多糖マトリックス及び金属ナノ粒子からなる三次元ナノ複合材料、並びにその調製及び使用
本発明においては、中性又はアニオン性多糖及び金属ナノ粒子が均一に分散し且つ安定化している枝分かれしたカチオン性多糖の多糖組成物からなるポリマーマトリックスにより形成された三次元構造の形としてのナノ複合材料が記載されている。適切なゲル化技術を用いるか又は適切な脱水によって、上記ナノ複合材料は、ヒドロゲルとしての水和形態又は非水和形態の異なる形をしている三次元マトリックスである。上記ナノ複合材料は、強力な抗菌活性の広域スペクトルを有するが、細胞毒性を示さない。細胞毒性がないことに加えて、金属粒子ナノスケール及びポリマー鎖上の生物学的シグナルの存在と関係がある特定の抗菌特性は、抗菌特性が備わっている新世代の生体材料の開発、並びに生物医学分野、医薬品分野及び食品分野における他の多くの用途に利用できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、中性又はアニオン性多糖と金属ナノ粒子が均一に分散し且つ安定化している枝分かれしたカチオン性多糖との多糖組成物からなる複合ポリマーマトリックスを含む三次元ナノ複合材料に関するものであり、前記枝分かれしたカチオン性多糖は、そのようにして金属系ナノ複合材料を形成している。更に、本発明は、前記三次元ナノ複合材料の調製と、生物医学分野、医薬品分野及び食品分野での使用とに関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、天然の多糖は、生体適合性ポリマーとして認識されており；そのようなものとして、それらは、生物医学分野での適用のため、例えば生物学的に活性のある化合物又は組織工学の細胞のキャリヤーとして、長い期間採用され、よく研究された材料である。医薬品業界と食品業界の両方において最も使用されるものの中でも、アルギネート及びキトサンは、それらの存在量、比較的低いコスト、高い生体適合性、及び含水量の高いヒドロゲルの形態として三次元マトリックスを適当な条件下で作る能力を理由に言及され得る。しかしながら、キトサンは、その水溶性の著しいｐＨ依存性やその水溶液中におけるアルギネートのようなアニオン性多糖との非混和性と関係のある適用制限をいくらか示しており、それは、該アニオン性多糖と共に、例えば組織工学等の分野における適用目的では使用できないコアセルベートを作る。キトサンは、それが細胞特異的シグナルを保有せず、それ故に生物活性に欠けるため、更なる制限をアルギネートと共有する。それらの理由のため、上述の制限を克服することのできるキトサン誘導体が、現在のところ研究開発されている。
【０００３】
近年では、様々なキトサン誘導体が、ポリマー鎖の化学修飾によって得られた。それらの修飾には、線状キトサン鎖を形成するＤ−グルコサミン単位のアミノ残基にかかわる反応が広く用いられる。特に、Ｎ−結合側鎖として糖単位（単糖及びオリゴ糖）を導入することにより、ｐＨを酸性値まで下げる必要も無く水溶性キトサン誘導体を得ることが可能となり、また、この方法では、結果として起こり得る水溶液の酸性度によるポリマー分解の問題をも回避する。
【０００４】
ＵＳ ４，４２４，３４６（Ｈａｌｌ，Ｌ．Ｄ．及びＹａｌｐａｎｉ，Ｍ．）では、それら誘導体の合成及びその非酸性水媒体中での水溶解度を初めて記載している。特に、ＵＳ ４，４２４，３４６は、ラクトースによるキトサン誘導体が、３〜５％より高い濃度の水溶液中で硬質ゲルを生じさせる一方、（特にＣａ、Ｃｒ、Ｚｎ塩化物、Ｋクロム酸塩、ホウ酸との）塩又は酸混合物及びそれらの組み合わせの中ではゲル化も沈澱もしないことを開示した。また、上述の特許は、他のオリゴ糖、即ちセロビオースにより誘導体化したキトサンが、水溶液中では本質的にゲルを形成しないものの、アルギネートと混合した場合には硬質ゲルを形成することに言及した。このゲル形成は、正のポリカチオン電荷と負のポリアニオン電荷間の強い相互作用が原因であり、系のコアセルベーション、さもなければ例えば細胞等の生体物質のマイクロカプセル化に使用する際に制限となるプロセスをもたらす。
【０００５】
特許出願ＷＯ２００７／１３５１１６（Ｐａｏｌｅｔｔｉ Ｓ．ｅｔ ａｌ．）は、コアセルベーションの問題を克服するためのアニオン性多糖とカチオン性多糖の混合物を含有するポリマー溶液の調製方法と、その生物医学分野における使用を記載している。
【０００６】
加えて、特許出願ＷＯ２００７／１３５１１４（Ｐａｏｌｅｔｔｉ Ｓ．ｅｔ ａｌ．）は、水和又は非水和の三次元構造体と、薬理学的に活性のある分子及び細胞をカプセルに包む目的に対して有用である、適切なゲル化剤によりゲル化された、上述のアニオン性多糖とカチオン性多糖のポリマー混合物からそれらを調製する方法とを記載している。
【０００７】
時節がら多糖への大きな興味と共に、ナノ技術に関連した非常に興味のある他の研究分野は、特定の金属ナノ粒子を含むナノ複合材料を調製するためのそれらの使用可能性についてである。実際、ナノ粒子を安定化させるため、金属粒子がポリマー鎖との相互作用により均一に分散しているナノ複合材料系を得ることを可能にする多糖溶液は、有利に使用される可能性がある。従って、多糖の役割は、その特定の特性を十分に引き出す可能性を予期することで、金属ナノ粒子の形成及び安定化に関係しており；実際、金属ナノ粒子は、特定の光学特性、触媒特性及び抗菌特性が備わっていることが知られている。事実、抗菌性材料の分野における銀、金、銅、亜鉛及びニッケル等の金属の使用は、特に皮膚の創傷を治療するための、市場に大きな影響を及ぼしている。Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ（登録商標）及びＣｏｎｖａｔｅｃ（登録商標）等の会社は、最近になって銀ナノ粒子の抗菌特性に基づく薬物を市場に出している。それら金属の周知な抗菌活性を例えばガーゼ、包帯、パッチの開発に利用するのに適切な多糖系ナノ複合材料によって、同様な適用が見出される可能性がある。後の製品は、広域スペクトル抗菌活性又は殺菌活性を持った含水量の高いゲルが与えられている可能性がある。実際、火傷及び潰瘍のような皮膚又は粘膜の病変を治療するための新しい治療の助けの必要性が依然として残っている。それらの病変は、現在採用されている抗生物質治療に対し非常に抵抗性がある場合が多く；加えて、それらはまた、例えば細胞増殖及び／又は適切な組織の水和を増強するといった組織修復のための生物学的効果を更に必要とする。三次元のヒドロゲル構造体は、とりわけ後の側面に特に有利な場合があり、細胞表現型に干渉せずに細胞の複製に適した環境を確保することができる。
【０００８】
その上、三次元の水和構造体を得る可能性はまた組織工学用途のためにも大変興味深く、ここでは、多糖に特有の生物活性特性を抗菌活性と組み合わせることが望ましい。
【０００９】
組織工学の分野では、人体に埋め込まれるべき生体材料上に抗菌被膜を作るため、大きな努力がなされており；この場合、ほとんどの危険因子は、抗菌薬それ自体の細胞毒性の可能性に関係している。例えば、整形外科の分野において、人工関節置換術の作業及び露出していない骨折の骨接合術は、手術感染に関する清潔手術の一種を表す（非特許文献１）。しかしながら、生体材料の宿主組織内への埋め込みは、細菌負荷が若干小さい場合でも感染の発症及び生存を促進することができる。手術前後の予防における進歩にもかかわらず、細菌感染及び真菌感染は今でも非常に一般的であり；これは、時間延長によるそれら微生物の整形外科用デバイスへの付着の危険性に原因する（非特許文献２）。それらのデータは、新世代の生体材料と関係がある代わりの抗菌薬を開発する重要性を裏付ける。
【００１０】
ＵＳ ７２５５８８１（Ｇｉｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．）は、上述の問題に対して可能性のある解決策を提供する。事実、その特許は、抗菌用途のため、蒸気相からの化学堆積及び物理堆積（「化学蒸着」ＣＶＤ、「物理蒸着」ＰＶＤ）並びに液相中での化学堆積及び物理堆積等の技術を介して様々な種類の支持体上に形成された銀系被膜を開示する。銀が堆積している多糖支持体に関しては、キトサン、アルギネート及びヒアルロン酸について言及している。それらの技術は、適切なマトリックス内に均一に分散した金属ナノ粒子の形成に向いているものではなく、連続的な表面銀（ナノ結晶、多結晶又は非晶質）層の形成に向けていることに注意する。その上、それらの堆積技術に必要とされる温度及び圧力の条件は、多糖や、その骨格の一部であることが望ましい可能性のある（ペプチド又はタンパク質のような）生物活性生体分子の安定性と適合するものではなく、生きている細胞にかかわる組織工学用途の場合には、なおさらそうである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】ＵＳ ４，４２４，３４６
【特許文献２】ＷＯ２００７／１３５１１６
【特許文献３】ＷＯ２００７／１３５１１４
【特許文献４】ＵＳ ７２５５８８１
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Tucci G. et al., Giornale Italiano di Ortopedia e Traumatologia, 2005; 31:121-129
【非特許文献２】Zimmerli W. et al., New England J. Med., 2004; 351(16):1645-54
【発明の概要】
【００１３】
本発明の第一の目的は、三次元ナノ複合材料系を提供することにあり、ここでは、サイズの制御された金属ナノ粒子が多糖マトリックス中に均一に分散しており、前記マトリックスはゲル状又は固体状であり、その特性は、生物医学分野における生物学的適用に特に適していることである。
【００１４】
更なる目的は、かかる三次元ナノ複合材料が、単純で経済的に都合のよい化学的アプローチにより、特には、限定されないものの、生体適合性で且つ生理活性のあるヒドロゲル及び脱水ヒドロゲルを生成することによって得られることである。
【００１５】
更なる目的は、市販の多糖を容易に用いることによりそれらの系を改良することにあり、該多糖は化学操作を受けず、該系の複雑な予備操作の必要もない。
【００１６】
上記目的を実現するため、発明者らは、好ましくは植物源又は細菌源から生じる中性又はアニオン性多糖と、枝分かれしたカチオン性多糖とを含む少なくとも２成分の組成物であって、後者の多糖は金属ナノ粒子を取り込むことが可能であり、上記中性又はアニオン性多糖は水和又は非水和の三次元固体マトリックス（例えば、様々な形態のヒドロゲル、ミクロスフェア、スカフォールド、繊維マトリックス）及び／又は表面／体積比が高いマトリックス（湿潤の又は脱水した膜及びフィルム）を形成することができる組成物に基づく適切な多糖系を開発した。このように、金属ナノ粒子を均一に取り込んでいるカチオン性分岐多糖により形成される系は、それ自体がナノ複合材料である。
【００１７】
従って、第一の態様において、本発明の目的は、少なくとも一種の中性又はアニオン性の（リオトロピック、サーモトロピック又はサーモ−リオトロピックの）多糖と、金属ナノ粒子が均一に分散し且つ安定化している少なくとも一種のカチオン性分岐多糖からなる金属系ナノ複合材料とからなるポリマーマトリックスを含む三次元ナノ複合材料にあり、ここで、上記中性又はアニオン性多糖は、中性又はアニオン性多糖それ自体の種類に応じた適切な物理的又は化学的ゲル化手段によりゲル化されている。
【００１８】
コアセルベートの形成を引き起こさないために、適切なｐＨ値及びイオン強度で作業することで、金属ナノ粒子含有カチオン性分岐多糖の溶液を中性又はアニオン性多糖溶液と混合することができた。次いで、適切なゲル化手段により、イオンチャンネル型又は温度転移型ゲルを形成する中性又は酸性多糖の能力を利用することによって、それらの中性又はアニオン性多糖と、枝分かれした塩基性多糖それ自体を介して均一に分散し且つ安定化している金属ナノ粒子を取り込んでいる枝分かれした塩基性多糖との混合物からなる、水和又は非水和の三次元マトリックスを得ることができた。
【００１９】
従って、第二の態様において、本発明の目的は、少なくとも一種のリオトロピック、サーモトロピック又はサーモ−リオトロピックの中性又はアニオン性多糖と、金属ナノ粒子が均一に分散し且つ安定化している少なくとも一種のカチオン性分岐多糖からなる金属系ナノ複合材料とからなるポリマーマトリックスを含む三次元ナノ複合材料の製造方法であって、前記三次元ナノ複合材料は、少なくとも一種のリオトロピック、サーモトロピック又はサーモ−リオトロピックの中性又はアニオン性多糖と、金属ナノ粒子を取り込んでいる少なくとも一種のカチオン性分岐多糖からなる金属系ナノ複合材料の水溶液から得られることを特徴とする製造方法であり、ここで、それらの水溶液は、イオン強度が少なくとも５０ｍＭで且つ３５０ｍＭ以下であり、ｐＨが少なくとも７であり、また、それらの水溶液は、リオトロピック、サーモトロピック又はサーモ−リオトロピックの中性又はアニオン性多糖のゲル化をもたらすことが可能な物理的又は化学的ゲル化手段によって処理される。それらの水溶液は、モル浸透圧濃度が２５０〜３００ｍＭの範囲にあることが好ましい。
【００２０】
よって、かかる製造方法により得られる三次元ナノ複合材料もまた本発明の目的である。
【００２１】
その上、本発明に従う三次元ナノ複合材料は、強力な広域スペクトル抗菌活性を有しているものの、細胞毒性効果がないことが分かった。
【００２２】
従って、本発明の更なる目的は、生物医学分野における、特には抗菌用途のための、それら三次元ナノ複合材料の使用である。実際、本発明の対象である三次元複合材料は、皮膚科学分野（例えば、血管代謝皮膚潰瘍）及び整形外科分野（例えば、骨人工関節用被膜）、歯科分野（歯周病原性細菌感染の治療）、心臓病分野、泌尿器科分野（ステント用被膜）、並びに一般的な手術治療分野における生体材料としての有用な適用を約束する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】その図は、ラクトースによるキトサン誘導体（Ｃ：以下、キトラック（Ｃｈｉｔｌａｃ）と称する：ＣＡＳ登録番号８５９４１−４３−１）に基づく銀ナノ粒子（ｎＡｇ）によって形成された金属系ナノ複合材料をアルギネート（Ａ）マトリックス中に含むヒドロゲル形態の三次元ナノ複合材料を示す（ＡＣ−ｎＡｇゲル）。その組成は、０．２％（ｗ／ｖ）キトラック、１．５％（ｗ／ｖ）アルギネート、０．５ｍＭのＡｇＮＯ３、０．２５ｍＭのＣ６Ｈ８Ｏ６、１０ｍＭのヘペス緩衝液、３０ｍＭのＣａＣＯ３、６０ｍＭのＧＤＬ（Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン）である。ヒドロゲルの調製を例８に記載する。
【図２】その図は、キトラック系金ナノ粒子（ｎＡｕ）によって形成される金属系ナノ複合材料をアルギネートマトリックス中に含むヒドロゲル形態の三次元ナノ複合材料を示す（ＡＣ−ｎＡｕゲル）。その組成は、０．２％（ｗ／ｖ）キトラック、１．５％（ｗ／ｖ）アルギネート、０．５ｍＭのＨＡｕＣｌ４、１０ｍＭのヘペス緩衝液、３０ｍＭのＣａＣＯ３、６０ｍＭのＧＤＬである。その調製を例９に記載する。
【図３】その図は、三次元ナノ複合材料ＡＣ−ｎＡｇゲルのミクロスフェアを示す（０．２％（ｗ／ｖ）キトラック、１．５％（ｗ／ｖ）アルギネート、０．５ｍＭのＡｇＮＯ３、０．２５ｍＭのＣ６Ｈ８Ｏ６、１０ｍＭのヘペス緩衝液、３０ｍＭのＣａＣＯ３、６０ｍＭのＧＤＬ）。その調製を例１３に記載する。
【図４】その図は、アルギネート−キトラックヒドロゲル形態の三次元ナノ複合材料（ＡＣゲル、例６、左側）に関し、アルギネート−キトラック−ｎＡｇヒドロゲル形態の三次元ナノ複合材料（ＡＣ−ｎＡｇゲル、例８、右側）と比較した、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ２５９２２の細菌増殖テストを示す。
【図５】その図は、三次元ナノ複合材料ＡＣ−ｎＡｇミクロスフェアを含有する懸濁液と２４０分間接触したＥ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ２５９２２の細菌コロニー計数テストを示す。ミクロスフェアの調製を例１３に記載する。そのコントロールは、２０％ミューラー・ヒントン培地での増殖によって表される（Ｔ０及び２４０ｍｉｎ）。
【図６】その図は、三次元ナノ複合材料アルギネート−キトラックヒドロゲル（ＡＣゲル、例６、左側）に関し、三次元ナノ複合材料アルギネート−キトラック−ｎＡｕヒドロゲル（ＡＣ−ｎＡｇゲル、例９、右側）と比較した、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ２５９２２の細菌増殖テストを示す。
【図７】その図は、接触による三次元ナノ複合材料ＡＣ−ｎＡｇゲル（例８、斜線）並びに３７℃の培地中での２４時間及び７２時間後の関連抽出物の、ＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）放出として評価される、線維芽細胞株（ＮＩＨ−３Ｔ３）に関する細胞毒性テストを示す。そのコントロールは、ｉ）接着細胞（コントロール、コンフルエント）、ｉｉ）銀ナノ粒子がない場合のアルギネート−キトラックゲルと接触した細胞（ＡＣゲル、例６、横線）、ｉｉｉ）銀ナノ粒子がない場合のアルギネート−キトラックゲルからの所定の時間（２４時間）材料と接触して保たれた液体培地（以下、「抽出物」と称する）と接触した細胞（ＡＣゲル抽出物、直交メッシュ）によって表される。
【図８】その図は、接触による三次元ナノ複合材料ＡＣ−ｎＡｕゲル（例９、ＡＣ−ｎＡｕ Ｃｏｎｔ．）並びに３７℃の培地中での２４時間及び７２時間後の関連抽出物（ＡＣ−ｎＡｕ Ｅｓｔ．）の、ＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）放出として評価される、骨芽細胞株（ＭＧ６３）に関する細胞毒性テスト（ＬＤＨ）を示す。そのコントロールは、接着細胞（接着）、金属ナノ粒子がない場合のアルギネート−キトラックゲルと接触した細胞（例６、ＡＣ Ｃｏｎｔ．）、金属ナノ粒子がない場合のアルギネート−キトラックゲルからの抽出物（ＡＣ Ｅｓｔ）、ＺｎＤＢＣを含むポリウレタンディスクと接触した細胞（ＰＵ、ＩＳＯ１０９９３−５に従う接触系のポジティブコントロール）、Ｔｒｉｔｏｎ溶液での細胞（抽出物のポジティブコントロール）によって表される。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
定義
三次元構造体：その定義は、本願の目的のため、変形を受けない場合に形状及び大きさを維持することが可能な、水和又は非水和の構造体を示す。
【００２５】
本発明に開示の三次元構造体は、以下詳細に説明されるポリカチオン性分岐多糖中において均一に且つ永久に分散している金属ナノ粒子によって形成された材料を含む中性又はアニオン性多糖マトリックスによって形成されるナノ複合材料である。よって、第一の例においては、「三次元ナノ複合材料」の定義は、本発明のナノ複合材料を示すのに使用される。
【００２６】
ヒドロゲル：一般に、「ヒドロゲル」の語は、変形を受けない場合に形状及び大きさを維持することが可能な、非常に水和している半固体の三次元構造体を示す。それらは、適切に架橋した多糖の半希釈溶液から得られる場合がある。
【００２７】
以下の説明において、「ナノ複合材料ヒドロゲル」はまた、先に定義したように、水和した場合の本発明の三次元ナノ複合材料構造体を示すのに使用できる。
【００２８】
ナノ複合材料：一般に、「ナノ複合材料」の語は、巨視的材料（マトリックス）を介したナノメートルサイズの粒子（充填材）からなる系を示す。本発明は、中性又はアニオン性多糖マトリックスにおけるナノ複合材料（例えば、枝分かれしたカチオン性多糖中で均一且つ永久に分散している金属ナノ粒子）の包含から生じる三次元ナノ複合材料であるが、ここで、この前者の材料は、主に「金属系ナノ複合材料」として示される。特に、金属系ナノ複合材料は、キトサンのアルジトール又はアルドン酸多糖誘導体による又は該誘導体中での金属イオンの還元によって形成された金属ナノ粒子で構成されている。よって、以下の説明においては、「金属系ナノ複合材料」の他、この材料に関連して、「金属ナノ粒子系ナノ複合材料」を用いる。
【００２９】
コロイド溶液（又はコロイド）：サイズが１〜１，０００ｎｍの粒子が連続溶媒中に分散している系である。
【００３０】
「インサイチューでの」ゲル化：ゲル化剤の制御された放出がある（例えば、アルギネートのＣａ２＋イオン）ゲル化方法である。これは、ゲル化剤がその後第二成分（例えば、グルコノ−δ−ラクトン、ＧＤＬ）を加えるときに放出される不活性化形態のゲル化剤（例えば、ＣａＣＯ３）を使用することによって達成される。
【００３１】
本発明に記載される三次元ナノ複合材料の目的及び利点は、本発明の非限定的な例として、三次元ナノ複合材料を調製する一部の例とそれらの抗菌活性及び細胞毒性を評価する生物学的特性評価を記載する以下の詳細な説明から、より一層理解されることになる。
【００３２】
説明
達成しようとする目的のため、金属ナノ粒子のナノスケールに関する特性を利用する多糖系ナノ複合材料系の調製及び特徴付けに関する側面が取り組まれている。
【００３３】
本発明によれば、三次元ナノ複合材料は、少なくとも一種のリオトロピック、サーモトロピック又はサーモ−リオトロピックの中性又はアニオン性多糖と、カチオン性分岐多糖中で均一に分散し且つ安定化している金属ナノ粒子を取り込んでいる少なくとも一種のカチオン性分岐多糖からなる金属系ナノ複合材料との組成物からなるポリマーマトリックスから形成される。枝分かれしたカチオン性多糖は、本発明に従う三次元ナノ複合材料における二重の機能を有しており：ｉ）一側面では、主として金属ナノ粒子を適切に取り込み安定化させる機能と、ｉｉ）他の側面では、追加として、三次元マトリックスが主に中性又はアニオン性多糖の適切なゲル化手段によりゲルを形成する能力によるものであるため、実質的に多糖（例えば、少なくとも一種のリオトロピック、サーモトロピック又はサーモ−リオトロピックの中性又はアニオン性多糖と少なくとも一種のカチオン性分岐多糖）の組成物であるマトリックスの形成に貢献する機能である。よって、かかる多糖の組成物は、一の可能性がある実施態様において２成分であり、中性又は酸性多糖と枝分かれしたカチオン性多糖とによって形成される。
【００３４】
本発明の目的に有用な中性又は酸性多糖は、ａ）アルギネート、ペクテート及びペクチネートよりなる群から選択される、リオトロピックゲルが形成可能な酸性多糖；ｂ）サーモトロピックゲルを生じることが可能な中性多糖（この場合、それらは、アガロース、スクレログルカン、シゾフィラン、及びカードランよりなる群から選択されるのが好ましい）；ｃ）サーモ−リオトロピックゲルを生じることが可能な酸性多糖（この場合、それらは、硫酸アガロース、ι−及びκ−カラギーナン、硫酸セルロース、ジェランガム、ラムサンガム、ウィーランガム（ウエランガムとも呼ぶ）、並びにキサンタンガムよりなる群から選択されるのが好ましい）である。
【００３５】
中性又は酸性多糖の平均分子量（ＭＷ）は、２，０００ｋＤａ以下とすることができ、好ましくは１００ｋＤａ〜１，０００ｋＤａであり、２００ｋＤａの平均分子量を用いるのが更に好ましい。
【００３６】
よく知られているように、それらの中性又はアニオン性多糖は、適切な条件下で三次元構造体（水和の場合、ゲル様又はヒドロゲル）を形成する特徴を有する。実際、ヒドロゲルの形成に関する側面は、実質的に、リオトロピック多糖のイオン溶液又はサーモトロピック多糖の冷却溶液と接触したときに中性又はアニオン性多糖がヒドロゲルをすぐに形成する能力に関係している。酸性のサーモ−リオトロピック多糖の場合、ゲル化手段は、物理的及び／又は化学的なものの双方／一方とすることができ、そのため、イオンでも適切な温度でもその両方でもよい。
【００３７】
一方、金属ナノ粒子の形成及び保有に関する側面は、実質的に、第二の多糖成分、即ち枝分かれしたカチオン性多糖に関係している。本発明の目的のため、キトサンのアジトール又はアルドン酸分岐誘導体があり、ここで、Ｄ−グルコサミン単位は、炭素原子Ｃ２上の−ＮＨ−官能基を用いて線状キトサン鎖結合を形成し、単糖又はオリゴ糖のアルジトール又はアルドン酸ポリオール残基は、互いに同一であるか又は異なっており、一般式（Ｉ）
【化１】
［式中：
Ｒは、−ＣＨ２−又は−ＣＯ−であり；
Ｒ１は、水素、又は単糖、又はオリゴ糖であり；
Ｒ２は、−ＯＨ又は−ＮＨＣＯＣＨ３である］によって表される。
【００３８】
代表する目的のため、キトサン分岐誘導体における単糖又はオリゴ糖のアルジトール又はアルドン酸ポリオール残基で置換されたＤ−グルコサミン単位は、一般式（ＩＩ）によって表され、ここで、「ｎ」は線状キトサン鎖を構成するＤ−グルコサミン単位の総数を指す：
【化２】
【００３９】
本発明の目的のため、好ましいキトサンの分岐誘導体において、Ｒ１が単糖である場合には、前記単糖が、ガラクトース、グルコース、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、及びＮ−アセチルガラクトサミンよりなる群から選択され、Ｒ１がオリゴ糖である場合には、前記オリゴ糖が、２個のグリコシド単位を含むことができる。
【００４０】
一般式（Ｉ）のアルジトール又はアルドン酸の単糖又はオリゴ糖残基は、１〜３個のグリコシド単位を含む単糖又はオリゴ糖であることが好ましく、更に好ましい態様によれば、それらアルジトール又はアルドン酸のポリオール残基は、２〜３個のグリコシド単位を含むオリゴ糖の残基であり、一層好ましくは、ラクトース、セロビオース、セロトリオース、マルトース、マルトトリオース、キトビオース、キトトリオース及びマンノビオース並びにそれらの対応するアルドン酸よりなる群から選択される。本発明の目的のため、最も好ましいキトサンのオリゴ糖誘導体は、ラクトースによる誘導体である（キトラック；ＣＡＳ登録番号８５９４１−４３−１）。
【００４１】
その上、金属ナノ粒子を均一に分散し且つ安定化させるため、一般式（Ｉ）の単糖又はオリゴ糖によるキトサンアミノ基の化学置換度は、少なくとも４０％であることが必要である。キトサンアミノ基の前記単糖又はオリゴ糖による置換度は、５０％〜８０％の範囲が好ましく、７０％であることが更に好ましい。
【００４２】
上述のオリゴ糖誘導体を得るために使用できるキトサンの平均分子量（以下、ＭＷと称する）は、１，５００ｋＤａ以下であり、４００ｋＤａ〜７００ｋＤａの範囲が好ましい。
【００４３】
キトサンの単糖又はオリゴ糖分岐誘導体からなるポリマーマトリックス中に組み込まれる金属ナノ粒子は、銀、金、白金、パラジウム、銅、亜鉛、ニッケル及びそれらの混合物から優先的に選択される金属から作られる。
【００４４】
キトサンの単糖又はオリゴ糖分岐誘導体からなるポリマーマトリックス中に含まれるナノ粒子は、サイズが５ｎｍ〜１５０の範囲であり、特には、制御された平均金属ナノ粒子サイズが３０〜５０ｎｍである。
【００４５】
それらのナノ粒子の本質的特徴は、イオン性を持つわずかな原子で作られたクラスターの残留する存在を除外しないものの、それらのナノ粒子が主として還元形態の金属であるということと、多糖マトリックス中での分散／安定化においてはキトサンそれ自体のアミノ基に近接した単糖又はオリゴ糖側鎖が関与するということである。
【００４６】
それらに縛られるものではないものの、カチオン性多糖マトリックスと金属との好ましい比は、コロイド溶液の形態での金属系ナノ複合材料にゆだねられるが、前記金属系ナノ複合材料はまた脱水フィルム又は粉末の形態とすることもでき、更には該材料それ自体の調製からの残留する対イオンを除去するために透析さえされてもよい。コロイド水溶液の形態での金属系ナノ複合材料においては、出発金属塩の濃度（モル濃度として表される）に対する多糖濃度（％ｗ／ｖとして表される）の比が、０．００２５〜２０であり、好ましくは０．２である。
【００４７】
従って、カチオン性多糖のグラム当たりに組み込まれることのできる金属の質量（ｍｇとして表される）は、３，０００ｍｇ／ｇ〜０．３ｍｇ／ｇとすることができ、優先的には多糖のグラム当たりに組み込まれる金属が５０ｍｇである。
【００４８】
本発明に従う三次元ナノ複合材料のかかる成分は、適切な条件下、外因性還元剤の存在又は不在下における塩基性多糖の水溶液を用いて調製できる。
【００４９】
本発明に従う三次元ナノ複合材料のこの成分を調製する方法は、
ａ）枝分かれしたカチオン性多糖の水溶液を２％（ｗ／ｖ）以下の濃度で調製する工程と；
ｂ）金属塩の水溶液を０．１ｍＭ〜２０ｍＭの濃度で調製する工程と；
ｃ）それら多糖の溶液にそれら金属塩の溶液を加え、金属ナノ粒子が均一に分散しているコロイド溶液を得るまで混合する工程と；
を少なくとも含む。
【００５０】
得られるコロイド溶液に還元剤を加えることは任意である。
【００５１】
枝分かれしたカチオン性多糖の存在下での金属ナノ粒子の形成は、例外的によく分散して安定化した金属ナノ粒子系を作製し、一般にナノメートルスケールに関連する利益を失うことに至る、予備形成金属ナノ粒子の大きな凝集クラスターを溶液中で生じる周知の傾向を回避する。
【００５２】
その一般的な特徴において、金属系ナノ複合材料の調製方法は、次のとおりである：単糖又はオリゴ糖によるキトサン分岐誘導体の水溶液を異なる濃度（２％（ｗ／ｖ）以下、好ましくは０．０５％（ｗ／ｖ）〜１％（ｗ／ｖ）、更に好ましくは０．２％）で調製する。次いで、金属の最終濃度を０．１ｍＭ〜２０ｍＭ、更に好ましくは１ｍＭ〜１４ｍＭ、一層好ましくは１ｍＭで得るために、その多糖溶液を、銀、金、白金、パラジウム、銅、亜鉛及びニッケルから選択され、好ましくは塩化物、過塩素酸塩及び硝酸塩から選択される金属塩（例えば、ＡｇＮＯ３、ＨＡｕＣｌ４、ＣｕＳＯ４、ＺｎＣｌ２、ＮｉＣｌ２）の溶液と混合する。アスコルビン酸、クエン酸ナトリウム、水素化ホウ素ナトリウム及びシアノ水素化ホウ素ナトリウムから選択されるのが好ましい適切な既知の還元剤を、金属状態のナノ粒子を得るために、該溶液へ任意に加えることができる。上記還元剤は、０．０５ｍＭ〜１０ｍＭの濃度で加えられ、該濃度は０．５ｍＭであるのが好ましい。
【００５３】
しかしながら、別のやり方として、他のポリマー系については、単糖又はオリゴ糖側鎖が本質的に金属イオンの還元剤として作用し、ポリマーマトリックス中に分散しているナノ粒子をインサイチューで形成することが可能であるため、還元剤がない場合でも、単糖又はオリゴ糖によるキトサン分岐誘導体と金属ナノ粒子とから形成される金属系ナノ複合材料を調製できることを見出した。この場合、金属ナノ粒子は、キトサン誘導体溶液を、選択された金属の塩溶液と適切な濃度で単に混合するだけで得られる。また、この場合、多糖及び金属塩の濃度は、先に報告したとおりである。
【００５４】
しかしながら、両方の場合では、キトサンの単糖又はオリゴ糖分岐誘導体上に存する窒素原子及び側部置換基の化学特性及び物理化学特性のため、金属イオンは、配位相互作用によって高分子と相互作用しており、一方、単糖又はオリゴ糖、例えばラクトースの側鎖の存在は、ナノ粒子が凝集しようとする自然な傾向を妨げるために効果的な立体障害を提供する。外因性還元剤又はキトサン分岐誘導体の単糖若しくはオリゴ糖鎖によって生じるその後のイオン還元は、多糖鎖によって安定化したナノ粒子の形成をもたらす。
【００５５】
両方の場合において、組み込まれ得る銀の質量と多糖の質量の割合は、先に報告したとおりであり、グラム当たりのｍｇとして報告される。
【００５６】
予想外にも、上述の中性又は酸性多糖、特にはアルギネートからなるポリマー成分と、一般式（Ｉ）のアルジトール又はアルドン酸ポリオールによるキトサンの分岐誘導体であって、金属ナノ粒子を備え、既に本質的にはナノ複合材料（例えば金属系ナノ複合材料）である塩基性多糖のポリマー成分とを水溶液中で混合すると、得られるナノ複合材料は、三次元マトリックスであるか又は安定なヒドロゲルであり、金属ナノ粒子の存在にもかかわらず、それらは本質的にコアセルベートでなく、該ナノ粒子はキトサンの分岐誘導体中に均一に分散したままであることが分かった。
【００５７】
実際、本発明に従うヒドロゲル又は三次元マトリックスの形成は、二つの成分（例えば、中性又は酸性多糖及び金属系ナノ複合材料）を水溶液中で混合することによって得られ、アニオン性又は中性多糖をゲル化することが可能な適切な薬剤によるその後の処理によって適当な特徴を有する。
【００５８】
特に、少なくとも一種の中性又はアニオン性のリオトロピック、サーモトロピック又はサーモ−リオトロピック多糖と、均一に分散し且つ安定化した金属ナノ粒子を取り込んでいる少なくとも一種の枝分かれしたカチオン性多糖からなる金属系ナノ複合材料とからなるポリマーマトリックスを含む三次元ナノ複合材料は、溶液のイオン強度が少なくとも５０ｍＭで且つ３５０ｍＭ以下であり、ｐＨが少なくとも７である二つの成分の水溶液から、それらの溶液を、中性又はアニオン性のリオトロピック、サーモトロピック又はサーモ−リオトロピック多糖をゲル化することが可能な化学的又は物理的ゲル化手段により処理することにより得られる。
【００５９】
それら二つの成分から三次元マトリックス又はヒドロゲルを得るための好適な条件（実質的には濃度、ｐＨ、イオン強度）は、典型的に、ｐＨが生理的範囲で、特には７〜８の間で、更に好ましくはｐＨが７．４であり、モル浸透圧濃度が２５０〜３００ｍＭであり、イオン強度が５０ｍＭ〜３５０ｍＭで、好ましくは１５０ｍＭであり、好ましくはＮａＣｌを０．０５Ｍ〜０．３５Ｍ、更に好ましくは０．１５Ｍの濃度で加えることにより得られる水溶液である。
【００６０】
上記ゲル化手段は、リオトロピックアニオン性多糖の種類によって適切な１価、２価又は３価のイオンから選択でき、サーモトロピック多糖については、５０℃以下又は１０℃以上の温度間で選択できる。知られているように、サーモ−リオトロピック多糖について、ゲル化手段は、イオン等の化学的手段と、温度等の物理的手段との両方であり得る。２種類のゲル化手段間での選択は、当該技術分野においてよく知られているように、ゲル化されるべき酸性のサーモ−リオトロピック多糖によって実質的に決まる。
【００６１】
アルギネート及びペクテート等の多糖について、それらのイオンは、マグネシウムを除いたアルカリ土類イオン及び遷移金属であり、カルシウム、バリウム、ストロンチウム、鉛、銅、マンガン及びそれらの混合物よりなる群から選択されるのが好ましく、又はそれらは、希土類イオンであり、ガドリニウム、テルビウム、ユーロピウム及びそれらの混合物よりなる群から選択されるのが好ましい。
【００６２】
ゲル化に適合したそれらイオンの水溶液の濃度は、１０ｍＭより高く、好ましくは１０ｍＭ〜１００ｍＭであり、更に好ましくは５０ｍＭである。そのゲル化溶液は、ＣａＣｌ２の濃度が５０ｍＭで、イオン強度が０．１５Ｍであるのが好ましい。
【００６３】
カラギーナンの場合、好ましくはカリウム、ルビジウム及びセシウムよりなる群から選択され、５０ｍＭ以上、好ましくは５０ｍＭ〜２００ｍＭ、更に好ましくは０．１Ｍの濃度のアルカリイオンを用いることができる。
【００６４】
例えばアガロースのようなサーモトロピックヒドロゲルに導く多糖溶液の場合、ヒドロゲルの調製は、ゲル形成温度より低い温度に冷却することによって行われる。該多糖溶液は、サーモトロピック多糖によるヒドロゲル形成が生じる温度より高い温度で調製される。この温度では、サーモトロピック多糖はヒドロゲルを形成しない。多糖溶液を調製する温度は、好ましくは５０℃〜３０℃の範囲であり、更に好ましくは３７℃である。ヒドロゲルの形成は、ゲル形成温度より低い温度に冷却されたゲル化槽中に多糖溶液を滴下することで起こる。この温度は、好ましくは１０℃〜４０℃の範囲であり、更に好ましくは２０℃である。
【００６５】
本発明の目的のため、中性又はアニオン性多糖と金属ナノ粒子を含む枝分かれした塩基性多糖との少なくとも２成分の混合物は、中性又はアニオン性多糖の総ポリマー濃度が４％（ｗ／ｖ）以下である。それら総ポリマー濃度は、好ましくは１．５％〜３％（ｗ／ｖ）の範囲であり、更に好ましくは２％（ｗ／ｖ）である。
【００６６】
本発明の目的のため、酸性多糖と金属ナノ粒子が取り込まれているカチオン性多糖との重量比は、８：１〜１：１（中性又はアニオン性多糖：カチオン性多糖）であり、好ましくは８：１〜５：１であり、更に好ましくは７．５：１である。
【００６７】
従って、本発明の三次元ナノ複合材料は、少なくとも以下の工程を含む調製方法に従って得られる：
ｉ．少なくとも一種の中性又はアニオン性のリオトロピック、サーモトロピック又はサーモ−リオトロピック多糖と、（上述のようにして調製された）金属ナノ粒子を取り込んでいる少なくとも一種のキトサンの単糖又はオリゴ糖誘導体からなる金属系ナノ複合材料との混合物の水溶液を調製する工程であって、前記水溶液はイオン強度が少なくとも５０ｍＭで且つ３５０ｍＭ以下であり、ｐＨが少なくとも７である工程と；
ｉｉ．先の工程で調製した混合物の水溶液を、適切な化学的又は物理的ゲル化手段を用いて処理することにより、中性又はアニオン性のリオトロピック、サーモトロピック又はサーモ−リオトロピック多糖をゲル化する工程である。
【００６８】
特に、この後者の工程は、リオトロピックアニオン性多糖の架橋イオンを含有する溶液中に又はサーモトロピック多糖の適切な温度の溶液中に針を通して滴下することで、或いは「インサイチューでの」ゲル化により実現できる。サーモ−リオトロピック多糖については、ゲル化プロセスのためのイオン溶液及び適切な温度の溶液の両方を用いることができる。
【００６９】
上述の方法の場合、ナノ複合材料が得られ、ここで、多糖から作ったポリマーマトリックスは、三次元であって、ヒドロゲルの形態であるか又はその後の脱水プロセスを受けた場合には非水和の形態である。更に、それらのマトリックスは、シリンダー、ミクロスフェア、ディスク、乾燥フィルム及び粉末として様々な形態をとることができ、又は繊維を作るために押し出すことができる。
【００７０】
アルギネートの場合、シリンダーは、不活性形態の架橋イオン、例えばＣａＣＯ３又はＣａ−ＥＤＴＡ錯体を多糖溶液に加えることで調製できる。次いで、例えばＧＤＬ（Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン）のような、ゆっくりと加水分解する物質を加える。例えば、この懸濁液を、シリンダー形状の又は円盤状の容器内に移し、そこで２４時間保つ。次いで、多糖溶液のゲルシリンダーを容器から抜き出す。インサイチューでのシリンダー形成は、カルシウムイオンの放出による。
【００７１】
本発明の三次元ナノ複合材料の抗菌活性を試験するため、三次元ナノ複合材料ゲルのミクロスフェアの存在下における、半固体支持体上での細菌増殖テストと細菌コロニーの計数テストとを行い；金属ナノ粒子の存在のため、かかるゲル表面や三次元ナノ複合材料ゲルのミクロスフェアと接触して置かれた懸濁液中では細菌が増殖しないことを示し、それにより、強い抗菌活性が明確に示される。
【００７２】
異なる真核細胞株に関する細胞毒性テストは、それらの三次元ナノ複合材料ゲルが効果的な殺菌効果を維持していても、細胞毒性がないことを示す。
【００７３】
以下、非制限的な例証目的のため、本発明に従うヒドロゲル又は非水和３Ｄマトリックスの調製と、その抗菌性タイプの生物活性とを説明する。
【実施例】
【００７４】
一つのアニオン性多糖と、金属ナノ粒子を含む一つのキトサンオリゴ糖誘導体からなる金属系ナノ複合材料との溶液からの三次元ナノ複合材料ヒドロゲルの調製
例１：ラクトースによるキトサン誘導体（以下、「キトラック（Chitlac）」）の合成
メタノール溶液（５５ｍＬ）及びｐＨ４．５の１％酢酸緩衝液（５５ｍｌ）の１１０ｍＬ中に、キトサン（１．５ｇ、アセチル化度１１％）を溶解する。ラクトース（２．２ｇ）及びシアノ水素化ホウ素ナトリウム（９００ｍｇ）を含有する、メタノール溶液（３０ｍＬ）及びｐＨ４．５の１％酢酸緩衝液（３０ｍＬ）の６０ｍＬを加える。その混合物を２４時間攪拌して置いておき、透析管（カットオフ１２，０００Ｄａ）に移し、４℃での伝導率が４μＳに到達するまで０．１ＭのＮａＣｌ（２回の交換）及び脱イオン水で透析する。最後に、その溶液をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ０．４５μｍフィルター上にろ過し、凍結乾燥する。
【００７５】
例２：セロビオースによるキトサン誘導体（以下、「キトセル（Chitcell）」）の合成
メタノール溶液（５５ｍＬ）及びｐＨ４．５の１％酢酸緩衝液（５５ｍＬ）の１１０ｍＬ中に、キトサン（１．５ｇ、アセチル化度１１％）を溶解する。セロビオース（２．２ｇ）及びシアノ水素化ホウ素ナトリウム（９００ｍｇ）を含有する、メタノール溶液（３０ｍＬ）及びｐＨ４．５の１％酢酸緩衝液（３０ｍＬ）の６０ｍＬを加える。その混合物を２４時間攪拌して置いておき、透析管（カットオフ１２，０００Ｄａ）に移し、４℃での伝導率が４μＳに到達するまで０．１ＭのＮａＣｌ（２回の交換）及び脱イオン水で透析する。最後に、その溶液をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ０．４５μｍフィルター上にろ過し、凍結乾燥する。
【００７６】
例３：キトラック中に銀ナノ粒子を含む金属系ナノ複合材料の調製
以下の手順に従うキトラック溶液中でのアスコルビン酸による金属イオンの還元時にナノ粒子が得られる：濃度０．４％（ｗ／ｖ）のキトラック水溶液を調製する。次いで、１ｍＭのＡｇＮＯ３最終濃度を得るために、そのキトラック溶液を硝酸銀溶液と混合する。次いで、０．５ｍＭの最終濃度を得るために、アスコルビン酸溶液を加える。
【００７７】
例４：キトセル中に銀ナノ粒子を含む金属系ナノ複合材料の調製
以下の手順に従うキトセル溶液中でのアスコルビン酸による金属イオンの還元時にナノ粒子が得られる：濃度０．４％（ｗ／ｖ）のキトセル水溶液を調製する。次いで、１ｍＭのＡｇＮＯ３最終濃度を得るために、そのキトセル溶液を硝酸銀溶液と混合する。次いで、０．５ｍＭに等しい最終濃度を得るために、アスコルビン酸溶液を加える。
【００７８】
例５：キトラック中に金ナノ粒子を含む金属系ナノ複合材料の調製
以下の手順に従う多糖キトラックによる金属イオンの還元時にナノ粒子が得られる：濃度０．４％（ｗ／ｖ）のキトラック水溶液を調製する。次いで、１ｍＭのＨＡｕＣｌ４最終濃度を得るために、そのキトラック溶液を四塩化金酸と混合する。
【００７９】
例６：アルギネート−キトラックに基づくシリンダー形状ヒドロゲルの、「インサイチューでの」ゲル化を用いた調製
キトラック溶液に、ＮａＣｌ及びヘペス緩衝液の存在下、アルギネート溶液を、以下の最終濃度を得るために加える：１．５％（ｗ／ｖ）アルギネート、０．２％（ｗ／ｖ）キトラック、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１Ｍのヘペス緩衝液、ｐＨ７．４である。次いで、ＣａＣＯ３溶液（濃度３０ｍＭ）を加え、その後、緩徐なゲル化が可能なように、Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン（ＧＤＬ）（［ＧＤＬ］／［Ｃａ２＋］＝２）を加える。抗菌性試験のため、２０％ミューラー−ヒントン培地を加える（４．２ｇ／Ｌ）。その最終溶液を、要望通りの大きさのプラスチックシリンダー（例えば１６ｍＭ（φ）×１８ｍＭ（ｈ））に移し、暗闇で２４時間置いておき、ゲル化させる。
【００８０】
例７：アルギネート−キトラック及び金属ナノ粒子に基づく三次元ナノ複合材料ヒドロゲルの、「インサイチューでの」ゲル化を用いた調製
例３に従い調製した金属ナノ粒子を含むキトラック溶液を、ＣａＣＯ３（最終濃度は４０ｍＭ以下、好ましくは１５ｍＭ〜３０ｍＭである）の存在下、アルギネート溶液（最終アルギネート濃度は４％（ｗ／ｖ）以下、好ましくは１％（ｗ／ｖ）〜２％（ｗ／ｖ）の範囲である）に加え、次いで、緩徐なゲル化が可能なように、Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン（ＧＤＬ）（［ＧＤＬ］／［Ｃａ２＋］＝２）を加える。抗菌性試験のため、２０％最終ミューラー−ヒントン培地を加える（４．２ｇ／Ｌ）。
【００８１】
例８：アルギネート−キトラック及び銀ナノ粒子に基づくシリンダー形状三次元ナノ複合材料ヒドロゲルの、「インサイチューでの」ゲル化を用いた調製
例３に従い調製した銀ナノ粒子を含むキトラック溶液に、ＮａＣｌ及びヘペス緩衝液の存在下、アルギネート溶液を、以下の最終濃度を得るために加える：１．５％（ｗ／ｖ）アルギネート、０．２％（ｗ／ｖ）キトラック、０．５ｍＭのＡｇＮＯ３、０．２５ｍＭのＣ６Ｈ８Ｏ６、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１Ｍのヘペス緩衝液、ｐＨ７．４である。次いで、ＣａＣＯ３溶液（濃度３０ｍＭ）を加え、その後、緩徐なゲル化が可能なように、Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン（［ＧＤＬ］／［Ｃａ２＋］＝２）を加える。抗菌性試験のため、２０％ミューラー−ヒントン培地を加える（４．２ｇ／Ｌ）。その最終溶液を、要望通りの大きさのプラスチックシリンダー（例えば１６ｍＭ（φ）×１８ｍＭ（ｈ））に移し、暗闇で２４時間置いておき、ゲル化させる。
【００８２】
粒子凝集又はポリマー相分離はゲル化中及びゲル化後に発生しないことを明確に示すことには価値がある。図１において分かるように、得られた三次元ナノ複合材料は、黄色−オレンジ色のヒドロゲルである（その色は、銀の濃度によって変わる）。
【００８３】
例９：アルギネート−キトラック及び金ナノ粒子に基づくシリンダー形状三次元ヒドロゲルの、「インサイチューでの」ゲル化を用いた調製
例５に従い調製した金ナノ粒子を含むキトラック溶液に、ＮａＣｌ及びヘペス緩衝液の存在下、アルギネート溶液を、以下の最終濃度を得るために加える：１．５％（ｗ／ｖ）アルギネート、０．２％（ｗ／ｖ）キトラック、０．５ｍＭのＨＡｕＣｌ４、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１Ｍのヘペス緩衝液、ｐＨ７．４である。次いで、ＣａＣＯ３溶液（濃度３０ｍＭ）を加え、その後、緩徐なゲル化が可能なように、Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン（ＧＤＬ）（［ＧＤＬ］／［Ｃａ２＋］＝２）を加える。抗菌性試験のため、２０％ミューラー−ヒントン培地を加える（４．２ｇ／Ｌ）。その最終溶液を、要望通りの大きさのプラスチックシリンダー（例えば１６ｍＭ（φ）×１８ｍＭ（ｈ））に移し、暗闇で２４時間置いておき、ゲル化させる。
【００８４】
得られた三次元ナノ複合材料ヒドロゲルサンプルを図２に示す。
【００８５】
例１０：銀ナノ粒子の場合の（マンニトールに）アルギネート−キトラック溶液からのシリンジを用いた三次元ナノ複合材料スフェアの調製
以下の最終濃度の多糖溶液を調製した。１．５％（ｗ／ｖ）アルギネート、０．２％（ｗ／ｖ）キトラック、０．５ｍＭのＡｇＮＯ３、０．２５ｍＭのＣ６Ｈ８Ｏ６、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１Ｍのヘペス緩衝液、ｐＨ７．４である。２３Ｇ針付きシリンジを用い、その溶液を、５０ｍＭのＣａＣｌ２及び０．１５Ｍのマンニトール並びに１０ｍＭのヘペス緩衝液（ｐＨ７．４）を含有する溶液中に、磁気ロッドによって攪拌しながら滴下した。その球体は、ゲル化槽中で１０分間攪拌しながら保たれ、その後、除去し、脱イオン水で洗浄した。
【００８６】
例１１：銀ナノ粒子の場合の（ＮａＣｌに）アルギネート−キトラック溶液からのシリンジを用いた三次元ナノ複合材料スフェアの調製
以下の最終濃度の多糖溶液を調製した。１．５％（ｗ／ｖ）アルギネート、０．２％（ｗ／ｖ）キトラック、０．５ｍＭのＡｇＮＯ３、０．２５ｍＭのＣ６Ｈ８Ｏ６、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１Ｍのヘペス緩衝液、ｐＨ７．４である。２３Ｇ針付きシリンジを用い、その溶液を、５０ｍＭのＣａＣｌ２及び０．１５Ｍのマンニトール並びに１０ｍＭのヘペス緩衝液（ｐＨ７．４）を含有する溶液中に、磁気ロッドによって攪拌しながら滴下した。その球体は、ゲル化槽中で１０分間攪拌しながら保たれ、その後、除去し、脱イオン水で洗浄した。
【００８７】
例１２：金ナノ粒子の場合のアルギネート−キトラック溶液からのシリンジを用いた三次元ナノ複合材料スフェアの調製
以下の最終濃度の多糖溶液を調製した。１．５％（ｗ／ｖ）アルギネート、０．２％（ｗ／ｖ）キトラック、０．５ｍＭのＨＡｕＣｌ４、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１Ｍのヘペス緩衝液、ｐＨ７．４である。２３Ｇ針付きシリンジを用い、その溶液を、５０ｍＭのＣａＣｌ２及び０．１５Ｍのマンニトールを含有する溶液（ゲル化槽）中に、磁気ロッドによって攪拌しながら滴下した。その球体は、ゲル化槽中で１０分間攪拌しながら保たれ、その後、除去し、脱イオン水で洗浄した。
【００８８】
例１３：銀ナノ粒子の場合のアルギネート−キトラック溶液からの静電ビーズ発生器を用いた三次元ナノ複合材料ミクロスフェアの調製
以下の最終濃度の多糖溶液を調製した。１．５％（ｗ／ｖ）アルギネート、０．２％（ｗ／ｖ）キトラック、０．５ｍＭのＡｇＮＯ３、０．２５ｍＭのＣ６Ｈ８Ｏ６、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１Ｍのヘペス緩衝液、ｐＨ７．４である。その溶液を、５０ｍＭのＣａＣｌ２及び０．１５ｎｍのマンニトールを含有するゲル化槽中に、磁気ロッドによって攪拌しながら滴下した。静電発生器を用いてミクロスフェアのサイズを制御しており、該静電発生器は、そのサイズを縮小するために滴の表面張力に作用することが可能である。使用される条件は、典型的に、電圧５ｋＶ、内部針の直径０．７ｍＭ、ゲル化槽と針の間の距離４ｃｍ、２成分ポリマー溶液の流量１０ｍＬ／ｍｉｎであった。そのミクロスフェアをゲル化溶液中に攪拌しながら１０分間置いておき、その後、除去し、脱イオン水で洗浄した。
【００８９】
得られた三次元ナノ複合材料ミクロスフェアサンプルを図３に示す。
【００９０】
例１４：金ナノ粒子の場合のアルギネート−キトラック溶液からの静電ビーズ発生器を用いた三次元ナノ複合材料ミクロスフェアの調製
以下の最終濃度の多糖溶液を調製した：１．５％（ｗ／ｖ）アルギネート、０．２％（ｗ／ｖ）キトラック、０．５ｍＭのＨＡｕＣｌ４、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１Ｍのヘペス緩衝液、ｐＨ７．４である。その溶液を、５０ｍＭのＣａＣｌ２及び０．１５ｎｍのマンニトールを含有するゲル化槽中に、磁気ロッドによって攪拌しながら滴下した。
【００９１】
静電ビーズ発生器を用いてミクロスフェアのサイズを制御しており、該静電ビーズ発生器は、そのサイズを縮小するために滴の表面張力に作用することが可能である。使用される条件は、典型的に、電圧５ｋＶ、内部針の直径０．７ｍＭ、ゲル化槽と針の間の距離４ｃｍ、２成分ポリマー溶液の流量１０ｍＬ／ｍｉｎである。そのミクロスフェアをゲル化溶液中に攪拌しながら１０分間置いておき、その後、除去し、脱イオン水で洗浄した。
【００９２】
例１５：「インサイチューでの」ゲル化を用いたアルギネート−キトラック及び銀ナノ粒子に基づく表面／体積比の高い三次元ナノ複合材料ヒドロゲルの調製
例３に従い調製した銀ナノ粒子を含むキトラック溶液に、ＮａＣｌ及びヘペス緩衝液の存在下、アルギネート溶液を、以下の最終濃度を得るために加える：１．５％（ｗ／ｖ）アルギネート、０．２％（ｗ／ｖ）キトラック、０．５ｍＭのＡｇＮＯ３、０．２５ｍＭのＣ６Ｈ８Ｏ６、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１Ｍのヘペス緩衝液、ｐＨ７．４である。次いで、ＣａＣＯ３溶液（濃度３０ｍＭ）を加え、その後、緩徐なゲル化が可能なように、Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン（ＧＤＬ）（［ＧＤＬ］／［Ｃａ２＋］＝２）を加える。抗菌性試験のため、２０％最終ミューラー−ヒントン培地を加える（４．２ｇ／Ｌ）。その最終溶液を、平滑面（スライド、ペトリ皿等）上に注ぎ、暗闇で２４時間置いておき、ゲル化させる。
【００９３】
例１６：「インサイチューでの」ゲル化を用いたアルギネート−キトラック及び銀ナノ粒子に基づく三次元ナノ複合材料脱水フィルムの調製
例３に従い調製した銀ナノ粒子を含むキトラック溶液に、ＮａＣｌ及びヘペス緩衝液の存在下、アルギネート溶液を、以下の最終濃度を得るために加える：１．５％（ｗ／ｖ）アルギネート、０．２％（ｗ／ｖ）キトラック、０．５ｍＭのＡｇＮＯ３、０．２５ｍＭのＣ６Ｈ８Ｏ６、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１Ｍのヘペス緩衝液、ｐＨ７．４である。次いで、ＣａＣＯ３溶液（濃度３０ｍＭ）を加え、その後、緩徐なゲル化が可能なように、Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン（ＧＤＬ）（［ＧＤＬ］／［Ｃａ２＋］＝２）を加える。抗菌性試験のため、２０％最終ミューラー−ヒントン培地を加える（４．２ｇ／Ｌ）。その最終溶液を、平滑面（スライド、ペトリ皿等）上に注ぎ、暗闇で２４時間置いておき、ゲル化させる。次いで、三次元ナノ複合材料の固体脱水フィルムを得るため、その三次元ナノ複合材料ゲルを空気乾燥させる。
【００９４】
例１７：「インサイチューでの」ゲル化を用いたアルギネート−キトラック及び金ナノ粒子に基づく表面／体積比の高い三次元ナノ複合材料ヒドロゲルの調製
例５に従い調製した金ナノ粒子を含むキトラック溶液に、ＮａＣｌ及びヘペス緩衝液の存在下、アルギネート溶液を、以下の最終濃度を得るために加える：１．５％（ｗ／ｖ）アルギネート、０．２％（ｗ／ｖ）キトラック、０．５ｍＭのＨＡｕＣｌ４、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１Ｍのヘペス緩衝液、ｐＨ７．４である。次いで、ＣａＣＯ３溶液（濃度３０ｍＭ）を加え、その後、緩徐なゲル化が可能なように、Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン（ＧＤＬ）（［ＧＤＬ］／［Ｃａ２＋］＝２）を加える。抗菌性試験のため、２０％最終ミューラー−ヒントン培地を加える（４．２ｇ／Ｌ）。その最終溶液を、平滑面（スライド、ペトリ皿等）上に注ぎ、暗闇で２４時間置いておき、ゲル化させる。
【００９５】
例１８：「インサイチューでの」ゲル化を用いたアルギネート−キトラック及び金ナノ粒子に基づく三次元ナノ複合材料フィルムの調製
例５に従い調製した金ナノ粒子を含むキトラック溶液に、ＮａＣｌ及びヘペス緩衝液の存在下、アルギネート溶液を、以下の最終濃度を得るために加える：１．５％（ｗ／ｖ）アルギネート、０．２％（ｗ／ｖ）キトラック、０．５ｍＭのＨＡｕＣｌ４、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１Ｍのヘペス緩衝液、ｐＨ７．４である。次いで、ＣａＣＯ３溶液（濃度３０ｍＭ）を加え、その後、緩徐なゲル化が可能なように、Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン（ＧＤＬ）（［ＧＤＬ］／［Ｃａ２＋］＝２）を加える。抗菌性試験のため、２０％最終ミューラー−ヒントン培地を加える（４．２ｇ／Ｌ）。その最終溶液を、平滑面（スライド、ペトリ皿等）上に注ぎ、暗闇で２４時間置いておき、ゲル化させる。次いで、三次元ナノ複合材料の固体フィルムを得るため、その三次元ナノ複合材料ゲルを空気乾燥させる。
【００９６】
例１９：ミクロスフェアの調製
先に報告した特定の例１３及び１４のミクロスフェアは、既知の方法に従って、特には：ａ）シリンジを用い、一のアニオン性多糖と金属粒子を含むキトサンの単糖又はオリゴ糖誘導体である一の金属系ナノ複合材料との溶液を適切なゲル化槽中に手動で滴下し、ｂ）トロンヘイム（ノルウェー）ＮＴＮＵ大学バイオテクノロジー研究所のグドムンド（Ｇｕｄｍｕｎｄ Ｓｋｊａｋ［ここで、ａはリング符号付きのａである］−Ｂｒａｅｌ［ここで、ａｅはａとｅの合字である］）教授により開発され、Ｓｔｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ．ｏｆ Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ １９，６１５−６３０に記載された一の静電ビーズ発生器を用いることにより調製された。かかる装置は、Ｐｌｅｘｉｇｌａｓ製安全スタンドに含まれるオートクレーブ処理可能な針支持体に接続された、適切なスイッチにより調節可能な電圧（１０ｋＶ以下）が加えられる静電ビーズ発生器で構成される。
【００９７】
ポンプで調節され、内径が１ｍｍの格子で作ったパイプに接続されたシリンジで構成されるスタンド外側のシステムを用いて、出発溶液を、ゲル化溶液を含有する結晶化装置（スタンド内）中に滴下し、ここで、該結晶化装置には電極が挿入されている。その機器は、針先端とゲル化溶液の自由表面との間に一定の電位差を生じており、該電位差は調節でき、０〜１０ｋＶに及ぶ。その電位差は、針先端からポリマー滴（負に帯電）の突然の脱離をもたらし、それ故に小さなサイズ（＜２００μｍ）であってもカプセルを有することを可能にする。カプセルのサイズは、内部針の直径、針のゲル溶液表面からの距離、ポリマー流量等の他の要因を変えることによっても調節できる。
【００９８】
例２０：シリンダーの調製
先に報告した特定の例６、８及び９のゲルシリンダー及びディスクは、多糖及び金属系ナノ複合材料を含有する溶液をシリンダー形状の容器中に注ぐことにより調製された。シリンダー形状のヒドロゲルのサイズは、後のもののサイズによって決まる。異なるサイズ（高さ及び内径）が完全に許容可能であるものの、典型的に、シリンダー形状容器の寸法は、高さが１８ｍｍであり、内径が１６ｍｍであり、一方、円盤状の容器の寸法は、高さが８ｍｍであり、内径が１６ｍｍである。
【００９９】
例２１：生物学的特性評価
Ａ．抗菌活性
三次元ナノ複合材料ゲルの抗菌活性をテストするため、様々な濃度の異なる菌種をゲル表面に塗りつけた。グラム陰性菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）及びグラム陽性菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ，Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）の両方についてテストした。コントロールは、寒天ゲル及びナノ粒子がない場合のアルギネート−キトラックゲル（ＡＣゲル）によって表される。「一晩の」インキュベーション後、細菌コロニーは、コントロールでははっきりと分かるが、ナノ粒子を含有するゲル（ＡＣ−ｎＡｇゲル）では全くなく（図４）、それ故に、それらの材料によって果たされる殺菌作用の有効性が証明される。
【０１００】
更に、銀ナノ粒子を含有するナノ複合材料ゲルミクロスフェア（ＡＣ−ｎＡｇ）を作製し、細菌溶液（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）と接触させ；そのコントロールは、アルギネート−キトラックゲルミクロスフェア（銀ナノ粒子なし）によって表される。その結果は、細菌コロニーの濃度がコントロールで増加するものの、銀ナノ粒子を含むミクロスフェアの場合では、３を超える対数単位減少させることを実証する。
【０１０１】
例１３に従って得られるナノ複合材料ミクロスフェア並びに例６及び９に従って得られるナノ複合材料ヒドロゲルでさえも、図５及び６にそれぞれ示されるように、効果的な抗菌作用を発揮できることを証明した。
【０１０２】
Ｂ．細胞毒性
骨芽細胞（ＭＧ６３）、肺細胞（ＨＥＰＧ２）及び線維芽細胞（３Ｔ３）等の真核細胞株に関するゲルの細胞毒性を評価するためのテストを行った。そのテストでは、細胞による乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出を測定及び評価しており、それは、細胞傷害及び細胞死に関係している。ＬＤＨテストは、三次元ナノ複合材料ゲルが、図７において分かるように、例えば線維芽細胞の場合に、テストした細胞に対して細胞毒性効果を生じないことを実証する。実際、２４時間及び７２時間後、ＡＣ−ｎＡｇで処理した細胞とコントロール（即ち、アルギネート−キトラックゲルで処理した細胞及び未処理細胞）間での乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出において著しい違いは見られない。
【０１０３】
金ナノ粒子を含有するアルギネート−キトラック系ゲル（ＡＣ−ｎＡｕゲル）である同様な三次元ナノ複合材料の場合でも同様の結果が報告され；図８において分かるように、この種類のゲルは、同様に真核細胞に対して細胞毒性がない。
【０１０４】
それらの結果の組み合わせにより、キトラック中に形成され安定化しているナノ粒子を含有するアルギネート−キトラック系ヒドロゲルのような本発明に従う三次元ナノ複合材料は、均質な構造が備わっており、ここで、ナノ粒子は凝集せず、強力な殺菌活性を有するものの、真核細胞に対しては毒性がないと結論を出すことが可能である。
【０１０５】
それらの新規な三次元ナノ複合材料系は、以下の利点を提供する：
・既に実証されているかかるキトサン誘導体のオリゴ糖側鎖による細胞刺激の生物学的特性（Marsich et al.,“Alginate/lactose-modified chitosan hydrogels: A bioactive biomaterial for chondrocyte encapsulation”, Journal of biomedical materials research-Part A, 2008 Feb; 84(2):364-76）と、殺菌活性を持つ金属ナノ粒子を形成させ安定化させるキトサン分岐誘導体の能力を組み合わせる、統合した系の開発である。この新規の「糖−ナノ技術」アプローチは、「糖鎖生物学的」成分によって与えられる生理活性とナノ粒子の特異的性質とを利用する材料を設計するための新規の機器を提供することになる；
・ｉ）中性又はアニオン性多糖とｉｉ）金属ナノ粒子を取り込んでいるキトサンのカチオン性分岐単糖又はオリゴ糖誘導体との混合組成物を用いた三次元ゲルの調製の可能性であって、金属ナノ粒子の存在にもかかわらず、それらは（クラスｉのポリアニオンに対して）反対の電荷を有するが、二つのクラスｉ）及びｉｉ）のそれぞれに独立して属する２種類のポリマー間の適当な条件下での完全混和性を利用することによる調製の可能性である。一方、知られているように、アニオン性多糖、特にアルギネートでのコアセルベーション現象は、オリゴ糖分岐のないキトサンのような他のカチオン性ポリマーを用いることによって起こる；
・得られたナノ複合材料ゲルは、それらが強力な殺菌活性を有していても、真核細胞に対して毒性がないことが分かる；
・使用したゲル化法により、異なる適用ニーズに適し得る形状及びサイズの材料を得られるようにする（例えば、湿潤及び乾燥フィルム、スカフォールド、ミクロスフェア、繊維等）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、中性又はアニオン性多糖と金属ナノ粒子が均一に分散し且つ安定化している枝分かれしたカチオン性多糖との多糖組成物からなる複合ポリマーマトリックスを含む三次元ナノ複合材料に関するものであり、前記枝分かれしたカチオン性多糖は、そのようにして金属系ナノ複合材料を形成している。更に、本発明は、前記三次元ナノ複合材料の調製と、生物医学分野、医薬品分野及び食品分野での使用とに関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、天然の多糖は、生体適合性ポリマーとして認識されており；そのようなものとして、それらは、生物医学分野での適用のため、例えば生物学的に活性のある化合物又は組織工学の細胞のキャリヤーとして、長い期間採用され、よく研究された材料である。医薬品業界と食品業界の両方において最も使用されるものの中でも、アルギネート及びキトサンは、それらの存在量、比較的低いコスト、高い生体適合性、及び含水量の高いヒドロゲルの形態として三次元マトリックスを適当な条件下で作る能力を理由に言及され得る。しかしながら、キトサンは、その水溶性の著しいｐＨ依存性やその水溶液中におけるアルギネートのようなアニオン性多糖との非混和性と関係のある適用制限をいくらか示しており、それは、該アニオン性多糖と共に、例えば組織工学等の分野における適用目的では使用できないコアセルベートを作る。キトサンは、それが細胞特異的シグナルを保有せず、それ故に生物活性に欠けるため、更なる制限をアルギネートと共有する。それらの理由のため、上述の制限を克服することのできるキトサン誘導体が、現在のところ研究開発されている。
【０００３】
近年では、様々なキトサン誘導体が、ポリマー鎖の化学修飾によって得られた。それらの修飾には、線状キトサン鎖を形成するＤ−グルコサミン単位のアミノ残基にかかわる反応が広く用いられる。特に、Ｎ−結合側鎖として糖単位（単糖及びオリゴ糖）を導入することにより、ｐＨを酸性値まで下げる必要も無く水溶性キトサン誘導体を得ることが可能となり、また、この方法では、結果として起こり得る水溶液の酸性度によるポリマー分解の問題をも回避する。
【０００４】
ＵＳ ４，４２４，３４６（Ｈａｌｌ，Ｌ．Ｄ．及びＹａｌｐａｎｉ，Ｍ．）では、それら誘導体の合成及びその非酸性水媒体中での水溶解度を初めて記載している。特に、ＵＳ ４，４２４，３４６は、ラクトースによるキトサン誘導体が、３〜５％より高い濃度の水溶液中で硬質ゲルを生じさせる一方、（特にＣａ、Ｃｒ、Ｚｎ塩化物、Ｋクロム酸塩、ホウ酸との）塩又は酸混合物及びそれらの組み合わせの中ではゲル化も沈澱もしないことを開示した。また、上述の特許は、他のオリゴ糖、即ちセロビオースにより誘導体化したキトサンが、水溶液中では本質的にゲルを形成しないものの、アルギネートと混合した場合には硬質ゲルを形成することに言及した。このゲル形成は、正のポリカチオン電荷と負のポリアニオン電荷間の強い相互作用が原因であり、系のコアセルベーション、さもなければ例えば細胞等の生体物質のマイクロカプセル化に使用する際に制限となるプロセスをもたらす。
【０００５】
特許出願ＷＯ２００７／１３５１１６（Ｐａｏｌｅｔｔｉ Ｓ．ｅｔ ａｌ．）は、コアセルベーションの問題を克服するためのアニオン性多糖とカチオン性多糖の混合物を含有するポリマー溶液の調製方法と、その生物医学分野における使用を記載している。
【０００６】
加えて、特許出願ＷＯ２００７／１３５１１４（Ｐａｏｌｅｔｔｉ Ｓ．ｅｔ ａｌ．）は、水和又は非水和の三次元構造体と、薬理学的に活性のある分子及び細胞をカプセルに包む目的に対して有用である、適切なゲル化剤によりゲル化された、上述のアニオン性多糖とカチオン性多糖のポリマー混合物からそれらを調製する方法とを記載している。
【０００７】
時節がら多糖への大きな興味と共に、ナノ技術に関連した非常に興味のある他の研究分野は、特定の金属ナノ粒子を含むナノ複合材料を調製するためのそれらの使用可能性についてである。実際、ナノ粒子を安定化させるため、金属粒子がポリマー鎖との相互作用により均一に分散しているナノ複合材料系を得ることを可能にする多糖溶液は、有利に使用される可能性がある。従って、多糖の役割は、その特定の特性を十分に引き出す可能性を予期することで、金属ナノ粒子の形成及び安定化に関係しており；実際、金属ナノ粒子は、特定の光学特性、触媒特性及び抗菌特性が備わっていることが知られている。事実、抗菌性材料の分野における銀、金、銅、亜鉛及びニッケル等の金属の使用は、特に皮膚の創傷を治療するための、市場に大きな影響を及ぼしている。Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ（登録商標）及びＣｏｎｖａｔｅｃ（登録商標）等の会社は、最近になって銀ナノ粒子の抗菌特性に基づく薬物を市場に出している。それら金属の周知な抗菌活性を例えばガーゼ、包帯、パッチの開発に利用するのに適切な多糖系ナノ複合材料によって、同様な適用が見出される可能性がある。後の製品は、広域スペクトル抗菌活性又は殺菌活性を持った含水量の高いゲルが与えられている可能性がある。実際、火傷及び潰瘍のような皮膚又は粘膜の病変を治療するための新しい治療の助けの必要性が依然として残っている。それらの病変は、現在採用されている抗生物質治療に対し非常に抵抗性がある場合が多く；加えて、それらはまた、例えば細胞増殖及び／又は適切な組織の水和を増強するといった組織修復のための生物学的効果を更に必要とする。三次元のヒドロゲル構造体は、とりわけ後の側面に特に有利な場合があり、細胞表現型に干渉せずに細胞の複製に適した環境を確保することができる。
【０００８】
その上、三次元の水和構造体を得る可能性はまた組織工学用途のためにも大変興味深く、ここでは、多糖に特有の生物活性特性を抗菌活性と組み合わせることが望ましい。
【０００９】
組織工学の分野では、人体に埋め込まれるべき生体材料上に抗菌被膜を作るため、大きな努力がなされており；この場合、ほとんどの危険因子は、抗菌薬それ自体の細胞毒性の可能性に関係している。例えば、整形外科の分野において、人工関節置換術の作業及び露出していない骨折の骨接合術は、手術感染に関する清潔手術の一種を表す（非特許文献１）。しかしながら、生体材料の宿主組織内への埋め込みは、細菌負荷が若干小さい場合でも感染の発症及び生存を促進することができる。手術前後の予防における進歩にもかかわらず、細菌感染及び真菌感染は今でも非常に一般的であり；これは、時間延長によるそれら微生物の整形外科用デバイスへの付着の危険性に原因する（非特許文献２）。それらのデータは、新世代の生体材料と関係がある代わりの抗菌薬を開発する重要性を裏付ける。
【００１０】
ＵＳ ７２５５８８１（Ｇｉｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．）は、上述の問題に対して可能性のある解決策を提供する。事実、その特許は、抗菌用途のため、蒸気相からの化学堆積及び物理堆積（「化学蒸着」ＣＶＤ、「物理蒸着」ＰＶＤ）並びに液相中での化学堆積及び物理堆積等の技術を介して様々な種類の支持体上に形成された銀系被膜を開示する。銀が堆積している多糖支持体に関しては、キトサン、アルギネート及びヒアルロン酸について言及している。それらの技術は、適切なマトリックス内に均一に分散した金属ナノ粒子の形成に向いているものではなく、連続的な表面銀（ナノ結晶、多結晶又は非晶質）層の形成に向けていることに注意する。その上、それらの堆積技術に必要とされる温度及び圧力の条件は、多糖や、その骨格の一部であることが望ましい可能性のある（ペプチド又はタンパク質のような）生物活性生体分子の安定性と適合するものではなく、生きている細胞にかかわる組織工学用途の場合には、なおさらそうである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】ＵＳ ４，４２４，３４６
【特許文献２】ＷＯ２００７／１３５１１６
【特許文献３】ＷＯ２００７／１３５１１４
【特許文献４】ＵＳ ７２５５８８１
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Tucci G. et al., Giornale Italiano di Ortopedia e Traumatologia, 2005; 31:121-129
【非特許文献２】Zimmerli W. et al., New England J. Med., 2004; 351(16):1645-54
【発明の概要】
【００１３】
本発明の第一の目的は、三次元ナノ複合材料系を提供することにあり、ここでは、サイズの制御された金属ナノ粒子が多糖マトリックス中に均一に分散しており、前記マトリックスはゲル状又は固体状であり、その特性は、生物医学分野における生物学的適用に特に適していることである。
【００１４】
更なる目的は、かかる三次元ナノ複合材料が、単純で経済的に都合のよい化学的アプローチにより、特には、限定されないものの、生体適合性で且つ生理活性のあるヒドロゲル及び脱水ヒドロゲルを生成することによって得られることである。
【００１５】
更なる目的は、市販の多糖を容易に用いることによりそれらの系を改良することにあり、該多糖は化学操作を受けず、該系の複雑な予備操作の必要もない。
【００１６】
上記目的を実現するため、発明者らは、好ましくは植物源又は細菌源から生じる中性又はアニオン性多糖と、枝分かれしたカチオン性多糖とを含む少なくとも２成分の組成物であって、後者の多糖は金属ナノ粒子を取り込むことが可能であり、上記中性又はアニオン性多糖は水和又は非水和の三次元固体マトリックス（例えば、様々な形態のヒドロゲル、ミクロスフェア、スカフォールド、繊維マトリックス）及び／又は表面／体積比が高いマトリックス（湿潤の又は脱水した膜及びフィルム）を形成することができる組成物に基づく適切な多糖系を開発した。このように、金属ナノ粒子を均一に取り込んでいるカチオン性分岐多糖により形成される系は、それ自体がナノ複合材料である。
【００１７】
従って、第一の態様において、本発明の目的は、少なくとも一種の中性又はアニオン性の（リオトロピック、サーモトロピック又はサーモ−リオトロピックの）多糖と、金属ナノ粒子が均一に分散し且つ安定化している少なくとも一種のカチオン性分岐多糖からなる金属系ナノ複合材料とからなるポリマーマトリックスを含む三次元ナノ複合材料にあり、ここで、上記中性又はアニオン性多糖は、中性又はアニオン性多糖それ自体の種類に応じた適切な物理的又は化学的ゲル化手段によりゲル化されている。
【００１８】
コアセルベートの形成を引き起こさないために、適切なｐＨ値及びイオン強度で作業することで、金属ナノ粒子含有カチオン性分岐多糖の溶液を中性又はアニオン性多糖溶液と混合することができた。次いで、適切なゲル化手段により、イオンチャンネル型又は温度転移型ゲルを形成する中性又は酸性多糖の能力を利用することによって、それらの中性又はアニオン性多糖と、枝分かれした塩基性多糖それ自体を介して均一に分散し且つ安定化している金属ナノ粒子を取り込んでいる枝分かれした塩基性多糖との混合物からなる、水和又は非水和の三次元マトリックスを得ることができた。
【００１９】
従って、第二の態様において、本発明の目的は、少なくとも一種のリオトロピック、サーモトロピック又はサーモ−リオトロピックの中性又はアニオン性多糖と、金属ナノ粒子が均一に分散し且つ安定化している少なくとも一種のカチオン性分岐多糖からなる金属系ナノ複合材料とからなるポリマーマトリックスを含む三次元ナノ複合材料の製造方法であって、前記三次元ナノ複合材料は、少なくとも一種のリオトロピック、サーモトロピック又はサーモ−リオトロピックの中性又はアニオン性多糖と、金属ナノ粒子を取り込んでいる少なくとも一種のカチオン性分岐多糖からなる金属系ナノ複合材料の水溶液から得られることを特徴とする製造方法であり、ここで、それらの水溶液は、イオン強度が少なくとも５０ｍＭで且つ３５０ｍＭ以下であり、ｐＨが少なくとも７であり、また、それらの水溶液は、リオトロピック、サーモトロピック又はサーモ−リオトロピックの中性又はアニオン性多糖のゲル化をもたらすことが可能な物理的又は化学的ゲル化手段によって処理される。それらの水溶液は、モル浸透圧濃度が２５０〜３００ｍＭの範囲にあることが好ましい。
【００２０】
よって、かかる製造方法により得られる三次元ナノ複合材料もまた本発明の目的である。
【００２１】
その上、本発明に従う三次元ナノ複合材料は、強力な広域スペクトル抗菌活性を有しているものの、細胞毒性効果がないことが分かった。
【００２２】
従って、本発明の更なる目的は、生物医学分野における、特には抗菌用途のための、それら三次元ナノ複合材料の使用である。実際、本発明の対象である三次元複合材料は、皮膚科学分野（例えば、血管代謝皮膚潰瘍）及び整形外科分野（例えば、骨人工関節用被膜）、歯科分野（歯周病原性細菌感染の治療）、心臓病分野、泌尿器科分野（ステント用被膜）、並びに一般的な手術治療分野における生体材料としての有用な適用を約束する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】その図は、ラクトースによるキトサン誘導体（Ｃ：以下、キトラック（Ｃｈｉｔｌａｃ）と称する：ＣＡＳ登録番号８５９４１−４３−１）に基づく銀ナノ粒子（ｎＡｇ）によって形成された金属系ナノ複合材料をアルギネート（Ａ）マトリックス中に含むヒドロゲル形態の三次元ナノ複合材料を示す（ＡＣ−ｎＡｇゲル）。その組成は、０．２％（ｗ／ｖ）キトラック、１．５％（ｗ／ｖ）アルギネート、０．５ｍＭのＡｇＮＯ３、０．２５ｍＭのＣ６Ｈ８Ｏ６、１０ｍＭのヘペス緩衝液、３０ｍＭのＣａＣＯ３、６０ｍＭのＧＤＬ（Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン）である。ヒドロゲルの調製を例８に記載する。
【図２】その図は、キトラック系金ナノ粒子（ｎＡｕ）によって形成される金属系ナノ複合材料をアルギネートマトリックス中に含むヒドロゲル形態の三次元ナノ複合材料を示す（ＡＣ−ｎＡｕゲル）。その組成は、０．２％（ｗ／ｖ）キトラック、１．５％（ｗ／ｖ）アルギネート、０．５ｍＭのＨＡｕＣｌ４、１０ｍＭのヘペス緩衝液、３０ｍＭのＣａＣＯ３、６０ｍＭのＧＤＬである。その調製を例９に記載する。
【図３】その図は、三次元ナノ複合材料ＡＣ−ｎＡｇゲルのミクロスフェアを示す（０．２％（ｗ／ｖ）キトラック、１．５％（ｗ／ｖ）アルギネート、０．５ｍＭのＡｇＮＯ３、０．２５ｍＭのＣ６Ｈ８Ｏ６、１０ｍＭのヘペス緩衝液、３０ｍＭのＣａＣＯ３、６０ｍＭのＧＤＬ）。その調製を例１３に記載する。
【図４】その図は、アルギネート−キトラックヒドロゲル形態の三次元ナノ複合材料（ＡＣゲル、例６、左側）に関し、アルギネート−キトラック−ｎＡｇヒドロゲル形態の三次元ナノ複合材料（ＡＣ−ｎＡｇゲル、例８、右側）と比較した、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ２５９２２の細菌増殖テストを示す。
【図５】その図は、三次元ナノ複合材料ＡＣ−ｎＡｇミクロスフェアを含有する懸濁液と２４０分間接触したＥ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ２５９２２の細菌コロニー計数テストを示す。ミクロスフェアの調製を例１３に記載する。そのコントロールは、２０％ミューラー・ヒントン培地での増殖によって表される（Ｔ０及び２４０ｍｉｎ）。
【図６】その図は、三次元ナノ複合材料アルギネート−キトラックヒドロゲル（ＡＣゲル、例６、左側）に関し、三次元ナノ複合材料アルギネート−キトラック−ｎＡｕヒドロゲル（ＡＣ−ｎＡｇゲル、例９、右側）と比較した、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ２５９２２の細菌増殖テストを示す。
【図７】その図は、接触による三次元ナノ複合材料ＡＣ−ｎＡｇゲル（例８、斜線）並びに３７℃の培地中での２４時間及び７２時間後の関連抽出物の、ＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）放出として評価される、線維芽細胞株（ＮＩＨ−３Ｔ３）に関する細胞毒性テストを示す。そのコントロールは、ｉ）接着細胞（コントロール、コンフルエント）、ｉｉ）銀ナノ粒子がない場合のアルギネート−キトラックゲルと接触した細胞（ＡＣゲル、例６、横線）、ｉｉｉ）銀ナノ粒子がない場合のアルギネート−キトラックゲルからの所定の時間（２４時間）材料と接触して保たれた液体培地（以下、「抽出物」と称する）と接触した細胞（ＡＣゲル抽出物、直交メッシュ）によって表される。
【図８】その図は、接触による三次元ナノ複合材料ＡＣ−ｎＡｕゲル（例９、ＡＣ−ｎＡｕ Ｃｏｎｔ．）並びに３７℃の培地中での２４時間及び７２時間後の関連抽出物（ＡＣ−ｎＡｕ Ｅｓｔ．）の、ＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）放出として評価される、骨芽細胞株（ＭＧ６３）に関する細胞毒性テスト（ＬＤＨ）を示す。そのコントロールは、接着細胞（接着）、金属ナノ粒子がない場合のアルギネート−キトラックゲルと接触した細胞（例６、ＡＣ Ｃｏｎｔ．）、金属ナノ粒子がない場合のアルギネート−キトラックゲルからの抽出物（ＡＣ Ｅｓｔ）、ＺｎＤＢＣを含むポリウレタンディスクと接触した細胞（ＰＵ、ＩＳＯ１０９９３−５に従う接触系のポジティブコントロール）、Ｔｒｉｔｏｎ溶液での細胞（抽出物のポジティブコントロール）によって表される。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
定義
三次元構造体：その定義は、本願の目的のため、変形を受けない場合に形状及び大きさを維持することが可能な、水和又は非水和の構造体を示す。
【００２５】
本発明に開示の三次元構造体は、以下詳細に説明されるポリカチオン性分岐多糖中において均一に且つ永久に分散している金属ナノ粒子によって形成された材料を含む中性又はアニオン性多糖マトリックスによって形成されるナノ複合材料である。よって、第一の例においては、「三次元ナノ複合材料」の定義は、本発明のナノ複合材料を示すのに使用される。
【００２６】
ヒドロゲル：一般に、「ヒドロゲル」の語は、変形を受けない場合に形状及び大きさを維持することが可能な、非常に水和している半固体の三次元構造体を示す。それらは、適切に架橋した多糖の半希釈溶液から得られる場合がある。
【００２７】
以下の説明において、「ナノ複合材料ヒドロゲル」はまた、先に定義したように、水和した場合の本発明の三次元ナノ複合材料構造体を示すのに使用できる。
【００２８】
ナノ複合材料：一般に、「ナノ複合材料」の語は、巨視的材料（マトリックス）を介したナノメートルサイズの粒子（充填材）からなる系を示す。本発明は、中性又はアニオン性多糖マトリックスにおけるナノ複合材料（例えば、枝分かれしたカチオン性多糖中で均一且つ永久に分散している金属ナノ粒子）の包含から生じる三次元ナノ複合材料であるが、ここで、この前者の材料は、主に「金属系ナノ複合材料」として示される。特に、金属系ナノ複合材料は、キトサンのアルジトール又はアルドン酸多糖誘導体による又は該誘導体中での金属イオンの還元によって形成された金属ナノ粒子で構成されている。よって、以下の説明においては、「金属系ナノ複合材料」の他、この材料に関連して、「金属ナノ粒子系ナノ複合材料」を用いる。
【００２９】
コロイド溶液（又はコロイド）：サイズが１〜１，０００ｎｍの粒子が連続溶媒中に分散している系である。
【００３０】
「インサイチューでの」ゲル化：ゲル化剤の制御された放出がある（例えば、アルギネートのＣａ２＋イオン）ゲル化方法である。これは、ゲル化剤がその後第二成分（例えば、グルコノ−δ−ラクトン、ＧＤＬ）を加えるときに放出される不活性化形態のゲル化剤（例えば、ＣａＣＯ３）を使用することによって達成される。
【００３１】
本発明に記載される三次元ナノ複合材料の目的及び利点は、本発明の非限定的な例として、三次元ナノ複合材料を調製する一部の例とそれらの抗菌活性及び細胞毒性を評価する生物学的特性評価を記載する以下の詳細な説明から、より一層理解されることになる。
【００３２】
説明
達成しようとする目的のため、金属ナノ粒子のナノスケールに関する特性を利用する多糖系ナノ複合材料系の調製及び特徴付けに関する側面が取り組まれている。
【００３３】
本発明によれば、三次元ナノ複合材料は、少なくとも一種のリオトロピック、サーモトロピック又はサーモ−リオトロピックの中性又はアニオン性多糖と、カチオン性分岐多糖中で均一に分散し且つ安定化している金属ナノ粒子を取り込んでいる少なくとも一種のカチオン性分岐多糖からなる金属系ナノ複合材料との組成物からなるポリマーマトリックスから形成される。枝分かれしたカチオン性多糖は、本発明に従う三次元ナノ複合材料における二重の機能を有しており：ｉ）一側面では、主として金属ナノ粒子を適切に取り込み安定化させる機能と、ｉｉ）他の側面では、追加として、三次元マトリックスが主に中性又はアニオン性多糖の適切なゲル化手段によりゲルを形成する能力によるものであるため、実質的に多糖（例えば、少なくとも一種のリオトロピック、サーモトロピック又はサーモ−リオトロピックの中性又はアニオン性多糖と少なくとも一種のカチオン性分岐多糖）の組成物であるマトリックスの形成に貢献する機能である。よって、かかる多糖の組成物は、一の可能性がある実施態様において２成分であり、中性又は酸性多糖と枝分かれしたカチオン性多糖とによって形成される。
【００３４】
本発明の目的に有用な中性又は酸性多糖は、ａ）アルギネート、ペクテート及びペクチネートよりなる群から選択される、リオトロピックゲルが形成可能な酸性多糖；ｂ）サーモトロピックゲルを生じることが可能な中性多糖（この場合、それらは、アガロース、スクレログルカン、シゾフィラン、及びカードランよりなる群から選択されるのが好ましい）；ｃ）サーモ−リオトロピックゲルを生じることが可能な酸性多糖（この場合、それらは、硫酸アガロース、ι−及びκ−カラギーナン、硫酸セルロース、ジェランガム、ラムサンガム、ウィーランガム（ウエランガムとも呼ぶ）、並びにキサンタンガムよりなる群から選択されるのが好ましい）である。
【００３５】
中性又は酸性多糖の平均分子量（ＭＷ）は、２，０００ｋＤａ以下とすることができ、好ましくは１００ｋＤａ〜１，０００ｋＤａであり、２００ｋＤａの平均分子量を用いるのが更に好ましい。
【００３６】
よく知られているように、それらの中性又はアニオン性多糖は、適切な条件下で三次元構造体（水和の場合、ゲル様又はヒドロゲル）を形成する特徴を有する。実際、ヒドロゲルの形成に関する側面は、実質的に、リオトロピック多糖のイオン溶液又はサーモトロピック多糖の冷却溶液と接触したときに中性又はアニオン性多糖がヒドロゲルをすぐに形成する能力に関係している。酸性のサーモ−リオトロピック多糖の場合、ゲル化手段は、物理的及び／又は化学的なものの双方／一方とすることができ、そのため、イオンでも適切な温度でもその両方でもよい。
【００３７】
一方、金属ナノ粒子の形成及び保有に関する側面は、実質的に、第二の多糖成分、即ち枝分かれしたカチオン性多糖に関係している。本発明の目的のため、キトサンのアジトール又はアルドン酸分岐誘導体があり、ここで、Ｄ−グルコサミン単位は、炭素原子Ｃ２上の−ＮＨ−官能基を用いて線状キトサン鎖結合を形成し、単糖又はオリゴ糖のアルジトール又はアルドン酸ポリオール残基は、互いに同一であるか又は異なっており、一般式（Ｉ）
【化１】
［式中：
Ｒは、−ＣＨ２−又は−ＣＯ−であり；
Ｒ１は、水素、又は単糖、又はオリゴ糖であり；
Ｒ２は、−ＯＨ又は−ＮＨＣＯＣＨ３である］によって表される。
【００３８】
代表する目的のため、キトサン分岐誘導体における単糖又はオリゴ糖のアルジトール又はアルドン酸ポリオール残基で置換されたＤ−グルコサミン単位は、一般式（ＩＩ）によって表され、ここで、「ｎ」は線状キトサン鎖を構成するＤ−グルコサミン単位の総数を指す：
【化２】
【００３９】
本発明の目的のため、好ましいキトサンの分岐誘導体において、Ｒ１が単糖である場合には、前記単糖が、ガラクトース、グルコース、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、及びＮ−アセチルガラクトサミンよりなる群から選択され、Ｒ１がオリゴ糖である場合には、前記オリゴ糖が、２個のグリコシド単位を含むことができる。
【００４０】
一般式（Ｉ）のアルジトール又はアルドン酸の単糖又はオリゴ糖残基は、１〜３個のグリコシド単位を含む単糖又はオリゴ糖であることが好ましく、更に好ましい態様によれば、それらアルジトール又はアルドン酸のポリオール残基は、２〜３個のグリコシド単位を含むオリゴ糖の残基であり、一層好ましくは、ラクトース、セロビオース、セロトリオース、マルトース、マルトトリオース、キトビオース、キトトリオース及びマンノビオース並びにそれらの対応するアルドン酸よりなる群から選択される。本発明の目的のため、最も好ましいキトサンのオリゴ糖誘導体は、ラクトースによる誘導体である（キトラック；ＣＡＳ登録番号８５９４１−４３−１）。
【００４１】
その上、金属ナノ粒子を均一に分散し且つ安定化させるため、一般式（Ｉ）の単糖又はオリゴ糖によるキトサンアミノ基の化学置換度は、少なくとも４０％であることが必要である。キトサンアミノ基の前記単糖又はオリゴ糖による置換度は、５０％〜８０％の範囲が好ましく、７０％であることが更に好ましい。
【００４２】
上述のオリゴ糖誘導体を得るために使用できるキトサンの平均分子量（以下、ＭＷと称する）は、１，５００ｋＤａ以下であり、４００ｋＤａ〜７００ｋＤａの範囲が好ましい。
【００４３】
キトサンの単糖又はオリゴ糖分岐誘導体からなるポリマーマトリックス中に組み込まれる金属ナノ粒子は、銀、金、白金、パラジウム、銅、亜鉛、ニッケル及びそれらの混合物から優先的に選択される金属から作られる。
【００４４】
キトサンの単糖又はオリゴ糖分岐誘導体からなるポリマーマトリックス中に含まれるナノ粒子は、サイズが５ｎｍ〜１５０の範囲であり、特には、制御された平均金属ナノ粒子サイズが３０〜５０ｎｍである。
【００４５】
それらのナノ粒子の本質的特徴は、イオン性を持つわずかな原子で作られたクラスターの残留する存在を除外しないものの、それらのナノ粒子が主として還元形態の金属であるということと、多糖マトリックス中での分散／安定化においてはキトサンそれ自体のアミノ基に近接した単糖又はオリゴ糖側鎖が関与するということである。
【００４６】
それらに縛られるものではないものの、カチオン性多糖マトリックスと金属との好ましい比は、コロイド溶液の形態での金属系ナノ複合材料にゆだねられるが、前記金属系ナノ複合材料はまた脱水フィルム又は粉末の形態とすることもでき、更には該材料それ自体の調製からの残留する対イオンを除去するために透析さえされてもよい。コロイド水溶液の形態での金属系ナノ複合材料においては、出発金属塩の濃度（モル濃度として表される）に対する多糖濃度（％ｗ／ｖとして表される）の比が、０．００２５〜２０であり、好ましくは０．２である。
【００４７】
従って、カチオン性多糖のグラム当たりに組み込まれることのできる金属の質量（ｍｇとして表される）は、３，０００ｍｇ／ｇ〜０．３ｍｇ／ｇとすることができ、優先的には多糖のグラム当たりに組み込まれる金属が５０ｍｇである。
【００４８】
本発明に従う三次元ナノ複合材料のかかる成分は、適切な条件下、外因性還元剤の存在又は不在下における塩基性多糖の水溶液を用いて調製できる。
【００４９】
本発明に従う三次元ナノ複合材料のこの成分を調製する方法は、
ａ）枝分かれしたカチオン性多糖の水溶液を２％（ｗ／ｖ）以下の濃度で調製する工程と；
ｂ）金属塩の水溶液を０．１ｍＭ〜２０ｍＭの濃度で調製する工程と；
ｃ）それら多糖の溶液にそれら金属塩の溶液を加え、金属ナノ粒子が均一に分散しているコロイド溶液を得るまで混合する工程と；
を少なくとも含む。
【００５０】
得られるコロイド溶液に還元剤を加えることは任意である。
【００５１】
枝分かれしたカチオン性多糖の存在下での金属ナノ粒子の形成は、例外的によく分散して安定化した金属ナノ粒子系を作製し、一般にナノメートルスケールに関連する利益を失うことに至る、予備形成金属ナノ粒子の大きな凝集クラスターを溶液中で生じる周知の傾向を回避する。
【００５２】
その一般的な特徴において、金属系ナノ複合材料の調製方法は、次のとおりである：単糖又はオリゴ糖によるキトサン分岐誘導体の水溶液を異なる濃度（２％（ｗ／ｖ）以下、好ましくは０．０５％（ｗ／ｖ）〜１％（ｗ／ｖ）、更に好ましくは０．２％）で調製する。次いで、金属の最終濃度を０．１ｍＭ〜２０ｍＭ、更に好ましくは１ｍＭ〜１４ｍＭ、一層好ましくは１ｍＭで得るために、その多糖溶液を、銀、金、白金、パラジウム、銅、亜鉛及びニッケルから選択され、好ましくは塩化物、過塩素酸塩及び硝酸塩から選択される金属塩（例えば、ＡｇＮＯ３、ＨＡｕＣｌ４、ＣｕＳＯ４、ＺｎＣｌ２、ＮｉＣｌ２）の溶液と混合する。アスコルビン酸、クエン酸ナトリウム、水素化ホウ素ナトリウム及びシアノ水素化ホウ素ナトリウムから選択されるのが好ましい適切な既知の還元剤を、金属状態のナノ粒子を得るために、該溶液へ任意に加えることができる。上記還元剤は、０．０５ｍＭ〜１０ｍＭの濃度で加えられ、該濃度は０．５ｍＭであるのが好ましい。
【００５３】
しかしながら、別のやり方として、他のポリマー系については、単糖又はオリゴ糖側鎖が本質的に金属イオンの還元剤として作用し、ポリマーマトリックス中に分散しているナノ粒子をインサイチューで形成することが可能であるため、還元剤がない場合でも、単糖又はオリゴ糖によるキトサン分岐誘導体と金属ナノ粒子とから形成される金属系ナノ複合材料を調製できることを見出した。この場合、金属ナノ粒子は、キトサン誘導体溶液を、選択された金属の塩溶液と適切な濃度で単に混合するだけで得られる。また、この場合、多糖及び金属塩の濃度は、先に報告したとおりである。
【００５４】
しかしながら、両方の場合では、キトサンの単糖又はオリゴ糖分岐誘導体上に存する窒素原子及び側部置換基の化学特性及び物理化学特性のため、金属イオンは、配位相互作用によって高分子と相互作用しており、一方、単糖又はオリゴ糖、例えばラクトースの側鎖の存在は、ナノ粒子が凝集しようとする自然な傾向を妨げるために効果的な立体障害を提供する。外因性還元剤又はキトサン分岐誘導体の単糖若しくはオリゴ糖鎖によって生じるその後のイオン還元は、多糖鎖によって安定化したナノ粒子の形成をもたらす。
【００５５】
両方の場合において、組み込まれ得る銀の質量と多糖の質量の割合は、先に報告したとおりであり、グラム当たりのｍｇとして報告される。
【００５６】
予想外にも、上述の中性又は酸性多糖、特にはアルギネートからなるポリマー成分と、一般式（Ｉ）のアルジトール又はアルドン酸ポリオールによるキトサンの分岐誘導体であって、金属ナノ粒子を備え、既に本質的にはナノ複合材料（例えば金属系ナノ複合材料）である塩基性多糖のポリマー成分とを水溶液中で混合すると、得られるナノ複合材料は、三次元マトリックスであるか又は安定なヒドロゲルであり、金属ナノ粒子の存在にもかかわらず、それらは本質的にコアセルベートでなく、該ナノ粒子はキトサンの分岐誘導体中に均一に分散したままであることが分かった。
【００５７】
実際、本発明に従うヒドロゲル又は三次元マトリックスの形成は、二つの成分（例えば、中性又は酸性多糖及び金属系ナノ複合材料）を水溶液中で混合することによって得られ、アニオン性又は中性多糖をゲル化することが可能な適切な薬剤によるその後の処理によって適当な特徴を有する。
【００５８】
特に、少なくとも一種の中性又はアニオン性のリオトロピック、サーモトロピック又はサーモ−リオトロピック多糖と、均一に分散し且つ安定化した金属ナノ粒子を取り込んでいる少なくとも一種の枝分かれしたカチオン性多糖からなる金属系ナノ複合材料とからなるポリマーマトリックスを含む三次元ナノ複合材料は、溶液のイオン強度が少なくとも５０ｍＭで且つ３５０ｍＭ以下であり、ｐＨが少なくとも７である二つの成分の水溶液から、それらの溶液を、中性又はアニオン性のリオトロピック、サーモトロピック又はサーモ−リオトロピック多糖をゲル化することが可能な化学的又は物理的ゲル化手段により処理することにより得られる。
【００５９】
それら二つの成分から三次元マトリックス又はヒドロゲルを得るための好適な条件（実質的には濃度、ｐＨ、イオン強度）は、典型的に、ｐＨが生理的範囲で、特には７〜８の間で、更に好ましくはｐＨが７．４であり、モル浸透圧濃度が２５０〜３００ｍＭであり、イオン強度が５０ｍＭ〜３５０ｍＭで、好ましくは１５０ｍＭであり、好ましくはＮａＣｌを０．０５Ｍ〜０．３５Ｍ、更に好ましくは０．１５Ｍの濃度で加えることにより得られる水溶液である。
【００６０】
上記ゲル化手段は、リオトロピックアニオン性多糖の種類によって適切な１価、２価又は３価のイオンから選択でき、サーモトロピック多糖については、５０℃以下又は１０℃以上の温度間で選択できる。知られているように、サーモ−リオトロピック多糖について、ゲル化手段は、イオン等の化学的手段と、温度等の物理的手段との両方であり得る。２種類のゲル化手段間での選択は、当該技術分野においてよく知られているように、ゲル化されるべき酸性のサーモ−リオトロピック多糖によって実質的に決まる。
【００６１】
アルギネート及びペクテート等の多糖について、それらのイオンは、マグネシウムを除いたアルカリ土類イオン及び遷移金属であり、カルシウム、バリウム、ストロンチウム、鉛、銅、マンガン及びそれらの混合物よりなる群から選択されるのが好ましく、又はそれらは、希土類イオンであり、ガドリニウム、テルビウム、ユーロピウム及びそれらの混合物よりなる群から選択されるのが好ましい。
【００６２】
ゲル化に適合したそれらイオンの水溶液の濃度は、１０ｍＭより高く、好ましくは１０ｍＭ〜１００ｍＭであり、更に好ましくは５０ｍＭである。そのゲル化溶液は、ＣａＣｌ２の濃度が５０ｍＭで、イオン強度が０．１５Ｍであるのが好ましい。
【００６３】
カラギーナンの場合、好ましくはカリウム、ルビジウム及びセシウムよりなる群から選択され、５０ｍＭ以上、好ましくは５０ｍＭ〜２００ｍＭ、更に好ましくは０．１Ｍの濃度のアルカリイオンを用いることができる。
【００６４】
例えばアガロースのようなサーモトロピックヒドロゲルに導く多糖溶液の場合、ヒドロゲルの調製は、ゲル形成温度より低い温度に冷却することによって行われる。該多糖溶液は、サーモトロピック多糖によるヒドロゲル形成が生じる温度より高い温度で調製される。この温度では、サーモトロピック多糖はヒドロゲルを形成しない。多糖溶液を調製する温度は、好ましくは５０℃〜３０℃の範囲であり、更に好ましくは３７℃である。ヒドロゲルの形成は、ゲル形成温度より低い温度に冷却されたゲル化槽中に多糖溶液を滴下することで起こる。この温度は、好ましくは１０℃〜４０℃の範囲であり、更に好ましくは２０℃である。
【００６５】
本発明の目的のため、中性又はアニオン性多糖と金属ナノ粒子を含む枝分かれした塩基性多糖との少なくとも２成分の混合物は、中性又はアニオン性多糖の総ポリマー濃度が４％（ｗ／ｖ）以下である。それら総ポリマー濃度は、好ましくは１．５％〜３％（ｗ／ｖ）の範囲であり、更に好ましくは２％（ｗ／ｖ）である。
【００６６】
本発明の目的のため、酸性多糖と金属ナノ粒子が取り込まれているカチオン性多糖との重量比は、８：１〜１：１（中性又はアニオン性多糖：カチオン性多糖）であり、好ましくは８：１〜５：１であり、更に好ましくは７．５：１である。
【００６７】
従って、本発明の三次元ナノ複合材料は、少なくとも以下の工程を含む調製方法に従って得られる：
ｉ．少なくとも一種の中性又はアニオン性のリオトロピック、サーモトロピック又はサーモ−リオトロピック多糖と、（上述のようにして調製された）金属ナノ粒子を取り込んでいる少なくとも一種のキトサンの単糖又はオリゴ糖誘導体からなる金属系ナノ複合材料との混合物の水溶液を調製する工程であって、前記水溶液はイオン強度が少なくとも５０ｍＭで且つ３５０ｍＭ以下であり、ｐＨが少なくとも７である工程と；
ｉｉ．先の工程で調製した混合物の水溶液を、適切な化学的又は物理的ゲル化手段を用いて処理することにより、中性又はアニオン性のリオトロピック、サーモトロピック又はサーモ−リオトロピック多糖をゲル化する工程である。
【００６８】
特に、この後者の工程は、リオトロピックアニオン性多糖の架橋イオンを含有する溶液中に又はサーモトロピック多糖の適切な温度の溶液中に針を通して滴下することで、或いは「インサイチューでの」ゲル化により実現できる。サーモ−リオトロピック多糖については、ゲル化プロセスのためのイオン溶液及び適切な温度の溶液の両方を用いることができる。
【００６９】
上述の方法の場合、ナノ複合材料が得られ、ここで、多糖から作ったポリマーマトリックスは、三次元であって、ヒドロゲルの形態であるか又はその後の脱水プロセスを受けた場合には非水和の形態である。更に、それらのマトリックスは、シリンダー、ミクロスフェア、ディスク、乾燥フィルム及び粉末として様々な形態をとることができ、又は繊維を作るために押し出すことができる。
【００７０】
アルギネートの場合、シリンダーは、不活性形態の架橋イオン、例えばＣａＣＯ３又はＣａ−ＥＤＴＡ錯体を多糖溶液に加えることで調製できる。次いで、例えばＧＤＬ（Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン）のような、ゆっくりと加水分解する物質を加える。例えば、この懸濁液を、シリンダー形状の又は円盤状の容器内に移し、そこで２４時間保つ。次いで、多糖溶液のゲルシリンダーを容器から抜き出す。インサイチューでのシリンダー形成は、カルシウムイオンの放出による。
【００７１】
本発明の三次元ナノ複合材料の抗菌活性を試験するため、三次元ナノ複合材料ゲルのミクロスフェアの存在下における、半固体支持体上での細菌増殖テストと細菌コロニーの計数テストとを行い；金属ナノ粒子の存在のため、かかるゲル表面や三次元ナノ複合材料ゲルのミクロスフェアと接触して置かれた懸濁液中では細菌が増殖しないことを示し、それにより、強い抗菌活性が明確に示される。
【００７２】
異なる真核細胞株に関する細胞毒性テストは、それらの三次元ナノ複合材料ゲルが効果的な殺菌効果を維持していても、細胞毒性がないことを示す。
【００７３】
以下、非制限的な例証目的のため、本発明に従うヒドロゲル又は非水和３Ｄマトリックスの調製と、その抗菌性タイプの生物活性とを説明する。
【実施例】
【００７４】
一つのアニオン性多糖と、金属ナノ粒子を含む一つのキトサンオリゴ糖誘導体からなる金属系ナノ複合材料との溶液からの三次元ナノ複合材料ヒドロゲルの調製
例１：ラクトースによるキトサン誘導体（以下、「キトラック（Chitlac）」）の合成
メタノール溶液（５５ｍＬ）及びｐＨ４．５の１％酢酸緩衝液（５５ｍｌ）の１１０ｍＬ中に、キトサン（１．５ｇ、アセチル化度１１％）を溶解する。ラクトース（２．２ｇ）及びシアノ水素化ホウ素ナトリウム（９００ｍｇ）を含有する、メタノール溶液（３０ｍＬ）及びｐＨ４．５の１％酢酸緩衝液（３０ｍＬ）の６０ｍＬを加える。その混合物を２４時間攪拌して置いておき、透析管（カットオフ１２，０００Ｄａ）に移し、４℃での伝導率が４μＳに到達するまで０．１ＭのＮａＣｌ（２回の交換）及び脱イオン水で透析する。最後に、その溶液をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ０．４５μｍフィルター上にろ過し、凍結乾燥する。
【００７５】
例２：セロビオースによるキトサン誘導体（以下、「キトセル（Chitcell）」）の合成
メタノール溶液（５５ｍＬ）及びｐＨ４．５の１％酢酸緩衝液（５５ｍＬ）の１１０ｍＬ中に、キトサン（１．５ｇ、アセチル化度１１％）を溶解する。セロビオース（２．２ｇ）及びシアノ水素化ホウ素ナトリウム（９００ｍｇ）を含有する、メタノール溶液（３０ｍＬ）及びｐＨ４．５の１％酢酸緩衝液（３０ｍＬ）の６０ｍＬを加える。その混合物を２４時間攪拌して置いておき、透析管（カットオフ１２，０００Ｄａ）に移し、４℃での伝導率が４μＳに到達するまで０．１ＭのＮａＣｌ（２回の交換）及び脱イオン水で透析する。最後に、その溶液をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ０．４５μｍフィルター上にろ過し、凍結乾燥する。
【００７６】
例３：キトラック中に銀ナノ粒子を含む金属系ナノ複合材料の調製
以下の手順に従うキトラック溶液中でのアスコルビン酸による金属イオンの還元時にナノ粒子が得られる：濃度０．４％（ｗ／ｖ）のキトラック水溶液を調製する。次いで、１ｍＭのＡｇＮＯ３最終濃度を得るために、そのキトラック溶液を硝酸銀溶液と混合する。次いで、０．５ｍＭの最終濃度を得るために、アスコルビン酸溶液を加える。
【００７７】
例４：キトセル中に銀ナノ粒子を含む金属系ナノ複合材料の調製
以下の手順に従うキトセル溶液中でのアスコルビン酸による金属イオンの還元時にナノ粒子が得られる：濃度０．４％（ｗ／ｖ）のキトセル水溶液を調製する。次いで、１ｍＭのＡｇＮＯ３最終濃度を得るために、そのキトセル溶液を硝酸銀溶液と混合する。次いで、０．５ｍＭに等しい最終濃度を得るために、アスコルビン酸溶液を加える。
【００７８】
例５：キトラック中に金ナノ粒子を含む金属系ナノ複合材料の調製
以下の手順に従う多糖キトラックによる金属イオンの還元時にナノ粒子が得られる：濃度０．４％（ｗ／ｖ）のキトラック水溶液を調製する。次いで、１ｍＭのＨＡｕＣｌ４最終濃度を得るために、そのキトラック溶液を四塩化金酸と混合する。
【００７９】
例６：アルギネート−キトラックに基づくシリンダー形状ヒドロゲルの、「インサイチューでの」ゲル化を用いた調製
キトラック溶液に、ＮａＣｌ及びヘペス緩衝液の存在下、アルギネート溶液を、以下の最終濃度を得るために加える：１．５％（ｗ／ｖ）アルギネート、０．２％（ｗ／ｖ）キトラック、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１Ｍのヘペス緩衝液、ｐＨ７．４である。次いで、ＣａＣＯ３溶液（濃度３０ｍＭ）を加え、その後、緩徐なゲル化が可能なように、Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン（ＧＤＬ）（［ＧＤＬ］／［Ｃａ２＋］＝２）を加える。抗菌性試験のため、２０％ミューラー−ヒントン培地を加える（４．２ｇ／Ｌ）。その最終溶液を、要望通りの大きさのプラスチックシリンダー（例えば１６ｍＭ（φ）×１８ｍＭ（ｈ））に移し、暗闇で２４時間置いておき、ゲル化させる。
【００８０】
例７：アルギネート−キトラック及び金属ナノ粒子に基づく三次元ナノ複合材料ヒドロゲルの、「インサイチューでの」ゲル化を用いた調製
例３に従い調製した金属ナノ粒子を含むキトラック溶液を、ＣａＣＯ３（最終濃度は４０ｍＭ以下、好ましくは１５ｍＭ〜３０ｍＭである）の存在下、アルギネート溶液（最終アルギネート濃度は４％（ｗ／ｖ）以下、好ましくは１％（ｗ／ｖ）〜２％（ｗ／ｖ）の範囲である）に加え、次いで、緩徐なゲル化が可能なように、Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン（ＧＤＬ）（［ＧＤＬ］／［Ｃａ２＋］＝２）を加える。抗菌性試験のため、２０％最終ミューラー−ヒントン培地を加える（４．２ｇ／Ｌ）。
【００８１】
例８：アルギネート−キトラック及び銀ナノ粒子に基づくシリンダー形状三次元ナノ複合材料ヒドロゲルの、「インサイチューでの」ゲル化を用いた調製
例３に従い調製した銀ナノ粒子を含むキトラック溶液に、ＮａＣｌ及びヘペス緩衝液の存在下、アルギネート溶液を、以下の最終濃度を得るために加える：１．５％（ｗ／ｖ）アルギネート、０．２％（ｗ／ｖ）キトラック、０．５ｍＭのＡｇＮＯ３、０．２５ｍＭのＣ６Ｈ８Ｏ６、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１Ｍのヘペス緩衝液、ｐＨ７．４である。次いで、ＣａＣＯ３溶液（濃度３０ｍＭ）を加え、その後、緩徐なゲル化が可能なように、Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン（［ＧＤＬ］／［Ｃａ２＋］＝２）を加える。抗菌性試験のため、２０％ミューラー−ヒントン培地を加える（４．２ｇ／Ｌ）。その最終溶液を、要望通りの大きさのプラスチックシリンダー（例えば１６ｍＭ（φ）×１８ｍＭ（ｈ））に移し、暗闇で２４時間置いておき、ゲル化させる。
【００８２】
粒子凝集又はポリマー相分離はゲル化中及びゲル化後に発生しないことを明確に示すことには価値がある。図１において分かるように、得られた三次元ナノ複合材料は、黄色−オレンジ色のヒドロゲルである（その色は、銀の濃度によって変わる）。
【００８３】
例９：アルギネート−キトラック及び金ナノ粒子に基づくシリンダー形状三次元ヒドロゲルの、「インサイチューでの」ゲル化を用いた調製
例５に従い調製した金ナノ粒子を含むキトラック溶液に、ＮａＣｌ及びヘペス緩衝液の存在下、アルギネート溶液を、以下の最終濃度を得るために加える：１．５％（ｗ／ｖ）アルギネート、０．２％（ｗ／ｖ）キトラック、０．５ｍＭのＨＡｕＣｌ４、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１Ｍのヘペス緩衝液、ｐＨ７．４である。次いで、ＣａＣＯ３溶液（濃度３０ｍＭ）を加え、その後、緩徐なゲル化が可能なように、Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン（ＧＤＬ）（［ＧＤＬ］／［Ｃａ２＋］＝２）を加える。抗菌性試験のため、２０％ミューラー−ヒントン培地を加える（４．２ｇ／Ｌ）。その最終溶液を、要望通りの大きさのプラスチックシリンダー（例えば１６ｍＭ（φ）×１８ｍＭ（ｈ））に移し、暗闇で２４時間置いておき、ゲル化させる。
【００８４】
得られた三次元ナノ複合材料ヒドロゲルサンプルを図２に示す。
【００８５】
例１０：銀ナノ粒子の場合の（マンニトールに）アルギネート−キトラック溶液からのシリンジを用いた三次元ナノ複合材料スフェアの調製
以下の最終濃度の多糖溶液を調製した。１．５％（ｗ／ｖ）アルギネート、０．２％（ｗ／ｖ）キトラック、０．５ｍＭのＡｇＮＯ３、０．２５ｍＭのＣ６Ｈ８Ｏ６、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１Ｍのヘペス緩衝液、ｐＨ７．４である。２３Ｇ針付きシリンジを用い、その溶液を、５０ｍＭのＣａＣｌ２及び０．１５Ｍのマンニトール並びに１０ｍＭのヘペス緩衝液（ｐＨ７．４）を含有する溶液中に、磁気ロッドによって攪拌しながら滴下した。その球体は、ゲル化槽中で１０分間攪拌しながら保たれ、その後、除去し、脱イオン水で洗浄した。
【００８６】
例１１：銀ナノ粒子の場合の（ＮａＣｌに）アルギネート−キトラック溶液からのシリンジを用いた三次元ナノ複合材料スフェアの調製
以下の最終濃度の多糖溶液を調製した。１．５％（ｗ／ｖ）アルギネート、０．２％（ｗ／ｖ）キトラック、０．５ｍＭのＡｇＮＯ３、０．２５ｍＭのＣ６Ｈ８Ｏ６、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１Ｍのヘペス緩衝液、ｐＨ７．４である。２３Ｇ針付きシリンジを用い、その溶液を、５０ｍＭのＣａＣｌ２及び０．１５Ｍのマンニトール並びに１０ｍＭのヘペス緩衝液（ｐＨ７．４）を含有する溶液中に、磁気ロッドによって攪拌しながら滴下した。その球体は、ゲル化槽中で１０分間攪拌しながら保たれ、その後、除去し、脱イオン水で洗浄した。
【００８７】
例１２：金ナノ粒子の場合のアルギネート−キトラック溶液からのシリンジを用いた三次元ナノ複合材料スフェアの調製
以下の最終濃度の多糖溶液を調製した。１．５％（ｗ／ｖ）アルギネート、０．２％（ｗ／ｖ）キトラック、０．５ｍＭのＨＡｕＣｌ４、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１Ｍのヘペス緩衝液、ｐＨ７．４である。２３Ｇ針付きシリンジを用い、その溶液を、５０ｍＭのＣａＣｌ２及び０．１５Ｍのマンニトールを含有する溶液（ゲル化槽）中に、磁気ロッドによって攪拌しながら滴下した。その球体は、ゲル化槽中で１０分間攪拌しながら保たれ、その後、除去し、脱イオン水で洗浄した。
【００８８】
例１３：銀ナノ粒子の場合のアルギネート−キトラック溶液からの静電ビーズ発生器を用いた三次元ナノ複合材料ミクロスフェアの調製
以下の最終濃度の多糖溶液を調製した。１．５％（ｗ／ｖ）アルギネート、０．２％（ｗ／ｖ）キトラック、０．５ｍＭのＡｇＮＯ３、０．２５ｍＭのＣ６Ｈ８Ｏ６、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１Ｍのヘペス緩衝液、ｐＨ７．４である。その溶液を、５０ｍＭのＣａＣｌ２及び０．１５ｎｍのマンニトールを含有するゲル化槽中に、磁気ロッドによって攪拌しながら滴下した。静電発生器を用いてミクロスフェアのサイズを制御しており、該静電発生器は、そのサイズを縮小するために滴の表面張力に作用することが可能である。使用される条件は、典型的に、電圧５ｋＶ、内部針の直径０．７ｍＭ、ゲル化槽と針の間の距離４ｃｍ、２成分ポリマー溶液の流量１０ｍＬ／ｍｉｎであった。そのミクロスフェアをゲル化溶液中に攪拌しながら１０分間置いておき、その後、除去し、脱イオン水で洗浄した。
【００８９】
得られた三次元ナノ複合材料ミクロスフェアサンプルを図３に示す。
【００９０】
例１４：金ナノ粒子の場合のアルギネート−キトラック溶液からの静電ビーズ発生器を用いた三次元ナノ複合材料ミクロスフェアの調製
以下の最終濃度の多糖溶液を調製した：１．５％（ｗ／ｖ）アルギネート、０．２％（ｗ／ｖ）キトラック、０．５ｍＭのＨＡｕＣｌ４、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１Ｍのヘペス緩衝液、ｐＨ７．４である。その溶液を、５０ｍＭのＣａＣｌ２及び０．１５ｎｍのマンニトールを含有するゲル化槽中に、磁気ロッドによって攪拌しながら滴下した。
【００９１】
静電ビーズ発生器を用いてミクロスフェアのサイズを制御しており、該静電ビーズ発生器は、そのサイズを縮小するために滴の表面張力に作用することが可能である。使用される条件は、典型的に、電圧５ｋＶ、内部針の直径０．７ｍＭ、ゲル化槽と針の間の距離４ｃｍ、２成分ポリマー溶液の流量１０ｍＬ／ｍｉｎである。そのミクロスフェアをゲル化溶液中に攪拌しながら１０分間置いておき、その後、除去し、脱イオン水で洗浄した。
【００９２】
例１５：「インサイチューでの」ゲル化を用いたアルギネート−キトラック及び銀ナノ粒子に基づく表面／体積比の高い三次元ナノ複合材料ヒドロゲルの調製
例３に従い調製した銀ナノ粒子を含むキトラック溶液に、ＮａＣｌ及びヘペス緩衝液の存在下、アルギネート溶液を、以下の最終濃度を得るために加える：１．５％（ｗ／ｖ）アルギネート、０．２％（ｗ／ｖ）キトラック、０．５ｍＭのＡｇＮＯ３、０．２５ｍＭのＣ６Ｈ８Ｏ６、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１Ｍのヘペス緩衝液、ｐＨ７．４である。次いで、ＣａＣＯ３溶液（濃度３０ｍＭ）を加え、その後、緩徐なゲル化が可能なように、Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン（ＧＤＬ）（［ＧＤＬ］／［Ｃａ２＋］＝２）を加える。抗菌性試験のため、２０％最終ミューラー−ヒントン培地を加える（４．２ｇ／Ｌ）。その最終溶液を、平滑面（スライド、ペトリ皿等）上に注ぎ、暗闇で２４時間置いておき、ゲル化させる。
【００９３】
例１６：「インサイチューでの」ゲル化を用いたアルギネート−キトラック及び銀ナノ粒子に基づく三次元ナノ複合材料脱水フィルムの調製
例３に従い調製した銀ナノ粒子を含むキトラック溶液に、ＮａＣｌ及びヘペス緩衝液の存在下、アルギネート溶液を、以下の最終濃度を得るために加える：１．５％（ｗ／ｖ）アルギネート、０．２％（ｗ／ｖ）キトラック、０．５ｍＭのＡｇＮＯ３、０．２５ｍＭのＣ６Ｈ８Ｏ６、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１Ｍのヘペス緩衝液、ｐＨ７．４である。次いで、ＣａＣＯ３溶液（濃度３０ｍＭ）を加え、その後、緩徐なゲル化が可能なように、Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン（ＧＤＬ）（［ＧＤＬ］／［Ｃａ２＋］＝２）を加える。抗菌性試験のため、２０％最終ミューラー−ヒントン培地を加える（４．２ｇ／Ｌ）。その最終溶液を、平滑面（スライド、ペトリ皿等）上に注ぎ、暗闇で２４時間置いておき、ゲル化させる。次いで、三次元ナノ複合材料の固体脱水フィルムを得るため、その三次元ナノ複合材料ゲルを空気乾燥させる。
【００９４】
例１７：「インサイチューでの」ゲル化を用いたアルギネート−キトラック及び金ナノ粒子に基づく表面／体積比の高い三次元ナノ複合材料ヒドロゲルの調製
例５に従い調製した金ナノ粒子を含むキトラック溶液に、ＮａＣｌ及びヘペス緩衝液の存在下、アルギネート溶液を、以下の最終濃度を得るために加える：１．５％（ｗ／ｖ）アルギネート、０．２％（ｗ／ｖ）キトラック、０．５ｍＭのＨＡｕＣｌ４、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１Ｍのヘペス緩衝液、ｐＨ７．４である。次いで、ＣａＣＯ３溶液（濃度３０ｍＭ）を加え、その後、緩徐なゲル化が可能なように、Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン（ＧＤＬ）（［ＧＤＬ］／［Ｃａ２＋］＝２）を加える。抗菌性試験のため、２０％最終ミューラー−ヒントン培地を加える（４．２ｇ／Ｌ）。その最終溶液を、平滑面（スライド、ペトリ皿等）上に注ぎ、暗闇で２４時間置いておき、ゲル化させる。
【００９５】
例１８：「インサイチューでの」ゲル化を用いたアルギネート−キトラック及び金ナノ粒子に基づく三次元ナノ複合材料フィルムの調製
例５に従い調製した金ナノ粒子を含むキトラック溶液に、ＮａＣｌ及びヘペス緩衝液の存在下、アルギネート溶液を、以下の最終濃度を得るために加える：１．５％（ｗ／ｖ）アルギネート、０．２％（ｗ／ｖ）キトラック、０．５ｍＭのＨＡｕＣｌ４、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１Ｍのヘペス緩衝液、ｐＨ７．４である。次いで、ＣａＣＯ３溶液（濃度３０ｍＭ）を加え、その後、緩徐なゲル化が可能なように、Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン（ＧＤＬ）（［ＧＤＬ］／［Ｃａ２＋］＝２）を加える。抗菌性試験のため、２０％最終ミューラー−ヒントン培地を加える（４．２ｇ／Ｌ）。その最終溶液を、平滑面（スライド、ペトリ皿等）上に注ぎ、暗闇で２４時間置いておき、ゲル化させる。次いで、三次元ナノ複合材料の固体フィルムを得るため、その三次元ナノ複合材料ゲルを空気乾燥させる。
【００９６】
例１９：ミクロスフェアの調製
先に報告した特定の例１３及び１４のミクロスフェアは、既知の方法に従って、特には：ａ）シリンジを用い、一のアニオン性多糖と金属粒子を含むキトサンの単糖又はオリゴ糖誘導体である一の金属系ナノ複合材料との溶液を適切なゲル化槽中に手動で滴下し、ｂ）トロンヘイム（ノルウェー）ＮＴＮＵ大学バイオテクノロジー研究所のグドムンド（Ｇｕｄｍｕｎｄ Ｓｋｊａｋ［ここで、ａはリング符号付きのａである］−Ｂｒａｅｌ［ここで、ａｅはａとｅの合字である］）教授により開発され、Ｓｔｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ．ｏｆ Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ １９，６１５−６３０に記載された一の静電ビーズ発生器を用いることにより調製された。かかる装置は、Ｐｌｅｘｉｇｌａｓ製安全スタンドに含まれるオートクレーブ処理可能な針支持体に接続された、適切なスイッチにより調節可能な電圧（１０ｋＶ以下）が加えられる静電ビーズ発生器で構成される。
【００９７】
ポンプで調節され、内径が１ｍｍの格子で作ったパイプに接続されたシリンジで構成されるスタンド外側のシステムを用いて、出発溶液を、ゲル化溶液を含有する結晶化装置（スタンド内）中に滴下し、ここで、該結晶化装置には電極が挿入されている。その機器は、針先端とゲル化溶液の自由表面との間に一定の電位差を生じており、該電位差は調節でき、０〜１０ｋＶに及ぶ。その電位差は、針先端からポリマー滴（負に帯電）の突然の脱離をもたらし、それ故に小さなサイズ（＜２００μｍ）であってもカプセルを有することを可能にする。カプセルのサイズは、内部針の直径、針のゲル溶液表面からの距離、ポリマー流量等の他の要因を変えることによっても調節できる。
【００９８】
例２０：シリンダーの調製
先に報告した特定の例６、８及び９のゲルシリンダー及びディスクは、多糖及び金属系ナノ複合材料を含有する溶液をシリンダー形状の容器中に注ぐことにより調製された。シリンダー形状のヒドロゲルのサイズは、後のもののサイズによって決まる。異なるサイズ（高さ及び内径）が完全に許容可能であるものの、典型的に、シリンダー形状容器の寸法は、高さが１８ｍｍであり、内径が１６ｍｍであり、一方、円盤状の容器の寸法は、高さが８ｍｍであり、内径が１６ｍｍである。
【００９９】
例２１：生物学的特性評価
Ａ．抗菌活性
三次元ナノ複合材料ゲルの抗菌活性をテストするため、様々な濃度の異なる菌種をゲル表面に塗りつけた。グラム陰性菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）及びグラム陽性菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ，Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）の両方についてテストした。コントロールは、寒天ゲル及びナノ粒子がない場合のアルギネート−キトラックゲル（ＡＣゲル）によって表される。「一晩の」インキュベーション後、細菌コロニーは、コントロールでははっきりと分かるが、ナノ粒子を含有するゲル（ＡＣ−ｎＡｇゲル）では全くなく（図４）、それ故に、それらの材料によって果たされる殺菌作用の有効性が証明される。
【０１００】
更に、銀ナノ粒子を含有するナノ複合材料ゲルミクロスフェア（ＡＣ−ｎＡｇ）を作製し、細菌溶液（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）と接触させ；そのコントロールは、アルギネート−キトラックゲルミクロスフェア（銀ナノ粒子なし）によって表される。その結果は、細菌コロニーの濃度がコントロールで増加するものの、銀ナノ粒子を含むミクロスフェアの場合では、３を超える対数単位減少させることを実証する。
【０１０１】
例１３に従って得られるナノ複合材料ミクロスフェア並びに例６及び９に従って得られるナノ複合材料ヒドロゲルでさえも、図５及び６にそれぞれ示されるように、効果的な抗菌作用を発揮できることを証明した。
【０１０２】
Ｂ．細胞毒性
骨芽細胞（ＭＧ６３）、肺細胞（ＨＥＰＧ２）及び線維芽細胞（３Ｔ３）等の真核細胞株に関するゲルの細胞毒性を評価するためのテストを行った。そのテストでは、細胞による乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出を測定及び評価しており、それは、細胞傷害及び細胞死に関係している。ＬＤＨテストは、三次元ナノ複合材料ゲルが、図７において分かるように、例えば線維芽細胞の場合に、テストした細胞に対して細胞毒性効果を生じないことを実証する。実際、２４時間及び７２時間後、ＡＣ−ｎＡｇで処理した細胞とコントロール（即ち、アルギネート−キトラックゲルで処理した細胞及び未処理細胞）間での乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出において著しい違いは見られない。
【０１０３】
金ナノ粒子を含有するアルギネート−キトラック系ゲル（ＡＣ−ｎＡｕゲル）である同様な三次元ナノ複合材料の場合でも同様の結果が報告され；図８において分かるように、この種類のゲルは、同様に真核細胞に対して細胞毒性がない。
【０１０４】
それらの結果の組み合わせにより、キトラック中に形成され安定化しているナノ粒子を含有するアルギネート−キトラック系ヒドロゲルのような本発明に従う三次元ナノ複合材料は、均質な構造が備わっており、ここで、ナノ粒子は凝集せず、強力な殺菌活性を有するものの、真核細胞に対しては毒性がないと結論を出すことが可能である。
【０１０５】
それらの新規な三次元ナノ複合材料系は、以下の利点を提供する：
・既に実証されているかかるキトサン誘導体のオリゴ糖側鎖による細胞刺激の生物学的特性（Marsich et al.,“Alginate/lactose-modified chitosan hydrogels: A bioactive biomaterial for chondrocyte encapsulation”, Journal of biomedical materials research-Part A, 2008 Feb; 84(2):364-76）と、殺菌活性を持つ金属ナノ粒子を形成させ安定化させるキトサン分岐誘導体の能力を組み合わせる、統合した系の開発である。この新規の「糖−ナノ技術」アプローチは、「糖鎖生物学的」成分によって与えられる生理活性とナノ粒子の特異的性質とを利用する材料を設計するための新規の機器を提供することになる；
・ｉ）中性又はアニオン性多糖とｉｉ）金属ナノ粒子を取り込んでいるキトサンのカチオン性分岐単糖又はオリゴ糖誘導体との混合組成物を用いた三次元ゲルの調製の可能性であって、金属ナノ粒子の存在にもかかわらず、それらは（クラスｉのポリアニオンに対して）反対の電荷を有するが、二つのクラスｉ）及びｉｉ）のそれぞれに独立して属する２種類のポリマー間の適当な条件下での完全混和性を利用することによる調製の可能性である。一方、知られているように、アニオン性多糖、特にアルギネートでのコアセルベーション現象は、オリゴ糖分岐のないキトサンのような他のカチオン性ポリマーを用いることによって起こる；
・得られたナノ複合材料ゲルは、それらが強力な殺菌活性を有していても、真核細胞に対して毒性がないことが分かる；
・使用したゲル化法により、異なる適用ニーズに適し得る形状及びサイズの材料を得られるようにする（例えば、湿潤及び乾燥フィルム、スカフォールド、ミクロスフェア、繊維等）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一種のリオトロピック、サーモトロピック又はサーモ−リオトロピックの中性又はアニオン性多糖と、金属ナノ粒子を均一に取り込んでいる少なくとも一種のカチオン性分岐多糖からなる金属系ナノ複合材料とからなるポリマーマトリックスを備えてなり、前記中性又はアニオン性多糖が適切な化学的又は物理的ゲル化手段によりゲル化されていることを特徴とする三次元ナノ複合材料。
【請求項２】
リオトロピックアニオン性多糖は、アルギネート、ペクテート、及びペクチネートよりなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の三次元ナノ複合材料。
【請求項３】
サーモトロピック中性多糖は、アガロース、スクレログルカン、シゾフィラン、及びカードランよりなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の三次元ナノ複合材料。
【請求項４】
サーモ−リオトロピックアニオン性多糖は、硫酸アガロース、ι−及びκ−カラギーナン、硫酸セルロース、ジェランガム、ラムサンガム、ウィーランガム、並びにキサンタンガムよりなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の三次元ナノ複合材料。
【請求項５】
前記中性又はアニオン性多糖は、平均分子量（ＭＷ）が２，０００ｋＤａ以下であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の三次元ナノ複合材料。
【請求項６】
前記中性又はアニオン性多糖は、平均分子量（ＭＷ）が１００ｋＤａ〜１，０００ｋＤａの範囲であることを特徴とする請求項５に記載の三次元ナノ複合材料。
【請求項７】
前記カチオン性分岐多糖は、キトサンの分岐誘導体（ここで、Ｄ−グルコサミン単位は、炭素原子Ｃ２上の官能基−ＮＨ−を用いてキトサンの線状鎖結合を形成し、アルジトール又はアルドン酸のポリオール残基は、互いに同一でも異なっていてもよく、一般式（Ｉ）
【化１】
［式中：
Ｒは、−ＣＨ２−又は−ＣＯ−であり；
Ｒ１は、水素、単糖又はオリゴ糖であり；
Ｒ２は、−ＯＨ又は−ＮＨＣＯＣＨ３である］によって表される）であることを特徴とする請求項１に記載の三次元ナノ複合材料。
【請求項８】
前記アルジトール又はアルドン酸のポリオール残基が、１〜３個のグリコシド単位を含む単糖又はオリゴ糖の残基であることを特徴とする請求項７に記載の三次元ナノ複合材料。
【請求項９】
Ｒ１が単糖である場合、前記単糖が、ガラクトース、グルコース、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、及びＮ−アセチルガラクトサミンよりなる群から選択されることを特徴とする請求項７に記載の三次元ナノ複合材料。
【請求項１０】
前記アルジトール又はアルドン酸のポリオール残基が、ラクトース、セロビオース、セロトリオース、マルトース、マルトトリオース、キトビオース、キトトリオース、マンノビオース及びそれらのアルドン酸の残基よりなる群から選択されることを特徴とする請求項７に記載の三次元ナノ複合材料。
【請求項１１】
前記キトサンの分岐誘導体は、Ｄ−グルコサミン単位のアミン基の化学置換度が４０％より高いことを特徴とする請求項７に記載の三次元ナノ複合材料。
【請求項１２】
前記置換度が、５０％〜８０％の範囲であることを特徴とする請求項１１に記載の三次元ナノ複合材料。
【請求項１３】
前記キトサンは、平均分子量が１，５００ｋＤａ以下であることを特徴とする請求項７に記載の三次元ナノ複合材料。
【請求項１４】
前記キトサンは、平均分子量（ＭＷ）が４００ｋＤａ〜７００ｋＤａの範囲であることを特徴とする請求項１３に記載の三次元ナノ複合材料。
【請求項１５】
カチオン性分岐多糖との金属系ナノ複合材料に含まれる金属ナノ粒子が、銀、金、白金、パラジウム、銅、亜鉛、ニッケル及びそれらの混合物よりなる群から選択される金属であることを特徴とする請求項１に記載の三次元ナノ複合材料。
【請求項１６】
前記ナノ粒子は、平均サイズが５ｎｍ〜１５０ｎｍの範囲であることを特徴とする請求項１に記載の三次元ナノ複合材料。
【請求項１７】
カチオン性多糖のｇ当たりの金属の質量（ｍｇ）は、３，０００ｍｇ／ｇ〜０．３ｍｇ／ｇの範囲であることを特徴とする請求項１に記載の三次元ナノ複合材料。
【請求項１８】
カチオン性多糖のｇ当たりの金属の質量（ｍｇ）は、５０ｍｇ／ｇであることを特徴とする請求項１７に記載の三次元ナノ複合材料。
【請求項１９】
中性又はアニオン性多糖の金属ナノ粒子を含むカチオン性分岐多糖に対する重量比は、８：１〜１：１（中性又はアニオン性多糖：カチオン性多糖）の範囲であることを特徴とする請求項１に記載の三次元ナノ複合材料。
【請求項２０】
中性又はアニオン性多糖の金属ナノ粒子を含むカチオン性分岐多糖に対する重量比は、８：１〜５：１の範囲であることを特徴とする請求項１９に記載の三次元ナノ複合材料。
【請求項２１】
抗菌薬として用いるための、請求項１〜２０のいずれかに記載の三次元ナノ複合材料。
【請求項２２】
請求項１〜２０のいずれかに記載の三次元ナノ複合材料の製造方法であって、前記三次元ナノ複合材料は、少なくとも一種のリオトロピック、サーモトロピック又はサーモ−リオトロピックの中性又はアニオン性多糖と、金属ナノ粒子を均一に取り込んでいる少なくとも一種のカチオン性分岐多糖からなる金属系ナノ複合材料との混合物の水溶液を調製すること（ここで、前記水溶液はイオン強度が少なくとも５０ｍＭで且つ３５０ｍＭ以下であり、ｐＨが少なくとも７である）、及び前記水溶液を、リオトロピック、サーモトロピック又はサーモ−リオトロピックの中性又はアニオン性多糖をゲル化することが可能な化学的又は物理的手段によって処理することにより得られることを特徴とする製造方法。
【請求項２３】
前記水溶液は、モル浸透圧濃度が２５０〜３００ｍＭの範囲であることを特徴とする請求項２２に記載の三次元ナノ複合材料の製造方法。
【請求項２４】
前記イオン強度は、濃度が０．０５Ｍ〜０．３５Ｍの範囲であるＮａＣｌの添加によって得られることを特徴とする請求項２２に記載の三次元ナノ複合材料の製造方法。
【請求項２５】
リオトロピック又はサーモ−リオトロピック多糖のゲル化手段が、一価、二価又は三価のイオンから選択されるイオンの塩の水溶液であることを特徴とする請求項２２に記載の三次元ナノ複合材料の製造方法。
【請求項２６】
前記水溶液の塩濃度が１０ｍＭより高いことを特徴とする請求項２５に記載の三次元ナノ複合材料の製造方法。
【請求項２７】
前記水溶液の塩濃度が１０ｍＭ〜１００ｍＭの範囲であることを特徴とする請求項２６に記載の三次元ナノ複合材料の製造方法。
【請求項２８】
サーモトロピック又はサーモ−リオトロピック多糖のゲル化手段は、１０℃〜４０℃の範囲の温度であることを特徴とする請求項２２に記載の三次元ナノ複合材料の製造方法。
【請求項２９】
前記温度が２０℃であることを特徴とする請求項２８に記載の三次元ナノ複合材料の製造方法。
【請求項３０】
中性又はアニオン性多糖のポリマー濃度が４％（ｗ／ｖ）以下であることを特徴とする請求項２２に記載の三次元ナノ複合材料の製造方法。
【請求項３１】
前記ポリマー濃度が、１．５〜３％（ｗ／ｖ）の範囲であることを特徴とする請求項３０に記載の三次元ナノ複合材料の製造方法。
【請求項３２】
請求項２２〜３１のいずれかに記載の製造方法によって得られる三次元ナノ複合材料。
【請求項３３】
前記ポリマーマトリックスが、ヒドロゲル又は非水和マトリックスであることを特徴とする請求項３２に記載の三次元ナノ複合材料。
【請求項３４】
前記ポリマーマトリックスが、シリンダー形状、ミクロスフェア、スカフォールド、ゲル−スラブ、フィルム及び繊維から選択される異なる形態であることを特徴とする請求項３２に記載の三次元ナノ複合材料。
【請求項３５】
抗菌薬としての、請求項１〜２０及び３２〜３４のいずれかに記載の三次元ナノ複合材料の使用。
【請求項３６】
創傷治癒における請求項３５に記載の三次元ナノ複合材料の使用。
【請求項３７】
外科用途における請求項３５に記載の三次元ナノ複合材料の使用。
【請求項３８】
農業及び食品用途における請求項３５に記載の三次元ナノ複合材料の使用。
【請求項１】
少なくとも一種のリオトロピック、サーモトロピック又はサーモ−リオトロピックの中性又はアニオン性多糖と、金属ナノ粒子を均一に取り込んでいる少なくとも一種のカチオン性分岐多糖からなる金属系ナノ複合材料とからなるポリマーマトリックスを備えてなり、前記中性又はアニオン性多糖が適切な化学的又は物理的ゲル化手段によりゲル化されていることを特徴とする三次元ナノ複合材料。
【請求項２】
リオトロピックアニオン性多糖は、アルギネート、ペクテート、及びペクチネートよりなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の三次元ナノ複合材料。
【請求項３】
サーモトロピック中性多糖は、アガロース、スクレログルカン、シゾフィラン、及びカードランよりなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の三次元ナノ複合材料。
【請求項４】
サーモ−リオトロピックアニオン性多糖は、硫酸アガロース、ι−及びκ−カラギーナン、硫酸セルロース、ジェランガム、ラムサンガム、ウィーランガム、並びにキサンタンガムよりなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の三次元ナノ複合材料。
【請求項５】
前記中性又はアニオン性多糖は、平均分子量（ＭＷ）が２，０００ｋＤａ以下であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の三次元ナノ複合材料。
【請求項６】
前記中性又はアニオン性多糖は、平均分子量（ＭＷ）が１００ｋＤａ〜１，０００ｋＤａの範囲であることを特徴とする請求項５に記載の三次元ナノ複合材料。
【請求項７】
前記カチオン性分岐多糖は、キトサンの分岐誘導体（ここで、Ｄ−グルコサミン単位は、炭素原子Ｃ２上の官能基−ＮＨ−を用いてキトサンの線状鎖結合を形成し、アルジトール又はアルドン酸のポリオール残基は、互いに同一でも異なっていてもよく、一般式（Ｉ）
【化１】
［式中：
Ｒは、−ＣＨ２−又は−ＣＯ−であり；
Ｒ１は、水素、単糖又はオリゴ糖であり；
Ｒ２は、−ＯＨ又は−ＮＨＣＯＣＨ３である］によって表される）であることを特徴とする請求項１に記載の三次元ナノ複合材料。
【請求項８】
前記アルジトール又はアルドン酸のポリオール残基が、１〜３個のグリコシド単位を含む単糖又はオリゴ糖の残基であることを特徴とする請求項７に記載の三次元ナノ複合材料。
【請求項９】
Ｒ１が単糖である場合、前記単糖が、ガラクトース、グルコース、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、及びＮ−アセチルガラクトサミンよりなる群から選択されることを特徴とする請求項７に記載の三次元ナノ複合材料。
【請求項１０】
前記アルジトール又はアルドン酸のポリオール残基が、ラクトース、セロビオース、セロトリオース、マルトース、マルトトリオース、キトビオース、キトトリオース、マンノビオース及びそれらのアルドン酸の残基よりなる群から選択されることを特徴とする請求項７に記載の三次元ナノ複合材料。
【請求項１１】
前記キトサンの分岐誘導体は、Ｄ−グルコサミン単位のアミン基の化学置換度が４０％より高いことを特徴とする請求項７に記載の三次元ナノ複合材料。
【請求項１２】
前記置換度が、５０％〜８０％の範囲であることを特徴とする請求項１１に記載の三次元ナノ複合材料。
【請求項１３】
前記キトサンは、平均分子量が１，５００ｋＤａ以下であることを特徴とする請求項７に記載の三次元ナノ複合材料。
【請求項１４】
前記キトサンは、平均分子量（ＭＷ）が４００ｋＤａ〜７００ｋＤａの範囲であることを特徴とする請求項１３に記載の三次元ナノ複合材料。
【請求項１５】
カチオン性分岐多糖との金属系ナノ複合材料に含まれる金属ナノ粒子が、銀、金、白金、パラジウム、銅、亜鉛、ニッケル及びそれらの混合物よりなる群から選択される金属であることを特徴とする請求項１に記載の三次元ナノ複合材料。
【請求項１６】
前記ナノ粒子は、平均サイズが５ｎｍ〜１５０ｎｍの範囲であることを特徴とする請求項１に記載の三次元ナノ複合材料。
【請求項１７】
カチオン性多糖のｇ当たりの金属の質量（ｍｇ）は、３，０００ｍｇ／ｇ〜０．３ｍｇ／ｇの範囲であることを特徴とする請求項１に記載の三次元ナノ複合材料。
【請求項１８】
カチオン性多糖のｇ当たりの金属の質量（ｍｇ）は、５０ｍｇ／ｇであることを特徴とする請求項１７に記載の三次元ナノ複合材料。
【請求項１９】
中性又はアニオン性多糖の金属ナノ粒子を含むカチオン性分岐多糖に対する重量比は、８：１〜１：１（中性又はアニオン性多糖：カチオン性多糖）の範囲であることを特徴とする請求項１に記載の三次元ナノ複合材料。
【請求項２０】
中性又はアニオン性多糖の金属ナノ粒子を含むカチオン性分岐多糖に対する重量比は、８：１〜５：１の範囲であることを特徴とする請求項１９に記載の三次元ナノ複合材料。
【請求項２１】
抗菌薬として用いるための、請求項１〜２０のいずれかに記載の三次元ナノ複合材料。
【請求項２２】
請求項１〜２０のいずれかに記載の三次元ナノ複合材料の製造方法であって、前記三次元ナノ複合材料は、少なくとも一種のリオトロピック、サーモトロピック又はサーモ−リオトロピックの中性又はアニオン性多糖と、金属ナノ粒子を均一に取り込んでいる少なくとも一種のカチオン性分岐多糖からなる金属系ナノ複合材料との混合物の水溶液を調製すること（ここで、前記水溶液はイオン強度が少なくとも５０ｍＭで且つ３５０ｍＭ以下であり、ｐＨが少なくとも７である）、及び前記水溶液を、リオトロピック、サーモトロピック又はサーモ−リオトロピックの中性又はアニオン性多糖をゲル化することが可能な化学的又は物理的手段によって処理することにより得られることを特徴とする製造方法。
【請求項２３】
前記水溶液は、モル浸透圧濃度が２５０〜３００ｍＭの範囲であることを特徴とする請求項２２に記載の三次元ナノ複合材料の製造方法。
【請求項２４】
前記イオン強度は、濃度が０．０５Ｍ〜０．３５Ｍの範囲であるＮａＣｌの添加によって得られることを特徴とする請求項２２に記載の三次元ナノ複合材料の製造方法。
【請求項２５】
リオトロピック又はサーモ−リオトロピック多糖のゲル化手段が、一価、二価又は三価のイオンから選択されるイオンの塩の水溶液であることを特徴とする請求項２２に記載の三次元ナノ複合材料の製造方法。
【請求項２６】
前記水溶液の塩濃度が１０ｍＭより高いことを特徴とする請求項２５に記載の三次元ナノ複合材料の製造方法。
【請求項２７】
前記水溶液の塩濃度が１０ｍＭ〜１００ｍＭの範囲であることを特徴とする請求項２６に記載の三次元ナノ複合材料の製造方法。
【請求項２８】
サーモトロピック又はサーモ−リオトロピック多糖のゲル化手段は、１０℃〜４０℃の範囲の温度であることを特徴とする請求項２２に記載の三次元ナノ複合材料の製造方法。
【請求項２９】
前記温度が２０℃であることを特徴とする請求項２８に記載の三次元ナノ複合材料の製造方法。
【請求項３０】
中性又はアニオン性多糖のポリマー濃度が４％（ｗ／ｖ）以下であることを特徴とする請求項２２に記載の三次元ナノ複合材料の製造方法。
【請求項３１】
前記ポリマー濃度が、１．５〜３％（ｗ／ｖ）の範囲であることを特徴とする請求項３０に記載の三次元ナノ複合材料の製造方法。
【請求項３２】
請求項２２〜３１のいずれかに記載の製造方法によって得られる三次元ナノ複合材料。
【請求項３３】
前記ポリマーマトリックスが、ヒドロゲル又は非水和マトリックスであることを特徴とする請求項３２に記載の三次元ナノ複合材料。
【請求項３４】
前記ポリマーマトリックスが、シリンダー形状、ミクロスフェア、スカフォールド、ゲル−スラブ、フィルム及び繊維から選択される異なる形態であることを特徴とする請求項３２に記載の三次元ナノ複合材料。
【請求項３５】
抗菌薬としての、請求項１〜２０及び３２〜３４のいずれかに記載の三次元ナノ複合材料の使用。
【請求項３６】
創傷治癒における請求項３５に記載の三次元ナノ複合材料の使用。
【請求項３７】
外科用途における請求項３５に記載の三次元ナノ複合材料の使用。
【請求項３８】
農業及び食品用途における請求項３５に記載の三次元ナノ複合材料の使用。
【図５】
【図７】
【図８】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図６】
【公表番号】特表２０１１−５２８７４６（Ｐ２０１１−５２８７４６Ａ）
【公表日】平成２３年１１月２４日（２０１１．１１．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１９１６４（Ｐ２０１１−５１９１６４）
【出願日】平成２１年７月２２日（２００９．７．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５９４３２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０１０１２３
【国際公開日】平成２２年１月２８日（２０１０．１．２８）
【出願人】（５０８３４５８３０）ユニヴァーシタ デグリ ステュディ デイ トリエステ (4)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１１月２４日（２０１１．１１．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年７月２２日（２００９．７．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５９４３２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０１０１２３
【国際公開日】平成２２年１月２８日（２０１０．１．２８）
【出願人】（５０８３４５８３０）ユニヴァーシタ デグリ ステュディ デイ トリエステ (4)
【Ｆターム（参考）】
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