外来性分子の一過性の発現もしくは安定な発現のための発現カセットおよび発現ベクター
【課題】外来蛋白質の一過性もしくは安定な発現のために有用な、発現カセットおよび発現ベクターを提供する。
【解決手段】外来蛋白質をコードするポリヌクレオチド発現のための、プロモーター／エンハンサー、介在領域およびポリアデニル化シグナルドメインを含む発現カセット、および該カセットを含むベクター。１つの実施形態において、ヒトＣＭＶ最初期１（ｈＣＭＶ ＩＥ１）プロモーター／エンハンサー領域、目的のポリヌクレオチド、および改変体ヒト成長ホルモン（ｈＧＨｖ）ポリＡシグナルドメインもしくはその改変体を含む発現カセット。
【解決手段】外来蛋白質をコードするポリヌクレオチド発現のための、プロモーター／エンハンサー、介在領域およびポリアデニル化シグナルドメインを含む発現カセット、および該カセットを含むベクター。１つの実施形態において、ヒトＣＭＶ最初期１（ｈＣＭＶ ＩＥ１）プロモーター／エンハンサー領域、目的のポリヌクレオチド、および改変体ヒト成長ホルモン（ｈＧＨｖ）ポリＡシグナルドメインもしくはその改変体を含む発現カセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、発現ベクターおよび発現カセットに関し、より具体的には、生物における外来性分子の発現のための方法、組成物および系に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
核酸分子、ポリペプチド、ペプチドおよび低分子の、標的細胞および標的分子への導入は、治療用の送達系およびインビトロでの治療用分子の産生の両方において使用される。このアプローチの適用性は、宿主細胞、ならびに、細胞の分裂、分化および発現機構の分子生物学のさらなる理解と共に増加している。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
（要旨）
ＣＭＶプロモーターにより駆動され、改変体ヒト成長ホルモン（ｈＧＨｖ）遺伝子に由来するポリＡドメインにより終結される転写は、このようなエレメントのうちの一方もしくはもう一方、または両方を欠く他の発現ベクターよりも効率が高いことが発見された。従って、本発明は、目的のポリヌクレオチドの発現において有用な発現カセットおよび発現ベクターを提供する。本発明の発現カセットは、効率的な転写、効率的な転写終結および転写産物の増加したｍＲＮＡ安定性を提供する、調節性エレメントの組み合わせを含む。１つの実施形態において、発現カセットは、ヒトサイトメガロウイルスのプロモーター／エンハンサー、目的のクローニング部位またはポリヌクレオチド、およびｈＧＨｖポリアデニル化シグナルドメインを含む。必要に応じて、可変長介在配列が存在し得る。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
発現カセットであって、以下：
ヒトＣＭＶ最初期１（ｈＣＭＶ ＩＥ１）プロモーター／エンハンサー領域；
目的のポリヌクレオチド；および
改変体ヒト成長ホルモン（ｈＧＨｖ）ポリＡシグナルドメインまたはその改変体
を含み、該ｈＧＨｖポリＡシグナルは、少なくとも１００ヌクレオチド長であり、かつ配列ＡＡＴＡＡＡを含み、そして、該ポリＡ改変体は、ｈＧＨポリＡシグナルドメインと少なくとも９２％同一である、発現カセット。
（項目２）
前記ヒトＣＭＶ ＩＥ１プロモーター／エンハンサー領域が、配列番号１の約ｘ１〜約ｘ２に示されるような配列を含み、ここでｘ１が配列番号１の約１〜２０の間のヌクレオチドを示し、そして、ｘ２が配列番号１の約７１５〜７２０の間のヌクレオチドを示す、項目１に記載の発現カセット。
（項目３）
スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位を含む可変長介在配列（ＶＬＩＶＳ）をさらに含む、項目１に記載の発現カセット。
（項目４）
前記ＶＬＩＶＳが、ｈＣＭＶ ＩＥ１遺伝子のイントロンＡを含む、項目３に記載の発現カセット。
（項目５）
前記ＶＬＩＶＳが、前記イントロンＡの前記スプライスアクセプターとスプライスドナーとの間に欠失を有するｈＣＭＶ ＩＥ１遺伝子のイントロンＡを含む、項目３に記載の発現カセット。
（項目６）
前記ＶＬＩＶＳが、配列番号１の約ｘ３〜ｘ４の配列を含み、ここで、ｘ３が配列番号１の約７１５〜７２０の間のヌクレオチドを示し、そして、ｘ４が配列番号１の約１２３６〜１２５４の間のヌクレオチドを示す、項目５に記載の発現カセット。
（項目７）
前記目的のポリヌクレオチドが治療剤をコードする、項目１に記載の発現カセット。
（項目８）
前記ポリＡシグナルドメインが、配列番号１９の少なくとも１００の連続するヌクレオチドを含む、項目１に記載の発現カセット。
（項目９）
前記ポリＡシグナルドメインが、配列番号１９を含む、項目８に記載の発現カセット。
（項目１０）
ＤＨＦＲ遺伝子をさらに含む、項目１に記載の発現カセット。
（項目１１）
項目１〜１０のいずれか１項に記載の発現カセットを含む、発現ベクター。
（項目１２）
項目１１の発現ベクターを含む、宿主細胞。
（項目１３）
項目１〜１０のいずれか１項に記載の発現カセットを含む、宿主細胞。
【０００４】
本発明は、ヒトＣＭＶ最初期１（ｈＣＭＶ ＩＥ１）プロモーター／エンハンサー領域、目的のポリヌクレオチド、および改変体ヒト成長ホルモン（ｈＧＨｖ）ポリＡシグナルドメインもしくはその改変体を含む発現カセットを提供する。ポリＡシグナル改変体は、少なくとも１００ヌクレオチド長であり、かつ、配列ＡＡＴＡＡＡを含み、そして、ｈＧＨポリＡシグナルドメインと少なくとも９２％同一である。
【０００５】
本発明はさらに、本発明の発現カセット、および本発明の発現カセットもしくは発現ベクターを含む宿主細胞を含む発現ベクターを提供する。
【０００６】
本発明はさらに、ヒトＣＭＶ最初期１（ｈＣＭＶ ＩＥ１）プロモーター／エンハンサー領域、スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位を含む可変長介在配列（ＶＬＩＶＳ）、目的のポリヌクレオチド、および改変体ヒト成長ホルモン（ｈＧＨｖ）ポリＡシグナルドメインまたはその改変体を含む発現カセットを提供する。ポリＡシグナルドメインまたはその改変体は、少なくとも１００ヌクレオチド長であり、かつ、配列ＡＡＴＡＡＡを含み、そしてｈＧＨｖポリＡシグナルドメインと少なくとも９２％同一である。
【０００７】
本発明はまた、ヒトＣＭＶ最初期１（ｈＣＭＶ ＩＥ１）プロモーター／エンハンサー領域、スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位を含む可変長介在配列（ＶＬＩＶＳ）、目的のポリヌクレオチド、クローニング部位、ｈＧＨポリアデニル化領域および選択マーカーを含む発現ベクターを提供する。本発明の１つの局面において、ｈＣＭＶ Ｅ１プロモーター／エンハンサー領域は、クローニング部位の上流（５’）であり、そしてｈＧＨポリアデニル化領域は、クローニング部位の下流（３’）である。
【０００８】
本発明はまた、インビボにおいて目的の因子を送達する方法を含む。この方法は、被験体に対して、発現カセットを含む組成物を送達する工程を包含し、この発現カセットは、ｈＣＭＶ ＩＥ１プロモーター／エンハンサー領域；スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位を含む可変長介在配列；目的の因子をコードするポリヌクレオチド；およびヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリＡシグナルドメインまたはその改変体を含む。
【０００９】
本発明はさらに、発現系を含む。この発現系は、本発明の発現カセットを用いてトランスフェクトまたは形質転換された宿主細胞を含み、この宿主細胞は、目的のポリヌクレオチドを発現するような条件下で培養され、そして目的の因子を回収する。
本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、添付の図面および以下の説明に示される。本発明の他の特徴、対象および利点は、明細書および図面、および添付の特許請求の範囲から明らかである。本明細書中に引用される全ての参考文献は、参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、ｐＶ１０ベクターのプラスミドマップである。サイトメガロウイルス最初期１（ＣＭＶ ＩＥ１）プロモーター／イントロン（ＩＶＳ）を、ＰＣＲにより作製し、ＨｉｎｄＩＩＩ部位およびＢａｍＨＩ部位にクローニングした。アンピシリン耐性遺伝子である、β−ラクタマーゼ（ｂｌａ）がまた示される。
【図２】図２は、ｐＶ４０のプラスミドマップである。サイトメガロウイルス最初期１（ＣＭＶ ＩＥ１）プロモーター、イントロン（ＩＶＳ）、長さ約６００塩基対のｈＧＨｖポリアデニル化シグナルドメイン（ポリＡ）、およびアンピシリン耐性遺伝子であるβ−ラクタマーゼ（ｂｌａ）が示される。
【図３】図３は、プラスミドｐＶ７０の模式図である。ＣＭＶ ＩＥ１プロモーター、欠失接合部、ならびにスプライスドナー（ＳＤ）部位およびスプライスアクセプター部位を含むＩＶＳ、ｈＧＨｖポリＡシグナルドメイン、ならびにｂｌａ遺伝子が示される。欠失接合部は、ＢｓｐＥ１’／’ＨｐａＩの平滑末端ライゲーションの結果を表す。
【図４】図４は、ｐＸＬＣ．１ベクターの作製の模式図である。ｐＸＬＣ．１ベクターは、発現ベクターｐＶ７０、および軽鎖コード配列を含むＰＣＲ産物を使用して構築した。ｐＶ７０をＢａｍＨＩで直線化し、ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩで消化し、そして、この２つを、一緒に連結して、ｐＸＬＣ．１ベクターを作製した。
【図５】図５は、ｐＸＬＣ．２ベクターの作製の模式図である。
【図６】図６は、ｐＶ６０ベクター、およびｐＸＨＣベクターの作製の模式図である。ｐＸＨＣベクターは、発現ベクターｐＶ６０、および重鎖コード配列の大部分（Ｎ末端の５２アミノ酸は含まれなかった）を含むＰＣＲ産物を使用して構築した。ｐＶ６０をＢａｍＨＩで直線化し、ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩで消化し、そして、この２つを一緒に連結した。
【図７】図７は、ｐＸＨＣ．１ベクターの模式図である。
【図８】図８は、ｐＸＨＣ．３ベクターの模式図である。
【図９】図９は、ｐＸＨＣ．３へのｄｈｆｒカセットの追加により得た、ｐＸＨＣ．５ベクターの模式図である。発現カセットの制御エレメントｔは、ｐＳＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｕ４７１２１）に由来し、そして、ＳＶ４０プロモーター／エンハンサー、人工イントロン、およびＳＶ４０後期ポリアデニル化配列を含む。
【図１０】図１０は、ベクターｐＶ８０の模式図である。サイトメガロウイルス最初期１（ＣＭＶ ＩＥ１）プロモーター／スプライスドナー（ＳＤ）部位およびスプライスアクセプター（ＳＡ）部位を含むイントロン（ＩＶＳ）フラグメント、ｈＧＨｖポリアデニル化シグナルドメイン（ポリＡ）、アンピシリン耐性遺伝子であるβ−ラクタマーゼ（ｂｌａ）、ＳＶ４０プロモーター／エンハンサー、人工イントロン、ならびにＳＶ４０後期ポリアデニル化配列が示される。
【図１１Ａ】図１１Ａおよび図１１Ｂは、ベクターｐＶ９０の模式図および対応する注釈つきの配列である。図１１Ａは、ベクターマップである。サイトメガロウイルス最初期１（ＣＭＶ ＩＥ１）プロモーター／スプライスドナー（ＳＤ）部位およびスプライスアクセプター（ＳＡ）部位を含むイントロン（ＩＶＳ）フラグメント、ｈＧＨｖポリアデニル化シグナルドメイン（ポリＡ）、アンピシリン耐性遺伝子であるβ−ラクタマーゼ（ｂｌａ）、ＳＶ４０プロモーター／エンハンサー、人工イントロン、ならびにＳＶ４０後期ポリアデニル化配列が示される。このベクターは、ｄｈｆｒ発現カセット内のＮｏｔＩ部位を欠く。
【図１１Ｂ−１】図１１Ａおよび図１１Ｂは、ベクターｐＶ９０の模式図および対応する注釈つきの配列である。図１１Ｂは、ｐＶ９０ベクターの注釈つきの配列である。図１１Ｂにおいて、配列番号１９のヌクレオチド１２７５〜１８６６は、約６００ヌクレオチド長のｈＧＨｖポリＡを表す。
【図１１Ｂ−２】図１１Ａおよび図１１Ｂは、ベクターｐＶ９０の模式図および対応する注釈つきの配列である。図１１Ｂは、ｐＶ９０ベクターの注釈つきの配列である。図１１Ｂにおいて、配列番号１９のヌクレオチド１２７５〜１８６６は、約６００ヌクレオチド長のｈＧＨｖポリＡを表す。
【図１２】図１２は、ｐＳＩ−ＤＨＦＲのベクターマップである。ＳＶ４０プロモーターがｄｈｆｒ遺伝子を駆動する。
【図１３】図１３は、トランスフェクトされたプールの相対特異的生産性を示すグラフである。３つのプールを、ｐＣＭＶ−ｈＧＨｖＰＡ−ＳＥＡＰおよびｐＳＥＡＰ２について、そして１つはｐＵＣ１８について分析した。
【図１４】図１４は、単離体の相対特異的生産性を示す一対のグラフである。各構築物からの上位２０の単離体が、ランク順に示される。
【図１５】図１５は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｋ００４７０（配列番号１８）の配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（詳細な説明）
本発明は、発現カセット、および発現カセットを含むベクターに関する。発現カセットは、真核生物宿主における転写を駆動し得る転写調節性領域、および転写終止領域を含む。本発明の発現カセットおよび発現ベクターは、強力な転写の開始および終止、ならびに、転写産物の増加したｍＲＮＡ安定性を提供する。
【００１２】
本発明は、プロモーターエレメント、および、必要に応じて、例えば、本明細書中もしくは米国特許第５，６５８，７５９号（その開示は、本明細書中に参考として援用される）のような参考文献に記載されるような、サイトメガロウイルスの任意の株に由来するエンハンサーエレメントを提供する。例えば、本発明の発現カセットにおいて有用な安定なＣＭＶ最初期プロモーター領域は、ＣＭＶが促進するβ−ガラクトシダーゼ発現ベクター、ＣＭＶ（ＭａｃＧｒｅｇｏｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：２３６５（１９８９））から得られ得る。
【００１３】
本明細書中でさらに議論されるように、ｈＧＨｖポリアデニル化シグナルドメインは、強力な転写終止シグナルを提供し、そして、ｍＲＮＡ転写物の安定性を増加させる。調節性／発現エレメントは、例えば、目的のポリヌクレオチドまたはクローニング部位（例えば、マルチクローニング部位）によってｈＧＨｖポリアデニル化シグナルドメインから分離され得る。
【００１４】
本発明の１つの局面において、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）転写調節性領域、可変長介在配列（例えば、ＣＭＶのイントロンＡに由来する）、目的のポリヌクレオチド、およびポリアデニル化シグナルドメインを含むポリヌクレオチドが提供される。本発明はさらに、宿主細胞から異種性のポリペプチドを産生および回収するためのプロセスおよび発現ベクターに関する。
【００１５】
別の局面において、本発明の発現カセットは、必要に応じて連結された、（ｉ）ＣＭＶ主要最初期１（ＩＥ１）プロモーター／エンハンサー領域および可変長介在配列（例えば、イントロンＡの誘導体）、（ｉｉ）目的のポリヌクレオチド、および（ｉｉｉ）ｈＧＨｖポリアデニル化シグナルドメインを含む。用語「必要に応じて連結された」とは、成分がその意図された様式（例えば、機能的に連結される）で機能することを可能にする関係にある、近位を指す。従って、例えば、目的のポリヌクレオチドに必要に応じて連結されたプロモーター／エンハンサーは、目的のポリヌクレオチドの発現が、プロモーター／エンハンサーからの発現の達成と適合する条件下で達成されるように、後者に連結される。
【００１６】
本発明の特定の実施形態において、発現カセットは、配列番号１の約ヌクレオチド１〜約ヌクレオチド１８６７に示される配列（例えば、約１〜１８６５、１８６６、１８６７、１８６８または１８６９）を含む。配列番号１のヌクレオチド１〜１８６７に示される発現カセットは、配列番号１の約ｘ１〜約ｘ２に示される配列を有するＣＭＶ ＩＥ１プロモーター／エンハンサーのような多数の別個のドメインを含み、ここで、ｘ１は、１〜２０のヌクレオチドであり、そしてｘ２は約７１５〜７２０のヌクレオチドである（例えば、配列番号１の約１〜７１９）。発現カセットの別のドメインは、スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位を含む可変長介在配列（ＶＬＩＶＳ）を含む。ＶＬＩＶＳは、少なくとも５０ｂｐ長（例えば、少なくとも１００ｂｐ長、１５０ｂｐ長、２００ｂｐ長または２５０ｂｐ長）であり得、かつ、当該分野で公知の任意の供給源に由来するスプライスドナーおよびスプライスアクセプターを含み得る。例えば、Ｖａｒａｎｉら、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｔｒｕｃｔ ２７：４０７−４５（１９９８）およびＫｏｎｉｎｇ，Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２１９：２５−４２（１９９４）を参照のこと。適切な介在ドメインは、任意の株のＣＭＶゲノムの全てのイントロンＡを含み得るか、または、スプライスアクセプター部位を含む３’配列に連結されたスプライスドナー部位を含む５’配列を含むより小さなフラグメントを含み得る。例えば、ＶＬＩＶＳは、配列番号１の約ｘ３〜約ｘ４のヌクレオチドを含み、ここで、ｘ３は、７１５〜７２０のヌクレオチドであり、そしてｘ４は１２３６〜１２５４のヌクレオチドである（例えば、配列番号１の７１９〜１２３６）。ＣＭＶ ＩＥ１プロモーター／エンハンサーに続く介在配列は、配列番号１に存在するものに由来する３１７ヌクレオチド程度のサイズで変化し得る。例えば、３１７ヌクレオチドは、ｐＶ４０およびｐＶ７０（例えば、それぞれ、図２および３を参照のこと）に示されるようなＩＶＳ配列から欠失された。従って、本発明の別の局面において、発現カセットは、配列番号１の１〜約１２５４のヌクレオチドに由来する配列（例えば、ＣＭＶ ＩＥ１プロモーター／エンハンサーおよび介在配列）を含む。マルチプルクローニング部位は、ＩＶＳ領域の後（すなわち下流）に存在し得る（例えば、配列番号１の１２５５〜１２７２のヌクレオチドは、ＢａｍＨＩ部位およびＮｏｔＩ部位を含む）。異なる制限部位またはさらなる制限部位は、当業者に公知の技術を用いて発現カセット中で遺伝子操作され得る。発現カセットはさらに、ポリＡドメインを含む。
【００１７】
ポリＡシグナルドメインは、ｈＧＨｖ遺伝子に由来し、例えば、対立遺伝子ごとに、その３’ＵＴＲ配列が変化し得る。ｈＧＨｖ遺伝子の片側の対立遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｋ００４７０（配列番号１８）に記載され、一方で、もう片側の配列は、図１１Ｂに配列番号１９として記載され、これは、配列番号１８のヌクレオチド２０３２〜２６２５に対応する（図１５を参照のこと）。ポリＡシグナルドメインの天然に存在しない改変体は、ポリヌクレオチド、細胞または生物体に適用される技術を含む変異誘発技術によってなされ得る。ｈＧＨｖ遺伝子に由来するポリＡ改変体は、野生型のｈＧＨｖポリＡシグナルドメインとは異なり、なお、シグナル転写終止に対する能力を保持し、そして／またはｍＲＮＡを安定化させる、ポリＡシグナルドメインを含む。例えば、ポリアデニル化シグナルドメインとしては、配列番号１８または１０に示されるようなｈＧＨｖポリアデニル化シグナルドメイン配列が挙げられ得る。分子生物学の当業者はまた、この配列が、約６００ヌクレオチド程度の長さである必要はないことを理解する。むしろ、少なくとも１００ｎｔ（例えば、少なくとも２００ｎｔ、３００ｎｔ、４００ｎｔ、５００ｎｔ、または６００ｎｔ）の連続したヌクレオチド配列を含み、ｈＧＨｖ遺伝子の基準のＡＡＴＡＡＡ部位を含む、任意のポリＡ配列ドメインが含まれる。さらに、本発明は、上記の配列から、８％まで異なる（例えば、配列番号１８もしくは１９、またはその別個のドメインと９２％の同一性を有する）配列を包含する。例えば、配列番号１のヌクレオチド１〜１８６７と９５％の同一性を有し、かつ配列ＡＡＴＡＡＡを含む１００ｎｔの長さのポリヌクレオチドは、転写を終結させる能力を保持する。
【００１８】
本発明の別の局面において、発現カセットを含むベクターが提供される。本明細書中で使用される場合、「ベクター」は、レシピエント細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌）への導入の際に、自律的な複製が可能な核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）である。プラスミド、ウイルスおよびバクテリオファージが、ベクターの例である。発現ベクターからの「発現」のプロセスは周知であり、細胞の酵素の使用、および目的のポリヌクレオチドからの発現産物を生じるプロセスを含む。発現ベクターは、宿主細胞内にクローニングされたポリヌクレオチドの発現を媒介し得るベクターであり、この宿主細胞は、ベクターの複製または増殖に使用されるのと同じ型の細胞であっても、そうでなくともよい。多くの哺乳動物発現ベクターは、一般的な細菌（レシピエント細胞）において増殖され得るが、哺乳動物細胞（宿主細胞）において目的のポリヌクレオチドを発現するが、細菌においては、発現しない。
【００１９】
本発明は、真核生物細胞（例えば、哺乳動物、および、最も具体的には、ヒト、マウス、サル、ウシ、ブタ、げっ歯類、またはヒツジの細胞）における、効率的なポリヌクレオチドの転写および翻訳を可能にし得る、ベクターの設計および使用に関する。本発明のベクターは、効率的な転写の終結とｍＲＮＡの安定性を提供する、ポリアデニル化シグナルドメインを含む上記に示されるような発現カセットを含む。
【００２０】
本発明のベクターは、以下を含む：目的のポリヌクレオチドを受容するためのクローニング部位；宿主細胞において、クローニング部位に挿入されたポリヌクレオチドの転写を可能にするのに十分な転写調節性エレメント（例えば、ＣＭＶ ＩＥ１プロモーター／エンハンサー領域）；宿主細胞において上記ポリヌクレオチドのＲＮＡ転写物の翻訳を可能するのに十分な翻訳エレメント、および（所望される場合）宿主細胞またはベクターの増殖に使用される別のレシピエント細胞において上記ベクターの複製を可能にするのに十分な複製エレメント。本発明のベクターは、このような宿主細胞における一過性の発現か、または安定な発現を調節し得る。
【００２１】
特定の実施形態において、本発明のベクターは、（１）配列番号１に示される配列；（２）配列番号１に示される配列に相補的な配列；（３）配列番号１またはその相補体に少なくとも８０％（好ましくは、少なくとも９０％；少なくとも９５％；少なくとも９８％または少なくとも９９％）同一な配列；または（４）配列番号１の約ヌクレオチド１〜約ヌクレオチド１８６７を含み、かつ目的のポリヌクレオチドおよび／または選択マーカーを含むベクター。
【００２２】
配列番号１を含むベクターは、多数の別個のドメインおよびコード領域を有する。例えば、配列番号１の約ｘ１〜約ｘ２に示される配列を有するＣＭＶ ＩＥ１プロモーター／エンハンサー領域（ここで、ｘ１は１〜２０のヌクレオチドであり、そしてｘ２は約７１５〜７２０のヌクレオチドである（例えば、配列番号１の約１〜７１９））が、ベクター中に存在する。本発明の発現ベクターの別のドメインは、スプライスドナーおよびスプライスアクセプターを含む可変長介在配列（ＶＬＩＶＳ）を含む。例えば、ＩＶＳは、配列番号１の約ｘ３〜約ｘ４のヌクレオチドを含み、ここで、ｘ３は７１５〜７２０のヌクレオチドを含み、そしてｘ４は１２３６〜１２５４のヌクレオチドを含む（例えば、配列番号１の約７１９〜約１２３６のヌクレオチド）。発現ベクターのマルチプルクローニング部位は、配列番号１の１２５５〜１２７２のヌクレオチド（例えば、ＢａｍＨＩ部位およびＮｏｔＩ部位）を含む。異なる制限部位または追加の制限部位が、当業者に公知の技術を使用して発現ベクター内で遺伝子操作され得る。発現ベクターはさらに、ポリＡシグナルドメインを含む。ポリＡシグナルドメインは、ｈＧＨｖポリＡシグナルドメインであるか、または、ｈＧＨポリＡシグナルドメインの他の改変体である。例えば、ポリＡシグナルドメインは、配列番号１９に示されるｈＧＨｖポリＡシグナルドメイン配列を含む。また、１つ以上の選択マーカーが、本発明のベクター中に存在する。例えば、配列番号１は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺伝子（例えば、配列番号１のヌクレオチド約２５６８〜ヌクレオチド約３１３２）を含む。本発明のベクターは、上に提供されるものに加えて、追加のプロモーター／エンハンサーエレメントおよび調節性エレメント（例えば、ポリアデニル化ドメイン）を含み得る。このような追加の調節性エレメントおよびポリアデニル化ドメインは、選択マーカーまたは目的のポリヌクレオチド（例えば、５’および３’に直ぐ近接して）に隣接し得る。例えば、配列番号１を含むベクターは、配列番号１のヌクレオチド約２５６８〜ヌクレオチド約３１３２のジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺伝子を含む。ｄｈｆｒ遺伝子は、ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーエレメントおよびＳＶ４０ポリアデニル化領域（例えば、それぞれ、配列番号１のヌクレオチド約１８６８〜ヌクレオチド約２２１０およびヌクレオチド約３１４４〜ヌクレオチド約３４４０）によって隣接される。
【００２３】
選択マーカーの特定の例は、メトトレキサートに対する耐性を与えるＤＨＦＲタンパク質（Ｗｉｇｌｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：３５６７（１９８０）；Ｏ’Ｈａｒｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８
１５２７（１９８１））；ミコフェノール酸に対する耐性を与えるＧＰＦタンパク質（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ＆ Ｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：２０７２（１９８１））；アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を与えるネオマイシン耐性マーカー（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１（１９８１））；ハイグロマイシンに対する耐性を与えるＨｙｇｒｏタンパク質（Ｓａｎｔｅｒｒｅら，Ｇｅｎｅ ３０：１４７（１９８４））；およびＺｅｏｃｉｎＴＭ耐性マーカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから市販されている）のような、細胞増殖抑止薬もしくは細胞傷害薬に対する耐性を与えるタンパク質をコードするものである。さらに、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら，Ｃｅｌｌ １１：２２３（１９７７））、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ ＆ Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
４８：２０２６（１９６２））およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら，Ｃｅｌｌ ２２：８１７（１９８０））が、それぞれｔｋ−細胞、ｈｇｐｒｔ−細胞、またはａｐｒｔ−細胞において使用され得る。他の選択マーカーは、ピューロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼまたはアデノシンデアミナーゼをコードする。
【００２４】
２つ以上の核酸分子の文脈において、用語「同一」または％「同一性」とは、比較アルゴリズムを使用するか、または手動での整列および視覚的な検査によって決定すると、比較ウィンドウにわたる、最大の一致について比較および整列した場合に、同じであるか、または、同じであるヌクレオチドの特定の割合を有する、２つ以上の配列もしくは下位配列を指す。この定義はまた、配列の相補体（例えば、配列番号１に示される配列の相補体、または発現カセットを含むそのフラグメント）も指す。例えば、発現カセットおよびそのフラグメントは、配列番号１の一部と少なくとも約８０％同一、約９０％同一および約９５％同一、約９７％同一、約９８％同一、または約９９％同一である、ヌクレオチド配列同一性を有するもの（例えば、配列番号１のヌクレオチド１〜７１９、１〜１２５４など）を含む。従って、配列が、配列番号１の全長配列またはそのドメインに対して必須の配列同一性を有する場合、この配列がまた、それぞれ、本発明の発現カセットまたはドメインとして機能し得る。
【００２５】
配列比較について、代表的には、１つの配列は、参照配列として機能し、この配列に対して、試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列がコンピュータに入力され、必要に応じて下位配列の座標が指定され、そして、配列アルゴリズムプログラムのパラメータが指定される。デフォルトのプログラムパラメータを使用しても、代替のパラメータを指定してもよい。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたか、またはデフォルトのプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の％配列同一性を算出する。本明細書中で使用される場合、「比較ウィンドウ」は、２５〜６００、通常は約５０〜約２００、より通常は約１００〜約１５０からなる群より選択される連続する位置の数のいずれか１つのセグメントに対する参照を含み、ここで、２つの配列が最適に整列された後に、１つの配列が、同じ数の連続する位置の参照配列に対して比較され得る。比較のための配列の整列方法は、当該分野で周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）による部分相同性アルゴリズムによってか、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）による相同性アラインメントアルゴリズムによってか、Ｐｅａｒｓｏｎ
＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似法についての検索によってか、３つのアルゴリズムのコンピュータ実行（ＧＡＰ、ＩＬＥＵＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によってか、または、手動の整列および視覚的な検査によって行なわれ得る。
【００２６】
％配列同一性（すなわち、実質的な類似性または同一性）を決定するために適切なアルゴリズムの１つの例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、これは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０に記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を行なうためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ワールドワイドウェブ上、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／にある）から公的に利用可能である。このアルゴリズムは、クエリー配列中の長さＷの短いワードを同定することによって、高いスコアの配列対（ＨＳＰ）をまず同定することを含み、これらのワードは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列する場合に、いくらかポジティブな値の閾値スコアＴと適合するか、これを満たすかのいずれかである。「Ｔ」は、隣接するワードスコア閾値として呼ばれる。これらの最初の隣接するワードヒットは、これらを含むより長いＨＳＰを見出すための検索を開始するための種として機能する。次いで、ワードヒットが連続するアラインメントスコアが増やされ得る距離にわたって、各配列に沿って両方向に延ばされる。連続スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメータＭ（適合した残基対に対する報酬スコア；常に＞０）およびＮ（適合しなかった残基に対する罰則スコア；常に＜０）を使用して計算される。各方向におけるワードヒットの延びは、以下の場合休止される：連続アラインメントスコアが、その最大達成値から量Ｘだけ落ちる場合；１つ以上のネガティブなスコア付けの残基アラインメントの蓄積に起因して連続スコアが０以下になる場合；または、いずれかの配列の末端に到達した場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。１つの実施形態において、核酸配列が本発明の範囲内であるかどうかを決定するために、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４および両方の鎖の比較を組み込んで、（ヌクレオチド配列のための）ＢＬＡＳＴＮプログラムが使用される。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムが、デフォルトパラメータとして、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）およびＢＬＯＳＵＭ６２スコア付けマトリクス（例えば、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５，１９８９を参照のこと）を使用する。
【００２７】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計学的解析を実施する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７，１９９３を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの指標は、最小サム確率（ｓｍａｌｌｅｓｔ ｓｕｍ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間での適合が偶然生じる可能性の指標を提供する。例えば、核酸は、試験核酸の参照核酸に対する比較における最小サム確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、そして最も好ましくは約０．００１未満である場合に、参照配列と類似するとみなされる。
【００２８】
配列番号１のヌクレオチド約１〜１８６７に示されるポリヌクレオチド配列またはそのフラグメントに特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドもまた本発明に含まれる。句「選択的に（または特異的に）ハイブリダイズする」とは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下での、特定の参照ポリヌクレオチドに対する分子の結合、二重化、またはハイブリダイゼーションを指す。句「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、プローブがその標的配列（代表的には、核酸の複合混合物中にある）に主にハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしない条件である。ストリンジェントな条件は、例えば、プローブの長さに依存して、配列依存性であり、かつ、環境ごとに異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範なガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ｐｒｏｂｅｓ，「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ
ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｓｓａｙｓ」（１９９３）において見出される。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨにおいて、特定の配列についての熱融点（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低く選択される。Ｔｍは、平衡状態で、（規定されたイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度下で）標的に対して相補的なプローブの５０％が、標的配列にハイブリダイズする（Ｔｍにおいて標的配列が過剰に存在する場合、平衡状態において、プローブの５０％が占有される）温度である。ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３において、塩濃度が、約１．０Ｍのナトリウムイオンより少なく（代表的には、約０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオン濃度）（または他の塩）、かつ、温度が、短いプローブ（例えば、１０〜約５０のヌクレオチド）については少なくとも約３０℃、そして長いプローブ（例えば、約５０より大きいヌクレオチド）については少なくとも６０℃である、条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような撹乱物質の添加により達成され得る。選択的または特異的なハイブリダイゼーションについて、ポジティブなシグナル（例えば、本発明の核酸の同定）は、バックグラウンドのハイブリダイゼーションの約２倍である。本発明の範囲内の実質的に同一な核酸を同定するために使用される「ストリンジェントな条件」は、長いプローブについて、４２℃と６５℃との間の温度において、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣおよび１％ ＳＤＳを含む緩衝液中でのハイブリダイゼーション、６５℃において、０．２×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳ中での洗浄を含む。しかし、当業者に明らかなように、ハイブリダイゼーション条件は、配列組成に依存して改変され得る。例示的な「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、３７℃における４０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌおよび１％ ＳＤＳの緩衝液中でのハイブリダイゼーション、および４５℃における１×ＳＳＣ中での洗浄を含む。ポジティブなハイブリダイゼーションは、バックグラウンドの少なくとも２倍である。当業者は、代替のハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件が、同様のストリンジェンシーの条件を提供するために利用され得ることを容易に理解する。従って、本発明の発現カセットは、高いストリンジェンシーの条件下で、配列番号１８または１９のヌクレオチド配列を含むｓｓＤＮＡにハイブリダイズするｈＧＨｖポリＡシグナルドメインを含み得る。
【００２９】
発現カセットは、裸の核酸構築物の形態で使用され得る。あるいは、発現カセットは、核酸ベクター（例えば、上記のような発現ベクター）の一部として導入され得る。このようなベクターとしては、プラスミドベクターおよびウイルスベクターが挙げられる。ベクターは、真核生物のゲノム配列（例えば、哺乳動物のゲノム配列またはウイルスのゲノム配列）と相同な配列を含む、発現カセットに隣接する配列を含み得る。これは、真核生物細胞またはウイルスのゲノムへのこの発現カセットの相同組換えによる導入を可能にする。例えば、ウイルス配列により隣接された発現カセットを含むプラスミドベクターは、脊椎動物（魚類、鳥類または哺乳動物を含む）の細胞にこの発現カセットを送達するために適切なウイルスベクターを調製するために使用され得る。用いられる技術は、当業者に周知である。
【００３０】
用語「目的のポリヌクレオチド」は、少なくとも転写され得る核酸分子を包含することが意図される。この分子は、プロモーターに関して、センス配向であってもアンチセンス配向であってもよい。アンチセンス構築物は、周知の技術に従って、細胞における遺伝子の発現を阻害するために使用され得る。目的のポリヌクレオチドは、異種性のポリヌクレオチドを含み得る。用語異種性のポリヌクレオチドは、任意の遺伝子を包含する。異種性のポリヌクレオチドは、代表的には、発現カセットもしくは発現ベクターにおいて、そのポリヌクレオチドが作動可能に連結されている調節性エレメントと比べて外来の種に由来するか、または、同じ起源に由来する場合、その本来の形態から改変された遺伝子である。従って、プロモーターに作動可能に連結された異種性のポリヌクレオチドは、そのプロモーターが由来する供給源とはことなる供給源に由来するか、または、同じ供給源に由来する場合は、その本来の形態から改変されたプロモーターである。異種性のポリヌクレオチドの改変は、例えば、ＤＮＡを制限酵素で処理して、プロモーターに作動可能に連結され得るＤＮＡフラグメントを作製することによって生じ得る。特定部位の突然変異誘発がまた、異種性のポリヌクレオチドを改変するのに有用である。異種性のポリヌクレオチドはまた、マーカー遺伝子（例えば、β−ガラクトシダーゼまたは緑色蛍光タンパク質をコードするもの）、または、その生成物が他の遺伝子の発現を調節する遺伝子を含み得る。従って、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｒＲＮＡのための鋳型として機能するポリヌクレオチドが、この定義の中に含まれる。異種性の遺伝子は、野生型遺伝子の任意の対立遺伝子変異体であっても、変異体遺伝子であってもよい。ｍＲＮＡは、天然に、またはその他の方法により、翻訳されたコード配列に付随する、転写されたが翻訳されてない、５’および／または５’の隣接領域のいくつかまたは全てを必要に応じて含む。
【００３１】
目的のポリヌクレオチドは、必要に応じてさらに、転写された分子に通常付随する、関連の転写制御エレメント（例えば、転写終止シグナル、ポリアデニル化ドメインおよび下流のエンハンサーエレメント）を含み得る。目的のポリヌクレオチドは、治療用生成物のための鋳型をコードし得るか、または鋳型として機能し得、治療用生成物は、例えば、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質またはリボ核酸であり得る。目的のポリヌクレオチドは、代表的には、酵素（例えば、β−ガラクトシダーゼ）；血液誘導体；ホルモン；サイトカイン；インターロイキン；インターフェロン；ＴＮＦ；増殖因子（例えば、ＩＧＦ−１）；可溶性レセプター分子（例えば、可溶性ＴＮＦレセプター分子）；神経伝達物質またはその前駆物質；栄養性因子（例えば、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＧＦ、ＩＧＦ、ＧＭＦ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＮＴ３およびＮＴ５）；アポリポタンパク質（例えば、ＡｐｏＡＩおよびＡｐｏＡＩＶ）；ジストロフィンまたはミニジストロフィン；腫瘍抑制タンパク質（例えば、ｐ５３、Ｒｂ、ＲａｐＩＡ、ＤＣＣおよびｋ−ｒｅｖ）；凝血関連因子（例えば、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子）；あるいは、天然もしくは人工の免疫グロブリンの全てもしくは一部（例えば、ＦａｂおよびＳｃＦｖ、または、クローニングされたＩｇＧの軽鎖および重鎖）のようなポリペプチド生成物をコードするＤＮＡ配列（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）である。
【００３２】
目的のポリヌクレオチドはまた、アンチセンス分子の作製のための鋳型を含み得、標的細胞におけるこの転写物が、遺伝子発現または細胞内ｍＲＮＡの転写を制御し得る。このような分子は、例えば、標的細胞において、細胞のｍＲＮＡに相補的なＲＮＡに、転写され、当該分野で公知の技術に従って、そのタンパク質への翻訳をブロックし得る。特に、アンチセンス分子は、関節炎の処置における炎症性サイトカインまたは異化サイトカインの翻訳、および、これらのサイトカインにより引き起こされる組織の喪失をブロックするために使用され得る。
【００３３】
目的のポリヌクレオチド配列は、代表的には、診断用途または治療用途のポリペプチドをコードする。ポリペプチドは、本発明の発現カセットを含有する種々の宿主細胞（例えば、ＣＯＳ細胞もしくはＣＨＯ細胞、またはその誘導体）を使用して、インビトロでバイオリアクターにおいて産生され得る。あるいは、本発明の発現カセットおよび／またはベクターは、遺伝子送達、タンパク質送達および／または遺伝子治療のために使用され得る。
【００３４】
本発明はまた、毒性の因子およびポリペプチドの発現のために使用され得る。後者は特に、細胞毒素（例えば、ジフテリア毒素、シュードモナス毒素およびリシンＡ）、外来因子（例えば、チミジンキナーゼおよびシトシンデアミナーゼ）に対する生成物誘導性の感受性、あるいは、細胞死を誘導し得る因子（例えば、Ｇｒｂ３−３および抗−ｒａｓ ＳｃＦｖ）であり得る。
【００３５】
治療的用途により、疾患もしくは障害からの救済を提供し得、疾患もしくは障害を治癒し得、そして／または疾患もしくは障害の重篤度を軽減し得る用途が意味される。診断的用途は、分子の疾患プロセスに対する原因または関係性に関する情報を決定または提供し得る分子の使用、疾患もしくは障害の存在もしくは非存在を決定することを含む。診断剤は、疾患もしくは障害の軽減に直接は寄与しない。
【００３６】
目的のポリヌクレオチドはまた、ワクチンとしての用途のための抗原性ポリペプチドをコードし得る。抗原性のポリペプチドまたは核酸分子は、例えば、細菌またはウイルスのような病原性生物に由来する。例えば、抗原性ポリペプチドは、病原性生物（例えば、出血性敗血症ウイルス、腎臓病細菌、ビブリオおよびフルンケル症）のゲノムもしくは遺伝子産物に存在する抗原性決定基を含む。抗原性ポリペプチドは、例えば、Ｃ型肝炎ウイルスのゲノムおよび遺伝子産物の領域から選択され得る。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、例えば、本発明のベクターもしくは発現カセット、または目的のポリヌクレオチドのような、分子もしくは組成物に対して言及する場合、「単離された」とは、分子または組成物が、インビボにおいて、またはその天然に存在する状態において関連する、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは他の汚染物質のような、少なくとも互いの化合物から分離されていることを意味する。従って、目的のポリヌクレオチドは、天然に関連する任意の他の成分から単離されている場合、単離されているとみなされる。しかし、単離された組成物はまた、実質的に純粋であり得る。単離された組成物は、均質な状態であり得る。単離された組成物は、乾燥／凍結されているか、または、水溶液であり得る。純度および均質性は、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、アガロースゲル電気泳動、または高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のような分析化学技術を使用して決定され得る。
【００３８】
本明細書中で使用される場合、用語「核酸分子」および「ポリヌクレオチド」は、交換可能に使用され、そして、オリゴヌクレオチド（すなわち、短いポリヌクレオチド）を含む。これらはまた、合成および／または天然に存在しない核酸分子（例えば、ヌクレオチドアナログまたは改変骨格残基もしくは結合を含む）を指す。この用語はまた、一本鎖形態または二本鎖形態のいずれかのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを指す。この用語は、天然のヌクレオチドのアナログを含む核酸を包含する。この用語はまた、合成骨格を有する核酸様構造を包含する。本発明により提供されるＤＮＡ骨格アナログとしては、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチル−ホスホネート、ホスホラミデート、アルキルホスホトリエステル、スルファメート、３’−チオアセタール、メチレン（メチルイミノ）、３’−Ｎ−カルバメート、モルホリノカルバメート、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）；Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ６００，ＢａｓｅｒｇａおよびＤｅｎｈａｒｄｔ編（ＮＹＡＳ １９９２）；Ｍｉｌｌｉｇａｎ（１９９３）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：１９２３−１９３７；Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（１９９３，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）を参照のこと。ＰＮＡは、非イオン性の骨格（例えば、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン単位）を含む。ホスホロチオエート骨格は、ＷＯ ９７／０３２１１；ＷＯ ９６／３９１５４；Ｍａｔａ（１９９７）Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１４４：１８９−１９７に記載される。この用語に包含される他の合成骨格としては、メチル−ホスホネート結合または代替的なメチルホスホネートとホスホジエステルとの結合（Ｓｔｒａｕｓｓ−Ｓｏｕｋｕｐ（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６：８６９２−８６９８）、およびベンジル−ホスホネート結合（Ｓａｍｓｔａｇ（１９９６）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ ６：１５３−１５６）が挙げられる。
【００３９】
本明細書中で使用される場合「組換え体」とは、インビトロにおいて合成されたか、もしくは他の方法により操作されたポリヌクレオチド（例えば、「組換えポリヌクレオチド」）、組換えポリヌクレオチドを使用して細胞もしくは他の生物系において生成物を産生する方法、または、組換えポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド（「組換えタンパク質」）を指す。組換えポリヌクレオチドは、例えば、融合タンパク質の発現のために発現カセットもしくはベクターに連結された、異なる供給源に由来する核酸分子；またはポリペプチドの誘導性もしくは構成的な発現により産生されるもの（例えば、ポリペプチドコード配列のような異種性のポリヌクレオチドに作動可能に連結された本発明の発現カセットまたはベクター）を包含する。
【００４０】
代表的な発現系において、異種性のポリヌクレオチドからのポリペプチドの産生は、調節されていないか、または、異種性のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの上流に作動可能に連結されている転写プロモーターにからの転写を調節することによって調節されているかのいずれかである。しかし、この調節は、適切な転写の終結およびｍＲＮＡ安定性を提供するために、適切に下流に存在しなければならない。本発明の１つの局面において、ヒト成長ホルモン改変体（ｈＧＨｖ）ポリアデニル化（ポリＡ）シグナルドメインは、本発明の発現カセットまたはベクター中に存在する目的のポリヌクレオチドの下流（３’）に提供される。ｈＧＨｖポリＡシグナルドメインは、ヒト成長ホルモンの遺伝子配列番号に由来する配列を含む。ｈＧＨｖポリアデニル化シグナルドメイン配列は、強力な転写の終結を提供し、かつ、真核生物細胞において、ｍＲＮＡの増加した安定性を提供する。このｈＧＨｖポリアデニル化シグナルドメインは、ＣＭＶプロモーター／エンハンサーを利用し得るものを含む、先行技術の発現カセットおよび／またはベクターに対して、特有の利点を提供する。
【００４１】
翻訳エレメントがまた存在し得、これは、ＲＮＡ転写物をタンパク質に翻訳させるのに必須の特定の配列（例えば、リボソーム結合部位および開始コドン）を包含することが意図される。翻訳エレメントはまた、コンセンサス配列、リーダー配列、スプライスシグナルなどを含み得、これらは、翻訳の程度を促進もしくは増強するか、または、発現された産物の安定性を増加するために機能する。例えば、ｈＧＨｖポリアデニル化シグナルドメインは、増加したｍＲＮＡ安定性を提供する。本発明のベクターは、付属的な転写領域（例えば、イントロン、ポリアデニル化シグナル、Ｓｈｉｎｅ／Ｄａｌｇａｍｏ翻訳シグナルおよびＫｏｚａｋコンセンサス配列）を保有し得る（Ｓｈｉｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）７１：１３４２−１３４６（１９７４）；Ｋｏｚａｋ，Ｃｅｌｌ ４４：２８３−２９２（１９８６））。
【００４２】
用語「複製エレメント」は、レシピエント細胞においてベクターの複製を可能にするのに必須の特定の配列（例えば、複製起点）を包含することが意図される。一般に、このようなベクターは、レシピエント細胞においてベクターの自立的かつ安定な複製を可能にするのに十分な、少なくとも１つの複製起点を含む。
【００４３】
本発明のベクターの選択および維持を容易にするために、１つ以上の選択マーカー（例えば、抗生物質に対する耐性、または、最低量の培地中でか、もしくは、毒性代謝物の存在下において増殖する細胞能を与えるポリヌクレオチド）が、ベクター内に含められ得る。
【００４４】
さらなる実施形態において、本発明は、上記の構築物（例えば、本発明の発現カセットまたはベクター）を含む宿主細胞に関する。本発明の発現カセットは、所望の目的のポリヌクレオチドを発現するように、宿主細胞をトランスフェクトするか、または、宿主細胞を形質転換することによって、宿主細胞を組換え的に修飾するために使用され得る。本明細書中で使用される場合、用語「組換え的に修飾される」とは、本発明の発現カセットまたはベクターを、生細胞または発現系に導入することを意味する。通常、目的のポリヌクレオチドを含む発現カセットが、ベクター（例えば、プラスミド）中に存在する。発現系は、本明細書中に記載されるような、その生成物が発現されるべき目的のポリヌクレオチドが導入されている、生きている宿主細胞を含む。
【００４５】
宿主細胞は、発現カセット（発現カセットを含むベクターを含む）が、増殖され得、かつ、生成物をコードするポリヌクレオチドが発現され得る細胞である。宿主細胞はまた、主体の宿主細胞またはその誘導体の任意の子孫を含む。複製の間に生じる変異が存在し得るので、全ての子孫は、親細胞と同一であるわけではないことが理解される。しかし、このような子孫は、用語「宿主細胞」が使用される場合、含められる。本発明において有用な宿主細胞としては、細菌細胞、真菌細胞（例えば、酵母細胞）、植物細胞および動物細胞が挙げられる。例えば、宿主細胞は、哺乳動物細胞のような高等真核生物細胞であっても、酵母細胞のような下等真核生物細胞であってもよく、そしてまた、宿主細胞は、細菌細胞のような原核細胞生物細胞であってもよい。構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性のトランスフェクション、またはエレクトロポレーションにより達成され得る（Ｄａｖｉｓ，Ｌ．，Ｄｉｂｎｅｒ，Ｍ．，Ｂａｔｔｅｙ，Ｉ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６））。適切な宿主の代表例として、以下が言及され得る：酵母細胞のような真菌細胞；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９のような昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳまたはＢｏｗｅｓ黒色腫のような動物細胞；植物細胞など。適切な宿主の選択は、本明細書中の教示から、当業者の技術範囲内であると判断される。
【００４６】
本発明において使用するための宿主細胞は、真核生物宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞）である。本発明の１つの局面において、宿主細胞は、細胞培養において増殖するように適合された哺乳動物の産生細胞である。産業において一般に使用されるこのような細胞の例は、ＣＨＯ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＶ１細胞（Ｃｏｓ細胞；Ｃｏｓ−７細胞を含む）、ＭＤＣＫ細胞、２９３細胞、３Ｔ３細胞、Ｃ１２７細胞、骨髄腫細胞株（特にマウス）、ＰＣ １２細胞およびＷ１３８細胞である。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、いくつかの複合組換えタンパク質（例えば、サイトカイン、凝固因子および抗体）の産生のために広く使用される（Ｂｒａｓｅｌら，Ｂｌｏｏｄ ８８：２００４−２０１２（１９９６）；Ｋａｕｆｍａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６３：６３５２−６３６２（１９８８）；ＭｃＫｉｎｎｏｎら，Ｊ Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ６：２３１−２３９（１９９１）；Ｗｏｏｄら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １４５：３０１１−３０１６（１９９０））。ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）欠失変異細胞株（Ｕｒｌａｕｂら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７７：４２１６−４２２０（１９８０））は、最適のＣＨＯ宿主細胞株である。なぜならば、有効なＤＨＦＲ選択が可能であり、かつ、増幅可能な遺伝子発現系が、これらの細胞における高レベルの組換えタンパク質発現を可能にするからである（Ｋａｕｆｍａｎ，Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ １８５：５２７−５６６（１９９０））。さらに、これらの細胞は、接着培養物または懸濁培養物として扱いやすく、比較的良好な遺伝的安定性を示す。ＣＨＯ細胞およびこれらにおいて発現される組換えタンパク質は、広範に特徴付けられており、そして、監督官庁によって、臨床用製造における用途について認可されている。さらに、上記の細胞株のいずれかに由来し、所望の表現型を有する宿主細胞がまた使用され得ることが意図される。例えば、派生の宿主細胞としては、（例えば、ポジティブ選択および／またはネガティブ選択のプロセスにより）所望の表現型について選択的に培養されたＣＨＯ細胞（例えば、ＤＧ４４細胞株）が挙げられる。
【００４７】
本発明の１つの局面において、目的のポリヌクレオチドによりコードされる因子のインビトロ産生のための発現系が提供される。本明細書において議論されるように、目的のポリヌクレオチドは、薬学的、医療的、栄養的および／または産業的に価値のあるポリペプチドをコードし得る。例えば、目的のポリヌクレオチドは、ポリペプチドベースの薬物をコードし得る。代表的に、このようなポリペプチドは、細胞外生成物として発現される。例えば、本発明の発現カセットおよび／またはベクターを使用して産生され得るポリペプチドとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：Ｆｌｔ３リガンド、ＣＤ４０リガンド、エリスロポエチン、トロンボポエチン、カルシトニン、Ｆａｓリガンド、ＮＦ−κＢのレセプターアクチベーターに対するリガンド（ＲＡＮＫＬ）、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導性リガンド（ＴＲＡＩＬ）、ＯＲＫ／Ｔｅｋ、胸腺支質由来リンフォポエチン（ｌｙｍｐｈｏｐｏｉｅｔｉｎ）、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、肥満細胞増殖因子、幹細胞増殖因子、上皮増殖因子、ＲＡＮＴＥＳ、成長ホルモン、インシュリン、インシュリノトロピン（ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｎ）、インシュリン様増殖因子、甲状腺ホルモン、インターフェロン（例えば、インターフェロン−β）、神経成長因子、グルカゴン、インターロイキン１〜１８、コロニー刺激因子、リンフォトキシン−β、腫瘍壊死因子、白血病阻害因子、オンコスタチン−Ｍ、細胞表面分子ＥｌｋおよびＨｅｋに対する種々のリガンド（例えば、ｅｐｈ関連キナーゼすなわちＬＥＲＫＳに対するリガンド）、ならびに、抗体軽鎖または重鎖。
【００４８】
上記のタンパク質のいずれかに対するレセプターはまた、本発明の方法および組成物を使用して発現され得、これらとしては、腫瘍壊死因子レセプター（ｐ５５およびｐ７５と呼ばれる）、インターロイキン−１レセプター（１型および２型）、インターロイキン−４レセプター、インターロイキン−１５レセプター、インターロイキン−１７レセプター、インターロイキン−１８レセプター、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子レセプター、顆粒球刺激因子レセプター、オンコスタチン−Ｍおよび白血病阻害因子に対するレセプター、ＮＦ−κＢに対するレセプターアクチベーター（ＲＡＮＫ）、ＴＲＡＩＬに対するレセプター、ＢＡＥＦレセプター、リンフォトキシンβレセプター、ＴＧＦレセプターＩ型およびＩＩ型、ならびに、Ｆａｓもしくはアポトーシス誘導性レセプター（ＡＩＲ）のようなデスドメイン（ｄｅａｔｈ ｄｏｍａｉｎ）を含むレセプターの両方の形態が挙げられる。
【００４９】
本発明の発現カセットおよび／またはベクターを使用して発現され得る他のタンパク質としては、分化抗原のクラスター（ＣＤタンパク質と呼ばれる）（例えば、Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｔｙｐｉｎｇ ＶＩ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ＶＩｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ ａｎｄ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ；Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ，Ｋｉｋｕｔａｎｉら編；Ｋｏｂｅ，Ｊａｐａｎ，１９９６）において開示されるもの）、または、その後のワークショップで開示されたＣＤ分子が挙げられる。このような分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３９、ＣＤ４０およびこれらに対するリガンド（ＣＤ２７リガンド、ＣＤ３０リガンドおよびＣＤ４０リガンド）が挙げられる。これらのいくつかは、ＴＮＦレセプターファミリーのメンバーであり、そしてまた、４１ＢＢおよびＯＸ４０を含む；このリガンドは、しばしば、ＴＮＦファミリーのメンバーであり（４１ＢＢリガンドおよびＯＸ４０リガンドであるので）；従って、ＴＮＦファミリーおよびＴＮＦＲファミリーのメンバーはまた、本発明を使用して発現され得る。
【００５０】
酵素的に活性なポリペプチドがまた、本発明に従って発現され得る。例としては、メタロプロテイナーゼ−ジスインテグリンファミリーメンバー、種々のキナーゼ、グルコセレブロシド、スーパーペルオキシドジスムターゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ａ−１、グロビン、ＩＬ−２アンタゴニスト、α−１アンチトリプシン、ＴＮＦ−α変換酵素（ＴＡＣＥ）、および多数の他の酵素が挙げられる。酵素的に活性なタンパク質のリガンドはまた、本発明のカセットおよびベクターを使用して発現され得る。
【００５１】
本発明の組成物および方法はまた、他の型の組換えタンパク質および組換えポリペプチド（免疫グロブリン分子またはその一部およびキメラ抗体（例えば、マウス抗原結合領域に結合したヒト定常領域）を含む）またはそのフラグメントの発現に有用である。免疫グロブリン分子をコードするＤＮＡを加工して、組換えタンパク質をコードするＤＮＡ（例えば、単鎖抗体、親和性の増強した抗体、または他の抗体ベースのポリペプチド（例えば、Ｌａｒｒｉｃｋら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：９３４−９３８（１９８９）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｒｏｂｅｒｔｓら，Ｎａｔｕｒｅ ３２８：７３１−７３４（１９８７）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）；Ｃｈａｕｄｈａｒｙら，Ｎａｔｕｒｅ ３３９：３９４−３９７（１９８９）を参照のこと））を生じ得る、多数の技術が公知である。クローン化したヒト化抗体としては、リンフォトキシン−βレセプターおよびインテグリン（例えば、ＶＬＡ−１、ＶＬＡ−４およびαｖβ６）に特異的に結合するものが挙げられる。このような抗体は、アゴニストであってもアンタゴニストであってもよい。
【００５２】
種々の融合タンパク質がまた、本発明の方法および組成物を使用して発現され得る。このような融合タンパク質の例としては、免疫グロブリン分子の一部との融合物として発現されるタンパク質、ジッパー部分を有する融合タンパク質として発現されるタンパク質、ならびにサイトカインおよび増殖因子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３、ＭＧＦおよびＩＬ−３）の融合タンパク質のような新規な多機能タンパク質が挙げられる：ＷＯ ９３／０８２０７およびＷＯ ９６／４０９１８は、ＣＤ４０Ｌと呼ばれる分子の種々の可溶性オリゴマー形態の調製を記載し、これらは、それぞれ、免疫グロブリン融合タンパク質およびジッパー融合タンパク質を含み；これらにおいて議論される技術は、他のタンパク質に適用可能である。
【００５３】
一旦目的のポリヌクレオチドが発現されると、発現産物（例えば、タンパク質またはポリペプチド）は、当該分野で標準的な技術を使用して精製され得る。例えば、目的のポリヌクレオチドが精製タグを含む融合ポリペプチドをコードする場合、このポリペプチドは、このタグに特異的に結合する抗体を使用して精製され得る。１つの局面において、タグ分子をコードするオリゴヌクレオチドは、所望のポリペプチドをコードする目的のポリヌクレオチドの５’末端または３’末端において連結されている；このオリゴヌクレオチドは、ポリＨｉｓ（例えば、６Ｈｉｓ）または他の「タグ」（例えば、既存の市販の抗体について、ＦＬＡＧ、ＨＡ（ヘマグルチニンインフルエンザウイルス）またはｍｙｃ）をコードし得る。このタグは、代表的に、ポリペプチドの発現の際に、ポリペプチドに融合し、そして、宿主細胞からの所望のポリペプチドの親和性精製のための手段として機能し得る。親和性精製は、例えば、親和性マトリクスとしてタグに対する抗体を使用するカラムクロマトグラフィーによって達成され得る。必要に応じて、タグは、その後、タンパク質分解性の切断のような種々の手段によって精製したポリペプチドから除去され得る。
【００５４】
本発明の発現カセットおよびベクターは、宿主細胞への目的のポリヌクレオチドの安定な移送を提供するために使用され得る。安定な移送とは、目的のポリヌクレオチドが、宿主において継続的に維持されることを意味する。本発明の発現カセットまたはベクターはまた、宿主細胞内での目的のポリヌクレオチドの一過性の発現を提供し得る。一過的にトランスフェクトされた宿主細胞は、細胞の複製および増殖の間に、外来性ＤＮＡを欠失する。
【００５５】
本発明の発現カセットは、処置の必要なヒトまたは動物に治療剤を送達するために使用され得る。あるいは、本発明の発現カセットは、被験体（例えば、ヒト）へのワクチン目的のため、特に、魚、ブタ、ウマ、ウシ、イヌおよびネコの種のような食用の動物を含む、家畜動物のワクチン摂取のために、インビボにおいて免疫原性ポリペプチドをコードする因子を送達するために使用され得る。
【００５６】
本発明の発現カセットは、代表的に宿主細胞のゲノムと相同な隣接配列を含む、裸の核酸構築物として直接投与され得る。脊椎動物細胞による裸の核酸構築物の取込みは、微粒子銃形質転換およびリポフェクチンを含むいくつかの公知の技術によって増強される。
【００５７】
あるいは、発現カセットは、プラスミドベクターまたはウイルスベクターを含む、ベクターの一部として投与され得る。
【００５８】
代表的には、発現カセットまたはベクターは、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤と合わせられて、薬学的組成物を生成する。適切なキャリアおよび希釈剤としては、等張の生理食塩溶液（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水を含む）が挙げられる。発現カセットまたはベクターを含む組成物は、例えば、筋肉内投与を含む種々の型の投与のために処方され得る。
【００５９】
発現カセットまたはベクターを含む組成物が、注射可能な形態で使用される場合、この組成物は、代表的に、処置されるべき部位における直接注射のための注射可能処方物について、薬学的に受容可能であるビヒクルと混合される。薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤は、例えば、滅菌等張溶液であり得る。発現カセットまたはベクターを含む組成物はまた、経口的に活性な形態で処方され得る。
【００６０】
実際の処方は、当業者により容易に決定され得、そして、投与される物質の性質および投与経路に依存して変化する。
【００６１】
使用される物質の用量は、種々のパラメータによって、特に、使用される物質、処置されるべき被験体の年齢、体重および状態、使用される投与経路、ならびに、必要とされる臨床レジメンによって、調節され得る。医師は、任意の特定の被験体および状態に必要とされる投与経路および投薬量を決定し得る。
【実施例】
【００６２】
（ｐＶ１０ベクターの構築）
ｐＶ１０の構築のさらなる詳細を、図１に概説する。ゲノムＤＮＡを、ヒトサイトメガロウイルス株ＡＤ１６９（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−５３８）に感染したヒト２倍体線維芽細胞から単離し、これを鋳型として使用して、ＣＭＶ最初期遺伝子１プロモーター／エンハンサー領域（ＣＭＶ ＩＥ１ Ｐ／Ｅ）（ＣＭＶ ＩＥ１遺伝子の５’ＵＴＲの詳細については、図１１（Ｂ）（配列番号１）を参照のこと）をＰＣＲにより増幅した。プロモーターを、５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を含むプライマー
【００６３】
【数１】
および３’末端にＢａｍＨＩ部位を含むプライマー
【００６４】
【数２】
を使用して増幅した。制限部位に先行する末端の「ｔ」ヌクレオチドは、制限酵素消化を促進するためにオリゴヌクレオチド設計に含められ、クローニング工程において排除される。
【００６５】
全てのＰＣＲ反応を、ＤＮＡエンジンＰＴＣ−２００ Ｐｅｌｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ
Ｃｙｃｌｅｒ（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ，ＭＡ）にて行なった。合計反応容量は、１００μｌ（１×ＮＥＢ Ｖｅｎｔポリメラーゼ緩衝液（１０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２５℃にてｐＨ８．８、１０ｍＭ （ＮＨ４）ＳＯ４、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ、２単位のＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、１μｇの各プライマー、鋳型としてＣＭＶ感染細胞から単離した１μｇのゲノムＤＮＡ）であった。反応条件は以下の通りであった：９９℃で１分間、５５℃で３０秒間、７５℃で１．５分間を１５サイクル。得られたフラグメントを、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化し、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化したクローニングベクターｐＵＣ１９にサブクローニングした。インサートの配列解析を決定し、これは、クローニングされたＣＭＶ ＩＥ１プロモーター／エンハンサー領域の公開された配列と一致した。
【００６６】
（ｐＶ４０ベクターの構築）
ｐＶ４０の構築を図２に概説する。ポリＡシグナルを含むｈＧＨｖ遺伝子の３’ＵＴＲを、ヒト線維芽細胞から単離したゲノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅した。５’プライマーの（＋）鎖（ＴＴＴＴＧＧＡＴＣＣＣＴＧＣＣＣＧＧＧＴＧＧＣＡＴＣＣ；配列番号２０）は、末端にＢａｍＨＩ制限部位を含み、そして、３’プライマーの（−）鎖は、末端にＥｃｏＲＩ部位を含んだ（ＴＴＴＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＧＡＧＧＡＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣ；配列番号２１）。ＰＣＲ条件は、ｐＶ１０の構築について記載したのと同じであった。得られたＰＣＲフラグメントを、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ゲル精製し、そして、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化したベクターｐＶ１０に連結した。得られたプラスミド（ｐＶ４０と命名）を、制限酵素分析により評価した。その後の配列決定により、少数のヌクレオチドが、このｈＧＨｖ遺伝子の３’ＵＴＲ（配列番号１９）とＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｋ００４７０において公開されたｈＧＨｖ遺伝子配列（配列番号１８）との間で異なることが示された。少なくともいくつかの変化が、対立遺伝子の改変によるものである。
【００６７】
（ｐＶ７０ベクターの構築）
ｐＶ４０ベクターを、ＢｓｐＥＩおよびＨｐａＩで消化して、イントロンＡ領域の３１７ヌクレオチド部分（ＩＶＳ）を除去した（例えば、図２および３を参照のこと）。ｐＶ４０のｄｈｆｒコード領域のＢｓｐＥＩ−ＨｐａＩへの平滑末端ライゲーションにより、ｐＶ６０を作製した。ｐＶ７０発現ベクターは、転写を調節するために、ヒトサイトメガロウイルス最初期１（ｈＣＭＶ ＩＥ１）プロモーター／エンハンサー領域を含む。このベクターはまた、ｈＣＭＶ ＩＥ１ ５’ＵＴＲおよびイントロンＡを含み、このイントロンは、３１７塩基対の欠失を含む。転写の終結のために、ベクターは、ヒト成長ホルモン改変体ポリアデニル化（ｈＧＨｖポリＡ）領域、配列番号１９を含む。ｐＶ４０、ｐＶ６０およびｐＶ７０の構築は以下に詳説され、そして、図面にさらに記載される。
【００６８】
（Ａ．ｐＸＬＣ．１の作製）
抗体に対する軽鎖コード配列を含むＰＣＲ産物をＢａｍＨＩで消化して、発現ベクターｐＶ７０における固有のＢａｍＨＩにクローニングした（図３）。軽鎖コード領域を、ｈＣＭＶ ＩＥ１イントロンの３’末端の５’ＵＴＲ配列と、ｈＧＨｖポリＡ領域の５’末端との間の固有のＢａｍＨＩに挿入した。このプラスミドをｐＸＬＣ．１と名付けた。図４は、ｐＸＬＣ．１ベクターの作製の概略図を示す。
【００６９】
（Ｂ．ｎｅｏカセット−ｐＸＬＣ．２の追加）
ネオマイシントランスフェラーゼ（ｎｅｏ）発現カセットを、選択マーカーとして機能するように、ｐＸＬＣ．１に導入した（図５）。ｎｅｏカセットを、市販のｐＧＴ−Ｎ２８と呼ばれるプラスミド（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号３０７−２８）からＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントとして調製した。このプラスミドにおいて、ｎｅｏ遺伝子は、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターにより駆動され、ＰＧＫポリアデニル化部位において終結される。ｎｅｏカセットの５’末端にあるＢａｍＨＩ部位を、以下のアダプターオリゴ：
【００７０】
【数３】
を使用して、ＮａｒＩ末端に変換した。
【００７１】
これらのリンカーを用いて、新しいＥｃｏＲＩ部位をまた追加した。このアダプターをまずＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ切断したｎｅｏフラグメントに連結し、この変換されたＮａｒＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントを、次いで、ＮａｒＩおよびＥｃｏＲＩで消化したｐＸＬＣ．１にクローニングした。このようにして、ｎｅｏ発現カセットを、プラスミドの軽鎖配列の３’末端に挿入した。このプラスミドを、ｐＸＬＣ．２と名付けた（図５）。
【００７２】
（重鎖発現ベクターｐＸＨＣ．５の構築）
（Ａ．重鎖のＲＴ−ＰＣＲ）
重鎖を、５’ＰＣＲプライマー：
【００７３】
【数４】
を使用するＲＴ−ＰＣＲ反応から増幅し、この配列において、斜体の配列は、ＢａｍＨＩ部位を有する追加されたリンカー領域であり、そして、下線の塩基は、重鎖コード配列内の第２のメチオニンに対応する。使用した３’ＰＣＲプライマー：
【００７４】
【数５】
はまた、ＢａｍＨＩ部位を有する追加されたリンカー領域（斜体）、および終止コドンを含む重鎖コード配列に対応する配列（下線）を含む。予想された１２６８塩基対のＰＣＲ産物を得た。
【００７５】
（Ｂ．ｐＸＨＣの構築）
使用した５’ＰＣＲプライマーは、ＰＣＲ産物に含まれるコード領域の開始ＡＴＧではなく、コード領域の第２のＡＴＧコドンにハイブリダイズしたので、重鎖コード領域は不完全であった。不完全な重鎖を含むＢａｍＨＩフラグメントを、プラスミドｐＶ６０にクローニングした（図６）。このベクターは、イントロン内の欠失の部位にｄｈｆｒコード領域を含むこと以外は、ｐＶ７０（上記）と同一である。重鎖コード領域を、ｈＣＭＶ ＩＥ１イントロンの３’末端にある５’非翻訳配列と、ｈＧＨｖ改変体ポリＡ領域の５’末端との間の、固有のＢａｍＨＩ部位に挿入した。不完全な重鎖を有するこのプラスミドを、ｐＸＨＣと名付けた。
【００７６】
（Ｃ．重鎖コード配列−ｐＸＣＨ．１の完成）
重鎖配列から欠失しているコード領域をｐＸＨＣ内に挿入して、ｐＸＨＣ．１と命名されたプラスミドを作製した（図７）。これを行なうために、鋳型として抗体に対するコード配列を含むプラスミドを使用するＰＣＲによって、フラグメントを作製した。使用した５’ＣＲプライマーは、以下の通りであった：
【００７７】
【数６】
斜体の配列は、ＢａｍＨＩ部位のｐＸＨＣ配列５’に対応し、太字の配列は、重鎖配列内の開始コドンより２塩基前から始まる配列に対応する。使用した３’プライマーは、ＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＧＧＧＴＣＣＣＴＴＧＧＣＣＣＣ（配列番号９）であった。このプライマーは、第１エキソンの末端、重鎖可変領域にハイブリダイズする。予測されたように、４４５塩基対のＰＣＲ産物が得られ、ＰｓｔＩおよびＳｔｕＩで切断した。ＰｓｔＩＩ−ＳｔｕＩフラグメントを、ＰｓｔＩおよびＳｔｕＩで切断したｐＸＨＣにクローニングして、ｐＸＨＣ．１を得た。
【００７８】
（Ｄ．イントロンのｄｈｆｒ−ｐＸＨＣ．３の除去）
ｐＸＨＣ．１は、ｈＣＭＶ ＩＥ１イントロン内にｄｈｆｒ遺伝子を含んだ。この構成で見出される増幅の潜在的な問題に起因して、ｄｈｆｒ遺伝子をイントロンから除去し、そして、発現カセットを、重鎖カセットの３’に挿入した（図８）。第１の工程は、イントロンからのｄｈｆｒ遺伝子の除去であった。この工程を、ＰｓｔＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントとしてｐＸＨＣ．１から重鎖コード配列を切断し、同じ酵素を用いて切断したｐＸＬＣ．１プラスミドにクローニングすることによって達成した。このクローニング工程は、単に、プラスミド内の重鎖と軽鎖とを交換した。得られたプラスミドは、ｄｈｆｒ遺伝子を含むイントロンが、ｐＸＬＣ．１について上述したような欠失を有するイントロンにより置き換えられていることを除いて、ｐＸＨＣ．１と同一であった。この重鎖プラスミドを、ｐＸＨＣ．３と名付けた（図８）。
【００７９】
（Ｅ．ｄｈｆｒカセット−ｐＸＨＣ．５の挿入）
ｄｈｆｒ構成の変更における第２の工程は、重鎖発現カセットの３’へのｄｈｆｒ発現カセットの挿入であった（図９）。ｄｈｆｒ発現カセットは、ＢｇｌＩＩ／ＢａｍＨＩフラグメント上のプラスミドｐＳＩ−ＤＨＦＲに由来し、ＳＶ４０初期プロモーター、ｄｈｆｒ遺伝子およびＳＶ４０ポリＡ領域を含む。このフラグメントを、以下のアダプターオリゴを使用して、ｐＸＨＣ．３のｈＧＨｖポリＡ領域の３’末端に位置するＥｃｏＲＩ部位にクローニングした：
【００８０】
【数７】
このアダプターをまず、ＥｃｏＲＩ切断したプラスミドに連結し、次いで、ＢｇｌＩＩ／ＢａｍＨＩ ｄｈｆｒカセットをこのアダプタープラスミドに連結した。このプラスミドを、ｐＸＨＣ．５と名付けた（図９）。
【００８１】
（ｐＸＬＣ．２およびｐＸＨＣ．５の特徴づけ）
両方のプラスミドを、制限酵素を使用して分析し、挿入されたフラグメントの存在および配向を確認した。さらに、プラスミドのコード領域を配列決定して、ＰＣＲまたはクローニングの工程の間に変異が蓄積されていないことを確認した。
【００８２】
機能的なｎｅｏ選択マーカーの存在を、ｐＸＬＣ．２をＣＨＯ細胞にトランスフェクトし、Ｇ４１８に対する耐性を示すことによって確認した。二重選択を行なう能力は、ｐＸＬＣ．２プラスミドおよびｐＸＨＣ．５プラスミドを、血清を含まない、アダプターＤＧ４４ ＣＨＯ宿主に同時にトランスフェクトした場合に示された。二重選択培地（α−ＭＥＭ １０％ ｄＦＢＳ ＋ ４００ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８）において、同時トランスフェクションからコロニーが芽生えた。同じ条件下で、いずれかの選択単独（α−ＭＥＭまたは４００ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８）は、トランスフェクトされていない細胞を殺傷し得た。
【００８３】
（ベクターの構築：ｐＶ８０ベクターおよびｐＶ９０ベクター）
ｐＶ８０を、重鎖発現ベクターｐＸＨＣ．５から作製した（図１０）。重鎖コード配列を、ＢａｍＨＩを使用してｐＸＨＣ．５から欠失させた。骨格を、ＢａｍＨＩ部位において連結して再度環状にした。
【００８４】
ｐＶ８０ベクターに対して２つの変更を行なって、ｐＶ９０を作製した（図１１）。ｐＶ８０構築物の位置３１６６（ｄｈｆｒコード領域の末端、添付の配列を参照のこと）において見出されるＮｏｔＩ部位を破壊した。このことを達成するために、プラスミドをＮｏｔＩで消化し、そして、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼを使用して、突出を「埋めた」。結果として、再連結されたプラスミドは、位置３１６６のＮｏｔＩ部位がなくなった。次いで、新しいＮｏＩ部位を、ＢａｍＨＩでベクターを消化し、そして、それ自体と以下の１４マー：ＧＡＴＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧ（配列番号１２）とをアニーリングすることによって作製されるＮｏｔＩリンカーを導入することにより、クローニング部位において作製した。互いにアニーリングすると、リンカー配列は以下のようになる：
【００８５】
【数８】
このクローニング工程は、ＮｏｔＩ部位のいずれかの側にＢａｍＨＩ部位を再現した。これらのＢａｍＨＩ部位は、このベクターを用いて作製された安定な細胞株の遺伝学的分析において有用であり得る。ｐＶ９０のクローニング部位の配列を、配列決定解析により確認した。
【００８６】
ｐＶ８０ベクターにおいて、ポリヌクレオチド（例えば、コード配列）が、ＢａｍＨＩ部位
【００８７】
【数９】
にクローニングされ得る。太字の配列がＢａｍＨＩ部位を表す。ｐＶ９０ベクターにおいて、ポリヌクレオチド（例えば、コード配列）が、ＢａｍＨＩ部位またはＮｏｔＩ部位
【００８８】
【数１０】
にクローニングされ得る。ここで、太字の配列はＢａｍＨＩ部位を表し、そして、下線の配列はＮｏｔＩ部位を表す。最適な結果について、ＮｏｔＩ部位を使用する場合、「Ｃ」は、Ｋｏｚａｋ配列（例えば、ＧＧＡＴＣＣ ＧＣＧＧＣＣＧＣ Ｃ ＡＴＧ（配列番号１７））に最も良く適合するために、ＰＣＲプライマーの開始コドンより前に追加されるべきである。
【００８９】
（ｐＶ８０およびｐＶ９０における制限部位）
ｐＶ８０およびｐＶ９０は、ＮｏｔＩ制限部位を除いて、同一である：ｐＶ８０は、位置３１６６（ｄｈｆｒコード領域の末端）に単一のＮｏｔＩ部位を有し、そしてｐＶ９０は、位置１２６０（クローニング部位）に単一のＮｏｔＩ部位を有する。
【００９０】
２つ以下が見出された一般的な制限部位としては、表１に列挙されるものが挙げられる。
【００９１】
【表１】
以下の一般的な酵素切断部位は見出されなかった：
【００９２】
【表２】
。
【００９３】
（レポーター遺伝子のクローニング）
ＣＭＶ ＩＥ１、イントロンＡフラグメントおよびｈＧＨｖポリＡ構築物を含む発現カセット／ベクターを、市販のＳＶ４０ベースの高発現ベクターと比較した。
【００９４】
分泌されたアルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を、プラスミドの比較のためのレポーターとして使用した。ＳＶ４０ベースの発現ベクターである、ｐＳＥＡＰ２−コントロール（カタログ番号６０５２−１，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）は、ＳＶ４０初期プロモーターおよびＳＶ４０エンハンサーの制御下でＳＥＡＰを発現する。ＳＥＡＰをコードする配列の次に、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナルが続き、真核生物細胞におけるＳＥＡＰ転写物の適切かつ効率的なプロセシングを保証する。ＭＣＳの上流に位置する隣接するポリアデニル化部位および転写ポーズ部位から構成される合成転写ブロッカー（ＴＢ）は、バックグラウンドの転写を減らす。このベクターは、ＳＥＡＰの発現効率を増加することによってＳＥＡＰの感度を改善するか、または、ベクターの利用性を向上させる多数の特徴を組み込む。これらとしては以下が挙げられる：改善されたＫｏｚａｋコンセンサス転写開始部位；いくつかの遺伝子および／または細胞型において潜在性のスプライシングを生じ、そして、発現を減少させ得る、ＳＶ４０の小さなｔイントロンの除去；代表的に、ｍＲＮＡレベルの５倍の増加をもたらす、ＳＶ４０の初期ポリアデニル化シグナルから後期ポリアデニル化シグナルへの切り替え；拡張されたマルチプルクローニング部位（ＭＣＳ）；コンパクトなプラスミドのサイズ；ならびにＳＥＡＰ ｍＲＮＡの３’非翻訳領域に由来する外来性配列の除去。Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｕ８９９３８。
【００９５】
ｐＣＭＶ−ｈＧＨｖＰＡ−ＳＥＡＰプラスミドを作製するために、ＰＣＲによりｐＳＥＡＰ２−コントロールプラスミドからＳＥＡＰをコードする配列を抽出し、これをｐＶ１００ベクターにクローニングした。ｐＶ１１０プラスミドは、ｐＶ９０の派生物である（ｄｈｆｒ発現カセットがなく、ポリリンカーが異なるが、その他は同じである）。ｐＣＭＶ−ｈＧＨｖＰＡ−ＳＥＡＰプラスミド構築物を、配列決定により評価した。
【００９６】
トランスフェクションに使用した宿主は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）欠失チャイニーズハムスター卵巣細胞株ＤＧ４４（Ｕｒｌａｕｂら、Ｃｅｌｌ ３３，４０５−４１２（１９８３））であった。ＣＭＶ−ＳＥＡＰおよびｐＳＥＡＰ２−コントロールレポータープラスミドを、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）をコードし得るプラスミドと共に同時にトランスフェクトし、その結果、安定なトランスフェクト体を（ｐＳＩ−ＤＨＦＲ．２、図１２）について選択し得る。各トランスフェクションは、５０μｇのレポータープラスミドおよび５μｇのｐＳＩ−ＤＨＦＲ．２を含んだ。全てのＤＮＡを、Ｍｅｇａｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）により調製した。トランスフェクションの前に、ＤＮＡをＥＴＯＨ沈殿し、７０％ ＥｔＯＨで洗浄し、乾燥させ、ＨＥＢＳ（２０ｍＭ
Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．０５、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、０．７ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、６ｍＭデキストロース）中に再懸濁し、トランスフェクションの前に定量した。ネガティブコントロールは、レポーターコントロールとしてｐＵＣ１８（ＡＴＣＣ番号３７２５３）を含み、そして、トランスフェクションコントロールとしてはＤＮＡなしのトランスフェクションを含んだ（表３）。
【００９７】
細胞およびＤＮＡを、０．２８ｋＶおよび９５０ｍＦにて０．４ｃｍのキュベット（ＢｉｏＲａｄ）を使用して、０．８ｍｌのＨＥＢＳ中でのエレクトロポレーションによりトランスフェクトした。５Ｅ６細胞を各トランスフェクションに使用した。エレクトロポレーションのパルスの後、細胞を、室温にて５〜１０分間キュベット内でインキュベートさせた。次いで、これらを、ヌクレオシドを含むαＭＥＭおよび１０％ ｄＦＢＳ １０ｍｌを含む遠心チューブに移し、１Ｋ ＲＰＭで５分間ペレット化した。再懸濁したペレットを、１０％ｄＦＢＳを含み、ヌクレオシドを含まないアルファＭＥＭ中、６ウェルプレート内に撒き、コロニーが形成するまで、加湿したインキュベーター内で、３６℃にて５％ ＣＯ２でインキュベートした。
【００９８】
【表３】
トランスフェクションの約２週間後、ｐＳＩＤＨＦＲ．２プラスミドのみを含むトランスフェクション中に、コロニーが形成した。安定なトランスフェクト体を、プールまたは単離体のいずれかとして分析した。特定の生産性を、アッセイにおいて評価した。このアッセイにおいて、培地を、新しい培地と交換し、そして２４時間後に、培地をサンプリングし、細胞を計数した。２４時間のアッセイの終わりに、生成物の力価を細胞数に対して規準化し、そして、生産性を細胞１個あたりのＳＥＡＰ活性として表した。
【００９９】
（ＳＥＡＰアッセイ）
馴化培地を、Ｇｒｅａｔ ＥｓｃＡＰｅＴＭ ＳＥＡＰ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ ３（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して分析した。このアッセイは、馴化培地においてＳＥＡＰ活性を検出するために、蛍光基質を使用する。このキットを、以下の例外を除いて、製造業者の指示書に従って、９６ウェル形式において使用した。キットのアッセイ緩衝液を、１．５Ｍ ジエタノールアミン、０．７５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１５ｍＭ Ｌ−ホモアルギニンおよび１０％ Ｅｍｅｒａｌｄ ＩＩ（カタログ番号９７６１、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で置き換えた。全ての標準およびサンプルを、添付の希釈緩衝液ではなく、新しい培地に希釈した。６０分後に１回の読み取りを行なう代わりに、複数の読み取りを、１０〜２０分間隔で行い、これを使用して、１分あたりの相対蛍光単位（ＲＦＵ／分）としてＳＥＡＰ活性を表した。プレートリーダー（Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒ
ＩＩ，ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に使用した発光フィルターは、推奨される４４９ｎｍの代わりに４６０ｎｍであった。
【０１００】
ＲＦＵ／分の値を、キットに添付される標準物質に基づく標準曲線に対して基準化した。添付される標準物質は定量化されていなかったので、全ての値は相対値である。これらの相対値を、細胞数およびインキュベーション期間に対して規準化し、相対特異的生産性（１日あたりの、細胞１個あたりのＳＥＡＰ活性）を生じた。
【０１０１】
（プール）
コロニーが出現した後、各トランスフェクションから細胞を回収し、プールした。プールを、６ウェルプレート内の各ウェルに２×１０５個の細胞で撒いた。次の日に、培地を２ｍｌの新しい培地と交換した。２４時間後、細胞を計数し、培地のサンプルを使用して、ＳＥＡＰ活性を評価した。プールアッセイからの結果を図１３に示す。
【０１０２】
（単離体）
単離体を、トランスフェクションからコロニーを「ピックアップ」することによって得た。「ピックアップ」は、５０μｌに設定したＰ２００ Ｐｉｐｅｔｍａｎを用いてコロニーの上で直接吸引することによって達成した。吸引したコロニーを、まず、４８ウェルプレートに移し、次いで、十分な細胞数になると６ウェルプレートに移した。特定の生産性を、上記の２４時間アッセイを使用して、ほぼコンフルエントな細胞密度の６ウェルプレートにおいて評価した（図１４）。
【０１０３】
図１３および１４に要約したように、ＣＭＶ ＩＥプロモーターおよびｈＧＨｖポリＡシグナルドメインの組合せに基づく発現ベクターは、高い発現能力を誇る市販のベクターよりもかなり優れていた。
【０１０４】
本発明の多数の実施形態が記載された。それでもなお、種々の改変が、本発明の精神および範囲から逸脱することなくなされ得ることが理解される。従って、他の実施形態は、添付の特許請求の範囲内である。
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、発現ベクターおよび発現カセットに関し、より具体的には、生物における外来性分子の発現のための方法、組成物および系に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
核酸分子、ポリペプチド、ペプチドおよび低分子の、標的細胞および標的分子への導入は、治療用の送達系およびインビトロでの治療用分子の産生の両方において使用される。このアプローチの適用性は、宿主細胞、ならびに、細胞の分裂、分化および発現機構の分子生物学のさらなる理解と共に増加している。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
（要旨）
ＣＭＶプロモーターにより駆動され、改変体ヒト成長ホルモン（ｈＧＨｖ）遺伝子に由来するポリＡドメインにより終結される転写は、このようなエレメントのうちの一方もしくはもう一方、または両方を欠く他の発現ベクターよりも効率が高いことが発見された。従って、本発明は、目的のポリヌクレオチドの発現において有用な発現カセットおよび発現ベクターを提供する。本発明の発現カセットは、効率的な転写、効率的な転写終結および転写産物の増加したｍＲＮＡ安定性を提供する、調節性エレメントの組み合わせを含む。１つの実施形態において、発現カセットは、ヒトサイトメガロウイルスのプロモーター／エンハンサー、目的のクローニング部位またはポリヌクレオチド、およびｈＧＨｖポリアデニル化シグナルドメインを含む。必要に応じて、可変長介在配列が存在し得る。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
発現カセットであって、以下：
ヒトＣＭＶ最初期１（ｈＣＭＶ ＩＥ１）プロモーター／エンハンサー領域；
目的のポリヌクレオチド；および
改変体ヒト成長ホルモン（ｈＧＨｖ）ポリＡシグナルドメインまたはその改変体
を含み、該ｈＧＨｖポリＡシグナルは、少なくとも１００ヌクレオチド長であり、かつ配列ＡＡＴＡＡＡを含み、そして、該ポリＡ改変体は、ｈＧＨポリＡシグナルドメインと少なくとも９２％同一である、発現カセット。
（項目２）
前記ヒトＣＭＶ ＩＥ１プロモーター／エンハンサー領域が、配列番号１の約ｘ１〜約ｘ２に示されるような配列を含み、ここでｘ１が配列番号１の約１〜２０の間のヌクレオチドを示し、そして、ｘ２が配列番号１の約７１５〜７２０の間のヌクレオチドを示す、項目１に記載の発現カセット。
（項目３）
スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位を含む可変長介在配列（ＶＬＩＶＳ）をさらに含む、項目１に記載の発現カセット。
（項目４）
前記ＶＬＩＶＳが、ｈＣＭＶ ＩＥ１遺伝子のイントロンＡを含む、項目３に記載の発現カセット。
（項目５）
前記ＶＬＩＶＳが、前記イントロンＡの前記スプライスアクセプターとスプライスドナーとの間に欠失を有するｈＣＭＶ ＩＥ１遺伝子のイントロンＡを含む、項目３に記載の発現カセット。
（項目６）
前記ＶＬＩＶＳが、配列番号１の約ｘ３〜ｘ４の配列を含み、ここで、ｘ３が配列番号１の約７１５〜７２０の間のヌクレオチドを示し、そして、ｘ４が配列番号１の約１２３６〜１２５４の間のヌクレオチドを示す、項目５に記載の発現カセット。
（項目７）
前記目的のポリヌクレオチドが治療剤をコードする、項目１に記載の発現カセット。
（項目８）
前記ポリＡシグナルドメインが、配列番号１９の少なくとも１００の連続するヌクレオチドを含む、項目１に記載の発現カセット。
（項目９）
前記ポリＡシグナルドメインが、配列番号１９を含む、項目８に記載の発現カセット。
（項目１０）
ＤＨＦＲ遺伝子をさらに含む、項目１に記載の発現カセット。
（項目１１）
項目１〜１０のいずれか１項に記載の発現カセットを含む、発現ベクター。
（項目１２）
項目１１の発現ベクターを含む、宿主細胞。
（項目１３）
項目１〜１０のいずれか１項に記載の発現カセットを含む、宿主細胞。
【０００４】
本発明は、ヒトＣＭＶ最初期１（ｈＣＭＶ ＩＥ１）プロモーター／エンハンサー領域、目的のポリヌクレオチド、および改変体ヒト成長ホルモン（ｈＧＨｖ）ポリＡシグナルドメインもしくはその改変体を含む発現カセットを提供する。ポリＡシグナル改変体は、少なくとも１００ヌクレオチド長であり、かつ、配列ＡＡＴＡＡＡを含み、そして、ｈＧＨポリＡシグナルドメインと少なくとも９２％同一である。
【０００５】
本発明はさらに、本発明の発現カセット、および本発明の発現カセットもしくは発現ベクターを含む宿主細胞を含む発現ベクターを提供する。
【０００６】
本発明はさらに、ヒトＣＭＶ最初期１（ｈＣＭＶ ＩＥ１）プロモーター／エンハンサー領域、スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位を含む可変長介在配列（ＶＬＩＶＳ）、目的のポリヌクレオチド、および改変体ヒト成長ホルモン（ｈＧＨｖ）ポリＡシグナルドメインまたはその改変体を含む発現カセットを提供する。ポリＡシグナルドメインまたはその改変体は、少なくとも１００ヌクレオチド長であり、かつ、配列ＡＡＴＡＡＡを含み、そしてｈＧＨｖポリＡシグナルドメインと少なくとも９２％同一である。
【０００７】
本発明はまた、ヒトＣＭＶ最初期１（ｈＣＭＶ ＩＥ１）プロモーター／エンハンサー領域、スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位を含む可変長介在配列（ＶＬＩＶＳ）、目的のポリヌクレオチド、クローニング部位、ｈＧＨポリアデニル化領域および選択マーカーを含む発現ベクターを提供する。本発明の１つの局面において、ｈＣＭＶ Ｅ１プロモーター／エンハンサー領域は、クローニング部位の上流（５’）であり、そしてｈＧＨポリアデニル化領域は、クローニング部位の下流（３’）である。
【０００８】
本発明はまた、インビボにおいて目的の因子を送達する方法を含む。この方法は、被験体に対して、発現カセットを含む組成物を送達する工程を包含し、この発現カセットは、ｈＣＭＶ ＩＥ１プロモーター／エンハンサー領域；スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位を含む可変長介在配列；目的の因子をコードするポリヌクレオチド；およびヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリＡシグナルドメインまたはその改変体を含む。
【０００９】
本発明はさらに、発現系を含む。この発現系は、本発明の発現カセットを用いてトランスフェクトまたは形質転換された宿主細胞を含み、この宿主細胞は、目的のポリヌクレオチドを発現するような条件下で培養され、そして目的の因子を回収する。
本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、添付の図面および以下の説明に示される。本発明の他の特徴、対象および利点は、明細書および図面、および添付の特許請求の範囲から明らかである。本明細書中に引用される全ての参考文献は、参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、ｐＶ１０ベクターのプラスミドマップである。サイトメガロウイルス最初期１（ＣＭＶ ＩＥ１）プロモーター／イントロン（ＩＶＳ）を、ＰＣＲにより作製し、ＨｉｎｄＩＩＩ部位およびＢａｍＨＩ部位にクローニングした。アンピシリン耐性遺伝子である、β−ラクタマーゼ（ｂｌａ）がまた示される。
【図２】図２は、ｐＶ４０のプラスミドマップである。サイトメガロウイルス最初期１（ＣＭＶ ＩＥ１）プロモーター、イントロン（ＩＶＳ）、長さ約６００塩基対のｈＧＨｖポリアデニル化シグナルドメイン（ポリＡ）、およびアンピシリン耐性遺伝子であるβ−ラクタマーゼ（ｂｌａ）が示される。
【図３】図３は、プラスミドｐＶ７０の模式図である。ＣＭＶ ＩＥ１プロモーター、欠失接合部、ならびにスプライスドナー（ＳＤ）部位およびスプライスアクセプター部位を含むＩＶＳ、ｈＧＨｖポリＡシグナルドメイン、ならびにｂｌａ遺伝子が示される。欠失接合部は、ＢｓｐＥ１’／’ＨｐａＩの平滑末端ライゲーションの結果を表す。
【図４】図４は、ｐＸＬＣ．１ベクターの作製の模式図である。ｐＸＬＣ．１ベクターは、発現ベクターｐＶ７０、および軽鎖コード配列を含むＰＣＲ産物を使用して構築した。ｐＶ７０をＢａｍＨＩで直線化し、ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩで消化し、そして、この２つを、一緒に連結して、ｐＸＬＣ．１ベクターを作製した。
【図５】図５は、ｐＸＬＣ．２ベクターの作製の模式図である。
【図６】図６は、ｐＶ６０ベクター、およびｐＸＨＣベクターの作製の模式図である。ｐＸＨＣベクターは、発現ベクターｐＶ６０、および重鎖コード配列の大部分（Ｎ末端の５２アミノ酸は含まれなかった）を含むＰＣＲ産物を使用して構築した。ｐＶ６０をＢａｍＨＩで直線化し、ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩで消化し、そして、この２つを一緒に連結した。
【図７】図７は、ｐＸＨＣ．１ベクターの模式図である。
【図８】図８は、ｐＸＨＣ．３ベクターの模式図である。
【図９】図９は、ｐＸＨＣ．３へのｄｈｆｒカセットの追加により得た、ｐＸＨＣ．５ベクターの模式図である。発現カセットの制御エレメントｔは、ｐＳＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｕ４７１２１）に由来し、そして、ＳＶ４０プロモーター／エンハンサー、人工イントロン、およびＳＶ４０後期ポリアデニル化配列を含む。
【図１０】図１０は、ベクターｐＶ８０の模式図である。サイトメガロウイルス最初期１（ＣＭＶ ＩＥ１）プロモーター／スプライスドナー（ＳＤ）部位およびスプライスアクセプター（ＳＡ）部位を含むイントロン（ＩＶＳ）フラグメント、ｈＧＨｖポリアデニル化シグナルドメイン（ポリＡ）、アンピシリン耐性遺伝子であるβ−ラクタマーゼ（ｂｌａ）、ＳＶ４０プロモーター／エンハンサー、人工イントロン、ならびにＳＶ４０後期ポリアデニル化配列が示される。
【図１１Ａ】図１１Ａおよび図１１Ｂは、ベクターｐＶ９０の模式図および対応する注釈つきの配列である。図１１Ａは、ベクターマップである。サイトメガロウイルス最初期１（ＣＭＶ ＩＥ１）プロモーター／スプライスドナー（ＳＤ）部位およびスプライスアクセプター（ＳＡ）部位を含むイントロン（ＩＶＳ）フラグメント、ｈＧＨｖポリアデニル化シグナルドメイン（ポリＡ）、アンピシリン耐性遺伝子であるβ−ラクタマーゼ（ｂｌａ）、ＳＶ４０プロモーター／エンハンサー、人工イントロン、ならびにＳＶ４０後期ポリアデニル化配列が示される。このベクターは、ｄｈｆｒ発現カセット内のＮｏｔＩ部位を欠く。
【図１１Ｂ−１】図１１Ａおよび図１１Ｂは、ベクターｐＶ９０の模式図および対応する注釈つきの配列である。図１１Ｂは、ｐＶ９０ベクターの注釈つきの配列である。図１１Ｂにおいて、配列番号１９のヌクレオチド１２７５〜１８６６は、約６００ヌクレオチド長のｈＧＨｖポリＡを表す。
【図１１Ｂ−２】図１１Ａおよび図１１Ｂは、ベクターｐＶ９０の模式図および対応する注釈つきの配列である。図１１Ｂは、ｐＶ９０ベクターの注釈つきの配列である。図１１Ｂにおいて、配列番号１９のヌクレオチド１２７５〜１８６６は、約６００ヌクレオチド長のｈＧＨｖポリＡを表す。
【図１２】図１２は、ｐＳＩ−ＤＨＦＲのベクターマップである。ＳＶ４０プロモーターがｄｈｆｒ遺伝子を駆動する。
【図１３】図１３は、トランスフェクトされたプールの相対特異的生産性を示すグラフである。３つのプールを、ｐＣＭＶ−ｈＧＨｖＰＡ−ＳＥＡＰおよびｐＳＥＡＰ２について、そして１つはｐＵＣ１８について分析した。
【図１４】図１４は、単離体の相対特異的生産性を示す一対のグラフである。各構築物からの上位２０の単離体が、ランク順に示される。
【図１５】図１５は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｋ００４７０（配列番号１８）の配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（詳細な説明）
本発明は、発現カセット、および発現カセットを含むベクターに関する。発現カセットは、真核生物宿主における転写を駆動し得る転写調節性領域、および転写終止領域を含む。本発明の発現カセットおよび発現ベクターは、強力な転写の開始および終止、ならびに、転写産物の増加したｍＲＮＡ安定性を提供する。
【００１２】
本発明は、プロモーターエレメント、および、必要に応じて、例えば、本明細書中もしくは米国特許第５，６５８，７５９号（その開示は、本明細書中に参考として援用される）のような参考文献に記載されるような、サイトメガロウイルスの任意の株に由来するエンハンサーエレメントを提供する。例えば、本発明の発現カセットにおいて有用な安定なＣＭＶ最初期プロモーター領域は、ＣＭＶが促進するβ−ガラクトシダーゼ発現ベクター、ＣＭＶ（ＭａｃＧｒｅｇｏｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：２３６５（１９８９））から得られ得る。
【００１３】
本明細書中でさらに議論されるように、ｈＧＨｖポリアデニル化シグナルドメインは、強力な転写終止シグナルを提供し、そして、ｍＲＮＡ転写物の安定性を増加させる。調節性／発現エレメントは、例えば、目的のポリヌクレオチドまたはクローニング部位（例えば、マルチクローニング部位）によってｈＧＨｖポリアデニル化シグナルドメインから分離され得る。
【００１４】
本発明の１つの局面において、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）転写調節性領域、可変長介在配列（例えば、ＣＭＶのイントロンＡに由来する）、目的のポリヌクレオチド、およびポリアデニル化シグナルドメインを含むポリヌクレオチドが提供される。本発明はさらに、宿主細胞から異種性のポリペプチドを産生および回収するためのプロセスおよび発現ベクターに関する。
【００１５】
別の局面において、本発明の発現カセットは、必要に応じて連結された、（ｉ）ＣＭＶ主要最初期１（ＩＥ１）プロモーター／エンハンサー領域および可変長介在配列（例えば、イントロンＡの誘導体）、（ｉｉ）目的のポリヌクレオチド、および（ｉｉｉ）ｈＧＨｖポリアデニル化シグナルドメインを含む。用語「必要に応じて連結された」とは、成分がその意図された様式（例えば、機能的に連結される）で機能することを可能にする関係にある、近位を指す。従って、例えば、目的のポリヌクレオチドに必要に応じて連結されたプロモーター／エンハンサーは、目的のポリヌクレオチドの発現が、プロモーター／エンハンサーからの発現の達成と適合する条件下で達成されるように、後者に連結される。
【００１６】
本発明の特定の実施形態において、発現カセットは、配列番号１の約ヌクレオチド１〜約ヌクレオチド１８６７に示される配列（例えば、約１〜１８６５、１８６６、１８６７、１８６８または１８６９）を含む。配列番号１のヌクレオチド１〜１８６７に示される発現カセットは、配列番号１の約ｘ１〜約ｘ２に示される配列を有するＣＭＶ ＩＥ１プロモーター／エンハンサーのような多数の別個のドメインを含み、ここで、ｘ１は、１〜２０のヌクレオチドであり、そしてｘ２は約７１５〜７２０のヌクレオチドである（例えば、配列番号１の約１〜７１９）。発現カセットの別のドメインは、スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位を含む可変長介在配列（ＶＬＩＶＳ）を含む。ＶＬＩＶＳは、少なくとも５０ｂｐ長（例えば、少なくとも１００ｂｐ長、１５０ｂｐ長、２００ｂｐ長または２５０ｂｐ長）であり得、かつ、当該分野で公知の任意の供給源に由来するスプライスドナーおよびスプライスアクセプターを含み得る。例えば、Ｖａｒａｎｉら、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｔｒｕｃｔ ２７：４０７−４５（１９９８）およびＫｏｎｉｎｇ，Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２１９：２５−４２（１９９４）を参照のこと。適切な介在ドメインは、任意の株のＣＭＶゲノムの全てのイントロンＡを含み得るか、または、スプライスアクセプター部位を含む３’配列に連結されたスプライスドナー部位を含む５’配列を含むより小さなフラグメントを含み得る。例えば、ＶＬＩＶＳは、配列番号１の約ｘ３〜約ｘ４のヌクレオチドを含み、ここで、ｘ３は、７１５〜７２０のヌクレオチドであり、そしてｘ４は１２３６〜１２５４のヌクレオチドである（例えば、配列番号１の７１９〜１２３６）。ＣＭＶ ＩＥ１プロモーター／エンハンサーに続く介在配列は、配列番号１に存在するものに由来する３１７ヌクレオチド程度のサイズで変化し得る。例えば、３１７ヌクレオチドは、ｐＶ４０およびｐＶ７０（例えば、それぞれ、図２および３を参照のこと）に示されるようなＩＶＳ配列から欠失された。従って、本発明の別の局面において、発現カセットは、配列番号１の１〜約１２５４のヌクレオチドに由来する配列（例えば、ＣＭＶ ＩＥ１プロモーター／エンハンサーおよび介在配列）を含む。マルチプルクローニング部位は、ＩＶＳ領域の後（すなわち下流）に存在し得る（例えば、配列番号１の１２５５〜１２７２のヌクレオチドは、ＢａｍＨＩ部位およびＮｏｔＩ部位を含む）。異なる制限部位またはさらなる制限部位は、当業者に公知の技術を用いて発現カセット中で遺伝子操作され得る。発現カセットはさらに、ポリＡドメインを含む。
【００１７】
ポリＡシグナルドメインは、ｈＧＨｖ遺伝子に由来し、例えば、対立遺伝子ごとに、その３’ＵＴＲ配列が変化し得る。ｈＧＨｖ遺伝子の片側の対立遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｋ００４７０（配列番号１８）に記載され、一方で、もう片側の配列は、図１１Ｂに配列番号１９として記載され、これは、配列番号１８のヌクレオチド２０３２〜２６２５に対応する（図１５を参照のこと）。ポリＡシグナルドメインの天然に存在しない改変体は、ポリヌクレオチド、細胞または生物体に適用される技術を含む変異誘発技術によってなされ得る。ｈＧＨｖ遺伝子に由来するポリＡ改変体は、野生型のｈＧＨｖポリＡシグナルドメインとは異なり、なお、シグナル転写終止に対する能力を保持し、そして／またはｍＲＮＡを安定化させる、ポリＡシグナルドメインを含む。例えば、ポリアデニル化シグナルドメインとしては、配列番号１８または１０に示されるようなｈＧＨｖポリアデニル化シグナルドメイン配列が挙げられ得る。分子生物学の当業者はまた、この配列が、約６００ヌクレオチド程度の長さである必要はないことを理解する。むしろ、少なくとも１００ｎｔ（例えば、少なくとも２００ｎｔ、３００ｎｔ、４００ｎｔ、５００ｎｔ、または６００ｎｔ）の連続したヌクレオチド配列を含み、ｈＧＨｖ遺伝子の基準のＡＡＴＡＡＡ部位を含む、任意のポリＡ配列ドメインが含まれる。さらに、本発明は、上記の配列から、８％まで異なる（例えば、配列番号１８もしくは１９、またはその別個のドメインと９２％の同一性を有する）配列を包含する。例えば、配列番号１のヌクレオチド１〜１８６７と９５％の同一性を有し、かつ配列ＡＡＴＡＡＡを含む１００ｎｔの長さのポリヌクレオチドは、転写を終結させる能力を保持する。
【００１８】
本発明の別の局面において、発現カセットを含むベクターが提供される。本明細書中で使用される場合、「ベクター」は、レシピエント細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌）への導入の際に、自律的な複製が可能な核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）である。プラスミド、ウイルスおよびバクテリオファージが、ベクターの例である。発現ベクターからの「発現」のプロセスは周知であり、細胞の酵素の使用、および目的のポリヌクレオチドからの発現産物を生じるプロセスを含む。発現ベクターは、宿主細胞内にクローニングされたポリヌクレオチドの発現を媒介し得るベクターであり、この宿主細胞は、ベクターの複製または増殖に使用されるのと同じ型の細胞であっても、そうでなくともよい。多くの哺乳動物発現ベクターは、一般的な細菌（レシピエント細胞）において増殖され得るが、哺乳動物細胞（宿主細胞）において目的のポリヌクレオチドを発現するが、細菌においては、発現しない。
【００１９】
本発明は、真核生物細胞（例えば、哺乳動物、および、最も具体的には、ヒト、マウス、サル、ウシ、ブタ、げっ歯類、またはヒツジの細胞）における、効率的なポリヌクレオチドの転写および翻訳を可能にし得る、ベクターの設計および使用に関する。本発明のベクターは、効率的な転写の終結とｍＲＮＡの安定性を提供する、ポリアデニル化シグナルドメインを含む上記に示されるような発現カセットを含む。
【００２０】
本発明のベクターは、以下を含む：目的のポリヌクレオチドを受容するためのクローニング部位；宿主細胞において、クローニング部位に挿入されたポリヌクレオチドの転写を可能にするのに十分な転写調節性エレメント（例えば、ＣＭＶ ＩＥ１プロモーター／エンハンサー領域）；宿主細胞において上記ポリヌクレオチドのＲＮＡ転写物の翻訳を可能するのに十分な翻訳エレメント、および（所望される場合）宿主細胞またはベクターの増殖に使用される別のレシピエント細胞において上記ベクターの複製を可能にするのに十分な複製エレメント。本発明のベクターは、このような宿主細胞における一過性の発現か、または安定な発現を調節し得る。
【００２１】
特定の実施形態において、本発明のベクターは、（１）配列番号１に示される配列；（２）配列番号１に示される配列に相補的な配列；（３）配列番号１またはその相補体に少なくとも８０％（好ましくは、少なくとも９０％；少なくとも９５％；少なくとも９８％または少なくとも９９％）同一な配列；または（４）配列番号１の約ヌクレオチド１〜約ヌクレオチド１８６７を含み、かつ目的のポリヌクレオチドおよび／または選択マーカーを含むベクター。
【００２２】
配列番号１を含むベクターは、多数の別個のドメインおよびコード領域を有する。例えば、配列番号１の約ｘ１〜約ｘ２に示される配列を有するＣＭＶ ＩＥ１プロモーター／エンハンサー領域（ここで、ｘ１は１〜２０のヌクレオチドであり、そしてｘ２は約７１５〜７２０のヌクレオチドである（例えば、配列番号１の約１〜７１９））が、ベクター中に存在する。本発明の発現ベクターの別のドメインは、スプライスドナーおよびスプライスアクセプターを含む可変長介在配列（ＶＬＩＶＳ）を含む。例えば、ＩＶＳは、配列番号１の約ｘ３〜約ｘ４のヌクレオチドを含み、ここで、ｘ３は７１５〜７２０のヌクレオチドを含み、そしてｘ４は１２３６〜１２５４のヌクレオチドを含む（例えば、配列番号１の約７１９〜約１２３６のヌクレオチド）。発現ベクターのマルチプルクローニング部位は、配列番号１の１２５５〜１２７２のヌクレオチド（例えば、ＢａｍＨＩ部位およびＮｏｔＩ部位）を含む。異なる制限部位または追加の制限部位が、当業者に公知の技術を使用して発現ベクター内で遺伝子操作され得る。発現ベクターはさらに、ポリＡシグナルドメインを含む。ポリＡシグナルドメインは、ｈＧＨｖポリＡシグナルドメインであるか、または、ｈＧＨポリＡシグナルドメインの他の改変体である。例えば、ポリＡシグナルドメインは、配列番号１９に示されるｈＧＨｖポリＡシグナルドメイン配列を含む。また、１つ以上の選択マーカーが、本発明のベクター中に存在する。例えば、配列番号１は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺伝子（例えば、配列番号１のヌクレオチド約２５６８〜ヌクレオチド約３１３２）を含む。本発明のベクターは、上に提供されるものに加えて、追加のプロモーター／エンハンサーエレメントおよび調節性エレメント（例えば、ポリアデニル化ドメイン）を含み得る。このような追加の調節性エレメントおよびポリアデニル化ドメインは、選択マーカーまたは目的のポリヌクレオチド（例えば、５’および３’に直ぐ近接して）に隣接し得る。例えば、配列番号１を含むベクターは、配列番号１のヌクレオチド約２５６８〜ヌクレオチド約３１３２のジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺伝子を含む。ｄｈｆｒ遺伝子は、ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーエレメントおよびＳＶ４０ポリアデニル化領域（例えば、それぞれ、配列番号１のヌクレオチド約１８６８〜ヌクレオチド約２２１０およびヌクレオチド約３１４４〜ヌクレオチド約３４４０）によって隣接される。
【００２３】
選択マーカーの特定の例は、メトトレキサートに対する耐性を与えるＤＨＦＲタンパク質（Ｗｉｇｌｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：３５６７（１９８０）；Ｏ’Ｈａｒｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８
１５２７（１９８１））；ミコフェノール酸に対する耐性を与えるＧＰＦタンパク質（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ＆ Ｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：２０７２（１９８１））；アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を与えるネオマイシン耐性マーカー（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１（１９８１））；ハイグロマイシンに対する耐性を与えるＨｙｇｒｏタンパク質（Ｓａｎｔｅｒｒｅら，Ｇｅｎｅ ３０：１４７（１９８４））；およびＺｅｏｃｉｎＴＭ耐性マーカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから市販されている）のような、細胞増殖抑止薬もしくは細胞傷害薬に対する耐性を与えるタンパク質をコードするものである。さらに、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら，Ｃｅｌｌ １１：２２３（１９７７））、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ ＆ Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
４８：２０２６（１９６２））およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら，Ｃｅｌｌ ２２：８１７（１９８０））が、それぞれｔｋ−細胞、ｈｇｐｒｔ−細胞、またはａｐｒｔ−細胞において使用され得る。他の選択マーカーは、ピューロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼまたはアデノシンデアミナーゼをコードする。
【００２４】
２つ以上の核酸分子の文脈において、用語「同一」または％「同一性」とは、比較アルゴリズムを使用するか、または手動での整列および視覚的な検査によって決定すると、比較ウィンドウにわたる、最大の一致について比較および整列した場合に、同じであるか、または、同じであるヌクレオチドの特定の割合を有する、２つ以上の配列もしくは下位配列を指す。この定義はまた、配列の相補体（例えば、配列番号１に示される配列の相補体、または発現カセットを含むそのフラグメント）も指す。例えば、発現カセットおよびそのフラグメントは、配列番号１の一部と少なくとも約８０％同一、約９０％同一および約９５％同一、約９７％同一、約９８％同一、または約９９％同一である、ヌクレオチド配列同一性を有するもの（例えば、配列番号１のヌクレオチド１〜７１９、１〜１２５４など）を含む。従って、配列が、配列番号１の全長配列またはそのドメインに対して必須の配列同一性を有する場合、この配列がまた、それぞれ、本発明の発現カセットまたはドメインとして機能し得る。
【００２５】
配列比較について、代表的には、１つの配列は、参照配列として機能し、この配列に対して、試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列がコンピュータに入力され、必要に応じて下位配列の座標が指定され、そして、配列アルゴリズムプログラムのパラメータが指定される。デフォルトのプログラムパラメータを使用しても、代替のパラメータを指定してもよい。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたか、またはデフォルトのプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の％配列同一性を算出する。本明細書中で使用される場合、「比較ウィンドウ」は、２５〜６００、通常は約５０〜約２００、より通常は約１００〜約１５０からなる群より選択される連続する位置の数のいずれか１つのセグメントに対する参照を含み、ここで、２つの配列が最適に整列された後に、１つの配列が、同じ数の連続する位置の参照配列に対して比較され得る。比較のための配列の整列方法は、当該分野で周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）による部分相同性アルゴリズムによってか、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）による相同性アラインメントアルゴリズムによってか、Ｐｅａｒｓｏｎ
＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似法についての検索によってか、３つのアルゴリズムのコンピュータ実行（ＧＡＰ、ＩＬＥＵＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によってか、または、手動の整列および視覚的な検査によって行なわれ得る。
【００２６】
％配列同一性（すなわち、実質的な類似性または同一性）を決定するために適切なアルゴリズムの１つの例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、これは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０に記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を行なうためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ワールドワイドウェブ上、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／にある）から公的に利用可能である。このアルゴリズムは、クエリー配列中の長さＷの短いワードを同定することによって、高いスコアの配列対（ＨＳＰ）をまず同定することを含み、これらのワードは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列する場合に、いくらかポジティブな値の閾値スコアＴと適合するか、これを満たすかのいずれかである。「Ｔ」は、隣接するワードスコア閾値として呼ばれる。これらの最初の隣接するワードヒットは、これらを含むより長いＨＳＰを見出すための検索を開始するための種として機能する。次いで、ワードヒットが連続するアラインメントスコアが増やされ得る距離にわたって、各配列に沿って両方向に延ばされる。連続スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメータＭ（適合した残基対に対する報酬スコア；常に＞０）およびＮ（適合しなかった残基に対する罰則スコア；常に＜０）を使用して計算される。各方向におけるワードヒットの延びは、以下の場合休止される：連続アラインメントスコアが、その最大達成値から量Ｘだけ落ちる場合；１つ以上のネガティブなスコア付けの残基アラインメントの蓄積に起因して連続スコアが０以下になる場合；または、いずれかの配列の末端に到達した場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。１つの実施形態において、核酸配列が本発明の範囲内であるかどうかを決定するために、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４および両方の鎖の比較を組み込んで、（ヌクレオチド配列のための）ＢＬＡＳＴＮプログラムが使用される。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムが、デフォルトパラメータとして、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）およびＢＬＯＳＵＭ６２スコア付けマトリクス（例えば、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５，１９８９を参照のこと）を使用する。
【００２７】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計学的解析を実施する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７，１９９３を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの指標は、最小サム確率（ｓｍａｌｌｅｓｔ ｓｕｍ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間での適合が偶然生じる可能性の指標を提供する。例えば、核酸は、試験核酸の参照核酸に対する比較における最小サム確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、そして最も好ましくは約０．００１未満である場合に、参照配列と類似するとみなされる。
【００２８】
配列番号１のヌクレオチド約１〜１８６７に示されるポリヌクレオチド配列またはそのフラグメントに特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドもまた本発明に含まれる。句「選択的に（または特異的に）ハイブリダイズする」とは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下での、特定の参照ポリヌクレオチドに対する分子の結合、二重化、またはハイブリダイゼーションを指す。句「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、プローブがその標的配列（代表的には、核酸の複合混合物中にある）に主にハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしない条件である。ストリンジェントな条件は、例えば、プローブの長さに依存して、配列依存性であり、かつ、環境ごとに異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範なガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ｐｒｏｂｅｓ，「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ
ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｓｓａｙｓ」（１９９３）において見出される。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨにおいて、特定の配列についての熱融点（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低く選択される。Ｔｍは、平衡状態で、（規定されたイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度下で）標的に対して相補的なプローブの５０％が、標的配列にハイブリダイズする（Ｔｍにおいて標的配列が過剰に存在する場合、平衡状態において、プローブの５０％が占有される）温度である。ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３において、塩濃度が、約１．０Ｍのナトリウムイオンより少なく（代表的には、約０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオン濃度）（または他の塩）、かつ、温度が、短いプローブ（例えば、１０〜約５０のヌクレオチド）については少なくとも約３０℃、そして長いプローブ（例えば、約５０より大きいヌクレオチド）については少なくとも６０℃である、条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような撹乱物質の添加により達成され得る。選択的または特異的なハイブリダイゼーションについて、ポジティブなシグナル（例えば、本発明の核酸の同定）は、バックグラウンドのハイブリダイゼーションの約２倍である。本発明の範囲内の実質的に同一な核酸を同定するために使用される「ストリンジェントな条件」は、長いプローブについて、４２℃と６５℃との間の温度において、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣおよび１％ ＳＤＳを含む緩衝液中でのハイブリダイゼーション、６５℃において、０．２×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳ中での洗浄を含む。しかし、当業者に明らかなように、ハイブリダイゼーション条件は、配列組成に依存して改変され得る。例示的な「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、３７℃における４０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌおよび１％ ＳＤＳの緩衝液中でのハイブリダイゼーション、および４５℃における１×ＳＳＣ中での洗浄を含む。ポジティブなハイブリダイゼーションは、バックグラウンドの少なくとも２倍である。当業者は、代替のハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件が、同様のストリンジェンシーの条件を提供するために利用され得ることを容易に理解する。従って、本発明の発現カセットは、高いストリンジェンシーの条件下で、配列番号１８または１９のヌクレオチド配列を含むｓｓＤＮＡにハイブリダイズするｈＧＨｖポリＡシグナルドメインを含み得る。
【００２９】
発現カセットは、裸の核酸構築物の形態で使用され得る。あるいは、発現カセットは、核酸ベクター（例えば、上記のような発現ベクター）の一部として導入され得る。このようなベクターとしては、プラスミドベクターおよびウイルスベクターが挙げられる。ベクターは、真核生物のゲノム配列（例えば、哺乳動物のゲノム配列またはウイルスのゲノム配列）と相同な配列を含む、発現カセットに隣接する配列を含み得る。これは、真核生物細胞またはウイルスのゲノムへのこの発現カセットの相同組換えによる導入を可能にする。例えば、ウイルス配列により隣接された発現カセットを含むプラスミドベクターは、脊椎動物（魚類、鳥類または哺乳動物を含む）の細胞にこの発現カセットを送達するために適切なウイルスベクターを調製するために使用され得る。用いられる技術は、当業者に周知である。
【００３０】
用語「目的のポリヌクレオチド」は、少なくとも転写され得る核酸分子を包含することが意図される。この分子は、プロモーターに関して、センス配向であってもアンチセンス配向であってもよい。アンチセンス構築物は、周知の技術に従って、細胞における遺伝子の発現を阻害するために使用され得る。目的のポリヌクレオチドは、異種性のポリヌクレオチドを含み得る。用語異種性のポリヌクレオチドは、任意の遺伝子を包含する。異種性のポリヌクレオチドは、代表的には、発現カセットもしくは発現ベクターにおいて、そのポリヌクレオチドが作動可能に連結されている調節性エレメントと比べて外来の種に由来するか、または、同じ起源に由来する場合、その本来の形態から改変された遺伝子である。従って、プロモーターに作動可能に連結された異種性のポリヌクレオチドは、そのプロモーターが由来する供給源とはことなる供給源に由来するか、または、同じ供給源に由来する場合は、その本来の形態から改変されたプロモーターである。異種性のポリヌクレオチドの改変は、例えば、ＤＮＡを制限酵素で処理して、プロモーターに作動可能に連結され得るＤＮＡフラグメントを作製することによって生じ得る。特定部位の突然変異誘発がまた、異種性のポリヌクレオチドを改変するのに有用である。異種性のポリヌクレオチドはまた、マーカー遺伝子（例えば、β−ガラクトシダーゼまたは緑色蛍光タンパク質をコードするもの）、または、その生成物が他の遺伝子の発現を調節する遺伝子を含み得る。従って、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｒＲＮＡのための鋳型として機能するポリヌクレオチドが、この定義の中に含まれる。異種性の遺伝子は、野生型遺伝子の任意の対立遺伝子変異体であっても、変異体遺伝子であってもよい。ｍＲＮＡは、天然に、またはその他の方法により、翻訳されたコード配列に付随する、転写されたが翻訳されてない、５’および／または５’の隣接領域のいくつかまたは全てを必要に応じて含む。
【００３１】
目的のポリヌクレオチドは、必要に応じてさらに、転写された分子に通常付随する、関連の転写制御エレメント（例えば、転写終止シグナル、ポリアデニル化ドメインおよび下流のエンハンサーエレメント）を含み得る。目的のポリヌクレオチドは、治療用生成物のための鋳型をコードし得るか、または鋳型として機能し得、治療用生成物は、例えば、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質またはリボ核酸であり得る。目的のポリヌクレオチドは、代表的には、酵素（例えば、β−ガラクトシダーゼ）；血液誘導体；ホルモン；サイトカイン；インターロイキン；インターフェロン；ＴＮＦ；増殖因子（例えば、ＩＧＦ−１）；可溶性レセプター分子（例えば、可溶性ＴＮＦレセプター分子）；神経伝達物質またはその前駆物質；栄養性因子（例えば、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＧＦ、ＩＧＦ、ＧＭＦ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＮＴ３およびＮＴ５）；アポリポタンパク質（例えば、ＡｐｏＡＩおよびＡｐｏＡＩＶ）；ジストロフィンまたはミニジストロフィン；腫瘍抑制タンパク質（例えば、ｐ５３、Ｒｂ、ＲａｐＩＡ、ＤＣＣおよびｋ−ｒｅｖ）；凝血関連因子（例えば、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子）；あるいは、天然もしくは人工の免疫グロブリンの全てもしくは一部（例えば、ＦａｂおよびＳｃＦｖ、または、クローニングされたＩｇＧの軽鎖および重鎖）のようなポリペプチド生成物をコードするＤＮＡ配列（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）である。
【００３２】
目的のポリヌクレオチドはまた、アンチセンス分子の作製のための鋳型を含み得、標的細胞におけるこの転写物が、遺伝子発現または細胞内ｍＲＮＡの転写を制御し得る。このような分子は、例えば、標的細胞において、細胞のｍＲＮＡに相補的なＲＮＡに、転写され、当該分野で公知の技術に従って、そのタンパク質への翻訳をブロックし得る。特に、アンチセンス分子は、関節炎の処置における炎症性サイトカインまたは異化サイトカインの翻訳、および、これらのサイトカインにより引き起こされる組織の喪失をブロックするために使用され得る。
【００３３】
目的のポリヌクレオチド配列は、代表的には、診断用途または治療用途のポリペプチドをコードする。ポリペプチドは、本発明の発現カセットを含有する種々の宿主細胞（例えば、ＣＯＳ細胞もしくはＣＨＯ細胞、またはその誘導体）を使用して、インビトロでバイオリアクターにおいて産生され得る。あるいは、本発明の発現カセットおよび／またはベクターは、遺伝子送達、タンパク質送達および／または遺伝子治療のために使用され得る。
【００３４】
本発明はまた、毒性の因子およびポリペプチドの発現のために使用され得る。後者は特に、細胞毒素（例えば、ジフテリア毒素、シュードモナス毒素およびリシンＡ）、外来因子（例えば、チミジンキナーゼおよびシトシンデアミナーゼ）に対する生成物誘導性の感受性、あるいは、細胞死を誘導し得る因子（例えば、Ｇｒｂ３−３および抗−ｒａｓ ＳｃＦｖ）であり得る。
【００３５】
治療的用途により、疾患もしくは障害からの救済を提供し得、疾患もしくは障害を治癒し得、そして／または疾患もしくは障害の重篤度を軽減し得る用途が意味される。診断的用途は、分子の疾患プロセスに対する原因または関係性に関する情報を決定または提供し得る分子の使用、疾患もしくは障害の存在もしくは非存在を決定することを含む。診断剤は、疾患もしくは障害の軽減に直接は寄与しない。
【００３６】
目的のポリヌクレオチドはまた、ワクチンとしての用途のための抗原性ポリペプチドをコードし得る。抗原性のポリペプチドまたは核酸分子は、例えば、細菌またはウイルスのような病原性生物に由来する。例えば、抗原性ポリペプチドは、病原性生物（例えば、出血性敗血症ウイルス、腎臓病細菌、ビブリオおよびフルンケル症）のゲノムもしくは遺伝子産物に存在する抗原性決定基を含む。抗原性ポリペプチドは、例えば、Ｃ型肝炎ウイルスのゲノムおよび遺伝子産物の領域から選択され得る。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、例えば、本発明のベクターもしくは発現カセット、または目的のポリヌクレオチドのような、分子もしくは組成物に対して言及する場合、「単離された」とは、分子または組成物が、インビボにおいて、またはその天然に存在する状態において関連する、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは他の汚染物質のような、少なくとも互いの化合物から分離されていることを意味する。従って、目的のポリヌクレオチドは、天然に関連する任意の他の成分から単離されている場合、単離されているとみなされる。しかし、単離された組成物はまた、実質的に純粋であり得る。単離された組成物は、均質な状態であり得る。単離された組成物は、乾燥／凍結されているか、または、水溶液であり得る。純度および均質性は、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、アガロースゲル電気泳動、または高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のような分析化学技術を使用して決定され得る。
【００３８】
本明細書中で使用される場合、用語「核酸分子」および「ポリヌクレオチド」は、交換可能に使用され、そして、オリゴヌクレオチド（すなわち、短いポリヌクレオチド）を含む。これらはまた、合成および／または天然に存在しない核酸分子（例えば、ヌクレオチドアナログまたは改変骨格残基もしくは結合を含む）を指す。この用語はまた、一本鎖形態または二本鎖形態のいずれかのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを指す。この用語は、天然のヌクレオチドのアナログを含む核酸を包含する。この用語はまた、合成骨格を有する核酸様構造を包含する。本発明により提供されるＤＮＡ骨格アナログとしては、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチル−ホスホネート、ホスホラミデート、アルキルホスホトリエステル、スルファメート、３’−チオアセタール、メチレン（メチルイミノ）、３’−Ｎ−カルバメート、モルホリノカルバメート、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）；Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ６００，ＢａｓｅｒｇａおよびＤｅｎｈａｒｄｔ編（ＮＹＡＳ １９９２）；Ｍｉｌｌｉｇａｎ（１９９３）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：１９２３−１９３７；Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（１９９３，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）を参照のこと。ＰＮＡは、非イオン性の骨格（例えば、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン単位）を含む。ホスホロチオエート骨格は、ＷＯ ９７／０３２１１；ＷＯ ９６／３９１５４；Ｍａｔａ（１９９７）Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１４４：１８９−１９７に記載される。この用語に包含される他の合成骨格としては、メチル−ホスホネート結合または代替的なメチルホスホネートとホスホジエステルとの結合（Ｓｔｒａｕｓｓ−Ｓｏｕｋｕｐ（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６：８６９２−８６９８）、およびベンジル−ホスホネート結合（Ｓａｍｓｔａｇ（１９９６）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ ６：１５３−１５６）が挙げられる。
【００３９】
本明細書中で使用される場合「組換え体」とは、インビトロにおいて合成されたか、もしくは他の方法により操作されたポリヌクレオチド（例えば、「組換えポリヌクレオチド」）、組換えポリヌクレオチドを使用して細胞もしくは他の生物系において生成物を産生する方法、または、組換えポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド（「組換えタンパク質」）を指す。組換えポリヌクレオチドは、例えば、融合タンパク質の発現のために発現カセットもしくはベクターに連結された、異なる供給源に由来する核酸分子；またはポリペプチドの誘導性もしくは構成的な発現により産生されるもの（例えば、ポリペプチドコード配列のような異種性のポリヌクレオチドに作動可能に連結された本発明の発現カセットまたはベクター）を包含する。
【００４０】
代表的な発現系において、異種性のポリヌクレオチドからのポリペプチドの産生は、調節されていないか、または、異種性のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの上流に作動可能に連結されている転写プロモーターにからの転写を調節することによって調節されているかのいずれかである。しかし、この調節は、適切な転写の終結およびｍＲＮＡ安定性を提供するために、適切に下流に存在しなければならない。本発明の１つの局面において、ヒト成長ホルモン改変体（ｈＧＨｖ）ポリアデニル化（ポリＡ）シグナルドメインは、本発明の発現カセットまたはベクター中に存在する目的のポリヌクレオチドの下流（３’）に提供される。ｈＧＨｖポリＡシグナルドメインは、ヒト成長ホルモンの遺伝子配列番号に由来する配列を含む。ｈＧＨｖポリアデニル化シグナルドメイン配列は、強力な転写の終結を提供し、かつ、真核生物細胞において、ｍＲＮＡの増加した安定性を提供する。このｈＧＨｖポリアデニル化シグナルドメインは、ＣＭＶプロモーター／エンハンサーを利用し得るものを含む、先行技術の発現カセットおよび／またはベクターに対して、特有の利点を提供する。
【００４１】
翻訳エレメントがまた存在し得、これは、ＲＮＡ転写物をタンパク質に翻訳させるのに必須の特定の配列（例えば、リボソーム結合部位および開始コドン）を包含することが意図される。翻訳エレメントはまた、コンセンサス配列、リーダー配列、スプライスシグナルなどを含み得、これらは、翻訳の程度を促進もしくは増強するか、または、発現された産物の安定性を増加するために機能する。例えば、ｈＧＨｖポリアデニル化シグナルドメインは、増加したｍＲＮＡ安定性を提供する。本発明のベクターは、付属的な転写領域（例えば、イントロン、ポリアデニル化シグナル、Ｓｈｉｎｅ／Ｄａｌｇａｍｏ翻訳シグナルおよびＫｏｚａｋコンセンサス配列）を保有し得る（Ｓｈｉｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）７１：１３４２−１３４６（１９７４）；Ｋｏｚａｋ，Ｃｅｌｌ ４４：２８３−２９２（１９８６））。
【００４２】
用語「複製エレメント」は、レシピエント細胞においてベクターの複製を可能にするのに必須の特定の配列（例えば、複製起点）を包含することが意図される。一般に、このようなベクターは、レシピエント細胞においてベクターの自立的かつ安定な複製を可能にするのに十分な、少なくとも１つの複製起点を含む。
【００４３】
本発明のベクターの選択および維持を容易にするために、１つ以上の選択マーカー（例えば、抗生物質に対する耐性、または、最低量の培地中でか、もしくは、毒性代謝物の存在下において増殖する細胞能を与えるポリヌクレオチド）が、ベクター内に含められ得る。
【００４４】
さらなる実施形態において、本発明は、上記の構築物（例えば、本発明の発現カセットまたはベクター）を含む宿主細胞に関する。本発明の発現カセットは、所望の目的のポリヌクレオチドを発現するように、宿主細胞をトランスフェクトするか、または、宿主細胞を形質転換することによって、宿主細胞を組換え的に修飾するために使用され得る。本明細書中で使用される場合、用語「組換え的に修飾される」とは、本発明の発現カセットまたはベクターを、生細胞または発現系に導入することを意味する。通常、目的のポリヌクレオチドを含む発現カセットが、ベクター（例えば、プラスミド）中に存在する。発現系は、本明細書中に記載されるような、その生成物が発現されるべき目的のポリヌクレオチドが導入されている、生きている宿主細胞を含む。
【００４５】
宿主細胞は、発現カセット（発現カセットを含むベクターを含む）が、増殖され得、かつ、生成物をコードするポリヌクレオチドが発現され得る細胞である。宿主細胞はまた、主体の宿主細胞またはその誘導体の任意の子孫を含む。複製の間に生じる変異が存在し得るので、全ての子孫は、親細胞と同一であるわけではないことが理解される。しかし、このような子孫は、用語「宿主細胞」が使用される場合、含められる。本発明において有用な宿主細胞としては、細菌細胞、真菌細胞（例えば、酵母細胞）、植物細胞および動物細胞が挙げられる。例えば、宿主細胞は、哺乳動物細胞のような高等真核生物細胞であっても、酵母細胞のような下等真核生物細胞であってもよく、そしてまた、宿主細胞は、細菌細胞のような原核細胞生物細胞であってもよい。構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性のトランスフェクション、またはエレクトロポレーションにより達成され得る（Ｄａｖｉｓ，Ｌ．，Ｄｉｂｎｅｒ，Ｍ．，Ｂａｔｔｅｙ，Ｉ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６））。適切な宿主の代表例として、以下が言及され得る：酵母細胞のような真菌細胞；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９のような昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳまたはＢｏｗｅｓ黒色腫のような動物細胞；植物細胞など。適切な宿主の選択は、本明細書中の教示から、当業者の技術範囲内であると判断される。
【００４６】
本発明において使用するための宿主細胞は、真核生物宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞）である。本発明の１つの局面において、宿主細胞は、細胞培養において増殖するように適合された哺乳動物の産生細胞である。産業において一般に使用されるこのような細胞の例は、ＣＨＯ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＶ１細胞（Ｃｏｓ細胞；Ｃｏｓ−７細胞を含む）、ＭＤＣＫ細胞、２９３細胞、３Ｔ３細胞、Ｃ１２７細胞、骨髄腫細胞株（特にマウス）、ＰＣ １２細胞およびＷ１３８細胞である。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、いくつかの複合組換えタンパク質（例えば、サイトカイン、凝固因子および抗体）の産生のために広く使用される（Ｂｒａｓｅｌら，Ｂｌｏｏｄ ８８：２００４−２０１２（１９９６）；Ｋａｕｆｍａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６３：６３５２−６３６２（１９８８）；ＭｃＫｉｎｎｏｎら，Ｊ Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ６：２３１−２３９（１９９１）；Ｗｏｏｄら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １４５：３０１１−３０１６（１９９０））。ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）欠失変異細胞株（Ｕｒｌａｕｂら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７７：４２１６−４２２０（１９８０））は、最適のＣＨＯ宿主細胞株である。なぜならば、有効なＤＨＦＲ選択が可能であり、かつ、増幅可能な遺伝子発現系が、これらの細胞における高レベルの組換えタンパク質発現を可能にするからである（Ｋａｕｆｍａｎ，Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ １８５：５２７−５６６（１９９０））。さらに、これらの細胞は、接着培養物または懸濁培養物として扱いやすく、比較的良好な遺伝的安定性を示す。ＣＨＯ細胞およびこれらにおいて発現される組換えタンパク質は、広範に特徴付けられており、そして、監督官庁によって、臨床用製造における用途について認可されている。さらに、上記の細胞株のいずれかに由来し、所望の表現型を有する宿主細胞がまた使用され得ることが意図される。例えば、派生の宿主細胞としては、（例えば、ポジティブ選択および／またはネガティブ選択のプロセスにより）所望の表現型について選択的に培養されたＣＨＯ細胞（例えば、ＤＧ４４細胞株）が挙げられる。
【００４７】
本発明の１つの局面において、目的のポリヌクレオチドによりコードされる因子のインビトロ産生のための発現系が提供される。本明細書において議論されるように、目的のポリヌクレオチドは、薬学的、医療的、栄養的および／または産業的に価値のあるポリペプチドをコードし得る。例えば、目的のポリヌクレオチドは、ポリペプチドベースの薬物をコードし得る。代表的に、このようなポリペプチドは、細胞外生成物として発現される。例えば、本発明の発現カセットおよび／またはベクターを使用して産生され得るポリペプチドとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：Ｆｌｔ３リガンド、ＣＤ４０リガンド、エリスロポエチン、トロンボポエチン、カルシトニン、Ｆａｓリガンド、ＮＦ−κＢのレセプターアクチベーターに対するリガンド（ＲＡＮＫＬ）、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導性リガンド（ＴＲＡＩＬ）、ＯＲＫ／Ｔｅｋ、胸腺支質由来リンフォポエチン（ｌｙｍｐｈｏｐｏｉｅｔｉｎ）、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、肥満細胞増殖因子、幹細胞増殖因子、上皮増殖因子、ＲＡＮＴＥＳ、成長ホルモン、インシュリン、インシュリノトロピン（ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｎ）、インシュリン様増殖因子、甲状腺ホルモン、インターフェロン（例えば、インターフェロン−β）、神経成長因子、グルカゴン、インターロイキン１〜１８、コロニー刺激因子、リンフォトキシン−β、腫瘍壊死因子、白血病阻害因子、オンコスタチン−Ｍ、細胞表面分子ＥｌｋおよびＨｅｋに対する種々のリガンド（例えば、ｅｐｈ関連キナーゼすなわちＬＥＲＫＳに対するリガンド）、ならびに、抗体軽鎖または重鎖。
【００４８】
上記のタンパク質のいずれかに対するレセプターはまた、本発明の方法および組成物を使用して発現され得、これらとしては、腫瘍壊死因子レセプター（ｐ５５およびｐ７５と呼ばれる）、インターロイキン−１レセプター（１型および２型）、インターロイキン−４レセプター、インターロイキン−１５レセプター、インターロイキン−１７レセプター、インターロイキン−１８レセプター、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子レセプター、顆粒球刺激因子レセプター、オンコスタチン−Ｍおよび白血病阻害因子に対するレセプター、ＮＦ−κＢに対するレセプターアクチベーター（ＲＡＮＫ）、ＴＲＡＩＬに対するレセプター、ＢＡＥＦレセプター、リンフォトキシンβレセプター、ＴＧＦレセプターＩ型およびＩＩ型、ならびに、Ｆａｓもしくはアポトーシス誘導性レセプター（ＡＩＲ）のようなデスドメイン（ｄｅａｔｈ ｄｏｍａｉｎ）を含むレセプターの両方の形態が挙げられる。
【００４９】
本発明の発現カセットおよび／またはベクターを使用して発現され得る他のタンパク質としては、分化抗原のクラスター（ＣＤタンパク質と呼ばれる）（例えば、Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｔｙｐｉｎｇ ＶＩ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ＶＩｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ ａｎｄ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ；Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ，Ｋｉｋｕｔａｎｉら編；Ｋｏｂｅ，Ｊａｐａｎ，１９９６）において開示されるもの）、または、その後のワークショップで開示されたＣＤ分子が挙げられる。このような分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３９、ＣＤ４０およびこれらに対するリガンド（ＣＤ２７リガンド、ＣＤ３０リガンドおよびＣＤ４０リガンド）が挙げられる。これらのいくつかは、ＴＮＦレセプターファミリーのメンバーであり、そしてまた、４１ＢＢおよびＯＸ４０を含む；このリガンドは、しばしば、ＴＮＦファミリーのメンバーであり（４１ＢＢリガンドおよびＯＸ４０リガンドであるので）；従って、ＴＮＦファミリーおよびＴＮＦＲファミリーのメンバーはまた、本発明を使用して発現され得る。
【００５０】
酵素的に活性なポリペプチドがまた、本発明に従って発現され得る。例としては、メタロプロテイナーゼ−ジスインテグリンファミリーメンバー、種々のキナーゼ、グルコセレブロシド、スーパーペルオキシドジスムターゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ａ−１、グロビン、ＩＬ−２アンタゴニスト、α−１アンチトリプシン、ＴＮＦ−α変換酵素（ＴＡＣＥ）、および多数の他の酵素が挙げられる。酵素的に活性なタンパク質のリガンドはまた、本発明のカセットおよびベクターを使用して発現され得る。
【００５１】
本発明の組成物および方法はまた、他の型の組換えタンパク質および組換えポリペプチド（免疫グロブリン分子またはその一部およびキメラ抗体（例えば、マウス抗原結合領域に結合したヒト定常領域）を含む）またはそのフラグメントの発現に有用である。免疫グロブリン分子をコードするＤＮＡを加工して、組換えタンパク質をコードするＤＮＡ（例えば、単鎖抗体、親和性の増強した抗体、または他の抗体ベースのポリペプチド（例えば、Ｌａｒｒｉｃｋら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：９３４−９３８（１９８９）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｒｏｂｅｒｔｓら，Ｎａｔｕｒｅ ３２８：７３１−７３４（１９８７）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）；Ｃｈａｕｄｈａｒｙら，Ｎａｔｕｒｅ ３３９：３９４−３９７（１９８９）を参照のこと））を生じ得る、多数の技術が公知である。クローン化したヒト化抗体としては、リンフォトキシン−βレセプターおよびインテグリン（例えば、ＶＬＡ−１、ＶＬＡ−４およびαｖβ６）に特異的に結合するものが挙げられる。このような抗体は、アゴニストであってもアンタゴニストであってもよい。
【００５２】
種々の融合タンパク質がまた、本発明の方法および組成物を使用して発現され得る。このような融合タンパク質の例としては、免疫グロブリン分子の一部との融合物として発現されるタンパク質、ジッパー部分を有する融合タンパク質として発現されるタンパク質、ならびにサイトカインおよび増殖因子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３、ＭＧＦおよびＩＬ−３）の融合タンパク質のような新規な多機能タンパク質が挙げられる：ＷＯ ９３／０８２０７およびＷＯ ９６／４０９１８は、ＣＤ４０Ｌと呼ばれる分子の種々の可溶性オリゴマー形態の調製を記載し、これらは、それぞれ、免疫グロブリン融合タンパク質およびジッパー融合タンパク質を含み；これらにおいて議論される技術は、他のタンパク質に適用可能である。
【００５３】
一旦目的のポリヌクレオチドが発現されると、発現産物（例えば、タンパク質またはポリペプチド）は、当該分野で標準的な技術を使用して精製され得る。例えば、目的のポリヌクレオチドが精製タグを含む融合ポリペプチドをコードする場合、このポリペプチドは、このタグに特異的に結合する抗体を使用して精製され得る。１つの局面において、タグ分子をコードするオリゴヌクレオチドは、所望のポリペプチドをコードする目的のポリヌクレオチドの５’末端または３’末端において連結されている；このオリゴヌクレオチドは、ポリＨｉｓ（例えば、６Ｈｉｓ）または他の「タグ」（例えば、既存の市販の抗体について、ＦＬＡＧ、ＨＡ（ヘマグルチニンインフルエンザウイルス）またはｍｙｃ）をコードし得る。このタグは、代表的に、ポリペプチドの発現の際に、ポリペプチドに融合し、そして、宿主細胞からの所望のポリペプチドの親和性精製のための手段として機能し得る。親和性精製は、例えば、親和性マトリクスとしてタグに対する抗体を使用するカラムクロマトグラフィーによって達成され得る。必要に応じて、タグは、その後、タンパク質分解性の切断のような種々の手段によって精製したポリペプチドから除去され得る。
【００５４】
本発明の発現カセットおよびベクターは、宿主細胞への目的のポリヌクレオチドの安定な移送を提供するために使用され得る。安定な移送とは、目的のポリヌクレオチドが、宿主において継続的に維持されることを意味する。本発明の発現カセットまたはベクターはまた、宿主細胞内での目的のポリヌクレオチドの一過性の発現を提供し得る。一過的にトランスフェクトされた宿主細胞は、細胞の複製および増殖の間に、外来性ＤＮＡを欠失する。
【００５５】
本発明の発現カセットは、処置の必要なヒトまたは動物に治療剤を送達するために使用され得る。あるいは、本発明の発現カセットは、被験体（例えば、ヒト）へのワクチン目的のため、特に、魚、ブタ、ウマ、ウシ、イヌおよびネコの種のような食用の動物を含む、家畜動物のワクチン摂取のために、インビボにおいて免疫原性ポリペプチドをコードする因子を送達するために使用され得る。
【００５６】
本発明の発現カセットは、代表的に宿主細胞のゲノムと相同な隣接配列を含む、裸の核酸構築物として直接投与され得る。脊椎動物細胞による裸の核酸構築物の取込みは、微粒子銃形質転換およびリポフェクチンを含むいくつかの公知の技術によって増強される。
【００５７】
あるいは、発現カセットは、プラスミドベクターまたはウイルスベクターを含む、ベクターの一部として投与され得る。
【００５８】
代表的には、発現カセットまたはベクターは、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤と合わせられて、薬学的組成物を生成する。適切なキャリアおよび希釈剤としては、等張の生理食塩溶液（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水を含む）が挙げられる。発現カセットまたはベクターを含む組成物は、例えば、筋肉内投与を含む種々の型の投与のために処方され得る。
【００５９】
発現カセットまたはベクターを含む組成物が、注射可能な形態で使用される場合、この組成物は、代表的に、処置されるべき部位における直接注射のための注射可能処方物について、薬学的に受容可能であるビヒクルと混合される。薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤は、例えば、滅菌等張溶液であり得る。発現カセットまたはベクターを含む組成物はまた、経口的に活性な形態で処方され得る。
【００６０】
実際の処方は、当業者により容易に決定され得、そして、投与される物質の性質および投与経路に依存して変化する。
【００６１】
使用される物質の用量は、種々のパラメータによって、特に、使用される物質、処置されるべき被験体の年齢、体重および状態、使用される投与経路、ならびに、必要とされる臨床レジメンによって、調節され得る。医師は、任意の特定の被験体および状態に必要とされる投与経路および投薬量を決定し得る。
【実施例】
【００６２】
（ｐＶ１０ベクターの構築）
ｐＶ１０の構築のさらなる詳細を、図１に概説する。ゲノムＤＮＡを、ヒトサイトメガロウイルス株ＡＤ１６９（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−５３８）に感染したヒト２倍体線維芽細胞から単離し、これを鋳型として使用して、ＣＭＶ最初期遺伝子１プロモーター／エンハンサー領域（ＣＭＶ ＩＥ１ Ｐ／Ｅ）（ＣＭＶ ＩＥ１遺伝子の５’ＵＴＲの詳細については、図１１（Ｂ）（配列番号１）を参照のこと）をＰＣＲにより増幅した。プロモーターを、５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を含むプライマー
【００６３】
【数１】
および３’末端にＢａｍＨＩ部位を含むプライマー
【００６４】
【数２】
を使用して増幅した。制限部位に先行する末端の「ｔ」ヌクレオチドは、制限酵素消化を促進するためにオリゴヌクレオチド設計に含められ、クローニング工程において排除される。
【００６５】
全てのＰＣＲ反応を、ＤＮＡエンジンＰＴＣ−２００ Ｐｅｌｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ
Ｃｙｃｌｅｒ（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ，ＭＡ）にて行なった。合計反応容量は、１００μｌ（１×ＮＥＢ Ｖｅｎｔポリメラーゼ緩衝液（１０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２５℃にてｐＨ８．８、１０ｍＭ （ＮＨ４）ＳＯ４、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ、２単位のＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、１μｇの各プライマー、鋳型としてＣＭＶ感染細胞から単離した１μｇのゲノムＤＮＡ）であった。反応条件は以下の通りであった：９９℃で１分間、５５℃で３０秒間、７５℃で１．５分間を１５サイクル。得られたフラグメントを、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化し、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化したクローニングベクターｐＵＣ１９にサブクローニングした。インサートの配列解析を決定し、これは、クローニングされたＣＭＶ ＩＥ１プロモーター／エンハンサー領域の公開された配列と一致した。
【００６６】
（ｐＶ４０ベクターの構築）
ｐＶ４０の構築を図２に概説する。ポリＡシグナルを含むｈＧＨｖ遺伝子の３’ＵＴＲを、ヒト線維芽細胞から単離したゲノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅した。５’プライマーの（＋）鎖（ＴＴＴＴＧＧＡＴＣＣＣＴＧＣＣＣＧＧＧＴＧＧＣＡＴＣＣ；配列番号２０）は、末端にＢａｍＨＩ制限部位を含み、そして、３’プライマーの（−）鎖は、末端にＥｃｏＲＩ部位を含んだ（ＴＴＴＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＧＡＧＧＡＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣ；配列番号２１）。ＰＣＲ条件は、ｐＶ１０の構築について記載したのと同じであった。得られたＰＣＲフラグメントを、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ゲル精製し、そして、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化したベクターｐＶ１０に連結した。得られたプラスミド（ｐＶ４０と命名）を、制限酵素分析により評価した。その後の配列決定により、少数のヌクレオチドが、このｈＧＨｖ遺伝子の３’ＵＴＲ（配列番号１９）とＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｋ００４７０において公開されたｈＧＨｖ遺伝子配列（配列番号１８）との間で異なることが示された。少なくともいくつかの変化が、対立遺伝子の改変によるものである。
【００６７】
（ｐＶ７０ベクターの構築）
ｐＶ４０ベクターを、ＢｓｐＥＩおよびＨｐａＩで消化して、イントロンＡ領域の３１７ヌクレオチド部分（ＩＶＳ）を除去した（例えば、図２および３を参照のこと）。ｐＶ４０のｄｈｆｒコード領域のＢｓｐＥＩ−ＨｐａＩへの平滑末端ライゲーションにより、ｐＶ６０を作製した。ｐＶ７０発現ベクターは、転写を調節するために、ヒトサイトメガロウイルス最初期１（ｈＣＭＶ ＩＥ１）プロモーター／エンハンサー領域を含む。このベクターはまた、ｈＣＭＶ ＩＥ１ ５’ＵＴＲおよびイントロンＡを含み、このイントロンは、３１７塩基対の欠失を含む。転写の終結のために、ベクターは、ヒト成長ホルモン改変体ポリアデニル化（ｈＧＨｖポリＡ）領域、配列番号１９を含む。ｐＶ４０、ｐＶ６０およびｐＶ７０の構築は以下に詳説され、そして、図面にさらに記載される。
【００６８】
（Ａ．ｐＸＬＣ．１の作製）
抗体に対する軽鎖コード配列を含むＰＣＲ産物をＢａｍＨＩで消化して、発現ベクターｐＶ７０における固有のＢａｍＨＩにクローニングした（図３）。軽鎖コード領域を、ｈＣＭＶ ＩＥ１イントロンの３’末端の５’ＵＴＲ配列と、ｈＧＨｖポリＡ領域の５’末端との間の固有のＢａｍＨＩに挿入した。このプラスミドをｐＸＬＣ．１と名付けた。図４は、ｐＸＬＣ．１ベクターの作製の概略図を示す。
【００６９】
（Ｂ．ｎｅｏカセット−ｐＸＬＣ．２の追加）
ネオマイシントランスフェラーゼ（ｎｅｏ）発現カセットを、選択マーカーとして機能するように、ｐＸＬＣ．１に導入した（図５）。ｎｅｏカセットを、市販のｐＧＴ−Ｎ２８と呼ばれるプラスミド（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号３０７−２８）からＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントとして調製した。このプラスミドにおいて、ｎｅｏ遺伝子は、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターにより駆動され、ＰＧＫポリアデニル化部位において終結される。ｎｅｏカセットの５’末端にあるＢａｍＨＩ部位を、以下のアダプターオリゴ：
【００７０】
【数３】
を使用して、ＮａｒＩ末端に変換した。
【００７１】
これらのリンカーを用いて、新しいＥｃｏＲＩ部位をまた追加した。このアダプターをまずＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ切断したｎｅｏフラグメントに連結し、この変換されたＮａｒＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントを、次いで、ＮａｒＩおよびＥｃｏＲＩで消化したｐＸＬＣ．１にクローニングした。このようにして、ｎｅｏ発現カセットを、プラスミドの軽鎖配列の３’末端に挿入した。このプラスミドを、ｐＸＬＣ．２と名付けた（図５）。
【００７２】
（重鎖発現ベクターｐＸＨＣ．５の構築）
（Ａ．重鎖のＲＴ−ＰＣＲ）
重鎖を、５’ＰＣＲプライマー：
【００７３】
【数４】
を使用するＲＴ−ＰＣＲ反応から増幅し、この配列において、斜体の配列は、ＢａｍＨＩ部位を有する追加されたリンカー領域であり、そして、下線の塩基は、重鎖コード配列内の第２のメチオニンに対応する。使用した３’ＰＣＲプライマー：
【００７４】
【数５】
はまた、ＢａｍＨＩ部位を有する追加されたリンカー領域（斜体）、および終止コドンを含む重鎖コード配列に対応する配列（下線）を含む。予想された１２６８塩基対のＰＣＲ産物を得た。
【００７５】
（Ｂ．ｐＸＨＣの構築）
使用した５’ＰＣＲプライマーは、ＰＣＲ産物に含まれるコード領域の開始ＡＴＧではなく、コード領域の第２のＡＴＧコドンにハイブリダイズしたので、重鎖コード領域は不完全であった。不完全な重鎖を含むＢａｍＨＩフラグメントを、プラスミドｐＶ６０にクローニングした（図６）。このベクターは、イントロン内の欠失の部位にｄｈｆｒコード領域を含むこと以外は、ｐＶ７０（上記）と同一である。重鎖コード領域を、ｈＣＭＶ ＩＥ１イントロンの３’末端にある５’非翻訳配列と、ｈＧＨｖ改変体ポリＡ領域の５’末端との間の、固有のＢａｍＨＩ部位に挿入した。不完全な重鎖を有するこのプラスミドを、ｐＸＨＣと名付けた。
【００７６】
（Ｃ．重鎖コード配列−ｐＸＣＨ．１の完成）
重鎖配列から欠失しているコード領域をｐＸＨＣ内に挿入して、ｐＸＨＣ．１と命名されたプラスミドを作製した（図７）。これを行なうために、鋳型として抗体に対するコード配列を含むプラスミドを使用するＰＣＲによって、フラグメントを作製した。使用した５’ＣＲプライマーは、以下の通りであった：
【００７７】
【数６】
斜体の配列は、ＢａｍＨＩ部位のｐＸＨＣ配列５’に対応し、太字の配列は、重鎖配列内の開始コドンより２塩基前から始まる配列に対応する。使用した３’プライマーは、ＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＧＧＧＴＣＣＣＴＴＧＧＣＣＣＣ（配列番号９）であった。このプライマーは、第１エキソンの末端、重鎖可変領域にハイブリダイズする。予測されたように、４４５塩基対のＰＣＲ産物が得られ、ＰｓｔＩおよびＳｔｕＩで切断した。ＰｓｔＩＩ−ＳｔｕＩフラグメントを、ＰｓｔＩおよびＳｔｕＩで切断したｐＸＨＣにクローニングして、ｐＸＨＣ．１を得た。
【００７８】
（Ｄ．イントロンのｄｈｆｒ−ｐＸＨＣ．３の除去）
ｐＸＨＣ．１は、ｈＣＭＶ ＩＥ１イントロン内にｄｈｆｒ遺伝子を含んだ。この構成で見出される増幅の潜在的な問題に起因して、ｄｈｆｒ遺伝子をイントロンから除去し、そして、発現カセットを、重鎖カセットの３’に挿入した（図８）。第１の工程は、イントロンからのｄｈｆｒ遺伝子の除去であった。この工程を、ＰｓｔＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントとしてｐＸＨＣ．１から重鎖コード配列を切断し、同じ酵素を用いて切断したｐＸＬＣ．１プラスミドにクローニングすることによって達成した。このクローニング工程は、単に、プラスミド内の重鎖と軽鎖とを交換した。得られたプラスミドは、ｄｈｆｒ遺伝子を含むイントロンが、ｐＸＬＣ．１について上述したような欠失を有するイントロンにより置き換えられていることを除いて、ｐＸＨＣ．１と同一であった。この重鎖プラスミドを、ｐＸＨＣ．３と名付けた（図８）。
【００７９】
（Ｅ．ｄｈｆｒカセット−ｐＸＨＣ．５の挿入）
ｄｈｆｒ構成の変更における第２の工程は、重鎖発現カセットの３’へのｄｈｆｒ発現カセットの挿入であった（図９）。ｄｈｆｒ発現カセットは、ＢｇｌＩＩ／ＢａｍＨＩフラグメント上のプラスミドｐＳＩ−ＤＨＦＲに由来し、ＳＶ４０初期プロモーター、ｄｈｆｒ遺伝子およびＳＶ４０ポリＡ領域を含む。このフラグメントを、以下のアダプターオリゴを使用して、ｐＸＨＣ．３のｈＧＨｖポリＡ領域の３’末端に位置するＥｃｏＲＩ部位にクローニングした：
【００８０】
【数７】
このアダプターをまず、ＥｃｏＲＩ切断したプラスミドに連結し、次いで、ＢｇｌＩＩ／ＢａｍＨＩ ｄｈｆｒカセットをこのアダプタープラスミドに連結した。このプラスミドを、ｐＸＨＣ．５と名付けた（図９）。
【００８１】
（ｐＸＬＣ．２およびｐＸＨＣ．５の特徴づけ）
両方のプラスミドを、制限酵素を使用して分析し、挿入されたフラグメントの存在および配向を確認した。さらに、プラスミドのコード領域を配列決定して、ＰＣＲまたはクローニングの工程の間に変異が蓄積されていないことを確認した。
【００８２】
機能的なｎｅｏ選択マーカーの存在を、ｐＸＬＣ．２をＣＨＯ細胞にトランスフェクトし、Ｇ４１８に対する耐性を示すことによって確認した。二重選択を行なう能力は、ｐＸＬＣ．２プラスミドおよびｐＸＨＣ．５プラスミドを、血清を含まない、アダプターＤＧ４４ ＣＨＯ宿主に同時にトランスフェクトした場合に示された。二重選択培地（α−ＭＥＭ １０％ ｄＦＢＳ ＋ ４００ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８）において、同時トランスフェクションからコロニーが芽生えた。同じ条件下で、いずれかの選択単独（α−ＭＥＭまたは４００ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８）は、トランスフェクトされていない細胞を殺傷し得た。
【００８３】
（ベクターの構築：ｐＶ８０ベクターおよびｐＶ９０ベクター）
ｐＶ８０を、重鎖発現ベクターｐＸＨＣ．５から作製した（図１０）。重鎖コード配列を、ＢａｍＨＩを使用してｐＸＨＣ．５から欠失させた。骨格を、ＢａｍＨＩ部位において連結して再度環状にした。
【００８４】
ｐＶ８０ベクターに対して２つの変更を行なって、ｐＶ９０を作製した（図１１）。ｐＶ８０構築物の位置３１６６（ｄｈｆｒコード領域の末端、添付の配列を参照のこと）において見出されるＮｏｔＩ部位を破壊した。このことを達成するために、プラスミドをＮｏｔＩで消化し、そして、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼを使用して、突出を「埋めた」。結果として、再連結されたプラスミドは、位置３１６６のＮｏｔＩ部位がなくなった。次いで、新しいＮｏＩ部位を、ＢａｍＨＩでベクターを消化し、そして、それ自体と以下の１４マー：ＧＡＴＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧ（配列番号１２）とをアニーリングすることによって作製されるＮｏｔＩリンカーを導入することにより、クローニング部位において作製した。互いにアニーリングすると、リンカー配列は以下のようになる：
【００８５】
【数８】
このクローニング工程は、ＮｏｔＩ部位のいずれかの側にＢａｍＨＩ部位を再現した。これらのＢａｍＨＩ部位は、このベクターを用いて作製された安定な細胞株の遺伝学的分析において有用であり得る。ｐＶ９０のクローニング部位の配列を、配列決定解析により確認した。
【００８６】
ｐＶ８０ベクターにおいて、ポリヌクレオチド（例えば、コード配列）が、ＢａｍＨＩ部位
【００８７】
【数９】
にクローニングされ得る。太字の配列がＢａｍＨＩ部位を表す。ｐＶ９０ベクターにおいて、ポリヌクレオチド（例えば、コード配列）が、ＢａｍＨＩ部位またはＮｏｔＩ部位
【００８８】
【数１０】
にクローニングされ得る。ここで、太字の配列はＢａｍＨＩ部位を表し、そして、下線の配列はＮｏｔＩ部位を表す。最適な結果について、ＮｏｔＩ部位を使用する場合、「Ｃ」は、Ｋｏｚａｋ配列（例えば、ＧＧＡＴＣＣ ＧＣＧＧＣＣＧＣ Ｃ ＡＴＧ（配列番号１７））に最も良く適合するために、ＰＣＲプライマーの開始コドンより前に追加されるべきである。
【００８９】
（ｐＶ８０およびｐＶ９０における制限部位）
ｐＶ８０およびｐＶ９０は、ＮｏｔＩ制限部位を除いて、同一である：ｐＶ８０は、位置３１６６（ｄｈｆｒコード領域の末端）に単一のＮｏｔＩ部位を有し、そしてｐＶ９０は、位置１２６０（クローニング部位）に単一のＮｏｔＩ部位を有する。
【００９０】
２つ以下が見出された一般的な制限部位としては、表１に列挙されるものが挙げられる。
【００９１】
【表１】
以下の一般的な酵素切断部位は見出されなかった：
【００９２】
【表２】
。
【００９３】
（レポーター遺伝子のクローニング）
ＣＭＶ ＩＥ１、イントロンＡフラグメントおよびｈＧＨｖポリＡ構築物を含む発現カセット／ベクターを、市販のＳＶ４０ベースの高発現ベクターと比較した。
【００９４】
分泌されたアルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を、プラスミドの比較のためのレポーターとして使用した。ＳＶ４０ベースの発現ベクターである、ｐＳＥＡＰ２−コントロール（カタログ番号６０５２−１，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）は、ＳＶ４０初期プロモーターおよびＳＶ４０エンハンサーの制御下でＳＥＡＰを発現する。ＳＥＡＰをコードする配列の次に、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナルが続き、真核生物細胞におけるＳＥＡＰ転写物の適切かつ効率的なプロセシングを保証する。ＭＣＳの上流に位置する隣接するポリアデニル化部位および転写ポーズ部位から構成される合成転写ブロッカー（ＴＢ）は、バックグラウンドの転写を減らす。このベクターは、ＳＥＡＰの発現効率を増加することによってＳＥＡＰの感度を改善するか、または、ベクターの利用性を向上させる多数の特徴を組み込む。これらとしては以下が挙げられる：改善されたＫｏｚａｋコンセンサス転写開始部位；いくつかの遺伝子および／または細胞型において潜在性のスプライシングを生じ、そして、発現を減少させ得る、ＳＶ４０の小さなｔイントロンの除去；代表的に、ｍＲＮＡレベルの５倍の増加をもたらす、ＳＶ４０の初期ポリアデニル化シグナルから後期ポリアデニル化シグナルへの切り替え；拡張されたマルチプルクローニング部位（ＭＣＳ）；コンパクトなプラスミドのサイズ；ならびにＳＥＡＰ ｍＲＮＡの３’非翻訳領域に由来する外来性配列の除去。Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｕ８９９３８。
【００９５】
ｐＣＭＶ−ｈＧＨｖＰＡ−ＳＥＡＰプラスミドを作製するために、ＰＣＲによりｐＳＥＡＰ２−コントロールプラスミドからＳＥＡＰをコードする配列を抽出し、これをｐＶ１００ベクターにクローニングした。ｐＶ１１０プラスミドは、ｐＶ９０の派生物である（ｄｈｆｒ発現カセットがなく、ポリリンカーが異なるが、その他は同じである）。ｐＣＭＶ−ｈＧＨｖＰＡ−ＳＥＡＰプラスミド構築物を、配列決定により評価した。
【００９６】
トランスフェクションに使用した宿主は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）欠失チャイニーズハムスター卵巣細胞株ＤＧ４４（Ｕｒｌａｕｂら、Ｃｅｌｌ ３３，４０５−４１２（１９８３））であった。ＣＭＶ−ＳＥＡＰおよびｐＳＥＡＰ２−コントロールレポータープラスミドを、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）をコードし得るプラスミドと共に同時にトランスフェクトし、その結果、安定なトランスフェクト体を（ｐＳＩ−ＤＨＦＲ．２、図１２）について選択し得る。各トランスフェクションは、５０μｇのレポータープラスミドおよび５μｇのｐＳＩ−ＤＨＦＲ．２を含んだ。全てのＤＮＡを、Ｍｅｇａｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）により調製した。トランスフェクションの前に、ＤＮＡをＥＴＯＨ沈殿し、７０％ ＥｔＯＨで洗浄し、乾燥させ、ＨＥＢＳ（２０ｍＭ
Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．０５、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、０．７ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、６ｍＭデキストロース）中に再懸濁し、トランスフェクションの前に定量した。ネガティブコントロールは、レポーターコントロールとしてｐＵＣ１８（ＡＴＣＣ番号３７２５３）を含み、そして、トランスフェクションコントロールとしてはＤＮＡなしのトランスフェクションを含んだ（表３）。
【００９７】
細胞およびＤＮＡを、０．２８ｋＶおよび９５０ｍＦにて０．４ｃｍのキュベット（ＢｉｏＲａｄ）を使用して、０．８ｍｌのＨＥＢＳ中でのエレクトロポレーションによりトランスフェクトした。５Ｅ６細胞を各トランスフェクションに使用した。エレクトロポレーションのパルスの後、細胞を、室温にて５〜１０分間キュベット内でインキュベートさせた。次いで、これらを、ヌクレオシドを含むαＭＥＭおよび１０％ ｄＦＢＳ １０ｍｌを含む遠心チューブに移し、１Ｋ ＲＰＭで５分間ペレット化した。再懸濁したペレットを、１０％ｄＦＢＳを含み、ヌクレオシドを含まないアルファＭＥＭ中、６ウェルプレート内に撒き、コロニーが形成するまで、加湿したインキュベーター内で、３６℃にて５％ ＣＯ２でインキュベートした。
【００９８】
【表３】
トランスフェクションの約２週間後、ｐＳＩＤＨＦＲ．２プラスミドのみを含むトランスフェクション中に、コロニーが形成した。安定なトランスフェクト体を、プールまたは単離体のいずれかとして分析した。特定の生産性を、アッセイにおいて評価した。このアッセイにおいて、培地を、新しい培地と交換し、そして２４時間後に、培地をサンプリングし、細胞を計数した。２４時間のアッセイの終わりに、生成物の力価を細胞数に対して規準化し、そして、生産性を細胞１個あたりのＳＥＡＰ活性として表した。
【００９９】
（ＳＥＡＰアッセイ）
馴化培地を、Ｇｒｅａｔ ＥｓｃＡＰｅＴＭ ＳＥＡＰ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ ３（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して分析した。このアッセイは、馴化培地においてＳＥＡＰ活性を検出するために、蛍光基質を使用する。このキットを、以下の例外を除いて、製造業者の指示書に従って、９６ウェル形式において使用した。キットのアッセイ緩衝液を、１．５Ｍ ジエタノールアミン、０．７５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１５ｍＭ Ｌ−ホモアルギニンおよび１０％ Ｅｍｅｒａｌｄ ＩＩ（カタログ番号９７６１、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で置き換えた。全ての標準およびサンプルを、添付の希釈緩衝液ではなく、新しい培地に希釈した。６０分後に１回の読み取りを行なう代わりに、複数の読み取りを、１０〜２０分間隔で行い、これを使用して、１分あたりの相対蛍光単位（ＲＦＵ／分）としてＳＥＡＰ活性を表した。プレートリーダー（Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒ
ＩＩ，ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に使用した発光フィルターは、推奨される４４９ｎｍの代わりに４６０ｎｍであった。
【０１００】
ＲＦＵ／分の値を、キットに添付される標準物質に基づく標準曲線に対して基準化した。添付される標準物質は定量化されていなかったので、全ての値は相対値である。これらの相対値を、細胞数およびインキュベーション期間に対して規準化し、相対特異的生産性（１日あたりの、細胞１個あたりのＳＥＡＰ活性）を生じた。
【０１０１】
（プール）
コロニーが出現した後、各トランスフェクションから細胞を回収し、プールした。プールを、６ウェルプレート内の各ウェルに２×１０５個の細胞で撒いた。次の日に、培地を２ｍｌの新しい培地と交換した。２４時間後、細胞を計数し、培地のサンプルを使用して、ＳＥＡＰ活性を評価した。プールアッセイからの結果を図１３に示す。
【０１０２】
（単離体）
単離体を、トランスフェクションからコロニーを「ピックアップ」することによって得た。「ピックアップ」は、５０μｌに設定したＰ２００ Ｐｉｐｅｔｍａｎを用いてコロニーの上で直接吸引することによって達成した。吸引したコロニーを、まず、４８ウェルプレートに移し、次いで、十分な細胞数になると６ウェルプレートに移した。特定の生産性を、上記の２４時間アッセイを使用して、ほぼコンフルエントな細胞密度の６ウェルプレートにおいて評価した（図１４）。
【０１０３】
図１３および１４に要約したように、ＣＭＶ ＩＥプロモーターおよびｈＧＨｖポリＡシグナルドメインの組合せに基づく発現ベクターは、高い発現能力を誇る市販のベクターよりもかなり優れていた。
【０１０４】
本発明の多数の実施形態が記載された。それでもなお、種々の改変が、本発明の精神および範囲から逸脱することなくなされ得ることが理解される。従って、他の実施形態は、添付の特許請求の範囲内である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ−１】
【図１１Ｂ−２】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ−１】
【図１１Ｂ−２】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公開番号】特開２０１０−２１３７１８（Ｐ２０１０−２１３７１８Ａ）
【公開日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１１４７８５（Ｐ２０１０−１１４７８５）
【出願日】平成２２年５月１８日（２０１０．５．１８）
【分割の表示】特願２００６−５０３５９２（Ｐ２００６−５０３５９２）の分割
【原出願日】平成１６年２月１３日（２００４．２．１３）
【出願人】（５９２２２１５２８）バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド (224)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年５月１８日（２０１０．５．１８）
【分割の表示】特願２００６−５０３５９２（Ｐ２００６−５０３５９２）の分割
【原出願日】平成１６年２月１３日（２００４．２．１３）
【出願人】（５９２２２１５２８）バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド (224)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]