大腸癌の判別方法
【課題】糖鎖の変化に関連して大腸癌の悪性度や転移性を高い信頼性で識別をする方法を提供する。
【解決手段】大腸癌の判別方法は、大腸癌の腫瘍組織から採取した検体に、フコースα１→６特異的レクチンであって、
（１）担子菌から抽出することができ、
（２）ＳＤＳ電気泳動法による分子量が４，０００〜４０，０００であり、及び、
（３）フコースα１→６糖鎖に対して結合定数１．０×１０４Ｍ−１以上（２５℃において）で示される親和性を有するフコースα１→６特異的レクチンを作用させることを含む。
【解決手段】大腸癌の判別方法は、大腸癌の腫瘍組織から採取した検体に、フコースα１→６特異的レクチンであって、
（１）担子菌から抽出することができ、
（２）ＳＤＳ電気泳動法による分子量が４，０００〜４０，０００であり、及び、
（３）フコースα１→６糖鎖に対して結合定数１．０×１０４Ｍ−１以上（２５℃において）で示される親和性を有するフコースα１→６特異的レクチンを作用させることを含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大腸癌の判別方法に関し、より詳細には、悪性や転移性の大腸癌を判別する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、大腸癌は、日本人の中で罹患率が増加傾向にある。主要部位別の統計でも、男女共、胃癌、肺癌に次ぐ第３位である。大腸癌は、癌の発生及び進行に伴って複数の癌関連遺伝子が関与する多段階発癌過程をとる。具体的には、ＡＰＣ等の癌抑制遺伝子異常により大腸ポリープができ、癌遺伝子ｒａｓの変異による活性化、癌抑制遺伝子ｐ５３の変異による不活性化等の異常が加わると、ポリープは肥大化及び癌化する。さらに、別の癌遺伝子の異常により、癌が浸潤や転移するようになる。大腸癌と診断されても、その詳細は、腫瘍組織を除去すれば問題のない良性のものから、小さくても転移しやすい悪性度の高いものまで多様である。
【０００３】
大腸癌は、早期に発見できれば、治癒が比較的容易である。単純なポリペクトミーから粘膜切除術も近年積極的に行なわれるようになってきた。また、手術による治療法も、癌が大腸壁中にどの程度深く入っているか、リンパ節転移、遠隔転移の有無等で規定される臨床病期や悪性度に応じて異なる。したがって、大腸癌の完全治癒を目指すには、早期発見と正確な臨床病理的な診断が重要である。
【０００４】
大腸癌の診断では、一般的に、注腸造影検査、内視鏡検査、腫瘍マーカー、各種画像診断等が行われる。大腸癌が疑われる場合、生検を行ない、癌の組織学的悪性度、脈管への浸潤等の病理診断が行われる。
【０００５】
病理診断では、病理医が摘出した組織や臓器を肉眼で見て、病変の部位、大きさ、性状、広がりを確認し、診断に必要な部分を切り取って生体試料標本とする。その生体試料標本を病理医が顕微鏡で観察し、組織的悪性度（分化度）の確認、手術で断端が完全に取り切れたかどうかのチェック、追加治療が必要かどうか、脈管やリンパ管への浸潤等を判断し、臨床医に伝える。病理診断にとって癌組織の悪性度を判断することが大事であるが、この悪性度を正確に判断することは、熟練を要し、病理医の専門性の高い領域である。
【０００６】
糖鎖は、タンパク質の翻訳後修飾を担う生体高分子であり、癌の発症に伴ってその構造が変化する。大腸癌では、ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＣＡ５０、ＣＳＬＥＸ（シアリルＬｅｘ抗原）、ＳＬＸ（シアリルＬｅｘ−ｉ抗原）、ＳＴＮ（シアリルＴｎ抗原）等の糖鎖関連の癌関連抗原が腫瘍マーカーとして利用されている。
【０００７】
糖鎖は、大腸癌の悪性度や転移性にも関与していると推測される。例えば、非特許文献１には、Ｄｕｋｅｓ分類やＴＭＮ分類のＧｒａｄｅの低い大腸癌では、Ｎ型糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにα１→６結合でフコース（コアフコースともいう）を付加するＦＵＴ８の酵素活性が高い値を示し、上記分類のＧｒａｄｅが高くなる、すなわち悪性度が高くなると、ＦＵＴ８の活性は有意に低下すると報告されている。
【０００８】
癌化に伴う細胞表面の糖鎖構造の変化や転移に関わる情報を得るために、糖鎖に結合するレクチンを利用することが考えられる。従来、上記コアフコースを検出するレクチンとして、ヒイロチャワンタケレクチン（ＡＡＬ）が知られている。ＡＡＬは、α１→２、α１→３、α１→４やα１→６結合のフコースと親和性を有する。しかし、後述の実施例に示すように、ＡＡＬを用いた検出方法では、原発癌と転移癌との間や悪性度の違いで有意差がでない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｖｏｌ １２３ Ｉｓｓｕｅ ３， Ｐａｇｅｓ ６４１−６４６，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ α（１，６）ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ
【非特許文献２】Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ． ２００８ Ｍａｒ ２８ ３７０， ２５９−２６３ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｎ ａｌｌ−ｉｎ−ｏｎｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｇｌｙｃａｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｆｏｒｍａｌｉｎ−ｅｍｂｅｄｄｅｄ ｔｉｓｓｕｅ ｓｅｃｔｉｏｎｓ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
そこで、本発明の課題は、大腸癌の悪性化や転移に伴う糖鎖構造の変化を、レクチンを用いて容易に判別する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、フコースα１→６糖鎖とのみ特異的に結合するレクチンを新規に単離した。このレクチンを用いて大腸癌腫瘍組織を組織学的に精査したところ、大腸癌腫瘍組織は癌化によりフコースが増加するが、悪性度の高い癌や転移癌ではα１→６結合フコースが減少していることを確認した。本発明者らはこれらの知見をもとに本発明を完成させた。すなわち、本発明は、大腸癌の腫瘍組織から採取した検体に、
（１）担子菌から抽出することができ、
（２）ＳＤＳ電気泳動法による分子量が４，０００〜４０，０００であり、及び、
（３）フコースα１→６糖鎖に対して結合定数１．０×１０４Ｍ−１以上（２５℃において）で示される親和性を有する
フコースα１→６特異的レクチンを作用させることを含む、大腸癌の判別方法を提供する。
【００１２】
上記レクチンは、フコースα１→６を有する糖鎖、糖ペプチドや糖タンパク質に対して結合定数１．０×１０４Ｍ−１以上という、従来よりも極めて高い親和性を有し、すなわち、フコースα１→６糖鎖構造を有する糖鎖を特異的に認識する。この特異性を利用した本発明は、悪性や転移性の大腸癌を判別することができる。すなわち、大腸癌で悪性度の低いものや原発癌では、α１→６結合フコースを含むL-フコース全般が増加する。一方、大腸癌の悪性度が高いものや転移癌では、α１→６結合フコースが減少する傾向がある。そこで、一次スクリーニングで大腸癌と診断された者の大腸癌の腫瘍組織に上記フコースα１→６特異的レクチンを作用させ、α１→６結合フコースの量を調べると、悪性度の高い大腸癌や転移癌の判別が可能となる。
【００１３】
前記フコースα１→６特異的レクチンは、さらに、（４）フコースα１→６糖鎖を含まないハイマンノース糖鎖及び／又は糖脂質に対して実質的に結合しないことが好ましい。
【００１４】
前記担子菌は、例えばモエギタケ科、キシメジ科、テングタケ科又はタコウキン科に属する。前記担子菌は、特にツチスギタケ、スギタケ、ヌメリスギタケモドキ、サケツバタケ、クリタケ、コムラサキシメジ又はベニテングタケである。
【００１５】
前記検体には、便潜血検査、腫瘍マーカー、直腸指診、大腸内視鏡検査、バリウム注腸二重撮像法及びＣＴ（コンピュータ断層撮影）からなる群の少なくとも一種により大腸癌と診断されたものであることが好ましい。
【００１６】
非特許文献２には、ヒイロチャワンタケレクチン（ＡＡＬ）、レンズマメレクチン（ＬＣＡ）、エンドウマメレクチン（ＰＳＡ）、ラッパスイセンレクチン（ＮＰＡ）、ソラマメレクチン（ＶＦＡ）、麹菌レクチン（ＡＯＬ）、ニホンニワトコレクチン（ＳＳＡ）、セイヨウニワトコレクチン（ＳＮＡ）、キカラスウリレクチン（ＴＪＡ）、ヒマレクチン（ＲＣＡ１２０）、ＰＨＡ（インゲンマメレクチン）、ドリコスマメレクチン（ＤＳＡ）、ラッパスイセン（ＮＰＡ）、ナタマメレクチン（ＣｏｎＡ）、スノードロップレクチン（ＧＮＡ）、アマリリスレクチン（ＨＨＡ）、トマトレクチン（ＬＥＬ）、ジャガイモレクチン（ＳＴＡ）、イラクサレクチン（ＵＤＡ）、ジャックフルーツレクチン（Ｊａｃａｌｉｎ）、ハリエニシダレクチン（ＵＥＡ−Ｉ）、ミヤゴグサレクチン（Ｌｏｔｕｓ）、イヌエンジュレクチン（ＭＡＭ）で大腸癌の組織がレクチン染色で陽性であることが報告されており、前記検体には、前記レクチンからなる群から選ばれる少なくとも一種を用いたレクチン染色で陽性であったものを用いることが可能である。より好ましくは、前記検体には、ＡＡＬ、ＬＣＡ、ＰＳＡ、ラッパスイセンレクチン、ソラマメレクチン、麹菌レクチン、ＵＥＡ−Ｉ及びＬｏｔｕｓからなる群から選ばれる少なくとも一種を用いたレクチン染色で陽性であったものを用いてもよい。
【００１７】
前記検体には、フコシル化反応に必須のドナー基質であるＧＤＰ−フコースの合成経路の酵素の一つであるＧＤＰ−マンノースデヒドロゲナーゼ（ＧＭＤ）を認識する抗ＧＭＤ抗体を用いた組織染色で陽性であったものを用いてもよい。
【００１８】
前記判別方法は、例えば標識した前記フコースα１→６特異的レクチンで前記検体をレクチン染色することからなる。
【００１９】
前記レクチン染色は、フコースα１→６特異的レクチンによる大腸癌の腫瘍組織の染色結果が、正常細胞の場合と同等かあるいはそれ以下であったら、悪性度が高いということを示唆することを含む。
【００２０】
前記悪性度が高いとは、大腸がんが将来転移しやすいこと、又は、分化度が未分化であることをいう。
【００２１】
本発明は、また、フコースα１→６特異的レクチンであって、
（１）担子菌から抽出することができ、
（２）ＳＤＳ電気泳動法による分子量が４，０００〜４０，０００であり、及び、
（３）フコースα１→６糖鎖に対して結合定数１．０×１０４Ｍ−１以上（２５℃において）で示される親和性を有する
前記フコースα１→６特異的レクチンを含む、大腸癌判別用診断薬又はキットを提供する。
【００２２】
前記大腸癌判別用診断薬又はキットには、大腸癌の一次スクリーニング用として、ＡＡＬ及び／又は抗ＧＭＤ抗体を含むことが好ましい。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の大腸癌の判別方法及び大腸癌判別用診断薬又はキットによれば、大腸癌患者等から採取された腫瘍組織を用いて調製された検体中の脱フコシル化を新規なα１→６特異的レクチンで検出することで、大腸癌の悪性度を客観的に評価できる可能性がある。すなわち、癌組織の一部にフコシル化欠損部を有する腫瘍は、将来的にどこか他の臓器に転移する可能性が高い悪性度の高い癌という予測診断ができる。また、転移リンパ節の染色から、悪性度を予測し、免疫療法、抗体医薬、抗がん薬等の治療法の選択の指標となり得る。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】ＡＡＬを用いた糖タンパク質のＥＬＩＳＡによる検出結果を示す。
【図２】調製例１のＰＴＬのイオン交換クロマトグラフィーの溶出図である。
【図３】調製例１のＰＴＬのアフィニティクロマトグラフィーの溶出図である。
【図４】ＰＴＬを用いた糖タンパク質のＥＬＩＳＡによる検出結果を示す。
【図５】ＳＲＬを用いた糖タンパク質のＥＬＩＳＡによる検出結果を示す。
【図６】大腸癌腫瘍組織をＡＡＬ、ＰＴＬ又は抗ＧＭＤ抗体を用いて染色した際に、染色強度に基づいて分類０〜３に分けた顕微鏡写真（図面代用）である。
【図７】大腸癌腫瘍組織のＡＡＬ染色において、原発癌と転移癌との陽性率（分類０〜３に占める分類２〜３の割合）を比較した図である。
【図８】大腸癌腫瘍組織のＡＡＬ染色の陽性率をＧｒａｄｅ（悪性度）別に比較した図である。
【図９】大腸癌腫瘍組織のＰＴＬ染色の陽性率を原発癌と転移癌とで比較した図である。
【図１０】大腸癌腫瘍組織のＰＴＬ染色の陽性率をＧｒａｄｅ別に比較した図である。
【図１１】大腸癌腫瘍組織のＡＡＬ染色において分類３（強陽性）を示した組織と同一ロットの組織を用いてＰＴＬ染色した際の陽性率を、原発癌と転移癌とで比較した図である。
【図１２】図１１のＡＡＬ染色及びＰＴＬ染色の顕微鏡写真（図面代用）を示す。
【図１３】大腸癌腫瘍組織の抗ＧＭＤ抗体を用いた免疫染色した際の陽性率を原発癌と転移癌とで比較した図である。
【図１４】大腸癌腫瘍組織の抗ＧＭＤ抗体を用いて免疫染色した際のＧｒａｄｅ別の陽性率を比較した図である。
【図１５】レクチンの糖結合性を調べるために使用したα１→６フコースオリゴ糖及び非α１→６フコースオリゴ糖の構造図である。
【図１６】レクチンの糖結合性を調べるために使用したフコースα１→６オリゴ糖及び非フコースα１→６オリゴ糖の構造図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下に、本発明の大腸癌の判別方法の一実施形態を説明する。本発明の方法は、大腸癌の腫瘍組織から採取した検体に、特定のフコースα１→６特異的レクチンを作用させることからなる。このレクチンで大腸癌腫瘍組織を染色すると、原発癌と転移癌とで陽性率に差が現れる（図９）。また、悪性度の違いでも陽性率に差が現れる（図１０）。本発明の方法がこの効果を奏するには、検体は、大腸癌の生検もしくは手術によって大腸癌と診断された腫瘍組織である必要がある。一次スクリーニングとして、従来公知の方法を用いることができる。例えば、腫瘍マーカー等が挙げられる。
【００２６】
上記腫瘍マーカーには、ＣＡ１９−９（ハプテン構造：２→３シアリルＬｅａ）、Ｃ−５０（２→３シアリルＬｅａ）、ＫＭ０１（２→３シアリルＬｅａ）ＣＡ１９５（ＬｅａとシアリルＬｅａ）等がある。これらの腫瘍マーカーを検出する手段には、腫瘍マーカーに特異的なモノクローナル抗体、腫瘍マーカーと親和性を有するレクチン等を用いることができる。
【００２７】
ＡＡＬは、図１の糖結合特異性の調査結果に示すように、α１→６結合フコースとα１→６結合以外のフコースとに親和性を有する。さらに、実施例１に示すように、ＡＡＬは、原発癌及び転移癌のいずれにも高い陽性率（図７）を示し、また、悪性度と陽性率との間で相関がない（図８）点で、大腸癌の一次スクリーニング用に好適である。
【００２８】
上記レクチンを用いた大腸癌の検出方法には、従来公知のレクチン染色が有効である。
【００２９】
レクチン染色の一例を以下に説明する。まず、腫瘍組織から検体を薄く切り出し、その薄片をガラスプレートに貼り付ける。ブロッキングバッファーにプレートを浸し、室温で緩く攪拌する。適宜、内因性ペルオキシダーゼ不活性化を行う。ビオチン標識レクチン溶液（２〜５μｇ／ｍｌにブロッキングバッファーで希釈）にメンブレンを浸し、室温で１時間、緩く撹拌する。西洋わさび由来ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識アビジン溶液にプレートを浸し、室温で緩く攪拌する。発色液にプレートを浸し、室温で数分間発色させる。発色が十分確認できたら純水で洗浄し、反応を停止させる。発色した組織を光学顕微鏡で観察する。レクチン染色には、市販のレクチン染色キットを用いることができる。
【００３０】
大腸癌の検出には、従来公知のレクチン染色のほかに、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）法も採用可能である。また、ＦＡＣＳ法を用いて、本発明の大腸癌の判別方法も可能である。ＦＡＣＳ法は、細胞等の粒子１個ずつから、大きさ等の形態の情報、ならびに、ＤＮＡ／ＲＮＡ蛍光染色や、タンパク等を蛍光抗体で染色した蛍光の情報を得ることができる。既に、疾病診断の分野では、白血病や悪性リンパ腫等の造血器腫瘍の診断に応用されている。本発明の判別方法では、例えば、以下のように行うことができる。３〜４ｍｍ角の大腸癌組織を細かく裁断し、１０ｍＭ リン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ ７．４、ＰＢＳ）に懸濁する。２１Ｇの針をつけた２．５ｍｌサイズのシリンジで、１０回程度強く出し入れし細胞をほぐした後、５０μｍのメッシュで細胞を濾過する。このように調製した大腸癌組織細胞に、蛍光標識したレクチンの溶液を直接的もしくは間接的に加えて、細胞とレクチンとを結合させる。その後、フローサイトメーター（例えば、ベックマンコールタール社製Ｃｙｔｏｍｉｃｓ ＦＣ ５００）で、レクチンの結合した細胞の量や割合を分析する。
【００３１】
図１３及び１４に、抗ＧＭＤ抗体を用いた大腸癌の免疫組織染色を示す。抗ＧＭＤ抗体を用いた免疫染色は、大腸癌陽性率がＡＡＬより低いものの、原発癌／転移癌や悪性度に関する陽性率の挙動がＡＡＬと似ている。したがって、抗ＧＭＤ抗体もまた、大腸癌の一次スクリーニングに使用し得る。抗ＧＭＤ抗体を用いた大腸癌の検出法には、従来公知の免疫染色法等を採用する。
【００３２】
本発明の大腸癌の判別方法には、化学式：
【化１】
〔式中、Ｍａｎはマンノース、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン、Ｆｕｃはフコースを意味する〕
示されるような糖鎖中のフコースα１→６結合を特異的に認識するレクチンの使用が必須である。本発明者らが単離した新規なレクチンは、本発明の大腸癌の判別方法に最適である。このレクチンを以下に詳述する。
【００３３】
（１）レクチンの由来
フコースα１→６特異的レクチンの由来となる原料は、担子菌である。担子菌の中でも、モエギタケ科、キシメジ科、タコウキン科及びテングタケ科に属することが好ましい。モエギタケ科としては、ツチスギタケ、サケツバタケ、クリタケ、スギタケ、ヌメリスギタケモドキ、ヌメリスギタケ等が挙げられる。キシメジ科としては、コムラサキシメジ等が挙げられる。タコウキン科としては、シロハカワラタケ、ツヤウチワタケ等が挙げられる。テングタケ科としては、ベニテングタケ等が挙げられる。これらの担子菌のうち、レクチンのフコースα１→６糖鎖認識特異性とレクチンの回収効率の観点から、モエギタケ科、キシメジ科又はテングタケ科が特に好ましく、さらに好ましくはツチスギタケ、スギタケ、ヌメリスギタケモドキ、サケツバタケ、クリタケ、コムラサキシメジ又はベニテングタケである。
【００３４】
（２）レクチンの分子量
前記フコースα１→６特異的レクチンのＳＤＳ電気泳動法による分子量は、４，０００〜４０，０００であり、好ましくは４，０００〜２０，０００である。ここで、ＳＤＳ電気泳動法による分子量は、例えばＬａｅｍｍｉの方法（Ｎａｔｕｒｅ，２２７巻，６８０頁，１９７６年）に準じて測定されるものである。上記分子量は、本明細書において、レクチンの単量体と複合体の両方を含む意味で使用される。
【００３５】
（３）レクチンの結合定数
前記フコースα１→６特異的レクチンのフコースα１→６糖鎖に対する結合定数は、１．０×１０４Ｍ−１以上であり、好ましくは１．０×１０５Ｍ−１以上、さらに好ましくは１．０×１０６Ｍ−１以上である。すなわち、フコースα１→６に親和性を有することが従来知られているＡＡＬ、ＡＯＬ、ＬＣＡ、ＮＰＡ及びＰＳＡと比べて、結合定数が著しく高い。これは、前記フコースα１→６特異的レクチンが、従来のレクチンと比べて極めて高い選択性をもってフコースα１→６糖鎖と結合することを意味する。
【００３６】
上記結合定数は、例えばフロンタルアフィニティクロマトグラフィー（ＦＡＣ法）により測定することができる。ＦＡＣ法の詳細は、例えば、本出願人の一部が出願したＰＣＴ／ＪＰ２００９／００３３４６に記載されている。ＰＣＴ／ＪＰ２００９／００３３４６を参照のために本明細書に編入する。
【００３７】
フコースα１→６糖鎖は、その非還元末端にシアル酸を有していてもよい。従来のフコースα１→６特異的レクチン（例えばＬＣＡ、ＮＰＡ及びＰＳＡ）は、非還元末端にシアル酸を有するフコースα１→６糖鎖に対して親和性が低かった。一方、前記フコースα１→６特異的レクチンは、このような糖鎖に対しても高い親和性を有する点でも従来のものより優れる。
【００３８】
（４）レクチンの特異性
前記フコースα１→６特異的レクチンは、フコースα１→６糖鎖を含まないハイマンノース糖鎖及び／又は糖脂質に対して実質的に結合しないことが好ましい。これにより、前記フコースα１→６特異的レクチンは、より一層高い結合特異性を有する。本明細書において、「実質的に結合しない」とは、結合定数が１．０×１０３Ｍ−１以下、好ましくは１．０×１０２Ｍ−１以下、特に好ましくは０であることを意味する。
【００３９】
（５）レクチンの分岐鎖への結合
前記フコースα１→６特異的レクチンは、フコースα１→６Ｎ結合型の一本、二本、三本及び／又は四本糖鎖に対して結合定数１．０×１０４Ｍ−１以上（２５℃において）で示される親和性を有することが好ましく、より好ましくは結合定数１．０×１０５Ｍ−１以上で示される親和性を有する。
【００４０】
（６）レクチンのアミノ酸配列
フコースα１→６特異的レクチンは、特に、表１の配列番号１に示すような共通のアミノ酸構造を有する。配列番号１の第４、５、６及び７番目のＸａａは、それぞれ、Ａｓｐ／Ａｓｎ／Ｇｌｕ／Ｔｈｒ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ／Ａｌａ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ及びＧｌｎ／Ｌｙｓ／Ｇｌｕを意味し、その斜線は「又は」を意味する。
【００４１】
本発明の方法に使用し得るフコースα１→６特異的レクチンの具体例を、配列番号２〜６に示す。
【００４２】
配列番号２に示すレクチンは、ツチスギタケから抽出することのできる、分子量４，５００の新規なレクチン（以下、ＰＴＬという）である。配列番号２の第１０及び１７番目のＸａａは、任意のアミノ酸残基であってよいが、好ましくはＣｙｓである。第２０、２３、２７、３３、３５及び３９番目のＸａａは、それぞれ、Ｔｙｒ／Ｓｅｒ、Ｐｈｅ／Ｔｙｒ、Ａｒｇ／Ｌｙｓ／Ａｓｎ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ／Ｓｅｒ、Ａｓｎ／Ａｌａ、及び、Ｔｈｒ／Ｇｌｎである。ＰＴＬの糖結合特異性を図４に示す。
【００４３】
配列番号３に示すレクチンは、サケツバタケから抽出することのできる、分子量４，５００の新規なレクチン（以下、ＳＲＬという）である。配列番号３の第１０及び１７番目のＸａａは、任意のアミノ酸残基であってよいが、好ましくはＣｙｓである。第４、７、９、１３、２０、２７、２９、３３、３４及び３９番目のＸａａは、それぞれ、Ｐｒｏ／Ｇｌｙ、Ｇｌｕ／Ｌｙｓ、Ｖａｌ／Ａｓｐ、Ａｓｎ／Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｈｉｓ／Ｓｅｒ、Ｌｙｓ／Ｈｉｓ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ｇｌｙ／Ａｓｎ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、及び、Ａｒｇ／Ｔｈｒである。ＳＲＬの糖結合特異性を図５に示す。
【００４４】
配列番号４に示すレクチンは、コムラサキシメジから抽出することのできる、分子量４，５００の新規なレクチン（以下、「ＬＳＬ」という）である。配列番号４の第１０及び１７番目のＸａａは、任意のアミノ酸残基であってよいが、好ましくはＣｙｓである。第１、４、７、８、９、１３、１６、２０、２２、２５、２７、３１及び３４番目のＸａａは、それぞれ、Ａｌａ／Ｇｌｎ、Ｐｒｏ／Ｌｙｓ、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｍｅｔ／Ｉｌｅ／Ｖａｌ、Ｔｙｒ／Ｔｈｒ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｙｓ／Ｇｌｕ、Ａｌａ／Ａｓｎ、Ｖａｌ／Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ａｒｇ／Ｈｉｓ／Ａｓｎ、Ｇｌｎ／Ａｒｇ、及び、Ｔｈｒ／Ｖａｌである。
【００４５】
配列番号５に示すレクチンは、クリタケから抽出することのできる新規なレクチン（以下、「ＮＳＬ」という）である。配列番号５の第１０及び１７番目のＸａａは、任意のアミノ酸残基であってよいが、好ましくはＣｙｓである。第１３、１４及び１６番目のＸａａは、それぞれ、Ａｓｐ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｌａ、及び、Ｇｌｎ／Ｌｙｓである。
【００４６】
配列番号６に示すレクチンもまた、クリタケから抽出することのできる、分子量４，５００の新規なレクチン（以下、「ＮＳＬ」という）である。配列番号６は、配列番号５のペプチド中に１個のＡｓｎが挿入された変異体である。したがって、配列番号６の第１０及び１８番目のＸａａは、任意のアミノ酸残基であってよいが、好ましくはＣｙｓである。第１４、１５及び１７番目のＸａａは、それぞれ、Ａｓｐ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｌａ及びＧｌｎ／Ｌｙｓである。
【００４７】
配列番号２〜６のレクチンがサブユニットとなって、通常、２〜１０個、好ましくは２〜３個結合したものもまた、フコースα１→６特異的レクチンとして使用可能である。
【００４８】
【表１】
【００４９】
ＰＴＬ、ＳＲＬ、ＮＳＬ及びＬＳＬと、従来、フコース特異的レクチンといわれているＡＡＬ、ＡＯＬ、ＬＣＡ及びＰＳＡの各種糖鎖（図１５及び図１６参照）への結合定数（２５℃において）を、表２〜４に列記する。
【００５０】
【表２】
【００５１】
【表３】
【００５２】
【表４Ａ】
【００５３】
【表４Ｂ】
【００５４】
【表４Ｃ】
【００５５】
【表４Ｄ】
【００５６】
表２〜４中、ＡＡＬ及びＡＯＬは、フコースα１→６糖鎖（糖鎖Ｎｏ．１５、２０１−２０３、４０１−４１８）とともに、非α１→６である糖脂質系のフコース糖鎖（糖鎖Ｎｏ．７１８、７２２、７２３、７２７、９０９、９１０、９３３）にも結合する。また、ＬＣＡ及びＰＳＡは、フコースα１→６糖鎖を持たない多くの糖鎖（糖鎖Ｎｏ．００３、００５−０１４）にも結合する。
【００５７】
それに対して、ＰＴＬ及びＳＲＬは、フコースα１→６糖鎖に確実に結合し、かつ非フコースα１→６糖鎖やフコースを持たない糖鎖に全く結合していない。しかも、ＰＴＬの結合定数は、従来のレクチンよりも大きい（結合定数がＫａ＝１．０×１０５Ｍ−１以上）。さらに、フコースα１→６糖鎖の三本鎖（糖鎖Ｎｏ．４０７−４１３）や四本鎖（糖鎖Ｎｏ．４１８）にも強く結合する。また、シアル酸が付加されていても（糖鎖Ｎｏ．６０１、６０２）、フコースα１→６糖鎖の結合定数が下がっていない。
【００５８】
ＮＳＬ及びＬＳＬもまた、フコースα１→６糖鎖のみを検出し、非フコースα１→６糖鎖やフコースを持たない糖鎖を全く検出していない。さらに、フコースα１→６糖鎖の三本鎖や四本鎖にも強く結合する。また、シアル酸が付加されていても、フコースα１→６糖鎖に結合定数が下がらない。
【００５９】
フコースα１→６特異的レクチンは、（ａ）配列番号２〜５のいずれかに示すアミノ酸配列からなるタンパク質又はペプチドの他に、（ｂ）配列番号２〜５のいずれかに示すアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が欠失、挿入又は置換され、かつ、配列番号２〜５のいずれかに示すアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチドと機能的に同等なタンパク質又はペプチドであってもよい。ここで、「機能的に同等」とは、フコースα１→６糖鎖に対して結合定数１．０×１０４Ｍ−１以上であり、好ましくは１．０×１０５Ｍ−１以上、さらに好ましくは１．０×１０６Ｍ−１以上で示される親和性を有することを意味する。（ｂ）の変異体の一例が、配列番号６に示すタンパク質又はペプチドである。
【００６０】
前記フコースα１→６特異的レクチンは、特に好ましくはＰＴＬ、ＳＲＬ、ＮＳＬ及びＬＳＬであり、さらに好ましくはＰＴＬ及びＳＲＬである。ＰＴＬ及びＳＲＬは、従来のフコースα１→６親和性レクチンと相違して、フコースα１→６以外のフコースや、フコースを持たない高マンノース糖鎖と結合しない点で、本発明の判別方法に使用するフコースα１→６特異的レクチンとして最適である。
【００６１】
フコースα１→６特異的レクチンは、担子菌から、公知の抽出方法、分離方法、精製方法等を適宜組み合わせることにより、単離することができる。例えば、水系媒体を抽出溶媒として用いて、担子菌の水系媒体抽出物を得る工程を含む。この前記抽出物から、ＳＤＳ電気泳動法による分子量が４，０００〜４０，０００、好ましくは４，０００〜２０，０００、及び、フコースα１→６糖鎖に対する結合定数が１．０×１０４Ｍ−１以上、好ましくは１．０×１０５Ｍ−１以上、さらに好ましくは１．０×１０６Ｍ−１以上（２５℃において）で示される親和性を有するレクチンを得る。
【００６２】
前記担子菌は、モエギタケ科、キシメジ科、タコウキン科及びテングタケ科の少なくとも一種から選ばれることが好ましい。特に、ツチスギタケ（Ｐｈｏｌｉｏｔａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ Ｏｖｅｒｈｏｌｔｓ）、スギタケ（Ｐｈｏｌｉｏｔａ ｓｑｕａｒｒｏｓａ （Ｆｒ．） Ｋｕｍｍｅｒ）、ヌメリスギタケ（Ｐｈｏｌｉｏｔａ ａｄｉｐｏｓａ （Ｆｒ．） Ｋｕｍｍｅｒ）、ナメコ（Ｐｈｏｌｉｏｔａ nameko）、サケツバタケ（Ｓｔｒｏｐｈａｒｉａ ｒｕｇｏｓｏａｎｎｕｌａｔａ Ｆａｒｌｏｗ ｉｎ Ｍｕｒｒ．）、クリタケ（Ｎａｅｍａｔｏｌｏｍａ ｓｕｂｌａｔｅｒｉｔｉｕｍ （Ｆｒ．） Ｋａｒｓｔ又はＨｙｐｈｏｌｏｍａ ｓｕｂｌａｔｅｒｉｔｉｕｍ（Ｆｒ．）Ｑｕｅｌ）等のモエギタケ科、コムラサキシメジ（Ｌｅｐｉｓｔａ ｓｏｒｄｉｄａ （Ｓｃｈｕｍ． ： Ｆｒ．） Ｓｉｎｇ．）等のキシメジ科、シロハカワラタケ（Ｔｒｉｃｈａｐｔｕｍ ｅｌｏｎｇａｔｕｍ）、ツヤウチワタケ（Ｍｉｃｒｏｐｏｒｕｓ ｖｅｒｎｉｃｉｐｅｓ）等のタコウキン科、ベニテングタケ（Ａｍａｎｉｔａ ｍｕｓｃａｒｉａ）等のテングタケ科に属するものが好ましい。これらの担子菌の使用部位は、子実体であることが好ましい。
【００６３】
水系媒体と担子菌の子実体とから、水系媒体抽出物を得る方法については、水系媒体と担子菌の子実体とを接触させることができれば特に制限はない。抽出効率の観点から、水系媒体中で担子菌の子実体を粉砕して懸濁液とする方法が好ましい。また、粉砕する方法としては、ミキサー、ホモジナイザー等を用いた通常の粉砕方法を挙げることができる。
【００６４】
上記水系媒体としては、緩衝液、水と混合し得る有機溶媒と水又は緩衝液との混合物等を挙げることができる。好ましくは、緩衝液又は有機溶媒と緩衝液との混合物を用いる。
【００６５】
上記緩衝液としては、特に制限されることなく公知の緩衝液を用いることができる。中でも、ｐＨ３〜１０の範囲に緩衝能を有するものが好ましく、ｐＨ６〜８の範囲に緩衝能を有するものがより好ましい。具体的には、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス緩衝液等を挙げることができる。中でも、抽出効率の観点から、リン酸緩衝液が好ましい。
【００６６】
前記緩衝液の塩濃度は、特に制限はないが、抽出効率と緩衝能の点から、１〜１００ｍＭであることが好ましく、５〜２０ｍＭであることがより好ましい。
【００６７】
前記緩衝液は、さらに塩類を含むことができる。例えば、リン酸緩衝液に食塩を更に加えたリン酸緩衝化生理食塩水等は、水系媒体として好ましい。
【００６８】
前記有機溶媒としては、水と混合し得る有機溶媒であれば特に制限なく用いることができる。中でも、アセトン、メタノール、エタノール、２−プロパノール及びアセトニトリルが好ましい。有機溶媒と水又は緩衝液とを混合する場合の有機溶媒の含有量としては、１０〜４０質量％であることが好ましい。
【００６９】
前記抽出工程は、水系媒体と担子菌の子実体との混合物から、水系媒体に対する不溶物を除去する工程を更に含むことが好ましい。不溶物の除去方法としては、濾過、遠心分離等の方法を挙げることができるが、除去効率の観点から遠心分離が好ましい。
【００７０】
前記抽出工程は、リン酸緩衝化生理食塩水中で、担子菌の子実体を粉砕し、遠心分離によって不溶物を除去して水系媒体抽出物を得る工程であることが特に好ましい。
【００７１】
前記フコースα１→６特異的レクチンの製造方法では、以下のいずれかの精製手段を採用すると、一層効率的な精製が可能となる。
【００７２】
（精製方法１）
上記工程によって得られた水系媒体抽出物を、硫酸アンモニウム沈殿法にかけることによってレクチン含有画分を得て、得られたレクチン画分を疎水クロマトグラフィー及び逆相クロマトグラフィーで精製する。
【００７３】
（精製方法２）
上記工程によって得られた水系媒体抽出物を、チログロブリンをアガロース等に固定した担体を用いたアフィニティクロマトグラフィーに供して精製する。
【００７４】
（精製方法３）
上記工程によって得られた水系媒体抽出物を、硫酸アンモニウム沈殿法にかけることによってレクチン含有画分を得て、透析凍結乾燥を行った後、粗レクチン画分をトリス緩衝液に溶解後、イオン交換クロマトグラフィーに供し、得られた活性画分を濃縮後、ゲルろ過クロマトグラフィーで分離する。
【００７５】
フコースα１→６特異的レクチンの製造方法には、前記精製工程で得られたレクチンを含む画分を透析処理する工程と、透析処理後のレクチン溶液を凍結乾燥する工程とを含んでもよい。これにより、レクチンを容易に単離することができる。透析処理する工程及び凍結乾燥する工程は、通常用いられる公知の方法によって行うことができる。
【００７６】
（ａ）配列番号２〜５のいずれかに示すアミノ酸配列からなるタンパク質又はペプチド、若しくは、（ｂ）配列番号２〜５のいずれかに示すアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が欠失、挿入又は置換され、かつ、配列番号２〜５のいずれかに示すアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチドと機能的に同等なタンパク質又はペプチドであるフコースα１→６特異的レクチンは、天然植物からの抽出のほかに、天然由来とは異なる宿主内で人工的に発現させ、又は化学合成させてもよい。宿主内での発現や化学合成は、通常用いられる公知の方法によって行うことができる。
【００７７】
大腸癌患者から採取された腫瘍組織は、適宜、凍結保存や、ホルマリン、パラフィン、パラホルムアルデヒド等の固定液で固定することができる。凍結保存等した腫瘍組織から切片を作成し、上記フコースα１→６特異的レクチンを作用させる検体とする。
【００７８】
上記フコースα１→６特異的レクチンを検体に作用させる方法は、上記ＡＡＬと同様である。特に、組織の形態を維持しながら観察するレクチン染色が好ましい。
【００７９】
フコースα１→６特異的レクチンによるレクチン染色では、通常、レクチンに標識手段が組み込まれている。標識手段は、特に制限なく、公知の標識化方法を適用可能である。例えば、放射性同位元素による標識化、標識化合物の結合等を挙げることができる。標識化合物としては、この用途に適したものであれば特に制限なく、例えば、直接又は間接標識化合物、酵素若しくは蛍光化合物を挙げることができる。具体的には、ビオチン、ジゴキシゲニン、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ、フルオレセインイソチオシアネート、ＣｙＤｙｅ等を挙げることができる。これらの標識化合物は、常法によりレクチンと結合させることができる。
【００８０】
標識したフコースα１→６特異的レクチンでのレクチン染色の手順は、ＡＡＬによる一次スクリーニングで説明したものと同様である。
【００８１】
大腸癌の悪性度の低いもの（例えば低転移性の原発癌）では、α１→６結合フコースが大腸組織の正常細胞よりも増加する。一方、大腸癌の悪性度が高いもの（例えば転移癌や、今後、転移が予測される原発癌）では、α１→６結合フコースが正常細胞と同等か正常細胞よりも減少する傾向がある。
【００８２】
レクチン染色において、フコースα１→６特異的レクチンによる大腸癌の腫瘍組織の染色結果が、正常細胞の場合と同等かあるいはそれ以下であったら、大腸癌の悪性又は転移性を疑う。
【００８３】
前記悪性は、転移しやすい、あるいは局所浸潤しやすいことを意味する。一般的に、未分化癌は分化癌に較べて悪性度が高いと言われている。
【００８４】
本発明は、また、フコースα１→６特異的レクチンであって、
（１）担子菌から抽出することができ、
（２）ＳＤＳ電気泳動法による分子量が４，０００〜４０，０００であり、及び、
（３）フコースα１→６糖鎖に対して結合定数１．０×１０４Ｍ−１以上（２５℃において）で示される親和性を有するフコースα１→６特異的レクチンを含む、大腸癌判別用診断薬又はキットを提供する。上記レクチンは、標識されていることが好ましい。
【００８５】
上記診断薬又はキットには、適宜、緩衝液、プレートガラス等のレクチン染色キットに公知のものを含む。大腸癌の一次スクリーニング用として、ＡＡＬ及び／又は抗ＧＭＤ抗体を含むことが好ましい。
【実施例】
【００８６】
以下に、本発明の実施例を示して、本発明をより詳細に説明する。しかし、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
〔調製例１〕ＰＴＬの製造
以下に示す精製工程に従って、ツチスギタケからツチスギタケレクチン（ＰＴＬ）を単離精製した。
【００８７】
（抽出）
ツチスギタケ約７．５ｇを凍結乾燥して得られたツチスギタケ凍結乾燥粉末２．５ｇに、１０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７．２）５０ｍｌを加えて、４℃下で２時間抽出した。この液を、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ、４℃）後、上清をガーゼろ過して１回目の抽出液を得た。この抽出残渣に、１０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７．２）を５０ｍｌ加えて、４℃下で一晩抽出した。この液を遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ、４℃）後、上清をガーゼろ過して２回目の抽出液を得た。これらの抽出液を合わせてろ紙でろ過し、ツチスギタケ抽出液とした。
【００８８】
（イオン交換クロマトグラフィー）
上記抽出液８７ｍｌを、１０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７．２）で平衡化したＤＥＡＥ−セファロース（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に供した。同緩衝液でカラムを洗浄後、０．１Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７．２）で溶出した。赤血球凝集活性を示す画分（図２の←→部）を合一し、限外ろ過で脱塩後凍結乾燥した。
【００８９】
（アフィニティクロマトグラフィー）
上記凍結乾燥粉末を、１０ｍＭ リン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．４、以後、ＰＢＳと略す）で溶解し、同緩衝液で平衡化したチログロブリン固定化アガロースに供した。ＰＢＳでカラムを洗浄後、０．２Ｍ アンモニアで溶出した。赤血球凝集活性を示す画分（図３の←→部）を合一し、限外ろ過で純水に置換後、凍結乾燥し、ＰＴＬを１．０７ｍｇ得た。
【００９０】
〔実施例１〕大腸癌腫瘍組織の組織染色
ＡＡＬは、α１→２、α１→３、１−４、及び１→６結合のフコースを認識し、ＰＴＬはα１→６結合のフコースを特異的に認識する。そのため、この２種類のレクチンによる染色レベルを比較することにより、フコシル化の結合様式の違いを知ることができる。
【００９１】
ヒト大腸癌腫瘍組織アレイに対して、ＰＴＬ、ＡＡＬ及び抗ＧＭＤ抗体による免疫組織染色を行った。正常組織の中の実質細胞は、わずかに褐色に染まる。その染色レベルを、本明細書では、「弱陽性（分類１）」と定義した。この染色レベルを基準として、染色結果と名称を表５のように分類した。
【００９２】
【表５】
【００９３】
（ＡＡＬによる組織染色）
組織染色の試料として、組織アレイ（倉敷紡績株式会社製、合計１９７例の大腸癌腫瘍組織及び正常組織）を入手した。この組織を脱パラフィンした後、ＰＢＳにて洗浄し、Ｄａｋｏ ＡＢＩＤＩＮ ＳＯＬＵＴＩＯＮ／ＢＩＯＴＩＮ ＳＯＬＵＴＩＯＮ （Ｄａｋｏ社）を用いてブロッキング処理（ａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎ ｂｌｏｃｋｉｎｇ）を行った。次いで、Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ （Ｄａｋｏ社）で内因性ペルオキシダーゼ不活性化を行い、５％子ウシ血清アルブミンを含む１０ｍＭ トリス干緩衝化生理食塩水（０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む）（以下、５％ＢＳＡ−ＴＢＳＴと記載する）を用いて４℃にて一昼夜、振蘯させた。５％ＢＳＡ−ＴＢＳＴにて、ビオチン標識ＡＡＬを５μｇ／ｍｌに希釈した。希釈したビオチン標識レクチンを上記組織アレイに添加して、室温にて１時間反応させ、ＰＢＳにて洗浄した。予め５％ＢＳＡ−ＴＢＳＴにてＡＢＣ ＲＥＡＧＥＮＴ（フナコシ社）を５０倍希釈して振蘯させたものを添加し、室温で３０分間、反応させた。Ｄａｋｏ ＥＮＶＩＳＩＯＮキット／ＨＲＰ ＤＡＢ基質キット（Ｄａｋｏ社）を５０倍希釈した後、組織アレイに添加して、１０×４０倍の顕微鏡で発色を確認した。分類０〜３の顕微鏡写真を図６に示す。
【００９４】
１）原発癌と転移癌との違いによる群分けと組織染色の結果
ＡＡＬ染色した大腸癌症例１２８例を、原発癌又は転移癌の２種類に分類した。結果を表６に示す。
【００９５】
【表６】
【００９６】
表６中、全分類に占める分類２及び３の割合を、大腸癌の陽性率と定義した。そして、図７に、原発癌と転移癌とでＡＡＬ染色の陽性率を比較したグラフを示す。陽性率について、カイ二乗検定法による有意差検定を行った。ＡＡＬ染色では、原発癌、転移癌ともに、強陽性のものが多く、有意差は見られなかった。
【００９７】
２）悪性度による群分けと組織染色の結果
組織アレイの添付書には、大腸癌の悪性度に応じてＧｒａｄｅ １〜３までの等級が付けられていた。Ｇｒａｄｅが上がることは、組織学的悪性度が高くなることを意味するが、Ｇｒａｄｅに関する詳しい説明は添付書になかった。そこで、各Ｇｒａｄｅの腺癌組織を観察し、Ｇｒａｄｅを表７に示すように定義した。さらに、Ｇｒａｄｅ ２及びＧｒａｄｅ ３を、悪性と評価した。
【００９８】
【表７】
【００９９】
大腸癌症例１１２例をＧｒａｄｅ別に分類し、Ｇｒａｄｅ間でのＡＡＬ染色結果の比較を行った。結果を表８に示す。
【０１００】
【表８】
【０１０１】
表８に示すとおり、ＡＡＬ染色では、Ｇｒａｄｅに関係なく強陽性のものが多かった。図８に、Ｇｒａｄｅ（悪性度）別の陽性率を示す。Ｇｒａｄｅ間の陽性率について、カイ二乗検定法により有意差検定を行った。Ｇｒａｄｅ間で陽性率の有意な差は見られなかった。
【０１０２】
（ＰＴＬによる組織染色）
レクチン染色の検体として、ＡＡＬ染色と同じ組織アレイ（倉敷紡績株式会社製）を入手した。この組織を脱パラフィンした後、ＰＢＳにて洗浄し、Ｄａｋｏ ＡＢＩＤＩＮ ＳＯＬＵＴＩＯＮ／ＢＩＯＴＩＮ ＳＯＬＵＴＩＯＮ （Ｄａｋｏ社）を用いてａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎ ｂｌｏｃｋｉｎｇを行った。Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ （Ｄａｋｏ社）で内因性ペルオキシダーゼ不活性化を行い、５％ＢＳＡ−ＴＢＳＴを用いて４℃にて一昼夜、振蘯させた。
【０１０３】
５％ＢＳＡ−ＴＢＳＴにて、ビオチン標識ＰＴＬを５０μｇ／ｍｌに希釈した。組織アレイに希釈したレクチンを添加して、室温にて１時間反応させ、ＰＢＳにて洗浄した。予め５％ＢＳＡ−ＴＢＳＴにてＡＢＣ ＲＥＡＧＥＮＴ（フナコシ社）を５０倍希釈して振蘯させたものを添加し、室温で３０分間、反応させた。Ｄａｋｏ ＥＮＶＩＳＩＯＮキット／ＨＲＰ ＤＡＢ基質キット（Ｄａｋｏ社）を５０倍希釈した後、組織アレイに添加して、１０×４０倍の顕微鏡で発色を確認した。
【０１０４】
１）原発癌と転移癌との違いによる群分けと組織染色の結果
ＰＴＬで染色した大腸癌症例１１６例を、原発癌又は転移癌の２種類に分類した。結果を表９に示す。
【０１０５】
【表９】
【０１０６】
表９に示すとおり、転移癌は、原発癌と比べて、分類２及び３の割合が減少していた。図９に、原発癌と転移癌との陽性率を比較したグラフを示す。カイ二乗検定法による有意差検定を行ったところ、原発癌と転移癌の間との間で陽性率に有意な差が見られた（Ｐ＜０．０１）。
【０１０７】
２）悪性度による群分けと組織染色の結果
大腸癌症例１１４例をＧｒａｄｅ別に分類し、Ｇｒａｄｅ間での染色結果の比較を行った。結果を表１０に示す。
【０１０８】
【表１０】
【０１０９】
表１０に示すとおり、ＰＴＬ染色では、Ｇｒａｄｅ ２及びＧｒａｄｅ ３において、分類２及び３の割合が減少した。図１０に、各Ｇｒａｄｅでの陽性率を示す。カイ二乗検定法により有意差検定を行ったところ、Ｇｒａｄｅ １とＧｒａｄｅ ２及びＧｒａｄｅ ３との間で、陽性率に有意な差が見られた（ｐ＜０．０５）。
【０１１０】
上記のＡＡＬ染色及びＰＴＬ染色の結果から、以下のことが判明した。ＡＡＬで認識されるα１→２、α１→３、１−４、及び１→６結合を含む総体的なフコシル化は、癌化により増加した。一方、悪性度の高い癌や転移癌では、フコシル化には変化がないが、ＰＴＬで認識されるα１→６結合のフコシル化が低下した。
【０１１１】
（ＡＡＬ染色とＰＴＬ染色の併用）
上記ＡＡＬ染色で分類３（強陽性）となった原発癌及び転移癌の症例８８例から、同一ロットの組織を準備し、さらにＰＴＬ染色した。結果を表１１に示す。
【０１１２】
【表１１】
【０１１３】
表１１に示すとおり、原発癌ではＡＡＬ染色が「強陽性」であれば、ＰＴＬ染色も「強陽性」もしくは「陽性」である組織が多数を占めた。一方、転移癌では、ＡＡＬ染色で「強陽性」であっても、ＰＴＬ染色では「弱陽性」もしくは「陰性」のものが多数を占めた。図１１に、原発癌と転移癌の間で陽性率を比較したグラフを示す。カイ二乗検定法により有意差検定を行ったところ、原発癌と転移癌との間で陽性率に有意差が見られた（ｐ＜０．０１）。図１２には、組織アレイの同一サンプルでＡＡＬ染色が強陽性かつＰＴＬ染色が陰性となった顕微鏡写真を示す。
【０１１４】
原発癌ではＡＡＬで認識されるα１→２、α１→３、１−４及び１→６結合のフコシル化が総体的に増加しているが、転移癌ではα１→６結合のフコシル化が低下する傾向にあることがさらに明確になった。これらの知見をもとに、大腸の組織細胞をＡＡＬ染色して大腸癌を一次スクリーニングし、大腸癌と診断された検体についてＰＴＬ染色することで、大腸癌のリンパ節転移を含めた悪性度の予測診断として、情報を得ることができる。
【０１１５】
〔応用例１〕
本発明の大腸癌の判別方法に供する大腸癌の腫瘍組織の一次スクリーニングとして、抗ＧＭＤ抗体によるアッセイが可能であるか調査した。
【０１１６】
（抗ＧＭＤ抗体による免疫染色）
免疫組織染色のサンプルとして、レクチン免疫染色と同じで２種類の組織アレイによる合計１４３例の大腸癌腫瘍組織及び正常組織を入手した。この組織を脱パラフィンした後、内因性ペルオキシダーゼ不活性化までレクチン免疫染色と同様に処理をした。
【０１１７】
Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｌｏｃｋ Ｓｅｒｕｍ−Ｆｒｅｅ Ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅ（Ｄａｋｏ社）を添加して１０分静置した。ＰＢＳで洗浄後、抗ＧＭＤ抗体（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １７， １３１１−１３２０， ２００７参照。阪大三善研にて作成）をＤａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｉｌｕｅｎｔ（Ｄａｋｏ社）で５μｇ／ｍｌに希釈したものを添加し、４℃にて一昼夜反応させた。
【０１１８】
ＰＢＳで洗浄後、Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ Ｅｎｖｉｓｉｏｎ＋Ｒ Ｓｙｓｔｅｍ Ｌａｂｅｌｌｅｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ−ＨＲＰ Ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ（Ｄａｋｏ社）で作製した２次抗体を添加して３０分室温で反応させた。以降、レクチン免疫染色と同様にして、発色を観察した。
【０１１９】
１）原発癌と転移癌との違いによる群分けと組織染色の結果
免疫染色した大腸癌症例１１２例を、原発癌又は転移癌の２種類に分類した。結果を表１２に示す。
【０１２０】
【表１２】
【０１２１】
表１２に示すとおり、免疫染色は、分類０（陰性）及び分類１（弱陽性）の割合が高かった。図１３に、原発癌と転移癌とで免疫染色の陽性率を比較したグラフを示す。カイ二乗検定法による有意差検定を行ったところ、原発癌と転移癌とで陽性率に有意差は見られなかった。
【０１２２】
２）悪性度による群分けと組織染色の結果
大腸癌症例８６例をＧｒａｄｅ別に分類し、Ｇｒａｄｅ間での染色結果の比較を行った。結果を表１３に示す。
【０１２３】
【表１３】
【０１２４】
表１３に示すとおり、免疫染色では、Ｇｒａｄｅに関係なく、陰性及び弱陽性のものが多かった。図１４に、Ｇｒａｄｅ（悪性度）別の陽性率を示す。Ｇｒａｄｅ間の陽性率について、カイ二乗検定法により有意差検定を行ったが、Ｇｒａｄｅ間で陽性率の有意な差は見られなかった。
【０１２５】
抗ＧＭＤ抗体を用いた免疫染色の結果は、陽性率は低いものの、ＡＡＬ染色と同様の挙動を示した。このことから、ＡＡＬの代わりに抗GMD抗体を用いて、大腸癌患者の一次スクリーニングを行い、大腸癌と診断された患者の検体をさらにＰＴＬ等のフコースα１→６特異的レクチンで染色することで、実施例１と同様の結果が得られることが予想される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大腸癌の判別方法に関し、より詳細には、悪性や転移性の大腸癌を判別する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、大腸癌は、日本人の中で罹患率が増加傾向にある。主要部位別の統計でも、男女共、胃癌、肺癌に次ぐ第３位である。大腸癌は、癌の発生及び進行に伴って複数の癌関連遺伝子が関与する多段階発癌過程をとる。具体的には、ＡＰＣ等の癌抑制遺伝子異常により大腸ポリープができ、癌遺伝子ｒａｓの変異による活性化、癌抑制遺伝子ｐ５３の変異による不活性化等の異常が加わると、ポリープは肥大化及び癌化する。さらに、別の癌遺伝子の異常により、癌が浸潤や転移するようになる。大腸癌と診断されても、その詳細は、腫瘍組織を除去すれば問題のない良性のものから、小さくても転移しやすい悪性度の高いものまで多様である。
【０００３】
大腸癌は、早期に発見できれば、治癒が比較的容易である。単純なポリペクトミーから粘膜切除術も近年積極的に行なわれるようになってきた。また、手術による治療法も、癌が大腸壁中にどの程度深く入っているか、リンパ節転移、遠隔転移の有無等で規定される臨床病期や悪性度に応じて異なる。したがって、大腸癌の完全治癒を目指すには、早期発見と正確な臨床病理的な診断が重要である。
【０００４】
大腸癌の診断では、一般的に、注腸造影検査、内視鏡検査、腫瘍マーカー、各種画像診断等が行われる。大腸癌が疑われる場合、生検を行ない、癌の組織学的悪性度、脈管への浸潤等の病理診断が行われる。
【０００５】
病理診断では、病理医が摘出した組織や臓器を肉眼で見て、病変の部位、大きさ、性状、広がりを確認し、診断に必要な部分を切り取って生体試料標本とする。その生体試料標本を病理医が顕微鏡で観察し、組織的悪性度（分化度）の確認、手術で断端が完全に取り切れたかどうかのチェック、追加治療が必要かどうか、脈管やリンパ管への浸潤等を判断し、臨床医に伝える。病理診断にとって癌組織の悪性度を判断することが大事であるが、この悪性度を正確に判断することは、熟練を要し、病理医の専門性の高い領域である。
【０００６】
糖鎖は、タンパク質の翻訳後修飾を担う生体高分子であり、癌の発症に伴ってその構造が変化する。大腸癌では、ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＣＡ５０、ＣＳＬＥＸ（シアリルＬｅｘ抗原）、ＳＬＸ（シアリルＬｅｘ−ｉ抗原）、ＳＴＮ（シアリルＴｎ抗原）等の糖鎖関連の癌関連抗原が腫瘍マーカーとして利用されている。
【０００７】
糖鎖は、大腸癌の悪性度や転移性にも関与していると推測される。例えば、非特許文献１には、Ｄｕｋｅｓ分類やＴＭＮ分類のＧｒａｄｅの低い大腸癌では、Ｎ型糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにα１→６結合でフコース（コアフコースともいう）を付加するＦＵＴ８の酵素活性が高い値を示し、上記分類のＧｒａｄｅが高くなる、すなわち悪性度が高くなると、ＦＵＴ８の活性は有意に低下すると報告されている。
【０００８】
癌化に伴う細胞表面の糖鎖構造の変化や転移に関わる情報を得るために、糖鎖に結合するレクチンを利用することが考えられる。従来、上記コアフコースを検出するレクチンとして、ヒイロチャワンタケレクチン（ＡＡＬ）が知られている。ＡＡＬは、α１→２、α１→３、α１→４やα１→６結合のフコースと親和性を有する。しかし、後述の実施例に示すように、ＡＡＬを用いた検出方法では、原発癌と転移癌との間や悪性度の違いで有意差がでない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｖｏｌ １２３ Ｉｓｓｕｅ ３， Ｐａｇｅｓ ６４１−６４６，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ α（１，６）ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ
【非特許文献２】Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ． ２００８ Ｍａｒ ２８ ３７０， ２５９−２６３ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｎ ａｌｌ−ｉｎ−ｏｎｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｇｌｙｃａｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｆｏｒｍａｌｉｎ−ｅｍｂｅｄｄｅｄ ｔｉｓｓｕｅ ｓｅｃｔｉｏｎｓ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
そこで、本発明の課題は、大腸癌の悪性化や転移に伴う糖鎖構造の変化を、レクチンを用いて容易に判別する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、フコースα１→６糖鎖とのみ特異的に結合するレクチンを新規に単離した。このレクチンを用いて大腸癌腫瘍組織を組織学的に精査したところ、大腸癌腫瘍組織は癌化によりフコースが増加するが、悪性度の高い癌や転移癌ではα１→６結合フコースが減少していることを確認した。本発明者らはこれらの知見をもとに本発明を完成させた。すなわち、本発明は、大腸癌の腫瘍組織から採取した検体に、
（１）担子菌から抽出することができ、
（２）ＳＤＳ電気泳動法による分子量が４，０００〜４０，０００であり、及び、
（３）フコースα１→６糖鎖に対して結合定数１．０×１０４Ｍ−１以上（２５℃において）で示される親和性を有する
フコースα１→６特異的レクチンを作用させることを含む、大腸癌の判別方法を提供する。
【００１２】
上記レクチンは、フコースα１→６を有する糖鎖、糖ペプチドや糖タンパク質に対して結合定数１．０×１０４Ｍ−１以上という、従来よりも極めて高い親和性を有し、すなわち、フコースα１→６糖鎖構造を有する糖鎖を特異的に認識する。この特異性を利用した本発明は、悪性や転移性の大腸癌を判別することができる。すなわち、大腸癌で悪性度の低いものや原発癌では、α１→６結合フコースを含むL-フコース全般が増加する。一方、大腸癌の悪性度が高いものや転移癌では、α１→６結合フコースが減少する傾向がある。そこで、一次スクリーニングで大腸癌と診断された者の大腸癌の腫瘍組織に上記フコースα１→６特異的レクチンを作用させ、α１→６結合フコースの量を調べると、悪性度の高い大腸癌や転移癌の判別が可能となる。
【００１３】
前記フコースα１→６特異的レクチンは、さらに、（４）フコースα１→６糖鎖を含まないハイマンノース糖鎖及び／又は糖脂質に対して実質的に結合しないことが好ましい。
【００１４】
前記担子菌は、例えばモエギタケ科、キシメジ科、テングタケ科又はタコウキン科に属する。前記担子菌は、特にツチスギタケ、スギタケ、ヌメリスギタケモドキ、サケツバタケ、クリタケ、コムラサキシメジ又はベニテングタケである。
【００１５】
前記検体には、便潜血検査、腫瘍マーカー、直腸指診、大腸内視鏡検査、バリウム注腸二重撮像法及びＣＴ（コンピュータ断層撮影）からなる群の少なくとも一種により大腸癌と診断されたものであることが好ましい。
【００１６】
非特許文献２には、ヒイロチャワンタケレクチン（ＡＡＬ）、レンズマメレクチン（ＬＣＡ）、エンドウマメレクチン（ＰＳＡ）、ラッパスイセンレクチン（ＮＰＡ）、ソラマメレクチン（ＶＦＡ）、麹菌レクチン（ＡＯＬ）、ニホンニワトコレクチン（ＳＳＡ）、セイヨウニワトコレクチン（ＳＮＡ）、キカラスウリレクチン（ＴＪＡ）、ヒマレクチン（ＲＣＡ１２０）、ＰＨＡ（インゲンマメレクチン）、ドリコスマメレクチン（ＤＳＡ）、ラッパスイセン（ＮＰＡ）、ナタマメレクチン（ＣｏｎＡ）、スノードロップレクチン（ＧＮＡ）、アマリリスレクチン（ＨＨＡ）、トマトレクチン（ＬＥＬ）、ジャガイモレクチン（ＳＴＡ）、イラクサレクチン（ＵＤＡ）、ジャックフルーツレクチン（Ｊａｃａｌｉｎ）、ハリエニシダレクチン（ＵＥＡ−Ｉ）、ミヤゴグサレクチン（Ｌｏｔｕｓ）、イヌエンジュレクチン（ＭＡＭ）で大腸癌の組織がレクチン染色で陽性であることが報告されており、前記検体には、前記レクチンからなる群から選ばれる少なくとも一種を用いたレクチン染色で陽性であったものを用いることが可能である。より好ましくは、前記検体には、ＡＡＬ、ＬＣＡ、ＰＳＡ、ラッパスイセンレクチン、ソラマメレクチン、麹菌レクチン、ＵＥＡ−Ｉ及びＬｏｔｕｓからなる群から選ばれる少なくとも一種を用いたレクチン染色で陽性であったものを用いてもよい。
【００１７】
前記検体には、フコシル化反応に必須のドナー基質であるＧＤＰ−フコースの合成経路の酵素の一つであるＧＤＰ−マンノースデヒドロゲナーゼ（ＧＭＤ）を認識する抗ＧＭＤ抗体を用いた組織染色で陽性であったものを用いてもよい。
【００１８】
前記判別方法は、例えば標識した前記フコースα１→６特異的レクチンで前記検体をレクチン染色することからなる。
【００１９】
前記レクチン染色は、フコースα１→６特異的レクチンによる大腸癌の腫瘍組織の染色結果が、正常細胞の場合と同等かあるいはそれ以下であったら、悪性度が高いということを示唆することを含む。
【００２０】
前記悪性度が高いとは、大腸がんが将来転移しやすいこと、又は、分化度が未分化であることをいう。
【００２１】
本発明は、また、フコースα１→６特異的レクチンであって、
（１）担子菌から抽出することができ、
（２）ＳＤＳ電気泳動法による分子量が４，０００〜４０，０００であり、及び、
（３）フコースα１→６糖鎖に対して結合定数１．０×１０４Ｍ−１以上（２５℃において）で示される親和性を有する
前記フコースα１→６特異的レクチンを含む、大腸癌判別用診断薬又はキットを提供する。
【００２２】
前記大腸癌判別用診断薬又はキットには、大腸癌の一次スクリーニング用として、ＡＡＬ及び／又は抗ＧＭＤ抗体を含むことが好ましい。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の大腸癌の判別方法及び大腸癌判別用診断薬又はキットによれば、大腸癌患者等から採取された腫瘍組織を用いて調製された検体中の脱フコシル化を新規なα１→６特異的レクチンで検出することで、大腸癌の悪性度を客観的に評価できる可能性がある。すなわち、癌組織の一部にフコシル化欠損部を有する腫瘍は、将来的にどこか他の臓器に転移する可能性が高い悪性度の高い癌という予測診断ができる。また、転移リンパ節の染色から、悪性度を予測し、免疫療法、抗体医薬、抗がん薬等の治療法の選択の指標となり得る。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】ＡＡＬを用いた糖タンパク質のＥＬＩＳＡによる検出結果を示す。
【図２】調製例１のＰＴＬのイオン交換クロマトグラフィーの溶出図である。
【図３】調製例１のＰＴＬのアフィニティクロマトグラフィーの溶出図である。
【図４】ＰＴＬを用いた糖タンパク質のＥＬＩＳＡによる検出結果を示す。
【図５】ＳＲＬを用いた糖タンパク質のＥＬＩＳＡによる検出結果を示す。
【図６】大腸癌腫瘍組織をＡＡＬ、ＰＴＬ又は抗ＧＭＤ抗体を用いて染色した際に、染色強度に基づいて分類０〜３に分けた顕微鏡写真（図面代用）である。
【図７】大腸癌腫瘍組織のＡＡＬ染色において、原発癌と転移癌との陽性率（分類０〜３に占める分類２〜３の割合）を比較した図である。
【図８】大腸癌腫瘍組織のＡＡＬ染色の陽性率をＧｒａｄｅ（悪性度）別に比較した図である。
【図９】大腸癌腫瘍組織のＰＴＬ染色の陽性率を原発癌と転移癌とで比較した図である。
【図１０】大腸癌腫瘍組織のＰＴＬ染色の陽性率をＧｒａｄｅ別に比較した図である。
【図１１】大腸癌腫瘍組織のＡＡＬ染色において分類３（強陽性）を示した組織と同一ロットの組織を用いてＰＴＬ染色した際の陽性率を、原発癌と転移癌とで比較した図である。
【図１２】図１１のＡＡＬ染色及びＰＴＬ染色の顕微鏡写真（図面代用）を示す。
【図１３】大腸癌腫瘍組織の抗ＧＭＤ抗体を用いた免疫染色した際の陽性率を原発癌と転移癌とで比較した図である。
【図１４】大腸癌腫瘍組織の抗ＧＭＤ抗体を用いて免疫染色した際のＧｒａｄｅ別の陽性率を比較した図である。
【図１５】レクチンの糖結合性を調べるために使用したα１→６フコースオリゴ糖及び非α１→６フコースオリゴ糖の構造図である。
【図１６】レクチンの糖結合性を調べるために使用したフコースα１→６オリゴ糖及び非フコースα１→６オリゴ糖の構造図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下に、本発明の大腸癌の判別方法の一実施形態を説明する。本発明の方法は、大腸癌の腫瘍組織から採取した検体に、特定のフコースα１→６特異的レクチンを作用させることからなる。このレクチンで大腸癌腫瘍組織を染色すると、原発癌と転移癌とで陽性率に差が現れる（図９）。また、悪性度の違いでも陽性率に差が現れる（図１０）。本発明の方法がこの効果を奏するには、検体は、大腸癌の生検もしくは手術によって大腸癌と診断された腫瘍組織である必要がある。一次スクリーニングとして、従来公知の方法を用いることができる。例えば、腫瘍マーカー等が挙げられる。
【００２６】
上記腫瘍マーカーには、ＣＡ１９−９（ハプテン構造：２→３シアリルＬｅａ）、Ｃ−５０（２→３シアリルＬｅａ）、ＫＭ０１（２→３シアリルＬｅａ）ＣＡ１９５（ＬｅａとシアリルＬｅａ）等がある。これらの腫瘍マーカーを検出する手段には、腫瘍マーカーに特異的なモノクローナル抗体、腫瘍マーカーと親和性を有するレクチン等を用いることができる。
【００２７】
ＡＡＬは、図１の糖結合特異性の調査結果に示すように、α１→６結合フコースとα１→６結合以外のフコースとに親和性を有する。さらに、実施例１に示すように、ＡＡＬは、原発癌及び転移癌のいずれにも高い陽性率（図７）を示し、また、悪性度と陽性率との間で相関がない（図８）点で、大腸癌の一次スクリーニング用に好適である。
【００２８】
上記レクチンを用いた大腸癌の検出方法には、従来公知のレクチン染色が有効である。
【００２９】
レクチン染色の一例を以下に説明する。まず、腫瘍組織から検体を薄く切り出し、その薄片をガラスプレートに貼り付ける。ブロッキングバッファーにプレートを浸し、室温で緩く攪拌する。適宜、内因性ペルオキシダーゼ不活性化を行う。ビオチン標識レクチン溶液（２〜５μｇ／ｍｌにブロッキングバッファーで希釈）にメンブレンを浸し、室温で１時間、緩く撹拌する。西洋わさび由来ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識アビジン溶液にプレートを浸し、室温で緩く攪拌する。発色液にプレートを浸し、室温で数分間発色させる。発色が十分確認できたら純水で洗浄し、反応を停止させる。発色した組織を光学顕微鏡で観察する。レクチン染色には、市販のレクチン染色キットを用いることができる。
【００３０】
大腸癌の検出には、従来公知のレクチン染色のほかに、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）法も採用可能である。また、ＦＡＣＳ法を用いて、本発明の大腸癌の判別方法も可能である。ＦＡＣＳ法は、細胞等の粒子１個ずつから、大きさ等の形態の情報、ならびに、ＤＮＡ／ＲＮＡ蛍光染色や、タンパク等を蛍光抗体で染色した蛍光の情報を得ることができる。既に、疾病診断の分野では、白血病や悪性リンパ腫等の造血器腫瘍の診断に応用されている。本発明の判別方法では、例えば、以下のように行うことができる。３〜４ｍｍ角の大腸癌組織を細かく裁断し、１０ｍＭ リン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ ７．４、ＰＢＳ）に懸濁する。２１Ｇの針をつけた２．５ｍｌサイズのシリンジで、１０回程度強く出し入れし細胞をほぐした後、５０μｍのメッシュで細胞を濾過する。このように調製した大腸癌組織細胞に、蛍光標識したレクチンの溶液を直接的もしくは間接的に加えて、細胞とレクチンとを結合させる。その後、フローサイトメーター（例えば、ベックマンコールタール社製Ｃｙｔｏｍｉｃｓ ＦＣ ５００）で、レクチンの結合した細胞の量や割合を分析する。
【００３１】
図１３及び１４に、抗ＧＭＤ抗体を用いた大腸癌の免疫組織染色を示す。抗ＧＭＤ抗体を用いた免疫染色は、大腸癌陽性率がＡＡＬより低いものの、原発癌／転移癌や悪性度に関する陽性率の挙動がＡＡＬと似ている。したがって、抗ＧＭＤ抗体もまた、大腸癌の一次スクリーニングに使用し得る。抗ＧＭＤ抗体を用いた大腸癌の検出法には、従来公知の免疫染色法等を採用する。
【００３２】
本発明の大腸癌の判別方法には、化学式：
【化１】
〔式中、Ｍａｎはマンノース、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン、Ｆｕｃはフコースを意味する〕
示されるような糖鎖中のフコースα１→６結合を特異的に認識するレクチンの使用が必須である。本発明者らが単離した新規なレクチンは、本発明の大腸癌の判別方法に最適である。このレクチンを以下に詳述する。
【００３３】
（１）レクチンの由来
フコースα１→６特異的レクチンの由来となる原料は、担子菌である。担子菌の中でも、モエギタケ科、キシメジ科、タコウキン科及びテングタケ科に属することが好ましい。モエギタケ科としては、ツチスギタケ、サケツバタケ、クリタケ、スギタケ、ヌメリスギタケモドキ、ヌメリスギタケ等が挙げられる。キシメジ科としては、コムラサキシメジ等が挙げられる。タコウキン科としては、シロハカワラタケ、ツヤウチワタケ等が挙げられる。テングタケ科としては、ベニテングタケ等が挙げられる。これらの担子菌のうち、レクチンのフコースα１→６糖鎖認識特異性とレクチンの回収効率の観点から、モエギタケ科、キシメジ科又はテングタケ科が特に好ましく、さらに好ましくはツチスギタケ、スギタケ、ヌメリスギタケモドキ、サケツバタケ、クリタケ、コムラサキシメジ又はベニテングタケである。
【００３４】
（２）レクチンの分子量
前記フコースα１→６特異的レクチンのＳＤＳ電気泳動法による分子量は、４，０００〜４０，０００であり、好ましくは４，０００〜２０，０００である。ここで、ＳＤＳ電気泳動法による分子量は、例えばＬａｅｍｍｉの方法（Ｎａｔｕｒｅ，２２７巻，６８０頁，１９７６年）に準じて測定されるものである。上記分子量は、本明細書において、レクチンの単量体と複合体の両方を含む意味で使用される。
【００３５】
（３）レクチンの結合定数
前記フコースα１→６特異的レクチンのフコースα１→６糖鎖に対する結合定数は、１．０×１０４Ｍ−１以上であり、好ましくは１．０×１０５Ｍ−１以上、さらに好ましくは１．０×１０６Ｍ−１以上である。すなわち、フコースα１→６に親和性を有することが従来知られているＡＡＬ、ＡＯＬ、ＬＣＡ、ＮＰＡ及びＰＳＡと比べて、結合定数が著しく高い。これは、前記フコースα１→６特異的レクチンが、従来のレクチンと比べて極めて高い選択性をもってフコースα１→６糖鎖と結合することを意味する。
【００３６】
上記結合定数は、例えばフロンタルアフィニティクロマトグラフィー（ＦＡＣ法）により測定することができる。ＦＡＣ法の詳細は、例えば、本出願人の一部が出願したＰＣＴ／ＪＰ２００９／００３３４６に記載されている。ＰＣＴ／ＪＰ２００９／００３３４６を参照のために本明細書に編入する。
【００３７】
フコースα１→６糖鎖は、その非還元末端にシアル酸を有していてもよい。従来のフコースα１→６特異的レクチン（例えばＬＣＡ、ＮＰＡ及びＰＳＡ）は、非還元末端にシアル酸を有するフコースα１→６糖鎖に対して親和性が低かった。一方、前記フコースα１→６特異的レクチンは、このような糖鎖に対しても高い親和性を有する点でも従来のものより優れる。
【００３８】
（４）レクチンの特異性
前記フコースα１→６特異的レクチンは、フコースα１→６糖鎖を含まないハイマンノース糖鎖及び／又は糖脂質に対して実質的に結合しないことが好ましい。これにより、前記フコースα１→６特異的レクチンは、より一層高い結合特異性を有する。本明細書において、「実質的に結合しない」とは、結合定数が１．０×１０３Ｍ−１以下、好ましくは１．０×１０２Ｍ−１以下、特に好ましくは０であることを意味する。
【００３９】
（５）レクチンの分岐鎖への結合
前記フコースα１→６特異的レクチンは、フコースα１→６Ｎ結合型の一本、二本、三本及び／又は四本糖鎖に対して結合定数１．０×１０４Ｍ−１以上（２５℃において）で示される親和性を有することが好ましく、より好ましくは結合定数１．０×１０５Ｍ−１以上で示される親和性を有する。
【００４０】
（６）レクチンのアミノ酸配列
フコースα１→６特異的レクチンは、特に、表１の配列番号１に示すような共通のアミノ酸構造を有する。配列番号１の第４、５、６及び７番目のＸａａは、それぞれ、Ａｓｐ／Ａｓｎ／Ｇｌｕ／Ｔｈｒ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ／Ａｌａ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ及びＧｌｎ／Ｌｙｓ／Ｇｌｕを意味し、その斜線は「又は」を意味する。
【００４１】
本発明の方法に使用し得るフコースα１→６特異的レクチンの具体例を、配列番号２〜６に示す。
【００４２】
配列番号２に示すレクチンは、ツチスギタケから抽出することのできる、分子量４，５００の新規なレクチン（以下、ＰＴＬという）である。配列番号２の第１０及び１７番目のＸａａは、任意のアミノ酸残基であってよいが、好ましくはＣｙｓである。第２０、２３、２７、３３、３５及び３９番目のＸａａは、それぞれ、Ｔｙｒ／Ｓｅｒ、Ｐｈｅ／Ｔｙｒ、Ａｒｇ／Ｌｙｓ／Ａｓｎ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ／Ｓｅｒ、Ａｓｎ／Ａｌａ、及び、Ｔｈｒ／Ｇｌｎである。ＰＴＬの糖結合特異性を図４に示す。
【００４３】
配列番号３に示すレクチンは、サケツバタケから抽出することのできる、分子量４，５００の新規なレクチン（以下、ＳＲＬという）である。配列番号３の第１０及び１７番目のＸａａは、任意のアミノ酸残基であってよいが、好ましくはＣｙｓである。第４、７、９、１３、２０、２７、２９、３３、３４及び３９番目のＸａａは、それぞれ、Ｐｒｏ／Ｇｌｙ、Ｇｌｕ／Ｌｙｓ、Ｖａｌ／Ａｓｐ、Ａｓｎ／Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｈｉｓ／Ｓｅｒ、Ｌｙｓ／Ｈｉｓ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ｇｌｙ／Ａｓｎ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、及び、Ａｒｇ／Ｔｈｒである。ＳＲＬの糖結合特異性を図５に示す。
【００４４】
配列番号４に示すレクチンは、コムラサキシメジから抽出することのできる、分子量４，５００の新規なレクチン（以下、「ＬＳＬ」という）である。配列番号４の第１０及び１７番目のＸａａは、任意のアミノ酸残基であってよいが、好ましくはＣｙｓである。第１、４、７、８、９、１３、１６、２０、２２、２５、２７、３１及び３４番目のＸａａは、それぞれ、Ａｌａ／Ｇｌｎ、Ｐｒｏ／Ｌｙｓ、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｍｅｔ／Ｉｌｅ／Ｖａｌ、Ｔｙｒ／Ｔｈｒ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｙｓ／Ｇｌｕ、Ａｌａ／Ａｓｎ、Ｖａｌ／Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ａｒｇ／Ｈｉｓ／Ａｓｎ、Ｇｌｎ／Ａｒｇ、及び、Ｔｈｒ／Ｖａｌである。
【００４５】
配列番号５に示すレクチンは、クリタケから抽出することのできる新規なレクチン（以下、「ＮＳＬ」という）である。配列番号５の第１０及び１７番目のＸａａは、任意のアミノ酸残基であってよいが、好ましくはＣｙｓである。第１３、１４及び１６番目のＸａａは、それぞれ、Ａｓｐ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｌａ、及び、Ｇｌｎ／Ｌｙｓである。
【００４６】
配列番号６に示すレクチンもまた、クリタケから抽出することのできる、分子量４，５００の新規なレクチン（以下、「ＮＳＬ」という）である。配列番号６は、配列番号５のペプチド中に１個のＡｓｎが挿入された変異体である。したがって、配列番号６の第１０及び１８番目のＸａａは、任意のアミノ酸残基であってよいが、好ましくはＣｙｓである。第１４、１５及び１７番目のＸａａは、それぞれ、Ａｓｐ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｌａ及びＧｌｎ／Ｌｙｓである。
【００４７】
配列番号２〜６のレクチンがサブユニットとなって、通常、２〜１０個、好ましくは２〜３個結合したものもまた、フコースα１→６特異的レクチンとして使用可能である。
【００４８】
【表１】
【００４９】
ＰＴＬ、ＳＲＬ、ＮＳＬ及びＬＳＬと、従来、フコース特異的レクチンといわれているＡＡＬ、ＡＯＬ、ＬＣＡ及びＰＳＡの各種糖鎖（図１５及び図１６参照）への結合定数（２５℃において）を、表２〜４に列記する。
【００５０】
【表２】
【００５１】
【表３】
【００５２】
【表４Ａ】
【００５３】
【表４Ｂ】
【００５４】
【表４Ｃ】
【００５５】
【表４Ｄ】
【００５６】
表２〜４中、ＡＡＬ及びＡＯＬは、フコースα１→６糖鎖（糖鎖Ｎｏ．１５、２０１−２０３、４０１−４１８）とともに、非α１→６である糖脂質系のフコース糖鎖（糖鎖Ｎｏ．７１８、７２２、７２３、７２７、９０９、９１０、９３３）にも結合する。また、ＬＣＡ及びＰＳＡは、フコースα１→６糖鎖を持たない多くの糖鎖（糖鎖Ｎｏ．００３、００５−０１４）にも結合する。
【００５７】
それに対して、ＰＴＬ及びＳＲＬは、フコースα１→６糖鎖に確実に結合し、かつ非フコースα１→６糖鎖やフコースを持たない糖鎖に全く結合していない。しかも、ＰＴＬの結合定数は、従来のレクチンよりも大きい（結合定数がＫａ＝１．０×１０５Ｍ−１以上）。さらに、フコースα１→６糖鎖の三本鎖（糖鎖Ｎｏ．４０７−４１３）や四本鎖（糖鎖Ｎｏ．４１８）にも強く結合する。また、シアル酸が付加されていても（糖鎖Ｎｏ．６０１、６０２）、フコースα１→６糖鎖の結合定数が下がっていない。
【００５８】
ＮＳＬ及びＬＳＬもまた、フコースα１→６糖鎖のみを検出し、非フコースα１→６糖鎖やフコースを持たない糖鎖を全く検出していない。さらに、フコースα１→６糖鎖の三本鎖や四本鎖にも強く結合する。また、シアル酸が付加されていても、フコースα１→６糖鎖に結合定数が下がらない。
【００５９】
フコースα１→６特異的レクチンは、（ａ）配列番号２〜５のいずれかに示すアミノ酸配列からなるタンパク質又はペプチドの他に、（ｂ）配列番号２〜５のいずれかに示すアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が欠失、挿入又は置換され、かつ、配列番号２〜５のいずれかに示すアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチドと機能的に同等なタンパク質又はペプチドであってもよい。ここで、「機能的に同等」とは、フコースα１→６糖鎖に対して結合定数１．０×１０４Ｍ−１以上であり、好ましくは１．０×１０５Ｍ−１以上、さらに好ましくは１．０×１０６Ｍ−１以上で示される親和性を有することを意味する。（ｂ）の変異体の一例が、配列番号６に示すタンパク質又はペプチドである。
【００６０】
前記フコースα１→６特異的レクチンは、特に好ましくはＰＴＬ、ＳＲＬ、ＮＳＬ及びＬＳＬであり、さらに好ましくはＰＴＬ及びＳＲＬである。ＰＴＬ及びＳＲＬは、従来のフコースα１→６親和性レクチンと相違して、フコースα１→６以外のフコースや、フコースを持たない高マンノース糖鎖と結合しない点で、本発明の判別方法に使用するフコースα１→６特異的レクチンとして最適である。
【００６１】
フコースα１→６特異的レクチンは、担子菌から、公知の抽出方法、分離方法、精製方法等を適宜組み合わせることにより、単離することができる。例えば、水系媒体を抽出溶媒として用いて、担子菌の水系媒体抽出物を得る工程を含む。この前記抽出物から、ＳＤＳ電気泳動法による分子量が４，０００〜４０，０００、好ましくは４，０００〜２０，０００、及び、フコースα１→６糖鎖に対する結合定数が１．０×１０４Ｍ−１以上、好ましくは１．０×１０５Ｍ−１以上、さらに好ましくは１．０×１０６Ｍ−１以上（２５℃において）で示される親和性を有するレクチンを得る。
【００６２】
前記担子菌は、モエギタケ科、キシメジ科、タコウキン科及びテングタケ科の少なくとも一種から選ばれることが好ましい。特に、ツチスギタケ（Ｐｈｏｌｉｏｔａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ Ｏｖｅｒｈｏｌｔｓ）、スギタケ（Ｐｈｏｌｉｏｔａ ｓｑｕａｒｒｏｓａ （Ｆｒ．） Ｋｕｍｍｅｒ）、ヌメリスギタケ（Ｐｈｏｌｉｏｔａ ａｄｉｐｏｓａ （Ｆｒ．） Ｋｕｍｍｅｒ）、ナメコ（Ｐｈｏｌｉｏｔａ nameko）、サケツバタケ（Ｓｔｒｏｐｈａｒｉａ ｒｕｇｏｓｏａｎｎｕｌａｔａ Ｆａｒｌｏｗ ｉｎ Ｍｕｒｒ．）、クリタケ（Ｎａｅｍａｔｏｌｏｍａ ｓｕｂｌａｔｅｒｉｔｉｕｍ （Ｆｒ．） Ｋａｒｓｔ又はＨｙｐｈｏｌｏｍａ ｓｕｂｌａｔｅｒｉｔｉｕｍ（Ｆｒ．）Ｑｕｅｌ）等のモエギタケ科、コムラサキシメジ（Ｌｅｐｉｓｔａ ｓｏｒｄｉｄａ （Ｓｃｈｕｍ． ： Ｆｒ．） Ｓｉｎｇ．）等のキシメジ科、シロハカワラタケ（Ｔｒｉｃｈａｐｔｕｍ ｅｌｏｎｇａｔｕｍ）、ツヤウチワタケ（Ｍｉｃｒｏｐｏｒｕｓ ｖｅｒｎｉｃｉｐｅｓ）等のタコウキン科、ベニテングタケ（Ａｍａｎｉｔａ ｍｕｓｃａｒｉａ）等のテングタケ科に属するものが好ましい。これらの担子菌の使用部位は、子実体であることが好ましい。
【００６３】
水系媒体と担子菌の子実体とから、水系媒体抽出物を得る方法については、水系媒体と担子菌の子実体とを接触させることができれば特に制限はない。抽出効率の観点から、水系媒体中で担子菌の子実体を粉砕して懸濁液とする方法が好ましい。また、粉砕する方法としては、ミキサー、ホモジナイザー等を用いた通常の粉砕方法を挙げることができる。
【００６４】
上記水系媒体としては、緩衝液、水と混合し得る有機溶媒と水又は緩衝液との混合物等を挙げることができる。好ましくは、緩衝液又は有機溶媒と緩衝液との混合物を用いる。
【００６５】
上記緩衝液としては、特に制限されることなく公知の緩衝液を用いることができる。中でも、ｐＨ３〜１０の範囲に緩衝能を有するものが好ましく、ｐＨ６〜８の範囲に緩衝能を有するものがより好ましい。具体的には、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス緩衝液等を挙げることができる。中でも、抽出効率の観点から、リン酸緩衝液が好ましい。
【００６６】
前記緩衝液の塩濃度は、特に制限はないが、抽出効率と緩衝能の点から、１〜１００ｍＭであることが好ましく、５〜２０ｍＭであることがより好ましい。
【００６７】
前記緩衝液は、さらに塩類を含むことができる。例えば、リン酸緩衝液に食塩を更に加えたリン酸緩衝化生理食塩水等は、水系媒体として好ましい。
【００６８】
前記有機溶媒としては、水と混合し得る有機溶媒であれば特に制限なく用いることができる。中でも、アセトン、メタノール、エタノール、２−プロパノール及びアセトニトリルが好ましい。有機溶媒と水又は緩衝液とを混合する場合の有機溶媒の含有量としては、１０〜４０質量％であることが好ましい。
【００６９】
前記抽出工程は、水系媒体と担子菌の子実体との混合物から、水系媒体に対する不溶物を除去する工程を更に含むことが好ましい。不溶物の除去方法としては、濾過、遠心分離等の方法を挙げることができるが、除去効率の観点から遠心分離が好ましい。
【００７０】
前記抽出工程は、リン酸緩衝化生理食塩水中で、担子菌の子実体を粉砕し、遠心分離によって不溶物を除去して水系媒体抽出物を得る工程であることが特に好ましい。
【００７１】
前記フコースα１→６特異的レクチンの製造方法では、以下のいずれかの精製手段を採用すると、一層効率的な精製が可能となる。
【００７２】
（精製方法１）
上記工程によって得られた水系媒体抽出物を、硫酸アンモニウム沈殿法にかけることによってレクチン含有画分を得て、得られたレクチン画分を疎水クロマトグラフィー及び逆相クロマトグラフィーで精製する。
【００７３】
（精製方法２）
上記工程によって得られた水系媒体抽出物を、チログロブリンをアガロース等に固定した担体を用いたアフィニティクロマトグラフィーに供して精製する。
【００７４】
（精製方法３）
上記工程によって得られた水系媒体抽出物を、硫酸アンモニウム沈殿法にかけることによってレクチン含有画分を得て、透析凍結乾燥を行った後、粗レクチン画分をトリス緩衝液に溶解後、イオン交換クロマトグラフィーに供し、得られた活性画分を濃縮後、ゲルろ過クロマトグラフィーで分離する。
【００７５】
フコースα１→６特異的レクチンの製造方法には、前記精製工程で得られたレクチンを含む画分を透析処理する工程と、透析処理後のレクチン溶液を凍結乾燥する工程とを含んでもよい。これにより、レクチンを容易に単離することができる。透析処理する工程及び凍結乾燥する工程は、通常用いられる公知の方法によって行うことができる。
【００７６】
（ａ）配列番号２〜５のいずれかに示すアミノ酸配列からなるタンパク質又はペプチド、若しくは、（ｂ）配列番号２〜５のいずれかに示すアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が欠失、挿入又は置換され、かつ、配列番号２〜５のいずれかに示すアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチドと機能的に同等なタンパク質又はペプチドであるフコースα１→６特異的レクチンは、天然植物からの抽出のほかに、天然由来とは異なる宿主内で人工的に発現させ、又は化学合成させてもよい。宿主内での発現や化学合成は、通常用いられる公知の方法によって行うことができる。
【００７７】
大腸癌患者から採取された腫瘍組織は、適宜、凍結保存や、ホルマリン、パラフィン、パラホルムアルデヒド等の固定液で固定することができる。凍結保存等した腫瘍組織から切片を作成し、上記フコースα１→６特異的レクチンを作用させる検体とする。
【００７８】
上記フコースα１→６特異的レクチンを検体に作用させる方法は、上記ＡＡＬと同様である。特に、組織の形態を維持しながら観察するレクチン染色が好ましい。
【００７９】
フコースα１→６特異的レクチンによるレクチン染色では、通常、レクチンに標識手段が組み込まれている。標識手段は、特に制限なく、公知の標識化方法を適用可能である。例えば、放射性同位元素による標識化、標識化合物の結合等を挙げることができる。標識化合物としては、この用途に適したものであれば特に制限なく、例えば、直接又は間接標識化合物、酵素若しくは蛍光化合物を挙げることができる。具体的には、ビオチン、ジゴキシゲニン、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ、フルオレセインイソチオシアネート、ＣｙＤｙｅ等を挙げることができる。これらの標識化合物は、常法によりレクチンと結合させることができる。
【００８０】
標識したフコースα１→６特異的レクチンでのレクチン染色の手順は、ＡＡＬによる一次スクリーニングで説明したものと同様である。
【００８１】
大腸癌の悪性度の低いもの（例えば低転移性の原発癌）では、α１→６結合フコースが大腸組織の正常細胞よりも増加する。一方、大腸癌の悪性度が高いもの（例えば転移癌や、今後、転移が予測される原発癌）では、α１→６結合フコースが正常細胞と同等か正常細胞よりも減少する傾向がある。
【００８２】
レクチン染色において、フコースα１→６特異的レクチンによる大腸癌の腫瘍組織の染色結果が、正常細胞の場合と同等かあるいはそれ以下であったら、大腸癌の悪性又は転移性を疑う。
【００８３】
前記悪性は、転移しやすい、あるいは局所浸潤しやすいことを意味する。一般的に、未分化癌は分化癌に較べて悪性度が高いと言われている。
【００８４】
本発明は、また、フコースα１→６特異的レクチンであって、
（１）担子菌から抽出することができ、
（２）ＳＤＳ電気泳動法による分子量が４，０００〜４０，０００であり、及び、
（３）フコースα１→６糖鎖に対して結合定数１．０×１０４Ｍ−１以上（２５℃において）で示される親和性を有するフコースα１→６特異的レクチンを含む、大腸癌判別用診断薬又はキットを提供する。上記レクチンは、標識されていることが好ましい。
【００８５】
上記診断薬又はキットには、適宜、緩衝液、プレートガラス等のレクチン染色キットに公知のものを含む。大腸癌の一次スクリーニング用として、ＡＡＬ及び／又は抗ＧＭＤ抗体を含むことが好ましい。
【実施例】
【００８６】
以下に、本発明の実施例を示して、本発明をより詳細に説明する。しかし、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
〔調製例１〕ＰＴＬの製造
以下に示す精製工程に従って、ツチスギタケからツチスギタケレクチン（ＰＴＬ）を単離精製した。
【００８７】
（抽出）
ツチスギタケ約７．５ｇを凍結乾燥して得られたツチスギタケ凍結乾燥粉末２．５ｇに、１０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７．２）５０ｍｌを加えて、４℃下で２時間抽出した。この液を、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ、４℃）後、上清をガーゼろ過して１回目の抽出液を得た。この抽出残渣に、１０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７．２）を５０ｍｌ加えて、４℃下で一晩抽出した。この液を遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ、４℃）後、上清をガーゼろ過して２回目の抽出液を得た。これらの抽出液を合わせてろ紙でろ過し、ツチスギタケ抽出液とした。
【００８８】
（イオン交換クロマトグラフィー）
上記抽出液８７ｍｌを、１０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７．２）で平衡化したＤＥＡＥ−セファロース（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に供した。同緩衝液でカラムを洗浄後、０．１Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７．２）で溶出した。赤血球凝集活性を示す画分（図２の←→部）を合一し、限外ろ過で脱塩後凍結乾燥した。
【００８９】
（アフィニティクロマトグラフィー）
上記凍結乾燥粉末を、１０ｍＭ リン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．４、以後、ＰＢＳと略す）で溶解し、同緩衝液で平衡化したチログロブリン固定化アガロースに供した。ＰＢＳでカラムを洗浄後、０．２Ｍ アンモニアで溶出した。赤血球凝集活性を示す画分（図３の←→部）を合一し、限外ろ過で純水に置換後、凍結乾燥し、ＰＴＬを１．０７ｍｇ得た。
【００９０】
〔実施例１〕大腸癌腫瘍組織の組織染色
ＡＡＬは、α１→２、α１→３、１−４、及び１→６結合のフコースを認識し、ＰＴＬはα１→６結合のフコースを特異的に認識する。そのため、この２種類のレクチンによる染色レベルを比較することにより、フコシル化の結合様式の違いを知ることができる。
【００９１】
ヒト大腸癌腫瘍組織アレイに対して、ＰＴＬ、ＡＡＬ及び抗ＧＭＤ抗体による免疫組織染色を行った。正常組織の中の実質細胞は、わずかに褐色に染まる。その染色レベルを、本明細書では、「弱陽性（分類１）」と定義した。この染色レベルを基準として、染色結果と名称を表５のように分類した。
【００９２】
【表５】
【００９３】
（ＡＡＬによる組織染色）
組織染色の試料として、組織アレイ（倉敷紡績株式会社製、合計１９７例の大腸癌腫瘍組織及び正常組織）を入手した。この組織を脱パラフィンした後、ＰＢＳにて洗浄し、Ｄａｋｏ ＡＢＩＤＩＮ ＳＯＬＵＴＩＯＮ／ＢＩＯＴＩＮ ＳＯＬＵＴＩＯＮ （Ｄａｋｏ社）を用いてブロッキング処理（ａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎ ｂｌｏｃｋｉｎｇ）を行った。次いで、Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ （Ｄａｋｏ社）で内因性ペルオキシダーゼ不活性化を行い、５％子ウシ血清アルブミンを含む１０ｍＭ トリス干緩衝化生理食塩水（０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む）（以下、５％ＢＳＡ−ＴＢＳＴと記載する）を用いて４℃にて一昼夜、振蘯させた。５％ＢＳＡ−ＴＢＳＴにて、ビオチン標識ＡＡＬを５μｇ／ｍｌに希釈した。希釈したビオチン標識レクチンを上記組織アレイに添加して、室温にて１時間反応させ、ＰＢＳにて洗浄した。予め５％ＢＳＡ−ＴＢＳＴにてＡＢＣ ＲＥＡＧＥＮＴ（フナコシ社）を５０倍希釈して振蘯させたものを添加し、室温で３０分間、反応させた。Ｄａｋｏ ＥＮＶＩＳＩＯＮキット／ＨＲＰ ＤＡＢ基質キット（Ｄａｋｏ社）を５０倍希釈した後、組織アレイに添加して、１０×４０倍の顕微鏡で発色を確認した。分類０〜３の顕微鏡写真を図６に示す。
【００９４】
１）原発癌と転移癌との違いによる群分けと組織染色の結果
ＡＡＬ染色した大腸癌症例１２８例を、原発癌又は転移癌の２種類に分類した。結果を表６に示す。
【００９５】
【表６】
【００９６】
表６中、全分類に占める分類２及び３の割合を、大腸癌の陽性率と定義した。そして、図７に、原発癌と転移癌とでＡＡＬ染色の陽性率を比較したグラフを示す。陽性率について、カイ二乗検定法による有意差検定を行った。ＡＡＬ染色では、原発癌、転移癌ともに、強陽性のものが多く、有意差は見られなかった。
【００９７】
２）悪性度による群分けと組織染色の結果
組織アレイの添付書には、大腸癌の悪性度に応じてＧｒａｄｅ １〜３までの等級が付けられていた。Ｇｒａｄｅが上がることは、組織学的悪性度が高くなることを意味するが、Ｇｒａｄｅに関する詳しい説明は添付書になかった。そこで、各Ｇｒａｄｅの腺癌組織を観察し、Ｇｒａｄｅを表７に示すように定義した。さらに、Ｇｒａｄｅ ２及びＧｒａｄｅ ３を、悪性と評価した。
【００９８】
【表７】
【００９９】
大腸癌症例１１２例をＧｒａｄｅ別に分類し、Ｇｒａｄｅ間でのＡＡＬ染色結果の比較を行った。結果を表８に示す。
【０１００】
【表８】
【０１０１】
表８に示すとおり、ＡＡＬ染色では、Ｇｒａｄｅに関係なく強陽性のものが多かった。図８に、Ｇｒａｄｅ（悪性度）別の陽性率を示す。Ｇｒａｄｅ間の陽性率について、カイ二乗検定法により有意差検定を行った。Ｇｒａｄｅ間で陽性率の有意な差は見られなかった。
【０１０２】
（ＰＴＬによる組織染色）
レクチン染色の検体として、ＡＡＬ染色と同じ組織アレイ（倉敷紡績株式会社製）を入手した。この組織を脱パラフィンした後、ＰＢＳにて洗浄し、Ｄａｋｏ ＡＢＩＤＩＮ ＳＯＬＵＴＩＯＮ／ＢＩＯＴＩＮ ＳＯＬＵＴＩＯＮ （Ｄａｋｏ社）を用いてａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎ ｂｌｏｃｋｉｎｇを行った。Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ （Ｄａｋｏ社）で内因性ペルオキシダーゼ不活性化を行い、５％ＢＳＡ−ＴＢＳＴを用いて４℃にて一昼夜、振蘯させた。
【０１０３】
５％ＢＳＡ−ＴＢＳＴにて、ビオチン標識ＰＴＬを５０μｇ／ｍｌに希釈した。組織アレイに希釈したレクチンを添加して、室温にて１時間反応させ、ＰＢＳにて洗浄した。予め５％ＢＳＡ−ＴＢＳＴにてＡＢＣ ＲＥＡＧＥＮＴ（フナコシ社）を５０倍希釈して振蘯させたものを添加し、室温で３０分間、反応させた。Ｄａｋｏ ＥＮＶＩＳＩＯＮキット／ＨＲＰ ＤＡＢ基質キット（Ｄａｋｏ社）を５０倍希釈した後、組織アレイに添加して、１０×４０倍の顕微鏡で発色を確認した。
【０１０４】
１）原発癌と転移癌との違いによる群分けと組織染色の結果
ＰＴＬで染色した大腸癌症例１１６例を、原発癌又は転移癌の２種類に分類した。結果を表９に示す。
【０１０５】
【表９】
【０１０６】
表９に示すとおり、転移癌は、原発癌と比べて、分類２及び３の割合が減少していた。図９に、原発癌と転移癌との陽性率を比較したグラフを示す。カイ二乗検定法による有意差検定を行ったところ、原発癌と転移癌の間との間で陽性率に有意な差が見られた（Ｐ＜０．０１）。
【０１０７】
２）悪性度による群分けと組織染色の結果
大腸癌症例１１４例をＧｒａｄｅ別に分類し、Ｇｒａｄｅ間での染色結果の比較を行った。結果を表１０に示す。
【０１０８】
【表１０】
【０１０９】
表１０に示すとおり、ＰＴＬ染色では、Ｇｒａｄｅ ２及びＧｒａｄｅ ３において、分類２及び３の割合が減少した。図１０に、各Ｇｒａｄｅでの陽性率を示す。カイ二乗検定法により有意差検定を行ったところ、Ｇｒａｄｅ １とＧｒａｄｅ ２及びＧｒａｄｅ ３との間で、陽性率に有意な差が見られた（ｐ＜０．０５）。
【０１１０】
上記のＡＡＬ染色及びＰＴＬ染色の結果から、以下のことが判明した。ＡＡＬで認識されるα１→２、α１→３、１−４、及び１→６結合を含む総体的なフコシル化は、癌化により増加した。一方、悪性度の高い癌や転移癌では、フコシル化には変化がないが、ＰＴＬで認識されるα１→６結合のフコシル化が低下した。
【０１１１】
（ＡＡＬ染色とＰＴＬ染色の併用）
上記ＡＡＬ染色で分類３（強陽性）となった原発癌及び転移癌の症例８８例から、同一ロットの組織を準備し、さらにＰＴＬ染色した。結果を表１１に示す。
【０１１２】
【表１１】
【０１１３】
表１１に示すとおり、原発癌ではＡＡＬ染色が「強陽性」であれば、ＰＴＬ染色も「強陽性」もしくは「陽性」である組織が多数を占めた。一方、転移癌では、ＡＡＬ染色で「強陽性」であっても、ＰＴＬ染色では「弱陽性」もしくは「陰性」のものが多数を占めた。図１１に、原発癌と転移癌の間で陽性率を比較したグラフを示す。カイ二乗検定法により有意差検定を行ったところ、原発癌と転移癌との間で陽性率に有意差が見られた（ｐ＜０．０１）。図１２には、組織アレイの同一サンプルでＡＡＬ染色が強陽性かつＰＴＬ染色が陰性となった顕微鏡写真を示す。
【０１１４】
原発癌ではＡＡＬで認識されるα１→２、α１→３、１−４及び１→６結合のフコシル化が総体的に増加しているが、転移癌ではα１→６結合のフコシル化が低下する傾向にあることがさらに明確になった。これらの知見をもとに、大腸の組織細胞をＡＡＬ染色して大腸癌を一次スクリーニングし、大腸癌と診断された検体についてＰＴＬ染色することで、大腸癌のリンパ節転移を含めた悪性度の予測診断として、情報を得ることができる。
【０１１５】
〔応用例１〕
本発明の大腸癌の判別方法に供する大腸癌の腫瘍組織の一次スクリーニングとして、抗ＧＭＤ抗体によるアッセイが可能であるか調査した。
【０１１６】
（抗ＧＭＤ抗体による免疫染色）
免疫組織染色のサンプルとして、レクチン免疫染色と同じで２種類の組織アレイによる合計１４３例の大腸癌腫瘍組織及び正常組織を入手した。この組織を脱パラフィンした後、内因性ペルオキシダーゼ不活性化までレクチン免疫染色と同様に処理をした。
【０１１７】
Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｌｏｃｋ Ｓｅｒｕｍ−Ｆｒｅｅ Ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅ（Ｄａｋｏ社）を添加して１０分静置した。ＰＢＳで洗浄後、抗ＧＭＤ抗体（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １７， １３１１−１３２０， ２００７参照。阪大三善研にて作成）をＤａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｉｌｕｅｎｔ（Ｄａｋｏ社）で５μｇ／ｍｌに希釈したものを添加し、４℃にて一昼夜反応させた。
【０１１８】
ＰＢＳで洗浄後、Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ Ｅｎｖｉｓｉｏｎ＋Ｒ Ｓｙｓｔｅｍ Ｌａｂｅｌｌｅｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ−ＨＲＰ Ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ（Ｄａｋｏ社）で作製した２次抗体を添加して３０分室温で反応させた。以降、レクチン免疫染色と同様にして、発色を観察した。
【０１１９】
１）原発癌と転移癌との違いによる群分けと組織染色の結果
免疫染色した大腸癌症例１１２例を、原発癌又は転移癌の２種類に分類した。結果を表１２に示す。
【０１２０】
【表１２】
【０１２１】
表１２に示すとおり、免疫染色は、分類０（陰性）及び分類１（弱陽性）の割合が高かった。図１３に、原発癌と転移癌とで免疫染色の陽性率を比較したグラフを示す。カイ二乗検定法による有意差検定を行ったところ、原発癌と転移癌とで陽性率に有意差は見られなかった。
【０１２２】
２）悪性度による群分けと組織染色の結果
大腸癌症例８６例をＧｒａｄｅ別に分類し、Ｇｒａｄｅ間での染色結果の比較を行った。結果を表１３に示す。
【０１２３】
【表１３】
【０１２４】
表１３に示すとおり、免疫染色では、Ｇｒａｄｅに関係なく、陰性及び弱陽性のものが多かった。図１４に、Ｇｒａｄｅ（悪性度）別の陽性率を示す。Ｇｒａｄｅ間の陽性率について、カイ二乗検定法により有意差検定を行ったが、Ｇｒａｄｅ間で陽性率の有意な差は見られなかった。
【０１２５】
抗ＧＭＤ抗体を用いた免疫染色の結果は、陽性率は低いものの、ＡＡＬ染色と同様の挙動を示した。このことから、ＡＡＬの代わりに抗GMD抗体を用いて、大腸癌患者の一次スクリーニングを行い、大腸癌と診断された患者の検体をさらにＰＴＬ等のフコースα１→６特異的レクチンで染色することで、実施例１と同様の結果が得られることが予想される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
大腸癌の腫瘍組織から採取した検体に、
（１）担子菌から抽出することができ、
（２）ＳＤＳ電気泳動法による分子量が４，０００〜４０，０００であり、及び、
（３）フコースα１→６糖鎖に対して結合定数１．０×１０４Ｍ−１以上（２５℃において）で示される親和性を有する
フコースα１→６特異的レクチンを作用させることを含む、大腸癌の判別方法。
【請求項２】
前記フコースα１→６特異的レクチンは、さらに、（４）フコースα１→６糖鎖を含まないハイマンノース糖鎖及び／又は糖脂質に対して実質的に結合しないことを特徴とする、請求項１に記載の大腸癌の判別方法。
【請求項３】
前記担子菌が、モエギタケ科、キシメジ科、テングタケ科又はタコウキン科に属することを特徴とする、請求項１又は２に記載の大腸癌の判別方法。
【請求項４】
前記担子菌が、ツチスギタケ、スギタケ、ヌメリスギタケモドキ、サケツバタケ、クリタケ、コムラサキシメジ又はベニテングタケであることを特徴とする、請求項１、２又は３に記載の大腸癌の判別方法。
【請求項５】
前記検体には、ヒイロチャワンタケレクチン（ＡＡＬ）、レンズマメレクチン（ＬＣＡ）、エンドウマメレクチン（ＰＳＡ）、ラッパスイセンレクチン（ＮＰＡ）、ソラマメレクチン（ＶＦＡ）、麹菌レクチン（ＡＯＬ）、ハリエニシダレクチン（ＵＥＡ−Ｉ）及びミヤゴグサレクチン（Ｌｏｔｕｓ）からなる群から選ばれる少なくとも一種のレクチンを用いたレクチン染色により大腸癌と診断されたものを用いることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の大腸癌の判別方法。
【請求項６】
前記フコースα１→６特異的レクチンを標識したもので、前記検体をレクチン染色することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の大腸癌の判別方法。
【請求項７】
フコースα１→６特異的レクチンによる大腸癌の腫瘍組織の染色結果が、正常細胞の場合と同等かあるいはそれ以下であったら、悪性度が高いということを示唆する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の大腸癌の判別方法。
【請求項８】
前記悪性度が高いとは、大腸がんが将来転移しやすいこと、又は、分化度が未分化であることをいう、請求項７に記載の大腸癌の判別方法。
【請求項９】
フコースα１→６特異的レクチンであって、
（１）担子菌から抽出することができ、
（２）ＳＤＳ電気泳動法による分子量が４，０００〜４０，０００であり、及び、
（３）フコースα１→６糖鎖に対して結合定数１．０×１０４Ｍ−１以上（２５℃において）で示される親和性を有する
前記フコースα１→６特異的レクチンを含む、大腸癌判別用診断薬又はキット。
【請求項１０】
大腸癌の一次スクリーニング用として、ＡＡＬ及び／又は抗ＧＭＤ抗体を含む、請求項９に記載の大腸癌判別用診断薬又はキット。
【請求項１】
大腸癌の腫瘍組織から採取した検体に、
（１）担子菌から抽出することができ、
（２）ＳＤＳ電気泳動法による分子量が４，０００〜４０，０００であり、及び、
（３）フコースα１→６糖鎖に対して結合定数１．０×１０４Ｍ−１以上（２５℃において）で示される親和性を有する
フコースα１→６特異的レクチンを作用させることを含む、大腸癌の判別方法。
【請求項２】
前記フコースα１→６特異的レクチンは、さらに、（４）フコースα１→６糖鎖を含まないハイマンノース糖鎖及び／又は糖脂質に対して実質的に結合しないことを特徴とする、請求項１に記載の大腸癌の判別方法。
【請求項３】
前記担子菌が、モエギタケ科、キシメジ科、テングタケ科又はタコウキン科に属することを特徴とする、請求項１又は２に記載の大腸癌の判別方法。
【請求項４】
前記担子菌が、ツチスギタケ、スギタケ、ヌメリスギタケモドキ、サケツバタケ、クリタケ、コムラサキシメジ又はベニテングタケであることを特徴とする、請求項１、２又は３に記載の大腸癌の判別方法。
【請求項５】
前記検体には、ヒイロチャワンタケレクチン（ＡＡＬ）、レンズマメレクチン（ＬＣＡ）、エンドウマメレクチン（ＰＳＡ）、ラッパスイセンレクチン（ＮＰＡ）、ソラマメレクチン（ＶＦＡ）、麹菌レクチン（ＡＯＬ）、ハリエニシダレクチン（ＵＥＡ−Ｉ）及びミヤゴグサレクチン（Ｌｏｔｕｓ）からなる群から選ばれる少なくとも一種のレクチンを用いたレクチン染色により大腸癌と診断されたものを用いることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の大腸癌の判別方法。
【請求項６】
前記フコースα１→６特異的レクチンを標識したもので、前記検体をレクチン染色することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の大腸癌の判別方法。
【請求項７】
フコースα１→６特異的レクチンによる大腸癌の腫瘍組織の染色結果が、正常細胞の場合と同等かあるいはそれ以下であったら、悪性度が高いということを示唆する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の大腸癌の判別方法。
【請求項８】
前記悪性度が高いとは、大腸がんが将来転移しやすいこと、又は、分化度が未分化であることをいう、請求項７に記載の大腸癌の判別方法。
【請求項９】
フコースα１→６特異的レクチンであって、
（１）担子菌から抽出することができ、
（２）ＳＤＳ電気泳動法による分子量が４，０００〜４０，０００であり、及び、
（３）フコースα１→６糖鎖に対して結合定数１．０×１０４Ｍ−１以上（２５℃において）で示される親和性を有する
前記フコースα１→６特異的レクチンを含む、大腸癌判別用診断薬又はキット。
【請求項１０】
大腸癌の一次スクリーニング用として、ＡＡＬ及び／又は抗ＧＭＤ抗体を含む、請求項９に記載の大腸癌判別用診断薬又はキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【公開番号】特開２０１１−１４９８２６（Ｐ２０１１−１４９８２６Ａ）
【公開日】平成２３年８月４日（２０１１．８．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１１４４６（Ｐ２０１０−１１４４６）
【出願日】平成２２年１月２１日（２０１０．１．２１）
【出願人】（３０２０４２６７８）株式会社Ｊ−オイルミルズ (75)
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年８月４日（２０１１．８．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１月２１日（２０１０．１．２１）
【出願人】（３０２０４２６７８）株式会社Ｊ−オイルミルズ (75)
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【Ｆターム（参考）】
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