大型生体分子のためのフロースルー精製プロセス
【課題】本発明は、試料中の１つまたは複数の夾雑物から、例えば、カプセル化ウイルス、ウイルス様粒子およびコンジュゲートワクチンなどの大型生体分子を分離するための、新規な改良されたフロースルー精製プロセスに少なくとも部分的に関する。
【解決手段】このプロセスは、粒子の単位体積当たりの最小化された外部表面積および（最小化された外部表面積を有さない同様の粒子の集団と比較して２５％を超えて減少していない）単位体積当たりの内部表面積を含む固体多孔性粒子の少なくとも１つの集団の使用を利用する。
【解決手段】このプロセスは、粒子の単位体積当たりの最小化された外部表面積および（最小化された外部表面積を有さない同様の粒子の集団と比較して２５％を超えて減少していない）単位体積当たりの内部表面積を含む固体多孔性粒子の少なくとも１つの集団の使用を利用する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その内容全体が参照によりそのまま本明細書に組み込まれる、出願日が２００９年１２月１６日の米国仮特許出願第６１／２８４３６８号の優先権の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、試料中の１つまたは複数の夾雑物から、例えば、カプセル化ウイルス、ウイルス様粒子およびコンジュゲートワクチンなどの大型生体分子を分離するための、新規な改良されたフロースルー精製プロセスに少なくとも部分的に関する。
【背景技術】
【０００３】
例えば、カプセル化ウイルス、感染宿主細胞もしくは卵中のウイルス様粒子またはコンジュゲートワクチンなどの大型生体分子の生成の後に、実質的に純粋な生体分子集団を取得するために、感染宿主細胞または卵の、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび宿主細胞タンパク質などの他の成分から生体分子を分離することが望ましい。さらに、添加剤はしばしば、生体分子と共精製される場合があるため、生成される生体分子は、生体分子の生成を容易にするために典型的に使用されるいくつかの添加剤から分離される必要がある。
【０００４】
従来、超遠心分離、クロマトグラフィーおよび膜濾過などの様々な技術が、カプセル化ウイルスおよびウイルス様粒子などの大型生体分子を精製および濃縮するために使用されてきた（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００８／０７３４９０およびＷＯ２００４／１１２７０７を参照されたい）。このような生体分子を精製するために使用されてきた様々なタイプのクロマトグラフィー技術は、例えば、サイズ排除（ＳＥＣ）、陰イオン交換（ＡＥＸ）および親和性クロマトグラフィーを含む（例えば、ＷＯ２００４／１１２７０７；Ｔｒａｎｓｆｉｇｕｒａｃｕｉｎら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １４２：２１−２８頁（２００７年）およびＫａＩｂｆｕｓｓらＢｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．９６：９３２−９４４頁（２００７年）を参照されたい）。
【０００５】
前述の技術は、カプセル化ウイルスおよびウイルス様粒子などの巨大分子の精製にある程度使用されているが、すべてのこれらのクロマトグラフィー技術は一般的に、結合および溶出方式において使用される。特に、このような生体分子の大きなサイズ（例えば、約１５−４００ｎＭ）のため、これらの分子は大抵の市販の媒体の細孔に浸透することができず、したがって、典型的には媒体の外側に結合してその後溶出される。一方、夾雑物および不純物は通常、粒子の内部表面積に結合するが、しかしながら、大型生体分子と一緒に部分的に溶出されることもある。さらに、時にはこれらの技術の１つまたは複数が非連続的に使用されるが、一般に全体収率は不十分である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＰＣＴ公開番号国際公開第２００８／０７３４９０号
【特許文献２】ＰＣＴ公開番号国際公開第２００４／１１２７０７号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｔｒａｎｓｆｉｇｕｒａｃｕｉｎら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １４２：２１−２８頁（２００７年）
【非特許文献２】ＫａＩｂｆｕｓｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．９６：９３２−９４４頁（２００７年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、試料中の１つまたは複数の夾雑物からの、例えば、カプセル化ウイルス、ウイルス様粒子およびコンジュゲートワクチンなどの大型生体分子の分離のための、改良されたフロースループロセスを少なくとも部分的に提供する。本発明は、カプセル化ウイルス、ウイルス様粒子、コンジュゲートワクチンおよび細菌の細胞表面多糖などの大型生体分子をフロースルーモードにおいて精製するための、例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）および疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を含む１つまたは複数のクロマトグラフィー技術を採用する。
【０００９】
本発明による方法は、当技術分野において現在使用されている従来の方法よりもはるかに優れた、一般には結合および溶出方式であり、非連続的である、単一の連続的フロースループロセスを使用して、ウイルス、ウイルス様粒子またはコンジュゲートワクチンなどの大型生体分子の回収率の向上を典型的にもたらす。本発明による方法は、単位体積当たりの外部表面積が最小化されており、（クロマトグラフィープロセスで典型的に使用されるが、単位体積当たりの外部表面積が最小化されていない）同様のクロマトグラフィー粒子と比較して、単位体積当たりの内部表面積が２５％を超えて減少していない、少なくとも１種類のクロマトグラフィー粒子（例えば、固体多孔性ビーズ）の使用に少なくとも部分的に基づく。一般に、本発明は、逆相モードの操作に少なくとも部分的に依存し、すなわち、フロースルーモードにおける１つまたは複数のＡＥＸ、ＣＥＸおよびＨＩＣクロマトグラフィー媒体の使用によるものであり、少なくとも１つのこのような媒体は回収率の向上をもたらす特徴、例えば、単位体積当たりの最小化された外部表面積および（２５％を超えて減少していない）単位体積当たりの内部表面積を含む。
【００１０】
本発明による方法は、単一段階プロセスにおける大型生体分子の回収を可能にし、加えて、多くの精製前および精製後段階を必要とする従来のクロマトグラフィー法と比較して供給原料流および生成物流の上流処理および下流処理を最小限にする。さらに、本発明の方法は、大型生体分子を含有する試料中の宿主細胞タンパク質の存在下および不在化の両方において大型生体分子の回収率の向上をもたらす。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の一態様において、大型生体分子および１つまたは複数の夾雑物を含む試料からの大型生体分子の回収率を向上させるためのフロースループロセスが提供される。このようなプロセスは、試料を、回収される大型生体分子より小さい分子量カットオフを有する固体多孔性粒子の１つまたは複数の集団と接触させるステップを含み、フロースループロセスにおいて使用される固体多孔性粒子の少なくとも１つの集団の単位体積当たりの外部表面積は最小化されており、単位体積当たりの最小化された外部表面積を含まない固体多孔性粒子の集団と比較して単位体積当たりの内部表面積は２５％を超えて減少しておらず、それによって大型生体分子の回収率を向上させる。
【００１２】
いくつかの実施形態において、固体多孔性粒子の１つまたは複数の集団は、クロマトグラフィーカラム中に充填されている。
【００１３】
本発明によるフロースループロセスは、単位体積当たりの最小化された外部表面積および（２５％を超えて減少していない）単位体積当たりの内部表面積を含む固体多孔性粒子の少なくとも１つの集団が使用されないフロースループロセスを使用した大型生体分子の回収率と比較して、大型生体分子の回収率の、例えば、少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％の向上をもたらす。
【００１４】
いくつかの実施形態において、本発明によるフロースループロセスは、大型生体分子の純度の少なくとも２０％の向上をもたらす。
【００１５】
いくつかの実施形態において、本発明によるフロースループロセスは、１つまたは複数の夾雑物の少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％以上の減少をもたらす。
【００１６】
いくつかの実施形態において、固体多孔性粒子の１つまたは複数の集団は、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーに使用されるビーズの１つまたは複数から選択される。
【００１７】
本発明のプロセスを使用して回収することができる大型生体分子は、カプセル化ウイルス、ウイルス様粒子およびコンジュゲートワクチンからなる群から選択される。
【００１８】
いくつかの実施形態において、１つまたは複数の夾雑物は、核酸、タンパク質、賦形剤および細胞培養添加剤からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、１つまたは複数の夾雑物は宿主細胞タンパク質である。
【００１９】
いくつかの実施形態において、本発明によるフロースループロセスは、１つまたは複数の夾雑物からウイルス様粒子を分離するために使用される。例示的なウイルス様粒子は、ＢＳＡで被覆したスチレン粒子を含むがこれらに限定されない。
【００２０】
いくつかの実施形態において、本発明によるフロースループロセスは、１つまたは複数の夾雑物からカプセル化ウイルスを分離するために使用される。例示的なカプセル化ウイルスは、インフルエンザウイルス（例えば、Ｈ１Ｎ１株）、アデノウイルスおよびバクテリオファージを含むがこれらに限定されない。
【００２１】
いくつかの実施形態において、大型生体分子は、細胞培養においてまたは卵中で産生される。いくつかの実施形態において、細胞培養はＭＤＣＫ細胞を含む。いくつかの実施形態において、大型生体分子および１つまたは複数の夾雑物を含む試料は細胞培養上清であり、これは本発明によるフロースループロセスに供される。
【００２２】
本発明によるフロースループロセスの様々な実施形態において、プロセス中に含まれる固体多孔性粒子の少なくとも１つの集団は、２００μｍから６００μｍまでの範囲の平均直径を含む。
【００２３】
様々な実施形態において、本発明のフロースループロセスは、試料からの大型生体分子の少なくとも５０％、または少なくとも５５％、または少なくとも６０％、または少なくとも６５％、または少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％の回収を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】Ｓ４ＦＦ（対照）ビーズ；ＱＳ４ＦＦ（９０μｍ）ビーズ；またはＱＳＢＢ（２００μｍ）ビーズのうちの１つを含有する０．５ｍｌカラムを通過した、Ｐｈｉ６およびＢＳＡの溶液混合物におけるバクテリオファージＰｈｉ６のフロースルー力価を測定するための例示的な実験の結果を表すグラフである。Ｘ軸は、各カラムを通って処理された供給原料のカラム体積を表し、Ｙ軸は、各カラムからのフロースルー中のＰｈｉ６力価を表す。
【図２】ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰ（３０μｍ）ビーズ；ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅ４ＦＦ（９０μｍ）ビーズ；またはＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＢＢ（２００μｍ）ビーズのうちの１つを含有する１ｍｌカラムを通過した、Ｂ型インフルエンザウイルス、宿主細胞ＤＮＡ、宿主細胞タンパク質、ウシ胎仔血清および他の細胞培養添加剤を含有する溶液混合物における、Ｂ型インフルエンザウイルスのフロースルー力価を測定するための例示的な実験の結果を表すグラフである。Ｘ軸は、各カラムを通って処理された供給原料のカラム体積を表し、Ｙ軸は、各カラムからのフロースルー中のＢ型インフルエンザウイルスの力価を表す。
【図３】Ｓ４ＦＦ（対照）ビーズ、ＱＳ４ＦＦ（９０μｍ）ビーズ；またはＱＳＢＢ（２００μｍ）ビーズのうちの１つを含有する０．８ｍｌカラムを通過した、宿主細胞タンパク質およびＤＮＡの混合物におけるＡ型インフルエンザウイルスのブレークスルーを測定した例示的な実験の結果を表すグラフである。Ｘ軸は、各カラムを通って処理された供給原料の体積を表し、Ｙ軸は、各カラムからのフロースルー中のＡ型インフルエンザウイルスの力価を表す。
【図４】Ｓ４ＦＦ（対照）ビーズ；ＱＳ４ＦＦ（９０μｍ）ビーズ；またはＱＳＢＢ（２００μｍ）ビーズのうちの１つを含有する０．８ｍｌカラムを通過した、Ａ型インフルエンザウイルスおよびＤＮＡの溶液混合物における宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）のブレークスルーを測定した例示的な実験の結果を表すグラフである。Ｘ軸は、各カラムを通って処理された供給原料の体積を表し、Ｙ軸は、各カラムからのフロースルー中のＨＣＰの力価を表す。
【図５】０．８ｍｌのＱＳ４ＦＦ（９０μｍ）ビーズ；０．８ｍｌのＱＳＢＢ（２００μｍ）ビーズ；連続して０．８ｍｌのＱＳＢＢおよび０．８ｍｌのＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビッグビーズ（２００μｍ）（ＡＣ）；連続して０．８ｍｌのＱＳＢＢおよび０．８ｍｌのＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビッグビーズ（２００μｍ）（ＡＨ）；連続して０．８ｍｌのＱＳＢＢ、０．８ｍｌのＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビッグビーズおよび０．８ｍｌのＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビッグビーズ（ＡＣＨ）；またはＱＳＢＢ、ＳＰ ＳｅｐｈａｒｏｓｅビッグビーズおよびＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビッグビーズの２．４ｍｌの混合物（ＭＡＣＨ）のうちの１つを含有するカラムを通過した、ＨＣＰおよび宿主細胞ＤＮＡの溶液混合物におけるＡ型インフルエンザウイルスのブレークスルーを測定した例示的な実験の結果を表すグラフである。Ｘ軸は、各カラムを通って処理された供給原料の体積を表し、Ｙ軸は、各カラムからのフロースルー中のＢ型インフルエンザウイルスの力価を表す。
【図６】０．８ｍｌのＱＳ４ＦＦ（９０μｍ）ビーズ；０．８ｍｌのＱＳＢＢ（２００μｍ）ビーズ；連続して０．８ｍｌのＱＳＢＢおよび０．８ｍｌのＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビッグビーズ（２００μｍ）（ＡＣ）；連続して０．８ｍｌのＱＳＢＢおよび０．８ｍｌのＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビッグビーズ（２００μｍ）（ＡＨ）；連続して０．８ｍｌのＱＳＢＢ、０．８ｍｌのＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビッグビーズおよび０．８ｍｌのＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビッグビーズ（ＡＣＨ）；またはＱＳＢＢ、ＳＰ ＳｅｐｈａｒｏｓｅビッグビーズおよびＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビッグビーズの２．４ｍｌの混合物（ＭＡＣＨ）のうちの１つを含有するカラムを通過した、Ａ型インフルエンザウイルスおよび宿主細胞ＤＮＡの溶液混合物におけるＨＣＰのブレークスルーを測定した例示的な実験の結果を表すグラフである。Ｘ軸は、各カラムを通って処理された供給原料の体積を表し、Ｙ軸は、各カラムからのフロースルー中のＨＣＰの力価を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明は、単位体積当たりの最小化された外部表面積および（単位体積当たりの最小化された外部表面積および単位体積当たりの減少していない内部表面積を含まない同様の種類のクロマトグラフィービーズと比較して２５％を超えて減少していない）単位体積当たりの内部表面積を含む少なくとも１種類のクロマトグラフィービーズを使用した、試料中の１つまたは複数の夾雑物から大型生体分子（例えば、カプセル化ウイルス、ウイルス様粒子またはコンジュゲートワクチン）を分離するための改良されたフロースループロセスを提供する。
【００２６】
Ｉ．定義
本開示がより容易に理解され得るように、特定の用語がまず定義される。さらなる定義は、詳細な説明の全体にわたって説明される。
【００２７】
本明細書において相互に交換して使用することができる「フロースループロセス」、「フロースルーモード」、および「フロースルークロマトグラフィー」という用語は、１つまたは複数の夾雑物とともに試料中に含有されている少なくとも１つの生成物（例えば、本明細書に記載のものなどの大型生体分子）はクロマトグラフィー樹脂または媒体を流過することを意図され、一方、少なくとも１つの潜在的な夾雑物または不純物はクロマトグラフィー樹脂または媒体に結合する、生成物分離技術を指す。「フロースルーモード」は一般に、アイソクラティック操作（すなわち、移動相の組成が変化しないクロマトグラフィープロセス）である。このようなフロースルークロマトグラフィープロセスは、単一カラム、連続したマルチカラムまたは並列、直列カラム、擬似移動床式（ＳＭＢ）およびこれらの組み合わせを使用して操作することができる。
【００２８】
本明細書において相互に交換して使用することができる「結合および溶出方式」および「結合および溶出プロセス」という用語は、試料中に含有されている少なくとも１つの生成物（例えば、本明細書に記載のものなどの大型生体分子）がクロマトグラフィー樹脂または媒体に結合し、その後溶出される、生成物分離技術を指す。
【００２９】
本明細書において相互に交換して使用することができる「夾雑物」、「不純物」、および「残屑」という用語は、本発明のフロースループロセスを使用して外来または有害分子の１つまたは複数から分離されている対象の大型生体分子を含有する試料中に存在し得る、ＤＮＡ、ＲＮＡ、１つまたは複数の宿主細胞タンパク質、エンドトキシン、脂質および１つまたは複数の添加剤などの生物学的マクロ分子を含む任意の外来または有害分子を指す。さらに、このような夾雑物は、分離プロセスの前にあり得る段階において使用される任意の試薬を含んでいてもよい。一般に、大型生体分子を含有する試料中に存在する夾雑物は、大型生体分子よりも大きさが小さい。例えば、大部分の宿主細胞タンパク質は、約３ＫＤから１５０ＫＤまでの範囲に及び、これは、本明細書に記載の方法を使用して分離される大部分の大型生体分子の大きさよりも小さい。
【００３０】
本明細書において使用される「大型生体分子」という用語は、本明細書に記載のフロースループロセスを使用して、生物学的材料を含有する試料中に存在する１つまたは複数の夾雑物から分離される、少なくとも１５ｎｍ、または少なくとも２０ｎｍ、または少なくとも２５ｎｍ、または少なくとも３０ｎｍ、または少なくとも３５ｎｍ、または少なくとも４０ｎｍ、または少なくとも４５ｎｍ、または少なくとも５０ｎｍ、または少なくとも５５ｎｍ、または少なくとも６０ｎｍ、または少なくとも６５ｎｍ、または少なくとも７０ｎｍ、または少なくとも７５ｎｍ、または少なくとも８０ｎｍ、または少なくとも９０ｎｍ、または少なくとも１００ｎｍ、または少なくとも１１０ｎｍ、または少なくとも１２０ｎｍ、または少なくとも１３０ｎｍ、または少なくとも１４０ｎｍ、または少なくとも１５０ｎｍ、または少なくとも１６０ｎｍ、または少なくとも１７０ｎｍ、または少なくとも１８０ｎｍ、または少なくとも１９０ｎｍ、または少なくとも２００ｎｍ、または少なくとも２１０ｎｍ、または少なくとも２２０ｎｍ、または少なくとも２３０ｎｍ、または少なくとも２４０ｎｍ、または少なくとも２５０ｎｍ、または少なくとも２６０ｎｍ、または少なくとも２７０ｎｍ、または少なくとも２８０ｎｍ、または少なくとも２９０ｎｍ、または少なくとも３００ｎｍ、または少なくとも３１０ｎｍ、または少なくとも３２０ｎｍ、または少なくとも３３０ｎｍ、または少なくとも３４０ｎｍ、または少なくとも３５０ ｎｍ、または少なくとも３６０ｎｍ、または少なくとも３７０ｎｍ、または少なくとも３８０ｎｍ、または少なくとも３９０ｎｍ、または少なくとも４００ｎｍの平均直径を有する、対象とする生物学的材料を指す。例示的な大型生体分子は、例えば、カプセル化ウイルス、ウイルス様粒子およびコンジュゲートワクチンを含む。いくつかの実施形態において、本発明の方法を使用して分離されている大型生体分子は、クロマトグラフィービーズの細孔から排除される、またはビーズの外部表面にのみ結合する。
【００３１】
「カプセル化ウイルス」という用語は、本明細書において使用される場合、キャプシドの内側の核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を含む任意のウイルスを指すことになっており、一般にクロマトグラフィービーズの外部表面に結合するのみである。いくつかの実施形態において、キャプシドは、キャプシド周囲に脂質エンベロープを有する。いくつかの実施形態において、カプセル化ウイルスは、複雑な膜構造の内側に囲まれたＲＮＡまたはＤＮＡ分子（例えば、ポックスウイルス（Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ）科の天然痘ウイルス（ｓｍａｌｌｐｏｘ ｖｉｒｕｓ））を含む。一般に、大部分のカプセル化ウイルスは、１５−４００ｎｍの範囲の大きさを有する。
【００３２】
「ウイルス様粒子」という用語は、本明細書において使用される場合、その大きさおよび／またはその免疫原性に関してウイルスに似ているが、ウイルスのように複製する能力を欠く粒子または物質（例えば、ヒト乳頭腫ウイルス（ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）（ＨＰＶ）ワクチン）を指すことになっている。
【００３３】
「コンジュゲートワクチン」という用語は、本明細書において使用される場合、細菌の細胞表面多糖をタンパク質または毒素と反応させることによって産生されるワクチンを指すことになっている。例示的なコンジュゲートワクチンは、肺炎球菌ワクチンおよびストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｓｅ）ワクチンを含むがこれらに限定されない。
【００３４】
「クロマトグラフィー」という用語は、本明細書において使用される場合、対象とする大型生体分子とともに試料中に存在する１つまたは複数の夾雑物から対象とする大型生体分子（例えば、カプセル化ウイルス、ウイルス様粒子またはコンジュゲートワクチン）を分離する任意の種類の技術を指す。
【００３５】
「陰イオン交換クロマトグラフィー」または「ＡＥＣ」という用語は、本明細書において使用される場合、正に荷電したビーズを使用して、試料中の１つまたは複数の夾雑物から対象とする生体分子（例えば、カプセル化ウイルス、ウイルス様粒子またはコンジュゲートワクチンなどの大型生体分子）を分離するクロマトグラフィープロセスを指す。例示的な市販のＡＥＣ媒体は、すべてＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製のＱ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ、Ｃａｐｔｏ Ｑ、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ、ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ製のＦｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＴＭＡＥ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＤＥＡＥならびにＴＯＳＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製のＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＤＥＡＥ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＱＡＥおよびＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＳｕｐｅｒＱを含む。
【００３６】
従来、ＡＥＣは、ビーズ、膜およびモノリスを使用したウイルス精製のために使用されてきた。ＡＥＣは一般に、例えば、インフルエンザおよびアデノウイルスなどのカプセル化ウイルスが、５．５より高いｐＨで負に荷電しているという原理に基づいている。したがって、これらは、５．５より高いｐＨでイオン相互作用を介して正に荷電した樹脂を使用して結合および溶出することができる。一般に、大部分のカプセル化ウイルスの大きさのために、これらは大部分の市販のＡＥＣ媒体に浸透することができず、媒体の外部表面に結合することができるのみであり、これによってクロマトグラフィーカラムのウイルス容量を制限している。したがって、カラム容量問題を回避するための一般的なアプローチは、ＡＥＣ媒体の大きさを減少させることであった（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００４１１２７０７を参照されたい）。
【００３７】
「陽イオン交換クロマトグラフィー」または「ＣＥＣ」という用語は、本明細書において使用される場合、負に荷電したビーズを使用して、試料中の１つまたは複数の夾雑物から対象とする生体分子（例えば、カプセル化ウイルス、ウイルス様粒子またはコンジュゲートワクチンなどの大型生体分子）を分離するクロマトグラフィープロセスを指す。例示的な市販のＣＥＣ媒体は、すべてＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製のＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ、ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ製のＦｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ Ｓ０３−、ならびにＴＯＳＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製のＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＳＰおよびＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＣＭを含む。
【００３８】
「疎水性相互作用クロマトグラフィー」または「ＨＩＣ」という用語は、本明細書において使用される場合、対象とする生体分子を分離するための疎水性基として芳香族または脂肪族炭化水素を固定されたビーズを使用するクロマトグラフィープロセスを指す。一実施形態において、ＨＩＣは、試料中の１つまたは複数の夾雑物から、例えば、コンジュゲートワクチンなどの大型生体分子を分離するために使用される。例示的な市販のＨＩＣ媒体は、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製のＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ製のＦｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ Ｐｒｏｐｙｌ ６５０、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ Ｐｈｅｎｙｌ ６５０、ならびにＴＯＳＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製のＴｏｙｏｐｅｒａｌ Ｐｈｅｎｙｌ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｂｕｔｙｌ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨｅｘｙｌおよびＴｏｙｏｐｅａｒｌ Ｅｔｈｅｒを含む。
【００３９】
「サイズ排除クロマトグラフィー」または「ＳＥＣ」という用語は、本明細書において使用される場合、異なる大きさの溶質を含有する溶液が適切な細孔径を有する多孔性媒体を通過するとき、小さい大きさの溶質は媒体から拡散するのに長い時間がかかり、そのため長い保持時間を有するが、一方、大きい大きさの溶質はすぐに拡散し、それによって小さい大きさの溶質からこれらの分離を可能にするという原則に基づくクロマトグラフィープロセスを指す。例示的な市販のＳＥＣ媒体は、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＳｅｐｈａｃｒｙｌおよびＦｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＢｉｏＳＥＣを含む。
【００４０】
大部分のウイルスはその大きさのために、大部分の市販のＳＥＣ媒体を浸透することができず、典型的には、ＳＥＣクロマトグラフィーカラムの空隙容量中に溶出される。しかしながら、ＳＥＣは一般にいくつかの不都合を有し、例えば、ＳＥＣクロマトグラフィーは典型的に長いカラム長を必要とし、最大充填容量は２０％を超えることができず、処理時間は非常に長く、しばしば対象とする生成物の希釈をもたらす。
【００４１】
本明細書において相互に交換して使用することができる「混合モードクロマトグラフィー」、または「バイモードクロマトグラフィー」もしくは「マルチモードクロマトグラフィー」という用語は、単一ビーズ上に複数の官能基および／または様々な官能基の組み合わせを有するビーズを使用するクロマトグラフィープロセスを指す。このようなビーズは、混合モード樹脂もしくはビーズ、バイモード樹脂もしくはビーズまたはマルチモード樹脂もしくはビーズと称されることもある。例えば、単一ビーズは、同じビーズ上に、正および負の両方に荷電した基または正に荷電しており疎水性でもある基または負に荷電しており疎水性でもある基または正の、負のおよび疎水性の基のそれぞれを有していてもよい。このようなビーズを使用して、試料中の１つまたは複数の不純物から対象とする生体分子を分離することができる。例示的な市販の混合モード媒体は、例えば、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製のＣａｐｔｏ ａｄｈｅｒｅ、Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製のＨＰＡおよびＰＰＡ ＨｙｐｅｒＣｅｌ（商標）を含む。
【００４２】
クロマトグラフィー媒体の「動的結合容量」という用語は、本明細書において使用される場合、結合していない生体分子の顕著なブレークスルーが起こるまでにフロースループロセスにおいて媒体が結合する標的生体分子の量を指す。クロマトグラフィー媒体の動的容量は、流速が増加したときに起こり得る物質移動律速の影響を反映し、これは媒体の飽和または静的結合容量の決定と比較して実際のプロセス性能を予測するのに有用である。一般に、媒体の動的結合容量は静的結合容量よりも低い。
【００４３】
本明細書において相互に交換して使用することができるクロマトグラフィー媒体の「静的結合容量」および「飽和結合容量」という用語は、ビーズ上のすべての利用可能な結合部位が利用されている場合に静的平衡条件下で媒体（例えば、カラム中に充填されたビーズ）が結合することができる標的生体分子の量を指す。静的結合容量は、例えば、カラム中のビーズの閉鎖系において非常に遅い流速でまたは長時間のインキュベーション後のいずれかで大過剰の標的生体分子を充填することによって決定することができる。実際には、静的結合容量が充填カラムを使用したプロセス条件下で有効になることはない。
【００４４】
「単位体積当たりの外部表面積」という用語は、本明細書において使用される場合、対象とする生体分子を結合するために利用可能なクロマトグラフィー粒子集団（例えば、ビーズ）の外部表面上の総面積を指す。例えば、いくつかの実施形態において、単位体積当たりの外部表面積は、大型生体分子を結合するために利用可能な、カラム中に充填されている固体多孔性粒子集団の外部表面上の総面積と定義されている。
【００４５】
ビーズの単位体積当たりの外部表面積の推定値は、数学的にまたは経験的に計算することができる。例えば、数学的には、単位体積当たりの外部表面積は、次の方程式
【００４６】
【数１】
（式中、Ａｅｓ／ｖ＝単位体積当たりの外部表面積；ｄ＝使用したビーズの直径；およびη＝カラム充填密度）を使用して推定することができる。ビーズの六方最密充填（ＨＣＰ）を仮定すれば、完全に充填されたカラムではこれは０．７４に等しい。
【００４７】
またη＝１−空隙容量。カラムの空隙容量は、ビーズと相互作用せず、ビーズの細孔から排除される分子を使用して実験的に決定することができる（例えば、Ｇｅｌ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓを参照されたい）。
【００４８】
経験的には、単位体積当たりの外部表面積は次の通り推定される。典型的に、経験的計算は、大型生体分子と同じ大きさおよび電荷の球状ナノ粒子を使用して行われる。入手したナノ粒子の濃度は通常、製造業者によって明記されている、または、動的光散乱またはＵＶ−Ｖｉｓ分光法などのウイルス粒子の測定のために使用される標準的技術を使用して（例えば、Ｗｏｌｆｇａｎｇ Ｈａｉｓｓら、Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｚｅ ａｎｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｏｌｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｒｏｍ ＵＶ−Ｖｉｓ Ｓｐｅｃｔｒａ、２００７年、７９、４２１５−４２２１頁を参照されたい）入手可能である。一定の体積のビーズへのナノ粒子の結合は、例えば、本明細書に記載の静的結合容量実験を使用して検討される。ビーズに結合したナノ粒子の量は、次の式
【００４９】
【数２】
（式中、ＮＳ＝飽和時のビーズに結合したナノ粒子の量；Ｃｉｎ＝単位体積当たりの粒子として測定した溶液中のナノ粒子の初期濃度；Ｃｆ＝単位体積当たりの粒子として測定した溶液中のナノ粒子の最終濃度；およびｖ＝使用した溶液の体積）を使用して推定することができる。
【００５０】
ナノ粒子を含有するカラムの単位体積当たりの外部表面積は、次の通り決定することができる
【００５１】
【数３】
（式中、ｄｎ＝ナノ粒子の直径；およびＶ＝カラム体積）。
【００５２】
クロマトグラフィー粒子（例えば、ビーズ）の集団の「単位体積当たりの内部表面積」という用語は、本明細書において使用される場合、粒子の単位体積当たりの外部表面積を引いた粒子の単位体積当たりの総表面積と定義することができ、次の通り：
【００５３】
【数４】
（式中、Ａｉｎ／Ｖ＝ビーズの単位体積当たりの内部表面積；Ａｔ＝ビーズの単位体積当たりの総表面積；およびＡｔ＝Ａ×ＢＤ、ここでＡ＝ビーズの単位質量当たりの表面積、これは、Ｂｒｕｎａｕｅｒ、Ｅｍｍｅｔｔ、およびＴｅｌｌｅｒ（ＢＥＴ）によって開発された方法を使用して計算することができる（例えば、Ｓ．Ｂｒｕｎａｕｅｒら、Ｊ Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９３８年、６０、３０９頁を参照されたい）；および単位体積当たりの質量の単位を有するＢＤ＝かさ密度）推定することができる。一般に、Ａｅｓ／ｖは、Ａｔと比較してごくわずかである。したがって、Ａｔは、内部表面積の推定値そのままであるとみなすことができる。
【００５４】
供給原料流中の宿主細胞タンパク質および別の不純物の大きさおよび電荷の典型を表す小分子について、単位体積当たりの内部表面積の推定値はまた、ビーズの静的および動的結合容量から取得することもできる。このような典型的な分子の例は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、リゾチームまたはモノクローナル抗体（Ｍａｂ、またはＩｇＧ）を含んでもよいがこれらに限定されない。すべての実用的な目的のために、この方法は、不純物に結合させるために利用可能な表面積を推定する、より現実的なアプローチである。
【００５５】
フロースループロセスにおける対象とする生成物の回収率パーセントは、次の方程式
【００５６】
【数５】
（式中、Ｐ供給原料＝供給原料中の大型生体分子の量およびＰフロースルー＝生成物中の大型生体分子の量）を使用して計算することができる。
【００５７】
本発明による方法を使用した対象とする生成物の回収率パーセントは、次の方程式
【００５８】
【数６】
（式中、Ｒｂ＝粒子集団の単位体積当たりの外部表面積が最小化されたプロセスの回収率；およびＲＳ＝粒子集団の単位体積当たりの外部表面積が最小化されていないプロセスの回収率）を使用して計算することができ、ここで回収率パーセントは向上した回収率パーセントである。
【００５９】
フロースループロセスを使用して回収した生成物の純度は、回収したフロースループール中の大型生体分子に対する不純物の量の比と定義することができる。例えば、生成物を含有するインフルエンザウイルスの純度は、μｇ／ＨＡＵ（ＨＡＵ＝ヘマグルチニン単位）と表すことができ、不純物（例えば、宿主細胞タンパク質）の総量をフロースループール中のウイルスの総量で割ることによって得られる。本発明による方法を使用した、対象とする生成物の純度の向上パーセントは、次の方程式
【００６０】
【数７】
（式中、単位体積当たりの最小化された外部表面積を有する粒子（例えば、固体多孔性ビーズ）の集団を用いたプロセスが使用される場合、ｒｂ＝生成物中の大型生体分子の総量に対する生成物中の宿主細胞タンパク質の総量の比）を使用して計算することができる。例えば、インフルエンザ精製について、この比はμｇ／ＨＡＵ（式中、μｇは宿主細胞タンパク質の単位であり、ＨＡＵはインフルエンザウイルスの単位を表す）において表すことができる：および単位体積当たりの最小化された外部表面積を有する粒子（例えば、固体多孔性ビーズ）の集団が使用されないプロセスの場合、ｒｓ＝生成物中の大型生体分子の総量に対する生成物中の宿主細胞タンパク質の総量の比。
【００６１】
一般に、特許請求されている方法において使用される単位体積当たりの最小化された外部表面積を有する粒子は、（単位体積当たりの最小化された外部表面積を有さない粒子と比較して２５％を超えて減少していない）単位体積当たりの内部表面積を有する。
【００６２】
ＩＩ．フロースループロセスにおいて使用される例示的なクロマトグラフィー媒体
フロースルー精製のために使用することができる例示的なクロマトグラフィー媒体は、陰イオン交換クロマトグラフィー媒体（例えば、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビッグビーズ、Ｑ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ、Ｃａｐｔｏ Ｑ、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＴＭＡＥ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＤＥＡＥ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＤＥＡＥ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＱＡＥおよびＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＳｕｐｅｒＱ）、陽イオン交換クロマトグラフィー媒体（例えば、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビッグビーズ、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＳＯ３−、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＳＰおよびＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＣＭ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー媒体（例えば、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｔｏｙｏｐｅｒａｌ Ｐｈｅｎｙｌ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｂｕｔｙｌ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨｅｘｙｌおよびＴｏｙｏｐｅａｒｌ Ｅｔｈｅｒ）およびサイズ排除クロマトグラフィー媒体（例えば、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＳｅｐｈａｃｒｙｌおよびＦｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＢｉｏＳＥＣ）を含むがこれらに限定されない。単一の種類のクロマトグラフィー媒体または１つもしくは複数の種類のクロマトグラフィー媒体の任意の組み合わせを、本発明の方法において使用することができる。どのクロマトグラフィー媒体を本発明の方法において使用することができるかについて、分離される大型生体分子および除去される必要のある不純物に主として基づいて、当業者には容易にわかるはずである。
【００６３】
ＩＩＩ．１つまたは複数の夾雑物から生体分子を分離するフロースルー方法
フロースルークロマトグラフィー分離は、モノクローナル抗体調製物から、例えば、エンドトキシン、ウイルスおよびＤＮＡなどの微量の不純物を除去するための重要な最終仕上げ段階となっている。フロースルー分離は、緩衝液交換、勾配およびピーク分離などのクロマトグラフィー分離プロセス中の複雑な段階の必要性をなくすため、従来の結合および溶出クロマトグラフィー方式に対して利点を有する。
【００６４】
分離のフロースルークロマトグラフィー方法は一般に、対象とする生体分子および１つまたは複数の不純物を含有する供給原料溶液をビーズまたは膜などの媒体と接触させるステップおよび処理した供給原料を回収するステップを含む。いくつかのフロースループロセスにおいて、媒体は、カラムなどのフロースルーデバイスの内側に充填されている。いくつかのプロセスにおいて、このようなデバイスは、供給原料流中の不純物の大部分を捕捉することができ、対象とする生成物についてはわずかに結合するか全く結合せず、その結果、フロースルーデバイスの生成物下流をより純粋にする媒体（例えば、固体多孔性ビーズ）を含有する。
【００６５】
本発明によるいくつかの実施形態において、フロースルーデバイスは、当技術分野において知られているおよび／または本明細書に記載のものなどの１つまたは複数の種類のクロマトグラフィービーズを充填されたカラムからなり、少なくとも１種類のビーズは、ビーズの単位体積当たりの最小化された外部表面積および（最小化された外部表面積を有さないビーズと比較して２５％を超えて減少していない）ビーズの単位体積当たりの内部表面積を含む。
【００６６】
いくつかの実施形態において、例えば、カプセル化ウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、ウイルス様粒子（例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で被覆されたスチレン粒子）またはコンジュゲートワクチンなどの大型生体分子を含有する供給原料を、供給原料中の１つまたは複数の夾雑物から大型生体分子を分離するために、生体分子よりも小さい分子量カットオフをそれぞれ有している１つまたは複数の種類のクロマトグラフィービーズと接触させ、少なくとも１種類のビーズは、この１種類のビーズの単位体積当たりの最小化された外部表面積および（ビーズの単位体積当たりの最小化された外部表面積を有さない同じ種類のビーズの単位体積当たりの内部表面積と比較して２５％を超えて減少していない）この１種類のビーズの単位体積当たりの内部表面積を有する。
【００６７】
例えば、本明細書に記載の例示的な実験において、インフルエンザウイルスはＭＤＣＫ細胞株を使用して増殖させた。ウイルス含有供給原料は、大きな細胞残屑を除去するために、遠心分離を使用して、その後０．４５μｍ膜濾過を使用して予備浄化した。次いでクロマトグラフィービーズを含有するフロースルーデバイスによる精製の前に所望の緩衝液に緩衝液交換した。一般に、例えば、遠心分離、深層濾過、接線流濾過、透析濾過および緩衝液交換などの１つまたは複数の調製段階は、様々な供給源（例えば、細胞培養、卵など）から得られたウイルスを含有する様々な供給原料のために、本明細書に記載のフロースルークロマトグラフィー方式を使用した精製の前に使用することができる。
【００６８】
対象とする生体分子を含有する供給原料の予備浄化に続いて、予備浄化した供給原料をフロースルー分離にかける。フロースルー分離は、１つまたは複数の構成を使用して行ってもよい。例示的な構成において、容積式ポンプ（例えば、Ｍｉｇｈｔｙ−Ｍｉｎｉ、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃシステム Ｉｎｃ．）およびフロースルーカラムは連続して使用される。例えば、ポンプおよびチューブはまず、２０％エタノールを使用して消毒し、次いで水および緩衝液で流す。その後、対象とする大型生体分子を含有する供給原料を、ポンプを使用してカラムを通過させ、画分をカラム下流でエッペンドルフチューブ中に手作業で回収する。
【００６９】
別の例示的な構成において、Ａｋｔａ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）またはＢｉｏＣａｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏシステム）などのより自給式の装置を使用することができる。これらのシステムは、自動化されたポンプ輸送ならびに供給原料および緩衝液の制御、フロースルー流のＵＶおよび伝導度信号のインライン測定ならびに自動画分回収を可能にする。回収された画分は、オフライン測定にさらに使用される。
【００７０】
ＩＶ．フロースループロセスにおいて回収した生体分子の力価を測定する方法
通例、試料中の１つまたは複数の夾雑物からの大型生体分子の分離の後に、回収した大型生体分子の力価を測定する。
【００７１】
ウイルス、タンパク質、核酸、コンジュゲートワクチンなどを含む様々な生体分子の検出のための技術は、一般に、当技術分野においてよく知られており、文献中に記述されている。クロマトグラフィープロセスを使用して回収した生体分子の力価は、インラインまたはオフラインのいずれかで測定することができる。インライン検出技術は、クロマトグラフィーカラムの下流に連続して配置された検出器を含む。一方、分析のオフライン方法は、クロマトグラフィーカラムを流れている溶液の画分を回収すること、および標準的技術を使用してこれらをアッセイすることによって達成される。オフライン検出は一般に、インライン技術において異なる種による阻害がある場合、生体分子が利用可能なインライン技術を使用して検出できない場合、または対象とする生体分子の濃度がインライン技術の検出限界より低いもしくは実際の濃度を表すものではない場合に使用される。
【００７２】
ウイルス、タンパク質およびＤＮＡ用に一般に使用されるインライン測定技術は、２８０ｎｍおよび２６０ｎｍでのＵＶ分光法である（例えば、欧州特許出願番号ＥＰ１８０１６９７Ａ１を参照されたい）。また、最近、多角度レーザー光散乱（ＭＡＬＳ）が使用され、クロマトグラフィープロセスにおいてウイルスをインラインで検出することに成功した（例えば、Ｏｐｉｔｚら、Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｂｉｏｅｎｇｇ．、１０３：１１４４−１１５４頁（２００９年）を参照されたい）。
【００７３】
オフライン測定技術は、ＵＶ分光法および動的光散乱（例えば、Ｏｐｉｔｚら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１３１：３０９−３１７頁（２００７年）を参照されたい）などの上記の技術に加えて、測定される対象とする生体分子に特有のさらなる技術を含む。例えば、タンパク質に一般に使用されるオフライン測定技術の一部は、ビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡ）（例えば、米国公開番号２００５０１１８１４０を参照されたい）、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（例えば、Ｎａｙａｋら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．、８２３：７５−８１頁（２００５年）を参照されたい）および酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）（例えば、米国公開番号２００５０１１８１４０を参照されたい）を含む。
【００７４】
同様に、核酸（例えば、ＤＮＡ）は、ピコグリーンアッセイ（例えば、Ｏｐｉｔｚら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇｇ．、１０３：１１４４−１１５４頁（２００９年）を参照されたい）または定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）を使用して測定することができる。
【００７５】
大部分のウイルスは、組織培養感染容量アッセイ（ＴＣＩＤ５０プラークアッセイとも称される）を使用して検出および定量することができる（例えば、Ｄｕｌｂｅｃｃｏら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．、１８：２７３−２７９頁（１９５３年）を参照されたい）。しかしながら、特有のアッセイは一般に、特定のウイルスを特定および定量するために使用され、例えば、インフルエンザウイルスは、赤血球凝集反応（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）および一元放射免疫拡散（ＳＲＩＤ）アッセイ（例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４３６、Ａｖｉａｎ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓ、Ｓｐａｃｋｍａｎ，Ｅ．編Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２００７年）を参照されたい）などのアッセイを使用して定量される。
【００７６】
Ｖ．クロマトグラフィービーズおよびウイルスの大きさを測定する方法
いくつかの実施形態において、本発明のクロマトグラフィー方法は、１つまたは複数の種類の固体多孔性クロマトグラフィービーズを利用し、少なくとも１つのビーズの種類は、他のビーズの種類の平均直径よりも大きい平均直径を有する。このようなビーズを、本発明との関連において「ビッグビーズ」または「大型ビーズ」と称する。いくつかの実施形態において、ビッグビーズは少なくとも２００μｍの平均直径を有する。
【００７７】
本発明の方法を使用して分離される生体分子の種類に基づいて、当業者は、生体分子の分離のために必要とされ得る１つまたは複数の種類のクロマトグラフィービーズを容易に決定することができる（例えば、生体分子の組成、大きさ、電荷などに基づいて）。
【００７８】
一般に、本発明の方法において使用される大部分のクロマトグラフィービーズは、市販のものを入手することができる。したがって、クロマトグラフィービーズの大きさは通常、製造業者の仕様書中に記載されている、または、（１）大きさの分布の広いビーズを狭い大きさの範囲に分けるためにも使用することができる湿式篩分け；（２）カメラを内蔵した光学顕微鏡およびマイクロメータースライドまたはビーズの写真を撮影することおよびＩｍａｇｅＪなどのソフトウェアを使用してこれらを分析すること；ならびに（３）Ｅｌｚｏｎｅ ＩＩ（Ｐａｒｔｉｃｌｅ ａｎｄ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｔｙ．Ｌｔｄ）、Ｍａｓｔｅｒ Ｓｉｚｅｒ（Ｍａｌｖｅｒｎ）およびＦｌｏｗＣａｍ（Ｆｌｕｉｄ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などの標準的な粒径測定器の使用、を含むがこれらに限定されない当技術分野においてよく知られている方法または機器の１つまたは複数を使用して容易に決定することができる。
【００７９】
本発明の方法を使用して分離することができる大部分の大型生体分子（例えば、ウイルス、ウイルス様粒子およびコンジュゲートワクチン）の大きさは、一般に、当技術分野においてよく特徴付けられている方法に基づいて決定することができる。例えば、ウイルスの大きさは、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）（例えば、Ｎｅｒｍｕｔら、ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．、９：９２９−９３８頁（１９９３年）を参照されたい）および動的光散乱（Ｄｙｎｏｐｒｏ、Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（例えば、Ｏｐｉｔｚら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１３１、３０９−３１７頁（２００７年）を参照されたい）を含むがこれらに限定されない、当技術分野においてよく知られている１つまたは複数の技術を使用して決定することができる。大型生体分子の大きさの予測は、大型生体分子との相互作用を有さないがフロースルー精製において使用されているビーズのものと同様の細孔径を有する中性ビーズを使用することによって得ることができる。大型生体分子がビーズの細孔よりも大きければ、大型生体分子はこのようなビーズのカラムの空隙容量中に溶出することになる。これにより、大型生体分子の大きさがビーズの細孔径よりも大きいかどうかの予測を提供する。
【００８０】
ＶＩ．クロマトグラフィービーズの細孔径を測定する方法
クロマトグラフィービーズの分子量カットオフを示す細孔径は、一般に、製造業者によって定められている。これらはまた、文献において広く論じられている（例えば、Ｇｕら、Ｅｎｚｙ．Ｍｉｃｒｏ．Ｔｅｃｈ．３３：４３０−４３７頁（２００３年）を参照されたい）。ビーズの細孔径を測定するために使用される一般的な技術は、（１）デキストラン排除クロマトグラフィー（例えば、ＤｅＰｈｉｌｌｉｐｓら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．Ａ．８８３：３９−５４頁（２００３年）を参照されたい）；（２）一般に水銀を使用するポロシメトリー（例えば、Ｓｏｂｉｓｃｈら、Ｃｏｌｌｏｉｄ Ｐｏｌｙ．Ｓｃｉ．１３３：１６９−１７２頁（２００６年）を参照されたい）；（３）ＳＥＭ（４）ガス収着（例えば、Ｂｒｕｎａｕｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、６０：３０９−３１９頁（１９３８年）を参照されたい）；および（５）サーモポロメトリー（例えば、Ｗｕｌｆｆら、Ｔｈｅｒｃｈｉｍｉ．Ａｃｔａ、４１９：２９１−２９４頁（２００４年）を参照されたい）を含むがこれらに限定されない。
【００８１】
本発明を、限定するものと解釈されるべきではない以下の実施例によりさらに説明する。本出願全体にわたって引用されたすべての参考文献、特許、公開特許出願ならびに図面の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００８２】
（実施例）
【実施例１】
【００８３】
単位体積当たりのビーズの外部表面積の測定
異なる大きさのビーズの、ビーズの単位体積当たりの外部表面積を、本明細書に記載の通り決定することができる。例示的な実験において、以下のビーズの単位体積当たりの外部表面積を、上記の数学的方法、３４μｍの平均直径を有するＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ、９０μｍの平均直径を有するＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦおよび２００μｍの平均直径を有するＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＢＢ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して推定した。
【００８４】
例えば、本明細書において論じられた方程式Ｉを使用して、３４μｍ平均直径ビーズに関する単位体積当たりの外部表面積は、次の通り、計算することができる：
【００８５】
【数８】
【００８６】
同様に、他のＡＥＣビーズすべてに関して外部表面積を計算し、表Ｉにまとめている。
【００８７】
【表１】
【００８８】
表Ｉから観察できるように、外部表面積はビーズ径の増加とともに減少する。
【００８９】
別の例示的な実験において、ビーズの単位体積当たりの外部表面積を計算するために、本明細書に記載の経験的方法を使用した。インフルエンザまたはアデノウイルスなどの大型生体分子を結合するための、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（９０μｍ）およびＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＢＢ（２００μｍ）上の利用可能な外部表面積の概算を、モデルとしてＢＳＡ被覆ラテックスビーズ（Ｐｏｓｔｎｏｖａ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ）を使用して経験的に得た。
【００９０】
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４ＦＦ（Ｓ４ＦＦ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＱＳ４ＦＦまたはＱＳＢＢビーズのそれぞれの５ｍｌカラムを、７ｍｌ蓋付き試験管に移した。Ｓ４ＦＦは中性に荷電されており、対照ビーズとして使用した。ＰＢＳ中約１．３８ｍｌのＢＳＡ被覆スチレン粒子溶液（１．４×１０１３粒子／ｍｌ）を、それぞれのビーズに加えた。
【００９１】
ビーズ−粒子混合物を回転させながら一晩混合し、ビーズを沈殿させ、上清中の粒子の吸光度を、ＵＶ分光法を使用して２８０ｎｍで測定した。標準検量線をプロットすることによって粒子の濃度を得た。
【００９２】
前述のビーズのそれぞれについて上記の方程式ＩＩＩを使用して、ＢＳＡ被覆スチレン粒子を使用して表面積を測定した例示的な実験の結果を、表ＩＩにまとめている。
【００９３】
【表２】
【００９４】
本明細書において観察されたように、経験的にならびに数学的に計算された単位体積当たりの外部表面積は、ビーズ径の増加とともに減少する。
【００９５】
しかしながら、経験による値は、大型生体分子に結合するために利用可能な実際の面積が、数学的に計算された面積よりもはるかに低いことを示唆している。本明細書に記載のフロースルー方法において、増加した平均直径を有し、また最小限の単位体積当たりの外部表面積を有するビーズの少なくとも１つの集団を使用することが望ましい。したがって、ビーズ集団の外部表面積は、単位体積当たりの内部表面積を減少させることなくビーズ径を増加させることによって最小化される。
【実施例２】
【００９６】
静的結合容量を使用した単位体積当たりのビーズの内部表面積の推定
実施例１において論じられた、それぞれ、より大きいおよび最小化された外部表面積を有する、ＱＳ４ＦＦ（９０μｍ）およびＱＳＢＢ（２００μｍ）ビーズの単位体積当たりの内部表面積を、ＢＳＡに関するこれらの静的結合容量を試験することによって推定した。ＢＳＡは、クロマトグラフィーにおけるモデルタンパク質として広く使用されてきた。ＢＳＡは、およそ６６ＫＤの平均分子量および約５のｐＩを有する。ＢＳＡは、大部分の宿主細胞タンパク質の大きさおよび電荷の典型的なものである。
【００９７】
１つの例示的な実験において、ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に関するＱＳ４ＦＦおよびＱＳＢＢビーズの静的容量を、２つの異なる種類の緩衝液において２つの異なるｐＨで測定した。ＱＳ４ＦＦまたはＱＳＢＢ媒体のいずれかを含有する１ｍｌカラムを充填し、４ｍｌの緩衝液中で媒体をスラリーにし、０．５ｍｌのスラリーを２ｍｇ／ｍｌの濃度を有する１４．５ｍｌのＢＳＡ溶液中に加えることによって実験を行った。４時間後、混合物中のビーズを沈殿させ、上清中のＢＳＡ濃度をＵＶ−Ｖｉｓ分光法によって測定した。上清濃度の変化を使用して、ＢＳＡに関するビーズの静的結合容量を計算した。
【００９８】
異なる溶液においてＢＳＡに関するビーズの静的容量を測定した実験の結果を、表ＩＩＩにまとめている。
【００９９】
【表３】
【０１００】
表ＩＩＩに示したように、最小化された外部表面積を有する２００μｍビーズおよび９０μｍビーズは、ｐＨ７．０のＴｒｉｚｍａおよびリン酸ナトリウム緩衝液において同様のＢＳＡ容量を有する。Ｔｒｉｚｍａ緩衝液においてｐＨ８．０でＱＳＢＢ（約２０％）の容量のわずかな減少が存在するが、ｐＨ８．０での容量はｐＨ７．０よりも高い。したがって、より大きいおよびより小さい単位体積当たりの外部表面積を有するＱＳ４ＦＦおよびＱＳＢＢビーズは、それぞれ、ＢＳＡを結合するための同様の単位体積当たりの内部表面積を有する、と推定することができる。したがって、適当な緩衝液、ｐＨおよびビーズ径を選択することによって、本発明において提案された方法を使用することにより同様な量の不純物を除去することができると結論付けることができる。
【実施例３】
【０１０１】
２つの異なるビーズ径の陰イオン交換媒体からのウイルス様粒子（すなわち、１００ｎｍＢＳＡ被覆スチレン粒子）の回収率の比較
例示的な実験において、異なるビーズ径を有する２つの別々の陰イオン交換媒体を、ウイルス様粒子の回収率について試験した。具体的には、陰イオン交換媒体、９０μｍの平均直径を有するＱ セファロース４ＦＦビーズ（ＱＳ４ＦＦ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）および２００μｍの平均直径を有するＱ セファロースビッグビーズ（ＱＳＢＢ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の静的結合容量を、例示的なウイルス様粒子であり、インフルエンザまたはアデノウイルスと同様の大きさおよび電荷を有する１００ｎｍウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）被覆スチレン粒子（Ｐｏｓｔｎｏｖａ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ）の回収率について試験した。ＱＳ４ＦＦおよびＱＳＢＢ媒体は、正に荷電しており、ＢＳＡ被覆ラテックス粒子に結合することができる第４級アンモニウム基を含有する。一般に、粒子はビーズの外部表面積にのみ結合するため、ＢＳＡ被覆粒子に関するこれらのビーズの静的結合容量は動的結合容量と等しくあるべきであると考えられていた。
【０１０２】
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４ＦＦ（Ｓ４ＦＦ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＱＳ４ＦＦおよびＱＳＢＢビーズのそれぞれの５ｍｌカラムを、７ｍｌ蓋付き試験管に移した。Ｓ４ＦＦは中性に荷電されており、対照ビーズとして使用した。ＰＢＳ中約１．３８ｍｌのＢＳＡ被覆スチレン粒子溶液（２５ｍｇ／ｍｌ、１．４×１０１３粒子／ｍｌ）を、それぞれのビーズに加えた。
【０１０３】
ビーズ／粒子混合物を一晩回転させ、ビーズを沈殿させ、上清中の粒子の吸光度を、ＵＶ分光法を使用して２８０ｎｍで測定した。標準検量線をプロットすることによって粒子の濃度を得た。
【０１０４】
供給原料および上清中の媒体および粒子の濃度のそれぞれについて、ＢＳＡ被覆スチレン粒子に関する容量を測定した例示的な実験の結果を、表ＩＶにまとめている。
【０１０５】
【表４】
【０１０６】
さらに、それぞれのビーズによって達成されたＢＳＡ被覆スチレン粒子の回収率を表Ｖにまとめている。
【０１０７】
【表５】
【０１０８】
表Ｖに示したように、ＢＳＡ被覆スチレン粒子の回収率は、ビーズ径の増加とともに約３３％増加する。したがって、ビーズ径を増加させることによって単位体積当たりの外部表面積を減少させることは、ウイルス様粒子の回収率の向上と相関する。
【実施例４】
【０１０９】
２つの異なるビーズ径の陰イオン交換媒体を使用した、Ｐｈｉ６およびＢＳＡの混合物からのバクテリオファージＰｈｉ６の回収率の比較
別の例示的な実験において、Ｐｈｉ６およびＢＳＡを含有する溶液混合物からのウイルス粒子（Ｐｈｉ６）の回収率を例証した。Ｐｈｉ６は、約８６ｎｍの大きさの、７．０より高いｐＨで負の電荷を有する脂質エンベロープバクテリオファージである。したがって、Ｐｈｉ６はインフルエンザウイルスを表すモデルとして使用された。さらに、ＢＳＡは、約５．０のｐＩを有する負に荷電したタンパク質であり、宿主細胞タンパク質を表すモデルとして使用された。以下の手順を使用して溶液をビーズの充填カラム中に約１ｍｌ／分の流速で流すことによって、動的モードでこれらの試験を行った。
【０１１０】
バクテリオファージＰｈｉ６（約１．１×１０１２ＰＦＵ／ｍｌのストック力価）を約６００ｍｌのＰＢＳに加えることによって供給原料溶液を調製して、約１０９ＰＦＵ／ｍｌの最終Ｐｈｉ６濃度を達成した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）をこの溶液に加えて、ＵＶ分光法により測定した０．１８ｍｇ／ｍｌの最終濃度を達成した。
【０１１１】
ガラスカラム（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製のＯｍｎｉｆｉｔ）に、約０．５ｍｌの９０μｍの平均直径を有する中性セファロース４ＦＦ（Ｓ４ＦＦ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、正に荷電した９０μｍの平均直径を有するＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦビーズ（ＱＳ４ＦＦ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）または正に荷電した２００μｍの平均直径を有するＱ セファロースビッグビーズ（ＱＳＢＢ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を充填した。カラムの品質はアセトンパルス法を使用して確認して、これらが良好な非対称性およびＨＥＴＰ（すなわち、理論段相当高さ）を確実に有するようにし、次いでＰＢＳ中で平衡化した（例えば、Ｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｆｏｃｕｓｉｎｇ− Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、１１−０００４−２１、Ｅｄｉｔｉｏｎ ＡＡにおいて記述されている通り参照されたい）。
【０１１２】
およそ２００ｍｌの供給原料溶液を、１±０．１ｍｌ／分の流速でそれぞれのカラムを通過させ、フロースルーを２０ｍｌ画分ずつ回収した。
【０１１３】
ＢＳＡ濃度について、対照として緩衝液中Ｐｈｉ６溶液を使用して、ＵＶ分光法を使用して２８０ｎｍで画分をアッセイした。バクテリオファージＰｈｉ６の濃度を、ＴＣＩＤ５０−プラーク形成単位アッセイを使用して決定した。
【０１１４】
Ｓ４ＦＦ（対照）、ＱＳ４ＦＦ（９０μｍ）またはＱＳＢＢ（２００μｍ）ビーズのいずれかを含有する０．５ｍカラムを通過した、Ｐｈｉ６およびＢＳＡの溶液混合物中のバクテリオファージＰｈｉ６のブレークスルーを測定した１つのこのような実験の結果を、図１に示している。
【０１１５】
図１により明示されているように、Ｐｈｉ６は何の相互作用もなく対照ビーズＳ４ＦＦを通過し、供給原料濃度と等しいフロースルー濃度を与える。ＱＳＢＢビーズ（２００μｍ）を使用したフロースルーは、Ｐｈｉ６が最初はカラムに結合し、１５０カラム体積（ＣＶ）の範囲内の供給原料濃度に達することを示唆している。しかしながら、ＱＳ４ＦＦビーズ（９０μｍ）を使用したフロースルー中のＰｈｉ６濃度は、３００ＣＶになって初めて供給原料濃度に達する。このことは、２００μｍビーズが９０μｍビーズの半分だけのウイルスに結合することを示唆している。
【０１１６】
実験中の特定の時点の、Ｓ４ＦＦ、ＱＳ４ＦＦまたはＱＳＢＢのいずれかを含有する０．５ｍｌカラムを通過した、上記を含有する溶液混合物のフロースルー中のＢＳＡおよびＰｈｉ６の量を測定した１つのこのような実験の結果を、表ＶＩにまとめている。
【０１１７】
【表６】
【０１１８】
表ＶＩにまとめた結果に基づいて、９０μｍおよび２００μｍ径ビーズは異なる量のＰｈｉ６に結合するものの、これらはＢＳＡに関して同様の結合特性を有すると考えられる。さらに、約８０ＣＶの供給原料を各カラム中に通過させた後、ＱＳ４ＦＦ（９０μｍ）と比較して１０倍高いＰｈｉ６の回収率を、ＱＳＢＢ（２００μｍ）を使用して得ることができる。
【０１１９】
したがって、前述の結果に基づいて、一定のカラム体積（ＣＶ）について、より小さいビーズ（例えば、９０μｍ）と比較して、より大きいビーズ（例えば、２００μｍ）を使用すると、単位体積当たりの外部表面積が減少するためより多くのウイルスを回収することができると考えられる。さらに、溶液中のタンパク質、例えば、宿主細胞タンパク質の存在は、ウイルス回収率に悪影響を及ぼさないようであり、宿主細胞タンパク質の除去自体はビーズ径とは無関係のようである。
【実施例５】
【０１２０】
３つの異なるビーズ径の陰イオン交換媒体を使用したＢ型インフルエンザウイルスおよび宿主細胞タンパク質の混合物からのＢ型インフルエンザウイルスの回収率の比較
別の例示的な実験において、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、フェノールレッドおよび非必須アミノ酸などの増殖培地中の宿主細胞タンパク質、ＤＮＡおよび他の成分の混合物からのＢ型インフルエンザウイルスの回収率を記述している。Ｂ型インフルエンザウイルスは、約５．０のｐＩおよびおよそ８０から１２０ｎｍの大きさを有する脂質エンベロープウイルスである。Ｂ型インフルエンザウイルスおよび宿主細胞タンパク質を含有する浄化した細胞培養溶解物上清をビーズの充填カラム中に１ｍｌ／分の流速で流すことによって、動的モードでこれらの試験を行った。
【０１２１】
ＭＤＣＫ細胞中で増殖させたＢ型インフルエンザウイルスを含有するおよそ２００ｍｌの供給原料を、標準的な手順を使用して調製した。初めに、８個のＴ１５０フラスコに、１０％ＦＢＳ ＤＭＥＭ中約２．０×１０７細胞／フラスコを接種した。２４時間後、フラスコ中の媒体をＤＭＥＭ中１％ＦＢＳに交換し、ＭＤＣＫ細胞における増殖に適合させた組織培養であるＢ型インフルエンザウイルス株Ｂ／Ｌｅｅ／４０（ＡＴＣＣ＃ＶＲ−１５３５）に細胞を感染させた。次いでフラスコを３７℃、５％ＣＯ２中で、完全なＣＰＥ（細胞変性作用）が観察されるまで５日間インキュベートした。その後上清を２５００ＲＰＭで遠心分離にかけ、０．４５μｍ膜フィルターによって濾過して細胞残屑を除去し、さらなる使用まで４℃で保存した。
【０１２２】
ガラスカラム（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製のＯｍｎｉｆｉｔ）に、約１ｍｌの９０μｍの平均直径を有する中性セファロース４ＦＦ（Ｓ４ＦＦ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、正に荷電した３４μｍの平均直径を有するＱ セファロース ＨＰ（ＱＳＨＰ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、正に荷電した９０μｍの平均直径を有するＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４ＦＦビーズ（ＱＳ４ＦＦ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）または正に荷電した２００μｍの平均直径を有するＱ セファロースビッグビーズ（ＱＳＢＢ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を充填した。カラムの品質はアセトンパルス法を使用して確認して、これらが良好な非対称性およびＨＥＴＰを確実に有するようにし、次いで２０ｍＭリン酸塩緩衝液ｐＨ７．２中で平衡化した。
【０１２３】
上記の通り調製したおよそ１０ｍｌの浄化したインフルエンザ供給原料を、各カラムを１ｍｌ／分の流速で通過させた。カラムを通ったフローを１ｍｌ画分ずつ回収し、赤血球凝集反応（ＨＡ）アッセイを使用してインフルエンザ含有量について２連でアッセイした。
【０１２４】
Ｓ４ＦＦ（対照）、ＱＳＨＰ（３４μｍ）ＱＳ４ＦＦ（９０μｍ）またはＱＳＢＢ（２００μｍ）ビーズのいずれかを含有する１ｍｌカラムを通過した、宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、ＦＢＳおよび他の増殖添加剤の溶液混合物中のＢ型インフルエンザウイルスのブレークスルー力価を測定した例示的な実験の結果を、表ＶＩＩおよび図２に示している。
【０１２５】
【表７】
【０１２６】
３つの異なる単位体積当たりの外部表面積に対応する３つの異なる大きさのビーズを、この実験において評価した。表ＶＩＩおよび図２において観察できるように、ＱＳＢＢ（２００μｍ）ビーズはＢ型インフルエンザウイルスの即時のブレークスルーを示す（３ＣＶ未満でブレークスルー）が、一方、ＱＳＨＰ（３４μｍ）は、９ＣＶのカラムを通過した供給原料まで、実験の全長にわたってブレークスルーしない。９ＣＶ後、ＱＳＢＢ（２００μｍ）のフロースルー濃度は供給原料溶液濃度に等しく、ＱＳ４ＦＦ（９０μｍ）ビーズよりも１６倍高い回収率およびＱＳＨＰ（３４μｍ）ビーズよりも６４倍高い回収率を示す。したがって、結果は、ビーズ径を増加させることにより単位体積当たりの外部表面積を減少させることによって、より小さい大きさのビーズと比較してＢ型インフルエンザウイルスのより高い回収率をもたらすことを例証する。
【０１２７】
さらに、下記の表ＶＩＩＩは、実施例３、４および５に記述されている実験において試験した様々な種類のウイルス粒子の回収率をまとめている。バクテリオファージ−Ｐｈｉ６およびＢ型インフルエンザウイルスのプール回収率を、図１および図２におけるブレークスルー曲線の下の面積を使用して計算した。
【０１２８】
【表８】
【０１２９】
表ＶＩＩＩにまとめたように、９０μｍから２００μｍまでビーズ径を増加させることによる外部表面積の最小化は、ウイルス／ウイルス様粒子の収率を３０−９０％向上させた。
【実施例６】
【０１３０】
陰イオン交換媒体を使用したインフルエンザウイルスおよび宿主細胞タンパク質およびＤＮＡの混合物からのＡ型インフルエンザウイルスの回収率および宿主細胞タンパク質の除去の比較
別の例示的な実験において、宿主細胞タンパク質およびＤＮＡの混合物からのＡ型インフルエンザウイルスの回収率を測定した。Ａ型インフルエンザウイルスは、約５．０のｐＩおよびおよそ８０から１２０ｎｍの大きさを有する脂質エンベロープウイルスである。Ａ型インフルエンザウイルスおよび宿主細胞タンパク質を含有する浄化および緩衝液交換した供給原料を、ビーズの充填カラム中に１ｍｌ／分の流速で流すことによって、動的モードでこれらの実験を行った。
【０１３１】
ＭＤＣＫ細胞中で増殖させたＡ型インフルエンザウイルスを含有する供給原料を、標準的な手順を使用して調製した。初めに、５０個のＴ１５０フラスコに、１０％ＦＢＳ ＤＭＥＭ中、ＭＤＣＫ細胞を１０％集密度で接種した。２−３日後、細胞が８０−９０％集密になれば、フラスコ中の媒体を無血清ＤＭＥＭに交換し、ＭＤＣＫ細胞における増殖に適合させた組織培養であるＡ型インフルエンザウイルス／ＷＳ（Ｈ１Ｎ１株）に細胞を感染させた。次いでフラスコを３３℃、５％ＣＯ２中で、完全なＣＰＥが観察されるまで３日間インキュベートした。その後上清を２５００ＲＰＭで遠心分離にかけ、０．４５μｍ膜フィルターによって濾過して細胞残屑を除去し、さらなる使用まで−８０℃で保存した。
【０１３２】
ガラスカラム（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製のＯｍｎｉｆｉｔ）に、約０．８ｍｌの９０μｍの平均直径を有する中性セファロース４ＦＦ（Ｓ４ＦＦ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、正に荷電した９０μｍの平均直径を有するＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦビーズ（ＱＳ４ＦＦ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）または正に荷電した２００μｍの平均直径を有するＱ セファロースビッグビーズ（ＱＳＢＢ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を充填した。カラムの品質はアセトンパルス法を使用して確認して、これらが良好な非対称性およびＨＥＴＰを確実に有するようにし、次いで５０ｍＭリン酸塩緩衝液ｐＨ７．１中で平衡化した。
【０１３３】
実験を行う直前に、およそ２００ｍｌの供給原料を４℃で一晩解凍し、次いで、１０Ｋｉｌｏ−Ｄａｌｔｏｎ Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ遠心フィルターデバイス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、ｐＨ７．１の５０ｍＭリン酸塩緩衝液に緩衝液を交換した。上記の通り調製したおよそ９０ｍｌのこのインフルエンザ供給原料を、各カラムを０．１６ｍｌ／分の流速で通過させた。カラムを通ったフローを１ｍｌ画分ずつ回収し、ＨＡアッセイ、ＢＣＡアッセイおよびＰｉｃｏ−ｇｒｅｅｎアッセイをそれぞれ使用してインフルエンザ、宿主細胞タンパク質、および宿主細胞ＤＮＡ含有量について２連でアッセイした。
【０１３４】
Ｓ４ＦＦ（対照）、ＱＳ４ＦＦ（９０μｍ）またはＱＳＢＢ（２００μｍ）ビーズを含有する０．８ｍｌカラムを通過した、宿主細胞タンパク質およびＤＮＡの混合物中のＡ型インフルエンザウイルスのブレークスルーを測定した例示的な実験の結果を図３に示している。
【０１３５】
Ｓ４ＦＦ（対照）、ＱＳ４ＦＦ（９０μｍ）またはＱＳＢＢ（２００μｍ）ビーズを含有する０．８ｍｌカラムを通過した、Ａ型インフルエンザウイルスおよびＤＮＡの溶液混合物中の宿主細胞タンパク質のブレークスルーを測定した例示的な実験の結果を図４に示している。
【０１３６】
表ＩＸは、４２ｍｌの供給原料がカラムを通過した後のＡ型インフルエンザウイルスの回収率および宿主細胞タンパク質の除去に関して、Ｓ４ＦＦ（対照）、ＱＳ４ＦＦ（９０μｍ）またはＱＳＢＢ（２００μｍ）ビーズのいずれかの０．８ｍｌカラムを通過した、上記の溶液混合物中のＡ型インフルエンザウイルス、ＨＣＰおよび宿主細胞ＤＮＡのブレークスルー力価を測定した、図３および４に記述した実験の結果をまとめている。
【０１３７】
【表９】
【０１３８】
図３および４ならびに表ＩＸにまとめたように、大きい２００μｍビーズカラムは、９０μｍビーズよりもはるかに速いＡ型インフルエンザウイルスのブレークスルーおよび約６５％高いウイルスの回収率をもたらすことが明らかである。ＱＳ４ＦＦおよびＱＳＢＢカラムの宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）ブレークスルー曲線は似ているようであり、ＱＳＢＢカラムによる全ＨＣＰ除去はＱＳ４ＦＦカラムよりも少し低いようである。しかし、２００μｍビーズは非常に高いウイルスの回収率を有するので、このカラムから得られた生成物の純度は、９０μｍビーズカラムよりも約６０％高い。
【実施例７】
【０１３９】
ビーズ混合物を使用したインフルエンザウイルスおよび宿主細胞タンパク質およびＤＮＡの混合物からのＡ型インフルエンザウイルスの回収率および宿主細胞タンパク質の除去の比較
例示的な実験において、（１）陰イオン交換ビーズカラム；（２）連続して陰イオンおよび陽イオン交換ビーズを含有するカラム；（３）連続して陰イオン交換および疎水性ビーズを含有するカラム；（４）連続して陰イオン交換、陽イオン交換および疎水性ビーズを含有するカラム；（５）または陰イオン交換、陽イオン交換および疎水性ビーズの混合物を含有するカラムを使用した、ウイルスおよび宿主細胞タンパク質および宿主細胞ＤＮＡを含有する混合物からのＡ型インフルエンザウイルスのフロースルー精製。
【０１４０】
ガラスカラム（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製のＯｍｎｉｆｉｔ）に、約０．８ｍｌの正に荷電した９０μｍの平均直径を有するＱセファロース４ＦＦビーズ（ＱＳ４ＦＦ）を、または０．８ｍｌの正に荷電した２００μｍの平均直径を有するＱ セファロースビッグビーズ（ＱＳＢＢ）を、または０．８ｍｌのＱ セファロースビッグビーズその後に０．８ｍｌの２００μｍの平均直径を有するＳＰセファロースビッグビーズを連続して（ＡＣ）、または０．８ｍｌのＱ セファロースビッグビーズその後に０．８ｍｌの２００μｍの平均直径を有するＰｈｅｎｙｌ セファロースビッグビーズを連続して（ＡＨ）、または０．８ｍｌのＱ セファロースビッグビーズその後に０．８ｍｌのＳＰセファロースビッグビーズその後に０．８ｍｌの２００μｍの平均直径を有するＰｈｅｎｙｌ セファロースビッグビーズを連続して（ＡＣＨ）、または２００μｍの平均直径を有するＱ セファロースビッグビーズ、ＳＰ ＳｅｐｈａｒｏｓｅビッグビーズおよびＰｈｅｎｙｌ セファロースビッグビーズの混合物を充填して、２．４ｍｌカラム（ＭＡＣＨ）を構成した。カラムの品質はアセトンパルス法を使用して確認して、これらが良好な非対称性およびＨＥＴＰを確実に有するようにし、次いで５０ｍＭＴｒｉｚｍａ緩衝液ｐＨ８中で平衡化した（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００８１１３０１１ Ａ２において記述されている通り参照されたい）。
【０１４１】
Ａ型インフルエンザウイルスを含有する供給原料は、実施例６に記述されているものと同様の方法で作製し、さらなる使用まで−８０℃で保存した。実験を行う前に、供給原料を４℃で一晩解凍し、次いで、１０Ｋｉｌｏ−Ｄａｌｔｏｎ Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ遠心フィルターデバイス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、ｐＨ８．０の５０ｍＭＴｒｉｚｍａ緩衝液に緩衝液を交換した。およそ６０ｍｌの緩衝液交換した供給原料を、各カラムを０．１６ｍｌ／分の流速で通過させた。カラムを通ったフローを１ｍｌ画分ずつ回収し、ＨＡアッセイ、ＢＣＡアッセイおよびＰｉｃｏ−ｇｒｅｅｎアッセイをそれぞれ使用してインフルエンザ、宿主細胞タンパク質、および宿主細胞ＤＮＡ含有量について２連でアッセイした。
【０１４２】
０．８ｍｌのＱＳ４ＦＦ（９０μｍ）ビーズ；０．８ｍｌのＱＳＢＢ（２００μｍ）ビーズ；連続して０．８ｍｌのＱＳＢＢビーズおよび０．８ｍｌのＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビッグビーズ（２００μｍ）（ＡＣ）；連続して０．８ｍｌのＱＳＢＢビーズおよび０．８ｍｌのＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビッグビーズ（２００μｍ）（ＡＨ）；連続して０．８ｍｌのＱＳＢＢビーズ、０．８ｍｌのＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビッグビーズおよび０．８ｍｌのＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビッグビーズ（ＡＣＨ）；またはＱＳＢＢビーズ、ＳＰ ＳｅｐｈａｒｏｓｅビッグビーズおよびＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビッグビーズの２．４ｍｌの混合物（ＭＡＣＨ）のうちの１つを含有しているカラムを通過した、ＨＣＰおよび宿主細胞ＤＮＡの溶液混合物におけるＡ型インフルエンザウイルスのブレークスルーを測定した例示的な実験の結果を、図５に示している。
【０１４３】
０．８ｍｌのＱＳ４ＦＦ（９０μｍ）ビーズ；０．８ｍｌのＱＳＢＢ（２００μｍ）ビーズ；連続して０．８ｍｌのＱＳＢＢビーズおよび０．８ｍｌのＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビッグビーズ（２００μｍ）（ＡＣ）；連続して０．８ｍｌのＱＳＢＢビーズおよび０．８ｍｌのＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビッグビーズ（２００μｍ）（ＡＨ）；連続して０．８ｍｌのＱＳＢＢビーズ、０．８ｍｌのＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビッグビーズおよび０．８ｍｌのＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビッグビーズ（ＡＣＨ）；またはＱＳＢＢビーズ、ＳＰ ＳｅｐｈａｒｏｓｅビッグビーズおよびＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビッグビーズの２．４ｍｌの混合物（ＭＡＣＨ）のうちの１つを含有しているカラムを通過した、Ａ型インフルエンザウイルスおよび宿主細胞ＤＮＡの溶液混合物におけるＨＣＰのブレークスルーを測定した例示的な実験の結果を、図６に示している。
【０１４４】
表Ｘは、４２ｍｌの供給原料が本明細書において論じられた様々なカラムを通過した後の、溶液混合物中のＡ型インフルエンザウイルス、ＨＣＰおよび宿主細胞ＤＮＡのブレークスルー力価を測定した、図５および６に示した実験の結果をまとめている。
【０１４５】
【表１０】
【０１４６】
上記の実験は、カラムにおいて単一のまたは複数の種類のビーズを使用した、Ａ型インフルエンザウイルスの精製を記述している。図５および６ならびに表Ｘから、複数の種類のビーズの使用はウイルス回収率をわずかに減少させたことが分かる。しかしながら、より大きい体積であっても、これらの小さい単位体積当たりの外部表面積およびウイルスとの相互作用の制限のために、２００μｍビーズを有するカラムは常に９０μｍビーズと比較して高いウイルス回収率を有した。複数の種類のビーズの使用は、全ＨＣＰ除去および生成物の純度を大幅に向上させた。このことは、陽イオンおよび疎水性ビーズのためにカラムに付加された外部表面積はウイルス回収を阻害しなかったが、これらのビーズの内部表面積が宿主細胞タンパク質のクリアランスを可能にし、これによって生成物の純度を増加させたことを示唆している。複数の種類のビーズを用いた試験はまた、陰イオン、陽イオンおよび／または疎水性樹脂の相互作用を組み合わせる２００μｍ混合モードビーズを使用して、同様の精製が達成される潜在的な可能性があることを示唆している。
【０１４７】
明細書は、参照により本明細書に組み込まれる明細書中で引用された参考文献の教示を踏まえて、最も完全に理解される。明細書中の実施形態は、本発明における実施形態の例示を提供し、その範囲を限定するとは解釈されるべきではない。当業者は、多くの別の実施形態が本発明に包含されることを容易に認識する。すべての出版物および発明は、その全体が参照により組み込まれる。参照により組み込まれる資料が本明細書と矛盾するまたは一致しない程度まで、本明細書はすべてのこのような資料に優先するものとする。本明細書中の任意の参考文献の引用は、このような参考文献が本発明の先行技術であると承認するものではない。
【０１４８】
別途指示のない限り、特許請求の範囲を含む明細書中で使用されている成分、細胞培養、処理条件などの量を表すすべての数は、「約」という用語によってすべての場合において修飾されていると理解されるべきである。したがって、別途反対の指示のない限り、数値パラメーターは近似値であり、本発明によって取得しようとする所望の特性に依存して変動し得る。別途指示のない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」という用語は、その一連におけるあらゆる要素を指すと理解されるべきである。当業者は、日常的作業にすぎない実験を使用して、本明細書に記載の本発明の具体的な実施形態の多くの等価物を認識する、または確認することができるはずである。このような等価物は、以下の特許請求の範囲に包含されるよう意図される。
【０１４９】
当業者には明らかであるように、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明の多くの変更形態および変形形態が可能である。本明細書に記載の具体的な実施形態は、例としてのみ提供され、決して限定するものではない。明細書および実施例は単なる例示としてみなされ、本発明の真の範囲および精神は以下の特許請求の範囲によって示されていることを意図している。
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その内容全体が参照によりそのまま本明細書に組み込まれる、出願日が２００９年１２月１６日の米国仮特許出願第６１／２８４３６８号の優先権の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、試料中の１つまたは複数の夾雑物から、例えば、カプセル化ウイルス、ウイルス様粒子およびコンジュゲートワクチンなどの大型生体分子を分離するための、新規な改良されたフロースルー精製プロセスに少なくとも部分的に関する。
【背景技術】
【０００３】
例えば、カプセル化ウイルス、感染宿主細胞もしくは卵中のウイルス様粒子またはコンジュゲートワクチンなどの大型生体分子の生成の後に、実質的に純粋な生体分子集団を取得するために、感染宿主細胞または卵の、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび宿主細胞タンパク質などの他の成分から生体分子を分離することが望ましい。さらに、添加剤はしばしば、生体分子と共精製される場合があるため、生成される生体分子は、生体分子の生成を容易にするために典型的に使用されるいくつかの添加剤から分離される必要がある。
【０００４】
従来、超遠心分離、クロマトグラフィーおよび膜濾過などの様々な技術が、カプセル化ウイルスおよびウイルス様粒子などの大型生体分子を精製および濃縮するために使用されてきた（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００８／０７３４９０およびＷＯ２００４／１１２７０７を参照されたい）。このような生体分子を精製するために使用されてきた様々なタイプのクロマトグラフィー技術は、例えば、サイズ排除（ＳＥＣ）、陰イオン交換（ＡＥＸ）および親和性クロマトグラフィーを含む（例えば、ＷＯ２００４／１１２７０７；Ｔｒａｎｓｆｉｇｕｒａｃｕｉｎら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １４２：２１−２８頁（２００７年）およびＫａＩｂｆｕｓｓらＢｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．９６：９３２−９４４頁（２００７年）を参照されたい）。
【０００５】
前述の技術は、カプセル化ウイルスおよびウイルス様粒子などの巨大分子の精製にある程度使用されているが、すべてのこれらのクロマトグラフィー技術は一般的に、結合および溶出方式において使用される。特に、このような生体分子の大きなサイズ（例えば、約１５−４００ｎＭ）のため、これらの分子は大抵の市販の媒体の細孔に浸透することができず、したがって、典型的には媒体の外側に結合してその後溶出される。一方、夾雑物および不純物は通常、粒子の内部表面積に結合するが、しかしながら、大型生体分子と一緒に部分的に溶出されることもある。さらに、時にはこれらの技術の１つまたは複数が非連続的に使用されるが、一般に全体収率は不十分である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＰＣＴ公開番号国際公開第２００８／０７３４９０号
【特許文献２】ＰＣＴ公開番号国際公開第２００４／１１２７０７号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｔｒａｎｓｆｉｇｕｒａｃｕｉｎら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １４２：２１−２８頁（２００７年）
【非特許文献２】ＫａＩｂｆｕｓｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．９６：９３２−９４４頁（２００７年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、試料中の１つまたは複数の夾雑物からの、例えば、カプセル化ウイルス、ウイルス様粒子およびコンジュゲートワクチンなどの大型生体分子の分離のための、改良されたフロースループロセスを少なくとも部分的に提供する。本発明は、カプセル化ウイルス、ウイルス様粒子、コンジュゲートワクチンおよび細菌の細胞表面多糖などの大型生体分子をフロースルーモードにおいて精製するための、例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）および疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を含む１つまたは複数のクロマトグラフィー技術を採用する。
【０００９】
本発明による方法は、当技術分野において現在使用されている従来の方法よりもはるかに優れた、一般には結合および溶出方式であり、非連続的である、単一の連続的フロースループロセスを使用して、ウイルス、ウイルス様粒子またはコンジュゲートワクチンなどの大型生体分子の回収率の向上を典型的にもたらす。本発明による方法は、単位体積当たりの外部表面積が最小化されており、（クロマトグラフィープロセスで典型的に使用されるが、単位体積当たりの外部表面積が最小化されていない）同様のクロマトグラフィー粒子と比較して、単位体積当たりの内部表面積が２５％を超えて減少していない、少なくとも１種類のクロマトグラフィー粒子（例えば、固体多孔性ビーズ）の使用に少なくとも部分的に基づく。一般に、本発明は、逆相モードの操作に少なくとも部分的に依存し、すなわち、フロースルーモードにおける１つまたは複数のＡＥＸ、ＣＥＸおよびＨＩＣクロマトグラフィー媒体の使用によるものであり、少なくとも１つのこのような媒体は回収率の向上をもたらす特徴、例えば、単位体積当たりの最小化された外部表面積および（２５％を超えて減少していない）単位体積当たりの内部表面積を含む。
【００１０】
本発明による方法は、単一段階プロセスにおける大型生体分子の回収を可能にし、加えて、多くの精製前および精製後段階を必要とする従来のクロマトグラフィー法と比較して供給原料流および生成物流の上流処理および下流処理を最小限にする。さらに、本発明の方法は、大型生体分子を含有する試料中の宿主細胞タンパク質の存在下および不在化の両方において大型生体分子の回収率の向上をもたらす。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の一態様において、大型生体分子および１つまたは複数の夾雑物を含む試料からの大型生体分子の回収率を向上させるためのフロースループロセスが提供される。このようなプロセスは、試料を、回収される大型生体分子より小さい分子量カットオフを有する固体多孔性粒子の１つまたは複数の集団と接触させるステップを含み、フロースループロセスにおいて使用される固体多孔性粒子の少なくとも１つの集団の単位体積当たりの外部表面積は最小化されており、単位体積当たりの最小化された外部表面積を含まない固体多孔性粒子の集団と比較して単位体積当たりの内部表面積は２５％を超えて減少しておらず、それによって大型生体分子の回収率を向上させる。
【００１２】
いくつかの実施形態において、固体多孔性粒子の１つまたは複数の集団は、クロマトグラフィーカラム中に充填されている。
【００１３】
本発明によるフロースループロセスは、単位体積当たりの最小化された外部表面積および（２５％を超えて減少していない）単位体積当たりの内部表面積を含む固体多孔性粒子の少なくとも１つの集団が使用されないフロースループロセスを使用した大型生体分子の回収率と比較して、大型生体分子の回収率の、例えば、少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％の向上をもたらす。
【００１４】
いくつかの実施形態において、本発明によるフロースループロセスは、大型生体分子の純度の少なくとも２０％の向上をもたらす。
【００１５】
いくつかの実施形態において、本発明によるフロースループロセスは、１つまたは複数の夾雑物の少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％以上の減少をもたらす。
【００１６】
いくつかの実施形態において、固体多孔性粒子の１つまたは複数の集団は、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーに使用されるビーズの１つまたは複数から選択される。
【００１７】
本発明のプロセスを使用して回収することができる大型生体分子は、カプセル化ウイルス、ウイルス様粒子およびコンジュゲートワクチンからなる群から選択される。
【００１８】
いくつかの実施形態において、１つまたは複数の夾雑物は、核酸、タンパク質、賦形剤および細胞培養添加剤からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、１つまたは複数の夾雑物は宿主細胞タンパク質である。
【００１９】
いくつかの実施形態において、本発明によるフロースループロセスは、１つまたは複数の夾雑物からウイルス様粒子を分離するために使用される。例示的なウイルス様粒子は、ＢＳＡで被覆したスチレン粒子を含むがこれらに限定されない。
【００２０】
いくつかの実施形態において、本発明によるフロースループロセスは、１つまたは複数の夾雑物からカプセル化ウイルスを分離するために使用される。例示的なカプセル化ウイルスは、インフルエンザウイルス（例えば、Ｈ１Ｎ１株）、アデノウイルスおよびバクテリオファージを含むがこれらに限定されない。
【００２１】
いくつかの実施形態において、大型生体分子は、細胞培養においてまたは卵中で産生される。いくつかの実施形態において、細胞培養はＭＤＣＫ細胞を含む。いくつかの実施形態において、大型生体分子および１つまたは複数の夾雑物を含む試料は細胞培養上清であり、これは本発明によるフロースループロセスに供される。
【００２２】
本発明によるフロースループロセスの様々な実施形態において、プロセス中に含まれる固体多孔性粒子の少なくとも１つの集団は、２００μｍから６００μｍまでの範囲の平均直径を含む。
【００２３】
様々な実施形態において、本発明のフロースループロセスは、試料からの大型生体分子の少なくとも５０％、または少なくとも５５％、または少なくとも６０％、または少なくとも６５％、または少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％の回収を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】Ｓ４ＦＦ（対照）ビーズ；ＱＳ４ＦＦ（９０μｍ）ビーズ；またはＱＳＢＢ（２００μｍ）ビーズのうちの１つを含有する０．５ｍｌカラムを通過した、Ｐｈｉ６およびＢＳＡの溶液混合物におけるバクテリオファージＰｈｉ６のフロースルー力価を測定するための例示的な実験の結果を表すグラフである。Ｘ軸は、各カラムを通って処理された供給原料のカラム体積を表し、Ｙ軸は、各カラムからのフロースルー中のＰｈｉ６力価を表す。
【図２】ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰ（３０μｍ）ビーズ；ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅ４ＦＦ（９０μｍ）ビーズ；またはＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＢＢ（２００μｍ）ビーズのうちの１つを含有する１ｍｌカラムを通過した、Ｂ型インフルエンザウイルス、宿主細胞ＤＮＡ、宿主細胞タンパク質、ウシ胎仔血清および他の細胞培養添加剤を含有する溶液混合物における、Ｂ型インフルエンザウイルスのフロースルー力価を測定するための例示的な実験の結果を表すグラフである。Ｘ軸は、各カラムを通って処理された供給原料のカラム体積を表し、Ｙ軸は、各カラムからのフロースルー中のＢ型インフルエンザウイルスの力価を表す。
【図３】Ｓ４ＦＦ（対照）ビーズ、ＱＳ４ＦＦ（９０μｍ）ビーズ；またはＱＳＢＢ（２００μｍ）ビーズのうちの１つを含有する０．８ｍｌカラムを通過した、宿主細胞タンパク質およびＤＮＡの混合物におけるＡ型インフルエンザウイルスのブレークスルーを測定した例示的な実験の結果を表すグラフである。Ｘ軸は、各カラムを通って処理された供給原料の体積を表し、Ｙ軸は、各カラムからのフロースルー中のＡ型インフルエンザウイルスの力価を表す。
【図４】Ｓ４ＦＦ（対照）ビーズ；ＱＳ４ＦＦ（９０μｍ）ビーズ；またはＱＳＢＢ（２００μｍ）ビーズのうちの１つを含有する０．８ｍｌカラムを通過した、Ａ型インフルエンザウイルスおよびＤＮＡの溶液混合物における宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）のブレークスルーを測定した例示的な実験の結果を表すグラフである。Ｘ軸は、各カラムを通って処理された供給原料の体積を表し、Ｙ軸は、各カラムからのフロースルー中のＨＣＰの力価を表す。
【図５】０．８ｍｌのＱＳ４ＦＦ（９０μｍ）ビーズ；０．８ｍｌのＱＳＢＢ（２００μｍ）ビーズ；連続して０．８ｍｌのＱＳＢＢおよび０．８ｍｌのＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビッグビーズ（２００μｍ）（ＡＣ）；連続して０．８ｍｌのＱＳＢＢおよび０．８ｍｌのＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビッグビーズ（２００μｍ）（ＡＨ）；連続して０．８ｍｌのＱＳＢＢ、０．８ｍｌのＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビッグビーズおよび０．８ｍｌのＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビッグビーズ（ＡＣＨ）；またはＱＳＢＢ、ＳＰ ＳｅｐｈａｒｏｓｅビッグビーズおよびＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビッグビーズの２．４ｍｌの混合物（ＭＡＣＨ）のうちの１つを含有するカラムを通過した、ＨＣＰおよび宿主細胞ＤＮＡの溶液混合物におけるＡ型インフルエンザウイルスのブレークスルーを測定した例示的な実験の結果を表すグラフである。Ｘ軸は、各カラムを通って処理された供給原料の体積を表し、Ｙ軸は、各カラムからのフロースルー中のＢ型インフルエンザウイルスの力価を表す。
【図６】０．８ｍｌのＱＳ４ＦＦ（９０μｍ）ビーズ；０．８ｍｌのＱＳＢＢ（２００μｍ）ビーズ；連続して０．８ｍｌのＱＳＢＢおよび０．８ｍｌのＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビッグビーズ（２００μｍ）（ＡＣ）；連続して０．８ｍｌのＱＳＢＢおよび０．８ｍｌのＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビッグビーズ（２００μｍ）（ＡＨ）；連続して０．８ｍｌのＱＳＢＢ、０．８ｍｌのＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビッグビーズおよび０．８ｍｌのＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビッグビーズ（ＡＣＨ）；またはＱＳＢＢ、ＳＰ ＳｅｐｈａｒｏｓｅビッグビーズおよびＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビッグビーズの２．４ｍｌの混合物（ＭＡＣＨ）のうちの１つを含有するカラムを通過した、Ａ型インフルエンザウイルスおよび宿主細胞ＤＮＡの溶液混合物におけるＨＣＰのブレークスルーを測定した例示的な実験の結果を表すグラフである。Ｘ軸は、各カラムを通って処理された供給原料の体積を表し、Ｙ軸は、各カラムからのフロースルー中のＨＣＰの力価を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明は、単位体積当たりの最小化された外部表面積および（単位体積当たりの最小化された外部表面積および単位体積当たりの減少していない内部表面積を含まない同様の種類のクロマトグラフィービーズと比較して２５％を超えて減少していない）単位体積当たりの内部表面積を含む少なくとも１種類のクロマトグラフィービーズを使用した、試料中の１つまたは複数の夾雑物から大型生体分子（例えば、カプセル化ウイルス、ウイルス様粒子またはコンジュゲートワクチン）を分離するための改良されたフロースループロセスを提供する。
【００２６】
Ｉ．定義
本開示がより容易に理解され得るように、特定の用語がまず定義される。さらなる定義は、詳細な説明の全体にわたって説明される。
【００２７】
本明細書において相互に交換して使用することができる「フロースループロセス」、「フロースルーモード」、および「フロースルークロマトグラフィー」という用語は、１つまたは複数の夾雑物とともに試料中に含有されている少なくとも１つの生成物（例えば、本明細書に記載のものなどの大型生体分子）はクロマトグラフィー樹脂または媒体を流過することを意図され、一方、少なくとも１つの潜在的な夾雑物または不純物はクロマトグラフィー樹脂または媒体に結合する、生成物分離技術を指す。「フロースルーモード」は一般に、アイソクラティック操作（すなわち、移動相の組成が変化しないクロマトグラフィープロセス）である。このようなフロースルークロマトグラフィープロセスは、単一カラム、連続したマルチカラムまたは並列、直列カラム、擬似移動床式（ＳＭＢ）およびこれらの組み合わせを使用して操作することができる。
【００２８】
本明細書において相互に交換して使用することができる「結合および溶出方式」および「結合および溶出プロセス」という用語は、試料中に含有されている少なくとも１つの生成物（例えば、本明細書に記載のものなどの大型生体分子）がクロマトグラフィー樹脂または媒体に結合し、その後溶出される、生成物分離技術を指す。
【００２９】
本明細書において相互に交換して使用することができる「夾雑物」、「不純物」、および「残屑」という用語は、本発明のフロースループロセスを使用して外来または有害分子の１つまたは複数から分離されている対象の大型生体分子を含有する試料中に存在し得る、ＤＮＡ、ＲＮＡ、１つまたは複数の宿主細胞タンパク質、エンドトキシン、脂質および１つまたは複数の添加剤などの生物学的マクロ分子を含む任意の外来または有害分子を指す。さらに、このような夾雑物は、分離プロセスの前にあり得る段階において使用される任意の試薬を含んでいてもよい。一般に、大型生体分子を含有する試料中に存在する夾雑物は、大型生体分子よりも大きさが小さい。例えば、大部分の宿主細胞タンパク質は、約３ＫＤから１５０ＫＤまでの範囲に及び、これは、本明細書に記載の方法を使用して分離される大部分の大型生体分子の大きさよりも小さい。
【００３０】
本明細書において使用される「大型生体分子」という用語は、本明細書に記載のフロースループロセスを使用して、生物学的材料を含有する試料中に存在する１つまたは複数の夾雑物から分離される、少なくとも１５ｎｍ、または少なくとも２０ｎｍ、または少なくとも２５ｎｍ、または少なくとも３０ｎｍ、または少なくとも３５ｎｍ、または少なくとも４０ｎｍ、または少なくとも４５ｎｍ、または少なくとも５０ｎｍ、または少なくとも５５ｎｍ、または少なくとも６０ｎｍ、または少なくとも６５ｎｍ、または少なくとも７０ｎｍ、または少なくとも７５ｎｍ、または少なくとも８０ｎｍ、または少なくとも９０ｎｍ、または少なくとも１００ｎｍ、または少なくとも１１０ｎｍ、または少なくとも１２０ｎｍ、または少なくとも１３０ｎｍ、または少なくとも１４０ｎｍ、または少なくとも１５０ｎｍ、または少なくとも１６０ｎｍ、または少なくとも１７０ｎｍ、または少なくとも１８０ｎｍ、または少なくとも１９０ｎｍ、または少なくとも２００ｎｍ、または少なくとも２１０ｎｍ、または少なくとも２２０ｎｍ、または少なくとも２３０ｎｍ、または少なくとも２４０ｎｍ、または少なくとも２５０ｎｍ、または少なくとも２６０ｎｍ、または少なくとも２７０ｎｍ、または少なくとも２８０ｎｍ、または少なくとも２９０ｎｍ、または少なくとも３００ｎｍ、または少なくとも３１０ｎｍ、または少なくとも３２０ｎｍ、または少なくとも３３０ｎｍ、または少なくとも３４０ｎｍ、または少なくとも３５０ ｎｍ、または少なくとも３６０ｎｍ、または少なくとも３７０ｎｍ、または少なくとも３８０ｎｍ、または少なくとも３９０ｎｍ、または少なくとも４００ｎｍの平均直径を有する、対象とする生物学的材料を指す。例示的な大型生体分子は、例えば、カプセル化ウイルス、ウイルス様粒子およびコンジュゲートワクチンを含む。いくつかの実施形態において、本発明の方法を使用して分離されている大型生体分子は、クロマトグラフィービーズの細孔から排除される、またはビーズの外部表面にのみ結合する。
【００３１】
「カプセル化ウイルス」という用語は、本明細書において使用される場合、キャプシドの内側の核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を含む任意のウイルスを指すことになっており、一般にクロマトグラフィービーズの外部表面に結合するのみである。いくつかの実施形態において、キャプシドは、キャプシド周囲に脂質エンベロープを有する。いくつかの実施形態において、カプセル化ウイルスは、複雑な膜構造の内側に囲まれたＲＮＡまたはＤＮＡ分子（例えば、ポックスウイルス（Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ）科の天然痘ウイルス（ｓｍａｌｌｐｏｘ ｖｉｒｕｓ））を含む。一般に、大部分のカプセル化ウイルスは、１５−４００ｎｍの範囲の大きさを有する。
【００３２】
「ウイルス様粒子」という用語は、本明細書において使用される場合、その大きさおよび／またはその免疫原性に関してウイルスに似ているが、ウイルスのように複製する能力を欠く粒子または物質（例えば、ヒト乳頭腫ウイルス（ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）（ＨＰＶ）ワクチン）を指すことになっている。
【００３３】
「コンジュゲートワクチン」という用語は、本明細書において使用される場合、細菌の細胞表面多糖をタンパク質または毒素と反応させることによって産生されるワクチンを指すことになっている。例示的なコンジュゲートワクチンは、肺炎球菌ワクチンおよびストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｓｅ）ワクチンを含むがこれらに限定されない。
【００３４】
「クロマトグラフィー」という用語は、本明細書において使用される場合、対象とする大型生体分子とともに試料中に存在する１つまたは複数の夾雑物から対象とする大型生体分子（例えば、カプセル化ウイルス、ウイルス様粒子またはコンジュゲートワクチン）を分離する任意の種類の技術を指す。
【００３５】
「陰イオン交換クロマトグラフィー」または「ＡＥＣ」という用語は、本明細書において使用される場合、正に荷電したビーズを使用して、試料中の１つまたは複数の夾雑物から対象とする生体分子（例えば、カプセル化ウイルス、ウイルス様粒子またはコンジュゲートワクチンなどの大型生体分子）を分離するクロマトグラフィープロセスを指す。例示的な市販のＡＥＣ媒体は、すべてＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製のＱ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ、Ｃａｐｔｏ Ｑ、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ、ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ製のＦｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＴＭＡＥ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＤＥＡＥならびにＴＯＳＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製のＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＤＥＡＥ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＱＡＥおよびＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＳｕｐｅｒＱを含む。
【００３６】
従来、ＡＥＣは、ビーズ、膜およびモノリスを使用したウイルス精製のために使用されてきた。ＡＥＣは一般に、例えば、インフルエンザおよびアデノウイルスなどのカプセル化ウイルスが、５．５より高いｐＨで負に荷電しているという原理に基づいている。したがって、これらは、５．５より高いｐＨでイオン相互作用を介して正に荷電した樹脂を使用して結合および溶出することができる。一般に、大部分のカプセル化ウイルスの大きさのために、これらは大部分の市販のＡＥＣ媒体に浸透することができず、媒体の外部表面に結合することができるのみであり、これによってクロマトグラフィーカラムのウイルス容量を制限している。したがって、カラム容量問題を回避するための一般的なアプローチは、ＡＥＣ媒体の大きさを減少させることであった（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００４１１２７０７を参照されたい）。
【００３７】
「陽イオン交換クロマトグラフィー」または「ＣＥＣ」という用語は、本明細書において使用される場合、負に荷電したビーズを使用して、試料中の１つまたは複数の夾雑物から対象とする生体分子（例えば、カプセル化ウイルス、ウイルス様粒子またはコンジュゲートワクチンなどの大型生体分子）を分離するクロマトグラフィープロセスを指す。例示的な市販のＣＥＣ媒体は、すべてＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製のＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ、ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ製のＦｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ Ｓ０３−、ならびにＴＯＳＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製のＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＳＰおよびＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＣＭを含む。
【００３８】
「疎水性相互作用クロマトグラフィー」または「ＨＩＣ」という用語は、本明細書において使用される場合、対象とする生体分子を分離するための疎水性基として芳香族または脂肪族炭化水素を固定されたビーズを使用するクロマトグラフィープロセスを指す。一実施形態において、ＨＩＣは、試料中の１つまたは複数の夾雑物から、例えば、コンジュゲートワクチンなどの大型生体分子を分離するために使用される。例示的な市販のＨＩＣ媒体は、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製のＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ製のＦｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ Ｐｒｏｐｙｌ ６５０、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ Ｐｈｅｎｙｌ ６５０、ならびにＴＯＳＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製のＴｏｙｏｐｅｒａｌ Ｐｈｅｎｙｌ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｂｕｔｙｌ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨｅｘｙｌおよびＴｏｙｏｐｅａｒｌ Ｅｔｈｅｒを含む。
【００３９】
「サイズ排除クロマトグラフィー」または「ＳＥＣ」という用語は、本明細書において使用される場合、異なる大きさの溶質を含有する溶液が適切な細孔径を有する多孔性媒体を通過するとき、小さい大きさの溶質は媒体から拡散するのに長い時間がかかり、そのため長い保持時間を有するが、一方、大きい大きさの溶質はすぐに拡散し、それによって小さい大きさの溶質からこれらの分離を可能にするという原則に基づくクロマトグラフィープロセスを指す。例示的な市販のＳＥＣ媒体は、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＳｅｐｈａｃｒｙｌおよびＦｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＢｉｏＳＥＣを含む。
【００４０】
大部分のウイルスはその大きさのために、大部分の市販のＳＥＣ媒体を浸透することができず、典型的には、ＳＥＣクロマトグラフィーカラムの空隙容量中に溶出される。しかしながら、ＳＥＣは一般にいくつかの不都合を有し、例えば、ＳＥＣクロマトグラフィーは典型的に長いカラム長を必要とし、最大充填容量は２０％を超えることができず、処理時間は非常に長く、しばしば対象とする生成物の希釈をもたらす。
【００４１】
本明細書において相互に交換して使用することができる「混合モードクロマトグラフィー」、または「バイモードクロマトグラフィー」もしくは「マルチモードクロマトグラフィー」という用語は、単一ビーズ上に複数の官能基および／または様々な官能基の組み合わせを有するビーズを使用するクロマトグラフィープロセスを指す。このようなビーズは、混合モード樹脂もしくはビーズ、バイモード樹脂もしくはビーズまたはマルチモード樹脂もしくはビーズと称されることもある。例えば、単一ビーズは、同じビーズ上に、正および負の両方に荷電した基または正に荷電しており疎水性でもある基または負に荷電しており疎水性でもある基または正の、負のおよび疎水性の基のそれぞれを有していてもよい。このようなビーズを使用して、試料中の１つまたは複数の不純物から対象とする生体分子を分離することができる。例示的な市販の混合モード媒体は、例えば、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製のＣａｐｔｏ ａｄｈｅｒｅ、Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製のＨＰＡおよびＰＰＡ ＨｙｐｅｒＣｅｌ（商標）を含む。
【００４２】
クロマトグラフィー媒体の「動的結合容量」という用語は、本明細書において使用される場合、結合していない生体分子の顕著なブレークスルーが起こるまでにフロースループロセスにおいて媒体が結合する標的生体分子の量を指す。クロマトグラフィー媒体の動的容量は、流速が増加したときに起こり得る物質移動律速の影響を反映し、これは媒体の飽和または静的結合容量の決定と比較して実際のプロセス性能を予測するのに有用である。一般に、媒体の動的結合容量は静的結合容量よりも低い。
【００４３】
本明細書において相互に交換して使用することができるクロマトグラフィー媒体の「静的結合容量」および「飽和結合容量」という用語は、ビーズ上のすべての利用可能な結合部位が利用されている場合に静的平衡条件下で媒体（例えば、カラム中に充填されたビーズ）が結合することができる標的生体分子の量を指す。静的結合容量は、例えば、カラム中のビーズの閉鎖系において非常に遅い流速でまたは長時間のインキュベーション後のいずれかで大過剰の標的生体分子を充填することによって決定することができる。実際には、静的結合容量が充填カラムを使用したプロセス条件下で有効になることはない。
【００４４】
「単位体積当たりの外部表面積」という用語は、本明細書において使用される場合、対象とする生体分子を結合するために利用可能なクロマトグラフィー粒子集団（例えば、ビーズ）の外部表面上の総面積を指す。例えば、いくつかの実施形態において、単位体積当たりの外部表面積は、大型生体分子を結合するために利用可能な、カラム中に充填されている固体多孔性粒子集団の外部表面上の総面積と定義されている。
【００４５】
ビーズの単位体積当たりの外部表面積の推定値は、数学的にまたは経験的に計算することができる。例えば、数学的には、単位体積当たりの外部表面積は、次の方程式
【００４６】
【数１】
（式中、Ａｅｓ／ｖ＝単位体積当たりの外部表面積；ｄ＝使用したビーズの直径；およびη＝カラム充填密度）を使用して推定することができる。ビーズの六方最密充填（ＨＣＰ）を仮定すれば、完全に充填されたカラムではこれは０．７４に等しい。
【００４７】
またη＝１−空隙容量。カラムの空隙容量は、ビーズと相互作用せず、ビーズの細孔から排除される分子を使用して実験的に決定することができる（例えば、Ｇｅｌ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓを参照されたい）。
【００４８】
経験的には、単位体積当たりの外部表面積は次の通り推定される。典型的に、経験的計算は、大型生体分子と同じ大きさおよび電荷の球状ナノ粒子を使用して行われる。入手したナノ粒子の濃度は通常、製造業者によって明記されている、または、動的光散乱またはＵＶ−Ｖｉｓ分光法などのウイルス粒子の測定のために使用される標準的技術を使用して（例えば、Ｗｏｌｆｇａｎｇ Ｈａｉｓｓら、Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｚｅ ａｎｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｏｌｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｒｏｍ ＵＶ−Ｖｉｓ Ｓｐｅｃｔｒａ、２００７年、７９、４２１５−４２２１頁を参照されたい）入手可能である。一定の体積のビーズへのナノ粒子の結合は、例えば、本明細書に記載の静的結合容量実験を使用して検討される。ビーズに結合したナノ粒子の量は、次の式
【００４９】
【数２】
（式中、ＮＳ＝飽和時のビーズに結合したナノ粒子の量；Ｃｉｎ＝単位体積当たりの粒子として測定した溶液中のナノ粒子の初期濃度；Ｃｆ＝単位体積当たりの粒子として測定した溶液中のナノ粒子の最終濃度；およびｖ＝使用した溶液の体積）を使用して推定することができる。
【００５０】
ナノ粒子を含有するカラムの単位体積当たりの外部表面積は、次の通り決定することができる
【００５１】
【数３】
（式中、ｄｎ＝ナノ粒子の直径；およびＶ＝カラム体積）。
【００５２】
クロマトグラフィー粒子（例えば、ビーズ）の集団の「単位体積当たりの内部表面積」という用語は、本明細書において使用される場合、粒子の単位体積当たりの外部表面積を引いた粒子の単位体積当たりの総表面積と定義することができ、次の通り：
【００５３】
【数４】
（式中、Ａｉｎ／Ｖ＝ビーズの単位体積当たりの内部表面積；Ａｔ＝ビーズの単位体積当たりの総表面積；およびＡｔ＝Ａ×ＢＤ、ここでＡ＝ビーズの単位質量当たりの表面積、これは、Ｂｒｕｎａｕｅｒ、Ｅｍｍｅｔｔ、およびＴｅｌｌｅｒ（ＢＥＴ）によって開発された方法を使用して計算することができる（例えば、Ｓ．Ｂｒｕｎａｕｅｒら、Ｊ Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９３８年、６０、３０９頁を参照されたい）；および単位体積当たりの質量の単位を有するＢＤ＝かさ密度）推定することができる。一般に、Ａｅｓ／ｖは、Ａｔと比較してごくわずかである。したがって、Ａｔは、内部表面積の推定値そのままであるとみなすことができる。
【００５４】
供給原料流中の宿主細胞タンパク質および別の不純物の大きさおよび電荷の典型を表す小分子について、単位体積当たりの内部表面積の推定値はまた、ビーズの静的および動的結合容量から取得することもできる。このような典型的な分子の例は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、リゾチームまたはモノクローナル抗体（Ｍａｂ、またはＩｇＧ）を含んでもよいがこれらに限定されない。すべての実用的な目的のために、この方法は、不純物に結合させるために利用可能な表面積を推定する、より現実的なアプローチである。
【００５５】
フロースループロセスにおける対象とする生成物の回収率パーセントは、次の方程式
【００５６】
【数５】
（式中、Ｐ供給原料＝供給原料中の大型生体分子の量およびＰフロースルー＝生成物中の大型生体分子の量）を使用して計算することができる。
【００５７】
本発明による方法を使用した対象とする生成物の回収率パーセントは、次の方程式
【００５８】
【数６】
（式中、Ｒｂ＝粒子集団の単位体積当たりの外部表面積が最小化されたプロセスの回収率；およびＲＳ＝粒子集団の単位体積当たりの外部表面積が最小化されていないプロセスの回収率）を使用して計算することができ、ここで回収率パーセントは向上した回収率パーセントである。
【００５９】
フロースループロセスを使用して回収した生成物の純度は、回収したフロースループール中の大型生体分子に対する不純物の量の比と定義することができる。例えば、生成物を含有するインフルエンザウイルスの純度は、μｇ／ＨＡＵ（ＨＡＵ＝ヘマグルチニン単位）と表すことができ、不純物（例えば、宿主細胞タンパク質）の総量をフロースループール中のウイルスの総量で割ることによって得られる。本発明による方法を使用した、対象とする生成物の純度の向上パーセントは、次の方程式
【００６０】
【数７】
（式中、単位体積当たりの最小化された外部表面積を有する粒子（例えば、固体多孔性ビーズ）の集団を用いたプロセスが使用される場合、ｒｂ＝生成物中の大型生体分子の総量に対する生成物中の宿主細胞タンパク質の総量の比）を使用して計算することができる。例えば、インフルエンザ精製について、この比はμｇ／ＨＡＵ（式中、μｇは宿主細胞タンパク質の単位であり、ＨＡＵはインフルエンザウイルスの単位を表す）において表すことができる：および単位体積当たりの最小化された外部表面積を有する粒子（例えば、固体多孔性ビーズ）の集団が使用されないプロセスの場合、ｒｓ＝生成物中の大型生体分子の総量に対する生成物中の宿主細胞タンパク質の総量の比。
【００６１】
一般に、特許請求されている方法において使用される単位体積当たりの最小化された外部表面積を有する粒子は、（単位体積当たりの最小化された外部表面積を有さない粒子と比較して２５％を超えて減少していない）単位体積当たりの内部表面積を有する。
【００６２】
ＩＩ．フロースループロセスにおいて使用される例示的なクロマトグラフィー媒体
フロースルー精製のために使用することができる例示的なクロマトグラフィー媒体は、陰イオン交換クロマトグラフィー媒体（例えば、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビッグビーズ、Ｑ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ、Ｃａｐｔｏ Ｑ、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＴＭＡＥ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＤＥＡＥ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＤＥＡＥ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＱＡＥおよびＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＳｕｐｅｒＱ）、陽イオン交換クロマトグラフィー媒体（例えば、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビッグビーズ、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＳＯ３−、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＳＰおよびＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＣＭ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー媒体（例えば、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｔｏｙｏｐｅｒａｌ Ｐｈｅｎｙｌ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｂｕｔｙｌ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨｅｘｙｌおよびＴｏｙｏｐｅａｒｌ Ｅｔｈｅｒ）およびサイズ排除クロマトグラフィー媒体（例えば、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＳｅｐｈａｃｒｙｌおよびＦｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＢｉｏＳＥＣ）を含むがこれらに限定されない。単一の種類のクロマトグラフィー媒体または１つもしくは複数の種類のクロマトグラフィー媒体の任意の組み合わせを、本発明の方法において使用することができる。どのクロマトグラフィー媒体を本発明の方法において使用することができるかについて、分離される大型生体分子および除去される必要のある不純物に主として基づいて、当業者には容易にわかるはずである。
【００６３】
ＩＩＩ．１つまたは複数の夾雑物から生体分子を分離するフロースルー方法
フロースルークロマトグラフィー分離は、モノクローナル抗体調製物から、例えば、エンドトキシン、ウイルスおよびＤＮＡなどの微量の不純物を除去するための重要な最終仕上げ段階となっている。フロースルー分離は、緩衝液交換、勾配およびピーク分離などのクロマトグラフィー分離プロセス中の複雑な段階の必要性をなくすため、従来の結合および溶出クロマトグラフィー方式に対して利点を有する。
【００６４】
分離のフロースルークロマトグラフィー方法は一般に、対象とする生体分子および１つまたは複数の不純物を含有する供給原料溶液をビーズまたは膜などの媒体と接触させるステップおよび処理した供給原料を回収するステップを含む。いくつかのフロースループロセスにおいて、媒体は、カラムなどのフロースルーデバイスの内側に充填されている。いくつかのプロセスにおいて、このようなデバイスは、供給原料流中の不純物の大部分を捕捉することができ、対象とする生成物についてはわずかに結合するか全く結合せず、その結果、フロースルーデバイスの生成物下流をより純粋にする媒体（例えば、固体多孔性ビーズ）を含有する。
【００６５】
本発明によるいくつかの実施形態において、フロースルーデバイスは、当技術分野において知られているおよび／または本明細書に記載のものなどの１つまたは複数の種類のクロマトグラフィービーズを充填されたカラムからなり、少なくとも１種類のビーズは、ビーズの単位体積当たりの最小化された外部表面積および（最小化された外部表面積を有さないビーズと比較して２５％を超えて減少していない）ビーズの単位体積当たりの内部表面積を含む。
【００６６】
いくつかの実施形態において、例えば、カプセル化ウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、ウイルス様粒子（例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で被覆されたスチレン粒子）またはコンジュゲートワクチンなどの大型生体分子を含有する供給原料を、供給原料中の１つまたは複数の夾雑物から大型生体分子を分離するために、生体分子よりも小さい分子量カットオフをそれぞれ有している１つまたは複数の種類のクロマトグラフィービーズと接触させ、少なくとも１種類のビーズは、この１種類のビーズの単位体積当たりの最小化された外部表面積および（ビーズの単位体積当たりの最小化された外部表面積を有さない同じ種類のビーズの単位体積当たりの内部表面積と比較して２５％を超えて減少していない）この１種類のビーズの単位体積当たりの内部表面積を有する。
【００６７】
例えば、本明細書に記載の例示的な実験において、インフルエンザウイルスはＭＤＣＫ細胞株を使用して増殖させた。ウイルス含有供給原料は、大きな細胞残屑を除去するために、遠心分離を使用して、その後０．４５μｍ膜濾過を使用して予備浄化した。次いでクロマトグラフィービーズを含有するフロースルーデバイスによる精製の前に所望の緩衝液に緩衝液交換した。一般に、例えば、遠心分離、深層濾過、接線流濾過、透析濾過および緩衝液交換などの１つまたは複数の調製段階は、様々な供給源（例えば、細胞培養、卵など）から得られたウイルスを含有する様々な供給原料のために、本明細書に記載のフロースルークロマトグラフィー方式を使用した精製の前に使用することができる。
【００６８】
対象とする生体分子を含有する供給原料の予備浄化に続いて、予備浄化した供給原料をフロースルー分離にかける。フロースルー分離は、１つまたは複数の構成を使用して行ってもよい。例示的な構成において、容積式ポンプ（例えば、Ｍｉｇｈｔｙ−Ｍｉｎｉ、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃシステム Ｉｎｃ．）およびフロースルーカラムは連続して使用される。例えば、ポンプおよびチューブはまず、２０％エタノールを使用して消毒し、次いで水および緩衝液で流す。その後、対象とする大型生体分子を含有する供給原料を、ポンプを使用してカラムを通過させ、画分をカラム下流でエッペンドルフチューブ中に手作業で回収する。
【００６９】
別の例示的な構成において、Ａｋｔａ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）またはＢｉｏＣａｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏシステム）などのより自給式の装置を使用することができる。これらのシステムは、自動化されたポンプ輸送ならびに供給原料および緩衝液の制御、フロースルー流のＵＶおよび伝導度信号のインライン測定ならびに自動画分回収を可能にする。回収された画分は、オフライン測定にさらに使用される。
【００７０】
ＩＶ．フロースループロセスにおいて回収した生体分子の力価を測定する方法
通例、試料中の１つまたは複数の夾雑物からの大型生体分子の分離の後に、回収した大型生体分子の力価を測定する。
【００７１】
ウイルス、タンパク質、核酸、コンジュゲートワクチンなどを含む様々な生体分子の検出のための技術は、一般に、当技術分野においてよく知られており、文献中に記述されている。クロマトグラフィープロセスを使用して回収した生体分子の力価は、インラインまたはオフラインのいずれかで測定することができる。インライン検出技術は、クロマトグラフィーカラムの下流に連続して配置された検出器を含む。一方、分析のオフライン方法は、クロマトグラフィーカラムを流れている溶液の画分を回収すること、および標準的技術を使用してこれらをアッセイすることによって達成される。オフライン検出は一般に、インライン技術において異なる種による阻害がある場合、生体分子が利用可能なインライン技術を使用して検出できない場合、または対象とする生体分子の濃度がインライン技術の検出限界より低いもしくは実際の濃度を表すものではない場合に使用される。
【００７２】
ウイルス、タンパク質およびＤＮＡ用に一般に使用されるインライン測定技術は、２８０ｎｍおよび２６０ｎｍでのＵＶ分光法である（例えば、欧州特許出願番号ＥＰ１８０１６９７Ａ１を参照されたい）。また、最近、多角度レーザー光散乱（ＭＡＬＳ）が使用され、クロマトグラフィープロセスにおいてウイルスをインラインで検出することに成功した（例えば、Ｏｐｉｔｚら、Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｂｉｏｅｎｇｇ．、１０３：１１４４−１１５４頁（２００９年）を参照されたい）。
【００７３】
オフライン測定技術は、ＵＶ分光法および動的光散乱（例えば、Ｏｐｉｔｚら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１３１：３０９−３１７頁（２００７年）を参照されたい）などの上記の技術に加えて、測定される対象とする生体分子に特有のさらなる技術を含む。例えば、タンパク質に一般に使用されるオフライン測定技術の一部は、ビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡ）（例えば、米国公開番号２００５０１１８１４０を参照されたい）、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（例えば、Ｎａｙａｋら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．、８２３：７５−８１頁（２００５年）を参照されたい）および酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）（例えば、米国公開番号２００５０１１８１４０を参照されたい）を含む。
【００７４】
同様に、核酸（例えば、ＤＮＡ）は、ピコグリーンアッセイ（例えば、Ｏｐｉｔｚら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇｇ．、１０３：１１４４−１１５４頁（２００９年）を参照されたい）または定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）を使用して測定することができる。
【００７５】
大部分のウイルスは、組織培養感染容量アッセイ（ＴＣＩＤ５０プラークアッセイとも称される）を使用して検出および定量することができる（例えば、Ｄｕｌｂｅｃｃｏら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．、１８：２７３−２７９頁（１９５３年）を参照されたい）。しかしながら、特有のアッセイは一般に、特定のウイルスを特定および定量するために使用され、例えば、インフルエンザウイルスは、赤血球凝集反応（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）および一元放射免疫拡散（ＳＲＩＤ）アッセイ（例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４３６、Ａｖｉａｎ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓ、Ｓｐａｃｋｍａｎ，Ｅ．編Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２００７年）を参照されたい）などのアッセイを使用して定量される。
【００７６】
Ｖ．クロマトグラフィービーズおよびウイルスの大きさを測定する方法
いくつかの実施形態において、本発明のクロマトグラフィー方法は、１つまたは複数の種類の固体多孔性クロマトグラフィービーズを利用し、少なくとも１つのビーズの種類は、他のビーズの種類の平均直径よりも大きい平均直径を有する。このようなビーズを、本発明との関連において「ビッグビーズ」または「大型ビーズ」と称する。いくつかの実施形態において、ビッグビーズは少なくとも２００μｍの平均直径を有する。
【００７７】
本発明の方法を使用して分離される生体分子の種類に基づいて、当業者は、生体分子の分離のために必要とされ得る１つまたは複数の種類のクロマトグラフィービーズを容易に決定することができる（例えば、生体分子の組成、大きさ、電荷などに基づいて）。
【００７８】
一般に、本発明の方法において使用される大部分のクロマトグラフィービーズは、市販のものを入手することができる。したがって、クロマトグラフィービーズの大きさは通常、製造業者の仕様書中に記載されている、または、（１）大きさの分布の広いビーズを狭い大きさの範囲に分けるためにも使用することができる湿式篩分け；（２）カメラを内蔵した光学顕微鏡およびマイクロメータースライドまたはビーズの写真を撮影することおよびＩｍａｇｅＪなどのソフトウェアを使用してこれらを分析すること；ならびに（３）Ｅｌｚｏｎｅ ＩＩ（Ｐａｒｔｉｃｌｅ ａｎｄ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｔｙ．Ｌｔｄ）、Ｍａｓｔｅｒ Ｓｉｚｅｒ（Ｍａｌｖｅｒｎ）およびＦｌｏｗＣａｍ（Ｆｌｕｉｄ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などの標準的な粒径測定器の使用、を含むがこれらに限定されない当技術分野においてよく知られている方法または機器の１つまたは複数を使用して容易に決定することができる。
【００７９】
本発明の方法を使用して分離することができる大部分の大型生体分子（例えば、ウイルス、ウイルス様粒子およびコンジュゲートワクチン）の大きさは、一般に、当技術分野においてよく特徴付けられている方法に基づいて決定することができる。例えば、ウイルスの大きさは、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）（例えば、Ｎｅｒｍｕｔら、ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．、９：９２９−９３８頁（１９９３年）を参照されたい）および動的光散乱（Ｄｙｎｏｐｒｏ、Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（例えば、Ｏｐｉｔｚら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１３１、３０９−３１７頁（２００７年）を参照されたい）を含むがこれらに限定されない、当技術分野においてよく知られている１つまたは複数の技術を使用して決定することができる。大型生体分子の大きさの予測は、大型生体分子との相互作用を有さないがフロースルー精製において使用されているビーズのものと同様の細孔径を有する中性ビーズを使用することによって得ることができる。大型生体分子がビーズの細孔よりも大きければ、大型生体分子はこのようなビーズのカラムの空隙容量中に溶出することになる。これにより、大型生体分子の大きさがビーズの細孔径よりも大きいかどうかの予測を提供する。
【００８０】
ＶＩ．クロマトグラフィービーズの細孔径を測定する方法
クロマトグラフィービーズの分子量カットオフを示す細孔径は、一般に、製造業者によって定められている。これらはまた、文献において広く論じられている（例えば、Ｇｕら、Ｅｎｚｙ．Ｍｉｃｒｏ．Ｔｅｃｈ．３３：４３０−４３７頁（２００３年）を参照されたい）。ビーズの細孔径を測定するために使用される一般的な技術は、（１）デキストラン排除クロマトグラフィー（例えば、ＤｅＰｈｉｌｌｉｐｓら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．Ａ．８８３：３９−５４頁（２００３年）を参照されたい）；（２）一般に水銀を使用するポロシメトリー（例えば、Ｓｏｂｉｓｃｈら、Ｃｏｌｌｏｉｄ Ｐｏｌｙ．Ｓｃｉ．１３３：１６９−１７２頁（２００６年）を参照されたい）；（３）ＳＥＭ（４）ガス収着（例えば、Ｂｒｕｎａｕｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、６０：３０９−３１９頁（１９３８年）を参照されたい）；および（５）サーモポロメトリー（例えば、Ｗｕｌｆｆら、Ｔｈｅｒｃｈｉｍｉ．Ａｃｔａ、４１９：２９１−２９４頁（２００４年）を参照されたい）を含むがこれらに限定されない。
【００８１】
本発明を、限定するものと解釈されるべきではない以下の実施例によりさらに説明する。本出願全体にわたって引用されたすべての参考文献、特許、公開特許出願ならびに図面の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００８２】
（実施例）
【実施例１】
【００８３】
単位体積当たりのビーズの外部表面積の測定
異なる大きさのビーズの、ビーズの単位体積当たりの外部表面積を、本明細書に記載の通り決定することができる。例示的な実験において、以下のビーズの単位体積当たりの外部表面積を、上記の数学的方法、３４μｍの平均直径を有するＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ、９０μｍの平均直径を有するＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦおよび２００μｍの平均直径を有するＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＢＢ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して推定した。
【００８４】
例えば、本明細書において論じられた方程式Ｉを使用して、３４μｍ平均直径ビーズに関する単位体積当たりの外部表面積は、次の通り、計算することができる：
【００８５】
【数８】
【００８６】
同様に、他のＡＥＣビーズすべてに関して外部表面積を計算し、表Ｉにまとめている。
【００８７】
【表１】
【００８８】
表Ｉから観察できるように、外部表面積はビーズ径の増加とともに減少する。
【００８９】
別の例示的な実験において、ビーズの単位体積当たりの外部表面積を計算するために、本明細書に記載の経験的方法を使用した。インフルエンザまたはアデノウイルスなどの大型生体分子を結合するための、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（９０μｍ）およびＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＢＢ（２００μｍ）上の利用可能な外部表面積の概算を、モデルとしてＢＳＡ被覆ラテックスビーズ（Ｐｏｓｔｎｏｖａ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ）を使用して経験的に得た。
【００９０】
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４ＦＦ（Ｓ４ＦＦ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＱＳ４ＦＦまたはＱＳＢＢビーズのそれぞれの５ｍｌカラムを、７ｍｌ蓋付き試験管に移した。Ｓ４ＦＦは中性に荷電されており、対照ビーズとして使用した。ＰＢＳ中約１．３８ｍｌのＢＳＡ被覆スチレン粒子溶液（１．４×１０１３粒子／ｍｌ）を、それぞれのビーズに加えた。
【００９１】
ビーズ−粒子混合物を回転させながら一晩混合し、ビーズを沈殿させ、上清中の粒子の吸光度を、ＵＶ分光法を使用して２８０ｎｍで測定した。標準検量線をプロットすることによって粒子の濃度を得た。
【００９２】
前述のビーズのそれぞれについて上記の方程式ＩＩＩを使用して、ＢＳＡ被覆スチレン粒子を使用して表面積を測定した例示的な実験の結果を、表ＩＩにまとめている。
【００９３】
【表２】
【００９４】
本明細書において観察されたように、経験的にならびに数学的に計算された単位体積当たりの外部表面積は、ビーズ径の増加とともに減少する。
【００９５】
しかしながら、経験による値は、大型生体分子に結合するために利用可能な実際の面積が、数学的に計算された面積よりもはるかに低いことを示唆している。本明細書に記載のフロースルー方法において、増加した平均直径を有し、また最小限の単位体積当たりの外部表面積を有するビーズの少なくとも１つの集団を使用することが望ましい。したがって、ビーズ集団の外部表面積は、単位体積当たりの内部表面積を減少させることなくビーズ径を増加させることによって最小化される。
【実施例２】
【００９６】
静的結合容量を使用した単位体積当たりのビーズの内部表面積の推定
実施例１において論じられた、それぞれ、より大きいおよび最小化された外部表面積を有する、ＱＳ４ＦＦ（９０μｍ）およびＱＳＢＢ（２００μｍ）ビーズの単位体積当たりの内部表面積を、ＢＳＡに関するこれらの静的結合容量を試験することによって推定した。ＢＳＡは、クロマトグラフィーにおけるモデルタンパク質として広く使用されてきた。ＢＳＡは、およそ６６ＫＤの平均分子量および約５のｐＩを有する。ＢＳＡは、大部分の宿主細胞タンパク質の大きさおよび電荷の典型的なものである。
【００９７】
１つの例示的な実験において、ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に関するＱＳ４ＦＦおよびＱＳＢＢビーズの静的容量を、２つの異なる種類の緩衝液において２つの異なるｐＨで測定した。ＱＳ４ＦＦまたはＱＳＢＢ媒体のいずれかを含有する１ｍｌカラムを充填し、４ｍｌの緩衝液中で媒体をスラリーにし、０．５ｍｌのスラリーを２ｍｇ／ｍｌの濃度を有する１４．５ｍｌのＢＳＡ溶液中に加えることによって実験を行った。４時間後、混合物中のビーズを沈殿させ、上清中のＢＳＡ濃度をＵＶ−Ｖｉｓ分光法によって測定した。上清濃度の変化を使用して、ＢＳＡに関するビーズの静的結合容量を計算した。
【００９８】
異なる溶液においてＢＳＡに関するビーズの静的容量を測定した実験の結果を、表ＩＩＩにまとめている。
【００９９】
【表３】
【０１００】
表ＩＩＩに示したように、最小化された外部表面積を有する２００μｍビーズおよび９０μｍビーズは、ｐＨ７．０のＴｒｉｚｍａおよびリン酸ナトリウム緩衝液において同様のＢＳＡ容量を有する。Ｔｒｉｚｍａ緩衝液においてｐＨ８．０でＱＳＢＢ（約２０％）の容量のわずかな減少が存在するが、ｐＨ８．０での容量はｐＨ７．０よりも高い。したがって、より大きいおよびより小さい単位体積当たりの外部表面積を有するＱＳ４ＦＦおよびＱＳＢＢビーズは、それぞれ、ＢＳＡを結合するための同様の単位体積当たりの内部表面積を有する、と推定することができる。したがって、適当な緩衝液、ｐＨおよびビーズ径を選択することによって、本発明において提案された方法を使用することにより同様な量の不純物を除去することができると結論付けることができる。
【実施例３】
【０１０１】
２つの異なるビーズ径の陰イオン交換媒体からのウイルス様粒子（すなわち、１００ｎｍＢＳＡ被覆スチレン粒子）の回収率の比較
例示的な実験において、異なるビーズ径を有する２つの別々の陰イオン交換媒体を、ウイルス様粒子の回収率について試験した。具体的には、陰イオン交換媒体、９０μｍの平均直径を有するＱ セファロース４ＦＦビーズ（ＱＳ４ＦＦ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）および２００μｍの平均直径を有するＱ セファロースビッグビーズ（ＱＳＢＢ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の静的結合容量を、例示的なウイルス様粒子であり、インフルエンザまたはアデノウイルスと同様の大きさおよび電荷を有する１００ｎｍウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）被覆スチレン粒子（Ｐｏｓｔｎｏｖａ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ）の回収率について試験した。ＱＳ４ＦＦおよびＱＳＢＢ媒体は、正に荷電しており、ＢＳＡ被覆ラテックス粒子に結合することができる第４級アンモニウム基を含有する。一般に、粒子はビーズの外部表面積にのみ結合するため、ＢＳＡ被覆粒子に関するこれらのビーズの静的結合容量は動的結合容量と等しくあるべきであると考えられていた。
【０１０２】
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４ＦＦ（Ｓ４ＦＦ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＱＳ４ＦＦおよびＱＳＢＢビーズのそれぞれの５ｍｌカラムを、７ｍｌ蓋付き試験管に移した。Ｓ４ＦＦは中性に荷電されており、対照ビーズとして使用した。ＰＢＳ中約１．３８ｍｌのＢＳＡ被覆スチレン粒子溶液（２５ｍｇ／ｍｌ、１．４×１０１３粒子／ｍｌ）を、それぞれのビーズに加えた。
【０１０３】
ビーズ／粒子混合物を一晩回転させ、ビーズを沈殿させ、上清中の粒子の吸光度を、ＵＶ分光法を使用して２８０ｎｍで測定した。標準検量線をプロットすることによって粒子の濃度を得た。
【０１０４】
供給原料および上清中の媒体および粒子の濃度のそれぞれについて、ＢＳＡ被覆スチレン粒子に関する容量を測定した例示的な実験の結果を、表ＩＶにまとめている。
【０１０５】
【表４】
【０１０６】
さらに、それぞれのビーズによって達成されたＢＳＡ被覆スチレン粒子の回収率を表Ｖにまとめている。
【０１０７】
【表５】
【０１０８】
表Ｖに示したように、ＢＳＡ被覆スチレン粒子の回収率は、ビーズ径の増加とともに約３３％増加する。したがって、ビーズ径を増加させることによって単位体積当たりの外部表面積を減少させることは、ウイルス様粒子の回収率の向上と相関する。
【実施例４】
【０１０９】
２つの異なるビーズ径の陰イオン交換媒体を使用した、Ｐｈｉ６およびＢＳＡの混合物からのバクテリオファージＰｈｉ６の回収率の比較
別の例示的な実験において、Ｐｈｉ６およびＢＳＡを含有する溶液混合物からのウイルス粒子（Ｐｈｉ６）の回収率を例証した。Ｐｈｉ６は、約８６ｎｍの大きさの、７．０より高いｐＨで負の電荷を有する脂質エンベロープバクテリオファージである。したがって、Ｐｈｉ６はインフルエンザウイルスを表すモデルとして使用された。さらに、ＢＳＡは、約５．０のｐＩを有する負に荷電したタンパク質であり、宿主細胞タンパク質を表すモデルとして使用された。以下の手順を使用して溶液をビーズの充填カラム中に約１ｍｌ／分の流速で流すことによって、動的モードでこれらの試験を行った。
【０１１０】
バクテリオファージＰｈｉ６（約１．１×１０１２ＰＦＵ／ｍｌのストック力価）を約６００ｍｌのＰＢＳに加えることによって供給原料溶液を調製して、約１０９ＰＦＵ／ｍｌの最終Ｐｈｉ６濃度を達成した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）をこの溶液に加えて、ＵＶ分光法により測定した０．１８ｍｇ／ｍｌの最終濃度を達成した。
【０１１１】
ガラスカラム（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製のＯｍｎｉｆｉｔ）に、約０．５ｍｌの９０μｍの平均直径を有する中性セファロース４ＦＦ（Ｓ４ＦＦ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、正に荷電した９０μｍの平均直径を有するＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦビーズ（ＱＳ４ＦＦ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）または正に荷電した２００μｍの平均直径を有するＱ セファロースビッグビーズ（ＱＳＢＢ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を充填した。カラムの品質はアセトンパルス法を使用して確認して、これらが良好な非対称性およびＨＥＴＰ（すなわち、理論段相当高さ）を確実に有するようにし、次いでＰＢＳ中で平衡化した（例えば、Ｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｆｏｃｕｓｉｎｇ− Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、１１−０００４−２１、Ｅｄｉｔｉｏｎ ＡＡにおいて記述されている通り参照されたい）。
【０１１２】
およそ２００ｍｌの供給原料溶液を、１±０．１ｍｌ／分の流速でそれぞれのカラムを通過させ、フロースルーを２０ｍｌ画分ずつ回収した。
【０１１３】
ＢＳＡ濃度について、対照として緩衝液中Ｐｈｉ６溶液を使用して、ＵＶ分光法を使用して２８０ｎｍで画分をアッセイした。バクテリオファージＰｈｉ６の濃度を、ＴＣＩＤ５０−プラーク形成単位アッセイを使用して決定した。
【０１１４】
Ｓ４ＦＦ（対照）、ＱＳ４ＦＦ（９０μｍ）またはＱＳＢＢ（２００μｍ）ビーズのいずれかを含有する０．５ｍカラムを通過した、Ｐｈｉ６およびＢＳＡの溶液混合物中のバクテリオファージＰｈｉ６のブレークスルーを測定した１つのこのような実験の結果を、図１に示している。
【０１１５】
図１により明示されているように、Ｐｈｉ６は何の相互作用もなく対照ビーズＳ４ＦＦを通過し、供給原料濃度と等しいフロースルー濃度を与える。ＱＳＢＢビーズ（２００μｍ）を使用したフロースルーは、Ｐｈｉ６が最初はカラムに結合し、１５０カラム体積（ＣＶ）の範囲内の供給原料濃度に達することを示唆している。しかしながら、ＱＳ４ＦＦビーズ（９０μｍ）を使用したフロースルー中のＰｈｉ６濃度は、３００ＣＶになって初めて供給原料濃度に達する。このことは、２００μｍビーズが９０μｍビーズの半分だけのウイルスに結合することを示唆している。
【０１１６】
実験中の特定の時点の、Ｓ４ＦＦ、ＱＳ４ＦＦまたはＱＳＢＢのいずれかを含有する０．５ｍｌカラムを通過した、上記を含有する溶液混合物のフロースルー中のＢＳＡおよびＰｈｉ６の量を測定した１つのこのような実験の結果を、表ＶＩにまとめている。
【０１１７】
【表６】
【０１１８】
表ＶＩにまとめた結果に基づいて、９０μｍおよび２００μｍ径ビーズは異なる量のＰｈｉ６に結合するものの、これらはＢＳＡに関して同様の結合特性を有すると考えられる。さらに、約８０ＣＶの供給原料を各カラム中に通過させた後、ＱＳ４ＦＦ（９０μｍ）と比較して１０倍高いＰｈｉ６の回収率を、ＱＳＢＢ（２００μｍ）を使用して得ることができる。
【０１１９】
したがって、前述の結果に基づいて、一定のカラム体積（ＣＶ）について、より小さいビーズ（例えば、９０μｍ）と比較して、より大きいビーズ（例えば、２００μｍ）を使用すると、単位体積当たりの外部表面積が減少するためより多くのウイルスを回収することができると考えられる。さらに、溶液中のタンパク質、例えば、宿主細胞タンパク質の存在は、ウイルス回収率に悪影響を及ぼさないようであり、宿主細胞タンパク質の除去自体はビーズ径とは無関係のようである。
【実施例５】
【０１２０】
３つの異なるビーズ径の陰イオン交換媒体を使用したＢ型インフルエンザウイルスおよび宿主細胞タンパク質の混合物からのＢ型インフルエンザウイルスの回収率の比較
別の例示的な実験において、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、フェノールレッドおよび非必須アミノ酸などの増殖培地中の宿主細胞タンパク質、ＤＮＡおよび他の成分の混合物からのＢ型インフルエンザウイルスの回収率を記述している。Ｂ型インフルエンザウイルスは、約５．０のｐＩおよびおよそ８０から１２０ｎｍの大きさを有する脂質エンベロープウイルスである。Ｂ型インフルエンザウイルスおよび宿主細胞タンパク質を含有する浄化した細胞培養溶解物上清をビーズの充填カラム中に１ｍｌ／分の流速で流すことによって、動的モードでこれらの試験を行った。
【０１２１】
ＭＤＣＫ細胞中で増殖させたＢ型インフルエンザウイルスを含有するおよそ２００ｍｌの供給原料を、標準的な手順を使用して調製した。初めに、８個のＴ１５０フラスコに、１０％ＦＢＳ ＤＭＥＭ中約２．０×１０７細胞／フラスコを接種した。２４時間後、フラスコ中の媒体をＤＭＥＭ中１％ＦＢＳに交換し、ＭＤＣＫ細胞における増殖に適合させた組織培養であるＢ型インフルエンザウイルス株Ｂ／Ｌｅｅ／４０（ＡＴＣＣ＃ＶＲ−１５３５）に細胞を感染させた。次いでフラスコを３７℃、５％ＣＯ２中で、完全なＣＰＥ（細胞変性作用）が観察されるまで５日間インキュベートした。その後上清を２５００ＲＰＭで遠心分離にかけ、０．４５μｍ膜フィルターによって濾過して細胞残屑を除去し、さらなる使用まで４℃で保存した。
【０１２２】
ガラスカラム（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製のＯｍｎｉｆｉｔ）に、約１ｍｌの９０μｍの平均直径を有する中性セファロース４ＦＦ（Ｓ４ＦＦ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、正に荷電した３４μｍの平均直径を有するＱ セファロース ＨＰ（ＱＳＨＰ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、正に荷電した９０μｍの平均直径を有するＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４ＦＦビーズ（ＱＳ４ＦＦ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）または正に荷電した２００μｍの平均直径を有するＱ セファロースビッグビーズ（ＱＳＢＢ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を充填した。カラムの品質はアセトンパルス法を使用して確認して、これらが良好な非対称性およびＨＥＴＰを確実に有するようにし、次いで２０ｍＭリン酸塩緩衝液ｐＨ７．２中で平衡化した。
【０１２３】
上記の通り調製したおよそ１０ｍｌの浄化したインフルエンザ供給原料を、各カラムを１ｍｌ／分の流速で通過させた。カラムを通ったフローを１ｍｌ画分ずつ回収し、赤血球凝集反応（ＨＡ）アッセイを使用してインフルエンザ含有量について２連でアッセイした。
【０１２４】
Ｓ４ＦＦ（対照）、ＱＳＨＰ（３４μｍ）ＱＳ４ＦＦ（９０μｍ）またはＱＳＢＢ（２００μｍ）ビーズのいずれかを含有する１ｍｌカラムを通過した、宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、ＦＢＳおよび他の増殖添加剤の溶液混合物中のＢ型インフルエンザウイルスのブレークスルー力価を測定した例示的な実験の結果を、表ＶＩＩおよび図２に示している。
【０１２５】
【表７】
【０１２６】
３つの異なる単位体積当たりの外部表面積に対応する３つの異なる大きさのビーズを、この実験において評価した。表ＶＩＩおよび図２において観察できるように、ＱＳＢＢ（２００μｍ）ビーズはＢ型インフルエンザウイルスの即時のブレークスルーを示す（３ＣＶ未満でブレークスルー）が、一方、ＱＳＨＰ（３４μｍ）は、９ＣＶのカラムを通過した供給原料まで、実験の全長にわたってブレークスルーしない。９ＣＶ後、ＱＳＢＢ（２００μｍ）のフロースルー濃度は供給原料溶液濃度に等しく、ＱＳ４ＦＦ（９０μｍ）ビーズよりも１６倍高い回収率およびＱＳＨＰ（３４μｍ）ビーズよりも６４倍高い回収率を示す。したがって、結果は、ビーズ径を増加させることにより単位体積当たりの外部表面積を減少させることによって、より小さい大きさのビーズと比較してＢ型インフルエンザウイルスのより高い回収率をもたらすことを例証する。
【０１２７】
さらに、下記の表ＶＩＩＩは、実施例３、４および５に記述されている実験において試験した様々な種類のウイルス粒子の回収率をまとめている。バクテリオファージ−Ｐｈｉ６およびＢ型インフルエンザウイルスのプール回収率を、図１および図２におけるブレークスルー曲線の下の面積を使用して計算した。
【０１２８】
【表８】
【０１２９】
表ＶＩＩＩにまとめたように、９０μｍから２００μｍまでビーズ径を増加させることによる外部表面積の最小化は、ウイルス／ウイルス様粒子の収率を３０−９０％向上させた。
【実施例６】
【０１３０】
陰イオン交換媒体を使用したインフルエンザウイルスおよび宿主細胞タンパク質およびＤＮＡの混合物からのＡ型インフルエンザウイルスの回収率および宿主細胞タンパク質の除去の比較
別の例示的な実験において、宿主細胞タンパク質およびＤＮＡの混合物からのＡ型インフルエンザウイルスの回収率を測定した。Ａ型インフルエンザウイルスは、約５．０のｐＩおよびおよそ８０から１２０ｎｍの大きさを有する脂質エンベロープウイルスである。Ａ型インフルエンザウイルスおよび宿主細胞タンパク質を含有する浄化および緩衝液交換した供給原料を、ビーズの充填カラム中に１ｍｌ／分の流速で流すことによって、動的モードでこれらの実験を行った。
【０１３１】
ＭＤＣＫ細胞中で増殖させたＡ型インフルエンザウイルスを含有する供給原料を、標準的な手順を使用して調製した。初めに、５０個のＴ１５０フラスコに、１０％ＦＢＳ ＤＭＥＭ中、ＭＤＣＫ細胞を１０％集密度で接種した。２−３日後、細胞が８０−９０％集密になれば、フラスコ中の媒体を無血清ＤＭＥＭに交換し、ＭＤＣＫ細胞における増殖に適合させた組織培養であるＡ型インフルエンザウイルス／ＷＳ（Ｈ１Ｎ１株）に細胞を感染させた。次いでフラスコを３３℃、５％ＣＯ２中で、完全なＣＰＥが観察されるまで３日間インキュベートした。その後上清を２５００ＲＰＭで遠心分離にかけ、０．４５μｍ膜フィルターによって濾過して細胞残屑を除去し、さらなる使用まで−８０℃で保存した。
【０１３２】
ガラスカラム（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製のＯｍｎｉｆｉｔ）に、約０．８ｍｌの９０μｍの平均直径を有する中性セファロース４ＦＦ（Ｓ４ＦＦ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、正に荷電した９０μｍの平均直径を有するＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦビーズ（ＱＳ４ＦＦ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）または正に荷電した２００μｍの平均直径を有するＱ セファロースビッグビーズ（ＱＳＢＢ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を充填した。カラムの品質はアセトンパルス法を使用して確認して、これらが良好な非対称性およびＨＥＴＰを確実に有するようにし、次いで５０ｍＭリン酸塩緩衝液ｐＨ７．１中で平衡化した。
【０１３３】
実験を行う直前に、およそ２００ｍｌの供給原料を４℃で一晩解凍し、次いで、１０Ｋｉｌｏ−Ｄａｌｔｏｎ Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ遠心フィルターデバイス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、ｐＨ７．１の５０ｍＭリン酸塩緩衝液に緩衝液を交換した。上記の通り調製したおよそ９０ｍｌのこのインフルエンザ供給原料を、各カラムを０．１６ｍｌ／分の流速で通過させた。カラムを通ったフローを１ｍｌ画分ずつ回収し、ＨＡアッセイ、ＢＣＡアッセイおよびＰｉｃｏ−ｇｒｅｅｎアッセイをそれぞれ使用してインフルエンザ、宿主細胞タンパク質、および宿主細胞ＤＮＡ含有量について２連でアッセイした。
【０１３４】
Ｓ４ＦＦ（対照）、ＱＳ４ＦＦ（９０μｍ）またはＱＳＢＢ（２００μｍ）ビーズを含有する０．８ｍｌカラムを通過した、宿主細胞タンパク質およびＤＮＡの混合物中のＡ型インフルエンザウイルスのブレークスルーを測定した例示的な実験の結果を図３に示している。
【０１３５】
Ｓ４ＦＦ（対照）、ＱＳ４ＦＦ（９０μｍ）またはＱＳＢＢ（２００μｍ）ビーズを含有する０．８ｍｌカラムを通過した、Ａ型インフルエンザウイルスおよびＤＮＡの溶液混合物中の宿主細胞タンパク質のブレークスルーを測定した例示的な実験の結果を図４に示している。
【０１３６】
表ＩＸは、４２ｍｌの供給原料がカラムを通過した後のＡ型インフルエンザウイルスの回収率および宿主細胞タンパク質の除去に関して、Ｓ４ＦＦ（対照）、ＱＳ４ＦＦ（９０μｍ）またはＱＳＢＢ（２００μｍ）ビーズのいずれかの０．８ｍｌカラムを通過した、上記の溶液混合物中のＡ型インフルエンザウイルス、ＨＣＰおよび宿主細胞ＤＮＡのブレークスルー力価を測定した、図３および４に記述した実験の結果をまとめている。
【０１３７】
【表９】
【０１３８】
図３および４ならびに表ＩＸにまとめたように、大きい２００μｍビーズカラムは、９０μｍビーズよりもはるかに速いＡ型インフルエンザウイルスのブレークスルーおよび約６５％高いウイルスの回収率をもたらすことが明らかである。ＱＳ４ＦＦおよびＱＳＢＢカラムの宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）ブレークスルー曲線は似ているようであり、ＱＳＢＢカラムによる全ＨＣＰ除去はＱＳ４ＦＦカラムよりも少し低いようである。しかし、２００μｍビーズは非常に高いウイルスの回収率を有するので、このカラムから得られた生成物の純度は、９０μｍビーズカラムよりも約６０％高い。
【実施例７】
【０１３９】
ビーズ混合物を使用したインフルエンザウイルスおよび宿主細胞タンパク質およびＤＮＡの混合物からのＡ型インフルエンザウイルスの回収率および宿主細胞タンパク質の除去の比較
例示的な実験において、（１）陰イオン交換ビーズカラム；（２）連続して陰イオンおよび陽イオン交換ビーズを含有するカラム；（３）連続して陰イオン交換および疎水性ビーズを含有するカラム；（４）連続して陰イオン交換、陽イオン交換および疎水性ビーズを含有するカラム；（５）または陰イオン交換、陽イオン交換および疎水性ビーズの混合物を含有するカラムを使用した、ウイルスおよび宿主細胞タンパク質および宿主細胞ＤＮＡを含有する混合物からのＡ型インフルエンザウイルスのフロースルー精製。
【０１４０】
ガラスカラム（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製のＯｍｎｉｆｉｔ）に、約０．８ｍｌの正に荷電した９０μｍの平均直径を有するＱセファロース４ＦＦビーズ（ＱＳ４ＦＦ）を、または０．８ｍｌの正に荷電した２００μｍの平均直径を有するＱ セファロースビッグビーズ（ＱＳＢＢ）を、または０．８ｍｌのＱ セファロースビッグビーズその後に０．８ｍｌの２００μｍの平均直径を有するＳＰセファロースビッグビーズを連続して（ＡＣ）、または０．８ｍｌのＱ セファロースビッグビーズその後に０．８ｍｌの２００μｍの平均直径を有するＰｈｅｎｙｌ セファロースビッグビーズを連続して（ＡＨ）、または０．８ｍｌのＱ セファロースビッグビーズその後に０．８ｍｌのＳＰセファロースビッグビーズその後に０．８ｍｌの２００μｍの平均直径を有するＰｈｅｎｙｌ セファロースビッグビーズを連続して（ＡＣＨ）、または２００μｍの平均直径を有するＱ セファロースビッグビーズ、ＳＰ ＳｅｐｈａｒｏｓｅビッグビーズおよびＰｈｅｎｙｌ セファロースビッグビーズの混合物を充填して、２．４ｍｌカラム（ＭＡＣＨ）を構成した。カラムの品質はアセトンパルス法を使用して確認して、これらが良好な非対称性およびＨＥＴＰを確実に有するようにし、次いで５０ｍＭＴｒｉｚｍａ緩衝液ｐＨ８中で平衡化した（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００８１１３０１１ Ａ２において記述されている通り参照されたい）。
【０１４１】
Ａ型インフルエンザウイルスを含有する供給原料は、実施例６に記述されているものと同様の方法で作製し、さらなる使用まで−８０℃で保存した。実験を行う前に、供給原料を４℃で一晩解凍し、次いで、１０Ｋｉｌｏ−Ｄａｌｔｏｎ Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ遠心フィルターデバイス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、ｐＨ８．０の５０ｍＭＴｒｉｚｍａ緩衝液に緩衝液を交換した。およそ６０ｍｌの緩衝液交換した供給原料を、各カラムを０．１６ｍｌ／分の流速で通過させた。カラムを通ったフローを１ｍｌ画分ずつ回収し、ＨＡアッセイ、ＢＣＡアッセイおよびＰｉｃｏ−ｇｒｅｅｎアッセイをそれぞれ使用してインフルエンザ、宿主細胞タンパク質、および宿主細胞ＤＮＡ含有量について２連でアッセイした。
【０１４２】
０．８ｍｌのＱＳ４ＦＦ（９０μｍ）ビーズ；０．８ｍｌのＱＳＢＢ（２００μｍ）ビーズ；連続して０．８ｍｌのＱＳＢＢビーズおよび０．８ｍｌのＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビッグビーズ（２００μｍ）（ＡＣ）；連続して０．８ｍｌのＱＳＢＢビーズおよび０．８ｍｌのＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビッグビーズ（２００μｍ）（ＡＨ）；連続して０．８ｍｌのＱＳＢＢビーズ、０．８ｍｌのＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビッグビーズおよび０．８ｍｌのＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビッグビーズ（ＡＣＨ）；またはＱＳＢＢビーズ、ＳＰ ＳｅｐｈａｒｏｓｅビッグビーズおよびＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビッグビーズの２．４ｍｌの混合物（ＭＡＣＨ）のうちの１つを含有しているカラムを通過した、ＨＣＰおよび宿主細胞ＤＮＡの溶液混合物におけるＡ型インフルエンザウイルスのブレークスルーを測定した例示的な実験の結果を、図５に示している。
【０１４３】
０．８ｍｌのＱＳ４ＦＦ（９０μｍ）ビーズ；０．８ｍｌのＱＳＢＢ（２００μｍ）ビーズ；連続して０．８ｍｌのＱＳＢＢビーズおよび０．８ｍｌのＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビッグビーズ（２００μｍ）（ＡＣ）；連続して０．８ｍｌのＱＳＢＢビーズおよび０．８ｍｌのＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビッグビーズ（２００μｍ）（ＡＨ）；連続して０．８ｍｌのＱＳＢＢビーズ、０．８ｍｌのＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビッグビーズおよび０．８ｍｌのＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビッグビーズ（ＡＣＨ）；またはＱＳＢＢビーズ、ＳＰ ＳｅｐｈａｒｏｓｅビッグビーズおよびＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビッグビーズの２．４ｍｌの混合物（ＭＡＣＨ）のうちの１つを含有しているカラムを通過した、Ａ型インフルエンザウイルスおよび宿主細胞ＤＮＡの溶液混合物におけるＨＣＰのブレークスルーを測定した例示的な実験の結果を、図６に示している。
【０１４４】
表Ｘは、４２ｍｌの供給原料が本明細書において論じられた様々なカラムを通過した後の、溶液混合物中のＡ型インフルエンザウイルス、ＨＣＰおよび宿主細胞ＤＮＡのブレークスルー力価を測定した、図５および６に示した実験の結果をまとめている。
【０１４５】
【表１０】
【０１４６】
上記の実験は、カラムにおいて単一のまたは複数の種類のビーズを使用した、Ａ型インフルエンザウイルスの精製を記述している。図５および６ならびに表Ｘから、複数の種類のビーズの使用はウイルス回収率をわずかに減少させたことが分かる。しかしながら、より大きい体積であっても、これらの小さい単位体積当たりの外部表面積およびウイルスとの相互作用の制限のために、２００μｍビーズを有するカラムは常に９０μｍビーズと比較して高いウイルス回収率を有した。複数の種類のビーズの使用は、全ＨＣＰ除去および生成物の純度を大幅に向上させた。このことは、陽イオンおよび疎水性ビーズのためにカラムに付加された外部表面積はウイルス回収を阻害しなかったが、これらのビーズの内部表面積が宿主細胞タンパク質のクリアランスを可能にし、これによって生成物の純度を増加させたことを示唆している。複数の種類のビーズを用いた試験はまた、陰イオン、陽イオンおよび／または疎水性樹脂の相互作用を組み合わせる２００μｍ混合モードビーズを使用して、同様の精製が達成される潜在的な可能性があることを示唆している。
【０１４７】
明細書は、参照により本明細書に組み込まれる明細書中で引用された参考文献の教示を踏まえて、最も完全に理解される。明細書中の実施形態は、本発明における実施形態の例示を提供し、その範囲を限定するとは解釈されるべきではない。当業者は、多くの別の実施形態が本発明に包含されることを容易に認識する。すべての出版物および発明は、その全体が参照により組み込まれる。参照により組み込まれる資料が本明細書と矛盾するまたは一致しない程度まで、本明細書はすべてのこのような資料に優先するものとする。本明細書中の任意の参考文献の引用は、このような参考文献が本発明の先行技術であると承認するものではない。
【０１４８】
別途指示のない限り、特許請求の範囲を含む明細書中で使用されている成分、細胞培養、処理条件などの量を表すすべての数は、「約」という用語によってすべての場合において修飾されていると理解されるべきである。したがって、別途反対の指示のない限り、数値パラメーターは近似値であり、本発明によって取得しようとする所望の特性に依存して変動し得る。別途指示のない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」という用語は、その一連におけるあらゆる要素を指すと理解されるべきである。当業者は、日常的作業にすぎない実験を使用して、本明細書に記載の本発明の具体的な実施形態の多くの等価物を認識する、または確認することができるはずである。このような等価物は、以下の特許請求の範囲に包含されるよう意図される。
【０１４９】
当業者には明らかであるように、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明の多くの変更形態および変形形態が可能である。本明細書に記載の具体的な実施形態は、例としてのみ提供され、決して限定するものではない。明細書および実施例は単なる例示としてみなされ、本発明の真の範囲および精神は以下の特許請求の範囲によって示されていることを意図している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料を、回収される大型生体分子より小さい分子量カットオフを有する固体多孔性粒子の１つまたは複数の集団と接触させるステップを含み、フロースループロセスにおいて使用される固体多孔性粒子の少なくとも１つの集団は、固体多孔性粒子の集団の単位体積当たりの最小化された外部表面積および（単位体積当たりの最小化された外部表面積を有さない固体多孔性粒子の集団と比較して、固体多孔性粒子の集団の単位体積当たりで２５％を超えて減少していない）内部表面積を含み、それによって大型生体分子の回収率を向上させる、大型生体分子および１つまたは複数の夾雑物を含む試料からの大型生体分子の回収率を向上させるためのフロースループロセス。
【請求項２】
固体多孔性粒子の１つまたは複数の集団が、クロマトグラフィーカラム中に充填されている、請求項１に記載のフロースループロセス。
【請求項３】
粒子集団の単位体積当たりの最小化された外部表面積および粒子集団の単位体積当たりで減少していない内部表面積を含む固体多孔性粒子の少なくとも１つの集団が使用されないフロースループロセスを使用した大型生体分子の回収率と比較して、大型生体分子の回収率が、少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％向上している、請求項１に記載のフロースループロセス。
【請求項４】
回収率の向上が、大型生体分子の純度の少なくとも１０％の向上を含む、請求項３に記載のフロースループロセス。
【請求項５】
回収率の向上が、１つまたは複数の夾雑物の少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％以上の減少を含む、請求項３に記載のフロースループロセス。
【請求項６】
固体多孔性粒子の１つまたは複数の集団が、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーに使用されるビーズの１つまたは複数から選択される、請求項１に記載のフロースループロセス。
【請求項７】
固体多孔性粒子の１つまたは複数の集団が、混合モードクロマトグラフィービーズを含む、請求項１に記載のフロースループロセス。
【請求項８】
大型生体分子が、カプセル化ウイルス、ウイルス様粒子およびコンジュゲートワクチンからなる群から選択される、請求項１に記載のフロースループロセス。
【請求項９】
１つまたは複数の夾雑物が、核酸、タンパク質、賦形剤および細胞培養添加剤からなる群から選択される、請求項１に記載のフロースループロセス。
【請求項１０】
タンパク質が宿主細胞タンパク質である、請求項８に記載のフロースループロセス。
【請求項１１】
ウイルス様粒子が、ＢＳＡで被覆されたスチレン粒子である、請求項７に記載のフロースループロセス。
【請求項１２】
カプセル化ウイルスがインフルエンザウイルスである、請求項７に記載のフロースループロセス。
【請求項１３】
カプセル化ウイルスがアデノウイルスである、請求項７に記載のフロースループロセス。
【請求項１４】
カプセル化ウイルスがバクテリオファージである、請求項７に記載のフロースループロセス。
【請求項１５】
インフルエンザウイルスがＨ１Ｎ１ウイルスである、請求項１１に記載のフロースループロセス。
【請求項１６】
大型生体分子が、細胞培養においてまたは卵中で産生される、請求項１に記載のフロースループロセス。
【請求項１７】
試料が細胞培養上清である、請求項１に記載のフロースループロセス。
【請求項１８】
細胞培養がＭＤＣＫ細胞を含む、請求項１５に記載のフロースループロセス。
【請求項１９】
固体多孔性粒子の少なくとも１つの集団が、２００μｍから６００μｍまでの範囲の平均直径を有する、請求項１に記載のフロースループロセス。
【請求項２０】
プロセスが、試料中の大型生体分子の少なくとも５０％、または少なくとも５５％、または少なくとも６０％、または少なくとも６５％、または少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％の回収を可能にする、請求項１に記載のフロースループロセス。
【請求項１】
試料を、回収される大型生体分子より小さい分子量カットオフを有する固体多孔性粒子の１つまたは複数の集団と接触させるステップを含み、フロースループロセスにおいて使用される固体多孔性粒子の少なくとも１つの集団は、固体多孔性粒子の集団の単位体積当たりの最小化された外部表面積および（単位体積当たりの最小化された外部表面積を有さない固体多孔性粒子の集団と比較して、固体多孔性粒子の集団の単位体積当たりで２５％を超えて減少していない）内部表面積を含み、それによって大型生体分子の回収率を向上させる、大型生体分子および１つまたは複数の夾雑物を含む試料からの大型生体分子の回収率を向上させるためのフロースループロセス。
【請求項２】
固体多孔性粒子の１つまたは複数の集団が、クロマトグラフィーカラム中に充填されている、請求項１に記載のフロースループロセス。
【請求項３】
粒子集団の単位体積当たりの最小化された外部表面積および粒子集団の単位体積当たりで減少していない内部表面積を含む固体多孔性粒子の少なくとも１つの集団が使用されないフロースループロセスを使用した大型生体分子の回収率と比較して、大型生体分子の回収率が、少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％向上している、請求項１に記載のフロースループロセス。
【請求項４】
回収率の向上が、大型生体分子の純度の少なくとも１０％の向上を含む、請求項３に記載のフロースループロセス。
【請求項５】
回収率の向上が、１つまたは複数の夾雑物の少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％以上の減少を含む、請求項３に記載のフロースループロセス。
【請求項６】
固体多孔性粒子の１つまたは複数の集団が、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーに使用されるビーズの１つまたは複数から選択される、請求項１に記載のフロースループロセス。
【請求項７】
固体多孔性粒子の１つまたは複数の集団が、混合モードクロマトグラフィービーズを含む、請求項１に記載のフロースループロセス。
【請求項８】
大型生体分子が、カプセル化ウイルス、ウイルス様粒子およびコンジュゲートワクチンからなる群から選択される、請求項１に記載のフロースループロセス。
【請求項９】
１つまたは複数の夾雑物が、核酸、タンパク質、賦形剤および細胞培養添加剤からなる群から選択される、請求項１に記載のフロースループロセス。
【請求項１０】
タンパク質が宿主細胞タンパク質である、請求項８に記載のフロースループロセス。
【請求項１１】
ウイルス様粒子が、ＢＳＡで被覆されたスチレン粒子である、請求項７に記載のフロースループロセス。
【請求項１２】
カプセル化ウイルスがインフルエンザウイルスである、請求項７に記載のフロースループロセス。
【請求項１３】
カプセル化ウイルスがアデノウイルスである、請求項７に記載のフロースループロセス。
【請求項１４】
カプセル化ウイルスがバクテリオファージである、請求項７に記載のフロースループロセス。
【請求項１５】
インフルエンザウイルスがＨ１Ｎ１ウイルスである、請求項１１に記載のフロースループロセス。
【請求項１６】
大型生体分子が、細胞培養においてまたは卵中で産生される、請求項１に記載のフロースループロセス。
【請求項１７】
試料が細胞培養上清である、請求項１に記載のフロースループロセス。
【請求項１８】
細胞培養がＭＤＣＫ細胞を含む、請求項１５に記載のフロースループロセス。
【請求項１９】
固体多孔性粒子の少なくとも１つの集団が、２００μｍから６００μｍまでの範囲の平均直径を有する、請求項１に記載のフロースループロセス。
【請求項２０】
プロセスが、試料中の大型生体分子の少なくとも５０％、または少なくとも５５％、または少なくとも６０％、または少なくとも６５％、または少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％の回収を可能にする、請求項１に記載のフロースループロセス。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１１−１２８１４７（Ｐ２０１１−１２８１４７Ａ）
【公開日】平成２３年６月３０日（２０１１．６．３０）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１０−２６３５０４（Ｐ２０１０−２６３５０４）
【出願日】平成２２年１１月２６日（２０１０．１１．２６）
【出願人】（３９００１９５８５）ミリポア・コーポレイション (212)
【氏名又は名称原語表記】ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年６月３０日（２０１１．６．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２６３５０４（Ｐ２０１０−２６３５０４）
【出願日】平成２２年１１月２６日（２０１０．１１．２６）
【出願人】（３９００１９５８５）ミリポア・コーポレイション (212)
【氏名又は名称原語表記】ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
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