説明

多価肺炎球菌多糖−タンパク質コンジュゲート組成物

13種類の異なる多糖−タンパク質コンジュゲート、および所望によりアルミニウムベースのアジュバントを有する免疫原性組成物について記載する。各コンジュゲートは、担体タンパク質にコンジュゲートしているストレプトコッカス・ニューモニアエの異なる血清型(1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19Fおよび23F)から調製される莢膜多糖を含有する。ワクチンとして製剤化される免疫原性組成物は、世界中の乳児および幼児における肺炎球菌疾患に対する適用範囲を高め、血清型交差防御の限界に左右されない血清型6Aおよび19Aについての適用範囲を提供する。担体タンパク質に共有結合しているストレプトコッカス・ニューモニアエ血清型1多糖を含む免疫原性コンジュゲートを製造するための方法であって、アルカリ性pH緩衝液中の緩和な加水分解による多糖の部分脱O−アセチル化を包含する方法についても記載する。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、一般的に、医学の分野、具体的には、微生物学、免疫学、ワクチンおよび細菌性病原体による感染の免疫化による予防に関する。
【背景技術】
【0002】
ストレプトコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)は、世界中で乳児および幼児における髄膜炎、肺炎、および重度の侵襲性疾患の主な原因である。多価肺炎球菌多糖ワクチンは、長年にわたって認可され、高齢者および高リスク患者において肺炎球菌疾患を予防するのに有益であることを証明してきた。しかしながら、乳児および幼児は、大部分の肺炎球菌多糖にほとんど反応しない。7価肺炎球菌コンジュゲートワクチン(7vPnC、Prevnar(登録商標))は、その種の中で乳児および幼児において侵襲性疾患および中耳炎に対して免疫原性および有効性が極めて高いことが立証された最初のワクチンであった。このワクチンは、現在、世界中の多くの国で承認されている。Prevnarは、血清型4、6B、9V、14、18C、19Fおよび23F由来の莢膜多糖を含有し、それぞれは、CRM197と呼ばれる担体タンパク質にコンジュゲートしている。Prevnarは、それぞれ米国、欧州、および世界の他の地域において侵襲性肺炎球菌疾患(IPD)の約80〜90%、60〜80%、および40〜80%をカバーしている[1、2]。Prevnarの導入後何年もの間に集められたサーベイランスデータから、予想通り、米国の幼児における侵襲性肺炎球菌疾患の減少が明示されている(図1)[3、4]。
【0003】
Prevnarの導入前に米国の幼児において行われたIPDのサーベイランスは、血清群6および19に起因する疾患のかなりの部分が、6A(約3分の1)および19A(約4分の1)血清型に起因していることを立証した[5、6]。Prevnarの認可の後に米国において行われた肺炎球菌侵襲性疾患サーベイランスは、疾患の大きな負担が、依然として血清型6Aおよび19Aに帰せられることを示唆している(図1)[3]。さらに、これら2種類の血清型は、血清型1、3、5、および7Fを合わせたよりも侵襲性疾患の症例数が多い(2歳未満の小児10万人当たりの症例数8.2対3.3)。さらに、血清型6Aおよび19Aは、高率の抗生物質耐性を伴う(図2)[7、8、9]。より多くの小児を免疫化すれば、血清群交差防御が、血清型6Aおよび19A疾患の減少をもたらすであろうが、減少には限界があり、これらの血清型に起因する疾患のかなりの負担が残るであろうことを示唆する証拠がある(以下を参照)。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】Hausdorff WP, Bryant J, Paradiso PR, Siber GR. Which pneumococcal serogroups cause the most invasive disease: implications for conjugate vaccine formulation and use, part I. Clin Infect Dis 2000; 30:100-21.
【非特許文献2】Hausdorff WP, Bryant J, Kloek C, Paradiso PR, Siber GR. The contribution of specific pneumococcal serogroups to different disease manifestations: implications for conjugate vaccine formulation and use, part I. Clin Infect Dis 2000; 30:122-40.
【非特許文献3】Whitney CG, Farley MM, Hadler J, et al. Decline in invasive pneumococcal disease after the introduction of protein-polysaccharide conjugate vaccine. New Engl J Med 2003; 348(18):1737-46.
【非特許文献4】Black S, Shinefield H, Hansen J, et al. Postlicensure evaluation of the effectiveness of seven valent pneumococcal conjugate vaccine. Pediatr Infect Dis J 2001; 20;1105-7.
【非特許文献5】Robinson KA, Baughman W, Rothrock G, et al. Epidemiology of invasive Streptococcus pneumoniae infections in the United States, 1995-1998: Opportunities for prevention in the conjugate vaccine era. JAMA 2001; 285:1729-35.
【非特許文献6】Butler J, Breiman R, Lipman H, et al. Serotype distribution of Streptococcus pneumoniae infections among preschool children in the United States, 1978-1994. J Infect Dis 1995; 171:885-9.
【非特許文献7】Whitney CG, Farley MM, Hadler J, et al. Increasing prevalence of multidrug-resistant Streptococcus pneumoniae in the United States. N Engl J Med 2000; 343:1917-24.
【非特許文献8】Hofmann J, Cetron MS, Farley MM, et al. The prevalence of drug-resistant Streptococcus pneumoniae in Atlanta. N Engl J Med 1995; 333:481-6.
【非特許文献9】Joloba ML, Windau A, Bajaksouzian S, Appelbaum PC Hausdorff WP, Jacobs MR. Pneumococcal conjugate vaccine serotypes of Streptococcus pneumoniae isolates and the antimicrobial susceptibility of such isolates in children with otitis media. Clin Infect Dis 2001; 33:1489-94.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
血清型1、3、5、6A、7F、および19Aに起因する侵襲性肺炎球菌疾患の相対的な負担および重要性を考えて、Prevnar製剤にこれらの血清型を加えると、侵襲性疾患についての適用範囲が、米国および欧州においては90%超、アジアおよびラテンアメリカにおいては70%〜80%まで高まるであろう。このワクチンは、Prevnarの適用範囲を超えて適用範囲を著しく広げ、血清型交差防御の限界に左右されない6Aおよび19Aについての適用範囲を提供するであろう。
【課題を解決するための手段】
【0006】
したがって、本発明は、一般的に、生理学的に許容できるビヒクルと一緒に、13種類の異なる多糖−タンパク質コンジュゲートを含み、コンジュゲートのそれぞれが、担体タンパク質にコンジュゲートしているストレプトコッカス・ニューモニアエの異なる血清型由来の莢膜多糖を含有する多価免疫原性組成物を提供する。所望により、アルミニウムベースのアジュバントなどのアジュバントが製剤中に包含される。より具体的には、本発明は、7vPnCワクチン中の7種類の血清型(4、6B、9V、14、18C、19Fおよび23F)に加えて6種類の追加血清型(1、3、5、6A、7Fおよび19A)を含む13価肺炎球菌コンジュゲート(13vPnC)組成物を提供する。
【0007】
本発明は、莢膜多糖がストレプトコッカス・ニューモニアエの血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19Fおよび23F由来であり、担体タンパク質がCRM197である、多価免疫原性組成物も提供する。
【0008】
本発明は、莢膜多糖がストレプトコッカス・ニューモニアエの血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9v、14、18C、19A、19Fおよび23F由来であり、担体タンパク質がCRM197であり、アジュバントがリン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムなどのアルミニウムベースのアジュバントである、多価免疫原性組成物をさらに提供する。本発明の特定の実施形態において、アジュバントは、リン酸アルミニウムである。
【0009】
本発明は、生理学的に許容できるビヒクルと一緒に多糖−タンパク質コンジュゲートを含み、コンジュゲートのそれぞれが、担体タンパク質にコンジュゲートしているストレプトコッカス・ニューモニアエの異なる血清型由来の莢膜多糖を含み、莢膜多糖が、血清型3および少なくとも1種類の追加血清型から調製される多価免疫原性組成物も提供する。
【0010】
この多価免疫原性組成物の一実施形態において、追加血清型は、血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、および23Fからなる群から選択される。別の実施形態において、担体タンパク質は、CRM197である。さらに別の実施形態において、組成物は、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムから選択されるアルミニウムベースのアジュバントなどのアジュバントを含む。特定の実施形態において、アジュバントは、リン酸アルミニウムである。
【0011】
本発明は、生理学的に許容できるビヒクルと一緒に多糖−タンパク質コンジュゲートを含み、コンジュゲートのそれぞれが、担体タンパク質にコンジュゲートしているストレプトコッカス・ニューモニアエの異なる血清型由来の莢膜多糖を含み、莢膜多糖が、血清型4、6B、9V、14、18C、19F、23Fおよび少なくとも1種類の追加血清型から調製される多価免疫原性組成物も提供する。
【0012】
この多価免疫原性組成物の一実施形態において、追加血清型は、血清型1、3、5、6A、7F、および19Aからなる群から選択される。別の実施形態において、担体タンパク質は、CRM197である。さらに別の実施形態において、組成物は、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムから選択されるアルミニウムベースのアジュバントなどのアジュバントを含む。特定の実施形態において、アジュバントは、リン酸アルミニウムである。
【0013】
本発明は、ストレプトコッカス・ニューモニアエ莢膜多糖コンジュゲートに対する免疫応答を誘導する方法であって、免疫学的に有効な量の前記免疫原性組成物のいずれかをヒトに投与することを含む方法も提供する。
【0014】
本発明は、投与されるどの免疫原性組成物も、4μgの6Bを除いて、各糖類2μg、CRM197担体タンパク質約29μg、元素アルミニウム(リン酸アルミニウム0.5mg)アジュバント0.125mg、ならびに賦形剤としての塩化ナトリウムおよびコハク酸ナトリウム緩衝液を含有するように製剤化される単一0.5mL投与量であることをさらに規定する。
【0015】
担体タンパク質に共有結合しているストレプトコッカス・ニューモニアエ血清型11(Pn 1)多糖を含む免疫原性コンジュゲートを製造するための方法も提供される。一実施形態において、この方法は、(i)精製Pn1多糖をアルカリ性pH緩衝液と反応させて部分脱O−アセチル化Pn1多糖にすること、(ii)部分脱O−アセチル化Pn1多糖を弱酸と反応させて中和された部分脱O−アセチル化Pn1多糖にすること、(iii)中和された部分脱O−アセチル化Pn1多糖を酸化剤と反応させて活性化Pn1多糖にすること、(iv)活性化Pn1多糖を担体タンパク質と混ぜ合わせること、(v)混ぜ合わせた活性化Pn1多糖および担体タンパク質を還元剤と反応させてPn1多糖:担体タンパク質コンジュゲートにすること、および(vi)Pn1多糖:担体タンパク質コンジュゲート中の未反応アルデヒドをキャッピングして、担体タンパク質に共有結合しているストレプトコッカス・ニューモニアエPn1多糖を含む免疫原性コンジュゲートにすることを含む。
【0016】
他の実施形態において、この方法は、(i)精製Pn1多糖を重炭酸塩/炭酸塩緩衝液と反応させて部分脱O−アセチル化Pn1多糖にすること、(ii)部分脱O−アセチル化Pn1多糖を酢酸と反応させ、中和された部分脱O−アセチル化Pn1多糖にすること、(iii)中和された部分脱O−アセチル化Pn1多糖を過ヨウ素酸ナトリウムと反応させて活性化Pn1多糖にすること、(iv)活性化Pn1多糖を精製すること、(v)活性化Pn1多糖を担体タンパク質と混ぜ合わせること、(vi)混ぜ合わせた活性化Pn1多糖および担体タンパク質を共凍結乾燥すること、(vii)共凍結乾燥した活性化Pn1多糖および担体タンパク質をシアノ水素化ホウ素ナトリウムと反応させてPn1多糖:担体タンパク質コンジュゲートにすること、および(viii)Pn1多糖:担体タンパク質コンジュゲート中の未反応アルデヒドを水素化ホウ素ナトリウムでキャッピングして、担体タンパク質に共有結合しているストレプトコッカス・ニューモニアエPn1多糖を含む免疫原性コンジュゲートにすることを含む。
【0017】
活性化されたストレプトコッカス・ニューモニアエPn1多糖を製造するための方法も提供される。この方法は、(i)精製Pn1多糖をアルカリ性pH緩衝液と反応させて部分脱O−アセチル化Pn1多糖にすること、(ii)部分脱O−アセチル化Pn1多糖を弱酸と反応させ、中和された部分脱O−アセチル化Pn1多糖にすること、および(iii)中和された部分脱O−アセチル化Pn1多糖を酸化剤と反応させて活性化Pn1多糖にすることを含む。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】ベースライン(1998年/1999年)から2001年までの2歳未満の米国の小児における血清型別のIPD率の変化を示す図である。
【図2】5歳未満の小児におけるペニシリン(PCN)に対する耐性を持つ肺炎球菌分離株の分布を示す図である(1998年)。
【図3】D118−P16Prevnar試験からの3回目投与後OPA結果の逆累積分布曲線(RCDC)を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0019】
Prevnar血清型4、6B、9V、14、18C、19F、23Fの包含
1995〜1998年の間のIPDサーベイランスからのデータは、Prevnar中の7種類の血清型が、2歳未満の小児におけるIPDの約82%の原因になっていると推定した[5]。有効性試験の場所である北カリフォルニアにおいて、Prevnar血清型は、乳児および幼児におけるIPDの全症例の90%を占めていた[10]。2000年のPrevnarワクチンの導入以来、ワクチン血清型に起因する疾患の減少により、全IPD率が著しく減少している[3、4]。したがって、現時点において、次世代の肺炎球菌コンジュゲートワクチンからPrevnar血清型のいずれかを除去するのではなく、むしろ、より広い適用範囲を得るために血清型を追加することを正当化することはできない。
【0020】
血清型1、3、5および7Fの包含
米国において、5歳未満の小児における血清型1により引き起こされるIPD率は、タイプ3および7Fのそれぞれについてとほぼ同じで2%未満である[1、6]。血清型1および5は、侵襲性肺炎球菌疾患の危険性の高い米国住民において高率のIPDを占めている。具体的には、血清型1は、2歳未満のアラスカ先住民の小児においてIPDの3.5%を、2〜4歳の小児において18%を引き起こす[11]。血清型1と血清型5は共に、世界の他の部分および先進国における土着住民において疾患をかなり引き起こす[12、13、14]。
【0021】
血清型1は、他の肺炎球菌血清型と比べて、より重度の疾患を伴うこともある[15]。この知見は、米国と欧州の間の症例識別率の差、およびそれに関連した医療行為における差に基づいている。全体として、IPDの発生率は米国よりも欧州において低い。しかしながら、欧州において血清型1により引き起こされるIPDの割合は、米国におけるよりも不釣り合いに高い(それぞれ6〜7%対1〜2%)。欧州では、血液培養物を、主に入院中の小児から入手する。米国では、39℃以上の発熱および白血球数の上昇を示す小児から外来患者として血液培養物を入手することが日常の医療行為である。医療行為の差を考えると、米国において血清型1により引き起こされる疾患の低い割合は、より軽度の疾患を引き起こす高率の他の血清型により下げられているが、欧州における高い割合は、より重篤な疾患を反映していることが想定される。さらに、複雑性肺炎の小児に関する血清疫学研究は、血清型1が不釣り合いに示されることを立証している[16、17、18]。このことは、血清型1の包含が、重度の肺炎球菌疾患の総計を低減するばかりでなく、侵襲性肺炎球菌疾患の全体的な低減に寄与することを示唆している。
【0022】
血清型3および7Fの追加は、IPDに対する適用範囲を、世界の大部分の地域で約3%〜7%、アジアでは約9%高めるであろう。すなわち、11価ワクチンは、アジアではIPDの50%を、すべての他の地域では約80%をカバーするであろう[1、2]。これらの血清型は、中耳炎適用範囲に関しても重要である[19]。中耳炎を引き起こす肺炎球菌血清型に関する多国研究において、Hausdorff他は、血清型3が、全体で8番目に最も一般的な中耳液分離株であることを見い出した[20]。血清型3は、中耳炎に関係する肺炎球菌血清型の最大で8.7%を占めていた。したがって、中耳炎、ならびにIPDにおけるタイプ3および7Fの重要性は、肺炎球菌コンジュゲートワクチンにおけるそれらの包含を正当化している。
【0023】
しかしながら、血清型3多糖に関して著しい免疫原性を示す多価肺炎球菌コンジュゲートワクチンを製造する試みは成功していない。例えば、11価肺炎球菌タンパク質Dコンジュゲートワクチン(11−Pn−PD)の免疫原性および安全性に関する研究において、ワクチンの3回投与と、続く、同じワクチンか肺炎球菌多糖ワクチンのどちらかのブースター投与を受けた乳児において、血清型3についてのプライミング効果は観察されなかった(Nurkka他(2004)Ped.Inf.Dis.J.、23:1008〜1014)。別の研究において、複数回の11−Pn−PDの投与を受けた乳児からのオプソニン食作用(opsonophagocytic)アッセイ(OPA)の結果は、他の試験血清型に匹敵するレベルにおいて血清型3についての抗体応答を示さなかった(Gatchalian他、17th Annual Meeting of the Eur.Soc.Paed.Inf.Dis.(ESPID)、Poster No.4、PIA Poster Session 1、Istanbul Turkey、Mar.27、2001)。急性中耳炎の予防における11−Pn−PDの有効性を評価したさらに別の研究において、ワクチンは、血清型3により引き起こされるエピソードに対する防御を提供しなかった(Prymula他(2006)Lancet、367:740〜748)。したがって、血清型3由来の莢膜多糖を含み、血清型3多糖に対する免疫原性応答を誘発することができる肺炎球菌コンジュゲートワクチンは、現状の技術を上回る著しい改善を提供する。
【0024】
血清型6Aおよび19Aの包含
a.血清型6Aおよび19Aの疫学
文献におけるサーベイランスデータは、血清型6Aおよび19Aが、血清型1、3、5、および7Fを合わせたものに比べて、2歳未満の米国の小児においてより多くの侵襲性肺炎球菌疾患を占めることを示唆している(図1)[1、5]。さらに、これらの血清型は、抗生物質耐性を一般的に伴い(図2)、中耳炎において重要な役割を果たす[6、19、20]。6Aおよび9Aに起因する疾患を予防する現在のPrevnarワクチンの能力は不明である。13vPnCワクチンにおける6Aおよび19A成分の包含についての理論的根拠を以下で論議する。
【0025】
b.6Bおよび19F多糖により誘導される6Aおよび19Aに対する応答
認可されたコンジュゲートされていない肺炎球菌多糖ワクチン(少なくとも2歳のヒトで使用するための)は、6Aまたは6B莢膜多糖を含有し、両方は含有していなかった[21]。23価肺炎球菌多糖ワクチンの製剤化時に作成された免疫原性データは、6B1価ワクチンが、6Aと6B莢膜の双方に対する抗体を誘導したことを立証した。遊離多糖および肺炎球菌コンジュゲートワクチンについて様々な集団におけるIgGおよびオプソニン食作用アッセイ(OPA)応答を評価するいくつかの試験からのデータは、6Aに対するIgG応答が、6B抗原により誘導されるが、応答は一般的に低く、6A生物体によるOPA活性は、6B生物体とは異なっていることを示唆した[22、23、24、25]。さらに、高い6B抗体で応答する被験者は、6Aに対する活性をほとんど有していないことがある。
【0026】
高度の類似性が存在する6Aおよび6B莢膜多糖の化学的組成とは対照的に、19Aおよび19F莢膜は、19A多糖中の2種類の追加側鎖の存在によりまったく異なっている。驚くほどのことではないが、19F多糖ワクチンで免疫化されたヒト志願者において測定された免疫応答は、19Fに対する応答が、被験者の80%において誘導されるが、19Aに対する応答を有するのは被験者の20%に過ぎないことを示した[26]。19F多糖による免疫化の後の血清型19Aに対する低レベルの交差反応性のIgGおよびOPA応答も、コンジュゲートワクチンによる試験において同様に立証されている[24、26]。
【0027】
6Aおよび19Aに対する交差反応性OPA応答に関する内部データは、米国の乳児において行われた7vPnCブリッジング試験(D118−P16)から作成されている(図3)。これらの研究は、他の研究者の知見と一致しており、交差反応性の、低レベルではあるが、6B多糖による免疫化の後の6A多糖に対する機能的抗体、および19Fによる免疫化の19Aに対する極めてわずかの機能的抗体の誘導を立証している。
【0028】
動物モデルにおける6Aおよび19Aに対する6Bおよび19F免疫化の影響
多糖免疫化による交差防御についての可能性を評価するために動物モデルが使用されてきた。Giebink他により開発された中耳炎モデルにおいて、チンチラは、4価多糖外膜タンパク質(OMP)コンジュゲートワクチン(6B、14、19F、23F糖類を含有する)またはプラセボで免疫化された[27]。この試験において、6Aについて一部の交差防御が見られたが、これは、統計的有意性に達することはなく、防御のレベルは、中耳炎対する6Bによるよりも低かった。この同じモデルにおいて、19F中耳炎に対する100%の防御が存在したが、19A中耳炎に対する防御は17%に過ぎなかった。
【0029】
Saeland他は、8価肺炎球菌破傷風コンジュゲートワクチン(6Bおよび19Fを含有する)で免疫化された乳児からの血清を使用し、肺感染モデルにおいて、6A生物体による鼻腔内チャレンジの前にマウスを受動的に免疫化した[28]。59の血清サンプルのうち、53%が、6Bによる菌血症に対してマウスを防御し、37%が、6Aに対して防御した。11価肺炎球菌コンジュゲートワクチン(破傷風トキソイドにコンジュゲートしている19Fを含有する)の4回投与で免疫化された乳児からの血清で受動的に免疫化されたマウスに、同じモデルにおいて、19A生物体による鼻腔内チャレンジを与えた[29]。受動的に免疫化され、次いで、チャレンジされた100匹のマウスのうち、60匹のマウスは、肺組織で検出される19A生物体を有していなかったが、生理食塩水プラセボを与えられたすべてのマウスでは生物体が識別された。しかしながら、受動免疫化は、このモデルにおいて19F生物体によるチャレンジに対して防御しなかった。したがって、血清群19についてのモデルの妥当性は疑わしい。一般に、これらのモデルは、6A生物体に対する6B免疫化の一部の生物学的影響の証拠を提供するが、異種血清型に対する効果は、同種血清型について観測されたものほど大きくなかった。19A生物体に対する19F免疫化の影響は、これらのモデルからは十分に理解されない。
【0030】
有効性/有用性試験における6Aおよび19A疾患に対する6Bおよび19F多糖コンジュゲート免疫化の影響
7vPnCおよび9vPnC(7vPnCに血清型1および5を加える)有効性試験における6B、6A、19F、および19A血清型に起因する疾患の症例数を表1に示す[30、10、31]。侵襲性疾患症例の数は、少な過ぎて、血清型6Aおよび19Aについていかなる結論も出すことができない。しかしながら、フィンランド中耳炎試験は、多数の肺炎球菌分離株をもたらした[32]。パープロトコル解析において、7vPnCは、血清型6Bに起因する中耳炎に対して84%(95%CI 62%、93%)有効であり、血清型6Aに起因する中耳炎に対して57%(95%CI 24%、76%)有効であった(表1)。対照的に、7vPnCによる血清型特異的有効性は、19Fか19Aのどちらかに起因する中耳炎については立証されなかった。
【0031】
【表1】

【0032】
市販後IPDサーベイランスデータも、Prevnarの有用性を評価するためにCenters for Disease Controlにより行われた症例対照試験から入手可能である[33]。生後3〜23ヶ月の小児で発生した侵襲性肺炎球菌疾患の症例は、サーベイランス研究室において識別され、年齢および郵便番号により3つの対照症例に対応付けられた。同意を得た後に、病歴および免疫化歴(被験者は、Prevnarの少なくとも1回の投与を受けていた場合に免疫化されていると見なされた)は、症例および対照について、両親および医療提供者から入手された。予備結果は、2003年のICAACミーティングで提示された。6B、19F、19A、および6A疾患についての知見の要約を表2に示す。これらのデータは、Prevnarが、血清型6B疾患よりもいくらか低いレベルであるが、6Aに起因する疾患を予防できることを示している。これらのデータは、19Aに起因する侵襲性疾患についての交差防御が制限されていることも示している。
【0033】
【表2】

【0034】
Prevnarの使用に関する公表された分析[3]は、血清型6Bおよび19Fが、2歳未満の小児の中で血清型6Aおよび19Aにより引き起こされるIPDの中等度減少をもたらすことも示した([3]の表1)。血清型6A、9A、9L、9N、18A、18B、18F、19A、19B、19C、23Aおよび23B(「すべてのワクチン関連血清型」)により引き起こされる非免疫化成人の中の疾患率は、いくらか軽減された([3]の表2)。これらのデータは、2歳未満の小児におけるPrevnarの使用からの集団免疫は、血清型6Aおよび19Aについて適度であることを立証し、本発明の13vPnCワクチンにおける血清型6Aおよび19Aの包含の根拠を提供する。
【0035】
6Aおよび19Aの追加についての結論
7vPnCワクチンについて図1および表2に述べられている市販後サーベイランスデータおよび症例対照試験結果は、上記に記載されている動物モデルにおける免疫応答および免疫性能に関する他の情報と一致して、6A疾患に対する一部の交差防御があっても、6B疾患に対するよりも少ない程度であることを示唆している。さらに、19Aに対する防御が制限されているように見える。したがって、血清型6Aおよび19Aを含有する13vPnCワクチンは、血清型6Bおよび19Fによる血清群交差防御の限界に左右されない適用範囲を提供する。
【0036】
したがって、本発明は、生理学的に許容できるビヒクルと一緒に、13種類の異なる多糖−タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物であって、コンジュゲートのそれぞれが、担体タンパク質にコンジュゲートしている異なる莢膜多糖を含有し、莢膜多糖が、ストレプトコッカス・ニューモニアエの血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19Fおよび23Fから調製される組成物を提供する。1つのそのような担体タンパク質は、CRM197と呼ばれるジフテリアトキソイドである。免疫原性組成物は、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、および水酸化アルミニウムなどのアルミニウムベースのアジュバントなどのアジュバントをさらに含むことがある。
【0037】
莢膜多糖は、当業者に知られている標準的技法により調製される。本発明において、莢膜多糖は、ストレプトコッカス・ニューモニアエの血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19Fおよび23Fから調製される。これらの肺炎球菌コンジュゲートは、別々のプロセスにより調製され、単回投与製剤に製剤化される。例えば、一実施形態において、各肺炎球菌多糖血清型は、大豆ベースの培地中で成育される。次いで、個々の多糖は、遠心分離、沈殿、限外濾過、およびカラムクロマトグラフィーにより精製される。精製した多糖は、担体タンパク質と反応することができる糖類を製造するために化学的に活性化される。
【0038】
活性化されたらすぐに、各莢膜多糖は、別々に担体タンパク質にコンジュゲートされ、グリココンジュゲートを形成する。一実施形態において、各莢膜多糖は、同じ担体タンパク質にコンジュゲートされる。この実施形態において、コンジュゲーションは、還元アミノ化により行われる。
【0039】
多糖の化学的活性化と、続く担体タンパク質とのコンジュゲーションは、従来の手段により行われる。例えば、米国特許第4,673,574号および第4,902,506号を参照されたい[34、35]。
【0040】
担体タンパク質は、無毒性かつ非反応原性(non−reactogenic)であり、十分な量および純度で得られるタンパク質であることが好ましい。担体タンパク質は、標準的なコンジュゲーション手順に適していなければならない。本発明の特定の実施形態において、CRM197が担体タンパク質として使用される。
【0041】
CRM197(Wyeth、Sanford、NC)は、カザミノ酸および酵母エキスベースの培地中で成育されたコリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diphtheria)C7株(β197)の培養物から単離されるジフテリア毒素の無毒性変異体(すなわち、トキソイド)である。CRM197は、限外濾過、硫酸アンモニウム沈殿、およびイオン交換クロマトグラフィーにより精製される。代替方法として、CRM197は、参照により本明細書に組み込まれている米国特許第5,614,382号に従って組換え技術により調製される。他のジフテリアトキソイドも、担体タンパク質として使用するのに適している。
【0042】
他の適当な担体タンパク質は、破傷風トキソイド、百日咳トキソイド、コレラトキソイド(例えば、国際特許出願WO2004/083251[38]に記載されているような)、エシェリヒア・コリ(E.coil)LT、エシェリヒア・コリST、およびシュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)由来の外毒素Aなどの不活化細菌毒素を包含する。外膜複合体c(OMPC)などの細菌外膜タンパク質、ポーリン、トランスフェリン結合タンパク質、ニューモリシン、肺炎球菌表面タンパク質A(PspA)、肺炎球菌アドヘシンタンパク質(PsaA)、A群もしくはB群ストレプトコッカス由来のC5aペプチダーゼ、またはヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)タンパク質Dも使用することができる。オボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、ウシ血清アルブミン(BSA)またはツベルクリンの精製タンパク質誘導体(PPD)などの他のタンパク質も担体タンパク質として使用することができる。
【0043】
莢膜多糖の担体タンパク質とのコンジュゲーションの後に、多糖−タンパク質コンジュゲートを、様々な技法により精製する(多糖−タンパク質コンジュゲートの量に関して富化される)。これらの技法は、濃縮/透析濾過操作、沈殿/溶出、カラムクロマトグラフィー、および深層濾過を包含する。以下の実施例を参照されたい。
【0044】
個々のグリココンジュゲートを精製した後に、それらを混ぜ合わせ、ワクチンとして使用することができる本発明の免疫原性組成物を製剤化する。本発明の免疫原性組成物の製剤化は、当技術分野において知られている方法を使用して行うことができる。例えば、13種類の個々の肺炎球菌コンジュゲートを、生理学的に許容できるビヒクルと一緒に製剤化し、組成物を調製することができる。そのようなビヒクルの例は、水、緩衝生理食塩水、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール)およびブドウ糖溶液を包含するが、これらに限定されるものではない。
【0045】
特定の実施形態において、免疫原性組成物は、1種類または複数のアジュバントを含むであろう。本明細書で定義されるように、「アジュバント」は、本発明の免疫原性組成物の免疫原性を高める役割を果たす物質である。すなわち、アジュバントは、免疫応答を高めるために与えられることが多く、当業者にはよく知られている。組成物の有用性を高めるのに適しているアジュバントは、
(1)水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなどのアルミニウム塩(ミョウバン)、
(2)水中油型エマルジョン製剤(ムラミルペプチド(以下で定義される)または細菌細胞壁成分などの他の特異的免疫刺激剤を含むまたは含まない)、例えば、
(a)モデル110Yマイクロフルイダイザー(Microfluidics、Newton、MA)などのマイクロフルイダイザーを使用してサブミクロン粒子に製剤化された、スクアレン5%、Tween80 0.5%、およびSpan85 0.5%(所望により、様々な量のMTP−PEを含有する(以下を参照、必要とされないにしても))を含有するMF59(PCT公開第WO90/14837号)、
(b)サブミクロンエマルジョンにマイクロ流動化されるか、より大きい粒径のエマルジョンを作成するためにボルテックスされた、スクアレン10%、Tween80 0.4%、プルロニック−ブロックドポリマーL121 5%、およびthr−MDP(以下を参照)を含有するSAF、ならびに
(c)スクアレン2%、Tween80 0.2%、ならびに米国特許第4,912,094号(Corixa)に記載されている3−O−脱アシル化モノホスホリル脂質A(MPL(商標))、トレハロースジミコレート(TDM)、および細胞壁骨格(CWS)からなる群からの1種類または複数の細菌細胞壁成分、好ましくは、MPL+CWS(Detox(商標))を含有するRibi(商標)アジュバント系(RAS)(Corixa、Hamilton、MT)、
(3)Quil AまたはSTIMULON(商標)QS−21(Antigenics、Framingham、MA)などのサポニンアジュバント(米国特許第5,057,540号)が使用されることがあり、またはISCOM(免疫賦活複合体)などのそれらから作成される粒子、
(4)Corixaから入手可能であり、米国特許第6,113,918号に記載されている、細菌性リポ多糖、アミノアルキルグルコサミンホスフェート化合物(AGP)、またはそれらの誘導体もしくは類似体などの合成脂質A類似体;1つのそのようなAGPは、529(以前は、RC529として知られている)としても知られており、水性形態または安定なエマルジョンとして製剤化される2−[(R)−3−テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]エチル 2−デオキシ−4−O−ホスホノ−3−O−[(R)−3−テトラデカノイルオキシテトラデカノイル]−2−[(R)−3−テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]−b−D−グルコピラノシド、1個または複数のCpGモチーフを含有するオリゴヌクレオチドなどの合成ポリヌクレオチド(米国特許第6,207,646号)であり、
(5)インターロイキン(例えば、IL−1、IL−2、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−12、IL−15、IL−18など)、インターフェロン(例えば、γインターフェロン)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、マクロファージコロニー刺激因子(M−CSF)、腫瘍壊死因子(TNF)、共刺激分子B7−1およびB7−2などのサイトカイン、
(6)野生型か、アミノ酸29位のグルタミン酸が、公開済み国際特許出願第WO00/18434号(WO02/098368およびWO02/098369も参照)に従って別のアミノ酸、好ましくは、ヒスチジンにより置き換えられている突然変異形態のどちらかのコレラ毒素(CT)、百日咳毒素(PT)、またはエシェリヒア・コリ易熱性毒素(LT)、特に、LT−K63、LT−R72、CT−S109、PT−K9/G129(例えば、WO93/13302およびWO92/19265を参照)などの細菌性ADP−リボシル化毒素の無毒化突然変異体、ならびに
(7)組成物の有効性を高めるための免疫刺激剤として作用する他の物質を包含するが、これらに限定されるものではない。
【0046】
ムラミルペプチドは、N−アセチル−ムラミル−L−スレオニル−D−イソグルタミン(thr−MDP)、N−アセチル−ノルムラミル−L−アラニン−2−(1'−2'ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ヒドロキシホスホリルオキシ)−エチルアミン(MTP−PE)などを包含するが、これらに限定されるものではない。
【0047】
本発明のワクチン製剤は、全身経路または粘膜経路を介してワクチンを投与することにより、肺炎球菌感染を起こしやすいヒトを予防または治療するために使用することができる。これらの投与は、筋肉内、腹腔内、皮内、もしくは皮下経路を介する注射、または口道/消化管、気道もしくは尿生殖路への粘膜投与を包含することができる。一実施形態において、鼻腔内投与が、肺炎または中耳炎を治療するために使用される(肺炎球菌の鼻咽頭保菌をより効果的に予防し、その最初期段階で感染を軽減することができるため)。
【0048】
各ワクチン投与におけるコンジュゲートの量は、著しい副作用なしに免疫防御応答を誘導する量として選択される。そのような量は、肺炎球菌血清型に応じて変わることがある。一般的に、各投与は、多糖0.1〜100μg、詳細には、0.1〜10μg、より詳細には、1〜5μgを含むであろう。
【0049】
特定のワクチンについての成分の最適量は、被験者における適切な免疫応答の観察が関わる標準的研究により確定することができる。最初のワクチン接種の後に、被験者は、十分に間隔をおいた1回または数回のブースター免疫化を受けることができる。
【0050】
本発明の特定の実施形態において、13vPnCワクチンは、個々にCRM197にコンジュゲートしている血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、および23Fの肺炎球菌莢膜多糖の滅菌液体製剤である。各0.5mL投与量は、4μgの6Bを除き、各糖類2μg、CRM197担体タンパク質約29μg、元素アルミニウム0.125mg(リン酸アルミニウム0.5mg)アジュバント、ならびに賦形剤としての塩化ナトリウムおよびコハク酸ナトリウム緩衝液を含有するように製剤化される。液体は、保存剤なしで単回投与シリンジに充填される。振盪した後に、ワクチンは、筋肉内投与が可能な状態の均一な白色の懸濁液である。
【0051】
13vPnCワクチンについての投与量レベルの選択は、市販の7vPnCワクチン(Prevnar)と同様である。1投与当たり4μgの6Bを除き、すべての血清型について糖類2μgの投与量レベルが選択された。7vPnCワクチンは、血清型4、9V、14、18C、19F、および23Fについては2μgの糖類投与量レベルで、6Bについては4μgの投与量で、IPDに対する望ましい安全性、免疫原性、および有効性を示した。
【0052】
免疫スケジュールは、7vPnCワクチンに合わせて設計されたスケジュールに従うことができる。例えば、13vPnCワクチンに包含される血清型に起因するストレプトコッカス・ニューモニアエにより引き起こされる侵襲性疾患に対する乳児および幼児のための通常のスケジュールは、生後2、4、6、および12〜15ヶ月である。本発明の組成物は、より年長の小児、青少年、および成人での使用にも適している。
【0053】
本発明の組成物は、他の細菌の感染により引き起こされる中耳炎に対して使用するための1種類または複数の追加抗原をさらに包含することがある。そのような細菌は、型別不能なヘモフィルス・インフルエンザ、モラクセラ・カタラーリス(Moraxella catarrhalis)(以前は、ブランハメラ・カタラーリス(Branhamella catarrhalis)として知られている)およびアロイオコッカス・オティティディス(Alloiococcus otitidis)を包含する。
【0054】
包含に適している型別不能なヘモフィルス・インフルエンザ抗原の例は、タンパク質「e」としても知られているP4タンパク質(米国特許第5,601,831号;国際特許出願WO03/078453)、PALまたはPBOMP−1タンパク質としても知られているP6タンパク質(米国特許第5,110,908号;国際特許出願WO0100790)、P5タンパク質(米国再発行特許第37,741号)、ヘモフィルス接着および透過タンパク質(米国特許第6,245,337号および第6,676,948号)、LKP先端アドヘシンタンパク質(米国特許第5,643,725号)、およびNucAタンパク質(米国特許第6,221,365号)を包含する。
【0055】
包含に適しているモラクセラ・カタラーリス抗原の例は、UspA2タンパク質(米国特許第5,552,146号、第6,310,190号)、CDタンパク質(米国特許第5,725,862号)、Eタンパク質(米国特許第5,948,412号)および74キロダルトン外膜タンパク質(米国特許第6,899,885号)を包含する。
【0056】
包含に適しているアロイオコッカス・オティティディス抗原の例は、国際特許出願WO03/048304に規定されているものを包含する。
【0057】
本発明の組成物は、ストレプトコッカス・ニューモニアエ由来の1種類または複数のタンパク質を包含することもある。包含に適しているストレプトコッカス・ニューモニアエタンパク質の例は、国際特許出願WO02/083855に規定されているもの、ならびに国際特許出願WO02/053761に記載されているものを包含する。
【0058】
本発明の組成物は、ナイセリア・メニンジティディス(Neisseria meningitidis)B型由来の1種類または複数のタンパク質をさらに包含することがある。包含に適しているナイセリア・メニンジティディスB型タンパク質の例は、国際特許出願WO03/063766、WO2004/094596、WO01/85772、WO02/16612およびWO01/87939に規定されているものを包含する。
【0059】
コンジュゲーションのためのストレプトコッカス・ニューモニアエ血清型1多糖の活性化
多糖中の炭水化物の部分酸化を効果的利用し、アルデヒド基を作成し、次いで、担体タンパク質のリシン残基に連結させ、免疫原性コンジュゲート(すなわち、脊椎動物において特異的免疫応答を刺激または誘発するのに有用な、ワクチンなどの組成物)を作成した。アルデヒド基を作成するための一般前提条件は、隣接(vicinal)(隣接(adjacent))ヒドロキシル基の存在である。一部の多糖において、ヒドロキシル基の一部は、他の官能基によりふさがれていることから利用できない。Pn1の場合、O−アセチル基が効率的酸化の妨げであり、これらの基の一部の選択的除去(すなわち、酸化前の多糖の緩和な脱O−アセチル化の導入)は、酸化を容易にし、コンジュゲーション効率を改善する。
【0060】
望ましい程度まで酸化反応の一貫性を維持するため、Pn1多糖を、まず、アルカリ性pH緩衝液中の緩和な加水分解により部分的に脱O−アセチル化する。例示的アルカリ性pH緩衝液は、重炭酸塩/炭酸塩緩衝液(重炭酸ナトリウム/炭酸ナトリウムなど)、グリシン、イミダゾール、およびTRIS−EDTAを包含するが、これらに限定されるものではない。脱O−アセチル化の後に、酢酸、クエン酸もしくは炭酸などの弱酸、または低イオン強度鉱酸(例えば、塩酸)を使用して中和する。「活性化」Pn1多糖を製造するための部分酸化を、制御された量の酸化剤を使用して中和の後に行う。特異的糖酸化酵素を包含する、末端ヒドロキシル基を酸化してアルデヒドにする任意の選択的酸化剤を使用することができる(例えば、過ヨウ素酸ナトリウムまたはカリウム)。次いで、活性化Pn1多糖を所望により精製する(例えば、緩衝生理食塩水に対する透析濾過により)。
【0061】
活性化Pn1多糖を、担体タンパク質と混ぜ合わせることができる。担体タンパク質は、結合したPn1多糖の免疫原性を高め、かつ/または診断上、分析上、および/または治療上有益である担体タンパク質に対する抗体を誘発するように選択される。抗原性分子(例えば、多糖)の担体との共有結合は、免疫原性およびT細胞依存性の増強を付与する(Pozsgay他(1999)PNAS、96:5194〜97;Lee他(1976)J.Immunol.、116:1711〜18;Dintzis他(1976)PNAS、73:3671〜75)。本明細書に記載されているように、有用な担体タンパク質は、破傷風トキソイド、百日咳トキソイド、コレラトキソイド(例えば、国際特許出願WO2004/083251に記載されているような)、エシェリヒア・コリLT、エシェリヒア・コリST、およびシュードモナス・エルギノーサ由来の外毒素Aなどの不活化細菌毒素を包含する。外膜複合体cなどの細菌外膜タンパク質、ポーリン、トランスフェリン結合タンパク質、ニューモリシン、肺炎球菌表面タンパク質A、肺炎球菌アドヘシンタンパク質、A群もしくはB群ストレプトコッカス由来のC5aペプチダーゼ、またはヘモフィルス・インフルエンザタンパク質Dも使用することができる。オボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、ウシ血清アルブミン、またはツベルクリンの精製タンパク質誘導体などの他のタンパク質も担体タンパク質として使用することができる。好ましい担体タンパク質は、突然変異ジフテリアトキシンCRM197である。担体タンパク質と混ぜ合わせた後に、活性化Pn1多糖/担体タンパク質混合物を所望により凍結し(例えば、シェル凍結し)、共凍結乾燥する。
【0062】
コンジュゲーションを、活性化Pn1多糖/担体タンパク質混合物を、シアノ水素化ホウ素ナトリウムなどの還元剤と反応させることにより行う。次いで、未反応アルデヒドを、水素化ホウ素ナトリウム還元によりキャッピングする。コンジュゲートを精製すると(例えば、リン酸塩緩衝液と、続く、緩衝生理食塩水に対する透析濾過により)、緩衝生理食塩水中のグリココンジュゲートの最終バッチ濃縮物が得られる。
【0063】
上記の開示は、一般的に、本発明について記載している。より完全な理解は、以下の具体的な実施例を参照することにより得ることができる。これらの実施例は、例示の目的のみで記載されており、本発明の範囲を限定することは意図されていない。
【実施例】
【0064】
実施例1
ストレプトコッカス・ニューモニアエ莢膜多糖血清型1の調製
マスターセルバンクおよびワーキングセルバンクの調製
ストレプトコッカス・ニューモニアエ血清型1をAmerican Type Culture Collection、ATCC、6301株から入手した。数世代のシードストックを、株を増やして動物由来成分を除去するために作成した(F1、F2、およびF3世代)。2つの追加世代のシードストックを製造した。第1の追加世代をF3バイアルから製造し、次の世代を、第1の追加世代のバイアルから製造した。シードバイアルを、冷凍保存剤としての合成グリセロールと共に冷凍保存した(−70℃未満)。冷凍バイアルの他に、凍結乾燥バイアルをF4世代について調製した。セルバンク調製については、すべての培養物を大豆ベースの培地中で成育させた。冷凍する前に、細胞を遠心分離により濃縮し、使用済み培地を除去し、細胞ペレットを、合成グリセロールなどの冷凍保存剤を含有する新鮮な培地中に再懸濁した。
【0065】
発酵および集菌
ワーキングセルバンクからの培養物を使用し、大豆ベースの培地を含有するシードボトルに接種した。ボトルを、成育要件が満たされるまで、かき混ぜずに36℃±2℃にてインキュベートした。シードボトルを使用し、大豆ベースの培地を含有するシード発酵槽に接種した。約7.0のpHを、滅菌炭酸ナトリウム溶液で維持した。目標光学密度に達した後に、シード発酵槽を使用し、大豆ベースの培地を含有する生産発酵槽に接種した。pHを、滅菌炭酸ナトリウム溶液で維持した。発酵を、成育の停止の後にまたは発酵槽の作業容量に達した場合に終了させた。適切な量の滅菌12%デオキシコール酸ナトリウムを培養物に添加し、細菌細胞を溶解し、細胞関連多糖を遊離させた。溶解した後に、発酵槽内容物を冷却した。溶解した培養ブロスのpHを、酢酸で約pH6.6に調整した。溶解物を、連続流遠心分離と、続いて、深層濾過および0.45μm精密濾過により清澄化した。
【0066】
代替プロセスにおいて、約7.0の発酵pHを、3N NaOHで維持した。目標光学密度に達した後に、シード発酵槽を使用し、大豆ベースの培地を含有する生産発酵槽に接種した。pHを、3N NaOHで維持した。発酵を、成育の停止の後にまたは発酵槽の使用容量に達した場合に終了させた。適切な量の滅菌12%デオキシコール酸ナトリウムを培養物に添加し、ブロス中0.12%濃度とし、細菌細胞を溶解し、細胞関連多糖を遊離させた。溶解させた後に、発酵槽内容物を、かき混ぜながら、7℃〜13℃の温度にて8〜24時間の時間間隔にわたって保持し、完全な細胞溶解および多糖遊離が起こったことを保証した。この保持時間中のかき混ぜは、発酵槽壁およびpHプローブ上に溶解物堆積物が沈着するのを防ぎ、それによって、pHプローブ保全を維持した。次に、溶解した培養ブロスのpHを、50%酢酸で約pH5.0に調整した。15℃〜25℃の温度にて12〜24時間の時間間隔にわたるかき混ぜない保持時間の後に、これまでは可溶性のタンパク質のかなりの部分が、固体沈殿物として溶液から落下し、溶液中に残っている多糖の損失と分解はほとんどなかった。次いで、沈殿物を含む溶液を、連続流遠心分離と、続く、深層濾過および0.45μm精密濾過により清澄化した。
【0067】
精製
肺炎球菌多糖の精製は、いくつかの濃縮/透析濾過操作、沈殿/溶出、カラムクロマトグラフィー、および深層濾過工程からなっていた。すべての手順は、特別の定めのない限り、室温にて行った。
【0068】
ストレプトコッカス・ニューモニアエ血清型1の発酵槽培養物からの清澄化ブロスを、100kDa MWCO(キロダルトン分子量カットオフ)フィルターを使用して濃縮および透析濾過した。透析濾過は、中性pHにてリン酸ナトリウム緩衝液を使用して行った。透析濾過は、核酸、タンパク質および多糖などの高分子量バイオポリマーから低分子量培地成分を除去した。
【0069】
多糖を、ストック溶液からのヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド(HB)を添加して1%HB(w/v)の最終濃度とすることにより、濃縮および透析濾過した溶液から沈殿させた。多糖/HB沈殿物をデプスフィルター上に捕捉し、濾液を廃棄した。多糖沈殿物を、沈殿物を含有するデプスフィルターに通して塩化ナトリウム溶液を再循環することにより再可溶化および溶出した。次いで、フィルターを、追加の塩化ナトリウム溶液ですすいだ。
【0070】
ヨウ化ナトリウム(NaI)を、ストックNaI溶液ストック溶液から多糖溶液に添加して0.5%の最終濃度とし、HBを沈殿させた。沈殿物を深層濾過により除去した。濾液は、目標多糖を含有している。沈殿容器およびフィルターをNaCl/NaI溶液ですすぎ、すすぎ液を、部分的に精製した多糖溶液と合わせた。フィルターを廃棄した。次いで、多糖を、0.2μmフィルターに通して濾過した。
【0071】
多糖溶液を、30kDa MWCOウルトラフィルター上にて濃縮し、塩化ナトリウム溶液で透析濾過した。
【0072】
部分的に精製した多糖溶液を、活性炭を含浸させたデプスフィルターに通して濾過することによりさらに精製した。濾過の後に、炭素フィルターを塩化ナトリウム溶液ですすいだ。すすぎ液を多糖溶液と合わせ、次いで、0.2μmフィルターに通して濾過した。
【0073】
多糖溶液を、30kDa MWCOウルトラフィルター上にて濃縮し、1Mリン酸ナトリウム緩衝液で調整して0.025Mリン酸ナトリウムの最終濃度とした。pHをチェックし、7.0±0.2に調整した。
【0074】
セラミックヒドロキシアパタイト(HA)カラムを、塩化ナトリウムを含有するリン酸ナトリウム緩衝液で平衡化して適切な伝導率(15μS未満)とした。次いで、多糖溶液を、カラム上にロードした。これらの条件下で、樹脂および多糖に結合している不純物を、カラムからのフロースルー中に回収した。多糖溶液を、カラムの前後に位置する0.2μm直列フィルターに通して濾過した。
【0075】
多糖溶液を、30kDa MWCOフィルターを使用して濃縮した。次いで、濃縮物を、注射用水(WFI)で透析濾過した。
【0076】
透析濾過した多糖溶液を、0.2μm膜フィルターに通してポリプロピレンボトル中に濾過した。サンプルを、遊離試験のために取り出し、精製多糖を−25℃±5℃にて冷凍保存した。
【0077】
キャラクタリゼーション
1H−NMRデータは、多糖分子のプロトンに割り当てられたシグナルの帰属により化学構造と一致した。1H−NMRスペクトルは、多糖中のO−アセチル官能基を定量化するための一連のよく分離したシグナル(メチル基由来のプロトン)を示した。
【0078】
1価多糖の同一性は、特異抗血清を使用する向流免疫電気泳動により確認された。
【0079】
屈折率検出器および多角度レーザー光散乱(MALLS)検出器と連結している高速ゲル濾過クロマトグラフィーを、サンプル濃度と連動して使用し、分子量を計算した。
【0080】
サイズ排除クロマトグラフィー媒体(CL−4B)を使用し、多糖の相対的分子サイズ分布をプロファイルした。
【0081】
実施例2
血清型1肺炎球菌多糖−CRM197コンジュゲートの調製
活性化およびコンジュゲーション
精製多糖の容器を解凍し、反応容器中で合わせた。容器に、0.2M炭酸ナトリウム、pH9.0を、50℃にて3時間にわたる部分的脱アセチル化(加水分解)のために添加した。反応物を20℃まで冷却し、中和を、0.2M酢酸により行った。過ヨウ素酸ナトリウム存在下の酸化を、2〜8℃におけるインキュベーションにより行い、混合物を15〜21時間にわたって撹拌した。
【0082】
活性化反応混合物を、30K MWCO膜を使用して0.9%NaClで10倍に濃縮および透析濾過した。保持液を、0.2μm濾過した。活性化糖類を、100mLガラス凍結乾燥ボトルに充填し、−75℃にてシェル凍結し、凍結乾燥した。
【0083】
「シェル凍結」は、凍結乾燥(フリーズドライ(freeze−drying))用のサンプルを調製するための方法である。フラスコを、アルコールまたはその他の適切な流体を含有する冷蔵浴中でモーター駆動のローラーにより自動的に回転させる。生成物の薄い被膜がフラスコの内面「シェル」の周りに均等に凍結され、各フリーズドライ実行中に多量の材料を安全に処理すること可能である。これらの自動冷蔵ユニットは、一度に多くのフラスコを予め冷凍する簡単かつ効率的な手段を提供し、望ましい被膜を内側に作り出し、効率的なフリーズドライにとって十分な表面積を提供する。
【0084】
凍結乾燥材料のボトルを室温にし、2:1の糖類/タンパク質比でCRM197溶液中に再懸濁した。糖類/タンパク質混合物に、1Mリン酸ナトリウム緩衝液を添加し、最終0.2Mイオン強度および7.5のpH7.5とし、次いで、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加した。反応物を18時間にわたって23℃にてインキュベートし、続いて、72時間にわたって37℃にて2回目のインキュベーションを行った。シアノ水素化ホウ素インキュベーションの後に、反応混合物を冷たい生理食塩水で希釈し、続いて、1M炭酸ナトリウムを添加して反応混合物をpH9.0に調整した。未反応アルデヒドを、3〜6時間にわたる23℃におけるインキュベーションにより、水素化ホウ素ナトリウムの添加によりクエンチした。
【0085】
反応混合物を生理食塩水で2倍に希釈し、0.45〜5μmプレフィルターに通して保持液容器中に移した。反応混合物を、0.15Mリン酸塩緩衝液、pH6で30倍に、生理食塩水で20倍に透析濾過した。保持液を0.2μmフィルターに通して濾過した。
【0086】
コンジュゲート溶液を、0.9%生理食塩水中で0.5mg/mLの目標まで希釈し、次いで、クラス100フード内の最終バルク濃縮物(FBC)容器中に滅菌濾過した。コンジュゲートを2〜8℃にて保存した。
【0087】
キャラクタリゼーション
サイズ排除クロマトグラフィー媒体(CL−4B)を使用し、コンジュゲートの相対的分子サイズ分布をプロファイルした。
【0088】
コンジュゲートの同一性は、特異抗血清を使用するスロット−ブロットアッセイにより確認された。
【0089】
糖類濃度およびタンパク質濃度は、それぞれウロン酸およびローリーアッセイにより決定した。共有結合したコンジュゲート複合体中のタンパク質に対する糖類の比は、計算:
【0090】
【数1】


により得られた。
【0091】
O−アセチル含有量は、Hestrin法(Hestrin他、J.Biol.Chem.1949、180、p.249)により測定した。総糖類濃度に対するO−アセチル濃度の比から、糖類1mg当たりのO−アセチルのマイクロモルが得られた。
【0092】
実施例3
ストレプトコッカス・ニューモニアエ筴膜多糖血清型3の調製
マスターセルバンクおよびワーキングセルバンクの調製
ストレプトコッカス・ニューモニアエ血清型3は、Dr.Robert Austrian、University of Pennsylvania、Philadelphia、Pennsylvainaから入手した。セルバンクシステムの調製については、実施例1を参照されたい。
【0093】
発酵および集菌
ワーキングセルバンクからの培養物を使用し、大豆ベースの培地を含有するシードボトルに接種した。ボトルを、成育要件が満たされるまで、かき混ぜずに36℃±2℃にてインキュベートした。シードボトルを使用し、大豆ベースの培地を含有するシード発酵槽に接種した。約7.0のpHを、滅菌炭酸ナトリウム溶液で維持した。目標光学密度に達した後に、シード発酵槽を使用し、中間シード発酵槽に接種した。目標光学密度に達した後に、中シード発酵槽を使用し、生産発酵槽に接種した。pHを、滅菌炭酸ナトリウム溶液で維持した。発酵を、発酵槽の作業容量に達した場合に終了させた。適切な量の滅菌12%デオキシコール酸ナトリウムを培養物に添加し、細菌細胞を溶解し、細胞関連多糖を遊離させた。溶解した後に、発酵槽内容物を冷却した。溶解した培養ブロスのpHを、酢酸で約pH6.6に調整した。溶解物を、連続流遠心分離と、続いて、深層濾過および0.45μm精密濾過により清澄化した。
【0094】
精製
肺炎球菌多糖の精製は、いくつかの濃縮/透析濾過操作、沈殿/溶出、カラムクロマトグラフィー、および深層濾過工程からなっていた。すべての手順は、特別の定めのない限り、室温にて行った。
【0095】
ストレプトコッカス・ニューモニアエ血清型3の発酵槽培養物からの清澄化ブロスを、100kDa MWCOフィルターを使用して濃縮および透析濾過した。透析濾過は、中性pHにてリン酸ナトリウム緩衝液を使用して行った。透析濾過は、核酸、タンパク質および多糖などの高分子量バイオポリマーから低分子量培地成分を除去した。
【0096】
ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド(HB)の添加前に、計算した容量のNaClストック溶液を、濃縮および透析濾過した多糖溶液に添加して0.25M NaClの最終濃度とした。次いで、多糖を、ストック溶液からのHBを添加して1%HB(w/v)の最終濃度とすることにより沈殿させた。多糖/HB沈殿物を、デプスフィルター上に捕捉し、濾液を廃棄した。多糖沈殿物を、沈殿物を含有するデプスフィルターに通して塩化ナトリウム溶液を再循環することにより再可溶化および溶出した。次いで、フィルターを、追加の塩化ナトリウム溶液ですすいだ。
【0097】
ヨウ化ナトリウム(NaI)を、ストックNaI溶液から多糖溶液に添加して0.5%の最終濃度とし、HBを沈殿させた。沈殿物を深層濾過により除去した。濾液は、目標多糖を含有していた。沈殿容器およびフィルターをNaCl/NaI溶液ですすぎ、すすぎ液を、部分的に精製した多糖溶液と合わせた。フィルターを廃棄した。次いで、多糖を、0.2μmフィルターに通して濾過した。
【0098】
多糖溶液を、30kDa MWCOウルトラフィルター上にて濃縮し、塩化ナトリウム溶液で透析濾過した。
【0099】
部分的に精製した多糖溶液を、活性炭を含浸させたデプスフィルターに通して濾過することによりさらに精製した。濾過の後に、炭素フィルターを塩化ナトリウム溶液ですすいだ。すすぎ液を多糖溶液と合わせ、次いで、0.2μmフィルターに通して濾過した。
【0100】
多糖溶液を、30kDa MWCOウルトラフィルター上にて濃縮し、1Mリン酸ナトリウム緩衝液で調整して0.025Mリン酸ナトリウムの最終濃度とした。pHをチェックし、7.0±0.2に調整した。
【0101】
セラミックヒドロキシアパタイト(HA)カラムを、塩化ナトリウムを含有するリン酸ナトリウム緩衝液で平衡化して適切な伝導率(15μS)とした。次いで、多糖溶液を、カラム上にロードした。これらの条件下で、樹脂および多糖に結合している不純物を、カラムからのフロースルー中に回収した。多糖溶液を、緩衝液と共にカラムに通して流し、0.2μmフィルターに通して濾過した。
【0102】
多糖溶液を、30kDa MWCOフィルターを使用して濃縮した。次いで、濃縮物を、WFIで透析濾過した。
【0103】
透析濾過した多糖溶液を、0.2μm膜フィルターに通してステンレス鋼容器中に濾過した。サンプルを、遊離試験のために取り出し、精製多糖を−25℃±5℃にて冷凍保存した。
【0104】
キャラクタリゼーション
1H−NMRデータは、多糖分子のプロトンに割り当てられたシグナルの帰属により化学構造と一致した。
【0105】
1価多糖の同一性は、特異抗血清を使用する向流免疫電気泳動により確認された。
【0106】
屈折率検出器および多角度レーザー光散乱(MALLS)検出器と連結している高速ゲル濾過クロマトグラフィーを、サンプル濃度と連動して使用し、分子量を計算した。
【0107】
サイズ排除クロマトグラフィー媒体(CL−4B)を使用し、多糖の相対的分子サイズ分布をプロファイルした。
【0108】
実施例4
血清型3肺炎球菌糖類−CRM197コンジュゲートの調製
活性化およびコンジュゲーション
精製した血清型3糖類の容器を解凍し、反応容器中で合わせた。容器に、WFIおよび2M酢酸を添加して0.2Mおよび2mg/mL糖類の最終濃度とした。溶液の温度を1時間にわたって85℃まで上げ、多糖を加水分解した。反応物を25℃以下まで冷却し、1M塩化マグネシウムを添加して0.1Mの最終濃度とした。過ヨウ素酸ナトリウム存在下の酸化を、23℃にて16〜24時間にわたるインキュベーションにより行った。
【0109】
活性化反応混合物を、100K MWCO膜を使用してWFIで10倍に濃縮および透析濾過した。保持液を0.2μmフィルターに通して濾過した。
【0110】
混ぜ合わせる場合、0.2Mリン酸ナトリウム、pH7.0を、活性化糖類に添加して10mMの最終濃度および6.0〜6.5のpHとした。CRM197担体タンパク質を、CRM1971g当たり糖類2gの比まで糖類溶液と混合した。合わせた糖類/タンパク質溶液を、50mL目標充填で100mLガラス凍結乾燥ボトルに充填し、−75℃にてシェル凍結し、凍結乾燥させた。
【0111】
共凍結乾燥した糖類/タンパク質材料のボトルを室温にし、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0中に再懸濁して20mg/mLの最終糖類濃度とした。pHを6.5に調整し、次いで、シアノ水素化ホウ素ナトリウム0.5モル当量を添加した。反応物を、48時間にわたって37℃にてインキュベートした。シアノ水素化ホウ素インキュベーションの後に、反応混合物を、冷たい5mMコハク酸塩/0.9%生理食塩水緩衝液で希釈した。未反応アルデヒドを、水酸化ホウ素ナトリウムの添加および3〜6時間にわたる23℃におけるインキュベーションによりクエンチした。反応混合物を、0.45〜5μmプレフィルターに通して保持液容器中に移した。
【0112】
反応混合物を、0.1Mのリン酸塩緩衝液(pH9)で30倍に、0.15Mリン酸塩緩衝液(pH6)で20倍に、5mMコハク酸塩/0.9%生理食塩水で20倍に透析濾過した。保持液を0.2μmフィルターに通して濾過した。
【0113】
コンジュゲート溶液を、0.5mg/mLの糖類目標まで希釈し、次いで、クラス100フード内のFBC容器中に滅菌濾過した。コンジュゲートを2〜8℃にて保存した。
【0114】
キャラクタリゼーション
サイズ排除クロマトグラフィー媒体(CL−4B)を使用し、コンジュゲートの相対的分子サイズ分布をプロファイルした。
【0115】
コンジュゲートの同一性は、特異抗血清を使用するスロット−ブロットアッセイにより確認された。
【0116】
糖類濃度およびタンパク質濃度は、それぞれアントロンおよびローリーアッセイにより決定した。共有結合したコンジュゲート複合体中のタンパク質に対する糖類の比は、計算:
【0117】
【数2】


により得られた。
【0118】
実施例5
ストレプトコッカス・ニューモニアエ筴膜多糖血清型5の調製
ストレプトコッカス・ニューモニアエ血清型5は、State University of New York、Brooklyn、New YorkのDr.Gerald Schiffmanから入手した。セルバンクシステムの調製については、実施例1を参照されたい。多糖の発酵、集菌、精製、およびキャラクタリゼーションについては、実施例1を参照されたい。
【0119】
代替発酵プロセス
ワーキングセルバンクからの培養物を使用し、大豆ベースの培地および10mM滅菌NaHCO溶液を含有するシードボトルに接種した。ボトルを、成育要件が満たされるまで、かき混ぜずに36℃±2℃にてインキュベートした。シードボトルを使用し、大豆ベースの培地および10mM滅菌NaHCO溶液を含有するシード発酵槽に接種した。約7.0のpHを、3N NaOHで維持した。目標光学密度に達した後に、シード発酵槽を使用し、10mM NaHCO濃度の大豆ベースの培地を含有する生産発酵槽に接種した。pHを、3N NaOHで維持した。発酵を、成育の停止の後にまたは発酵槽の作業容量に達した場合に終了させた。適切な量の滅菌12%デオキシコール酸ナトリウムを培養物に添加し、ブロス中0.12%濃度とし、細菌細胞を溶解し、細胞関連多糖を遊離させた。溶解した後に、発酵槽内容物を、かき混ぜながら、7℃〜13℃の温度にて8〜24時間の時間間隔にわたって保持し、完全な細胞溶解および多糖の遊離が起こったことを保証した。この保持時間中のかき混ぜは、発酵槽壁およびpHプローブ上に溶解物堆積物が沈着するのを防ぎ、それによって、pHプローブ保全を維持した。次に、溶解した培養ブロスのpHを、50%酢酸で約pH4.5に調整した。15℃〜25℃の温度にて12〜24時間の時間間隔にわたるかき混ぜない保持時間の後に、これまでは可溶性のタンパク質のかなりの部分が、固体沈殿物として溶液から落下し、溶液中に残っている多糖の損失と分解はほとんどなかった。次いで、沈殿物を含む溶液を、連続流遠心分離と、続く、深層濾過および0.45μm精密濾過により清澄化した。
【0120】
実施例6
血清型5肺炎球菌糖類−CRM197コンジュゲートの調製
活性化およびコンジュゲーション
血清型5糖類の容器を解凍し、反応容器中で合わせた。容器に、0.1M酢酸ナトリウム、pH4.7を添加し、続いて、23℃にて16〜22時間にわたるインキュベーションによる過ヨウ素酸ナトリウム存在下の酸化を行った。
【0121】
活性化反応混合物を、100K MWCO膜を使用し、WFIで10倍に濃縮および透析濾過した。保持液を0.2μmフィルターに通して濾過した。
【0122】
血清型5活性化糖類を、0.8:1の比でCRM197と合わせた。合わせた糖類/タンパク質溶液を、100mLガラス凍結乾燥ボトル(50mL目標充填)に充填し、−75℃にてシェル凍結し、共凍結乾燥した。
【0123】
共凍結乾燥材料のボトルを室温にし、0.1Mリン酸ナトリウム、pH7.5中に再懸濁し、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加した。反応物を72時間にわたって30℃にてインキュベートし、続いて、シアノ水素化ホウ素の2回目の添加を行い、20〜28時間にわたって30℃にてインキュベートした。
【0124】
シアノ水素化ホウ素インキュベーションの後に、反応混合物を生理食塩水で2倍に希釈し、0.45〜5μmプレフィルターに通して保持液容器中に移した。反応混合物を、0.01Mリン酸塩緩衝液、pH8で30倍に、0.15Mリン酸塩緩衝液、pH6で20倍に、生理食塩水で20倍に透析濾過した。保持液を0.2μmフィルターに通して濾過した。
【0125】
コンジュゲート溶液を希釈し、0.5mg/mLの糖類目標とし、次いで、クラス100フード内のFBC容器中に滅菌濾過した。コンジュゲートを2〜8℃にて保存した。
【0126】
コンジュゲートのキャラクタリゼーションについては、実施例2を参照されたい。
【0127】
実施例7
ストレプトコッカス・ニューモニアエ莢膜多糖血清型6Aの調製
ストレプトコッカス・ニューモニアエ血清型6Aは、State University of New York、Brooklyn、New YorkのDr.Gerald Schiffmanから入手した。セルバンクシステムの調製については、実施例1を参照されたい。多糖の発酵、集菌、および精製については、精製中に、クロマトグラフィー工程の前に、30kDa MWCO濃縮工程を省略することを除き、実施例1を参照されたい。
【0128】
実施例8
血清型6A肺炎球菌糖類−CRM197コンジュゲートの調製
活性化およびコンジュゲーション
血清型6A多糖は、酸化前にサイズを縮小しなければならなかった高分子量ポリマーである。血清型6A糖類の容器を解凍し、反応容器中で合わせた。容器に、60℃にて1.5時間にわたる加水分解のために、2M酢酸を添加して0.1Mの最終濃度とした。反応物を23℃まで冷却し、中和を、反応混合物を1M NaOHでpH6に調整することにより行った。過ヨウ素酸ナトリウム存在下の酸化を、14〜22時間にわたる23℃におけるインキュベーションにより行った。
【0129】
活性化反応混合物を、100K MWCO膜を使用し、WFIで10倍に濃縮および透析濾過した。保持液を0.2μmフィルターに通して濾過した。
【0130】
血清型6Aを、ショ糖と混ぜ合わせ、100mLガラス凍結乾燥ボトル(50mL目標充填)に充填し、−75℃にてシェル凍結し、凍結乾燥した。
【0131】
凍結乾燥した材料のボトルを室温とし、1:1の糖類/タンパク質の比でジメチルスルホキシド(DMSO)中に再懸濁した。シアノ水素化ホウ素ナトリウムの添加の後に、反応混合物を18時間にわたって23℃にてインキュベートした。シアノ水素化ホウ素インキュベーションの後に、反応混合物を冷たい生理食塩水で希釈した。未反応アルデヒドを、3〜20時間にわたる23℃におけるインキュベーションにより、水素化ホウ素ナトリウムの添加によりクエンチした。
【0132】
希釈した反応混合物を、5μmプレフィルターに通して保持液溶液中に移した。反応混合物を、0.9%NaClで10倍に、およびコハク酸塩−緩衝NaClで30倍に透析濾過した。保持液を0.2μmフィルターに通して濾過した。
【0133】
コンジュゲート溶液を希釈し、0.5mg/mLの糖類目標とし、次いで、クラス100フード内のFBC容器中に滅菌濾過した。コンジュゲートを2〜8℃にて保存した。
【0134】
コンジュゲートのキャラクタリゼーションについては、実施例2を参照されたい。
【0135】
実施例9
ストレプトコッカス・ニューモニアエ莢膜多糖血清型7Fの調製
ストレプトコッカス・ニューモニアエ血清型7Fは、State University of New York、Brooklyn、New YorkのDr.Gerald Schiffmanから入手した。セルバンクシステムの調製、ならびに多糖の発酵および集菌については、実施例3を参照されたい。代替発酵プロセスおよび集菌プロセスについては、実施例1に記載されている代替プロセスを参照されたい。
【0136】
精製
肺炎球菌多糖の精製は、いくつかの濃縮/透析濾過操作、沈殿/溶出、カラムクロマトグラフィー、および深層濾過工程からなっていた。すべての手順は、特別の定めのない限り、室温にて行った。
【0137】
ストレプトコッカス・ニューモニアエ血清型7Fの発酵槽培養物からの清澄化ブロスを、100kDa MWCOフィルターを使用して濃縮および透析濾過した。透析濾過は、中性pHにてリン酸ナトリウム緩衝液を使用して行った。透析濾過は、核酸、タンパク質および多糖などの高分子量バイオポリマーから低分子量培地成分を除去した。
【0138】
血清型7Fは、HBと沈殿物を形成しない。その代わり、不純物を、ストック溶液からのHBを添加して1%HBの最終濃度とすることにより、濃縮および透析濾過した溶液から沈殿させた。沈殿物をデプスフィルター上に捕捉し、フィルターを廃棄した。多糖は、濾液中に含有されていた。
【0139】
ヨウ化ナトリウム(NaI)を、ストックNaI溶液から多糖溶液に添加して0.5%の最終濃度とし、HBを沈殿させた。沈殿物を深層濾過により除去した。濾液は、目標多糖を含有していた。沈殿容器およびフィルターをNaCl/NaI溶液ですすぎ、すすぎ液を、部分的に精製した多糖溶液と合わせた。フィルターを廃棄した。次いで、多糖を、0.2μmフィルターに通して濾過した。
【0140】
多糖溶液を、30kDa MWCOウルトラフィルター上にて濃縮し、塩化ナトリウム溶液で透析濾過した。
【0141】
部分的に精製した多糖溶液を、活性炭を含浸させたデプスフィルターに通して濾過することによりさらに精製した。濾過の後に、炭素フィルターを塩化ナトリウム溶液ですすいだ。すすぎ液を多糖溶液と合わせ、次いで、0.2μmフィルターに通して濾過した。
【0142】
多糖溶液を、30kDa MWCOウルトラフィルター上にて濃縮し、1Mリン酸ナトリウム緩衝液で調整して0.025Mリン酸ナトリウムの最終濃度とした。pHをチェックし、7.0±0.2に調整した。
【0143】
セラミックヒドロキシアパタイト(HA)カラムを、塩化ナトリウムを含有するリン酸ナトリウム緩衝液で平衡化して適切な伝導率(15μS)とした。次いで、多糖溶液を、カラム上にロードした。これらの条件下で、樹脂および多糖に結合している不純物を、カラムからのフロースルー中に回収した。多糖を、緩衝液と共にカラムに通して流し、0.2μmフィルターに通して濾過した。
【0144】
多糖溶液を、30kDa MWCOフィルターを使用して濃縮した。次いで、濃縮物を、WFIで透析濾過した。
【0145】
透析濾過した多糖溶液を、0.2μm膜フィルターに通してステンレス鋼容器中に濾過した。サンプルを、遊離試験のために取り出し、精製多糖を2℃〜8℃にて保存した。
【0146】
多糖のキャラクタリゼーションについては、実施例3を参照されたい。
【0147】
実施例10
血清型7F肺炎球菌糖類−CRM197コンジュゲートの調製
活性化およびコンジュゲーション
過ヨウ素酸ナトリウム存在下の酸化を、23℃における16〜24時間にわたるインキュベーションにより行った。
【0148】
活性化反応混合物を、100K MWCO膜を使用して10mM NaOAc、pH4.5で10倍に濃縮および透析濾過した。保持液を0.2μmフィルターに通して濾過した。
【0149】
血清型7Fを、100mLガラス凍結乾燥ボトル(50mL目標充填)に充填し、−75℃にてシェル凍結し、凍結乾燥した。
【0150】
凍結乾燥した血清型7FおよびCRM197のボトルを室温とし、1.5:1の糖類/タンパク質の比でDMSO中に再懸濁した。シアノ水素化ホウ素ナトリウムの添加の後に、反応物を8〜10時間にわたって23℃にてインキュベートした。未反応アルデヒドを、16時間にわたる23℃におけるインキュベーションにより、水素化ホウ素ナトリウムの添加によりクエンチした。
【0151】
反応混合物を冷たい生理食塩水で10倍に希釈し、5μmプレフィルターに通して保持液容器中に移した。反応混合物を、0.9%生理食塩水で10倍に、コハク酸塩−緩衝生理食塩水で30倍に透析濾過した。保持液を0.2μmフィルターに通して濾過した。
【0152】
コンジュゲート溶液を希釈し、0.9%生理食塩水1mL当たり0.5mgの糖類目標として、次いで、クラス100フード内のFBC容器中に滅菌濾過した。コンジュゲートを2〜8℃にて保存した。
【0153】
コンジュゲートのキャラクタリゼーションについては、実施例4を参照されたい。
【0154】
実施例11
ストレプトコッカス・ニューモニアエ莢膜多糖血清型19Aの調製
ストレプトコッカス・ニューモニアエ血清型19Aは、State University of New York、Brooklyn、New YorkのDr.Gerald Schiffmanから入手した。セルバンクシステムの調製については、実施例1を参照されたい。多糖の発酵、集菌、および精製については、実施例7を参照されたい。キャラクタリゼーションについては、実施例3を参照されたい。
【0155】
実施例12
血清型19A肺炎球菌糖類−CRM197コンジュゲートの調製
活性化およびコンジュゲーション
血清型19A糖類の容器を解凍し、反応容器中で合わせた。酢酸ナトリウムを添加して10mM(pH5.0)とし、酸化を、23℃における16〜24時間にわたるインキュベーションにより過ヨウ素酸ナトリウムの存在下で行った。
【0156】
活性化反応混合物を、100K MWCO膜を使用して10mM酢酸、pH5.0で10倍に濃縮および透析濾過した。保持液を0.2μmフィルターに通して濾過した。
【0157】
活性化糖類をショ糖と混ぜ合わせ、続いてCRM197を添加した。血清型19A活性化糖類およびCRM197混合物(0.8:1比)を、100mLガラス凍結乾燥ボトル(50mL目標充填)に充填し、−75℃にてシェル凍結し、凍結乾燥した。
【0158】
凍結乾燥した材料のボトルを室温とし、DMSO中に再懸濁した。糖類/タンパク質混合物に、シアノ水素化ホウ素ナトリウム(100mg/ml)を添加した。反応物を15時間にわたって23℃にてインキュベートした。シアノ水素化ホウ素インキュベーションの後に、未反応アルデヒドを、3〜20時間にわたる23℃におけるインキュベーションにより、水素化ホウ素ナトリウムの添加によりクエンチした。
【0159】
反応混合物を冷たい生理食塩水で10倍に希釈し、5μmプレフィルターに通して保持液容器中に移した。反応混合物を、0.45μmフィルターで濾過した0.9%NaClで10倍に、5mMコハク酸/0.9%NaCl緩衝液、pH6を使用する透析濾過で30倍に透析濾過した。保持液を0.2μmフィルターに通して濾過した。
【0160】
コンジュゲート溶液を、5mMコハク酸塩/0.9%生理食塩水を使用して0.5mg/mLの目標まで希釈し、次いで、クラス100フード内のFBC容器中に滅菌濾過した。コンジュゲートを2〜8℃にて保存した。
【0161】
コンジュゲートのキャラクタリゼーションについては、実施例4を参照されたい。
【0162】
実施例13
ストレプトコッカス・ニューモニアエ莢膜多糖血清型4、6B、9V、14、18C、19F、および23Fの調製
ストレプトコッカス・ニューモニアエシード培養物の調製
ストレプトコッカス・ニューモニアエ血清型4、6B、9V、18C、19F、および23Fは、Dr.Gerald Schiffman、State University of New York、Brooklyn、New Yorkから入手した。ストレプトコッカス・ニューモニアエ血清型14は、ATCC、6314株から得た。
【0163】
別々に、ストレプトコッカス・ニューモニアエの望ましい血清型のそれぞれの1つのバイアルを使用し、発酵バッチを開始した。大豆ベースの培地およびフェノールレッドを含有する2つのボトルを、炭酸ナトリウムを使用して7.4±0.2のpH範囲に調整し、次いで、必要容量の50%ブドウ糖/1%硫酸マグネシウム溶液をボトルに添加した。2つのボトルに、異なる量のシードを接種した。ボトルを、培地が黄色に変わるまで、36℃±2℃にてインキュベートした。インキュベーションの後に、サンプルを、各ボトルから取り出し、光学密度(OD)(0.3〜0.9)およびpH(4.6〜5.5)について試験した。2つのボトルのうちの1つを、シード発酵槽の接種用に選択した。
【0164】
大豆ベースの培地をシード発酵槽に移し、滅菌した。次いで、ある容量の50%ブドウ糖/1%硫酸マグネシウム溶液を発酵槽に添加した。シード発酵槽のpHおよびかき混ぜをモニターおよび制御した(pH6.7〜7.4)。温度を36℃±2℃に維持した。シード接種物(ボトル)を、シード発酵槽と無菌的に連結し、接種物を移した。発酵槽をpH制御で維持し、サンプルを定期的に取り出し、ODおよびpHについて試験した。600nmにて0.5の望ましいODに達した場合、中間発酵槽に、シード発酵槽からの発酵ブロスを接種した。
【0165】
大豆ベースの培地を中間発酵槽に移し、滅菌した。次いで、ある容量の50%ブドウ糖/1%硫酸マグネシウム溶液を発酵槽に添加した。中間発酵槽のpHおよびかき混ぜをモニターおよび制御した(pH6.7〜7.4)。温度を36℃±2℃に維持した。シード発酵槽の内容物を中間発酵槽に移した。発酵槽をpH制御で維持し、サンプルを定期的に取り出し、ODおよびpHについて試験した。600nmにて0.5の望ましいODに達した場合、生産発酵槽に、中間発酵槽からの発酵ブロスを接種した。
【0166】
大豆ベースの培地を生産発酵槽に移し、滅菌した。次いで、ある容量の50%ブドウ糖/1%硫酸マグネシウム溶液を発酵槽に添加した。生産発酵槽のpHおよびかき混ぜをモニターおよび制御した(pH6.7〜7.4)。温度を36℃±2℃に維持した。発酵が終了するまで、発酵槽をpH制御で維持し、サンプルを定期的に取り出し、ODおよびpHについて試験した。
【0167】
デオキシコール酸ナトリウムを発酵槽に添加して約0.12%w/vの最終濃度とした。培養物を最短で30分にわたって混合し、温度設定点を10℃まで下げた。培養物を一夜にわたってインキュベートし、不活化を確認した後に、培養物のpHを、必要に応じて、50%酢酸で6.4〜6.8に調整した。発酵槽の温度を20℃±5℃まで上げ、内容物を清澄化保持タンクに移した。
【0168】
清澄化保持タンクの内容物(細胞残屑を包含する)を、1時間当たり25〜600リットルの流量にて遠心機により処理した(細胞残屑を廃棄し、流量を1時間当たり25〜250リットルに固定した血清型4を除いて)。上清のサンプルを取り出し、ODについて試験した。遠心分離中の望ましいODを0.15以下とした。
【0169】
初めに、上清を、0.05±0.03のODが得られるまで、デプスフィルターアセンブリに通して再循環した。次いで、上清を、デプスフィルターアセンブリおよび0.45μm膜フィルターに通して 濾液保持タンクに移した。
【0170】
続いて、生成物を、閉管に通して処理用の精製領域に移した。
【0171】
上記の操作(遠心分離、濾過および移送)はすべて、10℃〜30℃にて行った。
【0172】
血清型4および6Bについての代替発酵プロセスおよび集菌プロセスについては、実施例1に記載されている代替プロセスを参照されたい。
【0173】
精製
各肺炎球菌多糖の精製は、いくつかの濃縮/透析濾過操作、沈殿/溶出、カラムクロマトグラフィー、および深層濾過工程からなっていた。すべての手順は、特別の定めのない限り、室温にて行った。
【0174】
望ましいストレプトコッカス・ニューモニアエ血清型の発酵槽培養物からの清澄化ブロスを、100kDa MWCOフィルターを使用して濃縮および透析濾過した。透析濾過は、9.0未満のpHにてリン酸ナトリウム緩衝液を使用して行った。透析濾過は、核酸、タンパク質、および多糖などの高分子量バイオポリマーから低分子量培地成分を除去した。
【0175】
多糖を、ストック溶液からのHBを添加して1%HB(w/v)の最終濃度とすることにより、濃縮および透析濾過した溶液から沈殿させた(2.5%の最終濃度であった血清型23Fを除いて)。多糖/HB沈殿物をデプスフィルター上に捕捉し、濾液を廃棄した(注:血清型14は沈殿しない。したがって、濾液を保持した)。多糖沈殿物を、沈殿物を含有するデプスフィルターに通して塩化ナトリウム溶液を再循環することにより再可溶化および溶出した。次いで、フィルターを、追加の塩化ナトリウム溶液ですすいだ。
【0176】
ヨウ化ナトリウム(NaI)を、ストックNaI溶液から多糖溶液に添加して0.5%の最終濃度とし、HBを沈殿させた(0.25%の最終濃度であった血清型6Bを除いて)。沈殿物を深層濾過により除去した。濾液は、目標多糖を含有していた。フィルターを廃棄した。次いで、多糖を0.2μmフィルターに通して濾過した。
【0177】
多糖溶液を、30kDa MWCOウルトラフィルター上にて濃縮し、塩化ナトリウム溶液で透析濾過した。
【0178】
部分的に精製した多糖溶液を、活性炭を含浸させたデプスフィルターに通して濾過することによりさらに精製した。濾過の後に、炭素フィルターを塩化ナトリウム溶液ですすいだ。すすぎ液を多糖溶液と合わせ、次いで、0.2μmフィルターに通して濾過した。
【0179】
多糖溶液を、30kDa MWCOウルトラフィルター上にて濃縮し、フィルターを、塩化ナトリウム溶液ですすいだ。pHをチェックし、7.0±0.3に調整した。
【0180】
セラミックヒドロキシアパタイト(HA)カラムを、pHが7.0±0.3になり伝導率が26±4μSになるまで、塩化ナトリウムを含有するリン酸ナトリウム緩衝液で平衡化した。次いで、多糖溶液をカラム上にロードした。これらの条件下で、樹脂および多糖に結合している不純物を、カラムからのフロースルー中に回収した。多糖溶液を、0.2μmフィルターに通して濾過した。
【0181】
多糖溶液を、30kDa MWCOフィルターを使用して濃縮した。次いで、濃縮物を、伝導率が15μS未満になるまで、WFIで透析濾過した。
【0182】
透析濾過した多糖溶液を、0.2μm膜フィルターに通してバルク容器中に濾過し、2℃〜8℃にて保存した。
【0183】
実施例14
肺炎球菌糖類−CRM197コンジュゲートの調製
血清型4、6B、9V、14、18C、19F、および23Fについて
活性化プロセス
異なる血清型糖類は、この実施例に記載されているように、活性化(活性化前に加水分解するかまたは加水分解しない)およびコンジュゲーション(水性またはDMSO反応)のための異なる経路に従う。
【0184】
多糖を、バルク容器から反応器に移した。次いで、多糖を、WFIおよびリン酸ナトリウム中で希釈して1.6〜2.4mg/mLの最終濃度範囲とした。
【0185】
工程1.
血清型6B、9V、14、19F、および23Fについては、pHをpH6.0±0.3に調整した。
【0186】
血清型4については、塩酸(最終酸濃度0.01M)を添加し、溶液を45℃±2℃にて25〜35分にわたってインキュベートした。加水分解を、21〜25℃まで冷却し、1Mリン酸ナトリウムを添加してpH6.7±0.2の目標とすることにより停止させた。インプロセス試験を行い、適切なレベルの脱ピルビル化を確認した。
【0187】
血清型18Cについては、氷酢酸(0.2M最終酸濃度)を添加し、溶液を94℃±2℃にて205〜215分にわたってインキュベートした。次いで、温度を21〜25℃まで下げ、1〜2Mリン酸ナトリウムを添加してpH6.8±0.2の目標とした。
【0188】
工程2:過ヨウ素酸反応
肺炎球菌糖類活性化に必要とされる過ヨウ素酸ナトリウムモル当量は、総糖類含有量を使用して決定した(血清型4を除いて)。血清型4については、糖類1モル当たり過ヨウ素酸ナトリウム0.8〜1.2モルの比を使用した。十分に混合しながら、酸化反応を、温度が15℃以下である19Fを除くすべての血清型について、21〜25℃にて16〜20時間で進行させた。
【0189】
工程3:限外濾過
酸化した糖類を、100kDa MWCOウルトラフィルター(18Cについては5kDaウルトラフィルター)上にてWFI(血清型19Fについては0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液pH6.0)で濃縮および透析濾過した。浸透液を廃棄し、保持液を0.22μmフィルターに通して濾過した。
【0190】
工程4:凍結乾燥
血清型4、9V、および14については、濃縮糖類をCRM197担体タンパク質と混合し、ガラスボトルに充填し、シェル凍結し、−65℃以下にて保存した。凍結した濃縮糖類−CRM197を凍結乾燥し、次いで、−25℃±5℃にて保存した。
【0191】
血清型6B、19F、および23Fについては、コンジュゲーション反応混合物中で5%±3%ショ糖濃度となるように計算された指定量のショ糖を添加した。血清型18Cは、ショ糖添加を必要としなかった。次いで、濃縮糖類をガラスボトルに充填し、シェル凍結し、−65℃以下にて保存した。凍結した濃縮糖類を凍結乾燥し、次いで、−25℃±5℃にて保存した。
【0192】
コンジュゲーションプロセス
2種類のコンジュゲーションプロセス、すなわち、血清型4、9V、14および18Cについては水性コンジュゲーション、血清型6B、19Fおよび23FについてはDMSOコンジュゲーションを使用した。
【0193】
水性コンジュゲーション
工程1:溶解
血清型4、9V、および14については、凍結乾燥した活性化糖類−CRM197混合物を解凍し、室温にて平衡化した。次いで、凍結乾燥した活性化糖類−CRM197を、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液中で、
・血清型4および9Vについては、糖類16〜24g当たり緩衝液1L
・血清型14については、糖類6〜10g当たり緩衝液1L
の典型的な比で再構成した。
【0194】
反応混合物を、完全に溶解するまで、血清型9Vについては37℃±2℃にて、血清型4および14については23℃±2℃にてインキュベートした。
【0195】
血清型18Cについては、凍結乾燥した糖類を、CRM197溶液1L当たりリン酸ナトリウム0.11Lの典型的な比で、1M第二リン酸ナトリウム中のCRM197の溶液中で再構成した。反応混合物(8〜12g/L糖類濃度)を、完全に溶解するまで、23℃±2℃にてインキュベートした。
【0196】
pHは、この段階でインプロセスコントロールとして試験した。
【0197】
工程2:コンジュゲーション反応
血清型4および9Vについては、コンジュゲーション反応を、シアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液(100mg/mL)を添加して糖類1モル当たりシアノ水素化ホウ素ナトリウム1.0〜1.4モルとすることにより開始させた。反応混合物を37℃±2℃にて44〜52時間にわたってインキュベートした。次いで、温度を23℃±2℃まで下げ、塩化ナトリウム0.9%を反応器に添加した。水素化ホウ素ナトリウム溶液(100mg/mL)を添加して糖類1モル当たり水素化ホウ素ナトリウム1.8〜2.2モル当量とした。混合物を23℃±2℃にて3〜6時間にわたってインキュベートした。混合物を塩化ナトリウム0.9%で希釈し、反応器をすすいだ。希釈したコンジュゲーション混合物を、1.2μmのプレフィルターを使用して保持容器中に濾過した。
【0198】
血清型14および18Cについては、コンジュゲーション反応を、シアノ水素化ホウ素溶液(100mg/mL)を添加して糖類1モル当たりシアノ水素化ホウ素ナトリウム1.0〜1.4モルとすることにより開始させた。反応混合物を23℃±2℃にて12〜24時間にわたってインキュベートした。温度を37℃±2℃まで上げ、反応物を72〜96時間にわたってインキュベートした。次いで、温度を23℃±2℃まで下げ、0.9%塩化ナトリウムを反応器に添加した。水素化ホウ素ナトリウム溶液(100mg/mL)を添加して糖類1モル当たり水素化ホウ素ナトリウム1.8〜2.2モル当量とした。混合物を23℃±2℃にて3〜6時間にわたってインキュベートした。混合物を0.9%塩化ナトリウムで希釈し、反応器をすすいだ。次いで、希釈したコンジュゲーション混合物を、1.2μmプレフィルターを使用して保持容器中に濾過した。
【0199】
工程3:限外濾過100kDa
希釈したコンジュゲーション混合物を、100kDa MWCOウルトラフィルター上にて最少で15容量(血清型4)か40容量(血清型9V、14、および18C)のどちらかの0.9%塩化ナトリウムで濃縮および透析濾過した。
【0200】
浸透液を廃棄した。
【0201】
血清型4については、保持液を0.45μmフィルターに通して濾過した。
【0202】
インプロセスコントロール(糖類含有量)は、この工程で行った。
【0203】
工程4:HAカラム精製
この工程は、血清型4コンジュゲートについてのみ行った。
【0204】
HAカラムを、まず、0.5Mリン酸ナトリウム緩衝液を使用して中和し(pH7.0±0.3)、次いで、0.9%の塩化ナトリウムで平衡化した。濾過した保持液(血清型4)を、1.0L/分の流量にてカラムにロードした。カラムを、2.0L/分以下の流量にて0.9%塩化ナトリウムで洗浄した。次いで、生成物を、2.0L/分以下の流量にて0.5Mのリン酸ナトリウム緩衝液で溶出した。
【0205】
次いで、HA画分を、100kDa MWCO膜上にて最少で20容量の0.9%塩化ナトリウムで濃縮および透析濾過した。浸透液を廃棄した。
【0206】
工程5:滅菌濾過
100kDa MWCO透析濾過の後の保持液を0.22μmフィルターに通して濾過した。インプロセスコントロール(糖類含有量、遊離タンパク質、遊離糖類およびシアン化物)を、濾過した生成物について行った。濾過した保持液に対するインプロセスコントロールを行い、FBC目標を満たすために追加の濃縮、透析濾過、および/または希釈が必要か否かを決定した。これらの試験および追加試験をFBCサンプルで繰り返した。
【0207】
必要に応じて、濾過したコンジュゲートを、0.9%塩化ナトリウムで希釈して0.55g/L未満の最終濃度とした。糖類含有量、タンパク質含有量および糖類:タンパク質比についての遊離試験をこの段階で行った。
【0208】
最後に、コンジュゲートを濾過し(0.22μm)、2.64g/キャニスターの典型的な量で10Lステンレス鋼キャニスターに充填した。この段階で、収率、糖類含有量、タンパク質含有量、pH、糖類:タンパク質比、およびリシン含有量を、インプロセスコントロールとして行った。遊離試験(外観、遊離タンパク質、遊離糖類、内毒素、分子サイズ決定、残留シアン化物、糖類同一性、CRM197同一性)をこの段階で行った。
【0209】
DMSOコンジュゲーション
工程I:溶解
凍結乾燥した活性化糖類血清型6B、19F、23F、および凍結乾燥したCRM197担体タンパク質を室温にて平衡化し、DMSO中で再構成した。溶解濃度は、典型的には、DMSO1リットル当たり糖類2〜3グラム(2〜2.5gタンパク質)の範囲であった。
【0210】
工程II:コンジュゲーション反応
活性化糖類およびCRM197担体タンパク質を、血清型6Bおよび19FについてはCRM1971g当たり糖類0.6〜1.0gの比範囲で、または血清型23FについてはCRM1971g当たり糖類1.2〜1.8gの比範囲で、23℃±2℃にて60〜75分にわたって混合した。
【0211】
コンジュゲーション反応を、活性化糖類1モルに対するシアノ水素化ホウ素ナトリウム0.8〜1.2モル当量の比でシアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液(100mg/mL)を添加することにより開始させた。WFIを、反応混合物に添加して1%(v/v)の目標とし、混合物を、23℃±2℃にて40時間以上にわたってインキュベートした。
【0212】
水素化ホウ素ナトリウム溶液、100mg/mL(典型的には、活性化糖類1モル当たり水素化ホウ素ナトリウム1.8〜2.2モル当量)およびWFI(目標5%v/v)を反応物に添加し、混合物を23℃±2℃にて3〜6時間にわたってインキュベートした。この手順は、糖類上に存在する未反応アルデヒドを減らした。次いで、反応混合物を、15℃未満にて0.9%塩化ナトリウムを含有する希釈タンクに移した。
【0213】
工程III:100kDa限外濾過
希釈したコンジュゲート混合物を、1.2μmフィルターに通して濾過し、100kDa MWCO膜上にて最少で15容量の0.9%塩化ナトリウム(血清型23Fについては、0.01Mリン酸ナトリウム/0.05MNaCl緩衝液を使用した)で濃縮および透析濾過した。浸透液を廃棄した。保持液を0.45μmフィルターに通して濾過した。インプロセス糖類含有量サンプルをこの段階で採取した。
【0214】
工程IV:DEAEカラム精製
この工程は、血清型23Fについてのみ行った。
【0215】
DEAEカラムを、0.01Mリン酸ナトリウム/0.05M塩化ナトリウム緩衝液で平衡化した。濾過した保持液(血清型23F)をカラム上にロードし、0.01Mリン酸ナトリウム/0.05M塩化ナトリウム緩衝液で洗浄した。次いで、カラムを、0.01Mリン酸ナトリウム/0.9%NaCl緩衝液で洗浄した。次いで、生成物を、0.01Mリン酸ナトリウム/0.5M塩化ナトリウム緩衝液で溶出した。
【0216】
工程V:100kDa限外濾過
6Bおよび19Fからの保持液を、少なくとも30容量の0.9%塩化ナトリウムで濃縮および透析濾過した。浸透液を廃棄した。
【0217】
血清型23Fからの溶出液を、最少で20容量の0.9%塩化ナトリウムで濃縮および透析濾過した。浸透液を廃棄した。
【0218】
工程VI:滅菌濾過
100kDa MWCO透析濾過の後の保持液を、0.22μmフィルターに通して濾過した。インプロセスコントロール(糖類含有量、遊離タンパク質、遊離糖類、残留DMSOおよび残留シアン化物)を、濾過した生成物で行った。濾過した保持液に対するインプロセスコントロールを行い、FBC目標を満たすために追加の濃縮、透析濾過、および/または希釈が必要か否かを決定した。これらの試験および追加試験を、FBCサンプルで繰り返した。
【0219】
必要に応じて、濾過したコンジュゲートを0.9%塩化ナトリウムで希釈して0.55g/L未満の最終濃度とした。糖類含有量、タンパク質含有量、および糖類:タンパク質の比についての遊離試験をこの段階で行った。
【0220】
最後に、コンジュゲートを濾過し(0.22μm)、2.64g/キャニスターの量で10Lステンレス鋼キャニスターに充填した。この段階で、収率、糖類含有量、タンパク質含有量、pH、糖類:タンパク質比およびリシン含有量を、インプロセスコントロールとして行った。遊離試験(外観、遊離タンパク質、遊離糖類、内毒素、分子サイズ決定、残留シアン化物、糖類同一性、CRM197同一性)をこの段階で行った。
【0221】
実施例15
多価肺炎球菌コンジュゲートワクチンの製剤化
13種類のコンジュゲートの最終バルク濃縮物は、0.85%塩化ナトリウムを含有する。タイプ3、6A、7F、および19Aバルク濃縮物は、pH5.8の5mMコハク酸ナトリウム緩衝液も含有する。バルク濃縮物の必要容量を、バッチ容量およびバルク糖類濃度に基づいて計算した。0.85%塩化ナトリウム(生理食塩水)の80%および必要量のコハク酸塩緩衝液を、予め標識した製剤化容器に添加した後に、バルク濃縮物を添加した。次いで、調製物を、Millipore Durapore膜フィルターユニットを使用することにより0.22μm膜に通して第2の容器中に滅菌濾過した。第1の容器を、0.85%塩化ナトリウムの残りの20%で洗浄し、溶液を同じフィルターに通過させ、第2の容器中に集めた。製剤化したバルクを、バルクリン酸アルミニウムの添加の間および添加の後に穏やかに混合した。必要に応じて、pHをチェックし調整した。製剤化したバルク生成物を2〜8℃にて保存した。
【0222】
製剤化したバルク生成物を、Becton Dickinsonから入手したタイプ1ホウケイ酸塩ガラスシリンジに充填した。ワクチンを、濁度について一定の間隔をおいてモニターし、充填操作の均一性を確保した。充填したワクチン(最終製品)を2〜8℃にて保存した。
【0223】
実施例16
13価コンジュゲートワクチンの免疫原生
今日まで、13vPnCワクチンに関する前臨床研究をウサギで行ってきた。研究#HT01−0021および#HT01−0036は、ストレプトコッカス・ニューモニアエ由来の莢膜多糖(PS)のCRM197との化学的コンジュゲーションの効果、およびウサギにおける13vPnCワクチンへの免疫応答に対するリン酸アルミニウム(AlPO)アジュバントの効果を独立して調べるために設計された。これらの効果を、血清IgG濃度については抗原特異的ELISAにより、抗体機能についてはオプソニン食作用アッセイ(OPA)により特徴付けた。
【0224】
研究#HT01−0021
研究#HT01−0021は、AlPOアジュバントを含む13vPnCワクチンがワクチン血清型特異的免疫応答を誘発する能力を調べた。13vPnCワクチンで表される肺炎球菌血清型は、タイプ1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19Fおよび23Fを包含する。第2の目的は、抗体応答の動力学および持続時間の評価を包含していた。ニュージーランド白色ウサギを、AlPO(100μg/投与量)と共に、またはAlPOなしで製剤化された各多糖の計画的ヒト臨床投与量(6Bの4μgを除いて、各PS 2μg)で0週目および2週目に筋肉注射で免疫化した。血清を様々な時点で集めた。血清型特異的IgGをELISAにより測定し、機能的活性をOPAにより評価した。
【0225】
表3は、13vPnCワクチンの2回投与の後に、プールした血清サンプルにおいて得られた幾何平均力価(GMT)を示している。IgG GMTの比を使用し、4週目から0週目までの応答を比較した。これらのデータは、13vPnC製剤におけるAlPOの包含が、アジュバントのない同じワクチンと比べ、より高いレベルのIgG抗体を誘発したことを立証している。抗体応答は、AlPOが製剤中に包含された場合により大きいが、これらの増加は、統計的に有意ではなかった。
【0226】
機能的抗体応答も、2種類の13vPnC製剤による免疫化の後にウサギで評価した(表4)。アジュバントを含む、またはアジュバントを含まないワクチン製剤を比較すると、より高いOPA GMTは、13vPnC+AlPOワクチン処置群で観測された。OPA力価は、両グループにおけるすべてのワクチン血清型に対して4週目の血清プールで検出された。血清型の大部分について、4週目に測定されたOPA力価は、0週目(ベースライン)のOPA力価に比べて少なくとも4倍高かった。
【0227】
13vPnCワクチン血清型のそれぞれに対する動力学的応答を、両処置群の血清プールから評価した。各血清型に対するIgG力価を、0週目ならびに、1、2、3、4、8、12、26、および39週目における採血から測定し、次いで、比較した。血清型1を除いて、アジュバント化ワクチンを受けた動物における抗体応答は、非アジュバント化ワクチンを受けた動物を上回り、免疫化スケジュールの2週目でピークに達した(データ省略)。
【0228】
全体として、データは、リン酸アルミニウムと共に製剤化された13vPnCワクチンが、ウサギにおいて免疫原性であり、ワクチンに含有される肺炎球菌莢膜多糖に対して実質的な抗体応答を誘発し、これらの応答が、機能的活性に関係していることを示している。13vPnC+AlPOによる免疫化の後に7種類の中核血清型に対して観測された応答は、7価製剤に対するウサギの過去の応答と一致している。
【0229】
【表3】

【0230】
【表4】

【0231】
研究#HT01−0036
研究#HT01−0036は、CRM197タンパク質とのコンジュゲーションを含む、または含まない13vPnCワクチンによる免疫化の後の、ワクチンに含有される多糖(PS)に対するウサギ免疫応答を比較した。ニュージーランド白色サギを、各PS2.2μg(6Bの4.4μgを除いて)の投与量で、0週目および2週目に筋肉注射で免疫化した。動物は、3種類のワクチン調製物、すなわち、(a)13vPnC(CRM197に直接コンジュゲートしているPS)、(b)13vPnPS(遊離PS)、または(c)13vPnPS+CRM197(CRM197と混合された遊離PS)のうちの1つを受けた。すべてのワクチン調製物は、125μg/投与量でアジュバントとしてのAlPOを含有していた。
【0232】
すべてのワクチン調製物についての血清型特異的免疫応答を、IgG ELISAおよび機能的抗体を測定する補体仲介性OPAで評価した。免疫応答を処置群間で比較した。
【0233】
表5は、抗原特異的IgG ELISAで分析した4週目の血液から得られたGMTデータを示している。追加分析は、0週目に対する4週目のGMT値の比を示している。データは、コンジュゲートワクチン調製物が、遊離PSまたは遊離PS+CRM197ワクチンよりも高い血清IgG力価を誘発したことを示している。ストレプトコッカス・ニューモニアエタイプ14を除いて、13vPnCワクチンは、OPAにおいてストレプトコッカス・ニューモニアエの代表的な株に対する機能的抗体を誘導することができた(表6)。13vPnPSか13vPnPS+CRM197ワクチンのどちらかによる2種類の免疫化の後に、どちらも、測定した13種類のうちの10種類の血清型について、0週目に比べて4週目に8倍以上のOPA力価を誘導することはできなかった(表6)。
【0234】
結論として、これらの結果は、13価肺炎球菌ワクチン多糖のコンジュゲーションが、遊離多糖単独または非コンジュゲートCRM197と混合された遊離多糖で見られるよりも高い血清IgG力価および全体的な大きい機能的抗体活性を生み出すことを示している。
【0235】
【表5】

【0236】
【表6】

【0237】
実施例17
血清型1肺炎球菌糖類−CRM197コンジュゲーションについての代替手順
【0238】
精製多糖の容器を解凍し、反応容器中で合わせた。容器に、30mM重炭酸ナトリウム/炭酸ナトリウム緩衝液、pH9.0を、50℃にて3時間にわたる部分脱O−アセチル化(加水分解)のために添加した。約40モルパーセントまでの脱O−アセチル化を行った。反応物を20℃まで冷却し、中和を、0.2M酢酸により5.0〜7.0のpHまで行った。過ヨウ素酸ナトリウム存在下の部分酸化を2〜8℃におけるインキュベーションにより行い、混合物を15〜21時間にわたって撹拌した。
【0239】
反応混合物を、30K MWCO再生セルロース膜を使用して10倍容量の0.9%生理食塩水に対する透析濾過により精製した。精製した活性化多糖を、2:1の多糖/タンパク質比でCRM197と混ぜ合わせ、−75℃にてシェル凍結し、共凍結乾燥した。共凍結乾燥の後に、多糖/CRM197混合物を、コンジュゲーションまで−25°±5℃にて保存した。共凍結乾燥した多糖/CRM197混合物に、1Mリン酸ナトリウム緩衝液を添加し、最終0.2Mイオン強度および7.5のpHとし、次いで、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加した。反応物を、15〜21時間にわたって23℃にてインキュベートし、続いて、66〜78時間にわたって37℃にて2回目のインキュベーションを行った。シアノ水素化ホウ素インキュベーションの後に、反応混合物を冷たい生理食塩水で希釈し、続いて、1M炭酸ナトリウムを添加して反応混合物をpH9.0に調整した。未反応アルデヒドを、3〜6時間にわたる23℃におけるインキュベーションにより、水素化ホウ素ナトリウムの添加によりクエンチした。
【0240】
反応混合物を、生理食塩水で2倍に希釈し、0.45〜5μmプレフィルターに通して保持液容器中に移し、次いで、0.15Mリン酸塩緩衝液、pH6.0で30倍に、および生理食塩水で20倍に透析濾過した。保持液を0.2μmフィルターに通して濾過した。コンジュゲート溶液を、0.9%生理食塩水中で0.5mg/mLの目標まで希釈し、次いで、クラス100フード内の最終バルク濃縮物容器中に滅菌濾過した。コンジュゲートを2〜8℃にて保存した。
【0241】
コンジュゲートのキャラクタリゼーションについては、実施例2を参照されたい。
【0242】
上記の議論および実施例は、単に、特定の実施形態の詳細な説明を提示するものであることが理解されるべきである。したがって、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更形態および等価形態を製造することができることが当業者に明らかにされるべきである。
【0243】
本特許出願に規定されているすべての学術論文、他の参考文献、特許および特許出願は、全体として参照により組み込まれるものとする。
(参考文献)
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34. U.S. Patent No. 4,673,574.
35. U.S. Patent No. 4,902,506.

【特許請求の範囲】
【請求項1】
担体タンパク質に共有結合しているストレプトコッカス・ニューモニアエ血清型1多糖を含む免疫原性コンジュゲートを製造するための方法であって、
(a)精製血清型1多糖をアルカリ性pH緩衝液と反応させて部分脱O−アセチル化血清型1多糖にすること、
(b)部分脱O−アセチル化血清型1多糖を弱酸と反応させ、中和された部分脱O−アセチル化血清型1多糖にすること、
(c)中和された部分脱O−アセチル化血清型1多糖を酸化剤と反応させて活性化血清型1多糖にすること、
(d)活性化血清型1多糖を担体タンパク質と混ぜ合わせること、
(e)混ぜ合わせた活性化血清型1多糖および担体タンパク質を還元剤と反応させて血清型1多糖:担体タンパク質コンジュゲートにすること、および
(f)血清型1多糖:担体タンパク質コンジュゲート中の未反応アルデヒドをキャッピングして、担体タンパク質に共有結合しているストレプトコッカス・ニューモニアエ血清型1多糖を含む免疫原性コンジュゲートにすることを含む方法。
【請求項2】
担体タンパク質と混ぜ合わせる前に、活性化血清型1多糖を精製することをさらに含む請求項1に記載の方法。
【請求項3】
還元剤と反応させる前に、混ぜ合わせた活性化血清型1多糖および担体タンパク質を共凍結乾燥することをさらに含む請求項1に記載の方法。
【請求項4】
免疫原性コンジュゲートを精製することをさらに含む請求項1に記載の方法。
【請求項5】
アルカリ性pH緩衝液が重炭酸塩/炭酸塩緩衝液である請求項1に記載の方法。
【請求項6】
弱酸が酢酸である請求項1に記載の方法。
【請求項7】
弱酸が低イオン強度鉱酸である請求項1に記載の方法。
【請求項8】
低イオン強度鉱酸が塩酸である請求項7に記載の方法。
【請求項9】
酸化剤が過ヨウ素酸ナトリウムである請求項1に記載の方法。
【請求項10】
担体タンパク質がCRM197である請求項1に記載の方法。
【請求項11】
還元剤がシアノ水素化ホウ素ナトリウムである請求項1に記載の方法。
【請求項12】
未反応アルデヒドをキャッピングすることが、血清型1多糖:担体タンパク質コンジュゲートを水素化ホウ素ナトリウムと反応させることを含む請求項1に記載の方法。
【請求項13】
担体タンパク質に共有結合しているストレプトコッカス・ニューモニアエ血清型1多糖を含む免疫原性コンジュゲートを製造するための方法であって、
(a)精製血清型1多糖を重炭酸塩/炭酸塩緩衝液と反応させて部分脱O−アセチル化血清型1多糖にすること、
(b)部分脱O−アセチル化血清型1多糖を酢酸と反応させ、中和された部分脱O−アセチル化血清型1多糖にすること、
(c)中和された部分脱O−アセチル化血清型1多糖を過ヨウ素酸ナトリウムと反応させて活性化血清型1多糖にすること、
(d)活性化血清型1多糖を精製すること、
(e)活性化血清型1多糖を担体タンパク質と混ぜ合わせること、
(f)混ぜ合わせた活性化血清型1多糖および担体タンパク質を共凍結乾燥すること、
(g)共凍結乾燥した活性化血清型1多糖および担体タンパク質をシアノ水素化ホウ素ナトリウムと反応させて血清型1多糖:担体タンパク質コンジュゲートにすること、および
(h)血清型1多糖:担体タンパク質コンジュゲート中の未反応アルデヒドを水素化ホウ素ナトリウムでキャッピングして、担体タンパク質に共有結合しているストレプトコッカス・ニューモニアエ血清型1多糖を含む免疫原性コンジュゲートにすることを含む方法。
【請求項14】
免疫原性コンジュゲートを精製することをさらに含む請求項13に記載の方法。
【請求項15】
担体タンパク質がCRM197である請求項13に記載の方法。
【請求項16】
活性化されたストレプトコッカス・ニューモニアエ血清型1多糖を製造するための方法であって、
(a)精製血清型1多糖をアルカリ性pH緩衝液と反応させて部分脱O−アセチル化血清型1多糖にすること、
(b)部分脱O−アセチル化血清型1多糖を弱酸と反応させ、中和された部分脱O−アセチル化血清型1多糖にすること、および
(c)中和された部分脱O−アセチル化血清型1多糖を酸化剤と反応させて活性化血清型1多糖にすることを含む方法。
【請求項17】
酸化の後に、活性化血清型1多糖を精製することをさらに含む請求項16に記載の方法。
【請求項18】
アルカリ性pH緩衝液が重炭酸塩/炭酸塩緩衝液である請求項16に記載の方法。
【請求項19】
弱酸が酢酸である請求項16に記載の方法。
【請求項20】
酸化剤が過ヨウ素酸ナトリウムである請求項16に記載の方法。

【図1】
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【図2】
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【図3】
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【公表番号】特表2010−513550(P2010−513550A)
【公表日】平成22年4月30日(2010.4.30)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2009−543058(P2009−543058)
【出願日】平成19年12月10日(2007.12.10)
【国際出願番号】PCT/US2007/086976
【国際公開番号】WO2008/079653
【国際公開日】平成20年7月3日(2008.7.3)
【出願人】(591011502)ワイス エルエルシー (573)
【Fターム(参考)】