多剤耐性緑膿菌検出用培地およびそれを用いた検出方法
【課題】本発明の課題は、複数の抗菌剤を含み、用時調製を必要としない多剤耐性緑膿菌の検出用培地を提供することである。
【解決手段】本発明は、基礎培地にフルオロキノロン系抗菌剤、アミノ配糖体系抗菌剤およびセフェム系抗菌剤を含んでなる、多剤耐性緑膿菌検出用培地およびそれを用いた多剤耐性緑膿菌を検出する方法ならびに感染症の予防及び感染症の患者に対する医療に関する法律に定められる薬剤耐性緑膿菌感染症の病原体を検出する方法に関する。
【解決手段】本発明は、基礎培地にフルオロキノロン系抗菌剤、アミノ配糖体系抗菌剤およびセフェム系抗菌剤を含んでなる、多剤耐性緑膿菌検出用培地およびそれを用いた多剤耐性緑膿菌を検出する方法ならびに感染症の予防及び感染症の患者に対する医療に関する法律に定められる薬剤耐性緑膿菌感染症の病原体を検出する方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多剤耐性緑膿菌（ＭＤＲＰ: Multi-Drug-Resistance-Pseudomonas aeruginosa）検出用培地およびそれを用いた検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、多剤耐性緑膿菌（ＭＤＲＰ）、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（ＶＲＳＡ）、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）、多剤耐性結核菌（ＭＤＲ−ＴＢ）など、複数の抗菌剤に対して耐性を有する病原体が問題となっている。
我が国では、感染症の予防及び感染症の患者に対する医療に関する法律（以下、感染症法という）において、一類感染症から五類感染症までが規定されており、多剤耐性緑膿菌に関しては、「薬剤耐性緑膿菌感染症」が五類感染症の１つとされている（感染症法６条６項９号、感染症法施行規則１条３０号）。
【０００３】
感染症法に基づく薬剤耐性緑膿菌感染症の報告件数は、２００６年の段階でＭＲＳＡ感染症やＶＲＥ感染症に比べ低い値となっているが、毎月平均５０件前後の報告があり、年間の報告総件数は６４６件に達している。カルバペネムなどに耐性を獲得した緑膿菌は、血液疾患や悪性腫瘍の手術後、骨髄移植を含む臓器移植後などの患者から分離される事例も多く、患者が術後に感染症に対する抵抗力が低下し、敗血症や腹膜炎などを起こした場合、化学療法の効果が得られ難く、予後の悪化や死亡率を増加させる要因の１つとなっていることから、耐性の有無の確認は、的確な治療方法を早期に選択するために極めて重要な意味を持つ。また、病院内は清浄に保たれるべき場所であり、常に院内に耐性菌が存在しないことを確認する必要もある。
【０００４】
厚生労働省では、薬剤耐性緑膿菌感染症を「広域β−ラクタム剤、アミノ配糖体、フルオロキノロンの３系統の薬剤に対して耐性を示す緑膿菌による感染症」と定義し、その病原体となる緑膿菌の判定基準として、各抗菌剤を個別に添加した培地に接種して、各抗菌剤に対する最小発育阻止濃度を確認する方法（ＭＩＣ法）、または、培地に一定量の菌を接種した後、各抗菌剤を含ませた感受性ディスクを置き、得られる発育阻止円の大きさを調査する方法（ＤＩＳＣ法）を用い、以下のア〜ウの条件を全て満たした場合としている（非特許文献１）。
ア． イミペネムのＭＩＣ≧１６μｇ／ｍＬ又は、イミペネムの感受性ディスク（ＫＢ）の阻止円の直径が１３ｍｍ以下
イ． アミカシンのＭＩＣ≧３２μｇ／ｍＬ又は、アミカシンの感受性ディスク（ＫＢ）の阻止円の直径が１４ｍｍ以下
ウ． シプロフロキサシンのＭＩＣ≧４μｇ／ｍＬ又は、シプロフロキサシンの感受性ディスク（ＫＢ）の阻止円の直径が１５ｍｍ以下
【０００５】
上記の感染症法上の薬剤耐性緑膿菌か否かの判定を簡便にするため、緑膿菌選択培地に直接、イミペネム、アミカシン、シプロフロキサシンの３種類の抗菌剤を添加し、多剤耐性緑膿菌を検出する方法が提案されている。かかる方法では、緑膿菌の選択培養とＭＩＣ法を同時に実施することができ、多剤耐性の有無を１日で判定可能であるとされる（特許文献１、非特許文献２）。しかしながら、緑膿菌選択培地に前記の３種類の抗菌剤を添加した培地の有効期間は培地調製後１日程度であることから、該培地を用時調製する必要があって、結局、判定を行うためには培地を調製する時間が余分にかかることとなっていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００９−１５９８３７号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】厚生労働省、「感染症法に基づく医師及び獣医師の届出について ４２ 薬剤耐性緑膿菌感染症」、＜URL：http://www.mhlw.go.jp/bunya/kenkou/kekkaku-kansenshou11/01-05-42.html＞
【非特許文献２】川村久美子、「多剤耐性緑膿菌の検出方法およびそのキット」、名古屋大学医学・バイオ系特許フェア、平成２０年１１月２１日、Ｄ７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、本発明の課題は、複数の抗菌剤を含み、用時調製を必要としない多剤耐性緑膿菌の検出用培地を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意研究を重ねる中で、カルバペネム系抗菌剤（広域β−ラクタム剤）、アミノ配糖体、フルオロキノロンの３系統の薬剤を含む培地において、カルバペネム系抗菌剤が容易に分解してしまうことが検出用培地の有効期間を短くする原因であるとの知見を得た。かかる知見に基づき検討したところ、カルバペネム系抗菌剤に替えてセフェム系抗菌剤を用いた場合であっても同一または近似の検出結果が得られること、またセフェム系抗菌剤は生培地中で比較的安定であることを究明し、さらに研究を進めた結果、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち本発明は、基礎培地にフルオロキノロン系抗菌剤、アミノ配糖体系抗菌剤およびセフェム系抗菌剤を含んでなる、多剤耐性緑膿菌検出用培地に関する。
また本発明は、基礎培地が、緑膿菌選択培地である、前記の多剤耐性緑膿菌検出用培地に関する。
さらに本発明は、フルオロキノロン系抗菌剤が、シプロフロキサシンおよび／またはレボフロキサシンである、請求項１または２に記載の多剤耐性緑膿菌検出用培地に関する。
また本発明は、アミノ配糖体系抗菌剤が、アミカシン、トブラマイシンおよびアルベカシからなる群から選択される１種または２種以上である、前記の多剤耐性緑膿菌検出用培地に関する。
さらに本発明は、セフェム系抗菌剤が、セフェピムおよび／またはセフタジジムである、前記の多剤耐性緑膿菌検出用培地に関する。
【００１１】
また本発明は、フルオロキノロン系抗菌剤が、シプロフロキサシンであり、アミノ配糖体系抗菌剤がアミカシンであり、セフェム系抗菌剤がセフェピムである、前記の多剤耐性緑膿菌検出用培地に関する。
さらに本発明は、検出される多剤耐性緑膿菌が、感染症の予防及び感染症の患者に対する医療に関する法律に定められる薬剤耐性緑膿菌感染症の病原体である、前記の緑膿菌検出用培地に関する。
また本発明は、少なくとも３ヵ月の有効期間を有する、前記の多剤耐性緑膿菌検出用培地に関する。
さらに本発明は、前記の多剤耐性緑膿菌検出用培地を用いて、多剤耐性緑膿菌を検出する方法に関する。
また本発明は、感染症の予防及び感染症の患者に対する医療に関する法律に定められる薬剤耐性緑膿菌感染症の病原体を検出する方法であって、前記の多剤耐性緑膿菌検出用培地を用いて検出する、前記方法に関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、発育阻害機構が異なる３種類の抗菌剤を含むことから、治療において大きな障害となる多剤耐性緑膿菌を簡便に検出することができる。また、病院内の検査室等での用時調製を必要とすることがなく、生培地中では容易に分解してしまうカルバペネム系抗菌剤を含まないことから、長期保存が可能になり、工業的に大量生産して商品化することができ、生培地のまま市場に流通させても十分な有効期間を確保することができる。さらに、感染症法上の薬剤耐性緑膿菌感染症の病原体（薬剤耐性緑膿菌）を短時間で正確に判定することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の多剤耐性緑膿菌検出用培地は、基礎培地に、フルオロキノロン系抗菌剤、アミノ配糖体系抗菌剤、セフェム系抗菌剤が含まれている。このことから、これら添加した３種の抗菌剤のすべてに対して耐性を有する多剤耐性緑膿菌のみが発育する。
基礎培地は、ミューラーヒントン寒天培地やトリプトンソーヤ寒天培地といった一般的な細菌培養培地のほか、緑膿菌のみが発育するように選択剤（セトリミド、ナリジクス酸、セファロリジン、フシジンなど）が添加された緑膿菌選択培地であってもよい。かかる緑膿菌選択培地としては、セトリミド寒天培地、ＮＡＣ寒天培地、CHROMagar Pseudomonas（CHROMagar社製）などがあげられる。
【００１４】
添加する抗菌剤のうち少なくとも一つの抗菌剤の濃度が適正な濃度よりも低い場合、かかる抗菌剤による発育阻止能が適正な濃度の抗菌剤を添加した場合よりも弱くなり、多剤耐性を持たない緑膿菌も発育してしまうことから、多剤耐性緑膿菌と多剤耐性を持たない緑膿菌とが培地上で同様に発育する結果となり、培地上の発育から多剤耐性緑膿菌を検出することは困難となる。
【００１５】
一方、添加する抗菌剤のうち少なくとも一つの抗菌剤の濃度が適正な濃度よりも高い場合、かかる抗菌剤による発育阻止能が適正な濃度の抗菌剤を添加した場合よりも強くなり、多剤耐性緑膿菌のうち中度耐性のものが培地上で発育しない結果となり、培地上の発育からこれら中度耐性の多剤耐性緑膿菌を検出することは困難となる。
これらのことから、多剤耐性緑膿菌を検出するために適した抗菌剤添加濃度は、多剤耐性緑膿菌の発育を抑制せず、多剤耐性を持たない緑膿菌の発育を抑制する濃度となる。
【００１６】
かかる観点から最適化を行った場合、各抗菌剤において添加に適した濃度は下記のとおりである。すなわち、各抗菌剤において添加に適した濃度は、一致率が８５〜１００％となる濃度であることが好ましく、さらに好ましくは、一致率が９５〜１００％となる濃度である。なお、ここで「一致率」とは、ＣＬＳＩのディスク拡散法に基づく判定と本発明の多剤耐性緑膿菌検出用培地を用いた判定が一致した株数を試験菌株の総数で割った値を百分率で表した数値を示す。
【００１７】
フルオロキノロン系抗菌剤としては、シプロフロキサシン（ＣＰＦＸ）、レボフロキサシン、オフロキサシンなどが挙げられ、これらのうち１種または２種以上を用いることができるが、シプロフロキサシンおよび／またはレボフロキサシンを用いることが好ましく、とくにシプロフロキサシンを用いることが好ましい。フルオロキノロン系抗菌剤の添加量は、一致率の観点から、０．５〜４μｇ／ｍＬが好ましく、さらに好ましくは０．５〜２μｇ／ｍＬである。
【００１８】
アミノ配糖体系抗菌剤としては、アミカシン（ＡＭＫ）、トブラマイシン、アルベカシンなどが挙げられ、これらのうち１種または２種以上を用いることができるが、アミカシンを用いることが好ましい。アミノ配糖体系抗菌剤の添加量は、一致率の観点から、０．５〜１６μｇ／ｍＬが好ましい。
【００１９】
セフェム系の抗菌剤としては、セフェピム（ＣＦＰＭ）、セフタジジムなどが挙げられ、これらのうち１種または２種以上を用いることができるが、セフェピムを用いることが好ましい。セフェム系の抗菌剤の添加量は、一致率の観点から、０．０３〜８μｇ／ｍＬが好ましく、さらに好ましくは０．０６〜８μｇ／ｍＬである。
【００２０】
本発明においては、多剤耐性緑膿菌として、感染症法に定められる薬剤耐性緑膿菌感染症の病原体（薬剤耐性緑膿菌）を検出することも可能である。なお、薬剤耐性緑膿菌は、感染症法上、イミペネム、アミカシン、シプロフロキサシンの３種の抗菌剤に対する耐性を指標として判定されるものであり、本発明の検出用培地によって検出されたものが直ちに厳密な意味での薬剤耐性緑膿菌と結論付けることはできない。しかしながら、本発明の検出用培地は、基礎培地、フルオロキノロン系抗菌剤、アミノ配糖体系抗菌剤、セフェム系抗菌剤の３種の抗菌剤の種類および各添加量を調整することによって、相当の確度で薬剤耐性緑膿菌と判定されるべき多剤耐性緑膿菌を検出することが可能である。すなわち本発明においては、フルオロキノロン系抗菌剤、アミノ配糖体系抗菌剤、セフェム系抗菌剤の３種の抗菌剤を、シプロフロキサシン（ＣＰＦＸ）、アミカシン（ＡＭＫ）、セフェピム（ＣＦＰＭ）の組み合わせで用いることが好ましい。
【００２１】
本発明において、検体としては、通常検体とされるものであればとくに限定されないが、例えば、尿、血漿などの臨床検体、病院内で汚染されたドアノブ、手すり、壁ぬぐい液や器具ぬぐい液などの院内検体などが挙げられる。
本発明の多剤耐性緑膿菌検出用培地は、少なくとも３ヵ月、好ましくは少なくとも４ヵ月の有効期間を有する。
【００２２】
以下に実施例によって本発明を詳述するが、実施の形態は発明を限定するものではなく例示であり、本発明は記載される特徴や組み合わせなどに限定されるものではない。なお、以下、シプロフロキサシン、アミカシン、セフェピムを、夫々、ＣＰＦＸ、ＡＭＫ、ＣＦＰＭと略号により記載することがある。
【実施例】
【００２３】
〔実施例１〕多剤耐性緑膿菌検出用培地１〜７の作製
以下の作製手順で、基礎培地としてCHROMagar Pseudomonasを用いた本発明の検出用培地１〜７を作製した。
１０００ｍＬの精製水にCHROMagar Pseudomonas（CHROMagar社製）３３．２ｇを溶解させ、沸騰させた後に、５０℃に冷ましてから、アミカシン二硫酸塩、シプロフロキサシン、セフェピム塩酸塩を表２に記載の濃度となるように添加し、ペトリ−シャーレ１枚に１８ｍＬずつ分注し、室温で放置して冷却し寒天を固めて検出用培地１〜７を作製した。作製した検出用培地１〜７は、半透明で淡白色の培地であった。
検出用培地１〜７を用いた検出は、検体を含む試料を塗沫し、３６±１℃の恒温下で２０〜２４時間培養した後に培地上の緑色〜青緑色のコロニーの有無を確認することで行った。
検出用培地１〜７を用いた検出では、培地３および培地４が多剤耐性緑膿菌のみを選択的に検出できることが分かった。
【００２４】
〔実施例２〕多剤耐性緑膿菌検出用培地８〜１３の作製
以下の作製手順で、基礎培地としてＮＡＣ寒天培地を用いた本発明の検出用培地８〜１３を作製した。
１０００ｍＬの精製水にＮＡＣ寒天培地（日水製薬株式会社）３５．７ｇを溶解させ、沸騰させた後に、５０℃に冷ましてから、アミカシン二硫酸塩、シプロフロキサシン、セフェピム塩酸塩を表３に記載の濃度となるように添加し、ペトリ−シャーレ１枚に１８ｍＬずつ分注し、室温で放置して冷却し寒天を固めて検出用培地８〜１３を作製した。作製した検出用培地８〜１３は、半透明で淡黄色の培地であった。
検出用培地８〜１３を用いた検出は、検体を含む試料を塗沫し、３６±１℃の恒温下で２０〜２４時間培養した後に培地上の黄色〜黄緑色のコロニーの有無を確認することで行った。
検出用培地８〜１３を用いた検出では、培地１０が多剤耐性緑膿菌のみを選択的に検出できることが分かった。
【００２５】
〔実施例３〕多剤耐性緑膿菌検出用培地１４〜１９の作製
以下の作製手順で、基礎培地としてミューラーヒントン培地を用いた本発明の検出用培地１４〜１９を作製した。
１０００ｍＬの精製水にミューラーヒントン寒天培地（オキソイド社製）３８ｇを懸濁させ、１２１℃で１５分間高圧蒸気滅菌したのち、５０℃に冷ましてから、アミカシン二硫酸塩、シプロフロキサシン、セフェピム塩酸塩を表４に記載の濃度となるように添加し、ペトリ−シャーレ１枚に１８ｍＬずつ分注し、室温で放置して冷却し寒天を固めて検出用培地１４〜１９を作製した。作製した検出用培地１４〜１９は、半透明で淡黄色の培地であった。
検出用培地１４〜１９を用いた検出は、検体を含む試料を塗沫し、３６±１℃の恒温下で２０〜２４時間培養した後に培地上の白色〜緑色のコロニーの有無を確認することで行った。
検出用培地１４〜１９を用いた検出では、培地１７が多剤耐性緑膿菌のみを選択的に検出できることが分かった。
【００２６】
〔実施例４〕米国臨床検査標準化協会のディスク拡散法との比較
表１に示す臨床分離株である緑膿菌菌株１〜２７を対象に、米国臨床検査標準化協会（ＣＬＳＩ:Clinical and Laboratory Standards Institute、旧ＮＣＣＬＳ）のディスク拡散法に基づく判定結果と、本発明の多剤耐性緑膿菌検出用培地１〜１９を用いた判定結果とを比較した。
【００２７】
【表１】
【００２８】
【表２】
【００２９】
【表３】
【００３０】
【表４】
【００３１】
表２、３、４に示した結果から明らかなとおり、３種の抗菌剤の至適濃度は基礎培地との組み合わせにより変動するため、濃度を調整することが必要であり、多剤耐性緑膿菌検出用培地３、４、１０、１７は多剤耐性緑膿菌を検出するのに適した抗菌剤濃度で添加されていることが分かった。
【００３２】
〔実施例５〕多剤耐性緑膿菌検出用培地３の長期保存安定性
下記の緑膿菌（１）〜（３）を用いて、多剤耐性緑膿菌検出用培地３の長期保存安定性について検討した。
（１）多剤耐性緑膿菌（ＭＤＲＰ）
（２）イミペネム感受性・シプロフロキサシン耐性・アミカシン耐性の緑膿菌（ｎｏｎ−ＭＤＲＰ１）
（３）イミペネム感受性・シプロフロキサシン感受性・アミカシン耐性の緑膿菌（ｎｏｎ−ＭＤＲＰ２）
【００３３】
本発明の多剤耐性緑膿菌検出用培地３を用いた。
また、対照として、１０００ｍＬの精製水にCHROMagar Pseudomonas３３．２ｇを溶解させ、沸騰させた後に、５０℃に冷ましてから、アミカシン二硫酸塩１ｍｇ、シプロフロキサシン１ｍｇ、イミペネム１ｍｇを溶解し、ペトリ−シャーレ１枚に１８ｍＬ分注し、室温で放置して冷却し寒天を固めて多剤耐性緑膿菌検出用培地（対照培地）を作製し用いた。
多剤耐性緑膿菌検出用培地３および対照培地を遮光状態で冷蔵保存し、０ヵ月後、１ヵ月後、２ヵ月後、３ヵ月後、４ヵ月後に上記緑膿菌（１）〜（３）を接種し、３６℃±１℃の恒温下で２０〜２４時間培養し、各菌の発育を観察した。その結果、多剤耐性緑膿菌検出用培地３において、０ヵ月後の各菌の発育と４ヵ月後の各菌の発育は同等であった。
一方、対照培地では冷蔵保存１ヵ月後から非多剤耐性緑膿菌の発育が見られた。
【００３４】
【表５】
【００３５】
表５に示した結果から明らかなとおり、対照培地は冷蔵１ヵ月間で非多剤耐性緑膿菌が発育しているのに対して、本発明培地は冷蔵４ヵ月間は多剤耐性緑膿菌のみが選択的に発育する性能を有していることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明は、多剤耐性緑膿菌の検出が必要な検査室において、必要時に短時間で判定できる培地を提供する。また、従来の技術では、生培地を市場に流通させることはできなかったが、本発明では、保存安定性の向上により、常に一定の性能を有する製品を市場に流通させることができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多剤耐性緑膿菌（ＭＤＲＰ: Multi-Drug-Resistance-Pseudomonas aeruginosa）検出用培地およびそれを用いた検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、多剤耐性緑膿菌（ＭＤＲＰ）、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（ＶＲＳＡ）、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）、多剤耐性結核菌（ＭＤＲ−ＴＢ）など、複数の抗菌剤に対して耐性を有する病原体が問題となっている。
我が国では、感染症の予防及び感染症の患者に対する医療に関する法律（以下、感染症法という）において、一類感染症から五類感染症までが規定されており、多剤耐性緑膿菌に関しては、「薬剤耐性緑膿菌感染症」が五類感染症の１つとされている（感染症法６条６項９号、感染症法施行規則１条３０号）。
【０００３】
感染症法に基づく薬剤耐性緑膿菌感染症の報告件数は、２００６年の段階でＭＲＳＡ感染症やＶＲＥ感染症に比べ低い値となっているが、毎月平均５０件前後の報告があり、年間の報告総件数は６４６件に達している。カルバペネムなどに耐性を獲得した緑膿菌は、血液疾患や悪性腫瘍の手術後、骨髄移植を含む臓器移植後などの患者から分離される事例も多く、患者が術後に感染症に対する抵抗力が低下し、敗血症や腹膜炎などを起こした場合、化学療法の効果が得られ難く、予後の悪化や死亡率を増加させる要因の１つとなっていることから、耐性の有無の確認は、的確な治療方法を早期に選択するために極めて重要な意味を持つ。また、病院内は清浄に保たれるべき場所であり、常に院内に耐性菌が存在しないことを確認する必要もある。
【０００４】
厚生労働省では、薬剤耐性緑膿菌感染症を「広域β−ラクタム剤、アミノ配糖体、フルオロキノロンの３系統の薬剤に対して耐性を示す緑膿菌による感染症」と定義し、その病原体となる緑膿菌の判定基準として、各抗菌剤を個別に添加した培地に接種して、各抗菌剤に対する最小発育阻止濃度を確認する方法（ＭＩＣ法）、または、培地に一定量の菌を接種した後、各抗菌剤を含ませた感受性ディスクを置き、得られる発育阻止円の大きさを調査する方法（ＤＩＳＣ法）を用い、以下のア〜ウの条件を全て満たした場合としている（非特許文献１）。
ア． イミペネムのＭＩＣ≧１６μｇ／ｍＬ又は、イミペネムの感受性ディスク（ＫＢ）の阻止円の直径が１３ｍｍ以下
イ． アミカシンのＭＩＣ≧３２μｇ／ｍＬ又は、アミカシンの感受性ディスク（ＫＢ）の阻止円の直径が１４ｍｍ以下
ウ． シプロフロキサシンのＭＩＣ≧４μｇ／ｍＬ又は、シプロフロキサシンの感受性ディスク（ＫＢ）の阻止円の直径が１５ｍｍ以下
【０００５】
上記の感染症法上の薬剤耐性緑膿菌か否かの判定を簡便にするため、緑膿菌選択培地に直接、イミペネム、アミカシン、シプロフロキサシンの３種類の抗菌剤を添加し、多剤耐性緑膿菌を検出する方法が提案されている。かかる方法では、緑膿菌の選択培養とＭＩＣ法を同時に実施することができ、多剤耐性の有無を１日で判定可能であるとされる（特許文献１、非特許文献２）。しかしながら、緑膿菌選択培地に前記の３種類の抗菌剤を添加した培地の有効期間は培地調製後１日程度であることから、該培地を用時調製する必要があって、結局、判定を行うためには培地を調製する時間が余分にかかることとなっていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００９−１５９８３７号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】厚生労働省、「感染症法に基づく医師及び獣医師の届出について ４２ 薬剤耐性緑膿菌感染症」、＜URL：http://www.mhlw.go.jp/bunya/kenkou/kekkaku-kansenshou11/01-05-42.html＞
【非特許文献２】川村久美子、「多剤耐性緑膿菌の検出方法およびそのキット」、名古屋大学医学・バイオ系特許フェア、平成２０年１１月２１日、Ｄ７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、本発明の課題は、複数の抗菌剤を含み、用時調製を必要としない多剤耐性緑膿菌の検出用培地を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意研究を重ねる中で、カルバペネム系抗菌剤（広域β−ラクタム剤）、アミノ配糖体、フルオロキノロンの３系統の薬剤を含む培地において、カルバペネム系抗菌剤が容易に分解してしまうことが検出用培地の有効期間を短くする原因であるとの知見を得た。かかる知見に基づき検討したところ、カルバペネム系抗菌剤に替えてセフェム系抗菌剤を用いた場合であっても同一または近似の検出結果が得られること、またセフェム系抗菌剤は生培地中で比較的安定であることを究明し、さらに研究を進めた結果、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち本発明は、基礎培地にフルオロキノロン系抗菌剤、アミノ配糖体系抗菌剤およびセフェム系抗菌剤を含んでなる、多剤耐性緑膿菌検出用培地に関する。
また本発明は、基礎培地が、緑膿菌選択培地である、前記の多剤耐性緑膿菌検出用培地に関する。
さらに本発明は、フルオロキノロン系抗菌剤が、シプロフロキサシンおよび／またはレボフロキサシンである、請求項１または２に記載の多剤耐性緑膿菌検出用培地に関する。
また本発明は、アミノ配糖体系抗菌剤が、アミカシン、トブラマイシンおよびアルベカシからなる群から選択される１種または２種以上である、前記の多剤耐性緑膿菌検出用培地に関する。
さらに本発明は、セフェム系抗菌剤が、セフェピムおよび／またはセフタジジムである、前記の多剤耐性緑膿菌検出用培地に関する。
【００１１】
また本発明は、フルオロキノロン系抗菌剤が、シプロフロキサシンであり、アミノ配糖体系抗菌剤がアミカシンであり、セフェム系抗菌剤がセフェピムである、前記の多剤耐性緑膿菌検出用培地に関する。
さらに本発明は、検出される多剤耐性緑膿菌が、感染症の予防及び感染症の患者に対する医療に関する法律に定められる薬剤耐性緑膿菌感染症の病原体である、前記の緑膿菌検出用培地に関する。
また本発明は、少なくとも３ヵ月の有効期間を有する、前記の多剤耐性緑膿菌検出用培地に関する。
さらに本発明は、前記の多剤耐性緑膿菌検出用培地を用いて、多剤耐性緑膿菌を検出する方法に関する。
また本発明は、感染症の予防及び感染症の患者に対する医療に関する法律に定められる薬剤耐性緑膿菌感染症の病原体を検出する方法であって、前記の多剤耐性緑膿菌検出用培地を用いて検出する、前記方法に関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、発育阻害機構が異なる３種類の抗菌剤を含むことから、治療において大きな障害となる多剤耐性緑膿菌を簡便に検出することができる。また、病院内の検査室等での用時調製を必要とすることがなく、生培地中では容易に分解してしまうカルバペネム系抗菌剤を含まないことから、長期保存が可能になり、工業的に大量生産して商品化することができ、生培地のまま市場に流通させても十分な有効期間を確保することができる。さらに、感染症法上の薬剤耐性緑膿菌感染症の病原体（薬剤耐性緑膿菌）を短時間で正確に判定することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の多剤耐性緑膿菌検出用培地は、基礎培地に、フルオロキノロン系抗菌剤、アミノ配糖体系抗菌剤、セフェム系抗菌剤が含まれている。このことから、これら添加した３種の抗菌剤のすべてに対して耐性を有する多剤耐性緑膿菌のみが発育する。
基礎培地は、ミューラーヒントン寒天培地やトリプトンソーヤ寒天培地といった一般的な細菌培養培地のほか、緑膿菌のみが発育するように選択剤（セトリミド、ナリジクス酸、セファロリジン、フシジンなど）が添加された緑膿菌選択培地であってもよい。かかる緑膿菌選択培地としては、セトリミド寒天培地、ＮＡＣ寒天培地、CHROMagar Pseudomonas（CHROMagar社製）などがあげられる。
【００１４】
添加する抗菌剤のうち少なくとも一つの抗菌剤の濃度が適正な濃度よりも低い場合、かかる抗菌剤による発育阻止能が適正な濃度の抗菌剤を添加した場合よりも弱くなり、多剤耐性を持たない緑膿菌も発育してしまうことから、多剤耐性緑膿菌と多剤耐性を持たない緑膿菌とが培地上で同様に発育する結果となり、培地上の発育から多剤耐性緑膿菌を検出することは困難となる。
【００１５】
一方、添加する抗菌剤のうち少なくとも一つの抗菌剤の濃度が適正な濃度よりも高い場合、かかる抗菌剤による発育阻止能が適正な濃度の抗菌剤を添加した場合よりも強くなり、多剤耐性緑膿菌のうち中度耐性のものが培地上で発育しない結果となり、培地上の発育からこれら中度耐性の多剤耐性緑膿菌を検出することは困難となる。
これらのことから、多剤耐性緑膿菌を検出するために適した抗菌剤添加濃度は、多剤耐性緑膿菌の発育を抑制せず、多剤耐性を持たない緑膿菌の発育を抑制する濃度となる。
【００１６】
かかる観点から最適化を行った場合、各抗菌剤において添加に適した濃度は下記のとおりである。すなわち、各抗菌剤において添加に適した濃度は、一致率が８５〜１００％となる濃度であることが好ましく、さらに好ましくは、一致率が９５〜１００％となる濃度である。なお、ここで「一致率」とは、ＣＬＳＩのディスク拡散法に基づく判定と本発明の多剤耐性緑膿菌検出用培地を用いた判定が一致した株数を試験菌株の総数で割った値を百分率で表した数値を示す。
【００１７】
フルオロキノロン系抗菌剤としては、シプロフロキサシン（ＣＰＦＸ）、レボフロキサシン、オフロキサシンなどが挙げられ、これらのうち１種または２種以上を用いることができるが、シプロフロキサシンおよび／またはレボフロキサシンを用いることが好ましく、とくにシプロフロキサシンを用いることが好ましい。フルオロキノロン系抗菌剤の添加量は、一致率の観点から、０．５〜４μｇ／ｍＬが好ましく、さらに好ましくは０．５〜２μｇ／ｍＬである。
【００１８】
アミノ配糖体系抗菌剤としては、アミカシン（ＡＭＫ）、トブラマイシン、アルベカシンなどが挙げられ、これらのうち１種または２種以上を用いることができるが、アミカシンを用いることが好ましい。アミノ配糖体系抗菌剤の添加量は、一致率の観点から、０．５〜１６μｇ／ｍＬが好ましい。
【００１９】
セフェム系の抗菌剤としては、セフェピム（ＣＦＰＭ）、セフタジジムなどが挙げられ、これらのうち１種または２種以上を用いることができるが、セフェピムを用いることが好ましい。セフェム系の抗菌剤の添加量は、一致率の観点から、０．０３〜８μｇ／ｍＬが好ましく、さらに好ましくは０．０６〜８μｇ／ｍＬである。
【００２０】
本発明においては、多剤耐性緑膿菌として、感染症法に定められる薬剤耐性緑膿菌感染症の病原体（薬剤耐性緑膿菌）を検出することも可能である。なお、薬剤耐性緑膿菌は、感染症法上、イミペネム、アミカシン、シプロフロキサシンの３種の抗菌剤に対する耐性を指標として判定されるものであり、本発明の検出用培地によって検出されたものが直ちに厳密な意味での薬剤耐性緑膿菌と結論付けることはできない。しかしながら、本発明の検出用培地は、基礎培地、フルオロキノロン系抗菌剤、アミノ配糖体系抗菌剤、セフェム系抗菌剤の３種の抗菌剤の種類および各添加量を調整することによって、相当の確度で薬剤耐性緑膿菌と判定されるべき多剤耐性緑膿菌を検出することが可能である。すなわち本発明においては、フルオロキノロン系抗菌剤、アミノ配糖体系抗菌剤、セフェム系抗菌剤の３種の抗菌剤を、シプロフロキサシン（ＣＰＦＸ）、アミカシン（ＡＭＫ）、セフェピム（ＣＦＰＭ）の組み合わせで用いることが好ましい。
【００２１】
本発明において、検体としては、通常検体とされるものであればとくに限定されないが、例えば、尿、血漿などの臨床検体、病院内で汚染されたドアノブ、手すり、壁ぬぐい液や器具ぬぐい液などの院内検体などが挙げられる。
本発明の多剤耐性緑膿菌検出用培地は、少なくとも３ヵ月、好ましくは少なくとも４ヵ月の有効期間を有する。
【００２２】
以下に実施例によって本発明を詳述するが、実施の形態は発明を限定するものではなく例示であり、本発明は記載される特徴や組み合わせなどに限定されるものではない。なお、以下、シプロフロキサシン、アミカシン、セフェピムを、夫々、ＣＰＦＸ、ＡＭＫ、ＣＦＰＭと略号により記載することがある。
【実施例】
【００２３】
〔実施例１〕多剤耐性緑膿菌検出用培地１〜７の作製
以下の作製手順で、基礎培地としてCHROMagar Pseudomonasを用いた本発明の検出用培地１〜７を作製した。
１０００ｍＬの精製水にCHROMagar Pseudomonas（CHROMagar社製）３３．２ｇを溶解させ、沸騰させた後に、５０℃に冷ましてから、アミカシン二硫酸塩、シプロフロキサシン、セフェピム塩酸塩を表２に記載の濃度となるように添加し、ペトリ−シャーレ１枚に１８ｍＬずつ分注し、室温で放置して冷却し寒天を固めて検出用培地１〜７を作製した。作製した検出用培地１〜７は、半透明で淡白色の培地であった。
検出用培地１〜７を用いた検出は、検体を含む試料を塗沫し、３６±１℃の恒温下で２０〜２４時間培養した後に培地上の緑色〜青緑色のコロニーの有無を確認することで行った。
検出用培地１〜７を用いた検出では、培地３および培地４が多剤耐性緑膿菌のみを選択的に検出できることが分かった。
【００２４】
〔実施例２〕多剤耐性緑膿菌検出用培地８〜１３の作製
以下の作製手順で、基礎培地としてＮＡＣ寒天培地を用いた本発明の検出用培地８〜１３を作製した。
１０００ｍＬの精製水にＮＡＣ寒天培地（日水製薬株式会社）３５．７ｇを溶解させ、沸騰させた後に、５０℃に冷ましてから、アミカシン二硫酸塩、シプロフロキサシン、セフェピム塩酸塩を表３に記載の濃度となるように添加し、ペトリ−シャーレ１枚に１８ｍＬずつ分注し、室温で放置して冷却し寒天を固めて検出用培地８〜１３を作製した。作製した検出用培地８〜１３は、半透明で淡黄色の培地であった。
検出用培地８〜１３を用いた検出は、検体を含む試料を塗沫し、３６±１℃の恒温下で２０〜２４時間培養した後に培地上の黄色〜黄緑色のコロニーの有無を確認することで行った。
検出用培地８〜１３を用いた検出では、培地１０が多剤耐性緑膿菌のみを選択的に検出できることが分かった。
【００２５】
〔実施例３〕多剤耐性緑膿菌検出用培地１４〜１９の作製
以下の作製手順で、基礎培地としてミューラーヒントン培地を用いた本発明の検出用培地１４〜１９を作製した。
１０００ｍＬの精製水にミューラーヒントン寒天培地（オキソイド社製）３８ｇを懸濁させ、１２１℃で１５分間高圧蒸気滅菌したのち、５０℃に冷ましてから、アミカシン二硫酸塩、シプロフロキサシン、セフェピム塩酸塩を表４に記載の濃度となるように添加し、ペトリ−シャーレ１枚に１８ｍＬずつ分注し、室温で放置して冷却し寒天を固めて検出用培地１４〜１９を作製した。作製した検出用培地１４〜１９は、半透明で淡黄色の培地であった。
検出用培地１４〜１９を用いた検出は、検体を含む試料を塗沫し、３６±１℃の恒温下で２０〜２４時間培養した後に培地上の白色〜緑色のコロニーの有無を確認することで行った。
検出用培地１４〜１９を用いた検出では、培地１７が多剤耐性緑膿菌のみを選択的に検出できることが分かった。
【００２６】
〔実施例４〕米国臨床検査標準化協会のディスク拡散法との比較
表１に示す臨床分離株である緑膿菌菌株１〜２７を対象に、米国臨床検査標準化協会（ＣＬＳＩ:Clinical and Laboratory Standards Institute、旧ＮＣＣＬＳ）のディスク拡散法に基づく判定結果と、本発明の多剤耐性緑膿菌検出用培地１〜１９を用いた判定結果とを比較した。
【００２７】
【表１】
【００２８】
【表２】
【００２９】
【表３】
【００３０】
【表４】
【００３１】
表２、３、４に示した結果から明らかなとおり、３種の抗菌剤の至適濃度は基礎培地との組み合わせにより変動するため、濃度を調整することが必要であり、多剤耐性緑膿菌検出用培地３、４、１０、１７は多剤耐性緑膿菌を検出するのに適した抗菌剤濃度で添加されていることが分かった。
【００３２】
〔実施例５〕多剤耐性緑膿菌検出用培地３の長期保存安定性
下記の緑膿菌（１）〜（３）を用いて、多剤耐性緑膿菌検出用培地３の長期保存安定性について検討した。
（１）多剤耐性緑膿菌（ＭＤＲＰ）
（２）イミペネム感受性・シプロフロキサシン耐性・アミカシン耐性の緑膿菌（ｎｏｎ−ＭＤＲＰ１）
（３）イミペネム感受性・シプロフロキサシン感受性・アミカシン耐性の緑膿菌（ｎｏｎ−ＭＤＲＰ２）
【００３３】
本発明の多剤耐性緑膿菌検出用培地３を用いた。
また、対照として、１０００ｍＬの精製水にCHROMagar Pseudomonas３３．２ｇを溶解させ、沸騰させた後に、５０℃に冷ましてから、アミカシン二硫酸塩１ｍｇ、シプロフロキサシン１ｍｇ、イミペネム１ｍｇを溶解し、ペトリ−シャーレ１枚に１８ｍＬ分注し、室温で放置して冷却し寒天を固めて多剤耐性緑膿菌検出用培地（対照培地）を作製し用いた。
多剤耐性緑膿菌検出用培地３および対照培地を遮光状態で冷蔵保存し、０ヵ月後、１ヵ月後、２ヵ月後、３ヵ月後、４ヵ月後に上記緑膿菌（１）〜（３）を接種し、３６℃±１℃の恒温下で２０〜２４時間培養し、各菌の発育を観察した。その結果、多剤耐性緑膿菌検出用培地３において、０ヵ月後の各菌の発育と４ヵ月後の各菌の発育は同等であった。
一方、対照培地では冷蔵保存１ヵ月後から非多剤耐性緑膿菌の発育が見られた。
【００３４】
【表５】
【００３５】
表５に示した結果から明らかなとおり、対照培地は冷蔵１ヵ月間で非多剤耐性緑膿菌が発育しているのに対して、本発明培地は冷蔵４ヵ月間は多剤耐性緑膿菌のみが選択的に発育する性能を有していることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明は、多剤耐性緑膿菌の検出が必要な検査室において、必要時に短時間で判定できる培地を提供する。また、従来の技術では、生培地を市場に流通させることはできなかったが、本発明では、保存安定性の向上により、常に一定の性能を有する製品を市場に流通させることができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基礎培地にフルオロキノロン系抗菌剤、アミノ配糖体系抗菌剤およびセフェム系抗菌剤を含んでなる、多剤耐性緑膿菌検出用培地。
【請求項２】
基礎培地が、緑膿菌選択培地である、請求項１に記載の多剤耐性緑膿菌検出用培地。
【請求項３】
フルオロキノロン系抗菌剤が、シプロフロキサシンおよび／またはレボフロキサシンである、請求項１または２に記載の多剤耐性緑膿菌検出用培地。
【請求項４】
アミノ配糖体系抗菌剤が、アミカシン、トブラマイシンおよびアルベカシからなる群から選択される１種または２種以上である、請求項１〜３のいずれかに記載の多剤耐性緑膿菌検出用培地。
【請求項５】
セフェム系抗菌剤が、セフェピムおよび／またはセフタジジムである、請求項１〜４のいずれかに記載の多剤耐性緑膿菌検出用培地。
【請求項６】
フルオロキノロン系抗菌剤が、シプロフロキサシンであり、アミノ配糖体系抗菌剤がアミカシンであり、セフェム系抗菌剤がセフェピムである、請求項１〜５のいずれかに記載の多剤耐性緑膿菌検出用培地。
【請求項７】
検出される多剤耐性緑膿菌が、感染症の予防及び感染症の患者に対する医療に関する法律に定められる薬剤耐性緑膿菌感染症の病原体である、請求項１〜６のいずれかに記載の緑膿菌検出用培地。
【請求項８】
少なくとも３ヵ月の有効期間を有する、請求項１〜７のいずれかに記載の多剤耐性緑膿菌検出用培地。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の多剤耐性緑膿菌検出用培地を用いて、多剤耐性緑膿菌を検出する方法。
【請求項１０】
感染症の予防及び感染症の患者に対する医療に関する法律に定められる薬剤耐性緑膿菌感染症の病原体を検出する方法であって、請求項１〜８のいずれかに記載の多剤耐性緑膿菌検出用培地を用いて検出する、前記方法。
【請求項１】
基礎培地にフルオロキノロン系抗菌剤、アミノ配糖体系抗菌剤およびセフェム系抗菌剤を含んでなる、多剤耐性緑膿菌検出用培地。
【請求項２】
基礎培地が、緑膿菌選択培地である、請求項１に記載の多剤耐性緑膿菌検出用培地。
【請求項３】
フルオロキノロン系抗菌剤が、シプロフロキサシンおよび／またはレボフロキサシンである、請求項１または２に記載の多剤耐性緑膿菌検出用培地。
【請求項４】
アミノ配糖体系抗菌剤が、アミカシン、トブラマイシンおよびアルベカシからなる群から選択される１種または２種以上である、請求項１〜３のいずれかに記載の多剤耐性緑膿菌検出用培地。
【請求項５】
セフェム系抗菌剤が、セフェピムおよび／またはセフタジジムである、請求項１〜４のいずれかに記載の多剤耐性緑膿菌検出用培地。
【請求項６】
フルオロキノロン系抗菌剤が、シプロフロキサシンであり、アミノ配糖体系抗菌剤がアミカシンであり、セフェム系抗菌剤がセフェピムである、請求項１〜５のいずれかに記載の多剤耐性緑膿菌検出用培地。
【請求項７】
検出される多剤耐性緑膿菌が、感染症の予防及び感染症の患者に対する医療に関する法律に定められる薬剤耐性緑膿菌感染症の病原体である、請求項１〜６のいずれかに記載の緑膿菌検出用培地。
【請求項８】
少なくとも３ヵ月の有効期間を有する、請求項１〜７のいずれかに記載の多剤耐性緑膿菌検出用培地。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の多剤耐性緑膿菌検出用培地を用いて、多剤耐性緑膿菌を検出する方法。
【請求項１０】
感染症の予防及び感染症の患者に対する医療に関する法律に定められる薬剤耐性緑膿菌感染症の病原体を検出する方法であって、請求項１〜８のいずれかに記載の多剤耐性緑膿菌検出用培地を用いて検出する、前記方法。
【公開番号】特開２０１１−１２０５０９（Ｐ２０１１−１２０５０９Ａ）
【公開日】平成２３年６月２３日（２０１１．６．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２７９７４７（Ｐ２００９−２７９７４７）
【出願日】平成２１年１２月９日（２００９．１２．９）
【出願人】（５９１０４５６７７）関東化学株式会社 (99)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年６月２３日（２０１１．６．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月９日（２００９．１２．９）
【出願人】（５９１０４５６７７）関東化学株式会社 (99)
【Ｆターム（参考）】
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