変異型ポリヒドロキシアルカン酸結合タンパク質およびそれを用いたポリヒドロキシアルカン酸の製造方法
【課題】ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）の工業的発酵生産において、高い生産性にてＰＨＡを生産するとともに、共重合ＰＨＡのモノマー組成比を制御することを可能にする変異型ＰＨＡ結合タンパク質（フェイシン）を提供する。
【解決手段】微生物由来のＰＨＡ結合タンパク質のＮ末端から２０番目までのアミノ酸領域において１以上のアミノ酸が置換されてなるアミノ酸配列を有する、変異型ポリヒドロキシアルカン酸結合タンパク質。特に、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属微生物由来のＰＨＡ結合タンパク質のＮ末端から４番目のアミノ酸が置換される。また、該タンパク質をコードする遺伝子、及び、更にプロモーターとターミネーターを含む遺伝子発現カセットを提供する。更には該遺伝子又は該遺伝子発現カセットを微生物に導入して得られる形質転換微生物、及び、該形質転換微生物を用いたＰＨＡの製造方法を提供する。
【解決手段】微生物由来のＰＨＡ結合タンパク質のＮ末端から２０番目までのアミノ酸領域において１以上のアミノ酸が置換されてなるアミノ酸配列を有する、変異型ポリヒドロキシアルカン酸結合タンパク質。特に、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属微生物由来のＰＨＡ結合タンパク質のＮ末端から４番目のアミノ酸が置換される。また、該タンパク質をコードする遺伝子、及び、更にプロモーターとターミネーターを含む遺伝子発現カセットを提供する。更には該遺伝子又は該遺伝子発現カセットを微生物に導入して得られる形質転換微生物、及び、該形質転換微生物を用いたＰＨＡの製造方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）に結合するタンパク質（フェイシン：Ｐｈａｓｉｎ）、及び、それを用いたＰＨＡの製造方法に関する。より詳しくは、変異型フェイシン遺伝子、及び、これをＰＨＡ生産微生物に導入することで高効率にＰＨＡを生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
数多くの微生物がエネルギー貯蔵物質としてポリエステルを菌体内に蓄積することが知られている。そのようなポリエステルの１種である、３−ヒドロキシアルカン酸のホモポリマーあるいはコポリマーであるポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）は熱可塑性高分子であり、かつ環境中で炭酸ガスと水に分解されることから環境にやさしいプラスチックとして注目されてきた。また、バイオマスを炭素源として発酵生産されるＰＨＡは、石油由来プラスチックに比べて温室効果ガスを削減できることが示され、地球温暖化を抑制する効果も明らかとなった。
【０００３】
ＰＨＡは、Ｃ３〜Ｃ５の３−ヒドロキシアルカン酸からなるｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ−ｌｅｎｇｔｈ ＰＨＡｓ（ｓｃｌ−ＰＨＡｓ）と、Ｃ６〜Ｃ１６の３−ヒドロキシアルカン酸からなるｍｅｄｉｕｍ−ｃｈａｉｎ−ｌｅｎｇｔｈ ＰＨＡｓ（ｍｃｌ−ＰＨＡｓ）に分類されるが、その混合型も報告されている。これらのうち、ｓｃｌ−ＰＨＡｓ（例えば、ＰＨＢ：ポリ−３−ヒドロキシ酪酸、ＰＨＢＶ：ポリ(３−ヒドロキシ酪酸−ｃｏ−３−ヒドロキシ吉草酸)）については優れた研究開発が行われ、工業的規模での生産技術も開発されてきた。
【０００４】
一方、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅが脂肪酸や油脂を炭素源として３−ヒドロキシ酪酸（３ＨＢ）と３−ヒドロキシヘキサン酸（３ＨＨ）の共重合ポリエステル（ＰＨＢＨ）を生産することが報告されている。ＰＨＢＨは３ＨＨ組成比により硬質から軟質に至る幅広い物性を示すことから、ｓｃｌ−ＰＨＡｓよりも広範な用途に適用可能である。
【０００５】
Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅを用いたＰＨＢＨ発酵生産では非常に低いポリマー生産性しか得られないが、Ａ．ｃａｖｉａｅよりＰＨＡ合成酵素遺伝子がクローニングされたことによりＰＨＢＨ生産性の改善が進められた。当該遺伝子をＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ ＰＨＢ−４（旧名Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ ＰＨＢ−４、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ ＰＨＢ−４）に導入した形質転換株を用い、植物油脂を炭素源に用いることで高いＰＨＢＨ生産性が得られる。また、宿主をＣ．ｎｅｃａｔｏｒ野生株に変更することでＰＨＢＨ生産性を更に向上できることも報告されている。本菌株は軟質ＰＨＢＨ（高３ＨＨ組成）の製法への適用についても検討され、３ＨＢの供給経路を遺伝子レベルで調節することにより３ＨＨ組成比を高めることができるようになっている。さらにＰＨＡ合成酵素の改変体に関する研究が行われ、３ＨＨ組成比の高い軟質ＰＨＢＨの生産に有利な変異型酵素が見出されている。本変異型酵素を用いてＰＨＢＨ生産株の育種も行なわれている。
【０００６】
一方、ＰＨＡ生産性向上や共重合ポリエステルの共重合比の制御を目指し、ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）に結合するタンパク質（フェイシン：Ｐｈａｓｉｎ）を利用した研究も進められている。
【０００７】
種々の微生物のフェイシンが研究され、当該遺伝子がクローニングされている。Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒでは４種類のフェイシン遺伝子（ｐｈａＰ１〜Ｐ４）が確認されており、そのうちフェイシンＰ１（ｐｈａＰ１：ＧＡ２４）が主要構成成分である（非特許文献１、非特許文献２を参照）。Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓのフェイシン（ＧＡ１６）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｕｂｅｒのフェイシン（ＧＡ１４）、Ａ．ｃａｖｉａｅのフェイシンも報告されている（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５を参照）。フェイシンが菌体内に多量に存在すると、一般的にＰＨＡの顆粒サイズが小さくなり、粒子数が増加することが知られている。
【０００８】
フェイシンがＰＨＡ生産性や共重合ポリエステルの共重合比に与える影響についても研究されている。宿主大腸菌にＰＨＡ合成系遺伝子を導入したＰＨＡ生産系において、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒやＡ．ｃａｖｉａｅのフェイシンの高発現はＰＨＡ生産性を向上する（非特許文献６、非特許文献７を参照）。また、Ａ．ｃａｖｉａｅのフェイシンがＰＨＢＨの３ＨＨ組成比を高める効果のあることも報告されている。宿主として大腸菌やＡｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａを用いた場合、Ａ．ｃａｖｉａｅのフェイシンはこれらの菌株において３ＨＨ組成比を向上させることから、フェイシンは軟質ＰＨＢＨの生産に適していることが示されている（非特許文献７、非特許文献８を参照）。
【０００９】
上記の種々の技術により、ＰＨＡの生産性向上や共重合ポリエステルの共重合比の制御が可能となっている。しかしながら、ＰＨＡの工業的な生産技術の構築には更に高生産性が求められており、また共重合ポリエステルの共重合比のより広範な制御技術が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Wieczorek等, J. Bacteriol., vol.177, 2425 (1995)
【非特許文献２】Potter等, Microbiology, vol.150, 2301 (2004)
【非特許文献３】Maehara等, J. Bacteriol., vol.181, 2914 (1999)
【非特許文献４】Pieper-Furst等, J. Bacteriol., vol.177, 2513 (1995)
【非特許文献５】Fukui等, Biomacromolecules, vol.2, 148 (2001)
【非特許文献６】York等, J. Bacteriol., vol.184, 59 (2002)
【非特許文献７】Tian等, FEMS Microbiol.Lett., vol.244, 19 (2005)
【非特許文献８】Han等, FEMS Microbiol.Lett., vol.239, 195 (2004)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、上記現状に鑑み、ＰＨＡの工業的発酵生産において、高い生産性にてＰＨＡを生産するとともに、複数のモノマーから構成される共重合ＰＨＡのモノマー組成比を制御することを可能にする変異型ＰＨＡ結合タンパク質（変異型フェイシン）、及び、それを用いたＰＨＡの製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
現在までに、フェイシンはＰＨＡ生産性を向上させること、及び、ＰＨＢＨの３ＨＨ組成比を高くする機能を有することが報告されているが、フェイシンの構造と、ＰＨＡ生産性又はＰＨＢＨの３ＨＨ組成比との関係については十分な解析が行なわれていない。
【００１３】
フェイシンのカルボキシ末端には疎水性アミノ酸を含む領域が存在しており、この領域でＰＨＡ顆粒に結合していると考えられている。また、ＰＨＡ顆粒にはフェイシン以外にも、ＰＨＡ合成酵素やデポリメラーゼ、ＰｈａＲ等が結合しており、ＰＨＡ生合成系・分解系において複雑な相互作用をしていると推定されている（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ１５１，８２５（２００５））。
【００１４】
本発明者らは、これらの相互作用にフェイシンタンパク質の構造、特にアミノ末端領域が関与していると考え、鋭意研究を行なった。その結果、フェイシンのアミノ末端領域の改変体がＰＨＡ生産性を向上させ、ＰＨＢＨの３ＨＨ組成比を高くすることを見出し、本研究を完成するに至った。
【００１５】
すなわち本発明は、微生物由来のポリヒドロキシアルカン酸結合タンパク質のＮ末端から２０番目までのアミノ酸領域において１以上のアミノ酸が置換されてなるアミノ酸配列を有する、変異型ポリヒドロキシアルカン酸結合タンパク質である。
【００１６】
また本発明は、前記変異型ポリヒドロキシアルカン酸結合タンパク質をコードする遺伝子、又は、前記遺伝子に加えて、ポリヒドロキシアルカン酸生産微生物において機能するプロモーター及びターミネーターを含む、遺伝子発現カセットでもある。
【００１７】
さらに本発明は、前記遺伝子又は前記遺伝子発現カセットをポリヒドロキシアルカン酸生産微生物に導入して得られる形質転換微生物でもある。
【００１８】
さらにまた本発明は、前記形質転換微生物を培養してポリヒドロキシアルカン酸を発酵生産する工程を含む、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法でもある。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、ＰＨＡ生産を工業的規模で生産性よく実施することが可能となる。また、共重合ＰＨＡのモノマー組成比を広範囲に調節でき、特に軟質ＰＨＡを容易に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ｐＢＢＲ１ｐｈａＰＣＪＡｃＡＢＲｅＤ１７１Ｌのベクター構築図
【図２】ＰＣＲを用いたｐｈａＣ変異導入条件を説明する図
【図３】ＰＣＲを用いたｐｈａＰ変異導入条件を説明する図
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００２２】
本発明におけるポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）は以下の一般式で表される。
【００２３】
【化１】
【００２４】
（式中、Ｒ１及びＲ２は炭素数１以上１３以下であるアルキル基を表し、互いに同一であっても異なっていても良い。ｍ及びｎは該ＰＨＡのモノマー単位数を表し、３種以上のモノマー単位から構成される場合はモノマー単位数を増やすことができる。）で表される３−ヒドロキシアルカン酸をモノマー単位として含む重合体（単独重合体または共重合体）である。ＰＨＡは、Ｒ１及びＲ２がともにメチル基のホモポリマーであるＰＨＢであってもよい。または、モノマー単位が３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ吉草酸、３−ヒドロキシヘキサン酸、３−ヒドロキシヘプタン酸、３−ヒドロキシオクタン酸、３−ヒドロキシノナン酸、３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシウンデカン酸、３−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドキシトリデカン酸、３−ヒドロキシテトラデカン酸、３−ヒドロキシペンタデカン酸、及び３−ヒドロキシヘキサデカン酸からなる群より選択されるモノマー単位の２種以上から構成される共重合ＰＨＡであってもよい。特に、３−ヒドロキシ酪酸をモノマー単位として含む共重合ＰＨＡが好ましく、３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸をモノマー単位として含む共重合ＰＨＡがより好ましい。
【００２５】
本発明における微生物由来のポリヒドロキシアルカン酸結合タンパク質（フェイシン）は、ＰＨＡを生産する微生物由来であればどのような微生物由来のフェイシンでもよい。具体的には、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｕｂｅｒ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．の他、Ａ．ｃａｖｉａｅ、Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ、Ａ．ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ、Ａ．ａｌｌｏｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａ、Ａ．ｂｅｓｔｉａｒｕｍ、Ａ．ｅｎｃｈｅｌｅｉａ、Ａ．ｅｎｔｅｒｏｐｅｌｏｇｅｎｅｓ、Ａ．ｅｕｃｒｅｎｏｐｈｉｌａ、Ａ．ｉｃｈｔｈｉｏｓｍｉａ、Ａ．ｊａｎｄａｅｉ、Ａ．ｍｅｄｉａ、Ａ．ｐｏｐｏｆｆｉｉ、Ａ．ｐｕｎｃｔａｔａ、Ａ．ｓｃｈｕｂｅｒｔｔｉ、Ａ．ｓｏｂｒｉａ、Ａ．ｔｒｏｔａ等のＡｅｒｏｍｏｎａｓ属由来のフェイシンが挙げられる。好ましくはＡ．ｃａｖｉａｅ、又は、Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ由来のフェイシンであり、より好ましくは、Ａ．ｃａｖｉａｅ由来のフェイシンである。
【００２６】
Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ由来のフェイシンのアミノ酸配列については、Ａ．ｃａｖｉａｅ由来のフェイシンのアミノ酸配列と同じであることが報告されている（非特許文献７）。
【００２７】
フェイシン遺伝子のＤＮＡ配列情報は、科学論文や「日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）」などより入手することができる。当該フェイシンを有する微生物より調製した染色体ＤＮＡを鋳型にし、当該ＤＮＡ配列情報に基づいて作製したＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行うことでフェイシン遺伝子をクローニングすることができる。一例として、Ａ．ｃａｖｉａｅのフェイシンＤＮＡ配列（配列番号２）はＦｕｋｕｉ等，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，ｖｏｌ１７９，４８２１（１９９７）にＯＲＦ１として報告されていることから、当該ＤＮＡ配列に基づいてＰＣＲプライマーを作成し、Ａ．ｃａｖｉａｅ ＦＡ４４０の染色体ＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲによってフェイシン遺伝子をクローニングすることができる。
【００２８】
フェイシン遺伝子への変異導入は、一般的な方法を適用することができる。一例として当該遺伝子に対してランダムプライマーを用いた変異導入法、部位特異的変異を有するプライマーを用いた変異導入法などを利用することができる。これらの方法を用いることによりフェイシンを構成するいずれのアミノ酸に対しても効率よく変異を導入することができる。
【００２９】
フェイシンに対する変異導入はアミノ末端領域に行われ、具体的には、アミノ末端（Ｎ末端）から２０番目までのアミノ酸領域において１以上のアミノ酸が置換される。好ましくはＮ末端から４番目のアミノ酸に対して行われる。一例として、Ａ．ｃａｖｉａｅ由来のフェイシンのアミノ酸配列（配列番号１）のうちＮ末端から４番目のアミノ酸はアスパラギン酸であるが、このアスパラギン酸を、アスパラギン酸以外の１９種類のアミノ酸に置換することができる。好ましくは、Ｎ末端から４番目のアスパラギン酸を、極性だが電荷のない天然アミノ酸（セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミンに加え、分子内でアミノ基・カルボキシル基の占める割合の大きいグリシンを含める。）の一つに置換することができる。より好ましくは、Ｎ末端から４番目のアスパラギン酸を、アスパラギンに置換することができる。Ａ．ｃａｖｉａｅ由来のフェイシンのアミノ酸配列においてＮ末端から４番目のアミノ酸がアスパラギン酸からアスパラギンに置換されてなるアミノ酸配列を配列番号３に示す。
【００３０】
フェイシンに対する変異導入は、Ｎ末端から４番目のアミノ酸のみに限定されない。本発明の効果が発揮される限り、他のアミノ酸残基において変異が導入されていてもよい。この時、本発明の変異型フェイシンのアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列（Ａ．ｃａｖｉａｅ由来の野生型フェイシンのアミノ酸配列を表す）と８５％以上の配列同一性を示すことが好ましい。より好ましくは９０％以上であり、さらに好ましくは９５％以上であり、さらに好ましくは９７％以上である。
【００３１】
ＰＨＡ生産微生物において変異型フェイシンを発現させるために、変異型フェイシン遺伝子の上流にプロモーター、下流にターミネーターを連結して変異型フェイシン遺伝子発現カセットを構築することが好ましい。プロモーターとしては当該ＰＨＡ生産微生物において機能するものであればどのようなプロモーターでもよく、一例として、ラクトースオペロンプロモーター、λファージプロモーター、Ａ．ｃａｖｉａｅ由来のＰＨＡオペロンプロモーター、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ由来のＰＨＡオペロンプロモーターなどを利用することができる。また、ターミネーターとしては当該ＰＨＡ生産微生物において機能するものであればどのようなターミネーターでもよく、一例として、ｒｒｎターミネーター、Ａ．ｃａｖｉａｅ由来のＰＨＡオペロンターミネーター、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ由来のＰＨＡオペロンターミネーターなどを利用することができる。
【００３２】
上記のように作製した変異型フェイシン遺伝子発現カセットは、種々の形質転換法を用いてＰＨＡ生産微生物に形質転換することができる。ＰＨＡ生産微生物としては、例えば、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ属、又は、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属に属する微生物が挙げられる。より具体的には、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ、Ａ.ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｌａｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐ.ｐｕｔｉｄａ、Ｐ.ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、又は、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍに属する微生物が挙げられる。このうち、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ、Ａ．ｃａｖｉａｅ、Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ、Ｐ.ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｎａｓ ａｅｒｇｉｎｏｓａ等は、本来ＰＨＡを生産する微生物である。また、Ｅ．ｃｏｌｉのように本来ＰＨＡを生産できない微生物にＰＨＡ合成系遺伝子群等を形質転換することでＰＨＡを生産可能となった微生物も利用することができる。更に、本来ＰＨＡを生産する微生物のＰＨＡ合成酵素遺伝子が破壊され、且つ他の微生物由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子を形質転換することでＰＨＡを生産可能となった微生物も利用することができる。
【００３３】
変異型フェイシン遺伝子発現カセットの前記ＰＨＡ生産微生物への形質転換には、一般的な種々の方法を利用することができる。自律増殖可能なプラスミドベクターを用いる場合、当該ベクターに当該発現カセットを挿入することで発現プラスミドを構築し、電気導入法やカルシウム法などにより発現プラスミドをＰＨＡ生産微生物に形質転換することができる。例えば、大腸菌で自律増殖可能なプラスミドベクターとしてｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２を用い、当該ベクターにＡ．ｃａｖｉａｅ由来の変異型フェイシン及びポリエステル合成系遺伝子群発現カセットを組み込んだ発現プラスミドを大腸菌に形質転換し、形質転換微生物を取得できる。また、本発現プラスミドはＣ．ｎｅｃａｔｏｒにおいて自律増殖することができることから、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ由来の宿主に形質転換することもできる。
【００３４】
また、当該発現カセットをＰＨＡ生産微生物の染色体上に組み込むことで形質転換することもできる。具体的には、発現カセットの上流と下流にＰＨＡ生産微生物のゲノム配列の一部を連結し、当該構築物を電気導入法やカルシウム法などにより形質転換することで当該微生物の染色体上に組み込むことができる。更に、本来ＰＨＡを生産する微生物は、当該微生物由来のフェイシン遺伝子を保有している。このため、形質転換する変異型フェイシン遺伝子を用いて当該微生物のフェイシン遺伝子を破壊・置換することが好ましい。発現カセットの染色体上への挿入には、種々の抗生物質耐性遺伝子や糖代謝に関わるｓａｃＢ遺伝子などの適切な選択マーカーが種々準備されており、それらを適切に組み合わせて用いることができる。
【００３５】
上記形質転換微生物を用いてポリヒドロキシアルカン酸を発酵生産することで、変異型フェイシンの効果（ＰＨＡ生産性向上、共重合比の制御）を明らかにすることができる。形質転換微生物の培養では、炭素源、炭素源以外の栄養源である窒素源、無機塩類、そのほかの有機栄養源を含む培地を用いて、当該形質転換微生物を培養することが好ましい。炭素源としては、糖類、油脂類、脂肪酸類などが好ましく、より好ましくはブドウ糖、蔗糖、植物油脂、植物由来脂肪酸類である。窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス等が挙げられる。無機塩類としては、例えばリン酸２水素カリウム、リン酸水素２ナトリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。そのほかの有機栄養源としては、例えばグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリン等のアミノ酸、ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ等のビタミン等が挙げられる。また、培養液中に、発現プラスミドに存在する抗生物質耐性遺伝子に対応する抗生物質（アンピシリン、カナマイシン等）を添加しても良い。
【００３６】
本発明において、形質転換微生物の菌体からのＰＨＡ（ホモポリマー、共重合ポリエステル）の回収は、特に限定されないが、例えば次のような方法により行うことができる。培養終了後、培養液から遠心分離機等で菌体を分離し、その菌体を蒸留水およびメタノール等により洗浄し、乾燥させる。この乾燥菌体から、クロロホルム等の有機溶剤を用いてＰＨＡを抽出する。このＰＨＡを含んだ有機溶剤溶液から、濾過等によって菌体成分を除去し、その濾液にヘキサン等の貧溶媒を加えてＰＨＡを沈殿させる。さらに、濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させてＰＨＡを回収する。
【００３７】
得られたＰＨＡの重量平均分子量（Ｍｗ）はＧＰＣを用いて測定することができ、また得られたＰＨＡが共重合ポリエステルの場合には、その組成の分析をガスクロマトグラフ法や核磁気共鳴法等により行うことができる。例えば共重合ポリエステルがＰＨＢＨの場合、３ＨＢ／３ＨＨ組成比を決定することができる。
【００３８】
本発明により、ＰＨＡの工業的発酵生産により高い生産性にてＰＨＡを生産する方法が提供され、複数のモノマーから構成される共重合ＰＨＡのモノマー組成比を制御することで硬質から軟質に至る物性を示すＰＨＡを製造する方法が提供される。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例によりその技術的範囲を限定されるものではない。なお一般的な遺伝子操作は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、（１９８９））に記載されている方法等を用いることができる。また、遺伝子操作に使用する酵素、クローニング宿主等は、市場の供給者から購入し、その取扱説明書に従い使用することができる。なお、酵素としては、遺伝子操作に使用できるものであれば特に限定されない。
【００４０】
（実施例１）Ａ．ｃａｖｉａｅのフェイシン（ＰｈａＰＡＣ）変異体Ｄ４Ｎの取得
（１）ｐＢＢＲ１ｐｈａＰＣＪＡｃＡＢＲｅ
本プラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉを宿主とした糖からのＰＨＢホモポリマー合成および脂肪酸からのＰＨＢＨ合成の両方に利用できるプラスミドである。Ｋｉｃｈｉｓｅ等によって作製されたプラスミドｐＢＳＥＥ３２ｐｈｂＡＢ（Ｋｉｃｈｉｓｅ等，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖｏｌ６８，２４１１（２００２））を制限酵素（ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ）で処理することで調製した発現ユニットｐｈａＰＣＪＡｃＡＢＲｅを、制限酵素（ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ）で切断した広域ベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２に挿入することで作製した。当該発現ユニットの上流にはＡ．ｃａｖｉａｅ由来のプロモーター、および、Ｅ．ｃｏｌｉでより転写活性の高いｌａｃプロモーターが配置されている。その構造を図１に示す。
【００４１】
（２）ｐＢＢＲ１ｐｈａＰＣＪＡｃＡＢＲｅ Ｄ１７１Ｘの作製
ｐＢＢＲ１ｐｈａＰＣＪＡｃＡＢＲｅのＡ．ｃａｖｉａｅ由来ｐｈａＣ（ＰＨＡ合成酵素遺伝子）のＤ１７１位（１７１番目のアスパラギン酸）に対してＰＣＲを用いた部位特異的ランダム変異導入（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ１９，２７８５（１９９１））を行った後、ＢＫＬキット（タカラバイオ製）による平衡末端化、リン酸化及び自己ライゲーション反応を行った。ＰＣＲの条件を図２に示す。
【００４２】
次に自己ライゲーション反応液をＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９またはＥ．ｃｏｌｉ ＬＳ５２１８のコンピテントセルに形質転換することで種々のＤ１７１位の変異体を取得した。導入された変異は、当該プラスミドの全長又はｐｈａＣ、ｐｈａＰの塩基配列を決定することで解析した。
【００４３】
その結果、ｐｈａＣのＤ１７１がＬ（ロイシン）に置換されたプラスミドｐＢＢＲ１ｐｈａＰＣＪＡｃＡＢＲｅＤ１７１Ｌを取得した（比較例）。
【００４４】
同時に、ｐｈａＣのＤ１７１のＬへの置換に加えて、ＰｈａＰのＤ４（４番目のアスパラギン酸）がＮ（アスパラギン）に置換されたプラスミドｐＢＢＲ１ｐｈａＰ（Ｄ４Ｎ）ＣＪＡｃＡＢＲｅＤ１７１Ｌも取得した。同プラスミドには同変異に加えてｍｏｂ（プラスミド伝達に関与する遺伝子）のＲ１７７（１７７番目のアルギニン）がＣ（システイン）に置換され、Ｌ３０１（３０１番目のロイシン）にはサイレント変異が導入されていた。ＰＣＲの条件を図２に示す。
【００４５】
野生型ＰｈａＰのアミノ酸 配列を配列番号１に、Ｄ４がＮに置換された変異型ＰｈａＰのアミノ酸配列を配列番号３に示す。
【００４６】
ベクター部分の変異の影響を避けるため、ｐｈａＣ（Ｄ１７１Ｌ）およびＰｈａＰ（Ｄ４Ｎ）の変異を有する発現ユニット（ｐｈａＰ（Ｄ４Ｎ）ＣＪＡｃＡＢＲｅＤ１７１Ｌ）を前述の方法を用いてｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２に再挿入し、ｐＢＢＲ１ｐｈａＰ（Ｄ４Ｎ）ＣＪＡｃＡＢＲｅＤ１７１Ｌを作製した（実施例）。
【００４７】
さらに、ｐｈａＣが野生型（ＷＴ）でかつＰｈａＰのＤ４がＮに置換されたプラスミドｐＢＢＲ１ｐｈａＰ（Ｄ４Ｎ）ＣＪＡｃＡＢＲｅＷＴを作製した（実施例）。本プラスミドは、ｐＢＢＲ１ｐｈａＰ（Ｄ４Ｎ）ＣＪＡｃＡＢＲｅＤ１７１Ｌを制限酵素ＫｐｎＩとＳｇｆＩで処理し、同酵素で処理したｐＢＢＲ１ｐｈａＰＣＪＡｃＡＢＲｅベクターに挿入することで構築した。
【００４８】
（実施例２）大腸菌を宿主としたフェイシン変異体（ｐｈａＰ（Ｄ４Ｎ））のＰＨＡ生産に与える効果
（１）形質転換体の培養方法
実施例１において作製した４種類のプラスミド（ｐＢＢＲ１ｐｈａＰＣＪＡｃＡＢＲｅ、ｐＢＢＲ１ｐｈａＰＣＪＡｃＡＢＲｅＤ１７１Ｌ、ｐＢＢＲ１ｐｈａＰ（Ｄ４Ｎ）ＣＪＡｃＡＢＲｅＷＴ、ｐＢＢＲ１ｐｈａＰ（Ｄ４Ｎ）ＣＪＡｃＡＢＲｅＤ１７１Ｌ）をＥ．ｃｏｌｉ ＬＳ５２１８に形質転換し、カナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）を含むＬＢ寒天培地に塗り広げ、３７℃で一晩培養することでそれぞれの形質転換体を培養した。
【００４９】
プレート培地に形成された単一コロニー（形質転換体）をＬＢ液体培地に植菌し、３７℃、１５０回／ｍｉｎで１６時間振盪培養した（前培養）。次に５００ｍｌ振とうフラスコに、単一炭素源としてドデカン酸ナトリウム（２．５ｇ／Ｌ）を含む１００ｍｌのＭ９液体培地（表１）を入れ、前培養液１ｍｌを植菌し、３７℃、１３０回／ｍｉｎで７２時間振とう培養した（本培養）。なお、抗生物質としてカナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）を加えた。また、炭素源であるドデカン酸ナトリウムは水に対する溶解度が低く、これを補うために非イオン性界面活性剤ＢＲＩＪ３５（ポリオキシエチレンラウリルエーテル）を０．４ｖｏｌ％加えた。
【００５０】
【表１】
【００５１】
（２）集菌方法
上記（１）の培養液を２５０ｍｌ遠沈管に移し、振とうフラスコ内を適量のヘキサンで１回、純水で３回すすいだ。この洗液も遠沈管に加えて激しく撹拌した後、４℃、６０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、上清を除いた。菌体ペレットを適量の純水で懸濁して激しく撹拌した後、４℃、６０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、上清を除いた。ペレットを適量の純水（５ｍｌ未満）に懸濁し、風袋を秤量済みの５ｍｌ集菌チューブに移して凍結乾燥した。乾燥後のチューブを秤量することで乾燥菌体重量を得た。
【００５２】
（３）分析方法
（３−１）ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）
培養菌体が合成したＰＨＡの含有率とモノマー組成比は、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）を用いて内部標準法により求めた。この方法では、メタノリシス反応により生じた乾燥菌体内ＰＨＡ分解物であるメチルエステルを測定する。
【００５３】
乾燥菌体をネジ蓋付き試験管に約１０ｍｇ採り、１５％硫酸-メタノール溶液２ｍｌとクロロホルム２ｍｌを加え、途中で数回激しく撹拌しながら１００℃で１４０ｍｉｎ加熱した。室温まで放冷した後、超純水１ｍｌを加えて激しく混合し、一晩放置した。二層分離したサンプル溶液の下層（クロロホルム層）をパスツールピペットで採り、φ０．４５μｍ ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）フィルター（Ａｄｖａｎｔｅｃ製）でろ過した。
【００５４】
１．５ｍｌバイアル管にこのろ液と０．１％オクタン酸メチル−クロロホルム溶液を５００μｌずつ加え、８ｍｍポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）／シリコンセプタムを挟んで蓋をした。この溶液をサンプルとした。
【００５５】
ＧＣ測定は、以下の条件下で行った。
【００５６】
（ＧＣ分析装置）
ＧＣ装置：ガスクロマトグラフＧＣ−１４Ｂ（島津製作所製）
キャピラリーカラム：１００％メチルポリシロキサン無極性カラム１０１０−１１１４３（架橋タイプ、内径 ０．２５ｍｍ × ３０ｍ、膜厚 ０．４μｍ）（ジーエルサイエンス製）
検出器：水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）
オートインジェクタ：ＡＯＣ−２０ｉオートインジェクタ２２１−４４５２７−３０（島津製作所製）
オートサンプラ：ＡＯＣ−２０ｓオートサンプラ２２１−４４８８０−３０（島津製作所製）
解析装置：クロマトパックＣ−Ｒ７Ａ ｐｌｕｓ（島津製作所製）
（ＧＣ測定条件）
ＧＣ測定条件を、表２および表３に示す。
【００５７】
【表２】
【００５８】
【表３】
【００５９】
ＦＩＤにより検出した各保持時間のピークの積分値から、ＰＨＡ菌体内含有率およびモノマー組成比を決定した。ＧＣ測定結果の解析は以下の手順で行った。
【００６０】
ＧＣ測定の結果、各モノマーに対応するメチルエステルａ、ｂ、ｃ（モノマーユニット数に対応）が検出されたとき、その積分値をＡ、Ｂ，Ｃとし、対応する補正係数（相対感度の逆数）をＸ、Ｙ、Ｚとすると、ａのモル分率は次式から求められる。
【００６１】
【数１】
【００６２】
なお、３ＨＢの値で規格化された各補正係数を表４に示す。
【００６３】
【表４】
【００６４】
内部標準物質であるオクタン酸メチルのピークの積分値をＳ、サンプルに用いた乾燥菌体の重量をｍ（ｍｇ）とすると、ＰＨＡ菌体内含有率Ｐ（ｗｔ％）は以下の式より算出できる。
【００６５】
【数２】
【００６６】
ここでＫはＰＨＢを用いて作成した検量線から決定した定数で、本実施例では次式よりＫ値を５．８とした。
【００６７】
【数３】
【００６８】
フェイシン変異体の培養結果を表５に示す。表中のＤＣＷ（乾燥菌体重量）、ＰＨＡ含量および３ＨＨ組成比に関する各数値は、平均値±標準偏差である。この結果より、ｐｈａＣのＤ１７１Ｌ変異の有無に関わらず、ｐｈａＰのＤ４Ｎ変異体においてＰＨＡ（ＰＨＢＨ）含量および３ＨＨ組成比が大きく向上していることが明らかになった。
【００６９】
【表５】
【００７０】
(実施例３)フェイシン変異体（Ｄ４Ｘ）の作製
ｐＢＢＲ１ｐｈａＰＣＪＡｃＡＢＲｅのｐｈａＰのＤ４位（４番目のアスパラギン酸）に対してＰＣＲを用いた部位特異的ランダム変異導入（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ１９，２７８５（１９９１））を行った後、ＢＫＬキット（タカラバイオ製）による平衡末端化、リン酸化及び自己ライゲーション反応を行った。ＰＣＲの条件を図３に示す。次に自己ライゲーション反応液をＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９またはＥ．ｃｏｌｉ ＬＳ５２１８のコンピテントセルに形質転換することで種々のＤ１７１位の変異体を取得した。導入された変異は、当該プラスミドのｐｈａＰの塩基配列を決定することで解析した。
【００７１】
その結果、ｐｈａＰの４番目のアスパラギン酸に対して、アスパラギン酸以外の１９種類の天然アミノ酸に置換された変異体を作製することができた。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）に結合するタンパク質（フェイシン：Ｐｈａｓｉｎ）、及び、それを用いたＰＨＡの製造方法に関する。より詳しくは、変異型フェイシン遺伝子、及び、これをＰＨＡ生産微生物に導入することで高効率にＰＨＡを生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
数多くの微生物がエネルギー貯蔵物質としてポリエステルを菌体内に蓄積することが知られている。そのようなポリエステルの１種である、３−ヒドロキシアルカン酸のホモポリマーあるいはコポリマーであるポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）は熱可塑性高分子であり、かつ環境中で炭酸ガスと水に分解されることから環境にやさしいプラスチックとして注目されてきた。また、バイオマスを炭素源として発酵生産されるＰＨＡは、石油由来プラスチックに比べて温室効果ガスを削減できることが示され、地球温暖化を抑制する効果も明らかとなった。
【０００３】
ＰＨＡは、Ｃ３〜Ｃ５の３−ヒドロキシアルカン酸からなるｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ−ｌｅｎｇｔｈ ＰＨＡｓ（ｓｃｌ−ＰＨＡｓ）と、Ｃ６〜Ｃ１６の３−ヒドロキシアルカン酸からなるｍｅｄｉｕｍ−ｃｈａｉｎ−ｌｅｎｇｔｈ ＰＨＡｓ（ｍｃｌ−ＰＨＡｓ）に分類されるが、その混合型も報告されている。これらのうち、ｓｃｌ−ＰＨＡｓ（例えば、ＰＨＢ：ポリ−３−ヒドロキシ酪酸、ＰＨＢＶ：ポリ(３−ヒドロキシ酪酸−ｃｏ−３−ヒドロキシ吉草酸)）については優れた研究開発が行われ、工業的規模での生産技術も開発されてきた。
【０００４】
一方、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅが脂肪酸や油脂を炭素源として３−ヒドロキシ酪酸（３ＨＢ）と３−ヒドロキシヘキサン酸（３ＨＨ）の共重合ポリエステル（ＰＨＢＨ）を生産することが報告されている。ＰＨＢＨは３ＨＨ組成比により硬質から軟質に至る幅広い物性を示すことから、ｓｃｌ−ＰＨＡｓよりも広範な用途に適用可能である。
【０００５】
Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅを用いたＰＨＢＨ発酵生産では非常に低いポリマー生産性しか得られないが、Ａ．ｃａｖｉａｅよりＰＨＡ合成酵素遺伝子がクローニングされたことによりＰＨＢＨ生産性の改善が進められた。当該遺伝子をＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ ＰＨＢ−４（旧名Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ ＰＨＢ−４、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ ＰＨＢ−４）に導入した形質転換株を用い、植物油脂を炭素源に用いることで高いＰＨＢＨ生産性が得られる。また、宿主をＣ．ｎｅｃａｔｏｒ野生株に変更することでＰＨＢＨ生産性を更に向上できることも報告されている。本菌株は軟質ＰＨＢＨ（高３ＨＨ組成）の製法への適用についても検討され、３ＨＢの供給経路を遺伝子レベルで調節することにより３ＨＨ組成比を高めることができるようになっている。さらにＰＨＡ合成酵素の改変体に関する研究が行われ、３ＨＨ組成比の高い軟質ＰＨＢＨの生産に有利な変異型酵素が見出されている。本変異型酵素を用いてＰＨＢＨ生産株の育種も行なわれている。
【０００６】
一方、ＰＨＡ生産性向上や共重合ポリエステルの共重合比の制御を目指し、ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）に結合するタンパク質（フェイシン：Ｐｈａｓｉｎ）を利用した研究も進められている。
【０００７】
種々の微生物のフェイシンが研究され、当該遺伝子がクローニングされている。Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒでは４種類のフェイシン遺伝子（ｐｈａＰ１〜Ｐ４）が確認されており、そのうちフェイシンＰ１（ｐｈａＰ１：ＧＡ２４）が主要構成成分である（非特許文献１、非特許文献２を参照）。Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓのフェイシン（ＧＡ１６）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｕｂｅｒのフェイシン（ＧＡ１４）、Ａ．ｃａｖｉａｅのフェイシンも報告されている（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５を参照）。フェイシンが菌体内に多量に存在すると、一般的にＰＨＡの顆粒サイズが小さくなり、粒子数が増加することが知られている。
【０００８】
フェイシンがＰＨＡ生産性や共重合ポリエステルの共重合比に与える影響についても研究されている。宿主大腸菌にＰＨＡ合成系遺伝子を導入したＰＨＡ生産系において、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒやＡ．ｃａｖｉａｅのフェイシンの高発現はＰＨＡ生産性を向上する（非特許文献６、非特許文献７を参照）。また、Ａ．ｃａｖｉａｅのフェイシンがＰＨＢＨの３ＨＨ組成比を高める効果のあることも報告されている。宿主として大腸菌やＡｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａを用いた場合、Ａ．ｃａｖｉａｅのフェイシンはこれらの菌株において３ＨＨ組成比を向上させることから、フェイシンは軟質ＰＨＢＨの生産に適していることが示されている（非特許文献７、非特許文献８を参照）。
【０００９】
上記の種々の技術により、ＰＨＡの生産性向上や共重合ポリエステルの共重合比の制御が可能となっている。しかしながら、ＰＨＡの工業的な生産技術の構築には更に高生産性が求められており、また共重合ポリエステルの共重合比のより広範な制御技術が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Wieczorek等, J. Bacteriol., vol.177, 2425 (1995)
【非特許文献２】Potter等, Microbiology, vol.150, 2301 (2004)
【非特許文献３】Maehara等, J. Bacteriol., vol.181, 2914 (1999)
【非特許文献４】Pieper-Furst等, J. Bacteriol., vol.177, 2513 (1995)
【非特許文献５】Fukui等, Biomacromolecules, vol.2, 148 (2001)
【非特許文献６】York等, J. Bacteriol., vol.184, 59 (2002)
【非特許文献７】Tian等, FEMS Microbiol.Lett., vol.244, 19 (2005)
【非特許文献８】Han等, FEMS Microbiol.Lett., vol.239, 195 (2004)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、上記現状に鑑み、ＰＨＡの工業的発酵生産において、高い生産性にてＰＨＡを生産するとともに、複数のモノマーから構成される共重合ＰＨＡのモノマー組成比を制御することを可能にする変異型ＰＨＡ結合タンパク質（変異型フェイシン）、及び、それを用いたＰＨＡの製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
現在までに、フェイシンはＰＨＡ生産性を向上させること、及び、ＰＨＢＨの３ＨＨ組成比を高くする機能を有することが報告されているが、フェイシンの構造と、ＰＨＡ生産性又はＰＨＢＨの３ＨＨ組成比との関係については十分な解析が行なわれていない。
【００１３】
フェイシンのカルボキシ末端には疎水性アミノ酸を含む領域が存在しており、この領域でＰＨＡ顆粒に結合していると考えられている。また、ＰＨＡ顆粒にはフェイシン以外にも、ＰＨＡ合成酵素やデポリメラーゼ、ＰｈａＲ等が結合しており、ＰＨＡ生合成系・分解系において複雑な相互作用をしていると推定されている（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ１５１，８２５（２００５））。
【００１４】
本発明者らは、これらの相互作用にフェイシンタンパク質の構造、特にアミノ末端領域が関与していると考え、鋭意研究を行なった。その結果、フェイシンのアミノ末端領域の改変体がＰＨＡ生産性を向上させ、ＰＨＢＨの３ＨＨ組成比を高くすることを見出し、本研究を完成するに至った。
【００１５】
すなわち本発明は、微生物由来のポリヒドロキシアルカン酸結合タンパク質のＮ末端から２０番目までのアミノ酸領域において１以上のアミノ酸が置換されてなるアミノ酸配列を有する、変異型ポリヒドロキシアルカン酸結合タンパク質である。
【００１６】
また本発明は、前記変異型ポリヒドロキシアルカン酸結合タンパク質をコードする遺伝子、又は、前記遺伝子に加えて、ポリヒドロキシアルカン酸生産微生物において機能するプロモーター及びターミネーターを含む、遺伝子発現カセットでもある。
【００１７】
さらに本発明は、前記遺伝子又は前記遺伝子発現カセットをポリヒドロキシアルカン酸生産微生物に導入して得られる形質転換微生物でもある。
【００１８】
さらにまた本発明は、前記形質転換微生物を培養してポリヒドロキシアルカン酸を発酵生産する工程を含む、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法でもある。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、ＰＨＡ生産を工業的規模で生産性よく実施することが可能となる。また、共重合ＰＨＡのモノマー組成比を広範囲に調節でき、特に軟質ＰＨＡを容易に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ｐＢＢＲ１ｐｈａＰＣＪＡｃＡＢＲｅＤ１７１Ｌのベクター構築図
【図２】ＰＣＲを用いたｐｈａＣ変異導入条件を説明する図
【図３】ＰＣＲを用いたｐｈａＰ変異導入条件を説明する図
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００２２】
本発明におけるポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）は以下の一般式で表される。
【００２３】
【化１】
【００２４】
（式中、Ｒ１及びＲ２は炭素数１以上１３以下であるアルキル基を表し、互いに同一であっても異なっていても良い。ｍ及びｎは該ＰＨＡのモノマー単位数を表し、３種以上のモノマー単位から構成される場合はモノマー単位数を増やすことができる。）で表される３−ヒドロキシアルカン酸をモノマー単位として含む重合体（単独重合体または共重合体）である。ＰＨＡは、Ｒ１及びＲ２がともにメチル基のホモポリマーであるＰＨＢであってもよい。または、モノマー単位が３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ吉草酸、３−ヒドロキシヘキサン酸、３−ヒドロキシヘプタン酸、３−ヒドロキシオクタン酸、３−ヒドロキシノナン酸、３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシウンデカン酸、３−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドキシトリデカン酸、３−ヒドロキシテトラデカン酸、３−ヒドロキシペンタデカン酸、及び３−ヒドロキシヘキサデカン酸からなる群より選択されるモノマー単位の２種以上から構成される共重合ＰＨＡであってもよい。特に、３−ヒドロキシ酪酸をモノマー単位として含む共重合ＰＨＡが好ましく、３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸をモノマー単位として含む共重合ＰＨＡがより好ましい。
【００２５】
本発明における微生物由来のポリヒドロキシアルカン酸結合タンパク質（フェイシン）は、ＰＨＡを生産する微生物由来であればどのような微生物由来のフェイシンでもよい。具体的には、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｕｂｅｒ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．の他、Ａ．ｃａｖｉａｅ、Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ、Ａ．ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ、Ａ．ａｌｌｏｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａ、Ａ．ｂｅｓｔｉａｒｕｍ、Ａ．ｅｎｃｈｅｌｅｉａ、Ａ．ｅｎｔｅｒｏｐｅｌｏｇｅｎｅｓ、Ａ．ｅｕｃｒｅｎｏｐｈｉｌａ、Ａ．ｉｃｈｔｈｉｏｓｍｉａ、Ａ．ｊａｎｄａｅｉ、Ａ．ｍｅｄｉａ、Ａ．ｐｏｐｏｆｆｉｉ、Ａ．ｐｕｎｃｔａｔａ、Ａ．ｓｃｈｕｂｅｒｔｔｉ、Ａ．ｓｏｂｒｉａ、Ａ．ｔｒｏｔａ等のＡｅｒｏｍｏｎａｓ属由来のフェイシンが挙げられる。好ましくはＡ．ｃａｖｉａｅ、又は、Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ由来のフェイシンであり、より好ましくは、Ａ．ｃａｖｉａｅ由来のフェイシンである。
【００２６】
Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ由来のフェイシンのアミノ酸配列については、Ａ．ｃａｖｉａｅ由来のフェイシンのアミノ酸配列と同じであることが報告されている（非特許文献７）。
【００２７】
フェイシン遺伝子のＤＮＡ配列情報は、科学論文や「日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）」などより入手することができる。当該フェイシンを有する微生物より調製した染色体ＤＮＡを鋳型にし、当該ＤＮＡ配列情報に基づいて作製したＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行うことでフェイシン遺伝子をクローニングすることができる。一例として、Ａ．ｃａｖｉａｅのフェイシンＤＮＡ配列（配列番号２）はＦｕｋｕｉ等，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，ｖｏｌ１７９，４８２１（１９９７）にＯＲＦ１として報告されていることから、当該ＤＮＡ配列に基づいてＰＣＲプライマーを作成し、Ａ．ｃａｖｉａｅ ＦＡ４４０の染色体ＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲによってフェイシン遺伝子をクローニングすることができる。
【００２８】
フェイシン遺伝子への変異導入は、一般的な方法を適用することができる。一例として当該遺伝子に対してランダムプライマーを用いた変異導入法、部位特異的変異を有するプライマーを用いた変異導入法などを利用することができる。これらの方法を用いることによりフェイシンを構成するいずれのアミノ酸に対しても効率よく変異を導入することができる。
【００２９】
フェイシンに対する変異導入はアミノ末端領域に行われ、具体的には、アミノ末端（Ｎ末端）から２０番目までのアミノ酸領域において１以上のアミノ酸が置換される。好ましくはＮ末端から４番目のアミノ酸に対して行われる。一例として、Ａ．ｃａｖｉａｅ由来のフェイシンのアミノ酸配列（配列番号１）のうちＮ末端から４番目のアミノ酸はアスパラギン酸であるが、このアスパラギン酸を、アスパラギン酸以外の１９種類のアミノ酸に置換することができる。好ましくは、Ｎ末端から４番目のアスパラギン酸を、極性だが電荷のない天然アミノ酸（セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミンに加え、分子内でアミノ基・カルボキシル基の占める割合の大きいグリシンを含める。）の一つに置換することができる。より好ましくは、Ｎ末端から４番目のアスパラギン酸を、アスパラギンに置換することができる。Ａ．ｃａｖｉａｅ由来のフェイシンのアミノ酸配列においてＮ末端から４番目のアミノ酸がアスパラギン酸からアスパラギンに置換されてなるアミノ酸配列を配列番号３に示す。
【００３０】
フェイシンに対する変異導入は、Ｎ末端から４番目のアミノ酸のみに限定されない。本発明の効果が発揮される限り、他のアミノ酸残基において変異が導入されていてもよい。この時、本発明の変異型フェイシンのアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列（Ａ．ｃａｖｉａｅ由来の野生型フェイシンのアミノ酸配列を表す）と８５％以上の配列同一性を示すことが好ましい。より好ましくは９０％以上であり、さらに好ましくは９５％以上であり、さらに好ましくは９７％以上である。
【００３１】
ＰＨＡ生産微生物において変異型フェイシンを発現させるために、変異型フェイシン遺伝子の上流にプロモーター、下流にターミネーターを連結して変異型フェイシン遺伝子発現カセットを構築することが好ましい。プロモーターとしては当該ＰＨＡ生産微生物において機能するものであればどのようなプロモーターでもよく、一例として、ラクトースオペロンプロモーター、λファージプロモーター、Ａ．ｃａｖｉａｅ由来のＰＨＡオペロンプロモーター、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ由来のＰＨＡオペロンプロモーターなどを利用することができる。また、ターミネーターとしては当該ＰＨＡ生産微生物において機能するものであればどのようなターミネーターでもよく、一例として、ｒｒｎターミネーター、Ａ．ｃａｖｉａｅ由来のＰＨＡオペロンターミネーター、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ由来のＰＨＡオペロンターミネーターなどを利用することができる。
【００３２】
上記のように作製した変異型フェイシン遺伝子発現カセットは、種々の形質転換法を用いてＰＨＡ生産微生物に形質転換することができる。ＰＨＡ生産微生物としては、例えば、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ属、又は、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属に属する微生物が挙げられる。より具体的には、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ、Ａ.ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｌａｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐ.ｐｕｔｉｄａ、Ｐ.ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、又は、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍに属する微生物が挙げられる。このうち、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ、Ａ．ｃａｖｉａｅ、Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ、Ｐ.ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｎａｓ ａｅｒｇｉｎｏｓａ等は、本来ＰＨＡを生産する微生物である。また、Ｅ．ｃｏｌｉのように本来ＰＨＡを生産できない微生物にＰＨＡ合成系遺伝子群等を形質転換することでＰＨＡを生産可能となった微生物も利用することができる。更に、本来ＰＨＡを生産する微生物のＰＨＡ合成酵素遺伝子が破壊され、且つ他の微生物由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子を形質転換することでＰＨＡを生産可能となった微生物も利用することができる。
【００３３】
変異型フェイシン遺伝子発現カセットの前記ＰＨＡ生産微生物への形質転換には、一般的な種々の方法を利用することができる。自律増殖可能なプラスミドベクターを用いる場合、当該ベクターに当該発現カセットを挿入することで発現プラスミドを構築し、電気導入法やカルシウム法などにより発現プラスミドをＰＨＡ生産微生物に形質転換することができる。例えば、大腸菌で自律増殖可能なプラスミドベクターとしてｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２を用い、当該ベクターにＡ．ｃａｖｉａｅ由来の変異型フェイシン及びポリエステル合成系遺伝子群発現カセットを組み込んだ発現プラスミドを大腸菌に形質転換し、形質転換微生物を取得できる。また、本発現プラスミドはＣ．ｎｅｃａｔｏｒにおいて自律増殖することができることから、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ由来の宿主に形質転換することもできる。
【００３４】
また、当該発現カセットをＰＨＡ生産微生物の染色体上に組み込むことで形質転換することもできる。具体的には、発現カセットの上流と下流にＰＨＡ生産微生物のゲノム配列の一部を連結し、当該構築物を電気導入法やカルシウム法などにより形質転換することで当該微生物の染色体上に組み込むことができる。更に、本来ＰＨＡを生産する微生物は、当該微生物由来のフェイシン遺伝子を保有している。このため、形質転換する変異型フェイシン遺伝子を用いて当該微生物のフェイシン遺伝子を破壊・置換することが好ましい。発現カセットの染色体上への挿入には、種々の抗生物質耐性遺伝子や糖代謝に関わるｓａｃＢ遺伝子などの適切な選択マーカーが種々準備されており、それらを適切に組み合わせて用いることができる。
【００３５】
上記形質転換微生物を用いてポリヒドロキシアルカン酸を発酵生産することで、変異型フェイシンの効果（ＰＨＡ生産性向上、共重合比の制御）を明らかにすることができる。形質転換微生物の培養では、炭素源、炭素源以外の栄養源である窒素源、無機塩類、そのほかの有機栄養源を含む培地を用いて、当該形質転換微生物を培養することが好ましい。炭素源としては、糖類、油脂類、脂肪酸類などが好ましく、より好ましくはブドウ糖、蔗糖、植物油脂、植物由来脂肪酸類である。窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス等が挙げられる。無機塩類としては、例えばリン酸２水素カリウム、リン酸水素２ナトリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。そのほかの有機栄養源としては、例えばグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリン等のアミノ酸、ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ等のビタミン等が挙げられる。また、培養液中に、発現プラスミドに存在する抗生物質耐性遺伝子に対応する抗生物質（アンピシリン、カナマイシン等）を添加しても良い。
【００３６】
本発明において、形質転換微生物の菌体からのＰＨＡ（ホモポリマー、共重合ポリエステル）の回収は、特に限定されないが、例えば次のような方法により行うことができる。培養終了後、培養液から遠心分離機等で菌体を分離し、その菌体を蒸留水およびメタノール等により洗浄し、乾燥させる。この乾燥菌体から、クロロホルム等の有機溶剤を用いてＰＨＡを抽出する。このＰＨＡを含んだ有機溶剤溶液から、濾過等によって菌体成分を除去し、その濾液にヘキサン等の貧溶媒を加えてＰＨＡを沈殿させる。さらに、濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させてＰＨＡを回収する。
【００３７】
得られたＰＨＡの重量平均分子量（Ｍｗ）はＧＰＣを用いて測定することができ、また得られたＰＨＡが共重合ポリエステルの場合には、その組成の分析をガスクロマトグラフ法や核磁気共鳴法等により行うことができる。例えば共重合ポリエステルがＰＨＢＨの場合、３ＨＢ／３ＨＨ組成比を決定することができる。
【００３８】
本発明により、ＰＨＡの工業的発酵生産により高い生産性にてＰＨＡを生産する方法が提供され、複数のモノマーから構成される共重合ＰＨＡのモノマー組成比を制御することで硬質から軟質に至る物性を示すＰＨＡを製造する方法が提供される。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例によりその技術的範囲を限定されるものではない。なお一般的な遺伝子操作は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、（１９８９））に記載されている方法等を用いることができる。また、遺伝子操作に使用する酵素、クローニング宿主等は、市場の供給者から購入し、その取扱説明書に従い使用することができる。なお、酵素としては、遺伝子操作に使用できるものであれば特に限定されない。
【００４０】
（実施例１）Ａ．ｃａｖｉａｅのフェイシン（ＰｈａＰＡＣ）変異体Ｄ４Ｎの取得
（１）ｐＢＢＲ１ｐｈａＰＣＪＡｃＡＢＲｅ
本プラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉを宿主とした糖からのＰＨＢホモポリマー合成および脂肪酸からのＰＨＢＨ合成の両方に利用できるプラスミドである。Ｋｉｃｈｉｓｅ等によって作製されたプラスミドｐＢＳＥＥ３２ｐｈｂＡＢ（Ｋｉｃｈｉｓｅ等，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖｏｌ６８，２４１１（２００２））を制限酵素（ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ）で処理することで調製した発現ユニットｐｈａＰＣＪＡｃＡＢＲｅを、制限酵素（ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ）で切断した広域ベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２に挿入することで作製した。当該発現ユニットの上流にはＡ．ｃａｖｉａｅ由来のプロモーター、および、Ｅ．ｃｏｌｉでより転写活性の高いｌａｃプロモーターが配置されている。その構造を図１に示す。
【００４１】
（２）ｐＢＢＲ１ｐｈａＰＣＪＡｃＡＢＲｅ Ｄ１７１Ｘの作製
ｐＢＢＲ１ｐｈａＰＣＪＡｃＡＢＲｅのＡ．ｃａｖｉａｅ由来ｐｈａＣ（ＰＨＡ合成酵素遺伝子）のＤ１７１位（１７１番目のアスパラギン酸）に対してＰＣＲを用いた部位特異的ランダム変異導入（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ１９，２７８５（１９９１））を行った後、ＢＫＬキット（タカラバイオ製）による平衡末端化、リン酸化及び自己ライゲーション反応を行った。ＰＣＲの条件を図２に示す。
【００４２】
次に自己ライゲーション反応液をＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９またはＥ．ｃｏｌｉ ＬＳ５２１８のコンピテントセルに形質転換することで種々のＤ１７１位の変異体を取得した。導入された変異は、当該プラスミドの全長又はｐｈａＣ、ｐｈａＰの塩基配列を決定することで解析した。
【００４３】
その結果、ｐｈａＣのＤ１７１がＬ（ロイシン）に置換されたプラスミドｐＢＢＲ１ｐｈａＰＣＪＡｃＡＢＲｅＤ１７１Ｌを取得した（比較例）。
【００４４】
同時に、ｐｈａＣのＤ１７１のＬへの置換に加えて、ＰｈａＰのＤ４（４番目のアスパラギン酸）がＮ（アスパラギン）に置換されたプラスミドｐＢＢＲ１ｐｈａＰ（Ｄ４Ｎ）ＣＪＡｃＡＢＲｅＤ１７１Ｌも取得した。同プラスミドには同変異に加えてｍｏｂ（プラスミド伝達に関与する遺伝子）のＲ１７７（１７７番目のアルギニン）がＣ（システイン）に置換され、Ｌ３０１（３０１番目のロイシン）にはサイレント変異が導入されていた。ＰＣＲの条件を図２に示す。
【００４５】
野生型ＰｈａＰのアミノ酸 配列を配列番号１に、Ｄ４がＮに置換された変異型ＰｈａＰのアミノ酸配列を配列番号３に示す。
【００４６】
ベクター部分の変異の影響を避けるため、ｐｈａＣ（Ｄ１７１Ｌ）およびＰｈａＰ（Ｄ４Ｎ）の変異を有する発現ユニット（ｐｈａＰ（Ｄ４Ｎ）ＣＪＡｃＡＢＲｅＤ１７１Ｌ）を前述の方法を用いてｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２に再挿入し、ｐＢＢＲ１ｐｈａＰ（Ｄ４Ｎ）ＣＪＡｃＡＢＲｅＤ１７１Ｌを作製した（実施例）。
【００４７】
さらに、ｐｈａＣが野生型（ＷＴ）でかつＰｈａＰのＤ４がＮに置換されたプラスミドｐＢＢＲ１ｐｈａＰ（Ｄ４Ｎ）ＣＪＡｃＡＢＲｅＷＴを作製した（実施例）。本プラスミドは、ｐＢＢＲ１ｐｈａＰ（Ｄ４Ｎ）ＣＪＡｃＡＢＲｅＤ１７１Ｌを制限酵素ＫｐｎＩとＳｇｆＩで処理し、同酵素で処理したｐＢＢＲ１ｐｈａＰＣＪＡｃＡＢＲｅベクターに挿入することで構築した。
【００４８】
（実施例２）大腸菌を宿主としたフェイシン変異体（ｐｈａＰ（Ｄ４Ｎ））のＰＨＡ生産に与える効果
（１）形質転換体の培養方法
実施例１において作製した４種類のプラスミド（ｐＢＢＲ１ｐｈａＰＣＪＡｃＡＢＲｅ、ｐＢＢＲ１ｐｈａＰＣＪＡｃＡＢＲｅＤ１７１Ｌ、ｐＢＢＲ１ｐｈａＰ（Ｄ４Ｎ）ＣＪＡｃＡＢＲｅＷＴ、ｐＢＢＲ１ｐｈａＰ（Ｄ４Ｎ）ＣＪＡｃＡＢＲｅＤ１７１Ｌ）をＥ．ｃｏｌｉ ＬＳ５２１８に形質転換し、カナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）を含むＬＢ寒天培地に塗り広げ、３７℃で一晩培養することでそれぞれの形質転換体を培養した。
【００４９】
プレート培地に形成された単一コロニー（形質転換体）をＬＢ液体培地に植菌し、３７℃、１５０回／ｍｉｎで１６時間振盪培養した（前培養）。次に５００ｍｌ振とうフラスコに、単一炭素源としてドデカン酸ナトリウム（２．５ｇ／Ｌ）を含む１００ｍｌのＭ９液体培地（表１）を入れ、前培養液１ｍｌを植菌し、３７℃、１３０回／ｍｉｎで７２時間振とう培養した（本培養）。なお、抗生物質としてカナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）を加えた。また、炭素源であるドデカン酸ナトリウムは水に対する溶解度が低く、これを補うために非イオン性界面活性剤ＢＲＩＪ３５（ポリオキシエチレンラウリルエーテル）を０．４ｖｏｌ％加えた。
【００５０】
【表１】
【００５１】
（２）集菌方法
上記（１）の培養液を２５０ｍｌ遠沈管に移し、振とうフラスコ内を適量のヘキサンで１回、純水で３回すすいだ。この洗液も遠沈管に加えて激しく撹拌した後、４℃、６０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、上清を除いた。菌体ペレットを適量の純水で懸濁して激しく撹拌した後、４℃、６０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、上清を除いた。ペレットを適量の純水（５ｍｌ未満）に懸濁し、風袋を秤量済みの５ｍｌ集菌チューブに移して凍結乾燥した。乾燥後のチューブを秤量することで乾燥菌体重量を得た。
【００５２】
（３）分析方法
（３−１）ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）
培養菌体が合成したＰＨＡの含有率とモノマー組成比は、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）を用いて内部標準法により求めた。この方法では、メタノリシス反応により生じた乾燥菌体内ＰＨＡ分解物であるメチルエステルを測定する。
【００５３】
乾燥菌体をネジ蓋付き試験管に約１０ｍｇ採り、１５％硫酸-メタノール溶液２ｍｌとクロロホルム２ｍｌを加え、途中で数回激しく撹拌しながら１００℃で１４０ｍｉｎ加熱した。室温まで放冷した後、超純水１ｍｌを加えて激しく混合し、一晩放置した。二層分離したサンプル溶液の下層（クロロホルム層）をパスツールピペットで採り、φ０．４５μｍ ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）フィルター（Ａｄｖａｎｔｅｃ製）でろ過した。
【００５４】
１．５ｍｌバイアル管にこのろ液と０．１％オクタン酸メチル−クロロホルム溶液を５００μｌずつ加え、８ｍｍポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）／シリコンセプタムを挟んで蓋をした。この溶液をサンプルとした。
【００５５】
ＧＣ測定は、以下の条件下で行った。
【００５６】
（ＧＣ分析装置）
ＧＣ装置：ガスクロマトグラフＧＣ−１４Ｂ（島津製作所製）
キャピラリーカラム：１００％メチルポリシロキサン無極性カラム１０１０−１１１４３（架橋タイプ、内径 ０．２５ｍｍ × ３０ｍ、膜厚 ０．４μｍ）（ジーエルサイエンス製）
検出器：水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）
オートインジェクタ：ＡＯＣ−２０ｉオートインジェクタ２２１−４４５２７−３０（島津製作所製）
オートサンプラ：ＡＯＣ−２０ｓオートサンプラ２２１−４４８８０−３０（島津製作所製）
解析装置：クロマトパックＣ−Ｒ７Ａ ｐｌｕｓ（島津製作所製）
（ＧＣ測定条件）
ＧＣ測定条件を、表２および表３に示す。
【００５７】
【表２】
【００５８】
【表３】
【００５９】
ＦＩＤにより検出した各保持時間のピークの積分値から、ＰＨＡ菌体内含有率およびモノマー組成比を決定した。ＧＣ測定結果の解析は以下の手順で行った。
【００６０】
ＧＣ測定の結果、各モノマーに対応するメチルエステルａ、ｂ、ｃ（モノマーユニット数に対応）が検出されたとき、その積分値をＡ、Ｂ，Ｃとし、対応する補正係数（相対感度の逆数）をＸ、Ｙ、Ｚとすると、ａのモル分率は次式から求められる。
【００６１】
【数１】
【００６２】
なお、３ＨＢの値で規格化された各補正係数を表４に示す。
【００６３】
【表４】
【００６４】
内部標準物質であるオクタン酸メチルのピークの積分値をＳ、サンプルに用いた乾燥菌体の重量をｍ（ｍｇ）とすると、ＰＨＡ菌体内含有率Ｐ（ｗｔ％）は以下の式より算出できる。
【００６５】
【数２】
【００６６】
ここでＫはＰＨＢを用いて作成した検量線から決定した定数で、本実施例では次式よりＫ値を５．８とした。
【００６７】
【数３】
【００６８】
フェイシン変異体の培養結果を表５に示す。表中のＤＣＷ（乾燥菌体重量）、ＰＨＡ含量および３ＨＨ組成比に関する各数値は、平均値±標準偏差である。この結果より、ｐｈａＣのＤ１７１Ｌ変異の有無に関わらず、ｐｈａＰのＤ４Ｎ変異体においてＰＨＡ（ＰＨＢＨ）含量および３ＨＨ組成比が大きく向上していることが明らかになった。
【００６９】
【表５】
【００７０】
(実施例３)フェイシン変異体（Ｄ４Ｘ）の作製
ｐＢＢＲ１ｐｈａＰＣＪＡｃＡＢＲｅのｐｈａＰのＤ４位（４番目のアスパラギン酸）に対してＰＣＲを用いた部位特異的ランダム変異導入（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ１９，２７８５（１９９１））を行った後、ＢＫＬキット（タカラバイオ製）による平衡末端化、リン酸化及び自己ライゲーション反応を行った。ＰＣＲの条件を図３に示す。次に自己ライゲーション反応液をＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９またはＥ．ｃｏｌｉ ＬＳ５２１８のコンピテントセルに形質転換することで種々のＤ１７１位の変異体を取得した。導入された変異は、当該プラスミドのｐｈａＰの塩基配列を決定することで解析した。
【００７１】
その結果、ｐｈａＰの４番目のアスパラギン酸に対して、アスパラギン酸以外の１９種類の天然アミノ酸に置換された変異体を作製することができた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物由来のポリヒドロキシアルカン酸結合タンパク質のＮ末端から２０番目までのアミノ酸領域において１以上のアミノ酸が置換されてなるアミノ酸配列を有する、変異型ポリヒドロキシアルカン酸結合タンパク質。
【請求項２】
前記微生物がＡｅｒｏｍｏｎａｓ属微生物である、請求項１に記載の変異型ポリヒドロキシアルカン酸結合タンパク質。
【請求項３】
配列番号１に示されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を有する、請求項２に記載の変異型ポリヒドロキシアルカン酸結合タンパク質。
【請求項４】
前記Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属微生物由来のポリヒドロキシアルカン酸結合タンパク質のＮ末端から４番目のアミノ酸が置換されてなるアミノ酸配列を有する、請求項２又は３に記載の変異型ポリヒドロキシアルカン酸結合タンパク質。
【請求項５】
前記Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属微生物由来のポリヒドロキシアルカン酸結合タンパク質のＮ末端から４番目のアミノ酸が、アスパラギン酸を除く１９種類の天然アミノ酸の一つに置換されてなるアミノ酸配列を有する、請求項４に記載の変異型ポリヒドロキシアルカン酸結合タンパク質。
【請求項６】
前記アスパラギン酸を除く１９種類の天然アミノ酸が、非電荷の極性天然アミノ酸である、請求項５に記載の変異型ポリヒドロキシアルカン酸結合タンパク質。
【請求項７】
前記非電荷の極性天然アミノ酸がアスパラギンである、請求項６に記載の変異型ポリヒドロキシアルカン酸結合タンパク質。
【請求項８】
前記Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属微生物が、Ａ．ｃａｖｉａｅ、Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ、Ａ．ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ、Ａ．ａｌｌｏｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａ、Ａ．ｂｅｓｔｉａｒｕｍ、Ａ．ｅｎｃｈｅｌｅｉａ、Ａ．ｅｎｔｅｒｏｐｅｌｏｇｅｎｅｓ、Ａ．ｅｕｃｒｅｎｏｐｈｉｌａ、Ａ．ｉｃｈｔｈｉｏｓｍｉａ、Ａ．ｊａｎｄａｅｉ、Ａ．ｍｅｄｉａ、Ａ．ｐｏｐｏｆｆｉｉ、Ａ．ｐｕｎｃｔａｔａ、Ａ．ｓｃｈｕｂｅｒｔｔｉ、Ａ．ｓｏｂｒｉａ、又はＡ．ｔｒｏｔａである、請求項２〜７のいずれか一項に記載の変異型ポリヒドロキシアルカン酸結合タンパク質。
【請求項９】
前記Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属微生物が、Ａ．ｃａｖｉａｅ又はＡ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａである、請求項８に記載の変異型ポリヒドロキシアルカン酸結合タンパク質。
【請求項１０】
前記Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属微生物がＡ．ｃａｖｉａｅである、請求項９に記載の変異型ポリヒドロキシアルカン酸結合タンパク質。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の変異型ポリヒドロキシアルカン酸結合タンパク質をコードする遺伝子。
【請求項１２】
ポリヒドロキシアルカン酸生産微生物において機能するプロモーター及びターミネーターと、請求項１１に記載の遺伝子と、を含む、遺伝子発現カセット。
【請求項１３】
請求項１１に記載の遺伝子又は請求項１２に記載の遺伝子発現カセットをポリヒドロキシアルカン酸生産微生物に導入して得られる形質転換微生物。
【請求項１４】
前記ポリヒドロキシアルカン酸生産微生物が、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ属、又は、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属に属する微生物である、請求項１３に記載の形質転換微生物。
【請求項１５】
前記ポリヒドロキシアルカン酸生産微生物が、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ、Ａ.ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｌａｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐ.ｐｕｔｉｄａ、Ｐ.ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、又は、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍに属する微生物である、請求項１４に記載の形質転換微生物。
【請求項１６】
前記ポリヒドロキシアルカン酸生産微生物が、Ｃ４〜Ｃ１６のヒドロキシアルカン酸からなる群から選ばれる１以上のヒドロキシアルカン酸をモノマー単位として含むポリヒドロキシアルカン酸を生産する微生物である、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の形質転換微生物。
【請求項１７】
前記ポリヒドロキシアルカン酸生産微生物が、Ｃ４〜Ｃ１６のヒドロキシアルカン酸からなる群から選ばれる２以上のヒドロキシアルカン酸をモノマー単位として含む共重合ポリヒドロキシアルカン酸を生産する微生物である、請求項１６に記載の形質転換微生物。
【請求項１８】
前記ポリヒドロキシアルカン酸生産微生物がポリヒドロキシ酪酸を生産する微生物である、請求項１６に記載の形質転換微生物。
【請求項１９】
前記ポリヒドロキシアルカン酸生産微生物が３−ヒドロキシ酪酸をモノマー単位として含む共重合ポリヒドロキシアルカン酸を生産する微生物である、請求項１７に記載の形質転換微生物。
【請求項２０】
前記ポリヒドロキシアルカン酸生産微生物が、３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸をモノマー単位として含む共重合ポリヒドロキシアルカン酸を生産する微生物である、請求項１９に記載の形質転換微生物。
【請求項２１】
請求項１３〜２０のいずれか一項に記載の形質転換微生物を培養してポリヒドロキシアルカン酸を発酵生産する工程を含む、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
【請求項１】
微生物由来のポリヒドロキシアルカン酸結合タンパク質のＮ末端から２０番目までのアミノ酸領域において１以上のアミノ酸が置換されてなるアミノ酸配列を有する、変異型ポリヒドロキシアルカン酸結合タンパク質。
【請求項２】
前記微生物がＡｅｒｏｍｏｎａｓ属微生物である、請求項１に記載の変異型ポリヒドロキシアルカン酸結合タンパク質。
【請求項３】
配列番号１に示されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を有する、請求項２に記載の変異型ポリヒドロキシアルカン酸結合タンパク質。
【請求項４】
前記Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属微生物由来のポリヒドロキシアルカン酸結合タンパク質のＮ末端から４番目のアミノ酸が置換されてなるアミノ酸配列を有する、請求項２又は３に記載の変異型ポリヒドロキシアルカン酸結合タンパク質。
【請求項５】
前記Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属微生物由来のポリヒドロキシアルカン酸結合タンパク質のＮ末端から４番目のアミノ酸が、アスパラギン酸を除く１９種類の天然アミノ酸の一つに置換されてなるアミノ酸配列を有する、請求項４に記載の変異型ポリヒドロキシアルカン酸結合タンパク質。
【請求項６】
前記アスパラギン酸を除く１９種類の天然アミノ酸が、非電荷の極性天然アミノ酸である、請求項５に記載の変異型ポリヒドロキシアルカン酸結合タンパク質。
【請求項７】
前記非電荷の極性天然アミノ酸がアスパラギンである、請求項６に記載の変異型ポリヒドロキシアルカン酸結合タンパク質。
【請求項８】
前記Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属微生物が、Ａ．ｃａｖｉａｅ、Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ、Ａ．ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ、Ａ．ａｌｌｏｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａ、Ａ．ｂｅｓｔｉａｒｕｍ、Ａ．ｅｎｃｈｅｌｅｉａ、Ａ．ｅｎｔｅｒｏｐｅｌｏｇｅｎｅｓ、Ａ．ｅｕｃｒｅｎｏｐｈｉｌａ、Ａ．ｉｃｈｔｈｉｏｓｍｉａ、Ａ．ｊａｎｄａｅｉ、Ａ．ｍｅｄｉａ、Ａ．ｐｏｐｏｆｆｉｉ、Ａ．ｐｕｎｃｔａｔａ、Ａ．ｓｃｈｕｂｅｒｔｔｉ、Ａ．ｓｏｂｒｉａ、又はＡ．ｔｒｏｔａである、請求項２〜７のいずれか一項に記載の変異型ポリヒドロキシアルカン酸結合タンパク質。
【請求項９】
前記Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属微生物が、Ａ．ｃａｖｉａｅ又はＡ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａである、請求項８に記載の変異型ポリヒドロキシアルカン酸結合タンパク質。
【請求項１０】
前記Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属微生物がＡ．ｃａｖｉａｅである、請求項９に記載の変異型ポリヒドロキシアルカン酸結合タンパク質。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の変異型ポリヒドロキシアルカン酸結合タンパク質をコードする遺伝子。
【請求項１２】
ポリヒドロキシアルカン酸生産微生物において機能するプロモーター及びターミネーターと、請求項１１に記載の遺伝子と、を含む、遺伝子発現カセット。
【請求項１３】
請求項１１に記載の遺伝子又は請求項１２に記載の遺伝子発現カセットをポリヒドロキシアルカン酸生産微生物に導入して得られる形質転換微生物。
【請求項１４】
前記ポリヒドロキシアルカン酸生産微生物が、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ属、又は、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属に属する微生物である、請求項１３に記載の形質転換微生物。
【請求項１５】
前記ポリヒドロキシアルカン酸生産微生物が、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ、Ａ.ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｌａｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐ.ｐｕｔｉｄａ、Ｐ.ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、又は、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍに属する微生物である、請求項１４に記載の形質転換微生物。
【請求項１６】
前記ポリヒドロキシアルカン酸生産微生物が、Ｃ４〜Ｃ１６のヒドロキシアルカン酸からなる群から選ばれる１以上のヒドロキシアルカン酸をモノマー単位として含むポリヒドロキシアルカン酸を生産する微生物である、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の形質転換微生物。
【請求項１７】
前記ポリヒドロキシアルカン酸生産微生物が、Ｃ４〜Ｃ１６のヒドロキシアルカン酸からなる群から選ばれる２以上のヒドロキシアルカン酸をモノマー単位として含む共重合ポリヒドロキシアルカン酸を生産する微生物である、請求項１６に記載の形質転換微生物。
【請求項１８】
前記ポリヒドロキシアルカン酸生産微生物がポリヒドロキシ酪酸を生産する微生物である、請求項１６に記載の形質転換微生物。
【請求項１９】
前記ポリヒドロキシアルカン酸生産微生物が３−ヒドロキシ酪酸をモノマー単位として含む共重合ポリヒドロキシアルカン酸を生産する微生物である、請求項１７に記載の形質転換微生物。
【請求項２０】
前記ポリヒドロキシアルカン酸生産微生物が、３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸をモノマー単位として含む共重合ポリヒドロキシアルカン酸を生産する微生物である、請求項１９に記載の形質転換微生物。
【請求項２１】
請求項１３〜２０のいずれか一項に記載の形質転換微生物を培養してポリヒドロキシアルカン酸を発酵生産する工程を含む、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
【図２】
【図３】
【図１】
【図３】
【図１】
【公開番号】特開２０１３−４２６９７（Ｐ２０１３−４２６９７Ａ）
【公開日】平成２５年３月４日（２０１３．３．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１８２３５２（Ｐ２０１１−１８２３５２）
【出願日】平成２３年８月２４日（２０１１．８．２４）
【出願人】（３０４０２１４１７）国立大学法人東京工業大学 (1,821)
【出願人】（００００００９４１）株式会社カネカ (3,932)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年３月４日（２０１３．３．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年８月２４日（２０１１．８．２４）
【出願人】（３０４０２１４１７）国立大学法人東京工業大学 (1,821)
【出願人】（００００００９４１）株式会社カネカ (3,932)
【Ｆターム（参考）】
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