大腸癌マーカー検出方法
【課題】従来の便潜血検査を超える感度及び特異度を有する非侵襲的かつ簡便な大腸癌診断のための腫瘍マーカーの検出方法を提供する。
【解決手段】採取された、場合により液体窒素を用いて直ちに凍結された生物学的サンプルを、ＲＮＡ分解酵素阻害剤の存在下で均質化し、懸濁物を調製し、得られた懸濁物からＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡを逆転写しｃＤＮＡを得、得られたｃＤＮＡを増幅し、増幅されたｃＤＮＡを検出する、大腸癌診断のための腫瘍マーカーの検出方法であって、生物学的サンプルから細胞成分を分離する手段を含まない方法。
【解決手段】採取された、場合により液体窒素を用いて直ちに凍結された生物学的サンプルを、ＲＮＡ分解酵素阻害剤の存在下で均質化し、懸濁物を調製し、得られた懸濁物からＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡを逆転写しｃＤＮＡを得、得られたｃＤＮＡを増幅し、増幅されたｃＤＮＡを検出する、大腸癌診断のための腫瘍マーカーの検出方法であって、生物学的サンプルから細胞成分を分離する手段を含まない方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的サンプルから細胞成分を分離する手段を含まないことを特徴とする、生物学的サンプルからＲＮＡを抽出する工程を含む大腸癌診断のための腫瘍マーカーの検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
大腸癌による死亡者が、増加している。大腸癌による死亡者は、全ての癌による死亡者のうち男性においては第４番目、女性においては第２番目に多い癌である（１９９９年度癌死統計）。また、２０１５年の癌患者推計では、男女とも似に第一位になると推計されており、二次的な予防を含めた総合的な大腸癌対策が求められており、癌の集団検診は、最も効果的な方法の一つである。
【０００３】
癌の集団検診（mass screening）のためには、簡便かつ非侵襲性の検出方法であることが重要である。現在利用することができる唯一の非侵襲性の方法は、潜血の有無を調べる糞便検査、すなわち便潜血検査であり、大腸癌の集団検診の標準方法として広く用いられている。
【０００４】
しかし、便潜血検査は、糞便中にヘモグロビンが現れることが腫瘍に特異的なものではないことから、感度及び特異度が低く（感度３０〜９０％、特異度７０〜９８％）、そのため偽陰性や偽陽性が少なからず存在するという欠点がある。
【０００５】
また、大腸癌の診断には、免疫学的便潜血法によるスクリーニングの後か、又は同時に、全大腸内視鏡検査又は注腸検査とＳ状結腸内視鏡検査とが組み合わせて用いられており、多大な時間と労力がかかるという欠点がある。
【０００６】
便潜血検査の代替法としては、糞便中のＫ−ｒａｓ、ｐ−５３、ＡＰＣ遺伝子変異やマイクロサテライト不安定性を検出する等のＤＮＡを用いた方法が報告されている（シドランスキー等著（D. Sidransky, et al.）、サイエンス（Science）、第２５６巻、１９９２年４月３日、第１０２頁〜第１０５頁；ドン等著（S.M.Dong, et al.）、ジャーナル・オブ・ザ・ナショナル・キャンサー・インスティテュート（Journal of the National Cancer Institute）、第９３巻、第１１号、２００１年６月１１日、第８５８頁〜第８６５頁；トラベルソ等著（G.Traverso, et al.）、ザ・ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（The New England Journal of Medicine）、第３４６巻、第５号、２００２年１月３１日、第３１１頁〜第３２０頁；トラベルソ等著（G.Traverso, et al.）、ザ・ランセット（The Lncet）、第３５９巻、２００２年２月２日、第４０３頁〜第４０４頁）。
【０００７】
これらのＤＮＡを用いる方法は、非侵襲的で癌細胞の直接的変化を捉えることができる方法であり、特異度が高いという特徴を有し、将来性豊かな方法と考えられるが、従来技術である便潜血検査と比べると感度が低く、また、時間と労力もかなりかかるという欠点がある。
【０００８】
また、さらなる便潜血検査の代替法として、遺伝子発現をより直接的に検出するために、糞便中のタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）等のｍＲＮＡを検出する方法も開発されている（デビッドソン等著（L.A.Davidson, et al.）、カーシノジェネシス（Carcinogenesis）、第１９巻、第２号、１９９８年、第２５３頁〜第２５７頁；アレキサンダー及びライハット等著（R.J.Alexander and R.F.Raicht）、ダイジェスティブ・デジージス・アンド・サイエンス（Digestive Diseases and Sciences）、第４３巻、第１２号、１９９８年、第２６５２頁〜第２６５８頁；ヤマオ等著（T.Yamao et al.）、ガストロエンテロロジー（Gastroenterology）、第１１４巻、第６号、１９９８年、第１１９８頁〜第１２０５頁）。
【０００９】
しかし、上記のＲＮＡを用いる方法によっても、少量の糞便から簡便かつ効率的にＲＮＡを抽出することができず、便潜血法を超える感度を得ることができなかった。
【００１０】
ＰＣＲ法を逆転写酵素反応（ＲＴ）と組み合わせることによって、ＲＮＡを定性的に、また定量的に検出する方法が知られている。このＲＴ−ＰＣＲ法は、微量分子を検出することができる感度の高さで、ノーザンブロット法に優り、また、手技の速さや容易さでin situハイブリダイゼーション法に優るものである。
【００１１】
しかし、ＲＮＡは、ＤＮＡに比べて不安定であり、かつ、全ての生物学的試料中に普遍的に存在し、極めて安定であるＲＮＡ分解酵素（ＲＮａｓｅ）による分解の危険性に常にさらされていることから、ＲＴ−ＰＣＲ法においても、ＲＮＡの精製過程及び精製後においても、ＲＮａｓｅが混入しないように厳密な管理が要求される。
【００１２】
したがって、糞便という生物学的に極めて粗製の試料からＲＮＡを抽出する際には、ＲＮａｓｅの影響を排除するために、予め細胞画分を分離する工程が必要とされていた。
【００１３】
したがって、極めて多量の微生物に由来する膨大な量のＲＮａｓｅが存在する糞便中から直接ＲＮＡを検出することは、不可能であり、少なくとも微生物等に由来する外因性ＲＮａｓｅ除去のために細胞画分の分離は、必須であると考えられていた。
【００１４】
しかし、本発明者は、驚くべきことに、場合により凍結した生物学的試料をＲＮＡ分解酵素阻害剤の存在下に均質化することによって、上記課題を解決することができることを発見し、本発明を完成させた。
【００１５】
発明の開示
したがって、本発明の目的は、従来の便潜血検査を超える感度及び特異度を有する非侵襲的かつ簡便な大腸癌診断のための腫瘍マーカーの検出方法を提供することにある。
【００１６】
本発明は、下記工程：
ａ）採取された生物学的サンプルをＲＮＡ分解酵素阻害剤の存在下で均質化し、懸濁物を調製する工程、
を含む大腸癌診断のための腫瘍マーカーの検出方法に用いるＲＮＡを抽出するための試料の調製方法であって、
生物学的サンプルから細胞成分を分離する工程を含まないことを特徴とする方法である。
【００１７】
ここで、該採取された生物学的サンプルは、凍結されていることが好ましい。
【００１８】
また、本発明は、ＲＮＡ分解酵素阻害剤が、チオシアン酸グアニジンである、上記方法である。
【００１９】
また、本発明は、生物学的サンプルが、糞便である、上記の方法である。
【００２０】
また、本発明は、上記の方法の工程に加えて、下記工程：
ｂ）得られたＲＮＡを抽出するための試料から、ＲＮＡを抽出する工程、
ｃ）抽出されたＲＮＡを逆転写し、ｃＤＮＡを得る工程、
ｄ）得られたｃＤＮＡを増幅する工程、及び
ｅ）増幅されたｃＤＮＡを検出する工程
を含む、大腸癌診断のための腫瘍マーカーの検出方法である。
【００２１】
本発明は、腫瘍マーカーが、ＣＯＸ−２である、大腸癌診断のための腫瘍マーカーの検出方法である。
【００２２】
また、本発明は、下記手段：
ａ）採取された生物学的サンプルをＲＮＡ分解酵素阻害剤の存在下で均質化し、懸濁物を調製する手段、
を含む大腸癌診断のための腫瘍マーカーの検出方法に用いるＲＮＡを抽出するための試料の調製のためのキットであって、
生物学的サンプルから細胞成分を分離する手段を含まないことを特徴とするキットである。
【００２３】
また、本発明のキットは、好ましくは、該採取された生物学的サンプルを凍結する手段を含む。
【００２４】
また、本発明は、ＲＮＡ分解酵素阻害剤が、チオシアン酸グアニジンである、上記のキットである。
【００２５】
また、本発明は、生物学的サンプルが、糞便である、上記のキットである。
【００２６】
また、本発明は、さらに、下記手段：
ｂ）得られたＲＮＡを抽出するための試料から、ＲＮＡを抽出する手段、
ｃ）抽出されたＲＮＡを逆転写し、ｃＤＮＡを得る手段、
ｄ）得られたｃＤＮＡを増幅する手段、及び
ｅ）増幅されたｃＤＮＡを検出する手段
を含む、大腸癌診断のための腫瘍マーカーの検出キットである。
【００２７】
また、本発明は、腫瘍マーカーが、ＣＯＸ−２である、上記のキットである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本発明のＲＮＡ分解酵素阻害剤としては、チオシアン酸グアニジン、アイソジェン（Ｉｓｏｇｅｎｅ）、ウルトラスペックII（登録商標）（Ｕｌｔｒａｓｐｅｃ II）等が挙げられる。
【００２９】
本発明の生物学的サンプルとしては、動植物組織、体液、排泄物等を挙げることができ、好ましくは、糞便、より好ましくは、ヒトの糞便である。
【００３０】
本発明の生物学的サンプルは、そのままか、又は場合により凍結して用いることができる。
【００３１】
凍結方法は、任意の従来技術を用いることができ、好ましくは、液体窒素を用いる方法である。凍結温度は、保存温度は、−１〜−１９６℃、好ましくは、−２０〜−１９６℃、好ましくは、−７５〜−１９６℃、より好ましくは、−１１０〜−１９６℃、最も好ましくは−１９６℃である。
【００３２】
凍結されたサンプルは、冷凍保存してもよい。保存温度は、−７５〜−１９６℃、好ましくは、−１１０〜−１９６℃、より好ましくは−１９６℃である。保存期間は、１日〜１０年、好ましくは、１日〜３年、より好ましくは、１日〜１年である。
【００３３】
本発明で用いられる腫瘍マーカーとしては、ＣＯＸ−２、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、ｃ−ｍｅｔ、ＣＤ４４変異体（variants）、ＥＧＦ−Ｒ、ＥＦ−１、Ｗｎｔ−２、ブラディオン（Bradeion）、ＳＫＰ２、ＫＰＣ−１、ＫＰＣ−２、ＰＲＬ−３、アンギオゲニン（Angiogenin）、インテグリン（Integrin）、Ｓｎａｉｌ、Ｄｙｓａｄｈｅｒｉｎ等が挙げられるが、好ましくは、ＣＯＸ−２である。
【００３４】
上記工程ｃ）〜ｅ）は、ＲＴ−ＰＣＲ法と呼ばれるものであり、例えば、関谷剛男等編、ＰＣＲ法最前線、１９９７年、共立出版、第１８７頁〜第１９６頁の記載にしたがって行うことができる。
【００３５】
懸濁物からのＲＮＡの抽出は、従来公知の方法を用いることができ、例えば、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ（ＱＩＡＧＥＮ）やＲＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Pharmacia Biotech）のような市販のキットを用いることができる。
【００３６】
本発明で逆転写とは、逆転写酵素（Reverse Transcriptase）を用いてＲＮＡを相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に転換することをいう。逆転写反応は、通常、バッファー、ＭｇＣｌ2やＫＣｌ等の塩類、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、プライマー、デオキシリボヌクレオチド類、ＲＮａｓｅ阻害剤及び逆転写酵素を含む溶液を用いて行われる。上記塩類は、適宜、他の塩類に変更して試用することができる。また、ゼラチン、アルブミン等のタンパク質や界面活性剤等を添加することもできる。
【００３７】
逆転写に続いて行われるｃＤＮＡの増幅は、通常、ＰＣＲが用いられる。ＰＣＲの反応液は、通常、バッファー、ＭｇＣｌ2やＫＣｌ等の塩類、プライマー、デオキシリボヌクレオチド類、及び耐熱性ポリメラーゼを含む。上記塩類は、適宜、他の塩類に変更して試用することができる。また、ゼラチン、アルブミン等のタンパク質、ジメチルスルホキシドや界面活性剤等を添加することもできる。
【００３８】
ｃＤＮＡの増幅は、ＬＡＭＰ法（特許第３３１３３５８号公報）やＩＣＡＮ法（特開２００１−１３６９６５）を用いることもできる。
【００３９】
本発明でプライマーとは、ｃＤＮＡ合成や核酸増幅の際の合成開始点として働くオリゴヌクレオチドをいう。プライマーは一本鎖であることが望ましいが、日本鎖も使用することができる。プライマーが二本鎖である場合には、増幅反応に先立ち、一本鎖にすることが望ましい。プライマーは、公知の方法にしたがって合成することができ、また、生物から単離することもできる。
【００４０】
逆転写反応に使用する逆転写酵素は、ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写することができる酵素を意味する。逆転写酵素としては、ＲＡＶ（Rous associated virus）やＡＭＶ（Avian myeloblastosis virus）等のレトロウイルス由来の逆転写酵素や、ＭＭＬＶ（Moloney murine leukemia virus）等のマウスのレトロウイルス由来の逆転写酵素があるが、これらに限定されるものではない。
【００４１】
ＰＣＲに用いる耐熱性ポリメラーゼとしては、Ｔａｑポリメラーゼが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００４２】
増幅されたＤＮＡの検出方法としては、アガロースゲルを用いる電気泳動を用いることができるが、これに限定されるものではない。
【００４３】
また、本発明のキットには、本発明の方法を記載した指示書を含むこともできる。
【実施例１】
【００４４】
以下の実施例は、本発明を説明するものであるが、本発明を限定するものではない。
【００４５】
浜松医科大学第１内科に精査・治療目的のために入院し、全大腸内視鏡によって大腸癌の存在が確認された患者３０例、及び大腸に腫瘍又は炎症性変化のない（非大腸疾患）患者２２例を対象とした。なお、すべての患者からインフォームドコンセントが得られている。
【００４６】
糞便は、採便後可及的速やかに５mlチューブに約１ｇずつ分取し、液体窒素を用いて凍結させ、−８０℃で保存した。また、比較対照のため、それぞれの試料について免疫学的便潜血検査法により便中のヒトヘモグロビン（Ｈｂ）を測定した。組織は、治療前に受けた内視鏡検査時に癌部と正常部の生検材料を液体窒素で凍結してから−８０℃で保存した。その後、ホモジナイザーとグアニジン塩とフェノールを用いてホモジナイズし、クロロホルムとエタノールで全ＲＮＡを抽出した。
【００４７】
得られたＲＮＡの１μgをリバースクリプトII（登録商標）（反応液量２０μl、和光純薬）を用いて逆転写しｃＤＮＡを得、その一部をＧｅｎｅ Ｔａｑ（和光純薬）を用いて、ネスティドＰＣＲによって増幅させた。得られたＰＣＲを、４％アガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色した。
【００４８】
なお、用いたプライマーは、逆転写では、ランダムプライマーであり、ＰＣＲでは、ＣＥＡについては、Ｇｅｒｈａｒｄ（ＪＪＣＯ、１９９４）に報告されたものであり、ＣＯＸ−２については、独自に設計したものを使用した。ＰＣＲは、第１ラウンドを２０サイクルで、第２ラウンドを２５サイクルで行った。
【００４９】
使用したプライマーを下記に示す。
＜ＣＥＡ＞
フォワード１：5'-TCTGGAACTTCTCCTGGTCTCTCAGCTGG-3'
フォワード２：5'-GGGCCACTGCTGGCATCATGATTG-3'
リバース ：5'-TGTAGCTGTTGCAAATGCTTTAAGGAAGAAGC-3'
＜ＣＯＸ−２＞
フォワード１：5'-CTGAAAACTCCAAACACAG-3'
フォワード２：5'-GCACTACATACTTACCCACTTCAA-3'
リバース ：5'-ATAGGAGAGGTTAGAGAAGGCT-3'
【００５０】
結果
大腸癌３０例（早期癌３例、進行癌２７例）と対照群２２例における糞便からのＲＴ−ＰＣＲによるＣＥＡ、ＣＯＸ−２の検出を試みたところ、以下の結果を得た。
【００５１】
ＣＥＡは、大腸癌３０例中の全例で、対照群２２例中の２１例で検出された。また、両者からＲＴ−ＰＣＲで増幅し得るＲＮＡの抽出が行えることが判明した。
【００５２】
ＣＯＸ−２は、大腸癌３０例中の２７例（盲腸２／２、上行結腸３／５、下行き結腸１／１、Ｓ状結腸７／７、直腸１２／１３、早期癌２／３、進行癌２５／２７）で検出されたが、対照群２２例中では、１例も検出されなかった（感度９０％、特異度１００％）。
【００５３】
免疫学的便潜血検査法では、大腸癌２８例中２３例及び対照群２２例中３例が陽性であった（感度８２．１％、特異度８６．３％）。
【００５４】
ＣＯＸ−２陰性大腸癌３例中では、１例で免疫学的便潜血検査が陽性であり、２例が陰性であった。
【００５５】
免疫学的便潜血検査が陰性の大腸癌５例中３例で、ＣＯＸ−２が検出された。
【実施例２】
【００５６】
ヒト糞便から得られる全ＲＮＡの量及び分子量の分布を、本発明の方法とアレキサンダーの方法（非特許文献６）とで比較した。対象として、ヒトの大腸癌組織から市販のＲＮＡ抽出剤（アイソジェン、和光純薬）を用いて全ＲＮＡを抽出した。
【００５７】
それぞれの試料から抽出された全ＲＮＡの同一量をアガロースゲル上で電気泳動した。
【００５８】
レーン３（ヒト大腸癌組織由来ＲＮＡ）において認められる２本の主要バンドは、２８Ｓ及び１８ＳｒＲＮＡを示す。また、スメア状の部分は、得られた全ＲＮＡ中に種々の高分子ＲＮＡが含まれていることを示す。
【００５９】
レーン２（本発明の方法による糞便由来ＲＮＡ）において認められる２本の主要バンドは、腸内細菌由来の２３Ｓ及び１６ＳｒＲＮＡを示す。また、レーン３と同様にスメア状の部分が認められることから、本願発明の方法によって糞便から得られた全ＲＮＡ中には、種々の高分子ＲＮＡが含まれていると考えられる。
【００６０】
これに対して、レーン１では、いかなるバンドもスメアも全く認められず、試料抽出物中には、高分子ＲＮＡが含まれていないことを示した。
【００６１】
実際に、レーン２のサンプルからはＲＴ−ＰＣＲで目的の産物が得られたが、レーン１のサンプルからは、ＰＣＲ産物は得られなかった。
【００６２】
本研究結果から、本発明の方法によってヒト糞便から抽出されたＲＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲによる増幅が可能であることが明らかとなった。また、ＲＴ−ＰＣＲによる糞便からのＣＯＸ−２の検出は、９０％の感度及び１００％の特異度を有することから、従来技術である免疫学的便潜血法に比べて優れていることが証明された。
【００６３】
また、本発明の方法は、報告されているＡＰＣ、Ｋ−ｒａｓやｐ５３遺伝子変異の検出に比べて、検出に必要とする糞便の量が少なくかつ検出感度が高いことから、検出にかかる時間及び労力を大幅に節約することができる。
【００６４】
従来技術の便潜血法が、病変からの「出血」という一般的かつ間接的な事象を対象とするのに対し、本発明の方法は、発癌マーカーであるＣＯＸ−２発現という特異的かつ直接的な事象を対象とすることから、本発明の方法によって得られたデータは、より品質の高い診断を提供することができる。
【００６５】
したがって、本発明の方法は、特異度及び感度の高い新規大腸癌の非侵襲的スクリーニング方法として臨床的に極めて有用なものである。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】図１は、実施例２の電気泳動結果である。レーン１は、アレキサンダーらの方法でヒト糞便から抽出された全ＲＮＡである。レーン２は、本発明の方法でヒト糞便から抽出された全ＲＮＡである。レーン３は、ヒト大腸癌組織から抽出された全ＲＮＡである。レーンＭは、分子量マーカーである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的サンプルから細胞成分を分離する手段を含まないことを特徴とする、生物学的サンプルからＲＮＡを抽出する工程を含む大腸癌診断のための腫瘍マーカーの検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
大腸癌による死亡者が、増加している。大腸癌による死亡者は、全ての癌による死亡者のうち男性においては第４番目、女性においては第２番目に多い癌である（１９９９年度癌死統計）。また、２０１５年の癌患者推計では、男女とも似に第一位になると推計されており、二次的な予防を含めた総合的な大腸癌対策が求められており、癌の集団検診は、最も効果的な方法の一つである。
【０００３】
癌の集団検診（mass screening）のためには、簡便かつ非侵襲性の検出方法であることが重要である。現在利用することができる唯一の非侵襲性の方法は、潜血の有無を調べる糞便検査、すなわち便潜血検査であり、大腸癌の集団検診の標準方法として広く用いられている。
【０００４】
しかし、便潜血検査は、糞便中にヘモグロビンが現れることが腫瘍に特異的なものではないことから、感度及び特異度が低く（感度３０〜９０％、特異度７０〜９８％）、そのため偽陰性や偽陽性が少なからず存在するという欠点がある。
【０００５】
また、大腸癌の診断には、免疫学的便潜血法によるスクリーニングの後か、又は同時に、全大腸内視鏡検査又は注腸検査とＳ状結腸内視鏡検査とが組み合わせて用いられており、多大な時間と労力がかかるという欠点がある。
【０００６】
便潜血検査の代替法としては、糞便中のＫ−ｒａｓ、ｐ−５３、ＡＰＣ遺伝子変異やマイクロサテライト不安定性を検出する等のＤＮＡを用いた方法が報告されている（シドランスキー等著（D. Sidransky, et al.）、サイエンス（Science）、第２５６巻、１９９２年４月３日、第１０２頁〜第１０５頁；ドン等著（S.M.Dong, et al.）、ジャーナル・オブ・ザ・ナショナル・キャンサー・インスティテュート（Journal of the National Cancer Institute）、第９３巻、第１１号、２００１年６月１１日、第８５８頁〜第８６５頁；トラベルソ等著（G.Traverso, et al.）、ザ・ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（The New England Journal of Medicine）、第３４６巻、第５号、２００２年１月３１日、第３１１頁〜第３２０頁；トラベルソ等著（G.Traverso, et al.）、ザ・ランセット（The Lncet）、第３５９巻、２００２年２月２日、第４０３頁〜第４０４頁）。
【０００７】
これらのＤＮＡを用いる方法は、非侵襲的で癌細胞の直接的変化を捉えることができる方法であり、特異度が高いという特徴を有し、将来性豊かな方法と考えられるが、従来技術である便潜血検査と比べると感度が低く、また、時間と労力もかなりかかるという欠点がある。
【０００８】
また、さらなる便潜血検査の代替法として、遺伝子発現をより直接的に検出するために、糞便中のタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）等のｍＲＮＡを検出する方法も開発されている（デビッドソン等著（L.A.Davidson, et al.）、カーシノジェネシス（Carcinogenesis）、第１９巻、第２号、１９９８年、第２５３頁〜第２５７頁；アレキサンダー及びライハット等著（R.J.Alexander and R.F.Raicht）、ダイジェスティブ・デジージス・アンド・サイエンス（Digestive Diseases and Sciences）、第４３巻、第１２号、１９９８年、第２６５２頁〜第２６５８頁；ヤマオ等著（T.Yamao et al.）、ガストロエンテロロジー（Gastroenterology）、第１１４巻、第６号、１９９８年、第１１９８頁〜第１２０５頁）。
【０００９】
しかし、上記のＲＮＡを用いる方法によっても、少量の糞便から簡便かつ効率的にＲＮＡを抽出することができず、便潜血法を超える感度を得ることができなかった。
【００１０】
ＰＣＲ法を逆転写酵素反応（ＲＴ）と組み合わせることによって、ＲＮＡを定性的に、また定量的に検出する方法が知られている。このＲＴ−ＰＣＲ法は、微量分子を検出することができる感度の高さで、ノーザンブロット法に優り、また、手技の速さや容易さでin situハイブリダイゼーション法に優るものである。
【００１１】
しかし、ＲＮＡは、ＤＮＡに比べて不安定であり、かつ、全ての生物学的試料中に普遍的に存在し、極めて安定であるＲＮＡ分解酵素（ＲＮａｓｅ）による分解の危険性に常にさらされていることから、ＲＴ−ＰＣＲ法においても、ＲＮＡの精製過程及び精製後においても、ＲＮａｓｅが混入しないように厳密な管理が要求される。
【００１２】
したがって、糞便という生物学的に極めて粗製の試料からＲＮＡを抽出する際には、ＲＮａｓｅの影響を排除するために、予め細胞画分を分離する工程が必要とされていた。
【００１３】
したがって、極めて多量の微生物に由来する膨大な量のＲＮａｓｅが存在する糞便中から直接ＲＮＡを検出することは、不可能であり、少なくとも微生物等に由来する外因性ＲＮａｓｅ除去のために細胞画分の分離は、必須であると考えられていた。
【００１４】
しかし、本発明者は、驚くべきことに、場合により凍結した生物学的試料をＲＮＡ分解酵素阻害剤の存在下に均質化することによって、上記課題を解決することができることを発見し、本発明を完成させた。
【００１５】
発明の開示
したがって、本発明の目的は、従来の便潜血検査を超える感度及び特異度を有する非侵襲的かつ簡便な大腸癌診断のための腫瘍マーカーの検出方法を提供することにある。
【００１６】
本発明は、下記工程：
ａ）採取された生物学的サンプルをＲＮＡ分解酵素阻害剤の存在下で均質化し、懸濁物を調製する工程、
を含む大腸癌診断のための腫瘍マーカーの検出方法に用いるＲＮＡを抽出するための試料の調製方法であって、
生物学的サンプルから細胞成分を分離する工程を含まないことを特徴とする方法である。
【００１７】
ここで、該採取された生物学的サンプルは、凍結されていることが好ましい。
【００１８】
また、本発明は、ＲＮＡ分解酵素阻害剤が、チオシアン酸グアニジンである、上記方法である。
【００１９】
また、本発明は、生物学的サンプルが、糞便である、上記の方法である。
【００２０】
また、本発明は、上記の方法の工程に加えて、下記工程：
ｂ）得られたＲＮＡを抽出するための試料から、ＲＮＡを抽出する工程、
ｃ）抽出されたＲＮＡを逆転写し、ｃＤＮＡを得る工程、
ｄ）得られたｃＤＮＡを増幅する工程、及び
ｅ）増幅されたｃＤＮＡを検出する工程
を含む、大腸癌診断のための腫瘍マーカーの検出方法である。
【００２１】
本発明は、腫瘍マーカーが、ＣＯＸ−２である、大腸癌診断のための腫瘍マーカーの検出方法である。
【００２２】
また、本発明は、下記手段：
ａ）採取された生物学的サンプルをＲＮＡ分解酵素阻害剤の存在下で均質化し、懸濁物を調製する手段、
を含む大腸癌診断のための腫瘍マーカーの検出方法に用いるＲＮＡを抽出するための試料の調製のためのキットであって、
生物学的サンプルから細胞成分を分離する手段を含まないことを特徴とするキットである。
【００２３】
また、本発明のキットは、好ましくは、該採取された生物学的サンプルを凍結する手段を含む。
【００２４】
また、本発明は、ＲＮＡ分解酵素阻害剤が、チオシアン酸グアニジンである、上記のキットである。
【００２５】
また、本発明は、生物学的サンプルが、糞便である、上記のキットである。
【００２６】
また、本発明は、さらに、下記手段：
ｂ）得られたＲＮＡを抽出するための試料から、ＲＮＡを抽出する手段、
ｃ）抽出されたＲＮＡを逆転写し、ｃＤＮＡを得る手段、
ｄ）得られたｃＤＮＡを増幅する手段、及び
ｅ）増幅されたｃＤＮＡを検出する手段
を含む、大腸癌診断のための腫瘍マーカーの検出キットである。
【００２７】
また、本発明は、腫瘍マーカーが、ＣＯＸ−２である、上記のキットである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本発明のＲＮＡ分解酵素阻害剤としては、チオシアン酸グアニジン、アイソジェン（Ｉｓｏｇｅｎｅ）、ウルトラスペックII（登録商標）（Ｕｌｔｒａｓｐｅｃ II）等が挙げられる。
【００２９】
本発明の生物学的サンプルとしては、動植物組織、体液、排泄物等を挙げることができ、好ましくは、糞便、より好ましくは、ヒトの糞便である。
【００３０】
本発明の生物学的サンプルは、そのままか、又は場合により凍結して用いることができる。
【００３１】
凍結方法は、任意の従来技術を用いることができ、好ましくは、液体窒素を用いる方法である。凍結温度は、保存温度は、−１〜−１９６℃、好ましくは、−２０〜−１９６℃、好ましくは、−７５〜−１９６℃、より好ましくは、−１１０〜−１９６℃、最も好ましくは−１９６℃である。
【００３２】
凍結されたサンプルは、冷凍保存してもよい。保存温度は、−７５〜−１９６℃、好ましくは、−１１０〜−１９６℃、より好ましくは−１９６℃である。保存期間は、１日〜１０年、好ましくは、１日〜３年、より好ましくは、１日〜１年である。
【００３３】
本発明で用いられる腫瘍マーカーとしては、ＣＯＸ−２、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、ｃ−ｍｅｔ、ＣＤ４４変異体（variants）、ＥＧＦ−Ｒ、ＥＦ−１、Ｗｎｔ−２、ブラディオン（Bradeion）、ＳＫＰ２、ＫＰＣ−１、ＫＰＣ−２、ＰＲＬ−３、アンギオゲニン（Angiogenin）、インテグリン（Integrin）、Ｓｎａｉｌ、Ｄｙｓａｄｈｅｒｉｎ等が挙げられるが、好ましくは、ＣＯＸ−２である。
【００３４】
上記工程ｃ）〜ｅ）は、ＲＴ−ＰＣＲ法と呼ばれるものであり、例えば、関谷剛男等編、ＰＣＲ法最前線、１９９７年、共立出版、第１８７頁〜第１９６頁の記載にしたがって行うことができる。
【００３５】
懸濁物からのＲＮＡの抽出は、従来公知の方法を用いることができ、例えば、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ（ＱＩＡＧＥＮ）やＲＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Pharmacia Biotech）のような市販のキットを用いることができる。
【００３６】
本発明で逆転写とは、逆転写酵素（Reverse Transcriptase）を用いてＲＮＡを相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に転換することをいう。逆転写反応は、通常、バッファー、ＭｇＣｌ2やＫＣｌ等の塩類、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、プライマー、デオキシリボヌクレオチド類、ＲＮａｓｅ阻害剤及び逆転写酵素を含む溶液を用いて行われる。上記塩類は、適宜、他の塩類に変更して試用することができる。また、ゼラチン、アルブミン等のタンパク質や界面活性剤等を添加することもできる。
【００３７】
逆転写に続いて行われるｃＤＮＡの増幅は、通常、ＰＣＲが用いられる。ＰＣＲの反応液は、通常、バッファー、ＭｇＣｌ2やＫＣｌ等の塩類、プライマー、デオキシリボヌクレオチド類、及び耐熱性ポリメラーゼを含む。上記塩類は、適宜、他の塩類に変更して試用することができる。また、ゼラチン、アルブミン等のタンパク質、ジメチルスルホキシドや界面活性剤等を添加することもできる。
【００３８】
ｃＤＮＡの増幅は、ＬＡＭＰ法（特許第３３１３３５８号公報）やＩＣＡＮ法（特開２００１−１３６９６５）を用いることもできる。
【００３９】
本発明でプライマーとは、ｃＤＮＡ合成や核酸増幅の際の合成開始点として働くオリゴヌクレオチドをいう。プライマーは一本鎖であることが望ましいが、日本鎖も使用することができる。プライマーが二本鎖である場合には、増幅反応に先立ち、一本鎖にすることが望ましい。プライマーは、公知の方法にしたがって合成することができ、また、生物から単離することもできる。
【００４０】
逆転写反応に使用する逆転写酵素は、ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写することができる酵素を意味する。逆転写酵素としては、ＲＡＶ（Rous associated virus）やＡＭＶ（Avian myeloblastosis virus）等のレトロウイルス由来の逆転写酵素や、ＭＭＬＶ（Moloney murine leukemia virus）等のマウスのレトロウイルス由来の逆転写酵素があるが、これらに限定されるものではない。
【００４１】
ＰＣＲに用いる耐熱性ポリメラーゼとしては、Ｔａｑポリメラーゼが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００４２】
増幅されたＤＮＡの検出方法としては、アガロースゲルを用いる電気泳動を用いることができるが、これに限定されるものではない。
【００４３】
また、本発明のキットには、本発明の方法を記載した指示書を含むこともできる。
【実施例１】
【００４４】
以下の実施例は、本発明を説明するものであるが、本発明を限定するものではない。
【００４５】
浜松医科大学第１内科に精査・治療目的のために入院し、全大腸内視鏡によって大腸癌の存在が確認された患者３０例、及び大腸に腫瘍又は炎症性変化のない（非大腸疾患）患者２２例を対象とした。なお、すべての患者からインフォームドコンセントが得られている。
【００４６】
糞便は、採便後可及的速やかに５mlチューブに約１ｇずつ分取し、液体窒素を用いて凍結させ、−８０℃で保存した。また、比較対照のため、それぞれの試料について免疫学的便潜血検査法により便中のヒトヘモグロビン（Ｈｂ）を測定した。組織は、治療前に受けた内視鏡検査時に癌部と正常部の生検材料を液体窒素で凍結してから−８０℃で保存した。その後、ホモジナイザーとグアニジン塩とフェノールを用いてホモジナイズし、クロロホルムとエタノールで全ＲＮＡを抽出した。
【００４７】
得られたＲＮＡの１μgをリバースクリプトII（登録商標）（反応液量２０μl、和光純薬）を用いて逆転写しｃＤＮＡを得、その一部をＧｅｎｅ Ｔａｑ（和光純薬）を用いて、ネスティドＰＣＲによって増幅させた。得られたＰＣＲを、４％アガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色した。
【００４８】
なお、用いたプライマーは、逆転写では、ランダムプライマーであり、ＰＣＲでは、ＣＥＡについては、Ｇｅｒｈａｒｄ（ＪＪＣＯ、１９９４）に報告されたものであり、ＣＯＸ−２については、独自に設計したものを使用した。ＰＣＲは、第１ラウンドを２０サイクルで、第２ラウンドを２５サイクルで行った。
【００４９】
使用したプライマーを下記に示す。
＜ＣＥＡ＞
フォワード１：5'-TCTGGAACTTCTCCTGGTCTCTCAGCTGG-3'
フォワード２：5'-GGGCCACTGCTGGCATCATGATTG-3'
リバース ：5'-TGTAGCTGTTGCAAATGCTTTAAGGAAGAAGC-3'
＜ＣＯＸ−２＞
フォワード１：5'-CTGAAAACTCCAAACACAG-3'
フォワード２：5'-GCACTACATACTTACCCACTTCAA-3'
リバース ：5'-ATAGGAGAGGTTAGAGAAGGCT-3'
【００５０】
結果
大腸癌３０例（早期癌３例、進行癌２７例）と対照群２２例における糞便からのＲＴ−ＰＣＲによるＣＥＡ、ＣＯＸ−２の検出を試みたところ、以下の結果を得た。
【００５１】
ＣＥＡは、大腸癌３０例中の全例で、対照群２２例中の２１例で検出された。また、両者からＲＴ−ＰＣＲで増幅し得るＲＮＡの抽出が行えることが判明した。
【００５２】
ＣＯＸ−２は、大腸癌３０例中の２７例（盲腸２／２、上行結腸３／５、下行き結腸１／１、Ｓ状結腸７／７、直腸１２／１３、早期癌２／３、進行癌２５／２７）で検出されたが、対照群２２例中では、１例も検出されなかった（感度９０％、特異度１００％）。
【００５３】
免疫学的便潜血検査法では、大腸癌２８例中２３例及び対照群２２例中３例が陽性であった（感度８２．１％、特異度８６．３％）。
【００５４】
ＣＯＸ−２陰性大腸癌３例中では、１例で免疫学的便潜血検査が陽性であり、２例が陰性であった。
【００５５】
免疫学的便潜血検査が陰性の大腸癌５例中３例で、ＣＯＸ−２が検出された。
【実施例２】
【００５６】
ヒト糞便から得られる全ＲＮＡの量及び分子量の分布を、本発明の方法とアレキサンダーの方法（非特許文献６）とで比較した。対象として、ヒトの大腸癌組織から市販のＲＮＡ抽出剤（アイソジェン、和光純薬）を用いて全ＲＮＡを抽出した。
【００５７】
それぞれの試料から抽出された全ＲＮＡの同一量をアガロースゲル上で電気泳動した。
【００５８】
レーン３（ヒト大腸癌組織由来ＲＮＡ）において認められる２本の主要バンドは、２８Ｓ及び１８ＳｒＲＮＡを示す。また、スメア状の部分は、得られた全ＲＮＡ中に種々の高分子ＲＮＡが含まれていることを示す。
【００５９】
レーン２（本発明の方法による糞便由来ＲＮＡ）において認められる２本の主要バンドは、腸内細菌由来の２３Ｓ及び１６ＳｒＲＮＡを示す。また、レーン３と同様にスメア状の部分が認められることから、本願発明の方法によって糞便から得られた全ＲＮＡ中には、種々の高分子ＲＮＡが含まれていると考えられる。
【００６０】
これに対して、レーン１では、いかなるバンドもスメアも全く認められず、試料抽出物中には、高分子ＲＮＡが含まれていないことを示した。
【００６１】
実際に、レーン２のサンプルからはＲＴ−ＰＣＲで目的の産物が得られたが、レーン１のサンプルからは、ＰＣＲ産物は得られなかった。
【００６２】
本研究結果から、本発明の方法によってヒト糞便から抽出されたＲＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲによる増幅が可能であることが明らかとなった。また、ＲＴ−ＰＣＲによる糞便からのＣＯＸ−２の検出は、９０％の感度及び１００％の特異度を有することから、従来技術である免疫学的便潜血法に比べて優れていることが証明された。
【００６３】
また、本発明の方法は、報告されているＡＰＣ、Ｋ−ｒａｓやｐ５３遺伝子変異の検出に比べて、検出に必要とする糞便の量が少なくかつ検出感度が高いことから、検出にかかる時間及び労力を大幅に節約することができる。
【００６４】
従来技術の便潜血法が、病変からの「出血」という一般的かつ間接的な事象を対象とするのに対し、本発明の方法は、発癌マーカーであるＣＯＸ−２発現という特異的かつ直接的な事象を対象とすることから、本発明の方法によって得られたデータは、より品質の高い診断を提供することができる。
【００６５】
したがって、本発明の方法は、特異度及び感度の高い新規大腸癌の非侵襲的スクリーニング方法として臨床的に極めて有用なものである。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】図１は、実施例２の電気泳動結果である。レーン１は、アレキサンダーらの方法でヒト糞便から抽出された全ＲＮＡである。レーン２は、本発明の方法でヒト糞便から抽出された全ＲＮＡである。レーン３は、ヒト大腸癌組織から抽出された全ＲＮＡである。レーンＭは、分子量マーカーである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程：
ａ）採取された生物学的サンプルをＲＮＡ分解酵素阻害剤の存在下で均質化し、懸濁物を調製する工程、
を含む大腸癌診断のための腫瘍マーカーの検出方法に用いるＲＮＡを抽出するための試料の調製方法であって、
生物学的サンプルから細胞成分を分離する工程を含まないことを特徴とする方法。
【請求項２】
採取された生物学的サンプルが、凍結されている、請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項３】
ＲＮＡ分解酵素阻害剤が、チオシアン酸グアニジンである、請求の範囲第１項又は第２項記載の方法。
【請求項４】
生物学的サンプルが、糞便である、請求の範囲第１項〜第３項いずれか１項記載の方法。
【請求項５】
下記手段：
ａ）採取された生物学的サンプルをＲＮＡ分解酵素阻害剤の存在下で均質化し、懸濁物を調製する手段、
を含む大腸癌診断のための腫瘍マーカーの検出方法に用いるＲＮＡを抽出するための試料の調製のためのキットであって、
生物学的サンプルから細胞成分を分離する手段を含まないことを特徴とするキット。
【請求項６】
さらに、採取された生物学的サンプルを凍結する手段を含む、請求の範囲第５項記載のキット。
【請求項７】
ＲＮＡ分解酵素阻害剤が、チオシアン酸グアニジンである、請求の範囲第５項又は第６項記載のキット。
【請求項８】
生物学的サンプルが、糞便である、請求の範囲第５項〜第７項いずれか１項記載のキット。
【請求項９】
ＣＯＸ−２の大腸癌診断のための腫瘍マーカーとしての使用。
【請求項１】
下記工程：
ａ）採取された生物学的サンプルをＲＮＡ分解酵素阻害剤の存在下で均質化し、懸濁物を調製する工程、
を含む大腸癌診断のための腫瘍マーカーの検出方法に用いるＲＮＡを抽出するための試料の調製方法であって、
生物学的サンプルから細胞成分を分離する工程を含まないことを特徴とする方法。
【請求項２】
採取された生物学的サンプルが、凍結されている、請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項３】
ＲＮＡ分解酵素阻害剤が、チオシアン酸グアニジンである、請求の範囲第１項又は第２項記載の方法。
【請求項４】
生物学的サンプルが、糞便である、請求の範囲第１項〜第３項いずれか１項記載の方法。
【請求項５】
下記手段：
ａ）採取された生物学的サンプルをＲＮＡ分解酵素阻害剤の存在下で均質化し、懸濁物を調製する手段、
を含む大腸癌診断のための腫瘍マーカーの検出方法に用いるＲＮＡを抽出するための試料の調製のためのキットであって、
生物学的サンプルから細胞成分を分離する手段を含まないことを特徴とするキット。
【請求項６】
さらに、採取された生物学的サンプルを凍結する手段を含む、請求の範囲第５項記載のキット。
【請求項７】
ＲＮＡ分解酵素阻害剤が、チオシアン酸グアニジンである、請求の範囲第５項又は第６項記載のキット。
【請求項８】
生物学的サンプルが、糞便である、請求の範囲第５項〜第７項いずれか１項記載のキット。
【請求項９】
ＣＯＸ−２の大腸癌診断のための腫瘍マーカーとしての使用。
【図１】
【公開番号】特開２００８−２７１９６９（Ｐ２００８−２７１９６９Ａ）
【公開日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１０９８９１（Ｐ２００８−１０９８９１）
【出願日】平成２０年４月２１日（２００８．４．２１）
【分割の表示】特願２００４−５６９６０１（Ｐ２００４−５６９６０１）の分割
【原出願日】平成１５年９月１９日（２００３．９．１９）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 日本消化器病学会誌 第９９巻 臨時増刊号（大会）（平成１４年９月２０日）財団法人日本消化器病学会発行 第Ａ６３４ページ（消Ｐ−３７９）に発表
【出願人】（８０２００００２０）財団法人浜松科学技術研究振興会 (63)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年４月２１日（２００８．４．２１）
【分割の表示】特願２００４−５６９６０１（Ｐ２００４−５６９６０１）の分割
【原出願日】平成１５年９月１９日（２００３．９．１９）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 日本消化器病学会誌 第９９巻 臨時増刊号（大会）（平成１４年９月２０日）財団法人日本消化器病学会発行 第Ａ６３４ページ（消Ｐ−３７９）に発表
【出願人】（８０２００００２０）財団法人浜松科学技術研究振興会 (63)
【Ｆターム（参考）】
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