高く、変性多糖を大量に得ることができる。
【００９７】
本発明の変性多糖の製造方法によれば、一部を化学修飾した新規な変性多糖を得ることができる。また、多糖がヒアルロン酸である場合、本発明の製造方法により得られた変性ヒアルロン酸は、ヒアルロン酸の優れた性質を保持しつつ、化学修飾されたヒアルロン酸の置換率、化学修飾する化合物（Ｅ）の種類等を変化させることにより、ヒアルロン酸の物性を調整することができる。ヒアルロン酸以外の多糖においても、多糖の有する優れた性質を保持しつつ、化学修飾された多糖（Ａ）の置換率等を変化させることにより、物性を調整することができる。
したがって、本発明の製造方法により得られる変性多糖は、化粧品、医薬部外品、関節炎治療剤、創傷被覆剤、眼科手術用手術補助剤及び外科手術後の癒着阻止剤などの医薬品、医療機器として広範囲に使用できる。
【実施例】
【００９８】
以下、実施例及び比較例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。以下、特に定めない限り、％は重量％、部は重量部を示す。
【００９９】
＜製造例１＞
パスツレラ・ムルトシダ由来の配列番号１のヒアルロン酸合成酵素にＦＬＡＧタグを融合したアミノ酸配列をコードする遺伝子をｐＫＫ２２３−３に組み込んだプラスミドを大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉＳＵＲＥに形質転換して、培養し、発現誘導した後、遠心分離機（６０００×ｇ、１５分間）を用いて大腸菌を回収した。回収した大腸菌を、緩衝液Ａ｛１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭドデシルマルトシド、５ｍＭオレイン酸｝に再懸濁して、超音波破砕（１３０Ｗ、１０分）を行った。その後、抗ＦＬＡＧ抗体カラムで精製を行い、多糖合成酵素（Ｃ）であるヒアルロン酸合成酵素（Ｃ−１）の水溶液を得た。
【０１００】
＜製造例２＞
ソラマメ由来の配列番号２のスクロースシンターゼにＦＬＡＧタグを融合したアミノ酸配列をコードする遺伝子をｐＥＴ２２ｂに組み込んだプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した後、培養し、発現誘導した後、遠心分離機（６０００×ｇ、１５分間）を用いて大腸菌を回収した。緩衝液Ｂ｛１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化マグネシウム｝に再懸濁して、超音波破砕（１３０Ｗ、１０分）を行った。その後、抗ＦＬＡＧ抗体カラムで精製を行い、リボヌクレオシド２リン酸変換酵素（Ｇ）であるスクロースシンターゼの水溶液を得た。
【０１０１】
＜ヒアルロン酸合成酵素（Ｃ−１）水溶液の比活性測定＞
水溶液Ｓ｛１ｍＭ ウリジン２リン酸−グルクロン酸（14Ｃでラベルした放射性同位体を含むウリジン２リン酸−グルクロン酸、放射能３００ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）、１ｍＭ ウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭドデシルマルトシド、５ｍＭオレイン酸｝１ｍＬに、１Ｍ スクロースを１０μＬ、製造例２で得たスクロースシンターゼ水溶液を１０μＬ及び製造例１で得たヒアルロン酸合成酵素（Ｃ−１）水溶液を１０μＬ加えて、反応溶液（Ｘ−１）とし、３０℃で１時間反応を行った。ろ紙を用いたペーパークロマトグラフィー法で未反応の基質とヒアルロン酸を分離した後、原点部を切り出し、液体シンチレーションカクテルに浸漬させた後、液体シンチレーションカウンターを用いて放射性同位体を測定し、14Ｃでラベルしたグルクロン酸の取り込み量からヒアルロン酸の合成量を算出した。その結果、ヒアルロン酸の合成量は１００μｇであった。したがって、製造例１で得られたヒアルロン酸合成酵素（Ｃ−１）の水溶液の比活性は０．４ユニット／ｍＬであった。
【０１０２】
＜スクロースシンターゼ水溶液の比活性測定＞
水溶液Ｒ｛１００ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭの塩化マグネシウム、１ｍＭのウリジン２リン酸を含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）｝１ｍＬに、１Ｍのスクロース水溶液を１０μＬ及びスクロースシンターゼ水溶液を１０μＬ加えて反応溶液（１）としたものを３つ作成し、それぞれ３０℃で５分、１０分、１５分反応を行った。反応生成物（ウリジン２リン酸−グルコース）の量は、ＴＬＣ（Ｓｉｄｍａ社、ＰＥＩ−Ｃｅｌｌｕｒｏｓｅプレート）で展開して（展開溶媒：１ＭのＬｉＣｌ、１Ｍのギ酸を含む水溶液）、ＵＶライト（２６０ｎｍ）で検出して求めた。反応生成量と反応時間との関係から、スクロースシンターゼ水溶液の比活性を計算したところ、０．３ユニット／ｍＬであった。
【０１０３】
＜ヒアルロン酸合成酵素（Ｃ−１）の阻害剤濃度ＩＣ50の測定＞
１．５ｍＬ容量のチューブ中で９４０μＬの水溶液１［５ｍＭの塩化マグネシウムと０．０５ｍＭのウリジン２リン酸ナトリウムを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５、２５℃）］に、製造例１で得たヒアルロン酸合成酵素（Ｃ−１）水溶液を１０μＬ溶解し、恒温水槽を用いてチューブを４０℃で２０分静置した。ここに、４０℃に温調した基質溶液１［ウリジン２リン酸−グルクロン酸ナトリウム塩及びウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンを緩衝液Ｂ｛５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５、２５℃）｝に溶解してそれぞれ２０ｍＭの濃度にしたもの］を５０μＬ添加し、酵素反応溶液（Ｉ−１）とした。（Ｉ−１）を作成直後及び５分おきに１００μＬずつ取り出し、取り出した溶液は、１００℃で２分間加熱して酵素反応を停止した。酵素反応を停止した溶液について、遠心分離器（４℃、１２，０００×ｇ、１０分）を用いて遠心し、不純物を沈殿させた。上清８０μＬを下記条件でＨＰＬＣにより分析し、ヒアルロン酸のピーク面積を記録した。
＜ＨＰＬＣの測定条件＞
装置：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣシステム
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ ＯＨｐａｋ ＳＢ−８０６Ｍ ＨＱ
移動相：０．１Ｍ ＮａＣＯ3
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
検出器：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＲＩＤ検出器
温度：４０℃
水溶液１において、ウリジン２リン酸ナトリウムの濃度が異なる溶液｛０ｍＭ（水溶液２）、０．１５ｍＭ（水溶液３）、０．５ｍＭ（水溶液４）、１ｍＭ（水溶液５）及び３ｍＭ（水溶液６）｝を作成した。水溶液１に代えて水溶液２〜６を用いる以外は同様にして酵素反応溶液（Ｉ−２）〜（Ｉ−６）を作成した。酵素反応溶液（Ｉ−２）〜（Ｉ−６）についても、酵素反応溶液（Ｉ−１）の場合と同様にして、ヒアルロン酸のピーク面積を記録した。
ヒアルロン酸ナトリウム（フナコシ社製、「ヒアロース」、分子質量：１７５ｋＤａ）を緩衝液Ｂに溶解し、それぞれ０．００１μｇ／ｍＬ、０．０１μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ及び５μｇ／ｍＬの濃度にしたものを作成し、ヒアルロン酸標準溶液（１）〜（４）とした。（１）〜（４）を、ＨＰＬＣにより分析し、ヒアルロン酸のピーク面積をそれぞれ記録した。横軸（ｘ軸）にそれぞれのヒアルロン酸濃度（μｇ）、縦軸（ｙ軸）にそれぞれのピーク面積Ｐをプロットし、直線の傾き「ｋ」を算出した。
（Ｉ−１）〜（Ｉ−６）を作成直後のウリジン３リン酸のピーク面積をＰ0、「ｍ」分後のピーク面積をＰhとし、それぞれピーク面積の変化ΔＰ（ΔＰ＝Ｐh−Ｐ0）と上記直線の傾きを用いて下記数式（１）からそれぞれの酵素反応初速度ｖ（μｇ／ｓ）を算出した。
ｖ＝ΔＰ／（ｋ×ｍ×６０）（１）
酵素反応溶液（Ｉ−２）を用いて測定した酵素反応初速度ｖを１００％とし、酵素反応溶液（Ｉ−１）及び（Ｉ−３）〜（Ｉ−６）を用いて測定した酵素反応初速度の相対値（％）を算出した。算出した相対値を用いて、横軸（ｘ軸）にそれぞれのウリジン２リン酸濃度［Ｓ］、縦軸（ｙ軸）に酵素反応溶液（Ｉ−１）〜（Ｉ−６）での酵素反応初速度ｖの相対値をプロットした。プロットの近似曲線と直線ｙ＝５０（％）との交点でのウリジン２リン酸の濃度が阻害濃度ＩＣ50であり、阻害濃度ＩＣ50は０．８ｍＭであった。
【０１０４】
＜実施例１＞
水溶液Ｘ｛０．００１％のアセチル化ヒアルロン酸（資生堂；重量平均分子量約１０万、酢酸による置換率０．１５、化学修飾された多糖（Ａ−１））、１ｍＭ ウリジン２リン酸−グルクロン酸、１ｍＭ ウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化マグネシウム｝１ｍＬに、製造例１で得たヒアルロン酸合成酵素（Ｃ−１）の水溶液を１０μＬ加えて、反応溶液（Ｌ−１）とし、３０℃で１時間反応を行った。限外ろ過膜｛Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、アミコンウルトラ−１５（分画分子量１０万）｝を用いて未反応の基質と変性多糖である変性ヒアルロン酸とを精製した。変性ヒアルロン酸を１００ｍｇ得た。
（Ａ−１）及び得られた変性ヒアルロン酸について、液体クロマトグラフィーで分析した結果、分子量５０万以上のピークは、（Ａ−１）が＜１％、得られた変性ヒアルロン酸が８０％であった。
また、得られた変性ヒアルロン酸について、液体クロマトグラフィーを用いて分子量５０万以上のものを分取し、液体クロマトグラフィー分取後の変性ヒアルロン酸（Ｖ−１）を得た。（Ｖ−１）をＮＭＲを用いて解析した結果、置換率は０．０２５であり、（Ａ−１）の置換率０．１５よりも低かった。
その後、液体クロマトグラフィーで分取後の変性ヒアルロン酸（Ｖ−１）をヒアルロニダーゼ（β−Ｎ−アセチルグルコサミナーゼ（生化学工業製）とβ−グルクロニダーゼ（シグマ社製）の混合物）を用いて分解し、さらに液体クロマトグラフィーで分子量１０００〜１０万のフラクションを分取し、ＮＭＲで解析した結果、分解後の変性ヒアルロン酸の置換率は０．１５５であった。
したがって、液体クロマトグラフィー分取後の変性ヒアルロン酸（Ｖ−１）は、（Ａ−１）に化学修飾されていないヒアルロン酸セグメント（グルクロン酸及びＮ−アセチルグルコサミン）が結合した、一部分が化学修飾された変性多糖である変性ヒアルロン酸を含んでいることがわかった。
【０１０５】
＜実施例２＞
実施例１において、水溶液Ｘ中のアセチル化ヒアルロン酸を、置換率が「約０．１５」のものに代えて「約１」のアセチル化ヒアルロン酸（Ａ−２）（資生堂；重量平均分子量約１０万）を使用する以外は同様にして実施した。変性ヒアルロン酸を３ｍｇ得た。
（Ａ−２）及び得られた変性ヒアルロン酸について、液体クロマトグラフィーで解析を行った結果、分子量５０万以上のピークは（Ａ−２）＜１％、得られた変性ヒアルロン酸が１０％であった。
得られた変性ヒアルロン酸について、液体クロマトグラフィーを用いて分子量５０万以上のものを分取し、液体クロマトグラフィー分取後の変性ヒアルロン酸（Ｖ−２）を得た。（Ｖ−２）をＮＭＲを用いて解析した結果、置換率は０．５であり、（Ａ−２）の置換率１よりも低かった。
その後、液体クロマトグラフィー分取後の変性ヒアルロン酸（Ｖ−２）をヒアルロニダーゼ（β−Ｎ−アセチルグルコサミナーゼ（生化学工業製）とβ−グルクロニダーゼ（シグマ社製）の混合物）を用いて分解した後、液体クロマトグラフィーで分子量１０００〜１０万のフラクションを分取し、ＮＭＲで解析した結果、分解後の変性ヒアルロン酸の置換率は０．９であった。
したがって、液体クロマトグラフィー分取後の変性ヒアルロン酸（Ｖ−２）は、（Ａ−２）に化学修飾されていないヒアルロン酸セグメント（グルクロン酸及びＮ−アセチルグルコサミン）が結合した、一部分が化学修飾された変性ヒアルロン酸を含んでいることがわかった。
【０１０６】
＜実施例３＞
実施例１において、水溶液Ｘ中に９０ｍＭのウリジン２リン酸を含む以外は同様にして実施した。変性ヒアルロン酸を１５ｍｇ得た。
得られた変性ヒアルロン酸について、液体クロマトグラフィーで解析を行った結果、分子量５０万以上のピークは５％であった。
得られた変性ヒアルロン酸について、液体クロマトグラフィーを用いて分子量５０万以上のものを分取し、液体クロマトグラフィー分取後の変性ヒアルロン酸（Ｖ−３）を得た。（Ｖ−３）をＮＭＲを用いて解析した結果、置換率は０．０７であり、（Ａ−１）の置換率０．１５よりも低かった。
その後、液体クロマトグラフィー分取後の変性ヒアルロン酸（Ｖ−３）をヒアルロニダーゼ（β−Ｎ−アセチルグルコサミナーゼ（生化学工業製）とβ−グルクロニダーゼ（シグマ社製）の混合物）を用いて分解した後、液体クロマトグラフィーで分子量１０００〜１０万のフラクションを分取し、ＮＭＲで解析した結果、分解後の変性ヒアルロン酸の置換率は０．１４であった。
したがって、液体クロマトグラフィー分取後の変性ヒアルロン酸（Ｖ−３）は、（Ａ−１）に化学修飾されていないヒアルロン酸セグメント（グルクロン酸及びＮ−アセチルグルコサミン）が結合した、一部分が化学修飾された変性ヒアルロン酸を含んでいることがわかった。
【０１０７】
＜実施例４＞
実施例１において、水溶液Ｘ中のアセチル化ヒアルロン酸を、置換率が「約０．１５」のものに代えて「約０．８」のアセチル化ヒアルロン酸（Ａ−３）（資生堂；重量平均分子量約１０万）を使用する以外は同様にして実施した。変性ヒアルロン酸を５０ｍｇ得た。
（Ａ−３）及び得られた変性ヒアルロン酸について、液体クロマトグラフィーで解析を行った結果、分子量５０万以上のピークは（Ａ−３）＜１％、得られた変性ヒアルロン酸が３０％であった。
得られた変性ヒアルロン酸について、液体クロマトグラフィーを用いて分子量５０万以上のものを分取し、液体クロマトグラフィー分取後の変性ヒアルロン酸（Ｖ−４）を得た。（Ｖ−４）をＮＭＲを用いて解析した結果、置換率は０．０５であり、置換率が原料として用いたアセチル化ヒアルロン酸の置換率である０．８よりも低かった。
その後、液体クロマトグラフィー分取後の変性ヒアルロン酸（Ｖ−４）をヒアルロニダーゼ（β−Ｎ−アセチルグルコサミナーゼ（生化学工業製）とβ−グルクロニダーゼ（シグマ社製）の混合物）を用いて分解した後、液体クロマトグラフィーで分子量１０００〜１０万のフラクションを分取し、ＮＭＲで解析した結果、分解後の変性ヒアルロン酸の置換率は０．７５であった。
したがって、液体クロマトグラフィー分取後の変性ヒアルロン酸（Ｖ−４）は、（Ａ−３）に化学修飾されていないヒアルロン酸セグメント（グルクロン酸及びＮ−アセチルグルコサミン）が結合した、一部分が化学修飾された変性ヒアルロン酸を含んでいることがわかった。
【０１０８】
＜実施例５＞
実施例１において、水溶液Ｘ中にさらに「スクロース（和光純薬社製）を溶液中の濃度が１００ｍＭとなるように加え、製造例２で得たスクロースシンターゼの水溶液を１μＬ加える」以外は同様にして実施した。変性ヒアルロン酸を２００ｍｇ得た。
得られた変性ヒアルロン酸について、液体クロマトグラフィーで分析した結果、分子量５０万以上のピークは、８０％であった。
また、得られた変性ヒアルロン酸について、液体クロマトグラフィーを用いて分子量５０万以上のものを分取し、液体クロマトグラフィー分取後の変性ヒアルロン酸（Ｖ−５）を得た。（Ｖ−５）をＮＭＲを用いて解析した結果、置換率は０．０２５であり、（Ａ−１）の置換率０．１５よりも低かった。
その後、液体クロマトグラフィーで分取後の変性ヒアルロン酸（Ｖ−５）をヒアルロニダーゼ（β−Ｎ−アセチルグルコサミナーゼ（生化学工業製）とβ−グルクロニダーゼ（シグマ社製）の混合物）を用いて分解し、さらに液体クロマトグラフィーで分子量１０００〜１０万のフラクションを分取し、ＮＭＲで解析した結果、分解後の変性ヒアルロン酸の置換率は０．１５であった。
したがって、液体クロマトグラフィー分取後のヒアルロン酸誘導体（Ｖ−５）は、（Ａ−１）に化学修飾されていないヒアルロン酸セグメント（グルクロン酸及びＮ−アセチルグルコサミン）が結合した、一部分が化学修飾された変性多糖である変性ヒアルロン酸を含んでいることがわかった。
【０１０９】
実施例１〜５の結果から、得られた変性ヒアルロン酸は原料のアセチルヒアルロン酸よりも分子量が大きく、原料と比較して置換率が低かった。また、実施例１〜５で得られた変性ヒアルロン酸はヒアルロニダーゼにより分解され、原料の置換率と同程度になった。したがって、実施例１〜５で得た変性ヒアルロン酸は、アセチルヒアルロン酸セグメントにヒアルロン酸セグメントが結合した一部分がアセチル化された変性ヒアルロン酸であることが分かる。
したがって、本発明の変性多糖の製造方法によれば、一部を化学修飾した変性多糖を製造することができることがわかる。
また、置換率１とほぼ全てのヒドロキシル基がアセチル化されている実施例２と置換率が０．１５の実施例１及び置換率が０．８の実施例４とを比較した場合、置換率が０．１５又は０．８である実施例１及び４の方が、変性多糖をより大量に得ることができた。
また、リボヌクレオシド２リン酸であるウリジン２リン酸を阻害濃度ＩＣ50の１１３倍含む溶液を用いた実施例３とウリジン２リン酸を加えていない実施例１とを比較した場合、ウリジン２リン酸を加えていない実施例１の方が、変性多糖をより大量に得ることができた。また、リボヌクレオシド２リン酸変換酵素（Ｇ）を用いた実施例５は、用いていない実施例１と比較して、さらに変性多糖を大量に得ることができた。
【０１１０】
＜ヒアルロン酸誘導体の汗による流れやすさ試験＞
実施例１〜５で液体クロマトグラフィー分取により得られた変性ヒアルロン酸（Ｖ−１）〜（Ｖ−５）を、限外ろ過膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製アミコンウルトラ−１５（分画分子量１０万））で濃縮して０．１％の変性ヒアルロン酸水溶液（Ｙ−１）〜（Ｙ−５）にした。５００μＬの（Ｙ−１）〜（Ｙ−５）をそれぞれ被験者の右手に塗布して３０分放置した後、サウナで１０分過ごした。水で簡単に汗を流した後、布で変性ヒアルロン酸塗布部位を拭き取った。その後、布から変性ヒアルロン酸を抽出し、液体クロマトグラフィーにより変性ヒアルロン酸量を定量した。同様の試験を変性ヒアルロン酸水溶液（Ｙ−１）〜（Ｙ−５）についてそれぞれ１０人に行ったところ、布に付着していた（汗で流れずに残った）変性ヒアルロン酸の量は（Ｖ−１）〜（Ｖ−５）全て０．３±０．１ｍｇであった。
【０１１１】
＜ヒアルロン酸の汗による流れやすさ試験＞
アセチル化ヒアルロン酸に代えて、ヒアルロン酸（重量平均分子量１０万）を用いる以外は実施例１と同様にして、ヒアルロン酸を作成した。
作成したヒアルロン酸について、液体クロマトグラフィーで分子量１００万付近を分取し、液体クロマトグラフィー分取後のヒアルロン酸（Ｖ’−１）を得た。さらに限外ろ過膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製アミコンウルトラ−１５（分画分子量１００，０００））で濃縮して、０．１％のヒアルロン酸溶液（Ｙ’−１）にした。５００μＬの（Ｙ’−１）を被験者の左手に塗布して３０分放置した後、サウナで１０分過ごした。水で簡単に汗を流した後、布でヒアルロン酸塗布部位を拭き取った。その後、布からヒアルロン酸を抽出して液体クロマトグラフィーによりヒアルロン酸量を定量した。同様の試験を１０人に行ったところ、布に付着していた（汗で流れずに残った）ヒアルロン酸の量は＜０．１ｍｇであった。
【０１１２】
変性ヒアルロン酸及びヒアルロン酸の汗による流れやすさ試験の結果から、化学修飾セグメントを有さないヒアルロン酸と比較して、本発明の製造方法により得られた変性ヒアルロン酸は、汗で流されにくいことがわかる。
したがって、本発明の製造方法によれば、機能性の高い変性多糖を得ることができることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【０１１３】
本発明の変性多糖の製造方法によれば、一部を化学修飾した変性多糖を製造できる。また、本発明の製造方法により得られた変性多糖は、化粧品のみならず医薬部外品、医薬品及び医療機器にも用いることができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学修飾された多糖（Ａ）及び下記リボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ｂ）を多糖合成酵素（Ｃ）の存在下で反応させる変性多糖の製造方法。
リボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ｂ）：トリオース（ｂ−１）、テトロース（ｂ−２）、ペントース（ｂ−３）、ヘキソース（ｂ−４）、ヘプトース（ｂ−５）及び下記単糖（ｂ−６）からなる群より選ばれる少なくとも１種の単糖（ｂ）が有する少なくとも１つのヒドロキシル基の水素原子が下記化学式（１）〜（５）のいずれか１つの官能基で置換された糖ヌクレオチド。
【化１】
【化２】
【化３】
【化４】
【化５】
単糖（ｂ−６）：（ｂ−１）、（ｂ−２）、（ｂ−３）、（ｂ−４）及び（ｂ−５）からなる群より選ばれる単糖において、この単糖が有する水素原子、ヒドロキシル基及びヒドロキシメチル基からなる群より選ばれる少なくとも１種が下記置換基（Ｄ）で置換された単糖。
置換基（Ｄ）：カルボキシル基、アミノ基、Ｎ−アセチルアミノ基、スルホ基、メチルエステル基、Ｎ−グリコリル基、メチル基、１，２，３−トリヒドロキシプロピル基、リン酸基及び２−カルボキシ−２−ヒドロキシエチル基からなる群より選ばれる少なくとも１種の置換基。
【請求項２】
化学修飾された多糖（Ａ）中に、（Ａ）１分子の糖鎖を構成する末端の単糖のうち、少なくとも２つの末端の単糖が化学修飾されていない多糖分子を含む請求項１に記載の変性多糖の製造方法。
【請求項３】
化学修飾された多糖（Ａ）が、下記化合物（Ｅ）と多糖とを反応させた反応生成物である請求項１又は２に記載の変性多糖の製造方法。
化合物（Ｅ）：ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、スルホ基及びリン酸基からなる群より選ばれる少なくとも１種を有する化合物と反応する官能基（ｅ）を有する化合物。
【請求項４】
化学修飾された多糖（Ａ）が、下記化合物（Ｅ１）と多糖とを反応させた反応生成物である請求項１〜３のいずれかに記載の変性多糖の製造方法。
化合物（Ｅ１）：ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、スルホ基、ホスホン酸基及びリン酸基からなる群より選ばれる少なくとも１種を有する化合物。
【請求項５】
化学修飾された多糖（Ａ）がヒドロキシル基及び／又はカルボキシル基を有する化合物によりアセチル化されたヒアルロン酸である請求項１〜４のいずれかに記載の変性多糖の製造方法。
【請求項６】
化学修飾された多糖（Ａ）及びリボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ｂ）に多糖合成酵素（Ｃ）を作用させる時間中の１０〜１００％の時間において、反応溶液中のリボヌクレオシド２リン酸の濃度が多糖合成酵素（Ｃ）の下記阻害濃度ＩＣ50の１００倍未満である請求項１〜５のいずれかに記載の変性多糖の製造方法。
阻害濃度ＩＣ50：リボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ｂ）を多糖合成酵素（Ｃ）の存在下で反応させる際の（Ｃ）の濃度において、基質としてリボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ｂ）を用いて、阻害剤としてリボヌクレオシド２リン酸を用いて求めた、（Ｃ）の酵素活性が半減するときのリボヌクレオシド２リン酸の濃度。
【請求項１】
化学修飾された多糖（Ａ）及び下記リボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ｂ）を多糖合成酵素（Ｃ）の存在下で反応させる変性多糖の製造方法。
リボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ｂ）：トリオース（ｂ−１）、テトロース（ｂ−２）、ペントース（ｂ−３）、ヘキソース（ｂ−４）、ヘプトース（ｂ−５）及び下記単糖（ｂ−６）からなる群より選ばれる少なくとも１種の単糖（ｂ）が有する少なくとも１つのヒドロキシル基の水素原子が下記化学式（１）〜（５）のいずれか１つの官能基で置換された糖ヌクレオチド。
【化１】
【化２】
【化３】
【化４】
【化５】
単糖（ｂ−６）：（ｂ−１）、（ｂ−２）、（ｂ−３）、（ｂ−４）及び（ｂ−５）からなる群より選ばれる単糖において、この単糖が有する水素原子、ヒドロキシル基及びヒドロキシメチル基からなる群より選ばれる少なくとも１種が下記置換基（Ｄ）で置換された単糖。
置換基（Ｄ）：カルボキシル基、アミノ基、Ｎ−アセチルアミノ基、スルホ基、メチルエステル基、Ｎ−グリコリル基、メチル基、１，２，３−トリヒドロキシプロピル基、リン酸基及び２−カルボキシ−２−ヒドロキシエチル基からなる群より選ばれる少なくとも１種の置換基。
【請求項２】
化学修飾された多糖（Ａ）中に、（Ａ）１分子の糖鎖を構成する末端の単糖のうち、少なくとも２つの末端の単糖が化学修飾されていない多糖分子を含む請求項１に記載の変性多糖の製造方法。
【請求項３】
化学修飾された多糖（Ａ）が、下記化合物（Ｅ）と多糖とを反応させた反応生成物である請求項１又は２に記載の変性多糖の製造方法。
化合物（Ｅ）：ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、スルホ基及びリン酸基からなる群より選ばれる少なくとも１種を有する化合物と反応する官能基（ｅ）を有する化合物。
【請求項４】
化学修飾された多糖（Ａ）が、下記化合物（Ｅ１）と多糖とを反応させた反応生成物である請求項１〜３のいずれかに記載の変性多糖の製造方法。
化合物（Ｅ１）：ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、スルホ基、ホスホン酸基及びリン酸基からなる群より選ばれる少なくとも１種を有する化合物。
【請求項５】
化学修飾された多糖（Ａ）がヒドロキシル基及び／又はカルボキシル基を有する化合物によりアセチル化されたヒアルロン酸である請求項１〜４のいずれかに記載の変性多糖の製造方法。
【請求項６】
化学修飾された多糖（Ａ）及びリボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ｂ）に多糖合成酵素（Ｃ）を作用させる時間中の１０〜１００％の時間において、反応溶液中のリボヌクレオシド２リン酸の濃度が多糖合成酵素（Ｃ）の下記阻害濃度ＩＣ50の１００倍未満である請求項１〜５のいずれかに記載の変性多糖の製造方法。
阻害濃度ＩＣ50：リボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ｂ）を多糖合成酵素（Ｃ）の存在下で反応させる際の（Ｃ）の濃度において、基質としてリボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ｂ）を用いて、阻害剤としてリボヌクレオシド２リン酸を用いて求めた、（Ｃ）の酵素活性が半減するときのリボヌクレオシド２リン酸の濃度。
【公開番号】特開２０１３−３１４３３（Ｐ２０１３−３１４３３Ａ）
【公開日】平成２５年２月１４日（２０１３．２．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１４２６８１（Ｐ２０１２−１４２６８１）
【出願日】平成２４年６月２６日（２０１２．６．２６）
【出願人】（０００００２２８８）三洋化成工業株式会社 (1,719)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年２月１４日（２０１３．２．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年６月２６日（２０１２．６．２６）
【出願人】（０００００２２８８）三洋化成工業株式会社 (1,719)
【Ｆターム（参考）】
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