多能性幹細胞の非腫瘍形成性の増殖
【課題】不純物の混入と奇形腫の形成を引き起こさない他のフィーダー細胞のソースを用いるｈＥＳ細胞の培養に関する新たな方法が必要となっている。
【解決手段】本発明は、フィーダーとして、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞（ＨＵＣＭＳＣｓ）を含む培地におけるヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞を増殖させる方法を提供する。前記ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞は、前記培地中で、例えば分化万能性、未分化状態での無限増殖及び正常核型といった胚性幹細胞の特性を維持する。本発明は、さらに、奇形腫を形成しないヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞の非腫瘍形成性増殖に関する方法をも提供する。
【解決手段】本発明は、フィーダーとして、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞（ＨＵＣＭＳＣｓ）を含む培地におけるヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞を増殖させる方法を提供する。前記ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞は、前記培地中で、例えば分化万能性、未分化状態での無限増殖及び正常核型といった胚性幹細胞の特性を維持する。本発明は、さらに、奇形腫を形成しないヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞の非腫瘍形成性増殖に関する方法をも提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト多能性幹細胞（ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）の増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）に関し、特に、ヒト胚性幹細胞（ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ （ｈＥＳ） ｃｅｌｌｓ）の非腫瘍形成性の増殖（ｎｏｎ−ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞は多能性であり、これらは成人のほとんどすべての細胞型に分化できる大きな能力を備えている。それ故、これらの細胞は、再生医療に利用されることが大いに期待されている。ｈＥＳ細胞を望ましいものとしている特性としては、不滅性、分化万能性及び未分化のまま無限に増殖できることが含まれる。分化万能性の胚性幹細胞は通常その未分化状態を維持するために、例えばマウス胚性線維芽細胞（ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ（ＭＥＦｓ））のようなフィーダー細胞層上で培養される。そのフィーダー層は、主に細胞を支持する役割を果たし、通常、ｈＥＳ細胞の培養は、分化が望まれるまで、フィーダー層の層上において培養される。しかるに、不幸にして、このマウスフィーダー支持細胞によって、ｈＥＳ細胞培養は、しばしば不純物の混入を伴ない、機能面への大きな影響こそもたらさないものの、マウスフィーダー細胞上で培養されたｈＥＳ細胞は、臨床上の用途には不適合である。報告によると、フィーダー無しでヒト多能性幹（ｈＰＳ）細胞を培養するとすぐに死に至るか、又は、委任細胞の異種集団に分化する。
【０００３】
フィーダー若しくは支持細胞の代りに、無細胞成分を使用すること、又は少なくとも非ヒト成分若しくは細胞を避けることを試みる論証が多くの報告によってなされている。しかし、このような代用では、長期間にわたって期待される結果は見られず、これらの試みでは、細胞の健全で継続的な増殖を支持するには不充分であることが明らかにされた。更に、無フィーダー細胞の培養中、代替培地で生育したｈＥＳ細胞は、ｈＥＳコロニーの周りに分化細胞を形成し、至適条件を満たさないことが示された。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、不純物の混入と奇形腫の形成を引き起こさない他のフィーダー細胞のソースを用いるｈＥＳ細胞の培養に関する新たな方法が必要となっている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
１つの実施態様において、臍帯由来幹細胞とヒト多能性幹細胞とを共培養することでヒト多能性幹細胞を増殖させる方法を提供する。ヒト多能性幹細胞を増殖させるための培地中において、臍帯由来幹細胞はフィーダー層を形成し、ヒト多能性幹細胞を未分化状態に維持する。
【０００６】
１つの実施態様において、ヒト多能性幹細胞の増殖は、非腫瘍形成性増殖であり、それ故、ヒト多能性幹細胞は、奇形腫を形成しない。
【０００７】
他の実施態様において、臍帯由来幹細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１６６又はＨＬＡ−ＡＢＣに対しては陽性を示し、ＣＤ１ｑ、ＣＤ３、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ１１７、又はＨＬＡ−ＤＲに対しては陰性である。又、臍帯由来幹細胞は、骨形成性又は脂質生成性の分化能を有する。
【０００８】
他の実施態様において、臍帯由来幹細胞は、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞（ＨＵＣＭＳＣｓ）であり、ヒト臍帯のホウォートンゼリー由来である。
【０００９】
他の実施態様において、ヒト多能性幹細胞は、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）、Ｏｃｔ−４、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＮＦ−２００、短尾奇形突然変異体、ＡＴＢＦ１又はＭＡＰ２に対して陽性であり、ＧＤＦ９、ＧＡＴＡ４、ＨＡＮＤ１又はＴＵＪ−１遺伝子を発現する。又、ヒト多能性幹細胞中、ＭＹＣは下方調節を示す。
【００１０】
他の実施態様において、ヒト多能性幹細胞は、ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞であり、胚様体を形成する。
【００１１】
他の実施態様において、ヒト多能性幹細胞の増殖用の培地を提供する。当該培地は、培地中でフィーダー層を形成する臍帯由来幹細胞を含有する。１つの実施態様において、培地中の臍帯由来幹細胞は、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞（ＨＵＣＭＳＣｓ）である。
【００１２】
他の実施態様において、ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞の増殖用のキットを提供する。当該キットは、臍帯由来幹細胞を含む培地とその取扱説明書とにより構成される。１つの実施態様において、キットの培地中の臍帯由来幹細胞は、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞（ＨＵＣＭＳＣｓ）である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】図１は、ＨＵＣＭＳＣの形態学、免疫型別と、試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）の分化を示すものである。外植片より生育したホウォートンゼリー細胞（ＷＪ）は形態学的に紡錘状の線維芽細胞様（図１Ａを参照）である。急速に分裂しているＨＵＣＭＳＣｓをフローサイトメトリーにより分離した結果、ＣＤ１ｑ、ＣＤ３、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ１１７及びＨＬＡ−ＤＲに対しては陰性を示し、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１６６及びＨＬＡ−ＡＢＣに対しては陽性を示した（図１Ｂを参照）。脂質生成分化においては、細胞は、中性脂質液胞を形成し、多数のオイルレッドＯ陽性の脂質小滴を含有する（図１Ｃの上段のパネルを参照）。骨形成性の培地中で３〜４週間培養した後、細胞はアリザリンレッドＳにより強く染色される鉱化したマトリックスを広がって形成する（図１Ｃ、下段のパネルを参照）。ＧＡＰＤＨをボジティブ対照としたＲＴ−ＰＣＲ分析により、脂質生成性（ＰＰＡＲγ）と骨形成性（オステオポンチン）の分化に特異的遺伝子の発現を示す（図１Ｄを参照）。図中のスケールバーは、図１Ａの左パネルにおいて、１０００μｍを示し、図１Ａの右の二つのパネルと図１Ｃにおいて、１００μｍを示す。
【図１Ｂ１】図１Ａの説明参照。
【図１Ｂ２】図１Ａの説明参照。
【図１Ｂ３】図１Ａの説明参照。
【図１Ｂ４】図１Ａの説明参照。
【図１Ｃ】図１Ａの説明参照。
【図１Ｄ】図１Ａの説明参照。
【図２】図２は、ＨＵＣＭＳＣとＭＥＦフィーダーに生育した未分化のヒトＥＳ細胞コロニーの形態学的性状を示す。図２ＡにＨＵＣＭＳＣフィーダー層に生育したｈＥＳコロニーを示し、図２ＢにＭＥＦフィーダー層に生育したｈＥＳコロニーを示す。ＨＵＣＭＳＣに生育したコロニーの拡大写真より、高い核−細胞質比を有する典型的なｈＥＳ細胞の形態学的性状を示す（図２Ｃと図２Ｄを参照）。スケールバーは、図２Ａと図２Ｂにおいて１０００μｍを示し、図２Ｃと図２Ｄにおいては１００μｍを示す。
【図３】図３は、ＨＵＣＭＳＣ上で培養されたヒトＥＳ細胞の表現型を示す。特異的抗体でｈＥＳコロニーを免疫染色することによって、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）（図３Ａを参照）、Ｏｃｔ４（図３Ｂを参照）、ＳＳＥＡ−４（図３Ｃを参照）、ＴＲＡ−１−６０（図３Ｄを参照）、及びＴＲＡ−１−８１（図３Ｅを参照）の強い発現を示す。代表的な正常の核型（４６、ＸＸ）は、ＨＵＣＭＳＣ上で２０継代継続培養した後のＥＳ細胞で観察された（図３Ｆを参照）。スケールバーは、１０００μｍを示す。
【図４】図４は、ｈＥＳ由来の胚様体（ＥＢ）の免疫蛍光染色を示す。胚様体は、位相差顕微鏡で観察され（図４Ａを参照）、ＮＦ−２００（図４Ｂを参照）、短尾奇形突然変異体（図４Ｃを参照）、ＡＴＢＦ１（図４Ｄを参照）及びＭＡＰ２（図４Ｅを参照）に対する抗体での免疫染色が、それぞれ示される。スケールバーは１０００μｍを示す。
【図５】図５は、異なるフィーダー上におけるｈＥＳ細胞中の分化マーカーの発現を示す。図５Ａは、ＧＡＰＤＨを対照に用い、ＲＴ−ＰＣＲによりそれぞれ生殖細胞（ＧＤＦ９）、内胚葉（ＧＡＴＡ４）、中胚葉（ＨＡＮＤ１）及び外胚葉（ＴＵＪ−１）に対する特異的遺伝子の発現を示したものである。図５Ｂは、図５Ａに示された遺伝子発現の半定量的分析を示す。
【図６】図６は、フィーダー細胞をＨＵＣＭＳＣからＭＥＦに変更することによって、ｈＥＳ細胞より発達した奇形腫を示す。図６Ａは、奇形腫（図中、矢印で示される）は、フィーダーをＨＵＣＭＳＣからＭＥＦに変更した後、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにおいては、ｈＥＳ細胞よりたやすく発達することを示す。組織学的切片は、網膜様構造のメラノサイトリボン（図６Ｂを参照）、神経管様構造（図６Ｃ〜図６Ｅを参照）、歯原性上皮（図６Ｆを参照）、神経上皮（図６Ｇを参照）、未成熟な軟骨（図６Ｈを参照）と未成熟な扁平上皮（図６Ｉを参照）などが観察された。スケールバーは、１００μｍを示す。
【図７】図７は、ＨＵＣＭＳＣとＭＥＦ上に培養されたｈＥＳ細胞中の多能性遺伝子の発現を示す。図７Ａは、ＧＡＰＤＨを内部対照としたＨＵＣＭＳＣ（ＷＪ）とＭＥＦ上に培養されたｈＥＳ細胞（ＥＳ）中のＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２及びＭＹＣのＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。図７Ｂは、図７Ａに示された遺伝子発現の半定量的分析を示したものである。図７Ｃは、ウェスタンブロット分析により測定されたＣ−ＭＹＣ蛋白を示す。図７Ｄは、ｑＲＴ−ＰＣＲにより測定された内部対照物の倍数で示すＭＹＣのｍＲＮＡレベルを示す。ＥＢは、胚様体を意味する。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明をより完全に理解できるように、様々な詳細について述べる。
【実施例】
【００１５】
ＲＴ−ＰＣＲと遺伝子の定量性ＲＴ−ＰＣＲ及び他の分化マーカー遺伝子
ＨＵＣＭＳＣｓ又はＭＥＦフィーダー層において培養された未分化の、又は分化したｈＥＳ細胞を、ＲＬＴ溶解緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ社）により処理し、機械的に除去した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い、そのメーカーの指示に従い、最初のｃＤＮＡ鎖を合成した。表１に、その配列、アニーリング温度、及び各対のプライマーの生成物サイズを示す。すべてのＰＣＲサンプルについて、０.５μｇ／ｍｌの臭化エチジウム（Ｓｉｇｍａ社）を含有する２％アガロースゲルで電気泳動分析を行った。定量性ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）分析を行うために、ＧＡＰＤＨを内部対照とした、ＡＢＩ Ｓｔｅｐ Ｏｎｅ Ｐｌｕｓシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）におけるＦａｓｔＳｔａｒｔユニバーサルＳＹＢＲグリーンマスター（ＲＯＸ、Ｒｏｃｈｅ社、米国）遺伝子発現分析を使用した。表１に、プライマーの配列と、アニーリング温度を示す。
【００１６】
【表１】
【００１７】
ＨＵＣＭＳＣｓの分離と増殖
ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ：Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ １４１８５−０５２）を含む無菌箱中において、ヒト臍帯サンプル（長さ：２０ｃｍ、重さ：２０ｇ）を収集した。ヒト臍帯の収集と使用のためのプロトコールは、慈濟大学病院の治験審査委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ）によって承認された。同意書は陣痛前の妊婦から取得した。
【００１８】
収集したヒト臍帯組織を、Ｃａ２+とＭｇ２+-フリーの燐酸緩衝食塩水（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ＰＢＳ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用いて３回洗浄した。それらを、ミッドラインにそって機械的に切断し、その臍帯動脈、静脈、羊膜を、ＷＪから分離し、その後、そのゼリー（臍帯の粘性結合組織）を、０.５ｃｍ３以下の片状に切断し、トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ社、米国セントルイス）を用いて処理し、９５％空気と５％炭酸ガスの湿大気中、３７℃で３０分間インキュベートした。その外植片を、１０％ヒト臍帯血清（ＣＢＳ）と抗生物質を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）中で培養し、５〜７日間静置し、細胞が外植片から遊走するようにする。
【００１９】
ヒト臍帯由来のＨＵＣＭＳＣｓの特性
フローサイトメトリック分析によりＭＳＣ特異性表面マーカーの特性を確認した。その細胞を、燐酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の２ｍＭ ＥＤＴＡで剥離し、洗浄してからフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）又はフィコエリスリン（ＰＥ）をコンジュゲートした適切な抗体と共にインキュベートした。抗体としては、ＣＤ1ｑ、ＣＤ３、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５６、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１１７、ＣＤ１６６、ＨＬＡ−ＡＢＣ及びＨＬＡ−ＤＲ（ＢＤ，ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を使用した。次に、その細胞を、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製フローサイトメーター（Ｖａｎｔａｇｅ ＳＥ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、米国カリフォルニア州サンノゼ）で分析した。
【００２０】
ＷＪ組織片の最初の培養において、紡錘状形態を示す付着した成長細胞は、外植片から遊走した（図１Ａを参照）。これらの細胞は、２８時間の倍加時間で急速に分裂し、更に、継代培養を２５回以上続け（４０回以上の細胞分裂回数に相当する）、自然発生的分化がない。これらの細胞は、ＣＤ1ｑ、ＣＤ３、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ１１７及びＨＬＡ−ＤＲに対して陰性を示し、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１６６及びＨＬＡ−ＡＢＣに対して陽性を示した（図１Ｂを参照）。これらの観察結果は、ヒト臍帯のＷＪより分離された細胞が間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）と同様の表面マーカーを有することを示す。
【００２１】
骨細胞と脂肪細胞に至るＨＵＣＭＳＣｓの試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）における分化
骨形成性と脂質生成性の分化を誘発するために、ＨＵＣＭＳＣｓを骨形成性培地（１０％ＣＢＳ、０.１μｍｏｌ／Ｌ デキサメタゾン、１０ｍｍｏｌ／Ｌ β−グリセロール燐酸塩、５０μｍｏｌ／Ｌ アスコルベイトを補充したＤＭＥＭ培地）と脂質生成性培地（１０％ＣＢＳ、１μｍｏｌ／Ｌ デキサメタゾン、５μｇ／ｍＬ インスリン、０.５ｍｍｏｌ／Ｌ イソブチルメチルキサンチン及び６０μｍｏｌ／Ｌ インドメタシンを補充したＤＭＥＭ培地）に３週間転写した。骨形成性の潜在能力は、アリザリンレッドＳ（Ｓｉｇｍａ社、米国）で染色することで測定するカルシウムの鉱化作用により評価した。脂質生成性分化を評価するために、顕微鏡下で細胞内の脂質の小滴を観察した。当該脂質の小滴を、オイルレッドＯで染色することにより検証した。
【００２２】
ＨＵＣＭＳＣの脂質生成性分化は、脂質形成性補足培地で２週間インキュベートした後に確認された。第２週目の最後の日に、細胞形態学上の変化が明らかになり、中性脂質の液胞が形成され、ほとんどすべての細胞内に多くのオイルレッドＯ陽性の脂質小滴が含まれる状態を示した（図１Ｃを参照）。同様に、骨形成性培地で分化を誘発した場合も、処理される細胞は、急速に生育し、アリザリンレッドＳにより強く染色される鉱化したマトリックスを含有し、培養後３〜４週間でカルシウムの沈殿が示された（図１Ｃを参照）。脂質生成（ＰＰＡＲγ）遺伝子と骨形成（オステオポンチン）遺伝子の発現は、ＲＴ−ＰＣＲ分析により明白になった（図１Ｄを参照）。
【００２３】
ＨＵＣＭＳＣ共培養ｈＥＳ株化細胞（ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）の特性
ＴＷ１株化細胞（Ｐ２２、即ち、２２回継代培養で得た細胞株）を工業技術研究院生物医学技術及び装置研究実験室より取得し、提供者である食品工業発展研究所（ＦＩＲＤＩ、台湾）の指導に従い、ＭＥＦｓ上で培養を開始し、ＭＥＦｓ（Ｐ３、即ち、３回継代培養したもの）、又はＨＵＣＭＳＣｓのどちらかをミトマイシンＣで失活した後に、フィーダー細胞としてｈＥＳ細胞の培養に使用した。これらは、２００,０００細胞数／９.４ｃｍ２／ウェルの密度で６ウェルプレートにおいて培養した。ｈＥＳ細胞の培養培地は、８０％（ｖ／ｖ）ノックアウト（ＫＯ）ＤＭＥＭ，２０％（ｖ／ｖ）ＫＯ血清置換、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０ｍＭ非必須アミノ酸（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、５０μＭ Ｂ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ社）及び４ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦより構成される。
【００２４】
前記ｈＥＳ細胞について、未分化ｈＥＳ細胞に特異的な蛍光ラベル抗体であるＳＳＥＡ−４、ＳＳＥＡ−１、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１とＯｃｔ−４（ＥＳ細胞の特性評価キット；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社）を用いて免疫細胞化学的に特性を評価した。最初に、ｈＥＳ細胞をフィーダー細胞とともに、培養皿中のチャンバースライド（Ｎｕｎｃ社、デンマーク）又は無菌のカバーグラス（Ａｓｓｉｓｔｅｎｔ、ドイツ）に培養した。３〜７日目の継代培養後の特異的な時間に、ｈＥＳ細胞のコロニーに免疫蛍光染色を行った。簡単に述べると、細胞を４％のパラホルムアルデヒドで固定し、次に、透過化（０.１％トリトンＸ−１００）、ブロッキング（４％ノルマルヤギ血清）、一次抗体処理（１：１０−１：５０に希釈）、３回洗浄、蛍光でラベルした二次抗体処理、更に３回洗浄、カバーグラスによる被覆、そしてマウントなど、いくつかの手順で操作を行った。更に、ＥＳ細胞特性評価キット（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社）を用い、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）染色を行う。
【００２５】
ＨＵＣＭＳＣｓフィーダーに転写された前記ｈＥＳ細胞は、効果的にコロニーを形成して、３６時間の倍加時間で増殖を続けた。そのコロニーは、ＭＥＦで培養したものと形態学的に若干相違する（図２Ａと２Ｂを参照）。しかしながら、ＨＵＣＭＳＣで培養したそれぞれのヒトＥＳ細胞はＭＥＦで培養したものと形態学的に同様である。当該細胞は、圓形で小さく、高い核−細胞質比を示し、注目すべきことに核小体が１〜３個存在する（図２Ｃと２Ｄを参照）。ＨＵＣＭＳＣｓフィーダー上のＴＷ１ ｈＥＳ細胞は、ＡＰ、Ｏｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０及びＴＲＡ−１−８１マーカーを発現した（図３Ａ−３Ｅを参照）
【００２６】
４０継代培養の細胞について核型の研究を行った。継代培養後の７日目に、０.１μｇ／ｍｌのコルセミド（Ｇｉｂｃｏ社）を用いてｈＥＳ細胞を４時間処理し、それら細胞について、洗浄後に０.２５％のトリプシンで３〜５分間、又は、ＩＶ型コラゲナーゼで８分間処理し、ピペットで操作し、収集した。これらを、ガラススライド上に固定・マウントした。認定された細胞遺伝学研究室で、標準的なＧ−ｂａｎｄｉｎｇ法を用いて分裂中期の分析を行った。第４０回目の継代培養において、ＨＵＣＭＳＣｓフィーダー上のＴＷ１ ｈＥＳ細胞は、４６、ＸＸの正常な核型を示した（図３Ｆを参照）。
【００２７】
ＨＵＣＭＳＣ共培養ｈＥＳ株化細胞における試験管内の分化万能性
分化が発生する前にｈＥＳ細胞を収集し、ｂＦＧＦを欠いたｈＥＳ細胞培地に再懸濁した。その後、このｈＥＳ細胞を、低接着６ウェルプレートにおいて、懸濁液中の凝集した状態で培養した。５日後に、牛胎児血清（ＦＢＳ）（最終濃度５％）を添加した。通常７〜１０日後に、その凝集ｈＥＳ細胞は胚様体（ＥＢ）を形成し、その後、成熟した（嚢胞性の）ＥＢが２０〜８０％のＥＢから出現する。その後、生成固形物又は嚢胞性のＥＢを、ゼラチン処理したチュンバースライド又は３５ｍｍの培養皿にプレートし、更に分化を続けさせ、その後、直接的に接着培養で育てられた細胞で同様に処理した。分化したｈＥＳ細胞について、固定後に、三つの胚性胚葉に特異的な蛍光ラベル抗体を用いて免疫細胞化学的研究を行った。当該胚葉は、外胚葉としてＭＡＰ２、ＮＦ２００（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社）、中胚葉として短尾奇形突然変異体、内胚葉としてＡＴＢＦ１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社）を使用した。
【００２８】
ＨＵＣＭＳＣフィーダーで培養したｈＥＳ細胞は、ＭＥＦｓ上で生育したものと同様に、懸濁液で培養した場合は、ＥＢを形成する。これらのＥＢ中、三つの胚性胚葉を示す細胞の分化が観察された。これらの細胞は、外胚葉由来のマーカー（ＭＡＰ−２とＮＦ−２００）、中胚葉由来のマーカー（短尾奇形突然変異体）、及び内胚葉由来のマーカー（ＡＴＢＦ１）を発現することが、免疫組織化学的に示された（図４を参照）。７〜１０日齢のＥＢから収集した細胞は、ＧＤＦ９（生殖細胞関連）、ＧＡＴＡ４（内胚葉）、Ｈａｎｄ１（中胚葉）及びＴｕｊ−１（外胚葉）などそれぞれの遺伝子を発現したことが、ＲＴ−ＰＣＲにより示された（図５を参照）。
【００２９】
ＨＵＣＭＳＣ共培養ｈＥＳ株化細胞における非腫瘍形成性と生体内（ｉｎ ｖｉｂｏ）の分化万能性
ｈＥＳ細胞を、ガラスキャピラリを用いた機械的スライシングにより分離し、ペレット後、マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）とＰＢＳ（１：１の比率）中に再懸濁し、非肥満性糖尿病−重度複合免疫不全症（ＮＯＤ−ＳＣＩＤ）マウスの背部皮下組織（ｎ＝１７）又は腎被膜（ｎ＝４）に注入した。細胞を血球計算板を用いて測定した後、ＰＢＳとマトリゲル（１：１）との異なる濃度の混合液に懸濁した。ｈＥＳ細胞は注入に先立って、最適な成育能力を有するように４５分間未満氷上に保持した。奇形腫の形成を触診によって追跡し、生成した腫瘍を切り離し、固定して、パラフィン中に包埋するなど、組織学的に処理した。
【００３０】
ＨＵＣＭＳＣフィーダーで長期間培養した後の細胞の発育潜在能力について、異種移植モデルを使用して生体内研究を行った。ＮＯＤ−ＳＣＩＤ（ｎ＝１８）とヌード（ｎ＝３）の双方のマウスにおける、２１の異なる移植による多方面の試験の結果、３ヶ月以上にわたる長期間の追跡調査においても奇形腫の生育は観察されなかった（表２と表３を参照）。しかし、奇形腫は、続くＭＥＦフィーダーにおける短期間（数日間）の培養において明らかに観察された。ＨＵＣＭＳＣフィーダーに移植する前と後にｈＥＳ細胞から誘発された奇形腫は、組織学的には相違はなかった（表２と図６を参照）。
【００３１】
【表２】
【００３２】
【表３】
【００３３】
ＨＵＣＭＳＣと共培養したｈＥＳにおけるＭＹＣの下方調節
細胞を溶解緩衝液（１５０ｍＭの食塩、５０ｍＭのトリス−塩酸[ｐＨ７.４]、１％のＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０）にプロティナーゼ阻害因子カクテル（Ｒｏｃｈｅ社、米国インディアナ州インディアナポリス）を加えた混合液に溶解した。タンパク質を１０％のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）した後、ニトロセルロース膜（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｃ Ｓｕｐｅｒ；Ａｍｅｒｓｈａｍ社、英国リトルチャルフォント）に転写した。当該膜を抗−ｃ−ｍｙｃ（２μｇ／ｍ）、又は抗−α−アクチン（１：１０,０００；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）モノクロナール抗体とインキュベートした。二次抗体としてヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰコンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ−Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いた。増強化学発光試薬（ＥＣＬ；Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を用いて結合抗体を検出した。
【００３４】
二種の異なるフィーダーにおけるｈＥＳ中のかぎとなる多能性遺伝子の発現を更に調べた。未分化の幹細胞のマーカー、例えばＯｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ及びＳｏｘ２は、たやすく発現することがＲＴ−ＰＣＲにより明らかとなった（図７Ａと図７Ｂを参照）。ホメオボックス遺伝子ＯＣＴ４とプロトオンコジーンＭＹＣの発現低下を、ＨＵＣＭＳＣと共培養したｈＥＳにおいて観察した。そのＭＹＣの下方調節を、ウェスタンブロット分析と定量的ＲＴ−ＰＣＲでさらに証明した。
【００３５】
【化１】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト多能性幹細胞（ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）の増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）に関し、特に、ヒト胚性幹細胞（ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ （ｈＥＳ） ｃｅｌｌｓ）の非腫瘍形成性の増殖（ｎｏｎ−ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞は多能性であり、これらは成人のほとんどすべての細胞型に分化できる大きな能力を備えている。それ故、これらの細胞は、再生医療に利用されることが大いに期待されている。ｈＥＳ細胞を望ましいものとしている特性としては、不滅性、分化万能性及び未分化のまま無限に増殖できることが含まれる。分化万能性の胚性幹細胞は通常その未分化状態を維持するために、例えばマウス胚性線維芽細胞（ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ（ＭＥＦｓ））のようなフィーダー細胞層上で培養される。そのフィーダー層は、主に細胞を支持する役割を果たし、通常、ｈＥＳ細胞の培養は、分化が望まれるまで、フィーダー層の層上において培養される。しかるに、不幸にして、このマウスフィーダー支持細胞によって、ｈＥＳ細胞培養は、しばしば不純物の混入を伴ない、機能面への大きな影響こそもたらさないものの、マウスフィーダー細胞上で培養されたｈＥＳ細胞は、臨床上の用途には不適合である。報告によると、フィーダー無しでヒト多能性幹（ｈＰＳ）細胞を培養するとすぐに死に至るか、又は、委任細胞の異種集団に分化する。
【０００３】
フィーダー若しくは支持細胞の代りに、無細胞成分を使用すること、又は少なくとも非ヒト成分若しくは細胞を避けることを試みる論証が多くの報告によってなされている。しかし、このような代用では、長期間にわたって期待される結果は見られず、これらの試みでは、細胞の健全で継続的な増殖を支持するには不充分であることが明らかにされた。更に、無フィーダー細胞の培養中、代替培地で生育したｈＥＳ細胞は、ｈＥＳコロニーの周りに分化細胞を形成し、至適条件を満たさないことが示された。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、不純物の混入と奇形腫の形成を引き起こさない他のフィーダー細胞のソースを用いるｈＥＳ細胞の培養に関する新たな方法が必要となっている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
１つの実施態様において、臍帯由来幹細胞とヒト多能性幹細胞とを共培養することでヒト多能性幹細胞を増殖させる方法を提供する。ヒト多能性幹細胞を増殖させるための培地中において、臍帯由来幹細胞はフィーダー層を形成し、ヒト多能性幹細胞を未分化状態に維持する。
【０００６】
１つの実施態様において、ヒト多能性幹細胞の増殖は、非腫瘍形成性増殖であり、それ故、ヒト多能性幹細胞は、奇形腫を形成しない。
【０００７】
他の実施態様において、臍帯由来幹細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１６６又はＨＬＡ−ＡＢＣに対しては陽性を示し、ＣＤ１ｑ、ＣＤ３、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ１１７、又はＨＬＡ−ＤＲに対しては陰性である。又、臍帯由来幹細胞は、骨形成性又は脂質生成性の分化能を有する。
【０００８】
他の実施態様において、臍帯由来幹細胞は、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞（ＨＵＣＭＳＣｓ）であり、ヒト臍帯のホウォートンゼリー由来である。
【０００９】
他の実施態様において、ヒト多能性幹細胞は、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）、Ｏｃｔ−４、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＮＦ−２００、短尾奇形突然変異体、ＡＴＢＦ１又はＭＡＰ２に対して陽性であり、ＧＤＦ９、ＧＡＴＡ４、ＨＡＮＤ１又はＴＵＪ−１遺伝子を発現する。又、ヒト多能性幹細胞中、ＭＹＣは下方調節を示す。
【００１０】
他の実施態様において、ヒト多能性幹細胞は、ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞であり、胚様体を形成する。
【００１１】
他の実施態様において、ヒト多能性幹細胞の増殖用の培地を提供する。当該培地は、培地中でフィーダー層を形成する臍帯由来幹細胞を含有する。１つの実施態様において、培地中の臍帯由来幹細胞は、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞（ＨＵＣＭＳＣｓ）である。
【００１２】
他の実施態様において、ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞の増殖用のキットを提供する。当該キットは、臍帯由来幹細胞を含む培地とその取扱説明書とにより構成される。１つの実施態様において、キットの培地中の臍帯由来幹細胞は、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞（ＨＵＣＭＳＣｓ）である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】図１は、ＨＵＣＭＳＣの形態学、免疫型別と、試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）の分化を示すものである。外植片より生育したホウォートンゼリー細胞（ＷＪ）は形態学的に紡錘状の線維芽細胞様（図１Ａを参照）である。急速に分裂しているＨＵＣＭＳＣｓをフローサイトメトリーにより分離した結果、ＣＤ１ｑ、ＣＤ３、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ１１７及びＨＬＡ−ＤＲに対しては陰性を示し、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１６６及びＨＬＡ−ＡＢＣに対しては陽性を示した（図１Ｂを参照）。脂質生成分化においては、細胞は、中性脂質液胞を形成し、多数のオイルレッドＯ陽性の脂質小滴を含有する（図１Ｃの上段のパネルを参照）。骨形成性の培地中で３〜４週間培養した後、細胞はアリザリンレッドＳにより強く染色される鉱化したマトリックスを広がって形成する（図１Ｃ、下段のパネルを参照）。ＧＡＰＤＨをボジティブ対照としたＲＴ−ＰＣＲ分析により、脂質生成性（ＰＰＡＲγ）と骨形成性（オステオポンチン）の分化に特異的遺伝子の発現を示す（図１Ｄを参照）。図中のスケールバーは、図１Ａの左パネルにおいて、１０００μｍを示し、図１Ａの右の二つのパネルと図１Ｃにおいて、１００μｍを示す。
【図１Ｂ１】図１Ａの説明参照。
【図１Ｂ２】図１Ａの説明参照。
【図１Ｂ３】図１Ａの説明参照。
【図１Ｂ４】図１Ａの説明参照。
【図１Ｃ】図１Ａの説明参照。
【図１Ｄ】図１Ａの説明参照。
【図２】図２は、ＨＵＣＭＳＣとＭＥＦフィーダーに生育した未分化のヒトＥＳ細胞コロニーの形態学的性状を示す。図２ＡにＨＵＣＭＳＣフィーダー層に生育したｈＥＳコロニーを示し、図２ＢにＭＥＦフィーダー層に生育したｈＥＳコロニーを示す。ＨＵＣＭＳＣに生育したコロニーの拡大写真より、高い核−細胞質比を有する典型的なｈＥＳ細胞の形態学的性状を示す（図２Ｃと図２Ｄを参照）。スケールバーは、図２Ａと図２Ｂにおいて１０００μｍを示し、図２Ｃと図２Ｄにおいては１００μｍを示す。
【図３】図３は、ＨＵＣＭＳＣ上で培養されたヒトＥＳ細胞の表現型を示す。特異的抗体でｈＥＳコロニーを免疫染色することによって、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）（図３Ａを参照）、Ｏｃｔ４（図３Ｂを参照）、ＳＳＥＡ−４（図３Ｃを参照）、ＴＲＡ−１−６０（図３Ｄを参照）、及びＴＲＡ−１−８１（図３Ｅを参照）の強い発現を示す。代表的な正常の核型（４６、ＸＸ）は、ＨＵＣＭＳＣ上で２０継代継続培養した後のＥＳ細胞で観察された（図３Ｆを参照）。スケールバーは、１０００μｍを示す。
【図４】図４は、ｈＥＳ由来の胚様体（ＥＢ）の免疫蛍光染色を示す。胚様体は、位相差顕微鏡で観察され（図４Ａを参照）、ＮＦ−２００（図４Ｂを参照）、短尾奇形突然変異体（図４Ｃを参照）、ＡＴＢＦ１（図４Ｄを参照）及びＭＡＰ２（図４Ｅを参照）に対する抗体での免疫染色が、それぞれ示される。スケールバーは１０００μｍを示す。
【図５】図５は、異なるフィーダー上におけるｈＥＳ細胞中の分化マーカーの発現を示す。図５Ａは、ＧＡＰＤＨを対照に用い、ＲＴ−ＰＣＲによりそれぞれ生殖細胞（ＧＤＦ９）、内胚葉（ＧＡＴＡ４）、中胚葉（ＨＡＮＤ１）及び外胚葉（ＴＵＪ−１）に対する特異的遺伝子の発現を示したものである。図５Ｂは、図５Ａに示された遺伝子発現の半定量的分析を示す。
【図６】図６は、フィーダー細胞をＨＵＣＭＳＣからＭＥＦに変更することによって、ｈＥＳ細胞より発達した奇形腫を示す。図６Ａは、奇形腫（図中、矢印で示される）は、フィーダーをＨＵＣＭＳＣからＭＥＦに変更した後、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにおいては、ｈＥＳ細胞よりたやすく発達することを示す。組織学的切片は、網膜様構造のメラノサイトリボン（図６Ｂを参照）、神経管様構造（図６Ｃ〜図６Ｅを参照）、歯原性上皮（図６Ｆを参照）、神経上皮（図６Ｇを参照）、未成熟な軟骨（図６Ｈを参照）と未成熟な扁平上皮（図６Ｉを参照）などが観察された。スケールバーは、１００μｍを示す。
【図７】図７は、ＨＵＣＭＳＣとＭＥＦ上に培養されたｈＥＳ細胞中の多能性遺伝子の発現を示す。図７Ａは、ＧＡＰＤＨを内部対照としたＨＵＣＭＳＣ（ＷＪ）とＭＥＦ上に培養されたｈＥＳ細胞（ＥＳ）中のＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２及びＭＹＣのＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。図７Ｂは、図７Ａに示された遺伝子発現の半定量的分析を示したものである。図７Ｃは、ウェスタンブロット分析により測定されたＣ−ＭＹＣ蛋白を示す。図７Ｄは、ｑＲＴ−ＰＣＲにより測定された内部対照物の倍数で示すＭＹＣのｍＲＮＡレベルを示す。ＥＢは、胚様体を意味する。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明をより完全に理解できるように、様々な詳細について述べる。
【実施例】
【００１５】
ＲＴ−ＰＣＲと遺伝子の定量性ＲＴ−ＰＣＲ及び他の分化マーカー遺伝子
ＨＵＣＭＳＣｓ又はＭＥＦフィーダー層において培養された未分化の、又は分化したｈＥＳ細胞を、ＲＬＴ溶解緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ社）により処理し、機械的に除去した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い、そのメーカーの指示に従い、最初のｃＤＮＡ鎖を合成した。表１に、その配列、アニーリング温度、及び各対のプライマーの生成物サイズを示す。すべてのＰＣＲサンプルについて、０.５μｇ／ｍｌの臭化エチジウム（Ｓｉｇｍａ社）を含有する２％アガロースゲルで電気泳動分析を行った。定量性ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）分析を行うために、ＧＡＰＤＨを内部対照とした、ＡＢＩ Ｓｔｅｐ Ｏｎｅ Ｐｌｕｓシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）におけるＦａｓｔＳｔａｒｔユニバーサルＳＹＢＲグリーンマスター（ＲＯＸ、Ｒｏｃｈｅ社、米国）遺伝子発現分析を使用した。表１に、プライマーの配列と、アニーリング温度を示す。
【００１６】
【表１】
【００１７】
ＨＵＣＭＳＣｓの分離と増殖
ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ：Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ １４１８５−０５２）を含む無菌箱中において、ヒト臍帯サンプル（長さ：２０ｃｍ、重さ：２０ｇ）を収集した。ヒト臍帯の収集と使用のためのプロトコールは、慈濟大学病院の治験審査委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ）によって承認された。同意書は陣痛前の妊婦から取得した。
【００１８】
収集したヒト臍帯組織を、Ｃａ２+とＭｇ２+-フリーの燐酸緩衝食塩水（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ＰＢＳ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用いて３回洗浄した。それらを、ミッドラインにそって機械的に切断し、その臍帯動脈、静脈、羊膜を、ＷＪから分離し、その後、そのゼリー（臍帯の粘性結合組織）を、０.５ｃｍ３以下の片状に切断し、トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ社、米国セントルイス）を用いて処理し、９５％空気と５％炭酸ガスの湿大気中、３７℃で３０分間インキュベートした。その外植片を、１０％ヒト臍帯血清（ＣＢＳ）と抗生物質を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）中で培養し、５〜７日間静置し、細胞が外植片から遊走するようにする。
【００１９】
ヒト臍帯由来のＨＵＣＭＳＣｓの特性
フローサイトメトリック分析によりＭＳＣ特異性表面マーカーの特性を確認した。その細胞を、燐酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の２ｍＭ ＥＤＴＡで剥離し、洗浄してからフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）又はフィコエリスリン（ＰＥ）をコンジュゲートした適切な抗体と共にインキュベートした。抗体としては、ＣＤ1ｑ、ＣＤ３、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５６、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１１７、ＣＤ１６６、ＨＬＡ−ＡＢＣ及びＨＬＡ−ＤＲ（ＢＤ，ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を使用した。次に、その細胞を、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製フローサイトメーター（Ｖａｎｔａｇｅ ＳＥ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、米国カリフォルニア州サンノゼ）で分析した。
【００２０】
ＷＪ組織片の最初の培養において、紡錘状形態を示す付着した成長細胞は、外植片から遊走した（図１Ａを参照）。これらの細胞は、２８時間の倍加時間で急速に分裂し、更に、継代培養を２５回以上続け（４０回以上の細胞分裂回数に相当する）、自然発生的分化がない。これらの細胞は、ＣＤ1ｑ、ＣＤ３、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ１１７及びＨＬＡ−ＤＲに対して陰性を示し、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１６６及びＨＬＡ−ＡＢＣに対して陽性を示した（図１Ｂを参照）。これらの観察結果は、ヒト臍帯のＷＪより分離された細胞が間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）と同様の表面マーカーを有することを示す。
【００２１】
骨細胞と脂肪細胞に至るＨＵＣＭＳＣｓの試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）における分化
骨形成性と脂質生成性の分化を誘発するために、ＨＵＣＭＳＣｓを骨形成性培地（１０％ＣＢＳ、０.１μｍｏｌ／Ｌ デキサメタゾン、１０ｍｍｏｌ／Ｌ β−グリセロール燐酸塩、５０μｍｏｌ／Ｌ アスコルベイトを補充したＤＭＥＭ培地）と脂質生成性培地（１０％ＣＢＳ、１μｍｏｌ／Ｌ デキサメタゾン、５μｇ／ｍＬ インスリン、０.５ｍｍｏｌ／Ｌ イソブチルメチルキサンチン及び６０μｍｏｌ／Ｌ インドメタシンを補充したＤＭＥＭ培地）に３週間転写した。骨形成性の潜在能力は、アリザリンレッドＳ（Ｓｉｇｍａ社、米国）で染色することで測定するカルシウムの鉱化作用により評価した。脂質生成性分化を評価するために、顕微鏡下で細胞内の脂質の小滴を観察した。当該脂質の小滴を、オイルレッドＯで染色することにより検証した。
【００２２】
ＨＵＣＭＳＣの脂質生成性分化は、脂質形成性補足培地で２週間インキュベートした後に確認された。第２週目の最後の日に、細胞形態学上の変化が明らかになり、中性脂質の液胞が形成され、ほとんどすべての細胞内に多くのオイルレッドＯ陽性の脂質小滴が含まれる状態を示した（図１Ｃを参照）。同様に、骨形成性培地で分化を誘発した場合も、処理される細胞は、急速に生育し、アリザリンレッドＳにより強く染色される鉱化したマトリックスを含有し、培養後３〜４週間でカルシウムの沈殿が示された（図１Ｃを参照）。脂質生成（ＰＰＡＲγ）遺伝子と骨形成（オステオポンチン）遺伝子の発現は、ＲＴ−ＰＣＲ分析により明白になった（図１Ｄを参照）。
【００２３】
ＨＵＣＭＳＣ共培養ｈＥＳ株化細胞（ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）の特性
ＴＷ１株化細胞（Ｐ２２、即ち、２２回継代培養で得た細胞株）を工業技術研究院生物医学技術及び装置研究実験室より取得し、提供者である食品工業発展研究所（ＦＩＲＤＩ、台湾）の指導に従い、ＭＥＦｓ上で培養を開始し、ＭＥＦｓ（Ｐ３、即ち、３回継代培養したもの）、又はＨＵＣＭＳＣｓのどちらかをミトマイシンＣで失活した後に、フィーダー細胞としてｈＥＳ細胞の培養に使用した。これらは、２００,０００細胞数／９.４ｃｍ２／ウェルの密度で６ウェルプレートにおいて培養した。ｈＥＳ細胞の培養培地は、８０％（ｖ／ｖ）ノックアウト（ＫＯ）ＤＭＥＭ，２０％（ｖ／ｖ）ＫＯ血清置換、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０ｍＭ非必須アミノ酸（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、５０μＭ Ｂ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ社）及び４ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦより構成される。
【００２４】
前記ｈＥＳ細胞について、未分化ｈＥＳ細胞に特異的な蛍光ラベル抗体であるＳＳＥＡ−４、ＳＳＥＡ−１、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１とＯｃｔ−４（ＥＳ細胞の特性評価キット；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社）を用いて免疫細胞化学的に特性を評価した。最初に、ｈＥＳ細胞をフィーダー細胞とともに、培養皿中のチャンバースライド（Ｎｕｎｃ社、デンマーク）又は無菌のカバーグラス（Ａｓｓｉｓｔｅｎｔ、ドイツ）に培養した。３〜７日目の継代培養後の特異的な時間に、ｈＥＳ細胞のコロニーに免疫蛍光染色を行った。簡単に述べると、細胞を４％のパラホルムアルデヒドで固定し、次に、透過化（０.１％トリトンＸ−１００）、ブロッキング（４％ノルマルヤギ血清）、一次抗体処理（１：１０−１：５０に希釈）、３回洗浄、蛍光でラベルした二次抗体処理、更に３回洗浄、カバーグラスによる被覆、そしてマウントなど、いくつかの手順で操作を行った。更に、ＥＳ細胞特性評価キット（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社）を用い、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）染色を行う。
【００２５】
ＨＵＣＭＳＣｓフィーダーに転写された前記ｈＥＳ細胞は、効果的にコロニーを形成して、３６時間の倍加時間で増殖を続けた。そのコロニーは、ＭＥＦで培養したものと形態学的に若干相違する（図２Ａと２Ｂを参照）。しかしながら、ＨＵＣＭＳＣで培養したそれぞれのヒトＥＳ細胞はＭＥＦで培養したものと形態学的に同様である。当該細胞は、圓形で小さく、高い核−細胞質比を示し、注目すべきことに核小体が１〜３個存在する（図２Ｃと２Ｄを参照）。ＨＵＣＭＳＣｓフィーダー上のＴＷ１ ｈＥＳ細胞は、ＡＰ、Ｏｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０及びＴＲＡ−１−８１マーカーを発現した（図３Ａ−３Ｅを参照）
【００２６】
４０継代培養の細胞について核型の研究を行った。継代培養後の７日目に、０.１μｇ／ｍｌのコルセミド（Ｇｉｂｃｏ社）を用いてｈＥＳ細胞を４時間処理し、それら細胞について、洗浄後に０.２５％のトリプシンで３〜５分間、又は、ＩＶ型コラゲナーゼで８分間処理し、ピペットで操作し、収集した。これらを、ガラススライド上に固定・マウントした。認定された細胞遺伝学研究室で、標準的なＧ−ｂａｎｄｉｎｇ法を用いて分裂中期の分析を行った。第４０回目の継代培養において、ＨＵＣＭＳＣｓフィーダー上のＴＷ１ ｈＥＳ細胞は、４６、ＸＸの正常な核型を示した（図３Ｆを参照）。
【００２７】
ＨＵＣＭＳＣ共培養ｈＥＳ株化細胞における試験管内の分化万能性
分化が発生する前にｈＥＳ細胞を収集し、ｂＦＧＦを欠いたｈＥＳ細胞培地に再懸濁した。その後、このｈＥＳ細胞を、低接着６ウェルプレートにおいて、懸濁液中の凝集した状態で培養した。５日後に、牛胎児血清（ＦＢＳ）（最終濃度５％）を添加した。通常７〜１０日後に、その凝集ｈＥＳ細胞は胚様体（ＥＢ）を形成し、その後、成熟した（嚢胞性の）ＥＢが２０〜８０％のＥＢから出現する。その後、生成固形物又は嚢胞性のＥＢを、ゼラチン処理したチュンバースライド又は３５ｍｍの培養皿にプレートし、更に分化を続けさせ、その後、直接的に接着培養で育てられた細胞で同様に処理した。分化したｈＥＳ細胞について、固定後に、三つの胚性胚葉に特異的な蛍光ラベル抗体を用いて免疫細胞化学的研究を行った。当該胚葉は、外胚葉としてＭＡＰ２、ＮＦ２００（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社）、中胚葉として短尾奇形突然変異体、内胚葉としてＡＴＢＦ１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社）を使用した。
【００２８】
ＨＵＣＭＳＣフィーダーで培養したｈＥＳ細胞は、ＭＥＦｓ上で生育したものと同様に、懸濁液で培養した場合は、ＥＢを形成する。これらのＥＢ中、三つの胚性胚葉を示す細胞の分化が観察された。これらの細胞は、外胚葉由来のマーカー（ＭＡＰ−２とＮＦ−２００）、中胚葉由来のマーカー（短尾奇形突然変異体）、及び内胚葉由来のマーカー（ＡＴＢＦ１）を発現することが、免疫組織化学的に示された（図４を参照）。７〜１０日齢のＥＢから収集した細胞は、ＧＤＦ９（生殖細胞関連）、ＧＡＴＡ４（内胚葉）、Ｈａｎｄ１（中胚葉）及びＴｕｊ−１（外胚葉）などそれぞれの遺伝子を発現したことが、ＲＴ−ＰＣＲにより示された（図５を参照）。
【００２９】
ＨＵＣＭＳＣ共培養ｈＥＳ株化細胞における非腫瘍形成性と生体内（ｉｎ ｖｉｂｏ）の分化万能性
ｈＥＳ細胞を、ガラスキャピラリを用いた機械的スライシングにより分離し、ペレット後、マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）とＰＢＳ（１：１の比率）中に再懸濁し、非肥満性糖尿病−重度複合免疫不全症（ＮＯＤ−ＳＣＩＤ）マウスの背部皮下組織（ｎ＝１７）又は腎被膜（ｎ＝４）に注入した。細胞を血球計算板を用いて測定した後、ＰＢＳとマトリゲル（１：１）との異なる濃度の混合液に懸濁した。ｈＥＳ細胞は注入に先立って、最適な成育能力を有するように４５分間未満氷上に保持した。奇形腫の形成を触診によって追跡し、生成した腫瘍を切り離し、固定して、パラフィン中に包埋するなど、組織学的に処理した。
【００３０】
ＨＵＣＭＳＣフィーダーで長期間培養した後の細胞の発育潜在能力について、異種移植モデルを使用して生体内研究を行った。ＮＯＤ−ＳＣＩＤ（ｎ＝１８）とヌード（ｎ＝３）の双方のマウスにおける、２１の異なる移植による多方面の試験の結果、３ヶ月以上にわたる長期間の追跡調査においても奇形腫の生育は観察されなかった（表２と表３を参照）。しかし、奇形腫は、続くＭＥＦフィーダーにおける短期間（数日間）の培養において明らかに観察された。ＨＵＣＭＳＣフィーダーに移植する前と後にｈＥＳ細胞から誘発された奇形腫は、組織学的には相違はなかった（表２と図６を参照）。
【００３１】
【表２】
【００３２】
【表３】
【００３３】
ＨＵＣＭＳＣと共培養したｈＥＳにおけるＭＹＣの下方調節
細胞を溶解緩衝液（１５０ｍＭの食塩、５０ｍＭのトリス−塩酸[ｐＨ７.４]、１％のＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０）にプロティナーゼ阻害因子カクテル（Ｒｏｃｈｅ社、米国インディアナ州インディアナポリス）を加えた混合液に溶解した。タンパク質を１０％のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）した後、ニトロセルロース膜（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｃ Ｓｕｐｅｒ；Ａｍｅｒｓｈａｍ社、英国リトルチャルフォント）に転写した。当該膜を抗−ｃ−ｍｙｃ（２μｇ／ｍ）、又は抗−α−アクチン（１：１０,０００；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）モノクロナール抗体とインキュベートした。二次抗体としてヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰコンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ−Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いた。増強化学発光試薬（ＥＣＬ；Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を用いて結合抗体を検出した。
【００３４】
二種の異なるフィーダーにおけるｈＥＳ中のかぎとなる多能性遺伝子の発現を更に調べた。未分化の幹細胞のマーカー、例えばＯｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ及びＳｏｘ２は、たやすく発現することがＲＴ−ＰＣＲにより明らかとなった（図７Ａと図７Ｂを参照）。ホメオボックス遺伝子ＯＣＴ４とプロトオンコジーンＭＹＣの発現低下を、ＨＵＣＭＳＣと共培養したｈＥＳにおいて観察した。そのＭＹＣの下方調節を、ウェスタンブロット分析と定量的ＲＴ−ＰＣＲでさらに証明した。
【００３５】
【化１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト多能性幹細胞と臍帯由来幹細胞とを共培養することにより構成される、ヒト多能性幹細胞を増殖させる方法。
【請求項２】
前記臍帯由来幹細胞は、前記ヒト多能性幹細胞の増殖用の培地中に、フィーダー層を形成する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記臍帯由来幹細胞は、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞（ＨＵＣＭＳＣｓ）である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ヒト臍帯由来間葉系幹細胞（ＨＵＣＭＳＣｓ）は、ヒト臍帯のホウォートンゼリー由来である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記臍帯由来幹細胞は、前記ヒト多能性幹細胞を未分化状態に維持する請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記臍帯由来幹細胞は、一つ又は一つ以上のＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１６６及びＨＬＡ−ＡＢＣに対して陽性である請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記臍帯由来幹細胞は、一つ又は一つ以上のＣＤ１ｑ、ＣＤ３、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ１１７及びＨＬＡ−ＤＲに対して陰性である請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記臍帯由来幹細胞は、骨形成性と脂質生成性の分化能力を有する請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ヒト多能性幹細胞は、ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ヒト多能性幹細胞は、一つ又は一つ以上のアルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）、Ｏｃｔ−４、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−４，ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２及び分化マーカーに対して陽性であり、前記分化マーカーは、一つ又は一つ以上のＮＦ−２００、短尾奇形突然変異体、ＡＴＢＦ１及びＭＡＰ２である請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ヒト多能性幹細胞は、一つ又は一つ以上の分化遺伝子を発現し、前記分化遺伝子は、ＧＤＦ９、ＧＡＴＡ４、ＨＡＮＤ１又はＴＵＪ−１遺伝子である請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ヒト多能性幹細胞において、ＭＹＣは下方調節される請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ヒト多能性幹細胞の増殖は、非腫瘍形成性増殖である請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ヒト多能性幹細胞は、奇形腫を形成しないものである請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ヒト多能性幹細胞は、胚様体を形成する請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
臍帯由来幹細胞を含有して構成される、ヒト多能性幹細胞を増殖させるための培地。
【請求項１７】
前記臍帯由来幹細胞は、前記培地中でフィーダー層を形成する請求項１６に記載の培地。
【請求項１８】
前記臍帯由来幹細胞は、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞（ＨＵＣＭＳＣｓ）である請求項１６に記載の培地。
【請求項１９】
臍帯由来幹細胞を含有する培地と、その取扱説明書とにより構成されるヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞を増殖させるためのキット。
【請求項２０】
前記臍帯由来幹細胞は、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞（ＨＵＣＭＳＣｓ）である請求項１９のキット。
【請求項１】
ヒト多能性幹細胞と臍帯由来幹細胞とを共培養することにより構成される、ヒト多能性幹細胞を増殖させる方法。
【請求項２】
前記臍帯由来幹細胞は、前記ヒト多能性幹細胞の増殖用の培地中に、フィーダー層を形成する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記臍帯由来幹細胞は、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞（ＨＵＣＭＳＣｓ）である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ヒト臍帯由来間葉系幹細胞（ＨＵＣＭＳＣｓ）は、ヒト臍帯のホウォートンゼリー由来である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記臍帯由来幹細胞は、前記ヒト多能性幹細胞を未分化状態に維持する請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記臍帯由来幹細胞は、一つ又は一つ以上のＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１６６及びＨＬＡ−ＡＢＣに対して陽性である請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記臍帯由来幹細胞は、一つ又は一つ以上のＣＤ１ｑ、ＣＤ３、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ１１７及びＨＬＡ−ＤＲに対して陰性である請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記臍帯由来幹細胞は、骨形成性と脂質生成性の分化能力を有する請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ヒト多能性幹細胞は、ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ヒト多能性幹細胞は、一つ又は一つ以上のアルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）、Ｏｃｔ−４、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−４，ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２及び分化マーカーに対して陽性であり、前記分化マーカーは、一つ又は一つ以上のＮＦ−２００、短尾奇形突然変異体、ＡＴＢＦ１及びＭＡＰ２である請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ヒト多能性幹細胞は、一つ又は一つ以上の分化遺伝子を発現し、前記分化遺伝子は、ＧＤＦ９、ＧＡＴＡ４、ＨＡＮＤ１又はＴＵＪ−１遺伝子である請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ヒト多能性幹細胞において、ＭＹＣは下方調節される請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ヒト多能性幹細胞の増殖は、非腫瘍形成性増殖である請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ヒト多能性幹細胞は、奇形腫を形成しないものである請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ヒト多能性幹細胞は、胚様体を形成する請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
臍帯由来幹細胞を含有して構成される、ヒト多能性幹細胞を増殖させるための培地。
【請求項１７】
前記臍帯由来幹細胞は、前記培地中でフィーダー層を形成する請求項１６に記載の培地。
【請求項１８】
前記臍帯由来幹細胞は、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞（ＨＵＣＭＳＣｓ）である請求項１６に記載の培地。
【請求項１９】
臍帯由来幹細胞を含有する培地と、その取扱説明書とにより構成されるヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞を増殖させるためのキット。
【請求項２０】
前記臍帯由来幹細胞は、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞（ＨＵＣＭＳＣｓ）である請求項１９のキット。
【図１Ａ】
【図１Ｂ１】
【図１Ｂ２】
【図１Ｂ３】
【図１Ｂ４】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図１Ｂ１】
【図１Ｂ２】
【図１Ｂ３】
【図１Ｂ４】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１２−２２３１９１（Ｐ２０１２−２２３１９１Ａ）
【公開日】平成２４年１１月１５日（２０１２．１１．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−９５６２４（Ｐ２０１２−９５６２４）
【出願日】平成２４年４月１９日（２０１２．４．１９）
【出願人】（５０４１８７８５８）財團法人佛教慈濟総合醫院 (7)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月１５日（２０１２．１１．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年４月１９日（２０１２．４．１９）
【出願人】（５０４１８７８５８）財團法人佛教慈濟総合醫院 (7)
【Ｆターム（参考）】
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