変異アルカリセルラーゼ
【課題】アルカリ性領域で良好に作用し、且つ分泌能が高く、または比活性が向上することで容易に大量生産が可能なアルカリセルラーゼを提供する。
【解決手段】特定のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるセルラーゼについて、前記配列の（ａ）１０位、（ｂ）１６位、（ｃ）２２位、（ｄ）３３位、（ｅ）３９位、（ｆ）７６位、（ｇ）１０９位、（ｈ）２４２位、（ｉ）２６３位、（ｊ）３０８位、（ｋ）４６２位、（ｌ）４６６位、（ｍ）４６８位、（ｎ）５５２位、（ｏ）５６４位又は（ｐ）６０８位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換した変異アルカリセルラーゼ；それをコードする遺伝子；該遺伝子を含有するベクター；該ベクターを含有する形質転換体；該変異アルカリセルラーゼを配合する洗浄剤組成物。
【解決手段】特定のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるセルラーゼについて、前記配列の（ａ）１０位、（ｂ）１６位、（ｃ）２２位、（ｄ）３３位、（ｅ）３９位、（ｆ）７６位、（ｇ）１０９位、（ｈ）２４２位、（ｉ）２６３位、（ｊ）３０８位、（ｋ）４６２位、（ｌ）４６６位、（ｍ）４６８位、（ｎ）５５２位、（ｏ）５６４位又は（ｐ）６０８位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換した変異アルカリセルラーゼ；それをコードする遺伝子；該遺伝子を含有するベクター；該ベクターを含有する形質転換体；該変異アルカリセルラーゼを配合する洗浄剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、衣料用洗剤等に配合可能な変異アルカリセルラーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
セルロースは地球上で最も豊富に存在するバイオマス資源である。斯かるセルラーゼを利用した技術のうち、衣料用洗剤への配合は、洗浄力を向上させるばかりでなく、洗剤のコンパクト化にも貢献して広く定着している。
【０００３】
セルラーゼは中酸性領域のみで作用する酵素であり、アルカリ性の衣料用洗剤液中で作用できるものではなかったが、掘越（特許文献１、非特許文献１等参照）によって好アルカリ性バチルス属細菌由来のアルカリセルラーゼが見出され、衣料用重質洗剤への応用が可能となった。そして、これまでに好アルカリ性バチルス属細菌が生産するアルカリセルラーゼ（特許文献２、特許文献３、特許文献４等参照）が開発され、衣料用洗剤へ配合されるに至っている。
【０００４】
近年、遺伝子工学の発展に伴い洗剤用酵素の生産も遺伝子組換えにより大量生産されるようになっているが、アルカリセルラーゼについても例外ではなく、既に数多くの遺伝子についてクローニング、塩基配列の決定がなされ、更に生産菌の変異育種や酵素をコードする遺伝子を改良するという技術の導入が行われている。
しかしながら、工業的レベルでの生産を考えた場合、その生産性は必ずしも満足できるものではなく、培地中に効率良く生産されるアルカリセルラーゼが求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特公昭５０−２８５１５号公報
【特許文献２】特公昭６０−２３１５８号公報
【特許文献３】特公平６−０３０５７８号公報
【特許文献４】米国特許第４９４５０５３号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Horikoshi & Akiba, Alkalophilic Microorganisms, Springer, Berlin, 1982
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、アルカリ性領域で良好に作用し、且つ分泌能が高く、または比活性が向上することで容易に大量生産が可能なアルカリセルラーゼを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、アルカリセルラーゼの特性を保持しつつ、効率良く培地中に生産できる新たな酵素の探索を行ったところ、配列番号１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列中の特定位置のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換した変異アルカリセルラーゼが高い分泌能を有する、あるいは比活性が向上することにより大量生産が可能であることを見出した。
【０００９】
すなわち本発明は、配列番号１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるセルラーゼについて、配列番号１の（ａ）１０位、（ｂ）１６位、（ｃ）２２位、（ｄ）３３位、（ｅ）３９位、（ｆ）７６位、（ｇ）１０９位、（ｈ）２４２位、（ｉ）２６３位、（ｊ）３０８位、（ｋ）４６２位、（ｌ）４６６位、（ｍ）４６８位、（ｎ）５５２位、（ｏ）５６４位又は（ｐ）６０８位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換した変異アルカリセルラーゼ、及びそれをコードする遺伝子を提供するものである。
【００１０】
また本発明は、該遺伝子を含有するベクター、該ベクターを含有する形質転換体を提供するものである。
【００１１】
更に本発明は、上記変異アルカリセルラーゼを配合する洗浄剤組成物を提供するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の変異アルカリセルラーゼを用いれば、これまでに比べ高活性の培養液を得ることができるため、洗剤等工業用用途に必要なアルカリセルラーゼを大量に供給可能である。また、一定の酵素量を生産する場合においては培養回数を減少させることで、培養に要するエネルギー、培地成分量、培養中に生成される二酸化炭素量、並びに排水量を減少させることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】配列番号１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するセルラーゼのアミノ酸配列を整列させた図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の変異アルカリセルラーゼは、配列番号１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるセルラーゼを変異の対象となるセルラーゼ（以下、「親アルカリセルラーゼ」ともいう）とし、当該配列番号１の上記（ａ）〜（ｐ）位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換してなるものであり、これらは野生型の変異体或いは人為的に変異を施した変異体であってもよい。
【００１５】
親アルカリセルラーゼである配列番号１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアルカリセルラーゼには、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるアルカリセルラーゼ及び当該アミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアルカリセルラーゼが包含され、これらは野生型又は野生型の変異体であってもよく、その性質としては、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）法あるいはゲル濾過法により得られる分子量が８６,０００±２，０００であることが好ましく、カルボキシメチルセルロースを基質とした場合の最適反応pHは７．５〜９．５の間にあることが好ましく、最適反応温度が４０〜５０℃の範囲にあることが好ましい。また、カルボキシメチルセルロースのほかにリケナンを良好に分解することが好ましく、pH９で５０℃、１０分間の処理においても充分に安定であることが好ましい。特に好ましくは、分子量が８６，０００±２，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥあるいはSephacryl Ｓ２００カラムによるゲル濾過法）、最適反応pHはpH８．６〜９．０、最適反応温度が５０℃、カルボキシメチルセルロースのほかにリケナンを良好に分解し、pH９、５mM塩化カルシウム存在下で５０℃、１０分間の処理を行った場合９５％以上（３０℃、１０分間処理時の残存活性を１００％とする）の残存活性を認めるようなセルラーゼである。
【００１６】
「配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるアルカリセルラーゼ」としては、例えばＥｇｌ−２３７［バチルス エスピーＫＳＭ−Ｓ２３７（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８７５）由来、Hakamadaら，Biosci. Biotechnol. Biochem., 64, 2281-2289, 2000］が挙げられる。また、「配列番号１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアルカリセルラーゼ」としては、配列番号１で示されるアミノ酸配列と好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアルカリセルラーゼが挙げられ、例えば、バチルス エスピー １１３９株由来のアルカリセルラーゼ（Ｅｇｌ−１１３９）（Fukumori ら，J. Gen. Microbiol., 132, 2329-2335）（相同性９１．４％）、バチルス エスピー ＫＳＭ−６４株由来のアルカリセルラーゼ（Ｅｇｌ−６４）（Sumitomo ら，Biosci. Biotechnol. Biochem., 56, 872-877, 1992）（相同性９１．９％）、バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｎ１３１株由来のセルラーゼ（Ｅｇｌ−Ｎ１３１ｂ）（特願２０００−４７２３７号）（相同性９５．０％）が挙げられる。
尚、アミノ酸配列の相同性はＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮのマキシマムマッチングやサーチホモロジー等のプログラム（ソフトウェア開発）を用いて計算することができる。
【００１７】
上記配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる親アルカリセルラーゼの（ａ）〜（ｐ）位置におけるアミノ酸残基は、（ａ）１０位：ロイシン、（ｂ）１６位：イソロイシン、（ｃ）２２位：セリン、（ｄ）３３位：アスパラギン、（ｅ）３９位：フェニルアラニン、（ｆ）７６位：イソロイシン、（ｇ）１０９位：メチオニン、（ｈ）２４２位：グルタミン、（ｉ）２６３位：フェニルアラニン、（ｊ）３０８位：スレオニン、（ｋ）４６２位：アスパラギン、（ｌ）４６６位：リジン、（ｍ）４６８位：バリン、（ｎ）５５２位：イソロイシン、（ｏ）５６４位：イソロイシン、（ｐ）６０８位：セリンである。
【００１８】
また、配列番号１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる親アルカリセルラーゼにおいては、配列番号１の上記（ａ）〜（ｐ）位に相当する位置のアミノ酸残基は、それぞれ（ａ）位：ロイシン、（ｅ）位：フェニルアラニン、（ｆ）位：イソロイシン、（ｈ）位：グルタミン、（ｉ）位：フェニルアラニン、（ｋ）位：アスパラギン、（ｌ）位：リジン、（ｍ）位：バリン、（ｎ）位：イソロイシンであるものが好ましく、更にこれに加えて（ｂ）位：イソロイシン、（ｃ）位：セリンであるものが好ましく、更にこれに加えて（ｄ）位：アスパラギン、（ｇ）位：メチオニン、（ｊ）位：スレオニン、（ｏ）位：イソロイシン、（ｐ）位：セリンであるものが好ましい。
【００１９】
従って、配列番号１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる親アルカリセルラーゼの中で好ましいものとしては、上述した酵素学的性質を有するもの（段落〔００１２〕）及び／又は配列番号１で示されるアミノ酸配列と好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるものであって、更に配列番号１の（ａ）〜（ｐ）位に相当する位置のアミノ酸残基が上記（段落〔００１５〕）のものであるセルラーゼが挙げられ、特に当該酵素学的性質を有し（段落〔００１２〕）、配列番号１に示すアミノ酸配列と好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ配列番号１の（ａ）〜（ｐ）位に相当する位置のアミノ酸残基が上記（段落〔００１５〕）のものであるセルラーゼが好ましい。
【００２０】
そして、本発明の変異アルカリセルラーゼは、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるセルラーゼを親アルカリセルラーゼとする場合には、当該（ａ）〜（ｐ）位置のいずれかのアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換したものであり、配列番号１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるセルラーゼ（配列番号１で示されるアルカリセルラーゼを除く）を親アルカリセルラーゼとする場合には、配列番号１の上記（ａ）〜（ｐ）位に相当する位置のいずれかのアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換したものである。
【００２１】
斯かる他のアミノ酸残基としては、（ａ）位置については、グルタミン、アラニン、プロリン又はメチオニン、特にグルタミンであるのが好ましく、（ｂ）位置については、アスパラギン又はアルギニン、特にアスパラギンであるのが好ましく、（ｃ）位置についてはプロリンであるのが好ましく、（ｄ）位置についてはヒスチジンであるのが好ましく、（ｅ）位置については、アラニン、スレオニン又はチロシン、特にアラニンであるのが好ましく、（ｆ）位置については、ヒスチジン、メチオニン、バリン、スレオニン又はアラニン、特にヒスチジンであるのが好ましく、（ｇ）位置については、イソロイシン、ロイシン、セリン又はバリン、特にイソロイシンであるのが好ましく、（ｈ）位置についてアラニン、フェニルアラニン、バリン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ロイシン、イソロイシン、チロシン、スレオニン、メチオニン又はグリシン、特にアラニン、フェニルアラニン、セリンであるのが好ましく、（ｉ）位置についてはイソロイシン、ロイシン、プロリン又はバリン、特にイソロイシンであるのが好ましく、（ｊ）位置については、アラニン、セリン、グリシン又はバリン、特にアラニンであるのが好ましく、（ｋ）位置については、スレオニン、ロイシン、フェニルアラニン又はアルギニン、特にスレオニンであるのが好ましく、（ｌ）位置については、ロイシン、アラニン又はセリン、特にロイシンであるのが好ましく、（ｍ）位置については、アラニン、アスパラギン酸、グリシン又はリジン、特にアラニンであるのが好ましく、（ｎ）位置については、メチオニンであるのが好ましく、（ｏ）位置については、バリン、スレオニン又はロイシン、特にバリンであるのが好ましく、（ｐ）位置については、イソロイシン又はアルギニン、特にイソロイシンであるのが好ましい。
【００２２】
また、「相当する位置のアミノ酸残基」を特定する方法としては、例えばリップマン−パーソン法等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較し、各アルカリセルラーゼのアミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の相同性を与えることにより行うことができる。セルラーゼのアミノ酸配列をこのような方法で整列させることにより、アミノ酸配列中にある挿入、欠失にかかわらず、相同アミノ酸残基の各セルラーゼにおける配列中の位置を決めることが可能である（図１）。相同位置は、三次元構造中で同位置に存在すると考えられ、対象のセルラーゼの特異的機能に関して類似した効果を有することが推定できる。
【００２３】
配列番号１に示すアルカリセルラーゼ（Ｅｇｌ−２３７）の（ａ）１０位、（ｂ）１６位、（ｃ）２２位、（ｄ）３３位、（ｅ）３９位、（ｆ）７６位、（ｇ）１０９位、（ｈ）２４２位、（ｉ）２６３位、（ｊ）３０８位、（ｋ）４６２位、（ｌ）４６６位、（ｍ）４６８位、（ｎ）５５２位、（ｏ）５６４位、（ｐ）６０８位に相当する位置及びアミノ酸番号の具体例を配列番号１と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる他のアルカリセルラーゼについて示す。
【００２４】
【表１】
【００２５】
斯かるアミノ酸残基の置換は、酵素活性及び酵素特性が変化しない限り２個所以上が同時になされていてもよい。２個所以上が同時になされた場合の好ましい具体例を以下に示す。尚、以下の表記ではアミノ酸を３文字表記とし、「＋」は一ヶ所の置換に対し付加された置換を表し、「／」については表記したいずれのアミノ酸を使用しても良いことを示している。
【００２６】
例えば、２重置換体の例としては、Ｌｅｕ１０（Ｇｌｎ／Ａｌａ／Ｐｒｏ／Ｍｅｔ）＋Ｉｌｅ１６（Ａｓｎ／Ａｒｇ）、Ｉｌｅ１６（Ａｓｎ／Ａｒｇ）＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ、Ｌｅｕ１０（Ｇｌｎ／Ａｌａ／Ｐｒｏ／Ｍｅｔ）＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ、Ａｓｎ３３Ｈｉｓ＋Ｐｈｅ３９（Ｔｈｒ／Ｔｙｒ／Ａｌａ）、Ｌｅｕ１０（Ｇｌｎ／Ａｌａ／Ｐｒｏ／Ｍｅｔ）＋Ｇｌｎ２４２（Ｓｅｒ／Ａｌａ／Ｐｈｅ／Ｖａｌ／Ａｓｐ／Ｇｌｕ／Ｇｌｙ）、Ｉｌｅ１６（Ａｒｇ／Ａｓｎ）＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ+Ｇｌｎ２４２（Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ｐｈｅ／Ｖａｌ／Ｉｌｅ／Ｇｌｙ／Ｇｌｕ／Ａｓｐ／Ｔｈｒ／Ｌｅｕ／Ｍｅｔ／Ｔｙｒ）、Ｇｌｎ２４２（Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ｐｈｅ／Ｖａｌ／Ｉｌｅ／Ｇｌｙ／Ｇｌｕ／Ａｓｐ／Ｔｈｒ／Ｌｅｕ／Ｍｅｔ／Ｔｙｒ）＋Ｐｈｅ２６３（Ｉｌｅ／Ｌｅｕ／Ｐｒｏ／Ｖａｌ）、Ｌｅｕ１０（Ｇｌｎ／Ａｌａ／Ｐｒｏ／Ｍｅｔ）＋Ｔｈｒ３０８（Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ｇｌｙ／Ｖａｌ）、Ｉｌｅ１６（Ａｓｎ／Ａｒｇ）＋Ａｓｎ４６２（Ｔｈｒ／Ｌｅｕ／Ｐｈｅ／Ａｒｇ）、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｖａｌ４６８（Ａｌａ／Ａｓｐ／Ｇｌｙ／Ｌｙｓ）、Ａｓｎ３３Ｈｉｓ＋Ｉｌｅ５５２Ｍｅｔ、Ａｓｎ３３ＨｉｓＩｌｅ５６４（Ｖａｌ／Ｔｈｒ／Ｌｅｕ）、Ｇｌｎ２４２（Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ｐｈｅ／Ｖａｌ／Ｉｌｅ／Ｇｌｙ／Ｇｌｕ／Ａｓｐ／Ｔｈｒ／Ｌｅｕ／Ｍｅｔ／Ｔｙｒ）＋Ｓｅｒ６０８（Ｉｌｅ／Ａｒｇ）等が好ましく、Ｌｅｕ１０Ｇｌｎ＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ、Ａｓｎ３３Ｈｉｓ＋Ｐｈｅ３９Ａｌａ、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｇｌｎ２４２Ａｌａ、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｇｌｎ２４２Ｐｈｅ、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒが特に好ましい。
【００２７】
３重置換体の例としては、Ｌｅｕ１０（Ｇｌｎ／Ａｌａ／Ｐｒｏ／Ｍｅｔ）＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｇｌｎ２４２（Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ｐｈｅ／Ｖａｌ／Ｉｌｅ／Ｇｌｙ／Ｇｌｕ／Ａｓｐ／Ｔｈｒ／Ｌｅｕ／Ｍｅｔ／Ｔｙｒ）、Ｉｌｅ１６（Ａｓｎ／Ａｒｇ）＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｇｌｎ２４２（Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ｐｈｅ／Ｖａｌ／Ｉｌｅ／Ｇｌｙ／Ｇｌｕ／Ａｓｐ／Ｔｈｒ／Ｌｅｕ／Ｍｅｔ／Ｔｙｒ）、Ｉｌｅ７６（Ｈｉｓ／Ｍｅｔ／Ｖａｌ／Ｔｈｒ／Ａｌａ）＋Ｇｌｎ２４２（Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ｐｈｅ／Ｖａｌ／Ｉｌｅ／Ｇｌｙ／Ｇｌｕ／Ａｓｐ／Ｔｈｒ／Ｌｅｕ／Ｍｅｔ／Ｔｙｒ）＋Ｌｙｓ４６６（Ｌｅｕ／Ａｌａ／Ｓｅｒ）等が好ましく、Ｌｅｕ１０Ｇｌｎ＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｇｌｎ２４２Ａｌａ、Ｉｌｅ１６Ａｓｎ＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒ、Ｉｌｅ１６Ａｓｎ＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｇｌｎ２４２Ｐｈｅが特に好ましい。
【００２８】
４重置換体の例としては、Ｌｅｕ１０（Ｇｌｎ／Ａｌａ／Ｐｒｏ／Ｍｅｔ）＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｉｌｅ７６（Ｈｉｓ／Ｍｅｔ／Ｖａｌ／Ｔｈｒ／Ａｌａ）＋Ｌｙｓ４６６（Ｌｅｕ／Ａｌａ／Ｓｅｒ）、Ｌｅｕ１０（Ｇｌｎ／Ａｌａ／Ｐｒｏ／Ｍｅｔ）＋Ｉｌｅ１６（Ａｓｎ／Ａｒｇ）＋Ｉｌｅ７６（Ｈｉｓ／Ｍｅｔ／Ｖａｌ／Ｔｈｒ／Ａｌａ）＋Ｌｙｓ４６６（Ｌｅｕ／Ａｌａ／Ｓｅｒ）、Ｉｌｅ１６（Ａｓｎ／Ａｒｇ）＋Ｍｅｔ１０９（Ｉｌｅ／Ｌｅｕ／Ｓｅｒ／Ｖａｌ）＋Ｇｌｎ２４２（Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ｐｈｅ／Ｖａｌ／Ｉｌｅ／Ｇｌｙ／Ｇｌｕ／Ａｓｐ／Ｔｈｒ／Ｌｅｕ／Ｍｅｔ／Ｔｙｒ）＋Ｉｌｅ５６４（Ｖａｌ／Ｔｈｒ／Ｌｅｕ）等が好ましく、Ｌｅｕ１０Ｇｌｎ＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｉｌｅ７６Ｈｉｓ＋Ｌｙｓ４６６Ｌｅｕ、Ｌｅｕ１０Ｇｌｎ＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｇｌｎ２４２Ａｌａ＋Ｌｙｓ４６６Ｌｅｕ、Ｌｅｕ１０Ｇｌｎ＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒ＋Ｌｙｓ４６６Ｌｅｕが特に好ましい。
【００２９】
５重置換体の例としては、Ｌｅｕ１０（Ｇｌｎ／Ａｌａ／Ｐｒｏ／Ｍｅｔ）＋Ｉｌｅ１６（Ａｓｎ／Ａｒｇ）＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｉｌｅ７６（Ｈｉｓ／Ｍｅｔ／Ｖａｌ／Ｔｈｒ／Ａｌａ）＋Ｌｙｓ４６６（Ｌｅｕ／Ａｌａ／Ｓｅｒ）、Ｉｌｅ１６（Ａｓｎ／Ａｒｇ）＋Ｇｌｎ２４２（Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ｐｈｅ／Ｖａｌ／Ｉｌｅ／Ｇｌｙ／Ｇｌｕ／Ａｓｐ／Ｔｈｒ／Ｌｅｕ／Ｍｅｔ／Ｔｙｒ）＋Ｔｈｒ３０８（Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ｇｌｙ／Ｖａｌ）＋Ｉｌｅ５５２Ｍｅｔ＋Ｓｅｒ６０８（Ｉｌｅ／Ａｒｇ）等が好ましく、Ｌｅｕ１０Ｇｌｎ＋Ｉｌｅ１６Ａｓｎ＋Ｉｌｅ７６Ｈｉｓ＋Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒ＋Ｌｙｓ４６６Ｌｅｕ、Ｌｅｕ１０Ｇｌｎ＋Ｉｌｅ１６Ａｓｎ＋Ｉｌｅ７６Ｈｉｓ＋Ｇｌｎ２４２Ａｌａ＋Ｌｙｓ４６６Ｌｅｕが特に好ましい。
また、更にそれ以上の多重置換、例えば６〜１６置換体でもよい。
【００３０】
また、本発明の変異アルカリセルラーゼには、上記（ａ）〜（ｐ）位置に相当する位置のいずれかのアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換したもののみならず、アルカリセルラーゼ活性を失わない限り、該アミノ酸配列中の他の位置において１〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は付加されたものも包含する。
【００３１】
本発明の変異アルカリセルラーゼは、例えば以下の方法により得ることができる。
すなわち、クローニングされた親アルカリセルラーゼ（例えば配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するアルカリセルラーゼ）をコードする遺伝子（配列番号２）に対して置換（以下、「変異」ともいう）を施し、得られた変異遺伝子を用いて適当な宿主を形質転換し、当該組換え宿主を培養し、培養物から採取することにより得られる。
【００３２】
親アルカリセルラーゼをコードする遺伝子のクローニングは、一般的な遺伝子組換え技術を用いればよく、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＫＳＭ−Ｓ２３７の染色体より、ショットガン法やＰＣＲ法により取得できる。
【００３３】
親アルカリセルラーゼをコードする遺伝子の変異手段としては、一般的に行われているランダム変異や部異特異的変異の方法がいずれも採用できる。より具体的には、例えばのSite-Directed Mutagenesis System Mutan-Super Express Kmキット(Ｔａｋａｒａ)等を用いて行うことができる。また、リコンビナントＰＣＲ（polymerase chain reaction）法（PCR protocols, Academic press, New York, 1990）を用いることによって、遺伝子の任意の配列を他の遺伝子の該任意の配列に相当する配列と置換することが可能である。
【００３４】
得られた変異遺伝子を用いた本発明変異アルカリセルラーゼの生産は、宿主菌体内で複製維持が可能であり、該酵素を安定に発現させることができ、該遺伝子を安定に保持できるベクターに当該遺伝子を組込み、得られた組換えベクターを用いて宿主菌を形質転換することにより行えばよい。
【００３５】
斯かるベクターとしては大腸菌を宿主とする場合、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（ヤクルト本社製）等が挙げられ、枯草菌を宿主にする場合、ｐＵＢ１１０、ｐＨＳＰ６４（Sumitomoら、 Biosci. Biotechnol,Biocem., 59, 2172-2175, 1995）あるいはｐＨＹ３００ＰＬＫ等が挙げられる。
【００３６】
宿主菌を形質転換するには、プロトプラスト法、コンピテントセル法、エレクトロポレーション法等を用いればよく、宿主菌としては、例えばバチルス属（枯草菌）等のグラム陽性菌、大腸菌等のグラム陰性菌、ストレプトマイセス属等の放線菌、サッカロマイセス属等の酵母あるいはアスペルギルス属等のカビが挙げられる。
【００３７】
得られた形質転換体は、資化しうる炭素源、窒素源、金属塩、ビタミン等を含む培地を用いて適当な条件下で培養すればよく、得られた培養液から、一般的な方法によって酵素の分取や精製を行い、凍結乾燥、噴霧乾燥、結晶化により必要な酵素形態を得ることができる。
【００３８】
かくして得られる本発明の変異アルカリセルラーゼは、親アルカリセルラーゼの性質を保持しつつ、且つ形質転換体での酵素の分泌能が向上している、あるいは酵素自体の比活性の向上をもたらすものである。
【００３９】
ここで酵素の「分泌の向上」とは、親アルカリセルラーゼと同一の条件下において（例えば３％（ｗ／ｖ）ポリペプトンＳ（日本製薬製）、０．５％魚肉エキス（和光純薬製）、０．０５％酵母エキス、０．１％リン酸１カリウム、０．０２％硫酸マグネシウム７水塩、テトラサイクリン（１５μｇ／ｍＬ）及び５％マルトースを含んだ培地（ＰＳＭ培地）を用いて、３０℃で７２時間振とう培養する）生産した変異アルカリセルラーゼについて培養上清中の酵素活性量、タンパク質量を測定した場合、親アルカリセルラーゼのそれに対し、一定量以上の活性量、タンパク質量を示すこと、例えば親アルカリセルラーゼの５％以上、望ましくは１０％以上、さらに望ましくは２０％以上の活性量またはタンパク質量の増大が認められるものとすることができる。
特に、比活性などの変化が認められなければ活性量とタンパク量の比は親アルカリセルラーゼと変異アルカリセルラーゼでは一定の値をとると考えられることから、活性量またはタンパク質量のどちらか一方を測定しても構わない。
【００４０】
従って、本発明の変異アルカリセルラーゼは、各種洗剤組成物配合用酵素として有用である。
洗浄剤組成物中への本発明変異アルカリセルラーゼの配合量は、当該セルラーゼが活性を示す量であれば特に制限されないが、洗浄剤組成物あたり、０．０００１〜５質量％であるのが好ましく、０．００００５〜２．５質量％がより好ましく、０．００１〜２質量％が更に好ましい。また、酵素造粒物として用いる場合の造粒物中での含有量は、０．０１〜５０質量％であるのが好ましく、０．０５〜２５質量％がより好ましく、０．１〜２０質量％が更に好ましい。
【００４１】
本発明の洗浄剤組成物は、上記アルカリセルラーゼ（造粒物）の他に、界面活性剤及びビルダーを含有するのが好ましい。界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤及び陽イオン性界面活性剤の１種又は組み合わせを挙げることができるが、好ましくは陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤である。
【００４２】
陰イオン性界面活性剤としては、炭素数１０〜１８のアルコールの硫酸エステル塩、炭素数８〜２０のアルコールのアルコキシル化物の硫酸エステル塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル硫酸エステル塩、パラフィンスルホン酸塩、α−オレフィンスルホン酸塩、α−スルホ脂肪酸塩、α−スルホ脂肪酸アルキルエステル塩又は脂肪酸塩が好ましい。本発明では特に、アルキル鎖の炭素数が１０〜１４、より好ましくは１２〜１４の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩が好ましい。これらの塩の対イオンとしては、アルカリ金属塩やアミン類が好ましく、特にナトリウム及び／又はカリウム、モノエタノールアミン、ジエタノールアミンが好ましい。
【００４３】
非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシアルキレンアルキル（炭素数８〜２０）エーテル、アルキルポリグリコシド、ポリオキシアルキレンアルキル（炭素数８〜２０）フェニルエーテル、ポリオキシアルキレンソルビタン脂肪酸（炭素数８〜２２）エステル、ポリオキシアルキレングリコール脂肪酸（炭素数８〜２２）エステル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックポリマーが好ましい。特に、非イオン性界面活性剤としては、炭素数１０〜１８のアルコールにエチレンオキシドやプロピレンオキシド等のアルキレンオキシドを４〜２０モル付加した〔ＨＬＢ値（グリフィン法で算出）が１０．５〜１５．０、好ましくは１１．０〜１４．５であるような〕ポリオキシアルキレンアルキルエーテルが好ましい。
【００４４】
界面活性剤の合計量は、洗浄力及び溶解性の点から、洗浄剤組成物中１０〜６０質量％であるのが好ましく、１５〜５０質量％がより好ましく、２０〜４５質量％が更に好ましい。
陰イオン性界面活性剤は、特に粉末洗浄剤組成物中１〜６０質量％であるのが好ましく、１〜５０質量％がより好ましく、３〜４０質量％が特に好ましい。
非イオン性界面活性剤は、特に粉末洗浄剤組成物中０．５〜４５質量％であるのが好ましく、１〜３５質量％がより好ましく、３〜２５質量％が特に好ましい。
【００４５】
陰イオン性界面活性剤と非イオン性界面活性剤は、単独で用いることもできるが、好ましくは混合して用いるのが良い。また、両性界面活性剤や陽イオン性界面活性剤を目的に合わせ併用することもできる。
【００４６】
ビルダーとしては、そのもの自身では洗浄力がないか、又はあってもそれ程著しくないが、洗浄剤組成物に配合されると著しく洗浄性能を向上させ、特に洗浄剤の主要成分である界面活性剤の洗浄能力を向上させるものが挙げられ、作用として、多価金属陽イオンの捕捉作用、汚れ分散作用及びアルカリ緩衝作用の少なくとも１つの作用を有するものである。
斯かるビルダーとしては、例えば水溶性無機化合物、水不溶性無機化合物、有機化合物等が挙げられる。
【００４７】
水溶性無機化合物としては、リン酸塩（トリポリリン酸塩、ピロリン酸塩、メタリン酸塩、リン酸三ナトリウム等）、ケイ酸塩、炭酸塩、硫酸塩等が挙げられる。中でも３つの作用を全て有する点でリン酸塩が好ましい。
【００４８】
水不溶性無機化合物としては、アルミノケイ酸塩（Ａ型ゼオライト、Ｐ型ゼオライト、Ｘ型ゼオライト、非晶質アルミノケイ酸塩等）、結晶性ケイ酸塩等が挙げられる。中でも粒子径３μｍ以下（より好ましくは１μｍ以下）のＡ型ゼオライトが好ましい。
【００４９】
有機化合物としては、カルボン酸塩（アミノカルボン酸塩、ヒドロキシアミノカルボン酸塩、ヒドロキシカルボン酸塩、シクロカルボン酸塩、マレイン酸誘導体、シュウ酸塩等）、有機カルボン酸（塩）ポリマー（アクリル酸重合体及び共重合体、多価カルボン酸重合体及び共重合体、グリオキシル酸重合体、多糖類及びこれらの塩等）等が挙げられる。中でも有機カルボン酸（塩）ポリマーが好ましい。
【００５０】
前記ビルダーの塩において、対イオンとしては、アルカリ金属塩、アミン類が好ましく、特にナトリウム及び／又はカリウム、モノエタノールアミン、ジエタノールアミンが好ましい。
【００５１】
これらのビルダーは、単独で又は２種以上を併用することができるが、水溶性無機化合物を含有するのが好ましく、水溶性無機化合物及び有機化合物を併用するのがより好ましく、水溶性無機化合物、有機化合物及び水不溶性無機化合物を併用するのが更に好ましい。
【００５２】
ビルダーの合計量は、洗浄性能の点から、洗浄剤組成物中２０〜８０質量％であるのが好ましく、３０〜７０質量％がより好ましく、３５〜６０質量％が更に好ましい。
また、水溶性無機化合物ビルダーは、特に粉末洗浄剤組成物中１０〜５０質量％であるのが好ましく、１５〜４５質量％がより好ましく、２０〜４０質量％が更に好ましい。
水不溶性無機化合物ビルダーは、特に粉末洗浄剤組成物中５〜５０質量％であるのが好ましく、１０〜４５質量％がより好ましく、１５〜４０質量％が更に好ましい。
有機化合物ビルダーは、特に粉末洗浄剤組成物中０．１〜２０質量％であるのが好ましく、０．３〜１５質量％がより好ましく、０．５〜１０質量％が更に好ましい。
【００５３】
本発明の洗浄剤組成物には、上記成分の他に、漂白剤（過炭酸塩、過ホウ酸塩、漂白活性化剤等）、再汚染防止剤（カルボキシメチルセルロース等）、柔軟化剤（ジアルキル型第四級アンモニウム塩、粘土鉱物等）、還元剤（亜硫酸塩等）、蛍光増白剤（ビフェニル型、アミノスチルベン型等）、泡コントロール剤（シリコーン等）、香料等の添加剤を含有させることができる。
【００５４】
また、本発明の洗浄剤組成物には、本発明のアルカリセルラーゼ以外に様々な酵素を併用することもできる。例えば、加水分解酵素、酸化酵素、還元酵素、トランスフェラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、シンテターゼ等である。このうち、本発明以外のセルラーゼ、プロテアーゼ、ケラチナーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、プルラナーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、グルコシダーゼ、グルカナーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ等が好ましく、特にプロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、リパーゼが好ましい。
【００５５】
本発明の洗浄剤組成物は、上記方法で得られた本発明変異アルカリセルラーゼ及び上記公知の洗浄成分を組み合わせて常法に従い製造することができる。洗剤の形態は用途に応じて選択することができ、例えば液体、粉体、顆粒、ペースト、固形等にすることができる。
かくして得られる本洗浄剤組成物は、衣料用粉末洗浄剤、衣料用液体洗浄剤、自動食器洗浄機用洗剤、木綿繊維改質用洗浄剤等として使用することができる。
【実施例】
【００５６】
実施例１ アルカリセルラーゼ遺伝子の変異体作製
アルカリセルラーゼの生産量を向上させる変異体取得のため、先ずアルカリセルラーゼ遺伝子領域内の変異ＰＣＲ法によるランダム変異を行い、変異体のライブラリーを構築した。得られた変異体の中からアルカリセルラーゼの生産量向上に有効な変異体を選別し、変異箇所を塩基配列解析で決定した後、混合プライマーを用いて変異箇所のランダム変異及び部位特異的変異により多重変異体を構築して生産量の向上を試みた。鋳型ＤＮＡとして大腸菌−枯草菌のシャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ中に組換えられたＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＫＳＭ−Ｓ２３７株由来のアルカリセルラーゼ遺伝子を用いた。
【００５７】
ランダム変異の混合プライマーには、Ｉｌｅ１６Ｘ（プライマー１、配列番号３、Ｘは他のアミノ酸）、Ｐｈｅ３９Ｘ（プライマー２、配列番号４）、Ｉｌｅ７６Ｘ（プライマー３、配列番号５）、Ｍｅｔ１０９Ｘ（プライマー４、配列番号６）、Ｐｈｅ２６３Ｘ（プライマー５、配列番号７）、Ｔｈｒ３０８Ｘ（プライマー６、配列番号８）、Ａｓｎ４６２Ｘ（プライマー７、配列番号９）、Ｌｙｓ４６６Ｘ（プライマー８、配列番号１０）、Ｖａｌ４６８Ｘ（プライマー９、配列番号１１）、Ｉｌｅ５５２Ｘ（プライマー１０、配列番号１２）、Ｉｌｅ５６４Ｘ（プライマー１１、配列番号１３）及びＳｅｒ６０８Ｘ（プライマー１２、配列番号１４）を用いた。
【００５８】
また、部位特異的変異Ｌｅｕ１０Ｇｌｎ、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ、Ａｓｎ３３Ｈｉｓ、Ｐｈｅ３９Ａｌａ、Ｍｅｔ１０９Ｉｌｅ、Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒ、Ｇｌｎ２４２Ａｌａ、Ｇｌｎ２４２Ｐｈｅ、Ｇｌｎ２４２Ｖａｌ、Ｇｌｎ２４２Ａｓｐ、Ｇｌｎ２４２Ｇｌｕ、Ｇｌｎ２４２Ｇｌｙ、Ｇｌｎ２４２Ｉｌｅ、Ｇｌｎ２４２Ｌｅｕ、Ｇｌｎ２４２Ｍｅｔ、Ｇｌｎ２４２Ｔｙｒ、Ｐｈｅ２６３Ｉｌｅ、Ｔｈｒ３０８Ａｌａ及びＩｌｅ５５２Ｍｅｔを導入する為の変異導入用プライマーＬｅｕ１０Ｇｌｎ（プライマー１３、配列番号１５）、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ（プライマー１４、配列番号１６）、Ａｓｎ３３Ｈｉｓ（プライマー１５、配列番号１７）、Ｐｈｅ３９Ａｌａ（プライマー１６、配列番号１８）、Ｍｅｔ１０９Ｉｌｅ（プライマー１７、配列番号１９）、Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒ（プライマー１８、配列番号２０）、Ｇｌｎ２４２Ａｌａ（プライマー１９、配列番号２１）、Ｇｌｎ２４２Ｐｈｅ（プライマー２０、配列番号２２）、Ｇｌｎ２４２Ｖａｌ（プライマー２１、配列番号２３）、Ｇｌｎ２４２Ａｓｐ（プライマー２２、配列番号２４）又はＧｌｎ２４２Ｇｌｕ（プライマー２２、配列番号２４）、Ｇｌｎ２４２Ｇｌｙ（プライマー２３、配列番号２５）、Ｇｌｎ２４２Ｉｌｅ（プライマー２０、配列番号２２）、Ｇｌｎ２４２Ｔｈｒ（プライマー２４、配列番号２６）、Ｇｌｎ２４２Ｌｅｕ（プライマー２５、配列番号２７）、Ｇｌｎ２４２Ｍｅｔ（プライマー２６、配列番号２８）、Ｇｌｎ２４２Ｔｙｒ（プライマー２７、配列番号２９）、Ｐｈｅ２６３Ｉｌｅ（プライマー２８、配列番号３０）、Ｔｈｒ３０８Ａｌａ（プライマー２９、配列番号３１）及びＩｌｅ５５２Ｍｅｔ（プライマー３０、配列番号３２）を用い、アルカリセルラーゼ遺伝子内に存在する適当な対向プライマーを構築して鋳型ＤＮＡと共に変異導入を行なった。
【００５９】
即ち、鋳型ＤＮＡプラスミド０．５μＬ(１０ｎｇ)、変異導入用プライマー２０μＬ（１μＭ）、対向プライマー２０μＬ（１μＭ）、１０倍濃度のＰＣＲ用緩衝液１０μＬ、１０ｍＭデオキシヌクレオチド３リン酸(ｄＮＴＰ)混液８μＬ、ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡポリメラーゼ０．５μＬ(２．５ｕｎｉｔｓ、Ｔａｋａｒａ)及び脱イオン水３９．５μＬを混合した後、ｇｅｎｅ ａｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ９７００（Ａｍｅｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）でＰＣＲを行った。反応条件は、９４℃２分間の熱変性後、９４℃１分間、５６℃１分間、７２℃３０秒間（３０サイクル）及び７２℃１分間で行った。得られたＰＣＲ産物をＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ ｇｅｌ ｂａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｍｅｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で精製後（４３．５μＬ）、５．５μＬの１０倍濃度のリン酸化用緩衝液及びポリヌクレオチドキナーゼ１μＬ(１０ｕｎｉｔｓ)を加え、３７℃で１時間リン酸化反応を行ない精製（５０μＬ）した。リン酸化されたＰＣＲ産物２５μＬに、鋳型プラスミドを２μＬ(２０ｎｇ)、１０倍濃度のＰＣＲ用緩衝液１０μＬ、１０ ｍＭ ｄＮＴＰ混液８μＬ、ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡポリメラー１μＬ (５ｕｎｉｔｓ)及び脱イオン水５４μＬを混合した後、ＰＣＲを行った。反応条件は、９４℃、２分間の熱変性後、９４℃１分間、６０℃１分間、７２℃６分間（３０サイクル）及び７２℃１２分間で行った。
得られたＰＣＲ産物を精製後（４３．５μＬ）、５．５μＬの１０倍濃度のリン酸化用緩衝液及びポリヌクレオチドキナーゼ１μＬ (１０ｕｎｉｔｓ)を加え、３７℃で１時間リン酸化反応を行った後、エタノール沈澱（１０μＬ）した。回収された１０μＬのＤＮＡ溶液をｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ ｖｅｒ．２（Ｔａｋａｒａ）を用いて１６℃、１８時間ライゲーション反応を行い、自己閉環した後、再度エタノール沈殿して、ＤＮＡ混液を回収した。
【００６０】
実施例２ 形質転換法
実施例１で得られたＤＮＡ混液５μＬを用いて（Chang and Cohen, Mol.Gen.Gent., 168, 111-115,1979）によりＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＳＷ１２１４株に導入して形質転換体を取得した。即ち、宿主菌Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＳＷ１２１４株を５０ ｍＬのＬＢ培地中で３７℃で、約２時間振とう培養後(６００ｎｍにおける吸光度が０．４)、室温で遠心分離 (７０００ｒｐｍ、１５分間)により菌体を集め、５ｍＬのＳＭＭＰ[０．５Ｍ シュークロース、２０ｍＭ マレイン酸二ナトリウム、２０ｍＭ 塩化マグネシウム６水塩、３５％（ｗ／ｖ）ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｍｅｄｉｕｍ３（Ｄｉｆｃｏ）］に懸濁後、ＳＭＭＰ溶液に溶解した５００μＬのリゾチーム溶液 (３０ｍｇ／ｍＬ)を加え、３７℃で１時間保温した。保温終了後、室温で遠心分離 (２８００ｒｐｍ、１５分間)によりプロトプラストを集め、５ｍＬのＳＭＭＰに懸濁しプロトプラスト溶液を調製した。０．５ｍＬのプロトプラスト溶液に１０μＬのプラスミド溶液と１．５ｍＬの４０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ８０００、Ｓｉｇｍａ）を加え、緩やかに攪拌後、室温で２分間放置した後、直ちに５ｍＬのＳＭＭＰ溶液を混和し、室温で遠心分離 (２８００ｒｐｍ、１５分間)によりプロトプラストを集め、１ｍＬのＳＭＭＰ溶液に再懸濁した。プロトプラスト懸濁液を３７℃で９０分間振盪 (１２０ｒｐｍ)した後、テトラサイクリン（１５μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）を含むＤＭ３再生寒天培地[０．８％（ｗ／ｖ） 寒天（和光純薬）、０．５％コハク酸２ナトリウム６水塩、０．５％カザミノ酸テクニカル（Ｄｉｆｃｏ）、０．５％酵母エキス、０．３５％リン酸１カリウム、０．１５％リン酸２カリウム、０．５％グルコース、０．４％塩化マグネシウム６水塩、０．０１％牛血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）、０．５％カルボキメチルセルロース、０．００５％トリパンブルー（Ｍｅｒｃｋ）及びアミノ酸混液(ロイシン、メチオニン１０μg／ｍＬ)]上に塗布し、３０℃で７２時間培養して形質転換体を得た。ＤＭ３再生寒天平板培地上で、ハローを形成した形質転換体をテトラサイクリン（１５μｇ／ｍＬ）を含んだポリペプトン培地で、３０℃で１５時間振とう培養を行い、集菌後、ｍｉｃｒｏ ｐｒｅｐ ｐｌａｓｍｉｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｍｅｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によりプラスミドを回収、精製した。
【００６１】
実施例３ 塩基配列の決定
実施例２で取得したプラスミド中に挿入されたセルラーゼ遺伝子の塩基配列の確認は、３７７ＤＮＡシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行なった。
【００６２】
実施例４ セルラーゼ変異体の生産評価
宿主菌Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＳＷ１２１４株の培養は、３％（ｗ／ｖ）ポリペプトンＳ（日本製薬）、０．５％魚肉エキス（和光純薬）、０．０５％酵母エキス、０．１％リン酸１カリウム、０．０２％硫酸マグネシウム７水塩、テトラサイクリン（１５μｇ／ｍＬ）及び５％マルトースを含んだ培地（ＰＳＭ培地）を用いて、３０℃で７２時間行った。
【００６３】
各セルラーゼ変異体の培養上清中の活性を測定し、組換え野性型セルラーゼの培養液あたりの生産量を１００％とした時、Ｌｅｕ１０Ｇｌｎは１２０％、Ｉｌｅ１６Ａｓｎは１３９％、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏは１４０％、Ａｓｎ３３Ｈｉｓは１０５％、Ｐｈｅ３９Ａｌａは１１３％、Ｉｌｅ７６Ｈｉｓは１１２％、Ｍｅｔ１０９Ｌｅｕは１１２％、Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒは１２５％、Ｐｈｅ２６３Ｉｌｅは１３７％、Ｔｈｒ３０８Ａｌａは１０２％、Ａｓｎ４６２Ｔｈｒは１１６％、Ｌｙｓ４６６Ｌｅｕは１１０％、Ｖａｌ４６８Ａｌａは１２２％、Ｉｌｅ５５２Ｍｅｔは１３２％、Ｉｌｅ５６４Ｖａｌは１１３％、Ｓｅｒ６０８Ｉｌｅは１１０％であった。２重変異体Ｌｅｕ１０Ｇｌｎ＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏは１１７％、Ａｓｎ３３Ｈｉｓ＋Ｐｈｅ３９Ａｌａは１１８％、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ+Ｇｌｎ２４２Ａｌａは２０７％、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ+Ｇｌｎ２４２Ｐｈｅは１９６％、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ+Ｇｌｎ２４２Ｖａｌは１８７％、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒは１７５％、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ+Ｇｌｎ２４２Ｉｌｅは１７４％、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ+Ｇｌｎ２４２Ｇｌｙは１６０％、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ+Ｇｌｎ２４２Ｇｌｕは１５８％、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ+Ｇｌｎ２４２Ａｓｐは１４５％、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ+Ｇｌｎ２４２Ｔｈｒは１３４％、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ+Ｇｌｎ２４２Ｌｅｕは１２８％、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ+Ｇｌｎ２４２Ｍｅｔは１２５％及び、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ+Ｇｌｎ２４２Ｔｙｒは１１５％であった。３重変異体Ｌｅｕ１０Ｇｌｎ＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒは１６２％、Ｉｌｅ１６Ａｓｎ＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒは１０７％、４重変異体Ｌｅｕ１０Ｇｌｎ＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｉｌｅ７６Ｈｉｓ＋Ｌｙｓ４６６Ｌｅｕは１１３％、５重変異体Ｌｅｕ１０Ｇｌｎ＋Ｉｌｅ１６Ａｓｎ＋Ｉｌｅ７６Ｈｉｓ＋Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒ＋Ｌｙｓ４６６Ｌｅｕは１６３％と生産向上が認められた。
解析の結果、殆どの変異体における生産向上はタンパク質の分泌量の増加であることが明かとなった。その中において２４２位の置換体については基質であるカルボキメチルセルロース（ＣＭＣ）の分解反応に対する比活性の向上が認められた。即ち、野生型酵素の比活性を１００％とした場合、Ｇｌｎ２４２Ａｌａは、１４７％、Ｇｌｎ２４２Ｖａｌは、１５０％、Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒは、１２５％、Ｇｌｎ２４２Ｐｈｅは、１２８％、Ｇｌｎ２４２Ａｓｐは、１０７％、Ｇｌｎ２４２Ｇｌｕは、１０６％、Ｇｌｎ２４２Ｇｌｙは、１０５％とそれぞれ相対比活性の向上を認めた。さらに０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８）中における比活性も向上しており、Ｇｌｎ２４２Ａｌａは、１５０％、Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒは、１１０％、Ｇｌｎ２４２Ｖａｌは、１２３％、Ｇｌｎ２４２Ｐｈｅは、１１０％、Ｇｌｎ２４２Ａｓｐは１０８％、Ｇｌｎ２４２Ｇｌｕは１１４％と相対比活性の向上が認められた。尚、タンパク質量は、標準タンパク質として牛血清アルブミンを用い、プロテインアッセイキット（Ｂｉｏ―Ｒａｄ）にて定量した。
【００６４】
＜セルラーゼ活性測定法（３，５−ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）法＞
０．２ｍＬの０．５Ｍグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）、０．４ｍＬの２．５％（ｗ／ｖ）カルボキシメチルセルロース（Ａ０１ＭＣ；日本製紙）、０．３ｍＬの脱イオン水から成る反応液に０．１ｍＬの適当に希釈した酵素液を加え４０℃で２０分間反応させた後、１ｍＬのジニトロサリチル酸試薬（０．５％ジニトロサリチル酸、３０％ロッシェル塩、１．６％水酸化ナトリウム水溶液）を添加し、沸水中で５分間還元糖の発色を行った。氷水中で急冷し、４ｍＬの脱イオン水を加え５３５ｎｍにおける吸光度を測定し還元糖の生成量を求めた。尚、ブランクは酵素液を加えずに処理した反応液にジニトロサリチル酸試薬を加えた後、酵素液を添加し、同様に発色させたものを用意した。酵素１単位（１Ｕ）は、上記反応条件下において１分間に１μｍｏｌのグルコース相当の還元糖を生成する量とした。
【００６５】
実施例５
特開２００２−２６５９９９号公報に記載のＡ−１粒子、Ｃ−１粒子、及び香料からなる下記組成の粉末洗剤を調製し、これに本発明の変異アルカリセルラーゼを１３５００００Ｕ／ｋｇとなるように配合して、その洗浄力を調べた。
【００６６】
【表２】
【００６７】
＜洗浄力測定方法＞
（人工汚染布）
特開２００２−２６５９９９号公報に記載の洗浄力評価用人工汚染布を用いた。
（洗浄条件、洗浄方法及び評価法）
３０℃の硬水（CaCl2：55.42mg/L、MgCl2・6H2O：43.51mg/L）に洗剤を溶解し、０．０６６７質量％洗剤水溶液１Ｌを調製する。人工汚染布５枚を洗剤水溶液に添加し、３０℃にて１時間浸して置く。次いでターゴトメーターにて１００ｒｐｍ、３０℃で１０分間攪拌洗浄する。人工汚染布を流水下で濯いだ後、アイロンプレスし、反射率測定に供した。汚染前の原布及び洗浄前後の人工汚染布の５５０ｎｍにおける反射率を自記色彩計（島津製作所(株)製）にて測定し、次式によって洗浄率（％）を求め、５枚の測定平均値にて洗浄力を評価した。
【００６８】
【数１】
【００６９】
（評価結果）
この結果、本発明の変異アルカリセルラーゼを配合した洗剤による洗浄率は７１％であり、セルラーゼ無添加の洗剤の６４％に比べて７ポイント向上した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、衣料用洗剤等に配合可能な変異アルカリセルラーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
セルロースは地球上で最も豊富に存在するバイオマス資源である。斯かるセルラーゼを利用した技術のうち、衣料用洗剤への配合は、洗浄力を向上させるばかりでなく、洗剤のコンパクト化にも貢献して広く定着している。
【０００３】
セルラーゼは中酸性領域のみで作用する酵素であり、アルカリ性の衣料用洗剤液中で作用できるものではなかったが、掘越（特許文献１、非特許文献１等参照）によって好アルカリ性バチルス属細菌由来のアルカリセルラーゼが見出され、衣料用重質洗剤への応用が可能となった。そして、これまでに好アルカリ性バチルス属細菌が生産するアルカリセルラーゼ（特許文献２、特許文献３、特許文献４等参照）が開発され、衣料用洗剤へ配合されるに至っている。
【０００４】
近年、遺伝子工学の発展に伴い洗剤用酵素の生産も遺伝子組換えにより大量生産されるようになっているが、アルカリセルラーゼについても例外ではなく、既に数多くの遺伝子についてクローニング、塩基配列の決定がなされ、更に生産菌の変異育種や酵素をコードする遺伝子を改良するという技術の導入が行われている。
しかしながら、工業的レベルでの生産を考えた場合、その生産性は必ずしも満足できるものではなく、培地中に効率良く生産されるアルカリセルラーゼが求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特公昭５０−２８５１５号公報
【特許文献２】特公昭６０−２３１５８号公報
【特許文献３】特公平６−０３０５７８号公報
【特許文献４】米国特許第４９４５０５３号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Horikoshi & Akiba, Alkalophilic Microorganisms, Springer, Berlin, 1982
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、アルカリ性領域で良好に作用し、且つ分泌能が高く、または比活性が向上することで容易に大量生産が可能なアルカリセルラーゼを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、アルカリセルラーゼの特性を保持しつつ、効率良く培地中に生産できる新たな酵素の探索を行ったところ、配列番号１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列中の特定位置のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換した変異アルカリセルラーゼが高い分泌能を有する、あるいは比活性が向上することにより大量生産が可能であることを見出した。
【０００９】
すなわち本発明は、配列番号１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるセルラーゼについて、配列番号１の（ａ）１０位、（ｂ）１６位、（ｃ）２２位、（ｄ）３３位、（ｅ）３９位、（ｆ）７６位、（ｇ）１０９位、（ｈ）２４２位、（ｉ）２６３位、（ｊ）３０８位、（ｋ）４６２位、（ｌ）４６６位、（ｍ）４６８位、（ｎ）５５２位、（ｏ）５６４位又は（ｐ）６０８位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換した変異アルカリセルラーゼ、及びそれをコードする遺伝子を提供するものである。
【００１０】
また本発明は、該遺伝子を含有するベクター、該ベクターを含有する形質転換体を提供するものである。
【００１１】
更に本発明は、上記変異アルカリセルラーゼを配合する洗浄剤組成物を提供するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の変異アルカリセルラーゼを用いれば、これまでに比べ高活性の培養液を得ることができるため、洗剤等工業用用途に必要なアルカリセルラーゼを大量に供給可能である。また、一定の酵素量を生産する場合においては培養回数を減少させることで、培養に要するエネルギー、培地成分量、培養中に生成される二酸化炭素量、並びに排水量を減少させることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】配列番号１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するセルラーゼのアミノ酸配列を整列させた図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の変異アルカリセルラーゼは、配列番号１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるセルラーゼを変異の対象となるセルラーゼ（以下、「親アルカリセルラーゼ」ともいう）とし、当該配列番号１の上記（ａ）〜（ｐ）位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換してなるものであり、これらは野生型の変異体或いは人為的に変異を施した変異体であってもよい。
【００１５】
親アルカリセルラーゼである配列番号１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアルカリセルラーゼには、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるアルカリセルラーゼ及び当該アミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアルカリセルラーゼが包含され、これらは野生型又は野生型の変異体であってもよく、その性質としては、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）法あるいはゲル濾過法により得られる分子量が８６,０００±２，０００であることが好ましく、カルボキシメチルセルロースを基質とした場合の最適反応pHは７．５〜９．５の間にあることが好ましく、最適反応温度が４０〜５０℃の範囲にあることが好ましい。また、カルボキシメチルセルロースのほかにリケナンを良好に分解することが好ましく、pH９で５０℃、１０分間の処理においても充分に安定であることが好ましい。特に好ましくは、分子量が８６，０００±２，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥあるいはSephacryl Ｓ２００カラムによるゲル濾過法）、最適反応pHはpH８．６〜９．０、最適反応温度が５０℃、カルボキシメチルセルロースのほかにリケナンを良好に分解し、pH９、５mM塩化カルシウム存在下で５０℃、１０分間の処理を行った場合９５％以上（３０℃、１０分間処理時の残存活性を１００％とする）の残存活性を認めるようなセルラーゼである。
【００１６】
「配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるアルカリセルラーゼ」としては、例えばＥｇｌ−２３７［バチルス エスピーＫＳＭ−Ｓ２３７（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８７５）由来、Hakamadaら，Biosci. Biotechnol. Biochem., 64, 2281-2289, 2000］が挙げられる。また、「配列番号１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアルカリセルラーゼ」としては、配列番号１で示されるアミノ酸配列と好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアルカリセルラーゼが挙げられ、例えば、バチルス エスピー １１３９株由来のアルカリセルラーゼ（Ｅｇｌ−１１３９）（Fukumori ら，J. Gen. Microbiol., 132, 2329-2335）（相同性９１．４％）、バチルス エスピー ＫＳＭ−６４株由来のアルカリセルラーゼ（Ｅｇｌ−６４）（Sumitomo ら，Biosci. Biotechnol. Biochem., 56, 872-877, 1992）（相同性９１．９％）、バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｎ１３１株由来のセルラーゼ（Ｅｇｌ−Ｎ１３１ｂ）（特願２０００−４７２３７号）（相同性９５．０％）が挙げられる。
尚、アミノ酸配列の相同性はＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮのマキシマムマッチングやサーチホモロジー等のプログラム（ソフトウェア開発）を用いて計算することができる。
【００１７】
上記配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる親アルカリセルラーゼの（ａ）〜（ｐ）位置におけるアミノ酸残基は、（ａ）１０位：ロイシン、（ｂ）１６位：イソロイシン、（ｃ）２２位：セリン、（ｄ）３３位：アスパラギン、（ｅ）３９位：フェニルアラニン、（ｆ）７６位：イソロイシン、（ｇ）１０９位：メチオニン、（ｈ）２４２位：グルタミン、（ｉ）２６３位：フェニルアラニン、（ｊ）３０８位：スレオニン、（ｋ）４６２位：アスパラギン、（ｌ）４６６位：リジン、（ｍ）４６８位：バリン、（ｎ）５５２位：イソロイシン、（ｏ）５６４位：イソロイシン、（ｐ）６０８位：セリンである。
【００１８】
また、配列番号１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる親アルカリセルラーゼにおいては、配列番号１の上記（ａ）〜（ｐ）位に相当する位置のアミノ酸残基は、それぞれ（ａ）位：ロイシン、（ｅ）位：フェニルアラニン、（ｆ）位：イソロイシン、（ｈ）位：グルタミン、（ｉ）位：フェニルアラニン、（ｋ）位：アスパラギン、（ｌ）位：リジン、（ｍ）位：バリン、（ｎ）位：イソロイシンであるものが好ましく、更にこれに加えて（ｂ）位：イソロイシン、（ｃ）位：セリンであるものが好ましく、更にこれに加えて（ｄ）位：アスパラギン、（ｇ）位：メチオニン、（ｊ）位：スレオニン、（ｏ）位：イソロイシン、（ｐ）位：セリンであるものが好ましい。
【００１９】
従って、配列番号１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる親アルカリセルラーゼの中で好ましいものとしては、上述した酵素学的性質を有するもの（段落〔００１２〕）及び／又は配列番号１で示されるアミノ酸配列と好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるものであって、更に配列番号１の（ａ）〜（ｐ）位に相当する位置のアミノ酸残基が上記（段落〔００１５〕）のものであるセルラーゼが挙げられ、特に当該酵素学的性質を有し（段落〔００１２〕）、配列番号１に示すアミノ酸配列と好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ配列番号１の（ａ）〜（ｐ）位に相当する位置のアミノ酸残基が上記（段落〔００１５〕）のものであるセルラーゼが好ましい。
【００２０】
そして、本発明の変異アルカリセルラーゼは、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるセルラーゼを親アルカリセルラーゼとする場合には、当該（ａ）〜（ｐ）位置のいずれかのアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換したものであり、配列番号１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるセルラーゼ（配列番号１で示されるアルカリセルラーゼを除く）を親アルカリセルラーゼとする場合には、配列番号１の上記（ａ）〜（ｐ）位に相当する位置のいずれかのアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換したものである。
【００２１】
斯かる他のアミノ酸残基としては、（ａ）位置については、グルタミン、アラニン、プロリン又はメチオニン、特にグルタミンであるのが好ましく、（ｂ）位置については、アスパラギン又はアルギニン、特にアスパラギンであるのが好ましく、（ｃ）位置についてはプロリンであるのが好ましく、（ｄ）位置についてはヒスチジンであるのが好ましく、（ｅ）位置については、アラニン、スレオニン又はチロシン、特にアラニンであるのが好ましく、（ｆ）位置については、ヒスチジン、メチオニン、バリン、スレオニン又はアラニン、特にヒスチジンであるのが好ましく、（ｇ）位置については、イソロイシン、ロイシン、セリン又はバリン、特にイソロイシンであるのが好ましく、（ｈ）位置についてアラニン、フェニルアラニン、バリン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ロイシン、イソロイシン、チロシン、スレオニン、メチオニン又はグリシン、特にアラニン、フェニルアラニン、セリンであるのが好ましく、（ｉ）位置についてはイソロイシン、ロイシン、プロリン又はバリン、特にイソロイシンであるのが好ましく、（ｊ）位置については、アラニン、セリン、グリシン又はバリン、特にアラニンであるのが好ましく、（ｋ）位置については、スレオニン、ロイシン、フェニルアラニン又はアルギニン、特にスレオニンであるのが好ましく、（ｌ）位置については、ロイシン、アラニン又はセリン、特にロイシンであるのが好ましく、（ｍ）位置については、アラニン、アスパラギン酸、グリシン又はリジン、特にアラニンであるのが好ましく、（ｎ）位置については、メチオニンであるのが好ましく、（ｏ）位置については、バリン、スレオニン又はロイシン、特にバリンであるのが好ましく、（ｐ）位置については、イソロイシン又はアルギニン、特にイソロイシンであるのが好ましい。
【００２２】
また、「相当する位置のアミノ酸残基」を特定する方法としては、例えばリップマン−パーソン法等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較し、各アルカリセルラーゼのアミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の相同性を与えることにより行うことができる。セルラーゼのアミノ酸配列をこのような方法で整列させることにより、アミノ酸配列中にある挿入、欠失にかかわらず、相同アミノ酸残基の各セルラーゼにおける配列中の位置を決めることが可能である（図１）。相同位置は、三次元構造中で同位置に存在すると考えられ、対象のセルラーゼの特異的機能に関して類似した効果を有することが推定できる。
【００２３】
配列番号１に示すアルカリセルラーゼ（Ｅｇｌ−２３７）の（ａ）１０位、（ｂ）１６位、（ｃ）２２位、（ｄ）３３位、（ｅ）３９位、（ｆ）７６位、（ｇ）１０９位、（ｈ）２４２位、（ｉ）２６３位、（ｊ）３０８位、（ｋ）４６２位、（ｌ）４６６位、（ｍ）４６８位、（ｎ）５５２位、（ｏ）５６４位、（ｐ）６０８位に相当する位置及びアミノ酸番号の具体例を配列番号１と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる他のアルカリセルラーゼについて示す。
【００２４】
【表１】
【００２５】
斯かるアミノ酸残基の置換は、酵素活性及び酵素特性が変化しない限り２個所以上が同時になされていてもよい。２個所以上が同時になされた場合の好ましい具体例を以下に示す。尚、以下の表記ではアミノ酸を３文字表記とし、「＋」は一ヶ所の置換に対し付加された置換を表し、「／」については表記したいずれのアミノ酸を使用しても良いことを示している。
【００２６】
例えば、２重置換体の例としては、Ｌｅｕ１０（Ｇｌｎ／Ａｌａ／Ｐｒｏ／Ｍｅｔ）＋Ｉｌｅ１６（Ａｓｎ／Ａｒｇ）、Ｉｌｅ１６（Ａｓｎ／Ａｒｇ）＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ、Ｌｅｕ１０（Ｇｌｎ／Ａｌａ／Ｐｒｏ／Ｍｅｔ）＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ、Ａｓｎ３３Ｈｉｓ＋Ｐｈｅ３９（Ｔｈｒ／Ｔｙｒ／Ａｌａ）、Ｌｅｕ１０（Ｇｌｎ／Ａｌａ／Ｐｒｏ／Ｍｅｔ）＋Ｇｌｎ２４２（Ｓｅｒ／Ａｌａ／Ｐｈｅ／Ｖａｌ／Ａｓｐ／Ｇｌｕ／Ｇｌｙ）、Ｉｌｅ１６（Ａｒｇ／Ａｓｎ）＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ+Ｇｌｎ２４２（Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ｐｈｅ／Ｖａｌ／Ｉｌｅ／Ｇｌｙ／Ｇｌｕ／Ａｓｐ／Ｔｈｒ／Ｌｅｕ／Ｍｅｔ／Ｔｙｒ）、Ｇｌｎ２４２（Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ｐｈｅ／Ｖａｌ／Ｉｌｅ／Ｇｌｙ／Ｇｌｕ／Ａｓｐ／Ｔｈｒ／Ｌｅｕ／Ｍｅｔ／Ｔｙｒ）＋Ｐｈｅ２６３（Ｉｌｅ／Ｌｅｕ／Ｐｒｏ／Ｖａｌ）、Ｌｅｕ１０（Ｇｌｎ／Ａｌａ／Ｐｒｏ／Ｍｅｔ）＋Ｔｈｒ３０８（Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ｇｌｙ／Ｖａｌ）、Ｉｌｅ１６（Ａｓｎ／Ａｒｇ）＋Ａｓｎ４６２（Ｔｈｒ／Ｌｅｕ／Ｐｈｅ／Ａｒｇ）、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｖａｌ４６８（Ａｌａ／Ａｓｐ／Ｇｌｙ／Ｌｙｓ）、Ａｓｎ３３Ｈｉｓ＋Ｉｌｅ５５２Ｍｅｔ、Ａｓｎ３３ＨｉｓＩｌｅ５６４（Ｖａｌ／Ｔｈｒ／Ｌｅｕ）、Ｇｌｎ２４２（Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ｐｈｅ／Ｖａｌ／Ｉｌｅ／Ｇｌｙ／Ｇｌｕ／Ａｓｐ／Ｔｈｒ／Ｌｅｕ／Ｍｅｔ／Ｔｙｒ）＋Ｓｅｒ６０８（Ｉｌｅ／Ａｒｇ）等が好ましく、Ｌｅｕ１０Ｇｌｎ＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ、Ａｓｎ３３Ｈｉｓ＋Ｐｈｅ３９Ａｌａ、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｇｌｎ２４２Ａｌａ、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｇｌｎ２４２Ｐｈｅ、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒが特に好ましい。
【００２７】
３重置換体の例としては、Ｌｅｕ１０（Ｇｌｎ／Ａｌａ／Ｐｒｏ／Ｍｅｔ）＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｇｌｎ２４２（Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ｐｈｅ／Ｖａｌ／Ｉｌｅ／Ｇｌｙ／Ｇｌｕ／Ａｓｐ／Ｔｈｒ／Ｌｅｕ／Ｍｅｔ／Ｔｙｒ）、Ｉｌｅ１６（Ａｓｎ／Ａｒｇ）＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｇｌｎ２４２（Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ｐｈｅ／Ｖａｌ／Ｉｌｅ／Ｇｌｙ／Ｇｌｕ／Ａｓｐ／Ｔｈｒ／Ｌｅｕ／Ｍｅｔ／Ｔｙｒ）、Ｉｌｅ７６（Ｈｉｓ／Ｍｅｔ／Ｖａｌ／Ｔｈｒ／Ａｌａ）＋Ｇｌｎ２４２（Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ｐｈｅ／Ｖａｌ／Ｉｌｅ／Ｇｌｙ／Ｇｌｕ／Ａｓｐ／Ｔｈｒ／Ｌｅｕ／Ｍｅｔ／Ｔｙｒ）＋Ｌｙｓ４６６（Ｌｅｕ／Ａｌａ／Ｓｅｒ）等が好ましく、Ｌｅｕ１０Ｇｌｎ＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｇｌｎ２４２Ａｌａ、Ｉｌｅ１６Ａｓｎ＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒ、Ｉｌｅ１６Ａｓｎ＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｇｌｎ２４２Ｐｈｅが特に好ましい。
【００２８】
４重置換体の例としては、Ｌｅｕ１０（Ｇｌｎ／Ａｌａ／Ｐｒｏ／Ｍｅｔ）＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｉｌｅ７６（Ｈｉｓ／Ｍｅｔ／Ｖａｌ／Ｔｈｒ／Ａｌａ）＋Ｌｙｓ４６６（Ｌｅｕ／Ａｌａ／Ｓｅｒ）、Ｌｅｕ１０（Ｇｌｎ／Ａｌａ／Ｐｒｏ／Ｍｅｔ）＋Ｉｌｅ１６（Ａｓｎ／Ａｒｇ）＋Ｉｌｅ７６（Ｈｉｓ／Ｍｅｔ／Ｖａｌ／Ｔｈｒ／Ａｌａ）＋Ｌｙｓ４６６（Ｌｅｕ／Ａｌａ／Ｓｅｒ）、Ｉｌｅ１６（Ａｓｎ／Ａｒｇ）＋Ｍｅｔ１０９（Ｉｌｅ／Ｌｅｕ／Ｓｅｒ／Ｖａｌ）＋Ｇｌｎ２４２（Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ｐｈｅ／Ｖａｌ／Ｉｌｅ／Ｇｌｙ／Ｇｌｕ／Ａｓｐ／Ｔｈｒ／Ｌｅｕ／Ｍｅｔ／Ｔｙｒ）＋Ｉｌｅ５６４（Ｖａｌ／Ｔｈｒ／Ｌｅｕ）等が好ましく、Ｌｅｕ１０Ｇｌｎ＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｉｌｅ７６Ｈｉｓ＋Ｌｙｓ４６６Ｌｅｕ、Ｌｅｕ１０Ｇｌｎ＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｇｌｎ２４２Ａｌａ＋Ｌｙｓ４６６Ｌｅｕ、Ｌｅｕ１０Ｇｌｎ＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒ＋Ｌｙｓ４６６Ｌｅｕが特に好ましい。
【００２９】
５重置換体の例としては、Ｌｅｕ１０（Ｇｌｎ／Ａｌａ／Ｐｒｏ／Ｍｅｔ）＋Ｉｌｅ１６（Ａｓｎ／Ａｒｇ）＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｉｌｅ７６（Ｈｉｓ／Ｍｅｔ／Ｖａｌ／Ｔｈｒ／Ａｌａ）＋Ｌｙｓ４６６（Ｌｅｕ／Ａｌａ／Ｓｅｒ）、Ｉｌｅ１６（Ａｓｎ／Ａｒｇ）＋Ｇｌｎ２４２（Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ｐｈｅ／Ｖａｌ／Ｉｌｅ／Ｇｌｙ／Ｇｌｕ／Ａｓｐ／Ｔｈｒ／Ｌｅｕ／Ｍｅｔ／Ｔｙｒ）＋Ｔｈｒ３０８（Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ｇｌｙ／Ｖａｌ）＋Ｉｌｅ５５２Ｍｅｔ＋Ｓｅｒ６０８（Ｉｌｅ／Ａｒｇ）等が好ましく、Ｌｅｕ１０Ｇｌｎ＋Ｉｌｅ１６Ａｓｎ＋Ｉｌｅ７６Ｈｉｓ＋Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒ＋Ｌｙｓ４６６Ｌｅｕ、Ｌｅｕ１０Ｇｌｎ＋Ｉｌｅ１６Ａｓｎ＋Ｉｌｅ７６Ｈｉｓ＋Ｇｌｎ２４２Ａｌａ＋Ｌｙｓ４６６Ｌｅｕが特に好ましい。
また、更にそれ以上の多重置換、例えば６〜１６置換体でもよい。
【００３０】
また、本発明の変異アルカリセルラーゼには、上記（ａ）〜（ｐ）位置に相当する位置のいずれかのアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換したもののみならず、アルカリセルラーゼ活性を失わない限り、該アミノ酸配列中の他の位置において１〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は付加されたものも包含する。
【００３１】
本発明の変異アルカリセルラーゼは、例えば以下の方法により得ることができる。
すなわち、クローニングされた親アルカリセルラーゼ（例えば配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するアルカリセルラーゼ）をコードする遺伝子（配列番号２）に対して置換（以下、「変異」ともいう）を施し、得られた変異遺伝子を用いて適当な宿主を形質転換し、当該組換え宿主を培養し、培養物から採取することにより得られる。
【００３２】
親アルカリセルラーゼをコードする遺伝子のクローニングは、一般的な遺伝子組換え技術を用いればよく、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＫＳＭ−Ｓ２３７の染色体より、ショットガン法やＰＣＲ法により取得できる。
【００３３】
親アルカリセルラーゼをコードする遺伝子の変異手段としては、一般的に行われているランダム変異や部異特異的変異の方法がいずれも採用できる。より具体的には、例えばのSite-Directed Mutagenesis System Mutan-Super Express Kmキット(Ｔａｋａｒａ)等を用いて行うことができる。また、リコンビナントＰＣＲ（polymerase chain reaction）法（PCR protocols, Academic press, New York, 1990）を用いることによって、遺伝子の任意の配列を他の遺伝子の該任意の配列に相当する配列と置換することが可能である。
【００３４】
得られた変異遺伝子を用いた本発明変異アルカリセルラーゼの生産は、宿主菌体内で複製維持が可能であり、該酵素を安定に発現させることができ、該遺伝子を安定に保持できるベクターに当該遺伝子を組込み、得られた組換えベクターを用いて宿主菌を形質転換することにより行えばよい。
【００３５】
斯かるベクターとしては大腸菌を宿主とする場合、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（ヤクルト本社製）等が挙げられ、枯草菌を宿主にする場合、ｐＵＢ１１０、ｐＨＳＰ６４（Sumitomoら、 Biosci. Biotechnol,Biocem., 59, 2172-2175, 1995）あるいはｐＨＹ３００ＰＬＫ等が挙げられる。
【００３６】
宿主菌を形質転換するには、プロトプラスト法、コンピテントセル法、エレクトロポレーション法等を用いればよく、宿主菌としては、例えばバチルス属（枯草菌）等のグラム陽性菌、大腸菌等のグラム陰性菌、ストレプトマイセス属等の放線菌、サッカロマイセス属等の酵母あるいはアスペルギルス属等のカビが挙げられる。
【００３７】
得られた形質転換体は、資化しうる炭素源、窒素源、金属塩、ビタミン等を含む培地を用いて適当な条件下で培養すればよく、得られた培養液から、一般的な方法によって酵素の分取や精製を行い、凍結乾燥、噴霧乾燥、結晶化により必要な酵素形態を得ることができる。
【００３８】
かくして得られる本発明の変異アルカリセルラーゼは、親アルカリセルラーゼの性質を保持しつつ、且つ形質転換体での酵素の分泌能が向上している、あるいは酵素自体の比活性の向上をもたらすものである。
【００３９】
ここで酵素の「分泌の向上」とは、親アルカリセルラーゼと同一の条件下において（例えば３％（ｗ／ｖ）ポリペプトンＳ（日本製薬製）、０．５％魚肉エキス（和光純薬製）、０．０５％酵母エキス、０．１％リン酸１カリウム、０．０２％硫酸マグネシウム７水塩、テトラサイクリン（１５μｇ／ｍＬ）及び５％マルトースを含んだ培地（ＰＳＭ培地）を用いて、３０℃で７２時間振とう培養する）生産した変異アルカリセルラーゼについて培養上清中の酵素活性量、タンパク質量を測定した場合、親アルカリセルラーゼのそれに対し、一定量以上の活性量、タンパク質量を示すこと、例えば親アルカリセルラーゼの５％以上、望ましくは１０％以上、さらに望ましくは２０％以上の活性量またはタンパク質量の増大が認められるものとすることができる。
特に、比活性などの変化が認められなければ活性量とタンパク量の比は親アルカリセルラーゼと変異アルカリセルラーゼでは一定の値をとると考えられることから、活性量またはタンパク質量のどちらか一方を測定しても構わない。
【００４０】
従って、本発明の変異アルカリセルラーゼは、各種洗剤組成物配合用酵素として有用である。
洗浄剤組成物中への本発明変異アルカリセルラーゼの配合量は、当該セルラーゼが活性を示す量であれば特に制限されないが、洗浄剤組成物あたり、０．０００１〜５質量％であるのが好ましく、０．００００５〜２．５質量％がより好ましく、０．００１〜２質量％が更に好ましい。また、酵素造粒物として用いる場合の造粒物中での含有量は、０．０１〜５０質量％であるのが好ましく、０．０５〜２５質量％がより好ましく、０．１〜２０質量％が更に好ましい。
【００４１】
本発明の洗浄剤組成物は、上記アルカリセルラーゼ（造粒物）の他に、界面活性剤及びビルダーを含有するのが好ましい。界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤及び陽イオン性界面活性剤の１種又は組み合わせを挙げることができるが、好ましくは陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤である。
【００４２】
陰イオン性界面活性剤としては、炭素数１０〜１８のアルコールの硫酸エステル塩、炭素数８〜２０のアルコールのアルコキシル化物の硫酸エステル塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル硫酸エステル塩、パラフィンスルホン酸塩、α−オレフィンスルホン酸塩、α−スルホ脂肪酸塩、α−スルホ脂肪酸アルキルエステル塩又は脂肪酸塩が好ましい。本発明では特に、アルキル鎖の炭素数が１０〜１４、より好ましくは１２〜１４の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩が好ましい。これらの塩の対イオンとしては、アルカリ金属塩やアミン類が好ましく、特にナトリウム及び／又はカリウム、モノエタノールアミン、ジエタノールアミンが好ましい。
【００４３】
非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシアルキレンアルキル（炭素数８〜２０）エーテル、アルキルポリグリコシド、ポリオキシアルキレンアルキル（炭素数８〜２０）フェニルエーテル、ポリオキシアルキレンソルビタン脂肪酸（炭素数８〜２２）エステル、ポリオキシアルキレングリコール脂肪酸（炭素数８〜２２）エステル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックポリマーが好ましい。特に、非イオン性界面活性剤としては、炭素数１０〜１８のアルコールにエチレンオキシドやプロピレンオキシド等のアルキレンオキシドを４〜２０モル付加した〔ＨＬＢ値（グリフィン法で算出）が１０．５〜１５．０、好ましくは１１．０〜１４．５であるような〕ポリオキシアルキレンアルキルエーテルが好ましい。
【００４４】
界面活性剤の合計量は、洗浄力及び溶解性の点から、洗浄剤組成物中１０〜６０質量％であるのが好ましく、１５〜５０質量％がより好ましく、２０〜４５質量％が更に好ましい。
陰イオン性界面活性剤は、特に粉末洗浄剤組成物中１〜６０質量％であるのが好ましく、１〜５０質量％がより好ましく、３〜４０質量％が特に好ましい。
非イオン性界面活性剤は、特に粉末洗浄剤組成物中０．５〜４５質量％であるのが好ましく、１〜３５質量％がより好ましく、３〜２５質量％が特に好ましい。
【００４５】
陰イオン性界面活性剤と非イオン性界面活性剤は、単独で用いることもできるが、好ましくは混合して用いるのが良い。また、両性界面活性剤や陽イオン性界面活性剤を目的に合わせ併用することもできる。
【００４６】
ビルダーとしては、そのもの自身では洗浄力がないか、又はあってもそれ程著しくないが、洗浄剤組成物に配合されると著しく洗浄性能を向上させ、特に洗浄剤の主要成分である界面活性剤の洗浄能力を向上させるものが挙げられ、作用として、多価金属陽イオンの捕捉作用、汚れ分散作用及びアルカリ緩衝作用の少なくとも１つの作用を有するものである。
斯かるビルダーとしては、例えば水溶性無機化合物、水不溶性無機化合物、有機化合物等が挙げられる。
【００４７】
水溶性無機化合物としては、リン酸塩（トリポリリン酸塩、ピロリン酸塩、メタリン酸塩、リン酸三ナトリウム等）、ケイ酸塩、炭酸塩、硫酸塩等が挙げられる。中でも３つの作用を全て有する点でリン酸塩が好ましい。
【００４８】
水不溶性無機化合物としては、アルミノケイ酸塩（Ａ型ゼオライト、Ｐ型ゼオライト、Ｘ型ゼオライト、非晶質アルミノケイ酸塩等）、結晶性ケイ酸塩等が挙げられる。中でも粒子径３μｍ以下（より好ましくは１μｍ以下）のＡ型ゼオライトが好ましい。
【００４９】
有機化合物としては、カルボン酸塩（アミノカルボン酸塩、ヒドロキシアミノカルボン酸塩、ヒドロキシカルボン酸塩、シクロカルボン酸塩、マレイン酸誘導体、シュウ酸塩等）、有機カルボン酸（塩）ポリマー（アクリル酸重合体及び共重合体、多価カルボン酸重合体及び共重合体、グリオキシル酸重合体、多糖類及びこれらの塩等）等が挙げられる。中でも有機カルボン酸（塩）ポリマーが好ましい。
【００５０】
前記ビルダーの塩において、対イオンとしては、アルカリ金属塩、アミン類が好ましく、特にナトリウム及び／又はカリウム、モノエタノールアミン、ジエタノールアミンが好ましい。
【００５１】
これらのビルダーは、単独で又は２種以上を併用することができるが、水溶性無機化合物を含有するのが好ましく、水溶性無機化合物及び有機化合物を併用するのがより好ましく、水溶性無機化合物、有機化合物及び水不溶性無機化合物を併用するのが更に好ましい。
【００５２】
ビルダーの合計量は、洗浄性能の点から、洗浄剤組成物中２０〜８０質量％であるのが好ましく、３０〜７０質量％がより好ましく、３５〜６０質量％が更に好ましい。
また、水溶性無機化合物ビルダーは、特に粉末洗浄剤組成物中１０〜５０質量％であるのが好ましく、１５〜４５質量％がより好ましく、２０〜４０質量％が更に好ましい。
水不溶性無機化合物ビルダーは、特に粉末洗浄剤組成物中５〜５０質量％であるのが好ましく、１０〜４５質量％がより好ましく、１５〜４０質量％が更に好ましい。
有機化合物ビルダーは、特に粉末洗浄剤組成物中０．１〜２０質量％であるのが好ましく、０．３〜１５質量％がより好ましく、０．５〜１０質量％が更に好ましい。
【００５３】
本発明の洗浄剤組成物には、上記成分の他に、漂白剤（過炭酸塩、過ホウ酸塩、漂白活性化剤等）、再汚染防止剤（カルボキシメチルセルロース等）、柔軟化剤（ジアルキル型第四級アンモニウム塩、粘土鉱物等）、還元剤（亜硫酸塩等）、蛍光増白剤（ビフェニル型、アミノスチルベン型等）、泡コントロール剤（シリコーン等）、香料等の添加剤を含有させることができる。
【００５４】
また、本発明の洗浄剤組成物には、本発明のアルカリセルラーゼ以外に様々な酵素を併用することもできる。例えば、加水分解酵素、酸化酵素、還元酵素、トランスフェラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、シンテターゼ等である。このうち、本発明以外のセルラーゼ、プロテアーゼ、ケラチナーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、プルラナーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、グルコシダーゼ、グルカナーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ等が好ましく、特にプロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、リパーゼが好ましい。
【００５５】
本発明の洗浄剤組成物は、上記方法で得られた本発明変異アルカリセルラーゼ及び上記公知の洗浄成分を組み合わせて常法に従い製造することができる。洗剤の形態は用途に応じて選択することができ、例えば液体、粉体、顆粒、ペースト、固形等にすることができる。
かくして得られる本洗浄剤組成物は、衣料用粉末洗浄剤、衣料用液体洗浄剤、自動食器洗浄機用洗剤、木綿繊維改質用洗浄剤等として使用することができる。
【実施例】
【００５６】
実施例１ アルカリセルラーゼ遺伝子の変異体作製
アルカリセルラーゼの生産量を向上させる変異体取得のため、先ずアルカリセルラーゼ遺伝子領域内の変異ＰＣＲ法によるランダム変異を行い、変異体のライブラリーを構築した。得られた変異体の中からアルカリセルラーゼの生産量向上に有効な変異体を選別し、変異箇所を塩基配列解析で決定した後、混合プライマーを用いて変異箇所のランダム変異及び部位特異的変異により多重変異体を構築して生産量の向上を試みた。鋳型ＤＮＡとして大腸菌−枯草菌のシャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ中に組換えられたＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＫＳＭ−Ｓ２３７株由来のアルカリセルラーゼ遺伝子を用いた。
【００５７】
ランダム変異の混合プライマーには、Ｉｌｅ１６Ｘ（プライマー１、配列番号３、Ｘは他のアミノ酸）、Ｐｈｅ３９Ｘ（プライマー２、配列番号４）、Ｉｌｅ７６Ｘ（プライマー３、配列番号５）、Ｍｅｔ１０９Ｘ（プライマー４、配列番号６）、Ｐｈｅ２６３Ｘ（プライマー５、配列番号７）、Ｔｈｒ３０８Ｘ（プライマー６、配列番号８）、Ａｓｎ４６２Ｘ（プライマー７、配列番号９）、Ｌｙｓ４６６Ｘ（プライマー８、配列番号１０）、Ｖａｌ４６８Ｘ（プライマー９、配列番号１１）、Ｉｌｅ５５２Ｘ（プライマー１０、配列番号１２）、Ｉｌｅ５６４Ｘ（プライマー１１、配列番号１３）及びＳｅｒ６０８Ｘ（プライマー１２、配列番号１４）を用いた。
【００５８】
また、部位特異的変異Ｌｅｕ１０Ｇｌｎ、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ、Ａｓｎ３３Ｈｉｓ、Ｐｈｅ３９Ａｌａ、Ｍｅｔ１０９Ｉｌｅ、Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒ、Ｇｌｎ２４２Ａｌａ、Ｇｌｎ２４２Ｐｈｅ、Ｇｌｎ２４２Ｖａｌ、Ｇｌｎ２４２Ａｓｐ、Ｇｌｎ２４２Ｇｌｕ、Ｇｌｎ２４２Ｇｌｙ、Ｇｌｎ２４２Ｉｌｅ、Ｇｌｎ２４２Ｌｅｕ、Ｇｌｎ２４２Ｍｅｔ、Ｇｌｎ２４２Ｔｙｒ、Ｐｈｅ２６３Ｉｌｅ、Ｔｈｒ３０８Ａｌａ及びＩｌｅ５５２Ｍｅｔを導入する為の変異導入用プライマーＬｅｕ１０Ｇｌｎ（プライマー１３、配列番号１５）、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ（プライマー１４、配列番号１６）、Ａｓｎ３３Ｈｉｓ（プライマー１５、配列番号１７）、Ｐｈｅ３９Ａｌａ（プライマー１６、配列番号１８）、Ｍｅｔ１０９Ｉｌｅ（プライマー１７、配列番号１９）、Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒ（プライマー１８、配列番号２０）、Ｇｌｎ２４２Ａｌａ（プライマー１９、配列番号２１）、Ｇｌｎ２４２Ｐｈｅ（プライマー２０、配列番号２２）、Ｇｌｎ２４２Ｖａｌ（プライマー２１、配列番号２３）、Ｇｌｎ２４２Ａｓｐ（プライマー２２、配列番号２４）又はＧｌｎ２４２Ｇｌｕ（プライマー２２、配列番号２４）、Ｇｌｎ２４２Ｇｌｙ（プライマー２３、配列番号２５）、Ｇｌｎ２４２Ｉｌｅ（プライマー２０、配列番号２２）、Ｇｌｎ２４２Ｔｈｒ（プライマー２４、配列番号２６）、Ｇｌｎ２４２Ｌｅｕ（プライマー２５、配列番号２７）、Ｇｌｎ２４２Ｍｅｔ（プライマー２６、配列番号２８）、Ｇｌｎ２４２Ｔｙｒ（プライマー２７、配列番号２９）、Ｐｈｅ２６３Ｉｌｅ（プライマー２８、配列番号３０）、Ｔｈｒ３０８Ａｌａ（プライマー２９、配列番号３１）及びＩｌｅ５５２Ｍｅｔ（プライマー３０、配列番号３２）を用い、アルカリセルラーゼ遺伝子内に存在する適当な対向プライマーを構築して鋳型ＤＮＡと共に変異導入を行なった。
【００５９】
即ち、鋳型ＤＮＡプラスミド０．５μＬ(１０ｎｇ)、変異導入用プライマー２０μＬ（１μＭ）、対向プライマー２０μＬ（１μＭ）、１０倍濃度のＰＣＲ用緩衝液１０μＬ、１０ｍＭデオキシヌクレオチド３リン酸(ｄＮＴＰ)混液８μＬ、ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡポリメラーゼ０．５μＬ(２．５ｕｎｉｔｓ、Ｔａｋａｒａ)及び脱イオン水３９．５μＬを混合した後、ｇｅｎｅ ａｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ９７００（Ａｍｅｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）でＰＣＲを行った。反応条件は、９４℃２分間の熱変性後、９４℃１分間、５６℃１分間、７２℃３０秒間（３０サイクル）及び７２℃１分間で行った。得られたＰＣＲ産物をＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ ｇｅｌ ｂａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｍｅｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で精製後（４３．５μＬ）、５．５μＬの１０倍濃度のリン酸化用緩衝液及びポリヌクレオチドキナーゼ１μＬ(１０ｕｎｉｔｓ)を加え、３７℃で１時間リン酸化反応を行ない精製（５０μＬ）した。リン酸化されたＰＣＲ産物２５μＬに、鋳型プラスミドを２μＬ(２０ｎｇ)、１０倍濃度のＰＣＲ用緩衝液１０μＬ、１０ ｍＭ ｄＮＴＰ混液８μＬ、ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡポリメラー１μＬ (５ｕｎｉｔｓ)及び脱イオン水５４μＬを混合した後、ＰＣＲを行った。反応条件は、９４℃、２分間の熱変性後、９４℃１分間、６０℃１分間、７２℃６分間（３０サイクル）及び７２℃１２分間で行った。
得られたＰＣＲ産物を精製後（４３．５μＬ）、５．５μＬの１０倍濃度のリン酸化用緩衝液及びポリヌクレオチドキナーゼ１μＬ (１０ｕｎｉｔｓ)を加え、３７℃で１時間リン酸化反応を行った後、エタノール沈澱（１０μＬ）した。回収された１０μＬのＤＮＡ溶液をｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ ｖｅｒ．２（Ｔａｋａｒａ）を用いて１６℃、１８時間ライゲーション反応を行い、自己閉環した後、再度エタノール沈殿して、ＤＮＡ混液を回収した。
【００６０】
実施例２ 形質転換法
実施例１で得られたＤＮＡ混液５μＬを用いて（Chang and Cohen, Mol.Gen.Gent., 168, 111-115,1979）によりＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＳＷ１２１４株に導入して形質転換体を取得した。即ち、宿主菌Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＳＷ１２１４株を５０ ｍＬのＬＢ培地中で３７℃で、約２時間振とう培養後(６００ｎｍにおける吸光度が０．４)、室温で遠心分離 (７０００ｒｐｍ、１５分間)により菌体を集め、５ｍＬのＳＭＭＰ[０．５Ｍ シュークロース、２０ｍＭ マレイン酸二ナトリウム、２０ｍＭ 塩化マグネシウム６水塩、３５％（ｗ／ｖ）ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｍｅｄｉｕｍ３（Ｄｉｆｃｏ）］に懸濁後、ＳＭＭＰ溶液に溶解した５００μＬのリゾチーム溶液 (３０ｍｇ／ｍＬ)を加え、３７℃で１時間保温した。保温終了後、室温で遠心分離 (２８００ｒｐｍ、１５分間)によりプロトプラストを集め、５ｍＬのＳＭＭＰに懸濁しプロトプラスト溶液を調製した。０．５ｍＬのプロトプラスト溶液に１０μＬのプラスミド溶液と１．５ｍＬの４０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ８０００、Ｓｉｇｍａ）を加え、緩やかに攪拌後、室温で２分間放置した後、直ちに５ｍＬのＳＭＭＰ溶液を混和し、室温で遠心分離 (２８００ｒｐｍ、１５分間)によりプロトプラストを集め、１ｍＬのＳＭＭＰ溶液に再懸濁した。プロトプラスト懸濁液を３７℃で９０分間振盪 (１２０ｒｐｍ)した後、テトラサイクリン（１５μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）を含むＤＭ３再生寒天培地[０．８％（ｗ／ｖ） 寒天（和光純薬）、０．５％コハク酸２ナトリウム６水塩、０．５％カザミノ酸テクニカル（Ｄｉｆｃｏ）、０．５％酵母エキス、０．３５％リン酸１カリウム、０．１５％リン酸２カリウム、０．５％グルコース、０．４％塩化マグネシウム６水塩、０．０１％牛血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）、０．５％カルボキメチルセルロース、０．００５％トリパンブルー（Ｍｅｒｃｋ）及びアミノ酸混液(ロイシン、メチオニン１０μg／ｍＬ)]上に塗布し、３０℃で７２時間培養して形質転換体を得た。ＤＭ３再生寒天平板培地上で、ハローを形成した形質転換体をテトラサイクリン（１５μｇ／ｍＬ）を含んだポリペプトン培地で、３０℃で１５時間振とう培養を行い、集菌後、ｍｉｃｒｏ ｐｒｅｐ ｐｌａｓｍｉｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｍｅｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によりプラスミドを回収、精製した。
【００６１】
実施例３ 塩基配列の決定
実施例２で取得したプラスミド中に挿入されたセルラーゼ遺伝子の塩基配列の確認は、３７７ＤＮＡシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行なった。
【００６２】
実施例４ セルラーゼ変異体の生産評価
宿主菌Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＳＷ１２１４株の培養は、３％（ｗ／ｖ）ポリペプトンＳ（日本製薬）、０．５％魚肉エキス（和光純薬）、０．０５％酵母エキス、０．１％リン酸１カリウム、０．０２％硫酸マグネシウム７水塩、テトラサイクリン（１５μｇ／ｍＬ）及び５％マルトースを含んだ培地（ＰＳＭ培地）を用いて、３０℃で７２時間行った。
【００６３】
各セルラーゼ変異体の培養上清中の活性を測定し、組換え野性型セルラーゼの培養液あたりの生産量を１００％とした時、Ｌｅｕ１０Ｇｌｎは１２０％、Ｉｌｅ１６Ａｓｎは１３９％、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏは１４０％、Ａｓｎ３３Ｈｉｓは１０５％、Ｐｈｅ３９Ａｌａは１１３％、Ｉｌｅ７６Ｈｉｓは１１２％、Ｍｅｔ１０９Ｌｅｕは１１２％、Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒは１２５％、Ｐｈｅ２６３Ｉｌｅは１３７％、Ｔｈｒ３０８Ａｌａは１０２％、Ａｓｎ４６２Ｔｈｒは１１６％、Ｌｙｓ４６６Ｌｅｕは１１０％、Ｖａｌ４６８Ａｌａは１２２％、Ｉｌｅ５５２Ｍｅｔは１３２％、Ｉｌｅ５６４Ｖａｌは１１３％、Ｓｅｒ６０８Ｉｌｅは１１０％であった。２重変異体Ｌｅｕ１０Ｇｌｎ＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏは１１７％、Ａｓｎ３３Ｈｉｓ＋Ｐｈｅ３９Ａｌａは１１８％、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ+Ｇｌｎ２４２Ａｌａは２０７％、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ+Ｇｌｎ２４２Ｐｈｅは１９６％、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ+Ｇｌｎ２４２Ｖａｌは１８７％、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒは１７５％、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ+Ｇｌｎ２４２Ｉｌｅは１７４％、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ+Ｇｌｎ２４２Ｇｌｙは１６０％、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ+Ｇｌｎ２４２Ｇｌｕは１５８％、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ+Ｇｌｎ２４２Ａｓｐは１４５％、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ+Ｇｌｎ２４２Ｔｈｒは１３４％、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ+Ｇｌｎ２４２Ｌｅｕは１２８％、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ+Ｇｌｎ２４２Ｍｅｔは１２５％及び、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ+Ｇｌｎ２４２Ｔｙｒは１１５％であった。３重変異体Ｌｅｕ１０Ｇｌｎ＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒは１６２％、Ｉｌｅ１６Ａｓｎ＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒは１０７％、４重変異体Ｌｅｕ１０Ｇｌｎ＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｉｌｅ７６Ｈｉｓ＋Ｌｙｓ４６６Ｌｅｕは１１３％、５重変異体Ｌｅｕ１０Ｇｌｎ＋Ｉｌｅ１６Ａｓｎ＋Ｉｌｅ７６Ｈｉｓ＋Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒ＋Ｌｙｓ４６６Ｌｅｕは１６３％と生産向上が認められた。
解析の結果、殆どの変異体における生産向上はタンパク質の分泌量の増加であることが明かとなった。その中において２４２位の置換体については基質であるカルボキメチルセルロース（ＣＭＣ）の分解反応に対する比活性の向上が認められた。即ち、野生型酵素の比活性を１００％とした場合、Ｇｌｎ２４２Ａｌａは、１４７％、Ｇｌｎ２４２Ｖａｌは、１５０％、Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒは、１２５％、Ｇｌｎ２４２Ｐｈｅは、１２８％、Ｇｌｎ２４２Ａｓｐは、１０７％、Ｇｌｎ２４２Ｇｌｕは、１０６％、Ｇｌｎ２４２Ｇｌｙは、１０５％とそれぞれ相対比活性の向上を認めた。さらに０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８）中における比活性も向上しており、Ｇｌｎ２４２Ａｌａは、１５０％、Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒは、１１０％、Ｇｌｎ２４２Ｖａｌは、１２３％、Ｇｌｎ２４２Ｐｈｅは、１１０％、Ｇｌｎ２４２Ａｓｐは１０８％、Ｇｌｎ２４２Ｇｌｕは１１４％と相対比活性の向上が認められた。尚、タンパク質量は、標準タンパク質として牛血清アルブミンを用い、プロテインアッセイキット（Ｂｉｏ―Ｒａｄ）にて定量した。
【００６４】
＜セルラーゼ活性測定法（３，５−ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）法＞
０．２ｍＬの０．５Ｍグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）、０．４ｍＬの２．５％（ｗ／ｖ）カルボキシメチルセルロース（Ａ０１ＭＣ；日本製紙）、０．３ｍＬの脱イオン水から成る反応液に０．１ｍＬの適当に希釈した酵素液を加え４０℃で２０分間反応させた後、１ｍＬのジニトロサリチル酸試薬（０．５％ジニトロサリチル酸、３０％ロッシェル塩、１．６％水酸化ナトリウム水溶液）を添加し、沸水中で５分間還元糖の発色を行った。氷水中で急冷し、４ｍＬの脱イオン水を加え５３５ｎｍにおける吸光度を測定し還元糖の生成量を求めた。尚、ブランクは酵素液を加えずに処理した反応液にジニトロサリチル酸試薬を加えた後、酵素液を添加し、同様に発色させたものを用意した。酵素１単位（１Ｕ）は、上記反応条件下において１分間に１μｍｏｌのグルコース相当の還元糖を生成する量とした。
【００６５】
実施例５
特開２００２−２６５９９９号公報に記載のＡ−１粒子、Ｃ−１粒子、及び香料からなる下記組成の粉末洗剤を調製し、これに本発明の変異アルカリセルラーゼを１３５００００Ｕ／ｋｇとなるように配合して、その洗浄力を調べた。
【００６６】
【表２】
【００６７】
＜洗浄力測定方法＞
（人工汚染布）
特開２００２−２６５９９９号公報に記載の洗浄力評価用人工汚染布を用いた。
（洗浄条件、洗浄方法及び評価法）
３０℃の硬水（CaCl2：55.42mg/L、MgCl2・6H2O：43.51mg/L）に洗剤を溶解し、０．０６６７質量％洗剤水溶液１Ｌを調製する。人工汚染布５枚を洗剤水溶液に添加し、３０℃にて１時間浸して置く。次いでターゴトメーターにて１００ｒｐｍ、３０℃で１０分間攪拌洗浄する。人工汚染布を流水下で濯いだ後、アイロンプレスし、反射率測定に供した。汚染前の原布及び洗浄前後の人工汚染布の５５０ｎｍにおける反射率を自記色彩計（島津製作所(株)製）にて測定し、次式によって洗浄率（％）を求め、５枚の測定平均値にて洗浄力を評価した。
【００６８】
【数１】
【００６９】
（評価結果）
この結果、本発明の変異アルカリセルラーゼを配合した洗剤による洗浄率は７１％であり、セルラーゼ無添加の洗剤の６４％に比べて７ポイント向上した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるセルラーゼについて、配列番号１の（ａ）１０位、（ｂ）１６位、（ｃ）２２位、（ｅ）３９位、（ｆ）７６位、（ｇ）１０９位、（ｉ）２６３位、（ｋ）４６２位、（ｌ）４６６位、（ｍ）４６８位、（ｎ）５５２位、（ｏ）５６４位又は（ｐ）６０８位の位置のアミノ酸残基が、
（ａ）位置：グルタミン
（ｂ）位置：アスパラギン
（ｃ）位置：プロリン
（ｅ）位置：アラニン
（ｆ）位置：ヒスチジン
（ｇ）位置：ロイシン
（ｉ）位置：イソロイシン
（ｋ）位置：スレオニン
（ｌ）位置：ロイシン
（ｍ）位置：アラニン
（ｎ）位置：メチオニン
（ｏ）位置：バリン
（ｐ）位置：イソロイシン
から選ばれたアミノ酸残基に置換された、親アルカリセルラーゼに比して分泌量が向上した変異アルカリセルラーゼ。
【請求項２】
配列番号１で示されるアミノ酸配列と９８％以上の相同性を有するセルラーゼについて、配列番号１の（ａ）１０位、（ｂ）１６位、（ｃ）２２位、（ｅ）３９位、（ｆ）７６位、（ｇ）１０９位、（ｉ）２６３位、（ｋ）４６２位、（ｌ）４６６位、（ｍ）４６８位、（ｎ）５５２位、（ｏ）５６４位又は（ｐ）６０８位に相当する位置のアミノ酸残基が、
（ａ）位置：グルタミン
（ｂ）位置：アスパラギン
（ｃ）位置：プロリン
（ｅ）位置：アラニン
（ｆ）位置：ヒスチジン
（ｇ）位置：ロイシン
（ｉ）位置：イソロイシン
（ｋ）位置：スレオニン
（ｌ）位置：ロイシン
（ｍ）位置：アラニン
（ｎ）位置：メチオニン
（ｏ）位置：バリン
（ｐ）位置：イソロイシン
から選ばれたアミノ酸残基に置換された、親アルカリセルラーゼに比して分泌量が向上した変異アルカリセルラーゼ。
【請求項３】
配列番号１におけるアミノ酸残基の置換が、Ｌｅｕ１０Ｇｌｎ、Ｉｌｅ１６Ａｓｎ、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ、Ｐｈｅ３９Ａｌａ、Ｉｌｅ７６Ｈｉｓ、Ｍｅｔ１０９Ｌｅｕ、Ｐｈｅ２６３Ｉｌｅ、Ａｓｎ４６２Ｔｈｒ、Ｌｙｓ４６６Ｌｅｕ、Ｖａｌ４６８Ａｌａ、Ｉｌｅ５５２Ｍｅｔ、Ｉｌｅ５６４Ｖａｌ、Ｓｅｒ６０８Ｉｌｅ、Ｌｅｕ１０Ｇｌｎ＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ、Ａｓｎ３３Ｈｉｓ＋Ｐｈｅ３９Ａｌａ、Ｌｅｕ１０Ｇｌｎ＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｉｌｅ７６Ｈｉｓ＋Ｌｙｓ４６６Ｌｅｕである請求項１又は２記載の変異アルカリセルラーゼ。
【請求項４】
請求項１〜３記載の変異アルカリセルラーゼをコードする遺伝子。
【請求項５】
請求項４記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項６】
請求項５記載の組換えベクターを含有する形質転換体。
【請求項７】
宿主が微生物である請求項６記載の形質転換体。
【請求項８】
請求項１〜３記載の変異アルカリセルラーゼを配合する洗浄剤組成物。
【請求項１】
配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるセルラーゼについて、配列番号１の（ａ）１０位、（ｂ）１６位、（ｃ）２２位、（ｅ）３９位、（ｆ）７６位、（ｇ）１０９位、（ｉ）２６３位、（ｋ）４６２位、（ｌ）４６６位、（ｍ）４６８位、（ｎ）５５２位、（ｏ）５６４位又は（ｐ）６０８位の位置のアミノ酸残基が、
（ａ）位置：グルタミン
（ｂ）位置：アスパラギン
（ｃ）位置：プロリン
（ｅ）位置：アラニン
（ｆ）位置：ヒスチジン
（ｇ）位置：ロイシン
（ｉ）位置：イソロイシン
（ｋ）位置：スレオニン
（ｌ）位置：ロイシン
（ｍ）位置：アラニン
（ｎ）位置：メチオニン
（ｏ）位置：バリン
（ｐ）位置：イソロイシン
から選ばれたアミノ酸残基に置換された、親アルカリセルラーゼに比して分泌量が向上した変異アルカリセルラーゼ。
【請求項２】
配列番号１で示されるアミノ酸配列と９８％以上の相同性を有するセルラーゼについて、配列番号１の（ａ）１０位、（ｂ）１６位、（ｃ）２２位、（ｅ）３９位、（ｆ）７６位、（ｇ）１０９位、（ｉ）２６３位、（ｋ）４６２位、（ｌ）４６６位、（ｍ）４６８位、（ｎ）５５２位、（ｏ）５６４位又は（ｐ）６０８位に相当する位置のアミノ酸残基が、
（ａ）位置：グルタミン
（ｂ）位置：アスパラギン
（ｃ）位置：プロリン
（ｅ）位置：アラニン
（ｆ）位置：ヒスチジン
（ｇ）位置：ロイシン
（ｉ）位置：イソロイシン
（ｋ）位置：スレオニン
（ｌ）位置：ロイシン
（ｍ）位置：アラニン
（ｎ）位置：メチオニン
（ｏ）位置：バリン
（ｐ）位置：イソロイシン
から選ばれたアミノ酸残基に置換された、親アルカリセルラーゼに比して分泌量が向上した変異アルカリセルラーゼ。
【請求項３】
配列番号１におけるアミノ酸残基の置換が、Ｌｅｕ１０Ｇｌｎ、Ｉｌｅ１６Ａｓｎ、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ、Ｐｈｅ３９Ａｌａ、Ｉｌｅ７６Ｈｉｓ、Ｍｅｔ１０９Ｌｅｕ、Ｐｈｅ２６３Ｉｌｅ、Ａｓｎ４６２Ｔｈｒ、Ｌｙｓ４６６Ｌｅｕ、Ｖａｌ４６８Ａｌａ、Ｉｌｅ５５２Ｍｅｔ、Ｉｌｅ５６４Ｖａｌ、Ｓｅｒ６０８Ｉｌｅ、Ｌｅｕ１０Ｇｌｎ＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ、Ａｓｎ３３Ｈｉｓ＋Ｐｈｅ３９Ａｌａ、Ｌｅｕ１０Ｇｌｎ＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｉｌｅ７６Ｈｉｓ＋Ｌｙｓ４６６Ｌｅｕである請求項１又は２記載の変異アルカリセルラーゼ。
【請求項４】
請求項１〜３記載の変異アルカリセルラーゼをコードする遺伝子。
【請求項５】
請求項４記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項６】
請求項５記載の組換えベクターを含有する形質転換体。
【請求項７】
宿主が微生物である請求項６記載の形質転換体。
【請求項８】
請求項１〜３記載の変異アルカリセルラーゼを配合する洗浄剤組成物。
【図１】
【公開番号】特開２０１２−９０６３１（Ｐ２０１２−９０６３１Ａ）
【公開日】平成２４年５月１７日（２０１２．５．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２５３００４（Ｐ２０１１−２５３００４）
【出願日】平成２３年１１月１８日（２０１１．１１．１８）
【分割の表示】特願２００３−１３８４０（Ｐ２００３−１３８４０）の分割
【原出願日】平成１５年１月２２日（２００３．１．２２）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年５月１７日（２０１２．５．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１１月１８日（２０１１．１１．１８）
【分割の表示】特願２００３−１３８４０（Ｐ２００３−１３８４０）の分割
【原出願日】平成１５年１月２２日（２００３．１．２２）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
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