変異型尿酸オキシダーゼおよびその利用
【課題】 トランケートされ、構造安定性が向上した変異型組み換えウリカーゼタンパク質の提供。
【解決手段】 本発明は、尿酸分解活性を有する遺伝的に改変したタンパク質に関する。より具体的には、本発明は切断型尿酸オキシダーゼを含むタンパク質、ならびにその製造法、および、切断型尿酸オキシダーゼを含むＰＥＧ化タンパク質を含む。
【解決手段】 本発明は、尿酸分解活性を有する遺伝的に改変したタンパク質に関する。より具体的には、本発明は切断型尿酸オキシダーゼを含むタンパク質、ならびにその製造法、および、切断型尿酸オキシダーゼを含むＰＥＧ化タンパク質を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連文献の相互参照
本出願は、参照によりここに援用されるところの、２００５年４月１１日出願の米国特許仮出願番号第６０／６７０，５４１号の優先権並びに利益を請求するものである。
【０００２】
技術分野
本発明は、尿酸分解活性を有する遺伝的に改変されたタンパク質に関する。より具体的には切断型尿酸オキシダーゼを含むタンパク質および、その製造法に関する。
【０００３】
背景技術
以下、「尿酸オキシダーゼ」と「ウリカーゼ」を同義語として用いる。尿酸オキシダーゼ（ウリカーゼ、Ｅ．Ｃ．１．７．３．３）は、酸化を触媒する事によって尿酸を、より可溶性が高く、より容易に排泄されるプリン代謝物質、アラントインへ転換する酵素である。ヒトは、高等霊長類の進化の過程で蓄積したウリカーゼ遺伝子へのいくつかの変異により、酵素活性を有するウリカーゼを生産しない。Ｗｕ，Ｘ，ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ ３４：７８−８４を参照することにより、その全文を本明細書に含む。この結果、感受性個体では、血中での過剰濃度の尿酸（高尿酸血症）が疼痛性関節炎（痛風）、関節破壊を伴う尿酸塩沈着（痛風結節）および腎不全を引き起こすことがある。アロプリノール（尿酸合成阻害剤）などの薬剤が利用可能であるが、一部の罹患個体では、治療を限定する有害作用を生じるか、またはこれらの症状を適切に軽減できない場合がある。Ｈａｎｄｅ，ＫＲ，ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ ７６：４７−５６、Ｆａｍ，ＡＧ，（１９９０） Ｂａｉｌｌｉｅｒｅ’ｓ Ｃｌｉｎ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ ４：１７７−１９２を、それぞれ参照することによってその全文を本明細書に含む。ウリカーゼの注入は、高尿酸血症および高尿酸尿症を少なくとも一次的に低減し得る。しかしながら、ウリカーゼはヒトにおいては外来タンパク質であるため、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ由来の非修飾タンパク質の一次注射でさえ、処置患者の数パーセントにおいてアナフィラキシー反応を誘導し（Ｐｕｉ，Ｃ−Ｈ，ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｌｅｕｋｅｍｉａ １１：１８１３−１８１６を、参照することによってその全文を本明細書に含む）、免疫応答は慢性的または間欠的治療における有用性を限定する（Ｄｏｎａｄｉｏ，Ｄ，ｅｔ ａｌ．，（１９８１） Ｎｏｕｖ Ｐｒｅｓｓｅ Ｍｅｄ １０：７１１−７１２、Ｌｅａｕｓｔｉｃ，Ｍ，ｅｔ ａｌ．，（１９８３） Ｒｅｖ Ｒｈｕｍ Ｍａｌ Ｏｓｔｅｏａｒｔｉｃ ５０：５５３−５５４をそれぞれ参照することによって全文を本明細書に含む）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、トランケートされ、構造安定性が向上した変異型組み換えウリカーゼタンパク質に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は新規の組み換えウリカーゼタンパク質を提供する。本発明のウリカーゼはトランケートされており、天然のウリカーゼタンパク質に対して、変異したアミノ酸を有する。
【０００６】
本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８のアミノ酸配列を含む変異型組み換えウリカーゼを提供する。さらにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３のアミノ酸配列を含む変異型組み換えウリカーゼも提供する。
【０００７】
本発明のさらなる目的は、尿酸分解活性を有する新規の組み換えウリカーゼタンパク質を含む、尿酸を代謝する手段を提供することである。尿酸分解活性とは、本明細書では酵素による尿酸のアラントインへの変換を指す。
【０００８】
特定の一実施形態にあっては、ウリカーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２の位置８から位置２８７のアミノ酸配列を含む。さらにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３のアミノ酸配列を含むウリカーゼが提供される。一実施形態にあっては、ウリカーゼはアミノ末端アミノ酸を含み、該アミノ末端アミノ酸はアラニン、グリシン、プロリン、セリンまたはトレオニンである。特定の一実施形態にあっては、アミノ末端アミノ酸はメチオニンである。
【０００９】
本発明は、本発明のウリカーゼをコードする核酸配列を含む、単離された核酸も提供する。一実施形態にあっては、該ウリカーゼをコードする核酸は動作可能なように異種性のプロモータ、例えばｏｓｍＢプロモータに連結されている。さらに、ウリカーゼをエンコードする核酸を含む核酸ベクター、ならびにこのようなベクターを含む宿主細胞も提供される。さらに一実施形態にあっては、核酸はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７の配列を有する。
【００１０】
このような宿主細胞を、核酸配列が宿主細胞によって発現されるような条件下で培養し、発現されたウリカーゼを単離する工程を含む、ウリカーゼを生成する方法も、提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１はプラスミドｐＯＵＲ−Ｐ−ΔＮ−ｋｓ−１の構造を示している。制限酵素サイトの横に示された番号は、１で示したＨａｅＩＩサイトから数えた、ヌクレオチドの位置を示している。クローニングの過程で失われた制限酵素サイトは、括弧付きで示している。
【００１２】
【図２】図２は、Ｐｉｇ−ＫＳ−ΔＮウリカーゼのＤＮＡ配列、および推定されるアミノ酸配列を示したものである（それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７）。図２のアミノ酸番号は、全長ブタウリカーゼに対応している。イニシエーターであるメチオニン残基に続いて、ブタウリカーゼ配列のアスパラギン酸７がトレオニンに置換されている。サブクローニングの様々な過程で使用した制限酵素サイトが、示されている。３′側の翻訳されない配列は小文字で示されている。翻訳終止コドンは、アスタリスクで示してある。
【００１３】
【図３】図３は様々な組み換えブタ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１）、ＰＢＣ−ΔＮＣ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２）およびＰｉｇ−ＫＳ−ΔＮ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７）ウリカーゼ配列のアラインメントを示している。Ｐｉｇ−ＫＳ−ΔＮで、公開されているブタウリカーゼ配列とアミノ酸の相違がある位置をアスタリスクで示している。丸印は、Ｐｉｇ−ＫＳ−ΔＮとＰＢＣ−ΔＮでアミノ酸の相違がある位置を示している。点線は、アミノ酸の欠失を示している。
【００１４】
【図４】図４はブタウリカーゼおよび、高度に精製した、実施例１から３に従って作成した変異型ウリカーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示している。生成日（月／年）およびそれぞれのサンプルに対応するレーン番号は以下に示してある。Ｙ軸は分子量マーカーの分子量でラベルされており、図の上部にレーン番号を示してある。レーン番号は以下の通りである：レーン１−分子量マーカー、レーン２−ＰｉｇＫＳ−ΔＮ（７／９８）、レーン３−Ｐｉｇ（９／９８）、レーン４−ＰｉｇＫＳ（６／９９）、レーン５−ＰｉｇＫＳ（６／９９）、レーン６−Ｐｉｇ−ΔＮ（６／９９）、レーン７−ＰｉｇＫＳ−ΔＮ（７／９９）、レーン８−ＰｉｇＫＳ−ΔＮ（８／９９）。
【００１５】
【図５】図５は血液サンプルでの酵素活性を測定することによって求めた、ラットでのＰＥＧ化された（９ｘ１０ｋＤ）Ｐｉｇ−ＫＳ−ΔＮウリカーゼのＩＭ（筋肉内投与）、ＳＣ（皮下投与）およびＩＶ（静脈内投与）注射後の薬物動態プロファイルを示している。示した時間間隔で採取した血漿サンプルにおけるウリカーゼ活性は比色分析によって求めた。活性の値（ｍＡＵ＝ミリ吸光度単位）は、血漿サンプル１μｌあたりの酵素反応速度を表している。注射されたウリカーゼの生物学的利用率（ＩＶ注射の内、循環系に到達する薬剤の量）はグラフの曲線の下のエリアから計算した。
【００１６】
【図６】図６は血液サンプルでの酵素活性を測定することによって求めた、ウサギでのＰＥＧ化された（９ｘ１０ｋＤ）Ｐｉｇ−ＫＳ−ΔＮウリカーゼのＩＭ（筋肉内投与），ＳＣ（皮下投与）およびＩＶ（静脈内投与）注射後の薬物動態プロファイルを示している。示した時間間隔で採取した血漿サンプルにおけるウリカーゼ活性は比色分析によって求めた。活性の値（ｍＡＵ＝ミリ吸光度単位）は、血漿サンプル１μlあたりの酵素反応速度を表している。注射されたウリカーゼの生物学的利用率（ＩＶ注射の内、循環系に到達する薬剤の量）はグラフの曲線の下のエリアから計算した。
【００１７】
【図７】図７は血液サンプルでの酵素活性を測定することによって求めた、イヌでのＰＥＧ化された（９ｘ１０ｋＤ）Ｐｉｇ−ＫＳ−ΔＮウリカーゼのＩＭ（筋肉内投与），ＳＣ（皮下投与）およびＩＶ（静脈内投与）注射後の薬物動態プロファイルを示している。示した時間間隔で採取した血漿サンプルにおけるウリカーゼ活性は比色分析によって求めた。活性の値（ｍＡＵ＝ミリ吸光度単位）は、血漿サンプル１μlあたりの酵素反応速度を表している。注射されたウリカーゼの生物学的利用率（ＩＶ注射の内、循環系に到達する薬剤の量）はグラフの曲線の下のエリアから計算した。
【００１８】
【図８】図８は血液サンプルでの酵素活性を測定することによって求めた、ブタでのＰＥＧ化された（９ｘ１０ｋＤ）Ｐｉｇ−ＫＳ−ΔＮウリカーゼのＩＭ（筋肉内投与），ＳＣ（皮下投与）およびＩＶ（静脈内投与）注射後の薬物動態プロファイルを示している。示した時間間隔で採取した血漿サンプルにおけるウリカーゼ活性は比色分析によって求めた。活性の値（ｍＡＵ＝ミリ吸光度単位）は、血漿サンプル１μlあたりの酵素反応速度を表している。注射されたウリカーゼの生物学的利用率（ＩＶ注射の内、循環系に到達する薬剤の量）はグラフの曲線の下のエリアから計算した。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
これまでの研究は、ＰＥＧ化によってウリカーゼの免疫原性および／または抗原性の大幅な低減が達成された場合は、必ず尿酸分解活性も大幅に失われてしまうことを示している。生物薬剤の安全性、利便性および対費用効果は、効力が失われ、また従って投与量を上げなければならないことによって悪影響を受ける。従って、血液を含む体液において、上昇した尿酸レベルを下げる安全で効果的な代替的な方法が必要とされている。本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３のアミノ酸配列を含む変異型組み換えウリカーゼを提供する。
【００２０】
特に記載のない限り、本明細書では用語「ウリカーゼ」を、個々のサブユニットならびにその四量体両方を指すものとして用いる。
【００２１】
本明細書では、用語「変異型ウリカーゼ」を、他のアミノ酸に置換されたアミノ酸を有するウリカーゼ分子を指す語として用いる。
【００２２】
特定の実施態様では、本発明のウリカーゼはアミノ末端メチオニンを有する。特定の実施態様では、アミノ末端メチオニンはウリカーゼが産生された後に除去される。特定の実施態様では、該メチオニンは内在するバクテリアのアミノペプチダーゼによって除去される。Ｎ末端のメチオニンの最も完全な除去を可能にするアミノ酸は、アラニン、グリシン、プロリン、セリンおよびトレオニンである。特定の一実施形態にあっては、ウリカーゼはアミノ末端に２つのアミノ酸を有し、この２つのアミノ酸は一方がメチオニンであって、これに引き続いてアラニン、グリシン、プロリン、セリンおよびトレオニンからなる群から選んだアミノ酸１つが引き続くものである。
【００２３】
本発明はウリカーゼをコードする核酸配列を提供する。
【００２４】
本発明は、当該核酸配列を含むベクターを提供する。
【００２５】
特定の一実施形態にあっては、ウリカーゼは単離される。特定の一実施形態にあっては、ウリカーゼは精製される。特定の実施形態にあっては、ウリカーゼは単離され精製される。
【００２６】
本発明はウリカーゼをコードする核酸配列を含むベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００２７】
本発明はＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応法）技術による、ウリカーゼをコードする核酸配列の改変を含む、ウリカーゼをコードする核酸配列を作成する方法を提供する。当該業務に精通する者には目的の核酸配列がＰＣＲによって、増幅する標的ＤＮＡの領域に相補的な合成オリゴヌクレオチドプライマー（それぞれの鎖に１つずつ）を介して、調製できることが既知である。プライマーを、過剰量のデオキシヌクレオチドおよび、耐熱性ＤＮＡポリメーラーゼであるＴａｑポリメラーゼの存在下で標的ＤＮＡ（純粋なものでなくてよい）に加える。標的ＤＮＡは、連続する温度サイクル（典型的な場合で、３０回）を経る中で反復して変性（約９０℃）、プライマーとのアニーリング（典型的な場合で、５０から６０℃）、プライマーからの娘鎖の伸長（７２℃）を繰り返す。次のサイクルからは娘鎖もテンプレートとして働くので、両方のプライマーとマッチするＤＮＡ断片は線形にではなく、指数関数的に増幅される。
【００２８】
本発明は、変異型組み換えウリカーゼを生成する方法を提供するものであって、宿主細胞のベクターによる形質転換、宿主細胞によるウリカーゼの発現、変異型組み換えウリカーゼの宿主細胞からの単離、精製された変異型組み換えウリカーゼの、例えばクロマトグラフィー技術による単離、および変異型組み換えウリカーゼの精製を含む。例えば、ウリカーゼは参照することによってその全文を本明細書に含む、国際公開第００／０８１９６号パンフレット、および米国特許出願番号６０／０９５，４８９に記載の方法によって作成することができる。
【００２９】
好ましい一実施形態にあっては、変異型組み換えウリカーゼの発現を引き起こすよう、宿主細胞に処置を施す。当該業務に精通する者には、細胞のベクターによる形質転換は通常カルシウムイオンと沈殿させたＤＮＡを用いて達成されるが、他にも様々な方法（例えば電気穿孔法）を用いることができることを理解している。
【００３０】
ウリカーゼは、当該業務に精通した者に既知であるあらゆる方法によって単離および／または精製されうる。一般に、本発明で発現させたポリペプチドは実質的に純粋な形で単離される。好ましくは、ポリペプチドは重量で少なくとも８０％の純度で単離される。より好ましくは、重量で少なくとも９５％の純度、そして最も好ましくは、少なくとも９９％の純度で単離される。一般にこのような精製は、例えば硫安分画法、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法およびアフィニティークロマトグラフィーの標準的な技法を用いて達成されうる。ウリカーゼは、好ましくは陽イオン界面活性剤、例えば、参照することによってその全文を本明細書に含む、２００５年４月１１日出願の同時係属出願、代理人整理番号第１０３８６４．１４６６４４号、タイトルが陽イオン界面活性剤によるタンパク質の精製である、米国特許仮出願番号第６０／６７０，５２０号に記載の方法に従って塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）によって単離される。
【００３１】
本発明の一実施形態にあっては、ベクターは浸透圧感受性プロモータの制御下にある。プロモータとは、ＲＮＡポリメラーゼが、ＤＮＡのＲＮＡへの転写プロセスを開始するに先立って結合する、ＤＮＡ領域のことを言う。浸透圧感受性プロモータは、細胞が浸透圧の上昇を感知した場合に転写を開始する。
【００３２】
本発明のウリカーゼはポリマーと結合したウリカーゼ、たとえばポリエチレングリコールと結合したウリカーゼ、すなわち、ＰＥＧ化されたウリカーゼを含む。
【００３３】
本発明の一実施形態にあっては、ウリカーゼを含む医薬組成物が提供される。一実施形態にあっては、組成物はウリカーゼ溶液である。好ましい一実施形態にあっては、溶液は滅菌済みであり、注射に適している。一実施形態にあっては、このような組成物はウリカーゼのリン酸緩衝生理食塩水溶液を含む。一実施形態にあっては、組成物はバイアルで提供され、さらに、任意にラバー注射ストッパーを備えることができる。特定の実施形態にあっては、組成物は、ウリカーゼを溶液１ミリリットルあたり２から１６ミリグラムの濃度、溶液１ミリリットルあたり４から１２ミリグラムの濃度、溶液１ミリリットルあたり６から１０ミリグラムの濃度で含む。好ましい一実施形態にあっては、組成物はウリカーゼを１ミリリットルあたり８ミリグラムの濃度で含む。好ましくは、ウリカーゼの重量は、タンパク質重量に対して測定される。
【００３４】
本発明の組成物の効果的な投与計画は、当該業務に精通した者によって決定されうる。任意の投与計画の、有効性の評価に適した指標は、当該業務に精通した者に既知である。このような指標の例としては、血漿尿酸レベル（ＰＵＡ）の正常化または低下、ならびにＰＵＡを６．８ｍｇ／ｄＬ以下、好ましくは６ｍｇ／ｄＬ以下に低下または維持させることが挙げられる。好ましい一実施形態にあっては、本発明の組成物による治療の対象者は、総治療期間の７０％以上、８０％以上、または９０％以上の期間、ＰＵＡが６ｍｇ／ｍｌ以下である。例えば治療期間が２４週間である場合、対象者のＰＵＡは２４週間の治療期間の８０％以上の間、すなわち、少なくとも１３４．４日（２４週間ｘ７日間／週間ｘ０．８＝１３４．４日）に等しい時間の間、６ｍｇ／ｍｌ以下である。
【００３５】
特定の実施形態にあっては、溶液としてウリカーゼ０．５から２４ｍｇが２から４週に１回投与される。ウリカーゼは、当該業務に精通した者に既知のあらゆる適切な方法、例えば静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与によって投与することができる。好ましくは、投与が静脈内投与による場合は、ウリカーゼとして０．５ｍｇから１２ｍｇが投与される。好ましくは、投与が皮下投与による場合は、ウリカーゼとして４ｍｇから２４ｍｇが投与される。好ましい一実施形態にあっては、ウリカーゼは静脈点滴によって、３０から２４０分の点滴時間で投与される。一実施形態にあっては、２週間に１回、ウリカーゼとして８ｍｇが投与される。特定の実施形態にあっては、１００から５００ｍＬの生理食塩水を用いて点滴を行うことができる。好ましい一実施形態にあっては、２週間に１回または４週間に１回、点滴時間１２０分で、溶液として８ｍｇのウリカーゼが投与される。好ましくは、点滴に用いるウリカーゼは２５０ｍＬの生理食塩水に溶解される。特定の実施形態にあっては、ウリカーゼの投与は３ヶ月間、６ヶ月間、８ヶ月間または１２ヶ月間の治療期間にわたって行う。他の実施形態にあっては、治療期間は１２週間、２４週間、３６週間または４８週間である。特定の一実施形態にあっては、治療期間は長期間にわたるものであって、例えば２年以上、治療対象者の全生存期間にわたる。加えて、複数の治療期間を、治療休止期間ではさむことも可能である。例えば、６ヶ月間の治療に引き続いて３ヶ月間の治療休止期間をおき、その後再び６ヶ月間治療を行うことなどが、可能である。
【００３６】
特定の実施形態にあっては、ウリカーゼの投与による注入反応の出現を阻止または低減するために、予防的に抗炎症性物質を投与することができる。一実施形態にあっては、少なくとも１つのコルチコステロイド、少なくとも１つの抗ヒスタミン薬、少なくとも１つのＮＳＡＩＤ、またはこれらの組み合わせが、よって投与される。有用なコルチコステロイドには、ベータメタゾン、ブデソニド、コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニソロン、プレドニソロン、プレドニゾンおよびトリアムシノロンが含まれる。有用なＮＳＡＩＤにはイブプロフェン、インドメタシン、ナプロキセン、アスピリン、アセトアミノフェン、セレコキシブおよびバルデコキシブが含まれる。有用な抗ヒスタミン薬には、アザタジン、ブロムフェニラミン、セチリジン、クロルフェニラミン、クレマスチン、シプロヘプタジン、デスロラタジン、デクスクロルフェニラミン、ジメンヒドリナート、ジフェンヒドラミン、ドキシルアミン、フェキソフェナジン、ヒドロキシジン、ロラタジンおよびフェニンダミンが含まれる。
【００３７】
好ましい一実施形態にあっては、抗ヒスタミン薬はフェキソフェナジンであり、ＮＳＡＩＤはアセトアミノフェンであり、コルチコステロイドはヒドロコルチゾンおよび／またはプレドニゾンである。好ましくは、３つ全ての組み合わせ（必ずしも同時にではない）を、ウリカーゼ溶液の注入投与の前に投与する。好ましい一実施形態にあっては、ＮＳＡＩＤと抗ヒスタミン薬はウリカーゼ注入の１から４時間前に経口投与される。フェキソフェナジンの適切な用量は約３０から約１８０ｍｇ、約４０から約１５０ｍｇ、約５０から約１２０ｍｇ、約６０から約９０ｍｇ、約６０ｍｇを含み、好ましくは６０ｍｇである。アセトアミノフェンの適切な用量は約５００から約１５００ｍｇ、約７００から約１２００ｍｇ、約８００から約１１００ｍｇ、約１０００ｍｇを含み、好ましくは１０００ｍｇである。ヒドロコルチゾンの適切な用量は約１００から約５００ｍｇ、約１５０から約３００ｍｇ、約２００ｍｇを含み、好ましくは２００ｍｇである。一実施形態にあっては、抗ヒスタミン薬はジフェンヒドラミンではない。他の実施形態にあっては、ＮＳＡＩＤはアセトアミノフェンではない。好ましい一実施形態にあっては、フェキソフェナジン６０ｍｇをウリカーゼ注入の前夜に経口投与し、フェキソフェナジン６０ｍｇおよびアセトアミノフェン１０００ｍｇを次の朝に経口投与し、最後に、ウリカーゼ注入の直前にヒドロコルチゾン２００ｍｇを投与する。一実施形態にあっては、プレドニゾンをウリカーゼ投与の前日に、好ましくは夕方、投与する。プレドニゾンの適切な用量は５から５０ｍｇを含み、好ましくは２０ｍｇである。特定の実施形態にあっては、注入反応の出現を阻止または低減させるためのこのような予防措置は、ＰＥＧ化ウリカーゼおよび非ＰＥＧ化ウリカーゼを含むウリカーゼ投与を、受けているかまたは受ける予定の治療対象者に対して講じられる。特定の実施形態にあっては、このような予防措置はウリカーゼ以外の、ＰＥＧ化治療薬ペプチドおよび非ＰＥＧ化治療薬ペプチドを含む、治療薬ペプチド投与を受けているかまたは受ける予定の対象者に対して講じられる。
【００３８】
本発明の一実施形態にあっては、医薬組成物はポリマーと結合されたウリカーゼを含有するものであって、修飾されたウリカーゼは尿酸分解活性を保持している。好ましい実施態様においては、ウリカーゼはＰＥＧ化されたウリカーゼである。
【００３９】
本発明の一実施形態にあっては、医薬組成物はポリマーとの結合によって修飾されたウリカーゼを含有するものであって、修飾されたウリカーゼは尿酸分解活性を保持している。特定の一実施形態にあっては、ポリマー−ウリカーゼ結合体は参照によってその全文を本明細書に含める、国際公開第０１／５９０７８号パンフレットおよび米国特許出願番号第０９／５０１７３０号に記載されている方法に従って調製される。
【００４０】
本発明の一実施形態にあっては、ポリマーはポリエチレングリコール、デキストラン、ポリプロピレングリコール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリビニールピロリドンおよびポリビニールアルコールを含む群から選択される。好ましい実施態様においては、ポリマーはポリエチレングリコールであり、ウリカーゼはＰＥＧ化されたウリカーゼである。
【００４１】
本発明の一実施形態にあっては、組成物は２−１２のポリマー分子をそれぞれのウリカーゼサブユニットに含有し、好ましくは、３から１０ポリマー分子をそれぞれのウリカーゼサブユニットに含有する。本発明の一実施形態にあっては、それぞれのポリマー分子は約１ｋＤから約１００ｋＤの分子量を有する。
【００４２】
本発明の他の実施形態にあっては、それぞれのポリマー分子は約１ｋＤから約５０ｋＤの分子量を有する。本発明の好ましい一実施形態にあっては、それぞれのポリマー分子は約５ｋＤから約２０ｋＤ、約８ｋＤから約１５ｋＤ、約１０ｋＤから１２ｋＤの分子量を有し、好ましくは、約１０ｋＤの分子量を有する。好ましい一実施形態にあっては、それぞれのポリマー分子は約５ｋＤまたは約２０ｋＤの分子量を有する。特に好ましい本発明の一実施形態にあっては、それぞれのポリマー分子は１０ｋＤの分子量を有する。
【００４３】
本発明の実施態様においては、組成物は、組成物の反復投与に適している。
【００４４】
本発明は当該ウリカーゼを用いて尿酸を代謝する方法を提供する。
【００４５】
本発明は、ウリカーゼ組成物の、体液中尿酸レベルの低減への利用を提供する。
【００４６】
本発明の一実施形態にあっては、ウリカーゼ組成物は血液を含む体液における尿酸の低減に用いられる。
【００４７】
また、本発明のウリカーゼをコードする新規核酸分子も提供される。これらを生産する技法は、当該業務に精通した者によく知られている。例えば、ウリカーゼ核酸配列は当該業界に既知である、多くのあらゆる戦略によって改変されうる（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，１９９０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）。配列は、適切な場所で１つまたはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼによって切断でき、必要であればさらに酵素による改変を施し、単離し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでライゲーションすることができる。ウリカーゼをコードする遺伝子の作成にあっては、改変された遺伝子が翻訳停止シグナルに遮られることなく、適切な翻訳読み枠を保持するよう注意すべきである。
【００４８】
ウリカーゼタンパク質をコードする核酸配列は適切な発現ベクター、すなわち、挿入されたタンパク質コーディング配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含むベクターに、挿入することができる。タンパク質コーディング配列を発現させるためには、多様な宿主ベクター系を用いることができる。これらはウィルス（例えばワクシニアウィルス、アデノウィルス等）を感染させた哺乳類細胞系、ウィルス（例えばバキュロウィルス）を感染させた昆虫細胞系、酵母ベクターを含む酵母などの微生物、バクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、コスミドＤＮＡなどで形質転換したバクテリアを含むが、これに限定されない。これらのベクターの発現エレメントはそれらの強度と特異性において異なる。用いる宿主ベクター系に応じて、あらゆる適切な転写および翻訳エレメントを用いることができる。
【００４９】
適切な転写／翻訳制御シグナルと、タンパクをコードする配列からなるキメラ遺伝子を含んだ発現ベクターの作製には、ＤＮＡ断片をベクターに挿入する既知のあらゆる方法を用いることができる。このような方法には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡおよび合成的技術およびｉｎ ｖｉｖｏ組換え（遺伝的組換え）を含めることができる。ウリカーゼタンパク質をコードしている核酸配列の発現は、組換えＤＮＡ分子で形質転換した宿主内でウリカーゼタンパク質が発現されるよう、第二の核酸配列によって制御することができる。例えば、ウリカーゼの発現は、技術的に知られているあらゆるプロモータ／エンハンサーエレメントによって制御され得る。ウリカーゼの発現を制御するのに用いることのできるプロモータはＳＶ４０初期プロモータ領域（Ｂｅｒｎｏｉｓｔ ａｎｄ Ｃｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４−３１０）、ラウス肉腫ウィルスの３’末端反復配列に含まれるプロモータ（Ｙａｍａｍｏｔｏ，ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｃｅｌｌ ２２：７８７−７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモータ（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４−１４４５）、メタロチオネイン遺伝子の制御配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８２，Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２）、βラクタマーゼプロモータなどの原核生物発現ベクター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆ，ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７５：３７２７−３７３１）、ｔａｃプロモータ（ＤｅＢｏｅｒ，ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２１−２５）、ｏｓｍＢプロモータを含むが、これに限定されない。特定の実施形態にあっては、核酸は動作可能な形で異種性プロモータに結合されたウリカーゼ配列を含む。
【００５０】
核酸配列がコードされている特定の組み換えＤＮＡ分子が一旦調製され単離されたならば、技術的に知られている数種の方法によって、増殖させることができる。一旦宿主系ならびに培養条件が確立されれば、組み換え発現ベクターは増殖させ、大量に調製することができる。先に説明したように、使用できる発現ベクターは数例を挙げるならば、ワクシニアウィルスまたはアデノウィルスなどのヒトまたは動物ウィルス、バキュロウィルスなどの昆虫ウィルス、酵母ベクター、バクテリオファージベクター（例：ラムダ）およびプラスミドおよびコスミドＤＮＡベクターならびに、これらの誘導体を含むが、これに限定されない。
【００５１】
加えて、挿入された配列の発現を制御する、または遺伝子産物に、目的に合致した特定の修飾ならびに処理を施す宿主細胞株を選択することが可能である。特定のプロモータによる発現は特定の誘導物質の存在下で上昇し、よって遺伝的に改変したウリカーゼタンパク質の発現を制御することができる。さらに、異なる宿主細胞はそれぞれ特徴的ならびに特異的な、タンパク質の翻訳処理および翻訳後処理および修飾（例えばグリコシル化、切断）メカニズムを有している。発現された外来タンパク質に、目的の修飾および処理が施されることが保証されるよう、適切な細胞株を選ぶことができる。異なったベクター／宿主発現系は、タンパク質分解性開裂反応などの処理反応の程度を変えるなどの影響を与えうる。
【００５２】
本発明の特定の実施形態にあっては、ウリカーゼ をＥ．ｃｏｌｉで発現させることが好ましく、この際ｏｓｍＢプロモータを含むベクターを用いる。
【００５３】
実施例
実施例 １． 遺伝子の作成ならびにウリカーゼ発現のための発現プラスミド
組み換えブタウリカーゼ（尿酸酸化酵素）、Ｐｉｇ−ＫＳ−ΔＮ（アミノ末端がトランケーションされたブタウリカーゼタンパク質で、第２９１番目と第３０１番目のアミノ酸が、それぞれリシンとセリンに置換されている）をＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２株Ｗ３１１０Ｆ−で発現させた。ｐＯＵＲ−Ｐ−ΔＮ−ｋｓ−１に到る、一連のプラスミドを作成したが、ｐＯＵＲ−Ｐ−ΔＮ−ｋｓ−１でＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞を形質転換したところ、ウリカーゼを効率的に発現する能力を獲得した。
【００５４】
ウリカーゼｃＤＮＡのブタおよびヒヒ肝臓からの単離およびサブクローニング
ウリカーゼｃＤＮＡは、当該ＲＮＡのサブクローニングおよび単離によって、ブタおよびヒヒ肝臓より調製した。全細胞ＲＮＡをブタおよびヒヒ肝臓より抽出し（Ｅｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ａ．（１９８９）．ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．（１９９８）．Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、ファースト−ストランドｃＤＮＡ合成キット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて逆転写した。ＰＣＲ増幅反応は、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて行った。
【００５５】
ブタならびにヒヒ尿酸オキシダーゼ（ウリカーゼ）のＰＣＲ増幅反応に用いた合成オリゴヌクレオチドプライマーは表１に示した。
表 １． ウリカーゼｃＤＮＡのＰＣＲ増幅に用いたプライマー
【表１】
【００５６】
プライマー末端に設定した制限酵素配列はセンスＥｃｏＲＩおよびＮｃｏＩ（ブタおよびヒヒ）およびアンチセンスＮｃｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ（ブタ）、ＸｂａＩおよびＮｃｏＩ（ヒヒ）であり、表１に小文字で示してある。ヒヒのセンスプライマーでは、ヒヒウリカーゼに存在する３番目のコドンＧＡＣ（アスパラギン酸）を、ヒト尿酸オキシダーゼ偽遺伝子をコードする配列のこの位置に存在するＣＡＣ（ヒスチジン）で置換した。これらのプライマーを用いて作成した組み換えヒヒウリカーゼ構造体をＤ３Ｈヒヒウリカーゼとする。
【００５７】
ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩでブタウリカーゼＰＣＲ産物を処理し、ｐＵＣ１８にクローニングしてｐＵＣ１８−ブタウリカーゼを得た。Ｄ３ＨヒヒウリカーゼＰＣＲ産物はＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、直接ｐＣＲ（登録商標）ＩＩベクターにクローニングし、ｐＣＲ（登録商標）ＩＩ−Ｄ３Ｈヒヒウリカーゼを得た。
【００５８】
ライゲーションしたｃＤＮＡでＥ．ｃｏｌｉ株ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）を形質転換した。クローニングしたウリカーゼｃＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡを調製し、公開されたウリカーゼＤＮＡコーディング配列を含むクローン（表１に記載の、ヒヒウリカーゼでのＤ３Ｈの置換を除く）をセレクションし、単離した。選んだｐＣＲ（登録商標）ＩＩ−Ｄ３ＨヒヒウリカーゼクローンにおいてはＰＣＲによって配列を削除したことで、ｐＣＲ（登録商標）ＩＩ配列がウリカーゼのストップコドンの隣にくるようになっている。この結果として、３′側の翻訳されない領域にあったＸｂａＩおよびＮｃｏＩの制限酵素サイトが除かれているので、ＰＣＲ産物の５′末端に存在するＮｃｏＩサイトとｐＣＲ（登録商標）ＩＩベクター由来のＢａｍＨＩサイトを用いて、デクレショナルクローニングをすることができた。
【００５９】
ウリカーゼｃＤＮＡの、ｐＥＴ発現ベクターへのサブクローニング
ヒヒウリカーゼのサブクローニング
ウリカーゼコード配列の全長を含むＤ３ＨヒヒｃＤＮＡをｐＥＴ−３ｄ発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に導入した。ｐＣＲ（登録商標）ＩＩ−Ｄ３ＨヒヒウリカーゼをＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで処理し、得られた９６０ｂｐの断片を単離した。発現プラスミドｐＥＴ−３ｄはＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで処理し、得られた４６００ｂｐの断片を単離した。この２つの断片をライゲーションしてｐＥＴ−３ｄ−Ｄ３Ｈ−Ｂａｂｏｏｎを得た。
【００６０】
ブタ−ヒヒキメラウリカーゼのサブクローニング
ブタ−ヒヒキメラ（ＰＢＣ）ウリカーゼは、発現量、安定性および活性がより大きい組み換え遺伝子を得るために作成された。ＰＢＣの作成にはまず、ｐＥＴ−３ｄ−Ｄ３Ｈ−ヒヒクローンから４９３６ｂｐ長のＮｃｏＩ−ＡｐａＩ断片を単離し、これをｐＵＣ１８−ブタウリカーゼから単離した６２４ｂｐ長のＮｃｏＩ−ＡｐａＩ断片とライゲーションしてｐＥＴ−３ｄ−ＰＢＣを得た。ＰＢＣウリカーゼｃＤＮＡは、ブタウリカーゼのコドン１−２２５と、ヒヒウリカーゼのコドン２２６−３０４をインフレームで結合したものからなる。
【００６１】
Ｐｉｇ−ＫＳウリカーゼのサブクローニング
Ｐｉｇ−ＫＳウリカーゼは、ＰＥＧ化できる部位を１つ増やすことが期待されるリシン残基を、１つ加える目的で作成した。ＫＳとはブタウリカーゼの２９１番目の位置にあるアルギニンの代わりにリシンを挿入したアミノ酸置換（Ｒ２９１Ｋ）を指す。加えて、３０１番目の位置にあるトレオニンをセリンで置換した（Ｔ３０１Ｓ）。Ｐｉｇ−ＫＳウリカーゼプラスミドは、ｐＥＴ−３ｄ−Ｄ３Ｈ−Ｂａｂｏｏｎから４６９６ｂｐ長のＮｃｏＩ−ＮｄｅＩ断片を単離し、ｐＵＣ１８−ブタウリカーゼから単離した得た８６４ｂｐ長のＮｃｏＩ−ＮｄｅＩ断片をライゲーションして作成し、ｐＥＴ−３ｄ−Ｐｉｇ−ＫＳとした。得られたＰｉｇＫＳウリカーゼ配列は、ブタウリカーゼコドン１−２８８がインフレームにヒヒウリカーゼコドン２８９−３０４と結合されたものとなっている。
【００６２】
ｏｓｍＢプロモータの制御下にあるウリカーゼ配列のサブクローニング
ウリカーゼ遺伝子を、ｏｓｍＢプロモータを含む発現ベクターにサブクローニングした（参照することによってその全文を本明細書に含む、米国特許番号５，７９５，７７６号に従った）。このベクターは、高浸透圧または長時間の培養によってタンパク質発現を誘導することを可能にした。発現プラスミドｐＭＦＯＡ−１８はｏｓｍＢプロモータ、リボソーム結合部位配列（ｒｂｓ）および転写ターミネーター配列（ｔｅｒ）を含んでいる。また、アンピシリン耐性（ＡｍｐＲ）を付与し、組み換えヒトアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）を発現する。
【００６３】
Ｄ３Ｈ−ヒヒウリカーゼのサブクローニング
プラスミドｐＭＦＯＡ−１８をＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで処理し、大きな断片を単離した。ｐＥＴ−３ｄ−Ｄ３Ｈ−ＢａｂｏｏｎをＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで処理し、Ｄ３Ｈヒヒウリカーゼを含む９６０ｂｐ長の断片を単離した。この２つの断片をライゲーションしてｐＭＦＯＵ１８を得た。
【００６４】
発現プラスミドｐＭＦＸＴ１３３はｏｓｍＢプロモータ、ｒｂｓ（Ｅ．ｃｏｌｉｄｅｏオペロン）、ｔｅｒ（Ｅ．ｃｏｌｉＴｒｙｐＡ）、組み換え型第Ｘａ因子阻害ポリペプチド（ＦｘａＩ）を含み、テトラサイクリン耐性遺伝子（ＴｅｔＲ）を宿主に与える。ヒヒウリカーゼ遺伝子をこのプラスミドに挿入し、抗生物質耐性遺伝子と交換した。プラスミドｐＭＦＯＵ１８をＮｃｏＩで処理し、平滑化後、ＸｈｏＩで処理し、１０３０ｂｐ長の断片を単離した。プラスミドｐＭＦＸＴ１３３はＮｄｅＩで処理した後、平滑化し、その後ＸｈｏＩで処理し、大きな断片を単離した。この２断片をライゲーションしてヒヒウリカーゼ発現ベクターｐＵＲＢＡ１６を得た。
【００６５】
ブタ−ヒヒキメラウリカーゼのサブクローニング
プラスミドｐＵＲＢＡ１６をＡｐａＩおよびＡｌｗＮＩで処理し、２３２０ｂｐ長の断片を単離した。プラスミドｐＭＦＸＴ１３３をＮｄｅＩで処理し、平滑化し、次にＡｌｗＮＩで処理し、６２０ｂｐ長の断片を単離した。プラスミドｐＥＴ−３ｄ−ＰＢＣをＸｂａＩで処理し、平滑化し、次にＡｐａＩで処理し、得た７１０ｂｐ長の断片を単離した。この３つの断片をライゲーションし、ｐＥＴ−３ｄベクター由来の、ｏｓｍＢプロモータならびにｒｂｓならびにＴ７ｒｂｓの制御下でＰＢＣウリカーゼを発現するプラスミドｐＵＲ−ＰＢを得た。
【００６６】
Ｔ７ｒｂｓは追加的な工程で取り除いた。ｐＵＲ−ＰＢをＮｃｏＩで処理し、平滑化し、次にＡｌｗＮＩで処理し、得た３０００ｂｐ長の断片を単離した。プラスミドｐＭＦＸＴ１３３をＮｄｅＩで処理し、平滑化し、次にＡｌｗＮＩで処理し、得た６２０ｂｐ長の断片を単離した。この２つの断片をライゲーションして、ＰＢＣをｏｓｍＢプロモータの制御下で発現するｐＤＵＲ−ＰＢを得た。
【００６７】
ｐＯＵＲ−ＰＢ−ΔＮＣの作成
ウリカーゼｃＤＮＡを何カ所か改変したところ、安定性が大幅に高まった組み換え体酵素を得ることができた。プラスミドｐＯＵＲ−ＰＢＣ−ΔＮＣは、ｉｎｖｉｖｏでペルオキシソームターゲティングシグナルとして機能する、Ｃ末端のトリペプチドとマチュレーションペプチドであるＮ末端の６残基とを取り除いて作成した。これは、プラスミドｐＤＵＲ−ＰＢのＰＢＣ配列と、表２に示した特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ増幅反応によって行った。
表２．ＰＢＣ−ΔＮＣウリカーゼのＰＣＲ増幅に用いたプライマー
【表２】
【００６８】
プライマーの末端に導入した制限酵素切断部位は太字で、また翻訳されない領域は小文字で、それぞれ表２に示してある。ＮｄｅＩはセンス方向であり、ＸｂａＩはアンチセンス方向である。アンチセンスプライマーは、アミノ酸配列に影響しない点変異（下線で示している）を導入することによって内部に存在するＮｄｅＩサイトを除去し、ＮｄｅＩを用いたサブクローニングを可能にするためにも用いられた。
【００６９】
ｐＤＵＲ−ＰＢのＰＣＲ増幅反応で得た９００塩基長の断片をＮｄｅＩおよびＸｂａＩで切断し、単離した。得た断片を、次にＥ．ｃｏｌｉ由来のｄｅｏ−Ｐ１Ｐ２プロモータおよびｒｂｓを含み、恒常的にヒト組み換え型インシュリン前駆体を発現するｄｅｏ発現プラスミドｐＤＢＡＳＴ−ＲＡＴ−Ｎに挿入した。プラスミドをＮｄｅＩおよびＸｂａＩで処理し、得た４０３５ｂｐ長の断片を単離し、ＰＢＣ−ウリカーゼＰＣＲ産物とライゲーションした。よって得たｐＤＵＲ−ＰＢ−ΔＮＣで、Ｅ．ｃｏｌｉＫ−１２ＳΦ７３３（Ｆ−ｃｙｔＲｓｔｒＡ）を形質転換したところ、活性を有する切断型ウリカーゼを多量に発現した。
【００７０】
両端でトランケーションしたＰＢＣ−ΔＮＣ配列は、ｏｓｍＢプロモータの制御下でも発現させた。プラスミドｐＤＵＲ−ＰＢ−ΔＮＣをＡｌｗＮＩ−ＮｄｅＩで処理し、得た３４５９ｂｐ長の断片を単離した。先に述べたプラスミドｐＭＦＸＴ１３３をＮｄｅＩ−ＡｌｗＮＩで処理し、得た６６０ｂｐ長の断片を単離した。これらの断片をライゲーションし、ｐＯＵＲ−ＰＢ−ΔＮＣを得、これでＥ．ｃｏｌｉＫ−１２株Ｗ３１１０Ｆ−を形質転換したところ、活性を有する切断型ウリカーゼを多量に発現した。
【００７１】
ウリカーゼ発現プラスミドｐＯＵＲ−Ｐ−ΔＮ−ｋｓ−１の作成
このプラスミドは、組み換え型酵素の活性ならびに安定性を向上させるために作成した。Ｐｉｇ−ＫＳ−ΔＮウリカーゼは、Ｎ末端のマチュレーションペプチド６残基が除去される形でＮ末端のみをトランケーションし（ΔＮ）、Ｓ４６ＴならびにＲ２９１ＫならびにＴ３０１Ｓ変異を有するように作成した。４６番目の位置には、ＰＣＲ増幅反応ならびにクローニングの過程で発生した保存的変異によって、セリン残基の代わりにトレオニン残基が存在していた。２９１番目の位置ではアルギニンがリシンに、また３０１番目の位置では、トレオニンがセリンに置換されていた。この両方が、ヒヒウリカーゼ配列由来である。Ｒ２９１ＫならびにＴ３０１Ｓの両改変は先にＫＳと命名し、説明したとおりである。リシン残基を追加することで、潜在的なＰＥＧ化サイトが１つ追加されている。
【００７２】
ｐＯＵＲ−Ｐ−ΔＮ−ｋｓ−１（図１）の作成には、プラスミドｐＯＵＲ−ＰＢ−ΔＮＣをＡｐａＩ−ＸｂａＩで処理し、得た３８７３ｂｐ長の断片を単離した。プラスミドｐＥＴ−３ｄ−ＰＫＳ（構造を図４に示してある）をＡｐａＩ−ＳｐｅＩで処理し、得た２７０ｂｐ長の断片を単離した。ＳｐｅＩによる５′ＣＴＡＧでの切断の結果、ＸｂａＩによって生じたＤＮＡ断片と効率的にライゲーションする、５′ＣＴＡＧの突出部が生じた。この２つの断片をライゲーションしてｐＯＵＲ−Ｐ−ΔＮ−ｋｓ−１を得た。ライゲーションの結果、ＳｐｅＩおよびＸｂａＩ認識サイトは失われた（図９に括弧で示してある）。プラスミドｐＯＵＲ−Ｐ−ΔＮ−ｋｓ−１をＥ．ｃｏｌｉＫ−１２株Ｗ３１１０Ｆ−原栄養株ＡＴＣＣ＃２７３２５に導入した。ｏｓｍＢプロモータの制御下で発現させて得たＰｉｇ−ＫＳ−ΔＮウリカーゼにより、優れた活性ならびに安定性を有する組み換え型酵素を多量に得ることができた。
【００７３】
図１はプラスミドｐＯＵＲ−Ｐ−ΔＮ−ｋｓ−１の構造を示したものである。制限酵素サイトの横に示した番号は、１と設定したＨａｅＩＩサイトから数えた、ヌクレオチドの位置を示している。クローニングの過程で失われた制限酵素サイトは括弧で示してある。Ｐｉｇ−ＫＳ−ΔＮウリカーゼをコードするプラスミドｐＯＵＲ−Ｐ−ΔＮ−ｋｓ−１は４１４３塩基対（ｂｐ）長で、下記のエレメントを含む。
１． ｏｓｍＢプロモータおよびリボソーム結合サイト（ｒｂｓ）を含む、１番目のヌクレオチドから、ＮｄｅＩサイト（１１３番目の位置）に到る、１１３ｂｐ長のＤＮＡ断片。
２． Ｐｉｇ−ＫＳ−ΔＮ（アミノ末端がトランケーションされており、２９１番目および３０１番目のアミノ酸がそれぞれリシンおよびセリンで置換されているブタウリカーゼタンパク質の核酸配列）コーディング領域から９００ｂｐ、ならびにｐＣＲ（登録商標）ＩＩ由来の、ＴＡクローニング部位から上流方向にＳｐｅＩ／ＸｂａＩ制限酵素サイトまでの同フランキング配列３２ｂｐを含む、ＮｄｅＩ（１１３番目の位置）からＳｐｅＩ／ＸｂａＩジャンクション（第１０４５番目の位置）に到る９３２ｂｐ長のＤＮＡ断片。
３． ＳｐｅＩ／ＸｂａＩジャンクション（１０４５番目の位置）からＨｉｎｄＩＩＩ（１０７０番目の位置）にわたる、２５ｂｐのマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）配列。
４． ＨｉｎｄＩＩＩ（１０７０番目の位置）およびＡａｔＩＩ（１１１０番目の位置）を末端に有し、ＴｒｐＡ転写ターミネーター（ｔｅｒ）を含む４０ｂｐの合成オリゴヌクレオチド。
５． ｐＢＲ３２２上の、ＡａｔＩＩ（１１１０番目の位置）からＭｓｃＩ／ＳｃａＩ（２６２９番目の位置）にわたる、テトラサイクリン耐性遺伝子（ＴｅｔＲ）を含む１５１９ｂｐ長のＤＮＡ断片。
６． ＤＮＡ複製起点を含み、ｐＢＲ３２２上のＳｃａＩ（２６２９番目の位置）からＨａｅＩＩ（４１４３番目の位置）にわたる、１５１４ｂｐ長のＤＮＡ断片。
【００７４】
図２は、Ｐｉｇ−ＫＳ−ΔＮウリカーゼのＤＮＡ配列ならびに推定アミノ酸配列を示している。この図では、アミノ酸の位置を示す番号は全長ブタウリカーゼ配列に対応している。イニシエーターであるメチオニン残基に続いて、ブタウリカーゼ配列ではアスパラギン酸となっている位置に、代わりにトレオニンを挿入した。このトレオニン残基によって、バクテリアのアミノペプチダーゼによるメチオニンの除去が可能となっている。アミノ酸配列にある間隙は、削除されたＮ末端のマチュレーションペプチドを示している。異なるウリカーゼ配列のサブクローニングの様々な過程で用いた制限酵素サイト（ＡｐａＩ、ＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩおよびＳｐｅＩ）が示してある。小文字で示した３′側の翻訳されない領域は、ｐＣＲ（登録商標）ＩＩに由来する配列である。翻訳停止コドンはアスタリスクで示してある。
【００７５】
図３は様々な組み換え型ウリカーゼ配列のアミノ酸配列のアラインメントを示したものである。１行目は全長アミノ酸配列を含むブタウリカーゼの配列である。２行目は両端をトランケーションしたブタ−ヒヒキメラウリカーゼ（ＰＢＣ−ΔＮＣ）である。３行目はＮ末端側のみでトランケーションされており、変異Ｓ４６Ｔおよびウリカーゼコーディング配列のカルボキシ末端のヒヒ由来物を反映するアミノ酸変異Ｒ２９１ＫおよびＴ３０１Ｓを有するＰｉｇ−ＫＳ−ΔＮウリカーゼ配列である。アスタリスクは、Ｐｉｇ−ＫＳ−ΔＮと公開されているブタウリカーゼ配列とでアミノ酸配列に相違がある位置を示している。丸印は、Ｐｉｇ−ＫＳ−ΔＮとブタ−ヒヒキメラＰＢＣ−ΔＮとでアミノ酸配列に相違がある位置を示している。点線はアミノ酸の欠損を示している。
【００７６】
Ｙ９７Ｈ変異を有するネィティブのヒヒ、ブタ、ウサギウリカーゼおよびブタ／ヒヒキメラ（ＰＢＣ）のｃＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉへのクローニングのために作成した。全クローンでｏｓｍＢによって発現が制御されており、Ｗ３１１０Ｆ−Ｅ．ｃｏｌｉであるように、変異型ウリカーゼを多量に発現しているクローンを作成して選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、ＤＮＡシーケンシングならびに制限酵素分析によって確認し、細胞を培養した。
【００７７】
Ｐｉｇ−ΔＮおよびＰｉｇ−ＫＳ−ΔＮを含む切断型ウリカーゼの作成は、ＰＢＣ−ΔＮＣとＰｉｇ−ＫＳを、制限酵素ＡｐａＩおよびＸｂａＩ、ならびにＡｐａＩおよびＳｐｅＩでそれぞれ処理後、クロスライゲーションして行った。Ｎ末端の「マチュレーションペプチド」（１−２）６残基、ならびにＣ末端のトリペプチド「ペルオキシソームターゲティングシグナル」（３−５）は酵素活性に大きく影響する機能を有さないので、これらのトランケーションされた変異体は活性を保つものと思われ、また、これらの配列は免疫原性を有する可能性が考えられる。ウリカーゼを非常に多量に発現しているクローンを選択した。
【００７８】
実施例２．発現プラスミドの、バクテリア宿主細胞への形質転換
発現プラスミドｐＯＵＲ−Ｐ−ΔＮ−ｋｓ−１を、Ｅ．ｃｏｌｉＫ−１２株Ｗ３１１０Ｆ−に導入した。ルリア培地（ＬＢ）で対数増殖期中期にまで培養した形質転換用のバクテリア細胞を、遠心処理によって集菌し、冷水で洗浄後１０％グリセロールに懸濁、さらに水に懸濁し、１ｍｌあたり約３ｘ１０１０細胞の最終濃度とした。細胞はアリコットとして−７０℃で保存した。プラスミドＤＮＡはエタノールで沈殿させ水に溶解した。
【００７９】
バクテリア細胞とプラスミドＤＮＡを混合し、ＢＩＯ−ＲＡＤからのＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ ＩＩを用いた高電圧電気穿孔法（Ｔｒｅｖｏｒｓ ｅｔ ａｌ（１９９２）Ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ ｂｙ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ，ｉｎ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｆｕｓｉｏｎ（Ｄ．Ｃ．Ｃｈａｎｇ，Ｂ．Ｍ．Ｃｈａｓｓｙ，Ｊ．Ａ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ ａｎｄ Ａ．Ｅ．Ｓｏｗｅｒｓ，ｅｄｓ．），ｐｐ．２６５−２９０，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｈａｎａｈａｎ ｅｔ ａｌ（１９９１）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２０４，６３−１１３）によって形質転換した。形質転換した細胞はＳＯＣ培地（２％ トリプトン、０．５％ 酵母抽出物、１０ ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４、２０ｍＭ グルコース）に懸濁し、３７℃で１時間インキュベーションした後テトラサイクリン耐性を指標に選択した。高発現クローンを選択した。
【００８０】
実施例３．組み換え型ウリカーゼの調製
形質転換したものなど（上記参照）のバクテリアは、グルコースを含有する培地で培養した。約３７℃で、ｐＨは７．２±０．２に保った。
【００８１】
培養の終期５−６時間にかけて培地にＫＣｌを、最終濃度が０．３Ｍとなるように加えた。ウリカーゼの蓄積を生じさせるため、培養を続けた。
【００８２】
組み換え型ウリカーゼはバクテリア細胞内で、封入体（ＩＢ）に類似した不溶性の沈殿物として蓄積した。細胞懸濁液を遠心処理で洗浄し、ｐＨ８．０の５０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファーおよび１０ｍＭ ＥＤＴＡに懸濁し、最終体積を乾燥菌体重量の約４０倍とした。
【００８３】
細胞をライソザイムと高圧力によって破壊した後、遠心処理によって組み換え型ウリカーゼを含有するＩＢを単離した。ライソザイム処理（２０００−３０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）はｐＨ８．０、７±３℃で１６−２０時間、混合しながら行った。ペレットを水で洗浄し、使用するまで−２０℃で保存した。
【００８４】
濃縮したＩＢは、ｐＨ１０．３±０．１の５０ｍＭ ＮａＨＣＯ３バッファーで懸濁後さらに処理した。懸濁液は一晩室温でインキュベーションし、ＩＢ由来のウリカーゼを可溶化させた後、遠心処理によって沈殿物を除いた。
【００８５】
ウリカーゼはさらに、複数のクロマトグラフィー工程によって精製した。最初のクロマトグラフィーはＱ−セファロースＦＦカラムを用いて行った。カラムにサンプルをロードした後、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する重炭酸バッファーで洗浄し、ウリカーゼの溶出は２５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する重炭酸バッファーによって行った。次に、キサンチン−アガロース樹脂（Ｓｉｇｍａ）によって少量の不純物をウリカーゼ調製物より除いた。Ｑ−セファロースＦＦ溶出物はｐＨ１０．３±０．１の５０ｍＭグリシンバッファーで希釈し、タンパク質最終濃度を約０．２５ｍｇ／ｍｌとしてロードした。カラムを１００ｍＭ ＮａＣｌを含有するｐＨ１０．３±０．１の重炭酸バッファーで洗浄し、同じバッファーに６０μＭキサンチンを加えたものでウリカーゼを溶出した。この段階で、ウリカーゼをＱ−セファロースクロマトグラフィーで再精製し、凝集したものを除いた。
【００８６】
それぞれのウリカーゼ調製物の純度を、サイズ排除クロマトグラフィーで測定したところ、９５％以上であった。それぞれの調製物でＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムを用いて行った分析では、凝集体は０．５％以下しか検出されなかった。
【００８７】
表３は２５リットルの発酵培地から得たＩＢ由来のＰｉｇ−ＫＳΔＮウリカーゼの精製をまとめたものである。
表３．Ｐｉｇ−ＫＳΔＮウリカーゼの精製
【表３】
【００８８】
実施例 ４． 組み換え型ウリカーゼの性質
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
高度に精製された変異型ウリカーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図４）では、かなり特徴的なパターンが現れた。サンプルはｐＨ１０．３の炭酸バッファーに、４℃で最高数ヶ月保存した。ブタ、ブタ−ＫＳならびにＰＢＣの、全長変異型タンパク質では、分子量が２０および１５ｋＤの顕著な分解産物の蓄積が見られた。これは、少なくとも１つのニックがウリカーゼサブユニット分子を開裂していることを示唆している。アミノ末端を短くしたクローンならびにウサギウリカーゼでは、これと異なった分解パターンが検出されたが、割合は小さかった。ウサギウリカーゼのアミノ末端は、短くしたクローンに類似している。精製並びに保管の過程で生じたウリカーゼ断片のアミノ末端配列を決定した。
【００８９】
ペプチドシーケンシング
原体ウリカーゼ調製物のＮ末端を、エドマン分解法でシーケンシングした。サイクル数は１０であった。組み換え型ブタウリカーゼ（全長クローン）はＰｉｇ−ＫＳ−ΔＮよりも多くの分解断片を産した。分解断片を生じる切断部位の予想位置は以下の通りである：
１）下記の配列を有する、１６８番目の位置の、メジャーサイト：
−−ＱＳＧ ↓ ＦＥＧＦＩ−−
２） 下記の配列を有する、１４２番目の位置の、マイナーサイト：
−−ＩＲＮ ↓ ＧＰＰＶＩ−−
【００９０】
上記の配列は、既知のいかなるタンパク質分解性開裂も示唆しない。しかしながら、開裂はタンパク質分解またはなんらかの化学反応によって生じうる。アミノ末端切断型ウリカーゼは非アミノ末端切断型ウリカーゼに比べて驚くほど安定性が高い。ＰＢＣ−ΔＮＣも、他のΔＮ分子と類似した、非アミノ切断型ＰＢＣよりも少ない安定性を有していた。
【００９１】
効力
ウリカーゼ活性の測定はＵＶ法によって行った。酵素反応速度は、尿酸のアラントインへの酸化による、２９２ｎｍ吸光度の減少を測定することによって求めた。１活性単位は、２５℃、１分間で、示した特定の条件下で１μモルの尿酸を酸化するのに必要なウリカーゼの量と定義される。ウリカーゼの効力は、タンパク質１ｍｇあたりの活性単位として表される（Ｕ／ｍｇ）。
【００９２】
２９２ｎｍにおける１ｍＭ尿酸の消衰係数は１２．２ｍＭ−１ｃｍ−１である。ゆえに、反応溶液１ｍｌあたりの、尿酸１μモルの酸化は、１２．２ｍＡ２９２の吸光度の減少となる。経時的な吸光度の変化（毎分ΔＡ２９２）は、曲線の直線部より得た。
【００９３】
タンパク質濃度は、改変ブラッドフォード法によって求めた（ＭａｃａｒｔａｎｄＧｅｒｂａｕｔ（１９８２） Ｃｌｉｎ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ １２２：９３−１０１）。ウリカーゼの比活性度（効力）は、Ｕ／ｍｌで表される活性を、ｍｇ／ｍｌで表されるタンパク質濃度で割ることによって計算した。様々な組み換え型ウリカーゼの酵素活性結果を、表４にまとめた。市販の調製物の結果も、参考値としてこの表に示した。結果からは、ウリカーゼタンパク質のトランケーションがその酵素活性に大きな影響を与えないことが明らかである。
表４． 組み換え型およびネィティブ型のウリカーゼの、速度パラメータのまとめ
【表４】
【００９４】
表４注釈：
（１） タンパク質濃度は、２７８ｎｍにおける吸光度から、１０ｍｇ／ｍｌウリカーゼ溶液に対して消衰係数として１１．３を用いて求めた（Ｍａｈｌｅｒ，１９６３）。
（２）１単位のウリカーゼ活性は、２５℃、１分間で１μモルの尿酸をアラントインに酸化するのに必要な酵素の量と定義される。
（３）比活性度は、６０μＭに等しい基質濃度の下で行ったラインウィーバーバークプロットによって求めた。
（４）反応混合物は、以下のストック溶液を様々な組み合わせで混合して作成した。
ｐＨ９．２の１００ｍＭホウ酸ナトリウムバッファー
ｐＨ９．２の５０ｍＭホウ酸ナトリウムに溶解した３００μＭ尿酸
ｐＨ９．２の５０ｍＭホウ酸ナトリウムに溶解した１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ
（５）Ｋｃａｔは、Ｖｍａｘ（対応するラインウィーバーバークプロットから算出）を反応溶液のウリカーゼ濃度（リカーゼの四量体の分子量に基づいてモル量として表現したもの）で割ることで求めた。
【００９５】
実施例５．ウリカーゼとｍ−ＰＥＧの結合（ＰＥＧ化）
Ｐｉｇ−ＫＳ−ΔＮウリカーゼは、ｍ−ＰＥＧ−ＮＰＣ（モノメトキシ−ポリ（エチレングリコール）−ニトロフェニルカーボネート）と結合体を形成させた。１ウリカーゼサブユニットあたり５、１０または２０ｋＤのＰＥＧ鎖２から１２本が結合する条件を確立した。ｍ−ＰＥＧ−ＮＰＣは、徐々にタンパク質溶液に加えた。ＰＥＧの添加が終わった後、ウリカーゼ／ｍ−ＰＥＧ−ＮＰＣ反応溶液を２から８℃で１６から１８時間、未結合のｍ−ＰＥＧ鎖が最大限ウリカーゼに結合するようインキュベーションした。
【００９６】
ＰＥＧ−ウリカーゼモノマー１つあたりのＰＥＧ鎖の数は、ＰＥＧおよびウリカーゼ標準試料を用いて、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって同定した。サブユニット１つあたりに結合したＰＥＧの数は、下記の式によって算出した：
【数１】
【００９７】
紫外線（ＵＶ）および屈折率（ＲＩ）検出器の配列（Ｋｕｎｉｔａｎｉ，ｅｔ ａｌ．，１９９１の開発による）を用いて、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によってＰＥＧ−ウリカーゼサンプルにおける、ＰＥＧ並びにタンパク質成分濃度を同定した。３つの較正曲線を作成した：タンパク質曲線（２２０ｎｍで測定した吸光度）、タンパク質曲線（ＲＩの測定による）、ＰＥＧ曲線（ＲＩの測定による）。次に、ＰＥＧ−ウリカーゼサンプルを同様のシステムで測定した。得られた試験サンプルのＵＶならびにＲＩピークエリア値を、較正曲線に対するＰＥＧならびにタンパク質の濃度を計算するのに用いた。３．４２は、１０ｋＤ ＰＥＧに対するウリカーゼ分子モノマーの分子量（３４，１９２ダルトン）の比である。
【００９８】
結合させたＰＥＧは、生理的ｐＨの溶液においてウリカーゼの可溶性を向上させた。表５はＰＥＧ化Ｐｉｇ−ＫＳ−ΔＮウリカーゼ産生物のバッチ間のばらつきを示したものである。一般に、結合したＰＥＧ鎖数と酵素が保持する比活性度（ＳＡ）との間には、反比例の関係がある。
表５．ＰＥＧ化Ｐｉｇ−ＫＳ−ΔＮウリカーゼ結合体の酵素活性
【表５】
【００９９】
実施例６．１０００Ｄならびに１００，０００ＤのＰＥＧによるウリカーゼのＰＥＧ化
Ｐｉｇ−ＫＳ−ΔＮウリカーゼを、実施例５に記載の通りの方法で、１０００Ｄならびに１００，０００Ｄのｍ−ＰＥＧ−ＮＰＣを用いてＰＥＧ化した。１ウリカーゼサブユニットあたりＰＥＧ鎖２〜１１本が結合する条件を用いた。ＰＥＧの添加が終わった後、ウリカーゼ／ｍ−ＰＥＧ−ＮＰＣ反応溶液を２から８℃で１６から１８時間、未結合のｍ−ＰＥＧ鎖が最大限ウリカーゼに結合するようインキュベーションした。
【０１００】
ＰＥＧ−ウリカーゼモノマー１つあたりのＰＥＧ鎖数は、上記に記載の方法で求めた。
【０１０１】
結合させたＰＥＧは、生理的ｐＨの溶液においてウリカーゼの可溶性を向上させた。
【０１０２】
実施例７．ＰＥＧと結合させたＰｉｇ−ＫＳ−ΔＮウリカーゼの薬物動態
治療上の利益を提供するために、ＰＥＧ化の最適な程度ならびにサイズを決定するために、生物学的な実験を行った。
【０１０３】
ラットで、体重１ｋｇあたり０．４ｍｇ（２Ｕ）の改変されていないウリカーゼを、１日目ならびに８日目に静脈投与して行った薬物動態試験では、循環系半減期が約１０分であるとの結果が得られた。しかしながら、ラットで２−１１ｘ１０ｋＤのＰＥＧ−Ｐｉｇ−ＫＳ−ΔＮウリカーゼを、週１回、９回に渡って注射してクリアランス速度を調べた試験では、クリアランスはＰＥＧ鎖の数に（この範囲においては）依存していないことが示唆され、試験期間を通じて比較的同じ値に保たれた（表６参照、半減期が約３０時間）。各週間の違いは誤差の範囲内である。１０ｘ５ｋＤ ＰＥＧならびに１０ｘ２０ｋＤ ＰＥＧ−ウリカーゼ結合体の９回の注射後でも、同様のパターンが観察された。結果は、この範囲においては、ウリカーゼのＰＥＧ化の程度にかかわらず、ラットモデルにおいて類似した生理的影響が観察されたことを示している。
表６．ＰＥＧ化Ｐｉｇ−ＫＳ−ΔＮウリカーゼ調製物の、ラットにおける半減期
【表６】
【０１０４】
表６注釈： 結果は時間±標準誤差で示している。括弧で示した数字は試験した実験動物個体数を示している。
【０１０５】
ラットに、１週間に１回、体重１ｋｇあたり０．４ｍｇの、表に示したとおりの改変を施したＰｉｇ−ＫＳ−ΔＮウリカーゼを静脈投与した。それぞれの個体群は元々１５個体のラットから成っており、５個体のサブグループで交互に採血した。ラット数例が、麻酔によって実験中に死亡した。半減期は、注射５分後、および６、２４、４８時間後に採取した血漿サンプルのウリカーゼ活性（比色測定）を測定することによって同定した。
【０１０６】
表５に、実験に用いられたＰＥＧ化ウリカーゼを記載している。
【０１０７】
６ｘ５ｋＤ ＰＥＧ−Ｐｉｇ−ＫＳ−ΔＮウリカーゼを用いた、ウサギでの生物学的利用率試験によると、最初の注射後では、循環系半減期は９８．２±１．８時間（ｉ．ｖ．）であり、筋肉投与（ｉ．ｍ．）ならびに皮下投与（ｓ．ｃ．）では、それぞれ７１％、５２％であった。しかしながら、２回目のｉ．ｍ．ならびにｓ．ｃ．注射の後、全てのウサギで相当量の抗ウリカーゼ抗体タイターが検出され、以降の注射でクリアランスが促進された。ラットに同じ結合体を注射した実験では、２６±１．６時間の半減期（ｉ．ｖ．）が得られ、生物学的利用率はｉ．ｍ．ならびにｓ．ｃ．注射についてそれぞれ３３％、２２％であった。
【０１０８】
９ｘ１０ｋＤ ＰＥＧ−Ｐｉｇ−ＫＳ−ΔＮウリカーゼを用いたラットでの試験では、１回目の注射後の循環系半減期が４２．４時間（ｉ．ｖ．）であり、ｉ．ｍ．ならびにｓ．ｃ．注射後の生物学的利用率はそれぞれ２８．９％、１４．５％だった。（図５ならびに表７参照）。４回目の注射後では、循環系半減期は３２．１±２．４時間であり、ｉ．ｍ．ならびにｓ．ｃ．注射後の生物学的利用率はそれぞれ２６．１％、１４．９％だった。
【０１０９】
９ｘ１０ｋＤ ＰＥＧ−Ｐｉｇ−ＫＳ−ΔＮウリカーゼを用いた、ウサギでの同様の薬物動態試験では、この結合体の注射に引き続くクリアランスの促進は観察されなかった（隔週で４回注射として投与した）。これらの個体では、最初の注射後の循環系半減期は８８．５時間（ｉ．ｖ．）であり、ｉ．ｍ．ならびにｓ．ｃ．注射後の生物学的利用率はそれぞれ９８．３％、８４．４％であった。（図６ならびに表７参照）。４回目の注射後の循環系半減期は１４１．１±１５．４時間であり、ｉ．ｍ．ならびにｓ．ｃ．注射後の生物学的利用率はそれぞれ８５％、８３％であった。
【０１１０】
９ｘ１０ｋ ＤＰＥＧ−Ｐｉｇ−ＫＳ−ΔＮを用いた同様の試験によって、ビーグル犬における生物学的利用率を測定した（それぞれの群にオス２個体、雌２個体）。１回目のｉ．ｖ．注射後で、７０±１１．７時間の循環系半減期が記録され、ｉ．ｍ．ならびにｓ．ｃ．注射後の生物学的利用率はそれぞれ６９．５％、５０．４％だった（図６ならびに表７参照）。
【０１１１】
９ｘ１０ｋＤ ＰＥＧ−Ｐｉｇ−ＫＳ−ΔＮ調製物を用いて、ブタで試験を行った。１つの群あたり３個体にｉ．ｖ．、ｓ．ｃ．ならびにｉ．ｍ．ルートによる投与を行った。１回目のｉ．ｖ．注射後で、１７８±２４時間の循環系半減期が記録され、ｉ．ｍ．ならびにｓ．ｃ．注射後の生物学的利用率はそれぞれ７１．６％、７６．８％であった（図８ならびに表７参照）。
表７．９ｘ１０ｋＤＰＥＧ−Ｐｉｇ−ＫＳ−ΔＮウリカーゼを用いた薬物
【表７】
【０１１２】
９ｘ１０ｋＤ ＰＥＧ−Ｐｉｇ−ＫＳ−ΔＮウリカーゼの、ボルトン＆ハンター法による、１２５Ｉでのヨウ素化に引き続いて、吸収、分布、代謝、排泄（ＡＤＭＥ）試験を実施した。ラベルした結合体を、それぞれ４個体のラット（雄２個体と雌２個体）からなる７群に注射した。放射線の分布を、１時間後ならびに、７日間にわたって２４時間毎に（５日目を除く）測定した。それぞれの群を順番に屠殺し、異なる臓器を摘出して分析した。７番目の群は代謝ケージで飼育し、尿と便を回収した。物質の、動物体内における分布は、それぞれの臓器の総放射活性ならびに、ＴＣＡによる沈殿が可能なカウント（腎臓、肝臓、肺、脾臓）のフラクション（すなわち、臓器のサイズで標準化した結合したタンパク質）を測定することによって評価した。摘出した臓器で、他の臓器よりも比放射能が高いものはなかった。すなわち、例えば肝臓または腎臓における特筆すべき蓄積は見られなかった。放射活性の７０％が、７日目までに排出された。
【０１１３】
実施例８．治験結果
従来の治療法に不応答性または不耐性の、ヒト高尿酸血症または重篤な痛風に罹患している患者における、ＰＥＧ−ウリカーゼ（Ｐｕｒｉｃａｓｅ（登録商標），Ｓａｖｉｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）の尿酸応答ならびに、薬物動態的および安全性プロフィールを評価するために無作為化非盲検多施設並行群間試を実施した。平均罹患期間は１４年で、被験者集団の７０％が１つまたはそれ以上の痛風結節を有していた。
【０１１４】
治験では、４１例の患者（平均年齢５８．１歳）を無作為に、次に示す４つの１２週間にわたる、静脈投与によるＰＥＧ−ウリカーゼ治療投与量計画に振り分けた：２週間毎に１回４ｍｇ（７例）、２週間毎に１回８ｍｇ（８例）、４週間毎に１回８ｍｇ（１３例）、４週間毎に１回１２ｍｇ（１３例）。血漿ウリカーゼ活性ならびに尿酸レベルを定められた時間間隔で測定した。薬物動態学的パラメータ、平均血漿尿酸濃度および血漿尿酸レベルが６ｍｇ／ｄＬ以下であった時間の百分率を、ウリカーゼ活性並びに尿酸レベルの分析によって求めた。
【０１１５】
ＰＥＧ−ウリカーゼを２週間毎に１回８ｍｇ投与した群で、最も大きなＰＵＡの低減が見られ、治療期間の９２％で６ｍｇ／ｄＬ未満のレベルであった。（１２週間で、平均血漿尿酸濃度が治療前の９．１ｍｇ／ｄＬに対して、治療後は１．４ｍｇ／ｄＬ）。
【０１１６】
他の投与量を用いたＰＥＧ−ウリカーゼ治療群でも、顕著で持続的な低い血漿尿酸レベルが観察された：４週間毎に１回８ｍｇを投与した群で、ＰＵＡレベルが６ｍｇ／ｍｌ未満である期間が治療期間の８６％（１２週間で、平均血漿尿酸濃度が治療前の９．１ｍｇ／ｄＬに対して、治療後は２．６ｍｇ／ｄＬ）、４週間毎に１回１２ｍｇを投与した群で、ＰＵＡレベルが６ｍｇ／ｍｌ未満である期間が治療期間の８４％（１２週間で、平均血漿尿酸濃度が治療前の８．５ｍｇ／ｄＬに対して、治療後は２．６ｍｇ／ｄＬ）、２週間毎に１回４ｍｇを投与した群で、ＰＵＡレベルが６ｍｇ／ｍｌ未満である期間が治療期間の７３％（１２週間で、平均血漿尿酸濃度が治療前の７．６ｍｇ／ｄＬに対して、治療後は４．２ｍｇ／ｄＬ）。
【０１１７】
最初のＰＥＧ−ウリカーゼ投与から２４時間以内での、血漿中尿酸の基線レベルからの減少割合の最大値は４ｍｇ／２週間の群で７２％（ｐ＝．０００２）、８ｍｇ／２週間の群で９４％（ｐ＜．０００１）、８ｍｇ／４週間の群で８７％（ｐ＜．０００１）、１２ｍｇ／４週間の群で９３％（ｐ＜．０００１）であった。
【０１１８】
１２週間の治療期間における血漿中尿酸の基線レベルからの減少割合は４ｍｇ／２週間の群で３８％（ｐ＝．０００２）、８ｍｇ／２週間の群で８６％（ｐ＜．０００１）、８ｍｇ／４週間の群で５８％（ｐ＜．０００３）、１２ｍｇ／４週間の群で６７％（ｐ＜．０００１）であった。
【０１１９】
驚くべき事に、ＰＥＧ−ウリカーゼの投与を受けた患者の一部で注入に関連した有害事象、例えば注入反応が出現した。この反応はすべての注入のうち１４％で出現した。
【０１２０】
本出願に引用される全ての文献を、各個々の刊行物、特許または特許出願を具体的かつ個々に、参照することによって援用すると示したのと同程度に、全ての目的のためにその全文を参照することによって本明細書に含める。
【０１２１】
当該分野に精通する者に理解されるように、本発明にあっては、その思想および範囲から逸脱することなく、様々な変更ならびに形態様が可能である。ここに記載された具体的な実施例は単に例を示すのみであって、本発明は添付した特許請求項、ならびに、このような請求に権利が与えられるあらゆる等価例によってのみ制限されるものである。
【技術分野】
【０００１】
関連文献の相互参照
本出願は、参照によりここに援用されるところの、２００５年４月１１日出願の米国特許仮出願番号第６０／６７０，５４１号の優先権並びに利益を請求するものである。
【０００２】
技術分野
本発明は、尿酸分解活性を有する遺伝的に改変されたタンパク質に関する。より具体的には切断型尿酸オキシダーゼを含むタンパク質および、その製造法に関する。
【０００３】
背景技術
以下、「尿酸オキシダーゼ」と「ウリカーゼ」を同義語として用いる。尿酸オキシダーゼ（ウリカーゼ、Ｅ．Ｃ．１．７．３．３）は、酸化を触媒する事によって尿酸を、より可溶性が高く、より容易に排泄されるプリン代謝物質、アラントインへ転換する酵素である。ヒトは、高等霊長類の進化の過程で蓄積したウリカーゼ遺伝子へのいくつかの変異により、酵素活性を有するウリカーゼを生産しない。Ｗｕ，Ｘ，ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ ３４：７８−８４を参照することにより、その全文を本明細書に含む。この結果、感受性個体では、血中での過剰濃度の尿酸（高尿酸血症）が疼痛性関節炎（痛風）、関節破壊を伴う尿酸塩沈着（痛風結節）および腎不全を引き起こすことがある。アロプリノール（尿酸合成阻害剤）などの薬剤が利用可能であるが、一部の罹患個体では、治療を限定する有害作用を生じるか、またはこれらの症状を適切に軽減できない場合がある。Ｈａｎｄｅ，ＫＲ，ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ ７６：４７−５６、Ｆａｍ，ＡＧ，（１９９０） Ｂａｉｌｌｉｅｒｅ’ｓ Ｃｌｉｎ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ ４：１７７−１９２を、それぞれ参照することによってその全文を本明細書に含む。ウリカーゼの注入は、高尿酸血症および高尿酸尿症を少なくとも一次的に低減し得る。しかしながら、ウリカーゼはヒトにおいては外来タンパク質であるため、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ由来の非修飾タンパク質の一次注射でさえ、処置患者の数パーセントにおいてアナフィラキシー反応を誘導し（Ｐｕｉ，Ｃ−Ｈ，ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｌｅｕｋｅｍｉａ １１：１８１３−１８１６を、参照することによってその全文を本明細書に含む）、免疫応答は慢性的または間欠的治療における有用性を限定する（Ｄｏｎａｄｉｏ，Ｄ，ｅｔ ａｌ．，（１９８１） Ｎｏｕｖ Ｐｒｅｓｓｅ Ｍｅｄ １０：７１１−７１２、Ｌｅａｕｓｔｉｃ，Ｍ，ｅｔ ａｌ．，（１９８３） Ｒｅｖ Ｒｈｕｍ Ｍａｌ Ｏｓｔｅｏａｒｔｉｃ ５０：５５３−５５４をそれぞれ参照することによって全文を本明細書に含む）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、トランケートされ、構造安定性が向上した変異型組み換えウリカーゼタンパク質に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は新規の組み換えウリカーゼタンパク質を提供する。本発明のウリカーゼはトランケートされており、天然のウリカーゼタンパク質に対して、変異したアミノ酸を有する。
【０００６】
本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８のアミノ酸配列を含む変異型組み換えウリカーゼを提供する。さらにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３のアミノ酸配列を含む変異型組み換えウリカーゼも提供する。
【０００７】
本発明のさらなる目的は、尿酸分解活性を有する新規の組み換えウリカーゼタンパク質を含む、尿酸を代謝する手段を提供することである。尿酸分解活性とは、本明細書では酵素による尿酸のアラントインへの変換を指す。
【０００８】
特定の一実施形態にあっては、ウリカーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２の位置８から位置２８７のアミノ酸配列を含む。さらにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３のアミノ酸配列を含むウリカーゼが提供される。一実施形態にあっては、ウリカーゼはアミノ末端アミノ酸を含み、該アミノ末端アミノ酸はアラニン、グリシン、プロリン、セリンまたはトレオニンである。特定の一実施形態にあっては、アミノ末端アミノ酸はメチオニンである。
【０００９】
本発明は、本発明のウリカーゼをコードする核酸配列を含む、単離された核酸も提供する。一実施形態にあっては、該ウリカーゼをコードする核酸は動作可能なように異種性のプロモータ、例えばｏｓｍＢプロモータに連結されている。さらに、ウリカーゼをエンコードする核酸を含む核酸ベクター、ならびにこのようなベクターを含む宿主細胞も提供される。さらに一実施形態にあっては、核酸はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７の配列を有する。
【００１０】
このような宿主細胞を、核酸配列が宿主細胞によって発現されるような条件下で培養し、発現されたウリカーゼを単離する工程を含む、ウリカーゼを生成する方法も、提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１はプラスミドｐＯＵＲ−Ｐ−ΔＮ−ｋｓ−１の構造を示している。制限酵素サイトの横に示された番号は、１で示したＨａｅＩＩサイトから数えた、ヌクレオチドの位置を示している。クローニングの過程で失われた制限酵素サイトは、括弧付きで示している。
【００１２】
【図２】図２は、Ｐｉｇ−ＫＳ−ΔＮウリカーゼのＤＮＡ配列、および推定されるアミノ酸配列を示したものである（それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７）。図２のアミノ酸番号は、全長ブタウリカーゼに対応している。イニシエーターであるメチオニン残基に続いて、ブタウリカーゼ配列のアスパラギン酸７がトレオニンに置換されている。サブクローニングの様々な過程で使用した制限酵素サイトが、示されている。３′側の翻訳されない配列は小文字で示されている。翻訳終止コドンは、アスタリスクで示してある。
【００１３】
【図３】図３は様々な組み換えブタ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１）、ＰＢＣ−ΔＮＣ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２）およびＰｉｇ−ＫＳ−ΔＮ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７）ウリカーゼ配列のアラインメントを示している。Ｐｉｇ−ＫＳ−ΔＮで、公開されているブタウリカーゼ配列とアミノ酸の相違がある位置をアスタリスクで示している。丸印は、Ｐｉｇ−ＫＳ−ΔＮとＰＢＣ−ΔＮでアミノ酸の相違がある位置を示している。点線は、アミノ酸の欠失を示している。
【００１４】
【図４】図４はブタウリカーゼおよび、高度に精製した、実施例１から３に従って作成した変異型ウリカーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示している。生成日（月／年）およびそれぞれのサンプルに対応するレーン番号は以下に示してある。Ｙ軸は分子量マーカーの分子量でラベルされており、図の上部にレーン番号を示してある。レーン番号は以下の通りである：レーン１−分子量マーカー、レーン２−ＰｉｇＫＳ−ΔＮ（７／９８）、レーン３−Ｐｉｇ（９／９８）、レーン４−ＰｉｇＫＳ（６／９９）、レーン５−ＰｉｇＫＳ（６／９９）、レーン６−Ｐｉｇ−ΔＮ（６／９９）、レーン７−ＰｉｇＫＳ−ΔＮ（７／９９）、レーン８−ＰｉｇＫＳ−ΔＮ（８／９９）。
【００１５】
【図５】図５は血液サンプルでの酵素活性を測定することによって求めた、ラットでのＰＥＧ化された（９ｘ１０ｋＤ）Ｐｉｇ−ＫＳ−ΔＮウリカーゼのＩＭ（筋肉内投与）、ＳＣ（皮下投与）およびＩＶ（静脈内投与）注射後の薬物動態プロファイルを示している。示した時間間隔で採取した血漿サンプルにおけるウリカーゼ活性は比色分析によって求めた。活性の値（ｍＡＵ＝ミリ吸光度単位）は、血漿サンプル１μｌあたりの酵素反応速度を表している。注射されたウリカーゼの生物学的利用率（ＩＶ注射の内、循環系に到達する薬剤の量）はグラフの曲線の下のエリアから計算した。
【００１６】
【図６】図６は血液サンプルでの酵素活性を測定することによって求めた、ウサギでのＰＥＧ化された（９ｘ１０ｋＤ）Ｐｉｇ−ＫＳ−ΔＮウリカーゼのＩＭ（筋肉内投与），ＳＣ（皮下投与）およびＩＶ（静脈内投与）注射後の薬物動態プロファイルを示している。示した時間間隔で採取した血漿サンプルにおけるウリカーゼ活性は比色分析によって求めた。活性の値（ｍＡＵ＝ミリ吸光度単位）は、血漿サンプル１μlあたりの酵素反応速度を表している。注射されたウリカーゼの生物学的利用率（ＩＶ注射の内、循環系に到達する薬剤の量）はグラフの曲線の下のエリアから計算した。
【００１７】
【図７】図７は血液サンプルでの酵素活性を測定することによって求めた、イヌでのＰＥＧ化された（９ｘ１０ｋＤ）Ｐｉｇ−ＫＳ−ΔＮウリカーゼのＩＭ（筋肉内投与），ＳＣ（皮下投与）およびＩＶ（静脈内投与）注射後の薬物動態プロファイルを示している。示した時間間隔で採取した血漿サンプルにおけるウリカーゼ活性は比色分析によって求めた。活性の値（ｍＡＵ＝ミリ吸光度単位）は、血漿サンプル１μlあたりの酵素反応速度を表している。注射されたウリカーゼの生物学的利用率（ＩＶ注射の内、循環系に到達する薬剤の量）はグラフの曲線の下のエリアから計算した。
【００１８】
【図８】図８は血液サンプルでの酵素活性を測定することによって求めた、ブタでのＰＥＧ化された（９ｘ１０ｋＤ）Ｐｉｇ−ＫＳ−ΔＮウリカーゼのＩＭ（筋肉内投与），ＳＣ（皮下投与）およびＩＶ（静脈内投与）注射後の薬物動態プロファイルを示している。示した時間間隔で採取した血漿サンプルにおけるウリカーゼ活性は比色分析によって求めた。活性の値（ｍＡＵ＝ミリ吸光度単位）は、血漿サンプル１μlあたりの酵素反応速度を表している。注射されたウリカーゼの生物学的利用率（ＩＶ注射の内、循環系に到達する薬剤の量）はグラフの曲線の下のエリアから計算した。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
これまでの研究は、ＰＥＧ化によってウリカーゼの免疫原性および／または抗原性の大幅な低減が達成された場合は、必ず尿酸分解活性も大幅に失われてしまうことを示している。生物薬剤の安全性、利便性および対費用効果は、効力が失われ、また従って投与量を上げなければならないことによって悪影響を受ける。従って、血液を含む体液において、上昇した尿酸レベルを下げる安全で効果的な代替的な方法が必要とされている。本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３のアミノ酸配列を含む変異型組み換えウリカーゼを提供する。
【００２０】
特に記載のない限り、本明細書では用語「ウリカーゼ」を、個々のサブユニットならびにその四量体両方を指すものとして用いる。
【００２１】
本明細書では、用語「変異型ウリカーゼ」を、他のアミノ酸に置換されたアミノ酸を有するウリカーゼ分子を指す語として用いる。
【００２２】
特定の実施態様では、本発明のウリカーゼはアミノ末端メチオニンを有する。特定の実施態様では、アミノ末端メチオニンはウリカーゼが産生された後に除去される。特定の実施態様では、該メチオニンは内在するバクテリアのアミノペプチダーゼによって除去される。Ｎ末端のメチオニンの最も完全な除去を可能にするアミノ酸は、アラニン、グリシン、プロリン、セリンおよびトレオニンである。特定の一実施形態にあっては、ウリカーゼはアミノ末端に２つのアミノ酸を有し、この２つのアミノ酸は一方がメチオニンであって、これに引き続いてアラニン、グリシン、プロリン、セリンおよびトレオニンからなる群から選んだアミノ酸１つが引き続くものである。
【００２３】
本発明はウリカーゼをコードする核酸配列を提供する。
【００２４】
本発明は、当該核酸配列を含むベクターを提供する。
【００２５】
特定の一実施形態にあっては、ウリカーゼは単離される。特定の一実施形態にあっては、ウリカーゼは精製される。特定の実施形態にあっては、ウリカーゼは単離され精製される。
【００２６】
本発明はウリカーゼをコードする核酸配列を含むベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００２７】
本発明はＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応法）技術による、ウリカーゼをコードする核酸配列の改変を含む、ウリカーゼをコードする核酸配列を作成する方法を提供する。当該業務に精通する者には目的の核酸配列がＰＣＲによって、増幅する標的ＤＮＡの領域に相補的な合成オリゴヌクレオチドプライマー（それぞれの鎖に１つずつ）を介して、調製できることが既知である。プライマーを、過剰量のデオキシヌクレオチドおよび、耐熱性ＤＮＡポリメーラーゼであるＴａｑポリメラーゼの存在下で標的ＤＮＡ（純粋なものでなくてよい）に加える。標的ＤＮＡは、連続する温度サイクル（典型的な場合で、３０回）を経る中で反復して変性（約９０℃）、プライマーとのアニーリング（典型的な場合で、５０から６０℃）、プライマーからの娘鎖の伸長（７２℃）を繰り返す。次のサイクルからは娘鎖もテンプレートとして働くので、両方のプライマーとマッチするＤＮＡ断片は線形にではなく、指数関数的に増幅される。
【００２８】
本発明は、変異型組み換えウリカーゼを生成する方法を提供するものであって、宿主細胞のベクターによる形質転換、宿主細胞によるウリカーゼの発現、変異型組み換えウリカーゼの宿主細胞からの単離、精製された変異型組み換えウリカーゼの、例えばクロマトグラフィー技術による単離、および変異型組み換えウリカーゼの精製を含む。例えば、ウリカーゼは参照することによってその全文を本明細書に含む、国際公開第００／０８１９６号パンフレット、および米国特許出願番号６０／０９５，４８９に記載の方法によって作成することができる。
【００２９】
好ましい一実施形態にあっては、変異型組み換えウリカーゼの発現を引き起こすよう、宿主細胞に処置を施す。当該業務に精通する者には、細胞のベクターによる形質転換は通常カルシウムイオンと沈殿させたＤＮＡを用いて達成されるが、他にも様々な方法（例えば電気穿孔法）を用いることができることを理解している。
【００３０】
ウリカーゼは、当該業務に精通した者に既知であるあらゆる方法によって単離および／または精製されうる。一般に、本発明で発現させたポリペプチドは実質的に純粋な形で単離される。好ましくは、ポリペプチドは重量で少なくとも８０％の純度で単離される。より好ましくは、重量で少なくとも９５％の純度、そして最も好ましくは、少なくとも９９％の純度で単離される。一般にこのような精製は、例えば硫安分画法、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法およびアフィニティークロマトグラフィーの標準的な技法を用いて達成されうる。ウリカーゼは、好ましくは陽イオン界面活性剤、例えば、参照することによってその全文を本明細書に含む、２００５年４月１１日出願の同時係属出願、代理人整理番号第１０３８６４．１４６６４４号、タイトルが陽イオン界面活性剤によるタンパク質の精製である、米国特許仮出願番号第６０／６７０，５２０号に記載の方法に従って塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）によって単離される。
【００３１】
本発明の一実施形態にあっては、ベクターは浸透圧感受性プロモータの制御下にある。プロモータとは、ＲＮＡポリメラーゼが、ＤＮＡのＲＮＡへの転写プロセスを開始するに先立って結合する、ＤＮＡ領域のことを言う。浸透圧感受性プロモータは、細胞が浸透圧の上昇を感知した場合に転写を開始する。
【００３２】
本発明のウリカーゼはポリマーと結合したウリカーゼ、たとえばポリエチレングリコールと結合したウリカーゼ、すなわち、ＰＥＧ化されたウリカーゼを含む。
【００３３】
本発明の一実施形態にあっては、ウリカーゼを含む医薬組成物が提供される。一実施形態にあっては、組成物はウリカーゼ溶液である。好ましい一実施形態にあっては、溶液は滅菌済みであり、注射に適している。一実施形態にあっては、このような組成物はウリカーゼのリン酸緩衝生理食塩水溶液を含む。一実施形態にあっては、組成物はバイアルで提供され、さらに、任意にラバー注射ストッパーを備えることができる。特定の実施形態にあっては、組成物は、ウリカーゼを溶液１ミリリットルあたり２から１６ミリグラムの濃度、溶液１ミリリットルあたり４から１２ミリグラムの濃度、溶液１ミリリットルあたり６から１０ミリグラムの濃度で含む。好ましい一実施形態にあっては、組成物はウリカーゼを１ミリリットルあたり８ミリグラムの濃度で含む。好ましくは、ウリカーゼの重量は、タンパク質重量に対して測定される。
【００３４】
本発明の組成物の効果的な投与計画は、当該業務に精通した者によって決定されうる。任意の投与計画の、有効性の評価に適した指標は、当該業務に精通した者に既知である。このような指標の例としては、血漿尿酸レベル（ＰＵＡ）の正常化または低下、ならびにＰＵＡを６．８ｍｇ／ｄＬ以下、好ましくは６ｍｇ／ｄＬ以下に低下または維持させることが挙げられる。好ましい一実施形態にあっては、本発明の組成物による治療の対象者は、総治療期間の７０％以上、８０％以上、または９０％以上の期間、ＰＵＡが６ｍｇ／ｍｌ以下である。例えば治療期間が２４週間である場合、対象者のＰＵＡは２４週間の治療期間の８０％以上の間、すなわち、少なくとも１３４．４日（２４週間ｘ７日間／週間ｘ０．８＝１３４．４日）に等しい時間の間、６ｍｇ／ｍｌ以下である。
【００３５】
特定の実施形態にあっては、溶液としてウリカーゼ０．５から２４ｍｇが２から４週に１回投与される。ウリカーゼは、当該業務に精通した者に既知のあらゆる適切な方法、例えば静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与によって投与することができる。好ましくは、投与が静脈内投与による場合は、ウリカーゼとして０．５ｍｇから１２ｍｇが投与される。好ましくは、投与が皮下投与による場合は、ウリカーゼとして４ｍｇから２４ｍｇが投与される。好ましい一実施形態にあっては、ウリカーゼは静脈点滴によって、３０から２４０分の点滴時間で投与される。一実施形態にあっては、２週間に１回、ウリカーゼとして８ｍｇが投与される。特定の実施形態にあっては、１００から５００ｍＬの生理食塩水を用いて点滴を行うことができる。好ましい一実施形態にあっては、２週間に１回または４週間に１回、点滴時間１２０分で、溶液として８ｍｇのウリカーゼが投与される。好ましくは、点滴に用いるウリカーゼは２５０ｍＬの生理食塩水に溶解される。特定の実施形態にあっては、ウリカーゼの投与は３ヶ月間、６ヶ月間、８ヶ月間または１２ヶ月間の治療期間にわたって行う。他の実施形態にあっては、治療期間は１２週間、２４週間、３６週間または４８週間である。特定の一実施形態にあっては、治療期間は長期間にわたるものであって、例えば２年以上、治療対象者の全生存期間にわたる。加えて、複数の治療期間を、治療休止期間ではさむことも可能である。例えば、６ヶ月間の治療に引き続いて３ヶ月間の治療休止期間をおき、その後再び６ヶ月間治療を行うことなどが、可能である。
【００３６】
特定の実施形態にあっては、ウリカーゼの投与による注入反応の出現を阻止または低減するために、予防的に抗炎症性物質を投与することができる。一実施形態にあっては、少なくとも１つのコルチコステロイド、少なくとも１つの抗ヒスタミン薬、少なくとも１つのＮＳＡＩＤ、またはこれらの組み合わせが、よって投与される。有用なコルチコステロイドには、ベータメタゾン、ブデソニド、コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニソロン、プレドニソロン、プレドニゾンおよびトリアムシノロンが含まれる。有用なＮＳＡＩＤにはイブプロフェン、インドメタシン、ナプロキセン、アスピリン、アセトアミノフェン、セレコキシブおよびバルデコキシブが含まれる。有用な抗ヒスタミン薬には、アザタジン、ブロムフェニラミン、セチリジン、クロルフェニラミン、クレマスチン、シプロヘプタジン、デスロラタジン、デクスクロルフェニラミン、ジメンヒドリナート、ジフェンヒドラミン、ドキシルアミン、フェキソフェナジン、ヒドロキシジン、ロラタジンおよびフェニンダミンが含まれる。
【００３７】
好ましい一実施形態にあっては、抗ヒスタミン薬はフェキソフェナジンであり、ＮＳＡＩＤはアセトアミノフェンであり、コルチコステロイドはヒドロコルチゾンおよび／またはプレドニゾンである。好ましくは、３つ全ての組み合わせ（必ずしも同時にではない）を、ウリカーゼ溶液の注入投与の前に投与する。好ましい一実施形態にあっては、ＮＳＡＩＤと抗ヒスタミン薬はウリカーゼ注入の１から４時間前に経口投与される。フェキソフェナジンの適切な用量は約３０から約１８０ｍｇ、約４０から約１５０ｍｇ、約５０から約１２０ｍｇ、約６０から約９０ｍｇ、約６０ｍｇを含み、好ましくは６０ｍｇである。アセトアミノフェンの適切な用量は約５００から約１５００ｍｇ、約７００から約１２００ｍｇ、約８００から約１１００ｍｇ、約１０００ｍｇを含み、好ましくは１０００ｍｇである。ヒドロコルチゾンの適切な用量は約１００から約５００ｍｇ、約１５０から約３００ｍｇ、約２００ｍｇを含み、好ましくは２００ｍｇである。一実施形態にあっては、抗ヒスタミン薬はジフェンヒドラミンではない。他の実施形態にあっては、ＮＳＡＩＤはアセトアミノフェンではない。好ましい一実施形態にあっては、フェキソフェナジン６０ｍｇをウリカーゼ注入の前夜に経口投与し、フェキソフェナジン６０ｍｇおよびアセトアミノフェン１０００ｍｇを次の朝に経口投与し、最後に、ウリカーゼ注入の直前にヒドロコルチゾン２００ｍｇを投与する。一実施形態にあっては、プレドニゾンをウリカーゼ投与の前日に、好ましくは夕方、投与する。プレドニゾンの適切な用量は５から５０ｍｇを含み、好ましくは２０ｍｇである。特定の実施形態にあっては、注入反応の出現を阻止または低減させるためのこのような予防措置は、ＰＥＧ化ウリカーゼおよび非ＰＥＧ化ウリカーゼを含むウリカーゼ投与を、受けているかまたは受ける予定の治療対象者に対して講じられる。特定の実施形態にあっては、このような予防措置はウリカーゼ以外の、ＰＥＧ化治療薬ペプチドおよび非ＰＥＧ化治療薬ペプチドを含む、治療薬ペプチド投与を受けているかまたは受ける予定の対象者に対して講じられる。
【００３８】
本発明の一実施形態にあっては、医薬組成物はポリマーと結合されたウリカーゼを含有するものであって、修飾されたウリカーゼは尿酸分解活性を保持している。好ましい実施態様においては、ウリカーゼはＰＥＧ化されたウリカーゼである。
【００３９】
本発明の一実施形態にあっては、医薬組成物はポリマーとの結合によって修飾されたウリカーゼを含有するものであって、修飾されたウリカーゼは尿酸分解活性を保持している。特定の一実施形態にあっては、ポリマー−ウリカーゼ結合体は参照によってその全文を本明細書に含める、国際公開第０１／５９０７８号パンフレットおよび米国特許出願番号第０９／５０１７３０号に記載されている方法に従って調製される。
【００４０】
本発明の一実施形態にあっては、ポリマーはポリエチレングリコール、デキストラン、ポリプロピレングリコール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリビニールピロリドンおよびポリビニールアルコールを含む群から選択される。好ましい実施態様においては、ポリマーはポリエチレングリコールであり、ウリカーゼはＰＥＧ化されたウリカーゼである。
【００４１】
本発明の一実施形態にあっては、組成物は２−１２のポリマー分子をそれぞれのウリカーゼサブユニットに含有し、好ましくは、３から１０ポリマー分子をそれぞれのウリカーゼサブユニットに含有する。本発明の一実施形態にあっては、それぞれのポリマー分子は約１ｋＤから約１００ｋＤの分子量を有する。
【００４２】
本発明の他の実施形態にあっては、それぞれのポリマー分子は約１ｋＤから約５０ｋＤの分子量を有する。本発明の好ましい一実施形態にあっては、それぞれのポリマー分子は約５ｋＤから約２０ｋＤ、約８ｋＤから約１５ｋＤ、約１０ｋＤから１２ｋＤの分子量を有し、好ましくは、約１０ｋＤの分子量を有する。好ましい一実施形態にあっては、それぞれのポリマー分子は約５ｋＤまたは約２０ｋＤの分子量を有する。特に好ましい本発明の一実施形態にあっては、それぞれのポリマー分子は１０ｋＤの分子量を有する。
【００４３】
本発明の実施態様においては、組成物は、組成物の反復投与に適している。
【００４４】
本発明は当該ウリカーゼを用いて尿酸を代謝する方法を提供する。
【００４５】
本発明は、ウリカーゼ組成物の、体液中尿酸レベルの低減への利用を提供する。
【００４６】
本発明の一実施形態にあっては、ウリカーゼ組成物は血液を含む体液における尿酸の低減に用いられる。
【００４７】
また、本発明のウリカーゼをコードする新規核酸分子も提供される。これらを生産する技法は、当該業務に精通した者によく知られている。例えば、ウリカーゼ核酸配列は当該業界に既知である、多くのあらゆる戦略によって改変されうる（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，１９９０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）。配列は、適切な場所で１つまたはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼによって切断でき、必要であればさらに酵素による改変を施し、単離し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでライゲーションすることができる。ウリカーゼをコードする遺伝子の作成にあっては、改変された遺伝子が翻訳停止シグナルに遮られることなく、適切な翻訳読み枠を保持するよう注意すべきである。
【００４８】
ウリカーゼタンパク質をコードする核酸配列は適切な発現ベクター、すなわち、挿入されたタンパク質コーディング配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含むベクターに、挿入することができる。タンパク質コーディング配列を発現させるためには、多様な宿主ベクター系を用いることができる。これらはウィルス（例えばワクシニアウィルス、アデノウィルス等）を感染させた哺乳類細胞系、ウィルス（例えばバキュロウィルス）を感染させた昆虫細胞系、酵母ベクターを含む酵母などの微生物、バクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、コスミドＤＮＡなどで形質転換したバクテリアを含むが、これに限定されない。これらのベクターの発現エレメントはそれらの強度と特異性において異なる。用いる宿主ベクター系に応じて、あらゆる適切な転写および翻訳エレメントを用いることができる。
【００４９】
適切な転写／翻訳制御シグナルと、タンパクをコードする配列からなるキメラ遺伝子を含んだ発現ベクターの作製には、ＤＮＡ断片をベクターに挿入する既知のあらゆる方法を用いることができる。このような方法には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡおよび合成的技術およびｉｎ ｖｉｖｏ組換え（遺伝的組換え）を含めることができる。ウリカーゼタンパク質をコードしている核酸配列の発現は、組換えＤＮＡ分子で形質転換した宿主内でウリカーゼタンパク質が発現されるよう、第二の核酸配列によって制御することができる。例えば、ウリカーゼの発現は、技術的に知られているあらゆるプロモータ／エンハンサーエレメントによって制御され得る。ウリカーゼの発現を制御するのに用いることのできるプロモータはＳＶ４０初期プロモータ領域（Ｂｅｒｎｏｉｓｔ ａｎｄ Ｃｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４−３１０）、ラウス肉腫ウィルスの３’末端反復配列に含まれるプロモータ（Ｙａｍａｍｏｔｏ，ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｃｅｌｌ ２２：７８７−７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモータ（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４−１４４５）、メタロチオネイン遺伝子の制御配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８２，Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２）、βラクタマーゼプロモータなどの原核生物発現ベクター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆ，ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７５：３７２７−３７３１）、ｔａｃプロモータ（ＤｅＢｏｅｒ，ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２１−２５）、ｏｓｍＢプロモータを含むが、これに限定されない。特定の実施形態にあっては、核酸は動作可能な形で異種性プロモータに結合されたウリカーゼ配列を含む。
【００５０】
核酸配列がコードされている特定の組み換えＤＮＡ分子が一旦調製され単離されたならば、技術的に知られている数種の方法によって、増殖させることができる。一旦宿主系ならびに培養条件が確立されれば、組み換え発現ベクターは増殖させ、大量に調製することができる。先に説明したように、使用できる発現ベクターは数例を挙げるならば、ワクシニアウィルスまたはアデノウィルスなどのヒトまたは動物ウィルス、バキュロウィルスなどの昆虫ウィルス、酵母ベクター、バクテリオファージベクター（例：ラムダ）およびプラスミドおよびコスミドＤＮＡベクターならびに、これらの誘導体を含むが、これに限定されない。
【００５１】
加えて、挿入された配列の発現を制御する、または遺伝子産物に、目的に合致した特定の修飾ならびに処理を施す宿主細胞株を選択することが可能である。特定のプロモータによる発現は特定の誘導物質の存在下で上昇し、よって遺伝的に改変したウリカーゼタンパク質の発現を制御することができる。さらに、異なる宿主細胞はそれぞれ特徴的ならびに特異的な、タンパク質の翻訳処理および翻訳後処理および修飾（例えばグリコシル化、切断）メカニズムを有している。発現された外来タンパク質に、目的の修飾および処理が施されることが保証されるよう、適切な細胞株を選ぶことができる。異なったベクター／宿主発現系は、タンパク質分解性開裂反応などの処理反応の程度を変えるなどの影響を与えうる。
【００５２】
本発明の特定の実施形態にあっては、ウリカーゼ をＥ．ｃｏｌｉで発現させることが好ましく、この際ｏｓｍＢプロモータを含むベクターを用いる。
【００５３】
実施例
実施例 １． 遺伝子の作成ならびにウリカーゼ発現のための発現プラスミド
組み換えブタウリカーゼ（尿酸酸化酵素）、Ｐｉｇ−ＫＳ−ΔＮ（アミノ末端がトランケーションされたブタウリカーゼタンパク質で、第２９１番目と第３０１番目のアミノ酸が、それぞれリシンとセリンに置換されている）をＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２株Ｗ３１１０Ｆ−で発現させた。ｐＯＵＲ−Ｐ−ΔＮ−ｋｓ−１に到る、一連のプラスミドを作成したが、ｐＯＵＲ−Ｐ−ΔＮ−ｋｓ−１でＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞を形質転換したところ、ウリカーゼを効率的に発現する能力を獲得した。
【００５４】
ウリカーゼｃＤＮＡのブタおよびヒヒ肝臓からの単離およびサブクローニング
ウリカーゼｃＤＮＡは、当該ＲＮＡのサブクローニングおよび単離によって、ブタおよびヒヒ肝臓より調製した。全細胞ＲＮＡをブタおよびヒヒ肝臓より抽出し（Ｅｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ａ．（１９８９）．ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．（１９９８）．Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、ファースト−ストランドｃＤＮＡ合成キット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて逆転写した。ＰＣＲ増幅反応は、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて行った。
【００５５】
ブタならびにヒヒ尿酸オキシダーゼ（ウリカーゼ）のＰＣＲ増幅反応に用いた合成オリゴヌクレオチドプライマーは表１に示した。
表 １． ウリカーゼｃＤＮＡのＰＣＲ増幅に用いたプライマー
【表１】
【００５６】
プライマー末端に設定した制限酵素配列はセンスＥｃｏＲＩおよびＮｃｏＩ（ブタおよびヒヒ）およびアンチセンスＮｃｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ（ブタ）、ＸｂａＩおよびＮｃｏＩ（ヒヒ）であり、表１に小文字で示してある。ヒヒのセンスプライマーでは、ヒヒウリカーゼに存在する３番目のコドンＧＡＣ（アスパラギン酸）を、ヒト尿酸オキシダーゼ偽遺伝子をコードする配列のこの位置に存在するＣＡＣ（ヒスチジン）で置換した。これらのプライマーを用いて作成した組み換えヒヒウリカーゼ構造体をＤ３Ｈヒヒウリカーゼとする。
【００５７】
ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩでブタウリカーゼＰＣＲ産物を処理し、ｐＵＣ１８にクローニングしてｐＵＣ１８−ブタウリカーゼを得た。Ｄ３ＨヒヒウリカーゼＰＣＲ産物はＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、直接ｐＣＲ（登録商標）ＩＩベクターにクローニングし、ｐＣＲ（登録商標）ＩＩ−Ｄ３Ｈヒヒウリカーゼを得た。
【００５８】
ライゲーションしたｃＤＮＡでＥ．ｃｏｌｉ株ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）を形質転換した。クローニングしたウリカーゼｃＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡを調製し、公開されたウリカーゼＤＮＡコーディング配列を含むクローン（表１に記載の、ヒヒウリカーゼでのＤ３Ｈの置換を除く）をセレクションし、単離した。選んだｐＣＲ（登録商標）ＩＩ−Ｄ３ＨヒヒウリカーゼクローンにおいてはＰＣＲによって配列を削除したことで、ｐＣＲ（登録商標）ＩＩ配列がウリカーゼのストップコドンの隣にくるようになっている。この結果として、３′側の翻訳されない領域にあったＸｂａＩおよびＮｃｏＩの制限酵素サイトが除かれているので、ＰＣＲ産物の５′末端に存在するＮｃｏＩサイトとｐＣＲ（登録商標）ＩＩベクター由来のＢａｍＨＩサイトを用いて、デクレショナルクローニングをすることができた。
【００５９】
ウリカーゼｃＤＮＡの、ｐＥＴ発現ベクターへのサブクローニング
ヒヒウリカーゼのサブクローニング
ウリカーゼコード配列の全長を含むＤ３ＨヒヒｃＤＮＡをｐＥＴ−３ｄ発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に導入した。ｐＣＲ（登録商標）ＩＩ−Ｄ３ＨヒヒウリカーゼをＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで処理し、得られた９６０ｂｐの断片を単離した。発現プラスミドｐＥＴ−３ｄはＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで処理し、得られた４６００ｂｐの断片を単離した。この２つの断片をライゲーションしてｐＥＴ−３ｄ−Ｄ３Ｈ−Ｂａｂｏｏｎを得た。
【００６０】
ブタ−ヒヒキメラウリカーゼのサブクローニング
ブタ−ヒヒキメラ（ＰＢＣ）ウリカーゼは、発現量、安定性および活性がより大きい組み換え遺伝子を得るために作成された。ＰＢＣの作成にはまず、ｐＥＴ−３ｄ−Ｄ３Ｈ−ヒヒクローンから４９３６ｂｐ長のＮｃｏＩ−ＡｐａＩ断片を単離し、これをｐＵＣ１８−ブタウリカーゼから単離した６２４ｂｐ長のＮｃｏＩ−ＡｐａＩ断片とライゲーションしてｐＥＴ−３ｄ−ＰＢＣを得た。ＰＢＣウリカーゼｃＤＮＡは、ブタウリカーゼのコドン１−２２５と、ヒヒウリカーゼのコドン２２６−３０４をインフレームで結合したものからなる。
【００６１】
Ｐｉｇ−ＫＳウリカーゼのサブクローニング
Ｐｉｇ−ＫＳウリカーゼは、ＰＥＧ化できる部位を１つ増やすことが期待されるリシン残基を、１つ加える目的で作成した。ＫＳとはブタウリカーゼの２９１番目の位置にあるアルギニンの代わりにリシンを挿入したアミノ酸置換（Ｒ２９１Ｋ）を指す。加えて、３０１番目の位置にあるトレオニンをセリンで置換した（Ｔ３０１Ｓ）。Ｐｉｇ−ＫＳウリカーゼプラスミドは、ｐＥＴ−３ｄ−Ｄ３Ｈ−Ｂａｂｏｏｎから４６９６ｂｐ長のＮｃｏＩ−ＮｄｅＩ断片を単離し、ｐＵＣ１８−ブタウリカーゼから単離した得た８６４ｂｐ長のＮｃｏＩ−ＮｄｅＩ断片をライゲーションして作成し、ｐＥＴ−３ｄ−Ｐｉｇ−ＫＳとした。得られたＰｉｇＫＳウリカーゼ配列は、ブタウリカーゼコドン１−２８８がインフレームにヒヒウリカーゼコドン２８９−３０４と結合されたものとなっている。
【００６２】
ｏｓｍＢプロモータの制御下にあるウリカーゼ配列のサブクローニング
ウリカーゼ遺伝子を、ｏｓｍＢプロモータを含む発現ベクターにサブクローニングした（参照することによってその全文を本明細書に含む、米国特許番号５，７９５，７７６号に従った）。このベクターは、高浸透圧または長時間の培養によってタンパク質発現を誘導することを可能にした。発現プラスミドｐＭＦＯＡ−１８はｏｓｍＢプロモータ、リボソーム結合部位配列（ｒｂｓ）および転写ターミネーター配列（ｔｅｒ）を含んでいる。また、アンピシリン耐性（ＡｍｐＲ）を付与し、組み換えヒトアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）を発現する。
【００６３】
Ｄ３Ｈ−ヒヒウリカーゼのサブクローニング
プラスミドｐＭＦＯＡ−１８をＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで処理し、大きな断片を単離した。ｐＥＴ−３ｄ−Ｄ３Ｈ−ＢａｂｏｏｎをＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで処理し、Ｄ３Ｈヒヒウリカーゼを含む９６０ｂｐ長の断片を単離した。この２つの断片をライゲーションしてｐＭＦＯＵ１８を得た。
【００６４】
発現プラスミドｐＭＦＸＴ１３３はｏｓｍＢプロモータ、ｒｂｓ（Ｅ．ｃｏｌｉｄｅｏオペロン）、ｔｅｒ（Ｅ．ｃｏｌｉＴｒｙｐＡ）、組み換え型第Ｘａ因子阻害ポリペプチド（ＦｘａＩ）を含み、テトラサイクリン耐性遺伝子（ＴｅｔＲ）を宿主に与える。ヒヒウリカーゼ遺伝子をこのプラスミドに挿入し、抗生物質耐性遺伝子と交換した。プラスミドｐＭＦＯＵ１８をＮｃｏＩで処理し、平滑化後、ＸｈｏＩで処理し、１０３０ｂｐ長の断片を単離した。プラスミドｐＭＦＸＴ１３３はＮｄｅＩで処理した後、平滑化し、その後ＸｈｏＩで処理し、大きな断片を単離した。この２断片をライゲーションしてヒヒウリカーゼ発現ベクターｐＵＲＢＡ１６を得た。
【００６５】
ブタ−ヒヒキメラウリカーゼのサブクローニング
プラスミドｐＵＲＢＡ１６をＡｐａＩおよびＡｌｗＮＩで処理し、２３２０ｂｐ長の断片を単離した。プラスミドｐＭＦＸＴ１３３をＮｄｅＩで処理し、平滑化し、次にＡｌｗＮＩで処理し、６２０ｂｐ長の断片を単離した。プラスミドｐＥＴ−３ｄ−ＰＢＣをＸｂａＩで処理し、平滑化し、次にＡｐａＩで処理し、得た７１０ｂｐ長の断片を単離した。この３つの断片をライゲーションし、ｐＥＴ−３ｄベクター由来の、ｏｓｍＢプロモータならびにｒｂｓならびにＴ７ｒｂｓの制御下でＰＢＣウリカーゼを発現するプラスミドｐＵＲ−ＰＢを得た。
【００６６】
Ｔ７ｒｂｓは追加的な工程で取り除いた。ｐＵＲ−ＰＢをＮｃｏＩで処理し、平滑化し、次にＡｌｗＮＩで処理し、得た３０００ｂｐ長の断片を単離した。プラスミドｐＭＦＸＴ１３３をＮｄｅＩで処理し、平滑化し、次にＡｌｗＮＩで処理し、得た６２０ｂｐ長の断片を単離した。この２つの断片をライゲーションして、ＰＢＣをｏｓｍＢプロモータの制御下で発現するｐＤＵＲ−ＰＢを得た。
【００６７】
ｐＯＵＲ−ＰＢ−ΔＮＣの作成
ウリカーゼｃＤＮＡを何カ所か改変したところ、安定性が大幅に高まった組み換え体酵素を得ることができた。プラスミドｐＯＵＲ−ＰＢＣ−ΔＮＣは、ｉｎｖｉｖｏでペルオキシソームターゲティングシグナルとして機能する、Ｃ末端のトリペプチドとマチュレーションペプチドであるＮ末端の６残基とを取り除いて作成した。これは、プラスミドｐＤＵＲ−ＰＢのＰＢＣ配列と、表２に示した特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ増幅反応によって行った。
表２．ＰＢＣ−ΔＮＣウリカーゼのＰＣＲ増幅に用いたプライマー
【表２】
【００６８】
プライマーの末端に導入した制限酵素切断部位は太字で、また翻訳されない領域は小文字で、それぞれ表２に示してある。ＮｄｅＩはセンス方向であり、ＸｂａＩはアンチセンス方向である。アンチセンスプライマーは、アミノ酸配列に影響しない点変異（下線で示している）を導入することによって内部に存在するＮｄｅＩサイトを除去し、ＮｄｅＩを用いたサブクローニングを可能にするためにも用いられた。
【００６９】
ｐＤＵＲ−ＰＢのＰＣＲ増幅反応で得た９００塩基長の断片をＮｄｅＩおよびＸｂａＩで切断し、単離した。得た断片を、次にＥ．ｃｏｌｉ由来のｄｅｏ−Ｐ１Ｐ２プロモータおよびｒｂｓを含み、恒常的にヒト組み換え型インシュリン前駆体を発現するｄｅｏ発現プラスミドｐＤＢＡＳＴ−ＲＡＴ−Ｎに挿入した。プラスミドをＮｄｅＩおよびＸｂａＩで処理し、得た４０３５ｂｐ長の断片を単離し、ＰＢＣ−ウリカーゼＰＣＲ産物とライゲーションした。よって得たｐＤＵＲ−ＰＢ−ΔＮＣで、Ｅ．ｃｏｌｉＫ−１２ＳΦ７３３（Ｆ−ｃｙｔＲｓｔｒＡ）を形質転換したところ、活性を有する切断型ウリカーゼを多量に発現した。
【００７０】
両端でトランケーションしたＰＢＣ−ΔＮＣ配列は、ｏｓｍＢプロモータの制御下でも発現させた。プラスミドｐＤＵＲ−ＰＢ−ΔＮＣをＡｌｗＮＩ−ＮｄｅＩで処理し、得た３４５９ｂｐ長の断片を単離した。先に述べたプラスミドｐＭＦＸＴ１３３をＮｄｅＩ−ＡｌｗＮＩで処理し、得た６６０ｂｐ長の断片を単離した。これらの断片をライゲーションし、ｐＯＵＲ−ＰＢ−ΔＮＣを得、これでＥ．ｃｏｌｉＫ−１２株Ｗ３１１０Ｆ−を形質転換したところ、活性を有する切断型ウリカーゼを多量に発現した。
【００７１】
ウリカーゼ発現プラスミドｐＯＵＲ−Ｐ−ΔＮ−ｋｓ−１の作成
このプラスミドは、組み換え型酵素の活性ならびに安定性を向上させるために作成した。Ｐｉｇ−ＫＳ−ΔＮウリカーゼは、Ｎ末端のマチュレーションペプチド６残基が除去される形でＮ末端のみをトランケーションし（ΔＮ）、Ｓ４６ＴならびにＲ２９１ＫならびにＴ３０１Ｓ変異を有するように作成した。４６番目の位置には、ＰＣＲ増幅反応ならびにクローニングの過程で発生した保存的変異によって、セリン残基の代わりにトレオニン残基が存在していた。２９１番目の位置ではアルギニンがリシンに、また３０１番目の位置では、トレオニンがセリンに置換されていた。この両方が、ヒヒウリカーゼ配列由来である。Ｒ２９１ＫならびにＴ３０１Ｓの両改変は先にＫＳと命名し、説明したとおりである。リシン残基を追加することで、潜在的なＰＥＧ化サイトが１つ追加されている。
【００７２】
ｐＯＵＲ−Ｐ−ΔＮ−ｋｓ−１（図１）の作成には、プラスミドｐＯＵＲ−ＰＢ−ΔＮＣをＡｐａＩ−ＸｂａＩで処理し、得た３８７３ｂｐ長の断片を単離した。プラスミドｐＥＴ−３ｄ−ＰＫＳ（構造を図４に示してある）をＡｐａＩ−ＳｐｅＩで処理し、得た２７０ｂｐ長の断片を単離した。ＳｐｅＩによる５′ＣＴＡＧでの切断の結果、ＸｂａＩによって生じたＤＮＡ断片と効率的にライゲーションする、５′ＣＴＡＧの突出部が生じた。この２つの断片をライゲーションしてｐＯＵＲ−Ｐ−ΔＮ−ｋｓ−１を得た。ライゲーションの結果、ＳｐｅＩおよびＸｂａＩ認識サイトは失われた（図９に括弧で示してある）。プラスミドｐＯＵＲ−Ｐ−ΔＮ−ｋｓ−１をＥ．ｃｏｌｉＫ−１２株Ｗ３１１０Ｆ−原栄養株ＡＴＣＣ＃２７３２５に導入した。ｏｓｍＢプロモータの制御下で発現させて得たＰｉｇ−ＫＳ−ΔＮウリカーゼにより、優れた活性ならびに安定性を有する組み換え型酵素を多量に得ることができた。
【００７３】
図１はプラスミドｐＯＵＲ−Ｐ−ΔＮ−ｋｓ−１の構造を示したものである。制限酵素サイトの横に示した番号は、１と設定したＨａｅＩＩサイトから数えた、ヌクレオチドの位置を示している。クローニングの過程で失われた制限酵素サイトは括弧で示してある。Ｐｉｇ−ＫＳ−ΔＮウリカーゼをコードするプラスミドｐＯＵＲ−Ｐ−ΔＮ−ｋｓ−１は４１４３塩基対（ｂｐ）長で、下記のエレメントを含む。
１． ｏｓｍＢプロモータおよびリボソーム結合サイト（ｒｂｓ）を含む、１番目のヌクレオチドから、ＮｄｅＩサイト（１１３番目の位置）に到る、１１３ｂｐ長のＤＮＡ断片。
２． Ｐｉｇ−ＫＳ−ΔＮ（アミノ末端がトランケーションされており、２９１番目および３０１番目のアミノ酸がそれぞれリシンおよびセリンで置換されているブタウリカーゼタンパク質の核酸配列）コーディング領域から９００ｂｐ、ならびにｐＣＲ（登録商標）ＩＩ由来の、ＴＡクローニング部位から上流方向にＳｐｅＩ／ＸｂａＩ制限酵素サイトまでの同フランキング配列３２ｂｐを含む、ＮｄｅＩ（１１３番目の位置）からＳｐｅＩ／ＸｂａＩジャンクション（第１０４５番目の位置）に到る９３２ｂｐ長のＤＮＡ断片。
３． ＳｐｅＩ／ＸｂａＩジャンクション（１０４５番目の位置）からＨｉｎｄＩＩＩ（１０７０番目の位置）にわたる、２５ｂｐのマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）配列。
４． ＨｉｎｄＩＩＩ（１０７０番目の位置）およびＡａｔＩＩ（１１１０番目の位置）を末端に有し、ＴｒｐＡ転写ターミネーター（ｔｅｒ）を含む４０ｂｐの合成オリゴヌクレオチド。
５． ｐＢＲ３２２上の、ＡａｔＩＩ（１１１０番目の位置）からＭｓｃＩ／ＳｃａＩ（２６２９番目の位置）にわたる、テトラサイクリン耐性遺伝子（ＴｅｔＲ）を含む１５１９ｂｐ長のＤＮＡ断片。
６． ＤＮＡ複製起点を含み、ｐＢＲ３２２上のＳｃａＩ（２６２９番目の位置）からＨａｅＩＩ（４１４３番目の位置）にわたる、１５１４ｂｐ長のＤＮＡ断片。
【００７４】
図２は、Ｐｉｇ−ＫＳ−ΔＮウリカーゼのＤＮＡ配列ならびに推定アミノ酸配列を示している。この図では、アミノ酸の位置を示す番号は全長ブタウリカーゼ配列に対応している。イニシエーターであるメチオニン残基に続いて、ブタウリカーゼ配列ではアスパラギン酸となっている位置に、代わりにトレオニンを挿入した。このトレオニン残基によって、バクテリアのアミノペプチダーゼによるメチオニンの除去が可能となっている。アミノ酸配列にある間隙は、削除されたＮ末端のマチュレーションペプチドを示している。異なるウリカーゼ配列のサブクローニングの様々な過程で用いた制限酵素サイト（ＡｐａＩ、ＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩおよびＳｐｅＩ）が示してある。小文字で示した３′側の翻訳されない領域は、ｐＣＲ（登録商標）ＩＩに由来する配列である。翻訳停止コドンはアスタリスクで示してある。
【００７５】
図３は様々な組み換え型ウリカーゼ配列のアミノ酸配列のアラインメントを示したものである。１行目は全長アミノ酸配列を含むブタウリカーゼの配列である。２行目は両端をトランケーションしたブタ−ヒヒキメラウリカーゼ（ＰＢＣ−ΔＮＣ）である。３行目はＮ末端側のみでトランケーションされており、変異Ｓ４６Ｔおよびウリカーゼコーディング配列のカルボキシ末端のヒヒ由来物を反映するアミノ酸変異Ｒ２９１ＫおよびＴ３０１Ｓを有するＰｉｇ−ＫＳ−ΔＮウリカーゼ配列である。アスタリスクは、Ｐｉｇ−ＫＳ−ΔＮと公開されているブタウリカーゼ配列とでアミノ酸配列に相違がある位置を示している。丸印は、Ｐｉｇ−ＫＳ−ΔＮとブタ−ヒヒキメラＰＢＣ−ΔＮとでアミノ酸配列に相違がある位置を示している。点線はアミノ酸の欠損を示している。
【００７６】
Ｙ９７Ｈ変異を有するネィティブのヒヒ、ブタ、ウサギウリカーゼおよびブタ／ヒヒキメラ（ＰＢＣ）のｃＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉへのクローニングのために作成した。全クローンでｏｓｍＢによって発現が制御されており、Ｗ３１１０Ｆ−Ｅ．ｃｏｌｉであるように、変異型ウリカーゼを多量に発現しているクローンを作成して選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、ＤＮＡシーケンシングならびに制限酵素分析によって確認し、細胞を培養した。
【００７７】
Ｐｉｇ−ΔＮおよびＰｉｇ−ＫＳ−ΔＮを含む切断型ウリカーゼの作成は、ＰＢＣ−ΔＮＣとＰｉｇ−ＫＳを、制限酵素ＡｐａＩおよびＸｂａＩ、ならびにＡｐａＩおよびＳｐｅＩでそれぞれ処理後、クロスライゲーションして行った。Ｎ末端の「マチュレーションペプチド」（１−２）６残基、ならびにＣ末端のトリペプチド「ペルオキシソームターゲティングシグナル」（３−５）は酵素活性に大きく影響する機能を有さないので、これらのトランケーションされた変異体は活性を保つものと思われ、また、これらの配列は免疫原性を有する可能性が考えられる。ウリカーゼを非常に多量に発現しているクローンを選択した。
【００７８】
実施例２．発現プラスミドの、バクテリア宿主細胞への形質転換
発現プラスミドｐＯＵＲ−Ｐ−ΔＮ−ｋｓ−１を、Ｅ．ｃｏｌｉＫ−１２株Ｗ３１１０Ｆ−に導入した。ルリア培地（ＬＢ）で対数増殖期中期にまで培養した形質転換用のバクテリア細胞を、遠心処理によって集菌し、冷水で洗浄後１０％グリセロールに懸濁、さらに水に懸濁し、１ｍｌあたり約３ｘ１０１０細胞の最終濃度とした。細胞はアリコットとして−７０℃で保存した。プラスミドＤＮＡはエタノールで沈殿させ水に溶解した。
【００７９】
バクテリア細胞とプラスミドＤＮＡを混合し、ＢＩＯ−ＲＡＤからのＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ ＩＩを用いた高電圧電気穿孔法（Ｔｒｅｖｏｒｓ ｅｔ ａｌ（１９９２）Ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ ｂｙ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ，ｉｎ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｆｕｓｉｏｎ（Ｄ．Ｃ．Ｃｈａｎｇ，Ｂ．Ｍ．Ｃｈａｓｓｙ，Ｊ．Ａ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ ａｎｄ Ａ．Ｅ．Ｓｏｗｅｒｓ，ｅｄｓ．），ｐｐ．２６５−２９０，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｈａｎａｈａｎ ｅｔ ａｌ（１９９１）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２０４，６３−１１３）によって形質転換した。形質転換した細胞はＳＯＣ培地（２％ トリプトン、０．５％ 酵母抽出物、１０ ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４、２０ｍＭ グルコース）に懸濁し、３７℃で１時間インキュベーションした後テトラサイクリン耐性を指標に選択した。高発現クローンを選択した。
【００８０】
実施例３．組み換え型ウリカーゼの調製
形質転換したものなど（上記参照）のバクテリアは、グルコースを含有する培地で培養した。約３７℃で、ｐＨは７．２±０．２に保った。
【００８１】
培養の終期５−６時間にかけて培地にＫＣｌを、最終濃度が０．３Ｍとなるように加えた。ウリカーゼの蓄積を生じさせるため、培養を続けた。
【００８２】
組み換え型ウリカーゼはバクテリア細胞内で、封入体（ＩＢ）に類似した不溶性の沈殿物として蓄積した。細胞懸濁液を遠心処理で洗浄し、ｐＨ８．０の５０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファーおよび１０ｍＭ ＥＤＴＡに懸濁し、最終体積を乾燥菌体重量の約４０倍とした。
【００８３】
細胞をライソザイムと高圧力によって破壊した後、遠心処理によって組み換え型ウリカーゼを含有するＩＢを単離した。ライソザイム処理（２０００−３０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）はｐＨ８．０、７±３℃で１６−２０時間、混合しながら行った。ペレットを水で洗浄し、使用するまで−２０℃で保存した。
【００８４】
濃縮したＩＢは、ｐＨ１０．３±０．１の５０ｍＭ ＮａＨＣＯ３バッファーで懸濁後さらに処理した。懸濁液は一晩室温でインキュベーションし、ＩＢ由来のウリカーゼを可溶化させた後、遠心処理によって沈殿物を除いた。
【００８５】
ウリカーゼはさらに、複数のクロマトグラフィー工程によって精製した。最初のクロマトグラフィーはＱ−セファロースＦＦカラムを用いて行った。カラムにサンプルをロードした後、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する重炭酸バッファーで洗浄し、ウリカーゼの溶出は２５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する重炭酸バッファーによって行った。次に、キサンチン−アガロース樹脂（Ｓｉｇｍａ）によって少量の不純物をウリカーゼ調製物より除いた。Ｑ−セファロースＦＦ溶出物はｐＨ１０．３±０．１の５０ｍＭグリシンバッファーで希釈し、タンパク質最終濃度を約０．２５ｍｇ／ｍｌとしてロードした。カラムを１００ｍＭ ＮａＣｌを含有するｐＨ１０．３±０．１の重炭酸バッファーで洗浄し、同じバッファーに６０μＭキサンチンを加えたものでウリカーゼを溶出した。この段階で、ウリカーゼをＱ−セファロースクロマトグラフィーで再精製し、凝集したものを除いた。
【００８６】
それぞれのウリカーゼ調製物の純度を、サイズ排除クロマトグラフィーで測定したところ、９５％以上であった。それぞれの調製物でＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムを用いて行った分析では、凝集体は０．５％以下しか検出されなかった。
【００８７】
表３は２５リットルの発酵培地から得たＩＢ由来のＰｉｇ−ＫＳΔＮウリカーゼの精製をまとめたものである。
表３．Ｐｉｇ−ＫＳΔＮウリカーゼの精製
【表３】
【００８８】
実施例 ４． 組み換え型ウリカーゼの性質
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
高度に精製された変異型ウリカーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図４）では、かなり特徴的なパターンが現れた。サンプルはｐＨ１０．３の炭酸バッファーに、４℃で最高数ヶ月保存した。ブタ、ブタ−ＫＳならびにＰＢＣの、全長変異型タンパク質では、分子量が２０および１５ｋＤの顕著な分解産物の蓄積が見られた。これは、少なくとも１つのニックがウリカーゼサブユニット分子を開裂していることを示唆している。アミノ末端を短くしたクローンならびにウサギウリカーゼでは、これと異なった分解パターンが検出されたが、割合は小さかった。ウサギウリカーゼのアミノ末端は、短くしたクローンに類似している。精製並びに保管の過程で生じたウリカーゼ断片のアミノ末端配列を決定した。
【００８９】
ペプチドシーケンシング
原体ウリカーゼ調製物のＮ末端を、エドマン分解法でシーケンシングした。サイクル数は１０であった。組み換え型ブタウリカーゼ（全長クローン）はＰｉｇ−ＫＳ−ΔＮよりも多くの分解断片を産した。分解断片を生じる切断部位の予想位置は以下の通りである：
１）下記の配列を有する、１６８番目の位置の、メジャーサイト：
−−ＱＳＧ ↓ ＦＥＧＦＩ−−
２） 下記の配列を有する、１４２番目の位置の、マイナーサイト：
−−ＩＲＮ ↓ ＧＰＰＶＩ−−
【００９０】
上記の配列は、既知のいかなるタンパク質分解性開裂も示唆しない。しかしながら、開裂はタンパク質分解またはなんらかの化学反応によって生じうる。アミノ末端切断型ウリカーゼは非アミノ末端切断型ウリカーゼに比べて驚くほど安定性が高い。ＰＢＣ−ΔＮＣも、他のΔＮ分子と類似した、非アミノ切断型ＰＢＣよりも少ない安定性を有していた。
【００９１】
効力
ウリカーゼ活性の測定はＵＶ法によって行った。酵素反応速度は、尿酸のアラントインへの酸化による、２９２ｎｍ吸光度の減少を測定することによって求めた。１活性単位は、２５℃、１分間で、示した特定の条件下で１μモルの尿酸を酸化するのに必要なウリカーゼの量と定義される。ウリカーゼの効力は、タンパク質１ｍｇあたりの活性単位として表される（Ｕ／ｍｇ）。
【００９２】
２９２ｎｍにおける１ｍＭ尿酸の消衰係数は１２．２ｍＭ−１ｃｍ−１である。ゆえに、反応溶液１ｍｌあたりの、尿酸１μモルの酸化は、１２．２ｍＡ２９２の吸光度の減少となる。経時的な吸光度の変化（毎分ΔＡ２９２）は、曲線の直線部より得た。
【００９３】
タンパク質濃度は、改変ブラッドフォード法によって求めた（ＭａｃａｒｔａｎｄＧｅｒｂａｕｔ（１９８２） Ｃｌｉｎ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ １２２：９３−１０１）。ウリカーゼの比活性度（効力）は、Ｕ／ｍｌで表される活性を、ｍｇ／ｍｌで表されるタンパク質濃度で割ることによって計算した。様々な組み換え型ウリカーゼの酵素活性結果を、表４にまとめた。市販の調製物の結果も、参考値としてこの表に示した。結果からは、ウリカーゼタンパク質のトランケーションがその酵素活性に大きな影響を与えないことが明らかである。
表４． 組み換え型およびネィティブ型のウリカーゼの、速度パラメータのまとめ
【表４】
【００９４】
表４注釈：
（１） タンパク質濃度は、２７８ｎｍにおける吸光度から、１０ｍｇ／ｍｌウリカーゼ溶液に対して消衰係数として１１．３を用いて求めた（Ｍａｈｌｅｒ，１９６３）。
（２）１単位のウリカーゼ活性は、２５℃、１分間で１μモルの尿酸をアラントインに酸化するのに必要な酵素の量と定義される。
（３）比活性度は、６０μＭに等しい基質濃度の下で行ったラインウィーバーバークプロットによって求めた。
（４）反応混合物は、以下のストック溶液を様々な組み合わせで混合して作成した。
ｐＨ９．２の１００ｍＭホウ酸ナトリウムバッファー
ｐＨ９．２の５０ｍＭホウ酸ナトリウムに溶解した３００μＭ尿酸
ｐＨ９．２の５０ｍＭホウ酸ナトリウムに溶解した１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ
（５）Ｋｃａｔは、Ｖｍａｘ（対応するラインウィーバーバークプロットから算出）を反応溶液のウリカーゼ濃度（リカーゼの四量体の分子量に基づいてモル量として表現したもの）で割ることで求めた。
【００９５】
実施例５．ウリカーゼとｍ−ＰＥＧの結合（ＰＥＧ化）
Ｐｉｇ−ＫＳ−ΔＮウリカーゼは、ｍ−ＰＥＧ−ＮＰＣ（モノメトキシ−ポリ（エチレングリコール）−ニトロフェニルカーボネート）と結合体を形成させた。１ウリカーゼサブユニットあたり５、１０または２０ｋＤのＰＥＧ鎖２から１２本が結合する条件を確立した。ｍ−ＰＥＧ−ＮＰＣは、徐々にタンパク質溶液に加えた。ＰＥＧの添加が終わった後、ウリカーゼ／ｍ−ＰＥＧ−ＮＰＣ反応溶液を２から８℃で１６から１８時間、未結合のｍ−ＰＥＧ鎖が最大限ウリカーゼに結合するようインキュベーションした。
【００９６】
ＰＥＧ−ウリカーゼモノマー１つあたりのＰＥＧ鎖の数は、ＰＥＧおよびウリカーゼ標準試料を用いて、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって同定した。サブユニット１つあたりに結合したＰＥＧの数は、下記の式によって算出した：
【数１】
【００９７】
紫外線（ＵＶ）および屈折率（ＲＩ）検出器の配列（Ｋｕｎｉｔａｎｉ，ｅｔ ａｌ．，１９９１の開発による）を用いて、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によってＰＥＧ−ウリカーゼサンプルにおける、ＰＥＧ並びにタンパク質成分濃度を同定した。３つの較正曲線を作成した：タンパク質曲線（２２０ｎｍで測定した吸光度）、タンパク質曲線（ＲＩの測定による）、ＰＥＧ曲線（ＲＩの測定による）。次に、ＰＥＧ−ウリカーゼサンプルを同様のシステムで測定した。得られた試験サンプルのＵＶならびにＲＩピークエリア値を、較正曲線に対するＰＥＧならびにタンパク質の濃度を計算するのに用いた。３．４２は、１０ｋＤ ＰＥＧに対するウリカーゼ分子モノマーの分子量（３４，１９２ダルトン）の比である。
【００９８】
結合させたＰＥＧは、生理的ｐＨの溶液においてウリカーゼの可溶性を向上させた。表５はＰＥＧ化Ｐｉｇ−ＫＳ−ΔＮウリカーゼ産生物のバッチ間のばらつきを示したものである。一般に、結合したＰＥＧ鎖数と酵素が保持する比活性度（ＳＡ）との間には、反比例の関係がある。
表５．ＰＥＧ化Ｐｉｇ−ＫＳ−ΔＮウリカーゼ結合体の酵素活性
【表５】
【００９９】
実施例６．１０００Ｄならびに１００，０００ＤのＰＥＧによるウリカーゼのＰＥＧ化
Ｐｉｇ−ＫＳ−ΔＮウリカーゼを、実施例５に記載の通りの方法で、１０００Ｄならびに１００，０００Ｄのｍ−ＰＥＧ−ＮＰＣを用いてＰＥＧ化した。１ウリカーゼサブユニットあたりＰＥＧ鎖２〜１１本が結合する条件を用いた。ＰＥＧの添加が終わった後、ウリカーゼ／ｍ−ＰＥＧ−ＮＰＣ反応溶液を２から８℃で１６から１８時間、未結合のｍ−ＰＥＧ鎖が最大限ウリカーゼに結合するようインキュベーションした。
【０１００】
ＰＥＧ−ウリカーゼモノマー１つあたりのＰＥＧ鎖数は、上記に記載の方法で求めた。
【０１０１】
結合させたＰＥＧは、生理的ｐＨの溶液においてウリカーゼの可溶性を向上させた。
【０１０２】
実施例７．ＰＥＧと結合させたＰｉｇ−ＫＳ−ΔＮウリカーゼの薬物動態
治療上の利益を提供するために、ＰＥＧ化の最適な程度ならびにサイズを決定するために、生物学的な実験を行った。
【０１０３】
ラットで、体重１ｋｇあたり０．４ｍｇ（２Ｕ）の改変されていないウリカーゼを、１日目ならびに８日目に静脈投与して行った薬物動態試験では、循環系半減期が約１０分であるとの結果が得られた。しかしながら、ラットで２−１１ｘ１０ｋＤのＰＥＧ−Ｐｉｇ−ＫＳ−ΔＮウリカーゼを、週１回、９回に渡って注射してクリアランス速度を調べた試験では、クリアランスはＰＥＧ鎖の数に（この範囲においては）依存していないことが示唆され、試験期間を通じて比較的同じ値に保たれた（表６参照、半減期が約３０時間）。各週間の違いは誤差の範囲内である。１０ｘ５ｋＤ ＰＥＧならびに１０ｘ２０ｋＤ ＰＥＧ−ウリカーゼ結合体の９回の注射後でも、同様のパターンが観察された。結果は、この範囲においては、ウリカーゼのＰＥＧ化の程度にかかわらず、ラットモデルにおいて類似した生理的影響が観察されたことを示している。
表６．ＰＥＧ化Ｐｉｇ−ＫＳ−ΔＮウリカーゼ調製物の、ラットにおける半減期
【表６】
【０１０４】
表６注釈： 結果は時間±標準誤差で示している。括弧で示した数字は試験した実験動物個体数を示している。
【０１０５】
ラットに、１週間に１回、体重１ｋｇあたり０．４ｍｇの、表に示したとおりの改変を施したＰｉｇ−ＫＳ−ΔＮウリカーゼを静脈投与した。それぞれの個体群は元々１５個体のラットから成っており、５個体のサブグループで交互に採血した。ラット数例が、麻酔によって実験中に死亡した。半減期は、注射５分後、および６、２４、４８時間後に採取した血漿サンプルのウリカーゼ活性（比色測定）を測定することによって同定した。
【０１０６】
表５に、実験に用いられたＰＥＧ化ウリカーゼを記載している。
【０１０７】
６ｘ５ｋＤ ＰＥＧ−Ｐｉｇ−ＫＳ−ΔＮウリカーゼを用いた、ウサギでの生物学的利用率試験によると、最初の注射後では、循環系半減期は９８．２±１．８時間（ｉ．ｖ．）であり、筋肉投与（ｉ．ｍ．）ならびに皮下投与（ｓ．ｃ．）では、それぞれ７１％、５２％であった。しかしながら、２回目のｉ．ｍ．ならびにｓ．ｃ．注射の後、全てのウサギで相当量の抗ウリカーゼ抗体タイターが検出され、以降の注射でクリアランスが促進された。ラットに同じ結合体を注射した実験では、２６±１．６時間の半減期（ｉ．ｖ．）が得られ、生物学的利用率はｉ．ｍ．ならびにｓ．ｃ．注射についてそれぞれ３３％、２２％であった。
【０１０８】
９ｘ１０ｋＤ ＰＥＧ−Ｐｉｇ−ＫＳ−ΔＮウリカーゼを用いたラットでの試験では、１回目の注射後の循環系半減期が４２．４時間（ｉ．ｖ．）であり、ｉ．ｍ．ならびにｓ．ｃ．注射後の生物学的利用率はそれぞれ２８．９％、１４．５％だった。（図５ならびに表７参照）。４回目の注射後では、循環系半減期は３２．１±２．４時間であり、ｉ．ｍ．ならびにｓ．ｃ．注射後の生物学的利用率はそれぞれ２６．１％、１４．９％だった。
【０１０９】
９ｘ１０ｋＤ ＰＥＧ−Ｐｉｇ−ＫＳ−ΔＮウリカーゼを用いた、ウサギでの同様の薬物動態試験では、この結合体の注射に引き続くクリアランスの促進は観察されなかった（隔週で４回注射として投与した）。これらの個体では、最初の注射後の循環系半減期は８８．５時間（ｉ．ｖ．）であり、ｉ．ｍ．ならびにｓ．ｃ．注射後の生物学的利用率はそれぞれ９８．３％、８４．４％であった。（図６ならびに表７参照）。４回目の注射後の循環系半減期は１４１．１±１５．４時間であり、ｉ．ｍ．ならびにｓ．ｃ．注射後の生物学的利用率はそれぞれ８５％、８３％であった。
【０１１０】
９ｘ１０ｋ ＤＰＥＧ−Ｐｉｇ−ＫＳ−ΔＮを用いた同様の試験によって、ビーグル犬における生物学的利用率を測定した（それぞれの群にオス２個体、雌２個体）。１回目のｉ．ｖ．注射後で、７０±１１．７時間の循環系半減期が記録され、ｉ．ｍ．ならびにｓ．ｃ．注射後の生物学的利用率はそれぞれ６９．５％、５０．４％だった（図６ならびに表７参照）。
【０１１１】
９ｘ１０ｋＤ ＰＥＧ−Ｐｉｇ−ＫＳ−ΔＮ調製物を用いて、ブタで試験を行った。１つの群あたり３個体にｉ．ｖ．、ｓ．ｃ．ならびにｉ．ｍ．ルートによる投与を行った。１回目のｉ．ｖ．注射後で、１７８±２４時間の循環系半減期が記録され、ｉ．ｍ．ならびにｓ．ｃ．注射後の生物学的利用率はそれぞれ７１．６％、７６．８％であった（図８ならびに表７参照）。
表７．９ｘ１０ｋＤＰＥＧ−Ｐｉｇ−ＫＳ−ΔＮウリカーゼを用いた薬物
【表７】
【０１１２】
９ｘ１０ｋＤ ＰＥＧ−Ｐｉｇ−ＫＳ−ΔＮウリカーゼの、ボルトン＆ハンター法による、１２５Ｉでのヨウ素化に引き続いて、吸収、分布、代謝、排泄（ＡＤＭＥ）試験を実施した。ラベルした結合体を、それぞれ４個体のラット（雄２個体と雌２個体）からなる７群に注射した。放射線の分布を、１時間後ならびに、７日間にわたって２４時間毎に（５日目を除く）測定した。それぞれの群を順番に屠殺し、異なる臓器を摘出して分析した。７番目の群は代謝ケージで飼育し、尿と便を回収した。物質の、動物体内における分布は、それぞれの臓器の総放射活性ならびに、ＴＣＡによる沈殿が可能なカウント（腎臓、肝臓、肺、脾臓）のフラクション（すなわち、臓器のサイズで標準化した結合したタンパク質）を測定することによって評価した。摘出した臓器で、他の臓器よりも比放射能が高いものはなかった。すなわち、例えば肝臓または腎臓における特筆すべき蓄積は見られなかった。放射活性の７０％が、７日目までに排出された。
【０１１３】
実施例８．治験結果
従来の治療法に不応答性または不耐性の、ヒト高尿酸血症または重篤な痛風に罹患している患者における、ＰＥＧ−ウリカーゼ（Ｐｕｒｉｃａｓｅ（登録商標），Ｓａｖｉｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）の尿酸応答ならびに、薬物動態的および安全性プロフィールを評価するために無作為化非盲検多施設並行群間試を実施した。平均罹患期間は１４年で、被験者集団の７０％が１つまたはそれ以上の痛風結節を有していた。
【０１１４】
治験では、４１例の患者（平均年齢５８．１歳）を無作為に、次に示す４つの１２週間にわたる、静脈投与によるＰＥＧ−ウリカーゼ治療投与量計画に振り分けた：２週間毎に１回４ｍｇ（７例）、２週間毎に１回８ｍｇ（８例）、４週間毎に１回８ｍｇ（１３例）、４週間毎に１回１２ｍｇ（１３例）。血漿ウリカーゼ活性ならびに尿酸レベルを定められた時間間隔で測定した。薬物動態学的パラメータ、平均血漿尿酸濃度および血漿尿酸レベルが６ｍｇ／ｄＬ以下であった時間の百分率を、ウリカーゼ活性並びに尿酸レベルの分析によって求めた。
【０１１５】
ＰＥＧ−ウリカーゼを２週間毎に１回８ｍｇ投与した群で、最も大きなＰＵＡの低減が見られ、治療期間の９２％で６ｍｇ／ｄＬ未満のレベルであった。（１２週間で、平均血漿尿酸濃度が治療前の９．１ｍｇ／ｄＬに対して、治療後は１．４ｍｇ／ｄＬ）。
【０１１６】
他の投与量を用いたＰＥＧ−ウリカーゼ治療群でも、顕著で持続的な低い血漿尿酸レベルが観察された：４週間毎に１回８ｍｇを投与した群で、ＰＵＡレベルが６ｍｇ／ｍｌ未満である期間が治療期間の８６％（１２週間で、平均血漿尿酸濃度が治療前の９．１ｍｇ／ｄＬに対して、治療後は２．６ｍｇ／ｄＬ）、４週間毎に１回１２ｍｇを投与した群で、ＰＵＡレベルが６ｍｇ／ｍｌ未満である期間が治療期間の８４％（１２週間で、平均血漿尿酸濃度が治療前の８．５ｍｇ／ｄＬに対して、治療後は２．６ｍｇ／ｄＬ）、２週間毎に１回４ｍｇを投与した群で、ＰＵＡレベルが６ｍｇ／ｍｌ未満である期間が治療期間の７３％（１２週間で、平均血漿尿酸濃度が治療前の７．６ｍｇ／ｄＬに対して、治療後は４．２ｍｇ／ｄＬ）。
【０１１７】
最初のＰＥＧ−ウリカーゼ投与から２４時間以内での、血漿中尿酸の基線レベルからの減少割合の最大値は４ｍｇ／２週間の群で７２％（ｐ＝．０００２）、８ｍｇ／２週間の群で９４％（ｐ＜．０００１）、８ｍｇ／４週間の群で８７％（ｐ＜．０００１）、１２ｍｇ／４週間の群で９３％（ｐ＜．０００１）であった。
【０１１８】
１２週間の治療期間における血漿中尿酸の基線レベルからの減少割合は４ｍｇ／２週間の群で３８％（ｐ＝．０００２）、８ｍｇ／２週間の群で８６％（ｐ＜．０００１）、８ｍｇ／４週間の群で５８％（ｐ＜．０００３）、１２ｍｇ／４週間の群で６７％（ｐ＜．０００１）であった。
【０１１９】
驚くべき事に、ＰＥＧ−ウリカーゼの投与を受けた患者の一部で注入に関連した有害事象、例えば注入反応が出現した。この反応はすべての注入のうち１４％で出現した。
【０１２０】
本出願に引用される全ての文献を、各個々の刊行物、特許または特許出願を具体的かつ個々に、参照することによって援用すると示したのと同程度に、全ての目的のためにその全文を参照することによって本明細書に含める。
【０１２１】
当該分野に精通する者に理解されるように、本発明にあっては、その思想および範囲から逸脱することなく、様々な変更ならびに形態様が可能である。ここに記載された具体的な実施例は単に例を示すのみであって、本発明は添付した特許請求項、ならびに、このような請求に権利が与えられるあらゆる等価例によってのみ制限されるものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７の位置８から位置２８７のアミノ酸配列を含む単離されたウリカーゼ、ここでアミノ酸番号は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１のアミノ酸配列を有する全長ブタウリカーゼに対応している。
【請求項２】
アミノ末端アミノ酸を有し、該アミノ末端アミノ酸がアラニン、グリシン、プロリン、セリン、またはトレオニンである請求項１に記載のウリカーゼ。
【請求項３】
アミノ末端アミノ酸を有し、アミノ末端アミノ酸がメチオニンである請求項１に記載のウリカーゼ。
【請求項４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２の位置８から位置２８７のアミノ酸配列を含む単離されたウリカーゼ、ここでアミノ酸番号は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１のアミノ酸配列を有する全長ブタウリカーゼに対応している。
【請求項５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３のアミノ酸配列を含む請求項４に記載のウリカーゼ。
【請求項６】
アミノ末端アミノ酸を有し、該アミノ末端アミノ酸がアラニン、グリシン、プロリン、セリン、またはトレオニンである請求項４に記載のウリカーゼ。
【請求項７】
アミノ末端アミノ酸を有し、アミノ末端アミノ酸がメチオニンである請求項５に記載のウリカーゼ。
【請求項８】
ウリカーゼがＰＥＧ化されたウリカーゼである、請求項１記載のウリカーゼ。
【請求項９】
請求項１記載のウリカーゼ、請求項２記載のウリカーゼ、請求項３記載のウリカーゼ、請求項５記載のウリカーゼ、および請求項６記載のウリカーゼからなる群から選択されたウリカーゼをコードする核酸配列を含む、単離された核酸。
【請求項１０】
核酸配列が動作可能な形で異種性プロモータに結合されている、請求項９記載の単離された核酸。
【請求項１１】
プロモータがｏｓｍＢプロモータである、請求項９に記載の核酸。
【請求項１２】
請求項１０に記載の核酸を含む、核酸ベクター。
【請求項１３】
請求項１２に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１３記載の宿主細胞を、宿主細胞により当該核酸配列が発現される条件下で培養し、発現されたウリカーゼを単離する工程を含む、ウリカーゼを生成するための方法。
【請求項１５】
請求項１から７のいずれか１項記載のウリカーゼを含む、医薬組成物。
【請求項１６】
請求項８記載のＰＥＧ化されたウリカーゼを含む、医薬組成物。
【請求項１７】
反復投与に適している、請求項１５記載の医薬組成物。
【請求項１８】
反復投与に適している、請求項１６記載の医薬組成物。
【請求項１９】
必要とされる対象の体液中の尿酸レベルを低下させる医薬組成物の製造のための、請求項１から７のいずれか１項に記載されたウリカーゼの使用。
【請求項２０】
必要とされる対象の体液中の尿酸レベルを低下させる医薬組成物の製造のための、請求項８に記載されたウリカーゼの使用。
【請求項２１】
該体液が血液である、請求項１９記載の使用。
【請求項２２】
該体液が血液である、請求項２０記載の使用。
【請求項１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７の位置８から位置２８７のアミノ酸配列を含む単離されたウリカーゼ、ここでアミノ酸番号は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１のアミノ酸配列を有する全長ブタウリカーゼに対応している。
【請求項２】
アミノ末端アミノ酸を有し、該アミノ末端アミノ酸がアラニン、グリシン、プロリン、セリン、またはトレオニンである請求項１に記載のウリカーゼ。
【請求項３】
アミノ末端アミノ酸を有し、アミノ末端アミノ酸がメチオニンである請求項１に記載のウリカーゼ。
【請求項４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２の位置８から位置２８７のアミノ酸配列を含む単離されたウリカーゼ、ここでアミノ酸番号は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１のアミノ酸配列を有する全長ブタウリカーゼに対応している。
【請求項５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３のアミノ酸配列を含む請求項４に記載のウリカーゼ。
【請求項６】
アミノ末端アミノ酸を有し、該アミノ末端アミノ酸がアラニン、グリシン、プロリン、セリン、またはトレオニンである請求項４に記載のウリカーゼ。
【請求項７】
アミノ末端アミノ酸を有し、アミノ末端アミノ酸がメチオニンである請求項５に記載のウリカーゼ。
【請求項８】
ウリカーゼがＰＥＧ化されたウリカーゼである、請求項１記載のウリカーゼ。
【請求項９】
請求項１記載のウリカーゼ、請求項２記載のウリカーゼ、請求項３記載のウリカーゼ、請求項５記載のウリカーゼ、および請求項６記載のウリカーゼからなる群から選択されたウリカーゼをコードする核酸配列を含む、単離された核酸。
【請求項１０】
核酸配列が動作可能な形で異種性プロモータに結合されている、請求項９記載の単離された核酸。
【請求項１１】
プロモータがｏｓｍＢプロモータである、請求項９に記載の核酸。
【請求項１２】
請求項１０に記載の核酸を含む、核酸ベクター。
【請求項１３】
請求項１２に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１３記載の宿主細胞を、宿主細胞により当該核酸配列が発現される条件下で培養し、発現されたウリカーゼを単離する工程を含む、ウリカーゼを生成するための方法。
【請求項１５】
請求項１から７のいずれか１項記載のウリカーゼを含む、医薬組成物。
【請求項１６】
請求項８記載のＰＥＧ化されたウリカーゼを含む、医薬組成物。
【請求項１７】
反復投与に適している、請求項１５記載の医薬組成物。
【請求項１８】
反復投与に適している、請求項１６記載の医薬組成物。
【請求項１９】
必要とされる対象の体液中の尿酸レベルを低下させる医薬組成物の製造のための、請求項１から７のいずれか１項に記載されたウリカーゼの使用。
【請求項２０】
必要とされる対象の体液中の尿酸レベルを低下させる医薬組成物の製造のための、請求項８に記載されたウリカーゼの使用。
【請求項２１】
該体液が血液である、請求項１９記載の使用。
【請求項２２】
該体液が血液である、請求項２０記載の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１３−９０６３６（Ｐ２０１３−９０６３６Ａ）
【公開日】平成２５年５月１６日（２０１３．５．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１３−９９６０（Ｐ２０１３−９９６０）
【出願日】平成２５年１月２３日（２０１３．１．２３）
【分割の表示】特願２００８−５０５６５６（Ｐ２００８−５０５６５６）の分割
【原出願日】平成１８年４月１１日（２００６．４．１１）
【出願人】（５０７３３４６７９）サビエント ファーマセウティカルズ インク． (4)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年５月１６日（２０１３．５．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２５年１月２３日（２０１３．１．２３）
【分割の表示】特願２００８−５０５６５６（Ｐ２００８−５０５６５６）の分割
【原出願日】平成１８年４月１１日（２００６．４．１１）
【出願人】（５０７３３４６７９）サビエント ファーマセウティカルズ インク． (4)
【Ｆターム（参考）】
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