説明

外来核酸配列の標的化された組込み及び発現

【課題】タンパク質発現及び遺伝子失活において使用するための、ゲノム内の予め決定された標的部位への、外来配列の標的化された組込みのための方法及び組成物を提供する。
【解決手段】細胞内の外来核酸配列の産物を発現する方法であって、以下のステップ:(a)この細胞内の第一の融合タンパク質を発現し、当該第一の融合タンパク質が、第一のジンクフィンガー結合ドメイン及び第一の切断ハーフドメインを含み、ここで第一のジンクフィンガー結合ドメインが、この細胞のゲノム内の関心対象の領域の第一の標的部位に結合するように操作されている;(b)第二の標的部位は第一の標的部位とは異なる細胞内の第二の融合タンパク質を発現し、並びに(c)この細胞を、外来核酸配列及び関心対象の領域の第一の配列に相同である第一のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと接触させること、を含む、前記方法。


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【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞内の外来核酸配列の産物を発現する方法であって、以下のステップ:
(a)この細胞内の第一の融合タンパク質を発現し、当該第一の融合タンパク質が、第一のジンクフィンガー結合ドメイン及び第一の切断ハーフドメインを含み、ここで第一のジンクフィンガー結合ドメインが、この細胞のゲノム内の関心対象の領域の第一の標的部位に結合するように操作されている;
(b)この細胞内の第二の融合タンパク質を発現し、第二の融合タンパク質が、第二のジンクフィンガー結合ドメイン及び第二の切断ハーフドメインを含み、ここで第二のジンクフィンガー結合ドメインが、この細胞のゲノム内の関心対象の領域の第二の標的部位へ結合し、ここで第二の標的部位は第一の標的部位とは異なる;並びに
(c)この細胞を、外来核酸配列及び関心対象の領域の第一の配列に相同である第一のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと接触させること、
を含み、
ここで第一の融合タンパク質の第一の標的部位への結合、及び第二の融合タンパク質の第二の標的部位への結合は、細胞のゲノムが関心対象の領域で切断されるように、切断ハーフ-ドメインを位置決めし、これにより関心対象の領域の細胞のゲノムへの外来配列の組込み及び外来配列の産物の発現を生じる、前記方法。
【請求項2】
前記外来核酸配列が、cDNAを含む、請求項1記載の方法。
【請求項3】
前記外来配列が、プロモーターを含む、請求項1又は2記載の方法。
【請求項4】
前記第一のヌクレオチド配列が、関心対象の領域の第一の配列と同一である、請求項1〜3のいずれか1項記載の方法。
【請求項5】
前記ポリヌクレオチドが、関心対象の領域の第二の配列と相同である第二のヌクレオチド配列を更に含む、請求項1〜4のいずれか1項記載の方法。
【請求項6】
前記第二のヌクレオチド配列が、関心対象の領域の第二の配列と同一である、請求項5記載の方法。
【請求項7】
前記第一及び第二のヌクレオチド配列が、外来配列に隣接する、請求項5又は6記載の方法。
【請求項8】
前記ポリヌクレオチドが、プラスミドである、請求項1〜7のいずれか1項記載の方法。
【請求項9】
前記ポリヌクレオチドが、線状DNA分子である、請求項1〜7のいずれか1項記載の方法。
【請求項10】
前記関心対象の領域が、細胞クロマチンの接近可能な領域内である、請求項1〜9のいずれか1項記載の方法。
【請求項11】
前記関心対象の領域が、生存能に必須でないゲノムの領域内である、請求項1〜10のいずれか1項記載の方法。
【請求項12】
前記関心対象の領域が、転写活性があるゲノムの領域内である、請求項1〜11のいずれか1項記載の方法。
【請求項13】
前記関心対象の領域が、ヒトRosa26遺伝子である、請求項12記載の方法。
【請求項14】
前記関心対象の領域が、マウスRosa26遺伝子のヒトホモログである、請求項12記載の方法。
【請求項15】
前記関心対象の領域が、CCR5遺伝子である、請求項12記載の方法。
【請求項16】
前記第一及び第二の切断ハーフドメインが、IIS型制限エンドヌクレアーゼ由来である、請求項1〜15のいずれか1項記載の方法。
【請求項17】
前記IIS型制限エンドヌクレアーゼが、FokI及びStsIからなる群より選択される、請求項16記載の方法。
【請求項18】
前記関心対象の領域が、染色体内である、請求項1〜17のいずれか1項記載の方法。
【請求項19】
前記関心対象の領域が、遺伝子を含む、請求項1〜18のいずれか1項記載の方法。
【請求項20】
前記遺伝子が、変異を含む、請求項19記載の方法。
【請求項21】
前記変異が、点変異、置換、欠失、挿入、重複、逆位及び転位からなる群より選択される、請求項20記載の方法。
【請求項22】
前記外来核酸配列が、その遺伝子の野生型配列を含む、請求項20記載の方法。
【請求項23】
前記外来核酸配列が、その遺伝子の野生型配列の一部を含む、請求項20記載の方法。
【請求項24】
前記外来核酸配列が、その遺伝子の転写産物のcDNAコピーを含む、請求項20記載の方法。
【請求項25】
前記外来核酸配列が、siRNAをコードしている、請求項1記載の方法。
【請求項26】
外来配列を、細胞のゲノム内の関心対象の領域へ組込む方法であって、以下のステップ:
(a)この細胞内の第一の融合タンパク質を発現し、第一の融合タンパク質が、第一のジンクフィンガー結合ドメイン及び第一の切断ハーフドメインを含み、ここで第一のジンクフィンガー結合ドメインが、この細胞のゲノム内の関心対象の領域の第一の標的部位に結合するように操作されている;
(b)この細胞内の第二の融合タンパク質を発現し、第二の融合タンパク質が、第二のジンクフィンガー結合ドメイン及び第二の切断ハーフドメインを含み、ここで第二のジンクフィンガー結合ドメインが、この細胞のゲノム内の関心対象の領域の第二の標的部位へ結合し、ここで第二の標的部位は第一の標的部位とは異なる;並びに
(c)この細胞を、外来核酸配列を含むポリヌクレオチドと接触させること、
を含み、
ここで第一の融合タンパク質の第一の標的部位への結合、及び第二の融合タンパク質の第二の標的部位への結合は、細胞のゲノムが関心対象の領域で切断されるように、切断ハーフ-ドメインを位置決めし、これにより関心対象の領域の細胞のゲノムへの外来配列の組込みを生じる、前記方法。
【請求項27】
前記組込みが、関心対象の領域の遺伝子発現を失活する、請求項26記載の方法。
【請求項28】
前記外来核酸配列が、1〜50ヌクレオチド長の配列を含む、請求項26又は27記載の方法。
【請求項29】
前記外来配列が、切断酵素認識部位を含む、請求項26〜28のいずれか1項記載の方法。
【請求項30】
前記切断酵素が、メガヌクレアーゼである、請求項29記載の方法。
【請求項31】
前記メガヌクレアーゼが、I-SceIである、請求項30記載の方法。
【請求項32】
前記メガヌクレアーゼが、非天然の標的部位に結合するように操作されている、請求項30又は31記載の方法。
【請求項33】
前記関心対象の領域が、細胞クロマチンの接近可能な領域内である、請求項26〜32のいずれか1項記載の方法。
【請求項34】
前記第一及び第二の切断ハーフドメインが、IIS型制限エンドヌクレアーゼ由来である、請求項26〜33のいずれか1項記載の方法。
【請求項35】
前記IIS型制限エンドヌクレアーゼが、FokI及びStsIからなる群より選択される、請求項34記載の方法。
【請求項36】
前記細胞が、細胞周期のG2期において停止される、請求項1〜35のいずれか1項記載の方法。
【請求項37】
前記融合タンパク質の少なくとも1種が、切断ハーフ-ドメインの二量体化界面のアミノ酸配列の変更を含む、請求項1〜36のいずれか1項記載の方法。
【請求項38】
前記細胞が、哺乳類細胞である、請求項1〜37のいずれか1項記載の方法。
【請求項39】
前記細胞が、ヒト細胞である、請求項38項記載の方法。
【請求項40】
前記細胞が、植物細胞である、請求項1〜37のいずれか1項記載の方法。
【請求項41】
前記外来核酸配列が、検出可能なアミノ酸配列をコードしている、請求項26〜40のいずれか1項記載の方法。

【図1】
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【図2】
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【図3】
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【図4】
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【図5】
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【図6】
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【図7】
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【図8】
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【図9】
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【図10】
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【図11】
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【図12】
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【図13】
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【図14】
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【図15】
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【図16】
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【図17】
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【図18】
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【図19】
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【図20】
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【図21】
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【図22】
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【図23】
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【図24】
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【図25】
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【図26】
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【図27】
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【図28】
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【図29】
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【図30】
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【図31】
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【図32】
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【図33】
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【図34】
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【図35】
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【図36】
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【図37】
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【図38】
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【図39】
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【図40】
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【図41】
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【図42】
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【図43】
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【図44】
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【図45】
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【図46】
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【図47】
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【図48】
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【図49】
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【図50】
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【図51】
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【図52】
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【図53】
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【図54】
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【公開番号】特開2013−31447(P2013−31447A)
【公開日】平成25年2月14日(2013.2.14)
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願2012−202294(P2012−202294)
【出願日】平成24年9月14日(2012.9.14)
【分割の表示】特願2008−524108(P2008−524108)の分割
【原出願日】平成18年7月26日(2006.7.26)
【出願人】(302043837)サンガモ バイオサイエンシズ インコーポレイテッド (11)
【Fターム(参考)】