多孔質吸着膜
【課題】電気伝導度の高い溶液であっても、目的タンパク質と、夾雑物と、を含む混合液から、夾雑物を有効かつ迅速に除去し、目的タンパク質を効率的に精製可能な、混合リガンドを有する多孔質吸着膜を提供する。
【解決手段】細孔を有する基材と、リガンドと、基材及びリガンド間を結合しているリンカーと、を備える多孔質吸着膜であって、リガンドは、（ａ）アニオン交換能を有す基を主鎖に持つモノマー由来ユニットと、（ｂ）疎水性相互作用を有す基を主鎖に持つモノマー由来ユニットと、を含み、（ａ）のユニットと、（ｂ）のユニットと、は、共重合体を形成している、多孔質吸着膜を提供する。
【解決手段】細孔を有する基材と、リガンドと、基材及びリガンド間を結合しているリンカーと、を備える多孔質吸着膜であって、リガンドは、（ａ）アニオン交換能を有す基を主鎖に持つモノマー由来ユニットと、（ｂ）疎水性相互作用を有す基を主鎖に持つモノマー由来ユニットと、を含み、（ａ）のユニットと、（ｂ）のユニットと、は、共重合体を形成している、多孔質吸着膜を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多孔質吸着膜、及び当該多孔質吸着膜を用いたタンパク質の精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、バイオテクノロジー産業において、タンパク質の大量精製が重要な課題となっている。特に、医薬の分野において、血液製剤、抗体医薬等の需要が急速に拡大しており、効率的に大量のタンパク質を生産及び精製可能な技術の確立が強く望まれている。
【０００３】
一般的に、タンパク質は、動物由来の細胞株を用いる細胞培養によって産生される。細胞培養液からタンパク質を精製する通常の操作においては、最初に、細胞培養液を遠心分離し、濁質成分を沈降除去する。次いで、遠心分離で除去しきれない約１μｍ以下の細胞デブリを、精密ろ過膜を用いるサイズろ過により除去する。さらに無菌化するために、最大細孔径が０．２２μｍ以下のろ過膜を用いて無菌化ろ過を施して、目的タンパク質の清澄な溶液を得る（ハーベスト工程）。続いて、プロテインＡに代表されるアフィニティークロマトグラフィーを初めとする、複数のクロマトグラフィー技術の組み合わせによる精製プロセスを用いて、Ｈｏｓｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＨＣＰ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、目的タンパク質の凝集物、エンドトキシン、ウイルス、及びカラムから脱離したプロテインＡなどの夾雑物を清澄な溶液から除去し、目的タンパク質を分離・精製する（ダウンストリーム工程）。
【０００４】
以上説明した従来のタンパク質の精製方法の対象となる細胞培養液中の目的タンパク質の濃度は、現状では通常１ｇ／Ｌ程度である。また、夾雑物の濃度も、目的タンパク質の濃度とほぼ同程度であると考えられる。このような濃度範囲では、ハーベスト工程及びダウンストリーム工程を含む従来のタンパク質の精製方法は、有効である。
【０００５】
しかしながら、抗体医薬の需要が急速に拡大し、抗体医薬に用いられるタンパク質の大量生産が指向されたため、近年では細胞培養液中のタンパク質濃度を高める細胞培養技術が急速に発達している。そのため、近年では細胞培養液中の目的タンパク質の濃度が１０ｇ／Ｌあるいはそれ以上にまで到達しようとしている。しかし同時に、細胞培養液中の夾雑物の濃度も同様に増加しており、従来のタンパク質の精製方法では、目的タンパク質の精製が困難になりつつある。
【０００６】
近年では効率的に目的タンパク質を分離精製するために、複数のリガンドを有する混合モードの樹脂を充填したクロマトグラフィーカラムを用いることが、広く検討されている。このようなクロマトグラフィーカラムに用いられるリガンドとしては、ミックスモードリガンド又はマルチモーダルリガンドと呼ばれるリガンドが用いられている。
【０００７】
このようなモードのリガンドを用いるクロマトグラフィーでは、リガンドに対する目的タンパク質と、夾雑物と、の電荷相互作用及び疎水性相互作用等の複数の相互作用の差を利用するため、より高精度な分離が可能になるだけでなく、複数の夾雑物を同時にかつ有効に除去できることが期待されている。
【０００８】
例えば、特許文献１には、イオン交換基及び疎水性基からなるマルチモーダルリガンドのクロマトグラフィーを用いて、生理的塩濃度のような比較的高いイオン強度において、タンパク質の分離精製をおこなう方法が記載されている。
【０００９】
また、特許文献２及び３では、疎水性単量体と親水性単量体を共重合し、さらに親水性単量体にイオン交換性基を導入してなる、イオン交換による捕捉力と、疎水性相互作用による捕捉力と、を有するミックスリガンド樹脂からなる粒子のクロマトグラフィーを用いて、タンパク質を吸着、溶出することで、目的タンパク質を効率的に濃縮する方法が記載されている。
【００１０】
特許文献１乃至３に開示されているように、タンパクの分離精製に関して、ミックスリガンドを用いたクロマトグラフィー担体が開発されている背景には、タンパク質医薬品市場の拡大により、製薬メーカーが、精製のプロセスウィンドウを広げると共に、生産をより効率的に行うことを望む事が挙げられる。
【００１１】
さらに、効率的に大量のタンパク質を精製する方法として、多孔質膜を用いたイオン交換吸着膜の報告もなされている。ビーズを基礎とするクロマトグラフィーでは、吸着のために利用できる表面積の大部分がビーズに対して内部にある。したがって、物質移動速度が細孔拡散によって典型的に制御されるため、この分離方法は本質的に遅い。この拡散抵抗を最小にし、そしてそれに伴って結合能力を最大にするために、さらに小さな直径のビーズを使用することができる。しかし、小さな直径のビーズを使用すると、カラムの圧力降下の増大という犠牲を払うことになる。そのため、クロマトグラフィー分離の最適化は、効率、吸着容量、及びカラムの圧力降下との妥協を伴うことが多い。これに対して、膜を基礎とするクロマトグラフィーは、リガンドが対流性の膜孔に直接結合しており、それによって物質移行に及ぼす内部細孔拡散の影響が排除される。したがって、吸着膜媒体の物質移動速度は、標準的なビーズを基礎とするクロマトグラフィー媒体の物質移動速度よりも大きさが一桁大きいため、高効率分離と、高流量分離と、の両方を可能にすることができる。
【００１２】
例えば、特許文献４及び５には、多孔質膜にイオン交換基を導入して、タンパク質吸着能力を付与したタンパク質吸着膜が開示されている。
【００１３】
特許文献６及び７には、カチオン交換基及びアニオン交換基をポリエーテルスルホン多孔膜に導入したタンパク質吸着膜が開示されている。
【００１４】
また、特許文献８には、アニオン交換基を固定化したグラフト鎖を細孔表面に有するタンパク質吸着膜を用いて、タンパク質を精製する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】特表２００４−５１６９２８号公報
【特許文献２】特開２００１−３４３３７８号公報
【特許文献３】特開２０１０−１３７２０７号公報
【特許文献４】米国特許第５，５４７，５７５号明細書
【特許文献５】米国特許第５，７３９，３１６号明細書
【特許文献６】米国特許第６，７８３，９３７号明細書
【特許文献７】米国特許第６，７８０，３２７号明細書
【特許文献８】国際公開第２００９／０５４２２６号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
上述のとおり、目的タンパク質を効率よく分離精製する方法は、数多く提案、報告されている。
【００１７】
しかしながら、現実には全ての夾雑物を有効かつ迅速に除去して目的タンパク質を精製することは、現状でも困難であり、特にアフィニティークロマトグラフィー後の塩濃度の高い中間精製溶液において、微量に残存するＨＣＰ及び凝集体などを医薬品として要求されるレベルにまで除去し、高精度な目的タンパク質を回収することは、細胞培養液中の目的タンパク質濃度が大幅に向上しつつある状況において、さらに困難になることが懸念されている。
【００１８】
特許文献１に開示されたマルチモーダルのリガンドについては、クロマトグラフィーカラムに用いるビーズのみを対象としており、高流速で通液することが困難である。特許文献２及び３に開示された共重合高分子からなるミックスリガンド樹脂についても、クロマトグラフィーカラムに用いるビーズのみを対象としており、高流速で通液することが困難である。
【００１９】
また、前述のように、アフィニティークロマトグラフィー後の中間精製溶液には、通常、塩が含まれている。特許文献４−７に開示されたタンパク質吸着膜は、イオン交換基の吸着作用のみでのタンパク吸着能を有するため、一般的なイオン交換カラムと同様に、これらの吸着膜のタンパク質吸着量は、溶液中に０．１ｍｏｌ／Ｌ以上の塩が含まれていると、著しく減少する。したがって、特許文献４−７に開示されたタンパク質吸着膜を用いて、電気伝導度の高いアフィニティークロマトグラフィー工程あるいはカチオン交換クロマトグラフィー工程の溶液から、不純物タンパク質を除去することは現実的ではない。
【００２０】
特許文献８に開示されたタンパク質吸着膜は、グラフト鎖によってアニオン交換基を立体的に配置することにより、タンパク質との相互作用点を増やすことで、溶液中に０．１５ｍｏｌ／Ｌ程度の塩が含まれていても、タンパク吸着性を維持できることが示されている。しかし、イオン交換基の吸着作用のみでタンパク質を吸着していることから、塩が含まれていない溶液でのタンパク質吸着量に比べると、塩が含まれている溶液でのタンパク質吸着量は低下する。
【００２１】
さらに、全ての夾雑物を有効にかつ迅速に除去してタンパク質を精製することの困難さは、フロースルーモード及び結合モードの両方において、有効にタンパク質を分離精製するための有効な塩濃度、ｐＨ、溶液組成などの条件、すなわちプロセスウィンドウが狭く、安定で汎用的な精製条件を決定することが容易ではないことに基づいている。この状況は、より効率的にタンパク質を精製することを目的とした混合モードリガンドのクロマトグラフィーにおいても同様である。
【００２２】
かかる状況に鑑み、本発明は、タンパク質の分離精製の中でも、特に求められている塩濃度に対するプロセスウィンドウを広くすることを目的として、電気伝導度の高い溶液であっても、目的タンパク質と、夾雑物と、を含む混合液から、夾雑物を有効かつ迅速に除去し、目的タンパク質を効率的に精製可能な、混合リガンドを有する多孔質吸着膜を提供することを課題とする。さらに、本発明は、塩濃度に対するプロセスウィンドウが広く、タンパク質分離精製ステップの簡素化や、溶液処理の時間短縮を可能とする、多孔質吸着膜を用いたタンパク質の精製方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明者らは、課題を解決するために鋭意検討した結果、アニオン交換能を有す基を主鎖に持つモノマー由来ユニットと、疎水性相互作用を有す基を主鎖に持つモノマー由来ユニットとの共重合体を有するリガンドが、多孔質基材の細孔中に網状に分布された構造を有する多孔質吸着膜を用いることが、塩濃度に対するプロセスウィンドウを広くすることが可能であり、電気伝導度が高い溶液から、医薬品として使われるタンパク質を効率よく且つ迅速に精製することに対して有用であることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明の態様は以下の通りである。
【００２４】
［１］細孔を有する基材と、リガンドと、基材及びリガンド間を結合しているリンカーと、を備える多孔質吸着膜であって、
リガンドは、
（ａ）アニオン交換能を有す基を主鎖に持つモノマー由来ユニットと、
（ｂ）疎水性相互作用を有す基を主鎖に持つモノマー由来ユニット
を含み、（ａ）と、（ｂ）と、は、共重合体を形成している、多孔質吸着膜。
【００２５】
［２］アニオン交換能を有す基を主鎖に持つモノマーが、ジアミン化合物モノマーである、［１］に記載の多孔質吸着膜。
【００２６】
［３］アニオン交換能を有す基を主鎖に持つモノマーが、疎水性相互作用を有す基を主鎖に持つモノマー由来ユニットである、［１］又は［２］に記載の多孔質吸着膜。
【００２７】
［４］ジアミン化合物モノマーが下記構造式（１）の構造を有し、
構造式（１） ＮＨ2 − Ｒ1 − ＮＨ2
構造式（１）のＲ1が、炭素数２から６のアルキレン基からなる群より選ばれる少なくとも１種である、［１］乃至［３］のいずれかに記載の多孔質吸着膜。
【００２８】
［５］疎水性相互作用を有す基を主鎖に持つモノマーが、ジグリシジル化合物モノマーである、［１］乃至［４］のいずれかに記載の多孔質吸着膜。
【００２９】
［６］ジグリシジル化合物モノマーが、下記構造式（２）の構造を有し、
【化１】
構造式（２）のＲ2が、炭素数２から６のアルキレン基、炭素数２から６のアルキレン基エーテル、又は六員環からなる群より選ばれる少なくとも１種である、［１］乃至［５］のいずれかに記載の多孔質吸着膜。
【００３０】
［７］リンカーが、基材の表面に導入されたグラフト鎖である、［１］乃至［６］のいずれかに記載の多孔質吸着膜。
【００３１】
［８］グラフト鎖がメタクリル酸グリシジルの重合体である、［１］乃至［７］のいずれかに記載の多孔質吸着膜。
【００３２】
［９］多孔質吸着膜の基材の材料が、ポリオレフィン系重合体を含む、［１］乃至［８］のいずれかに記載の多孔質吸着膜。
【００３３】
［１０］多孔質吸着膜が中空糸多孔膜である、［１］乃至［９］のいずれかに記載の多孔質吸着膜。
【００３４】
［１１］多孔質吸着膜のタンパク質吸着容量をＣとするとき、
０．１５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌの水溶液のイオン強度と同一のイオン強度のタンパク質溶液をろ過した場合の吸着容量Ｃ0.15が、ＮａＣｌを含まない水溶液のイオン強度と同一のイオン強度のタンパク質溶液をろ過した場合の吸着容量Ｃ0に対して、少なくとも３５％を下回らない、［１］乃至［１０］のいずれかに記載の多孔質吸着膜。
【００３５】
［１２］目的とするタンパク質と、夾雑物と、を含む混合溶液から目的とするタンパク質を精製する方法であって、
［１］乃至［１１］のいずれかに記載の多孔質吸着膜を用いて混合溶液をろ過し、夾雑物を除去する、タンパク質の精製方法。
【発明の効果】
【００３６】
本発明の多孔質吸着膜を用いることにより、電気伝導度が高い溶液であっても、目的タンパク質と、夾雑物と、を含む混合液から、該溶液に含まれる夾雑物を除去し、目的タンパク質の精製を効率よく且つ迅速に行うことが可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
以下、本発明を実施するための形態（以下、「本実施の形態」という。）について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の本実施の形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。
【００３８】
本実施の形態に係る多孔質吸着膜は、細孔を有する基材と、リガンドと、基材及びリガンド間を結合しているリンカーと、を備える多孔質吸着膜であって、リガンドは、（ａ）アニオン交換能を有す基を主鎖に持つモノマー由来ユニットと、（ｂ）疎水性相互作用を有す基を主鎖に持つモノマー由来ユニットと、の共重合体を有している多孔質吸着膜である。（ａ）ユニットと、（ｂ）ユニットからなる共重合体を、リガンドとして有することで、吸着作用点を３次元的に立体配置可能であり、吸着物質との相互作用を強めることが可能となる。さらに、リガンドが、疎水性相互作用を有す基を主鎖に持つことで、溶液中に含まれる塩が増加しても、疎水性相互作用が有効に作用し、吸着タンパク質との相互作用が著しく低下することなく保たれ得る。
【００３９】
アニオン交換能を有す基としては、混合液中に含まれる目的タンパク質及び／又は夾雑物、特に、夾雑物として、不純物タンパク質、ＤＮＡ、ＨＣＰ、ウイルス及びエンドトキシンなどを吸着する能力のある官能基であれば、特に限定されないが、１級アミン、２級アミン、３級アミン、及び４級アミンなどが挙げられる。
【００４０】
疎水性相互作用を有す基としては、混合液中に溶存する目的タンパク質及び／又は夾雑物、特に、夾雑物として、目的タンパク質の二量体及び三量体などの凝集体、目的タンパク質の誤って折りたたまれた種、並びに脂質などを吸着する能力ある官能基であれば特に限定されないが、アルキレン基、アルキレン基エーテル、及び六員環などが挙げられる。
【００４１】
アニオン交換能を有す基を主鎖に持つモノマーとしては、ジアミン化合物モノマーを用いることができる。疎水性相互作用を有す基を主鎖に持つモノマーとしては、ジグリシジル化合物モノマーを用いることができる。この場合、リガンドは、ジアミン化合物モノマーと、ジグリシジル化合物モノマーと、を共重合させることによって得ることができる。共重合リガンドの形成方法は、特に限定されないが、例えば、ジアミン化合物モノマー溶液と、ジグリシジル化合物モノマー溶液と、を混合させることにより、共重合体を形成させることが可能である。
【００４２】
アニオン交換能を有するジアミン化合物モノマーとしては、エチレンジアミン、プロピレンジアミン、イソプロピレンジアミン、ブタンジアミン、ペンタンジアミン、及びヘキサンジアミンなどが挙げられる。
【００４３】
疎水性相互作用を有するジグリシジル化合物モノマーとしては、ジエチレングリコールジグリシジルエーテル、プロピレングリコールジグリシジルエーテル、ブタンジオールジグリシジルエーテル、ヘキサンジオールジグリシジルエーテル、及びシクロヘキサンジメタノールジグリシジルエーテルなどが挙げられる。
【００４４】
共重合リガンドを、多孔質基材膜に固定する方法としては特に限定されないが、基材が有する官能基に直接固定する方法や、基材に反応性を有する化合物をリンカーとして導入し、該リンカーを介して固定する方法などが挙げられる。これらの中でも、リガンドを３次元的に立体配置可能であり、これにより効率的に吸着物質を捕捉可能になることから、反応性を有する化合物として重合性モノマーを基材に導入して、基材にグラフト鎖を形成させ、該グラフト鎖を介して共重合リガンドを多孔質基材膜に固定する方法が好ましい。
【００４５】
多孔基材膜の表面及び細孔に、グラフト鎖を導入し、さらに該グラフト鎖に共重合リガンドを固定する方法としては、限定されるものではないが、例えば特開平２−１３２１３２号公報に開示される方法が挙げられる。
【００４６】
本実施の形態において、基材の重量に対する、共重合リガンドが固定される前の基材に導入されたグラフト鎖の重量の比（百分率）を、グラフト率という。
【００４７】
グラフト率は、１０％以上２５０％以下であることが好ましく、より好ましくは１０％以上１５０％以下であり、さらに好ましくは２０％以上９０％以下である。グラフト率を１０％以上とすることにより、タンパク質の吸着容量が著しく高くなり実用的である。また、グラフト率を２５０％以下とすることにより、実用的な強度が得られる。
【００４８】
通常、吸着したタンパク質を溶出する際に、塩溶液を多孔膜に通液するが、それにより膜体積は膨張する特性があり、グラフト率が高いほど膨張率が高い。塩溶液通液による膜体積の膨張率は、多孔膜とグラフト鎖の構造にもよるが、グラフト率６０％では約２％以下、９０％では約３％以下、１５０％では約５％以下である。通液により膨張するという観点から、多孔膜において、グラフト率を２５０％以下とするのが、実用上好適ある。
【００４９】
本実施の形態において、基材に導入されるグラフト鎖とは、導入反応後にジメチルホルムアミドなどの有機溶剤で洗浄しても、除去されない化学構造を有する。グラフト鎖としては、例えば、メタクリル酸グリシジル、酢酸ビニル及びヒドロキシプロピルアセテートの重合体が挙げられるが、共重合リガンドを導入しやすいことから、メタクリル酸グリシジル又は酢酸ビニルの重合体が好ましく、メタクリル酸グリシジルの重合体がより好ましい。
【００５０】
本実施の形態において、多孔質吸着膜の基材としては、特に限定されないが、機械的性質の保持のために、ポリオレフィン系重合体から構成されていることが好ましい。ポリオレフィン系重合体としては、例えば、エチレン、プロピレン、ブチレン及びフッ化ビニリデンなどのオレフィンの単独重合体、該オレフィンの２種以上の共重合体、又は１種もしくは２種以上のオレフィンと、パーハロゲン化オレフィンと、の共重合体などが挙げられる。パーハロゲン化オレフィンとしては、テトラフルオロエチレン及び／又はクロロトリフルオロエチレンなどが挙げられる。
【００５１】
これらの基材の中でも、機械的強度に特に優れ、かつタンパク質などの夾雑物の高い吸着容量が得られる素材である点で、ポリエチレン又はポリフッ化ビニリデンが好ましく、ポリエチレンがより好ましい。
【００５２】
ポリオレフィン系重合体を用いて多孔質膜を製造する方法は、当業者にとって公知のものであるが、例えば、特開平３−４２０２５号公報に開示される方法などが挙げられる。
【００５３】
多孔質吸着膜は、上記基材中に細孔を有する多孔質膜である。細孔径は、特に限定されないが、夾雑物である溶存したタンパク質などの吸着除去が有効になされ、かつ液中に含まれるサイズの大きな夾雑物である濁質成分が有効に除去される範囲であることが好ましい。
【００５４】
細孔径は、多孔質膜の形状を保持しかつ通液時の圧損が実用上問題のない程度であれば、特に限定されないが、０．０１μｍ〜５μｍであることが好ましく、より好ましくは０．０５μｍ〜３μｍであり、さらに好ましくは０．１μｍ〜１μｍである。多孔質吸着膜中の細孔の占める体積である空孔率も、多孔質膜の形状を保持しかつ通液時の圧損が実用上問題のない程度であれば、特に限定されないが、好ましくは５％〜９９％であり、より好ましくは１０％〜９５％であり、さらに好ましくは３０％〜９０％である。
【００５５】
細孔径及び空孔率の測定は、Ｍａｒｃｅｌ Ｍｕｌｄｅｒ著「膜技術」（株式会社アイピーシー）などに記載されているような、当業者にとって公知の方法により行うことができるが、測定方法としては、例えば、電子顕微鏡による観察、バブルポイント法、水銀圧入法、及び透過率法などが挙げられる。
【００５６】
多孔質吸着膜の形態は、多孔質体であれば特に限定されないが、平膜、不織布、中空糸膜、モノリス、キャピラリー、円板又は円筒状などが挙げられる。これらの形態の中でも、製造の容易さ、スケールアップ性、モジュール成型した際の膜のパッキング性などから、多孔質吸着膜は、中空糸多孔膜であることが好ましい。
【００５７】
本実施の形態において、中空糸多孔膜とは、中空部分を有する円筒状又は繊維状の多孔膜であり、中空糸の内層と外層が、貫通孔である細孔によって連続しており、その細孔によって内層から外層、あるいは外層から内層に、液体あるいは気体が透過する性質を有する多孔体を意味する。
【００５８】
中空糸の外径及び内径は、物理的に形状を保持することができ、かつモジュール成型可能であれば、特に限定されない。
【００５９】
本実施の形態の多孔質吸着膜において、タンパク質吸着容量をＣとするとき、０．１５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌの水溶液のイオン強度と同一のイオン強度のタンパク質溶液をろ過した場合の吸着容量Ｃ0.15が、ＮａＣｌを含まない水溶液のイオン強度と同一のイオン強度のタンパク質溶液をろ過した場合の吸着容量Ｃ0に対して、３５％以上であることが好ましく、４０％以上であることがより好ましい。
【００６０】
吸着容量Ｃ0.15を吸着容量Ｃ0に対して３５％以上とすることによって、塩濃度に対するプロセスウィンドウを広くすることが可能であり、本実施の形態に係る多孔質吸着膜を用いて、電気伝導度が高い溶液から、目的タンパク質を効率よく且つ迅速に精製することが可能となる。
【００６１】
本実施の形態の目的とするタンパク質の精製方法は、目的とするタンパク質と、夾雑物と、を含む混合溶液から目的とするタンパク質を精製する方法であって、本実施の形態に係る多孔質吸着膜を用いて混合溶液をろ過し、夾雑物を除去することを含む、タンパク質の精製方法である。
【００６２】
本実施の形態に係る多孔質吸着膜は、混合溶液中に含まれる１種類以上の夾雑物から、目的とするタンパク質を分離、精製する用途に用いることが有効である。
【００６３】
目的とするタンパク質を分離・精製する方法としては、混合溶液を本実施の形態に係る多孔質吸着膜を用いてろ過することにより、（ａ）夾雑物を多孔質吸着膜に吸着させ、精製された目的タンパク質を、非吸着の画分として回収するフロースルーモード、あるいは（ｂ）目的タンパク質を多孔質吸着膜に吸着した後、選択的に溶出回収する結合モード、の２種類の態様が例えば挙げられる。
【００６４】
本実施の形態に係る多孔質吸着膜にろ過させる混合溶液としては、アフィニティークロマトグラフィーカラムから溶出された、抗体を含有する溶出液が好適である。アフィニティークロマトグラフィーに用いられるカラムに充填する樹脂のリガンドは、通常プロテインＡのようなＦｃ結合タンパク質を含む。このようなアフィニティークロマトグラフィーの樹脂は市販されており、容易に入手することが可能である。溶出液中に含まれる、除去すべき夾雑物としては、ＨＣＰ、ＤＮＡ、ウイルス、エンドトキシン、遊離プロテインＡ、プロテインＡと抗体との間で形成された複合体、並びに抗体の凝集体などが含まれる。
【００６５】
なお、アフィニティークロマトグラフィー工程前の溶液を、本実施の形態に係る多孔質吸着膜を用いてろ過してもよい。
【００６６】
上述した（ａ）の方法のろ過形態であるフロースルーモードを実施する場合には、本実施の形態に係る多孔質吸着膜を用いて混合溶液をろ過し、素通りした画分を精製された抗体の溶液として回収する。この場合、抗体の大半は、吸着されることなく素通りするが、夾雑物は吸着により除去される。フロースルーを得るための条件は、精製すべき抗体の性質、例えば電荷及び電荷分布に依存するが、本実施の形態に係る多孔質吸着膜を用いることにより、プロセスウィンドウを広くとることができるため、例えば混合溶液の電気伝導度やｐＨの調節によって、当業者が容易に条件を設定することが可能である。
【００６７】
上述した（ｂ）の方法のろ過形態である結合モードを実施する場合にも、本実施の形態に係る多孔質吸着膜を用いて抗体を含む溶液をろ過する。この場合、抗体のみ、あるいは抗体と一部の夾雑物が、本実施の形態に係る多孔質吸着膜に吸着される。この場合も、所望の物質を結合させるための条件は、本実施の形態に係る多孔質吸着膜を用いることにより、プロセスウィンドウを広くとることができるため、例えば溶液の電気伝導度やｐＨなどの調節によって、当業者が容易に条件を設定することが可能である。
【００６８】
抗体のみを吸着した場合には、抗体を含む溶液を通液した後に、多孔質吸着膜から吸着物を除去しない緩衝液によって多孔質吸着膜を洗浄し、その後、吸着物に対する溶出緩衝液を多孔質吸着膜に通液することにより、精製された目的の抗体を多孔質吸着膜からの溶出画分として得る。
【００６９】
吸着物として、抗体と夾雑物を共に吸着した場合には、それらの溶出条件の違いを利用して、抗体のみを溶出した画分を得ることにより、精製された目的の抗体を得る。
【００７０】
本実施の形態に係る多孔質吸着膜は、アニオン交換能を有す基を主鎖に持つモノマー由来ユニットと、疎水性相互作用を有す基を主鎖に持つモノマー由来ユニットと、の共重合部分を有するリガンドが、多孔質基材の細孔中に網状に分布された構造を有する多孔質吸着膜であるため、塩濃度に対するプロセスウィンドウを広げることができ、電気伝導度が高い溶液から、目的タンパク質を効率よく精製することが可能である。また、樹脂を充填するカラムプロセスに比べて、高流速で溶液を通液できるため、精製に要する処理時間を大幅に短縮することが可能である。
【実施例】
【００７１】
以下、実施例及び比較例に基づいて本実施の形態をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は以下の実施例のみに限定されない。
【００７２】
（実施例１：エチレンジアミンと、ジエチレングリコールジグリシジルエーテルと、の共重合リガンドが固定された多孔質吸着膜）
【００７３】
（ｉ）多孔質中空糸へのグラフト鎖の導入
外径３．０ｍｍ、内径２．０ｍｍ、最大細孔径が０．３μｍのポリエチレン多孔質中空糸を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２００ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン多孔質中空糸をガラス反応管に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。ここに４０℃に調整したグリシジルメタクリレート（ＧＭＡ）３体積部、及びメタノール９７体積部よりなる反応液を、多孔質中空糸１質量部に対し２０質量部注入した後、１２分間密閉状態で静置してグラフト重合反応を施し、多孔質中空糸にグラフト鎖を導入した。なお、反応液は予め窒素でバブリングして、反応液内の酸素を窒素置換した。
【００７４】
グラフト重合反応後、反応管内の反応液を除去した。次いで、反応管内にジメチルスルホキシドを入れて多孔質中空糸を洗浄することにより、残存したグリシジルメタクリレート、そのオリゴマー及び多孔質中空糸に固定されなかったグラフト鎖を除去した。
【００７５】
洗浄液を除去した後、さらにジメチルスルホシキドを入れて２回洗浄を行った。メタノールを用いて同様にして洗浄を３回行った。洗浄後の多孔質中空糸を乾燥し、重量を測定したところ、グラフト鎖が導入されたポリエチレン多孔質中空糸の重量はグラフト鎖導入前の１５０％であり、下記式（１）で算出される、基材重量に対するグラフト鎖の重量比として定義されるグラフト率（ｄｇ）は５０％であった。
式（１） ｄｇ ＝ （ｗ1 − ｗ0） ／ ｗ0
ここでｗ0は反応前のポリエチレン多孔質中空糸の重量、ｗ1はグラフト鎖が導入されたポリエチレン多孔質中空糸の重量である。
【００７６】
５０％のグラフト率は、下記式（２）によって算出される、基材ポリエチレンの骨格単位であるＣＨ2基（分子量１４）のモル数に対して導入されたＧＭＡ（分子量１４２）のモル数が４．９２％であることに相当する。
式（２） 導入ＧＭＡのモル数％ ＝ （グラフト率 ／ １４２） ／ （１００ ／ １４） × １００
【００７７】
固体ＮＭＲ法により、グラフト反応後の多孔質中空糸中のポリエチレン骨格単位ＣＨ2基のモル数と、グラフト鎖を構成するＧＭＡに特有なエステル基（ＣＯＯ基）のモル数と、の比を測定した。
【００７８】
測定はグラフト反応後の多孔質中空糸を凍結粉砕した粉末サンプル０．５ｇを用いて、Ｂｒｕｋｅｒ Ｂｉｏｓｐｉｎ社製ＤＳＸ４００を使用し、核種を13Ｃとして、Ｈｉｇｈ Ｐｏｗｅｒ Ｄｅｃｏｕｐｌｉｎｇ法（ＨＰＤＥＣ法）の定量モードにより、待ち時間１００ｓ、積算１０００回の条件で、室温下で測定を行った。
【００７９】
得られたＮＭＲスペクトルのエステル基に対応するピーク面積と、ＣＨ2基に対応するピーク面積との比が、ＧＭＡとＣＨ2基のモル数の比に対応することから、測定結果よりＣＨ2基のモル数に対する導入されたＧＭＡのモル数を算出したところ、４．９％と得られた。これはグラフト率４９．７％に相当し、グラフト反応後のサンプルを固体ＮＭＲ法で測定することにより、グラフト率が得られることが示された。
【００８０】
（ｉｉ）共重合リガンドの合成
エチレンジアミン（ＥＤＡ）２０体積部、及び純水８０体積部からなるＥＤＡ溶液と、ジエチレングリコールジグリシジルエーテル（ＤＥＧ−ＤＧＥ）２０体積部、イソプロパノール４０体積部、及び純水４０体積部からなるＤＥＧ−ＤＧＥ溶液をそれぞれ調整し、１０℃に冷却した。その後、１０℃のウォーターバス中で撹拌しながら、ＥＤＡ溶液３８体積部に対し、ＤＥＧ−ＤＧＥ溶液６２体積部を、３滴／秒ずつ混合し、ＥＤＡと、ＤＥＧ−ＤＧＥと、の共重合体からなる共重合リガンドを調整した。さらに、共重合リガンドを含む溶液６６体積部に対し、イソプロパノール３４体積部添加し、溶液のイソプロパノール最終比が５０体積部となるように調節した。
【００８１】
得られた共重合リガンドにおいて、ＥＤＡのモル比率は５０％であり、ＤＥＧ−ＤＧＥのモル比率は５０％であった。
【００８２】
（ｉｉｉ）共重合リガンドのグラフト鎖への固定
ガラス反応管に、グラフト鎖を導入した、乾燥した多孔質中空糸を乾燥重量で１質量部、さらに（ｉｉ）で調整した共重合リガンド導入のための反応溶液９９質量部入れ、撹拌後４０℃に調整した。ガラス反応管を密閉して７２時間静置し、グラフト鎖のエポキシ基を開環し、共重合リガンドを導入した。
【００８３】
反応後の多孔質中空糸膜を、イソプロパノール及び純水で十分洗浄し、真空乾燥後の重量を測定した。その結果、共重合リガンドを導入する前に比べて、多孔質中空糸の重量が１０６．６％に増加しており、エポキシ基が反応して、共重合リガンドが導入されていることが示された。
【００８４】
（実施例２：ヘキサンジアミンと、ヘキサンジオールジグリシジルエーテルと、の共重合リガンドが固定された多孔質吸着膜）
【００８５】
実施例１の（ｉｉ）において、ヘキサンジアミン（ＨＤＡ）を純水に溶解させ、１．９ｍｏｌ／ＬのＨＤＡ溶液と、ヘキサンジオールジグリシジルエーテル（ＨＤＯ−ＤＧＥ）２０体積部、イソプロパノール４０体積部、及び純水４０体積部からなるＨＤＯ−ＤＧＥ溶液を調整した。さらに、ＨＤＡ溶液５０体積部に対し、ＨＤＯ−ＤＧＥ溶液５０体積部を混合し、ＨＤＡと、ＨＤＯ−ＤＧＥと、の共重合体からなる共重合リガンドを調製した。その後、共重合リガンドを含む溶液６３体積部に対し、イソプロパノール３７体積部添加した。
【００８６】
得られた共重合リガンドにおいて、ＨＤＡのモル比率は５１％であり、ＨＥＧ−ＤＧＥのモル比率は４９％であった。それ以外は、実施例１と同じ操作を実施した。
【００８７】
得られた中空糸多孔膜は、共重合リガンドを導入する前に比べて、重量が１０６．９％に増加しており、エポキシ基が反応して、共重合リガンドが導入されていることが示された。
【００８８】
（実施例３：ヘキサンジアミンと、シクロヘキサンジメタノールジグリシジルエーテルと、の共重合リガンドが固定された多孔質吸着膜）
【００８９】
実施例１の（ｉｉ）において、ヘキサンジアミン（ＨＤＡ）を純水に溶解させ、１．５ｍｏｌ／ＬのＨＤＡ溶液と、シクロヘキサンジメタノールジグリシジルエーテル（ＣＨＤＭ−ＤＧＥ）２０体積部、イソプロパノール４０体積部、及び純水４０体積部からなるＣＨＤＭ−ＤＧＥ溶液を調整した。さらに、ＨＤＡ溶液５０体積部に対し、ＣＨＤＭ−ＤＧＥ溶液５０体積部を混合し、ＨＤＡと、ＣＨＤＭ−ＤＧＥと、の共重合体からなる共重合リガンドを調製した。その後、共重合リガンドを含む溶液６３体積部に対し、イソプロパノール３７体積部添加した。
【００９０】
得られた共重合リガンドにおいて、ＨＤＡのモル比率は４９％であり、ＣＨＤＭ−ＤＧＥのモル比率は５１％であった。それ以外は、実施例１と同じ操作を実施した。
【００９１】
得られた中空糸多孔膜は、共重合リガンドを導入する前に比べて、重量が１０８．１％に増加しており、エポキシ基が反応して、共重合リガンドが導入されていることが示された。
【００９２】
（実施例４：ウシ血清アルブミンを用いたタンパク質吸着能評価）
（ｉｖ）ＮａＣｌ濃度が０ｍｏｌ／Ｌのときのタンパク質吸着能評価
実施例１で得られた中空糸多孔膜を用いて、膜体積０．３８ｍＬ、膜面積４．１ｃｍ2のモジュールを作製した。このモジュールにＮａＣｌ濃度が０ｍｏｌ／Ｌの２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を３０ｍＬ通液して平衡化した後、緩衝液にウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を混合して、濃度を１ｍｇ／ｍＬに調整したＢＳＡ溶液を３０ｍＬ通液し、フロースルーにて得られる画分を回収した。次に、緩衝液を１０ｍＬ通液して、中空糸多孔膜中の非吸着のＢＳＡを洗浄し、洗浄にて得られる画分を回収した。次に１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ溶液を１０ｍＬ通液して、中空糸多孔膜中に吸着しているＢＳＡを溶出し、溶出にて得られる画分を回収した。得られたフロースルー、洗浄及び溶出回収液の量を測定すると共に、吸光度計で波長２８０ｎｍの吸光度を測定し、アルブミンの吸光係数０．６を用いて濃度を求めた結果、中空糸多孔膜のＢＳＡ吸着容量は１２．２ｍｇ／ｍＬであった。
【００９３】
また、実施例２で得られた中空糸多孔膜を用いて、膜体積０．３８ｍＬ、膜面積４．１ｃｍ2の単糸モジュールを作製した。上記と同様にして、吸着の際のＮａＣｌ濃度が０ｍｏｌ／ＬのときのＢＳＡの吸着容量を求めた結果、中空糸多孔膜のＢＳＡ吸着容量は１０．８ｍｇ／ｍＬであった。
【００９４】
さらに、実施例３で得られた中空糸多孔膜を用いて、膜体積０．３８ｍＬ、膜面積４．１ｃｍ2の単糸モジュールを作製した。上記と同様にして、吸着の際のＮａＣｌ濃度が０ｍｏｌ／ＬのときのＢＳＡの吸着容量を求めた結果、中空糸多孔膜のＢＳＡ吸着容量は１３．５ｍｇ／ｍＬであった。
【００９５】
（ｖ）ＮａＣｌ濃度が０．１５ｍｏｌ／Ｌのときのタンパク質吸着能評価
（ｉｖ）において、緩衝液を２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ０．１５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）にした以外は、同じ操作を実施した。実施例１で得られた中空糸多孔膜のＢＳＡ吸着容量は５．９ｍｇ／ｍＬであった。
【００９６】
また、実施例２で得られた中空糸多孔膜の、吸着の際のＮａＣｌ濃度が０．１５ｍｏｌ／ＬのときのＢＳＡ吸着容量は４．８ｍｇ／ｍＬであった。
【００９７】
また、実施例３で得られた中空糸多孔膜の、吸着の際のＮａＣｌ濃度が０．１５ｍｏｌ／ＬのときのＢＳＡ吸着容量は５．１ｍｇ／ｍＬであった。
【００９８】
（ｖｉ）塩濃度が変化したときのタンパク質吸着能変化
実施例１で得られた中空糸多孔膜について、緩衝液が２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）であって、吸着の際のＮａＣｌ濃度が０．１５ｍｏｌ／ＬであるときのＢＳＡの吸着容量は、吸着の際のＮａＣｌ濃度が０ｍｏｌ／ＬであるときのＢＳＡの吸着容量に比べて、４８．４％であった。
【００９９】
実施例２で得られた中空糸多孔膜について、緩衝液が２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）であって、吸着の際のＮａＣｌ濃度が０．１５ｍｏｌ／ＬであるときのＢＳＡの吸着容量は、吸着の際のＮａＣｌ濃度が０ｍｏｌ／ＬであるときのＢＳＡの吸着容量に比べて、４４．４％であった。
【０１００】
実施例３で得られた中空糸多孔膜について、緩衝液が２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）であって、吸着の際のＮａＣｌ濃度が０．１５ｍｏｌ／ＬであるときのＢＳＡの吸着容量は、吸着の際のＮａＣｌ濃度が０ｍｏｌ／ＬであるときのＢＳＡの吸着容量に比べて、３７．８％であった。
【０１０１】
（比較例１：陰イオン交換リガンドが固定された多孔質吸着膜）
実施例１の（ｉ）によって得られた、グラフト鎖を導入した中空糸多孔膜を、メタノールに１０分以上浸漬して膨潤させた後、純水に浸漬して水置換した。また、精製水１２．５ｍＬと、１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ水溶液１２．５ｍＬと、を混合し、ここに、１．１９ｇのトリメチルアミン塩酸塩加えて、反応液を作製した。次に、上記（ｉ）で得られたグラフト鎖導入後の中空糸多孔膜の乾燥重量に対して２５質量部の反応液をガラス反応管に入れ、４０℃に調整した。その後、反応液に、純水浸漬後のグラフト鎖を導入した中空糸多孔膜を挿入し、２４時間静置して、グラフト鎖のエポキシ基をトリメチルアミノ基に置換し、トリメチルアミノ基がグラフト鎖を介して固定された中空糸多孔膜を得た。
【０１０２】
得られた中空糸多孔膜は、トリメチルアミノ基を導入する前に比べて、重量が１１３．２％に増加しており、エポキシ基が反応して、トリメチルアミノ基が導入されていることが示された。
【０１０３】
得られた中空糸多孔膜を用いて、膜体積０．３８ｍＬ、膜面積４．１ｃｍ2の単糸モジュールを作製した。実施例３と同様にして、目的タンパク質としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を１ｍｇ／ｍＬ含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を通液し、ＢＳＡの吸着容量を求めた。
【０１０４】
吸着の際のＮａＣｌ濃度が０ｍｏｌ／Ｌのときのタンパク質吸着能は、４０．７ｍｇ／ｍＬであった。また、吸着の際のＮａＣｌ濃度が０．１５ｍｏｌ／Ｌのときのタンパク質吸着能は、１．７ｍｇ／ｍＬであった。
【０１０５】
よって、塩濃度が変化したときのタンパク質吸着能変化は、緩衝液が２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）であって、吸着の際のＮａＣｌ濃度が０．１５ｍｏｌ／ＬであるときのＢＳＡの吸着容量は、吸着の際のＮａＣｌ濃度が０ｍｏｌ／ＬであるときのＢＳＡの吸着容量に比べて、４．１％であった。
【０１０６】
このことから、本実施の形態の方法に比べて、比較例１に係る中空糸多孔膜は、電気伝導度の高い溶液におけるタンパク質吸着能の低下が著しく、塩濃度に対するプロセスウィンドウが狭いことが分かった。
【０１０７】
（比較例２：市販の膜）
市販のアニオン交換基を有する膜として、ザルトリウス製Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑ ＭＡ７５（リンカー：グラフト鎖、リガンド：４級アンモニウム、膜体積２．０６ｍＬ）、及びポール製Ｍｕｓｔａｎｇ Ｑ Ａｃｒｏｄｉｓｃ（リンカー：スペーサー基、リガンド：４級アミン、膜体積０．１８ｍＬ）の２種類を用い、実施例３と同様にして、目的タンパク質としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を１ｍｇ／ｍＬ含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を通液し、ＢＳＡの吸着容量を求めた。
【０１０８】
吸着の際のＮａＣｌ濃度が０ｍｏｌ／Ｌのときのタンパク質吸着能は、それぞれ、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑが２６．２ｍｇ／ｍＬ、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｑが５６．２ｍｇ／ｍＬであった。
【０１０９】
また、吸着の際のＮａＣｌ濃度が０．１５ｍｏｌ／Ｌのときのタンパク質吸着能は、それぞれ、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑが２．４ｍｇ／ｍＬ、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｑが３．３ｍｇ／ｍＬであった。
【０１１０】
よって、塩濃度が変化したときのタンパク質吸着能変化は、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑについて、緩衝液が２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）であって、吸着の際のＮａＣｌ濃度が０．１５ｍｏｌ／ＬであるときのＢＳＡの吸着容量は、吸着の際のＮａＣｌ濃度が０ｍｏｌ／ＬであるときのＢＳＡの吸着容量に比べて、９．１％であった。また、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｑについて、緩衝液が２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）であって、吸着の際のＮａＣｌ濃度が０．１５ｍｏｌ／ＬであるときのＢＳＡの吸着容量は、吸着の際のＮａＣｌ濃度が０ｍｏｌ／ＬであるときのＢＳＡの吸着容量に比べて、５．９％であった。
【０１１１】
このことから、本実施の形態の方法に比べて、比較例２に係る膜は、電気伝導度の高い溶液におけるタンパク質吸着能の低下が著しく、塩濃度に対するプロセスウィンドウが狭いことが分かった。
【０１１２】
（実施例６：フロースルーモードによる夾雑物の吸着除去）
（ｖｉｉ）抗体含有細胞培養液の調製
無血清培地にて培養したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の培養液（電気伝導度８．７ｍＳ／ｃｍ、細胞密度１．１×１０7／ｍＬ）１９６ｍＬに抗体５０ｍｇ／ｍＬを含むヒトγ−グロブリン溶液（ベネシス社、ヴェノグロブリン）４ｍＬを添加し、０．４５μｍ精密ろ過膜（ザルトリウス製、ミニザルト１６５５５Ｋ）を透過させることにより、ｐＨ７．４で抗体１ｍｇ／ｍＬを含有する細胞培養液を調製した。
【０１１３】
得られた細胞培養液中の代表的な夾雑物であるＨＣＰ濃度を、ＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。Ｃｙｇｎｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製、ＣＨＯ Ｈｏｓｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔの９６ウェルプレートに細胞培養液を滴下し、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製、Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ Ｖｉｓｉｂｌｅ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ ＩＩ９６のプレートリーダーを用いてＨＣＰ濃度を測定した。その結果、細胞培養液中のＨＣＰ濃度は、３５４μｇ／ｍＬであった。
【０１１４】
他の代表的な夾雑物であるＤＮＡの定量は、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ（登録商標）ｄｓＤＮＡ ＨＳ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを用いて評価する細胞培養液を処理した後、Ｑｕｂｉｔ（登録商標）フルオロメーターを用いて行った。その結果、細胞培養液中のＤＮＡ濃度は７５６０ｎｇ／ｍＬであった。
【０１１５】
（ｖｉｉｉ）プロテインＡカラムを用いた抗体精製
（ｖｉｉ）で得られた抗体含有細胞培養液２５ｍＬを０．２μｍ除菌膜（ザルトリウス製、Ｍｉｎｉｓａｒｔ ｐｌｕｓ）に通液した後、２０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍＬで平衡化したプロテインＡカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製、ＨｉＴｒａｐ ＰｒｏｔｅｉｎＡ ＨＰ １ｍＬ）に１０ｍＬ添加し、抗体を吸着させた。カラムに上記緩衝液２０ｍＬを通液して洗浄した後、０．１ｍｏｌ／Ｌのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）を１０ｍＬ通液して、抗体を溶出回収した。得られた溶出回収液に、ほぼ等量の１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．２）を添加し中和した後、少量の１．５ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で溶出回収液をｐＨ８．０に調整し、抗体の精製液２０ｍＬを得た。精製液はプロテインＡカラムに通液する前に対して２倍希釈されている。
【０１１６】
得られた抗体の精製液中のＨＣＰ濃度を（ｖｉｉ）と同様にして測定した結果、３．０２μｇ／ｍＬであった。また、（ｖｉｉ）と同様にしてＤＮＡ濃度を測定した結果、６７．５ｎｇ／ｍＬであった。さらに、得られた溶出回収液を、２０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）により１０倍希釈し、波長２８０ｎｍの吸光度を測定し、抗体の吸光係数Ｅ1% 280nm ＝ １４を用いてＬａｍｂｅｒｔ−Ｂｅｅｒの法則に従って濃度を求めたところ、０．４６ｇ／Ｌであり、２倍希釈されていることから、得られた抗体のアフィニティークロマトグラフィー後の回収率は９２％であった。
【０１１７】
（ｉｘ）固定された多孔質吸着膜による夾雑物除去
実施例１で得られた中空糸多孔膜を用いて、膜体積０．５４ｍＬ、膜面積６．４ｃｍ2のモジュールを作成した。このモジュールに２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を２０ｍＬ通液して平衡化した後、（ｖｉｉｉ）で得られたアフィニティークロマトグラフィー後の抗体の精製液を２０ｍＬ通液し、フロースルーにて得られる画分を回収した。得られたフロースルー回収液中のＨＣＰ濃度を（ｖｉｉ）と同様にして測定した結果、３０ｎｇ／ｍＬであり、フロースルーによりＨＣＰ含有量は約１００分の１に低下した。また、（ｖｉｉ）と同様にしてＤＮＡ濃度を測定した結果、検出限界（１０ｎｇ／ｍＬ）以下であった。さらに、得られた回収液を２０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）により１０倍希釈し、波長２８０ｎｍの吸光度を測定し、抗体の吸光係数Ｅ1% 280nm ＝ １４を用いてＬａｍｂｅｒｔ−Ｂｅｅｒの法則に従って濃度を求めたところ、０．９０ｇ／Ｌであり、抗体が中空糸多孔膜には吸着されなかったことを示していた。
【０１１８】
以上の実施例で示したように、本実施の形態に係る中空糸多孔膜を用いることにより、夾雑物を有効に除去し、速やかに抗体を精製することが可能であった。
【産業上の利用可能性】
【０１１９】
本発明により、塩濃度に対するプロセスウィンドウを広げることができ、電気伝導度が高い溶液から、目的タンパク質を効率よく精製することが可能な、共重合リガンドを有する多孔質吸着膜を得ることができる。また、アフィニティークロマトグラフィー工程後の中間精製において、ＨＣＰ、ＤＮＡなどの夾雑物を有効に且つ迅速に除去できるので、細胞培養液に含まれる目的タンパク質の精製において、産業上の利用可能性を有する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多孔質吸着膜、及び当該多孔質吸着膜を用いたタンパク質の精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、バイオテクノロジー産業において、タンパク質の大量精製が重要な課題となっている。特に、医薬の分野において、血液製剤、抗体医薬等の需要が急速に拡大しており、効率的に大量のタンパク質を生産及び精製可能な技術の確立が強く望まれている。
【０００３】
一般的に、タンパク質は、動物由来の細胞株を用いる細胞培養によって産生される。細胞培養液からタンパク質を精製する通常の操作においては、最初に、細胞培養液を遠心分離し、濁質成分を沈降除去する。次いで、遠心分離で除去しきれない約１μｍ以下の細胞デブリを、精密ろ過膜を用いるサイズろ過により除去する。さらに無菌化するために、最大細孔径が０．２２μｍ以下のろ過膜を用いて無菌化ろ過を施して、目的タンパク質の清澄な溶液を得る（ハーベスト工程）。続いて、プロテインＡに代表されるアフィニティークロマトグラフィーを初めとする、複数のクロマトグラフィー技術の組み合わせによる精製プロセスを用いて、Ｈｏｓｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＨＣＰ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、目的タンパク質の凝集物、エンドトキシン、ウイルス、及びカラムから脱離したプロテインＡなどの夾雑物を清澄な溶液から除去し、目的タンパク質を分離・精製する（ダウンストリーム工程）。
【０００４】
以上説明した従来のタンパク質の精製方法の対象となる細胞培養液中の目的タンパク質の濃度は、現状では通常１ｇ／Ｌ程度である。また、夾雑物の濃度も、目的タンパク質の濃度とほぼ同程度であると考えられる。このような濃度範囲では、ハーベスト工程及びダウンストリーム工程を含む従来のタンパク質の精製方法は、有効である。
【０００５】
しかしながら、抗体医薬の需要が急速に拡大し、抗体医薬に用いられるタンパク質の大量生産が指向されたため、近年では細胞培養液中のタンパク質濃度を高める細胞培養技術が急速に発達している。そのため、近年では細胞培養液中の目的タンパク質の濃度が１０ｇ／Ｌあるいはそれ以上にまで到達しようとしている。しかし同時に、細胞培養液中の夾雑物の濃度も同様に増加しており、従来のタンパク質の精製方法では、目的タンパク質の精製が困難になりつつある。
【０００６】
近年では効率的に目的タンパク質を分離精製するために、複数のリガンドを有する混合モードの樹脂を充填したクロマトグラフィーカラムを用いることが、広く検討されている。このようなクロマトグラフィーカラムに用いられるリガンドとしては、ミックスモードリガンド又はマルチモーダルリガンドと呼ばれるリガンドが用いられている。
【０００７】
このようなモードのリガンドを用いるクロマトグラフィーでは、リガンドに対する目的タンパク質と、夾雑物と、の電荷相互作用及び疎水性相互作用等の複数の相互作用の差を利用するため、より高精度な分離が可能になるだけでなく、複数の夾雑物を同時にかつ有効に除去できることが期待されている。
【０００８】
例えば、特許文献１には、イオン交換基及び疎水性基からなるマルチモーダルリガンドのクロマトグラフィーを用いて、生理的塩濃度のような比較的高いイオン強度において、タンパク質の分離精製をおこなう方法が記載されている。
【０００９】
また、特許文献２及び３では、疎水性単量体と親水性単量体を共重合し、さらに親水性単量体にイオン交換性基を導入してなる、イオン交換による捕捉力と、疎水性相互作用による捕捉力と、を有するミックスリガンド樹脂からなる粒子のクロマトグラフィーを用いて、タンパク質を吸着、溶出することで、目的タンパク質を効率的に濃縮する方法が記載されている。
【００１０】
特許文献１乃至３に開示されているように、タンパクの分離精製に関して、ミックスリガンドを用いたクロマトグラフィー担体が開発されている背景には、タンパク質医薬品市場の拡大により、製薬メーカーが、精製のプロセスウィンドウを広げると共に、生産をより効率的に行うことを望む事が挙げられる。
【００１１】
さらに、効率的に大量のタンパク質を精製する方法として、多孔質膜を用いたイオン交換吸着膜の報告もなされている。ビーズを基礎とするクロマトグラフィーでは、吸着のために利用できる表面積の大部分がビーズに対して内部にある。したがって、物質移動速度が細孔拡散によって典型的に制御されるため、この分離方法は本質的に遅い。この拡散抵抗を最小にし、そしてそれに伴って結合能力を最大にするために、さらに小さな直径のビーズを使用することができる。しかし、小さな直径のビーズを使用すると、カラムの圧力降下の増大という犠牲を払うことになる。そのため、クロマトグラフィー分離の最適化は、効率、吸着容量、及びカラムの圧力降下との妥協を伴うことが多い。これに対して、膜を基礎とするクロマトグラフィーは、リガンドが対流性の膜孔に直接結合しており、それによって物質移行に及ぼす内部細孔拡散の影響が排除される。したがって、吸着膜媒体の物質移動速度は、標準的なビーズを基礎とするクロマトグラフィー媒体の物質移動速度よりも大きさが一桁大きいため、高効率分離と、高流量分離と、の両方を可能にすることができる。
【００１２】
例えば、特許文献４及び５には、多孔質膜にイオン交換基を導入して、タンパク質吸着能力を付与したタンパク質吸着膜が開示されている。
【００１３】
特許文献６及び７には、カチオン交換基及びアニオン交換基をポリエーテルスルホン多孔膜に導入したタンパク質吸着膜が開示されている。
【００１４】
また、特許文献８には、アニオン交換基を固定化したグラフト鎖を細孔表面に有するタンパク質吸着膜を用いて、タンパク質を精製する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】特表２００４−５１６９２８号公報
【特許文献２】特開２００１−３４３３７８号公報
【特許文献３】特開２０１０−１３７２０７号公報
【特許文献４】米国特許第５，５４７，５７５号明細書
【特許文献５】米国特許第５，７３９，３１６号明細書
【特許文献６】米国特許第６，７８３，９３７号明細書
【特許文献７】米国特許第６，７８０，３２７号明細書
【特許文献８】国際公開第２００９／０５４２２６号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
上述のとおり、目的タンパク質を効率よく分離精製する方法は、数多く提案、報告されている。
【００１７】
しかしながら、現実には全ての夾雑物を有効かつ迅速に除去して目的タンパク質を精製することは、現状でも困難であり、特にアフィニティークロマトグラフィー後の塩濃度の高い中間精製溶液において、微量に残存するＨＣＰ及び凝集体などを医薬品として要求されるレベルにまで除去し、高精度な目的タンパク質を回収することは、細胞培養液中の目的タンパク質濃度が大幅に向上しつつある状況において、さらに困難になることが懸念されている。
【００１８】
特許文献１に開示されたマルチモーダルのリガンドについては、クロマトグラフィーカラムに用いるビーズのみを対象としており、高流速で通液することが困難である。特許文献２及び３に開示された共重合高分子からなるミックスリガンド樹脂についても、クロマトグラフィーカラムに用いるビーズのみを対象としており、高流速で通液することが困難である。
【００１９】
また、前述のように、アフィニティークロマトグラフィー後の中間精製溶液には、通常、塩が含まれている。特許文献４−７に開示されたタンパク質吸着膜は、イオン交換基の吸着作用のみでのタンパク吸着能を有するため、一般的なイオン交換カラムと同様に、これらの吸着膜のタンパク質吸着量は、溶液中に０．１ｍｏｌ／Ｌ以上の塩が含まれていると、著しく減少する。したがって、特許文献４−７に開示されたタンパク質吸着膜を用いて、電気伝導度の高いアフィニティークロマトグラフィー工程あるいはカチオン交換クロマトグラフィー工程の溶液から、不純物タンパク質を除去することは現実的ではない。
【００２０】
特許文献８に開示されたタンパク質吸着膜は、グラフト鎖によってアニオン交換基を立体的に配置することにより、タンパク質との相互作用点を増やすことで、溶液中に０．１５ｍｏｌ／Ｌ程度の塩が含まれていても、タンパク吸着性を維持できることが示されている。しかし、イオン交換基の吸着作用のみでタンパク質を吸着していることから、塩が含まれていない溶液でのタンパク質吸着量に比べると、塩が含まれている溶液でのタンパク質吸着量は低下する。
【００２１】
さらに、全ての夾雑物を有効にかつ迅速に除去してタンパク質を精製することの困難さは、フロースルーモード及び結合モードの両方において、有効にタンパク質を分離精製するための有効な塩濃度、ｐＨ、溶液組成などの条件、すなわちプロセスウィンドウが狭く、安定で汎用的な精製条件を決定することが容易ではないことに基づいている。この状況は、より効率的にタンパク質を精製することを目的とした混合モードリガンドのクロマトグラフィーにおいても同様である。
【００２２】
かかる状況に鑑み、本発明は、タンパク質の分離精製の中でも、特に求められている塩濃度に対するプロセスウィンドウを広くすることを目的として、電気伝導度の高い溶液であっても、目的タンパク質と、夾雑物と、を含む混合液から、夾雑物を有効かつ迅速に除去し、目的タンパク質を効率的に精製可能な、混合リガンドを有する多孔質吸着膜を提供することを課題とする。さらに、本発明は、塩濃度に対するプロセスウィンドウが広く、タンパク質分離精製ステップの簡素化や、溶液処理の時間短縮を可能とする、多孔質吸着膜を用いたタンパク質の精製方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明者らは、課題を解決するために鋭意検討した結果、アニオン交換能を有す基を主鎖に持つモノマー由来ユニットと、疎水性相互作用を有す基を主鎖に持つモノマー由来ユニットとの共重合体を有するリガンドが、多孔質基材の細孔中に網状に分布された構造を有する多孔質吸着膜を用いることが、塩濃度に対するプロセスウィンドウを広くすることが可能であり、電気伝導度が高い溶液から、医薬品として使われるタンパク質を効率よく且つ迅速に精製することに対して有用であることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明の態様は以下の通りである。
【００２４】
［１］細孔を有する基材と、リガンドと、基材及びリガンド間を結合しているリンカーと、を備える多孔質吸着膜であって、
リガンドは、
（ａ）アニオン交換能を有す基を主鎖に持つモノマー由来ユニットと、
（ｂ）疎水性相互作用を有す基を主鎖に持つモノマー由来ユニット
を含み、（ａ）と、（ｂ）と、は、共重合体を形成している、多孔質吸着膜。
【００２５】
［２］アニオン交換能を有す基を主鎖に持つモノマーが、ジアミン化合物モノマーである、［１］に記載の多孔質吸着膜。
【００２６】
［３］アニオン交換能を有す基を主鎖に持つモノマーが、疎水性相互作用を有す基を主鎖に持つモノマー由来ユニットである、［１］又は［２］に記載の多孔質吸着膜。
【００２７】
［４］ジアミン化合物モノマーが下記構造式（１）の構造を有し、
構造式（１） ＮＨ2 − Ｒ1 − ＮＨ2
構造式（１）のＲ1が、炭素数２から６のアルキレン基からなる群より選ばれる少なくとも１種である、［１］乃至［３］のいずれかに記載の多孔質吸着膜。
【００２８】
［５］疎水性相互作用を有す基を主鎖に持つモノマーが、ジグリシジル化合物モノマーである、［１］乃至［４］のいずれかに記載の多孔質吸着膜。
【００２９】
［６］ジグリシジル化合物モノマーが、下記構造式（２）の構造を有し、
【化１】
構造式（２）のＲ2が、炭素数２から６のアルキレン基、炭素数２から６のアルキレン基エーテル、又は六員環からなる群より選ばれる少なくとも１種である、［１］乃至［５］のいずれかに記載の多孔質吸着膜。
【００３０】
［７］リンカーが、基材の表面に導入されたグラフト鎖である、［１］乃至［６］のいずれかに記載の多孔質吸着膜。
【００３１】
［８］グラフト鎖がメタクリル酸グリシジルの重合体である、［１］乃至［７］のいずれかに記載の多孔質吸着膜。
【００３２】
［９］多孔質吸着膜の基材の材料が、ポリオレフィン系重合体を含む、［１］乃至［８］のいずれかに記載の多孔質吸着膜。
【００３３】
［１０］多孔質吸着膜が中空糸多孔膜である、［１］乃至［９］のいずれかに記載の多孔質吸着膜。
【００３４】
［１１］多孔質吸着膜のタンパク質吸着容量をＣとするとき、
０．１５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌの水溶液のイオン強度と同一のイオン強度のタンパク質溶液をろ過した場合の吸着容量Ｃ0.15が、ＮａＣｌを含まない水溶液のイオン強度と同一のイオン強度のタンパク質溶液をろ過した場合の吸着容量Ｃ0に対して、少なくとも３５％を下回らない、［１］乃至［１０］のいずれかに記載の多孔質吸着膜。
【００３５】
［１２］目的とするタンパク質と、夾雑物と、を含む混合溶液から目的とするタンパク質を精製する方法であって、
［１］乃至［１１］のいずれかに記載の多孔質吸着膜を用いて混合溶液をろ過し、夾雑物を除去する、タンパク質の精製方法。
【発明の効果】
【００３６】
本発明の多孔質吸着膜を用いることにより、電気伝導度が高い溶液であっても、目的タンパク質と、夾雑物と、を含む混合液から、該溶液に含まれる夾雑物を除去し、目的タンパク質の精製を効率よく且つ迅速に行うことが可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
以下、本発明を実施するための形態（以下、「本実施の形態」という。）について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の本実施の形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。
【００３８】
本実施の形態に係る多孔質吸着膜は、細孔を有する基材と、リガンドと、基材及びリガンド間を結合しているリンカーと、を備える多孔質吸着膜であって、リガンドは、（ａ）アニオン交換能を有す基を主鎖に持つモノマー由来ユニットと、（ｂ）疎水性相互作用を有す基を主鎖に持つモノマー由来ユニットと、の共重合体を有している多孔質吸着膜である。（ａ）ユニットと、（ｂ）ユニットからなる共重合体を、リガンドとして有することで、吸着作用点を３次元的に立体配置可能であり、吸着物質との相互作用を強めることが可能となる。さらに、リガンドが、疎水性相互作用を有す基を主鎖に持つことで、溶液中に含まれる塩が増加しても、疎水性相互作用が有効に作用し、吸着タンパク質との相互作用が著しく低下することなく保たれ得る。
【００３９】
アニオン交換能を有す基としては、混合液中に含まれる目的タンパク質及び／又は夾雑物、特に、夾雑物として、不純物タンパク質、ＤＮＡ、ＨＣＰ、ウイルス及びエンドトキシンなどを吸着する能力のある官能基であれば、特に限定されないが、１級アミン、２級アミン、３級アミン、及び４級アミンなどが挙げられる。
【００４０】
疎水性相互作用を有す基としては、混合液中に溶存する目的タンパク質及び／又は夾雑物、特に、夾雑物として、目的タンパク質の二量体及び三量体などの凝集体、目的タンパク質の誤って折りたたまれた種、並びに脂質などを吸着する能力ある官能基であれば特に限定されないが、アルキレン基、アルキレン基エーテル、及び六員環などが挙げられる。
【００４１】
アニオン交換能を有す基を主鎖に持つモノマーとしては、ジアミン化合物モノマーを用いることができる。疎水性相互作用を有す基を主鎖に持つモノマーとしては、ジグリシジル化合物モノマーを用いることができる。この場合、リガンドは、ジアミン化合物モノマーと、ジグリシジル化合物モノマーと、を共重合させることによって得ることができる。共重合リガンドの形成方法は、特に限定されないが、例えば、ジアミン化合物モノマー溶液と、ジグリシジル化合物モノマー溶液と、を混合させることにより、共重合体を形成させることが可能である。
【００４２】
アニオン交換能を有するジアミン化合物モノマーとしては、エチレンジアミン、プロピレンジアミン、イソプロピレンジアミン、ブタンジアミン、ペンタンジアミン、及びヘキサンジアミンなどが挙げられる。
【００４３】
疎水性相互作用を有するジグリシジル化合物モノマーとしては、ジエチレングリコールジグリシジルエーテル、プロピレングリコールジグリシジルエーテル、ブタンジオールジグリシジルエーテル、ヘキサンジオールジグリシジルエーテル、及びシクロヘキサンジメタノールジグリシジルエーテルなどが挙げられる。
【００４４】
共重合リガンドを、多孔質基材膜に固定する方法としては特に限定されないが、基材が有する官能基に直接固定する方法や、基材に反応性を有する化合物をリンカーとして導入し、該リンカーを介して固定する方法などが挙げられる。これらの中でも、リガンドを３次元的に立体配置可能であり、これにより効率的に吸着物質を捕捉可能になることから、反応性を有する化合物として重合性モノマーを基材に導入して、基材にグラフト鎖を形成させ、該グラフト鎖を介して共重合リガンドを多孔質基材膜に固定する方法が好ましい。
【００４５】
多孔基材膜の表面及び細孔に、グラフト鎖を導入し、さらに該グラフト鎖に共重合リガンドを固定する方法としては、限定されるものではないが、例えば特開平２−１３２１３２号公報に開示される方法が挙げられる。
【００４６】
本実施の形態において、基材の重量に対する、共重合リガンドが固定される前の基材に導入されたグラフト鎖の重量の比（百分率）を、グラフト率という。
【００４７】
グラフト率は、１０％以上２５０％以下であることが好ましく、より好ましくは１０％以上１５０％以下であり、さらに好ましくは２０％以上９０％以下である。グラフト率を１０％以上とすることにより、タンパク質の吸着容量が著しく高くなり実用的である。また、グラフト率を２５０％以下とすることにより、実用的な強度が得られる。
【００４８】
通常、吸着したタンパク質を溶出する際に、塩溶液を多孔膜に通液するが、それにより膜体積は膨張する特性があり、グラフト率が高いほど膨張率が高い。塩溶液通液による膜体積の膨張率は、多孔膜とグラフト鎖の構造にもよるが、グラフト率６０％では約２％以下、９０％では約３％以下、１５０％では約５％以下である。通液により膨張するという観点から、多孔膜において、グラフト率を２５０％以下とするのが、実用上好適ある。
【００４９】
本実施の形態において、基材に導入されるグラフト鎖とは、導入反応後にジメチルホルムアミドなどの有機溶剤で洗浄しても、除去されない化学構造を有する。グラフト鎖としては、例えば、メタクリル酸グリシジル、酢酸ビニル及びヒドロキシプロピルアセテートの重合体が挙げられるが、共重合リガンドを導入しやすいことから、メタクリル酸グリシジル又は酢酸ビニルの重合体が好ましく、メタクリル酸グリシジルの重合体がより好ましい。
【００５０】
本実施の形態において、多孔質吸着膜の基材としては、特に限定されないが、機械的性質の保持のために、ポリオレフィン系重合体から構成されていることが好ましい。ポリオレフィン系重合体としては、例えば、エチレン、プロピレン、ブチレン及びフッ化ビニリデンなどのオレフィンの単独重合体、該オレフィンの２種以上の共重合体、又は１種もしくは２種以上のオレフィンと、パーハロゲン化オレフィンと、の共重合体などが挙げられる。パーハロゲン化オレフィンとしては、テトラフルオロエチレン及び／又はクロロトリフルオロエチレンなどが挙げられる。
【００５１】
これらの基材の中でも、機械的強度に特に優れ、かつタンパク質などの夾雑物の高い吸着容量が得られる素材である点で、ポリエチレン又はポリフッ化ビニリデンが好ましく、ポリエチレンがより好ましい。
【００５２】
ポリオレフィン系重合体を用いて多孔質膜を製造する方法は、当業者にとって公知のものであるが、例えば、特開平３−４２０２５号公報に開示される方法などが挙げられる。
【００５３】
多孔質吸着膜は、上記基材中に細孔を有する多孔質膜である。細孔径は、特に限定されないが、夾雑物である溶存したタンパク質などの吸着除去が有効になされ、かつ液中に含まれるサイズの大きな夾雑物である濁質成分が有効に除去される範囲であることが好ましい。
【００５４】
細孔径は、多孔質膜の形状を保持しかつ通液時の圧損が実用上問題のない程度であれば、特に限定されないが、０．０１μｍ〜５μｍであることが好ましく、より好ましくは０．０５μｍ〜３μｍであり、さらに好ましくは０．１μｍ〜１μｍである。多孔質吸着膜中の細孔の占める体積である空孔率も、多孔質膜の形状を保持しかつ通液時の圧損が実用上問題のない程度であれば、特に限定されないが、好ましくは５％〜９９％であり、より好ましくは１０％〜９５％であり、さらに好ましくは３０％〜９０％である。
【００５５】
細孔径及び空孔率の測定は、Ｍａｒｃｅｌ Ｍｕｌｄｅｒ著「膜技術」（株式会社アイピーシー）などに記載されているような、当業者にとって公知の方法により行うことができるが、測定方法としては、例えば、電子顕微鏡による観察、バブルポイント法、水銀圧入法、及び透過率法などが挙げられる。
【００５６】
多孔質吸着膜の形態は、多孔質体であれば特に限定されないが、平膜、不織布、中空糸膜、モノリス、キャピラリー、円板又は円筒状などが挙げられる。これらの形態の中でも、製造の容易さ、スケールアップ性、モジュール成型した際の膜のパッキング性などから、多孔質吸着膜は、中空糸多孔膜であることが好ましい。
【００５７】
本実施の形態において、中空糸多孔膜とは、中空部分を有する円筒状又は繊維状の多孔膜であり、中空糸の内層と外層が、貫通孔である細孔によって連続しており、その細孔によって内層から外層、あるいは外層から内層に、液体あるいは気体が透過する性質を有する多孔体を意味する。
【００５８】
中空糸の外径及び内径は、物理的に形状を保持することができ、かつモジュール成型可能であれば、特に限定されない。
【００５９】
本実施の形態の多孔質吸着膜において、タンパク質吸着容量をＣとするとき、０．１５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌの水溶液のイオン強度と同一のイオン強度のタンパク質溶液をろ過した場合の吸着容量Ｃ0.15が、ＮａＣｌを含まない水溶液のイオン強度と同一のイオン強度のタンパク質溶液をろ過した場合の吸着容量Ｃ0に対して、３５％以上であることが好ましく、４０％以上であることがより好ましい。
【００６０】
吸着容量Ｃ0.15を吸着容量Ｃ0に対して３５％以上とすることによって、塩濃度に対するプロセスウィンドウを広くすることが可能であり、本実施の形態に係る多孔質吸着膜を用いて、電気伝導度が高い溶液から、目的タンパク質を効率よく且つ迅速に精製することが可能となる。
【００６１】
本実施の形態の目的とするタンパク質の精製方法は、目的とするタンパク質と、夾雑物と、を含む混合溶液から目的とするタンパク質を精製する方法であって、本実施の形態に係る多孔質吸着膜を用いて混合溶液をろ過し、夾雑物を除去することを含む、タンパク質の精製方法である。
【００６２】
本実施の形態に係る多孔質吸着膜は、混合溶液中に含まれる１種類以上の夾雑物から、目的とするタンパク質を分離、精製する用途に用いることが有効である。
【００６３】
目的とするタンパク質を分離・精製する方法としては、混合溶液を本実施の形態に係る多孔質吸着膜を用いてろ過することにより、（ａ）夾雑物を多孔質吸着膜に吸着させ、精製された目的タンパク質を、非吸着の画分として回収するフロースルーモード、あるいは（ｂ）目的タンパク質を多孔質吸着膜に吸着した後、選択的に溶出回収する結合モード、の２種類の態様が例えば挙げられる。
【００６４】
本実施の形態に係る多孔質吸着膜にろ過させる混合溶液としては、アフィニティークロマトグラフィーカラムから溶出された、抗体を含有する溶出液が好適である。アフィニティークロマトグラフィーに用いられるカラムに充填する樹脂のリガンドは、通常プロテインＡのようなＦｃ結合タンパク質を含む。このようなアフィニティークロマトグラフィーの樹脂は市販されており、容易に入手することが可能である。溶出液中に含まれる、除去すべき夾雑物としては、ＨＣＰ、ＤＮＡ、ウイルス、エンドトキシン、遊離プロテインＡ、プロテインＡと抗体との間で形成された複合体、並びに抗体の凝集体などが含まれる。
【００６５】
なお、アフィニティークロマトグラフィー工程前の溶液を、本実施の形態に係る多孔質吸着膜を用いてろ過してもよい。
【００６６】
上述した（ａ）の方法のろ過形態であるフロースルーモードを実施する場合には、本実施の形態に係る多孔質吸着膜を用いて混合溶液をろ過し、素通りした画分を精製された抗体の溶液として回収する。この場合、抗体の大半は、吸着されることなく素通りするが、夾雑物は吸着により除去される。フロースルーを得るための条件は、精製すべき抗体の性質、例えば電荷及び電荷分布に依存するが、本実施の形態に係る多孔質吸着膜を用いることにより、プロセスウィンドウを広くとることができるため、例えば混合溶液の電気伝導度やｐＨの調節によって、当業者が容易に条件を設定することが可能である。
【００６７】
上述した（ｂ）の方法のろ過形態である結合モードを実施する場合にも、本実施の形態に係る多孔質吸着膜を用いて抗体を含む溶液をろ過する。この場合、抗体のみ、あるいは抗体と一部の夾雑物が、本実施の形態に係る多孔質吸着膜に吸着される。この場合も、所望の物質を結合させるための条件は、本実施の形態に係る多孔質吸着膜を用いることにより、プロセスウィンドウを広くとることができるため、例えば溶液の電気伝導度やｐＨなどの調節によって、当業者が容易に条件を設定することが可能である。
【００６８】
抗体のみを吸着した場合には、抗体を含む溶液を通液した後に、多孔質吸着膜から吸着物を除去しない緩衝液によって多孔質吸着膜を洗浄し、その後、吸着物に対する溶出緩衝液を多孔質吸着膜に通液することにより、精製された目的の抗体を多孔質吸着膜からの溶出画分として得る。
【００６９】
吸着物として、抗体と夾雑物を共に吸着した場合には、それらの溶出条件の違いを利用して、抗体のみを溶出した画分を得ることにより、精製された目的の抗体を得る。
【００７０】
本実施の形態に係る多孔質吸着膜は、アニオン交換能を有す基を主鎖に持つモノマー由来ユニットと、疎水性相互作用を有す基を主鎖に持つモノマー由来ユニットと、の共重合部分を有するリガンドが、多孔質基材の細孔中に網状に分布された構造を有する多孔質吸着膜であるため、塩濃度に対するプロセスウィンドウを広げることができ、電気伝導度が高い溶液から、目的タンパク質を効率よく精製することが可能である。また、樹脂を充填するカラムプロセスに比べて、高流速で溶液を通液できるため、精製に要する処理時間を大幅に短縮することが可能である。
【実施例】
【００７１】
以下、実施例及び比較例に基づいて本実施の形態をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は以下の実施例のみに限定されない。
【００７２】
（実施例１：エチレンジアミンと、ジエチレングリコールジグリシジルエーテルと、の共重合リガンドが固定された多孔質吸着膜）
【００７３】
（ｉ）多孔質中空糸へのグラフト鎖の導入
外径３．０ｍｍ、内径２．０ｍｍ、最大細孔径が０．３μｍのポリエチレン多孔質中空糸を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２００ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン多孔質中空糸をガラス反応管に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。ここに４０℃に調整したグリシジルメタクリレート（ＧＭＡ）３体積部、及びメタノール９７体積部よりなる反応液を、多孔質中空糸１質量部に対し２０質量部注入した後、１２分間密閉状態で静置してグラフト重合反応を施し、多孔質中空糸にグラフト鎖を導入した。なお、反応液は予め窒素でバブリングして、反応液内の酸素を窒素置換した。
【００７４】
グラフト重合反応後、反応管内の反応液を除去した。次いで、反応管内にジメチルスルホキシドを入れて多孔質中空糸を洗浄することにより、残存したグリシジルメタクリレート、そのオリゴマー及び多孔質中空糸に固定されなかったグラフト鎖を除去した。
【００７５】
洗浄液を除去した後、さらにジメチルスルホシキドを入れて２回洗浄を行った。メタノールを用いて同様にして洗浄を３回行った。洗浄後の多孔質中空糸を乾燥し、重量を測定したところ、グラフト鎖が導入されたポリエチレン多孔質中空糸の重量はグラフト鎖導入前の１５０％であり、下記式（１）で算出される、基材重量に対するグラフト鎖の重量比として定義されるグラフト率（ｄｇ）は５０％であった。
式（１） ｄｇ ＝ （ｗ1 − ｗ0） ／ ｗ0
ここでｗ0は反応前のポリエチレン多孔質中空糸の重量、ｗ1はグラフト鎖が導入されたポリエチレン多孔質中空糸の重量である。
【００７６】
５０％のグラフト率は、下記式（２）によって算出される、基材ポリエチレンの骨格単位であるＣＨ2基（分子量１４）のモル数に対して導入されたＧＭＡ（分子量１４２）のモル数が４．９２％であることに相当する。
式（２） 導入ＧＭＡのモル数％ ＝ （グラフト率 ／ １４２） ／ （１００ ／ １４） × １００
【００７７】
固体ＮＭＲ法により、グラフト反応後の多孔質中空糸中のポリエチレン骨格単位ＣＨ2基のモル数と、グラフト鎖を構成するＧＭＡに特有なエステル基（ＣＯＯ基）のモル数と、の比を測定した。
【００７８】
測定はグラフト反応後の多孔質中空糸を凍結粉砕した粉末サンプル０．５ｇを用いて、Ｂｒｕｋｅｒ Ｂｉｏｓｐｉｎ社製ＤＳＸ４００を使用し、核種を13Ｃとして、Ｈｉｇｈ Ｐｏｗｅｒ Ｄｅｃｏｕｐｌｉｎｇ法（ＨＰＤＥＣ法）の定量モードにより、待ち時間１００ｓ、積算１０００回の条件で、室温下で測定を行った。
【００７９】
得られたＮＭＲスペクトルのエステル基に対応するピーク面積と、ＣＨ2基に対応するピーク面積との比が、ＧＭＡとＣＨ2基のモル数の比に対応することから、測定結果よりＣＨ2基のモル数に対する導入されたＧＭＡのモル数を算出したところ、４．９％と得られた。これはグラフト率４９．７％に相当し、グラフト反応後のサンプルを固体ＮＭＲ法で測定することにより、グラフト率が得られることが示された。
【００８０】
（ｉｉ）共重合リガンドの合成
エチレンジアミン（ＥＤＡ）２０体積部、及び純水８０体積部からなるＥＤＡ溶液と、ジエチレングリコールジグリシジルエーテル（ＤＥＧ−ＤＧＥ）２０体積部、イソプロパノール４０体積部、及び純水４０体積部からなるＤＥＧ−ＤＧＥ溶液をそれぞれ調整し、１０℃に冷却した。その後、１０℃のウォーターバス中で撹拌しながら、ＥＤＡ溶液３８体積部に対し、ＤＥＧ−ＤＧＥ溶液６２体積部を、３滴／秒ずつ混合し、ＥＤＡと、ＤＥＧ−ＤＧＥと、の共重合体からなる共重合リガンドを調整した。さらに、共重合リガンドを含む溶液６６体積部に対し、イソプロパノール３４体積部添加し、溶液のイソプロパノール最終比が５０体積部となるように調節した。
【００８１】
得られた共重合リガンドにおいて、ＥＤＡのモル比率は５０％であり、ＤＥＧ−ＤＧＥのモル比率は５０％であった。
【００８２】
（ｉｉｉ）共重合リガンドのグラフト鎖への固定
ガラス反応管に、グラフト鎖を導入した、乾燥した多孔質中空糸を乾燥重量で１質量部、さらに（ｉｉ）で調整した共重合リガンド導入のための反応溶液９９質量部入れ、撹拌後４０℃に調整した。ガラス反応管を密閉して７２時間静置し、グラフト鎖のエポキシ基を開環し、共重合リガンドを導入した。
【００８３】
反応後の多孔質中空糸膜を、イソプロパノール及び純水で十分洗浄し、真空乾燥後の重量を測定した。その結果、共重合リガンドを導入する前に比べて、多孔質中空糸の重量が１０６．６％に増加しており、エポキシ基が反応して、共重合リガンドが導入されていることが示された。
【００８４】
（実施例２：ヘキサンジアミンと、ヘキサンジオールジグリシジルエーテルと、の共重合リガンドが固定された多孔質吸着膜）
【００８５】
実施例１の（ｉｉ）において、ヘキサンジアミン（ＨＤＡ）を純水に溶解させ、１．９ｍｏｌ／ＬのＨＤＡ溶液と、ヘキサンジオールジグリシジルエーテル（ＨＤＯ−ＤＧＥ）２０体積部、イソプロパノール４０体積部、及び純水４０体積部からなるＨＤＯ−ＤＧＥ溶液を調整した。さらに、ＨＤＡ溶液５０体積部に対し、ＨＤＯ−ＤＧＥ溶液５０体積部を混合し、ＨＤＡと、ＨＤＯ−ＤＧＥと、の共重合体からなる共重合リガンドを調製した。その後、共重合リガンドを含む溶液６３体積部に対し、イソプロパノール３７体積部添加した。
【００８６】
得られた共重合リガンドにおいて、ＨＤＡのモル比率は５１％であり、ＨＥＧ−ＤＧＥのモル比率は４９％であった。それ以外は、実施例１と同じ操作を実施した。
【００８７】
得られた中空糸多孔膜は、共重合リガンドを導入する前に比べて、重量が１０６．９％に増加しており、エポキシ基が反応して、共重合リガンドが導入されていることが示された。
【００８８】
（実施例３：ヘキサンジアミンと、シクロヘキサンジメタノールジグリシジルエーテルと、の共重合リガンドが固定された多孔質吸着膜）
【００８９】
実施例１の（ｉｉ）において、ヘキサンジアミン（ＨＤＡ）を純水に溶解させ、１．５ｍｏｌ／ＬのＨＤＡ溶液と、シクロヘキサンジメタノールジグリシジルエーテル（ＣＨＤＭ−ＤＧＥ）２０体積部、イソプロパノール４０体積部、及び純水４０体積部からなるＣＨＤＭ−ＤＧＥ溶液を調整した。さらに、ＨＤＡ溶液５０体積部に対し、ＣＨＤＭ−ＤＧＥ溶液５０体積部を混合し、ＨＤＡと、ＣＨＤＭ−ＤＧＥと、の共重合体からなる共重合リガンドを調製した。その後、共重合リガンドを含む溶液６３体積部に対し、イソプロパノール３７体積部添加した。
【００９０】
得られた共重合リガンドにおいて、ＨＤＡのモル比率は４９％であり、ＣＨＤＭ−ＤＧＥのモル比率は５１％であった。それ以外は、実施例１と同じ操作を実施した。
【００９１】
得られた中空糸多孔膜は、共重合リガンドを導入する前に比べて、重量が１０８．１％に増加しており、エポキシ基が反応して、共重合リガンドが導入されていることが示された。
【００９２】
（実施例４：ウシ血清アルブミンを用いたタンパク質吸着能評価）
（ｉｖ）ＮａＣｌ濃度が０ｍｏｌ／Ｌのときのタンパク質吸着能評価
実施例１で得られた中空糸多孔膜を用いて、膜体積０．３８ｍＬ、膜面積４．１ｃｍ2のモジュールを作製した。このモジュールにＮａＣｌ濃度が０ｍｏｌ／Ｌの２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を３０ｍＬ通液して平衡化した後、緩衝液にウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を混合して、濃度を１ｍｇ／ｍＬに調整したＢＳＡ溶液を３０ｍＬ通液し、フロースルーにて得られる画分を回収した。次に、緩衝液を１０ｍＬ通液して、中空糸多孔膜中の非吸着のＢＳＡを洗浄し、洗浄にて得られる画分を回収した。次に１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ溶液を１０ｍＬ通液して、中空糸多孔膜中に吸着しているＢＳＡを溶出し、溶出にて得られる画分を回収した。得られたフロースルー、洗浄及び溶出回収液の量を測定すると共に、吸光度計で波長２８０ｎｍの吸光度を測定し、アルブミンの吸光係数０．６を用いて濃度を求めた結果、中空糸多孔膜のＢＳＡ吸着容量は１２．２ｍｇ／ｍＬであった。
【００９３】
また、実施例２で得られた中空糸多孔膜を用いて、膜体積０．３８ｍＬ、膜面積４．１ｃｍ2の単糸モジュールを作製した。上記と同様にして、吸着の際のＮａＣｌ濃度が０ｍｏｌ／ＬのときのＢＳＡの吸着容量を求めた結果、中空糸多孔膜のＢＳＡ吸着容量は１０．８ｍｇ／ｍＬであった。
【００９４】
さらに、実施例３で得られた中空糸多孔膜を用いて、膜体積０．３８ｍＬ、膜面積４．１ｃｍ2の単糸モジュールを作製した。上記と同様にして、吸着の際のＮａＣｌ濃度が０ｍｏｌ／ＬのときのＢＳＡの吸着容量を求めた結果、中空糸多孔膜のＢＳＡ吸着容量は１３．５ｍｇ／ｍＬであった。
【００９５】
（ｖ）ＮａＣｌ濃度が０．１５ｍｏｌ／Ｌのときのタンパク質吸着能評価
（ｉｖ）において、緩衝液を２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ０．１５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）にした以外は、同じ操作を実施した。実施例１で得られた中空糸多孔膜のＢＳＡ吸着容量は５．９ｍｇ／ｍＬであった。
【００９６】
また、実施例２で得られた中空糸多孔膜の、吸着の際のＮａＣｌ濃度が０．１５ｍｏｌ／ＬのときのＢＳＡ吸着容量は４．８ｍｇ／ｍＬであった。
【００９７】
また、実施例３で得られた中空糸多孔膜の、吸着の際のＮａＣｌ濃度が０．１５ｍｏｌ／ＬのときのＢＳＡ吸着容量は５．１ｍｇ／ｍＬであった。
【００９８】
（ｖｉ）塩濃度が変化したときのタンパク質吸着能変化
実施例１で得られた中空糸多孔膜について、緩衝液が２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）であって、吸着の際のＮａＣｌ濃度が０．１５ｍｏｌ／ＬであるときのＢＳＡの吸着容量は、吸着の際のＮａＣｌ濃度が０ｍｏｌ／ＬであるときのＢＳＡの吸着容量に比べて、４８．４％であった。
【００９９】
実施例２で得られた中空糸多孔膜について、緩衝液が２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）であって、吸着の際のＮａＣｌ濃度が０．１５ｍｏｌ／ＬであるときのＢＳＡの吸着容量は、吸着の際のＮａＣｌ濃度が０ｍｏｌ／ＬであるときのＢＳＡの吸着容量に比べて、４４．４％であった。
【０１００】
実施例３で得られた中空糸多孔膜について、緩衝液が２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）であって、吸着の際のＮａＣｌ濃度が０．１５ｍｏｌ／ＬであるときのＢＳＡの吸着容量は、吸着の際のＮａＣｌ濃度が０ｍｏｌ／ＬであるときのＢＳＡの吸着容量に比べて、３７．８％であった。
【０１０１】
（比較例１：陰イオン交換リガンドが固定された多孔質吸着膜）
実施例１の（ｉ）によって得られた、グラフト鎖を導入した中空糸多孔膜を、メタノールに１０分以上浸漬して膨潤させた後、純水に浸漬して水置換した。また、精製水１２．５ｍＬと、１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ水溶液１２．５ｍＬと、を混合し、ここに、１．１９ｇのトリメチルアミン塩酸塩加えて、反応液を作製した。次に、上記（ｉ）で得られたグラフト鎖導入後の中空糸多孔膜の乾燥重量に対して２５質量部の反応液をガラス反応管に入れ、４０℃に調整した。その後、反応液に、純水浸漬後のグラフト鎖を導入した中空糸多孔膜を挿入し、２４時間静置して、グラフト鎖のエポキシ基をトリメチルアミノ基に置換し、トリメチルアミノ基がグラフト鎖を介して固定された中空糸多孔膜を得た。
【０１０２】
得られた中空糸多孔膜は、トリメチルアミノ基を導入する前に比べて、重量が１１３．２％に増加しており、エポキシ基が反応して、トリメチルアミノ基が導入されていることが示された。
【０１０３】
得られた中空糸多孔膜を用いて、膜体積０．３８ｍＬ、膜面積４．１ｃｍ2の単糸モジュールを作製した。実施例３と同様にして、目的タンパク質としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を１ｍｇ／ｍＬ含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を通液し、ＢＳＡの吸着容量を求めた。
【０１０４】
吸着の際のＮａＣｌ濃度が０ｍｏｌ／Ｌのときのタンパク質吸着能は、４０．７ｍｇ／ｍＬであった。また、吸着の際のＮａＣｌ濃度が０．１５ｍｏｌ／Ｌのときのタンパク質吸着能は、１．７ｍｇ／ｍＬであった。
【０１０５】
よって、塩濃度が変化したときのタンパク質吸着能変化は、緩衝液が２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）であって、吸着の際のＮａＣｌ濃度が０．１５ｍｏｌ／ＬであるときのＢＳＡの吸着容量は、吸着の際のＮａＣｌ濃度が０ｍｏｌ／ＬであるときのＢＳＡの吸着容量に比べて、４．１％であった。
【０１０６】
このことから、本実施の形態の方法に比べて、比較例１に係る中空糸多孔膜は、電気伝導度の高い溶液におけるタンパク質吸着能の低下が著しく、塩濃度に対するプロセスウィンドウが狭いことが分かった。
【０１０７】
（比較例２：市販の膜）
市販のアニオン交換基を有する膜として、ザルトリウス製Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑ ＭＡ７５（リンカー：グラフト鎖、リガンド：４級アンモニウム、膜体積２．０６ｍＬ）、及びポール製Ｍｕｓｔａｎｇ Ｑ Ａｃｒｏｄｉｓｃ（リンカー：スペーサー基、リガンド：４級アミン、膜体積０．１８ｍＬ）の２種類を用い、実施例３と同様にして、目的タンパク質としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を１ｍｇ／ｍＬ含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を通液し、ＢＳＡの吸着容量を求めた。
【０１０８】
吸着の際のＮａＣｌ濃度が０ｍｏｌ／Ｌのときのタンパク質吸着能は、それぞれ、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑが２６．２ｍｇ／ｍＬ、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｑが５６．２ｍｇ／ｍＬであった。
【０１０９】
また、吸着の際のＮａＣｌ濃度が０．１５ｍｏｌ／Ｌのときのタンパク質吸着能は、それぞれ、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑが２．４ｍｇ／ｍＬ、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｑが３．３ｍｇ／ｍＬであった。
【０１１０】
よって、塩濃度が変化したときのタンパク質吸着能変化は、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑについて、緩衝液が２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）であって、吸着の際のＮａＣｌ濃度が０．１５ｍｏｌ／ＬであるときのＢＳＡの吸着容量は、吸着の際のＮａＣｌ濃度が０ｍｏｌ／ＬであるときのＢＳＡの吸着容量に比べて、９．１％であった。また、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｑについて、緩衝液が２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）であって、吸着の際のＮａＣｌ濃度が０．１５ｍｏｌ／ＬであるときのＢＳＡの吸着容量は、吸着の際のＮａＣｌ濃度が０ｍｏｌ／ＬであるときのＢＳＡの吸着容量に比べて、５．９％であった。
【０１１１】
このことから、本実施の形態の方法に比べて、比較例２に係る膜は、電気伝導度の高い溶液におけるタンパク質吸着能の低下が著しく、塩濃度に対するプロセスウィンドウが狭いことが分かった。
【０１１２】
（実施例６：フロースルーモードによる夾雑物の吸着除去）
（ｖｉｉ）抗体含有細胞培養液の調製
無血清培地にて培養したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の培養液（電気伝導度８．７ｍＳ／ｃｍ、細胞密度１．１×１０7／ｍＬ）１９６ｍＬに抗体５０ｍｇ／ｍＬを含むヒトγ−グロブリン溶液（ベネシス社、ヴェノグロブリン）４ｍＬを添加し、０．４５μｍ精密ろ過膜（ザルトリウス製、ミニザルト１６５５５Ｋ）を透過させることにより、ｐＨ７．４で抗体１ｍｇ／ｍＬを含有する細胞培養液を調製した。
【０１１３】
得られた細胞培養液中の代表的な夾雑物であるＨＣＰ濃度を、ＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。Ｃｙｇｎｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製、ＣＨＯ Ｈｏｓｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔの９６ウェルプレートに細胞培養液を滴下し、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製、Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ Ｖｉｓｉｂｌｅ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ ＩＩ９６のプレートリーダーを用いてＨＣＰ濃度を測定した。その結果、細胞培養液中のＨＣＰ濃度は、３５４μｇ／ｍＬであった。
【０１１４】
他の代表的な夾雑物であるＤＮＡの定量は、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ（登録商標）ｄｓＤＮＡ ＨＳ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを用いて評価する細胞培養液を処理した後、Ｑｕｂｉｔ（登録商標）フルオロメーターを用いて行った。その結果、細胞培養液中のＤＮＡ濃度は７５６０ｎｇ／ｍＬであった。
【０１１５】
（ｖｉｉｉ）プロテインＡカラムを用いた抗体精製
（ｖｉｉ）で得られた抗体含有細胞培養液２５ｍＬを０．２μｍ除菌膜（ザルトリウス製、Ｍｉｎｉｓａｒｔ ｐｌｕｓ）に通液した後、２０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍＬで平衡化したプロテインＡカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製、ＨｉＴｒａｐ ＰｒｏｔｅｉｎＡ ＨＰ １ｍＬ）に１０ｍＬ添加し、抗体を吸着させた。カラムに上記緩衝液２０ｍＬを通液して洗浄した後、０．１ｍｏｌ／Ｌのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）を１０ｍＬ通液して、抗体を溶出回収した。得られた溶出回収液に、ほぼ等量の１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．２）を添加し中和した後、少量の１．５ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で溶出回収液をｐＨ８．０に調整し、抗体の精製液２０ｍＬを得た。精製液はプロテインＡカラムに通液する前に対して２倍希釈されている。
【０１１６】
得られた抗体の精製液中のＨＣＰ濃度を（ｖｉｉ）と同様にして測定した結果、３．０２μｇ／ｍＬであった。また、（ｖｉｉ）と同様にしてＤＮＡ濃度を測定した結果、６７．５ｎｇ／ｍＬであった。さらに、得られた溶出回収液を、２０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）により１０倍希釈し、波長２８０ｎｍの吸光度を測定し、抗体の吸光係数Ｅ1% 280nm ＝ １４を用いてＬａｍｂｅｒｔ−Ｂｅｅｒの法則に従って濃度を求めたところ、０．４６ｇ／Ｌであり、２倍希釈されていることから、得られた抗体のアフィニティークロマトグラフィー後の回収率は９２％であった。
【０１１７】
（ｉｘ）固定された多孔質吸着膜による夾雑物除去
実施例１で得られた中空糸多孔膜を用いて、膜体積０．５４ｍＬ、膜面積６．４ｃｍ2のモジュールを作成した。このモジュールに２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を２０ｍＬ通液して平衡化した後、（ｖｉｉｉ）で得られたアフィニティークロマトグラフィー後の抗体の精製液を２０ｍＬ通液し、フロースルーにて得られる画分を回収した。得られたフロースルー回収液中のＨＣＰ濃度を（ｖｉｉ）と同様にして測定した結果、３０ｎｇ／ｍＬであり、フロースルーによりＨＣＰ含有量は約１００分の１に低下した。また、（ｖｉｉ）と同様にしてＤＮＡ濃度を測定した結果、検出限界（１０ｎｇ／ｍＬ）以下であった。さらに、得られた回収液を２０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）により１０倍希釈し、波長２８０ｎｍの吸光度を測定し、抗体の吸光係数Ｅ1% 280nm ＝ １４を用いてＬａｍｂｅｒｔ−Ｂｅｅｒの法則に従って濃度を求めたところ、０．９０ｇ／Ｌであり、抗体が中空糸多孔膜には吸着されなかったことを示していた。
【０１１８】
以上の実施例で示したように、本実施の形態に係る中空糸多孔膜を用いることにより、夾雑物を有効に除去し、速やかに抗体を精製することが可能であった。
【産業上の利用可能性】
【０１１９】
本発明により、塩濃度に対するプロセスウィンドウを広げることができ、電気伝導度が高い溶液から、目的タンパク質を効率よく精製することが可能な、共重合リガンドを有する多孔質吸着膜を得ることができる。また、アフィニティークロマトグラフィー工程後の中間精製において、ＨＣＰ、ＤＮＡなどの夾雑物を有効に且つ迅速に除去できるので、細胞培養液に含まれる目的タンパク質の精製において、産業上の利用可能性を有する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細孔を有する基材と、リガンドと、前記基材及び前記リガンド間を結合しているリンカーと、を備える多孔質吸着膜であって、
前記リガンドは、
（ａ）アニオン交換能を有す基を主鎖に持つモノマー由来ユニットと、
（ｂ）疎水性相互作用を有す基を主鎖に持つモノマー由来ユニットと、
を含み、
前記（ａ）のユニットと、前記（ｂ）のユニットと、は、共重合体を形成している、多孔質吸着膜。
【請求項２】
前記（ａ）のモノマーが、ジアミン化合物モノマーである、請求項１に記載の多孔質吸着膜。
【請求項３】
前記（ａ）のモノマーが、アニオン交換基と、疎水性相互作用を有す基を主鎖に持つモノマー由来ユニットである、請求項１乃至２のいずれか１項に記載の多孔質吸着膜。
【請求項４】
前記ジアミン化合物モノマーが、下記構造式（１）の構造を有し、
構造式（１） ＮＨ2 − Ｒ1 − ＮＨ2
前記構造式（１）のＲ1が、炭素数２から６のアルキレン基からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の多孔質吸着膜。
【請求項５】
前記（ｂ）のモノマーが、ジグリシジル化合物モノマーである、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の多孔質吸着膜。
【請求項６】
前記ジグリシジル化合物モノマーが、下記構造式（２）の構造を有し、
【化１】
前記構造式（２）のＲ2が、炭素数２から６のアルキレン基、炭素数２から６のアルキレン基エーテル、又は六員環からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の多孔質吸着膜。
【請求項７】
前記リンカーが、前記基材の表面に導入されたグラフト鎖である、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の多孔質吸着膜。
【請求項８】
前記グラフト鎖がメタクリル酸グリシジルの重合体である、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の多孔質吸着膜。
【請求項９】
前記多孔質吸着膜の基材の材料が、ポリオレフィン系重合体を含む、請求項１乃至８のいずれか１項に記載の多孔質吸着膜。
【請求項１０】
前記多孔質吸着膜が中空糸多孔膜である、請求項１乃至９のいずれか１項に記載の多孔質吸着膜。
【請求項１１】
前記多孔質吸着膜のタンパク質吸着容量をＣとして、０．１５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌの水溶液のイオン強度と同一のイオン強度のタンパク質溶液をろ過した場合の吸着容量Ｃ0.15が、ＮａＣｌを含まない水溶液のイオン強度と同一のイオン強度のタンパク質溶液をろ過した場合の吸着容量Ｃ0に対して、少なくとも３５％を下回らない、請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の多孔質吸着膜。
【請求項１２】
目的とするタンパク質と、夾雑物と、を含む混合溶液から、目的とするタンパク質を精製する方法であって、
請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の多孔質吸着膜を用いて前記混合溶液をろ過し、前記夾雑物を除去することを含む、タンパク質の精製方法。
【請求項１】
細孔を有する基材と、リガンドと、前記基材及び前記リガンド間を結合しているリンカーと、を備える多孔質吸着膜であって、
前記リガンドは、
（ａ）アニオン交換能を有す基を主鎖に持つモノマー由来ユニットと、
（ｂ）疎水性相互作用を有す基を主鎖に持つモノマー由来ユニットと、
を含み、
前記（ａ）のユニットと、前記（ｂ）のユニットと、は、共重合体を形成している、多孔質吸着膜。
【請求項２】
前記（ａ）のモノマーが、ジアミン化合物モノマーである、請求項１に記載の多孔質吸着膜。
【請求項３】
前記（ａ）のモノマーが、アニオン交換基と、疎水性相互作用を有す基を主鎖に持つモノマー由来ユニットである、請求項１乃至２のいずれか１項に記載の多孔質吸着膜。
【請求項４】
前記ジアミン化合物モノマーが、下記構造式（１）の構造を有し、
構造式（１） ＮＨ2 − Ｒ1 − ＮＨ2
前記構造式（１）のＲ1が、炭素数２から６のアルキレン基からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の多孔質吸着膜。
【請求項５】
前記（ｂ）のモノマーが、ジグリシジル化合物モノマーである、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の多孔質吸着膜。
【請求項６】
前記ジグリシジル化合物モノマーが、下記構造式（２）の構造を有し、
【化１】
前記構造式（２）のＲ2が、炭素数２から６のアルキレン基、炭素数２から６のアルキレン基エーテル、又は六員環からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の多孔質吸着膜。
【請求項７】
前記リンカーが、前記基材の表面に導入されたグラフト鎖である、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の多孔質吸着膜。
【請求項８】
前記グラフト鎖がメタクリル酸グリシジルの重合体である、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の多孔質吸着膜。
【請求項９】
前記多孔質吸着膜の基材の材料が、ポリオレフィン系重合体を含む、請求項１乃至８のいずれか１項に記載の多孔質吸着膜。
【請求項１０】
前記多孔質吸着膜が中空糸多孔膜である、請求項１乃至９のいずれか１項に記載の多孔質吸着膜。
【請求項１１】
前記多孔質吸着膜のタンパク質吸着容量をＣとして、０．１５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌの水溶液のイオン強度と同一のイオン強度のタンパク質溶液をろ過した場合の吸着容量Ｃ0.15が、ＮａＣｌを含まない水溶液のイオン強度と同一のイオン強度のタンパク質溶液をろ過した場合の吸着容量Ｃ0に対して、少なくとも３５％を下回らない、請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の多孔質吸着膜。
【請求項１２】
目的とするタンパク質と、夾雑物と、を含む混合溶液から、目的とするタンパク質を精製する方法であって、
請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の多孔質吸着膜を用いて前記混合溶液をろ過し、前記夾雑物を除去することを含む、タンパク質の精製方法。
【公開番号】特開２０１２−２１１１１０（Ｐ２０１２−２１１１１０Ａ）
【公開日】平成２４年１１月１日（２０１２．１１．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−７７８６２（Ｐ２０１１−７７８６２）
【出願日】平成２３年３月３１日（２０１１．３．３１）
【出願人】（５０７３６５２０４）旭化成メディカル株式会社 (65)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月１日（２０１２．１１．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年３月３１日（２０１１．３．３１）
【出願人】（５０７３６５２０４）旭化成メディカル株式会社 (65)
【Ｆターム（参考）】
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