多方向マイクロ流体装置および方法
多方向マイクロ流体装置、およびこれを使用する方法が、提供される。本発明の態様は、２つ以上の方向的に異なる流動場に試料を曝すように構成されており、分離媒体および結合媒体を含む、マイクロ流体装置を含み、結合媒体は分離媒体と流体連絡している。装置、ならびに装置を含むシステムおよびキットを使用する方法も、提供される。装置、システム、および方法は、診断および検証アッセイを含む、様々な異なる用途における利用を見出す。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
米国特許法§１１９（ｅ）によって、本願は、参照によりその全体が本願に組み込まれる、２００９年５月１９日出願の米国特許仮出願第６１／１７９，６４９号、および２００９年１１月２日出願の米国特許仮出願第６１／２５７，３６１号の出願日の優先権を主張する。
【０００２】
政府支援の参照
本発明は、認可番号ＮＩＤＣＲ ５Ｕ０１ＤＥ０１４９６１で、国立衛生研究所の認可の下、部分的に政府の援助を受けてなされた。政府は、本発明において特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
与えられた試料内の特定の被検体を検出するために、様々な分析手法が使用されてもよい。たとえば、試料中のタンパク質を分離するためにゲル電気泳動を使用し、その後標的タンパク質に特異的な抗体を探ることによって、試料中のタンパク質を検出するために、ウェスタンブロット法が使用されることが可能である。サザンブロット法は、電気泳動分離されたＤＮＡ断片の濾過膜への移送、およびその後のプローブハイブリダイゼーションによる断片検出を組み合わせている。ノーザンブロット法は、ＲＮＡ試料をサイズによって分離するための電気泳動の使用と、標的配列の一部または全体を補完するハイブリダイゼーションプローブを用いた検出とを、包含する。イースタンブロット法は、脂質、炭水化物、リン酸化、またはその他のいずれかのタンパク質修飾に特異的なプローブを使用して、翻訳後修飾のための電気泳動分離されたタンパク質を分析することによって、タンパク質翻訳後修飾（ＰＴＭ）を検出するために使用されることが可能である。ファーウェスタンブロット法は、ウェスタンブロット法と似ているが、しかし対象とするタンパク質を結合するために非抗体タンパク質を使用し、このためタンパク質間相互作用を検出するために使用されることが可能である。サウスウェスタンブロット法は、試料中のタンパク質を分離するためにゲル電気泳動を使用し、その後ゲノムＤＮＡ断片でプローブすることによって、ＤＮＡ結合タンパク質を検出するために使用されることが可能な手法である。
【０００４】
従来のブロット法は、上記で論じられたように、高スループット試料分析または資源不足の設定における操作のいずれかを要する用途の性能要求には、及ばない可能性がある。ブロット法は、熟練技術者によって実行される、労働集約的な、時間のかかる、多段階手順を必要とする可能性があり、このため臨床設定での使用には非実用的な可能性がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
多方向マイクロ流体装置、およびこれを使用する方法が、提供される。本発明の態様は、２つ以上の方向的に異なる流動場に試料を曝すように構成されており、分離媒体および結合媒体を含む、マイクロ流体装置を含み、結合媒体は分離媒体と流体連絡している。装置、ならびに装置を含むシステムおよびキットを使用する方法も、提供される。装置、システム、および方法は、診断および検証アッセイを含む、様々な異なる用途における利用を見出す。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１Ａ】従来の免疫ブロット法手順の図である。
【図１Ｂ】本開示の実施形態による、試料中の被検体の存在を検出するための方法の図である。
【図１Ｃ】本開示の実施形態による、マイクロ流体装置およびマイクロ流体装置内の結合媒体の明視野および蛍光画像の図である。
【図２】本開示の実施形態による、分離試料を結合媒体に移送する前（図２Ａ）および後（図２Ｂ）のタンパク質の電気泳動図である。
【図３】本開示の実施形態による、陽性および陰性タンパク質対照を使用してアッセイの特異性を検査する実験の、蛍光画像である。画像は、チャネル内抗体官能化膜に結合されたタンパク質の蛍光発光を示す。
【図４Ａ】本開示の実施形態による、マイクロ流体装置内の抗体官能化結合媒体に結合されたタンパク質の用量反応の蛍光画像である。
【図４Ｂ】本開示の実施形態による、結合媒体に結合された被検体における、蛍光シグナル対タンパク質濃度のグラフである。
【図５Ａ】本開示の実施形態による、分離媒体を含むマイクロ流体装置の図である。
【図５Ｂ】本開示の実施形態によるマイクロ流体装置を使用する、広い分子範囲のタンパク質ラダーの高分解能電気泳動分析を示す図である。
【図６】本開示の実施形態による、８％合計アクリルアミドゲル（上のグラフ）および４％合計アクリルアミドゲル（下のグラフ）における、５つの低分子量タンパク質の電気泳動図である。
【図７Ａ】本開示の実施形態によるマイクロ流体装置の図である。
【図７Ｂ】本開示の実施形態による、試料中の被検体の分離、移送、および検出の図である。
【図８】本開示の実施形態による、試料中の複数の被検体の多重分析向けに構成されたマイクロ流体装置の図である。
【図９Ａ】本開示の実施形態による、分離媒体の上流に濃縮媒体を含むマイクロ流体装置の図および画像（挿入画）である。
【図９Ｂ】本開示の実施形態による、分離媒体の上流に濃縮媒体を含むマイクロ流体装置を通る試料の電気泳動運動の画像である。
【図１０】本開示の実施形態による、第一マイクロ流体チャネルから第二マイクロ流体チャネルへの、対象とする被検体の選択的な移送の図である。
【図１１】本開示の実施形態による、結合媒体の図、および陰性および陽性対照に曝露された結合媒体の画像である。
【図１２Ａ】本開示の実施形態による、装荷媒体、分離媒体、および結合媒体を収容するチャンバ（挿入画）を含むマイクロ流体装置の明視野画像である。
【図１２Ｂ】本開示の実施形態によるチャンバの画像である。
【図１２Ｃ】本開示の実施形態によるチャンバを含むマイクロ流体装置の図である。
【図１２Ｄ】本開示の実施形態による、試料中の被検体の分離、移送、および検出の図が重ねられた画像である。
【図１３】本開示の実施形態によるマイクロ流体装置内のタンパク質ラダーの分離の画像およびグラフである。
【図１４Ａ】本開示の実施形態によるマイクロ流体装置を使用する、蛍光標識されたタンパク質の分離の画像である。
【図１４Ｂ】本開示の実施形態によるマイクロ流体装置における、分離媒体から結合媒体への蛍光標識されたタンパク質の移送の画像である。
【図１５Ａ】本開示の実施形態によるマイクロ流体装置についてシミュレートされた電場分布の画像である。
【図１５Ｂ】本開示の実施形態によるマイクロ流体装置についてシミュレートされた電場分布の画像である。
【図１５Ｃ】本開示の実施形態によるマイクロ流体装置についてシミュレートされた電場分布の画像である。
【図１５Ｄ】本開示の実施形態によるマイクロ流体装置についてシミュレートされた電場分布の画像である。
【図１５Ｅ】本開示の実施形態による、印加された電場の均一性を検査するマイクロ流体装置の画像である。
【図１５Ｆ】本開示の実施形態による、印加された電場の均一性を検査するマイクロ流体装置の画像である。
【図１６】本開示の実施形態による、電圧整形を備えるおよび備えないマイクロ流体装置を通る試料の電気運動のＣＣＤ画像である。
【図１７】本開示の実施形態による、試料中の複数の被検体の分離、移送、および検出の図が重ねられた画像である。
【図１８】本開示の実施形態による、試料中の複数の被検体の分離、移送、および検出の画像である。
【図１９】本開示の実施形態による、陰性対照に対する試料中の被検体の分離、移送、および検出の画像である。
【図２０】本開示の実施形態による、試料中の複数の被検体の多重検出の画像である。
【図２１】本開示の実施形態による、抗原捕捉効率対結合媒体幅（μｍ）のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
多方向マイクロ流体装置、およびこれを使用する方法が、提供される。本発明の態様は、２つ以上の方向的に異なる電場に試料を曝すように構成されており、分離媒体および結合媒体を含む、マイクロ流体装置を含み、結合媒体は分離媒体と流体連絡している。装置、ならびに装置を含むシステムおよびキットを使用する方法も、提供される。装置、システム、および方法は、診断および検証アッセイを含む、様々な異なる用途における利用を見出す。
【０００８】
本開示の態様は、流体試料中の被検体を検出し、２つ以上の方向的に異なる流動場に試料を曝すように構成されている、マイクロ流体装置を含み、マイクロ流体装置は：第一方向軸を備える分離流路を有する分離媒体；および第二方向軸を備える標識流路を有する結合媒体を含み、結合媒体は分離媒体と流体連絡している。
【０００９】
特定の実施形態において、分離媒体はポリマーゲルを含む。場合により、結合媒体は、担体と安定的に会合した結合メンバーを含む。場合により、担体は膜を含む。場合により、担体はポリマーゲルを含む。マイクロ流体装置の特定の実施形態は、タンパク質またはその結合断片を含む、結合メンバーを含む。たとえば、タンパク質は抗体であってもよい。場合により、被検体は蛍光標識を含む。
【００１０】
特定の実施形態において、第二方向軸は、第一方向軸に対して直交している。場合により、マイクロ流体装置は、分離媒体および結合媒体を収容するチャンバを含む。
【００１１】
本開示の態様は、流体試料中の被検体を検出する方法も含む。方法は：２つ以上の方向的に異なる流動場に試料を曝すように構成されているマイクロ流体装置内に流体試料を導入するステップと；分離試料を生成するために分離媒体を通るように試料を配向するステップと；分離試料中の被検体を検出するステップと、を含む。上述のように、マイクロ流体装置は：第一方向軸を備える分離流路を有する分離媒体；および第二方向軸を備える標識流路を有する結合媒体を含み、結合媒体は分離媒体と流体連絡している。
【００１２】
特定の実施形態において、方法は、分離試料を結合媒体に移送するステップを含む。別の実施形態において、方法は、結合メンバーを分離試料に移動するステップを含む。場合により、方法は、分離試料を生成するために分離媒体を通るように試料を配向するステップに先立って、試料を濃縮するステップをさらに含む。
【００１３】
対象とする方法の実施形態は、方法が診断方法である場合を含む。これに加えて、場合により、方法は検証方法である。
【００１４】
本開示の態様は、付加的に、流体試料中の被検体を検出するシステムを含む。システムは、本明細書に記載されるマイクロ流体装置、および検出器を含む。上述のように、マイクロ流体装置は、２つ以上の方向的に異なる流動場に試料を曝すように構成されており、マイクロ流体装置は：第一方向軸を備える分離流路を有する分離媒体；および第二方向軸を備える標識流路を有する結合媒体を含み、結合媒体は分離媒体と流体連絡している。
【００１５】
特定の実施形態において、検出器は、光電子増倍管（ＰＭＴ）、電荷結合素子（ＣＣＤ）、強化電荷結合素子（ＩＣＣＤ）、相補型金属酸化物半導体（ＣＭＯＳ）センサー、視感色彩読み取り、またはフォトダイオードである。場合により、システムは、マイクロ流体装置を通るように流体を配向するように構成されている、マイクロ流体素子をさらに含む。
【００１６】
本開示の態様は、付加的に、本明細書に記載されるマイクロ流体装置および緩衝液を含む、キットを含む。上述のように、マイクロ流体装置は：第一方向軸を備える分離流路を有する分離媒体；および第二方向軸を備える標識流路を有する結合媒体を含み、結合媒体は分離媒体と流体連絡している。
【００１７】
以下に、まず対象とするマイクロ流体装置が、より詳細に記載される。対象とするマイクロ流体装置の利用を見出す、流体試料中の被検体を検出する方法もまた、開示される。これに加えて、対象とするマイクロ流体装置を含むシステムおよびキットもまた、記載される。
【００１８】
マイクロ流体装置
本開示の実施形態は、多方向マイクロ流体装置を含む。「多方向」とは、２つ以上の方向、３つ以上の方向、４つ以上の方向など、１つより多い方向を意味する。特定の実施形態において、２つ以上の方向が共平面となるように、２つ以上の方向は１つの平面に含まれる。場合により、２つの方向が、異なる、交差する平面に含まれるように、２つ以上の方向は共平面ではない。これらの場合、２つ以上の方向は、多次元であってもよい。「多次元」とは、二次元、三次元など、１つより多い次元を意味する。多次元である方向は、三次元空間の領域を占有してもよい。たとえば、共平面ではない２つの方向は、２つの方向を含む交差する平面が三次元空間の領域を占有するように、異なった、交差する平面にそれぞれ含まれてもよい。
【００１９】
特定の実施形態において、マイクロ流体装置は、２つ以上の方向、３つ以上の方向、４つ以上の方向など、１つより多い方向（たとえば、マイクロ流体装置は多方向性である）に、流体を配向するように構成されている。たとえば、マイクロ流体装置は、２つの方向、３つの方向、４つの方向などに、流体を配向するように構成されていてもよい。場合により、マイクロ流体装置は多次元的である。たとえば、マイクロ流体装置は２つ以上の方向に流体を配向するように構成されていてもよく、ここで２つ以上の方向が２つ以上の異なる交差する平面に含まれるように、２つ以上の方向は共平面ではない。これらの場合、２つ以上の方向を含む交差する平面は、三次元空間の領域を占有してもよい。たとえば、マイクロ流体装置は、マイクロ流体装置が平面的になるように、基板に含まれていてもよい。マイクロ流体装置は、この平面内の複数の方向に、流体を配向するように構成されていてもよい。特定の実施形態において、マイクロ流体装置は、三次元など、多次元において流体を配向するように構成されている。たとえば、マイクロ流体装置は、同じ平面内の複数の方向に流体を配向するほか、マイクロ流体装置が三次元マイクロ流体装置として構成されるように、非共平面方向にも流体を配向するように構成されていてもよい。
【００２０】
特定の実施形態において、マイクロ流体装置は分離媒体を含む。分離媒体は、試料中の被検体を互いに分離するように構成されていてもよい。場合により、分離媒体は、被検体の物理的特性に基づいて、試料中の被検体を分離するように構成されている。たとえば、分離媒体は、被検体の分子量、サイズ、電荷（たとえば電荷質量比）、等電点などに基づいて、試料中の被検体を分離するように構成されていてもよい。特定の例において、分離媒体は、被検体の分子量に基づいて、試料中の被検体を分離するように構成されている。場合により、分離媒体は、被検体の等電点に基づいて（たとえば等電点収束）、試料中の被検体を分離するように構成されている。分離媒体は、試料中の被検体を分離して、被検体の明確で検出可能なバンドにするように、構成されていてもよい。「バンド」とは、被検体の濃度が周囲の領域よりも著しく高い、明確で検出可能な領域を意味する。被検体の各バンドは、単一の被検体、またはいくつかの被検体を含んでもよく、被検体の単一バンドの各被検体は、上述のように、実質的に類似の物理的特性を有する。
【００２１】
特定の実施形態において、分離媒体は、試料が分離媒体を横断する際に、試料中の被検体を分離するように構成されている。場合により、分離媒体は、試料が分離媒体を通って流れる際に、試料中の被検体を分離するように構成されている。分離媒体の態様は、分離媒体が方向軸を備える流路を有することを含む。「流路」とは、流体試料が動くときに移動する方向を意味する。場合により、流路は、試料が分離媒体、結合媒体などの媒体を横断する際に、試料が移動する方向である。先に示されたように、分離媒体は、方向軸を備える流路を有してもよい。いくつかの実施形態において、分離流路の方向軸は、分離媒体の長さに揃えられている。これらの実施形態において、試料は、分離媒体の分離流路の方向に、分離媒体を横断する（たとえば、試料は分離媒体の長さに沿って分離媒体を横断してもよい）。場合により、分離媒体の長さは、分離媒体の幅の２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍など、分離媒体の幅よりも大きい。場合により、分離媒体の分離流路は、マイクロ流体チャネルなどのチャネルによって定義される。分離媒体は、試料がマイクロ流体チャネルを通って流れる際に試料が分離媒体を横断するように、マイクロ流体チャネルに含まれてもよい。
【００２２】
特定の実施形態において、分離媒体は、ポリマーゲルなどのポリマーを含む。ポリマーゲルは、ゲル電気泳動に適したゲルであってもよい。ポリマーゲルは、ポリアクリルアミドゲル、アガロースゲルなどを含んでもよいが、これらに限定されない。分離媒体の分解能は、たとえば、ただしこれらに限定されないが、孔径、総ポリマー含有量（たとえば総アクリルアミド含有量）、架橋剤の濃度、印加された電場、アッセイ時間など、様々な要因に依存してもよい。たとえば、分離媒体の分解能は、分離媒体の孔径に依存してもよい。場合により、孔径は、分離媒体の総ポリマー含有量および／または分離媒体中の架橋剤の濃度に依存する。特定の例において、分離媒体は、５，０００Ｄａ以下、または２，０００Ｄａ以下、または１，０００Ｄａ以下、たとえば５００Ｄａ以下、または１００Ｄａ以下を含む、７，０００Ｄａ以下などの、１０，０００Ｄａ以下の分子量差で被検体を分解するように構成されている。場合により、分離媒体は、５％から１０％を含む、たとえば３％から１５％など、１％から２０％の範囲の総アクリルアミド含有量を有する、ポリアクリルアミドゲルを含んでもよい。
【００２３】
場合により、マイクロ流体装置は、分離媒体の上流に位置する濃縮媒体を含む。「上流」とは、流体の流れの源の近位に位置していることを意味する。濃縮媒体は、試料が分離媒体に接触する前に、試料を濃縮するように構成されていてもよい。濃縮媒体は、小さい孔径を有するポリマーゲルなどの、ポリマーゲルを含んでもよい。たとえば、濃縮媒体は、５％から８％、または５％から７％を含む、たとえば５％から９％など、５％から１０％の範囲の総アクリルアミド含有量を有する、ポリアクリルアミドゲルを含んでもよい。場合により、濃縮媒体は、６％の総ポリアクリルアミド含有量を有する。特定の実施形態において、濃縮媒体は、サイズ排除膜などの膜を含む。濃縮媒体の小さい孔径は、濃縮媒体を通る試料の電気泳動を遅らせ、そうして分離媒体に接触する前に試料を濃縮する。場合により、濃縮膜は、試料の濃度を２倍以上、４倍以上、１０倍以上、２５倍以上、５０倍以上、１００倍以上、５００倍以上、１０００倍以上、２５００倍以上などに、増加させるように構成されている。
【００２４】
特定の実施形態において、対象とするマイクロ流体装置は、分離媒体の下流に位置する結合媒体を含む。「下流」とは、流体の流れの源の遠位に位置していることを意味する。結合媒体は、方向軸を備える標識流路を有してもよい。場合により、標識流路は、試料または被検体が結合媒体を横断する際に試料が移動する方向である。試料または被検体は、結合媒体の標識流路の方向に、結合媒体を横断してもよい（たとえば、試料は結合媒体の方向軸に沿って分離媒体を横断してもよい）。結合媒体は、分離媒体の方向軸と同じかまたは異なる方向軸を有してもよい。たとえば、分離媒体は第一方向軸を有してもよく、結合媒体は第二方向軸を有してもよい。第一方向軸は、第二方向軸と同じ方向に揃えられていてもよい。場合により、第一方向軸は、第二方向軸と異なる方向に揃えられている。第一方向軸が第二方向軸とは異なる方向に揃えられている場合、上述のように、マイクロ流体装置は多次元（たとえば多方向）マイクロ流体装置である。たとえば、第二方向軸は、第一方向軸に対して１２０度以下、９０度以下、６０度以下、４５度以下、または３０度以下を含む、１５０度以下、１３５度以下など、第一方向軸に対して１８０度以下の角度であってもよい。特定の実施形態において、第二方向軸は第一方向軸に対して直交している。
【００２５】
特定の場合、結合媒体は、ポリマーゲルまたはポリマーモノリスなど、ポリマーを含む。モノリスとは、単一の、連続構造体を意味する。モノリスは、同じ物理および化学成分を備える単一の領域を含んでもよく、またはこれらの物理および化学成分に関して異なる、２つ以上の領域を含んでもよい。ポリマーゲルは、ゲル電気泳動に適したゲルであってもよい。ポリマーゲルは、ポリアクリルアミドゲル、アガロースゲルなどを含んでもよいが、これらに限定されない。場合により、結合媒体は、５％から１０％を含む、３％から１５％など、１％から２０％の範囲の総アクリルアミド含有量を有する、ポリアクリルアミドゲルを含んでもよい。ポリマーモノリスは、クロマトグラフィに適したモノリスであってもよい。ポリマーモノリスは、アクリレートポリマー、アルキルアクリレートポリマー、アルキルアルキルアクリレートポリマー、それらの共重合体などを含んでもよいが、これらに限定されない。場合により、結合媒体は膜を含む。膜は、ニトロセルロース膜、ポリマー膜などを含んでもよい。場合により、結合媒体はビーズを含む。ビーズは、ニトロセルロースビーズ、ポリマービーズ、それらの組合せなどを含んでもよい。
【００２６】
特定の実施形態において、結合媒体は、対象とする被検体に結合し、これを保持するように構成されていてもよい。場合により、結合媒体に結合された被検体は、被検体の検出を容易にする。たとえば、結合媒体は、担体と安定的に会合した結合メンバーを含んでもよい。「安定的に会合した」とは、ある部分が、標準状態において、別の部分または構造体と結合もしくは会合していることを意味する。特定の例において、上述のように、担体は、ポリマーゲルまたは膜である。結合は、イオン結合、疎水性相互作用、水素結合、ファンデルワールス力（たとえば、ロンドン分散力）、双極子間相互作用などの、ただしこれらに限定されない、共有結合および非共有相互作用を含んでもよい。特定の実施形態において、結合メンバーは、担体に架橋または共重合されるなど、担体に共有的に結合されてもよい。結合メンバーと担体との間の共有結合は、以下のものなど、ただしこれらに限定されない反応基を包含する共有結合を含む：結合メンバーおよび担体の両方のアミノ／アミド基との共有結合を形成するために、二官能性架橋剤のグルタルアルデヒドを利用する、グルタルアルデヒド；結合メンバーに共有結合するためにグリシジル官能基（すなわちエポキシ官能基）を、および担体に結合するためにメタクリレート基を利用する、グリシジルメタクリレート；担体に共有的に結合するために、結合メンバーのアミン基をアシル化するために使用され得る、４−ニトロフェニルメタクリレート；担体への取り込みのため、結合メンバー上のアミノ基と相互作用するためにＮ−ヒドロキシスクシンイミジル基を利用する、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルアクリレート（ＮＨＳ−アクリレート）。
【００２７】
結合メンバーは、標的とされるタンパク質、または核酸配列、または生体高分子（たとえば対象とする被検体）に具体的に結合するいずれの分子であってもよい。被検体の性質に応じて、結合メンバーは、（ａ）核酸の検出のための標的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列の特異領域を補完するＤＮＡの一本鎖；（ｂ）タンパク質およびペプチドの検出のためのペプチド被検体のエピトープに対する抗体；（ｃ）特異的結合対のメンバーなど、いずれかの認識分子、であってもよいが、これらに限定されない。たとえば、適切な特異的結合対は：受容体／リガンド対のメンバー；受容体のリガンド結合部；抗体／抗原対のメンバー；抗体の抗原−結合断片；ハプテン；レクチン／炭水化物対のメンバー；酵素／基板対のメンバー；ビオチン／アビジン；ビオチン／ストレプトアビジン；ジゴキシン／抗ジゴキシン；ＤＮＡまたはＲＮＡアプタマー結合対のメンバー；ペプチドアプタマー結合対のメンバー；などを含むが、これらに限定されない。
【００２８】
特定の実施形態において、結合メンバーは抗体を含む。結合メンバー抗体は、対象とする被検体と特異的に結合してもよい。場合により、結合メンバーは、上述のように、担体に安定的に会合している。担体結合された結合メンバーは、対象とする被検体と特異的に結合するように構成されていてもよい。したがって、担体結合された結合メンバーとの対象とする被検体の特異的結合は、対象とする被検体を担体と間接的に結合されてもよい。対象とする被検体の担体との結合は、被検体を担体と安定的に会合させ、こうして対象とする被検体の検出を容易にしてもよい。
【００２９】
特定の実施形態において、２つ以上の異なる結合メンバーは、結合媒体と安定的に会合している。２つ以上の異なる結合メンバーは、同じまたは異なる被検体と特異的に結合してもよい。場合により、２つ以上の異なる結合メンバーは、同じ被検体と特異的に結合してもよい。たとえば、２つ以上の異なる結合メンバーは、同じ被検体上の異なるエピトープに特異的な異なる抗体を含んでもよい。別の場合には、２つ以上の異なる結合メンバーは、異なる被検体と特異的に結合してもよい。たとえば、２つ以上の異なる結合メンバーは、異なる被検体上のエピトープに特異的な異なる抗体を含んでもよい。
【００３０】
マイクロ流体装置の態様は、分離媒体が結合媒体と流体連絡している実施形態を含む。特定の実施形態において、結合媒体は分離媒体の下流に配置されている。マイクロ流体装置は、まず分離試料を生成するために、分離媒体を通じて試料を配向するように構成されていてもよい。場合により、分離媒体および結合媒体は、互いに流体連絡しているが、しかし互いに直接物理的には接触していない。たとえば、分離媒体は、チャネルまたは別の媒体と流体連絡していてもよく、これはひいては結合媒体と流体連絡している。特定の実施形態において、マイクロ流体装置は、分離媒体および結合媒体が互いに直接的に流体連絡するように、構成されている。たとえば、分離媒体は、結合媒体と直接接触していてもよい。場合により、分離媒体および結合媒体は、共重合など、互いに結合されている。分離媒体が結合媒体と直接流体連絡している実施形態は、部分の損失を最小限に抑えながら、分離媒体から結合媒体への部分の移送、または結合媒体から分離媒体への部分の移送を容易にし得る。場合により、マイクロ流体装置は、部分がある媒体から別の媒体へ（たとえば、分離媒体から結合媒体へ、または結合媒体から分離媒体へ）定量的に移送されるように、構成されている。
【００３１】
特定の実施形態において、マイクロ流体装置は、結合媒体を通じて分離試料を配向するように構成されている。場合により、マイクロ流体装置は、試料または被検体が、分離媒体から介在するチャネルまたは媒体まで横断し、その後結合媒体まで横断するように、構成されている。別の場合には、マイクロ流体装置は、試料または被検体が分離媒体から結合媒体まで直接横断できるように、分離媒体および結合媒体が互いに直接流体連絡するように、構成されている。上述のように、結合媒体は、分離試料中の対象とする被検体の検出のために被検体に結合するように構成された、結合メンバーを含んでもよい。
【００３２】
特定の場合、結合媒体は、結合媒体に結合されない結合メンバーを含む。たとえば、結合媒体は、緩衝液など、流体中に懸濁または溶解している結合メンバーを含んでもよい。これらの場合、装置は、結合媒体から分離媒体に向かって結合メンバーを配向するように構成されている。たとえば、装置は、結合媒体から分離媒体の分離流路に向かって結合メンバーを配向するように構成されていてもよい。上述のように、結合メンバーは、分離試料中の対象とする被検体の検出のために被検体に結合するように構成されていてもよい。場合により、マイクロ流体装置は、結合メンバーが結合媒体から介在するチャネルまたは媒体まで横断し、その後分離媒体まで横断するように、構成されている。別の場合には、マイクロ流体装置は、結合メンバーが結合媒体から分離媒体まで直接横断できるように、結合媒体および分離媒体が互いに直接流体連絡するように、構成されている。
【００３３】
場合により、マイクロ流体装置は、２つ以上の方向的に異なる流動場に試料を曝すように構成されている。「流動場」とは、各部分が実質的に同じ方向に領域を横断する領域を意味する。たとえば、流動場は、移動部分が実質的に同じ方向に媒体を通って移動する領域を、含んでもよい。流動場は、緩衝液、被検体、試薬などの部分が実質的に同じ方向に媒体を通って移動する、分離媒体、結合媒体、装荷媒体などの媒体を、含んでもよい。流動場は、印加された電場、圧力差、電気浸透などに誘導されてもよい。いくつかの実施形態において、２つ以上の流動場は、方向的に異なっていてもよい。たとえば、第一流動場は、分離媒体の分離流路の方向軸に揃えられていてもよい。第一流動場は、分離流路に沿って分離媒体を通じて試料または被検体を配向するように構成されていてもよい。第二流動場は、結合媒体の標識流路の方向軸に揃えられていてもよい。場合により、第二流動場は、標識流路に沿って結合媒体を通じて試料または被検体を配向するように構成されている。第二流動場は、対象とする被検体がその特定の結合メンバーと接触するように、結合媒体を通じて試料または被検体を配向するように構成されていてもよい。場合により、第二流動場は、標識流路に沿って結合媒体を通じて結合メンバーを配向するように構成されている。第二流動場は、結合メンバーがその対象とする特定の被検体と接触するように、結合媒体を通じて結合メンバーを配向するように構成されていてもよい。上述のように、特定の例において、標識流路の方向軸は、分離流路の方向軸に対して直交している。これらの例において、第二流動場は第一流動場に対して直交していてもよい。
【００３４】
特定の実施形態において、マイクロ流体装置は、２つ以上の方向的に異なる電場に試料を曝すように構成されている。電場は、マイクロ流体装置を通る試料の運動（たとえば、マイクロ流体装置の１つの領域からマイクロ流体装置の別の領域への試料の電気運動移送）を容易にし得る。電場はまた、上述のように、電気泳動（たとえば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ））による試料中の被検体の分離も容易にし得る。たとえば、電場は、マイクロ流体装置の分離媒体を通じて試料中の被検体を配向するように構成されていてもよい。電場は、被検体の物理的特性に基づく試料中の被検体の分離を容易にするように、構成されていてもよい。たとえば、電場は、被検体の分子量、サイズ、電荷（たとえば電荷質量比）、等電点などに基づく試料中の被検体の分離を容易にするように、構成されていてもよい。特定の例において、電場は、被検体の分子量に基づく試料中の被検体の分離を容易にするように、構成されていてもよい。場合により、電場は、被検体の等電点に基づく試料中の被検体の分離を容易にするように、構成されている。
【００３５】
いくつかの実施形態において、２つ以上の電場は方向的に異なっていてもよい。たとえば、第一電場は、分離媒体の分離流路の方向軸に揃えられていてもよい。第一電場は、分離流路に沿って分離媒体を通じて試料または被検体を配向するように構成されていてもよい。第二電場は、結合媒体の標識流路の方向軸に揃えられていてもよい。場合により、第二電場は、標識流路に沿って結合媒体を通じて試料または被検体を配向するように構成されている。第二電場は、対象とする被検体がその特定の結合メンバーと接触するように、結合媒体を通じて試料または被検体を配向するように構成されていてもよい。場合により、第二電場は、標識流路に沿って結合媒体を通じて結合メンバーを配向するように構成されている。第二電場は、結合メンバーが対象とするその特定の被検体と接触するように、結合媒体を通じて結合メンバーを配向するように構成されていてもよい。上述のように、特定の例において、標識流路の方向軸は、分離流路の方向軸に対して直交している。これらの例において、第二電場は、第一電場に対して直交していてもよい。
【００３６】
特定の実施形態において、マイクロ流体装置は、電場を発生するように構成された１つ以上の電場発生器を含む。電場発生器は、分離媒体、結合媒体、装荷媒体などのうちの１つ以上など、マイクロ流体装置の様々な領域に、電場を印加するように構成されていてもよい。電場発生器は、マイクロ流体装置内の様々な媒体を通じて試料中の被検体および部分を電気運動的に移送するように、構成されていてもよい。特定の例において、電場発生器は、マイクロ流体装置上に配置されるなど、マイクロ流体装置の近位にあってもよい。場合により、電場発生器は、マイクロ流体装置から離れた位置にある。たとえば、電場発生器は、以下により詳細に記載されるように、被検体を検出するためのシステムに組み込まれてもよい。
【００３７】
マイクロ流体装置の態様は、移送流路を含む。移送流路は、結合媒体の標識流路と流体連絡していてもよい。たとえば、移送流路は、結合流路の下流に位置していてもよい。上述のように、結合媒体は、対象とする被検体に特異的に結合する結合メンバーを含んでもよい。対象としない部分は、結合メンバーによって結合されず、結合メンバーに結合することなく、結合媒体を横断してもよい。特定の実施形態において、移送流路は、結合媒体から離れる方へ対象としない部分を配向するように構成されている。たとえば、移送流路は、結合メンバーに結合することなく結合媒体を横断する、対象としない部分を、結合媒体から離れる方へ配向するように構成されていてもよい。特定の実施形態において、移送流路は、結合媒体内の化学的または物理的処置を通じてまたはそこへ向けて部分を配向するように、構成されている。たとえば、溶解した被検体は、化学的変性剤、リフォールディング化学薬品、洗剤などを通じて、推進されてもよい。
【００３８】
場合により、移送流路の下流末端は、移送流路が対象としない部分を排液リザーバに配向するように構成されるように、排液リザーバと流体連絡している。場合により、移送流路の下流末端は、移送流路が、結合メンバーに結合することなく結合媒体を通過する部分を、その部分のさらなる特徴付けのための二次分析装置に配向するように構成されるように、二次分析装置と流体連絡している。二次分析装置は、紫外分光計、赤外分光計、質量分析計、ＨＰＬＣ、親和性アッセイ装置などを含んでもよいが、これらに限定されない。場合により、二次分析装置は、マイクロ流体装置と同じ基板上に含まれる。これらの実施形態において、マイクロ流体装置および二次分析装置は、１つ以上の異なる分析法による試料の分析のため、単一の基板上に設けられてもよい。特定の実施形態において、二次分析装置はシステムの一部として含まれ、システムはマイクロ流体装置および１つ以上の個別の二次分析装置を含む。上述のように、マイクロ流体装置および二次分析装置は、マイクロ流体装置を通過する部分がその部分のさらなる特徴付けのために二次分析装置に配向されるように、互いに流体連絡していてもよい。
【００３９】
いくつかの態様において、分離および結合媒体は、図１Ｃおよび図７Ａに示されるように、個別のチャネルの異なる長さにおいて設けられている。これらの実施形態において、マイクロ流体装置は、互いに流体連絡しているマイクロ流体チャネルを含むように構成されている。マイクロ流体チャネルは、チャネルの長さがチャネルの幅よりも大きい、長尺チャネルであってもよい。たとえば、マイクロ流体チャネルの長さは、マイクロ流体チャネルの幅の２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍など、マイクロ流体チャネルの幅よりも大きくてもよい。
【００４０】
マイクロ流体装置は、上述のように、分離媒体を含む分離チャネルを含んでもよい。マイクロ流体装置は、上述のように、結合媒体を含む結合チャネルを含んでもよい。場合により、分離チャネル内の分離媒体が結合チャネル内の結合媒体と流体連絡するように、分離チャネルは結合チャネルと流体連絡している。マイクロ流体装置のいくつかの実施形態は、分離チャネルおよび結合チャネルを含み、ここで分離チャネルは第一方向軸を有し、結合チャネルは第二方向軸を有する。第一方向軸および第二方向軸は、互いに同じ方向に揃えられていてもよく、あるいは互いに異なる方向に揃えられていてもよい。たとえば、分離チャネルの方向軸は、結合チャネルに対して１２０度以下、９０度以下、６０度以下、４５度以下、または３０度以下を含む、１５０度以下、１３５度以下など、結合チャネルに対して１８０度以下の角度であってもよい。特定の実施形態において、結合チャネルの方向軸は、分離チャネルの方向軸に対して直交している。
【００４１】
マイクロ流体チャネルの実施形態は、マイクロ流体装置と適合し、マイクロ流体装置内で使用される試料、緩衝液、試薬などと適合する、いずれかの適切な材料で作られてもよい。場合により、マイクロ流体チャネルは、対象とするマイクロ流体装置および方法において使用される試料、緩衝液、試薬などに対して不活性な（たとえば、分解または反応しない）材料で作られる。たとえば、マイクロ流体チャネルは、ガラス、石英、ポリマー、エラストマー、紙、それらの組合せなどの、ただしこれらに限定されない材料で作られてもよい。
【００４２】
特定の実施形態において、マイクロ流体チャネルは、たとえば５０μｍから１５０μｍなど、１０μｍから２００μｍを含む、５μｍから３００μｍなど、１μｍから５００μｍの範囲の幅を有する。場合により、マイクロ流体チャネルは１００μｍの幅を有する。特定の実施形態において、マイクロ流体チャネルは、１０μｍから５０μｍを含む、５μｍから１００μｍなど、１μｍから２００μｍの範囲の深さを有する。場合により、マイクロ流体チャネルは２５μｍの深さを有する。
【００４３】
場合により、マイクロ流体装置は、１つ以上の試料注入ポートを含む。試料注入ポートは、試料がマイクロ流体装置内に導入されることを可能にするように構成されていてもよい。試料注入ポートは、分離媒体と流体連絡していてもよい。場合により、試料注入ポートは、分離媒体の上流末端と流体連絡している。試料注入ポートは、流体が試料注入ポートから排出されるのを防止するように構成された構造を、さらに含んでもよい。たとえば、試料注入ポートは、たとえば、マイクロ流体装置内への試料の導入を可能にするために穿孔または開口され、その後試料および／または緩衝液を含む流体が試料注入ポートから排出されるのを実質的に防止するために再封止または閉鎖されてもよい、キャップ、弁、シールなどを含んでもよい。
【００４４】
図１Ｃは、マイクロ流体装置１０の図を示す。マイクロ流体装置１０は、結合媒体１２と流体連絡している分離媒体１１を含む。マイクロ流体装置１０はまた、流体注入口１３、排液排出口１４、試料注入口１５、流体排出口１６、流体注入口１７、および流体排出口１８など、様々な注入口および排出口も含む。流体排出口１６は、分離された被検体を、必要に応じて排液リザーバまたは下流の二次分析装置へ配向するように構成されていてもよい。同様に、流体排出口１８は、非結合の被検体を、必要に応じて排液リザーバまたは下流の二次分析装置へ配向するように構成されていてもよい。図１Ｃはまた、マイクロ流体装置内の結合媒体の明視野および蛍光画像も示す。
【００４５】
図７Ａもまた、上述のように、互いに流体連絡しているマイクロ流体チャネルを含む、マイクロ流体装置７００の図を示す。マイクロ流体装置７００は、分離媒体７０２を含む分離チャネル７０１を含む。分離チャネルは、結合媒体７０４を含む結合チャネル７０３と流体連絡している。マイクロ流体装置７００もまた、以下のものなど、ただしこれらに限定されない、様々な注入口および排出口を含んでもよい：マイクロ流体装置７００内に向かって流体を配向するように構成されていてもよい、流体注入口７０５；排液をマイクロ流体装置７００から離れる方へ配向するように構成されていてもよい、排液排出口７０６；分離媒体より上流のマイクロ流体装置７００内に試料を配向するように構成されていてもよい、試料注入口７０７；結合チャネル７０３に移送されなかった分離された被検体を、必要に応じて排液リザーバまたは下流の二次分析装置へ配向するように構成されていてもよい、流体排出口７０８；移送チャネル７１１へ流体を配向するように構成されていてもよい、流体注入口７０９；および非結合の被検体を、必要に応じて排液リザーバまたは下流の二次分析装置へ配向するように構成されていてもよい、流体排出口７１０。
【００４６】
いくつかの態様において、分離および結合媒体は、図１２〜図１６に示されるように、単一の共通チャンバ内に設けられている。これらの実施形態において、マイクロ流体装置はチャンバを含む。チャンバは、分離媒体および結合媒体を含んでもよい。上述のように、分離媒体は、結合媒体と、直接物理接触などにより、流体連絡していてもよい。場合により、分離媒体は、結合媒体に共重合または架橋されるなど、結合媒体に結合される。したがって、チャンバは、互いに流体連絡している分離媒体および結合媒体の両方を含むように構成されてもよい。チャンバは、分離媒体の分離流路が結合媒体の標識流路より上流になるように、分離媒体および結合媒体を含むように構成されてもよい。
【００４７】
分離媒体および結合媒体に加えて、チャンバは、装荷媒体も含んでもよい。装荷媒体は、分離媒体と流体連絡していてもよい。場合により、装荷媒体は、分離媒体と直接物理接触している。たとえば、装荷媒体は、分離媒体に共重合または架橋されるなど、分離媒体に結合されてもよい。装荷媒体は、試料が分離媒体に接触する前に装荷媒体に接触するように、分離媒体より上流に位置してもよい。特定の実施形態において、装荷媒体は、分離媒体との試料の接触を容易にする。たとえば、装荷媒体は、試料が分離媒体と接触する前に、試料を濃縮するように構成されていてもよい。特定の実施形態において、装荷媒体は、異なる物理的および／または化学的特性を有する、２つ以上の領域を含んでもよい。装荷媒体は、装荷領域および積層領域を含んでもよい。装荷媒体は、積層領域より上流に装荷領域を含むように構成されていてもよい。
【００４８】
特定の実施形態において、装荷媒体は、ポリマーゲルなどのポリマーを含む。ポリマーゲルは、ゲル電気泳動に適したゲルであってもよい。ポリマーゲルは、ポリアクリルアミドゲル、アガロースゲルなどを含んでもよいが、これらに限定されない。場合により、装荷領域は、大きい孔径を有するポリマーゲルを含む。たとえば、装荷領域は、３％以下または２％以下を含む、４％以下など、５％以下の総アクリルアミド含有量を有する、ポリアクリルアミドゲルを含んでもよい。場合により、装荷領域は３％の総ポリアクリルアミド含有量を有する。場合により、装荷媒体の積層領域は、試料が分離媒体に接触する前に、試料を濃縮するように構成されていてもよい。積層領域は、小さい孔径を有するポリマーゲルを含んでもよい。たとえば、積層領域は、５％から８％、または５％から７％を含む、５％から９％など、５％から１０％の範囲の総アクリルアミド含有量を有する、ポリアクリルアミドゲルを含んでもよい。場合により、積層領域は６％の総ポリアクリルアミド含有量を有する。積層領域の小さい孔径は、積層領域を通る試料の電気泳動運動を遅らせ、そうして分離媒体に接触する前に試料を濃縮してもよい。
【００４９】
特定の例において、チャンバは、装荷媒体、分離媒体、および結合媒体を含む。チャンバは、上述のように、装荷媒体、分離媒体、および結合媒体が互いに流体連絡するように、装荷媒体、分離媒体、および結合媒体を含むように構成されていてもよい。たとえば、チャンバは、様々な領域を備える連続ポリマーゲルを含んでもよい。連続ポリマーゲルの各領域は、異なる物理的および／または化学的特性を有してもよい。連続ポリマーゲルは、装荷媒体を有する第一領域、分離媒体を有する第二領域、および結合媒体を有する第三領域を含んでもよい。ポリマーゲルの各領域の流路は、試料がまず装荷媒体に接触し、次に分離媒体に接触し、最後に結合媒体に接触するように、構成されていてもよい。
【００５０】
特定の実施形態において、ポリマーゲルは、０．５ｍｍから１．５ｍｍを含む、０．２ｍｍから２．５ｍｍなど、０．１ｍｍから５ｍｍの範囲の幅を有する。場合により、ポリマーゲルは１．０ｍｍの幅を有する。場合により、ポリマーゲルは、１ｍｍから２ｍｍを含む、０．５ｍｍから３ｍｍなど、０．５ｍｍから５ｍｍの範囲の長さを有する。特定の例において、ポリマーゲルは１．５ｍｍの長さを有する。特定の実施形態において、装荷媒体を含むポリマーゲルの第一領域は、０．５ｍｍから１．５ｍｍを含む、０．２ｍｍから２．５ｍｍなど、０．１ｍｍから５ｍｍの範囲の幅を有する。場合により、装荷媒体を含むポリマーゲルの第一領域は０．９ｍｍの幅を有する。場合により、装荷媒体を含むポリマーゲルの第一領域は、０．１ｍｍから０．５ｍｍを含む、０．１ｍｍから１ｍｍなど、０．１ｍｍから２ｍｍの範囲の長さを有する。特定の実施形態において、装荷媒体を含むポリマーゲルの第一領域は０．２ｍｍの長さを有する。特定の例において、分離媒体を含むポリマーゲルの第二領域は、０．５ｍｍから１．５ｍｍを含む、０．２ｍｍから２．５ｍｍなど、０．１ｍｍから５ｍｍの範囲の幅を有する。場合により、分離媒体を含むポリマーゲルの第二領域は０．９ｍｍの幅を有する。場合により、分離媒体を含むポリマーゲルの第二領域は、１ｍｍから２ｍｍを含む、０．５ｍｍから３ｍｍなど、０．５ｍｍから５ｍｍの範囲の長さを有する。特定の実施形態において、分離媒体を含むポリマーゲルの第二領域は１．３ｍｍの長さを有する。特定の例において、結合媒体を含むポリマーゲルの第三領域は、０．０５ｍｍから０．５ｍｍを含む、０．０１ｍｍから１ｍｍなど、０．０１ｍｍから２ｍｍの範囲の幅を有する。場合により、結合媒体を含むポリマーゲルの第三領域は０．１ｍｍの幅を有する。場合により、結合媒体を含むポリマーゲルの第三領域は、１ｍｍから２ｍｍを含む、０．５ｍｍから３ｍｍなど、０．５ｍｍから５ｍｍの範囲の長さを有する。特定の実施形態において、結合媒体を含むポリマーゲルの第三領域は１．５ｍｍの長さを有する。
【００５１】
特定の実施形態において、マイクロ流体装置は、１ｃｍから５ｍｍを含む、５ｃｍから５ｍｍなど、１０ｃｍから１ｍｍの範囲の幅を有する。場合により、マイクロ流体は、１０ｃｍから５ｍｍ、または１ｃｍから５ｍｍを含む、５０ｃｍから１ｍｍなど、１００ｃｍから１ｍｍの範囲の長さを有する。特定の態様において、マイクロ流体装置は、たとえば１０ｃｍ２以下、または５ｃｍ２以下、または３ｃｍ２以下、または１ｃｍ２以下、または０．５ｃｍ２以下、または０．２５ｃｍ２以下、または０．１ｃｍ２以下など、５０ｃｍ２以下を含む、１００ｃｍ２以下など、１０００ｃｍ２以下の面積を有する。
【００５２】
特定の実施形態において、マイクロ流体装置は実質的に透明である。「透明」とは、物質が、可視光線をその物質に透過させることを意味する。いくつかの実施形態において、透明なマイクロ流体装置は、たとえば蛍光標識などの検出可能標識を含む被検体など、結合媒体に結合された被検体の検出を容易にする。場合により、マイクロ流体装置は実質的に不透明である。「不透明」とは、物質が、可視光線をその物質に透過させないことを意味する。特定の例において、不透明なマイクロ流体装置は、光の存在下で反応または分解する被検体など、光に対して感受性の被検体の分析を、容易にする可能性がある。
【００５３】
方法
方法の実施形態は、たとえば試料中の１つ以上の被検体の存在または不存在を判定するなど、被検体が試料中に存在するか否かを判定することを、対象にしている。方法の特定の実施形態において、試料中の１つ以上の被検体の存在は、定質的にまたは定量的に判定されてもよい。定質的判定は、試料中の被検体の存在に関して単純なイエス／ノーの結果がユーザに提供される判定を含む。定量的判定は、試料中の被検体の量に関してたとえば低、中、高などのおおまかな結果がユーザに提供される準定量的判定、および被検体の濃度の正確な測定値がユーザに提供される詳細な結果の両方を含む。
【００５４】
特定の実施形態において、マイクロ流体装置は、試料中の１つ以上の被検体の存在を検出するように構成されている。対象とするマイクロ流体装置を用いて分析されてもよい試料は多様であり、単純および複合試料の両方を含む。単純試料は、対象とする被検体を含む試料であって、対象としない１つ以上の分子実体を含んでも含まなくてもよく、ここでこれら非対象分子実体の数は、たとえば１０以下、５以下など、小さくてよい。単純試料は、たとえば干渉する可能性のある分子実体を試料から除去するために、何らかの方法で処理された、初期の生体またはその他の試料を含んでもよい。「複合試料」とは、対象とする被検体を含んでも含まなくてもよいが、対象としない多くの異なるタンパク質およびその他の分子も含む試料を、意味する。場合により、対象とする方法で分析された複合試料は、分子構造または物理的特性に関して（たとえば、分子量、サイズ、電荷、等電点など）互いに異なる、たとえば１０３以上、１０４以上（たとえば１５，０００；２０，０００または２５，０００以上）など、１００以上を含む、２０以上など、１０以上の明確な（すなわち異なる）分子実体を含むものである。
【００５５】
特定の実施形態において、対象とする試料は、尿、血液、血清、血漿、唾液、精液、前立腺液、乳頭吸引液、涙液、汗、便、口腔粘膜採取物、脳脊髄液、細胞溶解物試料、羊水、胃腸液、生検組織（たとえば、レーザー・キャプチャー・マイクロダイセクション（ＬＣＭ）から得られる試料）などの、ただしこれらに限定されない、生体試料である。試料は、生体試料であってもよく、またはヒト、動物、植物、菌類、酵母、細菌、組織培養、ウイルス培養、またはそれらの組合せに由来する生体試料から、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、およびペプチドを成功裏に抽出するための従来の方法を用いて、抽出されてもよい。特定の実施形態において、試料は、流体中の被検体の溶液など、流体試料である。流体は、水、緩衝液などの、ただしこれらに限定されない、水溶液であってもよい。
【００５６】
上述のように、対象とする方法で分析されてもよい試料は、対象とする１つ以上の被検体を含んでもよい。検出可能な被検体の例は：たとえば二本または一本鎖ＤＮＡ、二本または一本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマーなどの、核酸；たとえば抗体、二重特異性抗体、Ｆａｂ断片、ＤＮＡまたはＲＮＡ結合タンパク質、リン酸化タンパク質（ホスホプロテオミクス）、ペプチドアプタマー、エピトープなど、修飾があるかまたはない、タンパク質およびペプチド；阻害物質、活性物質、リガンドなどの、小分子；オリゴまたは多糖；それらの混合物；などを含むが、これらに限定されない。
【００５７】
いくつかの実施形態において、対象とする被検体は、対象とする被検体の存在がその後検出され得るように、同定されることが可能である。被検体は、本明細書に記載される方法のいずれによって同定されてもよい。たとえば、被検体は、検出可能標識を含んでもよい。検出可能標識は、蛍光標識、比色標識、化学発光標識、酵素結合試薬、マルチカラー試薬、アビジン−ストレプトアビジン会合検出試薬、不可視検出可能標識（たとえば、放射標識、金粒子、磁気標識、電気読み取り値、密度シグナルなど）などを含むが、これらに限定されない。特定の実施形態において、検出可能標識は蛍光標識である。蛍光標識は、蛍光検出器によって検出可能な、標識部分である。たとえば、対象とする被検体への蛍光標識の結合は、対象とする被検体が蛍光検出器によって検出されることを可能にし得る。蛍光標識の例は、試薬と接触すると蛍光を発する蛍光分子、電磁放射線（たとえば、紫外線、可視光線、Ｘ線など）で照射されたときに蛍光を発する蛍光分子、などを含むが、これらに限定されない。
【００５８】
適切な蛍光分子（蛍光体）は、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、カルボキシフルオレセインのスクシンイミジルエステル、フルオレセインのスクシンイミジルエステル、フルオロセインジクロロトリアジンの５−異性体、ケージドカルボキシフルオレセイン−アラニン−カルボキシアミド、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５１４；ルシファーイエロー、アクリジンオレンジ、ローダミン、テトラメチルローダミン、テキサスレッド、ヨウ化プロピジウム、ＪＣ−１（５，５’，６，６’−テトラクロロ−１，１’，３，３’−テトラエチルベンゾイミダゾイルカルボシアニンヨウ化物）、テトラブロモローダミン１２３、ローダミン６Ｇ、ＴＭＲＭ（テトラメチルローダミンメチルエステル）、ＴＭＲＥ（テトラメチルローダミンエチルエステル）、テトラメチルロサミン、ローダミンＢおよび４−ジメチルアミノテトラメチルロサミン、緑色蛍光タンパク質、青色偏移緑色蛍光タンパク質、シアン偏移緑色蛍光タンパク質、赤色偏移緑色蛍光タンパク質、黄色偏移緑色蛍光タンパク質、４−アセトアミド−４’−イソチオシアネートスチルベン−２，２’ジスルホン酸；アクリジン、アクリジンイソチオシアネートなどのアクリジンおよび誘導体；５−（２’−アミノエチル）アミノナフタリン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）；４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニル）フェニル］ナフト−アリミド−３，５ジスルホン酸塩；Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド；アントラニルアミド；４，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−４−ボラ−３ａ，４ａジアザ−５−インダセン−３−プロピオニ−ｃ酸ＢＯＤＩＰＹ；カスケードブルー；ブリリアントイエロー；クマリンおよび誘導体：クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ，クマリン１２０）、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（クマリン１５１）；シアニン染料；シアノシン；４’，６−ジアミニジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）；５’，５”−ジブロモピロガロール−スルホナフタレイン（ブロモピロガロールレッド）；７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン；ジエチレントリアミンペンタアセテート；４，４’−ジイソチオシアナートジヒドロ−スチルベン−２−，２’−ジスルホン酸；４，４’−ジイソチオシアナートスチルベン−２，２’−ジスルホン酸；５−（ジメチルアミノ］ナフタリン−１−スルホニルクロリド（ＤＮＳ，ダンシルクロリド）；４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）；エオシンおよび誘導体：エオシン、エオシンイソチオシアネート、エリスロシンおよび誘導体：エリスロシンＢ、エリスロシン、イソチオシアネート；エチジウム；フルオレセインおよび誘導体：５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノ− −フルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’，７’ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ＱＦＩＴＣ、（ＸＲＩＴＣ）；フルオレスカミン；ＩＲ１４４；ＩＲ１４４６；マラカイトグリーンイソチオシアネート；４−メチルウンベリ−フェロネオルト（ｆｅｒｏｎｅｏｒｔｈｏ）クレゾールフタレイン；ニトロチロシン；パラローザニリン；フェノールレッド；Ｂ−フィコエリトリン；ｏ−フタルジアルデヒド；ピレンおよび誘導体：ピレン、ピレン酪酸、スクシンイミジル１−ピレン；ブチラート量子ドット；リアクティブレッド４（チバクロン（商標）ブリリアントレッド３Ｂ−Ａ）ローダミンおよび誘導体：６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミンローダミンＢスルホニルクロリドローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアネート、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１のスルホニルクロリド誘導体（テキサスレッド）；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）；テトラメチルローダミン；テトラメチルホダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）；リボフラビン；５−（２’−アミノエチル）アミノナフタリン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、ロゾール酸；ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｏｒａｎｇｅ ５６０；テルビウムキレート誘導体；Ｃｙ３；Ｃｙ５；Ｃｙ５．５；Ｃｙ７；ＩＲＤ７００；ＩＲＤ８００；ラヨラブルー；フタロシアニン；およびナフタロシアニン、クマリンおよび関連染料、キサンテン染料、たとえばロドール、レソルフィン、ビマン、アクリジン、イソインドール、ダンシル染料、アミノフタルヒドラジド、たとえばルミノール、およびイソルミノール誘導体、アミノフタルイミド、アミノナフタルイミド、アミノベンゾフラン、アミノキノリン、ジシアノヒドロキノン、蛍光ユーロピウムおよびテルビウム錯体；これらの組合せなど、を含むが、これらに限定されない。適切な蛍光タンパク質および発色性タンパク質は、オワンクラゲに由来するＧＦＰまたはその誘導体、たとえば増強ＧＦＰなどの「ヒト化」誘導体；ウミシイタケ、レニラムレリ、チロサルクスゲルニなど、別の種からのＧＦＰ；「ヒト化」組み換えＧＦＰ（ｈｒＧＦＰ）；花虫類種からの様々な蛍光および着色タンパク質のいずれか；それらの組合せ；などを含むがこれらに限定されない、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含むが、これらに限定されない。
【００５９】
特定の実施形態において、方法は、マイクロ流体装置内に流体試料を導入することを含む。マイクロ流体装置内への流体試料の導入は、分離試料を生成するために分離媒体を通じて試料を配向することを含んでもよい。場合により、分離試料は、上述のように、試料が分離媒体を横断する際に、ゲル電気泳動によって生成される。分離試料は、被検体の明確で検出可能なバンドを含んでもよく、ここで各バンドは、実行されるゲル電気泳動のタイプに応じて、分子量、サイズ、電荷（たとえば電荷質量比）、等電点など、実質的に類似の特性を有する１つ以上の被検体を含む。
【００６０】
方法の態様は、分離試料を結合媒体に移送することも含む。分離試料中の被検体の特異的バンドは、選択的に結合媒体に移送されてもよい。場合により、方法は、結合媒体内で対象とする被検体を結合メンバーと接触させることを含む。結合メンバーは、被検体に特異的に結合してもよく、こうして被検体を結合媒体内に保持する。対象としない部分は、結合媒体内の結合メンバーによって特異的に結合されない。
【００６１】
特定の実施形態において、方法は、結合媒体に結合された被検体を検出することを含む。対象とする被検体の、結合媒体内の結合メンバーとの検出可能な結合は、試料中の対象とする被検体の存在を示す。結合媒体を横断し、結合媒体内の結合メンバーと結合しない、対象としない部分は、洗い流されるか、または、紫外分光計、赤外分光計、質量分析計、ＨＰＬＣ、親和性アッセイ装置などの、ただしこれらに限定されない、二次分析装置へ移送されてもよい。
【００６２】
特定の実施形態において、方法は、分離試料から結合メンバーを移送することを含む。結合メンバーは、結合媒体から、分離試料中の被検体の特異的バンドへ移送されてもよい。場合により、方法は、分離試料中の対象とする被検体に結合メンバーを接触させることを含む。場合により、方法は、分離試料を分離媒体と安定的に会合させることを含む。たとえば、方法は、分離試料を分離媒体に結合させることを含んでもよい。分離試料は、分離試料を化学試薬に接触させること、分離試料を分離媒体に架橋させること、などによって、分離媒体に化学的または物理的に結合されてもよい。結合メンバーは、対象とする被検体に特異的に結合され、こうして、結合された結合メンバーがその後検出され得る分離媒体中に、結合メンバーを保持する。分離試料中の被検体に特異的に結合されない結合メンバーは、分離媒体を通じて移送されてもよい。
【００６３】
場合により、対象としない部分への結合メンバーの非特異的結合による偽陽性シグナルは、最小化される。たとえば、対象としない別の部分への結合メンバーの非特異的結合は最小化されてもよく、対象としない部分は検出されない。対象としない部分は、結合メンバーと結合することなく、結合媒体を横断する。このため、結合メンバーは、対象とする被検体にのみ、特異的に結合してもよい。対象とする被検体のみへの結合メンバーの特異的結合は、複合試料中の対象とする被検体の特異的検出を容易にし得る。
【００６４】
特定の実施形態において、方法は、分離媒体を通じて試料を配向する前に、試料を濃縮、希釈、または緩衝液交換することを含む。試料の濃縮は、試料を分離媒体に接触させる前に、試料を濃縮媒体に接触させることを含んでもよい。上述のように、濃縮媒体は、小孔径ポリマーゲル、膜（たとえばサイズ排除膜）、それらの組合せ、などを含んでもよい。試料が分離媒体を横断する際に、被検体の各分離されたバンドはあまり拡散しないので、試料を分離媒体に接触させる前の試料の濃縮は、分離試料中の被検体のバンド間の溶解の増加を促進し得る。試料の希釈は、試料を分離媒体に接触させる前に、試料を追加緩衝液に接触させることを含んでもよい。試料の緩衝液交換は、試料を分離媒体に接触させる前に、試料を緩衝液交換媒体に接触させることを含んでもよい。緩衝液交換媒体は、試料緩衝液とは異なる緩衝液を含んでもよい。緩衝液交換媒体は、分子篩、多孔性樹脂などを含んでもよいが、これらに限定されない。
【００６５】
特定の実施形態において、方法は、結合媒体中の結合メンバーによって結合されない部分を、結合媒体から離れる方へ移送することを含む。非結合部分は、結合媒体の標識流路と流体連絡している移送流路に向けて配向されてもよい。場合により、方法は、非結合部分を排液リザーバに移送することを含む。別の場合には、方法は、たとえば紫外分光計、赤外分光計、質量分析計、ＨＰＬＣ、親和性アッセイ装置などの、ただしこれらに限定されない、二次分析装置を用いた二次分析のため、非結合部分を結合媒体の下流に配向することを含む。
【００６６】
方法の実施形態はまた、結合媒体に結合された被検体を解放することも含んでもよい。解放は、結合された被検体を解放剤に接触させることを含んでもよい。解放剤は、被検体と結合メンバーとの間の結合相互作用を阻害するように構成されていてもよい。場合により、解放剤は、被検体と結合メンバーとの間の結合相互作用を阻害して、結合メンバーに被検体を解放させる、試薬、緩衝液などである。被検体を結合メンバーから解放した後、方法は、被検体を結合媒体から離れる方へ移相することを含んでもよい。たとえば、方法は、たとえば紫外分光計、赤外分光計、質量分析計、ＨＰＬＣ、親和性アッセイ装置などの、ただしこれらに限定されない、二次分析装置を用いた二次分析のため、解放された被検体を結合媒体の下流に配向することを含んでもよい。
【００６７】
いくつかの実施形態において、方法は、試料中の被検体のユニプレックス分析を含む。「ユニプレックス分析」とは、試料中の１つの被検体の存在を検出するために、試料が分析されることを意味する。たとえば、試料は、対象とする被検体、および対象とされないその他の分子実体の混合物を含んでもよい。場合により、方法は、試料混合物中の対象とする被検体の存在を判定するために、試料のユニプレックス分析を含む。
【００６８】
特定の実施形態は、試料中の２つ以上の被検体の多重分析を含む。「多重分析」とは、２つ以上の被検体が互いに異なる、２つ以上の明確な被検体の存在が判定されることを、意味する。たとえば、被検体は、分子量、サイズ、電荷（たとえば電荷質量比）、等電点などの、検出可能な違いを含んでもよい。場合により、被検体の数は、１００以上を含む、たとえば５０以上など、最大２０以上まで、４以上、６以上、８以上の明確な被検体など、２より大きい。特定の実施形態において、方法は、４から２０の明確な被検体を含む、４から５０の明確な被検体など、２から１００の明確な被検体の多重分析を含む。
【００６９】
図８は、試料中の複数の被検体の多重分析向けに構成された、マイクロ流体装置８００の図を示す。マイクロ流体装置８００は、分離チャネル８３０内の分離媒体８１０、および対応する個別の結合チャネル８４０内の複数の結合媒体８２０を含む。分離媒体８１０は、複数の結合媒体８２０と流体連絡している。各結合媒体は異なる結合メンバーを含んでもよい。たとえば、各結合媒体は、対象とする異なる被検体に特異的に結合される、異なる結合メンバーを含んでもよい。分離媒体によって分離された被検体は、結合媒体８２０に選択的に移送されてもよい。結合媒体８２０のうちの１つとの被検体の検出可能な結合は、試料中のその特定の被検体の存在を示す。各々が異なる結合メンバーに結合される、複数の結合媒体８２０を含むことで、単一のアッセイにおける対象とする複数の異なる被検体の検出を、容易にし得る。
【００７０】
図１７は、試料中の複数の被検体の多重分析向けに構成された、マイクロ流体装置１７００の図が重ねられた画像を示す。「ｉ」は、分離ステップ（１）および移送ステップ（２）のための電流の流れる方向を示す。マイクロ流体装置１７００は、分離媒体１７０１、第一結合媒体１７０２、および第二結合媒体１７０３を収容するチャンバを含む。分離媒体１７０１は第一結合媒体１７０２と流体連絡しており、これは第二結合媒体１７０３と流体連絡している。各結合媒体は異なる結合メンバーを含んでもよい。たとえば、第一結合媒体１７０２は、対象とする第一被検体１７０５を特異的に結合する第一結合メンバー１７０４を含んでもよく、第二結合媒体１７０３は、対象とする第二被検体１７０７を特異的に結合する第二結合メンバー１７０６を含んでもよい。試料中の被検体は、まず、分離媒体を通じて試料を配向することによって分離される（図１７、ステップ（１））。分離媒体によって分離された被検体は、それぞれ第一および第二結合媒体１７０２および１７０３に、移送されてもよい（図１７、ステップ（２））。第一結合媒体１７０２中の第一結合メンバー１７０４との対象とする第一被検体１７０５の検出可能な結合は、試料中の対象とする第一被検体１７０５の存在を示す（図１７、ステップ（３））。第二結合媒体１７０３中の第二結合メンバー１７０６との対象とする第二被検体１７０７の検出可能な結合は、試料中の対象とする第二被検体１７０７の存在を示す（図１７、ステップ（３））。各々が異なる結合メンバーに結合される、複数の結合媒体を含むことで、単一のアッセイにおける対象とする複数の異なる被検体の検出を、容易にし得る。
【００７１】
特定の実施形態において、方法は自動化された方法である。したがって、方法は、試料をマイクロ流体装置内に導入した後、マイクロ流体装置およびシステムとの最小限のユーザインタラクションを含んでもよい。たとえば、分離試料を生成するために分離媒体を通るように試料を配向するステップ、および分離試料を結合媒体に移送するステップは、ユーザがこれらのステップを手動で実行する必要がないように、マイクロ流体装置およびシステムによって実行されてもよい。場合により、自動化された方法は、総アッセイ時間の短縮を容易にする可能性がある。たとえば、試料中の被検体の分離および検出を含む、方法の実施形態は、１５分以下、または１０分以下、または５分以下、または２分以下、または１分以下を含む、２０分以下など、３０分以下の時間で実行されてもよい。
【００７２】
図１Ａは、従来の免疫ブロット法手順の図を示す。まず、試料中の様々な被検体が、電気泳動によって分離される。次に、分離された被検体は膜に向けて移送される。ブロッキングおよび洗浄に続いて、被検体は、特定の標的被検体に特異的に結合する抗体を用いてプローブされる。
【００７３】
図１Ｂは、試料中の被検体の存在を検出する方法の実施形態の図を示す。方法は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、続いて分離後試料移送、最後に膜ベースの親和性ブロット法を、含む。被検体は、ＰＡＧＥ分離媒体から連続結合媒体（たとえばブロット用ゲル）に電気運動的に移送され、特異的親和性相互作用によってｉｎ−ｓｉｔｕ同定される。ステップ１において、試料中の様々な被検体が、分離媒体５を通る電気泳動によって分離される。分離媒体は、第一方向軸を備える分離流路を有する。電場は、分離媒体５を通じて試料を配向するために、第一方向軸に沿って印加される。分離された被検体が、結合媒体４と流体連絡している分離媒体５内の領域に到達すると、分離された被検体を結合媒体の方へ配向するために第二方向軸に沿って電場を印加することによって、特異的な被検体は、結合媒体に向けて選択的に移送されることが可能である（図１Ｂ、ステップ２参照）。結合媒体４は、担体に結合された結合メンバー７を含む。たとえば、結合媒体４を形成するために、ストレプトアビジンアクリルアミド、およびビオチン標識された抗体が、投影リソグラフィ（３３０〜３７５ｎｍ、４分間）によって、ポリアクリルアミドゲル内で共重合された。特定の例において、結合メンバーは、特定の標的被検体６に特異的な抗体である。標的被検体６が存在する場合、標的被検体６は、結合メンバー７に結合することによって結合媒体４内に保持され、検出可能シグナルを生成する（図１Ｂ、ステップ３参照）。標的被検体が存在しない場合、結合メンバーに結合が生じることはなく、このため検出可能シグナルは生成されない。標的被検体以外の被検体が存在する場合には、これらは結合メンバーと結合することはなく、結合メンバーと結合せずに結合媒体を通過する。このため、検出可能シグナルは生成されない。
【００７４】
互いに流体連絡しているマイクロ流体チャネルを含むマイクロ流体装置７００の実施形態について、図７Ｂは、試料中の被検体の分離、移送、および検出の図を示す。図７Ｂのパネル（１）は、結合チャネル７２１と流体連絡している分離チャネル７２０の下流末端を示す。分離チャネル７２０は分離媒体７２２を含み、結合チャネル７２１は結合媒体７２３を含む。結合媒体７２３は、結合媒体７２３に結合された結合メンバー７２４を含む。電気泳動分離（図７Ｂ、パネル（１））の後、被検体７２５、７２６、および７２７は、選択的に電気泳動的に、結合媒体７２３に移送され、結合媒体７２３を通じて搬送されてよい（図７Ｂ、パネル（２））。結合メンバー７２４は、対象とする被検体７２７と特異的に結合し、こうして結合媒体７２３内の対象とする被検体７２７を保持する（図７Ｂ、パネル（３））。対象とする被検体７２７は、蛍光標識などの検出可能標識を含んでもよく、こうして結合媒体７２３に結合された対象とする被検体７２７は検出されてもよい。非結合の被検体７２６は、結合メンバー７２４によって特異的に結合されず、結合媒体７２３を通過して移送チャネル７２８内に入り、そこで非結合の被検体７２６は、必要に応じて排液リザーバまたは下流の二次分析装置へ配向されてもよい。結合媒体７２３に移送されない、分離された被検体７２５は、分離チャネル７２０内に残り、必要に応じて排液リザーバまたは下流の二次分析装置へ配向されてもよい。
【００７５】
システム
特定の実施形態の態様は、試料中の被検体を検出するシステムを含む。場合により、システムは、本明細書に記載されるようなマイクロ流体装置を含む。システムはまた、検出器も含んでもよい。場合により、検出器は、検出可能標識を検出するように構成された検出器である。上述のように、検出可能標識は蛍光標識であってもよい。たとえば、蛍光標識は、蛍光標識を励起して蛍光標識に検出可能な電磁放射線（たとえば、可視光線など）を放出させる、電磁放射線（たとえば、可視、紫外、Ｘ線など）に接触することが可能である。放出された電磁放射線は、結合メンバーに結合された被検体の存在を判定するために、適切な検出器を用いて検出されてもよい。
【００７６】
場合により、検出器は、上述のように、蛍光標識からの放射を検出するように構成されていてもよい。特定の場合、検出器は、光電子増倍管（ＰＭＴ）、電荷結合素子（ＣＣＤ）、強化電荷結合素子（ＩＣＣＤ）、相補型金属酸化物半導体（ＣＭＯＳ）センサー、視感色彩読み取り、フォトダイオード、等を含む。
【００７７】
本開示のシステムは、必要に応じて、様々なその他の要素を含んでもよい。たとえば、システムは、マイクロ流体処理素子などの、流体処理素子を含んでもよい。流体処理素子は、マイクロ流体装置を通じて１つ以上の流体を配向するように構成されていてもよい。場合により、流体処理素子は、試料溶液、緩衝液（たとえば解放緩衝液、洗浄緩衝液、電気泳動緩衝液など）などの、ただしこれらに限定されない流体を、配向するように構成されている。特定の実施形態において、マイクロ流体処理素子は、流体が分離媒体に接触するように、マイクロ流体装置の分離媒体に流体を送達するように構成されている。流体処理素子は、マイクロ流体ポンプを含んでもよい。場合により、マイクロ流体ポンプは、本明細書に開示されるマイクロ流体装置およびシステムを通る流体の、圧力駆動によるマイクロ流体処理および経路決定のために構成されている。特定の例において、マイクロ流体処理素子は、たとえば５０μＬ以下、または２５μＬ以下、または１０μＬ以下、または５μＬ以下、または１μＬ以下など、１００μＬ以下を含む、５００μＬ以下など、１ｍＬ以下など、少量の流体を送達するように構成されている。
【００７８】
特定の実施形態において、システムは１つ以上の電場発生器を含む。電場発生器は、マイクロ流体装置の様々な領域に、電場を印加するように構成されていてもよい。システムは、試料がマイクロ流体装置を通じて電気運動的に搬送されるように、電場を印加するように構成されていてもよい。たとえば、電場発生器は、分離媒体に電場を印加するように構成されていてもよい。場合により、印加された電場は、分離媒体の分離流路の方向軸に揃えられてもよい。したがって、印加された電場は、分離媒体を通じて、試料中の被検体および部分を電気運動的に搬送するように、構成されていてもよい。特定の実施形態において、システムは、試料中の被検体および／または部分が分離媒体から結合媒体へ電気運動的に搬送されるように、電場を印加するように構成された電場発生器を含む。たとえば、印加された電場は、結合媒体の標識流路の方向軸に揃えられてもよい。場合により、印加された電場は、分離媒体によって分離された、選択された被検体を、電気運動的に搬送するように、構成されている。分離媒体によって分離された、選択された被検体は、結合媒体の標識流路の方向軸に沿って適切な電場を印加することによって、結合媒体まで搬送されてもよい。場合により、電場発生器は、２００Ｖ／ｃｍから６００Ｖ／ｃｍを含む、１００Ｖ／ｃｍから８００Ｖ／ｃｍなど、１０Ｖ／ｃｍから１０００Ｖ／ｃｍの範囲の強度を有する電場を印加するように、構成されている。
【００７９】
特定の実施形態において、電場発生器は電圧整形素子を含む。場合により、電圧整形素子は、印加された電場強度が分離媒体および／または結合媒体にわたって実質的に均一となるように、印加された電場の強度を制御するように構成されている。電圧整形素子は、試料中の被検体の分解能の向上を容易にし得る。たとえば、電圧整形素子は、分離媒体を通る試料の不均一な運動の減少を容易にする可能性がある。これに加えて、電圧整形素子は、被検体が分離媒体を横断する際に、被検体のバンドの分散の最小化を容易にする可能性がある。
【００８０】
特定の実施形態において、対象のシステムは、バイオチップ（たとえばバイオセンサーチップ）である。「バイオチップ」または「バイオセンサーチップ」とは、基板表面上に２つ以上の明確なマイクロ流体装置を表示する基板表面を含む、マイクロ流体システムを意味する。特定の実施形態において、マイクロ流体システムは、マイクロ流体装置のアレイを備える基板表面を含む。
【００８１】
「アレイ」は、たとえば空間的にアドレス可能な領域など、アドレス可能領域のいかなる二次元的または実質的に二次元的（ならびに三次元的）配置も含む。アレイは、アレイ上の特定の所定箇所（たとえば「アドレス」）に位置する複数の装置を含むときに、「アドレス可能」である。アレイの特徴（たとえば、装置）は、空間に介入することによって分離されてもよい。任意の基板は、基板の前面上に設けられた１つ、２つ、４つ、またはそれ以上のアレイを担持してもよい。使用法に応じて、いずれかまたはすべてのアレイが互いに同じまたは異なってもよく、各々が複数の明確なマイクロ流体装置を収容してもよい。アレイは、２つ以上、４つ以上、８つ以上、１０以上、５０以上、または１００以上を含む、１つ以上のマイクロ流体装置を収容してもよい。特定の実施形態において、マイクロ流体装置は、１０ｍｍ２未満、またはそれよりさらに小さいなど、５０ｍｍ２未満、２０ｍｍ２未満を含む、たとえば１ｃｍ２未満など、１０ｃｍ２未満または５ｃｍ２未満の面積を有するアレイの中に、配置されることが可能である。たとえば、マイクロ流体装置は、たとえば１ｍｍ×１ｍｍ以下、たとえば２５ｍｍ×２５ｍｍ以下、または１０ｍｍ×１０ｍｍ以下、または５ｍｍ×５ｍｍ以下、５０ｍｍ×５０ｍｍ以下など、１００ｍｍ×１００ｍｍ以下の寸法を含む、１０ｍｍ×１０ｍｍから２００ｍｍ×２００ｍｍの範囲の寸法を有してもよい。
【００８２】
マイクロ流体装置のアレイは、試料の多重分析向けに配置されてもよい。たとえば、複数のマイクロ流体装置は、一連のマイクロ流体装置内でいくつかの異なる被検体の存在について試料が分析されるように、直列に配置されてもよい。特定の実施形態において、複数のマイクロ流体装置は、２つ以上の試料が実質的に同時に分析されるように、並列に配置されてもよい。
【００８３】
システムの態様は、マイクロ流体装置が、まだ検出可能な結果を生成しながら最小量の試料を消費するように構成されてもよいことを、含む。たとえば、システムは、まだ検出可能な結果を生成しながら、たとえば５μＬ以下、２μＬ以下、または１μＬ以下など、５０μＬ以下、または２５μＬ以下、または１０μＬ以下を含む、７５μＬ以下など、１００μＬ以下の試料体積を使用するように、構成されていてもよい。特定の実施形態において、システムは、５０ｆＭ以下、または２５ｆＭ以下、または１０ｆＭ以下を含む、１００ｆＭ以下など、たとえば１ｐＭ以下、または５００ｆＭ以下、または２５０ｆＭ以下など、１００ｐＭ以下を含む、５００ｐＭ以下など、１ｎＭ以下の検出感度を有するように構成されている。場合により、システムは、１ｐｇ／ｍＬ以下を含む、１ｎｇ／ｍＬ以下、または０．１ｎｇ／ｍＬ以下、または０．０１ｎｇ／ｍＬ以下など、たとえば１０ｍｇ／ｍＬ以下、または５ｎｇ／ｍＬ以下など、１００ｎｇ／ｍＬ以下を含む、５００ｎｇ／ｍＬ以下など、１μｇ／ｍＬ以下の濃度の被検体を検出することができるように、構成されている。特定の実施形態において、システムは、１０−１２Ｍから１０−６Ｍを含む、１０−１５Ｍから１０−３Ｍなど、１０−１８Ｍから１０Ｍのダイナミックレンジを有する。
【００８４】
特定の実施形態において、マイクロ流体装置は、１０℃から５０℃、または２０℃から４０℃を含む、５℃から７５℃など、１℃から１００℃の温度範囲で動作する。場合により、マイクロ流体装置は、３５℃から４０℃の温度範囲で動作する。
【００８５】
実用性
対象の装置、システム、および方法は、試料中の１つ以上の被検体の存在または不存在、および／または定量化の判定が望まれる、様々な異なる用途における利用を見出す。特定の実施形態において、方法は、試料中の核酸、タンパク質、またはその他の生体分子の検出を対象としている。方法は、試料中の、たとえば２つ以上の明確なタンパク質バイオマーカーなど、一組のバイオマーカーの検出を、含んでもよい。たとえば、方法は、たとえば被験者の病状の診断において、被験者の病状の現在進行している管理または治療などにおいて、採用されるような、生体試料中の２つ以上の疾患バイオマーカーの迅速な臨床検出において、使用されてもよい。これに加えて、対象の装置、システム、および方法は、ウェスタンブロット法、サザンブロット法、ノーザンブロット法、イースタン、ファーウェスタンブロット法、サウスウェスタンブロット法など、ただしこれらに限定されない、試料中の被検体の検出のためのプロトコルにおける利用を見出してもよい。
【００８６】
特定の実施形態において、対象の装置、システム、および方法は、バイオマーカーの検出における利用を見出す。場合により、対象の装置、システム、および方法は、特定のバイオマーカーの存在または不存在、ならびに、尿、血液、血清、血漿、唾液、精液、前立腺液、乳頭吸引液、涙液、汗、便、口腔粘膜採取物、脳脊髄液、細胞溶解物試料、羊水、胃腸液、生検組織（たとえば、レーザー・キャプチャー・マイクロダイセクション（ＬＣＭ）から得られる試料）などの、ただしこれらに限定されない、血液、血漿、血清、またはその他の体液または排泄物中の特定のバイオマーカーの濃度の増加または減少を、検出するために使用されてもよい。
【００８７】
バイオマーカーの存在または不存在、あるいはバイオマーカーの濃度の著しい変化は、疾患リスク、個人における疾患の存在を診断するために、または個人における疾患の治療を調整するために、使用されることが可能である。たとえば、特定のバイオマーカーまたはバイオマーカーのパネルの存在は、個人に対して与えられる薬物治療または投与計画の選択に影響を及ぼす可能性がある。可能性のある薬物療法の評価において、バイオマーカーは、生存または不可逆的罹患などの自然なエンドポイントの代用として、使用されてもよい。治療がバイオマーカーを変化させる場合、これは改善された健康に直接的な関連を有するが、バイオマーカーは、特定の治療または投与計画の臨床的利点を評価するための、代用エンドポイントの役割を果たすことができる。このため、個人において検出された特定のバイオマーカーまたはバイオマーカーのパネルに基づいてカスタマイズされた診断および治療は、対象の装置、システム、および方法によって容易になる。さらに、疾患に関連づけられたバイオマーカーの早期検出は、上述のように、対象の装置およびシステムの高い感度によって、容易になる。感度、拡張性、および使いやすさと相まって、単一チップ上の複数のバイオマーカーを検出する能力により、現在開示されているマイクロ流体装置、システム、および方法は、携帯型の、およびポイントオブケアまたはベッドサイド分子診断学における利用を見出す。
【００８８】
特定の実施形態において、対象の装置、システム、および方法は、疾患または病態のためのバイオマーカーの検出における利用を見出す。場合により、疾患は、癌、腫瘍、乳頭腫、肉腫、または癌腫などの、ただしこれらに限定されない、細胞増殖疾患である。特定の例において、対象の装置、システム、および方法は、創薬およびワクチン開発のための、細胞シグナリング経路および細胞内情報伝達の特徴付けのための、バイオマーカーの検出における利用を見出す。たとえば、対象の装置、システム、および方法は、癌、腫瘍、乳頭腫、肉腫、または癌腫などの、細胞増殖疾患などの疾患の存在の検出における利用を見出す。特定の例において、癌または細胞増殖疾患の指示薬を検出するための、対象とする特定のバイオマーカーは、以下を含むが、これらに限定されない：前立腺癌バイオマーカーである、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）；炎症の指示薬である、Ｃ反応性タンパク質；細胞周期およびアポトーシス制御を促進する、Ｐ５３などの転写因子；光線性角化症および鱗状細胞癌腫の指示薬である、ポリアミン濃度；増殖成長相にある細胞の核内に発現する細胞周期関連タンパク質である、増殖性細胞核抗原（ＰＣＮＡ）；ＩＧＦ−Ｉなどの増殖因子；ＩＧＦＢＰ−３などの増殖因子結合タンパク質；遺伝子発現を調節する、長さ約２１〜２３ヌクレオチドの一本鎖ＲＮＡ分子である、マイクロＲＮＡ；膵臓および結腸癌バイオマーカーである、炭水化物抗原ＣＡ１９．９；サイクリン依存性キナーゼ；上皮増殖因子（ＥＧＦ）；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；タンパク質チロシンキナーゼ；エストロゲン受容体（ＥＲ）およびプロゲステロン受容体（ＰＲ）の過剰発現；など。たとえば、対象の装置、システム、および方法は、罹患、健康、および良性試料中の、内因性前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の量を検出および／または定量化するために、使用されてもよい。
【００８９】
特定の実施形態において、対象の装置、システム、および方法は、感染症または病態のバイオマーカーの検出における利用を見出す。場合により、バイオマーカーは、タンパク質、核酸、炭水化物、小分子などの、ただしこれらに限定されない、分子バイオマーカーであってもよい。たとえば、対象の装置、システム、および方法は、ＨＩＶカプシドタンパク質ｐ２４、糖タンパク質１２０および４１、ＣＤ４＋細胞などの抗体でセンサー表面を官能化することによって、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ診断および／または治療監視のためのＨＩＶウイルス量および患者のＣＤ４値を監視するために、使用されてもよい。対象の装置、システム、および方法によって検出されてもよい特定の疾患および病態は、細菌感染、ウイルス感染、遺伝子発現の増加または減少、染色体異常（たとえば欠失または挿入）などを含むが、これらに限定されない。たとえば、対象の装置、システム、および方法は、無菌性髄膜炎、ボツリヌス中毒症、コレラ、大腸菌感染症、手足口病、ヘリコバクター感染症、出血性結膜炎、ヘルパンギーナ、心筋炎、パラチフス、ポリオ、細菌性赤痢、腸チフス、ブリオ敗血症、ウイルス性下痢などの、ただしこれらに限定されない、胃腸感染症を検出するために使用されることが可能である。これに加えて、対象の装置、システム、および方法は、アデノウイルス感染症、非定型肺炎、トリインフルエンザ、ブタインフルエンザ、腺ペスト、ジフテリア、インフルエンザ、はしか、髄膜炎菌性髄膜炎、流行性耳下腺炎、パラインフルエンザ、百日咳（すなわち、百日咳（ｗｈｏｏｐｉｎｇ ｃｈｏｕｇｈ））、肺炎、肺ペスト、呼吸合包体ウイルス感染症、風疹、紅熱、敗血症性ペスト、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、結核などの、ただしこれらに限定されない、呼吸器感染症を検出するために使用されることが可能である。これに加えて、対象の装置、システム、および方法は、クロイツフェルト・ヤコブ病、ウシ海綿状脳症（すなわち、狂牛病）、パーキンソン病、アルツハイマー病、狂犬病などの、ただしこれらに限定されない、神経疾患を検出するために使用されることが可能である。これに加えて、対象の装置、システム、および方法は、ＡＩＤＳ、軟性下疳、クラミジア感染症、尖圭コンジローマ、陰部ヘルペス、淋病、鼠径リンパ肉芽腫、非淋菌性尿道炎、梅毒などの、ただしこれらに限定されない、泌尿生殖器疾患を検出するために使用されることが可能である。これに加えて、対象の装置、システム、および方法は、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、Ｅ型肝炎などの、ただしこれらに限定されない、ウイルス性肝炎疾患を検出するために使用されることが可能である。これに加えて、対象の装置、システム、および方法は、エボラ出血熱、腎症候性出血熱（ＨＦＲＳ）、ラッサ出血熱、マールブルグ出血熱などの、ただしこれらに限定されない、出血熱疾患を検出するために使用されることが可能である。これに加えて、対象の装置、システム、および方法は、炭疽病、トリインフルエンザ、ブルセラ症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ウシ海綿状脳症（すなわち、狂牛病）、エンテロウイルス病原性大腸菌感染症、日本脳炎、レプトスピラ症，Ｑ熱、狂犬病、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）など、ただしこれらに限定されない、動物原生感染症を検出するために使用されることが可能である。これに加えて、対象の装置、システム、および方法は、デング出血熱、日本脳炎、ダニ媒介脳炎、西ナイル熱、黄熱病などの、ただしこれらに限定されない、アルボウイルス感染症を検出するために使用されることが可能である。これに加えて、対象の装置、システム、および方法は、アシネトバクター・バウマンニ、カンジダアルビカンス、腸球菌属、肺炎桿菌、緑膿菌、黄色ブドウ球菌など、ただしこれらに限定されない、抗生物質耐性菌感染症を検出するために使用されることが可能である。これに加えて、対象の装置、システム、および方法は、ネコ引っ掻き病、発疹熱、発疹チフス、ヒトエールリッヒ症、日本紅斑熱、シラミ媒介性回帰熱、ライム病、マラリア、塹壕熱、ツツガムシ病など、ただしこれらに限定されない、節足動物媒介感染症を検出するために使用されることが可能である。同様に、対象の装置、システム、および方法は、心血管疾患、中枢神経疾患、腎不全、糖尿病、自己免疫疾患、およびその他の多くの疾患を検出するために使用されることが可能である。
【００９０】
対象の装置、システム、および方法は、以下のものを含む、ただしこれらに限定されない、診断アッセイにおける利用を見出す：上述のように、バイオマーカーを検出および・または定量化すること；無症候被験者について試料が一定間隔で検査される、スクリーニングアッセイ；起こり得る疾病経過を予測するために、バイオマーカーの存在および／または量が使用される、予後アッセイ；異なる薬物治療への被験者の反応が予測され得る、層別化アッセイ；薬物治療の有効性が監視される、有効性アッセイ；など。
【００９１】
対象の装置、システム、および方法はまた、検証アッセイにおける利用も見出す。たとえば、検証アッセイは、潜在疾患バイオマーカーが、多様な個々人の間にある疾患の存在または不存在の確実な指示薬であることを、検証または確認するために、使用されてもよい。対象の装置、システム、および方法の短いアッセイ時間は、最短時間内で複数の試料をスクリーニングするためのスループットの向上を、容易にする可能性がある。
【００９２】
場合により、対象の装置、システム、および方法は、実施に実験室設定を必要とすることなく、使用されることが可能である。同等の分析研究実験用機器と比較して、対象の装置およびシステムは、携帯型の、手持ち式システムにおいて匹敵する分析感度を提供する。場合により、重量および運転コストは、一般的な固定型実験用機器よりも少ない。対象のシステムおよび装置は、対象とする被検体の分離、移送、標識、および検出を含む、アッセイのすべてのステップが、単一の装置によって実行されるように、単一の装置に組み込まれてもよい。たとえば、場合により、対象とする被検体の分離、移送、標識、および検出のための個別の装置は存在しない。これに加えて、対象のシステムおよび装置は、試料中の１つ以上の被検体を検出するために、医療研修を受けていない人によって、市販の家庭用検査向けの家庭内設定において、利用されることが可能である。対象のシステムおよび装置はまた、迅速な診断のための、たとえばベッドサイドなどの臨床設定において、あるいは費用またはその他の理由により固定型分析実験用機器が提供されない設定において、利用されることも可能である。
【００９３】
キット
本開示の態様は付加的に、本明細書に詳細に記載されるマイクロ流体装置を有するキットを、含む。キットは、緩衝液をさらに含んでもよい。たとえば、キットは、電気泳動緩衝液、試料緩衝液などの緩衝液を含んでもよい。キットは、解放剤、変性剤、リフォールディング剤、洗剤、検出可能標識（たとえば、蛍光標識、比色標識、化学発光標識、多色試薬、酵素結合試薬、アビジン−ストレプトアビジン会合検出試薬、放射標識、金粒子、磁気標識など）などの、ただしこれらに限定されない、付加的な試薬をさらに含んでもよい。
【００９４】
上記の要素に加えて、対象のキットは、対象とする方法を実現するための指示をさらに含んでもよい。これらの指示は、そのうちの１つ以上がキット内に存在し得る、様々な形態で対象のキット内に存在してもよい。これらの指示が存在してもよい１つの形態は、キットの包装内、または添付文書内の、たとえば情報が印刷されている１枚以上の紙など、適切な媒体または基板上の印刷情報としてである。別の手段は、情報が記録または格納されている、たとえばディスケット、ＣＤ、ＤＶＤ、Ｂｌｕ−Ｒａｙ、コンピュータ読み取り可能メモリなど、コンピュータ読み取り可能媒体である。存在し得るさらに別の手段は、離れた場所の情報にアクセスするためにインターネットを経由して使用され得る、ウェブサイトアドレスである。いずれの便利な手段がキット内に存在してもよい。
【００９５】
上記に提供された開示から理解されるように、本発明の実施形態は、多様な用途を有する。したがって、本明細書に提示される実施例は、説明目的のために提供され、いかようにも本発明に対する限定として解釈されると意図されるものではない。当業者は、本質的に類似の結果を産み出すために変更または修正され得る、様々な重要ではないパラメータを、容易に認識し得る。このため、以下の実施例は、本発明をどのように成し遂げて使用するかの完全な開示および記載を当業者に提供するように提示されており、本発明者らが自身の発明と見なすものの範囲を限定する意図はなく、以下の実験がすべてであって実行された実験のみであることを示すように意図するものでもない。使用される数値（たとえば量、温度など）に対する精度を保証するための努力がなされてきたが、しかしいくらかの実験的誤差およびずれは考慮されるべきである。別途記載のない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧またはその付近である。
【００９６】
実施例
材料および方法
別途記載のない限り、以下のプロトコルを使用して、マイクロ流体装置が用意されて実験が行われた。
【００９７】
試薬
水溶性光開始剤２，２−アゾビス［２−メチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）プロピオンアミド］（ＶＡ−０８６）が、Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（バージニア州リッチモンド）から購入された。３−（トリメトキシシリル）−プロピルメタクリレート（９８％）、氷酢酸（ＡＣＳグレード）、メタノール（ＡＣＳグレード、および３０％（２９：１）アクリルアミド／ビス−アクリルアミドが、Ｓｉｇｍａ（ミズーリ州セントルイス）から購入された。ストレプトアビジン−アクリルアミド（ＳＡ）が、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州カールスバッド）から購入された。予備混合された１０×トリスグリシンネイティブ電気泳動緩衝液（２５ｍＭトリス、ｐＨ８．３、１９２ｍＭグリシン）が、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（カリフォルニア州ハーキュリーズ）から購入された。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８で共役されたウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびＦＩＴＣ−ビオチンが、それぞれ陰性および陽性対照として使用された（ミズーリ州セントルイス、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）。α−アクチニンおよびビオチンで共役された抗アクチニンが、Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ，Ｉｎｃ．（コロラド州デンバー）から購入された。フリーＰＳＡ（前立腺特異抗原）およびビオチン標識されたモノクローナル抗ＰＳＡが、ＥＸＢＩＯ（チェコ共和国、プラハ）から購入された。タンパク質は、供給元（カリフォルニア州カールスバッド、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の指示に従って、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８タンパク質標識キットを使用して、研究室内で蛍光標識された。標識されたタンパク質は、使用されるまで暗所において４℃で保管された。
【００９８】
マイクロ流体チップ製造
ガラスマイクロ流体チップは、研究室内で設計され、Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（マサチューセッツ州ホプキントン）による標準ウェット・エッチ・プロセスを用いて製造された。３−（トリメトキシシリル）プロピルメタクリレート、氷酢酸、脱イオン水、およびメタノール２：３：２：３の比率の混合物を用いて、ポリアクリルアミド（ＰＡ）ゲルとの共有結合のために、表面がまず官能化された。２０分間静置培養の後、メタノールは３０分間マイクロ流体装置内を流され、その後乾燥窒素パージされた。
【００９９】
官能化結合媒体光パターン形成
フィルムマスクおよび顕微鏡システム（ＩＸ−７０、ニューヨーク州メルビル、オリンパス）と組み合わせた紫外線対物レンズ（ＵＰＬＡＮＳ−ＡＰＯ、４倍、オリンパス）を用いたマスクベースのリソグラフィは、励起をもたらし、その結果、架橋結合および結合媒体（ストレプトアビジン−アクリルアミドを含む８％Ｔ）の形成をもたらした。ゲルマトリクスにおいて共有結合されたストレプトアビジンは、免疫ブロット法のためにビオチン標識された抗体を固定するために使用された。水銀球は、励起源（３３０〜３７５ｎｍ）として使用され、チップに対するマスクアライメントは、顕微鏡（ニューヨーク州メルビル、オリンパス）の手動調整ｘ−ｙ並進ステージを用いて実行された。アクリルアミドおよびビスを含む、最終的な前駆体体積は、０．２％（ｗ／ｖ）ＶＡ−０８６光開始剤を含むトリスグリシン・ネイティブ・ランニング緩衝液を用いて調整された。ゲル前駆体溶液は、実質的に気泡のない最終ゲルを確保するために、マイクロ流体装置への装荷の直前に、脱気された（撹拌とともに超音波分解されながら、真空下に５分間）。製造を開始するため、ＰＡゲル前駆体溶液は、マイクロ流体装置内に逃がされるか、またはゆっくりと圧力装荷された（シリンジを通じて）。マイクロ流体装置が装荷された後、高粘度の５％２−ヒドロキシエチルセルロース溶液（Ｓｉｇｍａ、平均分子量〜７２０，０００）が、ピペットによって各リザーバ上にゆっくりと導入された。冷却ファンを備えて１５ｃｍ離れて位置する、フィルタを通した水銀ランプ（３００〜３８０ｎｍ）（１００Ｗ、カリフォルニア州アップランド、ＵＶＰ Ｂ１００−ＡＰ）へのチップの投光照明照射を用いて、より大きい孔径の試料装荷ゲルが形成された。
【０１００】
装置および撮像
アッセイ操作はプログラム可能であり、白金電極を備える高圧電源（カリフォルニア州リバモア、Ｌａｂｓｍｉｔｈ ＨＶＳ４４８）を用いて制御された。試料排液リザーバで＋８００Ｖの電位を印加し、〜２分間試料リザーバを接地することによって、試料が装荷された。画像は、１０倍対物レンズ（開口数０．３）、ＧＦＰ検出に最適化されたフィルタキューブ、およびｘ−ｙ並進ステージを備える、反転落射蛍光顕微鏡（ＩＸ−７０、ニューヨーク州メルビル、オリンパス）を用いて収集された。タンパク質移動および１０ＭＨｚ周波数での結合を監視するために、１３９２×１０４０ペルチェ冷却インターラインＣＣＤカメラ（ＣｏｏｌＳＮＡＰ（商標）ＨＱ２、ニュージャージー州トレントン、Ｒｏｐｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が使用された。別途記載のない限り、ＣＣＤ露光時間は３００ミリ秒であった。画像解析は、ＩｍａｇｅＪ（メリーランド州ベセスダ、国立衛生研究所）を使用して完成された。
【０１０１】
結果
図２は、分離試料を結合媒体に移送する前（図２Ａ）および後（図２Ｂ）の、タンパク質の電気泳動図を示す。標的タンパク質（α−アクチニンおよび前立腺特異抗原、ＰＳＡ）および陰性対照（ＢＳＡ）のネイティブＰＡＧＥ、ならびにその後の結合媒体への電気泳動移送が、実行された。分離されたタンパク質バンドは、３０秒以内に８５％の捕捉効率で、結合媒体に移送された。特異的標的タンパク質（最も遅いピーク、α−アクチニン）が、結合媒体に結合し、検出可能な蛍光シグナルを産み出した（図２Ｂ、挿入画、反転グレースケール）。
【０１０２】
図３は、陽性および陰性タンパク質対照を用いてアッセイの特異性を検査する実験の蛍光画像を示す。マイクロ流体装置の結合媒体３０の蛍光画像は、図３に示されている。被検体ＢＳＡ（たとえば、陰性対照）、ビオチン、α−アクチニン、およびＰＳＡは、結合媒体担体に結合された、ストレプトアビジン、抗アクチニン、および抗ＰＳＡを備える３つの異なる結合媒体に、個別に接触した。図３は、検出可能な非対角シグナルを示しておらず、検出可能な交差反応および検出可能な非特異的吸着が存在しないことを示している。
【０１０３】
図４Ａは、マイクロ流体装置内の抗体官能化結合媒体に結合されたタンパク質の用量反応の蛍光画像を示す。マイクロ流体装置の結合媒体４０の蛍光画像は、図４に示されている。増加する濃度のＢＳＡ（たとえば、陰性対照）は、ストレプトアビジンで官能化された結合媒体と接触させられた。ＢＳＡは、まったくまたはほとんど検出可能シグナルを示さなかった。増加する濃度のα−アクチニンは、抗アクチニンで官能化された結合媒体と接触させられた。α−アクチニンは、α−アクチニンの濃度が上昇するにつれて、蛍光シグナルの増加を示した。増加する濃度のＰＳＡは、抗ＰＳＡで機能化された結合媒体と接触させられた。ＰＳＡは、ＰＳＡの濃度が上昇するにつれて、蛍光シグナルの増加を示した。用量反応曲線の確立は、タンパク質定量化を容易にし得る。これに加えて、結合媒体上の内在性タンパク質濃縮が観察された（図４Ｂ参照）。タンパク質濃縮は、結合媒体が存在しない場合のシグナルと比較して、結合媒体上の検出感度の向上を容易にし得る。
【０１０４】
図５Ａは、分離媒体５０を含むマイクロ流体装置の図を示す。試料は、試料注入口５１を通じてマイクロ流体装置内に導入されることが可能である。試料は、試料注入口５１から分離媒体５０に試料を配向するために電場を印加することによって、分離媒体５０上に装荷されることが可能である（図５Ａ、挿入画１参照）。試料が分離媒体５０に接触させられた後、分離媒体５０を通じて試料を配向するために、分離媒体５０の方向軸に沿って電場が印加され得る（図５Ａ、挿入画２参照）。試料中の被検体は、これらが分離媒体５０を通じて流れる際に分離させられ、分離媒体５０の遠位末端に位置する検出器５２によって検出されることが、可能である。図５Ｂは、架橋結合されたポリアクリルアミドゲルを光パターン形成することによって用意された分離媒体を備えるマイクロ流体装置を使用した、広い分子範囲のタンパク質ラダーの高分解能電気泳動分析を示す。分離媒体は、１０×１０−６Ｌの試料体積を用いて、１５秒後に試料中の異なるタンパク質の間で検出可能な分解能を、実現することができた。
【０１０５】
図６は、５つの低分子量タンパク質の電気泳動分離における、ポリアクリルアミドゲルの分解能の違いの例を示す。図６において、８％の総アクリルアミドを含むポリアクリルアミドゲル（たとえば小孔径ゲル）は、試料中の５つのすべてのタンパク質を２０秒で検出可能に溶解することができたが（図６、上のグラフ参照）、これに対して４％の総アクリルアミドを含むポリアクリルアミドゲル（たとえば大孔径ゲル）は、試料中のタンパク質を溶解することができず、５秒で単一のピークを示しただけであった（図６、下のグラフ参照）。
【０１０６】
図９Ａは、分離媒体９２０の上流に濃縮媒体９１０を含んでいたマイクロ流体装置９００の図、および画像（挿入画）を示す。分離媒体９２０の上流域は、３．５％の総アクリルアミド（Ｔ）および２．２％の架橋剤（Ｃ）を含む、大孔径ゲルを含んでいた。分離媒体の大孔径領域より下流には、８％Ｔおよび２．２％Ｃを含む小孔径領域があった。図９Ｂは、分離媒体９５０の上流に濃縮媒体９４０を含んでいたマイクロ流体装置を通る試料９３０の、経時的な電気泳動運動の画像を示す。分離媒体は、分離チャネル９６０内に６％ポリアクリルアミドゲルを含んでいた。反転蛍光顕微鏡写真は５秒間隔で、ｔ０、ｔ５、およびｔ１０において撮影された。蛍光顕微鏡写真は、濃縮媒体９４０の付近のタンパク質試料の、試料濃縮および溶出を示している。図９Ｂにおいて、初期濃度１００ｎＭの濃縮レポータータンパク質（たとえば、蛍光標識された抗Ｃ−ＲＰ）は、３分後に濃縮媒体（たとえば、膜）において１７０倍に濃縮された。濃縮された抗Ｃ−ＲＰは、１０秒後に分離チャネル内に溶出した。印加された電場は、４００Ｖ／ｃｍであった。
【０１０７】
図１０は、第一マイクロ流体チャネル１０１０から第二マイクロ流体チャネル１０２０への電気泳動分析の後の、対象とする被検体１０００の選択的な移送の画像を示す。対象とする特異的な被検体の選択的な移送は、結合媒体との接触のため、またはその後の分析のためのタンパク質採取を可能にする。図１０において、対象とする被検体１０００は、さらなる分析のため、第一マイクロ流体チャネル１０１０内の電気泳動分離から第二マイクロ流体チャネル１０２０へ、配向された。対象としない被検体１０３０は、第一マイクロ流体チャネル１０１０内に影響を受けないまま残った。１つのマイクロ流体チャネルから別のマイクロ流体チャネルへの対象とする被検体の選択的移送は、少量（たとえば１ｐＬ未満）の定量的操作を容易にし得る。これに加えて、特異的な溶解された被検体の物理的操作は、選択された対象とする被検体の電気泳動後の特徴付けを容易にする可能性がある。図１０において、タンパク質は、第一マイクロ流体チャネル１０１０内で電気泳動的に分離された（たとえば、等電点電気泳動法）。第一マイクロ流体チャネル１０１０と第二マイクロ流体チャネル１０２０との交差点に位置する対象とする被検体１０００を移送するために、対象とする被検体１０００を第二マイクロ流体チャネル１０２０内に推進するため、被検体の分離に使用された初期電場に対して直交する電場が、交差点に印加された（Ｅ＝３９５Ｖ／ｃｍ）。
【０１０８】
図１１Ａは、マイクロ流体チャネル１１００内に位置する結合媒体１１１０の図を示す。これに加えて、結合媒体を通る電気泳動の方向を表す電場（Ｅ）が示されている。図１１Ｂおよび図１１Ｃは、陰性および陽性対照に曝露された結合媒体の蛍光画像を示す。２００ｎＭのＩｇＧが、ポリアクリルアミド結合媒体（１０％総アクリルアミド／２．５％架橋剤）内で共重合された。結合媒体は、ガラスマイクロチャネル内の１００Ｗ、３６５ｎｍのＹＡＧレーザーからの薄い（幅７５μｍ）レーザーシートへの２０秒間の曝露によって、形成された。１：１００のＩｇＧ−ＦＩＴＣおよび１：１００のタンパク質Ｇ−ＦＩＴＣ溶液が、結合媒体を通じて６００Ｖで５分間電気泳動され、その後非結合タンパク質Ｇ＊を洗い流すために、１５分間の緩衝液が続いた。蛍光撮像は、ＣＣＤ／落射蛍光顕微法によって実行された。図１１Ｂおよび１１Ｃに示される蛍光画像は、タンパク質Ｇ（ＩｇＧ）に対する共重合抗体の蛍光標識されたタンパク質Ｇ（タンパク質Ｇ＊）との特異的相互作用を、表している。図１１Ｂは、陰性対照（たとえば、結合媒体内の共重合されていないＩｇＧ）であって、電気泳動されてきた、蛍光標識されたタンパク質Ｇからのごくわずかな検出可能シグナルを示していた。図１１Ｃにおいて、結合媒体は、ＩｇＧ結合タンパク質Ｇ＊と共重合した。結果は、結合媒体に結合された抗体の特異性が、電気泳動による被検体移送の間も維持されることを示した。
【０１０９】
図１２Ａは、分離媒体１２０３および結合媒体１２０４を収容するチャンバ（挿入画）１２０２を含んでいた、マイクロ流体装置１２０１の明視野画像を示す。結合媒体１２０４は、分離媒体１２０３と流体連絡して標識流路（図１２Ｃ、ステップ３参照）に沿って揃えられるように、設けられた。この場合、分離流路（図１２Ｃ、ステップ２参照）および標識流路（図１２Ｃ、ステップ３参照）は、互いに直交していた。標識媒体は、孔径が分離媒体と類似しているゲルを含んでいた。これに加えて、標識媒体は、ビオチン標識された結合メンバー（たとえば、抗体）による官能化を可能にするために、ストレプトアビジンを含んでいた。チャンバ１２０２は、分離媒体１２０３と流体連絡している装荷媒体１２０５も含んでいた。装荷媒体１２０５は、分離流路（図１２Ｃ、ステップ２参照）に沿って、分離媒体１２０３の上流に設けられた。装荷媒体１２０５は、小孔径分離媒体１２０３（６％総アクリルアミド）より上流に、大孔径ゲル（３％総アクリルアミド）を含んでいた。図１２Ａのチャンバ１２０２はまた、チャンバ１２０２の各辺に沿って設けられた複数のチャネル１２０６とも流体連絡している。チャネル１２０６は、チャンバ１２０２内の装荷媒体１２０５、分離媒体１２０３、および結合媒体１２０４に、電場を配向するように構成されていてもよい。
【０１１０】
図１２Ｂは、チャンバ１２０２、およびチャンバ１２０２に電場を配向するように構成されたチャネル１２０６の、明視野画像を示す。図１２Ｃは、上述のようなチャンバ１２０２を含むマイクロ流体装置の図を示す。試料は、マイクロ流体装置内に導入されてもよい（図１２Ｃ、ステップ１参照）。電場は、装荷媒体および分離媒体を通じて試料を配向するために、分離流路の方向軸に沿って印加されてもよい（図１２Ｃ、ステップ２参照）。電場は、電場発生器Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４、Ｖ５、Ｖ６、Ｖ７、およびＶ８を使用して印加されてもよい。試料の電気泳動分離の後、試料中の分離された被検体は、標識流路の方向軸に沿って電場を印加することによって、選択的に結合媒体に移送されてもよい（図１２Ｃ、ステップ３参照）。
【０１１１】
図１２Ｄは、試料中の被検体の分離、移送、および検出の図が重ねられた画像を示す。タンパク質試料は最初に、マイクロ流体装置の大孔径装荷媒体内に電気運動的に装荷された（図１２Ｄ、ステップ１参照）。タンパク質試料は、大孔径装荷媒体と小孔径分離媒体との間の界面に到達すると、濃縮された。「ｉ」は、電流の流れる方向を示す。タンパク質は、これらが分離流路の方向軸に沿って分離媒体の底に向かって移動するにつれて、分離された（図１２Ｄ、ステップ２参照）。印加された電場はその後、分離されたタンパク質を結合媒体の内部に向けて配向するために切り替えられ、これは固定化された（たとえば、架橋結合または共重合された）結合メンバーを含んでいた（図１２Ｄ、ステップ３参照）。結合メンバーは、対象とする被検体１２０７に特異的に結合して保持するように構成されており、対象とする被検体１２０７が官能化された結合媒体に結合されたときに、陽性「ブロット」（たとえば、検出可能シグナル）を産み出した。対象とする被検体１２０７を同定するために、分子量および結合情報が判定された。
【０１１２】
図１３は、マイクロ流体装置内のタンパク質ラダーの分離の画像およびグラフを示す。図１３Ａ〜図１３Ｄは、マイクロ流体装置内で１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いたタンパク質ラダーの電気泳動分離の反転ＣＣＤ画像を示す。図１３Ａ〜図１３Ｄの画像は、様々な時点で撮影された（たとえば、電気泳動分離の開始から１１．６秒、１３．２秒、２２．０秒、および２６．８秒後）。図１３Ｅにおいて、タンパク質ラダーの移動性は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（３％〜８％のＴ）を使用するマイクロ流体装置によるタンパク質のサイズと、線形に関連していた。結果は、勾配スラブゲル（４％〜１２％のＴ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥと比較された（図１３Ｅ参照）。図１３Ｅのグラフの挿入図は、マイクロ流体装置およびスラブゲルによって分離されたタンパク質バンドを示す。図１３Ｆは、マイクロ流体装置を使用するＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離の電気泳動図を示す。移動距離は、図１３ＤのＣＣＤ画像の縮尺とした。
【０１１３】
図１４Ａは、マイクロ流体装置を使用する、蛍光標識されたタンパク質の分離の画像を示す。蛍光標識され、ビオチン標識されたアクチン１４０１は、マイクロ流体装置内でＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して、試料中の別のタンパク質から分離された。より大きいタンパク質種（たとえば、蛍光標識され、ビオチン標識されたアクチン１４０１）は、より小さいタンパク質種１４０２よりも短い距離だけ、分離媒体内を移動した。図１４Ｂは、マイクロ流体装置における、分離媒体から結合媒体への、蛍光標識されたタンパク質の移動の画像を示す。結合媒体は、結合媒体に結合されたストレプトアビジンを含んでいた。結合媒体は、蛍光標識され、ビオチン標識されたアクチン１４０１が結合媒体を横断する際に、蛍光標識され、ビオチン標識されたアクチン１４０１と特異的に結合して、これを保持した（図１４Ｂ参照）。より小さいタンパク質種１４０２は、結合媒体に結合することなく結合媒体を横断し、マイクロ流体装置を出た。
【０１１４】
図１５Ａ〜図１５Ｄは、マイクロ流体装置についてシミュレートされた電場分布の画像を示す。図１５Ａおよび図１５Ｂは、それぞれ主要チャネルおよび１つの交差チャネルを備えるマイクロ流体チャンバおよびマイクロ流体装置における、ＣＯＭＳＯＬでシミュレートされた１次元電気分布の画像を示す。図１５Ｃおよび図１５Ｄはそれぞれ、マイクロ流体チャンバ内の垂直および水平のＣＯＭＳＯＬでシミュレートされた２次元電場分布の画像を示す。ＣＯＭＳＯＬシミュレーションは、マイクロ流体チャンバ内の垂直および水平電場分布がマイクロ流体チャンバ全体で均一であることを、示していた。図１５Ｅ〜図１５Ｆは、２次元マイクロ流体チャンバ内の印加された電場の均一性を検査するマイクロ流体装置のＣＣＤ画像を示す。「ｉ」は、印加された電場の方向を示す。マイクロ流体チャンバ内に装荷される０．１μＭのフリー色素溶液の、実験ＣＣＤ画像が撮影された。図１５Ｅは、マイクロ流体チャンバ内を通る色素の電気運動が、垂直方向において実質的に均一であったことを、示している。図１５Ｆは、マイクロ流体チャンバ内を通る色素の電気運動が、水平方向において実質的に均一であったことを、示している。ＣＯＭＳＯＬシミュレーションおよび実験データはいずれも、マイクロ流体チャンバ内の垂直および水平次元において、良好に制御された、均一な電場分布を示した。均一な電場分布は、マイクロ流体装置を通じて複数の方向に、試料および／または選択された対象とする被検体を正確に配向することを、容易にし得る。
【０１１５】
図１６は、電圧整形を備えるおよび備えないマイクロ流体装置を通る試料１６０１の電気運動の画像を示す。蛍光標識された０．１μＭのＢＳＡが、マイクロ流体装置内に注入され、ＣＣＤ撮像を用いて観察された。ＣＣＤ画像は、垂直から水平方向への移送ステップの間の、蛍光標識された試料１６０１のバンド形状を、示した。試料バンド形状は、整形電圧を用いて移送した後に、著しい歪みを伴わずに、保存された。「ｉ」は、印加された電場の方向を示す。図１６（左）において、試料１６０１は、分離チャンバ内に侵入した後に実質的に歪みを伴わずに（図１６Ａ参照）、および第二水平次元に移送された後に実質的に歪みを伴わずに（図１６Ｂ参照）、その当初の形状を維持した。図１６Ｃおよび図１６Ｄは、電圧整形を用いないと、試料バンド形状が、分離チャンバへの侵入後（図１６Ｃ参照）、および第二水平次元への移送後に（図１６Ｄ参照）、著しく変形することを示した。複数のサイドチャネル１６０２は、異なる試料、試薬、緩衝液、などがマイクロ流体チャンバ内に導入されることを可能にする。たとえば、付加的な試料、試薬、緩衝液などが、試料中の被検体の分離後に、その後に続くサンドイッチ抗体検出、酵素反応などのため、マイクロ流体チャンバ内に導入されてもよい。
【０１１６】
図１８は、試料中の複数の被検体の分離、移送、および検出の画像を示す。マイクロ流体装置１８００は、分離媒体（６％総アクリルアミド）１８０１、および２つの異なる結合媒体、すなわちＰＧに特異的な結合メンバーを含む第一結合媒体（６％総アクリルアミド）１８０２、およびＣＲＰに特異的な結合メンバーを含む第二結合媒体（６％総アクリルアミド）１８０３を収容する、マイクロ流体チャンバ（１ｍｍ×１ｍｍ）を含んでいた。分離媒体および結合媒体は、ポリアクリルアミドゲルのマスクベースの紫外線リソグラフィを用いて、選択的な光パターン形成によって、形成された。選択的な光パターン形成は、マイクロ流体チャンバ内の統合媒体の形成を可能にし、ここで媒体は、被検体分離（たとえば、分離媒体）および抗体ベースの検出（たとえば、結合媒体）のための異なる物理的および機能的特性の明確な領域を含んでいた。
【０１１７】
図１８において、標的タンパク質であるタンパク質Ｇ（ＰＧ）およびＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）を含む試料は、１５０Ｖ／ｃｍの電場強度を用いて分離媒体１８０１を通じて試料を配向することによって、電気泳動的に分離された（図１８、ステップ（１））。ＰＧおよびＣＲＰのベースライン分離は、約２０秒で完了した。分離された標的タンパク質ＰＧおよびＣＲＰは、横方向電場（５０Ｖ／ｃｍ）を用いて結合媒体に移送された（図１８、ステップ（２））。ＰＧを含む分離試料バンドは、ＰＧに特異的な結合メンバーを含む結合媒体に選択的に結合し（〜８０％の捕捉効率）、ＣＲＰを含む分離試料バンドは、ＣＲＰに特異的な結合メンバーを含む結合媒体に選択的に結合した（〜８０％の捕捉効率）（図１８、ステップ（３））。分離、移送、および検出ステップは、９０秒以内で実行された。低交差反応では、各被検体は、それぞれのブロット領域において固定された抗体に結合された。
【０１１８】
図１９は、陰性対照に対する試料中の被検体の分離、移送、および検出の画像を示す。マイクロ流体装置１９００は、分離媒体（６％総ポリアクリルアミド）１９０１、および２つの異なる結合媒体、すなわちＰＧに特異的な結合メンバーを含む第一結合媒体（６％総ポリアクリルアミド）１９０２、およびＣＲＰに特異的な結合メンバーを含む第二結合媒体（６％総ポリアクリルアミド）１９０３を収容する、マイクロ流体チャンバ（１ｍｍ×１ｍｍ）を含んでいた。Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）および陰性対照（ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））を含む試料は、１５０Ｖ／ｃｍの電場強度を用いて分離媒体１９０１を通じて試料を配向することによって、電気泳動的に分離された（図１９、ステップ（１））。ＣＲＰおよびＢＳＡのベースライン分離は、３０秒で完了した。ＣＲＰおよびＢＳＡ陰性対照の分離されたバンドは、横方向電場（５０Ｖ／ｃｍ）を用いて結合媒体に移送された（図１９、ステップ（２））。ＣＲＰを含む分離試料バンドは、ＣＲＰに特異的な結合メンバーを含む結合媒体に選択的に結合した（図１９、ステップ（２））。ＢＳＡ陰性対照を含む分離試料バンドは、結合媒体に選択的に結合することも、検出可能な交差反応または非特異的吸着を示すことも、なかった（図１８、ステップ（３））。分離、移送、および検出ステップは、１１０秒以内で実行された。
【０１１９】
図２０は、試料中の複数の被検体の多重検出の画像を示す。以下の電気泳動分離、標的タンパク質であるタンパク質Ｇ（ＰＧ）およびＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）は、抗体官能化結合媒体において、選択的に捕捉および検出された（図１８参照）。標的タンパク質は、横方向電場に対する曝露（５０Ｖ／ｃｍで＞１１０秒）の後、それぞれの結合媒体中に保持された。結果は、残った被検体が、１１０秒以上の印加された電場への曝露の後、結合媒体に特異的に結合されることを示した。
【０１２０】
図２１は、抗原捕捉効率対結合媒体幅（μｍ）のグラフを示す。抗原捕捉効率は、ラングミュア結合キネティクスを前提として、設計および操作パラメータの関数として、モデリングされた。モデリングは、試料中の複数の被検体の多重分析向けに構成されたマイクロ流体装置のための、結合媒体の最適化（たとえば、結合媒体幅、結合メンバー密度など）を容易にし得る。
【０１２１】
先の実施形態は、理解しやすくする目的のため、解説および例示によってある程度詳細に記載されてきたが、本開示の教示に鑑みて、添付の特許請求の範囲の精神および範囲から逸脱することなく、特定の変更および修正がなされてもよいことは、当業者にとって容易に明確である。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書において使用される専門用語が、具体的な実施形態を記載することのみを目的とし、限定するように意図するものではないこともまた、理解されるべきである。
【０１２２】
数値の範囲が提供される場合には、文脈が別途明確に提示しない限り、その範囲の上限と下限との間の、下限の単位の十分の一までの各介在値、およびその提示された範囲の記載されたまたは介在するその他の値は、本発明に含まれると理解される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、より小さい範囲に独立して含まれてもよく、記載された範囲内のいずれか具体的な排他的限界を条件として、本発明にも含まれる。記載された範囲が１つまたは両方の限界を含む場合、それら含まれる限界のいずれかまたは両方を除く範囲もまた、本発明に含まれる。
【０１２３】
本明細書に引用されるすべての刊行物および特許は、あたかも各刊行物または特許が、具体的かつ個別に参照によって組み込まれるように、参照によって本願に組み込まれ、刊行物の引用に関連する方法および／または材料を開示および記載するために、参照によって本願に組み込まれる。いずれの刊行物の引用も、出願日に先立つその開示に関し、先行する発明のため、本発明がこのような刊行物に先んじないという許可として解釈されるべきではない。さらに、提供された発行日は、実際の発行日とは異なる可能性があり、各々確認される必要があるだろう。
【０１２４】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される際に、別途明確に指示されない限り、「ａ」、「ａｎ」「ｔｈｅ」などの単数形が複数形も含むことに留意されたい。特許請求の範囲が、いかなる任意の要素も排除するように記載されてよいことには、さらに留意されたい。したがって、この記述は、特許請求の範囲における要素の記載に関わる、「単独で（ｓｏｌｅｌｙ）」、「唯一の（ｏｎｌｙ）」などのような排他的用語の使用、または「否定的な」限定の使用のための前提の役割を果たすように、意図される。
【０１２５】
本開示を読むと当業者にとって明確となるように、本明細書に記載および解説される個別の実施形態の各々は、本発明の範囲または精神から逸脱することなく、その他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離されるかまたはこれと組み合わせられてもよい、個別の要素および特徴を有している。記載される方法のいずれも、記載された順番で、または論理的に可能ないずれか別の順番で、実行されることが可能である。
【０１２６】
したがって、上記は単に、本発明の原理を解説している。本明細書に明確に記載または図示されていないものの、当業者が、本発明の原理を実現し、その精神および範囲に含まれる、様々な構成を考案することができることは、理解される。さらに、本明細書に記載されるすべての実施例および条件的言語は主に、当該技術を拡大するために、本発明者らによって貢献された発明の原理および概念を、読者が理解するのを支援するように意図されており、このような具体的に明記された実施例および条件を限定することなく、ありのままに解釈されるべきである。また、本発明の原理、態様、および実施形態、ならびにその具体例を示す、本明細書内のすべての記述はその構造的および機能的同等物の両方を包含するように意図される。これに加えて、このような同等物は、現在周知の同等物、および将来開発される同等物、すなわちその構造にかかわらず同じ機能を実行する、今後開発されるいずれの要素も、両方とも含むものと意図される。したがって、本発明の範囲は、本明細書に提示または記載される、例示的実施形態に限定されるようには意図されない。むしろ、本発明の範囲および精神は、添付の特許請求の範囲によって実現される。
【図１】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
米国特許法§１１９（ｅ）によって、本願は、参照によりその全体が本願に組み込まれる、２００９年５月１９日出願の米国特許仮出願第６１／１７９，６４９号、および２００９年１１月２日出願の米国特許仮出願第６１／２５７，３６１号の出願日の優先権を主張する。
【０００２】
政府支援の参照
本発明は、認可番号ＮＩＤＣＲ ５Ｕ０１ＤＥ０１４９６１で、国立衛生研究所の認可の下、部分的に政府の援助を受けてなされた。政府は、本発明において特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
与えられた試料内の特定の被検体を検出するために、様々な分析手法が使用されてもよい。たとえば、試料中のタンパク質を分離するためにゲル電気泳動を使用し、その後標的タンパク質に特異的な抗体を探ることによって、試料中のタンパク質を検出するために、ウェスタンブロット法が使用されることが可能である。サザンブロット法は、電気泳動分離されたＤＮＡ断片の濾過膜への移送、およびその後のプローブハイブリダイゼーションによる断片検出を組み合わせている。ノーザンブロット法は、ＲＮＡ試料をサイズによって分離するための電気泳動の使用と、標的配列の一部または全体を補完するハイブリダイゼーションプローブを用いた検出とを、包含する。イースタンブロット法は、脂質、炭水化物、リン酸化、またはその他のいずれかのタンパク質修飾に特異的なプローブを使用して、翻訳後修飾のための電気泳動分離されたタンパク質を分析することによって、タンパク質翻訳後修飾（ＰＴＭ）を検出するために使用されることが可能である。ファーウェスタンブロット法は、ウェスタンブロット法と似ているが、しかし対象とするタンパク質を結合するために非抗体タンパク質を使用し、このためタンパク質間相互作用を検出するために使用されることが可能である。サウスウェスタンブロット法は、試料中のタンパク質を分離するためにゲル電気泳動を使用し、その後ゲノムＤＮＡ断片でプローブすることによって、ＤＮＡ結合タンパク質を検出するために使用されることが可能な手法である。
【０００４】
従来のブロット法は、上記で論じられたように、高スループット試料分析または資源不足の設定における操作のいずれかを要する用途の性能要求には、及ばない可能性がある。ブロット法は、熟練技術者によって実行される、労働集約的な、時間のかかる、多段階手順を必要とする可能性があり、このため臨床設定での使用には非実用的な可能性がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
多方向マイクロ流体装置、およびこれを使用する方法が、提供される。本発明の態様は、２つ以上の方向的に異なる流動場に試料を曝すように構成されており、分離媒体および結合媒体を含む、マイクロ流体装置を含み、結合媒体は分離媒体と流体連絡している。装置、ならびに装置を含むシステムおよびキットを使用する方法も、提供される。装置、システム、および方法は、診断および検証アッセイを含む、様々な異なる用途における利用を見出す。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１Ａ】従来の免疫ブロット法手順の図である。
【図１Ｂ】本開示の実施形態による、試料中の被検体の存在を検出するための方法の図である。
【図１Ｃ】本開示の実施形態による、マイクロ流体装置およびマイクロ流体装置内の結合媒体の明視野および蛍光画像の図である。
【図２】本開示の実施形態による、分離試料を結合媒体に移送する前（図２Ａ）および後（図２Ｂ）のタンパク質の電気泳動図である。
【図３】本開示の実施形態による、陽性および陰性タンパク質対照を使用してアッセイの特異性を検査する実験の、蛍光画像である。画像は、チャネル内抗体官能化膜に結合されたタンパク質の蛍光発光を示す。
【図４Ａ】本開示の実施形態による、マイクロ流体装置内の抗体官能化結合媒体に結合されたタンパク質の用量反応の蛍光画像である。
【図４Ｂ】本開示の実施形態による、結合媒体に結合された被検体における、蛍光シグナル対タンパク質濃度のグラフである。
【図５Ａ】本開示の実施形態による、分離媒体を含むマイクロ流体装置の図である。
【図５Ｂ】本開示の実施形態によるマイクロ流体装置を使用する、広い分子範囲のタンパク質ラダーの高分解能電気泳動分析を示す図である。
【図６】本開示の実施形態による、８％合計アクリルアミドゲル（上のグラフ）および４％合計アクリルアミドゲル（下のグラフ）における、５つの低分子量タンパク質の電気泳動図である。
【図７Ａ】本開示の実施形態によるマイクロ流体装置の図である。
【図７Ｂ】本開示の実施形態による、試料中の被検体の分離、移送、および検出の図である。
【図８】本開示の実施形態による、試料中の複数の被検体の多重分析向けに構成されたマイクロ流体装置の図である。
【図９Ａ】本開示の実施形態による、分離媒体の上流に濃縮媒体を含むマイクロ流体装置の図および画像（挿入画）である。
【図９Ｂ】本開示の実施形態による、分離媒体の上流に濃縮媒体を含むマイクロ流体装置を通る試料の電気泳動運動の画像である。
【図１０】本開示の実施形態による、第一マイクロ流体チャネルから第二マイクロ流体チャネルへの、対象とする被検体の選択的な移送の図である。
【図１１】本開示の実施形態による、結合媒体の図、および陰性および陽性対照に曝露された結合媒体の画像である。
【図１２Ａ】本開示の実施形態による、装荷媒体、分離媒体、および結合媒体を収容するチャンバ（挿入画）を含むマイクロ流体装置の明視野画像である。
【図１２Ｂ】本開示の実施形態によるチャンバの画像である。
【図１２Ｃ】本開示の実施形態によるチャンバを含むマイクロ流体装置の図である。
【図１２Ｄ】本開示の実施形態による、試料中の被検体の分離、移送、および検出の図が重ねられた画像である。
【図１３】本開示の実施形態によるマイクロ流体装置内のタンパク質ラダーの分離の画像およびグラフである。
【図１４Ａ】本開示の実施形態によるマイクロ流体装置を使用する、蛍光標識されたタンパク質の分離の画像である。
【図１４Ｂ】本開示の実施形態によるマイクロ流体装置における、分離媒体から結合媒体への蛍光標識されたタンパク質の移送の画像である。
【図１５Ａ】本開示の実施形態によるマイクロ流体装置についてシミュレートされた電場分布の画像である。
【図１５Ｂ】本開示の実施形態によるマイクロ流体装置についてシミュレートされた電場分布の画像である。
【図１５Ｃ】本開示の実施形態によるマイクロ流体装置についてシミュレートされた電場分布の画像である。
【図１５Ｄ】本開示の実施形態によるマイクロ流体装置についてシミュレートされた電場分布の画像である。
【図１５Ｅ】本開示の実施形態による、印加された電場の均一性を検査するマイクロ流体装置の画像である。
【図１５Ｆ】本開示の実施形態による、印加された電場の均一性を検査するマイクロ流体装置の画像である。
【図１６】本開示の実施形態による、電圧整形を備えるおよび備えないマイクロ流体装置を通る試料の電気運動のＣＣＤ画像である。
【図１７】本開示の実施形態による、試料中の複数の被検体の分離、移送、および検出の図が重ねられた画像である。
【図１８】本開示の実施形態による、試料中の複数の被検体の分離、移送、および検出の画像である。
【図１９】本開示の実施形態による、陰性対照に対する試料中の被検体の分離、移送、および検出の画像である。
【図２０】本開示の実施形態による、試料中の複数の被検体の多重検出の画像である。
【図２１】本開示の実施形態による、抗原捕捉効率対結合媒体幅（μｍ）のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
多方向マイクロ流体装置、およびこれを使用する方法が、提供される。本発明の態様は、２つ以上の方向的に異なる電場に試料を曝すように構成されており、分離媒体および結合媒体を含む、マイクロ流体装置を含み、結合媒体は分離媒体と流体連絡している。装置、ならびに装置を含むシステムおよびキットを使用する方法も、提供される。装置、システム、および方法は、診断および検証アッセイを含む、様々な異なる用途における利用を見出す。
【０００８】
本開示の態様は、流体試料中の被検体を検出し、２つ以上の方向的に異なる流動場に試料を曝すように構成されている、マイクロ流体装置を含み、マイクロ流体装置は：第一方向軸を備える分離流路を有する分離媒体；および第二方向軸を備える標識流路を有する結合媒体を含み、結合媒体は分離媒体と流体連絡している。
【０００９】
特定の実施形態において、分離媒体はポリマーゲルを含む。場合により、結合媒体は、担体と安定的に会合した結合メンバーを含む。場合により、担体は膜を含む。場合により、担体はポリマーゲルを含む。マイクロ流体装置の特定の実施形態は、タンパク質またはその結合断片を含む、結合メンバーを含む。たとえば、タンパク質は抗体であってもよい。場合により、被検体は蛍光標識を含む。
【００１０】
特定の実施形態において、第二方向軸は、第一方向軸に対して直交している。場合により、マイクロ流体装置は、分離媒体および結合媒体を収容するチャンバを含む。
【００１１】
本開示の態様は、流体試料中の被検体を検出する方法も含む。方法は：２つ以上の方向的に異なる流動場に試料を曝すように構成されているマイクロ流体装置内に流体試料を導入するステップと；分離試料を生成するために分離媒体を通るように試料を配向するステップと；分離試料中の被検体を検出するステップと、を含む。上述のように、マイクロ流体装置は：第一方向軸を備える分離流路を有する分離媒体；および第二方向軸を備える標識流路を有する結合媒体を含み、結合媒体は分離媒体と流体連絡している。
【００１２】
特定の実施形態において、方法は、分離試料を結合媒体に移送するステップを含む。別の実施形態において、方法は、結合メンバーを分離試料に移動するステップを含む。場合により、方法は、分離試料を生成するために分離媒体を通るように試料を配向するステップに先立って、試料を濃縮するステップをさらに含む。
【００１３】
対象とする方法の実施形態は、方法が診断方法である場合を含む。これに加えて、場合により、方法は検証方法である。
【００１４】
本開示の態様は、付加的に、流体試料中の被検体を検出するシステムを含む。システムは、本明細書に記載されるマイクロ流体装置、および検出器を含む。上述のように、マイクロ流体装置は、２つ以上の方向的に異なる流動場に試料を曝すように構成されており、マイクロ流体装置は：第一方向軸を備える分離流路を有する分離媒体；および第二方向軸を備える標識流路を有する結合媒体を含み、結合媒体は分離媒体と流体連絡している。
【００１５】
特定の実施形態において、検出器は、光電子増倍管（ＰＭＴ）、電荷結合素子（ＣＣＤ）、強化電荷結合素子（ＩＣＣＤ）、相補型金属酸化物半導体（ＣＭＯＳ）センサー、視感色彩読み取り、またはフォトダイオードである。場合により、システムは、マイクロ流体装置を通るように流体を配向するように構成されている、マイクロ流体素子をさらに含む。
【００１６】
本開示の態様は、付加的に、本明細書に記載されるマイクロ流体装置および緩衝液を含む、キットを含む。上述のように、マイクロ流体装置は：第一方向軸を備える分離流路を有する分離媒体；および第二方向軸を備える標識流路を有する結合媒体を含み、結合媒体は分離媒体と流体連絡している。
【００１７】
以下に、まず対象とするマイクロ流体装置が、より詳細に記載される。対象とするマイクロ流体装置の利用を見出す、流体試料中の被検体を検出する方法もまた、開示される。これに加えて、対象とするマイクロ流体装置を含むシステムおよびキットもまた、記載される。
【００１８】
マイクロ流体装置
本開示の実施形態は、多方向マイクロ流体装置を含む。「多方向」とは、２つ以上の方向、３つ以上の方向、４つ以上の方向など、１つより多い方向を意味する。特定の実施形態において、２つ以上の方向が共平面となるように、２つ以上の方向は１つの平面に含まれる。場合により、２つの方向が、異なる、交差する平面に含まれるように、２つ以上の方向は共平面ではない。これらの場合、２つ以上の方向は、多次元であってもよい。「多次元」とは、二次元、三次元など、１つより多い次元を意味する。多次元である方向は、三次元空間の領域を占有してもよい。たとえば、共平面ではない２つの方向は、２つの方向を含む交差する平面が三次元空間の領域を占有するように、異なった、交差する平面にそれぞれ含まれてもよい。
【００１９】
特定の実施形態において、マイクロ流体装置は、２つ以上の方向、３つ以上の方向、４つ以上の方向など、１つより多い方向（たとえば、マイクロ流体装置は多方向性である）に、流体を配向するように構成されている。たとえば、マイクロ流体装置は、２つの方向、３つの方向、４つの方向などに、流体を配向するように構成されていてもよい。場合により、マイクロ流体装置は多次元的である。たとえば、マイクロ流体装置は２つ以上の方向に流体を配向するように構成されていてもよく、ここで２つ以上の方向が２つ以上の異なる交差する平面に含まれるように、２つ以上の方向は共平面ではない。これらの場合、２つ以上の方向を含む交差する平面は、三次元空間の領域を占有してもよい。たとえば、マイクロ流体装置は、マイクロ流体装置が平面的になるように、基板に含まれていてもよい。マイクロ流体装置は、この平面内の複数の方向に、流体を配向するように構成されていてもよい。特定の実施形態において、マイクロ流体装置は、三次元など、多次元において流体を配向するように構成されている。たとえば、マイクロ流体装置は、同じ平面内の複数の方向に流体を配向するほか、マイクロ流体装置が三次元マイクロ流体装置として構成されるように、非共平面方向にも流体を配向するように構成されていてもよい。
【００２０】
特定の実施形態において、マイクロ流体装置は分離媒体を含む。分離媒体は、試料中の被検体を互いに分離するように構成されていてもよい。場合により、分離媒体は、被検体の物理的特性に基づいて、試料中の被検体を分離するように構成されている。たとえば、分離媒体は、被検体の分子量、サイズ、電荷（たとえば電荷質量比）、等電点などに基づいて、試料中の被検体を分離するように構成されていてもよい。特定の例において、分離媒体は、被検体の分子量に基づいて、試料中の被検体を分離するように構成されている。場合により、分離媒体は、被検体の等電点に基づいて（たとえば等電点収束）、試料中の被検体を分離するように構成されている。分離媒体は、試料中の被検体を分離して、被検体の明確で検出可能なバンドにするように、構成されていてもよい。「バンド」とは、被検体の濃度が周囲の領域よりも著しく高い、明確で検出可能な領域を意味する。被検体の各バンドは、単一の被検体、またはいくつかの被検体を含んでもよく、被検体の単一バンドの各被検体は、上述のように、実質的に類似の物理的特性を有する。
【００２１】
特定の実施形態において、分離媒体は、試料が分離媒体を横断する際に、試料中の被検体を分離するように構成されている。場合により、分離媒体は、試料が分離媒体を通って流れる際に、試料中の被検体を分離するように構成されている。分離媒体の態様は、分離媒体が方向軸を備える流路を有することを含む。「流路」とは、流体試料が動くときに移動する方向を意味する。場合により、流路は、試料が分離媒体、結合媒体などの媒体を横断する際に、試料が移動する方向である。先に示されたように、分離媒体は、方向軸を備える流路を有してもよい。いくつかの実施形態において、分離流路の方向軸は、分離媒体の長さに揃えられている。これらの実施形態において、試料は、分離媒体の分離流路の方向に、分離媒体を横断する（たとえば、試料は分離媒体の長さに沿って分離媒体を横断してもよい）。場合により、分離媒体の長さは、分離媒体の幅の２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍など、分離媒体の幅よりも大きい。場合により、分離媒体の分離流路は、マイクロ流体チャネルなどのチャネルによって定義される。分離媒体は、試料がマイクロ流体チャネルを通って流れる際に試料が分離媒体を横断するように、マイクロ流体チャネルに含まれてもよい。
【００２２】
特定の実施形態において、分離媒体は、ポリマーゲルなどのポリマーを含む。ポリマーゲルは、ゲル電気泳動に適したゲルであってもよい。ポリマーゲルは、ポリアクリルアミドゲル、アガロースゲルなどを含んでもよいが、これらに限定されない。分離媒体の分解能は、たとえば、ただしこれらに限定されないが、孔径、総ポリマー含有量（たとえば総アクリルアミド含有量）、架橋剤の濃度、印加された電場、アッセイ時間など、様々な要因に依存してもよい。たとえば、分離媒体の分解能は、分離媒体の孔径に依存してもよい。場合により、孔径は、分離媒体の総ポリマー含有量および／または分離媒体中の架橋剤の濃度に依存する。特定の例において、分離媒体は、５，０００Ｄａ以下、または２，０００Ｄａ以下、または１，０００Ｄａ以下、たとえば５００Ｄａ以下、または１００Ｄａ以下を含む、７，０００Ｄａ以下などの、１０，０００Ｄａ以下の分子量差で被検体を分解するように構成されている。場合により、分離媒体は、５％から１０％を含む、たとえば３％から１５％など、１％から２０％の範囲の総アクリルアミド含有量を有する、ポリアクリルアミドゲルを含んでもよい。
【００２３】
場合により、マイクロ流体装置は、分離媒体の上流に位置する濃縮媒体を含む。「上流」とは、流体の流れの源の近位に位置していることを意味する。濃縮媒体は、試料が分離媒体に接触する前に、試料を濃縮するように構成されていてもよい。濃縮媒体は、小さい孔径を有するポリマーゲルなどの、ポリマーゲルを含んでもよい。たとえば、濃縮媒体は、５％から８％、または５％から７％を含む、たとえば５％から９％など、５％から１０％の範囲の総アクリルアミド含有量を有する、ポリアクリルアミドゲルを含んでもよい。場合により、濃縮媒体は、６％の総ポリアクリルアミド含有量を有する。特定の実施形態において、濃縮媒体は、サイズ排除膜などの膜を含む。濃縮媒体の小さい孔径は、濃縮媒体を通る試料の電気泳動を遅らせ、そうして分離媒体に接触する前に試料を濃縮する。場合により、濃縮膜は、試料の濃度を２倍以上、４倍以上、１０倍以上、２５倍以上、５０倍以上、１００倍以上、５００倍以上、１０００倍以上、２５００倍以上などに、増加させるように構成されている。
【００２４】
特定の実施形態において、対象とするマイクロ流体装置は、分離媒体の下流に位置する結合媒体を含む。「下流」とは、流体の流れの源の遠位に位置していることを意味する。結合媒体は、方向軸を備える標識流路を有してもよい。場合により、標識流路は、試料または被検体が結合媒体を横断する際に試料が移動する方向である。試料または被検体は、結合媒体の標識流路の方向に、結合媒体を横断してもよい（たとえば、試料は結合媒体の方向軸に沿って分離媒体を横断してもよい）。結合媒体は、分離媒体の方向軸と同じかまたは異なる方向軸を有してもよい。たとえば、分離媒体は第一方向軸を有してもよく、結合媒体は第二方向軸を有してもよい。第一方向軸は、第二方向軸と同じ方向に揃えられていてもよい。場合により、第一方向軸は、第二方向軸と異なる方向に揃えられている。第一方向軸が第二方向軸とは異なる方向に揃えられている場合、上述のように、マイクロ流体装置は多次元（たとえば多方向）マイクロ流体装置である。たとえば、第二方向軸は、第一方向軸に対して１２０度以下、９０度以下、６０度以下、４５度以下、または３０度以下を含む、１５０度以下、１３５度以下など、第一方向軸に対して１８０度以下の角度であってもよい。特定の実施形態において、第二方向軸は第一方向軸に対して直交している。
【００２５】
特定の場合、結合媒体は、ポリマーゲルまたはポリマーモノリスなど、ポリマーを含む。モノリスとは、単一の、連続構造体を意味する。モノリスは、同じ物理および化学成分を備える単一の領域を含んでもよく、またはこれらの物理および化学成分に関して異なる、２つ以上の領域を含んでもよい。ポリマーゲルは、ゲル電気泳動に適したゲルであってもよい。ポリマーゲルは、ポリアクリルアミドゲル、アガロースゲルなどを含んでもよいが、これらに限定されない。場合により、結合媒体は、５％から１０％を含む、３％から１５％など、１％から２０％の範囲の総アクリルアミド含有量を有する、ポリアクリルアミドゲルを含んでもよい。ポリマーモノリスは、クロマトグラフィに適したモノリスであってもよい。ポリマーモノリスは、アクリレートポリマー、アルキルアクリレートポリマー、アルキルアルキルアクリレートポリマー、それらの共重合体などを含んでもよいが、これらに限定されない。場合により、結合媒体は膜を含む。膜は、ニトロセルロース膜、ポリマー膜などを含んでもよい。場合により、結合媒体はビーズを含む。ビーズは、ニトロセルロースビーズ、ポリマービーズ、それらの組合せなどを含んでもよい。
【００２６】
特定の実施形態において、結合媒体は、対象とする被検体に結合し、これを保持するように構成されていてもよい。場合により、結合媒体に結合された被検体は、被検体の検出を容易にする。たとえば、結合媒体は、担体と安定的に会合した結合メンバーを含んでもよい。「安定的に会合した」とは、ある部分が、標準状態において、別の部分または構造体と結合もしくは会合していることを意味する。特定の例において、上述のように、担体は、ポリマーゲルまたは膜である。結合は、イオン結合、疎水性相互作用、水素結合、ファンデルワールス力（たとえば、ロンドン分散力）、双極子間相互作用などの、ただしこれらに限定されない、共有結合および非共有相互作用を含んでもよい。特定の実施形態において、結合メンバーは、担体に架橋または共重合されるなど、担体に共有的に結合されてもよい。結合メンバーと担体との間の共有結合は、以下のものなど、ただしこれらに限定されない反応基を包含する共有結合を含む：結合メンバーおよび担体の両方のアミノ／アミド基との共有結合を形成するために、二官能性架橋剤のグルタルアルデヒドを利用する、グルタルアルデヒド；結合メンバーに共有結合するためにグリシジル官能基（すなわちエポキシ官能基）を、および担体に結合するためにメタクリレート基を利用する、グリシジルメタクリレート；担体に共有的に結合するために、結合メンバーのアミン基をアシル化するために使用され得る、４−ニトロフェニルメタクリレート；担体への取り込みのため、結合メンバー上のアミノ基と相互作用するためにＮ−ヒドロキシスクシンイミジル基を利用する、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルアクリレート（ＮＨＳ−アクリレート）。
【００２７】
結合メンバーは、標的とされるタンパク質、または核酸配列、または生体高分子（たとえば対象とする被検体）に具体的に結合するいずれの分子であってもよい。被検体の性質に応じて、結合メンバーは、（ａ）核酸の検出のための標的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列の特異領域を補完するＤＮＡの一本鎖；（ｂ）タンパク質およびペプチドの検出のためのペプチド被検体のエピトープに対する抗体；（ｃ）特異的結合対のメンバーなど、いずれかの認識分子、であってもよいが、これらに限定されない。たとえば、適切な特異的結合対は：受容体／リガンド対のメンバー；受容体のリガンド結合部；抗体／抗原対のメンバー；抗体の抗原−結合断片；ハプテン；レクチン／炭水化物対のメンバー；酵素／基板対のメンバー；ビオチン／アビジン；ビオチン／ストレプトアビジン；ジゴキシン／抗ジゴキシン；ＤＮＡまたはＲＮＡアプタマー結合対のメンバー；ペプチドアプタマー結合対のメンバー；などを含むが、これらに限定されない。
【００２８】
特定の実施形態において、結合メンバーは抗体を含む。結合メンバー抗体は、対象とする被検体と特異的に結合してもよい。場合により、結合メンバーは、上述のように、担体に安定的に会合している。担体結合された結合メンバーは、対象とする被検体と特異的に結合するように構成されていてもよい。したがって、担体結合された結合メンバーとの対象とする被検体の特異的結合は、対象とする被検体を担体と間接的に結合されてもよい。対象とする被検体の担体との結合は、被検体を担体と安定的に会合させ、こうして対象とする被検体の検出を容易にしてもよい。
【００２９】
特定の実施形態において、２つ以上の異なる結合メンバーは、結合媒体と安定的に会合している。２つ以上の異なる結合メンバーは、同じまたは異なる被検体と特異的に結合してもよい。場合により、２つ以上の異なる結合メンバーは、同じ被検体と特異的に結合してもよい。たとえば、２つ以上の異なる結合メンバーは、同じ被検体上の異なるエピトープに特異的な異なる抗体を含んでもよい。別の場合には、２つ以上の異なる結合メンバーは、異なる被検体と特異的に結合してもよい。たとえば、２つ以上の異なる結合メンバーは、異なる被検体上のエピトープに特異的な異なる抗体を含んでもよい。
【００３０】
マイクロ流体装置の態様は、分離媒体が結合媒体と流体連絡している実施形態を含む。特定の実施形態において、結合媒体は分離媒体の下流に配置されている。マイクロ流体装置は、まず分離試料を生成するために、分離媒体を通じて試料を配向するように構成されていてもよい。場合により、分離媒体および結合媒体は、互いに流体連絡しているが、しかし互いに直接物理的には接触していない。たとえば、分離媒体は、チャネルまたは別の媒体と流体連絡していてもよく、これはひいては結合媒体と流体連絡している。特定の実施形態において、マイクロ流体装置は、分離媒体および結合媒体が互いに直接的に流体連絡するように、構成されている。たとえば、分離媒体は、結合媒体と直接接触していてもよい。場合により、分離媒体および結合媒体は、共重合など、互いに結合されている。分離媒体が結合媒体と直接流体連絡している実施形態は、部分の損失を最小限に抑えながら、分離媒体から結合媒体への部分の移送、または結合媒体から分離媒体への部分の移送を容易にし得る。場合により、マイクロ流体装置は、部分がある媒体から別の媒体へ（たとえば、分離媒体から結合媒体へ、または結合媒体から分離媒体へ）定量的に移送されるように、構成されている。
【００３１】
特定の実施形態において、マイクロ流体装置は、結合媒体を通じて分離試料を配向するように構成されている。場合により、マイクロ流体装置は、試料または被検体が、分離媒体から介在するチャネルまたは媒体まで横断し、その後結合媒体まで横断するように、構成されている。別の場合には、マイクロ流体装置は、試料または被検体が分離媒体から結合媒体まで直接横断できるように、分離媒体および結合媒体が互いに直接流体連絡するように、構成されている。上述のように、結合媒体は、分離試料中の対象とする被検体の検出のために被検体に結合するように構成された、結合メンバーを含んでもよい。
【００３２】
特定の場合、結合媒体は、結合媒体に結合されない結合メンバーを含む。たとえば、結合媒体は、緩衝液など、流体中に懸濁または溶解している結合メンバーを含んでもよい。これらの場合、装置は、結合媒体から分離媒体に向かって結合メンバーを配向するように構成されている。たとえば、装置は、結合媒体から分離媒体の分離流路に向かって結合メンバーを配向するように構成されていてもよい。上述のように、結合メンバーは、分離試料中の対象とする被検体の検出のために被検体に結合するように構成されていてもよい。場合により、マイクロ流体装置は、結合メンバーが結合媒体から介在するチャネルまたは媒体まで横断し、その後分離媒体まで横断するように、構成されている。別の場合には、マイクロ流体装置は、結合メンバーが結合媒体から分離媒体まで直接横断できるように、結合媒体および分離媒体が互いに直接流体連絡するように、構成されている。
【００３３】
場合により、マイクロ流体装置は、２つ以上の方向的に異なる流動場に試料を曝すように構成されている。「流動場」とは、各部分が実質的に同じ方向に領域を横断する領域を意味する。たとえば、流動場は、移動部分が実質的に同じ方向に媒体を通って移動する領域を、含んでもよい。流動場は、緩衝液、被検体、試薬などの部分が実質的に同じ方向に媒体を通って移動する、分離媒体、結合媒体、装荷媒体などの媒体を、含んでもよい。流動場は、印加された電場、圧力差、電気浸透などに誘導されてもよい。いくつかの実施形態において、２つ以上の流動場は、方向的に異なっていてもよい。たとえば、第一流動場は、分離媒体の分離流路の方向軸に揃えられていてもよい。第一流動場は、分離流路に沿って分離媒体を通じて試料または被検体を配向するように構成されていてもよい。第二流動場は、結合媒体の標識流路の方向軸に揃えられていてもよい。場合により、第二流動場は、標識流路に沿って結合媒体を通じて試料または被検体を配向するように構成されている。第二流動場は、対象とする被検体がその特定の結合メンバーと接触するように、結合媒体を通じて試料または被検体を配向するように構成されていてもよい。場合により、第二流動場は、標識流路に沿って結合媒体を通じて結合メンバーを配向するように構成されている。第二流動場は、結合メンバーがその対象とする特定の被検体と接触するように、結合媒体を通じて結合メンバーを配向するように構成されていてもよい。上述のように、特定の例において、標識流路の方向軸は、分離流路の方向軸に対して直交している。これらの例において、第二流動場は第一流動場に対して直交していてもよい。
【００３４】
特定の実施形態において、マイクロ流体装置は、２つ以上の方向的に異なる電場に試料を曝すように構成されている。電場は、マイクロ流体装置を通る試料の運動（たとえば、マイクロ流体装置の１つの領域からマイクロ流体装置の別の領域への試料の電気運動移送）を容易にし得る。電場はまた、上述のように、電気泳動（たとえば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ））による試料中の被検体の分離も容易にし得る。たとえば、電場は、マイクロ流体装置の分離媒体を通じて試料中の被検体を配向するように構成されていてもよい。電場は、被検体の物理的特性に基づく試料中の被検体の分離を容易にするように、構成されていてもよい。たとえば、電場は、被検体の分子量、サイズ、電荷（たとえば電荷質量比）、等電点などに基づく試料中の被検体の分離を容易にするように、構成されていてもよい。特定の例において、電場は、被検体の分子量に基づく試料中の被検体の分離を容易にするように、構成されていてもよい。場合により、電場は、被検体の等電点に基づく試料中の被検体の分離を容易にするように、構成されている。
【００３５】
いくつかの実施形態において、２つ以上の電場は方向的に異なっていてもよい。たとえば、第一電場は、分離媒体の分離流路の方向軸に揃えられていてもよい。第一電場は、分離流路に沿って分離媒体を通じて試料または被検体を配向するように構成されていてもよい。第二電場は、結合媒体の標識流路の方向軸に揃えられていてもよい。場合により、第二電場は、標識流路に沿って結合媒体を通じて試料または被検体を配向するように構成されている。第二電場は、対象とする被検体がその特定の結合メンバーと接触するように、結合媒体を通じて試料または被検体を配向するように構成されていてもよい。場合により、第二電場は、標識流路に沿って結合媒体を通じて結合メンバーを配向するように構成されている。第二電場は、結合メンバーが対象とするその特定の被検体と接触するように、結合媒体を通じて結合メンバーを配向するように構成されていてもよい。上述のように、特定の例において、標識流路の方向軸は、分離流路の方向軸に対して直交している。これらの例において、第二電場は、第一電場に対して直交していてもよい。
【００３６】
特定の実施形態において、マイクロ流体装置は、電場を発生するように構成された１つ以上の電場発生器を含む。電場発生器は、分離媒体、結合媒体、装荷媒体などのうちの１つ以上など、マイクロ流体装置の様々な領域に、電場を印加するように構成されていてもよい。電場発生器は、マイクロ流体装置内の様々な媒体を通じて試料中の被検体および部分を電気運動的に移送するように、構成されていてもよい。特定の例において、電場発生器は、マイクロ流体装置上に配置されるなど、マイクロ流体装置の近位にあってもよい。場合により、電場発生器は、マイクロ流体装置から離れた位置にある。たとえば、電場発生器は、以下により詳細に記載されるように、被検体を検出するためのシステムに組み込まれてもよい。
【００３７】
マイクロ流体装置の態様は、移送流路を含む。移送流路は、結合媒体の標識流路と流体連絡していてもよい。たとえば、移送流路は、結合流路の下流に位置していてもよい。上述のように、結合媒体は、対象とする被検体に特異的に結合する結合メンバーを含んでもよい。対象としない部分は、結合メンバーによって結合されず、結合メンバーに結合することなく、結合媒体を横断してもよい。特定の実施形態において、移送流路は、結合媒体から離れる方へ対象としない部分を配向するように構成されている。たとえば、移送流路は、結合メンバーに結合することなく結合媒体を横断する、対象としない部分を、結合媒体から離れる方へ配向するように構成されていてもよい。特定の実施形態において、移送流路は、結合媒体内の化学的または物理的処置を通じてまたはそこへ向けて部分を配向するように、構成されている。たとえば、溶解した被検体は、化学的変性剤、リフォールディング化学薬品、洗剤などを通じて、推進されてもよい。
【００３８】
場合により、移送流路の下流末端は、移送流路が対象としない部分を排液リザーバに配向するように構成されるように、排液リザーバと流体連絡している。場合により、移送流路の下流末端は、移送流路が、結合メンバーに結合することなく結合媒体を通過する部分を、その部分のさらなる特徴付けのための二次分析装置に配向するように構成されるように、二次分析装置と流体連絡している。二次分析装置は、紫外分光計、赤外分光計、質量分析計、ＨＰＬＣ、親和性アッセイ装置などを含んでもよいが、これらに限定されない。場合により、二次分析装置は、マイクロ流体装置と同じ基板上に含まれる。これらの実施形態において、マイクロ流体装置および二次分析装置は、１つ以上の異なる分析法による試料の分析のため、単一の基板上に設けられてもよい。特定の実施形態において、二次分析装置はシステムの一部として含まれ、システムはマイクロ流体装置および１つ以上の個別の二次分析装置を含む。上述のように、マイクロ流体装置および二次分析装置は、マイクロ流体装置を通過する部分がその部分のさらなる特徴付けのために二次分析装置に配向されるように、互いに流体連絡していてもよい。
【００３９】
いくつかの態様において、分離および結合媒体は、図１Ｃおよび図７Ａに示されるように、個別のチャネルの異なる長さにおいて設けられている。これらの実施形態において、マイクロ流体装置は、互いに流体連絡しているマイクロ流体チャネルを含むように構成されている。マイクロ流体チャネルは、チャネルの長さがチャネルの幅よりも大きい、長尺チャネルであってもよい。たとえば、マイクロ流体チャネルの長さは、マイクロ流体チャネルの幅の２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍など、マイクロ流体チャネルの幅よりも大きくてもよい。
【００４０】
マイクロ流体装置は、上述のように、分離媒体を含む分離チャネルを含んでもよい。マイクロ流体装置は、上述のように、結合媒体を含む結合チャネルを含んでもよい。場合により、分離チャネル内の分離媒体が結合チャネル内の結合媒体と流体連絡するように、分離チャネルは結合チャネルと流体連絡している。マイクロ流体装置のいくつかの実施形態は、分離チャネルおよび結合チャネルを含み、ここで分離チャネルは第一方向軸を有し、結合チャネルは第二方向軸を有する。第一方向軸および第二方向軸は、互いに同じ方向に揃えられていてもよく、あるいは互いに異なる方向に揃えられていてもよい。たとえば、分離チャネルの方向軸は、結合チャネルに対して１２０度以下、９０度以下、６０度以下、４５度以下、または３０度以下を含む、１５０度以下、１３５度以下など、結合チャネルに対して１８０度以下の角度であってもよい。特定の実施形態において、結合チャネルの方向軸は、分離チャネルの方向軸に対して直交している。
【００４１】
マイクロ流体チャネルの実施形態は、マイクロ流体装置と適合し、マイクロ流体装置内で使用される試料、緩衝液、試薬などと適合する、いずれかの適切な材料で作られてもよい。場合により、マイクロ流体チャネルは、対象とするマイクロ流体装置および方法において使用される試料、緩衝液、試薬などに対して不活性な（たとえば、分解または反応しない）材料で作られる。たとえば、マイクロ流体チャネルは、ガラス、石英、ポリマー、エラストマー、紙、それらの組合せなどの、ただしこれらに限定されない材料で作られてもよい。
【００４２】
特定の実施形態において、マイクロ流体チャネルは、たとえば５０μｍから１５０μｍなど、１０μｍから２００μｍを含む、５μｍから３００μｍなど、１μｍから５００μｍの範囲の幅を有する。場合により、マイクロ流体チャネルは１００μｍの幅を有する。特定の実施形態において、マイクロ流体チャネルは、１０μｍから５０μｍを含む、５μｍから１００μｍなど、１μｍから２００μｍの範囲の深さを有する。場合により、マイクロ流体チャネルは２５μｍの深さを有する。
【００４３】
場合により、マイクロ流体装置は、１つ以上の試料注入ポートを含む。試料注入ポートは、試料がマイクロ流体装置内に導入されることを可能にするように構成されていてもよい。試料注入ポートは、分離媒体と流体連絡していてもよい。場合により、試料注入ポートは、分離媒体の上流末端と流体連絡している。試料注入ポートは、流体が試料注入ポートから排出されるのを防止するように構成された構造を、さらに含んでもよい。たとえば、試料注入ポートは、たとえば、マイクロ流体装置内への試料の導入を可能にするために穿孔または開口され、その後試料および／または緩衝液を含む流体が試料注入ポートから排出されるのを実質的に防止するために再封止または閉鎖されてもよい、キャップ、弁、シールなどを含んでもよい。
【００４４】
図１Ｃは、マイクロ流体装置１０の図を示す。マイクロ流体装置１０は、結合媒体１２と流体連絡している分離媒体１１を含む。マイクロ流体装置１０はまた、流体注入口１３、排液排出口１４、試料注入口１５、流体排出口１６、流体注入口１７、および流体排出口１８など、様々な注入口および排出口も含む。流体排出口１６は、分離された被検体を、必要に応じて排液リザーバまたは下流の二次分析装置へ配向するように構成されていてもよい。同様に、流体排出口１８は、非結合の被検体を、必要に応じて排液リザーバまたは下流の二次分析装置へ配向するように構成されていてもよい。図１Ｃはまた、マイクロ流体装置内の結合媒体の明視野および蛍光画像も示す。
【００４５】
図７Ａもまた、上述のように、互いに流体連絡しているマイクロ流体チャネルを含む、マイクロ流体装置７００の図を示す。マイクロ流体装置７００は、分離媒体７０２を含む分離チャネル７０１を含む。分離チャネルは、結合媒体７０４を含む結合チャネル７０３と流体連絡している。マイクロ流体装置７００もまた、以下のものなど、ただしこれらに限定されない、様々な注入口および排出口を含んでもよい：マイクロ流体装置７００内に向かって流体を配向するように構成されていてもよい、流体注入口７０５；排液をマイクロ流体装置７００から離れる方へ配向するように構成されていてもよい、排液排出口７０６；分離媒体より上流のマイクロ流体装置７００内に試料を配向するように構成されていてもよい、試料注入口７０７；結合チャネル７０３に移送されなかった分離された被検体を、必要に応じて排液リザーバまたは下流の二次分析装置へ配向するように構成されていてもよい、流体排出口７０８；移送チャネル７１１へ流体を配向するように構成されていてもよい、流体注入口７０９；および非結合の被検体を、必要に応じて排液リザーバまたは下流の二次分析装置へ配向するように構成されていてもよい、流体排出口７１０。
【００４６】
いくつかの態様において、分離および結合媒体は、図１２〜図１６に示されるように、単一の共通チャンバ内に設けられている。これらの実施形態において、マイクロ流体装置はチャンバを含む。チャンバは、分離媒体および結合媒体を含んでもよい。上述のように、分離媒体は、結合媒体と、直接物理接触などにより、流体連絡していてもよい。場合により、分離媒体は、結合媒体に共重合または架橋されるなど、結合媒体に結合される。したがって、チャンバは、互いに流体連絡している分離媒体および結合媒体の両方を含むように構成されてもよい。チャンバは、分離媒体の分離流路が結合媒体の標識流路より上流になるように、分離媒体および結合媒体を含むように構成されてもよい。
【００４７】
分離媒体および結合媒体に加えて、チャンバは、装荷媒体も含んでもよい。装荷媒体は、分離媒体と流体連絡していてもよい。場合により、装荷媒体は、分離媒体と直接物理接触している。たとえば、装荷媒体は、分離媒体に共重合または架橋されるなど、分離媒体に結合されてもよい。装荷媒体は、試料が分離媒体に接触する前に装荷媒体に接触するように、分離媒体より上流に位置してもよい。特定の実施形態において、装荷媒体は、分離媒体との試料の接触を容易にする。たとえば、装荷媒体は、試料が分離媒体と接触する前に、試料を濃縮するように構成されていてもよい。特定の実施形態において、装荷媒体は、異なる物理的および／または化学的特性を有する、２つ以上の領域を含んでもよい。装荷媒体は、装荷領域および積層領域を含んでもよい。装荷媒体は、積層領域より上流に装荷領域を含むように構成されていてもよい。
【００４８】
特定の実施形態において、装荷媒体は、ポリマーゲルなどのポリマーを含む。ポリマーゲルは、ゲル電気泳動に適したゲルであってもよい。ポリマーゲルは、ポリアクリルアミドゲル、アガロースゲルなどを含んでもよいが、これらに限定されない。場合により、装荷領域は、大きい孔径を有するポリマーゲルを含む。たとえば、装荷領域は、３％以下または２％以下を含む、４％以下など、５％以下の総アクリルアミド含有量を有する、ポリアクリルアミドゲルを含んでもよい。場合により、装荷領域は３％の総ポリアクリルアミド含有量を有する。場合により、装荷媒体の積層領域は、試料が分離媒体に接触する前に、試料を濃縮するように構成されていてもよい。積層領域は、小さい孔径を有するポリマーゲルを含んでもよい。たとえば、積層領域は、５％から８％、または５％から７％を含む、５％から９％など、５％から１０％の範囲の総アクリルアミド含有量を有する、ポリアクリルアミドゲルを含んでもよい。場合により、積層領域は６％の総ポリアクリルアミド含有量を有する。積層領域の小さい孔径は、積層領域を通る試料の電気泳動運動を遅らせ、そうして分離媒体に接触する前に試料を濃縮してもよい。
【００４９】
特定の例において、チャンバは、装荷媒体、分離媒体、および結合媒体を含む。チャンバは、上述のように、装荷媒体、分離媒体、および結合媒体が互いに流体連絡するように、装荷媒体、分離媒体、および結合媒体を含むように構成されていてもよい。たとえば、チャンバは、様々な領域を備える連続ポリマーゲルを含んでもよい。連続ポリマーゲルの各領域は、異なる物理的および／または化学的特性を有してもよい。連続ポリマーゲルは、装荷媒体を有する第一領域、分離媒体を有する第二領域、および結合媒体を有する第三領域を含んでもよい。ポリマーゲルの各領域の流路は、試料がまず装荷媒体に接触し、次に分離媒体に接触し、最後に結合媒体に接触するように、構成されていてもよい。
【００５０】
特定の実施形態において、ポリマーゲルは、０．５ｍｍから１．５ｍｍを含む、０．２ｍｍから２．５ｍｍなど、０．１ｍｍから５ｍｍの範囲の幅を有する。場合により、ポリマーゲルは１．０ｍｍの幅を有する。場合により、ポリマーゲルは、１ｍｍから２ｍｍを含む、０．５ｍｍから３ｍｍなど、０．５ｍｍから５ｍｍの範囲の長さを有する。特定の例において、ポリマーゲルは１．５ｍｍの長さを有する。特定の実施形態において、装荷媒体を含むポリマーゲルの第一領域は、０．５ｍｍから１．５ｍｍを含む、０．２ｍｍから２．５ｍｍなど、０．１ｍｍから５ｍｍの範囲の幅を有する。場合により、装荷媒体を含むポリマーゲルの第一領域は０．９ｍｍの幅を有する。場合により、装荷媒体を含むポリマーゲルの第一領域は、０．１ｍｍから０．５ｍｍを含む、０．１ｍｍから１ｍｍなど、０．１ｍｍから２ｍｍの範囲の長さを有する。特定の実施形態において、装荷媒体を含むポリマーゲルの第一領域は０．２ｍｍの長さを有する。特定の例において、分離媒体を含むポリマーゲルの第二領域は、０．５ｍｍから１．５ｍｍを含む、０．２ｍｍから２．５ｍｍなど、０．１ｍｍから５ｍｍの範囲の幅を有する。場合により、分離媒体を含むポリマーゲルの第二領域は０．９ｍｍの幅を有する。場合により、分離媒体を含むポリマーゲルの第二領域は、１ｍｍから２ｍｍを含む、０．５ｍｍから３ｍｍなど、０．５ｍｍから５ｍｍの範囲の長さを有する。特定の実施形態において、分離媒体を含むポリマーゲルの第二領域は１．３ｍｍの長さを有する。特定の例において、結合媒体を含むポリマーゲルの第三領域は、０．０５ｍｍから０．５ｍｍを含む、０．０１ｍｍから１ｍｍなど、０．０１ｍｍから２ｍｍの範囲の幅を有する。場合により、結合媒体を含むポリマーゲルの第三領域は０．１ｍｍの幅を有する。場合により、結合媒体を含むポリマーゲルの第三領域は、１ｍｍから２ｍｍを含む、０．５ｍｍから３ｍｍなど、０．５ｍｍから５ｍｍの範囲の長さを有する。特定の実施形態において、結合媒体を含むポリマーゲルの第三領域は１．５ｍｍの長さを有する。
【００５１】
特定の実施形態において、マイクロ流体装置は、１ｃｍから５ｍｍを含む、５ｃｍから５ｍｍなど、１０ｃｍから１ｍｍの範囲の幅を有する。場合により、マイクロ流体は、１０ｃｍから５ｍｍ、または１ｃｍから５ｍｍを含む、５０ｃｍから１ｍｍなど、１００ｃｍから１ｍｍの範囲の長さを有する。特定の態様において、マイクロ流体装置は、たとえば１０ｃｍ２以下、または５ｃｍ２以下、または３ｃｍ２以下、または１ｃｍ２以下、または０．５ｃｍ２以下、または０．２５ｃｍ２以下、または０．１ｃｍ２以下など、５０ｃｍ２以下を含む、１００ｃｍ２以下など、１０００ｃｍ２以下の面積を有する。
【００５２】
特定の実施形態において、マイクロ流体装置は実質的に透明である。「透明」とは、物質が、可視光線をその物質に透過させることを意味する。いくつかの実施形態において、透明なマイクロ流体装置は、たとえば蛍光標識などの検出可能標識を含む被検体など、結合媒体に結合された被検体の検出を容易にする。場合により、マイクロ流体装置は実質的に不透明である。「不透明」とは、物質が、可視光線をその物質に透過させないことを意味する。特定の例において、不透明なマイクロ流体装置は、光の存在下で反応または分解する被検体など、光に対して感受性の被検体の分析を、容易にする可能性がある。
【００５３】
方法
方法の実施形態は、たとえば試料中の１つ以上の被検体の存在または不存在を判定するなど、被検体が試料中に存在するか否かを判定することを、対象にしている。方法の特定の実施形態において、試料中の１つ以上の被検体の存在は、定質的にまたは定量的に判定されてもよい。定質的判定は、試料中の被検体の存在に関して単純なイエス／ノーの結果がユーザに提供される判定を含む。定量的判定は、試料中の被検体の量に関してたとえば低、中、高などのおおまかな結果がユーザに提供される準定量的判定、および被検体の濃度の正確な測定値がユーザに提供される詳細な結果の両方を含む。
【００５４】
特定の実施形態において、マイクロ流体装置は、試料中の１つ以上の被検体の存在を検出するように構成されている。対象とするマイクロ流体装置を用いて分析されてもよい試料は多様であり、単純および複合試料の両方を含む。単純試料は、対象とする被検体を含む試料であって、対象としない１つ以上の分子実体を含んでも含まなくてもよく、ここでこれら非対象分子実体の数は、たとえば１０以下、５以下など、小さくてよい。単純試料は、たとえば干渉する可能性のある分子実体を試料から除去するために、何らかの方法で処理された、初期の生体またはその他の試料を含んでもよい。「複合試料」とは、対象とする被検体を含んでも含まなくてもよいが、対象としない多くの異なるタンパク質およびその他の分子も含む試料を、意味する。場合により、対象とする方法で分析された複合試料は、分子構造または物理的特性に関して（たとえば、分子量、サイズ、電荷、等電点など）互いに異なる、たとえば１０３以上、１０４以上（たとえば１５，０００；２０，０００または２５，０００以上）など、１００以上を含む、２０以上など、１０以上の明確な（すなわち異なる）分子実体を含むものである。
【００５５】
特定の実施形態において、対象とする試料は、尿、血液、血清、血漿、唾液、精液、前立腺液、乳頭吸引液、涙液、汗、便、口腔粘膜採取物、脳脊髄液、細胞溶解物試料、羊水、胃腸液、生検組織（たとえば、レーザー・キャプチャー・マイクロダイセクション（ＬＣＭ）から得られる試料）などの、ただしこれらに限定されない、生体試料である。試料は、生体試料であってもよく、またはヒト、動物、植物、菌類、酵母、細菌、組織培養、ウイルス培養、またはそれらの組合せに由来する生体試料から、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、およびペプチドを成功裏に抽出するための従来の方法を用いて、抽出されてもよい。特定の実施形態において、試料は、流体中の被検体の溶液など、流体試料である。流体は、水、緩衝液などの、ただしこれらに限定されない、水溶液であってもよい。
【００５６】
上述のように、対象とする方法で分析されてもよい試料は、対象とする１つ以上の被検体を含んでもよい。検出可能な被検体の例は：たとえば二本または一本鎖ＤＮＡ、二本または一本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマーなどの、核酸；たとえば抗体、二重特異性抗体、Ｆａｂ断片、ＤＮＡまたはＲＮＡ結合タンパク質、リン酸化タンパク質（ホスホプロテオミクス）、ペプチドアプタマー、エピトープなど、修飾があるかまたはない、タンパク質およびペプチド；阻害物質、活性物質、リガンドなどの、小分子；オリゴまたは多糖；それらの混合物；などを含むが、これらに限定されない。
【００５７】
いくつかの実施形態において、対象とする被検体は、対象とする被検体の存在がその後検出され得るように、同定されることが可能である。被検体は、本明細書に記載される方法のいずれによって同定されてもよい。たとえば、被検体は、検出可能標識を含んでもよい。検出可能標識は、蛍光標識、比色標識、化学発光標識、酵素結合試薬、マルチカラー試薬、アビジン−ストレプトアビジン会合検出試薬、不可視検出可能標識（たとえば、放射標識、金粒子、磁気標識、電気読み取り値、密度シグナルなど）などを含むが、これらに限定されない。特定の実施形態において、検出可能標識は蛍光標識である。蛍光標識は、蛍光検出器によって検出可能な、標識部分である。たとえば、対象とする被検体への蛍光標識の結合は、対象とする被検体が蛍光検出器によって検出されることを可能にし得る。蛍光標識の例は、試薬と接触すると蛍光を発する蛍光分子、電磁放射線（たとえば、紫外線、可視光線、Ｘ線など）で照射されたときに蛍光を発する蛍光分子、などを含むが、これらに限定されない。
【００５８】
適切な蛍光分子（蛍光体）は、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、カルボキシフルオレセインのスクシンイミジルエステル、フルオレセインのスクシンイミジルエステル、フルオロセインジクロロトリアジンの５−異性体、ケージドカルボキシフルオレセイン−アラニン−カルボキシアミド、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５１４；ルシファーイエロー、アクリジンオレンジ、ローダミン、テトラメチルローダミン、テキサスレッド、ヨウ化プロピジウム、ＪＣ−１（５，５’，６，６’−テトラクロロ−１，１’，３，３’−テトラエチルベンゾイミダゾイルカルボシアニンヨウ化物）、テトラブロモローダミン１２３、ローダミン６Ｇ、ＴＭＲＭ（テトラメチルローダミンメチルエステル）、ＴＭＲＥ（テトラメチルローダミンエチルエステル）、テトラメチルロサミン、ローダミンＢおよび４−ジメチルアミノテトラメチルロサミン、緑色蛍光タンパク質、青色偏移緑色蛍光タンパク質、シアン偏移緑色蛍光タンパク質、赤色偏移緑色蛍光タンパク質、黄色偏移緑色蛍光タンパク質、４−アセトアミド−４’−イソチオシアネートスチルベン−２，２’ジスルホン酸；アクリジン、アクリジンイソチオシアネートなどのアクリジンおよび誘導体；５−（２’−アミノエチル）アミノナフタリン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）；４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニル）フェニル］ナフト−アリミド−３，５ジスルホン酸塩；Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド；アントラニルアミド；４，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−４−ボラ−３ａ，４ａジアザ−５−インダセン−３−プロピオニ−ｃ酸ＢＯＤＩＰＹ；カスケードブルー；ブリリアントイエロー；クマリンおよび誘導体：クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ，クマリン１２０）、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（クマリン１５１）；シアニン染料；シアノシン；４’，６−ジアミニジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）；５’，５”−ジブロモピロガロール−スルホナフタレイン（ブロモピロガロールレッド）；７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン；ジエチレントリアミンペンタアセテート；４，４’−ジイソチオシアナートジヒドロ−スチルベン−２−，２’−ジスルホン酸；４，４’−ジイソチオシアナートスチルベン−２，２’−ジスルホン酸；５−（ジメチルアミノ］ナフタリン−１−スルホニルクロリド（ＤＮＳ，ダンシルクロリド）；４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）；エオシンおよび誘導体：エオシン、エオシンイソチオシアネート、エリスロシンおよび誘導体：エリスロシンＢ、エリスロシン、イソチオシアネート；エチジウム；フルオレセインおよび誘導体：５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノ− −フルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’，７’ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ＱＦＩＴＣ、（ＸＲＩＴＣ）；フルオレスカミン；ＩＲ１４４；ＩＲ１４４６；マラカイトグリーンイソチオシアネート；４−メチルウンベリ−フェロネオルト（ｆｅｒｏｎｅｏｒｔｈｏ）クレゾールフタレイン；ニトロチロシン；パラローザニリン；フェノールレッド；Ｂ−フィコエリトリン；ｏ−フタルジアルデヒド；ピレンおよび誘導体：ピレン、ピレン酪酸、スクシンイミジル１−ピレン；ブチラート量子ドット；リアクティブレッド４（チバクロン（商標）ブリリアントレッド３Ｂ−Ａ）ローダミンおよび誘導体：６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミンローダミンＢスルホニルクロリドローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアネート、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１のスルホニルクロリド誘導体（テキサスレッド）；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）；テトラメチルローダミン；テトラメチルホダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）；リボフラビン；５−（２’−アミノエチル）アミノナフタリン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、ロゾール酸；ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｏｒａｎｇｅ ５６０；テルビウムキレート誘導体；Ｃｙ３；Ｃｙ５；Ｃｙ５．５；Ｃｙ７；ＩＲＤ７００；ＩＲＤ８００；ラヨラブルー；フタロシアニン；およびナフタロシアニン、クマリンおよび関連染料、キサンテン染料、たとえばロドール、レソルフィン、ビマン、アクリジン、イソインドール、ダンシル染料、アミノフタルヒドラジド、たとえばルミノール、およびイソルミノール誘導体、アミノフタルイミド、アミノナフタルイミド、アミノベンゾフラン、アミノキノリン、ジシアノヒドロキノン、蛍光ユーロピウムおよびテルビウム錯体；これらの組合せなど、を含むが、これらに限定されない。適切な蛍光タンパク質および発色性タンパク質は、オワンクラゲに由来するＧＦＰまたはその誘導体、たとえば増強ＧＦＰなどの「ヒト化」誘導体；ウミシイタケ、レニラムレリ、チロサルクスゲルニなど、別の種からのＧＦＰ；「ヒト化」組み換えＧＦＰ（ｈｒＧＦＰ）；花虫類種からの様々な蛍光および着色タンパク質のいずれか；それらの組合せ；などを含むがこれらに限定されない、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含むが、これらに限定されない。
【００５９】
特定の実施形態において、方法は、マイクロ流体装置内に流体試料を導入することを含む。マイクロ流体装置内への流体試料の導入は、分離試料を生成するために分離媒体を通じて試料を配向することを含んでもよい。場合により、分離試料は、上述のように、試料が分離媒体を横断する際に、ゲル電気泳動によって生成される。分離試料は、被検体の明確で検出可能なバンドを含んでもよく、ここで各バンドは、実行されるゲル電気泳動のタイプに応じて、分子量、サイズ、電荷（たとえば電荷質量比）、等電点など、実質的に類似の特性を有する１つ以上の被検体を含む。
【００６０】
方法の態様は、分離試料を結合媒体に移送することも含む。分離試料中の被検体の特異的バンドは、選択的に結合媒体に移送されてもよい。場合により、方法は、結合媒体内で対象とする被検体を結合メンバーと接触させることを含む。結合メンバーは、被検体に特異的に結合してもよく、こうして被検体を結合媒体内に保持する。対象としない部分は、結合媒体内の結合メンバーによって特異的に結合されない。
【００６１】
特定の実施形態において、方法は、結合媒体に結合された被検体を検出することを含む。対象とする被検体の、結合媒体内の結合メンバーとの検出可能な結合は、試料中の対象とする被検体の存在を示す。結合媒体を横断し、結合媒体内の結合メンバーと結合しない、対象としない部分は、洗い流されるか、または、紫外分光計、赤外分光計、質量分析計、ＨＰＬＣ、親和性アッセイ装置などの、ただしこれらに限定されない、二次分析装置へ移送されてもよい。
【００６２】
特定の実施形態において、方法は、分離試料から結合メンバーを移送することを含む。結合メンバーは、結合媒体から、分離試料中の被検体の特異的バンドへ移送されてもよい。場合により、方法は、分離試料中の対象とする被検体に結合メンバーを接触させることを含む。場合により、方法は、分離試料を分離媒体と安定的に会合させることを含む。たとえば、方法は、分離試料を分離媒体に結合させることを含んでもよい。分離試料は、分離試料を化学試薬に接触させること、分離試料を分離媒体に架橋させること、などによって、分離媒体に化学的または物理的に結合されてもよい。結合メンバーは、対象とする被検体に特異的に結合され、こうして、結合された結合メンバーがその後検出され得る分離媒体中に、結合メンバーを保持する。分離試料中の被検体に特異的に結合されない結合メンバーは、分離媒体を通じて移送されてもよい。
【００６３】
場合により、対象としない部分への結合メンバーの非特異的結合による偽陽性シグナルは、最小化される。たとえば、対象としない別の部分への結合メンバーの非特異的結合は最小化されてもよく、対象としない部分は検出されない。対象としない部分は、結合メンバーと結合することなく、結合媒体を横断する。このため、結合メンバーは、対象とする被検体にのみ、特異的に結合してもよい。対象とする被検体のみへの結合メンバーの特異的結合は、複合試料中の対象とする被検体の特異的検出を容易にし得る。
【００６４】
特定の実施形態において、方法は、分離媒体を通じて試料を配向する前に、試料を濃縮、希釈、または緩衝液交換することを含む。試料の濃縮は、試料を分離媒体に接触させる前に、試料を濃縮媒体に接触させることを含んでもよい。上述のように、濃縮媒体は、小孔径ポリマーゲル、膜（たとえばサイズ排除膜）、それらの組合せ、などを含んでもよい。試料が分離媒体を横断する際に、被検体の各分離されたバンドはあまり拡散しないので、試料を分離媒体に接触させる前の試料の濃縮は、分離試料中の被検体のバンド間の溶解の増加を促進し得る。試料の希釈は、試料を分離媒体に接触させる前に、試料を追加緩衝液に接触させることを含んでもよい。試料の緩衝液交換は、試料を分離媒体に接触させる前に、試料を緩衝液交換媒体に接触させることを含んでもよい。緩衝液交換媒体は、試料緩衝液とは異なる緩衝液を含んでもよい。緩衝液交換媒体は、分子篩、多孔性樹脂などを含んでもよいが、これらに限定されない。
【００６５】
特定の実施形態において、方法は、結合媒体中の結合メンバーによって結合されない部分を、結合媒体から離れる方へ移送することを含む。非結合部分は、結合媒体の標識流路と流体連絡している移送流路に向けて配向されてもよい。場合により、方法は、非結合部分を排液リザーバに移送することを含む。別の場合には、方法は、たとえば紫外分光計、赤外分光計、質量分析計、ＨＰＬＣ、親和性アッセイ装置などの、ただしこれらに限定されない、二次分析装置を用いた二次分析のため、非結合部分を結合媒体の下流に配向することを含む。
【００６６】
方法の実施形態はまた、結合媒体に結合された被検体を解放することも含んでもよい。解放は、結合された被検体を解放剤に接触させることを含んでもよい。解放剤は、被検体と結合メンバーとの間の結合相互作用を阻害するように構成されていてもよい。場合により、解放剤は、被検体と結合メンバーとの間の結合相互作用を阻害して、結合メンバーに被検体を解放させる、試薬、緩衝液などである。被検体を結合メンバーから解放した後、方法は、被検体を結合媒体から離れる方へ移相することを含んでもよい。たとえば、方法は、たとえば紫外分光計、赤外分光計、質量分析計、ＨＰＬＣ、親和性アッセイ装置などの、ただしこれらに限定されない、二次分析装置を用いた二次分析のため、解放された被検体を結合媒体の下流に配向することを含んでもよい。
【００６７】
いくつかの実施形態において、方法は、試料中の被検体のユニプレックス分析を含む。「ユニプレックス分析」とは、試料中の１つの被検体の存在を検出するために、試料が分析されることを意味する。たとえば、試料は、対象とする被検体、および対象とされないその他の分子実体の混合物を含んでもよい。場合により、方法は、試料混合物中の対象とする被検体の存在を判定するために、試料のユニプレックス分析を含む。
【００６８】
特定の実施形態は、試料中の２つ以上の被検体の多重分析を含む。「多重分析」とは、２つ以上の被検体が互いに異なる、２つ以上の明確な被検体の存在が判定されることを、意味する。たとえば、被検体は、分子量、サイズ、電荷（たとえば電荷質量比）、等電点などの、検出可能な違いを含んでもよい。場合により、被検体の数は、１００以上を含む、たとえば５０以上など、最大２０以上まで、４以上、６以上、８以上の明確な被検体など、２より大きい。特定の実施形態において、方法は、４から２０の明確な被検体を含む、４から５０の明確な被検体など、２から１００の明確な被検体の多重分析を含む。
【００６９】
図８は、試料中の複数の被検体の多重分析向けに構成された、マイクロ流体装置８００の図を示す。マイクロ流体装置８００は、分離チャネル８３０内の分離媒体８１０、および対応する個別の結合チャネル８４０内の複数の結合媒体８２０を含む。分離媒体８１０は、複数の結合媒体８２０と流体連絡している。各結合媒体は異なる結合メンバーを含んでもよい。たとえば、各結合媒体は、対象とする異なる被検体に特異的に結合される、異なる結合メンバーを含んでもよい。分離媒体によって分離された被検体は、結合媒体８２０に選択的に移送されてもよい。結合媒体８２０のうちの１つとの被検体の検出可能な結合は、試料中のその特定の被検体の存在を示す。各々が異なる結合メンバーに結合される、複数の結合媒体８２０を含むことで、単一のアッセイにおける対象とする複数の異なる被検体の検出を、容易にし得る。
【００７０】
図１７は、試料中の複数の被検体の多重分析向けに構成された、マイクロ流体装置１７００の図が重ねられた画像を示す。「ｉ」は、分離ステップ（１）および移送ステップ（２）のための電流の流れる方向を示す。マイクロ流体装置１７００は、分離媒体１７０１、第一結合媒体１７０２、および第二結合媒体１７０３を収容するチャンバを含む。分離媒体１７０１は第一結合媒体１７０２と流体連絡しており、これは第二結合媒体１７０３と流体連絡している。各結合媒体は異なる結合メンバーを含んでもよい。たとえば、第一結合媒体１７０２は、対象とする第一被検体１７０５を特異的に結合する第一結合メンバー１７０４を含んでもよく、第二結合媒体１７０３は、対象とする第二被検体１７０７を特異的に結合する第二結合メンバー１７０６を含んでもよい。試料中の被検体は、まず、分離媒体を通じて試料を配向することによって分離される（図１７、ステップ（１））。分離媒体によって分離された被検体は、それぞれ第一および第二結合媒体１７０２および１７０３に、移送されてもよい（図１７、ステップ（２））。第一結合媒体１７０２中の第一結合メンバー１７０４との対象とする第一被検体１７０５の検出可能な結合は、試料中の対象とする第一被検体１７０５の存在を示す（図１７、ステップ（３））。第二結合媒体１７０３中の第二結合メンバー１７０６との対象とする第二被検体１７０７の検出可能な結合は、試料中の対象とする第二被検体１７０７の存在を示す（図１７、ステップ（３））。各々が異なる結合メンバーに結合される、複数の結合媒体を含むことで、単一のアッセイにおける対象とする複数の異なる被検体の検出を、容易にし得る。
【００７１】
特定の実施形態において、方法は自動化された方法である。したがって、方法は、試料をマイクロ流体装置内に導入した後、マイクロ流体装置およびシステムとの最小限のユーザインタラクションを含んでもよい。たとえば、分離試料を生成するために分離媒体を通るように試料を配向するステップ、および分離試料を結合媒体に移送するステップは、ユーザがこれらのステップを手動で実行する必要がないように、マイクロ流体装置およびシステムによって実行されてもよい。場合により、自動化された方法は、総アッセイ時間の短縮を容易にする可能性がある。たとえば、試料中の被検体の分離および検出を含む、方法の実施形態は、１５分以下、または１０分以下、または５分以下、または２分以下、または１分以下を含む、２０分以下など、３０分以下の時間で実行されてもよい。
【００７２】
図１Ａは、従来の免疫ブロット法手順の図を示す。まず、試料中の様々な被検体が、電気泳動によって分離される。次に、分離された被検体は膜に向けて移送される。ブロッキングおよび洗浄に続いて、被検体は、特定の標的被検体に特異的に結合する抗体を用いてプローブされる。
【００７３】
図１Ｂは、試料中の被検体の存在を検出する方法の実施形態の図を示す。方法は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、続いて分離後試料移送、最後に膜ベースの親和性ブロット法を、含む。被検体は、ＰＡＧＥ分離媒体から連続結合媒体（たとえばブロット用ゲル）に電気運動的に移送され、特異的親和性相互作用によってｉｎ−ｓｉｔｕ同定される。ステップ１において、試料中の様々な被検体が、分離媒体５を通る電気泳動によって分離される。分離媒体は、第一方向軸を備える分離流路を有する。電場は、分離媒体５を通じて試料を配向するために、第一方向軸に沿って印加される。分離された被検体が、結合媒体４と流体連絡している分離媒体５内の領域に到達すると、分離された被検体を結合媒体の方へ配向するために第二方向軸に沿って電場を印加することによって、特異的な被検体は、結合媒体に向けて選択的に移送されることが可能である（図１Ｂ、ステップ２参照）。結合媒体４は、担体に結合された結合メンバー７を含む。たとえば、結合媒体４を形成するために、ストレプトアビジンアクリルアミド、およびビオチン標識された抗体が、投影リソグラフィ（３３０〜３７５ｎｍ、４分間）によって、ポリアクリルアミドゲル内で共重合された。特定の例において、結合メンバーは、特定の標的被検体６に特異的な抗体である。標的被検体６が存在する場合、標的被検体６は、結合メンバー７に結合することによって結合媒体４内に保持され、検出可能シグナルを生成する（図１Ｂ、ステップ３参照）。標的被検体が存在しない場合、結合メンバーに結合が生じることはなく、このため検出可能シグナルは生成されない。標的被検体以外の被検体が存在する場合には、これらは結合メンバーと結合することはなく、結合メンバーと結合せずに結合媒体を通過する。このため、検出可能シグナルは生成されない。
【００７４】
互いに流体連絡しているマイクロ流体チャネルを含むマイクロ流体装置７００の実施形態について、図７Ｂは、試料中の被検体の分離、移送、および検出の図を示す。図７Ｂのパネル（１）は、結合チャネル７２１と流体連絡している分離チャネル７２０の下流末端を示す。分離チャネル７２０は分離媒体７２２を含み、結合チャネル７２１は結合媒体７２３を含む。結合媒体７２３は、結合媒体７２３に結合された結合メンバー７２４を含む。電気泳動分離（図７Ｂ、パネル（１））の後、被検体７２５、７２６、および７２７は、選択的に電気泳動的に、結合媒体７２３に移送され、結合媒体７２３を通じて搬送されてよい（図７Ｂ、パネル（２））。結合メンバー７２４は、対象とする被検体７２７と特異的に結合し、こうして結合媒体７２３内の対象とする被検体７２７を保持する（図７Ｂ、パネル（３））。対象とする被検体７２７は、蛍光標識などの検出可能標識を含んでもよく、こうして結合媒体７２３に結合された対象とする被検体７２７は検出されてもよい。非結合の被検体７２６は、結合メンバー７２４によって特異的に結合されず、結合媒体７２３を通過して移送チャネル７２８内に入り、そこで非結合の被検体７２６は、必要に応じて排液リザーバまたは下流の二次分析装置へ配向されてもよい。結合媒体７２３に移送されない、分離された被検体７２５は、分離チャネル７２０内に残り、必要に応じて排液リザーバまたは下流の二次分析装置へ配向されてもよい。
【００７５】
システム
特定の実施形態の態様は、試料中の被検体を検出するシステムを含む。場合により、システムは、本明細書に記載されるようなマイクロ流体装置を含む。システムはまた、検出器も含んでもよい。場合により、検出器は、検出可能標識を検出するように構成された検出器である。上述のように、検出可能標識は蛍光標識であってもよい。たとえば、蛍光標識は、蛍光標識を励起して蛍光標識に検出可能な電磁放射線（たとえば、可視光線など）を放出させる、電磁放射線（たとえば、可視、紫外、Ｘ線など）に接触することが可能である。放出された電磁放射線は、結合メンバーに結合された被検体の存在を判定するために、適切な検出器を用いて検出されてもよい。
【００７６】
場合により、検出器は、上述のように、蛍光標識からの放射を検出するように構成されていてもよい。特定の場合、検出器は、光電子増倍管（ＰＭＴ）、電荷結合素子（ＣＣＤ）、強化電荷結合素子（ＩＣＣＤ）、相補型金属酸化物半導体（ＣＭＯＳ）センサー、視感色彩読み取り、フォトダイオード、等を含む。
【００７７】
本開示のシステムは、必要に応じて、様々なその他の要素を含んでもよい。たとえば、システムは、マイクロ流体処理素子などの、流体処理素子を含んでもよい。流体処理素子は、マイクロ流体装置を通じて１つ以上の流体を配向するように構成されていてもよい。場合により、流体処理素子は、試料溶液、緩衝液（たとえば解放緩衝液、洗浄緩衝液、電気泳動緩衝液など）などの、ただしこれらに限定されない流体を、配向するように構成されている。特定の実施形態において、マイクロ流体処理素子は、流体が分離媒体に接触するように、マイクロ流体装置の分離媒体に流体を送達するように構成されている。流体処理素子は、マイクロ流体ポンプを含んでもよい。場合により、マイクロ流体ポンプは、本明細書に開示されるマイクロ流体装置およびシステムを通る流体の、圧力駆動によるマイクロ流体処理および経路決定のために構成されている。特定の例において、マイクロ流体処理素子は、たとえば５０μＬ以下、または２５μＬ以下、または１０μＬ以下、または５μＬ以下、または１μＬ以下など、１００μＬ以下を含む、５００μＬ以下など、１ｍＬ以下など、少量の流体を送達するように構成されている。
【００７８】
特定の実施形態において、システムは１つ以上の電場発生器を含む。電場発生器は、マイクロ流体装置の様々な領域に、電場を印加するように構成されていてもよい。システムは、試料がマイクロ流体装置を通じて電気運動的に搬送されるように、電場を印加するように構成されていてもよい。たとえば、電場発生器は、分離媒体に電場を印加するように構成されていてもよい。場合により、印加された電場は、分離媒体の分離流路の方向軸に揃えられてもよい。したがって、印加された電場は、分離媒体を通じて、試料中の被検体および部分を電気運動的に搬送するように、構成されていてもよい。特定の実施形態において、システムは、試料中の被検体および／または部分が分離媒体から結合媒体へ電気運動的に搬送されるように、電場を印加するように構成された電場発生器を含む。たとえば、印加された電場は、結合媒体の標識流路の方向軸に揃えられてもよい。場合により、印加された電場は、分離媒体によって分離された、選択された被検体を、電気運動的に搬送するように、構成されている。分離媒体によって分離された、選択された被検体は、結合媒体の標識流路の方向軸に沿って適切な電場を印加することによって、結合媒体まで搬送されてもよい。場合により、電場発生器は、２００Ｖ／ｃｍから６００Ｖ／ｃｍを含む、１００Ｖ／ｃｍから８００Ｖ／ｃｍなど、１０Ｖ／ｃｍから１０００Ｖ／ｃｍの範囲の強度を有する電場を印加するように、構成されている。
【００７９】
特定の実施形態において、電場発生器は電圧整形素子を含む。場合により、電圧整形素子は、印加された電場強度が分離媒体および／または結合媒体にわたって実質的に均一となるように、印加された電場の強度を制御するように構成されている。電圧整形素子は、試料中の被検体の分解能の向上を容易にし得る。たとえば、電圧整形素子は、分離媒体を通る試料の不均一な運動の減少を容易にする可能性がある。これに加えて、電圧整形素子は、被検体が分離媒体を横断する際に、被検体のバンドの分散の最小化を容易にする可能性がある。
【００８０】
特定の実施形態において、対象のシステムは、バイオチップ（たとえばバイオセンサーチップ）である。「バイオチップ」または「バイオセンサーチップ」とは、基板表面上に２つ以上の明確なマイクロ流体装置を表示する基板表面を含む、マイクロ流体システムを意味する。特定の実施形態において、マイクロ流体システムは、マイクロ流体装置のアレイを備える基板表面を含む。
【００８１】
「アレイ」は、たとえば空間的にアドレス可能な領域など、アドレス可能領域のいかなる二次元的または実質的に二次元的（ならびに三次元的）配置も含む。アレイは、アレイ上の特定の所定箇所（たとえば「アドレス」）に位置する複数の装置を含むときに、「アドレス可能」である。アレイの特徴（たとえば、装置）は、空間に介入することによって分離されてもよい。任意の基板は、基板の前面上に設けられた１つ、２つ、４つ、またはそれ以上のアレイを担持してもよい。使用法に応じて、いずれかまたはすべてのアレイが互いに同じまたは異なってもよく、各々が複数の明確なマイクロ流体装置を収容してもよい。アレイは、２つ以上、４つ以上、８つ以上、１０以上、５０以上、または１００以上を含む、１つ以上のマイクロ流体装置を収容してもよい。特定の実施形態において、マイクロ流体装置は、１０ｍｍ２未満、またはそれよりさらに小さいなど、５０ｍｍ２未満、２０ｍｍ２未満を含む、たとえば１ｃｍ２未満など、１０ｃｍ２未満または５ｃｍ２未満の面積を有するアレイの中に、配置されることが可能である。たとえば、マイクロ流体装置は、たとえば１ｍｍ×１ｍｍ以下、たとえば２５ｍｍ×２５ｍｍ以下、または１０ｍｍ×１０ｍｍ以下、または５ｍｍ×５ｍｍ以下、５０ｍｍ×５０ｍｍ以下など、１００ｍｍ×１００ｍｍ以下の寸法を含む、１０ｍｍ×１０ｍｍから２００ｍｍ×２００ｍｍの範囲の寸法を有してもよい。
【００８２】
マイクロ流体装置のアレイは、試料の多重分析向けに配置されてもよい。たとえば、複数のマイクロ流体装置は、一連のマイクロ流体装置内でいくつかの異なる被検体の存在について試料が分析されるように、直列に配置されてもよい。特定の実施形態において、複数のマイクロ流体装置は、２つ以上の試料が実質的に同時に分析されるように、並列に配置されてもよい。
【００８３】
システムの態様は、マイクロ流体装置が、まだ検出可能な結果を生成しながら最小量の試料を消費するように構成されてもよいことを、含む。たとえば、システムは、まだ検出可能な結果を生成しながら、たとえば５μＬ以下、２μＬ以下、または１μＬ以下など、５０μＬ以下、または２５μＬ以下、または１０μＬ以下を含む、７５μＬ以下など、１００μＬ以下の試料体積を使用するように、構成されていてもよい。特定の実施形態において、システムは、５０ｆＭ以下、または２５ｆＭ以下、または１０ｆＭ以下を含む、１００ｆＭ以下など、たとえば１ｐＭ以下、または５００ｆＭ以下、または２５０ｆＭ以下など、１００ｐＭ以下を含む、５００ｐＭ以下など、１ｎＭ以下の検出感度を有するように構成されている。場合により、システムは、１ｐｇ／ｍＬ以下を含む、１ｎｇ／ｍＬ以下、または０．１ｎｇ／ｍＬ以下、または０．０１ｎｇ／ｍＬ以下など、たとえば１０ｍｇ／ｍＬ以下、または５ｎｇ／ｍＬ以下など、１００ｎｇ／ｍＬ以下を含む、５００ｎｇ／ｍＬ以下など、１μｇ／ｍＬ以下の濃度の被検体を検出することができるように、構成されている。特定の実施形態において、システムは、１０−１２Ｍから１０−６Ｍを含む、１０−１５Ｍから１０−３Ｍなど、１０−１８Ｍから１０Ｍのダイナミックレンジを有する。
【００８４】
特定の実施形態において、マイクロ流体装置は、１０℃から５０℃、または２０℃から４０℃を含む、５℃から７５℃など、１℃から１００℃の温度範囲で動作する。場合により、マイクロ流体装置は、３５℃から４０℃の温度範囲で動作する。
【００８５】
実用性
対象の装置、システム、および方法は、試料中の１つ以上の被検体の存在または不存在、および／または定量化の判定が望まれる、様々な異なる用途における利用を見出す。特定の実施形態において、方法は、試料中の核酸、タンパク質、またはその他の生体分子の検出を対象としている。方法は、試料中の、たとえば２つ以上の明確なタンパク質バイオマーカーなど、一組のバイオマーカーの検出を、含んでもよい。たとえば、方法は、たとえば被験者の病状の診断において、被験者の病状の現在進行している管理または治療などにおいて、採用されるような、生体試料中の２つ以上の疾患バイオマーカーの迅速な臨床検出において、使用されてもよい。これに加えて、対象の装置、システム、および方法は、ウェスタンブロット法、サザンブロット法、ノーザンブロット法、イースタン、ファーウェスタンブロット法、サウスウェスタンブロット法など、ただしこれらに限定されない、試料中の被検体の検出のためのプロトコルにおける利用を見出してもよい。
【００８６】
特定の実施形態において、対象の装置、システム、および方法は、バイオマーカーの検出における利用を見出す。場合により、対象の装置、システム、および方法は、特定のバイオマーカーの存在または不存在、ならびに、尿、血液、血清、血漿、唾液、精液、前立腺液、乳頭吸引液、涙液、汗、便、口腔粘膜採取物、脳脊髄液、細胞溶解物試料、羊水、胃腸液、生検組織（たとえば、レーザー・キャプチャー・マイクロダイセクション（ＬＣＭ）から得られる試料）などの、ただしこれらに限定されない、血液、血漿、血清、またはその他の体液または排泄物中の特定のバイオマーカーの濃度の増加または減少を、検出するために使用されてもよい。
【００８７】
バイオマーカーの存在または不存在、あるいはバイオマーカーの濃度の著しい変化は、疾患リスク、個人における疾患の存在を診断するために、または個人における疾患の治療を調整するために、使用されることが可能である。たとえば、特定のバイオマーカーまたはバイオマーカーのパネルの存在は、個人に対して与えられる薬物治療または投与計画の選択に影響を及ぼす可能性がある。可能性のある薬物療法の評価において、バイオマーカーは、生存または不可逆的罹患などの自然なエンドポイントの代用として、使用されてもよい。治療がバイオマーカーを変化させる場合、これは改善された健康に直接的な関連を有するが、バイオマーカーは、特定の治療または投与計画の臨床的利点を評価するための、代用エンドポイントの役割を果たすことができる。このため、個人において検出された特定のバイオマーカーまたはバイオマーカーのパネルに基づいてカスタマイズされた診断および治療は、対象の装置、システム、および方法によって容易になる。さらに、疾患に関連づけられたバイオマーカーの早期検出は、上述のように、対象の装置およびシステムの高い感度によって、容易になる。感度、拡張性、および使いやすさと相まって、単一チップ上の複数のバイオマーカーを検出する能力により、現在開示されているマイクロ流体装置、システム、および方法は、携帯型の、およびポイントオブケアまたはベッドサイド分子診断学における利用を見出す。
【００８８】
特定の実施形態において、対象の装置、システム、および方法は、疾患または病態のためのバイオマーカーの検出における利用を見出す。場合により、疾患は、癌、腫瘍、乳頭腫、肉腫、または癌腫などの、ただしこれらに限定されない、細胞増殖疾患である。特定の例において、対象の装置、システム、および方法は、創薬およびワクチン開発のための、細胞シグナリング経路および細胞内情報伝達の特徴付けのための、バイオマーカーの検出における利用を見出す。たとえば、対象の装置、システム、および方法は、癌、腫瘍、乳頭腫、肉腫、または癌腫などの、細胞増殖疾患などの疾患の存在の検出における利用を見出す。特定の例において、癌または細胞増殖疾患の指示薬を検出するための、対象とする特定のバイオマーカーは、以下を含むが、これらに限定されない：前立腺癌バイオマーカーである、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）；炎症の指示薬である、Ｃ反応性タンパク質；細胞周期およびアポトーシス制御を促進する、Ｐ５３などの転写因子；光線性角化症および鱗状細胞癌腫の指示薬である、ポリアミン濃度；増殖成長相にある細胞の核内に発現する細胞周期関連タンパク質である、増殖性細胞核抗原（ＰＣＮＡ）；ＩＧＦ−Ｉなどの増殖因子；ＩＧＦＢＰ−３などの増殖因子結合タンパク質；遺伝子発現を調節する、長さ約２１〜２３ヌクレオチドの一本鎖ＲＮＡ分子である、マイクロＲＮＡ；膵臓および結腸癌バイオマーカーである、炭水化物抗原ＣＡ１９．９；サイクリン依存性キナーゼ；上皮増殖因子（ＥＧＦ）；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；タンパク質チロシンキナーゼ；エストロゲン受容体（ＥＲ）およびプロゲステロン受容体（ＰＲ）の過剰発現；など。たとえば、対象の装置、システム、および方法は、罹患、健康、および良性試料中の、内因性前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の量を検出および／または定量化するために、使用されてもよい。
【００８９】
特定の実施形態において、対象の装置、システム、および方法は、感染症または病態のバイオマーカーの検出における利用を見出す。場合により、バイオマーカーは、タンパク質、核酸、炭水化物、小分子などの、ただしこれらに限定されない、分子バイオマーカーであってもよい。たとえば、対象の装置、システム、および方法は、ＨＩＶカプシドタンパク質ｐ２４、糖タンパク質１２０および４１、ＣＤ４＋細胞などの抗体でセンサー表面を官能化することによって、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ診断および／または治療監視のためのＨＩＶウイルス量および患者のＣＤ４値を監視するために、使用されてもよい。対象の装置、システム、および方法によって検出されてもよい特定の疾患および病態は、細菌感染、ウイルス感染、遺伝子発現の増加または減少、染色体異常（たとえば欠失または挿入）などを含むが、これらに限定されない。たとえば、対象の装置、システム、および方法は、無菌性髄膜炎、ボツリヌス中毒症、コレラ、大腸菌感染症、手足口病、ヘリコバクター感染症、出血性結膜炎、ヘルパンギーナ、心筋炎、パラチフス、ポリオ、細菌性赤痢、腸チフス、ブリオ敗血症、ウイルス性下痢などの、ただしこれらに限定されない、胃腸感染症を検出するために使用されることが可能である。これに加えて、対象の装置、システム、および方法は、アデノウイルス感染症、非定型肺炎、トリインフルエンザ、ブタインフルエンザ、腺ペスト、ジフテリア、インフルエンザ、はしか、髄膜炎菌性髄膜炎、流行性耳下腺炎、パラインフルエンザ、百日咳（すなわち、百日咳（ｗｈｏｏｐｉｎｇ ｃｈｏｕｇｈ））、肺炎、肺ペスト、呼吸合包体ウイルス感染症、風疹、紅熱、敗血症性ペスト、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、結核などの、ただしこれらに限定されない、呼吸器感染症を検出するために使用されることが可能である。これに加えて、対象の装置、システム、および方法は、クロイツフェルト・ヤコブ病、ウシ海綿状脳症（すなわち、狂牛病）、パーキンソン病、アルツハイマー病、狂犬病などの、ただしこれらに限定されない、神経疾患を検出するために使用されることが可能である。これに加えて、対象の装置、システム、および方法は、ＡＩＤＳ、軟性下疳、クラミジア感染症、尖圭コンジローマ、陰部ヘルペス、淋病、鼠径リンパ肉芽腫、非淋菌性尿道炎、梅毒などの、ただしこれらに限定されない、泌尿生殖器疾患を検出するために使用されることが可能である。これに加えて、対象の装置、システム、および方法は、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、Ｅ型肝炎などの、ただしこれらに限定されない、ウイルス性肝炎疾患を検出するために使用されることが可能である。これに加えて、対象の装置、システム、および方法は、エボラ出血熱、腎症候性出血熱（ＨＦＲＳ）、ラッサ出血熱、マールブルグ出血熱などの、ただしこれらに限定されない、出血熱疾患を検出するために使用されることが可能である。これに加えて、対象の装置、システム、および方法は、炭疽病、トリインフルエンザ、ブルセラ症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ウシ海綿状脳症（すなわち、狂牛病）、エンテロウイルス病原性大腸菌感染症、日本脳炎、レプトスピラ症，Ｑ熱、狂犬病、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）など、ただしこれらに限定されない、動物原生感染症を検出するために使用されることが可能である。これに加えて、対象の装置、システム、および方法は、デング出血熱、日本脳炎、ダニ媒介脳炎、西ナイル熱、黄熱病などの、ただしこれらに限定されない、アルボウイルス感染症を検出するために使用されることが可能である。これに加えて、対象の装置、システム、および方法は、アシネトバクター・バウマンニ、カンジダアルビカンス、腸球菌属、肺炎桿菌、緑膿菌、黄色ブドウ球菌など、ただしこれらに限定されない、抗生物質耐性菌感染症を検出するために使用されることが可能である。これに加えて、対象の装置、システム、および方法は、ネコ引っ掻き病、発疹熱、発疹チフス、ヒトエールリッヒ症、日本紅斑熱、シラミ媒介性回帰熱、ライム病、マラリア、塹壕熱、ツツガムシ病など、ただしこれらに限定されない、節足動物媒介感染症を検出するために使用されることが可能である。同様に、対象の装置、システム、および方法は、心血管疾患、中枢神経疾患、腎不全、糖尿病、自己免疫疾患、およびその他の多くの疾患を検出するために使用されることが可能である。
【００９０】
対象の装置、システム、および方法は、以下のものを含む、ただしこれらに限定されない、診断アッセイにおける利用を見出す：上述のように、バイオマーカーを検出および・または定量化すること；無症候被験者について試料が一定間隔で検査される、スクリーニングアッセイ；起こり得る疾病経過を予測するために、バイオマーカーの存在および／または量が使用される、予後アッセイ；異なる薬物治療への被験者の反応が予測され得る、層別化アッセイ；薬物治療の有効性が監視される、有効性アッセイ；など。
【００９１】
対象の装置、システム、および方法はまた、検証アッセイにおける利用も見出す。たとえば、検証アッセイは、潜在疾患バイオマーカーが、多様な個々人の間にある疾患の存在または不存在の確実な指示薬であることを、検証または確認するために、使用されてもよい。対象の装置、システム、および方法の短いアッセイ時間は、最短時間内で複数の試料をスクリーニングするためのスループットの向上を、容易にする可能性がある。
【００９２】
場合により、対象の装置、システム、および方法は、実施に実験室設定を必要とすることなく、使用されることが可能である。同等の分析研究実験用機器と比較して、対象の装置およびシステムは、携帯型の、手持ち式システムにおいて匹敵する分析感度を提供する。場合により、重量および運転コストは、一般的な固定型実験用機器よりも少ない。対象のシステムおよび装置は、対象とする被検体の分離、移送、標識、および検出を含む、アッセイのすべてのステップが、単一の装置によって実行されるように、単一の装置に組み込まれてもよい。たとえば、場合により、対象とする被検体の分離、移送、標識、および検出のための個別の装置は存在しない。これに加えて、対象のシステムおよび装置は、試料中の１つ以上の被検体を検出するために、医療研修を受けていない人によって、市販の家庭用検査向けの家庭内設定において、利用されることが可能である。対象のシステムおよび装置はまた、迅速な診断のための、たとえばベッドサイドなどの臨床設定において、あるいは費用またはその他の理由により固定型分析実験用機器が提供されない設定において、利用されることも可能である。
【００９３】
キット
本開示の態様は付加的に、本明細書に詳細に記載されるマイクロ流体装置を有するキットを、含む。キットは、緩衝液をさらに含んでもよい。たとえば、キットは、電気泳動緩衝液、試料緩衝液などの緩衝液を含んでもよい。キットは、解放剤、変性剤、リフォールディング剤、洗剤、検出可能標識（たとえば、蛍光標識、比色標識、化学発光標識、多色試薬、酵素結合試薬、アビジン−ストレプトアビジン会合検出試薬、放射標識、金粒子、磁気標識など）などの、ただしこれらに限定されない、付加的な試薬をさらに含んでもよい。
【００９４】
上記の要素に加えて、対象のキットは、対象とする方法を実現するための指示をさらに含んでもよい。これらの指示は、そのうちの１つ以上がキット内に存在し得る、様々な形態で対象のキット内に存在してもよい。これらの指示が存在してもよい１つの形態は、キットの包装内、または添付文書内の、たとえば情報が印刷されている１枚以上の紙など、適切な媒体または基板上の印刷情報としてである。別の手段は、情報が記録または格納されている、たとえばディスケット、ＣＤ、ＤＶＤ、Ｂｌｕ−Ｒａｙ、コンピュータ読み取り可能メモリなど、コンピュータ読み取り可能媒体である。存在し得るさらに別の手段は、離れた場所の情報にアクセスするためにインターネットを経由して使用され得る、ウェブサイトアドレスである。いずれの便利な手段がキット内に存在してもよい。
【００９５】
上記に提供された開示から理解されるように、本発明の実施形態は、多様な用途を有する。したがって、本明細書に提示される実施例は、説明目的のために提供され、いかようにも本発明に対する限定として解釈されると意図されるものではない。当業者は、本質的に類似の結果を産み出すために変更または修正され得る、様々な重要ではないパラメータを、容易に認識し得る。このため、以下の実施例は、本発明をどのように成し遂げて使用するかの完全な開示および記載を当業者に提供するように提示されており、本発明者らが自身の発明と見なすものの範囲を限定する意図はなく、以下の実験がすべてであって実行された実験のみであることを示すように意図するものでもない。使用される数値（たとえば量、温度など）に対する精度を保証するための努力がなされてきたが、しかしいくらかの実験的誤差およびずれは考慮されるべきである。別途記載のない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧またはその付近である。
【００９６】
実施例
材料および方法
別途記載のない限り、以下のプロトコルを使用して、マイクロ流体装置が用意されて実験が行われた。
【００９７】
試薬
水溶性光開始剤２，２−アゾビス［２−メチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）プロピオンアミド］（ＶＡ−０８６）が、Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（バージニア州リッチモンド）から購入された。３−（トリメトキシシリル）−プロピルメタクリレート（９８％）、氷酢酸（ＡＣＳグレード）、メタノール（ＡＣＳグレード、および３０％（２９：１）アクリルアミド／ビス−アクリルアミドが、Ｓｉｇｍａ（ミズーリ州セントルイス）から購入された。ストレプトアビジン−アクリルアミド（ＳＡ）が、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州カールスバッド）から購入された。予備混合された１０×トリスグリシンネイティブ電気泳動緩衝液（２５ｍＭトリス、ｐＨ８．３、１９２ｍＭグリシン）が、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（カリフォルニア州ハーキュリーズ）から購入された。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８で共役されたウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびＦＩＴＣ−ビオチンが、それぞれ陰性および陽性対照として使用された（ミズーリ州セントルイス、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）。α−アクチニンおよびビオチンで共役された抗アクチニンが、Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ，Ｉｎｃ．（コロラド州デンバー）から購入された。フリーＰＳＡ（前立腺特異抗原）およびビオチン標識されたモノクローナル抗ＰＳＡが、ＥＸＢＩＯ（チェコ共和国、プラハ）から購入された。タンパク質は、供給元（カリフォルニア州カールスバッド、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の指示に従って、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８タンパク質標識キットを使用して、研究室内で蛍光標識された。標識されたタンパク質は、使用されるまで暗所において４℃で保管された。
【００９８】
マイクロ流体チップ製造
ガラスマイクロ流体チップは、研究室内で設計され、Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（マサチューセッツ州ホプキントン）による標準ウェット・エッチ・プロセスを用いて製造された。３−（トリメトキシシリル）プロピルメタクリレート、氷酢酸、脱イオン水、およびメタノール２：３：２：３の比率の混合物を用いて、ポリアクリルアミド（ＰＡ）ゲルとの共有結合のために、表面がまず官能化された。２０分間静置培養の後、メタノールは３０分間マイクロ流体装置内を流され、その後乾燥窒素パージされた。
【００９９】
官能化結合媒体光パターン形成
フィルムマスクおよび顕微鏡システム（ＩＸ−７０、ニューヨーク州メルビル、オリンパス）と組み合わせた紫外線対物レンズ（ＵＰＬＡＮＳ−ＡＰＯ、４倍、オリンパス）を用いたマスクベースのリソグラフィは、励起をもたらし、その結果、架橋結合および結合媒体（ストレプトアビジン−アクリルアミドを含む８％Ｔ）の形成をもたらした。ゲルマトリクスにおいて共有結合されたストレプトアビジンは、免疫ブロット法のためにビオチン標識された抗体を固定するために使用された。水銀球は、励起源（３３０〜３７５ｎｍ）として使用され、チップに対するマスクアライメントは、顕微鏡（ニューヨーク州メルビル、オリンパス）の手動調整ｘ−ｙ並進ステージを用いて実行された。アクリルアミドおよびビスを含む、最終的な前駆体体積は、０．２％（ｗ／ｖ）ＶＡ−０８６光開始剤を含むトリスグリシン・ネイティブ・ランニング緩衝液を用いて調整された。ゲル前駆体溶液は、実質的に気泡のない最終ゲルを確保するために、マイクロ流体装置への装荷の直前に、脱気された（撹拌とともに超音波分解されながら、真空下に５分間）。製造を開始するため、ＰＡゲル前駆体溶液は、マイクロ流体装置内に逃がされるか、またはゆっくりと圧力装荷された（シリンジを通じて）。マイクロ流体装置が装荷された後、高粘度の５％２−ヒドロキシエチルセルロース溶液（Ｓｉｇｍａ、平均分子量〜７２０，０００）が、ピペットによって各リザーバ上にゆっくりと導入された。冷却ファンを備えて１５ｃｍ離れて位置する、フィルタを通した水銀ランプ（３００〜３８０ｎｍ）（１００Ｗ、カリフォルニア州アップランド、ＵＶＰ Ｂ１００−ＡＰ）へのチップの投光照明照射を用いて、より大きい孔径の試料装荷ゲルが形成された。
【０１００】
装置および撮像
アッセイ操作はプログラム可能であり、白金電極を備える高圧電源（カリフォルニア州リバモア、Ｌａｂｓｍｉｔｈ ＨＶＳ４４８）を用いて制御された。試料排液リザーバで＋８００Ｖの電位を印加し、〜２分間試料リザーバを接地することによって、試料が装荷された。画像は、１０倍対物レンズ（開口数０．３）、ＧＦＰ検出に最適化されたフィルタキューブ、およびｘ−ｙ並進ステージを備える、反転落射蛍光顕微鏡（ＩＸ−７０、ニューヨーク州メルビル、オリンパス）を用いて収集された。タンパク質移動および１０ＭＨｚ周波数での結合を監視するために、１３９２×１０４０ペルチェ冷却インターラインＣＣＤカメラ（ＣｏｏｌＳＮＡＰ（商標）ＨＱ２、ニュージャージー州トレントン、Ｒｏｐｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が使用された。別途記載のない限り、ＣＣＤ露光時間は３００ミリ秒であった。画像解析は、ＩｍａｇｅＪ（メリーランド州ベセスダ、国立衛生研究所）を使用して完成された。
【０１０１】
結果
図２は、分離試料を結合媒体に移送する前（図２Ａ）および後（図２Ｂ）の、タンパク質の電気泳動図を示す。標的タンパク質（α−アクチニンおよび前立腺特異抗原、ＰＳＡ）および陰性対照（ＢＳＡ）のネイティブＰＡＧＥ、ならびにその後の結合媒体への電気泳動移送が、実行された。分離されたタンパク質バンドは、３０秒以内に８５％の捕捉効率で、結合媒体に移送された。特異的標的タンパク質（最も遅いピーク、α−アクチニン）が、結合媒体に結合し、検出可能な蛍光シグナルを産み出した（図２Ｂ、挿入画、反転グレースケール）。
【０１０２】
図３は、陽性および陰性タンパク質対照を用いてアッセイの特異性を検査する実験の蛍光画像を示す。マイクロ流体装置の結合媒体３０の蛍光画像は、図３に示されている。被検体ＢＳＡ（たとえば、陰性対照）、ビオチン、α−アクチニン、およびＰＳＡは、結合媒体担体に結合された、ストレプトアビジン、抗アクチニン、および抗ＰＳＡを備える３つの異なる結合媒体に、個別に接触した。図３は、検出可能な非対角シグナルを示しておらず、検出可能な交差反応および検出可能な非特異的吸着が存在しないことを示している。
【０１０３】
図４Ａは、マイクロ流体装置内の抗体官能化結合媒体に結合されたタンパク質の用量反応の蛍光画像を示す。マイクロ流体装置の結合媒体４０の蛍光画像は、図４に示されている。増加する濃度のＢＳＡ（たとえば、陰性対照）は、ストレプトアビジンで官能化された結合媒体と接触させられた。ＢＳＡは、まったくまたはほとんど検出可能シグナルを示さなかった。増加する濃度のα−アクチニンは、抗アクチニンで官能化された結合媒体と接触させられた。α−アクチニンは、α−アクチニンの濃度が上昇するにつれて、蛍光シグナルの増加を示した。増加する濃度のＰＳＡは、抗ＰＳＡで機能化された結合媒体と接触させられた。ＰＳＡは、ＰＳＡの濃度が上昇するにつれて、蛍光シグナルの増加を示した。用量反応曲線の確立は、タンパク質定量化を容易にし得る。これに加えて、結合媒体上の内在性タンパク質濃縮が観察された（図４Ｂ参照）。タンパク質濃縮は、結合媒体が存在しない場合のシグナルと比較して、結合媒体上の検出感度の向上を容易にし得る。
【０１０４】
図５Ａは、分離媒体５０を含むマイクロ流体装置の図を示す。試料は、試料注入口５１を通じてマイクロ流体装置内に導入されることが可能である。試料は、試料注入口５１から分離媒体５０に試料を配向するために電場を印加することによって、分離媒体５０上に装荷されることが可能である（図５Ａ、挿入画１参照）。試料が分離媒体５０に接触させられた後、分離媒体５０を通じて試料を配向するために、分離媒体５０の方向軸に沿って電場が印加され得る（図５Ａ、挿入画２参照）。試料中の被検体は、これらが分離媒体５０を通じて流れる際に分離させられ、分離媒体５０の遠位末端に位置する検出器５２によって検出されることが、可能である。図５Ｂは、架橋結合されたポリアクリルアミドゲルを光パターン形成することによって用意された分離媒体を備えるマイクロ流体装置を使用した、広い分子範囲のタンパク質ラダーの高分解能電気泳動分析を示す。分離媒体は、１０×１０−６Ｌの試料体積を用いて、１５秒後に試料中の異なるタンパク質の間で検出可能な分解能を、実現することができた。
【０１０５】
図６は、５つの低分子量タンパク質の電気泳動分離における、ポリアクリルアミドゲルの分解能の違いの例を示す。図６において、８％の総アクリルアミドを含むポリアクリルアミドゲル（たとえば小孔径ゲル）は、試料中の５つのすべてのタンパク質を２０秒で検出可能に溶解することができたが（図６、上のグラフ参照）、これに対して４％の総アクリルアミドを含むポリアクリルアミドゲル（たとえば大孔径ゲル）は、試料中のタンパク質を溶解することができず、５秒で単一のピークを示しただけであった（図６、下のグラフ参照）。
【０１０６】
図９Ａは、分離媒体９２０の上流に濃縮媒体９１０を含んでいたマイクロ流体装置９００の図、および画像（挿入画）を示す。分離媒体９２０の上流域は、３．５％の総アクリルアミド（Ｔ）および２．２％の架橋剤（Ｃ）を含む、大孔径ゲルを含んでいた。分離媒体の大孔径領域より下流には、８％Ｔおよび２．２％Ｃを含む小孔径領域があった。図９Ｂは、分離媒体９５０の上流に濃縮媒体９４０を含んでいたマイクロ流体装置を通る試料９３０の、経時的な電気泳動運動の画像を示す。分離媒体は、分離チャネル９６０内に６％ポリアクリルアミドゲルを含んでいた。反転蛍光顕微鏡写真は５秒間隔で、ｔ０、ｔ５、およびｔ１０において撮影された。蛍光顕微鏡写真は、濃縮媒体９４０の付近のタンパク質試料の、試料濃縮および溶出を示している。図９Ｂにおいて、初期濃度１００ｎＭの濃縮レポータータンパク質（たとえば、蛍光標識された抗Ｃ−ＲＰ）は、３分後に濃縮媒体（たとえば、膜）において１７０倍に濃縮された。濃縮された抗Ｃ−ＲＰは、１０秒後に分離チャネル内に溶出した。印加された電場は、４００Ｖ／ｃｍであった。
【０１０７】
図１０は、第一マイクロ流体チャネル１０１０から第二マイクロ流体チャネル１０２０への電気泳動分析の後の、対象とする被検体１０００の選択的な移送の画像を示す。対象とする特異的な被検体の選択的な移送は、結合媒体との接触のため、またはその後の分析のためのタンパク質採取を可能にする。図１０において、対象とする被検体１０００は、さらなる分析のため、第一マイクロ流体チャネル１０１０内の電気泳動分離から第二マイクロ流体チャネル１０２０へ、配向された。対象としない被検体１０３０は、第一マイクロ流体チャネル１０１０内に影響を受けないまま残った。１つのマイクロ流体チャネルから別のマイクロ流体チャネルへの対象とする被検体の選択的移送は、少量（たとえば１ｐＬ未満）の定量的操作を容易にし得る。これに加えて、特異的な溶解された被検体の物理的操作は、選択された対象とする被検体の電気泳動後の特徴付けを容易にする可能性がある。図１０において、タンパク質は、第一マイクロ流体チャネル１０１０内で電気泳動的に分離された（たとえば、等電点電気泳動法）。第一マイクロ流体チャネル１０１０と第二マイクロ流体チャネル１０２０との交差点に位置する対象とする被検体１０００を移送するために、対象とする被検体１０００を第二マイクロ流体チャネル１０２０内に推進するため、被検体の分離に使用された初期電場に対して直交する電場が、交差点に印加された（Ｅ＝３９５Ｖ／ｃｍ）。
【０１０８】
図１１Ａは、マイクロ流体チャネル１１００内に位置する結合媒体１１１０の図を示す。これに加えて、結合媒体を通る電気泳動の方向を表す電場（Ｅ）が示されている。図１１Ｂおよび図１１Ｃは、陰性および陽性対照に曝露された結合媒体の蛍光画像を示す。２００ｎＭのＩｇＧが、ポリアクリルアミド結合媒体（１０％総アクリルアミド／２．５％架橋剤）内で共重合された。結合媒体は、ガラスマイクロチャネル内の１００Ｗ、３６５ｎｍのＹＡＧレーザーからの薄い（幅７５μｍ）レーザーシートへの２０秒間の曝露によって、形成された。１：１００のＩｇＧ−ＦＩＴＣおよび１：１００のタンパク質Ｇ−ＦＩＴＣ溶液が、結合媒体を通じて６００Ｖで５分間電気泳動され、その後非結合タンパク質Ｇ＊を洗い流すために、１５分間の緩衝液が続いた。蛍光撮像は、ＣＣＤ／落射蛍光顕微法によって実行された。図１１Ｂおよび１１Ｃに示される蛍光画像は、タンパク質Ｇ（ＩｇＧ）に対する共重合抗体の蛍光標識されたタンパク質Ｇ（タンパク質Ｇ＊）との特異的相互作用を、表している。図１１Ｂは、陰性対照（たとえば、結合媒体内の共重合されていないＩｇＧ）であって、電気泳動されてきた、蛍光標識されたタンパク質Ｇからのごくわずかな検出可能シグナルを示していた。図１１Ｃにおいて、結合媒体は、ＩｇＧ結合タンパク質Ｇ＊と共重合した。結果は、結合媒体に結合された抗体の特異性が、電気泳動による被検体移送の間も維持されることを示した。
【０１０９】
図１２Ａは、分離媒体１２０３および結合媒体１２０４を収容するチャンバ（挿入画）１２０２を含んでいた、マイクロ流体装置１２０１の明視野画像を示す。結合媒体１２０４は、分離媒体１２０３と流体連絡して標識流路（図１２Ｃ、ステップ３参照）に沿って揃えられるように、設けられた。この場合、分離流路（図１２Ｃ、ステップ２参照）および標識流路（図１２Ｃ、ステップ３参照）は、互いに直交していた。標識媒体は、孔径が分離媒体と類似しているゲルを含んでいた。これに加えて、標識媒体は、ビオチン標識された結合メンバー（たとえば、抗体）による官能化を可能にするために、ストレプトアビジンを含んでいた。チャンバ１２０２は、分離媒体１２０３と流体連絡している装荷媒体１２０５も含んでいた。装荷媒体１２０５は、分離流路（図１２Ｃ、ステップ２参照）に沿って、分離媒体１２０３の上流に設けられた。装荷媒体１２０５は、小孔径分離媒体１２０３（６％総アクリルアミド）より上流に、大孔径ゲル（３％総アクリルアミド）を含んでいた。図１２Ａのチャンバ１２０２はまた、チャンバ１２０２の各辺に沿って設けられた複数のチャネル１２０６とも流体連絡している。チャネル１２０６は、チャンバ１２０２内の装荷媒体１２０５、分離媒体１２０３、および結合媒体１２０４に、電場を配向するように構成されていてもよい。
【０１１０】
図１２Ｂは、チャンバ１２０２、およびチャンバ１２０２に電場を配向するように構成されたチャネル１２０６の、明視野画像を示す。図１２Ｃは、上述のようなチャンバ１２０２を含むマイクロ流体装置の図を示す。試料は、マイクロ流体装置内に導入されてもよい（図１２Ｃ、ステップ１参照）。電場は、装荷媒体および分離媒体を通じて試料を配向するために、分離流路の方向軸に沿って印加されてもよい（図１２Ｃ、ステップ２参照）。電場は、電場発生器Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４、Ｖ５、Ｖ６、Ｖ７、およびＶ８を使用して印加されてもよい。試料の電気泳動分離の後、試料中の分離された被検体は、標識流路の方向軸に沿って電場を印加することによって、選択的に結合媒体に移送されてもよい（図１２Ｃ、ステップ３参照）。
【０１１１】
図１２Ｄは、試料中の被検体の分離、移送、および検出の図が重ねられた画像を示す。タンパク質試料は最初に、マイクロ流体装置の大孔径装荷媒体内に電気運動的に装荷された（図１２Ｄ、ステップ１参照）。タンパク質試料は、大孔径装荷媒体と小孔径分離媒体との間の界面に到達すると、濃縮された。「ｉ」は、電流の流れる方向を示す。タンパク質は、これらが分離流路の方向軸に沿って分離媒体の底に向かって移動するにつれて、分離された（図１２Ｄ、ステップ２参照）。印加された電場はその後、分離されたタンパク質を結合媒体の内部に向けて配向するために切り替えられ、これは固定化された（たとえば、架橋結合または共重合された）結合メンバーを含んでいた（図１２Ｄ、ステップ３参照）。結合メンバーは、対象とする被検体１２０７に特異的に結合して保持するように構成されており、対象とする被検体１２０７が官能化された結合媒体に結合されたときに、陽性「ブロット」（たとえば、検出可能シグナル）を産み出した。対象とする被検体１２０７を同定するために、分子量および結合情報が判定された。
【０１１２】
図１３は、マイクロ流体装置内のタンパク質ラダーの分離の画像およびグラフを示す。図１３Ａ〜図１３Ｄは、マイクロ流体装置内で１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いたタンパク質ラダーの電気泳動分離の反転ＣＣＤ画像を示す。図１３Ａ〜図１３Ｄの画像は、様々な時点で撮影された（たとえば、電気泳動分離の開始から１１．６秒、１３．２秒、２２．０秒、および２６．８秒後）。図１３Ｅにおいて、タンパク質ラダーの移動性は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（３％〜８％のＴ）を使用するマイクロ流体装置によるタンパク質のサイズと、線形に関連していた。結果は、勾配スラブゲル（４％〜１２％のＴ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥと比較された（図１３Ｅ参照）。図１３Ｅのグラフの挿入図は、マイクロ流体装置およびスラブゲルによって分離されたタンパク質バンドを示す。図１３Ｆは、マイクロ流体装置を使用するＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離の電気泳動図を示す。移動距離は、図１３ＤのＣＣＤ画像の縮尺とした。
【０１１３】
図１４Ａは、マイクロ流体装置を使用する、蛍光標識されたタンパク質の分離の画像を示す。蛍光標識され、ビオチン標識されたアクチン１４０１は、マイクロ流体装置内でＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して、試料中の別のタンパク質から分離された。より大きいタンパク質種（たとえば、蛍光標識され、ビオチン標識されたアクチン１４０１）は、より小さいタンパク質種１４０２よりも短い距離だけ、分離媒体内を移動した。図１４Ｂは、マイクロ流体装置における、分離媒体から結合媒体への、蛍光標識されたタンパク質の移動の画像を示す。結合媒体は、結合媒体に結合されたストレプトアビジンを含んでいた。結合媒体は、蛍光標識され、ビオチン標識されたアクチン１４０１が結合媒体を横断する際に、蛍光標識され、ビオチン標識されたアクチン１４０１と特異的に結合して、これを保持した（図１４Ｂ参照）。より小さいタンパク質種１４０２は、結合媒体に結合することなく結合媒体を横断し、マイクロ流体装置を出た。
【０１１４】
図１５Ａ〜図１５Ｄは、マイクロ流体装置についてシミュレートされた電場分布の画像を示す。図１５Ａおよび図１５Ｂは、それぞれ主要チャネルおよび１つの交差チャネルを備えるマイクロ流体チャンバおよびマイクロ流体装置における、ＣＯＭＳＯＬでシミュレートされた１次元電気分布の画像を示す。図１５Ｃおよび図１５Ｄはそれぞれ、マイクロ流体チャンバ内の垂直および水平のＣＯＭＳＯＬでシミュレートされた２次元電場分布の画像を示す。ＣＯＭＳＯＬシミュレーションは、マイクロ流体チャンバ内の垂直および水平電場分布がマイクロ流体チャンバ全体で均一であることを、示していた。図１５Ｅ〜図１５Ｆは、２次元マイクロ流体チャンバ内の印加された電場の均一性を検査するマイクロ流体装置のＣＣＤ画像を示す。「ｉ」は、印加された電場の方向を示す。マイクロ流体チャンバ内に装荷される０．１μＭのフリー色素溶液の、実験ＣＣＤ画像が撮影された。図１５Ｅは、マイクロ流体チャンバ内を通る色素の電気運動が、垂直方向において実質的に均一であったことを、示している。図１５Ｆは、マイクロ流体チャンバ内を通る色素の電気運動が、水平方向において実質的に均一であったことを、示している。ＣＯＭＳＯＬシミュレーションおよび実験データはいずれも、マイクロ流体チャンバ内の垂直および水平次元において、良好に制御された、均一な電場分布を示した。均一な電場分布は、マイクロ流体装置を通じて複数の方向に、試料および／または選択された対象とする被検体を正確に配向することを、容易にし得る。
【０１１５】
図１６は、電圧整形を備えるおよび備えないマイクロ流体装置を通る試料１６０１の電気運動の画像を示す。蛍光標識された０．１μＭのＢＳＡが、マイクロ流体装置内に注入され、ＣＣＤ撮像を用いて観察された。ＣＣＤ画像は、垂直から水平方向への移送ステップの間の、蛍光標識された試料１６０１のバンド形状を、示した。試料バンド形状は、整形電圧を用いて移送した後に、著しい歪みを伴わずに、保存された。「ｉ」は、印加された電場の方向を示す。図１６（左）において、試料１６０１は、分離チャンバ内に侵入した後に実質的に歪みを伴わずに（図１６Ａ参照）、および第二水平次元に移送された後に実質的に歪みを伴わずに（図１６Ｂ参照）、その当初の形状を維持した。図１６Ｃおよび図１６Ｄは、電圧整形を用いないと、試料バンド形状が、分離チャンバへの侵入後（図１６Ｃ参照）、および第二水平次元への移送後に（図１６Ｄ参照）、著しく変形することを示した。複数のサイドチャネル１６０２は、異なる試料、試薬、緩衝液、などがマイクロ流体チャンバ内に導入されることを可能にする。たとえば、付加的な試料、試薬、緩衝液などが、試料中の被検体の分離後に、その後に続くサンドイッチ抗体検出、酵素反応などのため、マイクロ流体チャンバ内に導入されてもよい。
【０１１６】
図１８は、試料中の複数の被検体の分離、移送、および検出の画像を示す。マイクロ流体装置１８００は、分離媒体（６％総アクリルアミド）１８０１、および２つの異なる結合媒体、すなわちＰＧに特異的な結合メンバーを含む第一結合媒体（６％総アクリルアミド）１８０２、およびＣＲＰに特異的な結合メンバーを含む第二結合媒体（６％総アクリルアミド）１８０３を収容する、マイクロ流体チャンバ（１ｍｍ×１ｍｍ）を含んでいた。分離媒体および結合媒体は、ポリアクリルアミドゲルのマスクベースの紫外線リソグラフィを用いて、選択的な光パターン形成によって、形成された。選択的な光パターン形成は、マイクロ流体チャンバ内の統合媒体の形成を可能にし、ここで媒体は、被検体分離（たとえば、分離媒体）および抗体ベースの検出（たとえば、結合媒体）のための異なる物理的および機能的特性の明確な領域を含んでいた。
【０１１７】
図１８において、標的タンパク質であるタンパク質Ｇ（ＰＧ）およびＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）を含む試料は、１５０Ｖ／ｃｍの電場強度を用いて分離媒体１８０１を通じて試料を配向することによって、電気泳動的に分離された（図１８、ステップ（１））。ＰＧおよびＣＲＰのベースライン分離は、約２０秒で完了した。分離された標的タンパク質ＰＧおよびＣＲＰは、横方向電場（５０Ｖ／ｃｍ）を用いて結合媒体に移送された（図１８、ステップ（２））。ＰＧを含む分離試料バンドは、ＰＧに特異的な結合メンバーを含む結合媒体に選択的に結合し（〜８０％の捕捉効率）、ＣＲＰを含む分離試料バンドは、ＣＲＰに特異的な結合メンバーを含む結合媒体に選択的に結合した（〜８０％の捕捉効率）（図１８、ステップ（３））。分離、移送、および検出ステップは、９０秒以内で実行された。低交差反応では、各被検体は、それぞれのブロット領域において固定された抗体に結合された。
【０１１８】
図１９は、陰性対照に対する試料中の被検体の分離、移送、および検出の画像を示す。マイクロ流体装置１９００は、分離媒体（６％総ポリアクリルアミド）１９０１、および２つの異なる結合媒体、すなわちＰＧに特異的な結合メンバーを含む第一結合媒体（６％総ポリアクリルアミド）１９０２、およびＣＲＰに特異的な結合メンバーを含む第二結合媒体（６％総ポリアクリルアミド）１９０３を収容する、マイクロ流体チャンバ（１ｍｍ×１ｍｍ）を含んでいた。Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）および陰性対照（ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））を含む試料は、１５０Ｖ／ｃｍの電場強度を用いて分離媒体１９０１を通じて試料を配向することによって、電気泳動的に分離された（図１９、ステップ（１））。ＣＲＰおよびＢＳＡのベースライン分離は、３０秒で完了した。ＣＲＰおよびＢＳＡ陰性対照の分離されたバンドは、横方向電場（５０Ｖ／ｃｍ）を用いて結合媒体に移送された（図１９、ステップ（２））。ＣＲＰを含む分離試料バンドは、ＣＲＰに特異的な結合メンバーを含む結合媒体に選択的に結合した（図１９、ステップ（２））。ＢＳＡ陰性対照を含む分離試料バンドは、結合媒体に選択的に結合することも、検出可能な交差反応または非特異的吸着を示すことも、なかった（図１８、ステップ（３））。分離、移送、および検出ステップは、１１０秒以内で実行された。
【０１１９】
図２０は、試料中の複数の被検体の多重検出の画像を示す。以下の電気泳動分離、標的タンパク質であるタンパク質Ｇ（ＰＧ）およびＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）は、抗体官能化結合媒体において、選択的に捕捉および検出された（図１８参照）。標的タンパク質は、横方向電場に対する曝露（５０Ｖ／ｃｍで＞１１０秒）の後、それぞれの結合媒体中に保持された。結果は、残った被検体が、１１０秒以上の印加された電場への曝露の後、結合媒体に特異的に結合されることを示した。
【０１２０】
図２１は、抗原捕捉効率対結合媒体幅（μｍ）のグラフを示す。抗原捕捉効率は、ラングミュア結合キネティクスを前提として、設計および操作パラメータの関数として、モデリングされた。モデリングは、試料中の複数の被検体の多重分析向けに構成されたマイクロ流体装置のための、結合媒体の最適化（たとえば、結合媒体幅、結合メンバー密度など）を容易にし得る。
【０１２１】
先の実施形態は、理解しやすくする目的のため、解説および例示によってある程度詳細に記載されてきたが、本開示の教示に鑑みて、添付の特許請求の範囲の精神および範囲から逸脱することなく、特定の変更および修正がなされてもよいことは、当業者にとって容易に明確である。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書において使用される専門用語が、具体的な実施形態を記載することのみを目的とし、限定するように意図するものではないこともまた、理解されるべきである。
【０１２２】
数値の範囲が提供される場合には、文脈が別途明確に提示しない限り、その範囲の上限と下限との間の、下限の単位の十分の一までの各介在値、およびその提示された範囲の記載されたまたは介在するその他の値は、本発明に含まれると理解される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、より小さい範囲に独立して含まれてもよく、記載された範囲内のいずれか具体的な排他的限界を条件として、本発明にも含まれる。記載された範囲が１つまたは両方の限界を含む場合、それら含まれる限界のいずれかまたは両方を除く範囲もまた、本発明に含まれる。
【０１２３】
本明細書に引用されるすべての刊行物および特許は、あたかも各刊行物または特許が、具体的かつ個別に参照によって組み込まれるように、参照によって本願に組み込まれ、刊行物の引用に関連する方法および／または材料を開示および記載するために、参照によって本願に組み込まれる。いずれの刊行物の引用も、出願日に先立つその開示に関し、先行する発明のため、本発明がこのような刊行物に先んじないという許可として解釈されるべきではない。さらに、提供された発行日は、実際の発行日とは異なる可能性があり、各々確認される必要があるだろう。
【０１２４】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される際に、別途明確に指示されない限り、「ａ」、「ａｎ」「ｔｈｅ」などの単数形が複数形も含むことに留意されたい。特許請求の範囲が、いかなる任意の要素も排除するように記載されてよいことには、さらに留意されたい。したがって、この記述は、特許請求の範囲における要素の記載に関わる、「単独で（ｓｏｌｅｌｙ）」、「唯一の（ｏｎｌｙ）」などのような排他的用語の使用、または「否定的な」限定の使用のための前提の役割を果たすように、意図される。
【０１２５】
本開示を読むと当業者にとって明確となるように、本明細書に記載および解説される個別の実施形態の各々は、本発明の範囲または精神から逸脱することなく、その他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離されるかまたはこれと組み合わせられてもよい、個別の要素および特徴を有している。記載される方法のいずれも、記載された順番で、または論理的に可能ないずれか別の順番で、実行されることが可能である。
【０１２６】
したがって、上記は単に、本発明の原理を解説している。本明細書に明確に記載または図示されていないものの、当業者が、本発明の原理を実現し、その精神および範囲に含まれる、様々な構成を考案することができることは、理解される。さらに、本明細書に記載されるすべての実施例および条件的言語は主に、当該技術を拡大するために、本発明者らによって貢献された発明の原理および概念を、読者が理解するのを支援するように意図されており、このような具体的に明記された実施例および条件を限定することなく、ありのままに解釈されるべきである。また、本発明の原理、態様、および実施形態、ならびにその具体例を示す、本明細書内のすべての記述はその構造的および機能的同等物の両方を包含するように意図される。これに加えて、このような同等物は、現在周知の同等物、および将来開発される同等物、すなわちその構造にかかわらず同じ機能を実行する、今後開発されるいずれの要素も、両方とも含むものと意図される。したがって、本発明の範囲は、本明細書に提示または記載される、例示的実施形態に限定されるようには意図されない。むしろ、本発明の範囲および精神は、添付の特許請求の範囲によって実現される。
【図１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
流体試料中の被検体を検出するマイクロ流体装置であって、
第一方向軸を備える分離流路を有する分離媒体と、
第二方向軸を備える標識流路を有する結合媒体であって、前記結合媒体は前記分離媒体と流体連絡している、結合媒体と、を含み、
前記マイクロ流体装置は、２つ以上の方向的に異なる流動場に試料を曝すように構成されている、マイクロ流体装置。
【請求項２】
前記２つ以上の方向的に異なる流動場は、２つ以上の方向的に異なる電場を含む、請求項１に記載のマイクロ流体装置。
【請求項３】
前記分離媒体はポリマーゲルを含む、請求項１に記載のマイクロ流体装置。
【請求項４】
前記結合媒体は、担体と安定的に会合した結合メンバーを含む、請求項１に記載のマイクロ流体装置。
【請求項５】
前記担体は膜を含む、請求項４に記載のマイクロ流体装置。
【請求項６】
前記担体はポリマーゲルを含む、請求項４に記載のマイクロ流体装置。
【請求項７】
前記結合メンバーは、タンパク質またはその結合断片を含む、請求項４に記載のマイクロ流体装置。
【請求項８】
前記タンパク質は抗体である、請求項７に記載のマイクロ流体装置。
【請求項９】
前記被検体は蛍光標識を含む、請求項１に記載のマイクロ流体装置。
【請求項１０】
前記第二方向軸は前記第一方向軸に対して直交している、請求項１に記載のマイクロ流体装置。
【請求項１１】
前記マイクロ流体装置は、前記分離媒体および前記結合媒体を収容するチャンバを含む、請求項１に記載のマイクロ流体装置。
【請求項１２】
流体試料中の被検体を検出する方法において、
（ａ）２つ以上の方向的に異なる流動場に試料を曝すように構成されているマイクロ流体装置内に前記流体試料を導入するステップであって、前記マイクロ流体装置は、
（ｉ）第一方向軸を備える分離流路を有する分離媒体と、
（ｉｉ）第二方向軸を備える標識流路を有する結合媒体であって、前記結合媒体は前記分離媒体と流体連絡している、前記結合媒体とを含む、ステップと、
（ｂ）分離試料を生成するために前記分離媒体を通るように前記試料を配向するステップと、
（ｃ）前記分離試料中の前記被検体を検出するステップと、を含む方法。
【請求項１３】
前記２つ以上の方向的に異なる流動場は、２つ以上の方向的に異なる電場を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記方法は前記分離試料を前記結合媒体に移送するステップを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記方法は、結合メンバーを前記分離試料に移送するステップを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記試料を配向するステップに先立って、前記試料を濃縮するステップをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記方法は診断方法である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記方法は検証方法である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
流体試料中の被検体を検出するシステムにおいて、
（ａ）２つ以上の方向的に異なる流動場に試料を曝すように構成されているマイクロ流体装置であって、
（ｉ）第一方向軸を備える分離流路を有する分離媒体と、
（ｉｉ）第二方向軸を備える標識流路を有する結合媒体であって、前記結合媒体は前記分離媒体と流体連絡している、結合媒体と、を含むマイクロ流体装置と、
（ｂ）検出器と、を含むシステム。
【請求項２０】
前記２つ以上の方向的に異なる流動場は、２つ以上の方向的に異なる電場を含む、請求項１９に記載のシステム。
【請求項２１】
前記検出器は、光電子増倍管、電荷結合素子、強化電荷結合素子、相補型金属酸化物半導体センサー、視感色彩読み取り、またはフォトダイオードである、請求項１９に記載のシステム。
【請求項２２】
前記マイクロ流体装置を通じて流体を配向するように構成されているマイクロ流体素子をさらに含む、請求項１９に記載のシステム。
【請求項２３】
（ａ）２つ以上の方向的に異なる流動場に試料を曝すように構成されているマイクロ流体装置であって、
（ｉ）第一方向軸を備える分離流路を有する分離媒体と、
（ｉｉ）第二方向軸を備える標識流路を有する結合媒体であって、前記結合媒体は前記分離媒体と流体連絡している、結合媒体と、を含むマイクロ流体装置と、
（ｂ）緩衝液と、を含むキット。
【請求項２４】
前記２つ以上の方向的に異なる流動場は、２つ以上の方向的に異なる電場を含む、請求項２３に記載のキット。
【請求項１】
流体試料中の被検体を検出するマイクロ流体装置であって、
第一方向軸を備える分離流路を有する分離媒体と、
第二方向軸を備える標識流路を有する結合媒体であって、前記結合媒体は前記分離媒体と流体連絡している、結合媒体と、を含み、
前記マイクロ流体装置は、２つ以上の方向的に異なる流動場に試料を曝すように構成されている、マイクロ流体装置。
【請求項２】
前記２つ以上の方向的に異なる流動場は、２つ以上の方向的に異なる電場を含む、請求項１に記載のマイクロ流体装置。
【請求項３】
前記分離媒体はポリマーゲルを含む、請求項１に記載のマイクロ流体装置。
【請求項４】
前記結合媒体は、担体と安定的に会合した結合メンバーを含む、請求項１に記載のマイクロ流体装置。
【請求項５】
前記担体は膜を含む、請求項４に記載のマイクロ流体装置。
【請求項６】
前記担体はポリマーゲルを含む、請求項４に記載のマイクロ流体装置。
【請求項７】
前記結合メンバーは、タンパク質またはその結合断片を含む、請求項４に記載のマイクロ流体装置。
【請求項８】
前記タンパク質は抗体である、請求項７に記載のマイクロ流体装置。
【請求項９】
前記被検体は蛍光標識を含む、請求項１に記載のマイクロ流体装置。
【請求項１０】
前記第二方向軸は前記第一方向軸に対して直交している、請求項１に記載のマイクロ流体装置。
【請求項１１】
前記マイクロ流体装置は、前記分離媒体および前記結合媒体を収容するチャンバを含む、請求項１に記載のマイクロ流体装置。
【請求項１２】
流体試料中の被検体を検出する方法において、
（ａ）２つ以上の方向的に異なる流動場に試料を曝すように構成されているマイクロ流体装置内に前記流体試料を導入するステップであって、前記マイクロ流体装置は、
（ｉ）第一方向軸を備える分離流路を有する分離媒体と、
（ｉｉ）第二方向軸を備える標識流路を有する結合媒体であって、前記結合媒体は前記分離媒体と流体連絡している、前記結合媒体とを含む、ステップと、
（ｂ）分離試料を生成するために前記分離媒体を通るように前記試料を配向するステップと、
（ｃ）前記分離試料中の前記被検体を検出するステップと、を含む方法。
【請求項１３】
前記２つ以上の方向的に異なる流動場は、２つ以上の方向的に異なる電場を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記方法は前記分離試料を前記結合媒体に移送するステップを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記方法は、結合メンバーを前記分離試料に移送するステップを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記試料を配向するステップに先立って、前記試料を濃縮するステップをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記方法は診断方法である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記方法は検証方法である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
流体試料中の被検体を検出するシステムにおいて、
（ａ）２つ以上の方向的に異なる流動場に試料を曝すように構成されているマイクロ流体装置であって、
（ｉ）第一方向軸を備える分離流路を有する分離媒体と、
（ｉｉ）第二方向軸を備える標識流路を有する結合媒体であって、前記結合媒体は前記分離媒体と流体連絡している、結合媒体と、を含むマイクロ流体装置と、
（ｂ）検出器と、を含むシステム。
【請求項２０】
前記２つ以上の方向的に異なる流動場は、２つ以上の方向的に異なる電場を含む、請求項１９に記載のシステム。
【請求項２１】
前記検出器は、光電子増倍管、電荷結合素子、強化電荷結合素子、相補型金属酸化物半導体センサー、視感色彩読み取り、またはフォトダイオードである、請求項１９に記載のシステム。
【請求項２２】
前記マイクロ流体装置を通じて流体を配向するように構成されているマイクロ流体素子をさらに含む、請求項１９に記載のシステム。
【請求項２３】
（ａ）２つ以上の方向的に異なる流動場に試料を曝すように構成されているマイクロ流体装置であって、
（ｉ）第一方向軸を備える分離流路を有する分離媒体と、
（ｉｉ）第二方向軸を備える標識流路を有する結合媒体であって、前記結合媒体は前記分離媒体と流体連絡している、結合媒体と、を含むマイクロ流体装置と、
（ｂ）緩衝液と、を含むキット。
【請求項２４】
前記２つ以上の方向的に異なる流動場は、２つ以上の方向的に異なる電場を含む、請求項２３に記載のキット。
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【公表番号】特表２０１２−５２７６２２（Ｐ２０１２−５２７６２２Ａ）
【公表日】平成２４年１１月８日（２０１２．１１．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１１９７３（Ｐ２０１２−５１１９７３）
【出願日】平成２２年５月１８日（２０１０．５．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３５３１４
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１３５３６４
【国際公開日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【出願人】（５９２１３０６９９）ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア (364)
【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｒｅｇｅｎｔｓ ｏｆ Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ
【公表日】平成２４年１１月８日（２０１２．１１．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年５月１８日（２０１０．５．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３５３１４
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１３５３６４
【国際公開日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【出願人】（５９２１３０６９９）ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア (364)
【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｒｅｇｅｎｔｓ ｏｆ Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ
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