多型検出用プローブ、多型検出方法、薬効判定方法及び多型検出用キット
【課題】ＭＤＲ１遺伝子のエクソン１２におけるＣ１２３６Ｔ変異型を、高い感度で、簡便に検出することを可能にする多型検出用プローブを提供する。
【解決手段】Ｐ１及びＰ１’からなる群より選択される一種の蛍光標識オリゴヌクレオチドであるＭＤＲ１遺伝子の多型を検出するための多型検出用プローブ。
【解決手段】Ｐ１及びＰ１’からなる群より選択される一種の蛍光標識オリゴヌクレオチドであるＭＤＲ１遺伝子の多型を検出するための多型検出用プローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多型検出用プローブ、多型検出方法、薬効判定方法及び多型検出用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＭＤＲ１遺伝子は、Ｐ−糖タンパクをコードする遺伝子である。Ｐ−糖タンパクは、がん細胞、肝臓、小腸及び脳血管内皮細胞等様々な細胞に発現し、薬剤の輸送に関与する。
また、ＭＤＲ１遺伝子のエクソン２６の３４３５番目のＣがＴに置換する変異型（Ｃ３４３５Ｔ変異型）、ＭＤＲ１遺伝子のエクソン２１の２６７７番目のＧがＡまたはＴに置換する変異型（Ｇ２６７７Ａ／Ｔ変異型）及びＭＤＲ１遺伝子のエクソン１２の１２３６番目のＣがＴに置換する変異型（Ｃ１２３６Ｔ変異型）は、大腸がんの予後を推測するための因子として有用であることが知られている（例えば、非特許文献１参照)。
【０００３】
遺伝子の多型を測定する方法としては、測定対象となる塩基を含む部分を増幅するように設計されたプライマーを用いてＰＣＲを行い、当該塩基における変異型の有無で切断の有無が分かれるような制限酵素を用いて切断し、その後、電気泳動で切断されたかどうかを検出するという方法（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法）が知られている。
別の方法としては、変異型を含む領域をＰＣＲ法で増幅した後、蛍光色素で標識された核酸プローブを、標的核酸にハイブリダイゼーションさせ、蛍光色素の発光の減少量を測定し、融解曲線分析の結果に基づいて塩基配列の変異型を解析する方法が知られている（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
また、特定の核酸プローブを用いることにより、ＭＤＲ１遺伝子のＣ３４３５Ｔ変異型の有無を、高い感度で、簡便に、検出できることが報告されている（例えば、特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第３９６３４２２号公報
【特許文献２】特許第４４５４３６６号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ．Ｄｉｓ．、２０１０年、第２５巻、ｐ１１６７−１１７６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
非特許文献１では、ＭＤＲ１遺伝子のＣ３４３５Ｔ変異型を検出する方法として、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法が用いられている。ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法は、ＰＣＲ反応後に増幅産物を取り出して制限酵素処理を行う必要がある。そのため、増幅産物が次の反応系に混入する恐れがあり、これに起因して偽陽性、偽陰性の結果が得られてしまう場合がある。さらに、ＰＣＲ終了後、制限酵素で処理を行い、その後電気泳動を行うため、検出までに必要な時間も非常に長くなってしまう場合がある。また、操作が複雑なため、自動化が困難である。
また、非特許文献１では、ＭＤＲ１遺伝子のＧ２６７７Ａ／Ｔ変異型及びＣ１２３６Ｔ変異型を検出する方法として、シークエンス解析法が用いられている。シークエンス解析法を用いた検出方法では、ＰＣＲを行った後、シークエンス反応を行い、シークエンサーで電気泳動を行わなければならないなど、手間やコストを要する。また、増幅産物を処理する必要があるため、増幅産物が次の反応系に混入する恐れがある。
【０００８】
特許文献１では、核酸プローブを用いる方法により、多型を検出している。しかし、特許文献１には、核酸プローブの設計に関し、末端部が蛍光色素により標識された消光プローブが標的配列にハイブリダイゼーションしたとき、末端部分において形成される核酸プローブと標的配列とのハイブリッドの複数塩基対が少なくとも一つのＧとＣのペアを形成するように設計するという教示があるのみである。そのため、特許文献１に記載の方法では、変異型毎に適正なる配列を有する核酸プローブを使用する必要がある。
また、本発明者の検討により、核酸プローブの配列において、ＧＣの含量が高すぎると消光プローブが十分に機能しないことも明らかになった。
【０００９】
特許文献２には、ＭＤＲ１遺伝子のエクソン２６におけるＣ３４３５Ｔ変異型を検出する方法は記載されているものの、特許文献２に記載の核酸プローブを利用してＭＤＲ１遺伝子のＧ２６７７Ａ／Ｔ変異型やＣ１２３６Ｔ変異型を検出することはできない。
これらの現状を踏まえ、ＭＤＲ１遺伝子におけるＣ３４３５Ｔ変異型以外の塩基における多型検出のためのさらなる技術開発が待ち望まれていた。
【００１０】
本発明は、ＭＤＲ１遺伝子のエクソン１２におけるＣ１２３６Ｔ変異型を、高い感度で、簡便に検出することを可能にする多型検出用プローブ、これを用いた多型検出方法および薬効判定方法、ならびに多型検出用キットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、ＭＤＲ１遺伝子のエクソン１２におけるＣ１２３６Ｔ変異型を含む特定の領域に基づいて消光プローブを設計することにより、消光プローブを用いる融解曲線分析によりＣ１２３６Ｔ変異を検出できるとの知見を得た。本発明は、かかる知見に基づいて達成されたものである。
本発明は以下のとおりである。
＜１＞ 下記Ｐ１及びＰ１’からなる群より選択される一種の蛍光標識オリゴヌクレオチドであるＭＤＲ１遺伝子の多型を検出するための多型検出用プローブ；
（Ｐ１）配列番号１に示す塩基配列において、３９５番目〜４０１番目の塩基を含む塩基長７〜３８の塩基配列に相補的な配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、３９５番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、及び
（Ｐ１’）配列番号１に示す塩基配列において、３９５番目〜４０１番目の塩基を含む塩基長７〜３８の塩基配列に相補的な配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、３９５番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド。
＜２＞ 下記Ｐ１−１及びＰ１’−１からなる群より選択される少なくとも一種の蛍光標識オリゴヌクレオチドである＜１＞に記載の多型検出用プローブ；
（Ｐ１−１）配列番号１に示す塩基配列において、３９５番目〜４０１番目の塩基を含む塩基長７〜３８の塩基配列に相補的な配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、３９５番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号１における４０１番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド、及び
（Ｐ１’−１）配列番号１に示す塩基配列において、３９５番目〜４０１番目の塩基を含む塩基長７〜３８の塩基配列に相補的な配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、３９５番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号１における４０１番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド。
＜３＞ 前記Ｐ１又はＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドが、蛍光色素で標識された３９５番目の塩基に対応する塩基を３’末端から数えて１番目〜３番目の位置のいずれかに有する＜１＞又は＜２＞に記載の多型検出用プローブ。
＜４＞ 前記Ｐ１又はＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドが、蛍光色素で標識された３９５番目の塩基に対応する塩基を３’末端に有する＜１＞〜＜３＞のいずれか１つに記載の多型検出用プローブ。
＜５＞ 前記Ｐ１又はＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドが、標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、且つ標的配列にハイブリダイズしたときの蛍光強度が、ハイブリダイズしないときの蛍光強度に比べて、減少するか又は増加する、＜１＞〜＜４＞のいずれか１つに記載の多型検出用プローブ。
＜６＞ 前記Ｐ１又はＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドが、標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、標的配列にハイブリダイズしたときの蛍光強度が、ハイブリダイズしないときの蛍光強度に比べて、減少する＜５＞に記載の多型検出用プローブ。
＜７＞ 前記Ｐ１又はＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基長が７〜２８である＜１＞〜＜６＞のいずれか１つに記載の多型検出用プローブ。
＜８＞ 前記Ｐ１又はＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基長が７〜１８である＜１＞〜＜７＞のいずれか１つに記載の多型検出用プローブ。
＜９＞ 融解曲線分析用のプローブである＜１＞〜＜８＞のいずれか１つに記載の多型検出用プローブ。
＜１０＞ ＜１＞〜＜９＞のいずれか１つに記載のプローブを用いることによりＭＤＲ１遺伝子の多型を検出する多型検出方法。
＜１１＞ （Ｉ）＜１＞〜＜９＞のいずれか１つに記載のプローブ及び試料中の一本鎖核酸を接触させて、前記蛍光標識オリゴヌクレオチド及び前記一本鎖核酸をハイブリダイズさせてハイブリッドを得ることと、
（ＩＩ）前記ハイブリッドを含む試料の温度を変化させることにより、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づく蛍光シグナルの変動を測定することと、
（ＩＩＩ）前記蛍光シグナルの変動に基づいてハイブリッドの解離温度であるＴｍ値を測定することと、
（ＩＶ）前記Ｔｍ値に基づいて、前記試料中の一本鎖核酸における、ＭＤＲ１遺伝子の多型の存在を検出することと、
を含む、＜１０＞に記載の多型検出方法。
＜１２＞ さらに、前記（Ｉ）のハイブリッドを得る前又は前記（Ｉ）のハイブリッドを得ることと同時に、核酸を増幅することを含む＜１１＞に記載の多型検出方法。
＜１３＞ さらに、配列番号１５に示す塩基配列における２５６番目の塩基に対応する多型、及び配列番号１６に示す塩基配列における３００番目の塩基に対応する多型の少なくとも一方の多型を同一の系で検出することを含む＜１０＞〜＜１２＞のいずれか１つに記載の多型検出方法。
＜１４＞ 配列番号１に示す塩基配列における４０１番目の塩基に対応する多型と、配列番号１５に示す塩基配列における２５６番目の塩基に対応する多型と、配列番号１６に示す塩基配列における３００番目の塩基に対応する多型とを同一の系で検出することを含む、＜１０＞〜＜１３＞のいずれか１つに記載の多型検出方法。
＜１５＞ ＜１０＞〜＜１４＞のいずれか１つに記載の多型検出方法により、ＭＤＲ１遺伝子における多型を検出すること、及び検出された多型の有無に基づいて薬剤に対する耐性又は薬剤の薬効を判定することを含む薬剤の薬効判定方法。
＜１６＞ ＜１＞〜＜９＞のいずれか１つに記載のプローブを含む、ＭＤＲ１遺伝子における多型を検出する多型検出用試薬キット。
＜１７＞ さらに、前記プローブがハイブリダイズする領域を含む塩基配列を増幅するためのプライマーを含む＜１６＞に記載の多型検出用試薬キット。
＜１８＞ さらに、配列番号１に示す塩基配列における２５６番目の塩基に対応する多型を検出するための多型検出用プローブと、配列番号１６に示す塩基配列における３００番目の塩基に対応する多型を検出するための多型検出用プローブとを含む＜１６＞又は＜１７＞に記載の多型検出用試薬キット。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、ＭＤＲ１遺伝子のエクソン１２におけるＣ１２３６Ｔ変異型を、高い感度で、簡便に検出することを可能にする多型検出用プローブ、これを用いた多型検出方法および薬効判定方法、ならびに多型検出用キットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】（Ａ）は、核酸混合物の融解曲線の一例であり、（Ｂ）は微分融解曲線の一例である。
【図２】本発明の実施例１にかかる試料の微分融解曲線である。
【図３】（Ａ）〜（Ｆ）は、本発明の実施例２にかかる試料の微分融解曲線である。
【図４】本発明の比較例１にかかる試料の微分融解曲線である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明にかかるＭＤＲ１遺伝子の多型検出用プローブ（以下、単に「多型検出用プローブ」ということがある）は、下記Ｐ１及びＰ１’からなる群より選択される一種の蛍光標識オリゴヌクレオチドであるＭＤＲ１遺伝子の多型を検出するための多型検出用プローブである：
（Ｐ１）配列番号１に示す塩基配列において、３９５番目〜４０１番目の塩基を含む塩基長７〜３８の塩基配列に相補的な配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、３９５番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、及び
（Ｐ１’）配列番号１に示す塩基配列において、３９５番目〜４０１番目の塩基を含む塩基長７〜３８の塩基配列に相補的な配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、３９５番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド。
本発明にかかるＭＤＲ１遺伝子の多型検出方法は、前記ＭＤＲ１遺伝子の多型を検出するための多型検出用プローブを少なくとも１種用いてＭＤＲ１遺伝子の多型を検出することを含む方法である。
本発明にかかる薬剤の薬効判定方法は、前記ＭＤＲ１遺伝子多型検出方法によりＭＤＲ１遺伝子の多型を検出すること、及び検出された多型の有無に基づいて、薬剤に対する耐性または薬剤の薬効を判定することを含む方法である。
本発明にかかる多型検出用試薬キットは、ＭＤＲ１遺伝子の多型を検出するための多型検出用プローブを含むものである。
【００１５】
本発明における「ＭＤＲ１遺伝子」は、既に公知であり、その塩基配列は、Ｇｅｎｅ ＩＤ：５２４３、ＮＣＢＩのアクセッションＮｏ．ＮＧ_０１１５１３のうち４９２６番目の塩基〜２１４３８６番目の塩基の配列に相当する。なお、本明細書においては、特に断らない限り「ＭＤＲ１遺伝子」は、配列番号１に示すＭＤＲ１遺伝子のエクソン１２に相当する塩基配列を意味するものとする。
配列番号１の塩基配列は、ＮＣＢＩのｄｂＳＮＰのアクセッションＮｏ．ｒｓ１１２８５０３の１〜８０１の配列である。
【００１６】
本発明において、検出対象となる試料中の試料核酸、多型検出用プローブ又はプライマーの個々の配列に関して、これら互いの相補的な関係に基づいて記述された事項は、特に断らない限り、それぞれの配列と、各配列に対して相補的な配列とについても適用される。各配列に対して相補的な当該配列について本発明の事項を適用する際には、当該相補的な配列が認識する配列は、当業者にとっての技術常識の範囲内で、対応する本明細書に記載された配列に相補的な配列に、明細書全体を読み替えるものとする。
【００１７】
本発明において、「Ｔｍ値」とは、二本鎖核酸が解離する温度（解離温度：Ｔｍ）であって、一般に、２６０ｎｍにおける吸光度が、吸光度全上昇分の５０％に達した時の温度と定義される。即ち、二本鎖核酸、例えば、二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖ＤＮＡが解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度は加熱開始時の吸光度（二本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって融解が完了したと判断できる。Ｔｍ値は、この現象に基づき設定される。本発明におけるＴｍ値は、特に断らない限り、吸光度が、吸光度全上昇分の５０％に達した時の温度をいう。
本発明において、オリゴヌクレオチドの配列に関して「３’末端から数えて１〜３番目」という場合は、オリゴヌクレオチド鎖の３’末端を１番目として数える。同様に「５’末端から数えて１〜３番目」という場合は、オリゴヌクレオチド鎖の５’末端を１番目として数える。
【００１８】
本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であっても本工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。
また、本発明において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
また、本発明において、組成物中の各成分の量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
本明細書において変異とは、野生型の塩基配列の一部の塩基が置換、欠失、重複又は挿入されることによって生じる新たな塩基配列を意味する。また、多型とは、変異によって生じる塩基配列の多型を意味する。
以下、本発明について説明する。
【００１９】
＜ＭＤＲ１遺伝子多型検出用プローブ＞
本発明のＭＤＲ１遺伝子の多型検出用プローブ（以下、単に「多型検出用プローブ」ともいう）は、下記Ｐ１及びＰ１’からなる群より選択される一種の蛍光標識オリゴヌクレオチドであるＭＤＲ１遺伝子の多型を検出するための多型検出用プローブである：
（Ｐ１）配列番号１に示す塩基配列において、３９５番目〜４０１番目の塩基を含む塩基長７〜３８の塩基配列に相補的な配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、３９５番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、及び
（Ｐ１’）配列番号１に示す塩基配列において、３９５番目〜４０１番目の塩基を含む塩基長７〜３８の塩基配列に相補的な配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、３９５番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド。
【００２０】
本発明における前記Ｐ１及びＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号１に示す塩基配列の４０１番目の塩基における多型を検出することができるプローブである。
【００２１】
ＭＤＲ１遺伝子の野生型では、配列番号１に示される配列のうち４０１番目に対応する塩基は、Ｃ（シトシン）であるが、変異型においてはＴ（チミン）に変異しており（以下、「Ｃ１２３６Ｔ変異型」ともいう）、当該塩基は、ＭＤＲ１遺伝子の８７１３３１７９番目〜８７３４２６３９番目の塩基のうち、８７２９６２１７番目の塩基に該当する。
【００２２】
本発明における前記Ｐ１及びＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号１における３９５番目〜４０１番目の塩基を含む塩基配列に対して相補的な塩基配列である。
【００２３】
具体的には、本発明において相同性が認められる蛍光標識オリゴヌクレオチドとは、配列番号１に示す塩基配列において、３９５番目〜４０１番目の塩基を含む塩基長７〜３８の塩基配列に相補的な配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有する。なお、３９５番目の塩基に対応する塩基は、シトシンであることを要する。
また、Ｐ１の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、検出感度の観点より、配列番号１に示す塩基配列において、３９５番目〜４０１番目の塩基を含む塩基長７〜３８の塩基配列に相補的な配列に対して、８５％以上の同一性、９０％以上の同一性、９５％以上の同一性、９６％以上の同一性、９７％以上の同一性、９８％以上の同一性又は９９％以上の同一性を示してもよい。
本発明の前記Ｐ１の蛍光標識オリゴヌクレオチドと、配列番号１における２１７番目の塩基に対応する塩基がＣ（シトシン）である以外は配列番号１と同一の塩基を有する塩基配列とを比較した際の同一性が８０％未満である場合には、変異型のＭＤＲ１遺伝子を含む試料核酸に対する検出感度が低くなる。
【００２４】
本発明における前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号１に示す塩基配列において、３９５番目〜４０１番目の塩基を含む塩基長７〜３８の塩基配列に相補的な配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。なお、３９５番目の塩基に対応する塩基はシトシンであることを要する。
【００２５】
ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ３ｒｄ（Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ． Ｐｒｅｓｓ， ２００１） に記載の方法等に従って行うことができる。この文献は、参照により本明細書に組み入れられるものとする。
ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。典型的なストリンジェントな条件とは、例えば、カリウム濃度は約２５ｍＭ〜約５０ｍＭ、及びマグネシウム濃度は約１．０ｍＭ〜約５．０ｍＭ中において、ハイブリダイゼーションを行う条件があげられる。本発明の条件の１例としてＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）、２５ｍＭのＫＣｌ、及び１．５ｍＭのＭｇＣｌ２中においてハイブリダイゼーションを行う条件が、挙げられるが、これに限定されるものではない。その他、ストリンジェントな条件としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ３ｒｄ（Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ． Ｐｒｅｓｓ， ２００１）に記載されている。この文献は、参照により本明細書に組み入れられるものとする。当業者は、ハイブリダイゼーション反応や、ハイブリダイゼーション反応液の塩濃度等を変化させることによって、このような条件を容易に選択することができる。
【００２６】
さらに、本発明における前記Ｐ１及びＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドとしては、前記Ｐ１及びＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドに塩基が挿入、欠失又は置換した蛍光標識オリゴヌクレオチドも本発明における蛍光標識オリゴヌクレオチドに包含される。
当該塩基が挿入、欠失又は置換した蛍光標識オリゴヌクレオチドは、前記Ｐ１及びＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドと同等程度の作用を示せばよく、塩基が挿入、欠失又は置換されている場合、その挿入、欠失又は置換の位置は、特に限定されない。挿入、欠失又は置換した塩基の数としては１塩基又は２塩基以上が挙げられ、蛍光標識オリゴヌクレオチド全体の長さによって異なるが、例えば１塩基〜１０塩基、好ましくは１塩基〜５塩基が挙げられる。
【００２７】
前記蛍光標識オリゴヌクレオチドにおける、オリゴヌクレオチドとしては、オリゴヌクレオチドの他、修飾されたオリゴヌクレオチドも含まれる。
前記オリゴヌクレオチドの構成単位としては、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、人工核酸等が挙げられる。前記人工核酸としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡアナログであるＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）；ペプチド核酸であるＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）；架橋化核酸であるＢＮＡ（Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）等が挙げられる。
前記オリゴヌクレオチドは、前記構成単位のうち、一種類から構成されてもよいし、複数種類から構成されてもよい。
【００２８】
本発明の前記Ｐ１及びＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さとしては、７ｍｅｒ〜３８ｍｅｒであることを要する。前記Ｐ１及びＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さが７ｍｅｒ未満や、３８ｍｅｒより長い場合には、ＭＤＲ１遺伝子多型の検出感度が低下してしまい好ましくない。
また、本発明の前記Ｐ１及びＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さとしては、７ｍｅｒ〜２８ｍｅｒにすることができ、７ｍｅｒ〜１８ｍｅｒにすることもできる。７ｍｅｒ〜２８ｍｅｒという範囲にすることにより、例えば検出感度がさらに高くなる等の傾向がある。
前記Ｐ１及びＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基長を変化させることで、蛍光標識オリゴヌクレオチドがその相補鎖（標的配列）と形成するハイブリッドの解離温度であるＴｍ値を、所望の値に調整することができる。
【００２９】
以下に本発明における前記Ｐ１及びＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドにおける塩基配列の一例を表１に示すが、本発明はこれらに限定されない。
なお、表１では、配列番号１の４０１番目の塩基に対応する塩基を大文字で表記した。また、配列番号１の４０１番目に対応する塩基がＴ又はＣの場合である試料核酸と、それぞれのＰ１蛍光標識オリゴヌクレオチドとのハイブリッドのＴｍ値を併せて示した。Ｔｍ値は、Ｍｅｌｔｃａｌｃ ９９ ｆｒｅｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｌｔｃａｌｃ．ｃｏｍ／）を用い、設定条件：Ｏｌｉｇｏｃｏｎｃ［μＭ］０．２、Ｎａ ｅｑ．［ｍＭ］５０の条件で算出した(以下、同様)。
【００３０】
【表１】
【００３１】
本発明において、配列番号１の４０１番目に対応する塩基がＴに該当する試料核酸とハイブリダイズした場合のＴｍ値と、配列番号１の４０１番目に対応する塩基がＣに該当する試料核酸とハイブリダイズした場合のＴｍ値との差は、１．５℃以上、２．０℃、５℃以上、９℃以上にすることができる。前記Ｔｍ値の差が１．５℃以上であることで、例えば、配列番号１における４０１番目の塩基の変異型をより高感度に検出することができる。
【００３２】
前記Ｔｍ値の差を大きくする方法としては、例えばプローブがハイブリダイズする領域に対応する塩基配列に対して、ミスマッチとなる塩基を該プローブに含める方法などが挙げられる。具体的には、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ（１９９７）ｖｏｌ１５ ｐ．３３１−３３５等に記載の方法が挙げられる。
【００３３】
また、本発明の前記Ｐ１及びＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、３９５番目の塩基（シトシン）が蛍光色素で標識されていることを要する。
【００３４】
前記Ｐ１及びＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドにおいては、この蛍光標識された３９５番目の塩基が、３’末端から数えて１〜３番目のいずれかの位置に存在することができる。また、３’末端に存在することができる。これにより、例えば、多型検出感度がより向上する。また、Ｐ１又は前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドを生産性よく得ることができる。
【００３５】
本発明の前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは、標的配列にハイブリダイズしていないときの蛍光強度に比べて、標的配列にハイブリダイズしているときの蛍光強度が減少（消光）するかまたは増加する蛍光標識オリゴヌクレオチドであることができる。その中でも標的配列にハイブリダイズしていないときの蛍光強度に比べて、標的配列にハイブリダイズしているときの蛍光強度が減少する蛍光標識オリゴヌクレオチドであることができる。
【００３６】
このような蛍光消光現象（Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ）を利用したプローブは、一般的に、グアニン消光プローブと呼ばれており、いわゆるＱＰｒｏｂｅ（登録商標）として知られている。中でも、オリゴヌクレオチドを３'末端もしくは５'末端がシトシン（Ｃ）となるように設計し、その末端のＣが、グアニン（Ｇ）に近づくと発光が弱くなるように蛍光色素で標識化されたオリゴヌクレオチドであることが挙げられる。
このようなプローブを使用すれば、シグナルの変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認することができる。
【００３７】
なお、Ｑ Ｐｒｏｂｅを用いた検出方法以外にも、公知の検出様式を適用してもよい。このような検出様式としては、Ｔａｑ−ｍａｎ Ｐｒｏｂｅ法、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｂｅ法、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ Ｂｅａｃｏｎ法又はＭＧＢ Ｐｒｏｂｅ法などを挙げることができる。
【００３８】
前記蛍光色素としては、特に制限されないが、例えば、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等があげられる。これらの蛍光色素の市販品としては、例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ、ＦＡＭ、Ｃｙ３およびＣｙ５、ＴＡＭＲＡ等が挙げられる。
蛍光標識オリゴヌクレオチドの検出条件は特に制限されず、使用する蛍光色素により適宜決定できる。例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅは、検出波長４４５ｎｍ〜４８０ｎｍ、ＴＡＭＲＡは、検出波長５８５ｎｍ〜７００ｎｍ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬは、検出波長５２０ｎｍ〜５５５ｎｍで検出できる。
このような蛍光色素を有するプローブを使用すれば、それぞれの蛍光シグナルの変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認することができる。蛍光色素のオリゴヌクレオチドへの結合は、通常の方法、例えば特開２００２−１１９２９１号公報等に記載の方法に従って行うことができる。
【００３９】
また前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは、例えば、３'末端にリン酸基が付加されてもよい。蛍光標識オリゴヌクレオチドの３'末端にリン酸基を付加させておくことにより、プローブ自体が遺伝子増幅反応によって伸長することを十分に抑制できる。後述するように、変異の有無を検出するＤＮＡ（標的ＤＮＡ）は、ＰＣＲ等の遺伝子増幅法によって調製することができる。その際、３'末端にリン酸基が付加された蛍光標識オリゴヌクレオチドを用いることで、これを増幅反応の反応液中に共存させることができる。
また、３'末端に前述のような標識化物質（蛍光色素）を付加することによっても、同様の効果が得られる。
【００４０】
前記Ｐ１及びＰ１’蛍光標識オリゴヌクレオチドはＭＤＲ１遺伝子における多型、特にＭＤＲ１遺伝子のＣ１２３６Ｔ変異型を検出するＭＤＲ１遺伝子多型検出用プローブとして使用することができる。
また、ＭＤＲ１遺伝子多型検出用プローブは、融解曲線分析用のプローブとして使用することができる。
なお、本発明に係る前記Ｐ１及びＰ１’蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号１に示す塩基配列において、３９５番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、３９５番目の塩基に対応するシトシンが蛍光色素で標識された塩基を用いる以外は、オリゴヌクレオチドの合成方法として知られている公知の方法、例えば特開２００２−１１９２９１号公報等に記載の方法に従って作製することができる。
【００４１】
前記Ｐ１及びＰ１’蛍光標識オリゴヌクレオチドのより好ましい態様としては、以下のＰ１−１及びＰ１’−１蛍光標識オリゴヌクレオチドが挙げられる。
（Ｐ１−１）配列番号１に示す塩基配列において、３９５番目〜４０１番目の塩基を含む塩基長７〜３８の塩基配列に相補的な配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、３９５番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号１における４０１番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド、及び
（Ｐ１’−１）配列番号１に示す塩基配列において、３９５番目〜４０１番目の塩基を含む塩基長７〜３８の塩基配列に相補的な配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、３９５番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号１における４０１番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド。
なお、「配列番号１における４０１番目の多型を認識する」とは、「配列番号１における４０１番目の多型を示す塩基に結合する」と同義である。
【００４２】
＜プライマー＞
後述するＭＤＲ１遺伝子多型検出方法では、検出対象となるＭＤＲ１遺伝子多型を含む配列をＰＣＲ法により増幅する場合には、プライマーが用いられる。
本発明において使用しうるプライマーは、目的とする検出対象となるＭＤＲ１遺伝子の多型の部位である、配列番号１で示される配列のうち４０１番目の塩基に対応する塩基を含む核酸を増幅可能であれば特に制限されない。
【００４３】
ＰＣＲ法に適用するプライマーは、本発明の多型検出用プローブがハイブリダイズする領域を含む塩基配列を増幅できるものであれば特に制限されず、配列番号１〜配列番号６で示される塩基配列から、当業者であれば適宜設計することができる。プライマーの長さ及びＴｍ値は、１２ｍｅｒ〜４０ｍｅｒ及び４０℃〜７０℃、又は１６ｍｅｒ〜３０ｍｅｒ及び５５℃〜６０℃にすることができる。
また、プライマーセットの各プライマーの長さは同一でなくてもよいが、両プライマーのＴｍ値はほぼ同一（又は、Ｔｍ値の両プライマーでの差が５℃以内）であることが挙げられる。
【００４４】
以下に本発明の多型検出方法における本発明の多型検出用プローブがハイブリダイズする領域を含む塩基配列の増幅に使用できるプライマーの例を示す。なお、これらは例示であって、本発明を制限するものではない。
【００４５】
【表２】
【００４６】
本発明の多型検出用プローブがハイブリダイズする領域を含む塩基配列を増幅する際には、感度及び効率の観点より、表２に示す各オリゴヌクレオチドを、一対のプライマーセットとして用いることが挙げられる。
【００４７】
多型の検出方法は前記蛍光標識ヌクレオチドをプローブとして利用する方法であれば、特に制限されない。前記蛍光標識ヌクレオチドをプローブとして用いる多型検出方法の一例として、Ｔｍ解析を利用した多型検出方法について、以下に説明する。
【００４８】
＜多型検出方法＞
本発明にかかるＭＤＲ１遺伝子多型検出方法は、前記ＭＤＲ１遺伝子多型検出用プローブを少なくとも１種用いて、ＭＤＲ１遺伝子の多型を検出することを含むＭＤＲ１遺伝子多型検出方法である。
本発明にかかる多型検出方法によれば、前記多型検出用プローブを少なくとも１種含むことにより、ＭＤＲ１遺伝子の多型を簡便に、感度よく検出可能にする。
また、本発明の多型検出方法は、ＭＤＲ１遺伝子における多型の検出方法であって、下記工程（Ｉ）〜工程（ＩＶ）を含むことができ、下記工程（Ｖ）を含んでいてもよい。なお、本発明の多型検出方法は、前記多型検出用プローブを使用することが特徴であって、その他の構成や条件等は、以下の記載に制限されない。
【００４９】
（Ｉ）前記多型検出用プローブ及び試料中の一本鎖核酸を接触させて、前記蛍光標識オリゴヌクレオチド及び前記一本鎖核酸をハイブリダイズさせてハイブリッドを得ること。
（ＩＩ）前記ハイブリッドを含む試料の温度を変化させることにより、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づく蛍光シグナルの変動を測定すること。
（ＩＩＩ）前記蛍光シグナルの変動に基づいてハイブリッドの解離温度であるＴｍ値を測定すること。
（ＩＶ）前記Ｔｍ値に基づいて、ＭＤＲ１遺伝子における多型の存在を検出すること。
（Ｖ）前記多型の存在に基づいて、前記試料中の一本鎖核酸における、多型を有する一本鎖核酸の存在比を検出すること。
【００５０】
また、本発明においては、上記工程（Ｉ）〜（ＩＶ）又は上記工程（Ｉ）〜（Ｖ）に加えて、さらに、工程（Ｉ）のハイブリッドを得る前又は工程（Ｉ）のハイブリッドを得ることと同時に、核酸を増幅することを含んでいてもよい。
なお、（ＩＩＩ）でＴｍ値を測定することには、ハイブリッドの解離温度を測定することだけでなく、ハイブリット形成体の融解時に温度に応じて変動する蛍光シグナルの微分値の大きさを測定することを含んでもよい。
【００５１】
本発明において、試料中の核酸は、一本鎖核酸でもよいし二本鎖核酸であってもよい。前記核酸が二本鎖核酸の場合は、例えば、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることに先立って、加熱により前記試料中の二本鎖核酸を融解（解離）させて一本鎖核酸とすることを含むことが挙げられる。二本鎖核酸を一本鎖核酸に解離することによって、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドとのハイブリダイズが可能となる。
【００５２】
本発明において、検出対象である試料に含まれる核酸は、例えば、生体試料に元来含まれる核酸でもよいが、検出精度が向上できることから、生体試料に元来含まれている核酸を鋳型としてＰＣＲ等によりＭＤＲ１遺伝子の変異した部位を含む領域を増幅させた増幅産物であることが挙げられる。増幅産物の長さは、特に制限されないが、例えば、５０ｍｅｒ〜１０００ｍｅｒ、又は８０ｍｅｒ〜２００ｍｅｒにすることができる。また、試料中の核酸は、例えば、生体試料由来のＲＮＡ（トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ等）からＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＰＣＲ）により合成したｃＤＮＡであってもよい。
【００５３】
本発明において、前記試料中の核酸に対する、本発明の多型検出用プローブの添加割合（モル比）は特に制限されない。試料中のＤＮＡに対して例えば１倍以下が挙げられる。また、十分な検出シグナル確保の観点より、前記試料中の核酸に対する、本発明の多型検出用プローブの添加割合（モル比）は、０．１倍以下としうる。
ここで、試料中の核酸とは、例えば、検出目的の多型が発生している検出対象核酸と前記多型が発生していない非検出対象核酸との合計でもよいし、検出目的の多型が発生している検出対象配列を含む増幅産物と前記多型が発生していない非検出対象配列を含む増幅産物との合計でもよい。なお、試料中の核酸における前記検出対象核酸の割合は、通常、不明であるが、結果的に、前記多型検出用プローブの添加割合（モル比）は、検出対象核酸（検出対象配列を含む増幅産物）に対して１０倍以下としうる。また、前記多型検出用プローブの添加割合（モル比）は、検出対象核酸（検出対象配列を含む増幅産物）に対して、５倍以下、又は３倍以下としうる。また、その下限は特に制限されないが、例えば、０．００１倍以上、０．０１倍以上、又は０．１倍以上としうる。
【００５４】
前記ＤＮＡに対する本発明の多型検出用プローブの添加割合は、例えば、二本鎖核酸に対するモル比でもよいし、一本鎖核酸に対するモル比でもよい。
【００５５】
本発明において、Ｔｍ値を決定するための温度変化に伴うシグナル変動の測定は、前述のような原理から２６０ｎｍの吸光度測定により行うこともできるが、前記多型検出用プローブに付加した標識のシグナルに基づくシグナルであって、一本鎖ＤＮＡと前記多型検出用プローブとのハイブリッド形成の状態に応じて変動するシグナルを測定することが挙げられる。このため、前記多型検出用プローブとして、蛍光標識オリゴヌクレオチドを使用することが挙げられる。前記蛍光標識オリゴヌクレオチドとしては、例えば、標的配列にハイブリダイズしていないときの蛍光強度に比べて、標的配列にハイブリダイズしているときの蛍光強度が減少（消光）する蛍光標識オリゴヌクレオチド、または標的配列にハイブリダイズしていないときの蛍光強度に比べて、標的配列にハイブリダイズしているときの蛍光強度が増加する蛍光標識オリゴヌクレオチドが挙げられる。
前者のようなプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成している際には蛍光シグナルを示さないか、蛍光シグナルが弱いが、加熱によりプローブが解離すると蛍光シグナルを示すようになるか、蛍光シグナルが増加する。
また、後者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成することによって蛍光シグナルを示し、加熱によりプローブが解離すると蛍光シグナルが減少（消失）する。したがって、この蛍光標識に基づく蛍光シグナルの変化を蛍光標識特有の条件（蛍光波長等）で検出することによって、前記２６０ｎｍの吸光度測定と同様に、融解の進行ならびにＴｍ値の決定を行うことができる。
【００５６】
次に、本発明の多型検出方法について、蛍光色素に基づくシグナルの変化を検出する方法について具体例を挙げて説明する。なお、本発明の多型検出方法は、前記多型検出用プローブを使用すること自体が特徴であり、その他の工程や条件については何ら制限されない。
【００５７】
核酸増幅を行う際の鋳型となる核酸を含む試料としては、核酸、特にＭＤＲ１遺伝子を含んでいればよく、特に制限されない。例えば、大腸や肺等の組織、白血球細胞等の血球、全血、血漿、喀痰、口腔粘膜懸濁液、爪や毛髪等の体細胞、生殖細胞、乳、腹水液、パラフィン包埋組織、胃液、胃洗浄液、尿、腹膜液、羊水、細胞培養などの任意の生物学的起源に由来する又は由来しうるものを挙げられる。なお、試料の採取方法、核酸を含む試料の調製方法等は、制限されず、いずれも従来公知の方法が採用できる。また、鋳型となる核酸は、該起源から得られたままで直接的に、あるいは該サンプルの特性を改変するために前処理した後で使用することができる。
例えば、全血を試料とする場合、全血からのゲノムＤＮＡの単離は、従来公知の方法によって行うことができる。例えば、市販のゲノムＤＮＡ単離キット（商品名ＧＦＸ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ；ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）等が使用できる。
【００５８】
次に、単離したゲノムＤＮＡを含む試料に、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドを含む多型検出用プローブを添加する。
前記多型検出用プローブは、単離したゲノムＤＮＡを含む液体試料に添加してもよいし、適当な溶媒中でゲノムＤＮＡと混合してもよい。前記溶媒としては、特に制限されず、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の緩衝液、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、グリセロール等を含む溶媒、ＰＣＲ反応液等、従来公知のものが挙げられる。
【００５９】
前記多型検出用プローブの添加のタイミングは、特に制限されず、例えば、後述するＰＣＲ等の増幅処理を行う場合、増幅処理の後に、ＰＣＲ増幅産物に対して添加してもよいし、増幅処理前に添加してもよい。
このようにＰＣＲ等による増幅処理前に前記検出用プローブを添加する場合は、例えば、前述のように、その３'末端に、蛍光色素を付加したり、リン酸基を付加したりすることができる。
【００６０】
核酸増幅の方法としては、例えばポリメラーゼを用いる方法等が挙げられる。その例としては、ＰＣＲ法、ＩＣＡＮ法、ＬＡＭＰ法、ＮＡＳＢＡ法等が挙げられる。ポリメラーゼを用いる方法により増幅する場合は、本発明プローブの存在下で増幅を行うことが挙げられる。用いるプローブ及びポリメラーゼに応じて、増幅の反応条件等を調整することは当業者であれば容易である。これにより、核酸の増幅後にプローブのＴｍ値を解析するだけで多型の有無を判定できるので、反応終了後増幅産物を取り扱う必要がない。よって、増幅産物による汚染の心配がない。また、増幅に必要な機器と同じ機器で検出することが可能なので、容器を移動する必要がなく、自動化も容易である。
【００６１】
またＰＣＲ法に用いるＤＮＡポリメラーゼとしては、通常用いられるＤＮＡポリメラーゼを特に制限なく用いることができる。例えば、ＧｅｎｅＴａｑ（ニッポンジーン社製）、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）、Ｔａｑ ポリメラーゼ等を挙げることができる。
ポリメラーゼの使用量としては、通常用いられている濃度であれば特に制限はない。例えば、Ｔａｑポリメラーゼを用いる場合、例えば、反応溶液量５０μｌに対して０．０１Ｕ〜１００Ｕの濃度とすることができる。これにより、ＭＤＲ１遺伝子多型の検出感度が高まるなどの傾向がある。
【００６２】
またＰＣＲ法は、通常用いられる条件を適宜選択することで行うことができる。
なお、増幅の際、リアルタイムＰＣＲによって増幅をモニタリングし、試料に含まれるＤＮＡ（検出対象配列）のコピー数を調べることもできる。すなわち、ＰＣＲによるＤＮＡ（検出対象配列）の増幅に従ってハイブリッドを形成するプローブの割合が増えるので蛍光強度が変動する。これをモニタリングすることで、試料に含まれる検出対象配列（正常ＤＮＡまたは変異型ＤＮＡ）のコピー数や存在比を検出することができる。
【００６３】
本発明の多型検出方法においては、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドと、試料中の一本鎖核酸とを接触させて、両者をハイブリダイズさせる。試料中の一本鎖核酸は、例えば、上記のようにして得られたＰＣＲ増幅産物を解離することで調製することができる。
【００６４】
前記ＰＣＲ増幅産物の解離（解離工程）における加熱温度は、前記増幅産物が解離できる温度であれば特に制限されない。例えば、８５℃〜９５℃である。加熱時間も特に制限されない。加熱時間は、例えば１秒〜１０分、又は１秒〜５分としうる。
【００６５】
また、解離した一本鎖ＤＮＡと前記蛍光標識オリゴヌクレオチドとのハイブリダイズは、例えば、前記解離工程の後、前記解離工程における加熱温度を降下させることによって行うことができる。温度条件としては、例えば、４０℃〜５０℃である。
【００６６】
ハイブリダイズ工程の反応液における各組成の体積や濃度は、特に制限されない。具体例としては、前記反応液におけるＤＮＡの濃度は、例えば、０．０１μＭ〜１μＭ、又は０．１μＭ〜０．５μＭとしうる。前記蛍光標識オリゴヌクレオチドの濃度は、例えば、前記ＤＮＡに対する添加割合を満たす範囲であり、例えば、０．００１μＭ〜１０μＭ、又は０．００１μＭ〜１μＭとしうる。
【００６７】
そして、得られた前記一本鎖ＤＮＡと前記蛍光標識オリゴヌクレオチドとのハイブリッドを徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光シグナルの変動を測定する。例えば、ＱＰｒｏｂｅを使用した場合、一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズした状態では、解離した状態に比べて蛍光強度が減少（または消光）する。したがって、例えば、蛍光が減少（または消光）しているハイブリッドを徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【００６８】
蛍光強度の変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されないが、例えば、開始温度が室温〜８５℃、又は２５℃〜７０℃としうる。終了温度は、例えば、４０℃〜１０５℃としうる。また、温度の上昇速度は、特に制限されないが、例えば、０．１℃／秒〜２０℃／秒、又は０．３℃／秒〜５℃／秒としうる。
【００６９】
次に、前記シグナルの変動を解析してＴｍ値として決定する。具体的には、得られた蛍光強度から各温度における微分値（−ｄ蛍光強度／ｄｔ）を算出し、最も低い値を示す温度をＴｍ値として決定できる。また、単位時間当たりの蛍光強度増加量（蛍光強度増加量／ｔ）が最も高い点をＴｍ値として決定することもできる。なお、標識化プローブとして、消光プローブではなく、ハイブリッド形成によりシグナル強度が増加するプローブを使用した場合には、反対に、蛍光強度の減少量を測定すればよい。
【００７０】
また、本発明においては、前述のように、ハイブリッドを加熱して、温度上昇に伴う蛍光シグナル変動（好ましくは蛍光強度の増加）を測定するが、この方法に代えて、例えば、ハイブリッド形成時におけるシグナル変動の測定を行ってもよい。すなわち、前記プローブを添加した試料の温度を降下させてハイブリッドを形成する際の前記温度降下に伴う蛍光シグナル変動を測定してもよい。
【００７１】
具体例として、標的配列にハイブリダイズしていないときの蛍光強度に比べて、標的配列にハイブリダイズしているときの蛍光強度が減少（消光）する蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブ（例えば、ＱＰｒｏｂｅ）を使用した場合、前記プローブを試料に添加した際には、前記プローブは解離状態にあるため蛍光強度が大きいが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、前記蛍光が減少（または消光）する。したがって、例えば、前記加熱した試料の温度を徐々に降下して、温度下降に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。
他方、ハイブリッド形成によりシグナルが増加する標識化プローブを使用した場合、前記プローブを試料に添加した際には、前記プローブは解離状態にあるため蛍光強度が小さい（または消光）が、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光強度が増加するようになる。したがって、例えば、前記試料の温度を徐々に降下して、温度下降に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【００７２】
なお、本発明の多型検出方法においては、ＭＤＲ１遺伝子のエクソン１２の１２３６番目の塩基（配列番号１に示す塩基配列における４０１番目の塩基）の変異型に加えて、ＭＤＲ１遺伝子のエクソン２６の３４３５番目の塩基（配列番号１５に示す塩基配列における２５６番目の塩基）の変異型及びＭＤＲ１遺伝子のエクソン２１の２６７７番目塩基（配列番号１６に示す塩基配列における３００番目の塩基）の変異型の少なくとも一方の変異型を検出することを含む。
【００７３】
これにより、配列番号１に示す塩基配列における４０１番目の塩基の変異型に加えて、配列番号１５に示す塩基配列における２５６番目の塩基及び配列番号１６に示す塩基配列における３００番目の塩基の変異型の少なくとも一方の変異型をさらに検出することができる。
【００７４】
検出のための具体的な手段は特に限定されるものではないが、例えば、本発明の配列番号１に示す塩基配列における４０１番目の塩基の多型を検出するプローブに加えて、配列番号１５に示す塩基配列における２５６番目の塩基に対応する多型を検出するプローブ及び配列番号１６に示す塩基配列における３００番目の塩基に対応する多型を検出するプローブの少なくとも一方のプローブを併用することなどが挙げられる。
【００７５】
前記配列番号１５に示す塩基配列における２５６番目の塩基に対応する多型を検出するプローブとしては、特に限定はされないが、例えば特開２００５−２８７３３５号公報に記載のプローブに記載のプローブや、配列番号９に示す塩基配列からなるプローブ等が挙げられる。
【００７６】
前記配列番号１６に示す塩基配列における３００番目の塩基に対応する多型を検出するプローブとしては、特に制限はされないが、例えば、配列番号１０に示す塩基配列からなるプローブ等が挙げられる。
【００７７】
また、本発明の多型検出方法においては、配列番号１に示す塩基配列における４０１番目の塩基の多型に加えて、同一の系で、配列番号１５に示す塩基配列における２５６番目の塩基の多型、及び配列番号１６に示す塩基配列における３００番目の塩基の多型の少なくとも一方の多型を検出することを含む。
【００７８】
これにより、配列番号１に示す塩基配列における４０１番目の塩基の多型に加えて、配列番号１５に示す塩基配列における２５６番目の塩基及び配列番号１６に示す塩基配列における３００番目の塩基の多型の少なくとも一方の多型を同一の系で、検出することができ、利便性の観点より好ましい。
【００７９】
異なるエクソンに存在する複数の多型を、同一の系で検出する方法としては、特に制限されるものではない。例えば、各多型を検出できる各プローブを予め混合し、試料に添加してもよいし、一本鎖核酸を含む試料に各多型を検出できる各プローブを連続的に添加してもよい。
ここで、「系」とは、蛍光標識オリゴヌクレオチド及び一本鎖核酸がハイブリダイズしたハイブリッドを含む試料で形成される１個の独立した反応系を意味する。
【００８０】
本発明の多型検出方法においては、同一の系において、配列番号１に示す塩基配列における４０１番目の塩基に対応する多型と、配列番号１５に示す塩基配列における２５６番目の塩基に対応する多型と、配列番号１６に示す塩基配列における３００番目の塩基に対応する多型とを検出することを含むことができる。
【００８１】
これにより３種の遺伝子多型を１つの系で簡便に検出できるだけではなく、これら３種の多型に関連する後述の薬剤に対する耐性及び有効性をより正確に予測することができる。
【００８２】
検出のための具体的な手段は特に限定されるものではないが、例えば、本発明の配列番号１に示す塩基配列における４０１番目の塩基の多型を検出するプローブに加えて、配列番号１５に示す塩基配列における２５６番目の塩基に対応する多型を検出するプローブ及び配列番号１６に示す塩基配列における３００番目の塩基に対応する多型を検出するプローブの３種のプローブを併用することなどが挙げられる。
なお、各プローブの好ましい態様や配列については、上述の各プローブに関する説明を適用することができる。
【００８３】
＜薬効判定方法＞
本発明の薬効判定方法は、上述した多型検出方法によりＭＤＲ１遺伝子の多型を検出すること、及び前記検出結果に基づいて薬剤に対する耐性又は薬剤の薬効を判定することを含む。
上述した多型検出方法では、本発明における多型検出用プローブを用いて、感度よく且つ簡便にＭＤＲ１遺伝子の多型を検出するので、ＭＤＲ１遺伝子におけるこの多型に基づいて薬剤の判定を感度よく且つ簡便に行うことができる。
【００８４】
また、多型の有無に基づいて薬剤に対する耐性や薬剤の薬効を判定することができる。そして、本発明の薬効判定方法は、変異型の有無に基づいて、薬剤の投与量の増加、他の治療薬への変更等への切り替え等の疾病の治療方針を決定するのに有用である。
また、判定対象となる薬剤としては、具体的には、抗がん剤、高血圧治療薬、免疫抑制剤、中枢作用薬等が挙げられ、特に抗がん剤が挙げられる。
【００８５】
＜多型検出用試薬キット＞
本発明の多型検出用試薬キットは上述した多型検出用プローブを含む。
この多型検出用試薬キットには、上述の多型検出用プローブの少なくとも１種を含むので、例えばＭＤＲ１遺伝子の多型の検出をより簡便に行うことができるなどの傾向がある。
【００８６】
多型検出用試薬キットは、上述のプローブがハイブリダイズする領域を含む塩基配列を増幅するためのプライマーをさらに含むことができる。
これにより、本発明における多型検出用試薬キットは、精度よくＭＤＲ１遺伝子の多型の検出を行うことができる。
多型検出用試薬キットに含まれ得るプローブ及びプライマーについては、前述した事項をそのまま適用することができる。
【００８７】
また、本発明における多型検出用試薬キットは、好ましくは、ＭＤＲ１遺伝子の多型検出用プローブに加えて、上述した配列番号１５に示す塩基配列における２５６番目の塩基に対応する多型を検出するプローブ及び配列番号１６に示す塩基配列における３００番目の塩基に対応する多型を検出するプローブからなる群より選択される少なくとも１種のプローブをさらに含むことができる。
本発明における多型検出用試薬キットが、ＭＤＲ１遺伝子の多型検出用プローブに加えて、さらに上述した別のプローブを含むことにより、複数のエクソンに存在する複数の多型を簡便に検出することができる。
【００８８】
多型検出用プローブとして２種以上の蛍光標識オリゴヌクレオチドを含む場合、それぞれの蛍光標識オリゴヌクレオチドは混合された状態で含まれていても、別個に含まれていてもよい。
２種以上の前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは発光波長が互いに異なる蛍光色素で標識化されていてもよい。
このように蛍光色素の種類を変えることで、同じ反応系であっても、それぞれの蛍光標識オリゴヌクレオチドについての検出を同時に行うことも可能になる。
【００８９】
また、本発明における検出用試薬キットは、前記プローブ及び前記プライマーの他に、本発明の検出方法における核酸増幅を行うのに必要とされる試薬類をさらに含んでいてもよい。また、プローブ、プライマー及びその他の試薬類は、別個に収容されていてもよいし、それらの一部が混合物とされていてもよい。
なお、「別個に収容」とは、各試薬が非接触状態を維持できるように区分けされたものであればよく、必ずしも独立して取り扱い可能な個別の容器に収容される必要はない。
多型部位を含む配列（プローブがハイブリダイズする領域）を増幅するためのプライマーセットを含むことで、例えば、より高感度に多型を検出することができる。
【００９０】
さらに本発明の多型検出用試薬キットは、前記多型検出用プローブを使用して、検出対象である核酸を含む試料について微分融解曲線を作成し、そのＴｍ値解析を行って、ＭＤＲ１遺伝子における多型を検出することが記載された取扱い説明書、又は検出用試薬キットに含まれる若しくは追加的に含むことが可能な各種の試薬について記載された使用説明書を含むことができる。
【実施例】
【００９１】
以下、本発明を実施例にて詳細に説明する。しかしながら、本発明はそれらに何ら限定されるものではない。
【００９２】
［実施例１］
全自動ＳＮＰｓ検査装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ（商標）、アークレイ社製）と、下記表３に記載した処方の検査用試薬を用いてＴｍ解析を行い、蛍光標識オリゴヌクレオチド（配列番号２）のＭＤＲ１（１２３６）プローブの性能を確認した。なお、鋳型としては、配列番号１８及び配列番号１９の人工オリゴ配列を使用した。
【００９３】
【表３】
【００９４】
上記表３で使用したプローブ及び鋳型の詳細を以下に示す。なお、プローブ中の３’末端の括弧内は蛍光色素の種類を示す。表４に示す塩基配列中、大文字は、多型の位置を示す。以下同様である。
【００９５】
【表４】
【００９６】
【表５】
【００９７】
Ｔｍ解析は、９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理し、続けて温度の上昇速度１℃／３秒で、４０℃〜７５℃まで温度を上昇させ、その間の経時的な蛍光強度の変化を測定した。なお、励起波長を５２０ｎｍ〜５５５ｎｍとし、検出波長を５８５ｎｍ〜７００ｎｍとして蛍光標識プローブに由来する蛍光強度の変化をそれぞれ測定した。
【００９８】
Ｔｍ解析によって、プローブの蛍光値の変化量を示す図２を得た。図中、縦軸は単位時間当たりの蛍光強度の変化量(ｄ蛍光強度増加量/ｔ)を表し、横軸は温度（℃）をそれぞれ表す。図中、菱形で表すパターンは、鋳型として、配列番号１に示す塩基配列において４０１番目の塩基（Ｙ）がＣである、配列番号１９に示す人工オリゴ配列を用いた場合の結果を示す。図中、四角で表すパターンは、鋳型として、配列番号１に示す塩基配列において４０１番目の塩基（Ｙ）がＴである、配列番号１８に示す人工オリゴ配列を用いた場合の結果を示す。図中、三角で表すパターンは、鋳型として、配列番号１８に示す人工オリゴ配列と、配列番号２０に示す人工オリゴ配列とを、１：１混合して用いた場合の結果を示す。
【００９９】
図２の結果より、配列番号１に示す塩基配列において４０１番目の塩基（Ｙ）がＣである場合と、Ｔである場合とが混在しても、本発明に係る蛍光標識オリゴヌクレオチドをプローブとして用いることにより、配列番号１に示す塩基配列において４０１番目の塩基の多型を検出できることが明らかとなった。また、鋳型として、配列番号１９に示す人工オリゴ配列を用いた場合には、Ｔｍ値が６３℃であり、鋳型として、配列番号１８に示す人工オリゴ配列を用いた場合には、Ｔｍ値が５６℃であった。
【０１００】
［実施例２］
全自動ＳＮＰｓ検査装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ（商標）、アークレイ社製）と、下記表６又は表７に記載した処方の反応液を用いて、ＰＣＲ及びＴｍ解析を行った。
【０１０１】
【表６】
【０１０２】
【表７】
【０１０３】
ＰＣＲは、９５℃で６０秒処理した後、９５℃で１秒及び５７℃で３０秒を１サイクルとして、５０サイクル繰り返した。
Ｔｍ解析は、ＰＣＲの後、９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理し、続けて温度の上昇速度１℃／３秒で、４０℃〜７５℃まで温度を上昇させ、その間の経時的な蛍光強度の変化を測定した。
【０１０４】
多型検出用プローブには、配列番号２で示される配列のうち３’末端が蛍光色素（ＴＡＭＲＡ）で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド（ＭＤＲ１（１２３６）ｐｒｏｂｅ）、配列番号９で示される配列のうち５’末端が蛍光色素（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ）で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド（ＭＤＲ１ ｅｘｏｎ２６ ｐｒｏｂｅ）及び配列番号１０で示される配列のうち５’末端が蛍光色素（ＢｏＤＩＰＹ ＦＬ）で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド（ＭＤＲ１ ｅｘｏｎ２１ ｐｒｏｂｅ２）を用いた。
ＭＤＲ１ ｅｘｏｎ２６ ｐｒｏｂｅ及びＭＤＲ１ ｅｘｏｎ２１ ｐｒｏｂｅ２について、詳細を以下に示す。
【０１０５】
【表８】
【０１０６】
なお、蛍光色素Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅの励起波長は３６５ｎｍ〜４１５ｎｍであり、検出波長は４４５ｎｍ〜４８０ｎｍである。蛍光色素ＢＯＤＩＰＹ ＦＬの励起波長は４２０ｎｍ〜４８５ｎｍであり、検出波長は５２０〜５５５ｎｍである。蛍光色素ＴＡＭＲＡの励起波長は５２０ｎｍ〜５５５ｎｍであり、検出波長は５８５ｎｍ〜７００ｎｍである(以下、同様)。それぞれの波長により、蛍光標識プローブに由来する蛍光強度の変化をそれぞれ測定した。
【０１０７】
使用したプライマーのうち、配列番号７で示されるＭＤＲ１(１２３６)Ｆ及び配列番号８で示されるＭＤＲ１(１２３６)Ｒ以外のプライマーについて、詳細を以下に示す。
【０１０８】
【表９】
【０１０９】
鋳型としては、全血と、全血から常法に従い精製した精製ヒトゲノムとを、それぞれ用いた。
全血は、以下のように調製した。
全血１０μｌを７０μｌの希釈液１に加え、よく混合した後、この混合液１０μｌを７０μｌの希釈液２に加える。この混合液１７μｌを９５℃１０分で加熱すると４μｌの前処理済全血が得られる。これを１ｔｅｓｔあたりの鋳型として使用した。
【０１１０】
【表１０】
【０１１１】
Ｔｍ解析によって、プローブの蛍光値の変化量を示す図３を得た。
図３の（Ａ）〜（Ｃ）は試料として精製ヒトゲノムを用いた場合の結果を示す。
図３の（Ｄ）〜（Ｆ）は試料として全血を用いた場合の結果を示す。
また、図３（Ａ）及び（Ｄ）は配列番号１に示す塩基配列における４０１番目の塩基に対応する多型の有無を示し、図３（Ｂ）及び（Ｅ）は配列番号１５に示す塩基配列における２５６番目の塩基に対応する多型の有無を示し、及び図３（Ｃ）及び（Ｆ）は配列番号１６に示す塩基配列における３００番目の塩基に対応する多型の有無を示す。
図中、縦軸は単位時間当たりの蛍光強度の変化量(ｄ蛍光強度増加量/ｔ)を表し、横軸は温度（℃）をそれぞれ表す。
【０１１２】
その結果、本発明に係る蛍光標識オリゴヌクレオチドをプローブとして用いることにより、配列番号１に示す塩基配列において４０１番目の塩基の多型を検出できると同時に、同一の系において、簡便に、配列番号１５に示す塩基配列における２５６番目の塩基に対応する多型の有無、及び配列番号１６に示す塩基配列における３００番目の塩基に対応する多型の有無を検出できることが明らかとなった。
【０１１３】
［比較例１］
全自動ＳＮＰｓ検査装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ（商標）、アークレイ社製）と、下記表１１に記載した処方の検査用試薬を用いてＴｍ解析を行った。プローブとして、配列番号１７に示す蛍光標識オリゴヌクレオチドを用い、鋳型として、配列番号２０及び配列番号２１の人工オリゴ配列を使用した。
【０１１４】
【表１１】
【０１１５】
なお、上記表１１で使用したプローブ及び鋳型の詳細を以下に示す。プローブ中の３’末端の括弧内は蛍光色素の種類を示す。
【０１１６】
【表１２】
【０１１７】
【表１３】
【０１１８】
Ｔｍ解析は、９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理し、続けて温度の上昇速度１℃／３秒で、４０℃〜７５℃まで温度を上昇させ、その間の経時的な蛍光強度の変化を測定した。蛍光色素としてＴＡＭＲＡを用いた。
【０１１９】
Ｔｍ解析によって、プローブの蛍光値の変化量を示す図４を得た。図中、縦軸は単位時間当たりの蛍光強度の変化量(ｄ蛍光強度増加量/ｔ)を表し、横軸は温度（℃）をそれぞれ表す。図中、菱形で表すパターンは、鋳型として、配列番号１に示す塩基配列において４０１番目の塩基（Ｙ）がＣである、配列番号２１に示す人工オリゴ配列を用いた場合の結果を示す。図中、四角で表すパターンは、鋳型として、配列番号１に示す塩基配列において４０１番目の塩基（Ｙ）がＴである、配列番号２０に示す人工オリゴ配列を用いた場合の結果を示す。図中、三角で表すパターンは、鋳型として、配列番号２０に示す人工オリゴ配列と、配列願号２２に示す人工オリゴ配列とを、１：１混合して用いた場合の結果を示す。
【０１２０】
図４の結果より、配列番号１に示す塩基配列において４０１番目の塩基（Ｙ）がＣである場合と、Ｔである場合とが混在した場合には、検出ピークが１つしか得られず、多型を検出することはできなかった。
なお、比較例１で用いた配列番号１７に示す蛍光標識オリゴヌクレオチドは、数多く存在する検出不可能なプローブの代表例を示したものにすぎない。
【０１２１】
以上の通りであるので、本発明によれば、高い感度で、簡便にＭＤＲ１遺伝子における多型を検出することができることが明らかになった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多型検出用プローブ、多型検出方法、薬効判定方法及び多型検出用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＭＤＲ１遺伝子は、Ｐ−糖タンパクをコードする遺伝子である。Ｐ−糖タンパクは、がん細胞、肝臓、小腸及び脳血管内皮細胞等様々な細胞に発現し、薬剤の輸送に関与する。
また、ＭＤＲ１遺伝子のエクソン２６の３４３５番目のＣがＴに置換する変異型（Ｃ３４３５Ｔ変異型）、ＭＤＲ１遺伝子のエクソン２１の２６７７番目のＧがＡまたはＴに置換する変異型（Ｇ２６７７Ａ／Ｔ変異型）及びＭＤＲ１遺伝子のエクソン１２の１２３６番目のＣがＴに置換する変異型（Ｃ１２３６Ｔ変異型）は、大腸がんの予後を推測するための因子として有用であることが知られている（例えば、非特許文献１参照)。
【０００３】
遺伝子の多型を測定する方法としては、測定対象となる塩基を含む部分を増幅するように設計されたプライマーを用いてＰＣＲを行い、当該塩基における変異型の有無で切断の有無が分かれるような制限酵素を用いて切断し、その後、電気泳動で切断されたかどうかを検出するという方法（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法）が知られている。
別の方法としては、変異型を含む領域をＰＣＲ法で増幅した後、蛍光色素で標識された核酸プローブを、標的核酸にハイブリダイゼーションさせ、蛍光色素の発光の減少量を測定し、融解曲線分析の結果に基づいて塩基配列の変異型を解析する方法が知られている（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
また、特定の核酸プローブを用いることにより、ＭＤＲ１遺伝子のＣ３４３５Ｔ変異型の有無を、高い感度で、簡便に、検出できることが報告されている（例えば、特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第３９６３４２２号公報
【特許文献２】特許第４４５４３６６号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ．Ｄｉｓ．、２０１０年、第２５巻、ｐ１１６７−１１７６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
非特許文献１では、ＭＤＲ１遺伝子のＣ３４３５Ｔ変異型を検出する方法として、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法が用いられている。ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法は、ＰＣＲ反応後に増幅産物を取り出して制限酵素処理を行う必要がある。そのため、増幅産物が次の反応系に混入する恐れがあり、これに起因して偽陽性、偽陰性の結果が得られてしまう場合がある。さらに、ＰＣＲ終了後、制限酵素で処理を行い、その後電気泳動を行うため、検出までに必要な時間も非常に長くなってしまう場合がある。また、操作が複雑なため、自動化が困難である。
また、非特許文献１では、ＭＤＲ１遺伝子のＧ２６７７Ａ／Ｔ変異型及びＣ１２３６Ｔ変異型を検出する方法として、シークエンス解析法が用いられている。シークエンス解析法を用いた検出方法では、ＰＣＲを行った後、シークエンス反応を行い、シークエンサーで電気泳動を行わなければならないなど、手間やコストを要する。また、増幅産物を処理する必要があるため、増幅産物が次の反応系に混入する恐れがある。
【０００８】
特許文献１では、核酸プローブを用いる方法により、多型を検出している。しかし、特許文献１には、核酸プローブの設計に関し、末端部が蛍光色素により標識された消光プローブが標的配列にハイブリダイゼーションしたとき、末端部分において形成される核酸プローブと標的配列とのハイブリッドの複数塩基対が少なくとも一つのＧとＣのペアを形成するように設計するという教示があるのみである。そのため、特許文献１に記載の方法では、変異型毎に適正なる配列を有する核酸プローブを使用する必要がある。
また、本発明者の検討により、核酸プローブの配列において、ＧＣの含量が高すぎると消光プローブが十分に機能しないことも明らかになった。
【０００９】
特許文献２には、ＭＤＲ１遺伝子のエクソン２６におけるＣ３４３５Ｔ変異型を検出する方法は記載されているものの、特許文献２に記載の核酸プローブを利用してＭＤＲ１遺伝子のＧ２６７７Ａ／Ｔ変異型やＣ１２３６Ｔ変異型を検出することはできない。
これらの現状を踏まえ、ＭＤＲ１遺伝子におけるＣ３４３５Ｔ変異型以外の塩基における多型検出のためのさらなる技術開発が待ち望まれていた。
【００１０】
本発明は、ＭＤＲ１遺伝子のエクソン１２におけるＣ１２３６Ｔ変異型を、高い感度で、簡便に検出することを可能にする多型検出用プローブ、これを用いた多型検出方法および薬効判定方法、ならびに多型検出用キットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、ＭＤＲ１遺伝子のエクソン１２におけるＣ１２３６Ｔ変異型を含む特定の領域に基づいて消光プローブを設計することにより、消光プローブを用いる融解曲線分析によりＣ１２３６Ｔ変異を検出できるとの知見を得た。本発明は、かかる知見に基づいて達成されたものである。
本発明は以下のとおりである。
＜１＞ 下記Ｐ１及びＰ１’からなる群より選択される一種の蛍光標識オリゴヌクレオチドであるＭＤＲ１遺伝子の多型を検出するための多型検出用プローブ；
（Ｐ１）配列番号１に示す塩基配列において、３９５番目〜４０１番目の塩基を含む塩基長７〜３８の塩基配列に相補的な配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、３９５番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、及び
（Ｐ１’）配列番号１に示す塩基配列において、３９５番目〜４０１番目の塩基を含む塩基長７〜３８の塩基配列に相補的な配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、３９５番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド。
＜２＞ 下記Ｐ１−１及びＰ１’−１からなる群より選択される少なくとも一種の蛍光標識オリゴヌクレオチドである＜１＞に記載の多型検出用プローブ；
（Ｐ１−１）配列番号１に示す塩基配列において、３９５番目〜４０１番目の塩基を含む塩基長７〜３８の塩基配列に相補的な配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、３９５番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号１における４０１番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド、及び
（Ｐ１’−１）配列番号１に示す塩基配列において、３９５番目〜４０１番目の塩基を含む塩基長７〜３８の塩基配列に相補的な配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、３９５番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号１における４０１番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド。
＜３＞ 前記Ｐ１又はＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドが、蛍光色素で標識された３９５番目の塩基に対応する塩基を３’末端から数えて１番目〜３番目の位置のいずれかに有する＜１＞又は＜２＞に記載の多型検出用プローブ。
＜４＞ 前記Ｐ１又はＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドが、蛍光色素で標識された３９５番目の塩基に対応する塩基を３’末端に有する＜１＞〜＜３＞のいずれか１つに記載の多型検出用プローブ。
＜５＞ 前記Ｐ１又はＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドが、標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、且つ標的配列にハイブリダイズしたときの蛍光強度が、ハイブリダイズしないときの蛍光強度に比べて、減少するか又は増加する、＜１＞〜＜４＞のいずれか１つに記載の多型検出用プローブ。
＜６＞ 前記Ｐ１又はＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドが、標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、標的配列にハイブリダイズしたときの蛍光強度が、ハイブリダイズしないときの蛍光強度に比べて、減少する＜５＞に記載の多型検出用プローブ。
＜７＞ 前記Ｐ１又はＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基長が７〜２８である＜１＞〜＜６＞のいずれか１つに記載の多型検出用プローブ。
＜８＞ 前記Ｐ１又はＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基長が７〜１８である＜１＞〜＜７＞のいずれか１つに記載の多型検出用プローブ。
＜９＞ 融解曲線分析用のプローブである＜１＞〜＜８＞のいずれか１つに記載の多型検出用プローブ。
＜１０＞ ＜１＞〜＜９＞のいずれか１つに記載のプローブを用いることによりＭＤＲ１遺伝子の多型を検出する多型検出方法。
＜１１＞ （Ｉ）＜１＞〜＜９＞のいずれか１つに記載のプローブ及び試料中の一本鎖核酸を接触させて、前記蛍光標識オリゴヌクレオチド及び前記一本鎖核酸をハイブリダイズさせてハイブリッドを得ることと、
（ＩＩ）前記ハイブリッドを含む試料の温度を変化させることにより、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づく蛍光シグナルの変動を測定することと、
（ＩＩＩ）前記蛍光シグナルの変動に基づいてハイブリッドの解離温度であるＴｍ値を測定することと、
（ＩＶ）前記Ｔｍ値に基づいて、前記試料中の一本鎖核酸における、ＭＤＲ１遺伝子の多型の存在を検出することと、
を含む、＜１０＞に記載の多型検出方法。
＜１２＞ さらに、前記（Ｉ）のハイブリッドを得る前又は前記（Ｉ）のハイブリッドを得ることと同時に、核酸を増幅することを含む＜１１＞に記載の多型検出方法。
＜１３＞ さらに、配列番号１５に示す塩基配列における２５６番目の塩基に対応する多型、及び配列番号１６に示す塩基配列における３００番目の塩基に対応する多型の少なくとも一方の多型を同一の系で検出することを含む＜１０＞〜＜１２＞のいずれか１つに記載の多型検出方法。
＜１４＞ 配列番号１に示す塩基配列における４０１番目の塩基に対応する多型と、配列番号１５に示す塩基配列における２５６番目の塩基に対応する多型と、配列番号１６に示す塩基配列における３００番目の塩基に対応する多型とを同一の系で検出することを含む、＜１０＞〜＜１３＞のいずれか１つに記載の多型検出方法。
＜１５＞ ＜１０＞〜＜１４＞のいずれか１つに記載の多型検出方法により、ＭＤＲ１遺伝子における多型を検出すること、及び検出された多型の有無に基づいて薬剤に対する耐性又は薬剤の薬効を判定することを含む薬剤の薬効判定方法。
＜１６＞ ＜１＞〜＜９＞のいずれか１つに記載のプローブを含む、ＭＤＲ１遺伝子における多型を検出する多型検出用試薬キット。
＜１７＞ さらに、前記プローブがハイブリダイズする領域を含む塩基配列を増幅するためのプライマーを含む＜１６＞に記載の多型検出用試薬キット。
＜１８＞ さらに、配列番号１に示す塩基配列における２５６番目の塩基に対応する多型を検出するための多型検出用プローブと、配列番号１６に示す塩基配列における３００番目の塩基に対応する多型を検出するための多型検出用プローブとを含む＜１６＞又は＜１７＞に記載の多型検出用試薬キット。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、ＭＤＲ１遺伝子のエクソン１２におけるＣ１２３６Ｔ変異型を、高い感度で、簡便に検出することを可能にする多型検出用プローブ、これを用いた多型検出方法および薬効判定方法、ならびに多型検出用キットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】（Ａ）は、核酸混合物の融解曲線の一例であり、（Ｂ）は微分融解曲線の一例である。
【図２】本発明の実施例１にかかる試料の微分融解曲線である。
【図３】（Ａ）〜（Ｆ）は、本発明の実施例２にかかる試料の微分融解曲線である。
【図４】本発明の比較例１にかかる試料の微分融解曲線である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明にかかるＭＤＲ１遺伝子の多型検出用プローブ（以下、単に「多型検出用プローブ」ということがある）は、下記Ｐ１及びＰ１’からなる群より選択される一種の蛍光標識オリゴヌクレオチドであるＭＤＲ１遺伝子の多型を検出するための多型検出用プローブである：
（Ｐ１）配列番号１に示す塩基配列において、３９５番目〜４０１番目の塩基を含む塩基長７〜３８の塩基配列に相補的な配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、３９５番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、及び
（Ｐ１’）配列番号１に示す塩基配列において、３９５番目〜４０１番目の塩基を含む塩基長７〜３８の塩基配列に相補的な配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、３９５番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド。
本発明にかかるＭＤＲ１遺伝子の多型検出方法は、前記ＭＤＲ１遺伝子の多型を検出するための多型検出用プローブを少なくとも１種用いてＭＤＲ１遺伝子の多型を検出することを含む方法である。
本発明にかかる薬剤の薬効判定方法は、前記ＭＤＲ１遺伝子多型検出方法によりＭＤＲ１遺伝子の多型を検出すること、及び検出された多型の有無に基づいて、薬剤に対する耐性または薬剤の薬効を判定することを含む方法である。
本発明にかかる多型検出用試薬キットは、ＭＤＲ１遺伝子の多型を検出するための多型検出用プローブを含むものである。
【００１５】
本発明における「ＭＤＲ１遺伝子」は、既に公知であり、その塩基配列は、Ｇｅｎｅ ＩＤ：５２４３、ＮＣＢＩのアクセッションＮｏ．ＮＧ_０１１５１３のうち４９２６番目の塩基〜２１４３８６番目の塩基の配列に相当する。なお、本明細書においては、特に断らない限り「ＭＤＲ１遺伝子」は、配列番号１に示すＭＤＲ１遺伝子のエクソン１２に相当する塩基配列を意味するものとする。
配列番号１の塩基配列は、ＮＣＢＩのｄｂＳＮＰのアクセッションＮｏ．ｒｓ１１２８５０３の１〜８０１の配列である。
【００１６】
本発明において、検出対象となる試料中の試料核酸、多型検出用プローブ又はプライマーの個々の配列に関して、これら互いの相補的な関係に基づいて記述された事項は、特に断らない限り、それぞれの配列と、各配列に対して相補的な配列とについても適用される。各配列に対して相補的な当該配列について本発明の事項を適用する際には、当該相補的な配列が認識する配列は、当業者にとっての技術常識の範囲内で、対応する本明細書に記載された配列に相補的な配列に、明細書全体を読み替えるものとする。
【００１７】
本発明において、「Ｔｍ値」とは、二本鎖核酸が解離する温度（解離温度：Ｔｍ）であって、一般に、２６０ｎｍにおける吸光度が、吸光度全上昇分の５０％に達した時の温度と定義される。即ち、二本鎖核酸、例えば、二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖ＤＮＡが解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度は加熱開始時の吸光度（二本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって融解が完了したと判断できる。Ｔｍ値は、この現象に基づき設定される。本発明におけるＴｍ値は、特に断らない限り、吸光度が、吸光度全上昇分の５０％に達した時の温度をいう。
本発明において、オリゴヌクレオチドの配列に関して「３’末端から数えて１〜３番目」という場合は、オリゴヌクレオチド鎖の３’末端を１番目として数える。同様に「５’末端から数えて１〜３番目」という場合は、オリゴヌクレオチド鎖の５’末端を１番目として数える。
【００１８】
本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であっても本工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。
また、本発明において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
また、本発明において、組成物中の各成分の量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
本明細書において変異とは、野生型の塩基配列の一部の塩基が置換、欠失、重複又は挿入されることによって生じる新たな塩基配列を意味する。また、多型とは、変異によって生じる塩基配列の多型を意味する。
以下、本発明について説明する。
【００１９】
＜ＭＤＲ１遺伝子多型検出用プローブ＞
本発明のＭＤＲ１遺伝子の多型検出用プローブ（以下、単に「多型検出用プローブ」ともいう）は、下記Ｐ１及びＰ１’からなる群より選択される一種の蛍光標識オリゴヌクレオチドであるＭＤＲ１遺伝子の多型を検出するための多型検出用プローブである：
（Ｐ１）配列番号１に示す塩基配列において、３９５番目〜４０１番目の塩基を含む塩基長７〜３８の塩基配列に相補的な配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、３９５番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、及び
（Ｐ１’）配列番号１に示す塩基配列において、３９５番目〜４０１番目の塩基を含む塩基長７〜３８の塩基配列に相補的な配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、３９５番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド。
【００２０】
本発明における前記Ｐ１及びＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号１に示す塩基配列の４０１番目の塩基における多型を検出することができるプローブである。
【００２１】
ＭＤＲ１遺伝子の野生型では、配列番号１に示される配列のうち４０１番目に対応する塩基は、Ｃ（シトシン）であるが、変異型においてはＴ（チミン）に変異しており（以下、「Ｃ１２３６Ｔ変異型」ともいう）、当該塩基は、ＭＤＲ１遺伝子の８７１３３１７９番目〜８７３４２６３９番目の塩基のうち、８７２９６２１７番目の塩基に該当する。
【００２２】
本発明における前記Ｐ１及びＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号１における３９５番目〜４０１番目の塩基を含む塩基配列に対して相補的な塩基配列である。
【００２３】
具体的には、本発明において相同性が認められる蛍光標識オリゴヌクレオチドとは、配列番号１に示す塩基配列において、３９５番目〜４０１番目の塩基を含む塩基長７〜３８の塩基配列に相補的な配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有する。なお、３９５番目の塩基に対応する塩基は、シトシンであることを要する。
また、Ｐ１の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、検出感度の観点より、配列番号１に示す塩基配列において、３９５番目〜４０１番目の塩基を含む塩基長７〜３８の塩基配列に相補的な配列に対して、８５％以上の同一性、９０％以上の同一性、９５％以上の同一性、９６％以上の同一性、９７％以上の同一性、９８％以上の同一性又は９９％以上の同一性を示してもよい。
本発明の前記Ｐ１の蛍光標識オリゴヌクレオチドと、配列番号１における２１７番目の塩基に対応する塩基がＣ（シトシン）である以外は配列番号１と同一の塩基を有する塩基配列とを比較した際の同一性が８０％未満である場合には、変異型のＭＤＲ１遺伝子を含む試料核酸に対する検出感度が低くなる。
【００２４】
本発明における前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号１に示す塩基配列において、３９５番目〜４０１番目の塩基を含む塩基長７〜３８の塩基配列に相補的な配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。なお、３９５番目の塩基に対応する塩基はシトシンであることを要する。
【００２５】
ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ３ｒｄ（Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ． Ｐｒｅｓｓ， ２００１） に記載の方法等に従って行うことができる。この文献は、参照により本明細書に組み入れられるものとする。
ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。典型的なストリンジェントな条件とは、例えば、カリウム濃度は約２５ｍＭ〜約５０ｍＭ、及びマグネシウム濃度は約１．０ｍＭ〜約５．０ｍＭ中において、ハイブリダイゼーションを行う条件があげられる。本発明の条件の１例としてＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）、２５ｍＭのＫＣｌ、及び１．５ｍＭのＭｇＣｌ２中においてハイブリダイゼーションを行う条件が、挙げられるが、これに限定されるものではない。その他、ストリンジェントな条件としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ３ｒｄ（Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ． Ｐｒｅｓｓ， ２００１）に記載されている。この文献は、参照により本明細書に組み入れられるものとする。当業者は、ハイブリダイゼーション反応や、ハイブリダイゼーション反応液の塩濃度等を変化させることによって、このような条件を容易に選択することができる。
【００２６】
さらに、本発明における前記Ｐ１及びＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドとしては、前記Ｐ１及びＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドに塩基が挿入、欠失又は置換した蛍光標識オリゴヌクレオチドも本発明における蛍光標識オリゴヌクレオチドに包含される。
当該塩基が挿入、欠失又は置換した蛍光標識オリゴヌクレオチドは、前記Ｐ１及びＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドと同等程度の作用を示せばよく、塩基が挿入、欠失又は置換されている場合、その挿入、欠失又は置換の位置は、特に限定されない。挿入、欠失又は置換した塩基の数としては１塩基又は２塩基以上が挙げられ、蛍光標識オリゴヌクレオチド全体の長さによって異なるが、例えば１塩基〜１０塩基、好ましくは１塩基〜５塩基が挙げられる。
【００２７】
前記蛍光標識オリゴヌクレオチドにおける、オリゴヌクレオチドとしては、オリゴヌクレオチドの他、修飾されたオリゴヌクレオチドも含まれる。
前記オリゴヌクレオチドの構成単位としては、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、人工核酸等が挙げられる。前記人工核酸としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡアナログであるＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）；ペプチド核酸であるＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）；架橋化核酸であるＢＮＡ（Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）等が挙げられる。
前記オリゴヌクレオチドは、前記構成単位のうち、一種類から構成されてもよいし、複数種類から構成されてもよい。
【００２８】
本発明の前記Ｐ１及びＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さとしては、７ｍｅｒ〜３８ｍｅｒであることを要する。前記Ｐ１及びＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さが７ｍｅｒ未満や、３８ｍｅｒより長い場合には、ＭＤＲ１遺伝子多型の検出感度が低下してしまい好ましくない。
また、本発明の前記Ｐ１及びＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さとしては、７ｍｅｒ〜２８ｍｅｒにすることができ、７ｍｅｒ〜１８ｍｅｒにすることもできる。７ｍｅｒ〜２８ｍｅｒという範囲にすることにより、例えば検出感度がさらに高くなる等の傾向がある。
前記Ｐ１及びＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基長を変化させることで、蛍光標識オリゴヌクレオチドがその相補鎖（標的配列）と形成するハイブリッドの解離温度であるＴｍ値を、所望の値に調整することができる。
【００２９】
以下に本発明における前記Ｐ１及びＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドにおける塩基配列の一例を表１に示すが、本発明はこれらに限定されない。
なお、表１では、配列番号１の４０１番目の塩基に対応する塩基を大文字で表記した。また、配列番号１の４０１番目に対応する塩基がＴ又はＣの場合である試料核酸と、それぞれのＰ１蛍光標識オリゴヌクレオチドとのハイブリッドのＴｍ値を併せて示した。Ｔｍ値は、Ｍｅｌｔｃａｌｃ ９９ ｆｒｅｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｌｔｃａｌｃ．ｃｏｍ／）を用い、設定条件：Ｏｌｉｇｏｃｏｎｃ［μＭ］０．２、Ｎａ ｅｑ．［ｍＭ］５０の条件で算出した(以下、同様)。
【００３０】
【表１】
【００３１】
本発明において、配列番号１の４０１番目に対応する塩基がＴに該当する試料核酸とハイブリダイズした場合のＴｍ値と、配列番号１の４０１番目に対応する塩基がＣに該当する試料核酸とハイブリダイズした場合のＴｍ値との差は、１．５℃以上、２．０℃、５℃以上、９℃以上にすることができる。前記Ｔｍ値の差が１．５℃以上であることで、例えば、配列番号１における４０１番目の塩基の変異型をより高感度に検出することができる。
【００３２】
前記Ｔｍ値の差を大きくする方法としては、例えばプローブがハイブリダイズする領域に対応する塩基配列に対して、ミスマッチとなる塩基を該プローブに含める方法などが挙げられる。具体的には、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ（１９９７）ｖｏｌ１５ ｐ．３３１−３３５等に記載の方法が挙げられる。
【００３３】
また、本発明の前記Ｐ１及びＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、３９５番目の塩基（シトシン）が蛍光色素で標識されていることを要する。
【００３４】
前記Ｐ１及びＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドにおいては、この蛍光標識された３９５番目の塩基が、３’末端から数えて１〜３番目のいずれかの位置に存在することができる。また、３’末端に存在することができる。これにより、例えば、多型検出感度がより向上する。また、Ｐ１又は前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドを生産性よく得ることができる。
【００３５】
本発明の前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは、標的配列にハイブリダイズしていないときの蛍光強度に比べて、標的配列にハイブリダイズしているときの蛍光強度が減少（消光）するかまたは増加する蛍光標識オリゴヌクレオチドであることができる。その中でも標的配列にハイブリダイズしていないときの蛍光強度に比べて、標的配列にハイブリダイズしているときの蛍光強度が減少する蛍光標識オリゴヌクレオチドであることができる。
【００３６】
このような蛍光消光現象（Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ）を利用したプローブは、一般的に、グアニン消光プローブと呼ばれており、いわゆるＱＰｒｏｂｅ（登録商標）として知られている。中でも、オリゴヌクレオチドを３'末端もしくは５'末端がシトシン（Ｃ）となるように設計し、その末端のＣが、グアニン（Ｇ）に近づくと発光が弱くなるように蛍光色素で標識化されたオリゴヌクレオチドであることが挙げられる。
このようなプローブを使用すれば、シグナルの変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認することができる。
【００３７】
なお、Ｑ Ｐｒｏｂｅを用いた検出方法以外にも、公知の検出様式を適用してもよい。このような検出様式としては、Ｔａｑ−ｍａｎ Ｐｒｏｂｅ法、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｂｅ法、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ Ｂｅａｃｏｎ法又はＭＧＢ Ｐｒｏｂｅ法などを挙げることができる。
【００３８】
前記蛍光色素としては、特に制限されないが、例えば、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等があげられる。これらの蛍光色素の市販品としては、例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ、ＦＡＭ、Ｃｙ３およびＣｙ５、ＴＡＭＲＡ等が挙げられる。
蛍光標識オリゴヌクレオチドの検出条件は特に制限されず、使用する蛍光色素により適宜決定できる。例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅは、検出波長４４５ｎｍ〜４８０ｎｍ、ＴＡＭＲＡは、検出波長５８５ｎｍ〜７００ｎｍ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬは、検出波長５２０ｎｍ〜５５５ｎｍで検出できる。
このような蛍光色素を有するプローブを使用すれば、それぞれの蛍光シグナルの変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認することができる。蛍光色素のオリゴヌクレオチドへの結合は、通常の方法、例えば特開２００２−１１９２９１号公報等に記載の方法に従って行うことができる。
【００３９】
また前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは、例えば、３'末端にリン酸基が付加されてもよい。蛍光標識オリゴヌクレオチドの３'末端にリン酸基を付加させておくことにより、プローブ自体が遺伝子増幅反応によって伸長することを十分に抑制できる。後述するように、変異の有無を検出するＤＮＡ（標的ＤＮＡ）は、ＰＣＲ等の遺伝子増幅法によって調製することができる。その際、３'末端にリン酸基が付加された蛍光標識オリゴヌクレオチドを用いることで、これを増幅反応の反応液中に共存させることができる。
また、３'末端に前述のような標識化物質（蛍光色素）を付加することによっても、同様の効果が得られる。
【００４０】
前記Ｐ１及びＰ１’蛍光標識オリゴヌクレオチドはＭＤＲ１遺伝子における多型、特にＭＤＲ１遺伝子のＣ１２３６Ｔ変異型を検出するＭＤＲ１遺伝子多型検出用プローブとして使用することができる。
また、ＭＤＲ１遺伝子多型検出用プローブは、融解曲線分析用のプローブとして使用することができる。
なお、本発明に係る前記Ｐ１及びＰ１’蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号１に示す塩基配列において、３９５番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、３９５番目の塩基に対応するシトシンが蛍光色素で標識された塩基を用いる以外は、オリゴヌクレオチドの合成方法として知られている公知の方法、例えば特開２００２−１１９２９１号公報等に記載の方法に従って作製することができる。
【００４１】
前記Ｐ１及びＰ１’蛍光標識オリゴヌクレオチドのより好ましい態様としては、以下のＰ１−１及びＰ１’−１蛍光標識オリゴヌクレオチドが挙げられる。
（Ｐ１−１）配列番号１に示す塩基配列において、３９５番目〜４０１番目の塩基を含む塩基長７〜３８の塩基配列に相補的な配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、３９５番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号１における４０１番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド、及び
（Ｐ１’−１）配列番号１に示す塩基配列において、３９５番目〜４０１番目の塩基を含む塩基長７〜３８の塩基配列に相補的な配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、３９５番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号１における４０１番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド。
なお、「配列番号１における４０１番目の多型を認識する」とは、「配列番号１における４０１番目の多型を示す塩基に結合する」と同義である。
【００４２】
＜プライマー＞
後述するＭＤＲ１遺伝子多型検出方法では、検出対象となるＭＤＲ１遺伝子多型を含む配列をＰＣＲ法により増幅する場合には、プライマーが用いられる。
本発明において使用しうるプライマーは、目的とする検出対象となるＭＤＲ１遺伝子の多型の部位である、配列番号１で示される配列のうち４０１番目の塩基に対応する塩基を含む核酸を増幅可能であれば特に制限されない。
【００４３】
ＰＣＲ法に適用するプライマーは、本発明の多型検出用プローブがハイブリダイズする領域を含む塩基配列を増幅できるものであれば特に制限されず、配列番号１〜配列番号６で示される塩基配列から、当業者であれば適宜設計することができる。プライマーの長さ及びＴｍ値は、１２ｍｅｒ〜４０ｍｅｒ及び４０℃〜７０℃、又は１６ｍｅｒ〜３０ｍｅｒ及び５５℃〜６０℃にすることができる。
また、プライマーセットの各プライマーの長さは同一でなくてもよいが、両プライマーのＴｍ値はほぼ同一（又は、Ｔｍ値の両プライマーでの差が５℃以内）であることが挙げられる。
【００４４】
以下に本発明の多型検出方法における本発明の多型検出用プローブがハイブリダイズする領域を含む塩基配列の増幅に使用できるプライマーの例を示す。なお、これらは例示であって、本発明を制限するものではない。
【００４５】
【表２】
【００４６】
本発明の多型検出用プローブがハイブリダイズする領域を含む塩基配列を増幅する際には、感度及び効率の観点より、表２に示す各オリゴヌクレオチドを、一対のプライマーセットとして用いることが挙げられる。
【００４７】
多型の検出方法は前記蛍光標識ヌクレオチドをプローブとして利用する方法であれば、特に制限されない。前記蛍光標識ヌクレオチドをプローブとして用いる多型検出方法の一例として、Ｔｍ解析を利用した多型検出方法について、以下に説明する。
【００４８】
＜多型検出方法＞
本発明にかかるＭＤＲ１遺伝子多型検出方法は、前記ＭＤＲ１遺伝子多型検出用プローブを少なくとも１種用いて、ＭＤＲ１遺伝子の多型を検出することを含むＭＤＲ１遺伝子多型検出方法である。
本発明にかかる多型検出方法によれば、前記多型検出用プローブを少なくとも１種含むことにより、ＭＤＲ１遺伝子の多型を簡便に、感度よく検出可能にする。
また、本発明の多型検出方法は、ＭＤＲ１遺伝子における多型の検出方法であって、下記工程（Ｉ）〜工程（ＩＶ）を含むことができ、下記工程（Ｖ）を含んでいてもよい。なお、本発明の多型検出方法は、前記多型検出用プローブを使用することが特徴であって、その他の構成や条件等は、以下の記載に制限されない。
【００４９】
（Ｉ）前記多型検出用プローブ及び試料中の一本鎖核酸を接触させて、前記蛍光標識オリゴヌクレオチド及び前記一本鎖核酸をハイブリダイズさせてハイブリッドを得ること。
（ＩＩ）前記ハイブリッドを含む試料の温度を変化させることにより、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づく蛍光シグナルの変動を測定すること。
（ＩＩＩ）前記蛍光シグナルの変動に基づいてハイブリッドの解離温度であるＴｍ値を測定すること。
（ＩＶ）前記Ｔｍ値に基づいて、ＭＤＲ１遺伝子における多型の存在を検出すること。
（Ｖ）前記多型の存在に基づいて、前記試料中の一本鎖核酸における、多型を有する一本鎖核酸の存在比を検出すること。
【００５０】
また、本発明においては、上記工程（Ｉ）〜（ＩＶ）又は上記工程（Ｉ）〜（Ｖ）に加えて、さらに、工程（Ｉ）のハイブリッドを得る前又は工程（Ｉ）のハイブリッドを得ることと同時に、核酸を増幅することを含んでいてもよい。
なお、（ＩＩＩ）でＴｍ値を測定することには、ハイブリッドの解離温度を測定することだけでなく、ハイブリット形成体の融解時に温度に応じて変動する蛍光シグナルの微分値の大きさを測定することを含んでもよい。
【００５１】
本発明において、試料中の核酸は、一本鎖核酸でもよいし二本鎖核酸であってもよい。前記核酸が二本鎖核酸の場合は、例えば、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることに先立って、加熱により前記試料中の二本鎖核酸を融解（解離）させて一本鎖核酸とすることを含むことが挙げられる。二本鎖核酸を一本鎖核酸に解離することによって、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドとのハイブリダイズが可能となる。
【００５２】
本発明において、検出対象である試料に含まれる核酸は、例えば、生体試料に元来含まれる核酸でもよいが、検出精度が向上できることから、生体試料に元来含まれている核酸を鋳型としてＰＣＲ等によりＭＤＲ１遺伝子の変異した部位を含む領域を増幅させた増幅産物であることが挙げられる。増幅産物の長さは、特に制限されないが、例えば、５０ｍｅｒ〜１０００ｍｅｒ、又は８０ｍｅｒ〜２００ｍｅｒにすることができる。また、試料中の核酸は、例えば、生体試料由来のＲＮＡ（トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ等）からＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＰＣＲ）により合成したｃＤＮＡであってもよい。
【００５３】
本発明において、前記試料中の核酸に対する、本発明の多型検出用プローブの添加割合（モル比）は特に制限されない。試料中のＤＮＡに対して例えば１倍以下が挙げられる。また、十分な検出シグナル確保の観点より、前記試料中の核酸に対する、本発明の多型検出用プローブの添加割合（モル比）は、０．１倍以下としうる。
ここで、試料中の核酸とは、例えば、検出目的の多型が発生している検出対象核酸と前記多型が発生していない非検出対象核酸との合計でもよいし、検出目的の多型が発生している検出対象配列を含む増幅産物と前記多型が発生していない非検出対象配列を含む増幅産物との合計でもよい。なお、試料中の核酸における前記検出対象核酸の割合は、通常、不明であるが、結果的に、前記多型検出用プローブの添加割合（モル比）は、検出対象核酸（検出対象配列を含む増幅産物）に対して１０倍以下としうる。また、前記多型検出用プローブの添加割合（モル比）は、検出対象核酸（検出対象配列を含む増幅産物）に対して、５倍以下、又は３倍以下としうる。また、その下限は特に制限されないが、例えば、０．００１倍以上、０．０１倍以上、又は０．１倍以上としうる。
【００５４】
前記ＤＮＡに対する本発明の多型検出用プローブの添加割合は、例えば、二本鎖核酸に対するモル比でもよいし、一本鎖核酸に対するモル比でもよい。
【００５５】
本発明において、Ｔｍ値を決定するための温度変化に伴うシグナル変動の測定は、前述のような原理から２６０ｎｍの吸光度測定により行うこともできるが、前記多型検出用プローブに付加した標識のシグナルに基づくシグナルであって、一本鎖ＤＮＡと前記多型検出用プローブとのハイブリッド形成の状態に応じて変動するシグナルを測定することが挙げられる。このため、前記多型検出用プローブとして、蛍光標識オリゴヌクレオチドを使用することが挙げられる。前記蛍光標識オリゴヌクレオチドとしては、例えば、標的配列にハイブリダイズしていないときの蛍光強度に比べて、標的配列にハイブリダイズしているときの蛍光強度が減少（消光）する蛍光標識オリゴヌクレオチド、または標的配列にハイブリダイズしていないときの蛍光強度に比べて、標的配列にハイブリダイズしているときの蛍光強度が増加する蛍光標識オリゴヌクレオチドが挙げられる。
前者のようなプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成している際には蛍光シグナルを示さないか、蛍光シグナルが弱いが、加熱によりプローブが解離すると蛍光シグナルを示すようになるか、蛍光シグナルが増加する。
また、後者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成することによって蛍光シグナルを示し、加熱によりプローブが解離すると蛍光シグナルが減少（消失）する。したがって、この蛍光標識に基づく蛍光シグナルの変化を蛍光標識特有の条件（蛍光波長等）で検出することによって、前記２６０ｎｍの吸光度測定と同様に、融解の進行ならびにＴｍ値の決定を行うことができる。
【００５６】
次に、本発明の多型検出方法について、蛍光色素に基づくシグナルの変化を検出する方法について具体例を挙げて説明する。なお、本発明の多型検出方法は、前記多型検出用プローブを使用すること自体が特徴であり、その他の工程や条件については何ら制限されない。
【００５７】
核酸増幅を行う際の鋳型となる核酸を含む試料としては、核酸、特にＭＤＲ１遺伝子を含んでいればよく、特に制限されない。例えば、大腸や肺等の組織、白血球細胞等の血球、全血、血漿、喀痰、口腔粘膜懸濁液、爪や毛髪等の体細胞、生殖細胞、乳、腹水液、パラフィン包埋組織、胃液、胃洗浄液、尿、腹膜液、羊水、細胞培養などの任意の生物学的起源に由来する又は由来しうるものを挙げられる。なお、試料の採取方法、核酸を含む試料の調製方法等は、制限されず、いずれも従来公知の方法が採用できる。また、鋳型となる核酸は、該起源から得られたままで直接的に、あるいは該サンプルの特性を改変するために前処理した後で使用することができる。
例えば、全血を試料とする場合、全血からのゲノムＤＮＡの単離は、従来公知の方法によって行うことができる。例えば、市販のゲノムＤＮＡ単離キット（商品名ＧＦＸ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ；ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）等が使用できる。
【００５８】
次に、単離したゲノムＤＮＡを含む試料に、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドを含む多型検出用プローブを添加する。
前記多型検出用プローブは、単離したゲノムＤＮＡを含む液体試料に添加してもよいし、適当な溶媒中でゲノムＤＮＡと混合してもよい。前記溶媒としては、特に制限されず、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の緩衝液、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、グリセロール等を含む溶媒、ＰＣＲ反応液等、従来公知のものが挙げられる。
【００５９】
前記多型検出用プローブの添加のタイミングは、特に制限されず、例えば、後述するＰＣＲ等の増幅処理を行う場合、増幅処理の後に、ＰＣＲ増幅産物に対して添加してもよいし、増幅処理前に添加してもよい。
このようにＰＣＲ等による増幅処理前に前記検出用プローブを添加する場合は、例えば、前述のように、その３'末端に、蛍光色素を付加したり、リン酸基を付加したりすることができる。
【００６０】
核酸増幅の方法としては、例えばポリメラーゼを用いる方法等が挙げられる。その例としては、ＰＣＲ法、ＩＣＡＮ法、ＬＡＭＰ法、ＮＡＳＢＡ法等が挙げられる。ポリメラーゼを用いる方法により増幅する場合は、本発明プローブの存在下で増幅を行うことが挙げられる。用いるプローブ及びポリメラーゼに応じて、増幅の反応条件等を調整することは当業者であれば容易である。これにより、核酸の増幅後にプローブのＴｍ値を解析するだけで多型の有無を判定できるので、反応終了後増幅産物を取り扱う必要がない。よって、増幅産物による汚染の心配がない。また、増幅に必要な機器と同じ機器で検出することが可能なので、容器を移動する必要がなく、自動化も容易である。
【００６１】
またＰＣＲ法に用いるＤＮＡポリメラーゼとしては、通常用いられるＤＮＡポリメラーゼを特に制限なく用いることができる。例えば、ＧｅｎｅＴａｑ（ニッポンジーン社製）、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）、Ｔａｑ ポリメラーゼ等を挙げることができる。
ポリメラーゼの使用量としては、通常用いられている濃度であれば特に制限はない。例えば、Ｔａｑポリメラーゼを用いる場合、例えば、反応溶液量５０μｌに対して０．０１Ｕ〜１００Ｕの濃度とすることができる。これにより、ＭＤＲ１遺伝子多型の検出感度が高まるなどの傾向がある。
【００６２】
またＰＣＲ法は、通常用いられる条件を適宜選択することで行うことができる。
なお、増幅の際、リアルタイムＰＣＲによって増幅をモニタリングし、試料に含まれるＤＮＡ（検出対象配列）のコピー数を調べることもできる。すなわち、ＰＣＲによるＤＮＡ（検出対象配列）の増幅に従ってハイブリッドを形成するプローブの割合が増えるので蛍光強度が変動する。これをモニタリングすることで、試料に含まれる検出対象配列（正常ＤＮＡまたは変異型ＤＮＡ）のコピー数や存在比を検出することができる。
【００６３】
本発明の多型検出方法においては、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドと、試料中の一本鎖核酸とを接触させて、両者をハイブリダイズさせる。試料中の一本鎖核酸は、例えば、上記のようにして得られたＰＣＲ増幅産物を解離することで調製することができる。
【００６４】
前記ＰＣＲ増幅産物の解離（解離工程）における加熱温度は、前記増幅産物が解離できる温度であれば特に制限されない。例えば、８５℃〜９５℃である。加熱時間も特に制限されない。加熱時間は、例えば１秒〜１０分、又は１秒〜５分としうる。
【００６５】
また、解離した一本鎖ＤＮＡと前記蛍光標識オリゴヌクレオチドとのハイブリダイズは、例えば、前記解離工程の後、前記解離工程における加熱温度を降下させることによって行うことができる。温度条件としては、例えば、４０℃〜５０℃である。
【００６６】
ハイブリダイズ工程の反応液における各組成の体積や濃度は、特に制限されない。具体例としては、前記反応液におけるＤＮＡの濃度は、例えば、０．０１μＭ〜１μＭ、又は０．１μＭ〜０．５μＭとしうる。前記蛍光標識オリゴヌクレオチドの濃度は、例えば、前記ＤＮＡに対する添加割合を満たす範囲であり、例えば、０．００１μＭ〜１０μＭ、又は０．００１μＭ〜１μＭとしうる。
【００６７】
そして、得られた前記一本鎖ＤＮＡと前記蛍光標識オリゴヌクレオチドとのハイブリッドを徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光シグナルの変動を測定する。例えば、ＱＰｒｏｂｅを使用した場合、一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズした状態では、解離した状態に比べて蛍光強度が減少（または消光）する。したがって、例えば、蛍光が減少（または消光）しているハイブリッドを徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【００６８】
蛍光強度の変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されないが、例えば、開始温度が室温〜８５℃、又は２５℃〜７０℃としうる。終了温度は、例えば、４０℃〜１０５℃としうる。また、温度の上昇速度は、特に制限されないが、例えば、０．１℃／秒〜２０℃／秒、又は０．３℃／秒〜５℃／秒としうる。
【００６９】
次に、前記シグナルの変動を解析してＴｍ値として決定する。具体的には、得られた蛍光強度から各温度における微分値（−ｄ蛍光強度／ｄｔ）を算出し、最も低い値を示す温度をＴｍ値として決定できる。また、単位時間当たりの蛍光強度増加量（蛍光強度増加量／ｔ）が最も高い点をＴｍ値として決定することもできる。なお、標識化プローブとして、消光プローブではなく、ハイブリッド形成によりシグナル強度が増加するプローブを使用した場合には、反対に、蛍光強度の減少量を測定すればよい。
【００７０】
また、本発明においては、前述のように、ハイブリッドを加熱して、温度上昇に伴う蛍光シグナル変動（好ましくは蛍光強度の増加）を測定するが、この方法に代えて、例えば、ハイブリッド形成時におけるシグナル変動の測定を行ってもよい。すなわち、前記プローブを添加した試料の温度を降下させてハイブリッドを形成する際の前記温度降下に伴う蛍光シグナル変動を測定してもよい。
【００７１】
具体例として、標的配列にハイブリダイズしていないときの蛍光強度に比べて、標的配列にハイブリダイズしているときの蛍光強度が減少（消光）する蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブ（例えば、ＱＰｒｏｂｅ）を使用した場合、前記プローブを試料に添加した際には、前記プローブは解離状態にあるため蛍光強度が大きいが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、前記蛍光が減少（または消光）する。したがって、例えば、前記加熱した試料の温度を徐々に降下して、温度下降に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。
他方、ハイブリッド形成によりシグナルが増加する標識化プローブを使用した場合、前記プローブを試料に添加した際には、前記プローブは解離状態にあるため蛍光強度が小さい（または消光）が、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光強度が増加するようになる。したがって、例えば、前記試料の温度を徐々に降下して、温度下降に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【００７２】
なお、本発明の多型検出方法においては、ＭＤＲ１遺伝子のエクソン１２の１２３６番目の塩基（配列番号１に示す塩基配列における４０１番目の塩基）の変異型に加えて、ＭＤＲ１遺伝子のエクソン２６の３４３５番目の塩基（配列番号１５に示す塩基配列における２５６番目の塩基）の変異型及びＭＤＲ１遺伝子のエクソン２１の２６７７番目塩基（配列番号１６に示す塩基配列における３００番目の塩基）の変異型の少なくとも一方の変異型を検出することを含む。
【００７３】
これにより、配列番号１に示す塩基配列における４０１番目の塩基の変異型に加えて、配列番号１５に示す塩基配列における２５６番目の塩基及び配列番号１６に示す塩基配列における３００番目の塩基の変異型の少なくとも一方の変異型をさらに検出することができる。
【００７４】
検出のための具体的な手段は特に限定されるものではないが、例えば、本発明の配列番号１に示す塩基配列における４０１番目の塩基の多型を検出するプローブに加えて、配列番号１５に示す塩基配列における２５６番目の塩基に対応する多型を検出するプローブ及び配列番号１６に示す塩基配列における３００番目の塩基に対応する多型を検出するプローブの少なくとも一方のプローブを併用することなどが挙げられる。
【００７５】
前記配列番号１５に示す塩基配列における２５６番目の塩基に対応する多型を検出するプローブとしては、特に限定はされないが、例えば特開２００５−２８７３３５号公報に記載のプローブに記載のプローブや、配列番号９に示す塩基配列からなるプローブ等が挙げられる。
【００７６】
前記配列番号１６に示す塩基配列における３００番目の塩基に対応する多型を検出するプローブとしては、特に制限はされないが、例えば、配列番号１０に示す塩基配列からなるプローブ等が挙げられる。
【００７７】
また、本発明の多型検出方法においては、配列番号１に示す塩基配列における４０１番目の塩基の多型に加えて、同一の系で、配列番号１５に示す塩基配列における２５６番目の塩基の多型、及び配列番号１６に示す塩基配列における３００番目の塩基の多型の少なくとも一方の多型を検出することを含む。
【００７８】
これにより、配列番号１に示す塩基配列における４０１番目の塩基の多型に加えて、配列番号１５に示す塩基配列における２５６番目の塩基及び配列番号１６に示す塩基配列における３００番目の塩基の多型の少なくとも一方の多型を同一の系で、検出することができ、利便性の観点より好ましい。
【００７９】
異なるエクソンに存在する複数の多型を、同一の系で検出する方法としては、特に制限されるものではない。例えば、各多型を検出できる各プローブを予め混合し、試料に添加してもよいし、一本鎖核酸を含む試料に各多型を検出できる各プローブを連続的に添加してもよい。
ここで、「系」とは、蛍光標識オリゴヌクレオチド及び一本鎖核酸がハイブリダイズしたハイブリッドを含む試料で形成される１個の独立した反応系を意味する。
【００８０】
本発明の多型検出方法においては、同一の系において、配列番号１に示す塩基配列における４０１番目の塩基に対応する多型と、配列番号１５に示す塩基配列における２５６番目の塩基に対応する多型と、配列番号１６に示す塩基配列における３００番目の塩基に対応する多型とを検出することを含むことができる。
【００８１】
これにより３種の遺伝子多型を１つの系で簡便に検出できるだけではなく、これら３種の多型に関連する後述の薬剤に対する耐性及び有効性をより正確に予測することができる。
【００８２】
検出のための具体的な手段は特に限定されるものではないが、例えば、本発明の配列番号１に示す塩基配列における４０１番目の塩基の多型を検出するプローブに加えて、配列番号１５に示す塩基配列における２５６番目の塩基に対応する多型を検出するプローブ及び配列番号１６に示す塩基配列における３００番目の塩基に対応する多型を検出するプローブの３種のプローブを併用することなどが挙げられる。
なお、各プローブの好ましい態様や配列については、上述の各プローブに関する説明を適用することができる。
【００８３】
＜薬効判定方法＞
本発明の薬効判定方法は、上述した多型検出方法によりＭＤＲ１遺伝子の多型を検出すること、及び前記検出結果に基づいて薬剤に対する耐性又は薬剤の薬効を判定することを含む。
上述した多型検出方法では、本発明における多型検出用プローブを用いて、感度よく且つ簡便にＭＤＲ１遺伝子の多型を検出するので、ＭＤＲ１遺伝子におけるこの多型に基づいて薬剤の判定を感度よく且つ簡便に行うことができる。
【００８４】
また、多型の有無に基づいて薬剤に対する耐性や薬剤の薬効を判定することができる。そして、本発明の薬効判定方法は、変異型の有無に基づいて、薬剤の投与量の増加、他の治療薬への変更等への切り替え等の疾病の治療方針を決定するのに有用である。
また、判定対象となる薬剤としては、具体的には、抗がん剤、高血圧治療薬、免疫抑制剤、中枢作用薬等が挙げられ、特に抗がん剤が挙げられる。
【００８５】
＜多型検出用試薬キット＞
本発明の多型検出用試薬キットは上述した多型検出用プローブを含む。
この多型検出用試薬キットには、上述の多型検出用プローブの少なくとも１種を含むので、例えばＭＤＲ１遺伝子の多型の検出をより簡便に行うことができるなどの傾向がある。
【００８６】
多型検出用試薬キットは、上述のプローブがハイブリダイズする領域を含む塩基配列を増幅するためのプライマーをさらに含むことができる。
これにより、本発明における多型検出用試薬キットは、精度よくＭＤＲ１遺伝子の多型の検出を行うことができる。
多型検出用試薬キットに含まれ得るプローブ及びプライマーについては、前述した事項をそのまま適用することができる。
【００８７】
また、本発明における多型検出用試薬キットは、好ましくは、ＭＤＲ１遺伝子の多型検出用プローブに加えて、上述した配列番号１５に示す塩基配列における２５６番目の塩基に対応する多型を検出するプローブ及び配列番号１６に示す塩基配列における３００番目の塩基に対応する多型を検出するプローブからなる群より選択される少なくとも１種のプローブをさらに含むことができる。
本発明における多型検出用試薬キットが、ＭＤＲ１遺伝子の多型検出用プローブに加えて、さらに上述した別のプローブを含むことにより、複数のエクソンに存在する複数の多型を簡便に検出することができる。
【００８８】
多型検出用プローブとして２種以上の蛍光標識オリゴヌクレオチドを含む場合、それぞれの蛍光標識オリゴヌクレオチドは混合された状態で含まれていても、別個に含まれていてもよい。
２種以上の前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは発光波長が互いに異なる蛍光色素で標識化されていてもよい。
このように蛍光色素の種類を変えることで、同じ反応系であっても、それぞれの蛍光標識オリゴヌクレオチドについての検出を同時に行うことも可能になる。
【００８９】
また、本発明における検出用試薬キットは、前記プローブ及び前記プライマーの他に、本発明の検出方法における核酸増幅を行うのに必要とされる試薬類をさらに含んでいてもよい。また、プローブ、プライマー及びその他の試薬類は、別個に収容されていてもよいし、それらの一部が混合物とされていてもよい。
なお、「別個に収容」とは、各試薬が非接触状態を維持できるように区分けされたものであればよく、必ずしも独立して取り扱い可能な個別の容器に収容される必要はない。
多型部位を含む配列（プローブがハイブリダイズする領域）を増幅するためのプライマーセットを含むことで、例えば、より高感度に多型を検出することができる。
【００９０】
さらに本発明の多型検出用試薬キットは、前記多型検出用プローブを使用して、検出対象である核酸を含む試料について微分融解曲線を作成し、そのＴｍ値解析を行って、ＭＤＲ１遺伝子における多型を検出することが記載された取扱い説明書、又は検出用試薬キットに含まれる若しくは追加的に含むことが可能な各種の試薬について記載された使用説明書を含むことができる。
【実施例】
【００９１】
以下、本発明を実施例にて詳細に説明する。しかしながら、本発明はそれらに何ら限定されるものではない。
【００９２】
［実施例１］
全自動ＳＮＰｓ検査装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ（商標）、アークレイ社製）と、下記表３に記載した処方の検査用試薬を用いてＴｍ解析を行い、蛍光標識オリゴヌクレオチド（配列番号２）のＭＤＲ１（１２３６）プローブの性能を確認した。なお、鋳型としては、配列番号１８及び配列番号１９の人工オリゴ配列を使用した。
【００９３】
【表３】
【００９４】
上記表３で使用したプローブ及び鋳型の詳細を以下に示す。なお、プローブ中の３’末端の括弧内は蛍光色素の種類を示す。表４に示す塩基配列中、大文字は、多型の位置を示す。以下同様である。
【００９５】
【表４】
【００９６】
【表５】
【００９７】
Ｔｍ解析は、９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理し、続けて温度の上昇速度１℃／３秒で、４０℃〜７５℃まで温度を上昇させ、その間の経時的な蛍光強度の変化を測定した。なお、励起波長を５２０ｎｍ〜５５５ｎｍとし、検出波長を５８５ｎｍ〜７００ｎｍとして蛍光標識プローブに由来する蛍光強度の変化をそれぞれ測定した。
【００９８】
Ｔｍ解析によって、プローブの蛍光値の変化量を示す図２を得た。図中、縦軸は単位時間当たりの蛍光強度の変化量(ｄ蛍光強度増加量/ｔ)を表し、横軸は温度（℃）をそれぞれ表す。図中、菱形で表すパターンは、鋳型として、配列番号１に示す塩基配列において４０１番目の塩基（Ｙ）がＣである、配列番号１９に示す人工オリゴ配列を用いた場合の結果を示す。図中、四角で表すパターンは、鋳型として、配列番号１に示す塩基配列において４０１番目の塩基（Ｙ）がＴである、配列番号１８に示す人工オリゴ配列を用いた場合の結果を示す。図中、三角で表すパターンは、鋳型として、配列番号１８に示す人工オリゴ配列と、配列番号２０に示す人工オリゴ配列とを、１：１混合して用いた場合の結果を示す。
【００９９】
図２の結果より、配列番号１に示す塩基配列において４０１番目の塩基（Ｙ）がＣである場合と、Ｔである場合とが混在しても、本発明に係る蛍光標識オリゴヌクレオチドをプローブとして用いることにより、配列番号１に示す塩基配列において４０１番目の塩基の多型を検出できることが明らかとなった。また、鋳型として、配列番号１９に示す人工オリゴ配列を用いた場合には、Ｔｍ値が６３℃であり、鋳型として、配列番号１８に示す人工オリゴ配列を用いた場合には、Ｔｍ値が５６℃であった。
【０１００】
［実施例２］
全自動ＳＮＰｓ検査装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ（商標）、アークレイ社製）と、下記表６又は表７に記載した処方の反応液を用いて、ＰＣＲ及びＴｍ解析を行った。
【０１０１】
【表６】
【０１０２】
【表７】
【０１０３】
ＰＣＲは、９５℃で６０秒処理した後、９５℃で１秒及び５７℃で３０秒を１サイクルとして、５０サイクル繰り返した。
Ｔｍ解析は、ＰＣＲの後、９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理し、続けて温度の上昇速度１℃／３秒で、４０℃〜７５℃まで温度を上昇させ、その間の経時的な蛍光強度の変化を測定した。
【０１０４】
多型検出用プローブには、配列番号２で示される配列のうち３’末端が蛍光色素（ＴＡＭＲＡ）で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド（ＭＤＲ１（１２３６）ｐｒｏｂｅ）、配列番号９で示される配列のうち５’末端が蛍光色素（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ）で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド（ＭＤＲ１ ｅｘｏｎ２６ ｐｒｏｂｅ）及び配列番号１０で示される配列のうち５’末端が蛍光色素（ＢｏＤＩＰＹ ＦＬ）で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド（ＭＤＲ１ ｅｘｏｎ２１ ｐｒｏｂｅ２）を用いた。
ＭＤＲ１ ｅｘｏｎ２６ ｐｒｏｂｅ及びＭＤＲ１ ｅｘｏｎ２１ ｐｒｏｂｅ２について、詳細を以下に示す。
【０１０５】
【表８】
【０１０６】
なお、蛍光色素Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅの励起波長は３６５ｎｍ〜４１５ｎｍであり、検出波長は４４５ｎｍ〜４８０ｎｍである。蛍光色素ＢＯＤＩＰＹ ＦＬの励起波長は４２０ｎｍ〜４８５ｎｍであり、検出波長は５２０〜５５５ｎｍである。蛍光色素ＴＡＭＲＡの励起波長は５２０ｎｍ〜５５５ｎｍであり、検出波長は５８５ｎｍ〜７００ｎｍである(以下、同様)。それぞれの波長により、蛍光標識プローブに由来する蛍光強度の変化をそれぞれ測定した。
【０１０７】
使用したプライマーのうち、配列番号７で示されるＭＤＲ１(１２３６)Ｆ及び配列番号８で示されるＭＤＲ１(１２３６)Ｒ以外のプライマーについて、詳細を以下に示す。
【０１０８】
【表９】
【０１０９】
鋳型としては、全血と、全血から常法に従い精製した精製ヒトゲノムとを、それぞれ用いた。
全血は、以下のように調製した。
全血１０μｌを７０μｌの希釈液１に加え、よく混合した後、この混合液１０μｌを７０μｌの希釈液２に加える。この混合液１７μｌを９５℃１０分で加熱すると４μｌの前処理済全血が得られる。これを１ｔｅｓｔあたりの鋳型として使用した。
【０１１０】
【表１０】
【０１１１】
Ｔｍ解析によって、プローブの蛍光値の変化量を示す図３を得た。
図３の（Ａ）〜（Ｃ）は試料として精製ヒトゲノムを用いた場合の結果を示す。
図３の（Ｄ）〜（Ｆ）は試料として全血を用いた場合の結果を示す。
また、図３（Ａ）及び（Ｄ）は配列番号１に示す塩基配列における４０１番目の塩基に対応する多型の有無を示し、図３（Ｂ）及び（Ｅ）は配列番号１５に示す塩基配列における２５６番目の塩基に対応する多型の有無を示し、及び図３（Ｃ）及び（Ｆ）は配列番号１６に示す塩基配列における３００番目の塩基に対応する多型の有無を示す。
図中、縦軸は単位時間当たりの蛍光強度の変化量(ｄ蛍光強度増加量/ｔ)を表し、横軸は温度（℃）をそれぞれ表す。
【０１１２】
その結果、本発明に係る蛍光標識オリゴヌクレオチドをプローブとして用いることにより、配列番号１に示す塩基配列において４０１番目の塩基の多型を検出できると同時に、同一の系において、簡便に、配列番号１５に示す塩基配列における２５６番目の塩基に対応する多型の有無、及び配列番号１６に示す塩基配列における３００番目の塩基に対応する多型の有無を検出できることが明らかとなった。
【０１１３】
［比較例１］
全自動ＳＮＰｓ検査装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ（商標）、アークレイ社製）と、下記表１１に記載した処方の検査用試薬を用いてＴｍ解析を行った。プローブとして、配列番号１７に示す蛍光標識オリゴヌクレオチドを用い、鋳型として、配列番号２０及び配列番号２１の人工オリゴ配列を使用した。
【０１１４】
【表１１】
【０１１５】
なお、上記表１１で使用したプローブ及び鋳型の詳細を以下に示す。プローブ中の３’末端の括弧内は蛍光色素の種類を示す。
【０１１６】
【表１２】
【０１１７】
【表１３】
【０１１８】
Ｔｍ解析は、９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理し、続けて温度の上昇速度１℃／３秒で、４０℃〜７５℃まで温度を上昇させ、その間の経時的な蛍光強度の変化を測定した。蛍光色素としてＴＡＭＲＡを用いた。
【０１１９】
Ｔｍ解析によって、プローブの蛍光値の変化量を示す図４を得た。図中、縦軸は単位時間当たりの蛍光強度の変化量(ｄ蛍光強度増加量/ｔ)を表し、横軸は温度（℃）をそれぞれ表す。図中、菱形で表すパターンは、鋳型として、配列番号１に示す塩基配列において４０１番目の塩基（Ｙ）がＣである、配列番号２１に示す人工オリゴ配列を用いた場合の結果を示す。図中、四角で表すパターンは、鋳型として、配列番号１に示す塩基配列において４０１番目の塩基（Ｙ）がＴである、配列番号２０に示す人工オリゴ配列を用いた場合の結果を示す。図中、三角で表すパターンは、鋳型として、配列番号２０に示す人工オリゴ配列と、配列願号２２に示す人工オリゴ配列とを、１：１混合して用いた場合の結果を示す。
【０１２０】
図４の結果より、配列番号１に示す塩基配列において４０１番目の塩基（Ｙ）がＣである場合と、Ｔである場合とが混在した場合には、検出ピークが１つしか得られず、多型を検出することはできなかった。
なお、比較例１で用いた配列番号１７に示す蛍光標識オリゴヌクレオチドは、数多く存在する検出不可能なプローブの代表例を示したものにすぎない。
【０１２１】
以上の通りであるので、本発明によれば、高い感度で、簡便にＭＤＲ１遺伝子における多型を検出することができることが明らかになった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記Ｐ１及びＰ１’からなる群より選択される一種の蛍光標識オリゴヌクレオチドであるＭＤＲ１遺伝子の多型を検出するための多型検出用プローブ；
（Ｐ１）配列番号１に示す塩基配列において、３９５番目〜４０１番目の塩基を含む塩基長７〜３８の塩基配列に相補的な配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、３９５番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、及び
（Ｐ１’）配列番号１に示す塩基配列において、３９５番目〜４０１番目の塩基を含む塩基長７〜３８の塩基配列に相補的な配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、３９５番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
下記Ｐ１−１及びＰ１’−１からなる群より選択される少なくとも一種の蛍光標識オリゴヌクレオチドである請求項１に記載の多型検出用プローブ；
（Ｐ１−１）配列番号１に示す塩基配列において、３９５番目〜４０１番目の塩基を含む塩基長７〜３８の塩基配列に相補的な配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、３９５番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号１における４０１番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド、及び
（Ｐ１’−１）配列番号１に示す塩基配列において、３９５番目〜４０１番目の塩基を含む塩基長７〜３８の塩基配列に相補的な配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、３９５番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号１における４０１番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
前記Ｐ１又はＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドが、蛍光色素で標識された３９５番目の塩基に対応する塩基を３’末端から数えて１番目〜３番目の位置のいずれかに有する請求項１又は請求項２に記載の多型検出用プローブ。
【請求項４】
前記Ｐ１又はＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドが、蛍光色素で標識された３９５番目の塩基に対応する塩基を３’末端に有する請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の多型検出用プローブ。
【請求項５】
前記Ｐ１又はＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドが、標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、且つ標的配列にハイブリダイズしたときの蛍光強度が、ハイブリダイズしないときの蛍光強度に比べて、減少するか又は増加する、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の多型検出用プローブ。
【請求項６】
前記Ｐ１又はＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドが、標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、標的配列にハイブリダイズしたときの蛍光強度が、ハイブリダイズしないときの蛍光強度に比べて、減少する請求項５に記載の多型検出用プローブ。
【請求項７】
前記Ｐ１又はＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基長が７〜２８である請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の多型検出用プローブ。
【請求項８】
前記Ｐ１又はＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基長が７〜１８である請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載の多型検出用プローブ。
【請求項９】
融解曲線分析用のプローブである請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載の多型検出用プローブ。
【請求項１０】
請求項１〜請求項９のいずれか１項に記載のプローブを用いることによりＭＤＲ１遺伝子の多型を検出する多型検出方法。
【請求項１１】
（Ｉ）請求項１〜請求項９のいずれか１項に記載のプローブ及び試料中の一本鎖核酸を接触させて、前記蛍光標識オリゴヌクレオチド及び前記一本鎖核酸をハイブリダイズさせてハイブリッドを得ることと、
（ＩＩ）前記ハイブリッドを含む試料の温度を変化させることにより、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づく蛍光シグナルの変動を測定することと、
（ＩＩＩ）前記蛍光シグナルの変動に基づいてハイブリッドの解離温度であるＴｍ値を測定することと、
（ＩＶ）前記Ｔｍ値に基づいて、前記試料中の一本鎖核酸における、ＭＤＲ１遺伝子の多型の存在を検出することと、
を含む、請求項１０に記載の多型検出方法。
【請求項１２】
さらに、前記（Ｉ）のハイブリッドを得る前又は前記（Ｉ）のハイブリッドを得ることと同時に、核酸を増幅することを含む請求項１１に記載の多型検出方法。
【請求項１３】
さらに、配列番号１５に示す塩基配列における２５６番目の塩基に対応する多型、及び配列番号１６に示す塩基配列における３００番目の塩基に対応する多型の少なくとも一方の多型を同一の系で検出することを含む請求項１０〜請求項１２のいずれか１項に記載の多型検出方法。
【請求項１４】
配列番号１に示す塩基配列における４０１番目の塩基に対応する多型と、配列番号１５に示す塩基配列における２５６番目の塩基に対応する多型と、配列番号１６に示す塩基配列における３００番目の塩基に対応する多型とを同一の系で検出することを含む、請求項１０〜請求項１３のいずれか１項に記載の多型検出方法。
【請求項１５】
請求項１０〜請求項１４のいずれか１項に記載の多型検出方法により、ＭＤＲ１遺伝子における多型を検出すること、及び検出された多型の有無に基づいて薬剤に対する耐性又は薬剤の薬効を判定することを含む薬剤の薬効判定方法。
【請求項１６】
請求項１〜請求項９のいずれか１項に記載のプローブを含む、ＭＤＲ１遺伝子における多型を検出する多型検出用試薬キット。
【請求項１７】
さらに、前記プローブがハイブリダイズする領域を含む塩基配列を増幅するためのプライマーを含む請求項１６に記載の多型検出用試薬キット。
【請求項１８】
さらに、配列番号１に示す塩基配列における２５６番目の塩基に対応する多型を検出するための多型検出用プローブと、配列番号１６に示す塩基配列における３００番目の塩基に対応する多型を検出するための多型検出用プローブとを含む請求項１６又は請求項１７に記載の多型検出用試薬キット。
【請求項１】
下記Ｐ１及びＰ１’からなる群より選択される一種の蛍光標識オリゴヌクレオチドであるＭＤＲ１遺伝子の多型を検出するための多型検出用プローブ；
（Ｐ１）配列番号１に示す塩基配列において、３９５番目〜４０１番目の塩基を含む塩基長７〜３８の塩基配列に相補的な配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、３９５番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、及び
（Ｐ１’）配列番号１に示す塩基配列において、３９５番目〜４０１番目の塩基を含む塩基長７〜３８の塩基配列に相補的な配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、３９５番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
下記Ｐ１−１及びＰ１’−１からなる群より選択される少なくとも一種の蛍光標識オリゴヌクレオチドである請求項１に記載の多型検出用プローブ；
（Ｐ１−１）配列番号１に示す塩基配列において、３９５番目〜４０１番目の塩基を含む塩基長７〜３８の塩基配列に相補的な配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、３９５番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号１における４０１番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド、及び
（Ｐ１’−１）配列番号１に示す塩基配列において、３９５番目〜４０１番目の塩基を含む塩基長７〜３８の塩基配列に相補的な配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、３９５番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号１における４０１番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
前記Ｐ１又はＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドが、蛍光色素で標識された３９５番目の塩基に対応する塩基を３’末端から数えて１番目〜３番目の位置のいずれかに有する請求項１又は請求項２に記載の多型検出用プローブ。
【請求項４】
前記Ｐ１又はＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドが、蛍光色素で標識された３９５番目の塩基に対応する塩基を３’末端に有する請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の多型検出用プローブ。
【請求項５】
前記Ｐ１又はＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドが、標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、且つ標的配列にハイブリダイズしたときの蛍光強度が、ハイブリダイズしないときの蛍光強度に比べて、減少するか又は増加する、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の多型検出用プローブ。
【請求項６】
前記Ｐ１又はＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドが、標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、標的配列にハイブリダイズしたときの蛍光強度が、ハイブリダイズしないときの蛍光強度に比べて、減少する請求項５に記載の多型検出用プローブ。
【請求項７】
前記Ｐ１又はＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基長が７〜２８である請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の多型検出用プローブ。
【請求項８】
前記Ｐ１又はＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基長が７〜１８である請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載の多型検出用プローブ。
【請求項９】
融解曲線分析用のプローブである請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載の多型検出用プローブ。
【請求項１０】
請求項１〜請求項９のいずれか１項に記載のプローブを用いることによりＭＤＲ１遺伝子の多型を検出する多型検出方法。
【請求項１１】
（Ｉ）請求項１〜請求項９のいずれか１項に記載のプローブ及び試料中の一本鎖核酸を接触させて、前記蛍光標識オリゴヌクレオチド及び前記一本鎖核酸をハイブリダイズさせてハイブリッドを得ることと、
（ＩＩ）前記ハイブリッドを含む試料の温度を変化させることにより、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づく蛍光シグナルの変動を測定することと、
（ＩＩＩ）前記蛍光シグナルの変動に基づいてハイブリッドの解離温度であるＴｍ値を測定することと、
（ＩＶ）前記Ｔｍ値に基づいて、前記試料中の一本鎖核酸における、ＭＤＲ１遺伝子の多型の存在を検出することと、
を含む、請求項１０に記載の多型検出方法。
【請求項１２】
さらに、前記（Ｉ）のハイブリッドを得る前又は前記（Ｉ）のハイブリッドを得ることと同時に、核酸を増幅することを含む請求項１１に記載の多型検出方法。
【請求項１３】
さらに、配列番号１５に示す塩基配列における２５６番目の塩基に対応する多型、及び配列番号１６に示す塩基配列における３００番目の塩基に対応する多型の少なくとも一方の多型を同一の系で検出することを含む請求項１０〜請求項１２のいずれか１項に記載の多型検出方法。
【請求項１４】
配列番号１に示す塩基配列における４０１番目の塩基に対応する多型と、配列番号１５に示す塩基配列における２５６番目の塩基に対応する多型と、配列番号１６に示す塩基配列における３００番目の塩基に対応する多型とを同一の系で検出することを含む、請求項１０〜請求項１３のいずれか１項に記載の多型検出方法。
【請求項１５】
請求項１０〜請求項１４のいずれか１項に記載の多型検出方法により、ＭＤＲ１遺伝子における多型を検出すること、及び検出された多型の有無に基づいて薬剤に対する耐性又は薬剤の薬効を判定することを含む薬剤の薬効判定方法。
【請求項１６】
請求項１〜請求項９のいずれか１項に記載のプローブを含む、ＭＤＲ１遺伝子における多型を検出する多型検出用試薬キット。
【請求項１７】
さらに、前記プローブがハイブリダイズする領域を含む塩基配列を増幅するためのプライマーを含む請求項１６に記載の多型検出用試薬キット。
【請求項１８】
さらに、配列番号１に示す塩基配列における２５６番目の塩基に対応する多型を検出するための多型検出用プローブと、配列番号１６に示す塩基配列における３００番目の塩基に対応する多型を検出するための多型検出用プローブとを含む請求項１６又は請求項１７に記載の多型検出用試薬キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１３−９０６２２（Ｐ２０１３−９０６２２Ａ）
【公開日】平成２５年５月１６日（２０１３．５．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１９０１８６（Ｐ２０１２−１９０１８６）
【出願日】平成２４年８月３０日（２０１２．８．３０）
【出願人】（０００１４１８９７）アークレイ株式会社 (288)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年５月１６日（２０１３．５．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年８月３０日（２０１２．８．３０）
【出願人】（０００１４１８９７）アークレイ株式会社 (288)
【Ｆターム（参考）】
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