多発性骨髄腫細胞を死滅させるためのｅＩＦ−５Ａの使用
本発明は、真核生物翻訳開始因子５Ａ、および、癌細胞の成長を阻害し、転移を阻害するための、該因子をコード化するポリヌクレオチドの使用に関する。好ましい実施形態において、ｅＩＦ−５Ａ１は多発性骨髄腫細胞を死滅させるために使用される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００５年１２月１３日に出願された米国仮特許出願第６０／７４９，６０４号、および、２００６年４月２７日に出願された米国仮特許出願第６０／７９５，１６８号の利益を主張するものであり、参照することにより、そのすべてを本明細書に援用する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、アポトーシスに特異的な真核生物開始因子（「ｅＩＦ−５Ａ」）、および該因子をコード化するポリヌクレオチドの多発性骨髄腫細胞やその他の癌細胞を死滅させるための使用に関する。本発明は、多発性骨髄腫を阻害するため、多発性骨髄腫細胞を死滅させるため、そして、その他の癌細胞の成長を阻害するおよび／または死滅させるための、アポトーシスに特異的なｅＩＦ−５Ａ、または「アポトーシス特異的ｅＩＦ−５Ａ」、または「ｅＩＦ−５Ａ１」の使用と、ｅＩＦ−５Ａ２アイソフォームの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
アポトーシスは、細胞の縮小、クロマチンの濃縮、核断片化、および膜泡形成といった明確な形態学的特性によって特徴付けられる、遺伝子的にプログラムされた細胞事象である。Ｋｅｒｒ ｅｔ ａｌ（１９７２）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，２６，２３９−２５７；Ｗｙｌｌｉｅ ｅｔ ａｌ（１９８０）Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．，６８，２５１−３０６。アポトーシスは、正常な組織発達およびホメオスタシスにおいて重要な役割を果たし、アポトーシスのプログラムにおける欠陥は、神経変性疾患および自己免疫疾患から腫瘍まで、種々のヒト疾患の原因になると考えられている。Ｔｈｏｍｐｓｏｎ（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６７，１４５６−１４６２；Ｍｕｌｌａｕｅｒ ｅｔ ａｌ（２００１）Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ，４８８，２１１−２３１。アポトーシス細胞の形態学的特徴については明らかになっているものの、その過程を制御する分子経路が解明されるようになってからまだ間もない。
【０００４】
アポトーシスに関与する別の主要なタンパク質は、腫瘍抑制遺伝子ｐ５３によりコード化されるタンパク質である。このタンパク質は、おそらくはＢａｘの上方制御によって、細胞の成長を制御し、損傷を受けて遺伝的に不安定な細胞にアポトーシスを誘導する、転写因子である。Ｂｏｌｄ ｅｔ ａｌ（１９９７）Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，６，１３３−１４２；Ｒｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｓｃｈｕｌｅｒ ＆ Ｇｒｅｅｎ（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．，２９，６８４−６８８；Ｒｙａｎ ｅｔ ａｌ（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１３，３３２−３３７；Ｚｏｒｎｉｇ ｅｔ ａｌ（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１５５１，Ｆ１−Ｆ３７。
【０００５】
アポトーシス経路における改変は、癌など多数の疾患過程において重要な役割を果たすと考えられる。Ｗｙｌｌｉｅ ｅｔ ａｌ（１９８０）Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．，６８，２５１−３０６；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６７，１４５６−１４６２、Ｓｅｎ ＆ Ｄ’Ｉｎｃａｌｃｉ（１９９２）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，３０７，１２２−１２７；ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ（１９９５）Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，６，５３−６０。従来、癌の発生および進行についての調査は、細胞増殖に焦点を当ててきた。しかし、腫瘍形成においてアポトーシスが果たす重要な役割が最近明らかになった。実際、アポトーシスの制御には、腫瘍細胞において必ず何らかの改変が生じるため、アポトーシスに関して現在分かっていることのほとんどが、腫瘍モデルを用いて分かってきたことである。Ｂｏｌｄ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，６，１３３−１４２。
【０００６】
サイトカインもアポトーシス経路に関与してきた。生態系は、自らを制御するために細胞間相互作用を必要とし、細胞間のクロストークには概して多種類のサイトカインが必要となる。サイトカインは、数多くの異なる種類の細胞の型による、種々の刺激に反応して産生されるメディエータである。サイトカインは、数多くの異なる種類の細胞に、数多くの異なる効果を及ぼすことができる多面的分子であるが、特に、免疫応答の制御と、造血細胞の増殖および分化において重要である。標的細胞に対するサイトカインの作用は、特定のサイトカイン、相対濃度、その他のメディエータの存在に依存して、細胞の生存、増殖、活性化、分化、またはアポトーシスを促進することが可能である。
【０００７】
デオキシハイプシン合成酵素（ＤＨＳ）およびハイプシン含有の真核生物翻訳開始因子５Ａ（ｅＩＦ−５Ａ）は、細胞の成長や分化など多くの細胞過程において重要な役割を果たすことで知られている。独特のアミノ酸であるハイプシンは、検査するすべての真核生物および古細菌中に見られるが真正細菌中には見られず、ｅＩＦ−５Ａが唯一知られるハイプシン含有タンパク質である。Ｐａｒｋ（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３，７４４７−７４４９；Ｓｃｈｕｍａｎｎ ＆ Ｋｌｉｎｋ（１９８９）Ｓｙｓｔｅｍ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１１，１０３−１０７、Ｂａｒｔｉｇ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｓｙｓｔｅｍ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３，１１２−１１６；Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７ａ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２，１６５８５−１６５８９。活性ｅＩＦ−５Ａは、翻訳後２つのステップにおいて形成される。第１のステップは、デオキシハイプシン合成酵素により触媒される、前駆物質ｅＩＦ−５Ａの特定のリジンのα‐アミノ基へ、スペルミジンの４‐アミノブチル部分を転移することによる、デオキシハイプシン残基の形成であり、第２のステップは、この４‐アミノブチル部分をデオキシハイプシン水酸化酵素によって水酸化してハイプシンを形成することを含む。
【０００８】
ｅＩＦ−５Ａのアミノ酸配列は種間でよく保存されており、ｅＩＦ−５Ａ内のハイプシン残基を取り囲むアミノ酸配列には徹底した保存が見られ、この修飾が生存のために重要である可能性を示している。Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｆａｃｔｏｒｓ，４，９５−１０４。今まで酵母中に発見されたｅＩＦ−５Ａの両アイソフォームの不活性化、またはアイソフォーム活性化の第１のステップを触媒するＤＨＳ遺伝子の不活性化が、細胞分裂を阻止するという観察は、この仮説をさらに支持するものである。Ｓｃｈｎｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１，３１０５−３１１４；Ｓａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９９６）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，３８４，１５１−１５４，Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，１６７７−１６８３。しかし、酵母におけるｅＩＦ−５Ａタンパク質の枯渇は、総タンパク質合成をわずかに減少させたに過ぎず、タンパク質全体の合成にではなく、ｍＲＮＡの特定のサブセットの翻訳に、ｅＩＦ−５Ａが必要である可能性を示している。Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９３）「Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｅＩＦ−５Ａ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｏｎ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，」ｉｎ Ｔｕｉｔｅ，Ｍ．（ｅｄ．），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎ Ｙｅａｓｔ，ＮＡＴＯ Ｓｅｒｉｅｓ Ｈ。ｅＩＦ−５Ａを結合するリガンドが、非常によく保存された部分を共有するという最近の発見もまた、ｅＩＦ−５Ａの重要性を支持するものである。Ｘｕ ＆ Ｃｈｅｎ（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，２５５５−２５６１。また、修飾されたｅＩＦ−５Ａのハイプシン残基が、ＲＮＡへの配列特異的結合に必要不可欠であることが分かり、結合はリボヌクレアーゼからの保護を提供しなかった。
【０００９】
さらに、細胞内におけるｅＩＦ−５Ａの枯渇が、核内に特定のｍＲＮＡの有意な堆積をもたらし、ｅＩＦ−５Ａが、特定のクラスのｍＲＮＡを核から細胞質へと輸送する役割を担っている可能性があることを示唆している。Ｌｉｕ ＆ Ｔａｒｔａｋｏｆｆ（１９９７）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ，８，４２６ａ．Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｏ．２４７６，３７ｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ。核孔に関連する核内繊維にｅＩＦ−５Ａが堆積すること、そして一般の核外輸送受容体と相互作用することは、ｅＩＦ−５Ａが、ポリソームの一構成要素であるよりも、むしろ核細胞質間輸送タンパク質である可能性をさらに示すものである。Ｒｏｓｏｒｉｕｓ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１１２，２３６９−２３８０。
【００１０】
１９８９年に、初めてＳｍｉｔ−ＭｃＢｒｉｄｅらによってヒトからｅＩＦ−５ＡのｃＤＮＡがクローン化されて以来、酵母、ラット、ニワトリ胚、アルファルファ、トマトなど、種々の真核生物からｅＩＦ−５ＡのｃＤＮＡまたは遺伝子がクローン化されてきた。Ｓｍｉｔ−ＭｃＢｒｉｄｅ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１５７８−１５８３；Ｓｃｈｎｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１）（酵母）；Ｓａｎｏ，Ａ．（１９９５）ｉｎ Ｉｍａｈｏｒｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ），Ｐｏｌｙａｍｉｎｅｓ，Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ，ＶＮＵ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，８１−８８（ラット）；Ｒｉｎａｕｄｏ ＆ Ｐａｒｋ（１９９２）ＦＡＳＥＢ Ｊ．，６，Ａ４５３（ニワトリ胚）；Ｐａｙ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１７，９２７−９２９（アルファルファ）；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，１７５４１−１７５４９（トマト）。
【００１１】
多発性骨髄腫は、骨髄中における悪性形質細胞の増大、および溶骨性病変の存在を特徴とする、進行性および致命的な疾患である。多発性骨髄腫は、不治ではあるが治療可能な形質細胞の癌である。形質細胞は免疫系の重要な部分であり、感染や疾患との闘いを助ける免疫グロブリン（抗体）を産生する。多発性骨髄腫は、骨髄における過剰な数の異常な形質細胞、そして、インタクトなモノクローナル免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥ：「Ｍタンパク質」）、またはベンス・ジョーンズタンパク質（遊離のモノクローナルなＬ鎖）の、過剰産生によって特徴付けられる。低カルシウム血症、貧血、腎損傷、細菌感染に対する感受性の増加、正常な免疫グロブリンの産生低下が、多発性骨髄腫に共通する臨床症状である。また、多発性骨髄腫は、骨盤、脊椎、肋骨、および頭蓋骨におけるびまん性の骨粗しょう症を特徴とすることも多い。
【００１２】
多発性骨髄腫に対する従来の治療法には、化学療法、幹細胞移植、幹細胞移植を併用した大量化学療法、およびサルベージ療法がある。化学療法には、Ｔｈａｌｏｍｉｄ（登録商標）（サリドマイド）、ボルテゾミブ、Ａｒｅｄｉａ（登録商標）（パミドロネート）、ステロイド、およびＺｏｍｅｔａ（登録商標）（ゾレドロン酸）を用いる治療などがある。しかし、多くの化学療法薬は、骨髄、胃および腸の粘膜、毛包など、活発に分裂する非癌性細胞に毒性を有する。従って、化学療法は、血球数の減少、悪心、嘔吐、下痢、脱毛を引き起こす場合がある。
【００１３】
従来の化学療法、すなわち標準用量の化学療法は、多発性骨髄腫を罹患する患者に対して１次的にまたは初期的に通常行われる治療である。また、大量化学療法や幹細胞移植の準備として、患者が化学療法を受ける場合もある。移植前に腫瘍量を減少させるために、導入療法（幹細胞移植の前に行う従来の化学療法）が使用されることもある。特定の化学療法薬は、骨髄細胞に対する毒性がより低く、骨髄からより多くの幹細胞を得ることができるため、他の薬よりも導入療法に適している。導入療法に適した化学療法薬の例には、デキサメタゾン、サリドマイド／デキサメタゾン、ＶＡＤ（ビンクリスチン、Ａｄｒｉａｍｉｃｙｎ（登録商標）（ドキソルビシン）、およびデキサメタゾンの併用）、およびＤＶｄ（ペグ化リポソームドキソルビシン（Ｄｏｘｉｌ（登録商標）、Ｃａｅｌｙｘ（登録商標））、ビンクリスチン、および低用量デキサメサゾンの併用）が挙げられる。
【００１４】
多発性骨髄腫の標準的な治療は、メルファランをプレドニゾン（副腎皮質ステロイド剤）と併用することであり、５０％の奏功率を示している。残念ながら、メルファランはアルキル化剤であるため、導入治療には不向きである。副腎皮質ステロイド（特にデキサメサゾン）は、多発性骨髄腫の治療、特に化学療法に耐えられない高齢患者に対して、単独で使用される場合がある。デキサメサゾンも、単独あるいは他の薬剤と併用して、導入療法に使用される場合がある。ＶＡＤは最も広く使用される導入療法だが、ＤＶｄが導入療法において有効であることは最近明らかになった。ボルテゾミブは、多発性骨髄腫の治療に最近承認されたが、毒性が非常に高い。しかし、現存するいかなる治療法も、治癒に対する顕著な可能性を提供することはできない。つまり、多発性骨髄腫細胞を死滅させるための適切な治療法が、依然として必要である。本発明はその必要とされているものを提供する。
【発明の開示】
【００１５】
本発明は、癌細胞の成長を阻害する、および／または、癌細胞を死滅させる方法を提供する。また本発明は、癌細胞が転移する能力を阻害する、または遅らせる方法も提供する。癌の成長を阻害することは、腫瘍の縮小、腫瘍成長の低下を含み、また、腫瘍の完全な寛解を含む場合もある。癌はいかなる癌または腫瘍でもあり得るとし、大腸癌、結腸直腸腺癌、膀胱癌、子宮頸部腺癌、および肺癌を含むが、これらに限定されない。本発明の方法は、ｅＩＦ−５Ａの投与、好ましくはヒトｅＩＦ−５Ａ１を、該癌を罹患する患者（哺乳類、好ましくはヒト）に投与することに関連する。ｅＩＦ−５Ａ１が好ましいが、ｅＩＦ−５Ａ２アイソフォームを使用してもよい。ｅＩＦ−５Ａは、当該技術分野で既知である任意の適切な方法によって、それを必要とする患者に送達され得る。ｅＩＦ−５Ａは、生物学的に適切な媒体中のＤＮＡのような裸のＤＮＡとして、ＩＶや皮下注射を介して、あるいはその他の任意の生物学的に適切な送達機構を介して送達され得る。あるいは、ｅＩＦ−５Ａはアデノウイルスベクターのようなベクターの中で送達され得る。あるいは、ＤＮＡは、標的癌細胞へのＤＮＡの送達を提供する、リポソームやその他の任意の適切な「担体」の中で送達され得る。また、ｅＩＦ−５Ａは腫瘍の部位に直接送達され得る。当業者は、ｅＩＦ−５Ａの送達について、用量および治療投与計画の期間を決定することが可能であろう。
【００１６】
ｅＩＦ−５Ａ１およびｅＩＦ−５Ａ２は、０９／９０９，７９６（Ｕ．Ｓ．６，８６７，２３７）；１０／１４１，６４７（許可）；１０／２００，１４８；１０／２７７，９６９；１０／３８３，６１４；１０／７９２，８９３；１１／２８７，４６０；１０／８６１，９８０；１１／１３４，４４５；１１／１８４，９８２；１１／２９３，３９１；６０／７４９，６０４；６０／７９５，１６８などの先の同時係属出願において既知、かつ説明されており、参照することにより、それらのすべてを本明細書に援用するものとする。ｅＩＦ−５Ａはヒト、ラット、マウス、イヌ等の種間でよく保存されているため、任意のｅＩＦ−５Ａが本発明において使用され得る。好ましくは、ヒトｅＩＦ−５Ａがヒト等の治療に使用される。突然変異したｅＩＦ−５Ａｓが、ｅＩＦ−５Ａの発現を上方制御する、または増加することが可能であり、それにより癌の成長を阻害する、または癌細胞を死滅させることができる限り、ｅＩＦ−５ＡはｅＩＦ−５Ａの突然変異体も含む。
【００１７】
本発明は、細胞にｅＩＦ−５Ａ１をコード化するヌクレオチドを提供することにより、上記細胞内のＭＡＰＫ／ＳＡＰＫシグナル経路を活性化する方法も提供する。該ｅＩＦ−５Ａ１ポリヌクレオチドおよびｅＩＦ−５Ａ１タンパク質は上述の通りである。
【００１８】
本発明は、ｅＩＦ−５Ａをコード化するポリヌクレオチドを含む、骨髄腫細胞を死滅させるために有用な医薬組成物も提供する。該ｅＩＦ５Ａは、ｅＩＦ５Ａ１、ｅＩＦ５Ａ２、またはｅＩＦ５Ａ１の突然変異体であってもよい。好ましくは、該ｅＩＦ５ＡはｅＩＦ５Ａ１である。該組成物は、送達ビヒクルをさらに含んでもよい。該送達ビヒクルは、ベクター、プラスミド、リポソーム、またはデンドリマーであってもよいが、これらに限定されない。
【００１９】
本発明は、多発性骨髄腫を罹患する対象において多発性骨髄腫細胞を死滅させるための薬物を作るためのｅＩＦ５Ａ（好ましくはｅＩＦ５Ａ１）の使用も提供する。
【００２０】
本発明は、ｅＩＦ５Ａ１をコード化するポリヌクレオチドを含む組成物を骨髄腫細胞に投与することを含む、多発性骨髄腫細胞を死滅させる方法をさらに提供し、該組成物は多発性骨髄腫細胞を死滅させる。該ｅＩＦ５Ａ１は突然変異体であってもよく、該突然変異体は別のアミノ酸に変化した保存リジンを有し、上記突然変異体はハイプシン化されることができない。治療の方法において有用な組成物は本明細書に記載する通りである。
【００２１】
本発明は、多発性骨髄腫細胞を死滅させる方法をさらに提供し、ｅＩＦ−５Ａ１をコード化するポリヌクレオチドを含む組成物のほかに、ｅＩＦ−５Ａ１に対するｓｉＲＮＡを含む組成物が提供される。該ｓｉＲＮＡはｅＩＦ−５Ａ１の内因性発現を下方制御し、それによってＩＬ−６の発現を下方制御し、ひいては骨髄腫細胞内のアポトーシスを引き起こす。ｅＩＦ−５Ａ１ ｓｉＲＮＡを含む組成物は、静脈内投与されてもよく、または、プラスミド、ベクター、リポソーム、またはデンドリマーのような送達ビヒクルの中で投与されてもよい。
【００２２】
発明の詳細な説明
真核生物翻訳開始因子５Ａ１（ｅＩＦ５Ａ１）は、細胞増殖に関与するｍＲＮＡのサブセットの翻訳促進に関与する、核細胞質間輸送シャトルタンパク質として機能すると仮説を立てられてきた。しかし、ｅＩＦ５Ａ１は、アポトーシスの制御因子（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．；４５（１０）：３５６８−７６（２００４））として、また、ｐ５３の発現を制御することのできるアポトーシス促進性のタンパク質としても認識されている（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．；２７９：４９２５１−４９２５８；および本明細書の図２３）。腫瘍抑制タンパク質ｐ５３は、細胞周期停止を仲介する上で、またストレスやＤＮＡ損傷に応答するアポトーシスにおいて、中心的な役割を担っている。ｅＩＦ５Ａ１の過剰発現は、癌細胞株のｐ５３発現を上方制御することが可能であるが、（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．；２７９：４９２５１−４９２５８；および本明細書の図２３）、ｅＩＦ５Ａ１の過剰発現は、ｐ５３欠損細胞株にアポトーシスを誘導することも可能であり（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆｅｂ．９，２００６（決定保留））、ｅＩＦ５Ａ１の過剰発現が複数の機構によってアポトーシスを誘導することを示唆している。
【００２３】
ｅＩＦ５Ａ１の発現はアポトーシスと相関性を有する。トポイソメラーゼ阻害剤であるアクチノマイシンＤで処理した、正常な大腸線維芽細胞のウエスタンブロット（図１Ａ）は、アクチノマイシンＤ処理を開始してから２４時間後に、ｐ５３と並行してｅＩＦ５Ａ１タンパク質発現が上方制御されたことを実証している。一酸化窒素（ＮＯ）供与体であるＳＮＰへの暴露に起因するアポトーシス中のＲＫＯ細胞も、ｅＩＦ５Ａ１タンパク質発現を上方制御する（図１Ｂ）。ｅＩＦ５Ａ１のＲＮＡ転写レベルは、これらの条件下では増加せず、これは、ｅＩＦ５Ａ１タンパク質が、ｍＲＮＡの転写後制御の結果として堆積していることを示唆している（図１Ａおよび１Ｂ）。これらの結果は、ｅＩＦ５Ａ１が、遺伝毒性ストレスや一酸化窒素に起因するアポトーシスに関与する可能性を示唆するものである。
【００２４】
細胞周期停止やアポトーシスを誘導するＤＨＳおよびＤＨＨ阻害剤に関する報告や、細胞の成長を維持するにはハイプシン化されたｅＩＦ５Ａ１が必要であるに違いないという結論に一部基づいて、細胞増殖におけるｅＩＦ５Ａ１の必要性が長い間提案されてきた。しかし、ｓｉＲＮＡの使用によるｅＩＦ５Ａ１発現の特異的抑制は、細胞の成長に何の影響も与えなかったことが判明した。ＨＴ−２９細胞のｅＩＦ５Ａ１発現を９０％超抑制したことは、５日間にわたる細胞増殖に何の影響も与えなかった（図２Ａ〜Ｅ）。しかし、ＤＨＳ阻害剤であるＧＣ７は、これらの細胞の成長に絶大な影響を与えた（図２Ｃ）。これらの結果は、ｅＩＦ５Ａ１が細胞の成長に必要ではない可能性があることを示唆している。また、ｅＩＦ５Ａ１の抑制が、アクチノマイシンＤ誘導性の細胞毒性からＨＴ‐２９細胞を一部保護できたことは興味深く（図２Ｂ）、これは、遺伝毒性ストレスに起因するアポトーシスにｅＩＦ５Ａ１が関与することを、さらに支持するものである。
【００２５】
ｅＩＦ５Ａ１ ｓｉＲＮＡが、アポトーシスから細胞を保護する能力は、ｅＩＦ５Ａ１タンパク質抑制がｐ５３発現に与えた影響についての試験を促すことになった。ＲＫＯ細胞は、ストレス条件下以外では堆積しない機能的ｐ５３タンパク質を有する。ｓｉＲＮＡによるｅＩＦ５Ａ１の抑制は、アクチノマイシンＤ処理から２４時間後にｐ５３タンパク質の堆積を６９％阻害することが可能であり（図３Ａおよび３Ｂ）、これは遺伝毒性ストレス下でのｐ５３の適切な発現に、ｅＩＦ５Ａ１が必要であることを示唆している。異なる配列を有するｅＩＦ５Ａ１に対する第２のｓｉＲＮＡも、アクチノマイシンＤに反応してｐ５３の上方制御を防止することができ（図８Ｂ）、この効果がｓｉＲＮＡの非特異的な効果ではないことを示唆している。しかし、ｅＩＦ５Ａ１は、ＲＫＯ細胞（機能的ｐ５３を含む）およびＲＫＯ−Ｅ６（機能的ｐ５３を含まない、図８Ａ）の両方でアポトーシスを誘導することが可能であったため（図４Ａおよび４Ｂ）、ｅＩＦ５Ａ１がｐ５３から独立した機構によってもアポトーシスを誘導することができることを示唆している。
【００２６】
ｅＩＦ５Ａ１またはハイプシン修飾に必要な保存リジン（Ｋ）（５０位）において点突然変異を含むｅＩＦ５Ａ１｛ｅＩＦ５Ａ１（Ｋ５０Ａ）｝のいずれかを発現しているアデノウイルスコンストラクトを構築した。点突然変異はリジンがアラニン（Ａ）となる原因となった。ＨＴ‐２９細胞がいずれかのコンストラクトに感染することで、それらの細胞にアポトーシスを誘導し（図５Ｃおよび５Ｄおよび図６）、細胞のバイアビリティーを大きく減少した（図５Ｅ）。Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１またはＡｄ−ｅＩＦ５Ａ１（Ｋ５０Ａ）による感染の結果として、どのような形態のｅＩＦ５Ａ１が堆積していたかを判定するために、２次元ゲル電気泳動を使用した（図５Ｂ）。予想したとおり、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１（Ｋ５０Ａ）感染後に、非修飾ｅＩＦ５Ａ１が堆積した。Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１による感染は、非修飾およびデオキシハイプシン修飾ｅＩＦ５Ａ１の両方の堆積を著しく増加させる結果となり、ウイルスによって産生されたｅＩＦ５Ａ１タンパク質の大部分をハイプシン化するためには、ＤＨＳおよびＤＨＨの活性が不十分であることを示した（図５Ｂ）。これらの結果は、非修飾ｅＩＦ５Ａ１、そしておそらくはデオキシハイプシン修飾ｅＩＦ５Ａ１が、細胞のアポトーシスを引き起こす形態であることを強く示唆するものである。ハイプシン化ｅＩＦ５Ａ１もこの能力を有するか否かはまだ明らかではない。
【００２７】
ｅＩＦ５Ａ１の核細胞質間輸送機能が示唆されてきたが、ｅＩＦ５Ａ１は主として細胞質の中で発現すると報告されている。（Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．；２２５：３４８−３５６（１９９６ｂ））。核細胞質間輸送シャトルタンパク質は、核局在化も行うことが予想される。アポトーシス中のｅＩＦ５Ａ１の機能が発見されたため、アポトーシス中のｅＩＦ５Ａ１の局在変化についての研究を行った。ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αを用いた処理による細胞死受容体の活性化と、アクチノマイシンＤを用いた処理による遺伝毒性ストレスという、２つの異なる機構によってアポトーシスをＨＴ‐２９細胞に誘導した。間接免疫蛍光法によって、ｅＩＦ５Ａ１は未処理の成長中の細胞の細胞質内に局在することが明らかになった（図７）。しかし、アポトーシス刺激剤を用いた処理は、ｅＩＦ５Ａ１の動きを非常に迅速に刺激し、主に細胞質内に局在していたｅＩＦ５Ａ１が、主に核に局在するようになった（図７Ａおよび７Ｂ）。このｅＩＦ５Ａ１の局在における変化は、ＩＦＮγ／ＴＮＦ−α処理細胞では１０分以内（図７Ａ）、アクチノマイシンＤ処理細胞では９０分以内（図７Ｂ）と、非常に迅速に発生した。これらの結果は、細胞死受容体の活性化および遺伝毒性ストレスにより誘導されたアポトーシスの間、ｅＩＦ５Ａ１が核機能を有することを示唆している。
【００２８】
アポトーシスに関与しているのが、非修飾ｅＩＦ５Ａ１なのか、デオキシハイプシン修飾型ｅＩＦ５Ａ１なのか、あるいはハイプシン修飾型ｅＩＦ５Ａ１なのかを明確にするため、アポトーシス中に堆積するｅＩＦ５Ａ１の形態を２Ｄゲル電気泳動を用いて調査した。アクチノマイシンＤ（遺伝毒性ストレス）を用いた刺激によっても、Ｆａｓ（細胞死受容体経路）に対するアゴニスト抗体と一緒にインキューベーションすることによっても、ＨＴ−２９細胞においてアポトーシスの誘発が起こった。１〜２４時間までの異なる時点で細胞ライセートを収集し、２Ｄゲル電気泳動、およびｅＩＦ５Ａ抗体を用いたウエスタンブロットで分析した（図９）。文献に報告されるとおり、未処理の細胞においてｅＩＦ５Ａ１タンパク質は主にハイプシン化型で存在した。両方のアポトーシス誘発剤が、存在するデオキシハイプシン化型ｅＩＦ５Ａ１の増加を刺激した。処理から１時間後に増加し始めたが、処理から２４時間に停止した。非修飾ｅＩＦ５Ａ１の堆積も、処理から２時間後に観察された。これらの結果は、アポトーシスの制御に関与するデオキシハイプシン化および／または非修飾ｅＩＦ５Ａ１と一致していた。
【００２９】
ｅＩＦ５Ａ１、ｅＩＦ５Ａ１（Ｋ５０Ａ）（ｅＩＦ５Ａ１の突然変異体）、およびｅＩＦ５Ａ２が、アポトーシスを誘導する能力、および増殖を阻害する能力を、種々の癌細胞株において調査した。ｅＩＦ５Ａ１およびｅＩＦ５Ａ１（Ｋ５０Ａ）は両方とも、大腸癌細胞株ＨＴ−２９（図５、６および１０）と、膀胱癌細胞株ＨＴＢ−９（図１１）およびＨＴＢ−４（図１２）に、アポトーシスを誘導することができた。また、ｅＩＦ５Ａ２を発現するアデノウイルスによる感染は、膀胱癌細胞株ＨＴＢ−９（図１１）およびＨＴＢ−４（図１２）にアポトーシスを誘導することができた。Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１（Ｋ５０Ａ）、およびＡｄ−ｅＩＦ５Ａ２は、膀胱癌細胞株ＨＴＢ−４（図１３）、ＨＴＢ−９（図１４）、Ｊ８２ＨＴＢ−１（図１５）およびＵＭＵＣ−３（図１６）の成長を阻害することができた。これらウイルス性のコンストラクトは、ＨｅＬａ子宮頚部腺癌細胞（図１７）の成長を阻害することもできた。Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１（Ｋ５０Ａ）、およびＡｄ−ｅＩＦ５Ａ２の感染に反応したＰＡＲＰ切断により、ＨＴＢ−４細胞におけるアポトーシスも観察された（図１８）。ＰＡＲＰは、普通はＤＮＡの修復、ＤＮＡの安定化、およびその他の細胞事象に関与しているが、アポトーシス初期にカスパーゼファミリーのメンバーによって切断される。ＰＡＲＰのカスパーゼによる切断の検出は、アポトーシスを代表する特徴として示されてきた。Ｌａｚｅｂｎｉｋ Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３７１，３４６−３４７（１９９４）。これらの結果は、ｅＩＦ５Ａ１とｅＩＦ５Ａ２が、実際には重複する機能を有している可能性があることを示唆するものである。さらに、ｅＩＦ５Ａ１の突然変異型は、種々の細胞株において成長を停止し、アポトーシスを誘導することができた。野生型ｅＩＦ５Ａ１（およびｅＩＦ５Ａ２）のアポトーシス誘導能は、ＤＨＳおよびＤＨＨの制限的な活性のためにＡｄ−ｅＩＦ５Ａ１を細胞に導入した時に生じる（図５Ｂ）、デオキシハイプシン化および非修飾ｅＩＦ５Ａ１の堆積に関係している可能性がある。最近の報告は、外因性ｅＩＦ５Ａ１がハイプシン化型として細胞内で過剰発現するには、ＤＨＳおよびＤＨＨの両方が同一細胞内で過剰発現する必要があるとしている（Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．２００６，ＰＮＡＳ；１０３（１）：５１−５６）。これらの結果は、ＤＨＳおよびＤＨＨ阻害剤が細胞成長を阻害する能力は、細胞増殖に必要とされるハイプシン化ｅＩＦ５Ａ１の減少によるものではなく、細胞内で細胞周期停止および／またはアポトーシスをトリガーする、非修飾（ＤＨＳ阻害剤）あるいはデオキシハイプシン修飾型（ＤＨＨ阻害剤）ｅＩＦ５Ａ１の堆積によるものである可能性を示唆している。ＤＨＳは特定の細胞株において過剰発現されることが判明したこと（Ｃｌｅｍｅｎｔ ｅｔ ａｌ．２００６，ＦＥＢＳ Ｊ；２７３（６）：１１０２−１４）、およびＤＨＳは腫瘍転移における重要な増幅された遺伝子の組として認識されてきたこと（Ｒａｍａｓｗａｍｙ ｅｔ ａｌ．２００３，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ；３３，４９−５４．）は興味深い。この情報の解釈として、非修飾あるいはデオキシハイプシン修飾型ｅＩＦ５Ａ１の堆積（アポトーシスを起こすように細胞がトリガーされた時に堆積する。図９参照。）によってトリガーされるアポトーシスを避けるために、特定の癌細胞がＤＨＳを過剰発現するということが考えられる。ＤＨＳを過剰発現することにより、ｅＩＦ５Ａ１をハイプシン化した状態、つまり「安全な」形態を維持することによって、癌細胞は遺伝毒性ストレスやその他のストレスによるアポトーシスを減少できる可能性がある。
【００３０】
ｅＩＦ５Ａ１の過剰発現によって、どのシグナル経路が影響を受けているのかを解明するために、Ａ５４９肺癌細胞におけるＡｄ−ｅＩＦ５Ａ１またはＡｄ−ｅＩＦ５Ａ１（Ｋ５０Ａ）感染に反応した、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）／ストレス活性化タンパク質キナーゼ（ＳＡＰＫ）［ＭＡＰＫ／ＳＡＰＫ］経路の活性化を調査した。３つの主要なＭＡＰＫ経路は、ＥＲＫ ＭＡＰＫ経路、ｐ３８ ＭＡＰＫ経路、およびＪＮＫ ＳＡＰＫ経路である。ＥＲＫ ＭＡＰＫ経路は、主に上皮増殖因子（ＥＧＦ）などの成長ホルモンなどのマイトジェン刺激に反応してトリガーされ、種々の腫瘍の成長および生存を支持する。ｐ３８ ＭＡＰＫ経路は、細胞ストレス、ＵＶ光線、成長因子の使用中止、および炎症促進性サイトカインに反応して活性化される。リン酸化によりｐ３８を活性化することは、ｐ５３などの転写因子のリン酸化をもたらし、ひいてはｐ５３の活性または安定性を増加させる。ｐ３８の活性化は、アポトーシス促進性と抗アポトーシスの２つの経路、および炎症に関与している。ＪＮＫ／ＳＡＰＫ経路は、ＵＶ光線、ＤＮＡ損傷、炎症促進性サイトカインなどの細胞ストレスに対する反応を仲介し、ｃ−ｊｕｎのような転写因子のリン酸化および活性増加を引き起こす。ＪＮＫ経路の活性化は、成長、形質転換、アポトーシスなど、数多くの細胞応答をもたらすことができる。ＪＮＫ経路は、Ａ５４９細胞におけるＥＧＦ誘導性の成長の１次的なエフェクター経路であると思われる（Ｂｏｓｔ ｅｔ ａｌ．１９９７，ＪＢＣ；２７２：３３４２２−３３４２９）。Ａ５４９細胞をＡｄ−ｅＩＦ５Ａ１に感染させることは、これら３つの経路すべての活性化を誘発する。ＥＧＦを用いて３０分間刺激したＡ５４９細胞を、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１を増量しながら感染させることは、ＥＲＫおよびその下流標的であるｐ９０ＲＳＫのリン酸化／活性化の増加を引き起こしたが、非リン酸化ＥＲＫの量には変化は見られなかった（図２０）。Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１感染に反応して、リン酸化／活性化ｐ３８およびリン酸化／活性化ＪＮＫの、用量反応的な強い上方制御も観察された（図２０）。Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１感染の時間の経過とともに、ＥＲＫ、ｐ３８およびＪＮＫ経路の活性化が、感染後２４〜７２時間持続したことが明らかになった（図２１）。非ハイプシン化ｅＩＦ５Ａ１突然変異体であるＡｄ−ｅＩＦ５Ａ１（Ｋ５０Ａ）による感染に反応して、これらの経路の活性化において用量反応的な増加が見られた（図２２）。ＭＥＫ１阻害剤Ｕ１０２６を用いてＥＲＫの活性化を阻害することが、ＪＮＫの活性化をも阻害した（図２２）ということは興味深く、これは、ＥＲＫ活性化に反応してこれらの細胞内でＪＮＫが活性化されたことを裏付けるものである（Ｂｏｓｔ ｅｔ ａｌ．１９９７，ＪＢＣ；２７２：３３４２２−３３４２９）。反対に、ＭＥＫ１阻害剤は、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１またはＡｄ−ｅＩＦ５Ａ１（Ｋ５０Ａ）による感染に反応して一貫してｐ３８の活性化を増加し、ＥＲＫ経路の活性化がｅＩＦ５Ａ１に反応して、ｐ３８経路の活性化を負に制御することを示唆している（図２２）。
【００３１】
図３８は、ｅＩＦ−５Ａ１がＭＡＰＫ／ＳＡＰＫ経路およびＡ５４９肺癌細胞のアポトーシスに与える影響を示す仮説モデルを提供する。ｅＩＦ５Ａ１（野生型あるいはハイプシン化されることのできない突然変異体）（Ｋ５０Ａ）の過剰発現は、Ａ５４９細胞にアポトーシスを誘導する。ｅＩＦ５Ａ１の過剰発現は、ｐ３８、ＪＮＫ、およびＥＲＫなどのＭＡＰＫ／ＳＡＰＫ経路の増加も伴う。ｅＩＦ５Ａ１の過剰発現は、ｐ５３の安定性および活性の増加に関連するリン酸化型ｐ５３の増加など、ｐ５３タンパク質レベルの増加を誘発する。このｐ５３の増加は、ＭＥＫ／ＥＲＫ経路の活性およびｐ５３転写活性に依存する。しかし、ＭＥＫ／ＥＲＫ経路の阻害、そしてそれほど多くはないがＪＮＫ経路の阻害は、ｅＩＦ５Ａ１によって誘導されたアポトーシスを増強する。これらの結果は、癌細胞にアポトーシスを誘導するため、そして、抗癌剤のＭＥＫ阻害剤クラスの癌細胞死滅能を増加するために、ｅＩＦ５Ａ１を治療薬として使用できる可能性を示唆している。
【００３２】
Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１およびＡｄ−ｅＩＦ５Ａ１（Ｋ５０Ａ）が、ｐ５３の発現およびリン酸化に与える影響は、図２３で見ることができる。野生型および突然変異体ｅＩＦ５Ａ１の過剰発現は、用量反応的にｐ５３タンパク質の全体的な発現増加をもたらす（図２３）。セリン１５がリン酸化されたｐ５３の増加も、ｅＩＦ５Ａ１の両形態について観察された（図２３）。セリン４６がリン酸化されたｐ５３の増加はＡｄ−ｅＩＦ５Ａ１（Ｋ５０Ａ）について用量反応的に観察された。ｐ５３は、セリン１５においてＡＴＭ、ＡＴＲおよびｐ３８など幾つかのキナーゼによってリン酸化することが可能であり、この修飾は、ＭＤＭ２のｐ５３に対する結合能を減少してユビキネーションを標的とし、それによってｐ５３の堆積および機能活性を促進する。ｐ５３はセリン４６において、ＰＫＣｄｅｌｔａおよびｐ３８など種々のキナーゼによってリン酸化され、この修飾はｐ５３のアポトーシス促進プロモータに対する親和性を増加し、これはｐ５３誘導性アポトーシスにとって重要であると考えられる。
【００３３】
腫瘍の浸潤および転移は、複雑なプロセスである。そのためには腫瘍細胞が、付着する能力を備え、周辺の細胞外基質を分解し、２次的部位に移動して増殖し、そして最後には、成長の増加を維持するために血管新生を促進することが要求される。基底膜は、細胞外基質（ＥＣＭ）に近接するシートであり、すべての臓器を覆って、巨大分子および細胞に対するバリアの役目を果たしている。再構成ＥＣＭ（Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標））を含む８μｍ膜でトランスウェルを被膜し、走化性刺激に反応して、この膜を貫通して向こう側まで到達することのできる細胞を染色することにより、腫瘍細胞の侵襲性を測定できる。Ａ５４９肺癌細胞は侵襲性が高く、ＥＣＭの成分を消化することのできるゼラチナーゼであるマトリックスメタロプロテアーゼなどのタンパク質を分泌することができる。ｅＩＦ５Ａ１の過剰発現がＡ５４９細胞の侵襲性に与える影響を調査した。Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１またはＡｄ−ｅＩＦ５Ａ１（Ｋ５０Ａ）による感染が、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）で被膜したトランスウェルを通って浸潤した細胞数を有意に減少させた（図２４）。
【００３４】
こうして得られた結果は、腫瘍をｅＩＦ５Ａ１で処理することは治療効果がある可能性を示していた。そこで、マウスにおける実験的転移のモデルを使用した。実験ＩＩにおいて、侵襲性の高いマウスメラノーマ細胞株Ｂ１６Ｆ１０をマウスに注射することにより、実験的転移を開始した（第０日目）。ＬａｃＺ遺伝子（ＤＮＡ対照として）またはｅＩＦ５Ａ１をコード化するプラスミドＤＮＡを、２、４、７、１１、１６、２１、２６および３１日目に尾静脈に注射した。１×（３．３ｍｇ／ｋｇ）、０．１×（０．３ｍｇ／ｋｇ）、２×（６．６ｍｇ／ｋｇ）の、３つの異なるＤＮＡ濃度を使用した。マウスは瀕死状態となった時に屠殺し、肺を摘出して写真を撮影した（図２５）。ｅＩＦ５Ａ１をコード化するプラスミドＤＮＡでマウスを処理した時、腫瘍量における用量反応性の減少が観察された（図２５および２６）。１×の用量よりも２×の用量の方が効果が少ないように見えたが、０．１×用量と１×用量の間には、腫瘍量に有意な減少が観察された。腫瘍が巨視的に成長する能力は、新しい血管の形成（血管新生）に依存する。血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は、多くの腫瘍細胞によって分泌されるサイトカインであり、腫瘍の血管新生の促進における重要な因子である。実験ＩＩで単離された、Ｂ１６Ｆ１０を有する肺からの細胞ライセートを、ＶＥＧＦ発現について、ＥＬＩＳＡ法を用いて分析した（図２７）。ｅＩＦ５ＡプラスミドＤＮＡを与えたマウスのＶＥＧＦレベルにおいて、有意な用量反応性の減少が見られ、ｅＩＦ５Ａ１がＶＥＧＦを制御する可能性があることを示唆している。
【００３５】
実験ＩＩＩでは、尾静脈注射したＢ１６Ｆ１０細胞を用いた実験的転移のモデルを再び使用した。今回は、血清中ＤＮＡの半減期を延長し、プラスミドの肺腫瘍への取り込みを増加するために、プラスミドＤＮＡをＤＯＴＡＰと複合化した。７、１４および２１日目に、ＤＮＡ／ＤＯＴＡＰ複合体を注射した。マウスは瀕死状態となった時に屠殺し、肺を摘出して写真を撮影した（図２８）。ＬａｃＺプラスミドＤＮＡ／ＤＯＴＡＪＰ複合体を与えたマウスと比較すると、ｅＩＦ５Ａ１プラスミドＤＮＡ／ＤＯＴＡＰ複合体で処理したマウスの肺重量に、平均６０％の減少が見られた（図２９）。
【００３６】
ｅＩＦ５Ａ１処理がメラノーマ腫瘍にアポトーシスを誘導するかどうかを判定するために、Ｂ１６Ｆ０またはＢ１６Ｆ１０皮下腫瘍を有するマウスに、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１を腫瘍内注射した（実験ＩＶ）。４８時間後、腫瘍を切除し、パラフィンで包埋してから薄切した。薄切した組織をＴＵＮＥＬ染色することにより、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１が腫瘍細胞のアポトーシスを誘導したことが明らかになった（図３０）。実験Ｖは、アポトーシスを誘導するために腫瘍内に注射したＡｄ−ｅＩＦ５Ａ１の能力が、Ｂ１６Ｆ１０皮下腫瘍の成長を減少し、生存期間を延長するかどうかを判定するためにデザインされた。Ｂ１６Ｆ１０細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスの側腹部に皮下注射した。腫瘍が直径約８ｍｍに到達した時、Ａｄ−ＬａｃＺ、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１または緩衝液を腫瘍内に注射した。最初の３日間は毎日、それ以降は腫瘍の大きさが直径１５〜１６ｍｍを超えるまで１日置きにマウスに注射をし、その時点でマウスを屠殺した。キャリパーを用いて毎日腫瘍の大きさを計測し、腫瘍体積を推測するために使用した。マウスをＡｄ−ｅＩＦ５Ａ１で処理した時は、腫瘍成長の遅延が明らかに観察された（図３１）。緩衝液のみを注射したマウスは、治療開始から最長４〜６日間生存し、Ａｄ−ＬａｃＺのみを注射したマウスは、治療開始から４日間のみ生存した（図３２）。Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１を注射したマウスは、治療開始から少なくとも８日間、最長で２５日間生存し、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１を用いた治療が、腫瘍を有するマウスの生存期間を著しく改善することが可能であることを実証した。（図３２）。
【００３７】
従って、本発明は癌の成長を阻害する方法を提供する。また本発明は、癌細胞が転移する能力を阻害する、あるいは遅らせる方法も提供する。癌の成長を阻害することは、腫瘍の縮小、腫瘍成長の低下を含み、また、腫瘍の完全な寛解をも含む場合もある。癌の成長を阻害することは、癌細胞を死滅させることも含む。癌はいかなる癌または腫瘍でもあり得るとし、大腸癌、結腸直腸腺癌、膀胱癌、子宮頸部腺癌、および肺癌を含むが、これらに限定されない。
【００３８】
本発明の方法は、ｅＩＦ−５Ａをコード化するポリヌクレオチドの投与、好ましくはヒトｅＩＦ−５Ａ１の該癌を有する患者（哺乳類、好ましくはヒト）への投与、好ましくはｅＩＦ−５Ａ１受入番号ＮＭ００１９７０（図４４参照）の投与を含む。ｅＩＦ−５Ａ２アイソフォーム（受入番号ＮＭ０２０３９０。ただしｅＩＦ−５Ａ１が好ましい。）を使用してもよい。ｅＩＦ−５Ａは、当該技術分野で既知の任意の適切な方法で送達することができる。ｅＩＦ−５Ａは、生物学的に適切な媒体中のＤＮＡのような裸のＤＮＡとして、ＩＶや皮下注射を介して、あるいはその他の任意の生物学的に適切な送達機構を介して送達され得る。あるいは、ｅＩＦ−５Ａは、プラスミド、アデノウイルスベクターのようなベクター、または任意の適切な発現ベクターの中で送達され得る。
【００３９】
あるいは、上記ＤＮＡは、標的とする腫瘍または癌細胞へＤＮＡ（またはプラスミドまたは発現ベクター）の送達を提供する、リポソームやその他任意の適切な「担体」又は「ビヒクル」中で送達され得る。例えば合成ＤＮＡ送達システムの考察について、Ｌｕｏ，Ｄａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８，Ｊａｎｕａｒｙ ２０００，ｐｐ．３３−３７を参照のこと。本発明の発明者は、ｅＩＦ−５Ａ１は正常組織にとって有毒ではないと以前にも述べているが（参照することにより、そのすべてを本明細書に援用した、２００５年１１月２８日出願の、係属出願第１１／２９３，３９１号を参照のこと）、（ｅＩＦ５Ａポリヌクレオチド／プラスミド／発現ベクターの直接投与と比較して）送達システムが好ましい。好ましい送達システムは、有効量のｅＩＦ−５Ａを腫瘍または一群の癌細胞に提供し、また好ましくは標的送達を腫瘍または一群の癌細胞に提供する。よって、ｅＩＦ−５Ａヌクレオチド／プラスミド／発現ベクターを、リポソーム、デンドリマー、類似する無毒性のナノ粒子のような、ナノメートルサイズのビヒクルを介して送達することが好ましい。さらに、該ビヒクルは、有効量のｅＩＦ−５Ａヌクレオチド／プラスミド／発現ベクターを腫瘍または一群の癌細胞に送達する間に、好ましくはｅＩＦ−５Ａヌクレオチド／プラスミド／発現ベクターを、早急過ぎるクリアランスや免疫応答を引き起こすことから保護する。例示的なビヒクルは、ｅＩＦ−５Ａヌクレオチド／プラスミド／発現ベクターと会合した単純なナノ粒子から、特異的細胞受容体を標的とするために表面にリガンドを結合させたペグ化リポソームのような、より複雑なペグ化ビヒクルまで様々であってもよい。
【００４０】
リポソームおよびペグ化リポソームは当該技術分野において既知である。従来のリポソームにおいて、送達される分子（すなわち低分子量の薬剤、タンパク質、ヌクレオチドまたはプラスミド）は、リポソームの中心腔内に含まれる。当業者は、分子送達に有用な「ステルス」、標的化、および陽イオン性リポソームもあることを理解するであろう。例えば、Ｈｏｒｔｏｂａｇｙｉ，Ｇａｂｒｉｅｌ Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１９，Ｉｓｓｕｅ １４（Ｊｕｌｙ）２００１：３４２２−３４３３、およびＹｕ，Ｗｅｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２００４，３２（５）；ｅ４８を参照のこと。リポソームは、静脈内注射することができ、また、血流における循環時間が長くなるように、その表面をより親水性にするため（２重層にポリエチレングリコールを付加（「ペグ化」）することにより）に修飾することができる。これらは「ステルス」リポソームとして知られており、ドキソルビシンやミトキサントロンなど親水性（水溶性）の抗癌剤の担体として特に有用である。薬剤運搬リポソームの特異的結合特性を腫瘍細胞のような標的細胞にまで広げるために、抗体、タンパク質、ペプチド等の特異的分子がリポソームの表面に結合していてもよい。例えば、癌細胞に存在する受容体に対する抗体は、リポソームに癌細胞を標的とさせるために使用され得る。多発性骨髄腫を標的とする場合には、例えば葉酸、ＩＬ−６、またはトランスフェリンを、リポソームに多発性骨髄腫細胞を標的とさせるために使用してもよい。
【００４１】
デンドリマーもまた、当該技術分野において既知であり、好ましい送達ビヒクルを提供する。デンドリマーの考察について、例えば、Ｍａｒｊｏｒｏｓ，Ｉｓｔｖａｎ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ，「ＰＡＭＡＭ Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ−Ｂａｓｅｄ Ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ，」Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，Ｖｏｌ．７，Ｎｏ．２，２００６；５７２−５７９、およびＭａｊｏｒｏｓ，ＩｓｔｖａｎＪ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ，２００５．４８，５８９２−５８９９を参照のこと。
【００４２】
またｅＩＦ−５Ａは、腫瘍の部位に直接送達されてもよい。当業者は、ｅＩＦ−５Ａの送達に関して、用量および治療投与計画の期間を決定することが可能であろう。
【００４３】
本発明の別の実施態様は、多発性骨髄腫細胞において細胞死を誘導する方法を提供する。多発性骨髄腫は、骨病変および腫瘍の悪化を引き起こす、高レベルの炎症性サイトカインを産生する骨髄癌の一種である。サイトカインＩＬ−１ＢおよびＩＬ−６は骨髄腫細胞の成長因子の役割を果たす。
【００４４】
ｅＩＦ−５Ａ１をコード化するポリヌクレオチド（完全長コード領域）を含むアデノウイルスベクターコンストラクトを、多発性骨髄腫細胞株ＫＡＳ６／１細胞に投与した。ＫＡＳ６／１細胞株は、Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃで作成され、Ｗｅｓｔｅｎｄｏｒｆ，ＪＪ．，ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ（１９９６）１０，８６６−８７６において報告されている。細胞株は、侵襲性多発性骨髄腫を罹患する患者からの分離株から直接作製した。本発明の発明者は、ｅＩＦ−５Ａを含むアデノウイルスコンストラクトをＫＡＳ６／１細胞に投与すると、対照ベクターのみを用いて処理された細胞と比較して（図１で「ＣＴＬ」と表示）、死滅したあるいは死滅する細胞数が増加すること（より少ない生きた癌細胞を残す）（図４１で「ＷＴ」と表示）を示した。図４１参照。未処理の細胞の約２５％に比べて、Ｆａｃｔｏｒ５Ａ１で処理した癌細胞は約９０％が死滅した。従って、本発明の一実施形態は、ｅＩＦ−５Ａ１の発現を上方制御し、多発性骨髄腫細胞を死滅させるために、ｅＩＦ−５Ａ１をコード化するポリヌクレオチドを提供することにより骨髄腫細胞を死滅させる方法を提供する。
【００４５】
また、対照（「ＣＴＬ＋ＩＬ−６」と表示）およびｅＩＦ−５Ａコンストラクト（図４１において「ＷＴ＋ＩＬ−６」と表示）とともに、ＩＬ−６も投与した。ＩＬ−６は、骨髄腫細胞の成長因子の役割を果たすサイトカインである。結果は、たとえＩＬ−６をｅＩＦ−５Ａコンストラクトと同時投与しても、アポトーシスの増加を達成することができたことを示している。図４１参照。これは、Ｆａｃｔｏｒ５Ａ１が骨髄腫細胞を死滅させるだけでなく、ＩＬ−６の存在下において骨髄腫細胞を除去することも可能であることを示している。ＩＬ−６の存在下で、デキサメタゾンのような標準的治療薬を用いて骨髄腫細胞にアポトーシスを誘導することは、非常に難しいことが証明されているため、この発見は興味深い。
【００４６】
さらに、突然変異体ｅＩＦ−５Ａ（Ｋ５０Ａ）（５０位の保存リジンを別のアミノ酸に変更するため、ハイプシン化されることができない）を含むアデノウイルスコンストラクトも、単独投与（「ＭＵＴ」）またはＩＬ−６と併用投与した（「ＭＵＴ＋ＩＬ−６」）。結果は、ＩＬ−６の存在下においても、対照細胞と比較して、ｅＩＦ−５Ａ１の突然変異体もアポトーシスを増加させることができたことを示す。図４１を参照。従って、本発明の一実施形態は、ｅＩＦ−５Ａ１の突然変異体を投与することにより骨髄腫細胞を死滅させる方法を提供し、該突然変異体はハイプシン化されることができない。ｅＩＦ−５Ａ１の突然変異体は、骨髄腫細胞における細胞死を増加させる非ハイプシン化ｅＩＦ−５Ａ１の発現増加を引き起こす。
【００４７】
ＩＬ−６は骨髄腫細胞の成長因子としての役割を果たすため、ＩＬ−６の発現を下方制御することも、骨髄腫細胞を死滅させる方法を提供する。本発明の発明者は、ｅＩＦ−５Ａ１に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡコンストラクトについては図４３、４６Ａおよび４６Ｂ参照）が、内因性ｅＩＦ−５Ａ１の発現を下方制御するだけでなく、種々の炎症促進性サイトカインの発現も下方制御すると示した。よって、本発明の一実施形態は、ＩＬ−１Ｂの内因性発現を下方制御するためにアポトーシス特異的ｅＩＦ−５Ａに対するｓｉＲＮＡを投与することにより、骨髄腫細胞を死滅させる方法を提供し、それによってＩＬ−６の発現を下方制御し、ひいては骨髄腫細胞の成長因子としての役割を果たすＩＬ−６を減少させる。ＩＬ−６の発現を下方制御することにより、骨髄腫細胞の成長および生存を存続するために必要な、利用可能なＩＬ−６はより少なくなる。
【００４８】
別の実施形態において、ｅＩＦ−５Ａをコード化するポリヌクレオチドを、骨髄腫細胞のアポトーシス増加を提供するために、ｅＩＦ−５Ａに対するｓｉＲＮＡと併せて投与する。ｅＩＦ−５Ａ１をコード化するポリヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡが外因性ｅＩＦ−５Ａ１の発現を阻害しないように、好ましくはアデノウイルスベクターなどのベクター中で投与する。例えば、ｓｉＲＮＡは３’ＵＴＲを標的にするが、外因性ｅＩＦ５Ａ１をコード化するポリヌクレオチドは、好ましくは読み取り枠（ＯＲＦ）全体を含み、したがってｓｉＲＮＡによって標的とされる３’ＵＴＲを有しない。適切なｓｉＲＮＡコンストラクトは、１１／２８７，４６０；１１／１３４，４４５；１１／１８４，９８２；および１１／２９３，３９１などの同時係属出願において先に説明されており、参照することにより、そのすべてを本明細書に援用する。図４３、４６Ａおよび４６Ｂも参照のこと。ｅＩＦ−５Ａ１は骨髄腫細胞において発現し、細胞死を引き起こす。さらに、ｅＩＦ−５Ａ１ ｓｉＲＮＡは、ｅＩＦ−５Ａの内因性発現を減少させ、それによってＩＬ−６の発現を減少させ、ひいては骨髄腫細胞における細胞死を増加させる。本方法において、上述したｅＩＦ−５Ａの突然変異体もまたベクターコンストラクトに用いてもよい。
【００４９】
また、本発明は、多発性骨髄腫細胞を死滅させる併用療法をも提供する。ｅＩＦ５Ａ、好ましくはｅＩＦ５Ａ１をコード化するポリヌクレオチドを含む組成物は、標準的治療法と併せて投与されてもよい。ｅＩＦ５Ａ組成物は、標準的療法の前、途中、後に投与してもよい。ｅＩＦ５Ａは、医薬組成物として投与しても、または上述したように、送達ビヒクル内で投与してもよい。
【実施例】
【００５０】
実施例１：Ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験
薬品
ＤＨＳの阻害剤であるＮ１−グアニル−１，７−ジアミノヘプタン（ＧＣ７、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を濃度５０μＭで使用した。アクチノマイシンＤ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を０．５または１．０μｇ／ｍｌで使用した。ニトロプルシドナトリウムおよびデスフェリオキサミンをＳｉｇｍａ社より購入し、それぞれ濃度３ｍＭおよび５００μＭで使用した。ブレフェルジンＡもＳｉｇｍａ社から調達し、濃度４ｎＭで使用した。
【００５１】
細胞培養および処理
Ａｎｉｔａ Ａｎｔｅｓ氏（ニュージャージー医科歯科大学）のご好意により頂いたヒト大腸腺癌細胞株ＨＴ−２９を、細胞増殖およびｅＩＦ５Ａ局在化研究に使用した。ＨＴ‐２９細胞は、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、および１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を添加したＲＰＭＩ１６４０に維持した。その他の細胞株はすべてＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより入手した。ＣＣＤ１１２Ｃｏは、正常な大腸の繊維芽細胞株である。ＲＫＯは、野生型ｐ５３を含むヒト結腸直腸癌細胞株（ＣＲＬ−２５７７）である。ＲＫＯ−Ｅ６細胞株（ＣＲＬ−２５７８）はＲＫＯ細胞株に由来する。安定的に組み込まれたヒトパピローマウイルスＥ６癌遺伝子を含み、従ってかなりの機能性ｐ５３腫瘍抑制タンパク質が欠損している。ＲＫＯ、ＲＫＯ−Ｅ６、Ａ５４９および細胞株ＣＣＤ１１２Ｃｏは、２ｍＭのＬ−グルタミンと、１．５ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウム、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、および１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを含むように調製したＥａｒｌｅ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを含み、１０％のＦＢＳを添加したＭｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍで成長させた。細胞はＣＯ2を５％含む加湿環境において３７℃に維持した。
【００５２】
プラスミドのクローニングおよび構築
ＲＫＯ細胞から単離した総ＲＮＡから、製造者の付着細胞向けプロトコルに従ってＧｅｎＥｌｕｔｅ Ｍａｍｍａｌｉａｎ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ−Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ）を用いて、ヒトｅＩＦ５ＡをＲＴ−ＰＣＲ法によりクローン化した。使用したプライマーは、フォワードプライマー５’−ＣＧＡＧＴＴＧＧＡＡＴＣＧＡＡＧＣＣＴＣ−３’、リバースプライマー５’−ＧＧＴＴＣＡＧＡＧＧＡＴＣＡＣＴＧＣＴＧ−３’であった。得られた５３２塩基対の生成物を、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ （Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブクローニングして、配列決定した。得られたプラスミドを、フォワードプライマー５’−ＧＣＣＡＡＧＣＴＴＡＡＴＧＧＣＡＧＡＴＧＡＴＴＴＧＧ−３’、リバースプライマー５’−ＣＣＴＧＡＡＴＴＣＣＡＧＴＴＡＴＴＴＴＧＣＣＡＴＧＧ−３’を用いてＰＣＲのテンプレートとして使用し、ＰＣＲ生成物をｐＨＭ６（赤血球凝集素［ＨＡ］タグ付き、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）のＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩ部位にサブクローンし、ｐＨＭ６−ｅＩＦ５Ａベクターを生成した。ｅＩＦ５ＡのＣ末端切断コンストラクト（ｐＨＭ６−ｅＩＦ５ＡＡ３７）をＰＣＲ法により以下のプライマーを用いて生成した。フォワードプライマー：５’−ＧＣＣＡＡＧＣＴＴＡＡＴＧＧＣＡＧＡＴＧＡＴＴＴＧＧ−３’、リバースプライマー：５’−ＧＣＣＧＡＡＴＴＣＴＣＣＣＴＣＡＧＧＣＡＧＡＧＡＡＧ−３’。得られたＰＣＲ生成物をｐＨＭ６ベクターにサブクローンした。トランスフェクションを最適化するため、およびトランスフェクションがアポトーシスに与える影響を知るための対照として、ｐＨＭ６−ＬａｃＺベクター（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を使用した。
【００５３】
ノーザンブロット
ＲＫＯ細胞を６ウェルプレート上にコンフルエントになるよう成長させ、アクチノマイシンＤ１．０μｇ／ｍｌを用いて０、１、４、または８時間処理した。ＧｅｎＥｌｕｔｅ Ｍａｍｍａｌｉａｎ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ−Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ）を用いて総ＲＮＡを細胞から単離し、５μｇのＲＮＡを１．２％のアガロース／ホルムアルデヒドゲル上で分画した。確立された方法に従い、ｅＩＦ５Ａの３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）と相同である32Ｐ標識ｃＤＮＡで膜をプローブした。ノーザンブロットに用いたｅＩＦ５Ａの３’−ＵＴＲ ｃＤＮＡは、次のプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ法によりＲＫＯ細胞からクローン化した。フォワードプライマー：５’−ＧＡＧＧＡＡＴＴＣＧＣＴＧＴＴＧＣＡＡＴＣＡＡＧＧＣ−３’、リバースプライマー：５’−ＴＴＴＡＡＧＣＴＴＴＧＴＧＴＣＧＧＧＧＡＧＡＧＡＧＣ−３’。ノーザンブロットの負荷対照として使用したβ−アクチンｃＤＮＡを、次のプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ法によりクローン化した。フォワードプライマー：５’−ＧＡＴＧＡＴＡＴＣＧＣＣＧＣＧＣＴＣＧＴ−３’、リバースプライマー：５’−ＧＴＡＧＡＴＧＧＧＣＡＣＡＧＴＧＴＧＧＧＴＧ−３’。
【００５４】
プラスミドのトランスフェクションおよびアポトーシスの検出
製造者の推奨プロトコルに従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＲＫＯおよびＲＫＯ−Ｅ６細胞をプラスミドＤＮＡで一時的にトランスフェクトした。トランスフェクションから４８時間後、製造者のプロトコルに従ってＤＮＡ Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いて、末端デオキシリボヌクレオチジルトランスフェラーゼ仲介ｄＵＴＰ−ジゴキシゲニンニック末端標識法（ＴＵＮＥＬ）により、断片化ＤＮＡを含むアポトーシス細胞を検出した。蛍光顕微鏡による分析のため、細胞を８ウェルのカルチャースライドグラス上でトランスフェクトし、４％のホルムアルデヒドで固定した後に、ＴＵＮＥＬ法を用いて標識化し、Ｔａｙｌｏｒら（２００４）によって記述された方法に従って、Ｈｏｅｓｃｈｔ３３２５８で染色した。
【００５５】
ｓｉＲＮＡのトランスフェクション
ｓｉＲＮＡはすべてＤｈａｒｍａｃｏｎ社より入手した。ｅＩＦ５Ａ ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ（受入番号ＢＣ０８５０１５）を標的にするｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡは次の配列を有していた。センス鎖：５’−ＧＣＵＧＧＡＣＵＣＣＵＣＣＵＡＣＡＣＡｄＴｄＴ−３’、アンチセンス鎖：３’−ｄＴｄＴＣＧＡＣＣＵＧＡＧＧＡＧＧＡＵＧＵＧＵ−５’。ｅＩＦ５Ａに対する第２のｓｉＲＮＡ（５Ａ−２）は次の配列を有していた。センス鎖：５’−ＡＧＧＡＡＵＧＡＣＵＵＣＣＡＧＣＵＧＡｄＴｄＴ−３’、アンチセンス鎖：３’−ｄＴｄＴＵＣＣＵＵＡＣＵＧＡＡＧＧＵＣＧＡＣＵ−５’。使用した対照ｓｉＲＮＡは、ｅＩＦ５Ａ特異的ｓｉＲＮＡの逆の配列を有しており、いかなる既知であるヒト遺伝子生成物に対する同一性も示さなかった。対照ｓｉＲＮＡは次の配列を有していた。センス鎖：５’−ＡＣＡＣＡＵＣＣＵＣＣＵＣＡＧＧＵＣＧｄＴｄＴ−３’、アンチセンス鎖：３’−ｄＴｄＴＵＧＵＧＵＡＧＧＡＧＧＡＧＵＣＣＡＧＣ−５’。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を用いて細胞をｓｉＲＮＡ12でトランスフェクトし、増殖研究またはウエスタンブロットに使用した。
【００５６】
ウエスタンブロット
ウエスタンブロット用のタンパク質は、沸騰している溶解緩衝液［ＳＤＳ２％、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）］を用いて単離した。Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ Ａｃｉｄ Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ）を用いてタンパク質濃度を判定した。ウエスタンブロットするために、５μｇの総タンパク質を１２％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分画し、二フッ化ポリビニリデン膜に移した。使用した１次抗体は、抗ｅＩＦ５Ａ（ＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、マウスＩｇＧ）および、抗β−アクチン（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、マウスＩｇＭ）で、両方とも５％乳汁中１：２０，０００の希釈度であった。２次抗体は、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ、Ｓｉｇｍａ）に結合した抗マウスＩｇＧおよび抗マウスＩｇＭ−ＨＲＰ（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）であった。抗体‐タンパク質複合体は、増感化学発光法（ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて可視化した。ｅＩＦ５Ａ検出後、ＥＣＬ Ｐｌｕｓ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ検出システムの提供するプロトコルに従ってブロットをストリップに切断し、同等負荷を確認するために、抗β−アクチン抗体でプローブした。
【００５７】
ＭＡＰＫ／ＳＡＰＫ経路分析に使用したＡ５４９細胞のライセートのウエスタンブロットは、ＭＡＰＫ溶解緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ｐＨ７．４、２％ ＳＤＳ、１０％グリセロール）中で収集したライセートを用いて行った。ライセート１０μｇを１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、ＰＶＤＦ膜に移した。ＰＢＳ中の無脂肪５％脱脂乳により膜をブロックし、ＰＢＳで洗浄し、１：１０００の１次抗体を用いて、５％ＢＳＡ／ＰＢＳ−Ｔ中で振動を与えながら４℃で一晩インキュベートした。ＭＡＰＫ／ＳＡＰＫ抗体（Ｐ−ｐ３８、ｐ３８、Ｐ−ＪＮＫ、ＪＮＫ、Ｐ−ＥＲＫ、ＥＲＫ、ｐ９０ＲＳＫ）は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇより購入した。Ａ５４９の研究に使用したｐ５３抗体もＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇより入手し、同様の方法で用いた。
【００５８】
２Ｄゲル電気泳動
２Ｄゲル電気泳動のために、低温の溶解緩衝液（７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、３０ｍＭトリス、４％ＣＨＡＰＳ、プロテアーゼ阻害剤カクテル）中でＨＴ−２９細胞ライセートを採取して、超音波処理し、遠心分離によりデブリを除去した。Ｂｒａｄｆｏｒｄ法を用いてタンパク質濃度を判定した。製造者の指示に従ってＥｔｔａｎ ＩＰＧｐｈｏｒ Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｆｏｃｕｓｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、１次元等電点電気泳動を行った。再水和緩衝液（８Ｍの尿素、２％のＣＨＡＰＳ、０．２％のＤＴＴ，０．５％のｐＨ４〜７のＩＰＧ緩衝液、０．００２％のブロモフェノールブルー）の中で、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ ＤｒｙＳｔｒｉｐｓ（７ｃｍ ｐＨ ４〜７、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を細胞ライセートとともに室温で１２時間再水和した。５００Ｖで３０分、１０００Ｖで３０分、および５０００Ｖで１時間４０分、等電点電気泳動を行った。ＩＰＧストリップゲル上のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に移した。ｅＩＦ５Ａ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてウエスタンブロットを行った。
【００５９】
アデノウイルスの生成
ヒトｅＩＦ５Ａ、または、ハイプシン化を防ぐ単一の点突然変異（Ｋ５０→Ａ５０）を含むｅＩＦ５Ａ［ｅＩＦ５Ａ（Ｋ５０Ａ）］を発現するアデノウイルス（アデノウイルス５血清型、Ｅ１、Ｅ３−欠失）を、ＡｄＭａｘ（商標） Ｈｉ−ＩＱシステム（カナダ、トロントのＭｉｃｒｏｂｉｘ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ）を用いて構築した。ｅＩＦ５Ａ ｃＤＮＡ内に、ＰＣＲ法を用いて部位特異的突然変異を作製した。プラスミドＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＰＣＲ法でｅＩＦ５Ａ ｃＤＮＡを増幅し、アデノウイルスシャトルベクターｐＤＣ５１６（ｉｏ）のＳｍａＩ部位に連結した。ＰＣＲプライマーの配列は、フォワードプライマー５’−ＧＣＣＡＡＧＣＴＴＡＡＴＧＧＣＡＧＡＴＧＡＴＴＴＧＧ−３’、リバースプライマー５’−ＣＣＴＧＡＡＴＴＣＣＡＧＴＴＡＴＴＴＴＧＣＣＡＴＧＧ−３’であった。アデノウイルスゲノムのプラスミドベクターｐＢＨＧｆｒｔ（ｄｅｌ）Ｅ１，３ＦＬＰおよびシャトルベクターをＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａ中で増殖させ、Ｑｉａｇｅｎ ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｅｇａ Ｋｉｔを用いて精製した。それぞれ５μｇのアデノウイルスゲノムプラスミド ｐＢＨＧｆｒｔ（ｄｅｌ）Ｅ１、３ＦＬＰ、シャトルベクターｐＤＣ５１６（ｉｏ）−ｅＩＦ５Ａ、またはｐＤＣ５１６（ｉｏ）−ｅＩＦ５Ａ（Ｋ５０Ａ）を、Ｍｉｃｒｏｂｉｘ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．推奨のＣａＣｌ2法を用いて、６０ｍｍ培養皿内の６０〜８０％コンフルエントな２９３−ＩＱ細胞（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にトランスフェクトした。３７°Ｃで７〜１０日間培養した後プラークが現れ、得られたアデノウイルス粒子［Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ、およびＡｄ−ｅＩＦ５Ａ（Ｋ５０Ａ）］を２９３−ＩＱ細胞内で増殖した。純粋な、力値の高いアデノウイルス株を、Ｍｉｃｒｏｂｉｘ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．提供の製造者プロトコルに従って、ＣｓＣｌ勾配超遠心法を用いて調製した。ＬａｃＺを発現するアデノウイルスベクター（Ａｄ−ＬａｃＺ；血清型５、Ｅ１，Ｅ３−欠失）を、Ｑｂｉｏｇｅｎｅ（米国カリフォルニア州）より購入し、これらの実験における対照およびレポーターとして使用した。Ａｄ−ＬａｃＺアデノウイルスをＡｄ−ｅＩＦ５ＡおよびＡｄ−ｅＩＦ５Ａ（Ｋ５０Ａ）ウイルスと同様の方法で増幅および精製した。
【００６０】
アデノウイルス感染およびアネキシンＶ標識
１００ｍｍ組織培養プレート内に、ＨＴ−２９、ＨＴＢ−９、またはＨＴＢ−４細胞を、プレートあたり１×１０6細胞で播種し、翌日、５ｍｌのＲＰＭＩ１６４０＋２％ＦＢＳ中において、細胞あたり３０００感染単位でアデノウイルスに感染させた。４時間後、細胞にさらなる培地を追加し、ＦＢＳ濃度を１０％になるよう調製した。感染から２４、４８、または７２時間後、細胞をトリプシン処理により剥離し、洗浄してから製造者のプロトコル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に従ってＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣで染色した。フルオレセイン検出のための４８８ｎｍアルゴンレーザー光源及びフィルターを用いたフローサイメトリー（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｐｉｃｓ ＸＬ−ＭＣＬ）により細胞をソートし、ＷｉｎＭＤＩ２．８でデータを分析した。
【００６１】
ＨＴ‐２９細胞を、細胞あたり３０００感染単位を用いて感染させ、細胞あたり１５００感染単位でＡ５４９細胞を用いた実験を行った。
【００６２】
増殖アッセイ
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ｓｉＲＮＡでＨＴ‐２９細胞を９６ウェルプレート上でトランスフェクトした。ＸＴＴ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、増殖する細胞の代謝活性を測定した。ＤＮＡ合成を測定するためには、製造者のプロトコルに従ってＢｒｄＵ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いた。アデノウイルス感染後に実行したＸＴＴアッセイのために、９６ウェルプレート内に、ウェルあたり５０００個の細胞を播種した。翌日、Ａｄ−ｌａｃＺ、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１、およびＡｄ−ｅＩＦ５Ａ１（Ｋ５０Ａ）（Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１Ｍ）をそれぞれ用いて細胞を感染させ、未処理の細胞を負の対照とし、アクチノマイシンＤで処理した細胞を正の対照とした。ＸＴＴ基質を追加し、Ａ６９０ｎｍを基準としてＡ４７５ｎｍを測定した。
【００６３】
間接免疫蛍光法
ポリ−Ｌ−リジンを被膜したカバーガラス上でＨＴ‐２９細胞を培養した。サブコンフルエントな状態の細胞を、２００ 単位のインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて１６時間インキュベートした後、ＴＮＦ−α（１００ｎｇ／ｍｌ、Ｌｅｉｎｃｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で１０分〜８時間の異なる時間インキュベートした。あるいは、３０分から１６時間まで時間を増加させながら、１．０μｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤを用いて細胞を処理した。処理済の細胞を３％のホルムアルデヒド（メタノールを含まない；Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．）で２０分間固定し、ＰＢＳで５分間、２回洗浄し、１００ｍＭのグリシンを含むＰＢＳで５分間１回洗浄し、ＰＢＳ中の０．２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で４分間透過処理した。その後、標準プロトコルを用いて免疫蛍光検査のために細胞を標識化した。１次抗体は、抗−ｅＩＦ５Ａ（ＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、マウスＩｇＧ）を用いて、１：２５０の希釈度で１時間インキュベートした。２次抗体は、抗マウスＩｇＧ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で、希釈度１：２００で１時間使用した。抗体標識に続いて、Ｈｏｅｓｃｈｔ３３２５８で核を染色し、標識化した細胞を蛍光顕微鏡で観察した。
【００６４】
Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）細胞浸潤アッセイ
Ａ５４９細胞を、アデノウイルスを用いて細胞あたり１５００感染単位で感染させ、２４時間インキュベートした。トリプシンで細胞を剥離して、無血清培地で洗浄し、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標） Ｂａｓｅｍｅｎｔ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｍａｔｒｉｘ （ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で事前に被膜しておいたトランスウェル（Ｆａｌｃｏｎ ８．０μｍ セルカルチャーインサート）上に、ウェルあたり３０，０００個の細胞を無血清培地中に播種した。１０％のＦＢＳを含む培地を下のウェル（トランスウェルが乗っている２４ウェルプレートのウェル）に播種し、さらに細胞を２４時間インキュベートした。インキュベーション後、トランスウェルの上部チャンバから培地を除去し、トランスウェルを外して５００マイクロリットルのクリスタルバイオレットを含む２４ウェルプレートのウェル内に置いた。トランスウェルを色素の中で２０分間インキュベートしてから、ビーカーに入れた水にトランスウェルを何回も浸漬することにより洗浄した。あらかじめ濡らしておいた綿棒を用いてトランスウェルの上面から細胞をこすり取った。トランスウェルの底面まで移動した細胞を、光学顕微鏡を用いて観察し、写真を撮影し、領域ごとに移動した細胞数を数えた。図２４参照。
【００６５】
統計
統計分析にはスチューデントのｔ‐検定を用いた。信頼度９５％超（Ｐ＜０．０５）で有意性を判定した。
【００６６】
実施例２：Ｉｎ ｖｉｖｏ実験
マウスおよび腫瘍の確立
カナダのケベック州にあるＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒより、５〜７週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを購入した。実験開始前の１週間、マウスを馴化させた。Ｂ１６Ｆ１０マウスメラノーマ細胞をＡＴＣＣより購入し、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ内で培養した。細胞の単層をトリプシン処理し、１０％ＦＢＳ含有ＭＥＭで中性化した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、細胞の生存率をトリパンブルー染色によって判定した。実験的転移の実験（実験ＩＩおよびＩＩＩ）のため、Ｂ１６Ｆ１０細胞を６週齢マウスに尾静脈注射することにより、メラノーマ腫瘍を肺の中に確立した。ＰＢＳ中で、Ｂ１６Ｆ１０細胞を１×１０6生細胞／ｍｌまで希釈した。２００ｕｌの細胞を各マウスの尾静脈から注射した。皮下腫瘍実験（実験ＩＶおよびＶ）のために、５００，０００個のＢ１６Ｆ１０細胞を１０〜１４週齢のマウスの右側腹部に皮下注射してメラノーマ腫瘍を確立した。実験がすべて終了した時（マウスが瀕死状態となった時、または腫瘍が所定の大きさを超えた時）に、ＣＯ2吸入によりマウスを安楽死させた。
【００６７】
実施例３：実験ＩＩ
プラスミドＤＮＡの構築および精製
ＣｐＧジヌクレオチドを欠損するｐＣｐＧ−ｌａｃＺ発現ベクターを米国サンディエゴのＩｎｖｉｖｏＧｅｎより購入した。まずＮｃｏＩおよびＮｈｅＩでプラスミドを消化させ、３．１ｋｂのｐＣｐＧベクターバックボーンを単離し（ＬａｃＺコード化配列を除去）、ＨＡタグを含むｅＩＦ５Ａ１のＰＣＲで増幅したcＤＮＡと結合させて（ｐＣｐＧ−ＨＡ５Ａ１）、ＨＡタグ付きｅＩＦ５Ａ１ ｃＤＮＡを、ｐＣｐＧ−ｌａｃＺベクターにサブクローンした。ＰＣＲプライマーは次の通りであった。ｅＩＦ５Ａ１フォワード：ＨＡ−５Ａ１フォワード：５’−ＧＣＴＣＣＡＴＧＧＡＴＧＴＡＣＣＣＡＴＡＣＧＡＣＧＴＣＣＣ−３’、ｅＩＦ５Ａ１リバース：５’−ＣＧＣＧＣＴＡＧＣＣＡＧＴＴＡＴＴＴＴＧＣＣＡＴＣＧＣＣ−３’。２５μｇ／ｍｌのゼオシンを含むＬＢ培地または２ＸＹＴ培地で培養したＥ．ｃｏｌｉ ＧＴ１１５中で、ｐＣｐＧ−ｌａｃＺおよびｐＣｐＧ−ＨＡ５Ａ１を増幅した。プラスミドを抽出し、ＱＩＡＧＥＮ Ｅｎｄｏｆｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｇｉｇａ ｋｉｔを用いて精製した。波長２６０ｎｍのＵＶ吸収法およびアガロースゲル電気泳動法を用いてＤＮＡ濃度を測定した。
【００６８】
プラスミドＤＮＡの尾静脈注射（実験ＩＩ）
１×ＰＢＳ（体重に基づいて約２００μｌ）に溶解したプラスミドＤＮＡを、２、４、７、１１、１６、２１、２６、３１日目に、マウスの尾静脈に注射した。プラスミドＤＮＡの濃度は、２×（６．６ｍｇ／ｋｇ）に対して６６０ｎｇ／μｌ、１×（３．３ｍｇ／ｋｇ）に対して３３０ｎｇ／μｌ、０．１×（０．３３ｍｇ／ｋｇ）に対して３３ｎｇ／μｌであった。
【００６９】
体重および肺重量
尾静脈注射の前、または毎週月曜および金曜日に体重を測定した。マウスが瀕死状態（嗜眠性、呼吸困難）になった時にＣＯ2を用いて安楽死させ、肺を摘出して重量を測り、写真を撮ってから冷凍して−７０℃で保管した。図２５〜２７参照。
【００７０】
ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡ
採取した肺組織をＰＢＳで洗浄し、ドライアイスの中で冷凍し、−７０℃で保管した。粉砕した肺組織からタンパク質ライセートを単離した。５０μｇの肺組織タンパク質を使用して、Ｍｏｕｓｅ ＶＥＧＦ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｋｉｔ（米国ミネアポリス州、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を用いて、マウス肺中のＶＥＧＦ濃度を判定した。
【００７１】
実施例４：実験ＩＩＩ
プラスミドＤＮＡ／ＤＯＴＡＰ複合体の注射
６週齢のマウスの尾静脈に、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞（マウス１匹あたりＰＢＳ２００μｌ中に５０，０００個の細胞）、プラスミドＤＮＡ、および５０μｇのエンドトキシンフリーキットで精製したプラスミドＤＮＡを含むＤＮＡ担体複合体を注射し、８０μｇのＤＯＴＡＰを７、１４、および２１日目にマウスの尾静脈に注射した。２５日目にマウスを屠殺した。肺を摘出し、重量を測定して写真を撮影した。図２８〜２９参照。
【００７２】
実証例５：実験ＩＶ
アデノウイルスコンストラクトの注射およびＴＵＮＥＬ法
５００，０００個のＢ１６Ｆ０またはＢ１６Ｆ１０細胞を、１０週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの右側腹部に皮下注射した。腫瘍の大きさが直径約４ｍｍに到達した時（Ｂ１６細胞注射から１０〜１２日後）、ＰＢＳ５０ｕｌ中の１×１０9ｐｆｕ Ａｄ−５Ａ１を腫瘍内に注射した。４８時間後にマウスを屠殺し、腫瘍を摘出して固定し、パラフィンで包埋した。製造者のプロトコルに従ってＴＵＮＥＬ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、各細胞の腫瘍の種類ごとに（Ａｄ−５Ａ１−１およびＡｄ−５Ａ１−２）２ヶ所染色した。細胞の種類ごとに、ＴＵＮＥＬ反応の後ＴｄＴ酵素が残った、負の対照スライド（Ａｄ−５Ａ１陰性）を示した。図３０参照。
【００７３】
実施例６：実験Ｖ
腫瘍の確立
１４週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの右側腹部に、（ＰＢＳ１００ｕｌ中の）５００，０００個のＢ１６Ｆ１０細胞を皮下注射した。腫瘍の大きさが直径約８ｍｍに到達するまで、毎日腫瘍形成の経過を調べた。
【００７４】
アデノウイルスを用いた注射
腫瘍の直径が８ｍｍに到達した時に治療を開始した。Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１またはＡｄ−ＬａｃＺの１×１０9プラーク形成単位（ｐｆｕ）をマウスに注射した。注射は腫瘍の３つの部位に分散させた。最初の３日間は毎日マウスに注射をし、それ以降はマウスを屠殺するまで１日置きに注射した。腫瘍の大きさが１次元的に１５〜１６ｍｍを超えた時、マウスを屠殺した。緩衝液のみ与えた緩衝液マウスには、アデノウイルスを懸濁させた緩衝液のみを与えた（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．４、１０ ｍＭのＭｇＣｌ2、１０％グリセロール）。キャリパーを用いて毎日腫瘍の大きさを計測し、次の方程式を用いて腫瘍体積を算出した。
腫瘍体積（ｍｍ3）＝Ｌ＊Ｗ2＊０．５２
Ｌ＝長さ、Ｗ＝幅（常に短いほうの寸法）
図３１および３２参照。
【００７５】
実施例７
Ａ５４９肺癌細胞を、ＬａｃＺ（Ｌａｃ）またはｅＩＦ５Ａ１（５Ａ）のいずれかを発現するアデノウイルスに感染させた。感染から４時間後、培地をＤＭＳＯ、１０μＭのｐ３８阻害剤ＳＢ２０３５８０（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、１０μＭのＪＮＫ阻害剤ＩＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、１０μＭのＭＥＫ阻害剤Ｕ１０２６（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、または３０μＭのｐ５３阻害剤Ｐｉｆｉｔｈｒｉｎ−ａ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）のいずれかを含む培地と交換した。４８時間後、ＥＧＦで３０分間細胞を処理し、細胞ライセートを採取した。総ｐ５３（ｐ５３）、セリン１５位におけるリン酸化ｐ５３［Ｐ−ｐ５３（ｓｅｒ１５）］、またはセリン３７位におけるリン酸化ｐ５３［Ｐ−ｐ５３（ｓｅｒ３７）］に対する抗体のいずれかを用いて、ライセートにウエスタンブロットを行った。図３３参照。
【００７６】
図３３に示す結果は、感染から４８時間後までにＡｄ−ｅＩＦ５Ａ１がｐ５３の堆積を誘発することを表している。また、図は、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１が感染から４８時間後までにｐ５３のリン酸化を誘発すること、ｐ５３の堆積およびリン酸化がＭＥＫの阻害剤によって阻害されること、ｐ５３の堆積およびリン酸化がｐ５３活性の阻害剤によって阻害されること、ｅＩＦ５Ａ１は、ｐ５３のＭＥＫ依存リン酸化を刺激すること、そしてｅＩＦ５Ａ１が、ｐ５３のｐ５３依存性の堆積を刺激することを示している。
【００７７】
実施例８
Ａ５４９肺癌細胞を、ＬａｃＺ（Ａｄ−ＬａｃＺ）、またはｅＩＦ５Ａ１（Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１）のいずれかを発現するアデノウイルスに感染させた。４８時間後、総ＲＮＡを細胞から単離した。Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ法を用いて、ＧＡＰＤＨを参照の遺伝子としてｐ５３のレベルおよびｂａｘ ｍＲＮＡの転写産物レベルを判定した。ｐ５３プライマーは、５’−ＣＧＣＴＧＣＴＣＡＧＡＴＡＧＣＧＡＴＧＧＴＣ−３’（５’−プライマー）、および５’−ＣＴＴＣＴＴＴＧＧＣＴＧＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧ−３’（３’−プライマー）［これらのｐ５３プライマー配列は、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００４）．Ａ Ｎｏｖｅｌ ｅＩＦ５Ａ／ｃｏｍｐｌｅｘ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｓ ａ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｐ５３ ａｎｄ ｐ５３−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９ ４９２５１−４９２５８より入手した］であった。ｅＩＦ５Ａ１の過剰発現がｍＲＮＡレベルでｐ５３の堆積を誘発するが、ｂａｘへの影響は見られなかったことが分かる、図３４を参照のこと。
【００７８】
実施例９
Ａ５４９肺癌細胞を、ＬａｃＺ（Ａｄ−ＬａｃＺ）またはｅＩＦ５Ａ１（Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１）のいずれかを発現するアデノウイルスに感染させた。感染から４時間後、培地をＤＭＳＯ、１０μＭのＭＥＫ阻害剤Ｕ１０２６（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、または３０μＭのｐ５３阻害剤Ｐｉｆｉｔｈｒｉｎ−ａ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）のいずれかを含む培地と交換した。４８時間後、細胞から総ＲＮＡを単離した。Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ法を用いて、ＧＡＰＤＨを参照の遺伝子としてｐ５３転写産物レベルを判定した。ｐ５３プライマーは、５’−ＣＧＣＴＧＣＴＣＡＧＡＴＡＧＣＧＡＴＧＧＴＣ−３’ （５’−プライマー）、および５’−ＣＴＴＣＴＴＴＧＧＣＴＧＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧ−３’（３’−プライマー）［これらのｐ５３プライマー配列は、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００４）．Ａ Ｎｏｖｅｌ ｅＩＦ５Ａ／ｃｏｍｐｌｅｘ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｓ ａ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｐ５３ ａｎｄ ｐ５３−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９ ４９２５１−４９２５８より入手した］であった。ｐ５３のｅＩＦ５Ａ１依存性の堆積がｐ５３の転写活性に依存しており、ｅＩＦ５Ａ１に反応して生じるｐ５３タンパク質の上方制御が、ｐ５３ ｍＲＮＡの転写を増加させていることが分かる、図３５を参照のこと。
【００７９】
実施例１０
Ａ５４９肺癌細胞を、ＬａｃＺ（Ａｄ−ＬａｃＺ）またはｅＩＦ５Ａ１（Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１）のいずれかを発現するアデノウイルスに感染させた。感染から４時間後、培地を、ＤＭＳＯ、１０μＭのＭＥＫ阻害剤Ｕ１０２６（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、または３０μＭのｐ５３阻害剤Ｐｉｆｉｔｈｒｉｎ−ａ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）のいずれかを含む培地と交換した。４８時間後、細胞から総ＲＮＡを単離した。Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ法を用いて、ＧＡＰＤＨを参照の遺伝子としてｐ５３転写産物レベル濃度を判定した。ＴＮＦＲ１プライマーは、ＴＮＦＲ１−Ｆ ５’ＡＴＣＴＣＴＴＣＴＴＧＣＡＣＡＧＴＧＧ ３’、およびＴＮＦＲ１−Ｒ ５’ＣＡＡＴＧＧＡＧＴＡＧＡＧＣＴＴＧＧＡＣ ３’であった。ＴＮＦＲ１ ｍＲＮＡレベルがＡｄ−ｅＩＦ５Ａ１の感染によって上方制御されること、また、このＴＮＦＲ１ ｍＲＮＡの堆積が一部ＭＥＫに依存することを示す、図３６を参照のこと。このＴＮＦＲ１ ｍＲＮＡの堆積はｐ５３の転写活性に依存するものである。
【００８０】
実施例１１
Ａ５４９肺癌細胞を、ＬａｃＺ（Ｌａｃ）またはｅＩＦ５Ａ１（５Ａ）のいずれかを発現するアデノウイルスに感染させた。感染から４時間後、培地をＤＭＳＯ、１０μＭのｐ３８阻害剤ＳＢ２０３５８０（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、１０μＭのＪＮＫ阻害剤ＩＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、１０μＭのＭＥＫ阻害剤Ｕ１０２６（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、または３０μＭのｐ５３阻害剤Ｐｉｆｉｔｈｒｉｎ−ａ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）のいずれかを含む培地と交換した。４８時間後、細胞を採取し、Ａｎｎｅｘｉｎ／ＰＩ染色（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてアポトーシス中の細胞の割合を判定し、フローサイメトリーによる分析を行った。図３７参照。
【００８１】
図３７は、感染から４８時間後までにＡｄ−ｅＩＦ５Ａ１がアポトーシスを誘発すること、ＪＮＫの阻害がｅＩＦ５Ａ１によって誘導されたアポトーシスを増加させること、ＭＥＫの阻害がｅＩＦ５Ａ１によって誘導されたアポトーシスを増加させること、そして、ｐ５３の阻害がｅＩＦ５Ａ１によって誘導されたアポトーシスを減少させることを示している。
【００８２】
実施例１２
５０，０００個のＢ１６−Ｆ０メラノーマ細胞をマウスに皮下注射した。腫瘍の大きさが約５×５ｍｍ（６５ｍｍ3）に到達した時、腫瘍内注射を開始した。５０〜１００μｌのＰＢＳ／１０％グリセロール緩衝液で希釈した、１×１０9ｐｆｕのＡｄ−ｌａｃＺ（群２）、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１（群３）、またはＡｄ−ｅＩＦ５Ａ２（群４）あるいは緩衝液のみ（群１）を腫瘍内の３つの部位に１日置きに注射した。一日置きに腫瘍の大きさを測定し、腫瘍の大きさが体重の１０％に到達した時、マウスを屠殺した。図３９参照。
【００８３】
実施例１３
５０，０００個のＢ１６−Ｆ０メラノーマ細胞をマウスに皮下注射した。腫瘍の大きさが約５×５ｍｍ（６５ｍｍ3）に到達した時、腫瘍内注射を開始した。５０〜１００μｌのＰＢＳ／１０％グリセロール緩衝液で希釈した、１×１０9ｐｆｕのＡｄ−ｌａｃＺ（群２）、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１（群３）、またはＡｄ−ｅＩＦ５Ａ２（群４）あるいは緩衝液のみ（群１）のいずれかを、腫瘍内の３つの部位に、１日おきに注射した。腫瘍の大きさが体重の１０％に到達した時、マウスを屠殺した。図４０参照。
【００８４】
実施例１４：多発性骨髄腫
第０日目、ＫＡＳ６／１多発性骨髄腫細胞を、３０００ＩＦＵ／細胞の野生型または突然変異体のｅＩＦ５ａ（保存リジンが突然変異しているため、ハイプシン化されることができない）アデノウイルスベクターコンストラクトに４時間感染させた。感染後の培養培地に存在するＩＬ−６を含む、あるいは含まない、３つの複写物を設定した。また、対照（感染していない）のためにＫＡＳ細胞を播種した。
【００８５】
第２日目および４日目に、ＭＴＴおよびアネキシン／ＰＩアッセイを行った。上清を採取した。結果を図４１に示す。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】図１は、ｅＩＦ５Ａ１の発現が、遺伝毒性ストレスおよび一酸化窒素によって増加することを示す。Ａ）アクチノマイシンＤ０．５μｇ／ｍｌで０、１、４、８および２４時間処理した、正常な大腸繊維芽細胞における、ｅＩＦ５Ａの発現のノーザンブロット（上のパネル）およびウエスタンブロット（下のパネル）分析。ウエスタンブロットは、ｅＩＦ５Ａ、ｐ５３、およびβ−アクチンに対する抗体でプローブした。Ｂ）３ｍＭのニトロプルシドナトリウムで、０、２、４、８および２４時間処理したＲＫＯ細胞における、ｅＩＦ５Ａ１の発現のノーザンブロット（上のパネル）およびウエスタンブロット（下のパネル）分析。ウエスタンブロットは、ｅＩＦ５Ａおよびβ‐アクチンに対する抗体でプローブした。ＲＫＯ細胞は有意なレベルでｅＩＦ５Ａ２を発現しない。また、ｅＩＦ−５Ａ２のサイズは、ｅＩＦ−５Ａ１よりもアミノ酸１個長いだけであるが、ＳＤＳ ＰＡＧＥゲル上で高い位置を流れるため、ｅＩＦ５Ａ２が発現した場合、ｅＩＦ−５Ａ１とは別のバンドとして見えることになる。
【図２】図２は、ｅＩＦ５Ａ１発現の抑制が、細胞増殖に対して何の影響も与えないことを示す。Ａ）ｅＩＦ５Ａ１ ｓｉＲＮＡまたは対照ｓｉＲＮＡを用いたトランスフェクションから７２時間後にＨＴ−２９細胞から単離した細胞ライセートのウエスタンブロット。２つの独立した実験からのウエスタンブロットを示す。ブロットは、ｅＩＦ５Ａおよびβ−アクチンに対する抗体でプローブした。Ｂ）ｅＩＦ５Ａ１ ｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトした細胞の代謝活性を、ＸＴＴ細胞増殖アッセイを用いて測定した。対照ｓｉＲＮＡまたはｅＩＦ５Ａ１ ｓｉＲＮＡを用いたトランスフェクションの２４時間前に、ＨＴ−２９細胞を９６ウェルプレートに播種した。トランスフェクションから２４時間後、細胞を未処理のまま放置するか、または、代謝活性測定の前に、アクチノマイシンＤ（１．０μｇ／ｍｌ）を用いて４８時間処理した。値は、４通り行われた２つの実験からの平均値であり、１に設定された０時間対照のために得られた値まで正規化した。Ｃ）対照またはｅＩＦ５Ａ１ ｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトしたＨＴ−２９細胞の増殖能を、５０μＭのＧＣ７とともに７２時間インキュベートした細胞の増殖能と比較した。細胞増殖はＢｒｄＵ取り込みによって測定した。値は、ｎ＝４に対して平均値±ＳＥで、１に設定したＧＣ７（＋）血清サンプルの値に合わせて正規化した。アスタリスク（＊）は、対応のあるスチューデントのｔ検定（ｐ＜０．０１）により、有意に差があると思われた値を示す。対照ｓｉＲＮＡまたはｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡのどちらかを用いてトランスフェクトしたＨＴ−２９細胞のトランスフェクションの日（第０日目）からトランスフェクション後５日目までのＤ）ＸＴＴおよびＥ）ＢｒｄＵ取り込み細胞増殖アッセイ。第０日目の値は１に設定した。
【図３】図３は、ｅＩＦ５Ａ１が、アクチノマイシンＤに反応してｐ５３の発現を制御することを示す。ＲＫＯ細胞を、対照ｓｉＲＮＡ（Ｃ）またはｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡ（５Ａ−１）のいずれかを用いてトランスフェクトした。トランスフェクションから７２時間後、アクチノマイシンＤ０．５μｇ／ｍｌを用いて、０、４、８、または２４時間細胞を処理した。Ａ）ｅＩＦ５Ａ、ｐ５３、またはβ−アクチンに対する抗体を用いてブロッティングした細胞ライセートのウエスタンブロット。結果は３つの独立した実験を代表するものである。Ｂ）対応するアクチンバンドまで正規化したウエスタンブロットにおけるｐ５３の相対強度のプロット。値は最小値ｎ＝３に対して平均値±ＳＥ。
【図４】図４は、ヒトｅＩＦ５Ａ１の過剰発現が、ｐ５３から独立してアポトーシスを誘導することを示す。ＲＫＯ細胞（Ａ）またはＲＫＯ−Ｅ６細胞（Ｂ）を、ｐＨＭ６−ＬａｃＺ、ｐＨＭ６ ｅＩＦ５Ａ、またはｐＨＭ６−ｅＩＦ５Ａ△３７（Ｃ末端側で３７位のアミノ酸を切断）を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションから４８時間後、ＴＵＮＥＬ法を用いて細胞を固定し、標識化した。核は、Ｈｏｅｓｃｈｔ３３２５８で染色し、標識化した細胞を蛍光顕微鏡を用いて観察した。明るい緑色に染色された細胞を、アポトーシス性であるとスコア化した。Ｈｏｅｓｃｈｔで染色した核を総細胞数を決定するのに使用した。値はｎ＝４（Ａ）またはｎ＝３（Ｂ）についての平均値±ＳＥ。アスタリスク（＊）は、対応のあるスチューデントのｔ検定（ｐ＜０．０２）による、対照（ｐＨＭ６−ＬａｃＺ）からの有意差を示す。Ｃ）アクチノマイシンＤ０．５μｇ／ｍｌで処理してから０、４、８、および２４時間後に採取したＲＫＯおよびＲＫＯ−Ｅ６細胞ライセートのウエスタンブロット。ブロットは、ｐ５３およびβ−アクチンに対する抗体を用いてプローブした。
【図５】図５は、ｅＩＦ５Ａ１アデノウイルスコンストラクトが大腸癌細胞にアポトーシスを誘導することを示す。Ａ）Ａｄ−ＬａｃＺ（Ｌ）、ＡｄｅＩＦ５Ａ１（５Ａ）、またはＡｄ−ｅＩＦ５Ａ（Ｋ５０Ａ）（Ｋ５０Ａ）で感染させてから７２時間後にＨＴ−２９細胞から単離した、細胞ライセートのウエスタンブロット。Ｂ）ＧＣ７またはＤＦＯで７２時間処理した後、またはアデノウイルスコンストラクトに感染させてから７２時間後、ｅＩＦ５Ａに対する抗体を用いてウエスタンブロットを行った後、ＨＴ−２９細胞から単離した、細胞ライセートの２Ｄゲル電気泳動。ｅＩＦ５Ａを過剰発現するアデノウイルス感染細胞からのライセートから０．３μｇのタンパク質が分離されたことを除いては、７μｇのタンパク質が分離された。Ｃ）上のパネル：アデノウイルスコンストラクト感染から４８時間後のＨＴ−２９細胞のＴＵＮＥＬ染色。下のパネル：Ｈｏｅｃｈｓｔ染色した同じ領域内の細胞の核。すべての写真は４００倍の倍率で撮影した。結果は３つの独立した実験を代表するものである。Ｄ）アデノウイルスコンストラクト感染から４８時間後のＨＴ−２９細胞のアポトーシスの割合。値は、ｎ＝３に対して平均値±ＳＥ。Ｅ）アデノウイルスコンストラクト感染から７日後の、ＨＴ−２９細胞のＸＴＴ細胞増殖アッセイ。値は、ｎ＝４に対して平均値±ＳＥ。
【図６】図６は、ｅＩＦＡ１アデノウイルスコンストラクトに感染したＨＴ‐２９細胞のアネキシンＶおよびＰＩ染色を示す。Ａ）アデノウイルスコンストラクト感染から４８時間後のＨＴ‐２９細胞のアネキシン−ＦＩＴＣおよびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）標識のヒストグラム。Ｂ）アネキシンＶ標識およびフローサイトメトリー分析によって判定される、アデノウイルスコンストラクト感染後２４、４８、および７２時間後、またはアポトーシス誘導剤アクチノマイシンＤまたはブレフェルジンＡで処理した後の、ＨＴ−２９細胞アポトーシスの割合。値はｎ＝２に対して平均値±ＳＥ（事象数＞５０００）。
【図７】図７は、免疫蛍光法によるｅＩＦ５Ａ１の局在化を示す。ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α（Ａ）またはアクチノマイシンＤ（Ｂ）で刺激を与えたＨＴ‐２９細胞内におけるｅＩＦ５Ａタンパク質の細胞内局在を、間接免疫蛍光法によって判定した。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８を核の染色に使用した。Ａ）ＴＮＦ−αで０分［（−）ＴＮＦ−α］、１０分、または３０分間刺激する前に、ＨＴ‐２９細胞を未処理のまま放置するか、あるいはＩＦＮ−γで１６時間予備刺激した。上のパネル：ｅＩＦ５Ａ１の免疫蛍光検出。中央のパネル：Ｈｏｅｃｈｓｔ染色した同領域内にある細胞の核。下のパネル：合併したイメージ。Ｂ）ＨＴ‐２９細胞を未処理のまま放置するか、あるいはアクチノマイシンＤで０．５時間、１．５時間、または４時間処理した。上のパネル：ｅＩＦ５Ａ１の免疫蛍光検出。中央のパネル：Ｈｏｅｃｈｓｔ染色した同領域内にある細胞の核、下のパネル：合併したイメージ。すべての写真は４００倍の倍率で撮影した。結果は３つの独立した実験を代表するものである。
【図８】図８は、ｅＩＦ５Ａ１が、アクチノマイシンＤに反応してｐ５３の発現を制御することを示す。ＲＫＯ−Ｅ６細胞はｐ５３を発現しない。Ａ）ＲＫＯまたはＲＫＯ−Ｅ６細胞を、アクチノマイシンＤ０．５μｇ／ｍｌで１、４、８、または２４時間処理した。細胞ライセートを採取し、ウエスタンブロットを用いてｐ５３の発現について分析した。Ｂ）対照ｓｉＲＮＡ（Ｃ）、ｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡ（５Ａ−１）、またはｅＩＦ５Ａの異なる領域を標的とする第２のｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡ（５Ａ−２）のいずれかを用いて、ＲＫＯ細胞をトランスフェクトした。トランスフェクトから７２時間後、アクチノマイシンＤ０．５μｇ／ｍｌで０、４、８、または２４時間細胞を処理した。Ａ）ｅＩＦ５Ａ、ｐ５３、またはβ−アクチンに対する抗体でブロットした細胞ライセートのウエスタンブロット。結果は３つの独立した実験を代表するものである。
【図９】図９は、アポトーシスの間、デオキシハイプシン化したｅＩＦ５Ａ１が堆積することを示す。この図は、アクチノマイシンＤ（Ａ）または作動薬Ｆａｓ抗体（Ｂ）で、１〜２４時間処理してから、ｅＩＦ５Ａに対する抗体でウエスタンブロットした後、ＨＴ‐２９細胞から単離した細胞ライセートの２Ｄゲル電気泳動を提供する。
【図１０】図１０は、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１またはＡｄ−ｅＩＦ５Ａ１（Ｋ５０Ａ）｛Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１Ｍ）による感染が、ＨＴ−２９結腸直腸腺癌細胞にアポトーシスを誘導することを示す。この図は、アネキシンＶ標識およびフローサイトメトリー分析によって判定される、アデノウイルスコンストラクト感染、あるいはアポトーシス誘導剤アクチノマイシンＤまたはブレフェルジンＡ処理から２４、４８、および７２時間後の、ＨＴ−２９細胞アポトーシスの割合を提供する。値は、ｎ＝２に対して平均値±ＳＥ（事象数＞５０００）。
【図１１】図１１は、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１またはＡｄ−ｅＩＦ５Ａ２による感染が、ＨＴＢ−９膀胱癌細胞にアポトーシスを誘導することを示す。この図は、アネキシンＶ標識およびフローサイトメトリー分析によって判定される、アデノウイルスコンストラクト感染、あるいはアポトーシス誘導剤アクチノマイシンＤまたはブレフェルジンＡ処理から２４、４８、および７２時間後の、ＨＴＢ−９細胞アポトーシスの割合を提供する。値は、ｎ＝２に対して平均値±ＳＥ（事象数＞５０００）。
【図１２】図１２は、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１またはＡｄ−ｅＩＦ５Ａ２による感染が、ＨＴＢ−４膀胱癌細胞にアポトーシスを誘導することを示す。この図は、アネキシンＶ標識およびフローサイトメトリー分析によって判定される、アデノウイルスコンストラクト感染、あるいはアポトーシス誘導剤アクチノマイシンＤまたはブレフェルジンＡ処理から２４、４８、および７２時間後の、ＨＴＢ−４細胞アポトーシスの割合を提供する。値は、ｎ＝２に対して平均値±ＳＥ（事象数＞５０００）。
【図１３】図１３は、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１（Ｋ５０Ａ）｛Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１Ｍ｝、またはＡｄ−ｅＩＦ５Ａ２による感染が、ＨＴＢ−４膀胱癌細胞の成長を阻害することを示す。この図は、アデノウイルスコンストラクト感染から２４、４８、および７２時間後の、ＨＴＢ−４細胞のＸＴＴ細胞増殖アッセイの結果を提供する。値は、ｎ＝２に対して平均値±ＳＥ。
【図１４】図１４は、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１（Ｋ５０Ａ）｛Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１Ｍ｝、またはＡｄ−ｅＩＦ５Ａ２による感染がＨＴＢ−９膀胱癌細胞の成長を阻害することを示す。この図は、アデノウイルスコンストラクト感染から２４、４８、および７２時間後の、ＨＴＢ−９細胞のＸＴＴ細胞増殖アッセイの結果を提供する。値は、ｎ＝２に対して平均値±ＳＥ。
【図１５】図１５は、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１（Ｋ５０Ａ）｛Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１Ｍ｝、またはＡｄ−ｅＩＦ５Ａ２による感染が、ＨＴＢ−１膀胱癌細胞の成長を阻害することを示す。この図は、アデノウイルスコンストラクト感染から２４、４８、および７２時間後の、ＨＴＢ−１細胞のＸＴＴ細胞増殖アッセイの結果を提供する。値は、ｎ＝２に対して平均値±ＳＥ。
【図１６】図１６は、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１（Ｋ５０Ａ）｛Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１Ｍ｝、またはＡｄ−ｅＩＦ５Ａ２による感染が、ＵＭＵＣ−３膀胱癌細胞の成長を阻害することを示す。この図は、アデノウイルスコンストラクト感染から２４、４８、および７２時間後の、ＵＭＵＣ−３細胞のＸＴＴ細胞増殖アッセイの結果を提供する。値は、ｎ＝２に対して平均値±ＳＥ。
【図１７】図１７は、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１（Ｋ５０Ａ）｛Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１Ｍ｝、またはＡｄ−ｅＩＦ５Ａ２による感染が、ＨｅＬａ子宮頚部腺癌細胞の成長を阻害することを示す。この図は、アデノウイルスコンストラクト感染から２４、４８、および７２時間後の、ＨｅＬａ細胞のＸＴＴ細胞増殖アッセイの結果を提供する。値は、ｎ＝２に対して平均値±ＳＥ。
【図１８】図１８は、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１（Ｋ５０Ａ）（Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１Ｍ）、またはＡｄ−ｅＩＦ５Ａ２による感染が、ＨＴＢ−４細胞にＰＡＲＰ切断を誘発することを示す。この図は、アデノウイルスコンストラクト感染から４８時間または７２時間後に、ＨＴＢ−４細胞から単離された細胞ライセートを、ＰＡＲＰ、ｅＩＦ５Ａ、およびβ−アクチンに対する抗体を用いてウエスタンブロットした結果を示す。
【図１９】図１９は、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１（Ｋ５０Ａ）（Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１Ｍ）、またはＡｄ−ｅＩＦ５Ａ２による感染が、ＨＴＢ−１細胞にＰＡＲＰ切断を誘発しないことを示す。この図は、アデノウイルスコンストラクト感染から４８時間または７２時間後に、ＨＴＢ−１細胞から単離した細胞ライセートを、ＰＡＲＰ、ｅＩＦ５Ａ、およびβ−アクチンに対する抗体を用いてウエスタンブロットした結果を示す。
【図２０】図２０は、Ａ５４９肺癌細胞におけるｅＩＦ５Ａ１の過剰発現が、ＭＡＰＫ／ＳＡＰＫシグナル経路を活性化することを示す。Ａ５４９細胞は、感染効率（ＭＯＩ）を次第に高くしながらＡｄ−ｅＩＦ５Ａ１（５Ａ）に感染させた。比較のために、Ａｄ−ＬａｃＺ（Ｌａｃ）を用いて細胞を感染させた。感染から４８時間後、ＥＧＦで細胞を３０分間処理し、ウエスタンブロット分析のために細胞ライセートを採取した。
【図２１】図２１は、Ａ５４９肺癌細胞におけるｅＩＦ５Ａ１の過剰発現が、ＭＡＰＫ／ＳＡＰＫシグナル経路を活性化することを示す。Ａ５４９細胞は、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１（５Ａ）またはＡｄ−ＬａｃＺ（Ｌ）を用いて５０ＭＯＩで感染させた。感染から６、２４、４８、または７２時間後に、ＥＧＦで細胞を３０分間処理し、ウエスタンブロット分析のために細胞ライセートを採取した。
【図２２】図２２は、ハイプシン化されることのできないｅＩＦ５Ａ１の突然変異体の過剰発現が、ＭＡＰＫ／ＳＡＰＫシグナル経路を活性化することを示す。Ａ５４９細胞は、感染効率（ＭＯＩ）を次第に高めながらＡｄ−ｅＩＦ５Ａ１（Ｋ５０Ａ）（Ｍ）に感染させた。比較のために、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１（５Ａ）およびＡｄ−ＬａｃＺ（Ｌａｃ）を用いて細胞を感染させた。ＭＥＫ阻害剤Ｕ１０２６を用いて、あるいは用いずに細胞をインキュベートした。感染から４８時間後、ＥＧＦで細胞を３０分間処理し、ウエスタンブロット分析のために細胞ライセートを採取した。
【図２３】図２３は、Ａ５４９肺癌細胞におけるｅＩＦ５Ａ１または突然変異体ｅＩＦ５Ａ１（Ｋ５０Ａ）の過剰発現が、ｐ５３の発現を増加させることを示す。Ａ５４９細胞は感染効率（ＭＯＩ）を次第に高くしながらＡｄ−ｅＩＦ５Ａ１（５Ａ）またはＡｄ−ｅＩＦ５Ａ１（Ｋ５０Ａ）（Ｍ）を用いて感染させた。比較のために、Ａｄ−ＬａｃＺ（Ｌａｃ）に細胞を感染させた。ＭＥＫ阻害剤Ｕ１０２６を用いて、あるいは用いずに細胞をインキュベートした。感染から４８時間後、ＥＧＦで３０分間細胞を処理し、ウエスタンブロット分析のために細胞ライセートを採取した。
【図２４】図２４は、ｅＩＦ５Ａ１または突然変異体ｅＩＦ５Ａ１（Ｋ５０Ａ）の過剰発現は、Ａ５４９肺癌細胞がＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）細胞外基質に浸潤する能力を減少させることを示す。アデノウイルスコンストラクト感染から２４時間後、Ａ５４９細胞をＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）を塗布した無血清培地のトランスウェルに播種した。血清含有培地は、化学誘引物質として作用するように下のウェルに配置した。播種から２４時間後、トランスウェルの下部表面まで浸潤した細胞を、クリスタルバイオレットで染色し、光学顕微鏡下で細胞を数えることにより、領域あたりの平均細胞数を判定した。サンプルあたり最低６個の領域が数えられた。
【図２５】図２５は、実験ＩＩの結果を示す。Ｂ１６Ｆ１０を有するＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて、ｅＩＦ５Ａ１によって肺腫瘍量が有意に減少した。６週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの尾静脈に、２００，０００個のＢ１６Ｆ１０細胞を注射した。２、４、７、１１、１６、２１、２６および３１日目に、ＬａｃＺ遺伝子（ＤＮＡ対照として）またはｅＩＦ５Ａ１を有するプラスミドＤＮＡを尾静脈に注射した。１×（３．３ｍｇ／ｋｇ）、０．１×（０．３ｍｇ／ｋｇ）、２×（６．６ｍｇ／ｋｇ）の、３つの異なるＤＮＡ濃度を使用した。Ｂ１６Ｆ１０細胞の代わりにＰＢＳを与えたマウスを陰性対照として使用し、プラスミドＤＮＡの代わりにＰＢＳを注射したＢ１６Ｆ１０を有するマウスを陽性対照として使用した。マウスは瀕死状態となった時に屠殺し、肺を摘出して写真を撮影した。
【図２６】図２６は、実験ＩＩの結果を示す。Ｂ１６Ｆ１０を有するＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて、ｅＩＦ５Ａ１によって肺重量が有意に減少した。６週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの尾静脈に、２００，０００個のＢ１６Ｆ１０細胞を注射した。２、４、７、１１、１６、２１、２６および３１日目に、ＬａｃＺ遺伝子（ＤＮＡ対照として）またはｅＩＦ５Ａ１を有するプラスミドＤＮＡを尾静脈に注射した。１×（３．３ｍｇ／ｋｇ）、０．１×（０．３ｍｇ／ｋｇ）、２×（６．６ｍｇ／ｋｇ）の、３つの異なるＤＮＡ濃度を使用した。Ｂ１６Ｆ１０細胞の代わりにＰＢＳを与えたマウスを陰性対照として使用し、プラスミドＤＮＡの代わりにＰＢＳを注射したＢ１６Ｆ１０を有するマウスを陽性対照として使用した。マウスは瀕死状態となった時に屠殺し、肺を摘出して重量を測定した。
【図２７】図２７は、実験ＩＩの結果を示す。Ｂ１６Ｆ１０を有するＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて、ＶＥＧＦ発現がｅＩＦ５Ａ１によって有意に減少した。６週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの尾静脈に、２００，０００個のＢ１６Ｆ１０細胞を注射した。２、４、７、１１、１６、２１、２６および３１日目に、ＬａｃＺ遺伝子（ＤＮＡ対照として）またはｅＩＦ５Ａ１を有するプラスミドＤＮＡを尾静脈に注射した。１×（３．３ｍｇ／ｋｇ）、０．１×（０．３ｍｇ／ｋｇ）、２×（６．６ｍｇ／ｋｇ）の、３つの異なるＤＮＡ濃度を使用した。Ｂ１６Ｆ１０細胞の代わりにＰＢＳを与えたマウスを陰性対照として使用し、プラスミドＤＮＡの代わりにＰＢＳを注射したＢ１６Ｆ１０を有するマウスを陽性対照として使用した。マウスは瀕死状態となった時に屠殺し、肺を摘出して重量を測定した。肺重量が判明してからその肺を冷凍し、後にＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡに使用した。肺組織は溶解緩衝液中で粉砕し、ライセート中に存在するＶＥＧＦの量をＥＬＩＳＡ法によって測定した。
【図２８】図２８は、実験ＩＩＩの結果を示す。ＤＮＡをＤＯＴＡＰと複合化することにより、ｅＩＦ５Ａ１遺伝子療法の抗腫瘍効果が向上した。６週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの尾静脈に、５０，０００個のＢ１６Ｆ１０細胞を注射した（第０日目）。７，１４、および２１日目に尾静脈注射を行う前に、ＬａｃＺ遺伝子（ＤＮＡ対照として）またはｅＩＦ５Ａ１を有するプラスミドＤＮＡをＤＯＴＡＰと複合化した。プラスミドＤＮＡを含まないＤＯＴＡＰを注射した腫瘍の無いマウスを、ＤＯＴＡＰの効果の対照として使用した。マウスは２５日目に屠殺し、肺を摘出して写真を撮影した。
【図２９】図２９は、実験ＩＩＩの結果を示す。ＤＮＡをＤＯＴＡＰと複合化することにより、ｅＩＦ５Ａ１遺伝子療法の抗腫瘍効果が向上した。６週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの尾静脈に、５０，０００個のＢ１６Ｆ１０細胞を注射した（第０日目）。７，１４、および２１日目に尾静脈注射を行う前に、ＬａｃＺ遺伝子（ＤＮＡ対照として）またはｅＩＦ５Ａ１を有するプラスミドＤＮＡをＤＯＴＡＰと複合化した。プラスミドＤＮＡを含まないＤＯＴＡＰを注射した腫瘍の無いマウスを、ＤＯＴＡＰの効果の対照として使用した。マウスは２５日目に屠殺し、肺を摘出して重量を測定した。
【図３０】図３０は、実験ＩＶの結果を示す。Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１の注射はＢ１６Ｆ０およびＢ１６Ｆ１０腫瘍にアポトーシスを誘導する。５００，０００個のＢ１６Ｆ０またはＢ１６Ｆ１０細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右側腹部に皮下注射した。腫瘍の直径が約４ｍｍに到達した時、５０μｌのＰＢＳ中の１×１０9ｐｆｕ Ａｄ−５Ａ１を腫瘍に注射した（Ｂ１６細胞注射から１０〜１２日後）。マウスは４８時間後に屠殺し、腫瘍を切除して、固定し、パラフィンに包埋した。各細胞腫瘍の種類（Ａｄ−５Ａ１−１およびＡｄ−５Ａ１−２）に対して２ヶ所を、製造者のプロトコルに従ってＴＵＮＥＬ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて染色した。ＴＵＮＥＬ反応からＴｄＴ酵素が残った陰性対照のスライド（Ａｄ−５Ａ１陰性）を、各細胞の種類ごとに含ませた。
【図３１】図３１は、実験Ｖの結果を示す。Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１の注射により腫瘍成長が有意に遅延した。皮下にＢ１６−Ｆ１０を有するＣ５７ＢＬ／６に、１×１０9ｐｆｕのＡｄ−ｅＩＦ５Ａ１またはＡｄ−ＬａｃＺまたは等体積の緩衝液を注射した。腫瘍の直径が約８ｍｍに到達した時に治療を開始し、その日を「第０日目」に指定した。最初の３日間は毎日マウスに注射をし、それ以降はマウスを屠殺するまで１日置きに注射した。腫瘍の大きさが１次元的に１５〜１６ｍｍを超えた時、マウスを屠殺した。各群につきマウス３匹とした。群１のマウス（１−１、１−２、１−３）はＡｄ−ｅＩＦ５Ａ１で処理した。群２のマウス（２−１、２−２、２−３）にはＡｄ−ＬａｃＺを注射し、群３（３−１、３−２、３−３）のマウスには緩衝液のみを与えた。キャリパーを用いて毎日腫瘍の大きさを計測し、腫瘍体積を推測するために使用した。
【図３２】図３２は、実験Ｖの結果を示す。Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１の注射により生存期間が有意に伸びた。皮下にＢ１６−Ｆ１０を有するＣ５７ＢＬ／６に、１×１０9ｐｆｕのＡｄ−ｅＩＦ５Ａ１またはＡｄ−ＬａｃＺまたは等体積の緩衝液を注射した。腫瘍の直径が約８ｍｍに到達した時に治療を開始し、その日を「第０日目」に指定した。最初の３日間は毎日マウスに注射をし、それ以降はマウスを屠殺するまで１日置きに注射した。腫瘍の大きさが１次元的に１５〜１６ｍｍを超えた時、マウスを屠殺した。各群につきマウス３匹とした。群１のマウス（１−１、１−２、１−３）はＡｄ−ｅＩＦ５Ａ１で処理した。群２のマウス（２−１、２−２、２−３）にはＡｄ−ＬａｃＺを注射し、群３（３−１、３−２、３−３）のマウスには緩衝液のみを与えた。
【図３３】図３３は、ｅＩＦ−５Ａ１が、Ａ５４９肺癌細胞におけるｐ５３腫瘍抑制タンパク質の堆積およびリン酸化を増加することを示す。
【図３４】図３４は、ｅＩＦ−５Ａ１が、Ａ５４９肺癌細胞におけるｐ５３ ｍＲＮＡレベルを上昇させることを示す。
【図３５】図３５は、ｐ５３レベルの上昇は、Ａ５４９肺癌細胞におけるｐ５３の転写活性に依存することを示す。
【図３６】図３６は、ＴＮＦＲ１ ｍＲＮＡレベルは、Ａ５４９肺癌細胞においてｅＩＦ−５Ａ１に感染することにより上方制御されることを示す。
【図３７】図３７は、ｅＩＦ−５Ａ１が、Ａ５４９肺癌細胞におけるアポトーシスを誘導し、ＭＥＫ阻害剤の使用が、ｅＩＦ−５Ａ１によって誘導されたアポトーシス量を増加することを示す。
【図３８】図３８は、ｅＩＦ−５Ａ１の仮説モデルが、ＭＡＰＫ／ＳＡＰＫ経路およびＡ５４９肺癌細胞におけるアポトーシスに影響することを示す。
【図３９】図３９は、腫瘍成長の抑制において、ｅＩＦ−５Ａ１がｅＩＦ−５Ａ２より優れていることを示す（マウス異種移植モデル（Ｂ１６−ＦＯメラノーマ細胞））。
【図４０】図４０は、マウスの生存期間延長において、ｅＩＦ−５Ａ１がｅＩＦ−５Ａ２より優れていることを示す（マウス異種移植モデル（Ｂ１６−ＦＯメラノーマ細胞））。
【図４１】図４１は、ＩＬ−６を含む、あるいは含まない対照を用いて処理された細胞と比較すると、ｅＩＦ−５Ａが、死滅したあるいは死滅する細胞数を増加することを示す。
【図４２】図４２は、ｅＩＦ−５Ａ２の配列を提供する。
【図４３】図４３は、ｅＩＦ−５Ａ１ ｓｉＲＮＡの位置および配列を提供する。
【図４４】図４４は、ヒトｅＩＦ−５Ａ１およびヒトｅＩＦ−５Ａ２のヌクレオチドアラインメントを提供する。
【図４５】図４５は、ヒトｅＩＦ−５Ａ１およびヒトｅＩＦ−５Ａ２のアミノ酸アラインメントを提供する。
【図４６Ａ】図４６Ａは、ｅＩＦ−５Ａ１ ｓｉＲＮＡの位置および配列を提供する。
【図４６Ｂ】図４６Ｂは、ｅＩＦ−５Ａ１ ｓｉＲＮＡの位置および配列を提供する。
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００５年１２月１３日に出願された米国仮特許出願第６０／７４９，６０４号、および、２００６年４月２７日に出願された米国仮特許出願第６０／７９５，１６８号の利益を主張するものであり、参照することにより、そのすべてを本明細書に援用する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、アポトーシスに特異的な真核生物開始因子（「ｅＩＦ−５Ａ」）、および該因子をコード化するポリヌクレオチドの多発性骨髄腫細胞やその他の癌細胞を死滅させるための使用に関する。本発明は、多発性骨髄腫を阻害するため、多発性骨髄腫細胞を死滅させるため、そして、その他の癌細胞の成長を阻害するおよび／または死滅させるための、アポトーシスに特異的なｅＩＦ−５Ａ、または「アポトーシス特異的ｅＩＦ−５Ａ」、または「ｅＩＦ−５Ａ１」の使用と、ｅＩＦ−５Ａ２アイソフォームの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
アポトーシスは、細胞の縮小、クロマチンの濃縮、核断片化、および膜泡形成といった明確な形態学的特性によって特徴付けられる、遺伝子的にプログラムされた細胞事象である。Ｋｅｒｒ ｅｔ ａｌ（１９７２）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，２６，２３９−２５７；Ｗｙｌｌｉｅ ｅｔ ａｌ（１９８０）Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．，６８，２５１−３０６。アポトーシスは、正常な組織発達およびホメオスタシスにおいて重要な役割を果たし、アポトーシスのプログラムにおける欠陥は、神経変性疾患および自己免疫疾患から腫瘍まで、種々のヒト疾患の原因になると考えられている。Ｔｈｏｍｐｓｏｎ（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６７，１４５６−１４６２；Ｍｕｌｌａｕｅｒ ｅｔ ａｌ（２００１）Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ，４８８，２１１−２３１。アポトーシス細胞の形態学的特徴については明らかになっているものの、その過程を制御する分子経路が解明されるようになってからまだ間もない。
【０００４】
アポトーシスに関与する別の主要なタンパク質は、腫瘍抑制遺伝子ｐ５３によりコード化されるタンパク質である。このタンパク質は、おそらくはＢａｘの上方制御によって、細胞の成長を制御し、損傷を受けて遺伝的に不安定な細胞にアポトーシスを誘導する、転写因子である。Ｂｏｌｄ ｅｔ ａｌ（１９９７）Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，６，１３３−１４２；Ｒｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｓｃｈｕｌｅｒ ＆ Ｇｒｅｅｎ（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．，２９，６８４−６８８；Ｒｙａｎ ｅｔ ａｌ（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１３，３３２−３３７；Ｚｏｒｎｉｇ ｅｔ ａｌ（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１５５１，Ｆ１−Ｆ３７。
【０００５】
アポトーシス経路における改変は、癌など多数の疾患過程において重要な役割を果たすと考えられる。Ｗｙｌｌｉｅ ｅｔ ａｌ（１９８０）Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．，６８，２５１−３０６；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６７，１４５６−１４６２、Ｓｅｎ ＆ Ｄ’Ｉｎｃａｌｃｉ（１９９２）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，３０７，１２２−１２７；ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ（１９９５）Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，６，５３−６０。従来、癌の発生および進行についての調査は、細胞増殖に焦点を当ててきた。しかし、腫瘍形成においてアポトーシスが果たす重要な役割が最近明らかになった。実際、アポトーシスの制御には、腫瘍細胞において必ず何らかの改変が生じるため、アポトーシスに関して現在分かっていることのほとんどが、腫瘍モデルを用いて分かってきたことである。Ｂｏｌｄ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，６，１３３−１４２。
【０００６】
サイトカインもアポトーシス経路に関与してきた。生態系は、自らを制御するために細胞間相互作用を必要とし、細胞間のクロストークには概して多種類のサイトカインが必要となる。サイトカインは、数多くの異なる種類の細胞の型による、種々の刺激に反応して産生されるメディエータである。サイトカインは、数多くの異なる種類の細胞に、数多くの異なる効果を及ぼすことができる多面的分子であるが、特に、免疫応答の制御と、造血細胞の増殖および分化において重要である。標的細胞に対するサイトカインの作用は、特定のサイトカイン、相対濃度、その他のメディエータの存在に依存して、細胞の生存、増殖、活性化、分化、またはアポトーシスを促進することが可能である。
【０００７】
デオキシハイプシン合成酵素（ＤＨＳ）およびハイプシン含有の真核生物翻訳開始因子５Ａ（ｅＩＦ−５Ａ）は、細胞の成長や分化など多くの細胞過程において重要な役割を果たすことで知られている。独特のアミノ酸であるハイプシンは、検査するすべての真核生物および古細菌中に見られるが真正細菌中には見られず、ｅＩＦ−５Ａが唯一知られるハイプシン含有タンパク質である。Ｐａｒｋ（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３，７４４７−７４４９；Ｓｃｈｕｍａｎｎ ＆ Ｋｌｉｎｋ（１９８９）Ｓｙｓｔｅｍ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１１，１０３−１０７、Ｂａｒｔｉｇ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｓｙｓｔｅｍ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３，１１２−１１６；Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７ａ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２，１６５８５−１６５８９。活性ｅＩＦ−５Ａは、翻訳後２つのステップにおいて形成される。第１のステップは、デオキシハイプシン合成酵素により触媒される、前駆物質ｅＩＦ−５Ａの特定のリジンのα‐アミノ基へ、スペルミジンの４‐アミノブチル部分を転移することによる、デオキシハイプシン残基の形成であり、第２のステップは、この４‐アミノブチル部分をデオキシハイプシン水酸化酵素によって水酸化してハイプシンを形成することを含む。
【０００８】
ｅＩＦ−５Ａのアミノ酸配列は種間でよく保存されており、ｅＩＦ−５Ａ内のハイプシン残基を取り囲むアミノ酸配列には徹底した保存が見られ、この修飾が生存のために重要である可能性を示している。Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｆａｃｔｏｒｓ，４，９５−１０４。今まで酵母中に発見されたｅＩＦ−５Ａの両アイソフォームの不活性化、またはアイソフォーム活性化の第１のステップを触媒するＤＨＳ遺伝子の不活性化が、細胞分裂を阻止するという観察は、この仮説をさらに支持するものである。Ｓｃｈｎｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１，３１０５−３１１４；Ｓａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９９６）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，３８４，１５１−１５４，Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，１６７７−１６８３。しかし、酵母におけるｅＩＦ−５Ａタンパク質の枯渇は、総タンパク質合成をわずかに減少させたに過ぎず、タンパク質全体の合成にではなく、ｍＲＮＡの特定のサブセットの翻訳に、ｅＩＦ−５Ａが必要である可能性を示している。Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９３）「Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｅＩＦ−５Ａ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｏｎ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，」ｉｎ Ｔｕｉｔｅ，Ｍ．（ｅｄ．），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎ Ｙｅａｓｔ，ＮＡＴＯ Ｓｅｒｉｅｓ Ｈ。ｅＩＦ−５Ａを結合するリガンドが、非常によく保存された部分を共有するという最近の発見もまた、ｅＩＦ−５Ａの重要性を支持するものである。Ｘｕ ＆ Ｃｈｅｎ（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，２５５５−２５６１。また、修飾されたｅＩＦ−５Ａのハイプシン残基が、ＲＮＡへの配列特異的結合に必要不可欠であることが分かり、結合はリボヌクレアーゼからの保護を提供しなかった。
【０００９】
さらに、細胞内におけるｅＩＦ−５Ａの枯渇が、核内に特定のｍＲＮＡの有意な堆積をもたらし、ｅＩＦ−５Ａが、特定のクラスのｍＲＮＡを核から細胞質へと輸送する役割を担っている可能性があることを示唆している。Ｌｉｕ ＆ Ｔａｒｔａｋｏｆｆ（１９９７）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ，８，４２６ａ．Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｏ．２４７６，３７ｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ。核孔に関連する核内繊維にｅＩＦ−５Ａが堆積すること、そして一般の核外輸送受容体と相互作用することは、ｅＩＦ−５Ａが、ポリソームの一構成要素であるよりも、むしろ核細胞質間輸送タンパク質である可能性をさらに示すものである。Ｒｏｓｏｒｉｕｓ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１１２，２３６９−２３８０。
【００１０】
１９８９年に、初めてＳｍｉｔ−ＭｃＢｒｉｄｅらによってヒトからｅＩＦ−５ＡのｃＤＮＡがクローン化されて以来、酵母、ラット、ニワトリ胚、アルファルファ、トマトなど、種々の真核生物からｅＩＦ−５ＡのｃＤＮＡまたは遺伝子がクローン化されてきた。Ｓｍｉｔ−ＭｃＢｒｉｄｅ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１５７８−１５８３；Ｓｃｈｎｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１）（酵母）；Ｓａｎｏ，Ａ．（１９９５）ｉｎ Ｉｍａｈｏｒｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ），Ｐｏｌｙａｍｉｎｅｓ，Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ，ＶＮＵ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，８１−８８（ラット）；Ｒｉｎａｕｄｏ ＆ Ｐａｒｋ（１９９２）ＦＡＳＥＢ Ｊ．，６，Ａ４５３（ニワトリ胚）；Ｐａｙ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１７，９２７−９２９（アルファルファ）；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，１７５４１−１７５４９（トマト）。
【００１１】
多発性骨髄腫は、骨髄中における悪性形質細胞の増大、および溶骨性病変の存在を特徴とする、進行性および致命的な疾患である。多発性骨髄腫は、不治ではあるが治療可能な形質細胞の癌である。形質細胞は免疫系の重要な部分であり、感染や疾患との闘いを助ける免疫グロブリン（抗体）を産生する。多発性骨髄腫は、骨髄における過剰な数の異常な形質細胞、そして、インタクトなモノクローナル免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥ：「Ｍタンパク質」）、またはベンス・ジョーンズタンパク質（遊離のモノクローナルなＬ鎖）の、過剰産生によって特徴付けられる。低カルシウム血症、貧血、腎損傷、細菌感染に対する感受性の増加、正常な免疫グロブリンの産生低下が、多発性骨髄腫に共通する臨床症状である。また、多発性骨髄腫は、骨盤、脊椎、肋骨、および頭蓋骨におけるびまん性の骨粗しょう症を特徴とすることも多い。
【００１２】
多発性骨髄腫に対する従来の治療法には、化学療法、幹細胞移植、幹細胞移植を併用した大量化学療法、およびサルベージ療法がある。化学療法には、Ｔｈａｌｏｍｉｄ（登録商標）（サリドマイド）、ボルテゾミブ、Ａｒｅｄｉａ（登録商標）（パミドロネート）、ステロイド、およびＺｏｍｅｔａ（登録商標）（ゾレドロン酸）を用いる治療などがある。しかし、多くの化学療法薬は、骨髄、胃および腸の粘膜、毛包など、活発に分裂する非癌性細胞に毒性を有する。従って、化学療法は、血球数の減少、悪心、嘔吐、下痢、脱毛を引き起こす場合がある。
【００１３】
従来の化学療法、すなわち標準用量の化学療法は、多発性骨髄腫を罹患する患者に対して１次的にまたは初期的に通常行われる治療である。また、大量化学療法や幹細胞移植の準備として、患者が化学療法を受ける場合もある。移植前に腫瘍量を減少させるために、導入療法（幹細胞移植の前に行う従来の化学療法）が使用されることもある。特定の化学療法薬は、骨髄細胞に対する毒性がより低く、骨髄からより多くの幹細胞を得ることができるため、他の薬よりも導入療法に適している。導入療法に適した化学療法薬の例には、デキサメタゾン、サリドマイド／デキサメタゾン、ＶＡＤ（ビンクリスチン、Ａｄｒｉａｍｉｃｙｎ（登録商標）（ドキソルビシン）、およびデキサメタゾンの併用）、およびＤＶｄ（ペグ化リポソームドキソルビシン（Ｄｏｘｉｌ（登録商標）、Ｃａｅｌｙｘ（登録商標））、ビンクリスチン、および低用量デキサメサゾンの併用）が挙げられる。
【００１４】
多発性骨髄腫の標準的な治療は、メルファランをプレドニゾン（副腎皮質ステロイド剤）と併用することであり、５０％の奏功率を示している。残念ながら、メルファランはアルキル化剤であるため、導入治療には不向きである。副腎皮質ステロイド（特にデキサメサゾン）は、多発性骨髄腫の治療、特に化学療法に耐えられない高齢患者に対して、単独で使用される場合がある。デキサメサゾンも、単独あるいは他の薬剤と併用して、導入療法に使用される場合がある。ＶＡＤは最も広く使用される導入療法だが、ＤＶｄが導入療法において有効であることは最近明らかになった。ボルテゾミブは、多発性骨髄腫の治療に最近承認されたが、毒性が非常に高い。しかし、現存するいかなる治療法も、治癒に対する顕著な可能性を提供することはできない。つまり、多発性骨髄腫細胞を死滅させるための適切な治療法が、依然として必要である。本発明はその必要とされているものを提供する。
【発明の開示】
【００１５】
本発明は、癌細胞の成長を阻害する、および／または、癌細胞を死滅させる方法を提供する。また本発明は、癌細胞が転移する能力を阻害する、または遅らせる方法も提供する。癌の成長を阻害することは、腫瘍の縮小、腫瘍成長の低下を含み、また、腫瘍の完全な寛解を含む場合もある。癌はいかなる癌または腫瘍でもあり得るとし、大腸癌、結腸直腸腺癌、膀胱癌、子宮頸部腺癌、および肺癌を含むが、これらに限定されない。本発明の方法は、ｅＩＦ−５Ａの投与、好ましくはヒトｅＩＦ−５Ａ１を、該癌を罹患する患者（哺乳類、好ましくはヒト）に投与することに関連する。ｅＩＦ−５Ａ１が好ましいが、ｅＩＦ−５Ａ２アイソフォームを使用してもよい。ｅＩＦ−５Ａは、当該技術分野で既知である任意の適切な方法によって、それを必要とする患者に送達され得る。ｅＩＦ−５Ａは、生物学的に適切な媒体中のＤＮＡのような裸のＤＮＡとして、ＩＶや皮下注射を介して、あるいはその他の任意の生物学的に適切な送達機構を介して送達され得る。あるいは、ｅＩＦ−５Ａはアデノウイルスベクターのようなベクターの中で送達され得る。あるいは、ＤＮＡは、標的癌細胞へのＤＮＡの送達を提供する、リポソームやその他の任意の適切な「担体」の中で送達され得る。また、ｅＩＦ−５Ａは腫瘍の部位に直接送達され得る。当業者は、ｅＩＦ−５Ａの送達について、用量および治療投与計画の期間を決定することが可能であろう。
【００１６】
ｅＩＦ−５Ａ１およびｅＩＦ−５Ａ２は、０９／９０９，７９６（Ｕ．Ｓ．６，８６７，２３７）；１０／１４１，６４７（許可）；１０／２００，１４８；１０／２７７，９６９；１０／３８３，６１４；１０／７９２，８９３；１１／２８７，４６０；１０／８６１，９８０；１１／１３４，４４５；１１／１８４，９８２；１１／２９３，３９１；６０／７４９，６０４；６０／７９５，１６８などの先の同時係属出願において既知、かつ説明されており、参照することにより、それらのすべてを本明細書に援用するものとする。ｅＩＦ−５Ａはヒト、ラット、マウス、イヌ等の種間でよく保存されているため、任意のｅＩＦ−５Ａが本発明において使用され得る。好ましくは、ヒトｅＩＦ−５Ａがヒト等の治療に使用される。突然変異したｅＩＦ−５Ａｓが、ｅＩＦ−５Ａの発現を上方制御する、または増加することが可能であり、それにより癌の成長を阻害する、または癌細胞を死滅させることができる限り、ｅＩＦ−５ＡはｅＩＦ−５Ａの突然変異体も含む。
【００１７】
本発明は、細胞にｅＩＦ−５Ａ１をコード化するヌクレオチドを提供することにより、上記細胞内のＭＡＰＫ／ＳＡＰＫシグナル経路を活性化する方法も提供する。該ｅＩＦ−５Ａ１ポリヌクレオチドおよびｅＩＦ−５Ａ１タンパク質は上述の通りである。
【００１８】
本発明は、ｅＩＦ−５Ａをコード化するポリヌクレオチドを含む、骨髄腫細胞を死滅させるために有用な医薬組成物も提供する。該ｅＩＦ５Ａは、ｅＩＦ５Ａ１、ｅＩＦ５Ａ２、またはｅＩＦ５Ａ１の突然変異体であってもよい。好ましくは、該ｅＩＦ５ＡはｅＩＦ５Ａ１である。該組成物は、送達ビヒクルをさらに含んでもよい。該送達ビヒクルは、ベクター、プラスミド、リポソーム、またはデンドリマーであってもよいが、これらに限定されない。
【００１９】
本発明は、多発性骨髄腫を罹患する対象において多発性骨髄腫細胞を死滅させるための薬物を作るためのｅＩＦ５Ａ（好ましくはｅＩＦ５Ａ１）の使用も提供する。
【００２０】
本発明は、ｅＩＦ５Ａ１をコード化するポリヌクレオチドを含む組成物を骨髄腫細胞に投与することを含む、多発性骨髄腫細胞を死滅させる方法をさらに提供し、該組成物は多発性骨髄腫細胞を死滅させる。該ｅＩＦ５Ａ１は突然変異体であってもよく、該突然変異体は別のアミノ酸に変化した保存リジンを有し、上記突然変異体はハイプシン化されることができない。治療の方法において有用な組成物は本明細書に記載する通りである。
【００２１】
本発明は、多発性骨髄腫細胞を死滅させる方法をさらに提供し、ｅＩＦ−５Ａ１をコード化するポリヌクレオチドを含む組成物のほかに、ｅＩＦ−５Ａ１に対するｓｉＲＮＡを含む組成物が提供される。該ｓｉＲＮＡはｅＩＦ−５Ａ１の内因性発現を下方制御し、それによってＩＬ−６の発現を下方制御し、ひいては骨髄腫細胞内のアポトーシスを引き起こす。ｅＩＦ−５Ａ１ ｓｉＲＮＡを含む組成物は、静脈内投与されてもよく、または、プラスミド、ベクター、リポソーム、またはデンドリマーのような送達ビヒクルの中で投与されてもよい。
【００２２】
発明の詳細な説明
真核生物翻訳開始因子５Ａ１（ｅＩＦ５Ａ１）は、細胞増殖に関与するｍＲＮＡのサブセットの翻訳促進に関与する、核細胞質間輸送シャトルタンパク質として機能すると仮説を立てられてきた。しかし、ｅＩＦ５Ａ１は、アポトーシスの制御因子（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．；４５（１０）：３５６８−７６（２００４））として、また、ｐ５３の発現を制御することのできるアポトーシス促進性のタンパク質としても認識されている（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．；２７９：４９２５１−４９２５８；および本明細書の図２３）。腫瘍抑制タンパク質ｐ５３は、細胞周期停止を仲介する上で、またストレスやＤＮＡ損傷に応答するアポトーシスにおいて、中心的な役割を担っている。ｅＩＦ５Ａ１の過剰発現は、癌細胞株のｐ５３発現を上方制御することが可能であるが、（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．；２７９：４９２５１−４９２５８；および本明細書の図２３）、ｅＩＦ５Ａ１の過剰発現は、ｐ５３欠損細胞株にアポトーシスを誘導することも可能であり（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆｅｂ．９，２００６（決定保留））、ｅＩＦ５Ａ１の過剰発現が複数の機構によってアポトーシスを誘導することを示唆している。
【００２３】
ｅＩＦ５Ａ１の発現はアポトーシスと相関性を有する。トポイソメラーゼ阻害剤であるアクチノマイシンＤで処理した、正常な大腸線維芽細胞のウエスタンブロット（図１Ａ）は、アクチノマイシンＤ処理を開始してから２４時間後に、ｐ５３と並行してｅＩＦ５Ａ１タンパク質発現が上方制御されたことを実証している。一酸化窒素（ＮＯ）供与体であるＳＮＰへの暴露に起因するアポトーシス中のＲＫＯ細胞も、ｅＩＦ５Ａ１タンパク質発現を上方制御する（図１Ｂ）。ｅＩＦ５Ａ１のＲＮＡ転写レベルは、これらの条件下では増加せず、これは、ｅＩＦ５Ａ１タンパク質が、ｍＲＮＡの転写後制御の結果として堆積していることを示唆している（図１Ａおよび１Ｂ）。これらの結果は、ｅＩＦ５Ａ１が、遺伝毒性ストレスや一酸化窒素に起因するアポトーシスに関与する可能性を示唆するものである。
【００２４】
細胞周期停止やアポトーシスを誘導するＤＨＳおよびＤＨＨ阻害剤に関する報告や、細胞の成長を維持するにはハイプシン化されたｅＩＦ５Ａ１が必要であるに違いないという結論に一部基づいて、細胞増殖におけるｅＩＦ５Ａ１の必要性が長い間提案されてきた。しかし、ｓｉＲＮＡの使用によるｅＩＦ５Ａ１発現の特異的抑制は、細胞の成長に何の影響も与えなかったことが判明した。ＨＴ−２９細胞のｅＩＦ５Ａ１発現を９０％超抑制したことは、５日間にわたる細胞増殖に何の影響も与えなかった（図２Ａ〜Ｅ）。しかし、ＤＨＳ阻害剤であるＧＣ７は、これらの細胞の成長に絶大な影響を与えた（図２Ｃ）。これらの結果は、ｅＩＦ５Ａ１が細胞の成長に必要ではない可能性があることを示唆している。また、ｅＩＦ５Ａ１の抑制が、アクチノマイシンＤ誘導性の細胞毒性からＨＴ‐２９細胞を一部保護できたことは興味深く（図２Ｂ）、これは、遺伝毒性ストレスに起因するアポトーシスにｅＩＦ５Ａ１が関与することを、さらに支持するものである。
【００２５】
ｅＩＦ５Ａ１ ｓｉＲＮＡが、アポトーシスから細胞を保護する能力は、ｅＩＦ５Ａ１タンパク質抑制がｐ５３発現に与えた影響についての試験を促すことになった。ＲＫＯ細胞は、ストレス条件下以外では堆積しない機能的ｐ５３タンパク質を有する。ｓｉＲＮＡによるｅＩＦ５Ａ１の抑制は、アクチノマイシンＤ処理から２４時間後にｐ５３タンパク質の堆積を６９％阻害することが可能であり（図３Ａおよび３Ｂ）、これは遺伝毒性ストレス下でのｐ５３の適切な発現に、ｅＩＦ５Ａ１が必要であることを示唆している。異なる配列を有するｅＩＦ５Ａ１に対する第２のｓｉＲＮＡも、アクチノマイシンＤに反応してｐ５３の上方制御を防止することができ（図８Ｂ）、この効果がｓｉＲＮＡの非特異的な効果ではないことを示唆している。しかし、ｅＩＦ５Ａ１は、ＲＫＯ細胞（機能的ｐ５３を含む）およびＲＫＯ−Ｅ６（機能的ｐ５３を含まない、図８Ａ）の両方でアポトーシスを誘導することが可能であったため（図４Ａおよび４Ｂ）、ｅＩＦ５Ａ１がｐ５３から独立した機構によってもアポトーシスを誘導することができることを示唆している。
【００２６】
ｅＩＦ５Ａ１またはハイプシン修飾に必要な保存リジン（Ｋ）（５０位）において点突然変異を含むｅＩＦ５Ａ１｛ｅＩＦ５Ａ１（Ｋ５０Ａ）｝のいずれかを発現しているアデノウイルスコンストラクトを構築した。点突然変異はリジンがアラニン（Ａ）となる原因となった。ＨＴ‐２９細胞がいずれかのコンストラクトに感染することで、それらの細胞にアポトーシスを誘導し（図５Ｃおよび５Ｄおよび図６）、細胞のバイアビリティーを大きく減少した（図５Ｅ）。Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１またはＡｄ−ｅＩＦ５Ａ１（Ｋ５０Ａ）による感染の結果として、どのような形態のｅＩＦ５Ａ１が堆積していたかを判定するために、２次元ゲル電気泳動を使用した（図５Ｂ）。予想したとおり、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１（Ｋ５０Ａ）感染後に、非修飾ｅＩＦ５Ａ１が堆積した。Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１による感染は、非修飾およびデオキシハイプシン修飾ｅＩＦ５Ａ１の両方の堆積を著しく増加させる結果となり、ウイルスによって産生されたｅＩＦ５Ａ１タンパク質の大部分をハイプシン化するためには、ＤＨＳおよびＤＨＨの活性が不十分であることを示した（図５Ｂ）。これらの結果は、非修飾ｅＩＦ５Ａ１、そしておそらくはデオキシハイプシン修飾ｅＩＦ５Ａ１が、細胞のアポトーシスを引き起こす形態であることを強く示唆するものである。ハイプシン化ｅＩＦ５Ａ１もこの能力を有するか否かはまだ明らかではない。
【００２７】
ｅＩＦ５Ａ１の核細胞質間輸送機能が示唆されてきたが、ｅＩＦ５Ａ１は主として細胞質の中で発現すると報告されている。（Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．；２２５：３４８−３５６（１９９６ｂ））。核細胞質間輸送シャトルタンパク質は、核局在化も行うことが予想される。アポトーシス中のｅＩＦ５Ａ１の機能が発見されたため、アポトーシス中のｅＩＦ５Ａ１の局在変化についての研究を行った。ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αを用いた処理による細胞死受容体の活性化と、アクチノマイシンＤを用いた処理による遺伝毒性ストレスという、２つの異なる機構によってアポトーシスをＨＴ‐２９細胞に誘導した。間接免疫蛍光法によって、ｅＩＦ５Ａ１は未処理の成長中の細胞の細胞質内に局在することが明らかになった（図７）。しかし、アポトーシス刺激剤を用いた処理は、ｅＩＦ５Ａ１の動きを非常に迅速に刺激し、主に細胞質内に局在していたｅＩＦ５Ａ１が、主に核に局在するようになった（図７Ａおよび７Ｂ）。このｅＩＦ５Ａ１の局在における変化は、ＩＦＮγ／ＴＮＦ−α処理細胞では１０分以内（図７Ａ）、アクチノマイシンＤ処理細胞では９０分以内（図７Ｂ）と、非常に迅速に発生した。これらの結果は、細胞死受容体の活性化および遺伝毒性ストレスにより誘導されたアポトーシスの間、ｅＩＦ５Ａ１が核機能を有することを示唆している。
【００２８】
アポトーシスに関与しているのが、非修飾ｅＩＦ５Ａ１なのか、デオキシハイプシン修飾型ｅＩＦ５Ａ１なのか、あるいはハイプシン修飾型ｅＩＦ５Ａ１なのかを明確にするため、アポトーシス中に堆積するｅＩＦ５Ａ１の形態を２Ｄゲル電気泳動を用いて調査した。アクチノマイシンＤ（遺伝毒性ストレス）を用いた刺激によっても、Ｆａｓ（細胞死受容体経路）に対するアゴニスト抗体と一緒にインキューベーションすることによっても、ＨＴ−２９細胞においてアポトーシスの誘発が起こった。１〜２４時間までの異なる時点で細胞ライセートを収集し、２Ｄゲル電気泳動、およびｅＩＦ５Ａ抗体を用いたウエスタンブロットで分析した（図９）。文献に報告されるとおり、未処理の細胞においてｅＩＦ５Ａ１タンパク質は主にハイプシン化型で存在した。両方のアポトーシス誘発剤が、存在するデオキシハイプシン化型ｅＩＦ５Ａ１の増加を刺激した。処理から１時間後に増加し始めたが、処理から２４時間に停止した。非修飾ｅＩＦ５Ａ１の堆積も、処理から２時間後に観察された。これらの結果は、アポトーシスの制御に関与するデオキシハイプシン化および／または非修飾ｅＩＦ５Ａ１と一致していた。
【００２９】
ｅＩＦ５Ａ１、ｅＩＦ５Ａ１（Ｋ５０Ａ）（ｅＩＦ５Ａ１の突然変異体）、およびｅＩＦ５Ａ２が、アポトーシスを誘導する能力、および増殖を阻害する能力を、種々の癌細胞株において調査した。ｅＩＦ５Ａ１およびｅＩＦ５Ａ１（Ｋ５０Ａ）は両方とも、大腸癌細胞株ＨＴ−２９（図５、６および１０）と、膀胱癌細胞株ＨＴＢ−９（図１１）およびＨＴＢ−４（図１２）に、アポトーシスを誘導することができた。また、ｅＩＦ５Ａ２を発現するアデノウイルスによる感染は、膀胱癌細胞株ＨＴＢ−９（図１１）およびＨＴＢ−４（図１２）にアポトーシスを誘導することができた。Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１（Ｋ５０Ａ）、およびＡｄ−ｅＩＦ５Ａ２は、膀胱癌細胞株ＨＴＢ−４（図１３）、ＨＴＢ−９（図１４）、Ｊ８２ＨＴＢ−１（図１５）およびＵＭＵＣ−３（図１６）の成長を阻害することができた。これらウイルス性のコンストラクトは、ＨｅＬａ子宮頚部腺癌細胞（図１７）の成長を阻害することもできた。Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１（Ｋ５０Ａ）、およびＡｄ−ｅＩＦ５Ａ２の感染に反応したＰＡＲＰ切断により、ＨＴＢ−４細胞におけるアポトーシスも観察された（図１８）。ＰＡＲＰは、普通はＤＮＡの修復、ＤＮＡの安定化、およびその他の細胞事象に関与しているが、アポトーシス初期にカスパーゼファミリーのメンバーによって切断される。ＰＡＲＰのカスパーゼによる切断の検出は、アポトーシスを代表する特徴として示されてきた。Ｌａｚｅｂｎｉｋ Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３７１，３４６−３４７（１９９４）。これらの結果は、ｅＩＦ５Ａ１とｅＩＦ５Ａ２が、実際には重複する機能を有している可能性があることを示唆するものである。さらに、ｅＩＦ５Ａ１の突然変異型は、種々の細胞株において成長を停止し、アポトーシスを誘導することができた。野生型ｅＩＦ５Ａ１（およびｅＩＦ５Ａ２）のアポトーシス誘導能は、ＤＨＳおよびＤＨＨの制限的な活性のためにＡｄ−ｅＩＦ５Ａ１を細胞に導入した時に生じる（図５Ｂ）、デオキシハイプシン化および非修飾ｅＩＦ５Ａ１の堆積に関係している可能性がある。最近の報告は、外因性ｅＩＦ５Ａ１がハイプシン化型として細胞内で過剰発現するには、ＤＨＳおよびＤＨＨの両方が同一細胞内で過剰発現する必要があるとしている（Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．２００６，ＰＮＡＳ；１０３（１）：５１−５６）。これらの結果は、ＤＨＳおよびＤＨＨ阻害剤が細胞成長を阻害する能力は、細胞増殖に必要とされるハイプシン化ｅＩＦ５Ａ１の減少によるものではなく、細胞内で細胞周期停止および／またはアポトーシスをトリガーする、非修飾（ＤＨＳ阻害剤）あるいはデオキシハイプシン修飾型（ＤＨＨ阻害剤）ｅＩＦ５Ａ１の堆積によるものである可能性を示唆している。ＤＨＳは特定の細胞株において過剰発現されることが判明したこと（Ｃｌｅｍｅｎｔ ｅｔ ａｌ．２００６，ＦＥＢＳ Ｊ；２７３（６）：１１０２−１４）、およびＤＨＳは腫瘍転移における重要な増幅された遺伝子の組として認識されてきたこと（Ｒａｍａｓｗａｍｙ ｅｔ ａｌ．２００３，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ；３３，４９−５４．）は興味深い。この情報の解釈として、非修飾あるいはデオキシハイプシン修飾型ｅＩＦ５Ａ１の堆積（アポトーシスを起こすように細胞がトリガーされた時に堆積する。図９参照。）によってトリガーされるアポトーシスを避けるために、特定の癌細胞がＤＨＳを過剰発現するということが考えられる。ＤＨＳを過剰発現することにより、ｅＩＦ５Ａ１をハイプシン化した状態、つまり「安全な」形態を維持することによって、癌細胞は遺伝毒性ストレスやその他のストレスによるアポトーシスを減少できる可能性がある。
【００３０】
ｅＩＦ５Ａ１の過剰発現によって、どのシグナル経路が影響を受けているのかを解明するために、Ａ５４９肺癌細胞におけるＡｄ−ｅＩＦ５Ａ１またはＡｄ−ｅＩＦ５Ａ１（Ｋ５０Ａ）感染に反応した、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）／ストレス活性化タンパク質キナーゼ（ＳＡＰＫ）［ＭＡＰＫ／ＳＡＰＫ］経路の活性化を調査した。３つの主要なＭＡＰＫ経路は、ＥＲＫ ＭＡＰＫ経路、ｐ３８ ＭＡＰＫ経路、およびＪＮＫ ＳＡＰＫ経路である。ＥＲＫ ＭＡＰＫ経路は、主に上皮増殖因子（ＥＧＦ）などの成長ホルモンなどのマイトジェン刺激に反応してトリガーされ、種々の腫瘍の成長および生存を支持する。ｐ３８ ＭＡＰＫ経路は、細胞ストレス、ＵＶ光線、成長因子の使用中止、および炎症促進性サイトカインに反応して活性化される。リン酸化によりｐ３８を活性化することは、ｐ５３などの転写因子のリン酸化をもたらし、ひいてはｐ５３の活性または安定性を増加させる。ｐ３８の活性化は、アポトーシス促進性と抗アポトーシスの２つの経路、および炎症に関与している。ＪＮＫ／ＳＡＰＫ経路は、ＵＶ光線、ＤＮＡ損傷、炎症促進性サイトカインなどの細胞ストレスに対する反応を仲介し、ｃ−ｊｕｎのような転写因子のリン酸化および活性増加を引き起こす。ＪＮＫ経路の活性化は、成長、形質転換、アポトーシスなど、数多くの細胞応答をもたらすことができる。ＪＮＫ経路は、Ａ５４９細胞におけるＥＧＦ誘導性の成長の１次的なエフェクター経路であると思われる（Ｂｏｓｔ ｅｔ ａｌ．１９９７，ＪＢＣ；２７２：３３４２２−３３４２９）。Ａ５４９細胞をＡｄ−ｅＩＦ５Ａ１に感染させることは、これら３つの経路すべての活性化を誘発する。ＥＧＦを用いて３０分間刺激したＡ５４９細胞を、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１を増量しながら感染させることは、ＥＲＫおよびその下流標的であるｐ９０ＲＳＫのリン酸化／活性化の増加を引き起こしたが、非リン酸化ＥＲＫの量には変化は見られなかった（図２０）。Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１感染に反応して、リン酸化／活性化ｐ３８およびリン酸化／活性化ＪＮＫの、用量反応的な強い上方制御も観察された（図２０）。Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１感染の時間の経過とともに、ＥＲＫ、ｐ３８およびＪＮＫ経路の活性化が、感染後２４〜７２時間持続したことが明らかになった（図２１）。非ハイプシン化ｅＩＦ５Ａ１突然変異体であるＡｄ−ｅＩＦ５Ａ１（Ｋ５０Ａ）による感染に反応して、これらの経路の活性化において用量反応的な増加が見られた（図２２）。ＭＥＫ１阻害剤Ｕ１０２６を用いてＥＲＫの活性化を阻害することが、ＪＮＫの活性化をも阻害した（図２２）ということは興味深く、これは、ＥＲＫ活性化に反応してこれらの細胞内でＪＮＫが活性化されたことを裏付けるものである（Ｂｏｓｔ ｅｔ ａｌ．１９９７，ＪＢＣ；２７２：３３４２２−３３４２９）。反対に、ＭＥＫ１阻害剤は、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１またはＡｄ−ｅＩＦ５Ａ１（Ｋ５０Ａ）による感染に反応して一貫してｐ３８の活性化を増加し、ＥＲＫ経路の活性化がｅＩＦ５Ａ１に反応して、ｐ３８経路の活性化を負に制御することを示唆している（図２２）。
【００３１】
図３８は、ｅＩＦ−５Ａ１がＭＡＰＫ／ＳＡＰＫ経路およびＡ５４９肺癌細胞のアポトーシスに与える影響を示す仮説モデルを提供する。ｅＩＦ５Ａ１（野生型あるいはハイプシン化されることのできない突然変異体）（Ｋ５０Ａ）の過剰発現は、Ａ５４９細胞にアポトーシスを誘導する。ｅＩＦ５Ａ１の過剰発現は、ｐ３８、ＪＮＫ、およびＥＲＫなどのＭＡＰＫ／ＳＡＰＫ経路の増加も伴う。ｅＩＦ５Ａ１の過剰発現は、ｐ５３の安定性および活性の増加に関連するリン酸化型ｐ５３の増加など、ｐ５３タンパク質レベルの増加を誘発する。このｐ５３の増加は、ＭＥＫ／ＥＲＫ経路の活性およびｐ５３転写活性に依存する。しかし、ＭＥＫ／ＥＲＫ経路の阻害、そしてそれほど多くはないがＪＮＫ経路の阻害は、ｅＩＦ５Ａ１によって誘導されたアポトーシスを増強する。これらの結果は、癌細胞にアポトーシスを誘導するため、そして、抗癌剤のＭＥＫ阻害剤クラスの癌細胞死滅能を増加するために、ｅＩＦ５Ａ１を治療薬として使用できる可能性を示唆している。
【００３２】
Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１およびＡｄ−ｅＩＦ５Ａ１（Ｋ５０Ａ）が、ｐ５３の発現およびリン酸化に与える影響は、図２３で見ることができる。野生型および突然変異体ｅＩＦ５Ａ１の過剰発現は、用量反応的にｐ５３タンパク質の全体的な発現増加をもたらす（図２３）。セリン１５がリン酸化されたｐ５３の増加も、ｅＩＦ５Ａ１の両形態について観察された（図２３）。セリン４６がリン酸化されたｐ５３の増加はＡｄ−ｅＩＦ５Ａ１（Ｋ５０Ａ）について用量反応的に観察された。ｐ５３は、セリン１５においてＡＴＭ、ＡＴＲおよびｐ３８など幾つかのキナーゼによってリン酸化することが可能であり、この修飾は、ＭＤＭ２のｐ５３に対する結合能を減少してユビキネーションを標的とし、それによってｐ５３の堆積および機能活性を促進する。ｐ５３はセリン４６において、ＰＫＣｄｅｌｔａおよびｐ３８など種々のキナーゼによってリン酸化され、この修飾はｐ５３のアポトーシス促進プロモータに対する親和性を増加し、これはｐ５３誘導性アポトーシスにとって重要であると考えられる。
【００３３】
腫瘍の浸潤および転移は、複雑なプロセスである。そのためには腫瘍細胞が、付着する能力を備え、周辺の細胞外基質を分解し、２次的部位に移動して増殖し、そして最後には、成長の増加を維持するために血管新生を促進することが要求される。基底膜は、細胞外基質（ＥＣＭ）に近接するシートであり、すべての臓器を覆って、巨大分子および細胞に対するバリアの役目を果たしている。再構成ＥＣＭ（Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標））を含む８μｍ膜でトランスウェルを被膜し、走化性刺激に反応して、この膜を貫通して向こう側まで到達することのできる細胞を染色することにより、腫瘍細胞の侵襲性を測定できる。Ａ５４９肺癌細胞は侵襲性が高く、ＥＣＭの成分を消化することのできるゼラチナーゼであるマトリックスメタロプロテアーゼなどのタンパク質を分泌することができる。ｅＩＦ５Ａ１の過剰発現がＡ５４９細胞の侵襲性に与える影響を調査した。Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１またはＡｄ−ｅＩＦ５Ａ１（Ｋ５０Ａ）による感染が、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）で被膜したトランスウェルを通って浸潤した細胞数を有意に減少させた（図２４）。
【００３４】
こうして得られた結果は、腫瘍をｅＩＦ５Ａ１で処理することは治療効果がある可能性を示していた。そこで、マウスにおける実験的転移のモデルを使用した。実験ＩＩにおいて、侵襲性の高いマウスメラノーマ細胞株Ｂ１６Ｆ１０をマウスに注射することにより、実験的転移を開始した（第０日目）。ＬａｃＺ遺伝子（ＤＮＡ対照として）またはｅＩＦ５Ａ１をコード化するプラスミドＤＮＡを、２、４、７、１１、１６、２１、２６および３１日目に尾静脈に注射した。１×（３．３ｍｇ／ｋｇ）、０．１×（０．３ｍｇ／ｋｇ）、２×（６．６ｍｇ／ｋｇ）の、３つの異なるＤＮＡ濃度を使用した。マウスは瀕死状態となった時に屠殺し、肺を摘出して写真を撮影した（図２５）。ｅＩＦ５Ａ１をコード化するプラスミドＤＮＡでマウスを処理した時、腫瘍量における用量反応性の減少が観察された（図２５および２６）。１×の用量よりも２×の用量の方が効果が少ないように見えたが、０．１×用量と１×用量の間には、腫瘍量に有意な減少が観察された。腫瘍が巨視的に成長する能力は、新しい血管の形成（血管新生）に依存する。血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は、多くの腫瘍細胞によって分泌されるサイトカインであり、腫瘍の血管新生の促進における重要な因子である。実験ＩＩで単離された、Ｂ１６Ｆ１０を有する肺からの細胞ライセートを、ＶＥＧＦ発現について、ＥＬＩＳＡ法を用いて分析した（図２７）。ｅＩＦ５ＡプラスミドＤＮＡを与えたマウスのＶＥＧＦレベルにおいて、有意な用量反応性の減少が見られ、ｅＩＦ５Ａ１がＶＥＧＦを制御する可能性があることを示唆している。
【００３５】
実験ＩＩＩでは、尾静脈注射したＢ１６Ｆ１０細胞を用いた実験的転移のモデルを再び使用した。今回は、血清中ＤＮＡの半減期を延長し、プラスミドの肺腫瘍への取り込みを増加するために、プラスミドＤＮＡをＤＯＴＡＰと複合化した。７、１４および２１日目に、ＤＮＡ／ＤＯＴＡＰ複合体を注射した。マウスは瀕死状態となった時に屠殺し、肺を摘出して写真を撮影した（図２８）。ＬａｃＺプラスミドＤＮＡ／ＤＯＴＡＪＰ複合体を与えたマウスと比較すると、ｅＩＦ５Ａ１プラスミドＤＮＡ／ＤＯＴＡＰ複合体で処理したマウスの肺重量に、平均６０％の減少が見られた（図２９）。
【００３６】
ｅＩＦ５Ａ１処理がメラノーマ腫瘍にアポトーシスを誘導するかどうかを判定するために、Ｂ１６Ｆ０またはＢ１６Ｆ１０皮下腫瘍を有するマウスに、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１を腫瘍内注射した（実験ＩＶ）。４８時間後、腫瘍を切除し、パラフィンで包埋してから薄切した。薄切した組織をＴＵＮＥＬ染色することにより、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１が腫瘍細胞のアポトーシスを誘導したことが明らかになった（図３０）。実験Ｖは、アポトーシスを誘導するために腫瘍内に注射したＡｄ−ｅＩＦ５Ａ１の能力が、Ｂ１６Ｆ１０皮下腫瘍の成長を減少し、生存期間を延長するかどうかを判定するためにデザインされた。Ｂ１６Ｆ１０細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスの側腹部に皮下注射した。腫瘍が直径約８ｍｍに到達した時、Ａｄ−ＬａｃＺ、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１または緩衝液を腫瘍内に注射した。最初の３日間は毎日、それ以降は腫瘍の大きさが直径１５〜１６ｍｍを超えるまで１日置きにマウスに注射をし、その時点でマウスを屠殺した。キャリパーを用いて毎日腫瘍の大きさを計測し、腫瘍体積を推測するために使用した。マウスをＡｄ−ｅＩＦ５Ａ１で処理した時は、腫瘍成長の遅延が明らかに観察された（図３１）。緩衝液のみを注射したマウスは、治療開始から最長４〜６日間生存し、Ａｄ−ＬａｃＺのみを注射したマウスは、治療開始から４日間のみ生存した（図３２）。Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１を注射したマウスは、治療開始から少なくとも８日間、最長で２５日間生存し、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１を用いた治療が、腫瘍を有するマウスの生存期間を著しく改善することが可能であることを実証した。（図３２）。
【００３７】
従って、本発明は癌の成長を阻害する方法を提供する。また本発明は、癌細胞が転移する能力を阻害する、あるいは遅らせる方法も提供する。癌の成長を阻害することは、腫瘍の縮小、腫瘍成長の低下を含み、また、腫瘍の完全な寛解をも含む場合もある。癌の成長を阻害することは、癌細胞を死滅させることも含む。癌はいかなる癌または腫瘍でもあり得るとし、大腸癌、結腸直腸腺癌、膀胱癌、子宮頸部腺癌、および肺癌を含むが、これらに限定されない。
【００３８】
本発明の方法は、ｅＩＦ−５Ａをコード化するポリヌクレオチドの投与、好ましくはヒトｅＩＦ−５Ａ１の該癌を有する患者（哺乳類、好ましくはヒト）への投与、好ましくはｅＩＦ−５Ａ１受入番号ＮＭ００１９７０（図４４参照）の投与を含む。ｅＩＦ−５Ａ２アイソフォーム（受入番号ＮＭ０２０３９０。ただしｅＩＦ−５Ａ１が好ましい。）を使用してもよい。ｅＩＦ−５Ａは、当該技術分野で既知の任意の適切な方法で送達することができる。ｅＩＦ−５Ａは、生物学的に適切な媒体中のＤＮＡのような裸のＤＮＡとして、ＩＶや皮下注射を介して、あるいはその他の任意の生物学的に適切な送達機構を介して送達され得る。あるいは、ｅＩＦ−５Ａは、プラスミド、アデノウイルスベクターのようなベクター、または任意の適切な発現ベクターの中で送達され得る。
【００３９】
あるいは、上記ＤＮＡは、標的とする腫瘍または癌細胞へＤＮＡ（またはプラスミドまたは発現ベクター）の送達を提供する、リポソームやその他任意の適切な「担体」又は「ビヒクル」中で送達され得る。例えば合成ＤＮＡ送達システムの考察について、Ｌｕｏ，Ｄａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８，Ｊａｎｕａｒｙ ２０００，ｐｐ．３３−３７を参照のこと。本発明の発明者は、ｅＩＦ−５Ａ１は正常組織にとって有毒ではないと以前にも述べているが（参照することにより、そのすべてを本明細書に援用した、２００５年１１月２８日出願の、係属出願第１１／２９３，３９１号を参照のこと）、（ｅＩＦ５Ａポリヌクレオチド／プラスミド／発現ベクターの直接投与と比較して）送達システムが好ましい。好ましい送達システムは、有効量のｅＩＦ−５Ａを腫瘍または一群の癌細胞に提供し、また好ましくは標的送達を腫瘍または一群の癌細胞に提供する。よって、ｅＩＦ−５Ａヌクレオチド／プラスミド／発現ベクターを、リポソーム、デンドリマー、類似する無毒性のナノ粒子のような、ナノメートルサイズのビヒクルを介して送達することが好ましい。さらに、該ビヒクルは、有効量のｅＩＦ−５Ａヌクレオチド／プラスミド／発現ベクターを腫瘍または一群の癌細胞に送達する間に、好ましくはｅＩＦ−５Ａヌクレオチド／プラスミド／発現ベクターを、早急過ぎるクリアランスや免疫応答を引き起こすことから保護する。例示的なビヒクルは、ｅＩＦ−５Ａヌクレオチド／プラスミド／発現ベクターと会合した単純なナノ粒子から、特異的細胞受容体を標的とするために表面にリガンドを結合させたペグ化リポソームのような、より複雑なペグ化ビヒクルまで様々であってもよい。
【００４０】
リポソームおよびペグ化リポソームは当該技術分野において既知である。従来のリポソームにおいて、送達される分子（すなわち低分子量の薬剤、タンパク質、ヌクレオチドまたはプラスミド）は、リポソームの中心腔内に含まれる。当業者は、分子送達に有用な「ステルス」、標的化、および陽イオン性リポソームもあることを理解するであろう。例えば、Ｈｏｒｔｏｂａｇｙｉ，Ｇａｂｒｉｅｌ Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１９，Ｉｓｓｕｅ １４（Ｊｕｌｙ）２００１：３４２２−３４３３、およびＹｕ，Ｗｅｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２００４，３２（５）；ｅ４８を参照のこと。リポソームは、静脈内注射することができ、また、血流における循環時間が長くなるように、その表面をより親水性にするため（２重層にポリエチレングリコールを付加（「ペグ化」）することにより）に修飾することができる。これらは「ステルス」リポソームとして知られており、ドキソルビシンやミトキサントロンなど親水性（水溶性）の抗癌剤の担体として特に有用である。薬剤運搬リポソームの特異的結合特性を腫瘍細胞のような標的細胞にまで広げるために、抗体、タンパク質、ペプチド等の特異的分子がリポソームの表面に結合していてもよい。例えば、癌細胞に存在する受容体に対する抗体は、リポソームに癌細胞を標的とさせるために使用され得る。多発性骨髄腫を標的とする場合には、例えば葉酸、ＩＬ−６、またはトランスフェリンを、リポソームに多発性骨髄腫細胞を標的とさせるために使用してもよい。
【００４１】
デンドリマーもまた、当該技術分野において既知であり、好ましい送達ビヒクルを提供する。デンドリマーの考察について、例えば、Ｍａｒｊｏｒｏｓ，Ｉｓｔｖａｎ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ，「ＰＡＭＡＭ Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ−Ｂａｓｅｄ Ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ，」Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，Ｖｏｌ．７，Ｎｏ．２，２００６；５７２−５７９、およびＭａｊｏｒｏｓ，ＩｓｔｖａｎＪ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ，２００５．４８，５８９２−５８９９を参照のこと。
【００４２】
またｅＩＦ−５Ａは、腫瘍の部位に直接送達されてもよい。当業者は、ｅＩＦ−５Ａの送達に関して、用量および治療投与計画の期間を決定することが可能であろう。
【００４３】
本発明の別の実施態様は、多発性骨髄腫細胞において細胞死を誘導する方法を提供する。多発性骨髄腫は、骨病変および腫瘍の悪化を引き起こす、高レベルの炎症性サイトカインを産生する骨髄癌の一種である。サイトカインＩＬ−１ＢおよびＩＬ−６は骨髄腫細胞の成長因子の役割を果たす。
【００４４】
ｅＩＦ−５Ａ１をコード化するポリヌクレオチド（完全長コード領域）を含むアデノウイルスベクターコンストラクトを、多発性骨髄腫細胞株ＫＡＳ６／１細胞に投与した。ＫＡＳ６／１細胞株は、Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃで作成され、Ｗｅｓｔｅｎｄｏｒｆ，ＪＪ．，ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ（１９９６）１０，８６６−８７６において報告されている。細胞株は、侵襲性多発性骨髄腫を罹患する患者からの分離株から直接作製した。本発明の発明者は、ｅＩＦ−５Ａを含むアデノウイルスコンストラクトをＫＡＳ６／１細胞に投与すると、対照ベクターのみを用いて処理された細胞と比較して（図１で「ＣＴＬ」と表示）、死滅したあるいは死滅する細胞数が増加すること（より少ない生きた癌細胞を残す）（図４１で「ＷＴ」と表示）を示した。図４１参照。未処理の細胞の約２５％に比べて、Ｆａｃｔｏｒ５Ａ１で処理した癌細胞は約９０％が死滅した。従って、本発明の一実施形態は、ｅＩＦ−５Ａ１の発現を上方制御し、多発性骨髄腫細胞を死滅させるために、ｅＩＦ−５Ａ１をコード化するポリヌクレオチドを提供することにより骨髄腫細胞を死滅させる方法を提供する。
【００４５】
また、対照（「ＣＴＬ＋ＩＬ−６」と表示）およびｅＩＦ−５Ａコンストラクト（図４１において「ＷＴ＋ＩＬ−６」と表示）とともに、ＩＬ−６も投与した。ＩＬ−６は、骨髄腫細胞の成長因子の役割を果たすサイトカインである。結果は、たとえＩＬ−６をｅＩＦ−５Ａコンストラクトと同時投与しても、アポトーシスの増加を達成することができたことを示している。図４１参照。これは、Ｆａｃｔｏｒ５Ａ１が骨髄腫細胞を死滅させるだけでなく、ＩＬ−６の存在下において骨髄腫細胞を除去することも可能であることを示している。ＩＬ−６の存在下で、デキサメタゾンのような標準的治療薬を用いて骨髄腫細胞にアポトーシスを誘導することは、非常に難しいことが証明されているため、この発見は興味深い。
【００４６】
さらに、突然変異体ｅＩＦ−５Ａ（Ｋ５０Ａ）（５０位の保存リジンを別のアミノ酸に変更するため、ハイプシン化されることができない）を含むアデノウイルスコンストラクトも、単独投与（「ＭＵＴ」）またはＩＬ−６と併用投与した（「ＭＵＴ＋ＩＬ−６」）。結果は、ＩＬ−６の存在下においても、対照細胞と比較して、ｅＩＦ−５Ａ１の突然変異体もアポトーシスを増加させることができたことを示す。図４１を参照。従って、本発明の一実施形態は、ｅＩＦ−５Ａ１の突然変異体を投与することにより骨髄腫細胞を死滅させる方法を提供し、該突然変異体はハイプシン化されることができない。ｅＩＦ−５Ａ１の突然変異体は、骨髄腫細胞における細胞死を増加させる非ハイプシン化ｅＩＦ−５Ａ１の発現増加を引き起こす。
【００４７】
ＩＬ−６は骨髄腫細胞の成長因子としての役割を果たすため、ＩＬ−６の発現を下方制御することも、骨髄腫細胞を死滅させる方法を提供する。本発明の発明者は、ｅＩＦ−５Ａ１に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡコンストラクトについては図４３、４６Ａおよび４６Ｂ参照）が、内因性ｅＩＦ−５Ａ１の発現を下方制御するだけでなく、種々の炎症促進性サイトカインの発現も下方制御すると示した。よって、本発明の一実施形態は、ＩＬ−１Ｂの内因性発現を下方制御するためにアポトーシス特異的ｅＩＦ−５Ａに対するｓｉＲＮＡを投与することにより、骨髄腫細胞を死滅させる方法を提供し、それによってＩＬ−６の発現を下方制御し、ひいては骨髄腫細胞の成長因子としての役割を果たすＩＬ−６を減少させる。ＩＬ−６の発現を下方制御することにより、骨髄腫細胞の成長および生存を存続するために必要な、利用可能なＩＬ−６はより少なくなる。
【００４８】
別の実施形態において、ｅＩＦ−５Ａをコード化するポリヌクレオチドを、骨髄腫細胞のアポトーシス増加を提供するために、ｅＩＦ−５Ａに対するｓｉＲＮＡと併せて投与する。ｅＩＦ−５Ａ１をコード化するポリヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡが外因性ｅＩＦ−５Ａ１の発現を阻害しないように、好ましくはアデノウイルスベクターなどのベクター中で投与する。例えば、ｓｉＲＮＡは３’ＵＴＲを標的にするが、外因性ｅＩＦ５Ａ１をコード化するポリヌクレオチドは、好ましくは読み取り枠（ＯＲＦ）全体を含み、したがってｓｉＲＮＡによって標的とされる３’ＵＴＲを有しない。適切なｓｉＲＮＡコンストラクトは、１１／２８７，４６０；１１／１３４，４４５；１１／１８４，９８２；および１１／２９３，３９１などの同時係属出願において先に説明されており、参照することにより、そのすべてを本明細書に援用する。図４３、４６Ａおよび４６Ｂも参照のこと。ｅＩＦ−５Ａ１は骨髄腫細胞において発現し、細胞死を引き起こす。さらに、ｅＩＦ−５Ａ１ ｓｉＲＮＡは、ｅＩＦ−５Ａの内因性発現を減少させ、それによってＩＬ−６の発現を減少させ、ひいては骨髄腫細胞における細胞死を増加させる。本方法において、上述したｅＩＦ−５Ａの突然変異体もまたベクターコンストラクトに用いてもよい。
【００４９】
また、本発明は、多発性骨髄腫細胞を死滅させる併用療法をも提供する。ｅＩＦ５Ａ、好ましくはｅＩＦ５Ａ１をコード化するポリヌクレオチドを含む組成物は、標準的治療法と併せて投与されてもよい。ｅＩＦ５Ａ組成物は、標準的療法の前、途中、後に投与してもよい。ｅＩＦ５Ａは、医薬組成物として投与しても、または上述したように、送達ビヒクル内で投与してもよい。
【実施例】
【００５０】
実施例１：Ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験
薬品
ＤＨＳの阻害剤であるＮ１−グアニル−１，７−ジアミノヘプタン（ＧＣ７、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を濃度５０μＭで使用した。アクチノマイシンＤ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を０．５または１．０μｇ／ｍｌで使用した。ニトロプルシドナトリウムおよびデスフェリオキサミンをＳｉｇｍａ社より購入し、それぞれ濃度３ｍＭおよび５００μＭで使用した。ブレフェルジンＡもＳｉｇｍａ社から調達し、濃度４ｎＭで使用した。
【００５１】
細胞培養および処理
Ａｎｉｔａ Ａｎｔｅｓ氏（ニュージャージー医科歯科大学）のご好意により頂いたヒト大腸腺癌細胞株ＨＴ−２９を、細胞増殖およびｅＩＦ５Ａ局在化研究に使用した。ＨＴ‐２９細胞は、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、および１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を添加したＲＰＭＩ１６４０に維持した。その他の細胞株はすべてＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより入手した。ＣＣＤ１１２Ｃｏは、正常な大腸の繊維芽細胞株である。ＲＫＯは、野生型ｐ５３を含むヒト結腸直腸癌細胞株（ＣＲＬ−２５７７）である。ＲＫＯ−Ｅ６細胞株（ＣＲＬ−２５７８）はＲＫＯ細胞株に由来する。安定的に組み込まれたヒトパピローマウイルスＥ６癌遺伝子を含み、従ってかなりの機能性ｐ５３腫瘍抑制タンパク質が欠損している。ＲＫＯ、ＲＫＯ−Ｅ６、Ａ５４９および細胞株ＣＣＤ１１２Ｃｏは、２ｍＭのＬ−グルタミンと、１．５ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウム、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、および１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを含むように調製したＥａｒｌｅ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを含み、１０％のＦＢＳを添加したＭｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍで成長させた。細胞はＣＯ2を５％含む加湿環境において３７℃に維持した。
【００５２】
プラスミドのクローニングおよび構築
ＲＫＯ細胞から単離した総ＲＮＡから、製造者の付着細胞向けプロトコルに従ってＧｅｎＥｌｕｔｅ Ｍａｍｍａｌｉａｎ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ−Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ）を用いて、ヒトｅＩＦ５ＡをＲＴ−ＰＣＲ法によりクローン化した。使用したプライマーは、フォワードプライマー５’−ＣＧＡＧＴＴＧＧＡＡＴＣＧＡＡＧＣＣＴＣ−３’、リバースプライマー５’−ＧＧＴＴＣＡＧＡＧＧＡＴＣＡＣＴＧＣＴＧ−３’であった。得られた５３２塩基対の生成物を、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ （Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブクローニングして、配列決定した。得られたプラスミドを、フォワードプライマー５’−ＧＣＣＡＡＧＣＴＴＡＡＴＧＧＣＡＧＡＴＧＡＴＴＴＧＧ−３’、リバースプライマー５’−ＣＣＴＧＡＡＴＴＣＣＡＧＴＴＡＴＴＴＴＧＣＣＡＴＧＧ−３’を用いてＰＣＲのテンプレートとして使用し、ＰＣＲ生成物をｐＨＭ６（赤血球凝集素［ＨＡ］タグ付き、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）のＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩ部位にサブクローンし、ｐＨＭ６−ｅＩＦ５Ａベクターを生成した。ｅＩＦ５ＡのＣ末端切断コンストラクト（ｐＨＭ６−ｅＩＦ５ＡＡ３７）をＰＣＲ法により以下のプライマーを用いて生成した。フォワードプライマー：５’−ＧＣＣＡＡＧＣＴＴＡＡＴＧＧＣＡＧＡＴＧＡＴＴＴＧＧ−３’、リバースプライマー：５’−ＧＣＣＧＡＡＴＴＣＴＣＣＣＴＣＡＧＧＣＡＧＡＧＡＡＧ−３’。得られたＰＣＲ生成物をｐＨＭ６ベクターにサブクローンした。トランスフェクションを最適化するため、およびトランスフェクションがアポトーシスに与える影響を知るための対照として、ｐＨＭ６−ＬａｃＺベクター（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を使用した。
【００５３】
ノーザンブロット
ＲＫＯ細胞を６ウェルプレート上にコンフルエントになるよう成長させ、アクチノマイシンＤ１．０μｇ／ｍｌを用いて０、１、４、または８時間処理した。ＧｅｎＥｌｕｔｅ Ｍａｍｍａｌｉａｎ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ−Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ）を用いて総ＲＮＡを細胞から単離し、５μｇのＲＮＡを１．２％のアガロース／ホルムアルデヒドゲル上で分画した。確立された方法に従い、ｅＩＦ５Ａの３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）と相同である32Ｐ標識ｃＤＮＡで膜をプローブした。ノーザンブロットに用いたｅＩＦ５Ａの３’−ＵＴＲ ｃＤＮＡは、次のプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ法によりＲＫＯ細胞からクローン化した。フォワードプライマー：５’−ＧＡＧＧＡＡＴＴＣＧＣＴＧＴＴＧＣＡＡＴＣＡＡＧＧＣ−３’、リバースプライマー：５’−ＴＴＴＡＡＧＣＴＴＴＧＴＧＴＣＧＧＧＧＡＧＡＧＡＧＣ−３’。ノーザンブロットの負荷対照として使用したβ−アクチンｃＤＮＡを、次のプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ法によりクローン化した。フォワードプライマー：５’−ＧＡＴＧＡＴＡＴＣＧＣＣＧＣＧＣＴＣＧＴ−３’、リバースプライマー：５’−ＧＴＡＧＡＴＧＧＧＣＡＣＡＧＴＧＴＧＧＧＴＧ−３’。
【００５４】
プラスミドのトランスフェクションおよびアポトーシスの検出
製造者の推奨プロトコルに従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＲＫＯおよびＲＫＯ−Ｅ６細胞をプラスミドＤＮＡで一時的にトランスフェクトした。トランスフェクションから４８時間後、製造者のプロトコルに従ってＤＮＡ Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いて、末端デオキシリボヌクレオチジルトランスフェラーゼ仲介ｄＵＴＰ−ジゴキシゲニンニック末端標識法（ＴＵＮＥＬ）により、断片化ＤＮＡを含むアポトーシス細胞を検出した。蛍光顕微鏡による分析のため、細胞を８ウェルのカルチャースライドグラス上でトランスフェクトし、４％のホルムアルデヒドで固定した後に、ＴＵＮＥＬ法を用いて標識化し、Ｔａｙｌｏｒら（２００４）によって記述された方法に従って、Ｈｏｅｓｃｈｔ３３２５８で染色した。
【００５５】
ｓｉＲＮＡのトランスフェクション
ｓｉＲＮＡはすべてＤｈａｒｍａｃｏｎ社より入手した。ｅＩＦ５Ａ ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ（受入番号ＢＣ０８５０１５）を標的にするｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡは次の配列を有していた。センス鎖：５’−ＧＣＵＧＧＡＣＵＣＣＵＣＣＵＡＣＡＣＡｄＴｄＴ−３’、アンチセンス鎖：３’−ｄＴｄＴＣＧＡＣＣＵＧＡＧＧＡＧＧＡＵＧＵＧＵ−５’。ｅＩＦ５Ａに対する第２のｓｉＲＮＡ（５Ａ−２）は次の配列を有していた。センス鎖：５’−ＡＧＧＡＡＵＧＡＣＵＵＣＣＡＧＣＵＧＡｄＴｄＴ−３’、アンチセンス鎖：３’−ｄＴｄＴＵＣＣＵＵＡＣＵＧＡＡＧＧＵＣＧＡＣＵ−５’。使用した対照ｓｉＲＮＡは、ｅＩＦ５Ａ特異的ｓｉＲＮＡの逆の配列を有しており、いかなる既知であるヒト遺伝子生成物に対する同一性も示さなかった。対照ｓｉＲＮＡは次の配列を有していた。センス鎖：５’−ＡＣＡＣＡＵＣＣＵＣＣＵＣＡＧＧＵＣＧｄＴｄＴ−３’、アンチセンス鎖：３’−ｄＴｄＴＵＧＵＧＵＡＧＧＡＧＧＡＧＵＣＣＡＧＣ−５’。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を用いて細胞をｓｉＲＮＡ12でトランスフェクトし、増殖研究またはウエスタンブロットに使用した。
【００５６】
ウエスタンブロット
ウエスタンブロット用のタンパク質は、沸騰している溶解緩衝液［ＳＤＳ２％、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）］を用いて単離した。Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ Ａｃｉｄ Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ）を用いてタンパク質濃度を判定した。ウエスタンブロットするために、５μｇの総タンパク質を１２％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分画し、二フッ化ポリビニリデン膜に移した。使用した１次抗体は、抗ｅＩＦ５Ａ（ＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、マウスＩｇＧ）および、抗β−アクチン（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、マウスＩｇＭ）で、両方とも５％乳汁中１：２０，０００の希釈度であった。２次抗体は、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ、Ｓｉｇｍａ）に結合した抗マウスＩｇＧおよび抗マウスＩｇＭ−ＨＲＰ（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）であった。抗体‐タンパク質複合体は、増感化学発光法（ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて可視化した。ｅＩＦ５Ａ検出後、ＥＣＬ Ｐｌｕｓ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ検出システムの提供するプロトコルに従ってブロットをストリップに切断し、同等負荷を確認するために、抗β−アクチン抗体でプローブした。
【００５７】
ＭＡＰＫ／ＳＡＰＫ経路分析に使用したＡ５４９細胞のライセートのウエスタンブロットは、ＭＡＰＫ溶解緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ｐＨ７．４、２％ ＳＤＳ、１０％グリセロール）中で収集したライセートを用いて行った。ライセート１０μｇを１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、ＰＶＤＦ膜に移した。ＰＢＳ中の無脂肪５％脱脂乳により膜をブロックし、ＰＢＳで洗浄し、１：１０００の１次抗体を用いて、５％ＢＳＡ／ＰＢＳ−Ｔ中で振動を与えながら４℃で一晩インキュベートした。ＭＡＰＫ／ＳＡＰＫ抗体（Ｐ−ｐ３８、ｐ３８、Ｐ−ＪＮＫ、ＪＮＫ、Ｐ−ＥＲＫ、ＥＲＫ、ｐ９０ＲＳＫ）は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇより購入した。Ａ５４９の研究に使用したｐ５３抗体もＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇより入手し、同様の方法で用いた。
【００５８】
２Ｄゲル電気泳動
２Ｄゲル電気泳動のために、低温の溶解緩衝液（７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、３０ｍＭトリス、４％ＣＨＡＰＳ、プロテアーゼ阻害剤カクテル）中でＨＴ−２９細胞ライセートを採取して、超音波処理し、遠心分離によりデブリを除去した。Ｂｒａｄｆｏｒｄ法を用いてタンパク質濃度を判定した。製造者の指示に従ってＥｔｔａｎ ＩＰＧｐｈｏｒ Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｆｏｃｕｓｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、１次元等電点電気泳動を行った。再水和緩衝液（８Ｍの尿素、２％のＣＨＡＰＳ、０．２％のＤＴＴ，０．５％のｐＨ４〜７のＩＰＧ緩衝液、０．００２％のブロモフェノールブルー）の中で、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ ＤｒｙＳｔｒｉｐｓ（７ｃｍ ｐＨ ４〜７、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を細胞ライセートとともに室温で１２時間再水和した。５００Ｖで３０分、１０００Ｖで３０分、および５０００Ｖで１時間４０分、等電点電気泳動を行った。ＩＰＧストリップゲル上のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に移した。ｅＩＦ５Ａ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてウエスタンブロットを行った。
【００５９】
アデノウイルスの生成
ヒトｅＩＦ５Ａ、または、ハイプシン化を防ぐ単一の点突然変異（Ｋ５０→Ａ５０）を含むｅＩＦ５Ａ［ｅＩＦ５Ａ（Ｋ５０Ａ）］を発現するアデノウイルス（アデノウイルス５血清型、Ｅ１、Ｅ３−欠失）を、ＡｄＭａｘ（商標） Ｈｉ−ＩＱシステム（カナダ、トロントのＭｉｃｒｏｂｉｘ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ）を用いて構築した。ｅＩＦ５Ａ ｃＤＮＡ内に、ＰＣＲ法を用いて部位特異的突然変異を作製した。プラスミドＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＰＣＲ法でｅＩＦ５Ａ ｃＤＮＡを増幅し、アデノウイルスシャトルベクターｐＤＣ５１６（ｉｏ）のＳｍａＩ部位に連結した。ＰＣＲプライマーの配列は、フォワードプライマー５’−ＧＣＣＡＡＧＣＴＴＡＡＴＧＧＣＡＧＡＴＧＡＴＴＴＧＧ−３’、リバースプライマー５’−ＣＣＴＧＡＡＴＴＣＣＡＧＴＴＡＴＴＴＴＧＣＣＡＴＧＧ−３’であった。アデノウイルスゲノムのプラスミドベクターｐＢＨＧｆｒｔ（ｄｅｌ）Ｅ１，３ＦＬＰおよびシャトルベクターをＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａ中で増殖させ、Ｑｉａｇｅｎ ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｅｇａ Ｋｉｔを用いて精製した。それぞれ５μｇのアデノウイルスゲノムプラスミド ｐＢＨＧｆｒｔ（ｄｅｌ）Ｅ１、３ＦＬＰ、シャトルベクターｐＤＣ５１６（ｉｏ）−ｅＩＦ５Ａ、またはｐＤＣ５１６（ｉｏ）−ｅＩＦ５Ａ（Ｋ５０Ａ）を、Ｍｉｃｒｏｂｉｘ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．推奨のＣａＣｌ2法を用いて、６０ｍｍ培養皿内の６０〜８０％コンフルエントな２９３−ＩＱ細胞（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にトランスフェクトした。３７°Ｃで７〜１０日間培養した後プラークが現れ、得られたアデノウイルス粒子［Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ、およびＡｄ−ｅＩＦ５Ａ（Ｋ５０Ａ）］を２９３−ＩＱ細胞内で増殖した。純粋な、力値の高いアデノウイルス株を、Ｍｉｃｒｏｂｉｘ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．提供の製造者プロトコルに従って、ＣｓＣｌ勾配超遠心法を用いて調製した。ＬａｃＺを発現するアデノウイルスベクター（Ａｄ−ＬａｃＺ；血清型５、Ｅ１，Ｅ３−欠失）を、Ｑｂｉｏｇｅｎｅ（米国カリフォルニア州）より購入し、これらの実験における対照およびレポーターとして使用した。Ａｄ−ＬａｃＺアデノウイルスをＡｄ−ｅＩＦ５ＡおよびＡｄ−ｅＩＦ５Ａ（Ｋ５０Ａ）ウイルスと同様の方法で増幅および精製した。
【００６０】
アデノウイルス感染およびアネキシンＶ標識
１００ｍｍ組織培養プレート内に、ＨＴ−２９、ＨＴＢ−９、またはＨＴＢ−４細胞を、プレートあたり１×１０6細胞で播種し、翌日、５ｍｌのＲＰＭＩ１６４０＋２％ＦＢＳ中において、細胞あたり３０００感染単位でアデノウイルスに感染させた。４時間後、細胞にさらなる培地を追加し、ＦＢＳ濃度を１０％になるよう調製した。感染から２４、４８、または７２時間後、細胞をトリプシン処理により剥離し、洗浄してから製造者のプロトコル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に従ってＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣで染色した。フルオレセイン検出のための４８８ｎｍアルゴンレーザー光源及びフィルターを用いたフローサイメトリー（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｐｉｃｓ ＸＬ−ＭＣＬ）により細胞をソートし、ＷｉｎＭＤＩ２．８でデータを分析した。
【００６１】
ＨＴ‐２９細胞を、細胞あたり３０００感染単位を用いて感染させ、細胞あたり１５００感染単位でＡ５４９細胞を用いた実験を行った。
【００６２】
増殖アッセイ
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ｓｉＲＮＡでＨＴ‐２９細胞を９６ウェルプレート上でトランスフェクトした。ＸＴＴ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、増殖する細胞の代謝活性を測定した。ＤＮＡ合成を測定するためには、製造者のプロトコルに従ってＢｒｄＵ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いた。アデノウイルス感染後に実行したＸＴＴアッセイのために、９６ウェルプレート内に、ウェルあたり５０００個の細胞を播種した。翌日、Ａｄ−ｌａｃＺ、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１、およびＡｄ−ｅＩＦ５Ａ１（Ｋ５０Ａ）（Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１Ｍ）をそれぞれ用いて細胞を感染させ、未処理の細胞を負の対照とし、アクチノマイシンＤで処理した細胞を正の対照とした。ＸＴＴ基質を追加し、Ａ６９０ｎｍを基準としてＡ４７５ｎｍを測定した。
【００６３】
間接免疫蛍光法
ポリ−Ｌ−リジンを被膜したカバーガラス上でＨＴ‐２９細胞を培養した。サブコンフルエントな状態の細胞を、２００ 単位のインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて１６時間インキュベートした後、ＴＮＦ−α（１００ｎｇ／ｍｌ、Ｌｅｉｎｃｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で１０分〜８時間の異なる時間インキュベートした。あるいは、３０分から１６時間まで時間を増加させながら、１．０μｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤを用いて細胞を処理した。処理済の細胞を３％のホルムアルデヒド（メタノールを含まない；Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．）で２０分間固定し、ＰＢＳで５分間、２回洗浄し、１００ｍＭのグリシンを含むＰＢＳで５分間１回洗浄し、ＰＢＳ中の０．２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で４分間透過処理した。その後、標準プロトコルを用いて免疫蛍光検査のために細胞を標識化した。１次抗体は、抗−ｅＩＦ５Ａ（ＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、マウスＩｇＧ）を用いて、１：２５０の希釈度で１時間インキュベートした。２次抗体は、抗マウスＩｇＧ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で、希釈度１：２００で１時間使用した。抗体標識に続いて、Ｈｏｅｓｃｈｔ３３２５８で核を染色し、標識化した細胞を蛍光顕微鏡で観察した。
【００６４】
Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）細胞浸潤アッセイ
Ａ５４９細胞を、アデノウイルスを用いて細胞あたり１５００感染単位で感染させ、２４時間インキュベートした。トリプシンで細胞を剥離して、無血清培地で洗浄し、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標） Ｂａｓｅｍｅｎｔ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｍａｔｒｉｘ （ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で事前に被膜しておいたトランスウェル（Ｆａｌｃｏｎ ８．０μｍ セルカルチャーインサート）上に、ウェルあたり３０，０００個の細胞を無血清培地中に播種した。１０％のＦＢＳを含む培地を下のウェル（トランスウェルが乗っている２４ウェルプレートのウェル）に播種し、さらに細胞を２４時間インキュベートした。インキュベーション後、トランスウェルの上部チャンバから培地を除去し、トランスウェルを外して５００マイクロリットルのクリスタルバイオレットを含む２４ウェルプレートのウェル内に置いた。トランスウェルを色素の中で２０分間インキュベートしてから、ビーカーに入れた水にトランスウェルを何回も浸漬することにより洗浄した。あらかじめ濡らしておいた綿棒を用いてトランスウェルの上面から細胞をこすり取った。トランスウェルの底面まで移動した細胞を、光学顕微鏡を用いて観察し、写真を撮影し、領域ごとに移動した細胞数を数えた。図２４参照。
【００６５】
統計
統計分析にはスチューデントのｔ‐検定を用いた。信頼度９５％超（Ｐ＜０．０５）で有意性を判定した。
【００６６】
実施例２：Ｉｎ ｖｉｖｏ実験
マウスおよび腫瘍の確立
カナダのケベック州にあるＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒより、５〜７週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを購入した。実験開始前の１週間、マウスを馴化させた。Ｂ１６Ｆ１０マウスメラノーマ細胞をＡＴＣＣより購入し、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ内で培養した。細胞の単層をトリプシン処理し、１０％ＦＢＳ含有ＭＥＭで中性化した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、細胞の生存率をトリパンブルー染色によって判定した。実験的転移の実験（実験ＩＩおよびＩＩＩ）のため、Ｂ１６Ｆ１０細胞を６週齢マウスに尾静脈注射することにより、メラノーマ腫瘍を肺の中に確立した。ＰＢＳ中で、Ｂ１６Ｆ１０細胞を１×１０6生細胞／ｍｌまで希釈した。２００ｕｌの細胞を各マウスの尾静脈から注射した。皮下腫瘍実験（実験ＩＶおよびＶ）のために、５００，０００個のＢ１６Ｆ１０細胞を１０〜１４週齢のマウスの右側腹部に皮下注射してメラノーマ腫瘍を確立した。実験がすべて終了した時（マウスが瀕死状態となった時、または腫瘍が所定の大きさを超えた時）に、ＣＯ2吸入によりマウスを安楽死させた。
【００６７】
実施例３：実験ＩＩ
プラスミドＤＮＡの構築および精製
ＣｐＧジヌクレオチドを欠損するｐＣｐＧ−ｌａｃＺ発現ベクターを米国サンディエゴのＩｎｖｉｖｏＧｅｎより購入した。まずＮｃｏＩおよびＮｈｅＩでプラスミドを消化させ、３．１ｋｂのｐＣｐＧベクターバックボーンを単離し（ＬａｃＺコード化配列を除去）、ＨＡタグを含むｅＩＦ５Ａ１のＰＣＲで増幅したcＤＮＡと結合させて（ｐＣｐＧ−ＨＡ５Ａ１）、ＨＡタグ付きｅＩＦ５Ａ１ ｃＤＮＡを、ｐＣｐＧ−ｌａｃＺベクターにサブクローンした。ＰＣＲプライマーは次の通りであった。ｅＩＦ５Ａ１フォワード：ＨＡ−５Ａ１フォワード：５’−ＧＣＴＣＣＡＴＧＧＡＴＧＴＡＣＣＣＡＴＡＣＧＡＣＧＴＣＣＣ−３’、ｅＩＦ５Ａ１リバース：５’−ＣＧＣＧＣＴＡＧＣＣＡＧＴＴＡＴＴＴＴＧＣＣＡＴＣＧＣＣ−３’。２５μｇ／ｍｌのゼオシンを含むＬＢ培地または２ＸＹＴ培地で培養したＥ．ｃｏｌｉ ＧＴ１１５中で、ｐＣｐＧ−ｌａｃＺおよびｐＣｐＧ−ＨＡ５Ａ１を増幅した。プラスミドを抽出し、ＱＩＡＧＥＮ Ｅｎｄｏｆｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｇｉｇａ ｋｉｔを用いて精製した。波長２６０ｎｍのＵＶ吸収法およびアガロースゲル電気泳動法を用いてＤＮＡ濃度を測定した。
【００６８】
プラスミドＤＮＡの尾静脈注射（実験ＩＩ）
１×ＰＢＳ（体重に基づいて約２００μｌ）に溶解したプラスミドＤＮＡを、２、４、７、１１、１６、２１、２６、３１日目に、マウスの尾静脈に注射した。プラスミドＤＮＡの濃度は、２×（６．６ｍｇ／ｋｇ）に対して６６０ｎｇ／μｌ、１×（３．３ｍｇ／ｋｇ）に対して３３０ｎｇ／μｌ、０．１×（０．３３ｍｇ／ｋｇ）に対して３３ｎｇ／μｌであった。
【００６９】
体重および肺重量
尾静脈注射の前、または毎週月曜および金曜日に体重を測定した。マウスが瀕死状態（嗜眠性、呼吸困難）になった時にＣＯ2を用いて安楽死させ、肺を摘出して重量を測り、写真を撮ってから冷凍して−７０℃で保管した。図２５〜２７参照。
【００７０】
ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡ
採取した肺組織をＰＢＳで洗浄し、ドライアイスの中で冷凍し、−７０℃で保管した。粉砕した肺組織からタンパク質ライセートを単離した。５０μｇの肺組織タンパク質を使用して、Ｍｏｕｓｅ ＶＥＧＦ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｋｉｔ（米国ミネアポリス州、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を用いて、マウス肺中のＶＥＧＦ濃度を判定した。
【００７１】
実施例４：実験ＩＩＩ
プラスミドＤＮＡ／ＤＯＴＡＰ複合体の注射
６週齢のマウスの尾静脈に、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞（マウス１匹あたりＰＢＳ２００μｌ中に５０，０００個の細胞）、プラスミドＤＮＡ、および５０μｇのエンドトキシンフリーキットで精製したプラスミドＤＮＡを含むＤＮＡ担体複合体を注射し、８０μｇのＤＯＴＡＰを７、１４、および２１日目にマウスの尾静脈に注射した。２５日目にマウスを屠殺した。肺を摘出し、重量を測定して写真を撮影した。図２８〜２９参照。
【００７２】
実証例５：実験ＩＶ
アデノウイルスコンストラクトの注射およびＴＵＮＥＬ法
５００，０００個のＢ１６Ｆ０またはＢ１６Ｆ１０細胞を、１０週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの右側腹部に皮下注射した。腫瘍の大きさが直径約４ｍｍに到達した時（Ｂ１６細胞注射から１０〜１２日後）、ＰＢＳ５０ｕｌ中の１×１０9ｐｆｕ Ａｄ−５Ａ１を腫瘍内に注射した。４８時間後にマウスを屠殺し、腫瘍を摘出して固定し、パラフィンで包埋した。製造者のプロトコルに従ってＴＵＮＥＬ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、各細胞の腫瘍の種類ごとに（Ａｄ−５Ａ１−１およびＡｄ−５Ａ１−２）２ヶ所染色した。細胞の種類ごとに、ＴＵＮＥＬ反応の後ＴｄＴ酵素が残った、負の対照スライド（Ａｄ−５Ａ１陰性）を示した。図３０参照。
【００７３】
実施例６：実験Ｖ
腫瘍の確立
１４週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの右側腹部に、（ＰＢＳ１００ｕｌ中の）５００，０００個のＢ１６Ｆ１０細胞を皮下注射した。腫瘍の大きさが直径約８ｍｍに到達するまで、毎日腫瘍形成の経過を調べた。
【００７４】
アデノウイルスを用いた注射
腫瘍の直径が８ｍｍに到達した時に治療を開始した。Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１またはＡｄ−ＬａｃＺの１×１０9プラーク形成単位（ｐｆｕ）をマウスに注射した。注射は腫瘍の３つの部位に分散させた。最初の３日間は毎日マウスに注射をし、それ以降はマウスを屠殺するまで１日置きに注射した。腫瘍の大きさが１次元的に１５〜１６ｍｍを超えた時、マウスを屠殺した。緩衝液のみ与えた緩衝液マウスには、アデノウイルスを懸濁させた緩衝液のみを与えた（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．４、１０ ｍＭのＭｇＣｌ2、１０％グリセロール）。キャリパーを用いて毎日腫瘍の大きさを計測し、次の方程式を用いて腫瘍体積を算出した。
腫瘍体積（ｍｍ3）＝Ｌ＊Ｗ2＊０．５２
Ｌ＝長さ、Ｗ＝幅（常に短いほうの寸法）
図３１および３２参照。
【００７５】
実施例７
Ａ５４９肺癌細胞を、ＬａｃＺ（Ｌａｃ）またはｅＩＦ５Ａ１（５Ａ）のいずれかを発現するアデノウイルスに感染させた。感染から４時間後、培地をＤＭＳＯ、１０μＭのｐ３８阻害剤ＳＢ２０３５８０（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、１０μＭのＪＮＫ阻害剤ＩＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、１０μＭのＭＥＫ阻害剤Ｕ１０２６（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、または３０μＭのｐ５３阻害剤Ｐｉｆｉｔｈｒｉｎ−ａ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）のいずれかを含む培地と交換した。４８時間後、ＥＧＦで３０分間細胞を処理し、細胞ライセートを採取した。総ｐ５３（ｐ５３）、セリン１５位におけるリン酸化ｐ５３［Ｐ−ｐ５３（ｓｅｒ１５）］、またはセリン３７位におけるリン酸化ｐ５３［Ｐ−ｐ５３（ｓｅｒ３７）］に対する抗体のいずれかを用いて、ライセートにウエスタンブロットを行った。図３３参照。
【００７６】
図３３に示す結果は、感染から４８時間後までにＡｄ−ｅＩＦ５Ａ１がｐ５３の堆積を誘発することを表している。また、図は、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１が感染から４８時間後までにｐ５３のリン酸化を誘発すること、ｐ５３の堆積およびリン酸化がＭＥＫの阻害剤によって阻害されること、ｐ５３の堆積およびリン酸化がｐ５３活性の阻害剤によって阻害されること、ｅＩＦ５Ａ１は、ｐ５３のＭＥＫ依存リン酸化を刺激すること、そしてｅＩＦ５Ａ１が、ｐ５３のｐ５３依存性の堆積を刺激することを示している。
【００７７】
実施例８
Ａ５４９肺癌細胞を、ＬａｃＺ（Ａｄ−ＬａｃＺ）、またはｅＩＦ５Ａ１（Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１）のいずれかを発現するアデノウイルスに感染させた。４８時間後、総ＲＮＡを細胞から単離した。Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ法を用いて、ＧＡＰＤＨを参照の遺伝子としてｐ５３のレベルおよびｂａｘ ｍＲＮＡの転写産物レベルを判定した。ｐ５３プライマーは、５’−ＣＧＣＴＧＣＴＣＡＧＡＴＡＧＣＧＡＴＧＧＴＣ−３’（５’−プライマー）、および５’−ＣＴＴＣＴＴＴＧＧＣＴＧＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧ−３’（３’−プライマー）［これらのｐ５３プライマー配列は、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００４）．Ａ Ｎｏｖｅｌ ｅＩＦ５Ａ／ｃｏｍｐｌｅｘ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｓ ａ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｐ５３ ａｎｄ ｐ５３−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９ ４９２５１−４９２５８より入手した］であった。ｅＩＦ５Ａ１の過剰発現がｍＲＮＡレベルでｐ５３の堆積を誘発するが、ｂａｘへの影響は見られなかったことが分かる、図３４を参照のこと。
【００７８】
実施例９
Ａ５４９肺癌細胞を、ＬａｃＺ（Ａｄ−ＬａｃＺ）またはｅＩＦ５Ａ１（Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１）のいずれかを発現するアデノウイルスに感染させた。感染から４時間後、培地をＤＭＳＯ、１０μＭのＭＥＫ阻害剤Ｕ１０２６（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、または３０μＭのｐ５３阻害剤Ｐｉｆｉｔｈｒｉｎ−ａ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）のいずれかを含む培地と交換した。４８時間後、細胞から総ＲＮＡを単離した。Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ法を用いて、ＧＡＰＤＨを参照の遺伝子としてｐ５３転写産物レベルを判定した。ｐ５３プライマーは、５’−ＣＧＣＴＧＣＴＣＡＧＡＴＡＧＣＧＡＴＧＧＴＣ−３’ （５’−プライマー）、および５’−ＣＴＴＣＴＴＴＧＧＣＴＧＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧ−３’（３’−プライマー）［これらのｐ５３プライマー配列は、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００４）．Ａ Ｎｏｖｅｌ ｅＩＦ５Ａ／ｃｏｍｐｌｅｘ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｓ ａ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｐ５３ ａｎｄ ｐ５３−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９ ４９２５１−４９２５８より入手した］であった。ｐ５３のｅＩＦ５Ａ１依存性の堆積がｐ５３の転写活性に依存しており、ｅＩＦ５Ａ１に反応して生じるｐ５３タンパク質の上方制御が、ｐ５３ ｍＲＮＡの転写を増加させていることが分かる、図３５を参照のこと。
【００７９】
実施例１０
Ａ５４９肺癌細胞を、ＬａｃＺ（Ａｄ−ＬａｃＺ）またはｅＩＦ５Ａ１（Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１）のいずれかを発現するアデノウイルスに感染させた。感染から４時間後、培地を、ＤＭＳＯ、１０μＭのＭＥＫ阻害剤Ｕ１０２６（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、または３０μＭのｐ５３阻害剤Ｐｉｆｉｔｈｒｉｎ−ａ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）のいずれかを含む培地と交換した。４８時間後、細胞から総ＲＮＡを単離した。Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ法を用いて、ＧＡＰＤＨを参照の遺伝子としてｐ５３転写産物レベル濃度を判定した。ＴＮＦＲ１プライマーは、ＴＮＦＲ１−Ｆ ５’ＡＴＣＴＣＴＴＣＴＴＧＣＡＣＡＧＴＧＧ ３’、およびＴＮＦＲ１−Ｒ ５’ＣＡＡＴＧＧＡＧＴＡＧＡＧＣＴＴＧＧＡＣ ３’であった。ＴＮＦＲ１ ｍＲＮＡレベルがＡｄ−ｅＩＦ５Ａ１の感染によって上方制御されること、また、このＴＮＦＲ１ ｍＲＮＡの堆積が一部ＭＥＫに依存することを示す、図３６を参照のこと。このＴＮＦＲ１ ｍＲＮＡの堆積はｐ５３の転写活性に依存するものである。
【００８０】
実施例１１
Ａ５４９肺癌細胞を、ＬａｃＺ（Ｌａｃ）またはｅＩＦ５Ａ１（５Ａ）のいずれかを発現するアデノウイルスに感染させた。感染から４時間後、培地をＤＭＳＯ、１０μＭのｐ３８阻害剤ＳＢ２０３５８０（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、１０μＭのＪＮＫ阻害剤ＩＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、１０μＭのＭＥＫ阻害剤Ｕ１０２６（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、または３０μＭのｐ５３阻害剤Ｐｉｆｉｔｈｒｉｎ−ａ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）のいずれかを含む培地と交換した。４８時間後、細胞を採取し、Ａｎｎｅｘｉｎ／ＰＩ染色（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてアポトーシス中の細胞の割合を判定し、フローサイメトリーによる分析を行った。図３７参照。
【００８１】
図３７は、感染から４８時間後までにＡｄ−ｅＩＦ５Ａ１がアポトーシスを誘発すること、ＪＮＫの阻害がｅＩＦ５Ａ１によって誘導されたアポトーシスを増加させること、ＭＥＫの阻害がｅＩＦ５Ａ１によって誘導されたアポトーシスを増加させること、そして、ｐ５３の阻害がｅＩＦ５Ａ１によって誘導されたアポトーシスを減少させることを示している。
【００８２】
実施例１２
５０，０００個のＢ１６−Ｆ０メラノーマ細胞をマウスに皮下注射した。腫瘍の大きさが約５×５ｍｍ（６５ｍｍ3）に到達した時、腫瘍内注射を開始した。５０〜１００μｌのＰＢＳ／１０％グリセロール緩衝液で希釈した、１×１０9ｐｆｕのＡｄ−ｌａｃＺ（群２）、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１（群３）、またはＡｄ−ｅＩＦ５Ａ２（群４）あるいは緩衝液のみ（群１）を腫瘍内の３つの部位に１日置きに注射した。一日置きに腫瘍の大きさを測定し、腫瘍の大きさが体重の１０％に到達した時、マウスを屠殺した。図３９参照。
【００８３】
実施例１３
５０，０００個のＢ１６−Ｆ０メラノーマ細胞をマウスに皮下注射した。腫瘍の大きさが約５×５ｍｍ（６５ｍｍ3）に到達した時、腫瘍内注射を開始した。５０〜１００μｌのＰＢＳ／１０％グリセロール緩衝液で希釈した、１×１０9ｐｆｕのＡｄ−ｌａｃＺ（群２）、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１（群３）、またはＡｄ−ｅＩＦ５Ａ２（群４）あるいは緩衝液のみ（群１）のいずれかを、腫瘍内の３つの部位に、１日おきに注射した。腫瘍の大きさが体重の１０％に到達した時、マウスを屠殺した。図４０参照。
【００８４】
実施例１４：多発性骨髄腫
第０日目、ＫＡＳ６／１多発性骨髄腫細胞を、３０００ＩＦＵ／細胞の野生型または突然変異体のｅＩＦ５ａ（保存リジンが突然変異しているため、ハイプシン化されることができない）アデノウイルスベクターコンストラクトに４時間感染させた。感染後の培養培地に存在するＩＬ−６を含む、あるいは含まない、３つの複写物を設定した。また、対照（感染していない）のためにＫＡＳ細胞を播種した。
【００８５】
第２日目および４日目に、ＭＴＴおよびアネキシン／ＰＩアッセイを行った。上清を採取した。結果を図４１に示す。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】図１は、ｅＩＦ５Ａ１の発現が、遺伝毒性ストレスおよび一酸化窒素によって増加することを示す。Ａ）アクチノマイシンＤ０．５μｇ／ｍｌで０、１、４、８および２４時間処理した、正常な大腸繊維芽細胞における、ｅＩＦ５Ａの発現のノーザンブロット（上のパネル）およびウエスタンブロット（下のパネル）分析。ウエスタンブロットは、ｅＩＦ５Ａ、ｐ５３、およびβ−アクチンに対する抗体でプローブした。Ｂ）３ｍＭのニトロプルシドナトリウムで、０、２、４、８および２４時間処理したＲＫＯ細胞における、ｅＩＦ５Ａ１の発現のノーザンブロット（上のパネル）およびウエスタンブロット（下のパネル）分析。ウエスタンブロットは、ｅＩＦ５Ａおよびβ‐アクチンに対する抗体でプローブした。ＲＫＯ細胞は有意なレベルでｅＩＦ５Ａ２を発現しない。また、ｅＩＦ−５Ａ２のサイズは、ｅＩＦ−５Ａ１よりもアミノ酸１個長いだけであるが、ＳＤＳ ＰＡＧＥゲル上で高い位置を流れるため、ｅＩＦ５Ａ２が発現した場合、ｅＩＦ−５Ａ１とは別のバンドとして見えることになる。
【図２】図２は、ｅＩＦ５Ａ１発現の抑制が、細胞増殖に対して何の影響も与えないことを示す。Ａ）ｅＩＦ５Ａ１ ｓｉＲＮＡまたは対照ｓｉＲＮＡを用いたトランスフェクションから７２時間後にＨＴ−２９細胞から単離した細胞ライセートのウエスタンブロット。２つの独立した実験からのウエスタンブロットを示す。ブロットは、ｅＩＦ５Ａおよびβ−アクチンに対する抗体でプローブした。Ｂ）ｅＩＦ５Ａ１ ｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトした細胞の代謝活性を、ＸＴＴ細胞増殖アッセイを用いて測定した。対照ｓｉＲＮＡまたはｅＩＦ５Ａ１ ｓｉＲＮＡを用いたトランスフェクションの２４時間前に、ＨＴ−２９細胞を９６ウェルプレートに播種した。トランスフェクションから２４時間後、細胞を未処理のまま放置するか、または、代謝活性測定の前に、アクチノマイシンＤ（１．０μｇ／ｍｌ）を用いて４８時間処理した。値は、４通り行われた２つの実験からの平均値であり、１に設定された０時間対照のために得られた値まで正規化した。Ｃ）対照またはｅＩＦ５Ａ１ ｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトしたＨＴ−２９細胞の増殖能を、５０μＭのＧＣ７とともに７２時間インキュベートした細胞の増殖能と比較した。細胞増殖はＢｒｄＵ取り込みによって測定した。値は、ｎ＝４に対して平均値±ＳＥで、１に設定したＧＣ７（＋）血清サンプルの値に合わせて正規化した。アスタリスク（＊）は、対応のあるスチューデントのｔ検定（ｐ＜０．０１）により、有意に差があると思われた値を示す。対照ｓｉＲＮＡまたはｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡのどちらかを用いてトランスフェクトしたＨＴ−２９細胞のトランスフェクションの日（第０日目）からトランスフェクション後５日目までのＤ）ＸＴＴおよびＥ）ＢｒｄＵ取り込み細胞増殖アッセイ。第０日目の値は１に設定した。
【図３】図３は、ｅＩＦ５Ａ１が、アクチノマイシンＤに反応してｐ５３の発現を制御することを示す。ＲＫＯ細胞を、対照ｓｉＲＮＡ（Ｃ）またはｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡ（５Ａ−１）のいずれかを用いてトランスフェクトした。トランスフェクションから７２時間後、アクチノマイシンＤ０．５μｇ／ｍｌを用いて、０、４、８、または２４時間細胞を処理した。Ａ）ｅＩＦ５Ａ、ｐ５３、またはβ−アクチンに対する抗体を用いてブロッティングした細胞ライセートのウエスタンブロット。結果は３つの独立した実験を代表するものである。Ｂ）対応するアクチンバンドまで正規化したウエスタンブロットにおけるｐ５３の相対強度のプロット。値は最小値ｎ＝３に対して平均値±ＳＥ。
【図４】図４は、ヒトｅＩＦ５Ａ１の過剰発現が、ｐ５３から独立してアポトーシスを誘導することを示す。ＲＫＯ細胞（Ａ）またはＲＫＯ−Ｅ６細胞（Ｂ）を、ｐＨＭ６−ＬａｃＺ、ｐＨＭ６ ｅＩＦ５Ａ、またはｐＨＭ６−ｅＩＦ５Ａ△３７（Ｃ末端側で３７位のアミノ酸を切断）を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションから４８時間後、ＴＵＮＥＬ法を用いて細胞を固定し、標識化した。核は、Ｈｏｅｓｃｈｔ３３２５８で染色し、標識化した細胞を蛍光顕微鏡を用いて観察した。明るい緑色に染色された細胞を、アポトーシス性であるとスコア化した。Ｈｏｅｓｃｈｔで染色した核を総細胞数を決定するのに使用した。値はｎ＝４（Ａ）またはｎ＝３（Ｂ）についての平均値±ＳＥ。アスタリスク（＊）は、対応のあるスチューデントのｔ検定（ｐ＜０．０２）による、対照（ｐＨＭ６−ＬａｃＺ）からの有意差を示す。Ｃ）アクチノマイシンＤ０．５μｇ／ｍｌで処理してから０、４、８、および２４時間後に採取したＲＫＯおよびＲＫＯ−Ｅ６細胞ライセートのウエスタンブロット。ブロットは、ｐ５３およびβ−アクチンに対する抗体を用いてプローブした。
【図５】図５は、ｅＩＦ５Ａ１アデノウイルスコンストラクトが大腸癌細胞にアポトーシスを誘導することを示す。Ａ）Ａｄ−ＬａｃＺ（Ｌ）、ＡｄｅＩＦ５Ａ１（５Ａ）、またはＡｄ−ｅＩＦ５Ａ（Ｋ５０Ａ）（Ｋ５０Ａ）で感染させてから７２時間後にＨＴ−２９細胞から単離した、細胞ライセートのウエスタンブロット。Ｂ）ＧＣ７またはＤＦＯで７２時間処理した後、またはアデノウイルスコンストラクトに感染させてから７２時間後、ｅＩＦ５Ａに対する抗体を用いてウエスタンブロットを行った後、ＨＴ−２９細胞から単離した、細胞ライセートの２Ｄゲル電気泳動。ｅＩＦ５Ａを過剰発現するアデノウイルス感染細胞からのライセートから０．３μｇのタンパク質が分離されたことを除いては、７μｇのタンパク質が分離された。Ｃ）上のパネル：アデノウイルスコンストラクト感染から４８時間後のＨＴ−２９細胞のＴＵＮＥＬ染色。下のパネル：Ｈｏｅｃｈｓｔ染色した同じ領域内の細胞の核。すべての写真は４００倍の倍率で撮影した。結果は３つの独立した実験を代表するものである。Ｄ）アデノウイルスコンストラクト感染から４８時間後のＨＴ−２９細胞のアポトーシスの割合。値は、ｎ＝３に対して平均値±ＳＥ。Ｅ）アデノウイルスコンストラクト感染から７日後の、ＨＴ−２９細胞のＸＴＴ細胞増殖アッセイ。値は、ｎ＝４に対して平均値±ＳＥ。
【図６】図６は、ｅＩＦＡ１アデノウイルスコンストラクトに感染したＨＴ‐２９細胞のアネキシンＶおよびＰＩ染色を示す。Ａ）アデノウイルスコンストラクト感染から４８時間後のＨＴ‐２９細胞のアネキシン−ＦＩＴＣおよびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）標識のヒストグラム。Ｂ）アネキシンＶ標識およびフローサイトメトリー分析によって判定される、アデノウイルスコンストラクト感染後２４、４８、および７２時間後、またはアポトーシス誘導剤アクチノマイシンＤまたはブレフェルジンＡで処理した後の、ＨＴ−２９細胞アポトーシスの割合。値はｎ＝２に対して平均値±ＳＥ（事象数＞５０００）。
【図７】図７は、免疫蛍光法によるｅＩＦ５Ａ１の局在化を示す。ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α（Ａ）またはアクチノマイシンＤ（Ｂ）で刺激を与えたＨＴ‐２９細胞内におけるｅＩＦ５Ａタンパク質の細胞内局在を、間接免疫蛍光法によって判定した。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８を核の染色に使用した。Ａ）ＴＮＦ−αで０分［（−）ＴＮＦ−α］、１０分、または３０分間刺激する前に、ＨＴ‐２９細胞を未処理のまま放置するか、あるいはＩＦＮ−γで１６時間予備刺激した。上のパネル：ｅＩＦ５Ａ１の免疫蛍光検出。中央のパネル：Ｈｏｅｃｈｓｔ染色した同領域内にある細胞の核。下のパネル：合併したイメージ。Ｂ）ＨＴ‐２９細胞を未処理のまま放置するか、あるいはアクチノマイシンＤで０．５時間、１．５時間、または４時間処理した。上のパネル：ｅＩＦ５Ａ１の免疫蛍光検出。中央のパネル：Ｈｏｅｃｈｓｔ染色した同領域内にある細胞の核、下のパネル：合併したイメージ。すべての写真は４００倍の倍率で撮影した。結果は３つの独立した実験を代表するものである。
【図８】図８は、ｅＩＦ５Ａ１が、アクチノマイシンＤに反応してｐ５３の発現を制御することを示す。ＲＫＯ−Ｅ６細胞はｐ５３を発現しない。Ａ）ＲＫＯまたはＲＫＯ−Ｅ６細胞を、アクチノマイシンＤ０．５μｇ／ｍｌで１、４、８、または２４時間処理した。細胞ライセートを採取し、ウエスタンブロットを用いてｐ５３の発現について分析した。Ｂ）対照ｓｉＲＮＡ（Ｃ）、ｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡ（５Ａ−１）、またはｅＩＦ５Ａの異なる領域を標的とする第２のｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡ（５Ａ−２）のいずれかを用いて、ＲＫＯ細胞をトランスフェクトした。トランスフェクトから７２時間後、アクチノマイシンＤ０．５μｇ／ｍｌで０、４、８、または２４時間細胞を処理した。Ａ）ｅＩＦ５Ａ、ｐ５３、またはβ−アクチンに対する抗体でブロットした細胞ライセートのウエスタンブロット。結果は３つの独立した実験を代表するものである。
【図９】図９は、アポトーシスの間、デオキシハイプシン化したｅＩＦ５Ａ１が堆積することを示す。この図は、アクチノマイシンＤ（Ａ）または作動薬Ｆａｓ抗体（Ｂ）で、１〜２４時間処理してから、ｅＩＦ５Ａに対する抗体でウエスタンブロットした後、ＨＴ‐２９細胞から単離した細胞ライセートの２Ｄゲル電気泳動を提供する。
【図１０】図１０は、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１またはＡｄ−ｅＩＦ５Ａ１（Ｋ５０Ａ）｛Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１Ｍ）による感染が、ＨＴ−２９結腸直腸腺癌細胞にアポトーシスを誘導することを示す。この図は、アネキシンＶ標識およびフローサイトメトリー分析によって判定される、アデノウイルスコンストラクト感染、あるいはアポトーシス誘導剤アクチノマイシンＤまたはブレフェルジンＡ処理から２４、４８、および７２時間後の、ＨＴ−２９細胞アポトーシスの割合を提供する。値は、ｎ＝２に対して平均値±ＳＥ（事象数＞５０００）。
【図１１】図１１は、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１またはＡｄ−ｅＩＦ５Ａ２による感染が、ＨＴＢ−９膀胱癌細胞にアポトーシスを誘導することを示す。この図は、アネキシンＶ標識およびフローサイトメトリー分析によって判定される、アデノウイルスコンストラクト感染、あるいはアポトーシス誘導剤アクチノマイシンＤまたはブレフェルジンＡ処理から２４、４８、および７２時間後の、ＨＴＢ−９細胞アポトーシスの割合を提供する。値は、ｎ＝２に対して平均値±ＳＥ（事象数＞５０００）。
【図１２】図１２は、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１またはＡｄ−ｅＩＦ５Ａ２による感染が、ＨＴＢ−４膀胱癌細胞にアポトーシスを誘導することを示す。この図は、アネキシンＶ標識およびフローサイトメトリー分析によって判定される、アデノウイルスコンストラクト感染、あるいはアポトーシス誘導剤アクチノマイシンＤまたはブレフェルジンＡ処理から２４、４８、および７２時間後の、ＨＴＢ−４細胞アポトーシスの割合を提供する。値は、ｎ＝２に対して平均値±ＳＥ（事象数＞５０００）。
【図１３】図１３は、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１（Ｋ５０Ａ）｛Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１Ｍ｝、またはＡｄ−ｅＩＦ５Ａ２による感染が、ＨＴＢ−４膀胱癌細胞の成長を阻害することを示す。この図は、アデノウイルスコンストラクト感染から２４、４８、および７２時間後の、ＨＴＢ−４細胞のＸＴＴ細胞増殖アッセイの結果を提供する。値は、ｎ＝２に対して平均値±ＳＥ。
【図１４】図１４は、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１（Ｋ５０Ａ）｛Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１Ｍ｝、またはＡｄ−ｅＩＦ５Ａ２による感染がＨＴＢ−９膀胱癌細胞の成長を阻害することを示す。この図は、アデノウイルスコンストラクト感染から２４、４８、および７２時間後の、ＨＴＢ−９細胞のＸＴＴ細胞増殖アッセイの結果を提供する。値は、ｎ＝２に対して平均値±ＳＥ。
【図１５】図１５は、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１（Ｋ５０Ａ）｛Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１Ｍ｝、またはＡｄ−ｅＩＦ５Ａ２による感染が、ＨＴＢ−１膀胱癌細胞の成長を阻害することを示す。この図は、アデノウイルスコンストラクト感染から２４、４８、および７２時間後の、ＨＴＢ−１細胞のＸＴＴ細胞増殖アッセイの結果を提供する。値は、ｎ＝２に対して平均値±ＳＥ。
【図１６】図１６は、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１（Ｋ５０Ａ）｛Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１Ｍ｝、またはＡｄ−ｅＩＦ５Ａ２による感染が、ＵＭＵＣ−３膀胱癌細胞の成長を阻害することを示す。この図は、アデノウイルスコンストラクト感染から２４、４８、および７２時間後の、ＵＭＵＣ−３細胞のＸＴＴ細胞増殖アッセイの結果を提供する。値は、ｎ＝２に対して平均値±ＳＥ。
【図１７】図１７は、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１（Ｋ５０Ａ）｛Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１Ｍ｝、またはＡｄ−ｅＩＦ５Ａ２による感染が、ＨｅＬａ子宮頚部腺癌細胞の成長を阻害することを示す。この図は、アデノウイルスコンストラクト感染から２４、４８、および７２時間後の、ＨｅＬａ細胞のＸＴＴ細胞増殖アッセイの結果を提供する。値は、ｎ＝２に対して平均値±ＳＥ。
【図１８】図１８は、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１（Ｋ５０Ａ）（Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１Ｍ）、またはＡｄ−ｅＩＦ５Ａ２による感染が、ＨＴＢ−４細胞にＰＡＲＰ切断を誘発することを示す。この図は、アデノウイルスコンストラクト感染から４８時間または７２時間後に、ＨＴＢ−４細胞から単離された細胞ライセートを、ＰＡＲＰ、ｅＩＦ５Ａ、およびβ−アクチンに対する抗体を用いてウエスタンブロットした結果を示す。
【図１９】図１９は、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１（Ｋ５０Ａ）（Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１Ｍ）、またはＡｄ−ｅＩＦ５Ａ２による感染が、ＨＴＢ−１細胞にＰＡＲＰ切断を誘発しないことを示す。この図は、アデノウイルスコンストラクト感染から４８時間または７２時間後に、ＨＴＢ−１細胞から単離した細胞ライセートを、ＰＡＲＰ、ｅＩＦ５Ａ、およびβ−アクチンに対する抗体を用いてウエスタンブロットした結果を示す。
【図２０】図２０は、Ａ５４９肺癌細胞におけるｅＩＦ５Ａ１の過剰発現が、ＭＡＰＫ／ＳＡＰＫシグナル経路を活性化することを示す。Ａ５４９細胞は、感染効率（ＭＯＩ）を次第に高くしながらＡｄ−ｅＩＦ５Ａ１（５Ａ）に感染させた。比較のために、Ａｄ−ＬａｃＺ（Ｌａｃ）を用いて細胞を感染させた。感染から４８時間後、ＥＧＦで細胞を３０分間処理し、ウエスタンブロット分析のために細胞ライセートを採取した。
【図２１】図２１は、Ａ５４９肺癌細胞におけるｅＩＦ５Ａ１の過剰発現が、ＭＡＰＫ／ＳＡＰＫシグナル経路を活性化することを示す。Ａ５４９細胞は、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１（５Ａ）またはＡｄ−ＬａｃＺ（Ｌ）を用いて５０ＭＯＩで感染させた。感染から６、２４、４８、または７２時間後に、ＥＧＦで細胞を３０分間処理し、ウエスタンブロット分析のために細胞ライセートを採取した。
【図２２】図２２は、ハイプシン化されることのできないｅＩＦ５Ａ１の突然変異体の過剰発現が、ＭＡＰＫ／ＳＡＰＫシグナル経路を活性化することを示す。Ａ５４９細胞は、感染効率（ＭＯＩ）を次第に高めながらＡｄ−ｅＩＦ５Ａ１（Ｋ５０Ａ）（Ｍ）に感染させた。比較のために、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１（５Ａ）およびＡｄ−ＬａｃＺ（Ｌａｃ）を用いて細胞を感染させた。ＭＥＫ阻害剤Ｕ１０２６を用いて、あるいは用いずに細胞をインキュベートした。感染から４８時間後、ＥＧＦで細胞を３０分間処理し、ウエスタンブロット分析のために細胞ライセートを採取した。
【図２３】図２３は、Ａ５４９肺癌細胞におけるｅＩＦ５Ａ１または突然変異体ｅＩＦ５Ａ１（Ｋ５０Ａ）の過剰発現が、ｐ５３の発現を増加させることを示す。Ａ５４９細胞は感染効率（ＭＯＩ）を次第に高くしながらＡｄ−ｅＩＦ５Ａ１（５Ａ）またはＡｄ−ｅＩＦ５Ａ１（Ｋ５０Ａ）（Ｍ）を用いて感染させた。比較のために、Ａｄ−ＬａｃＺ（Ｌａｃ）に細胞を感染させた。ＭＥＫ阻害剤Ｕ１０２６を用いて、あるいは用いずに細胞をインキュベートした。感染から４８時間後、ＥＧＦで３０分間細胞を処理し、ウエスタンブロット分析のために細胞ライセートを採取した。
【図２４】図２４は、ｅＩＦ５Ａ１または突然変異体ｅＩＦ５Ａ１（Ｋ５０Ａ）の過剰発現は、Ａ５４９肺癌細胞がＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）細胞外基質に浸潤する能力を減少させることを示す。アデノウイルスコンストラクト感染から２４時間後、Ａ５４９細胞をＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）を塗布した無血清培地のトランスウェルに播種した。血清含有培地は、化学誘引物質として作用するように下のウェルに配置した。播種から２４時間後、トランスウェルの下部表面まで浸潤した細胞を、クリスタルバイオレットで染色し、光学顕微鏡下で細胞を数えることにより、領域あたりの平均細胞数を判定した。サンプルあたり最低６個の領域が数えられた。
【図２５】図２５は、実験ＩＩの結果を示す。Ｂ１６Ｆ１０を有するＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて、ｅＩＦ５Ａ１によって肺腫瘍量が有意に減少した。６週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの尾静脈に、２００，０００個のＢ１６Ｆ１０細胞を注射した。２、４、７、１１、１６、２１、２６および３１日目に、ＬａｃＺ遺伝子（ＤＮＡ対照として）またはｅＩＦ５Ａ１を有するプラスミドＤＮＡを尾静脈に注射した。１×（３．３ｍｇ／ｋｇ）、０．１×（０．３ｍｇ／ｋｇ）、２×（６．６ｍｇ／ｋｇ）の、３つの異なるＤＮＡ濃度を使用した。Ｂ１６Ｆ１０細胞の代わりにＰＢＳを与えたマウスを陰性対照として使用し、プラスミドＤＮＡの代わりにＰＢＳを注射したＢ１６Ｆ１０を有するマウスを陽性対照として使用した。マウスは瀕死状態となった時に屠殺し、肺を摘出して写真を撮影した。
【図２６】図２６は、実験ＩＩの結果を示す。Ｂ１６Ｆ１０を有するＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて、ｅＩＦ５Ａ１によって肺重量が有意に減少した。６週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの尾静脈に、２００，０００個のＢ１６Ｆ１０細胞を注射した。２、４、７、１１、１６、２１、２６および３１日目に、ＬａｃＺ遺伝子（ＤＮＡ対照として）またはｅＩＦ５Ａ１を有するプラスミドＤＮＡを尾静脈に注射した。１×（３．３ｍｇ／ｋｇ）、０．１×（０．３ｍｇ／ｋｇ）、２×（６．６ｍｇ／ｋｇ）の、３つの異なるＤＮＡ濃度を使用した。Ｂ１６Ｆ１０細胞の代わりにＰＢＳを与えたマウスを陰性対照として使用し、プラスミドＤＮＡの代わりにＰＢＳを注射したＢ１６Ｆ１０を有するマウスを陽性対照として使用した。マウスは瀕死状態となった時に屠殺し、肺を摘出して重量を測定した。
【図２７】図２７は、実験ＩＩの結果を示す。Ｂ１６Ｆ１０を有するＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて、ＶＥＧＦ発現がｅＩＦ５Ａ１によって有意に減少した。６週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの尾静脈に、２００，０００個のＢ１６Ｆ１０細胞を注射した。２、４、７、１１、１６、２１、２６および３１日目に、ＬａｃＺ遺伝子（ＤＮＡ対照として）またはｅＩＦ５Ａ１を有するプラスミドＤＮＡを尾静脈に注射した。１×（３．３ｍｇ／ｋｇ）、０．１×（０．３ｍｇ／ｋｇ）、２×（６．６ｍｇ／ｋｇ）の、３つの異なるＤＮＡ濃度を使用した。Ｂ１６Ｆ１０細胞の代わりにＰＢＳを与えたマウスを陰性対照として使用し、プラスミドＤＮＡの代わりにＰＢＳを注射したＢ１６Ｆ１０を有するマウスを陽性対照として使用した。マウスは瀕死状態となった時に屠殺し、肺を摘出して重量を測定した。肺重量が判明してからその肺を冷凍し、後にＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡに使用した。肺組織は溶解緩衝液中で粉砕し、ライセート中に存在するＶＥＧＦの量をＥＬＩＳＡ法によって測定した。
【図２８】図２８は、実験ＩＩＩの結果を示す。ＤＮＡをＤＯＴＡＰと複合化することにより、ｅＩＦ５Ａ１遺伝子療法の抗腫瘍効果が向上した。６週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの尾静脈に、５０，０００個のＢ１６Ｆ１０細胞を注射した（第０日目）。７，１４、および２１日目に尾静脈注射を行う前に、ＬａｃＺ遺伝子（ＤＮＡ対照として）またはｅＩＦ５Ａ１を有するプラスミドＤＮＡをＤＯＴＡＰと複合化した。プラスミドＤＮＡを含まないＤＯＴＡＰを注射した腫瘍の無いマウスを、ＤＯＴＡＰの効果の対照として使用した。マウスは２５日目に屠殺し、肺を摘出して写真を撮影した。
【図２９】図２９は、実験ＩＩＩの結果を示す。ＤＮＡをＤＯＴＡＰと複合化することにより、ｅＩＦ５Ａ１遺伝子療法の抗腫瘍効果が向上した。６週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの尾静脈に、５０，０００個のＢ１６Ｆ１０細胞を注射した（第０日目）。７，１４、および２１日目に尾静脈注射を行う前に、ＬａｃＺ遺伝子（ＤＮＡ対照として）またはｅＩＦ５Ａ１を有するプラスミドＤＮＡをＤＯＴＡＰと複合化した。プラスミドＤＮＡを含まないＤＯＴＡＰを注射した腫瘍の無いマウスを、ＤＯＴＡＰの効果の対照として使用した。マウスは２５日目に屠殺し、肺を摘出して重量を測定した。
【図３０】図３０は、実験ＩＶの結果を示す。Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１の注射はＢ１６Ｆ０およびＢ１６Ｆ１０腫瘍にアポトーシスを誘導する。５００，０００個のＢ１６Ｆ０またはＢ１６Ｆ１０細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右側腹部に皮下注射した。腫瘍の直径が約４ｍｍに到達した時、５０μｌのＰＢＳ中の１×１０9ｐｆｕ Ａｄ−５Ａ１を腫瘍に注射した（Ｂ１６細胞注射から１０〜１２日後）。マウスは４８時間後に屠殺し、腫瘍を切除して、固定し、パラフィンに包埋した。各細胞腫瘍の種類（Ａｄ−５Ａ１−１およびＡｄ−５Ａ１−２）に対して２ヶ所を、製造者のプロトコルに従ってＴＵＮＥＬ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて染色した。ＴＵＮＥＬ反応からＴｄＴ酵素が残った陰性対照のスライド（Ａｄ−５Ａ１陰性）を、各細胞の種類ごとに含ませた。
【図３１】図３１は、実験Ｖの結果を示す。Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１の注射により腫瘍成長が有意に遅延した。皮下にＢ１６−Ｆ１０を有するＣ５７ＢＬ／６に、１×１０9ｐｆｕのＡｄ−ｅＩＦ５Ａ１またはＡｄ−ＬａｃＺまたは等体積の緩衝液を注射した。腫瘍の直径が約８ｍｍに到達した時に治療を開始し、その日を「第０日目」に指定した。最初の３日間は毎日マウスに注射をし、それ以降はマウスを屠殺するまで１日置きに注射した。腫瘍の大きさが１次元的に１５〜１６ｍｍを超えた時、マウスを屠殺した。各群につきマウス３匹とした。群１のマウス（１−１、１−２、１−３）はＡｄ−ｅＩＦ５Ａ１で処理した。群２のマウス（２−１、２−２、２−３）にはＡｄ−ＬａｃＺを注射し、群３（３−１、３−２、３−３）のマウスには緩衝液のみを与えた。キャリパーを用いて毎日腫瘍の大きさを計測し、腫瘍体積を推測するために使用した。
【図３２】図３２は、実験Ｖの結果を示す。Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１の注射により生存期間が有意に伸びた。皮下にＢ１６−Ｆ１０を有するＣ５７ＢＬ／６に、１×１０9ｐｆｕのＡｄ−ｅＩＦ５Ａ１またはＡｄ−ＬａｃＺまたは等体積の緩衝液を注射した。腫瘍の直径が約８ｍｍに到達した時に治療を開始し、その日を「第０日目」に指定した。最初の３日間は毎日マウスに注射をし、それ以降はマウスを屠殺するまで１日置きに注射した。腫瘍の大きさが１次元的に１５〜１６ｍｍを超えた時、マウスを屠殺した。各群につきマウス３匹とした。群１のマウス（１−１、１−２、１−３）はＡｄ−ｅＩＦ５Ａ１で処理した。群２のマウス（２−１、２−２、２−３）にはＡｄ−ＬａｃＺを注射し、群３（３−１、３−２、３−３）のマウスには緩衝液のみを与えた。
【図３３】図３３は、ｅＩＦ−５Ａ１が、Ａ５４９肺癌細胞におけるｐ５３腫瘍抑制タンパク質の堆積およびリン酸化を増加することを示す。
【図３４】図３４は、ｅＩＦ−５Ａ１が、Ａ５４９肺癌細胞におけるｐ５３ ｍＲＮＡレベルを上昇させることを示す。
【図３５】図３５は、ｐ５３レベルの上昇は、Ａ５４９肺癌細胞におけるｐ５３の転写活性に依存することを示す。
【図３６】図３６は、ＴＮＦＲ１ ｍＲＮＡレベルは、Ａ５４９肺癌細胞においてｅＩＦ−５Ａ１に感染することにより上方制御されることを示す。
【図３７】図３７は、ｅＩＦ−５Ａ１が、Ａ５４９肺癌細胞におけるアポトーシスを誘導し、ＭＥＫ阻害剤の使用が、ｅＩＦ−５Ａ１によって誘導されたアポトーシス量を増加することを示す。
【図３８】図３８は、ｅＩＦ−５Ａ１の仮説モデルが、ＭＡＰＫ／ＳＡＰＫ経路およびＡ５４９肺癌細胞におけるアポトーシスに影響することを示す。
【図３９】図３９は、腫瘍成長の抑制において、ｅＩＦ−５Ａ１がｅＩＦ−５Ａ２より優れていることを示す（マウス異種移植モデル（Ｂ１６−ＦＯメラノーマ細胞））。
【図４０】図４０は、マウスの生存期間延長において、ｅＩＦ−５Ａ１がｅＩＦ−５Ａ２より優れていることを示す（マウス異種移植モデル（Ｂ１６−ＦＯメラノーマ細胞））。
【図４１】図４１は、ＩＬ−６を含む、あるいは含まない対照を用いて処理された細胞と比較すると、ｅＩＦ−５Ａが、死滅したあるいは死滅する細胞数を増加することを示す。
【図４２】図４２は、ｅＩＦ−５Ａ２の配列を提供する。
【図４３】図４３は、ｅＩＦ−５Ａ１ ｓｉＲＮＡの位置および配列を提供する。
【図４４】図４４は、ヒトｅＩＦ−５Ａ１およびヒトｅＩＦ−５Ａ２のヌクレオチドアラインメントを提供する。
【図４５】図４５は、ヒトｅＩＦ−５Ａ１およびヒトｅＩＦ−５Ａ２のアミノ酸アラインメントを提供する。
【図４６Ａ】図４６Ａは、ｅＩＦ−５Ａ１ ｓｉＲＮＡの位置および配列を提供する。
【図４６Ｂ】図４６Ｂは、ｅＩＦ−５Ａ１ ｓｉＲＮＡの位置および配列を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｅＩＦ５Ａをコード化するポリヌクレオチドを含む、骨髄腫細胞を死滅させるための組成物。
【請求項２】
前記ｅＩＦ５Ａは、ｅＩＦ５Ａ１、ｅＩＦ５Ａ２、またはｅＩＦ５Ａ１の突然変異体から成る群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ｅＩＦ５ＡはｅＩＦＡ１である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物は、送達ビヒクルをさらに含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記送達ビヒクルは、ベクター、プラスミド、リポソーム、またはデンドリマーから成る群から選択される、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記送達ビヒクルはベクターである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記送達ビヒクルはアデノウイルスベクターである、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記送達ビヒクルはリポソームである、請求項５に記載の組成物。
【請求項９】
前記送達ビヒクルはデンドリマーである、請求項５に記載の組成物。
【請求項１０】
多発性骨髄腫を罹患する対象において、多発性骨髄腫細胞を死滅させるための薬物を作製するためのｅＩＦＡの使用。
【請求項１１】
前記ｅＩＦ５ＡはｅＩＦ５Ａ１、ｅＩＦ５Ａ２、またはｅＩＦ５Ａ１の突然変異体であり、ｅＩＦ５Ａ１の前記突然変異体は、保存リジンをアラニンまたは他の任意のアミノ酸に変更しており、前記突然変異体はハイプシン化されることが不可能である、請求項１０に記載のｅＩＦ５Ａの使用。
【請求項１２】
多発性骨髄腫細胞を死滅させる方法であって、ｅＩＦ５Ａ１をコード化するポリヌクレオチドを含む組成物を前記骨髄腫細胞に投与するステップを含み、ここで、前記組成物は多発性骨髄腫細胞を死滅させる、前記方法。
【請求項１３】
前記ｅＩＦ５Ａ１は突然変異体であり、前記突然変異体は保存リジンをアラニンまたは他の任意のアミノ酸に変更しており、前記突然変異体はハイプシン化されることが不可能である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記組成物はベクターを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記ベクターはアデノウイルスベクターである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ｅＩＦ−５Ａ１に対するｓｉＲＮＡを投与するステップをさらに含み、ここで、前記ｓｉＲＮＡはｅＩＦ−５Ａ１の内因性発現を下方制御し、ここで、前記ｅＩＦ−５Ａ１の発現の下方制御はＩＬ−６の発現を下方制御し、さらにここで、前記ＩＬ−６の下方制御は多発性骨髄腫細胞を死滅させる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
多発性骨髄腫を罹患する対象において、多発性骨髄腫細胞にアポトーシスを誘導する方法であって、請求項３に記載の組成物を投与するステップを含み、ここで、前記組成物中の前記ｅＩＦ５Ａ１は、多発性骨髄腫細胞にアポトーシスを誘導する、前記方法。
【請求項１８】
前記組成物は静脈内に投与される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記組成物はリポソームをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記組成物はデンドリマーをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
多発性骨髄腫細胞を死滅させる方法であって、請求項３に記載の組成物を投与するステップと、慣用の多発性骨髄腫の治療薬をさらに投与するステップと、を含む前記方法。
【請求項１】
ｅＩＦ５Ａをコード化するポリヌクレオチドを含む、骨髄腫細胞を死滅させるための組成物。
【請求項２】
前記ｅＩＦ５Ａは、ｅＩＦ５Ａ１、ｅＩＦ５Ａ２、またはｅＩＦ５Ａ１の突然変異体から成る群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ｅＩＦ５ＡはｅＩＦＡ１である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物は、送達ビヒクルをさらに含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記送達ビヒクルは、ベクター、プラスミド、リポソーム、またはデンドリマーから成る群から選択される、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記送達ビヒクルはベクターである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記送達ビヒクルはアデノウイルスベクターである、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記送達ビヒクルはリポソームである、請求項５に記載の組成物。
【請求項９】
前記送達ビヒクルはデンドリマーである、請求項５に記載の組成物。
【請求項１０】
多発性骨髄腫を罹患する対象において、多発性骨髄腫細胞を死滅させるための薬物を作製するためのｅＩＦＡの使用。
【請求項１１】
前記ｅＩＦ５ＡはｅＩＦ５Ａ１、ｅＩＦ５Ａ２、またはｅＩＦ５Ａ１の突然変異体であり、ｅＩＦ５Ａ１の前記突然変異体は、保存リジンをアラニンまたは他の任意のアミノ酸に変更しており、前記突然変異体はハイプシン化されることが不可能である、請求項１０に記載のｅＩＦ５Ａの使用。
【請求項１２】
多発性骨髄腫細胞を死滅させる方法であって、ｅＩＦ５Ａ１をコード化するポリヌクレオチドを含む組成物を前記骨髄腫細胞に投与するステップを含み、ここで、前記組成物は多発性骨髄腫細胞を死滅させる、前記方法。
【請求項１３】
前記ｅＩＦ５Ａ１は突然変異体であり、前記突然変異体は保存リジンをアラニンまたは他の任意のアミノ酸に変更しており、前記突然変異体はハイプシン化されることが不可能である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記組成物はベクターを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記ベクターはアデノウイルスベクターである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ｅＩＦ−５Ａ１に対するｓｉＲＮＡを投与するステップをさらに含み、ここで、前記ｓｉＲＮＡはｅＩＦ−５Ａ１の内因性発現を下方制御し、ここで、前記ｅＩＦ−５Ａ１の発現の下方制御はＩＬ−６の発現を下方制御し、さらにここで、前記ＩＬ−６の下方制御は多発性骨髄腫細胞を死滅させる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
多発性骨髄腫を罹患する対象において、多発性骨髄腫細胞にアポトーシスを誘導する方法であって、請求項３に記載の組成物を投与するステップを含み、ここで、前記組成物中の前記ｅＩＦ５Ａ１は、多発性骨髄腫細胞にアポトーシスを誘導する、前記方法。
【請求項１８】
前記組成物は静脈内に投与される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記組成物はリポソームをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記組成物はデンドリマーをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
多発性骨髄腫細胞を死滅させる方法であって、請求項３に記載の組成物を投与するステップと、慣用の多発性骨髄腫の治療薬をさらに投与するステップと、を含む前記方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図４５】
【図４６Ａ】
【図４６Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図４５】
【図４６Ａ】
【図４６Ｂ】
【公表番号】特表２００９−５１９３５１（Ｐ２００９−５１９３５１Ａ）
【公表日】平成２１年５月１４日（２００９．５．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５４５９５３（Ｐ２００８−５４５９５３）
【出願日】平成１８年１２月１３日（２００６．１２．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０６１９９６
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０７０８２４
【国際公開日】平成１９年６月２１日（２００７．６．２１）
【出願人】（５０２４５８１３２）セネスコ テクノロジーズ，インコーポレイティド (16)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年５月１４日（２００９．５．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１２月１３日（２００６．１２．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０６１９９６
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０７０８２４
【国際公開日】平成１９年６月２１日（２００７．６．２１）
【出願人】（５０２４５８１３２）セネスコ テクノロジーズ，インコーポレイティド (16)
【Ｆターム（参考）】
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